特表 2023-542263 癌の治療用サルモネラ菌株およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-06

(54)【発明の名称】癌の治療用サルモネラ菌株およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20230929BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230929BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230929BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230929BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230929BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20230929BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20230929BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12Q1/02

A61P35/00

A61P35/02

A61K48/00

A61K35/74 A

C12N15/11 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022578550

(86)(22)【出願日】2020-07-08

(85)【翻訳文提出日】2022-12-16

(86)【国際出願番号】 KR2020008920

(87)【国際公開番号】W WO2021256599

(87)【国際公開日】2021-12-23

(31)【優先権主張番号】10-2020-0074197

(32)【優先日】2020-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513218905

【氏名又は名称】インダストリー、ファウンデーション、オブ、チョンナム、ナショナル、ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＯＦ ＣＨＯＮＮＡＭ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ミン、チョン チュン

(72)【発明者】

【氏名】ソン、ミ リョン

(72)【発明者】

【氏名】ユ、ソン ファン

(72)【発明者】

【氏名】ホン、ヨン チン

(72)【発明者】

【氏名】フイ、グエン ディン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QR75

4B063QR80

4B063QS05

4B063QS38

4B063QX02

4B065AA46X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065BA03

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC35

4C087CA10

4C087CA12

4C087MA52

4C087MA55

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

本発明は、癌の治療のために癌に選択的に作用するサルモネラ菌株およびこれを含む癌の予防または治療用組成物に関する。特に、本発明によるサルモネラ菌株は、腫瘍抑制効果を有するが、正常器官では生存力が著しく低くて、従来の発明より著しい抗癌効果を有することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

サルモネラ菌病原性アイランド－１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－１）；および
サルモネラ菌病原性アイランド－２（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－２；ＳＰＩ－２）；が欠失した、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項2】

前記サルモネラ菌病原性アイランド－１（ＳＰＩ－１）は、配列番号１で表される塩基配列からなる、請求項１に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項3】

前記サルモネラ菌病原性アイランド－２（ＳＰＩ－２）は、配列番号２で表される塩基配列からなる、請求項１に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項4】

前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、抗癌タンパク質を暗号化する遺伝子が追加的に導入されたものである、請求項１に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項5】

前記抗癌タンパク質は、毒素タンパク質、癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片、腫瘍抑制タンパク質（Ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、血管新生抑制剤、癌抗原、プロドラッグ転換酵素（Ｐｒｏｄｒｕｇ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）、およびプロアポトーシスタンパク質（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）から構成された群より選択される少なくとも１つである、請求項４に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項6】

前記毒素タンパク質は、リシン（Ｒｉｃｉｎ）、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（Ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボウガニン（Ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）、ヘモリシン（ＨｌｙＡ）、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳ ｌｉｇａｎｄ；ＦＡＳＬ）、腫瘍壊死因子－α（Ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α；ＴＮＦ－α）、ＴＮＦ－関連アポトーシス－誘発リガンド（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ；ＴＲＡＩＬ）およびサイトリシンＡ（Ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ；ＣｌｙＡ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項7】

前記サイトリシンＡは、配列番号１５で表される塩基配列からなる、請求項６に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項8】

前記腫瘍抑制タンパク質は、ＲＢ（Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、ｐ５３タンパク質、ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）タンパク質、ＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）タンパク質およびＣＤＫＮ２Ａ（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２Ａ）タンパク質から構成された群より選択される少なくとも１つである、請求項５に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項9】

前記血管新生抑制剤は、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）およびタンパク分解酵素抑制タンパク質から構成された群より選択される少なくとも１つである、請求項５に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項10】

前記癌抗原は、アルファ－フェトプロテイン（α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）、血管内皮成長因子受容体２（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２；ＶＥＧＦＲ２）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、レグマイン（Ｌｅｇｕｍａｉｎ）および前立腺癌特異的抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＰＣＳＡ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項11】

前記プロドラッグ転換酵素は、チミジンキナーゼ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ニトロレダクターゼ（ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｇ２）、クロメートレダクターゼＹｉｅＦ（ｃｈｒｏｍａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＹｉｅＦ）、単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ／ガンシクロビル（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ／ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ；ＨＳＶ１－ＴＫ／ＧＣＶ）およびβ－グルクロニダーゼ（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項12】

前記プロアポトーシスタンパク質は、Ｌ－アスナーゼ（Ｌ－ＡＳＮａｓｅ）またはＲＮＡ－結合モチーフタンパク質５（ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ５；ＲＢＭ５）である、請求項５に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項13】

前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラコレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラエンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラインファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）および腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）からなる群より選択される少なくとも１つに由来する、請求項１に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項14】

前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、グアノシン多リン酸合成能が欠如した変異体である、請求項１に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項15】

サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、ｐｐＧｐｐ合成酵素（ｐｐＧｐｐ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコーディングするサルモネラｒｅｌＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ－ｒｅｌＡ）遺伝子およびｓｐｏＴ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ－ｓｐｏＴ）遺伝子の少なくとも１つが不活性化された、請求項１に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株。

【請求項16】

サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株のサルモネラ菌病原性アイランド－１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－１）およびサルモネラ菌病原性アイランド－２（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－２）遺伝子を除去して形質転換された菌株を得るステップを含む、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項17】

前記サルモネラ菌病原性アイランド－１（ＳＰＩ－１）およびサルモネラ菌病原性アイランド－２（ＳＰＩ－２）の遺伝子の除去は、組換えベクターによって行われる、請求項１６に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項18】

前記サルモネラ菌病原性アイランド－１（ＳＰＩ－１）は、配列番号１で表される塩基配列からなる、請求項１６に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項19】

前記サルモネラ菌病原性アイランド－２（ＳＰＩ－２）は、配列番号２で表される塩基配列からなる、請求項１６に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項20】

抗癌タンパク質を暗号化する遺伝子を導入するステップをさらに含む、請求項１６に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項21】

前記抗癌タンパク質は、リシン（Ｒｉｃｉｎ）、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（Ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボウガニン（Ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）、ヘモリシン（ＨｌｙＡ）、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳ ｌｉｇａｎｄ；ＦＡＳＬ）、腫瘍壊死因子－α（Ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α；ＴＮＦ－α）、ＴＮＦ－関連アポトーシス－誘発リガンド（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ；ＴＲＡＩＬ）およびサイトリシンＡ（Ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ；ＣｌｙＡ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２０に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項22】

前記サイトリシンＡを暗号化する遺伝子は、配列番号１５で表される塩基配列からなる、請求項２１に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項23】

前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株は、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラコレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラエンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラインファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）および腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１６に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項24】

前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株は、グアノシン多リン酸合成能が欠如した変異体である、請求項１６に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項25】

前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株は、ｐｐＧｐｐ合成酵素（ｐｐＧｐｐ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコーディングするサルモネラｒｅｌＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ－ｒｅｌＡ）遺伝子またはｓｐｏＴ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ－ｓｐｏＴ）遺伝子が不活性化された、請求項２４に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項26】

前記形質転換された菌株を培養するステップをさらに含む、請求項１６に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項27】

前記形質転換された菌株を抗生剤培地に培養して変異菌株を選別するステップをさらに含む、請求項１６に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法。

【請求項28】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項29】

前記癌は、黒色腫、卵管癌、脳癌、小腸癌、食道癌、リンパ腺癌、胆嚢癌、血液癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、口腔癌、肝臓癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨／軟部組織肉腫、皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および孤立性骨髄腫から構成される群より選択される、請求項２８に記載の薬学的組成物。

【請求項30】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を有効成分として含む癌の診断用組成物。

【請求項31】

目的とする個体から分離された生物学的試料に、請求項１～１５のいずれか１項に記載の菌株を処理するステップを含む癌の診断のための情報提供方法。

【請求項32】

前記菌株からレポータータンパク質が発現する場合、癌と診断するステップをさらに含む、請求項３１に記載の癌の診断のための情報提供方法。

【請求項33】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を有効量で個体に投与するステップを含む、癌の予防または治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌に選択的に作用するサルモネラ菌株およびこれを含む癌の予防または治療用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は現在全世界的に最も多くの死亡者を出す疾病の一つであって、平均寿命の延長と癌発生年齢の低下によって癌発生率は継続して増加する傾向にある。韓国の国立癌センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）で提供する２０１３年の統計資料によれば、２０１０年に癌登録統計課に登録された韓国の癌発生患者は計２０２，０５３人であり、継続して増加する傾向にある。

【0003】

したがって、癌については細胞レベルの基本研究から全方位的な抗癌治療に関する研究が全世界的に進められてきているが、未だ癌の発生機序が不明確であり、再発防止および完治が難しくて抗癌剤に対する需要が爆発的に増えており、多大な研究費が研究所および企業体に投資されている。しかし、高価格の抗癌治療費用は、直接的な医療費用だけでなく、発病後の社会経済活動の萎縮、リハビリおよび患者の看護による間接費用が追加されて、癌患者の家族および社会構成員全体に経済的に大きな負担となっており、低費用の新たな技術の導入が要求されているのが現状である。

