特表 2023-542280 ３Ｄ細胞培養コロイドのセットとその３Ｄ細胞培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-06

(54)【発明の名称】３Ｄ細胞培養コロイドのセットとその３Ｄ細胞培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20230929BHJP

【ＦＩ】

C12N5/07

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023514014

(86)(22)【出願日】2020-08-26

(85)【翻訳文提出日】2023-03-20

(86)【国際出願番号】 CN2020111261

(87)【国際公開番号】W WO2022040959

(87)【国際公開日】2022-03-03

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523068868

【氏名又は名称】基可生医股▲分▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100082418

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 朔生

(74)【代理人】

【識別番号】100167601

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 信之

(74)【代理人】

【識別番号】100201329

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 真二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100220917

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 忠大

(72)【発明者】

【氏名】呉侑峻

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼静▲ウェン▼

(72)【発明者】

【氏名】林威宇

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BB02

4B065BB38

4B065BC41

4B065BC47

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】３Ｄ細胞培養コロイドのセットとその３Ｄ細胞培養方法を提供する。
【解決手段】３Ｄ細胞培養コロイドのセットは、Ａゲル材料と、Ｃ緩衝液と、Ｄ緩衝液と、を含む。３Ｄ細胞培養方法は、Ａゲル材料を含む混合液に細胞を添加し、低温で作用させた後に細胞を含むコロイドを獲得し、コロイドにＣ緩衝液を添加して架橋を行い、Ｃ緩衝液を除去すると共に成長培地を添加し、コロイド内にスフェロイドが形成されるまで細胞を静置して培養するステップを含む。また、本発明はＤ緩衝液によりコロイドをさらに溶解し、培養後の細胞を取り出して分析する。よって、本発明の３Ｄ細胞培養コロイドのセットは、使用が便利であり、多種類の細胞株の３Ｄ細胞培養に適用できる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

０．５～３重量％のアルギン酸ナトリウムと、２．５～１５重量％のゼラチンと、０．５～２重量％のＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含むＡゲル材料と、
０．２～１０重量％の二価カチオン塩類と、０．０１～１重量％の前記ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含むＣ緩衝液と、
１～１０重量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウムと、０．１～１重量％の水酸化ナトリウムと、０．０５～１重量％の前記ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含むＤ緩衝液と、を備えていることを特徴とする、
３Ｄ細胞培養コロイドのセット。

【請求項2】

前記Ｃ緩衝液の二価カチオン塩類は、塩化ストロンチウム、リン酸カルシウム、塩化カルシウム、及び硫酸カルシウムのうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の３Ｄ細胞培養コロイドのセット。

【請求項3】

前記ＨＥＰＥＳ緩衝液は０．５～３ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液であることを特徴とする請求項１に記載の３Ｄ細胞培養コロイドのセット。

【請求項4】

熱伝導シートを更に備えていることを特徴とする請求項１に記載の３Ｄ細胞培養コロイドのセット。

【請求項5】

請求項１に記載のセットを使用する３Ｄ細胞培養方法であって、
細胞懸濁液を獲得するように細胞を成長培地中に懸濁させ、前記細胞懸濁液とＡゲル材料とを体積比１：１の比率で混合し、混合溶液を獲得するステップ（ａ）と、
培養プレートを低温部材に載置し、且つ前記培養プレートの各穴に前記混合溶液を添加し、１～７分間静置してコロイドを形成するステップ（ｂ）と、
前記コロイドにＣ緩衝液を添加し、１０～２０分間静置して架橋を行うステップ（ｃ）と、
前記Ｃ緩衝液を前記成長培地に置換するステップ（ｄ）と、
前記コロイド内で前記細胞がスフェロイドを形成するまで前記培養プレートを必要な温度で培養するように載置し、前記培養プレートは前記成長培地を毎日１回交換するステップ（ｅ）と、を含むことを特徴とする、
３Ｄ細胞培養方法。

【請求項6】

前記Ａゲル材料は０．５～２重量％のアルギン酸ナトリウムと、２．５～１５重量％のゼラチンと、０．５～２重量％のＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含み、且つ前記Ｃ緩衝液は、０．２～１０重量％の二価カチオン塩類と、０．０１～１重量％の前記ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含むことを特徴とする請求項５に記載の３Ｄ細胞培養方法。