【0004】

このような現状に合わせて、約１００余年前に細菌による癌抑制現象が報告されて以来、多くの研究関係者によって抗癌効果を有する菌株が開発されており、一部の研究グループではすでに臨床段階が進行中である。

【0005】

低い酸素分圧と豊富な営養分、免疫反応の欠乏などに代表される癌組織の細胞環境体内で増殖する病原性菌株が好む生息地の特徴でもある。特に、癌組織の中心に位置したネクロティック領域（ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）は薬物伝達が効率的に行われず、癌の転移などを誘発することが知られているが、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などは、癌組織の中心にあるネクロティック領域の豊富な営養分に集積して増殖し、この過程で癌組織の縮小および成長抑制などが観察されて、昔から抗癌治療のための生菌株として使用されている。

【0006】

中国のＤｒ．Ｘｕ研究チームは、ビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を経口投与して、新生血管生成抑制剤であるエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）を固形癌組織に伝達するシステムを考案しており、以後、抗癌性抗生物質であるアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）との混合治療研究などを報告した（Ｘｕ ＹＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００７，１４（２）：１５１７；Ｈｕ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９，１６（８）：６５５－６３）。

【0007】

このほか、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）をはじめとする多様な研究チームでサルモネラの癌成長阻害結果を発表し、サルモネラチフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の毒性を弱めた変異菌株の開発を含む抗癌治療物質を搭載した弱毒化サルモネラ組換え菌株の抗癌効果を報告した（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００６，１１６（７）：１９４６－５４，Ｃｌａｉｒｍｏｎｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０００，１８１：１９９６－２００２．Ｎｇｕｙｅｎ ＶＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０，１；７０（１）：１８－２３，Ｋｉｍ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３，８（３）：ｅ６０５１１．）

【0008】

しかし、生菌株を用いた抗癌治療は、腫瘍組織以外の正常組織にも長時間残留し、菌株による副作用の発生が懸念されてきた。特に、腫瘍治療のための組換えサルモネラの強力な抗癌治療物質の生成は、正常組織に残留するサルモネラによって組織の損傷を引き起こすことがある。また、腫瘍細胞の死滅後、除去されずに残る残留サルモネラによる慢性感染時、保菌者として周辺の他の人への感染の恐れがあり、免疫機能が弱くなった患者や高齢者には病原性が弱くなったサルモネラによって致命的な敗血症が発生する可能性があり、慢性感染時に生成された抗体は、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）を起こす可能性、例えば、関節炎、眼炎、尿道炎などが発生する恐れがある。したがって、サルモネラを用いた抗癌治療技術の開発においてサルモネラの腫瘍組織に対する増殖の特異性を高め、正常器官での過度の免疫反応とそれによる副作用を最小化するために、腫瘍組織ではない他の正常組織でのサルモネラの生存能力を効率的に調節して、正常器官でサルモネラ感染時に迅速に除去できる菌株の開発が必要である。サルモネラの病原性遺伝子を欠如させた変異菌株は、サルモネラの弱毒性および生存能力を調節することが報告された。サルモネラ病原性遺伝子群であるＳＰＩ－１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１）またはＳＰＩ－２（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－２）の不活性化は、サルモネラガリナルムの病原性が弱くなる効果を示し（特許１０１５００８０５００００）、弱毒化サルモネラにおいて病原性遺伝子群に属する単一遺伝子の追加欠如は、脾臓で変異菌株の生存力を急速に減少させた。（特許１０１７７３５８０００００）

【0009】

しかし、サルモネラガリナルムにおいてＳＰＩ－１またはＳＰＩ－２遺伝子群の欠如は、鳥類上皮細胞内の侵入効率性が減少して非病原性を有する結果により正常組織で残留サルモネラの生存能力を確認することができず、弱毒化サルモネラにおける病原性遺伝子群に属する単一遺伝子の欠如による脾臓内のサルモネラ生存力の減少は、リンパ球と多様な免疫細胞から構成されている免疫器官である脾臓によるサルモネラに対する免疫反応感受性の増大効果と見られて、免疫器官ではない生体内すべての正常組織に対するサルモネラの生存能力を迅速に調節するとは考えにくい。

【0010】

そこで、本研究者らは、腫瘍組織ではない他の正常組織でのサルモネラの生存能力を効率的に調節し、抗癌効果に優れたサルモネラ菌株を開発するために努力した結果、かつて知られた弱毒化サルモネラ菌株にサルモネラ病原性遺伝子群を追加的に欠如させた結果、正常器官での生存力は減少し、腫瘍成長が著しく抑制されることを確認したことで、前記本発明の菌株を抗癌用組成物の有効成分として有用に使用できることを検証し、本発明を完成するに至った。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の一目的は、遺伝子が欠失したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株およびその製造方法に関する。

【0012】

本発明の他の目的は、本発明で提供するサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を用いた癌の予防、改善または治療用組成物を提供することである。

【0013】

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は以上に言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0014】

以下、本願に記載された多様な実施形態が図面を参照して記載される。下記の説明において、本発明の完全な理解のために、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物および工程などが記載されている。しかし、特定の実施形態は、これらの特異的詳細事項の１つ以上なしに、または他の公知の方法および形態とともに実行できる。他の例において、公知の工程および製造技術は本発明を不必要にあいまいにさせないために、特定の詳細事項として記載されない。「一つの実施形態」または「実施形態」に対する本明細書全体による参照は、実施形態と結びつけて記載された特別な特徴、形態、組成または特性が本発明の一つ以上の実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる多様な位置で表現された「一つの実施形態において」または「実施形態」の状況は必ずしも本発明の同一の実施形態を示さない。追加的に、特別な特徴、形態、組成、または特性は一つ以上の実施形態において何らかの適した方法で組み合わされる。

【0015】

本発明内に特別な定義がなければ、本明細書に使われたすべての科学的および技術的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。

【0016】

本発明の一実施形態によれば、サルモネラ菌病原性アイランド－１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－１）；およびサルモネラ菌病原性アイランド－２（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－２）；が欠失した、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株に関する。

【0017】

本発明において、前記サルモネラ菌病原性アイランド－１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－１）は、サルモネラ菌感染初期の腸上皮細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）に必要な第３型分泌系と毒性タンパク質の遺伝子全体群を有しているサルモネラ遺伝体内の特定部位である（Ｋｉｍｂｒｏｕｇｈ ＴＧ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ，（２００２）；４（１）：７５－８２）。

【0018】

本発明において、前記サルモネラ菌病原性アイランド－１（ＳＰＩ－１）は、配列番号１で表される塩基配列からなるものであってもよい。

【0019】

本発明において、サルモネラ菌病原性アイランド－２（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－２）は、サルモネラ菌が上皮細胞を通過した後、腸免疫器官や脾臓、肝などの免疫器官内の大食細胞に食菌（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後、食胞（ｐｈａｇｏｚｏｍｅ）内で溶菌せずに生き残るようにする機序に関与する反応期タンパク質とこれらのタンパク質を分泌させる第３型分泌系の遺伝子群を含む特定の遺伝体部位である（Ｗａｔｅｒｍａｎ ＳＲ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，（２００３）；５（８）：５０１～５１１，Ａｂｒａｈａｍｓ ＧＬ，Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，（２００６）；８（５）：７２８－７３７）。前記第３型分泌系（Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、ＴＴＳＳ）は、グラム陰性菌に発達した病原性物質の伝達方法で、宿主細胞膜を通過して直接細胞質に病原性活性タンパク質を注入する注射器形態の器具（Ｍｏｔａ ＬＪ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ Ｍｅｄ．（２００５）；３７（４）：２３４－２４９）で多重タンパク質複合構造体である。サルモネラ菌の感染経路では、第３型分泌系による病原性物質の伝達過程が非常に重要であることが知られている（Ｓｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒ ＭＣ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，（２００６）；９（１）：４６－５４）。野生型のサルモネラは、ＴＴＳＳタンパク質を用いて宿主の腸内上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）、侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）し、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の食菌作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）中にも生存して、場合によっては、血流に沿って全身感染（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を起こす現象を示す。したがって、ＴＴＳＳタンパク質が正常に機能する時、サルモネラ感染が進行する。

【0020】

本発明において、前記サルモネラ菌病原性アイランド－２（ＳＰＩ－２）は、配列番号２で表される塩基配列からなるものであってもよい。

【0021】

本発明において、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、抗癌タンパク質を暗号化する遺伝子を追加的に導入したものであってもよい。

【0022】

本発明の前記「抗癌タンパク質」とは、癌細胞の死滅を直間接的に誘導できる機能を有するペプチドであって、例えば、毒素タンパク質、癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片、腫瘍抑制タンパク質（Ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、血管新生抑制剤、癌抗原、プロドラッグ転換酵素（Ｐｒｏｄｒｕｇ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）およびプロアポトーシスタンパク質（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0023】

本発明の前記「毒素タンパク質」とは、癌細胞の死滅を直間接的に誘導できる機能を有するタンパク質であって、例えば、リシン（Ｒｉｃｉｎ）、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（Ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボウガニン（Ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）、ヘモリシン（ＨｌｙＡ）、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳ ｌｉｇａｎｄ；ＦＡＳＬ）、腫瘍壊死因子－α（Ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α；ＴＮＦ－α）、ＴＮＦ－関連アポトーシス－誘発リガンド（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ；ＴＲＡＩＬ）およびサイトリシンＡ（Ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ；ＣｌｙＡ）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよく、さらに好ましくは、サイトリシンＡであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0024】

本発明において、前記サイトリシンＡ遺伝子の導入は、組換えベクターによって行われてもよいが、これに限定されるものではない。

【0025】

本発明において、前記組換えベクターは、配列番号１３で表される正方向プライマーおよび配列番号１４で表される逆方向プライマーを用いて作製されたものであってもよい。

【0026】

本発明において、前記サイトリシンＡ（Ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ；ＣｌｙＡ）遺伝子は、３４－ｋＤａの細胞膜に穴を形成して細胞を溶血させるタンパク質をコーディングする遺伝子で、大腸菌、サルモネラなどで発現する。前記サイトリシンＡの配列は、ＷａｉＳＮ，Ｌｉｎｄｍａｒｋ Ｂ，Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｖｅｓｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐｏｒｔ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ＣｌｙＡ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ．Ｃｅｌｌ２００３；１１５：２５－３５に記載されているが、これに限定するものではなく、多様な原核細胞由来のものおよびこれらの機能的変異体が本願に使用可能である。一実施形態において、サイトリシンＡ（ＣｌｙＡ）のタンパク質ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号はＡＢＩ８３８３３．１、遺伝子配列はＤＱ９１０７８０．１である。前記サイトリシンＡ遺伝子は、配列番号１５で表される塩基配列からなるものであってもよい。

【0027】

本発明の前記「腫瘍抑制タンパク質」とは、正常細胞に存在しながら機能を維持するが、その機能が失われた場合には、正常細胞が無分別な細胞分裂および成長の誘導によって癌細胞に転換されるようにする機能をする遺伝子であって、例えば、ＲＢ（Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、ｐ５３タンパク質、ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）タンパク質、ＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）タンパク質、ＣＤＫＮ２Ａ（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２Ａ）タンパク質などであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0028】

本発明の前記癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片は、癌細胞の表面または細胞質に特異的に発現レベルが高いタンパク質である抗原に特異的に結合可能な抗体であって、例えば、乳癌または胃癌細胞に特異的に発現レベルが高いＨＥＲ２などに特異的な抗体のようなものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0029】

本発明の前記抗体は、タンパク質またはペプチド分子の抗原性部位に特異的に結合可能なタンパク質分子を意味する。前記抗体の形態は特に限定されず、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体または抗原結合性を有するものであれば、抗体の一部の場合でも含まれ、全種類の免疫グロブリン抗体が含まれていてもよい。また、ヒト化抗体などの特殊抗体が含まれ、前記抗体は、２個の全長の軽鎖および２個の全長の重鎖を有する完全な形態だけではなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどになってもよいが、これに限定されるものではない。

【0030】

本発明の前記「抗体」とは、本発明の前記癌抗原を暗号化する遺伝子を通常の方法により発現ベクターにクローニングして前記遺伝子によって暗号化されるタンパク質を得た後に、通常の方法により製造できる。

【0031】

本発明の前記「血管新生抑制剤」とは、癌細胞周辺で新しい血管が生成されることを抑制して癌細胞の死滅を直接または間接的に誘導できる機能を有するタンパク質または化合物を意味する。好ましくは、前記血管新生抑制剤は、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、およびタンパク分解酵素抑制タンパク質などであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0032】

本発明の前記「癌抗原」とは、癌細胞では発現するが、正常細胞ではほとんど発現しないタンパク質を抗原として、これにより抗腫瘍免疫反応を誘導することで癌細胞の直接または間接的死滅を誘導できるタンパク質を意味する。本発明の前記癌抗原は、好ましくは、アルファ－フェトプロテイン（α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）、血管内皮成長因子受容体２（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２；ＶＥＧＦＲ２）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、レグマイン（Ｌｅｇｕｍａｉｎ）、前立腺癌特異的抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＰＣＳＡ）などであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0033】

本発明の前記「プロドラッグ転換酵素」とは、不活性薬物を酵素反応による代謝により活性薬物に転換させる機能を有するタンパク質であって、このようなプロドラッグ転換酵素を用いる場合、不活性薬物が代謝されて癌細胞の死滅を直接または間接的に誘導できる活性薬物に転換されるようにして、癌の予防または治療に非常に有用に使用可能である。本発明の前記プロドラッグ転換酵素は、好ましくは、チミジンキナーゼ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ニトロレダクターゼ（ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｇ２）、クロメートレダクターゼＹｉｅＦ（ｃｈｒｏｍａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＹｉｅＦ）、単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ／ガンシクロビル（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ／ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ；ＨＳＶ１－ＴＫ／ＧＣＶ）、β－グルクロニダーゼ（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）などであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0034】

本発明の前記「プロアポトーシスタンパク質」とは、癌細胞が成長または維持されるのに必須の因子（タンパク質、営養分、オリゴヌクレオチドなど）を欠乏させることにより、癌細胞の直接または間接的な死滅を誘導するタンパク質を意味する。本発明の前記プロアポトーシスタンパク質は、好ましくは、Ｌ－アスナーゼ（Ｌ－ＡＳＮａｓｅ）、ＲＮＡ－結合モチーフタンパク質５（ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ５；ＲＢＭ５）などであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0035】

本発明において、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、レポーター遺伝子をさらに含み、前記レポーター遺伝子は、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株のイメージングを可能にする。

【0036】

前記レポーター遺伝子は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）映像撮影が可能なタンパク質をコーディングするもので、多様な由来の生物発光遺伝子、化学発光遺伝子、蛍光遺伝子を含むものである。

【0037】

本発明において、前記発光遺伝子は、原核または真核細胞由来のルシフェラーゼ遺伝子であってもよい。前記原核細胞由来のルシフェラーゼ遺伝子は、バクテリアルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｘ）であってもよい。前記真核細胞由来のルシフェラーゼ遺伝子は、ファイヤーフライ由来の発光遺伝子であってもよいが、これに限定されるものではない。前記遺伝子は、プラスミドの形態でまたはサルモネラの遺伝体に挿入されて存在してもよい。

【0038】

本発明において、前記発光遺伝子は、プラスミドの形態でまたはサルモネラの遺伝体に挿入されて存在してもよい。

【0039】

本発明において、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラコレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラエンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラインファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）および腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）からなる群より選択される少なくとも１つに由来するものであってもよい。挙げられたサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株は、グラム陰性の通性嫌気性桿菌である。乳糖分解力がなく、インドールを形成せず、硫化水素を生成しないので、大腸菌とは区別される。前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株は、周毛を有していて運動性があるものであってもよい。

【0040】

前記サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の腸チフスを起こす原因菌である。前記サルモネラチフィムリウムは、棒状の桿菌で、片毛がありグラム陰性である。前記サルモネラチフィムリウムは、熱に弱くて、６０℃で２０分で死滅し、家畜、野生動物、保菌者などや、牛乳、卵などによって１次汚染し、汚染した生育などから２次感染しやすいザラダなども原因になって、食中毒の一種であるサルモネラ症（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）を誘発することがある。

【0041】

前記サルモネラコレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属のブタコレラ菌としてよく知られている菌で、ヒトと動物ともに感染する菌である。前記サルモネラコレレスイスは、サルモネラによる急性敗血症の主な原因菌である。この菌は、周毛を有していて運動性があるグラム陰性の通性嫌気性桿菌である。乳糖分解力がなく、インドールを形成せず、硫化水素を生成しないので、大腸菌とは区別される。発育の最適温度は３５～３７℃であり、増殖可能な温度範囲は１０～４３℃であり、６０℃で２０分間加熱で死滅する。最適ｐＨは７．２～７．４であり、大きさは０．５～０．８×３～４μｍである。