【請求項7】

前記ステップ（ｅ）の後に、リン酸緩衝液を使用して前記スフェロイドを洗浄し、リン酸緩衝液を除去した後、Ｄ緩衝液を添加して前記スフェロイドと均一に混合し、且つ室温で５分間作用させて前記コロイドを溶解するステップ（ｆ）をさらに実行し、前記Ｄ緩衝液は、１～１０重量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウムと、０．１～１重量％の水酸化ナトリウムと、０．０５～１重量％の前記ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含むことを特徴とする請求項５に記載の３Ｄ細胞培養方法。

【請求項8】

前記ステップ（ｆ）の後に、前記リン酸緩衝液を使用して溶解後の前記コロイドを洗浄し、遠心分離した後に上澄み液を除去し、細胞沈殿物を収集すると共に前記細胞沈殿物中の細胞を分析するステップ（ｇ）をさらに実行することを特徴とする請求項７に記載の３Ｄ細胞培養方法。

【請求項9】

前記ステップ（ｂ）の前記低温素子は、熱伝導シートを低温部材に載置して冷却することで獲得し、且つ前記必要な温度は３０～３７℃であり、前記混合溶液の細胞密度は１０^４～１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることを特徴とする請求項５に記載の３Ｄ細胞培養方法。

【請求項10】

前記Ｃ緩衝液の二価カチオン塩類は、塩化ストロンチウム、リン酸カルシウム、塩化カルシウム、及び硫酸カルシウムのうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求項６に記載の３Ｄ細胞培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、３Ｄ細胞培養コロイドのセットとその３Ｄ細胞培養方法に関し、特に、本発明のセットは使用が便利であり、且つ多種類の細胞株の３Ｄ細胞培養に適用する。

【背景技術】

【0002】

体外で細胞を培養する技術はすでに相当成熟している。このため、現在の生物の研究において、細胞株が研究に常用されている。現在の細胞株の培養方法の多くは２Ｄの細胞培養法であり、細胞株を培養プレートの底部で平面的に培養する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】中国特許出願公開第１０５６９５４１３（Ｂ）号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、生物体内において、大多数の細胞の生長環境は立体的な環境であるため、２Ｄの細胞培養状態は、生物体内において細胞が生長する状態とは相当に大きな差がある。生物体内での細胞の生長状況をシミュレートするため、立体培地中で細胞を培養する３Ｄ細胞培養が現在研究、開発されており、従来の特許文献では、例えば、下記特許文献１には「腫瘍の個別化医療のための三次元細胞培養材料およびその調製方法」が開示されている。これはマトリゲル、低粘度アルギン酸ナトリウム溶液、ヒアルロン酸ナトリウム溶液、及び中粘度アルギン酸ナトリウム溶液等の材料を細胞の培地のマトリックスとして使用し、三次元細胞培養を行う。但し、従来の３Ｄ細胞培養に使用する立体培地の多くはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を材料として使用しており、その調製方法は繁雑であり、成分が複雑であり、コロイドの形成及び濃度の制御が難しく、ゲル化温度が低く、室温で操作する場合、凝固して操作が失敗し易かった。また、マトリゲルを調製する立体培地のコストは非常に高く、現在のところ、３Ｄ細胞培養は容易とは言えない。

【0005】

そこで、本発明者は上記の、３Ｄ細胞を培養するための材料とその方法を実際に使用するには、不足があるという欠点が改善可能と考え、鋭意検討を重ねた結果、合理的設計で上記の課題を効果的に改善する本発明の提案に至った。

【0006】

本発明は、上記問題点に鑑みて本発明者の鋭意研究により成されたものであり、その目的は、３Ｄ細胞培養コロイドのセットとその３Ｄ細胞培養方法を提供することにある。３Ｄ細胞培養コロイドのセットは、Ａゲル材料と、Ｃ緩衝液と、Ｄ緩衝液と、を備えている。Ａゲル材料は０．５～３重量％のアルギン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ａｌｇｉｎａｔｅ）と、２．５～１５重量％のゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）と、０．５～２重量％のＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含む。Ｃ緩衝液は、０．２～１０重量％の二価カチオン塩類と、０．０１～１重量％の前記ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含む。Ｄ緩衝液は、１～１０重量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ・２Ｈ_２Ｏ）と、０．１～１重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）と、０．０５～１重量％の前記ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含む。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決するために、本発明は３Ｄ細胞培養コロイドのセットにより３Ｄ細胞培養方法を実行し、これは、細胞懸濁液を獲得するように細胞を成長培地中に懸濁し、前記細胞懸濁液とＡゲル材料とを体積比１：１の比率で混合し、混合溶液を獲得するステップ（ａ）と、培養プレートを低温部材に載置し、且つ前記培養プレートの培養穴中に前記混合溶液を添加し、１～７分間静置してコロイドを形成するステップ（ｂ）と、前記コロイドにＣ緩衝液を添加し、１０～２０分間静置して架橋を行うステップ（ｃ）と、Ｃ緩衝液を細胞の成長培地に置換するステップ（ｄ）と、コロイド内で前記細胞がスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成するまで培養プレートを必要な温度で培養するように載置し、培養プレートは成長培地を毎日１回交換するステップ（ｅ）と、を含む。

【0008】

本発明の好適例において、Ｃ緩衝液の二価カチオン塩類は、塩化ストロンチウム、リン酸カルシウム、塩化カルシウム、及び硫酸カルシウムのうちの少なくとも１つである。

【0009】

本発明の好適例において、ＨＥＰＥＳ緩衝液は０．５～３ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液である。

【0010】

本発明の好適例において、本発明に係る３Ｄ細胞培養コロイドのセットは熱伝導シート（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｓｈｅｅｔ）を更に備えている。

【0011】

本発明の好適例において、ステップ（ｅ）の後に、リン酸緩衝液（１×ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ）を使用して前記スフェロイドを洗浄し、リン酸緩衝液を除去した後、Ｄ緩衝液を添加して前記スフェロイドと均一に混合し、且つ室温で５分間作用させてコロイドを溶解するステップ（ｆ）をさらに実行する。Ｄ緩衝液は、１～１０重量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ・２Ｈ_２Ｏ）と、０．１～１重量％の水酸化ナトリウムと、０．０５～１重量％の前記ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含む。

【0012】

本発明の好適例において、ステップ（ｆ）の後に、前記リン酸緩衝液を使用して溶解後の前記コロイド溶液を洗浄し、遠心分離した後に上澄み液を除去し、細胞沈殿物を収集すると共に前記細胞沈殿物中の細胞を分析するステップ（ｇ）をさらに実行する。

【0013】

本発明の好適例において、ステップ（ｂ）の前記低温部材は、低温装置に載置して冷却することで獲得する熱伝導シートである。

【0014】

本発明の好適例において、前記細胞の培養に必要な温度は３０～３７℃である。

【0015】

本発明の好適例において、混合溶液の細胞密度は１０^４～１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。

【発明の効果】

【0016】

本発明は、以上説明したように構成されているので、以下に記載されるような効果を奏する。
以上述べた如く、本発明の３Ｄ細胞培養コロイドのセットは、使用が非常に便利であり、且つ多種類の細胞株の３Ｄ細胞培養に適用できる。また、本発明は細胞コロイドを溶解するＤ緩衝液を含むため、培養後に後続の細胞の分析を行うのにも十分に便利である。

【0017】

本発明の他の目的、構成及び効果については、以下の発明の実施の形態の項から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明の一実施例に係る３Ｄ細胞培養方法を行う概略フローチャートである。

【図2】本発明の一実施例の培養細胞のコロイドを溶解して細胞を分析する方法の概略フローチャートである。

【図3】本発明による細胞培養後を示す生存率試験チャートである。

【図4A】マトリックスゲルにより３Ｄ 細胞培養を行った顕微鏡写真である。

【図4B】本発明のキットを使用して３Ｄ細胞培養を行った顕微鏡写真である。

【図5】本発明の培養細胞により形成した細胞スフェロイドを示す顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。