【0042】

前記サルモネラエンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の細菌性感染型食中毒の原因菌で、腸炎菌ともいう。前記サルモネラエンテリティディスは、サルモネラの代表的な菌で、すべての動物で感染を起こすことがあり、宿主適応力が非常に高い。周毛を有していて運動性があるグラム陰性の通性嫌気性桿菌である。乳糖分解力がなく、インドールを形成せず、硫化水素を生成しないので、大腸菌とは区別される。発育の最適温度は３５～３７℃であり、増殖可能な温度範囲は１０～４３℃であり、６０℃で２０分間加熱で死滅する。最適ｐＨは７．２～７．４であり、大きさは０．５～０．８×３～４μｍである。

【0043】

前記サルモネラインファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎｆａｎｔｉｓ）は、卵または家禽肉類によって感染する菌株であり、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）および腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）は、腸チフスの原因菌株である。

【0044】

本発明において、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、グアノシン多リン酸合成能が欠如した変異体であってもよい。前記グアノシン多リン酸は、グアノシン－５－二リン酸－３－二リン酸（ｐｐＧｐｐ）であってもよい。

【0045】

本発明において、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、ｐｐＧｐｐ合成酵素（ｐｐＧｐｐ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコーディングするサルモネラｒｅｌＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ－ｒｅｌＡ）遺伝子およびｓｐｏＴ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ－ｓｐｏＴ）遺伝子の少なくとも１つが不活性化されたものであってもよい。

【0046】

本発明において、前記ｐｐＧｐｐ合成能を有する遺伝子が欠失したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株は、腫瘍抑制効果を示すが、正常器官と組織でも有意な生存力を示してサルモネラによる感染が発生することがあり、また、サルモネラ菌の病原性遺伝子のみを欠失させた菌株も、正常器官で病原性が維持されて治療用菌株としての活用の可能性がわずかである。しかし、本発明のように、前記ｐｐＧｐｐ合成能遺伝子が不活性化されたサルモネラ属菌株に、追加的にＳＰＩ－１およびＳＰＩ－２遺伝子を同時に欠失させたサルモネラ属菌株は、正常器官では前記菌株の生存力が著しく低くて、サルモネラによる感染がないだけでなく、前記ｐｐＧｐｐ合成能を有する遺伝子が欠失したサルモネラ属菌株に比べて抗癌効果も著しく優れているというメリットがある。

【0047】

本発明において、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、ＳＨＪ２０３７（寄託番号ＫＣＴＣ １０７８７ＢＰ）に由来するものであってもよい。

【0048】

本発明において、用語「由来」は、組換えプラスミド乃至組換え菌株が遺伝子組換え過程を経る前の既存のプラスミド乃至菌株を意味する。

【0049】

本発明のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株の遺伝子の欠失および不活性化のために、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属宿主細胞に組換えベクターを使用することができる。前記組換えベクターは、プラスミドであってもよいが、これに限定されない。前記プラスミドは、電気穿孔方法によりサルモネラ属菌株に導入されてもよいが、これに限定されない。前記電気穿孔法は、原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）に電気衝撃を与えて細胞膜がＤＮＡを受け入れるようにする方法である。細胞に一定の間隔で高い電圧の電気刺激を与えると、細胞膜の小さい穴が開くが、この時、電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）作用によりＤＮＡがこの穴を通して細胞内に挿入される。

【0050】

本発明の前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、癌の予防または治療に使用できる。

【0051】

本発明において、前記「癌」は、変種細胞の迅速かつ制御されない成長を特徴とする疾病であって、黒色腫、卵管癌、脳癌、小腸癌、食道癌、リンパ腺癌、胆嚢癌、血液癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、口腔癌、肝臓癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨／軟部組織肉腫、皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および孤立性骨髄腫から構成される群より選択される少なくとも１つであってもよく、好ましくは、肝臓癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨／軟部組織肉腫および皮膚癌から構成される群より選択される少なくとも１つであってもよく、さらに好ましくは、結腸癌であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0052】

本発明の前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、腫瘍組織に比べて正常組織で生存力が低いものであってもよい。ここで、前記正常組織は、肺、肝および脾臓からなる群より選択される臓器の組織であってもよいが、これに限定されない。

【0053】

本発明の前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、正常組織では生存力が著しく低くて、サルモネラによる感染がないだけでなく、従来の発明より抗癌効果も著しく優れているというメリットがある。

【0054】

また、本発明の前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株のゲノム中の異なる２以上の突然変異によってサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株が弱毒化されれば、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、親菌株に復帰する確率が非常に希薄で安全であることが知られている。

【0055】

本発明のさらに他の実施形態によれば、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株のサルモネラ菌病原性アイランド－１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－１）およびサルモネラ菌病原性アイランド－２（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－２；ＳＰＩ－２）遺伝子を除去して形質転換された菌株を得るステップを含む、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を製造する方法を提供する。

【0056】

本発明の前記サルモネラ菌病原性アイランド－１（ＳＰＩ－１）は、配列番号１で表される塩基配列からなるものであってもよい。

【0057】

本発明の前記サルモネラ菌病原性アイランド－２（ＳＰＩ－２）は、配列番号２で表される塩基配列からなるものであってもよい。

【0058】

本発明において、前記サルモネラ菌病原性アイランド－１（ＳＰＩ－１）およびサルモネラ菌病原性アイランド－２（ＳＰＩ－２）の遺伝子の除去は、組換えベクターによって行われてもよいが、これに限定されるものではない。

【0059】

本発明において、前記組換えベクターは、配列番号７で表される正方向プライマーおよび配列番号８で表される逆方向プライマーを用いて作製されたものであってもよい。

【0060】

前記組換えベクターは、ｐＫＤ１３、ｐＣＰ２０またはｐＪＬ３９プラスミドに由来するものであってもよいが、これに限定されない。

【0061】

前記ｐＫＤ１３は、３４３４ｂｐからなり、ベータ－ラクタマーゼ（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ）、ｒｒｎＢ転写ターミネーター（ｒｒｎＢ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、プライミング部位１（ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｉｔｅ １）、天然ＦＲＴ部位（ｎａｔｕｒａｌ ＦＲＴ ｓｉｔｅ）、共通プライミング部位ｋｔ（ｃｏｍｍｏｎ ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｉｔｅ ｋｔ）、Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｔｎ５ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、共通プライミング部位ｋ２（ｃｏｍｍｏｎ ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｉｔｅ ｋ２）、共通プライミング部位ｋ１（ｃｏｍｍｏｎ ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｉｔｅ ｋ１）、天然ＦＲＴ部位の遠位３５－ｎｔ（ｄｉｓｔａｌ ３５－ｎｔ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ＦＲＴ ｓｉｔｅ）、プライミング部位４（ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｉｔｅ ４）、ラムダターミネーター（ｌａｍｂｄａ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）およびＲ６Ｋガンマ複製原点（Ｒ６Ｋ ｇａｍｍａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）遺伝子を含む。

【0062】

前記ｐＣＰ２０プラスミドは、９４９７ｂｐからなり、ＥｃｏＲＩ、ｃａｔ、Ｐｓｔｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｃｉ８５７、ｆｌｐ、ｂａｍＨｉ、ベータ－ラクタマーゼ（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ）、ｍｏｂＡ、ｍｏｂ２およびｒｅｐＡ１０１ｔｓ遺伝子から構成される。

【0063】

本発明の製造方法は、抗癌タンパク質を暗号化する遺伝子を導入するステップをさらに含むことができる。

【0064】

本発明において、前記抗癌タンパク質は、毒素タンパク質、癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片、腫瘍抑制タンパク質（Ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、血管新生抑制剤、癌抗原、プロドラッグ転換酵素（Ｐｒｏｄｒｕｇ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）およびプロアポトーシスタンパク質（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0065】

本発明の前記毒素タンパク質は、リシン（Ｒｉｃｉｎ）、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（Ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボウガニン（Ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）、ヘモリシン（ＨｌｙＡ）、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳ ｌｉｇａｎｄ；ＦＡＳＬ）、腫瘍壊死因子－α（Ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α；ＴＮＦ－α）、ＴＮＦ－関連アポトーシス－誘発リガンド（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ；ＴＲＡＩＬ）およびサイトリシンＡ（Ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ；ＣｌｙＡ）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよく、さらに好ましくは、サイトリシンＡであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0066】

本発明において、前記サイトリシンＡ遺伝子の導入は、組換えベクターによって行われてもよいが、これに限定されるものではない。前記サイトリシンＡ遺伝子の導入に使用されたベクターは、ＳＰ－１およびＳＰ－２遺伝子の除去に使用されたベクターと同一でも異なっていてもよい。

【0067】

本発明において、前記組換えベクターは、配列番号１３で表される正方向プライマーおよび配列番号１４で表される逆方向プライマーを用いて作製されたものであってもよい。

【0068】

本発明において、前記組換えベクターのうち前記プラスミドの導入は、電気穿孔方法によるものであってもよいが、これに限定されない。

【0069】

本発明において、前記サイトリシンＡ（ＣｌｙＡ）遺伝子を導入するステップは、前記サルモネラ菌病原性アイランド－１（ＳＰＩ－１）およびサルモネラ菌病原性アイランド－２（ＳＰＩ－２）の遺伝子の除去前または後に行われてもよいし、実行の順序を特に制限するわけではない。

【0070】

本発明において、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株は、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラコレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラエンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラインファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）および腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）からなる群より選択される少なくとも１つに由来するものであってもよい。

【0071】

本発明において、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株は、グアノシン多リン酸合成能が欠如した変異体であるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株であってもよい。

【0072】

本発明において、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株は、ｐｐＧｐｐ合成酵素（ｐｐＧｐｐ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコーディングするサルモネラｒｅｌＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ－ｒｅｌＡ）遺伝子またはｓｐｏＴ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ－ｓｐｏＴ）遺伝子が不活性化されたものであってもよい。

【0073】

本発明の製造方法は、前記のように形質転換された菌株を培養するステップをさらに含むことができる。

【0074】

本発明において、前記培養するステップは、抗生剤を含むＬＢ培地（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ）を用いて行われ、前記ＬＢ培地は、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属菌株の成長とプラークの形成を最適化するためにジュゼッペベルターニ（Ｇｉｕｓｅｐｐｅ Ｂｅｒｔａｎｉ）によって開発され、一般的な成分には、ペプチド、カゼインペプトン、ビタミン（Ｂビタミンを含む）、微量元素（窒素、硫黄、マグネシウム）、無機質が含まれ、滲透圧は塩化ナトリウムで調節される。

【0075】

本発明の製造方法は、前記のように形質転換された菌株を抗生剤培地に培養して変異菌株を選別するステップをさらに含むことができる。

【0076】

本発明において、前記抗生剤は、カナマイシンまたはテトラサイクリンであってもよいが、これに限定されない。

【0077】

本発明の前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株、前記抗癌タンパク質、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株および前記組換えベクターに関する内容は、前記組成物に記載されたものと同一で、明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。

【0078】

本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供するサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物に関する。

【0079】

本発明において、前記「癌」は、変種細胞の迅速かつ制御されない成長を特徴とする疾病であって、黒色腫、卵管癌、脳癌、小腸癌、食道癌、リンパ腺癌、胆嚢癌、血液癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、口腔癌、肝臓癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨／軟部組織肉腫、皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および孤立性骨髄腫から構成される群より選択される少なくとも１つであってもよく、好ましくは、肝臓癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨／軟部組織肉腫および皮膚癌から構成される群より選択される少なくとも１つであってもよく、さらに好ましくは、結腸癌であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0080】

本発明の前記「予防」は、本発明の組成物を用いて、癌によって発生した症状を遮断したり、その症状を抑制または遅延させるすべての行為であれば制限なく含むことができる。

【0081】

本発明の前記「改善」または「治療」は、本発明の組成物を用いて、癌によって発生した症状が好転したり、有利になるすべての行為であれば制限なく含むことができる。

【0082】

本発明の前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象とすることを特徴とする。

【0083】

本発明の前記薬学組成物はこれらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化されて使用可能である。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などが使用可能であり、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが混合されて使用可能であり、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などが使用可能である。本発明の薬学組成物の剤形は、上述のような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造できる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。

【0084】

本発明の前記製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含むことができる。

【0085】

本発明の前記薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。

【0086】

本発明の前記「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与できる。

【0087】

本発明の前記薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症度を含む様々な要因によって多様に変化することができき、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、１日０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明による医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化される。

【0088】

本発明のさらに他の実施形態では、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を有効成分として含む癌の診断用組成物を提供する。

【0089】

本発明の前記診断用組成物は、本発明による前記菌株を有効成分として含む。

【0090】

本発明の前記菌株は、本発明による変異菌株が個体内で癌細胞を標的とした後に、菌株内にリアルタイムにイメージング可能なレポータータンパク質が発現するため、正常組織に対するノイズシグナルなしに癌をリアルタイムに診断することができる。

【0091】

本発明の前記「レポータータンパク質」とは、視覚的に癌が診断できるようにする機能を行うタンパク質であって、例えば、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）および核医学またはＭＲＩ映像撮影に使用されるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0092】

本発明の前記「蛍光タンパク質は」は、癌が視覚的に診断できるように自ら蛍光を呈するタンパク質であって、例えば、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）、変形された緑色蛍光タンパク質（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＦＰ）、増強された赤色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＦＰ）、増強された青色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＹＦＰ）および増強された黄色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＹＦＰ）から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0093】

本発明の前記核医学またはＭＲＩ映像撮影に使用されるタンパク質は、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンリン酸酵素（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎｓｅａｓｅ）、ドーパミン受容体（Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ソマトスタチン受容体（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ソジウム－ヨウ素輸送体（Ｓｏｄｉｕｍ－ｉｏｄｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、鉄受容体、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）および鉄輸送体（ｍａｇＡ）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0094】

本発明の前記「診断」とは、本発明の前記菌株が癌を標的として位置する時、前記菌株に導入されたベクターまたは染色体に導入されたレポータータンパク質によってリアルタイムに癌の存在の有無をモニタリングできることを含む生体内癌組織を確認するすべての行為を意味する。

【0095】

本発明の前記診断用組成物において、前記変異菌株、ベクター、形質転換、癌などに関する内容は、先に記載したものと同一で、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。

【0096】

本発明のさらに他の実施形態では、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を処理するステップを含む癌の診断のための情報を提供する方法を提供する。

【0097】

本発明の前記方法は、目的とする個体から分離された生物学的試料に、本発明による前記変異菌株を処理するステップを含む。

【0098】

本発明の前記癌の診断のための情報を提供する方法は、前記菌株からレポータータンパク質が発現する場合、癌と診断するステップをさらに含むことができる。

【0099】

本発明の前記「生物学的試料」とは、個体から得られるか、個体に由来する任意の物質、組織または細胞を意味するもので、例えば、組織、細胞（ｃｅｌｌ）、または細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ）を含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0100】

本発明の前記診断のための情報提供方法において、前記変異菌株、抗癌タンパク質、レポータータンパク質、ベクター、菌株、形質転換、癌、診断などに関する内容は、前記レポータータンパク質、ベクター、菌株、癌の予防または治療用薬学的組成物に記載したものと同一で、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。

【0101】

本発明のさらに他の実施形態では、本発明で提供するサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株を有効量で個体に投与するステップを含む、癌の予防または治療方法に関する。

【0102】

本発明において、前記「個体」とは、癌の予防または治療が必要な個体であって、哺乳動物および非－哺乳動物をすべて含むことができる。ここで、前記哺乳動物の例としては、ヒト、非－ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、他の類人猿またはサル種；畜産動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；飼育動物、例えば、ウサギ、イヌまたはネコ；実験動物、例えば、齧歯類、例えば、ラット、マウスまたはモルモットなどを含むことができるが、これに限定されるものではない。また、本発明において、前記非－哺乳動物の例としては、鳥類または魚類などを含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0103】

本発明において、前記「投与」とは、任意の適切な方法で個体に本発明の有効成分を導入する過程を意味するものであって、前記のように投与されるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株の製剤は特に限定せず、固体形態の製剤、液体形態の製剤または吸引用エアゾール製剤で投与されてもよいし、使用直前に経口または非経口投与用液体形態の製剤に転換されるように意図される固体形態の製剤で投与されてもよく、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化して投与されてもよいが、これに限定されるものではない。

【0104】

また、本発明において、前記投与時、本発明のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株とともに薬学的に許容可能な担体を追加的に投与することができる。ここで、前記薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株の剤形は、上述のような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造できる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。

【0105】

一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含むことができる。

【0106】

本発明によるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。

【0107】

本発明において、「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学的組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与可能である。

【0108】

本発明において、「有効量」は、好ましい生物学的結果を提供するための作用剤の十分な量を指す。前記結果は、疾患の兆候、症状または原因の減少および／または緩和、または生物界の任意の他の好ましい変化であってもよい。例えば、治療用途のための「有効量」は、疾患において臨床的に有意な減少を提供するのに要求される、本発明に開示された前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株の量である。任意の個別的な場合において適切な「効果的な」量は、日常的な実験を用いて当業者によって決定可能である。したがって、表現「有効量」は、一般的に活性物質が治療効果を有する量を指す。本発明の場合に、活性物質は、癌の予防、改善または治療剤である。

【0109】

本発明のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、併用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症度を含む様々な要因によって多様に変化することができ、前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、１日０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明による前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化できる。