【0020】

本発明に係る３Ｄ細胞培養コロイドのセットとその３Ｄ細胞培養方法は、使用が便利であり、多種類の細胞株の３Ｄ細胞培養に適用できる。また、本発明はコロイドを溶解する緩衝液を含むため、後続の細胞分析を行うのも非常に便利である。

【0021】

本発明に係る３Ｄ細胞培養コロイドのセットは主に、Ａゲル材料と、Ｃ緩衝液と、Ｄ緩衝液と、を備えている。本発明のセットは熱伝導シート（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｓｈｅｅｔ）のような低温部材をさらに含み、３Ｄ細胞培養を行う過程において、コロイドの形成を助ける。

【0022】

本発明に係る３Ｄ細胞培養コロイドのセットのＡゲル材料は、アルギン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ａｌｇｉｎａｔｅ）と、ゼラチンと、ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含む。

【0023】

また、Ｃ緩衝液は、塩化ストロンチウム（Ｓｔｒｏｎｔｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ・６Ｈ_２Ｏ）のような０．２～１０重量％の二価カチオン塩類、リン酸カルシウム、塩化カルシウム、或いは硫酸カルシウムと、０．０１～１重量％の前記ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含む。本発明の好ましい実施形態では、Ｃ緩衝液は、０．５重量％の塩化ストロンチウムと、０．０９４重量％の１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含む。使用を便利にするため、Ｃ緩衝液を高濃度の濃縮型Ｃ緩衝液として調製し、例えば、１０倍濃縮したＣ緩衝液として調製し、使用時に再度希釈する。以下の実施例において、Ｃ緩衝液中に二価カチオン塩類として塩化ストロンチウムを添加して試験を行う。

【0024】

また、Ｄ緩衝液は、１～１０重量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ・２Ｈ_２Ｏ）と、０．１～１重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）と、０．０５～１重量％の前記ＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含む。本発明の好ましい実施形態では、Ｄ緩衝液は、１．５３重量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウムと、０．１６４重量％の水酸化ナトリウムと、０．０８２重量％の１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液と、余剰のパーセンテージの純水と、を含む。使用を便利にするため、Ｄ緩衝液を高濃度の濃縮型Ｄ緩衝液として調製し、例えば、１０倍の濃度のＤ緩衝液として調製し、使用時に再度希釈する。

【0025】

細胞の培養を開始する前に、まず、以下の使用する材料を準備する。Ａゲル材料を３７℃の水槽中に約１０分間載置し、徹底的に溶解する。次いで、Ｃ緩衝液の１０倍の濃縮液を、無血清（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ）の細胞培養液で１倍のＣ緩衝液に希釈する。ちなみに、このステップでは１×ＰＢＳ緩衝液を使用してＣ緩衝液の１０倍の濃縮液を希釈することはできない。また、１×ＰＢＳ緩衝液により、Ｄ緩衝液の１０倍の濃縮液を希釈し、１倍のＤ緩衝液を獲得する。なお、１倍のＣ緩衝液と１倍のＤ緩衝液は共に使用前に希釈する。

【0026】

以下に図１を参照しながら本発明の３Ｄ細胞培養コロイドのセットを用いた細胞培養方法について詳述する。
ステップ（ａ）では、０．５ｍＬのＡゲル材料（１）を試験管に注入し、次いで、培養する細胞を成長培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁し、細胞懸濁液を獲得する。０．５ｍＬの細胞懸濁液を０．５ｍＬのＡゲル材料（１）を含む試験管に添加し、Ａゲル材料（１）と十分に混合し、混合溶液（２）を獲得する。この混合溶液（２）中の細胞密度は、培養する細胞を考慮して適切に調整する。例えば、貼着型の細胞株の場合、培養する細胞は培養プレートの８０％に達する密度が好ましく、且つ細胞密度は１０^４～１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが常用される。この実施例の混合溶液（２）の細胞密度は１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。
ステップ（ｂ）では、熱伝導シート（３）を低温装置（４）に載置し、熱伝導シート（３）を迅速且つ均一に冷却する。熱伝導シート（３）は金属片であるが、これに限られず、且つこの低温装置（４）は氷塊や再使用可能なアイスバッグ等の物品であるが、これらに限られない。次いで、冷却が完了した熱伝導シート（３）に培養プレート（５）を載置し、且つ前記培養プレート（５）の培養穴に２０～５０μＬの混合溶液（２）を添加し、１～７分間静置してコロイド（６）を形成する。コロイド（６）を形成するためには、マイクロピペットのチップによりコロイド（６）の表面に優しく接触し、コロイド（６）が既に形成されている場合、チップをコロイド（６）の表面から離す際に、コロイド（６）の表面が外に向けて引っ張られないようにする。
ステップ（ｃ）では、コロイドの形成後に、コロイド（６）に１ｍＬの冷却した温度約４℃の１倍のＣ緩衝液（７）を添加し、且つＣ緩衝液（７）によりコロイド（６）を被覆し、１０～２０分間静置して架橋を行う。この実施例では１５分間静置する。
ステップ（ｄ）では、１倍のＣ緩衝液（７）を慎重に除去し、この細胞の培養に用いる成長培地（８）に添加する。
ステップ（ｅ）では、コロイド（６）内で細胞がスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成するまで培養プレート（５）を培養に必要な温度条件で載置し、成長培地（８）は毎日１回交換する。ステップ（ｅ）の前記必要な温度とは、前記細胞を培養するのに好適な温度を指し、哺乳類動物の細胞を培養する場合、３７℃が常用される培養温度である。また、培養時間も細胞の種類に応じて決定し、一般的には、３～１４日間培養した後、コロイド（６）内の細胞が形成するスフェロイドを観察可能になる。

【0027】

さらに、細胞が成長した後、コロイド（６）内の細胞を取り出して後続の観察分析を行う場合、ステップ（ｅ）の後に、ステップ（ｆ）及びステップ（ｇ） をさらに実行する。以下に図２を参照しながらステップ（ｆ）及びステップ（ｇ）について詳述する。
ステップ（ｆ）では、培養プレート（５）内の成長培地（８）を除去し、冷却した温度約４℃のリン酸緩衝液（９）を使用し、例えば、１×ＰＢＳ緩衝液によりコロイド（６）を慎重に洗浄した後、リン酸緩衝液（９）を除去する。この洗浄ステップを少なくとも１回実行する。次いで、冷却した温度約４℃のＤ緩衝液（１０）を添加し、Ｄ緩衝液（１０）とコロイド（６）とを均一に混合し、且つ室温で約５分間以上作用させてコロイド（６）を溶解する。
ステップ（ｇ）では、溶解後のコロイドと細胞との混合液を培養プレート（５）内から取り出し、遠心管（１１）に移し入れ、リン酸緩衝液（９）を添加して溶解後のコロイドと細胞との混合液を洗浄する。次いで、細胞を傷付けない回転速度で遠心分離ステップを実行し、例えば、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上澄み液を除去し、細胞沈殿物（１２）を収集する。

【0028】

単体の細胞を獲得してさらに分析を行う場合、トリプシンＥＤＴＡ溶液（ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液）を使用して細胞沈殿物（１２）を処理し、スフェロイド中の細胞群を分離し、単体の細胞を獲得する。

【0029】

＜実施例一、Ａゲル材料のゲル化試験＞
表１に示すように、本発明人はＡゲル材料中のアルギン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ａｌｇｉｎａｔｅ）、ゼラチン、及びＨＥＰＥＳ緩衝液の比率がゲル化に与える影響を試験した。表１は７種類の調合を提供し、且つ各種の調合で製造されるコロイドに対し試験を行った。７種類の調合のＡゲル材料は全てコロイドを製作可能であった。「コロイドのスライド」とは、コロイドが培養プレートの底部に対しスライドするかどうかを指す。「光学的透過性」とは、形成されたコロイドを文字が書かれた紙の上に載置し、コロイドを通して紙の上の文字が読めるかどうかを指す。「非崩壊時間」とは、コロイド形態を維持可能な時間を指す。
表１によると、７種類の調合で形成されたコロイドは、全て良好な光透過性を有し、且つ非崩壊時間は少なくとも１２日以上に上り、３Ｄ細胞培養に確実に適用可能である。また、以下の実施例では、表１中の調合６のＡゲル材料で形成されたコロイドにより３Ｄ細胞培養を行う。
＜表１＞