【0110】

本発明において、前記癌に関する記載は、先に記載されたものと重複し、明細書の過度の複雑性を避けるために、以下、その詳しい記載を省略する。

【0111】

本発明のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療および生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用可能である。

【発明の効果】

【0112】

本発明による遺伝子が欠失したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株は、正常組織ではその生存力が非常に低いが、癌組織では生存しながら癌細胞の死滅を効果的に誘導して、優れた抗癌効果とともにサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株による感染の副作用がないというメリットがある。

【図面の簡単な説明】

【0113】

【図1】ｐＪＨ１８プラスミド作製のための方法を模式図に示したものである。

【図2】ｐＪＨ１８プラスミドを含む組換え菌株間の成長速度をグラフに示す図である。

【図3】菌株間の成長速度をグラフに示す図である。

【図4】サルモネラ菌株のレポータータンパク質の発現確認の結果である。

【図5】培養された菌株においてルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性を測定するためにセレンテラジンを添加してイメージングを示す図である。

【図6】培養された菌株においてルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性をグラフに示す図である。

【図7】菌株の血液寒天に対する溶血活性の程度を確認した結果を示す図である。

【図8】本発明の一実施例による培養液のＡＴＰを測定した結果をグラフに示す図である。

【図9】マウス肝におけるサルモネラ分布度を分析した結果を示す図である。

【図10】マウス腫瘍におけるサルモネラ分布度を分析した結果を示す図である。

【図11】菌株が処理された腫瘍動物モデルの脾臓を摘出する過程を示す図である。

【図12】菌株が処理された腫瘍動物モデルの脾臓の大きさを測定した結果を示す図である。

【図13】菌株が処理された腫瘍動物モデルの脾臓の重量を測定した結果をグラフに示す図である。

【図14】ＣＴ２６を注射した腫瘍動物モデルに、本発明の一実施例であるＣＮＣ１８と対照群であるＰＢＳおよびＳＨＪ２０３７を接種した後、腫瘍の大きさをグラフに示す図である。

【図15】ＣＴ２６を注射した腫瘍動物モデルにおいて各菌株を接種した後、生存率を分析した結果をグラフに示す図である。

【図16】ＭＣ３８を注射した腫瘍動物モデルに、本発明の一実施例であるＣＮＣ１８と対照群であるＰＢＳおよびＳＨＪ２０３７を接種した後、腫瘍の大きさをグラフに示す図である。

【図17】ＭＣ３８を注射した腫瘍動物モデルにおいて各菌株を接種した後、生存率を分析した結果をグラフに示す図である。

【図18】腫瘍動物モデルに菌株注入後、腫瘍内の白血球の比率を測定して比較したものをグラフに示す図である。

【図19】腫瘍動物モデルに菌株注入後、腫瘍内の好中球を測定して比較したものをグラフに示す図である。

【図20】腫瘍動物モデルに菌株注入後、腫瘍内のナチュラルキラー細胞を測定して比較したものをグラフに示す図である。

【図21】腫瘍動物モデルに菌株注入後、腫瘍内のＣＤ８＋ Ｔ細胞を測定して比較したものをグラフに示す図である。

【図22】腫瘍動物モデルに菌株注入後、リンパ節内の樹状細胞を測定して比較したものをグラフに示す図である。

【図23】腫瘍動物モデルに菌株注入後、腫瘍内のＭ２大食細胞を測定して比較したものをグラフに示す図である。

【図24】腫瘍動物モデルに菌株注入後、腫瘍内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌ）を測定して比較したものをグラフに示す図である。

【図25】腫瘍動物モデルにＳＨＪ２０３７ｌｕｘとＣＮＣ１８ｌｕｘ菌株を注入した後、１日目に腫瘍と臓器を摘出して、ｉｎ ｖｉｖｏイメージシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＩＶＩＳ）を用いたイメージを撮影した図である。

【図26】腫瘍動物モデルにＳＨＪ２０３７ｌｕｘとＣＮＣ１８ｌｕｘ菌株を注入した後、３日目に腫瘍と臓器を摘出して、ｉｎ ｖｉｖｏイメージシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＩＶＩＳ）を用いたイメージを撮影した図である。

【図27】腫瘍動物モデルにＳＨＪ２０３７ｌｕｘとＣＮＣ１８ｌｕｘ菌株を注入した後、５日目に腫瘍と臓器を摘出して、ｉｎ ｖｉｖｏイメージシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＩＶＩＳ）を用いたイメージを撮影した図である。

【図28】多発性骨髄腫動物モデルにＳＨＪ２０３７ｌｕｘとＣＮＣ１８ｌｕｘ菌株を注入した後、ｉｎ ｖｉｖｏイメージシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＩＶＩＳ）を用いたイメージを撮影した図である。

【図29】多発性骨髄腫動物モデルにＳＨＪ２０３７ｌｕｘとＣＮＣ１８ｌｕｘ菌株を注入した後、ｉｎ ｖｉｖｏイメージシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＩＶＩＳ）を用いたイメージを撮影した図である。

【発明を実施するための形態】

【0114】

本発明の一実施形態によれば、サルモネラ菌病原性アイランド－１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－１）；およびサルモネラ菌病原性アイランド－２（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ－１；ＳＰＩ－２）；が欠失した、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属変異菌株に関する。

【実施例】

【0115】

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【0116】

［準備例１］弱毒化サルモネラの作製
本発明の弱毒化サルモネラは、ＳＨＪ２０３７菌株をテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）とし、病原性に関連する遺伝子あるいは遺伝子群をラムダファージ（λ ｐｈａｇｅ、ｌａｍｂｄａ ｐｈａｇｅ）を用いた相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）方法で欠如させて弱毒化サルモネラ菌株を作製した。

【0117】

具体的には、ｐＫＤ１３プラスミドを用いて各遺伝子のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の位置にＫａｎカセットを保有したＤＮＡ片をＰＣＲ増幅した。計３個の遺伝子（群）の除去に用いられたＰＣＲプライマー配列は下記表１の通りである。ＰＣＲ生成物であるｐＫＤ４６を細胞内に含んでいるサルモネラチフィムリウムＳＭＲ２１３０（ＳＨＪ２０３７、ＤｒｅｌＡ、ＤｓｐｏＴ）懸濁液に電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）方法により導入し、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）培地に培養してコロニーを選別した。以後、形質転換された菌株にｐＣＰ２０プラスミド（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＫＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ．２０００，６；９７（１２）：６６４０－５）を電気穿孔を用いて導入し、ＦＬＰ組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）によりｋａｎカセットを除去して菌株を作製した。

【0118】

【表1】

【0119】

［準備例２］遺伝子発現のための組換えサルモネラの作製
図１は、ｐＪＨ１８プラスミド作製のための方法を模式図に示したものである。ｐＪＬ３９プラスミド（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２１（１１），ｐ．１９８５－１９９５，（２０１３））を鋳型鎖として、制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を含むように作製された正方向プライマー（５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＡＧ－３’；配列番号９）および制限酵素ＰｖｕＩＩ－ＸｂａＩ部位を含むように作製された逆方向プライマー（５’－ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＧＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴ－３’；配列番号１０）を用いてｔｅｔＲ遺伝子を増幅した。以後、前記増幅産物に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを入れて切断し、これを精製して、ｔｅｔＲ遺伝子増幅産物を得た後に、これをｐＢＡＤ２４（カタログ番号、ＡＴＣＣ（登録商標）８７３９９、ＡＴＣＣ、米国）プラスミドに導入する過程によりｐＢＡＤ－ＴｅｔＲプラスミドを作製した。

【0120】

その後、前記ｐＪＬ３９プラスミドのＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を介して、多重クローニングサイトを含むダイバージェント（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）プロモーター領域を前記ｐＢＡＤ－ＴｅｔＲプラスミドに導入してｐＴｅｔＲ－ＢＡＤプラスミドを作製した。ＮｈｅＩおよびＰｃｉｌ制限酵素を用いて前記ｐＴｅｔＲ－ＢＡＤプラスミドからａｒａＣおよびａｒａＢＡＤプロモーターを除去して、ｐＴｅｔＩＩプラスミドを作製した。

【0121】

また、ｐＳＦ－ＯＸＢ１（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を鋳型として、正方向プライマー（５’－ＣＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＣＴ－３’；配列番号１１）および逆方向プライマー（５’－ＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＧＡＡＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＧ－３’；配列番号１２）で増幅された恒常的プロモーターであるＯＸＢ１を、ギブソンアセンブリ方式を用いて前記ｐＴｅｔＩＩプラスミドに導入することにより、最終的にＯＸＢ１、ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲプロモーターを含むｐＪＨ１８プラスミドを作製した。

【0122】

前記ｐＪＨ１８プラスミドをテンプレートとして、Ｒｌｕｃ８およびサイトリシンＡ（ＣｌｙＡ）を暗号化する遺伝子を、前記プロモーターの下流に図１のような組み合わせで導入する過程によりｐＪＨ１８－ＣＲプラスミドを作製した。この時、前記サイトリシンＡ（ＣｌｙＡ）遺伝子を導入するために用いられる正方向プライマーは５’－ＡＧＴＣＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＡＣＣＧＧＡＡＴＡＴＴＴＧＣ－３’（配列番号１３）であり、逆方向プライマーは５’－ＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＡＡＣＣＴＣ－３’（配列番号１４）である。

【0123】

［準備例３］形質転換されたサルモネラ属変異菌株の作製
前記準備例１で作製したサルモネラ菌株に、前記準備例２で作製したプラスミドを電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて形質転換した後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢ固体培地を用いて前記形質転換されたそれぞれの菌株を一晩培養した。その後、生成されたコロニーをアンピシリンが含まれたＬＢ液体培地に培養して実験に使用した。このように作製されたサルモネラ属変異菌株における形質転換された内容をまとめると下記表２の通りである。

【0124】

【表2】

【0125】

［実験例１］組換えサルモネラのタンパク質の発現および活性評価
［１－１］サルモネラ変異体菌株と既存の菌株との成長比較
前記比較例１および製造例で作製された組換えＳＨＪ２０３７、ＣＮＣ１８コロニーをアンピシリンが含まれたＬＢ液体培地に一晩培養した後、新しいＬＢ培地を用いて１：１００の比率で希釈し、追加培養によりＯＤ_６００値が０．５～０．７に到達する時、前記培養液に最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌとなるようにエタノールで希釈されたドキシサイクリンを添加し、２００ｒｐｍおよび３７℃の条件で振盪培養器で培養した。培養時間によりＯＤ_６００値を測定して菌株の成長パターンを分析して、その結果を図２に示した。

【0126】

一方、組換えされていない既存のサルモネラコロニーを同様の方式で処理して、その結果を図３に示した。

【0127】

図２および３に示すように、ＣＮＣ１８組換えサルモネラは、既存の弱毒化サルモネラであるＳＨＪ２０３７および野生型サルモネラ菌株と成長速度の差がほとんどなく、ドキシサイクリンを用いたタンパク質の発現中にも特別な成長阻害を有していなかった。したがって、前記のように作製されたサルモネラ菌株の病原性遺伝子の欠如がサルモネラ菌株の成長および遺伝子の発現に影響を及ぼさないことを確認した。

【0128】

［１－２］ウェスタンブロット分析によるタンパク質の発現レベルの比較
前記比較例１および製造例で作製された組換えＳＨＪ２０３７、ＣＮＣ１８サルモネラ菌株間のサイトリシンＡ（ＣｌｙＡ）遺伝子の発現レベルを評価するために、前記実験例［１－１］のように培養された菌株で発現したＲｌｕｃ８タンパク質を特異的な抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。

【0129】

具体的には、前記実験例［１－１］の菌株の培養液を４×１０^７ＣＦＵ／ｍｌとなるようにＰＢＳを用いて希釈し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットを収集した。前記ペレット分画をＰＢＳを用いて洗浄し、０．２％β－メルカプトエタノール（β－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（カタログ番号：ＥＢＡ－１０５２、ＥＬＰＩＳ ＢＩＯＴＥＣＨ）が含まれたＳＤＳサンプル緩衝液と混合して菌株溶解物を得た。その後、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで前記菌株溶解物を電気泳動し、前記ゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を移した後、５％脱脂乳を用いて常温でブロッキングした。以後、Ｒｌｕｃ８抗体（カタログ番号：ＡＢ３２５６、ミリポア、米国）を用いてＲｌｕｃ８タンパク質の発現レベルを確認し、その結果を図４に示した。

【0130】

図４に示すように、２つの組換えＳＨＪ２０３７、ＣＮＣ１８サルモネラ菌株はＲｌｕｃ８遺伝子を過発現し、菌株間の発現レベルは大きな差がないことを確認した。

【0131】

［１－３］タンパク質の活性分析による機能的発現レベルの比較
前記実験例［１－１］のように培養された菌株においてルシフェラーゼ活性の測定のために、図５のように前記菌株を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。その後、前記再懸濁された菌株に、基質であるエタノールで希釈された１μｇ／ｍｌのセレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）を添加した後、ＮｉｇｈｔＯＷＬ ＩＩ ＬＢ ９８３ Ｉｎ Ｖｉｖｏイメージシステム（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、ドイツ）またはバイオラッドイメージャーＣｈｅｍｏＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋システムを用いて１秒露出時間の条件でルシフェラーゼ活性値を測定した。このように測定された値は各菌株のＣＦＵによる標準化を行い、相対的発光ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｉｔｓ；ＲＬＵ）で計算して、その結果を図６に示した。

【0132】

図６に示すように、ルシフェラーゼ活性値はドキシサイクリンが存在する場合でのみ確認され、誘導体敏感度と活性最大値が類似することを確認した。

【0133】

また、ＰＢＳで希釈された前記準備例３によって選別された組換えサルモネラ菌株を０または２０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンが含まれた血液寒天プレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した後、プレート写真を撮影して、その結果を図７に示した。

【0134】

図７に示すように、菌株の血液寒天の溶血活性は、サイトリシンＡを暗号化する遺伝子のドキシサイクリンが含まれた場合（＋）でのみ現れることを確認した。

【0135】

前記の結果により、本発明による組換えＣＮＣ１８サルモネラ菌株は、サイトリシンＡ（ＣｌｙＡ）遺伝子の発現を調節することができ、抗癌遺伝子伝達体として機能を有することを確認した。

【0136】

［実験例２］組換えサルモネラ処理による腫瘍細胞のＤＡＭＰシグナル（ｓｉｇｎａｌ）分泌の確認
組換えサルモネラ菌株が腫瘍細胞に及ぼす影響を確認するために、ＳＨＪ２０３７およびＣＮＣ１８菌株が処理された腫瘍細胞で免疫反応を起こしうる損傷関連分子類型（Ｄａｍａｇｅ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｔｅｒｎ；ＤＡＭＰ）の変化を確認した。ＤＡＭＰ中にて細胞外分泌をするＡＴＰを測定した。具体的には、マウスのＣＴ２６結腸癌細胞株であるＣＲＬ－２６３８およびＨＢ－８０６４（ＡＴＣＣ、米国）を１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）および１％のペニシリン－ストレプトマイシンが含まれた高ブドウ糖ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地（カタログ番号：＃ＬＭ ００１－０５、ウェルジーン、韓国）を用いて、５％ＣＯ_２培養器で３７℃の条件で培養した後、組換えサルモネラを腫瘍細胞に処理して共同培養した。培養液を時間によりアッセイキット（ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を用いてＡＴＰを測定して、その結果を図８に示した。

【0137】

図８に示すように、腫瘍細胞で分泌したＡＴＰ値はサルモネラを処理した場合に増加し、本発明によるサルモネラ菌株自体が腫瘍の治療に利用できることを確認した。

【0138】

［実験例３］小動物腫瘍モデルにおける組換えサルモネラの分布度分析
抗癌治療のために研究で使用される小動物であるマウスモデルに弱毒化サルモネラ菌株を注入した時、宿主内菌株の増殖速度と分布を確認した。

【0139】

具体的には、４種のＳＨＪ２０３７、ＣＮＣ１６、ＣＮＣ１７、そしてＣＮＣ１８菌株をそれぞれＬＢ液体培地に培養後、ＰＢＳで洗浄および希釈した。前記それぞれの菌株を最終菌株濃度が２×１０^７ＣＦＵ／マウスとなるようにマウスの尾静脈に注入し、菌株あたり３匹ずつのマウスを安楽死させた後、宿主の臓器を摘出して破砕および希釈してＬＢ固体培地に塗抹培養して生菌数を測定し、その結果を図９に示した。また、腫瘍を含むマウスを同様の方法で処理して、宿主の腫瘍を摘出して破砕および希釈してＬＢ固体培地に塗抹培養して生菌数を測定し、その結果を図１０に示した。

【0140】

その結果、図９および１０に示すように、ＣＮＣ１８菌株は肝で非常に低い生存力を示して急速に死滅するが、腫瘍には残存して特異的かつ選択的な標的能力を有することを確認した。

【0141】

これに対し、ＣＮＣ１６菌株は、図９に示すように、肝でＳＨＪ２０３７菌株より高い生存力を有し、ＣＮＣ１８より１００倍以上高い生存力を有することを確認した。すなわち、ＣＮＣ１６菌株は、腫瘍以外の他の臓器でも非特異的な標的能力を有することを確認した。