【0030】

＜実施例二、細胞の生存率試験＞
Ｈｕｈ－７細胞に対し２Ｄ培養方法及び本発明のセットにより３Ｄ細胞培養をそれぞれ実施し、４８時間培養した後、ＭＴＴ（３－（４、５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２、５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）試験を行い、生存している細胞の比率を評価した。ＭＴＴ試験は本分野で常用される細胞生存試験方法であるため、そのステップの詳細は省略する。
図３に示すように、本発明のセットにより培養したＨｕｈ－７細胞は、培養後の活性細胞数と初期の培養細胞とを比較すると、明らかに増加している。本発明のセットは細胞に対し毒性がなく、細胞の培養に確実に使用可能である。

【0031】

＜実施例三、スフェロイドの生長の大きさ試験＞
本実施例では、Ｈｕｈ－７細胞を、初期細胞量を１×１０^５ｃｅｌｌｓとし、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）及び本発明のセットによりそれぞれ３Ｄ細胞培養を行い、且つ２組のスフェロイドの生長を観察した。
図４Ａと図４Ｂに示すように、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で培養した細胞は、培養後４日目にスフェロイドは観察されず、本発明のセットで培養した組では、培養後４日目にスフェロイドの生成が観察され、且つスフェロイドの直径は約２０ｍｍであった。また、培養後７日目に観察すると、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で培養した組は、スフェロイドの直径が約５０ｍｍであった。但し、本発明のセットで培養した組では、スフェロイドの直径は１００ｍｍに達した。マトリゲルと比べ、本発明のセットで３Ｄ細胞培養を行った場合、スフェロイドの生成がより早まり、且つスフェロイドの生長状況も好ましいことが明らかである。

【0032】

＜実施例四、培養する細胞の種類＞
表２及び図５は、本発明人が本発明の３Ｄ細胞培養コロイドのセットを使用し、多種類の癌細胞を培養する実験結果、及び形成されたスフェロイドの時間を示す。
表２及び図５によると、試験した細胞株は全て生長してスフェロイドを形成し、且つスフェロイドが観察されるまでの時間はどれも５日以上かからなかった。本発明のセットは多種類の細胞株に適用可能であり、且つ短時間内にスフェロイドの形成を観察できた。
＜表２＞

【0033】

以上述べた如く、本発明の３Ｄ細胞培養コロイドのセットとその３Ｄ細胞培養方法は、ゲル化ステップは２つの階段に分けて操作する。まず、低温環境で、例えば、１０℃以下の操作環境でＡゲル材料によりコロイドを形成した後、室温条件でコロイドとＣ緩衝液とを架橋し、３Ｄ細胞培養に用いる立体培地を獲得する。この２階段の操作方法は、操作時にコロイドの凝結速度が速すぎて立体培地の調製に影響が出るのを回避できる。
本発明に係る３Ｄ細胞培養コロイドのセットは操作が簡単であり、コロイドの形成に必要な時間が短く、形成されるコロイドの硬度を容易に制御できる。また、本発明により製造するコロイドはヒドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）の網状構造を有しており、大多数の細胞株の３Ｄ培養に適合する。よって、本発明に係る３Ｄ細胞培養コロイドのセットの応用範囲は非常に広い。また、本発明は実施例が証明するように、本発明に係る３Ｄ細胞培養コロイドのセットは、従来のマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を使用した３Ｄ細胞培養と比べて、スフェロイドの生成をより早く観察でき、実験効率が高まっている。

【0034】

以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。

【符号の説明】

【0035】

１ Ａゲル材料
２ 混合溶液
３ 熱伝導シート
４ 低温装置
５ 培養プレート
６ コロイド
７ Ｃ緩衝液
８ 成長培地
９ リン酸緩衝液
１０ Ｄ緩衝液
１１ 遠心管
１２ 細胞沈殿物

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【国際調査報告】