【0142】

また、ＣＮＣ１７も、肝でＳＨＪ２０３７菌株より高い生存力を示した。すなわち、ＣＮＣ１７菌株も、非特異的な標的能力を有することを確認した。

【0143】

図１０に示すように、腫瘍においてＣＮＣ１７菌株はＣＮＣ１８菌株に比べて１０倍以上低い生存力を有する。すなわち、ＣＮＣ１７菌株は、腫瘍に対してＣＮＣ１８菌株に比べて低い効果を有することを確認した。

【0144】

［実験例４］サルモネラの注入による過炎症反応分析（１）
１次的にサルモネラの注入による過炎症反応を確認するために、ＣＴ２６腫瘍モデルマウス９匹にＳＨＪ２０３７およびＣＮＣ１８菌株およびＰＢＳをそれぞれ３匹ずつ注入した後、時間によるマウスそれぞれに対する脾臓の重量を測定して比較した。図１１のように、マウスを開腹し、脾臓を摘出して、各マウスごとに脾臓の大きさを測定して、その結果を図１２に示した。

【0145】

図１２に示すように、菌株処理群は、ＰＢＳを処理した対照群に比べて脾臓の大きさが増加したが、ＣＮＣ１８菌株処理群はＳＨＪ２０３７菌株処理群に比べて脾臓の大きさが小さいことが分かり、本発明によるサルモネラ菌株が過炎症反応を最小化することを確認した。

【0146】

［実験例５］サルモネラの注入による過炎症反応分析（２）
追加的に、サルモネラの注入による過炎症反応を確認するために、実験例４と同様の方法でＳＨＪ２０３７、ＣＮＣ１６、ＣＮＣ１７、およびＣＮＣ１８菌株ごとにマウスにそれぞれ注入した後、１、３、５日目に脾臓の重量を測定して比較した。

【0147】

その結果、図１３に示すように、ＳＨＪ２０３７、ＣＮＣ１６、ＣＮＣ１７菌株処理群は、ＰＢＳを処理した対照群に比べて脾臓の重量が増加したが、ＣＮＣ１８は、菌株処理群のうち最も増加幅が少なかった。

【0148】

前記結果により、本発明による弱毒化サルモネラ菌株は、腫瘍に強い標的能力を維持しながら感染初期からすべての正常臓器で生存力が大きく減少して急速に死滅することにより、宿主に菌株による副作用を最小化することを確認した。

【0149】

［実験例６］小動物腫瘍モデルにおける弱毒化サルモネラの抗癌効果の分析（１）
前記実験例２のように培養された腫瘍細胞（ＣＴ２６ １×１０^６ ｃｅｌｌ／ｍｉｃｅ）をマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、ｎ＝７）の脇腹に皮下注射して、腫瘍動物モデルを構築した。このモデルにＳＨＪ２０３７とＣＮＣ１８サルモネラ菌株を尾静脈に注入した。腫瘍動物モデルの抗癌効果を評価するために、２％イソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を用いて麻酔した後、腫瘍の大きさ（ｍｍ^３）を（長さ×高さ×幅）／２を用いて測定し、その結果を図１４および１５に示した。

【0150】

図１４および１５に示すように、対照群と比較して、サルモネラ処理群が癌成長を阻害し、生存率が増加することを確認した。特に、ＣＮＣ１８菌株は、ＳＨＪ２０３７より腫瘍成長抑制効果が著しく優れていることを確認した。

【0151】

したがって、腫瘍に強い標的能力を維持しながら感染初期からすべての正常臓器で生存力が大きく減少して急速に死滅するＣＮＣ１８菌株は、宿主内感染による副作用を最小化しながら優れた腫瘍治療効能を有することを確認した。

【0152】

［実験例７］小動物腫瘍モデルにおける弱毒化サルモネラの抗癌効果の分析（２）
培養された腫瘍細胞（ＭＣ３８、マウス結腸腺癌細胞、１×１０^６ ｃｅｌｌ／ｍｉｃｅ）をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、ｎ＝６）の脇腹に皮下注射して、腫瘍動物モデルを構築した。このモデルにＳＨＪ２０３７とＣＮＣ１８サルモネラ菌株を尾静脈に注入した。腫瘍動物モデルの抗癌効果を評価するために、２％イソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を用いて麻酔した後、腫瘍の大きさ（ｍｍ^３）を（長さ×高さ×幅）／２を用いて測定し、その結果を図１６および１７に示した。

【0153】

図１６および１７に示すように、対照群と比較して、サルモネラ処理群が癌成長を阻害し、生存率が増加することを確認した。特に、ＣＮＣ１８菌株は、ＳＨＪ２０３７よりも腫瘍成長を抑制することを確認した。

【0154】

［実験例８］サルモネラの注入による免疫活性化効果の確認
サルモネラの注入による免疫活性化効果を確認するために、免疫細胞を測定して比較した。前記実験例６のように構築された腫瘍動物モデルにＳＨＪ２０３７とＣＮＣ１８サルモネラ菌株を注入し、３日目に免疫細胞を採取した。免疫細胞は腫瘍および腫瘍周囲のリンパ節から採取した。採取された前記免疫細胞の量を測定した後、その結果を図１８～２４の通りに示した。

【0155】

図１８～２２に示すように、ＣＮＣ１８菌株処理群がＰＢＳ対照群およびＳＨＪ２０３７対照群に比べて白血球、好中球、ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の比重が増加し、リンパ節での樹状細胞も増加した。これに対し、図２３および２４に示すように、ＣＮＣ１８菌株処理群がＰＢＳ対照群およびＳＨＪ２０３７対照群に比べて免疫抑制作用をするＭ２大食細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌ）は減少した。

【0156】

前記結果により、本発明によるＣＮＣ１８弱毒化サルモネラ菌株は、ＰＢＳ対照群およびＳＨＪ２０３７対照群に比べて免疫機能を大きく上昇させる効果を確認した。

【0157】

［実験例９］サルモネラによる腫瘍の映像化分析（１）
前記実験例２のように培養された腫瘍細胞をマウスの脇腹に皮下注射して、腫瘍動物モデルを構築した。このモデルにＳＨＪ２０３７ｌｕｘとＣＮＣ１８ｌｕｘサルモネラ菌株を注入した。ここで、前記ＳＨＪ２０３７ｌｕｘとＣＮＣ１８ｌｕｘ菌株は、ＳＨＪ２０３７菌株とＣＮＣ１８菌株に発光遺伝子を導入した菌株である。前記発光遺伝子は、バクテリアルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｘ）を使用した。

【0158】

腫瘍動物モデルにおける菌株の映像化効果を評価するために、インビボイメージシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＩＶＩＳ）を用いて時間ごとに臓器および腫瘍を摘出した後、イメージを撮影し、その結果を図２５～２７に示した。

【0159】

図２５～２７に示すように、ＳＨＪ２０３７ｌｕｘ菌株のように、ＣＮＣ１８ｌｕｘ菌株を注入した場合、腫瘍に特異的かつ選択的に生存能力を示し、リアルタイムに映像化できることを確認した。

【0160】

［実験例１０］サルモネラによる腫瘍の映像化分析（２）
培養されたＭＯＰＣ細胞をマウスの脛骨に注射して多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）モデルを構築した後、実験例９と同じく、ＳＨＪ２０３７ｌｕｘとＣＮＣ１８ｌｕｘサルモネラ菌株を注入した。次に、ｉｎ ｖｉｖｏイメージシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＩＶＩＳ）を用いて時間ごとにイメージを撮影し、その結果を図２８および２９に示した。

【0161】

図２８および２９に示すように、ＣＮＣ１８ｌｕｘ菌株を注入した場合、腫瘍に特異的かつ選択的に生存能力を示し、リアルタイムに映像化できることを確認した。特に、腫瘍周辺部に残留してイメージシグナルが分散したＳＨＪ２０３７ｌｕｘとは異なり、ＣＮＣ１８ｌｕｘ菌株の場合、腫瘍深部まで到達してより明確な映像をリアルタイムに確認することができた。

【0162】

前記実験例１～１０から分かるように、ＣＮＣ１８菌株は、腫瘍に強い標的能力を維持しながら感染初期からすべての正常臓器で生存力が大きく減少して急速に死滅するＣＮＣ１８菌株は、宿主内感染による副作用を最小化しながら優れた腫瘍治療効能を有することを確認した。

【0163】

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるわけではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によって定義される。

【産業上の利用可能性】

【0164】

本発明は、癌に選択的に作用するサルモネラ菌株およびこれを含む癌の予防または治療用組成物に関する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【配列表】

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【国際調査報告】