特表 2023-542302 核酸を標識するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-06

(54)【発明の名称】核酸を標識するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6806 20180101AFI20230929BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20230929BHJP

   A61K 51/04 20060101ALI20230929BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALN20230929BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20230929BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6806 Z

C12Q1/6869 Z ZNA

A61K51/04 300

C12Q1/6844 Z

C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023516511

(86)(22)【出願日】2021-09-14

(85)【翻訳文提出日】2023-05-10

(86)【国際出願番号】 EP2021075252

(87)【国際公開番号】W WO2022053718

(87)【国際公開日】2022-03-17

(31)【優先権主張番号】2014404.4

(32)【優先日】2020-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508311226

【氏名又は名称】ケンブリッジ・エンタープライズ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】ナッピ，マヌエル

(72)【発明者】

【氏名】ホファー，アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】バラスブラマニアン，シャンカー

(72)【発明者】

【氏名】ゴーント，マシュー・ジェイ

【テーマコード（参考）】

4B063

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QS14

4B063QS24

4C085HH20

4C085KA26

4C085KB91

4C085KB92

4C085LL18

(57)【要約】

本発明は、Ｎ６－メチルアデニンを含む核酸を標識するための方法を提供する。方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基にアルファ－アミノラジカルを形成するステップ、およびニトロソピリジル基を含むラジカル受容体で、アルファ－アミノラジカルを捕獲するステップを含む。その後、核酸におけるＮ^６ｍＡｄｅの存在が、標識核酸の検出により確立され得、または標識核酸が、抽出され、もしくは標識を用いてさらに修飾され得る。標的核酸内のＮ^６ｍＡｄｅの位置をマッピングするための方法、ならびに、その方法に用いられるプローブ分子およびキットもまた提供される。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ^６ｍＡｄｅ）を含む核酸を標識するための方法であって、
ｉ）Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ^６ｍＡｄｅ）のＮ６－メチル基にアルファ－アミノラジカルを形成するステップ；および
ｉｉ）前記アルファ－アミノラジカルを、ニトロソピリジル基（Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－）を含むラジカル受容体で捕獲するステップ
を含む、方法。

【請求項2】

Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を、アミン中心ラジカルカチオンと接触させて、水素原子をＮ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基から取り出すことにより、前記アルファ－アミノラジカルが形成される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

アミンを酸化して、アミン中心ラジカルカチオンを生成するステップを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記アミンが、以下の式を有するキヌクリジンなどの第３級アミンである、請求項３に記載の方法：

【化1】

式中、Ｒは、水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ_１～６アルキル基、Ｃ_１～６アルコキシ基、Ｃ_１～６アシルオキシ基、Ｃ_１～６逆エステル基、または－Ｃ（ＯＨ）Ｒ^１Ｒ^２基（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、Ｃ_１～６アルキルから選択される）から選択される。

【請求項5】

光触媒が前記アミンを酸化するために用いられ、任意で、励起状態かまたは還元型のいずれかの前記光触媒が、低くとも＋１．１０Ｖ ｖｓ ＳＣＥ～高くとも＋１．４５Ｖ ｖｓ ＳＣＥの還元電位を有する、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

前記光触媒が、ルテニウムまたはイリジウム光触媒などの遷移金属光触媒であり、任意で、前記光触媒が、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］^２＋および［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］^２＋から選択される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ラジカル受容体が、以下の式（Ｉ）を有するプローブである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （Ｉ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【請求項8】

－Ｌ－が以下である、請求項７に記載の方法：
－Ｌ^１－Ｌ^２－Ｌ^３－
式中、
－Ｌ^１－は共有結合またはＣ_６～１０アリレン基から選択され；
－Ｌ^２－は、アミド結合、エステル結合、カルボニル結合、アミン結合、またはエーテル結合から選択され；
－Ｌ^３－は、Ｃ_１～１０アルキレンおよびＣ_１～１０ヘテロアルキレンから選択される。

【請求項9】

－Ｘが、Ｃ_２～２０アルキニル、Ｃ_２～２０アルケニル、イソシアニド、アジド、ニトロン、ニトリルオキシド、およびテトラジンから選択される基などのクリック反応パートナー（－Ｃ^１）であり、好ましくは、－Ｃ^１が、エチニル基などのＣ_２～２０アルキニル基である、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

前記プローブが、以下の式（ＩＩ）を有する前駆体からインサイチューで形成される、請求項８または９に記載の方法：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （ＩＩ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【請求項11】

前記前駆体が以下の式Ｐ１～Ｐ７の化合物から選択される、請求項１０に記載の方法：

【化2】

【請求項12】

前記プローブが、式（ＩＩ）の前記前駆体を還元することにより形成される、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

式（ＩＩ）の前記前駆体を還元するために、およびアミンを酸化して、アミン中心ラジカルカチオンを生成するために同じ光触媒が用いられるなど、光触媒が式（ＩＩ）の前記前駆体を還元するために用いられる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであり、任意で、前記核酸がＤＮＡである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

以下のステップを含む、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を試料から抽出し、および任意で、濃縮するための方法：
ｉ）前記試料中のＮ６－メチルアデニンを含む核酸を、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法を用いて、標識するステップ；および
ｉｉ）前記標識核酸を前記試料から抽出するステップ；および任意で
ｉｉｉ）前記抽出された核酸を増幅するステップ。

【請求項16】

以下のステップを含む、標的核酸内のＮ^６ｍＡｄｅの位置をマッピングするための方法：
ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸を供給するステップであって、前記標的核酸が既知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記標的核酸を標識するステップ：
ｉｉｉ）前記標的核酸を増幅して、核酸断片の集団を生じるステップ；
ｉｖ）前記核酸断片の集団をシーケンシングして、前記核酸断片の塩基配列を決定するステップ；および
ｖ）前記核酸断片のヌクレオチド配列を、前記標的核酸のヌクレオチド配列と比較するステップであって、前記核酸断片のヌクレオチド配列の終止が、前記標的核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅ部位の位置を示す、ステップ。

【請求項17】

ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸の集団を供給するステップであって、前記標的核酸が未知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）前記集団の最初の部分をシーケンシングして、前記標的核酸の一次ヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ｉｉｉ）前記標識核酸を、以下の式を有する二官能性プローブと接触させるステップであって、その結果、前記二官能性プローブが前記標識核酸と共有結合する、ステップ
をさらに含む、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法：
Ｃ^２－Ｌ^４－Ｘ^２
式中、－Ｃ^２は相補性クリック反応パートナーであり、－Ｌ^４－はリンカーであり、－Ｘ^２は標識である。

【請求項19】

－Ｃ^２がアジド基（－Ｎ_３）である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記リンカー －Ｌ^４－が以下である、請求項１８または１９に記載の方法：
－Ｌ^４Ａ－（Ｌ^４Ｂ）_ｎ－
式中、
－Ｌ^４Ａ－はＣ_１～４アルキレンであり；
－Ｌ^４Ｂ－はＣ_１～４ヘテロアルキレンであり；
ｎは０～８である。

【請求項21】

－Ｘ^２が、結合剤と結合する単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）であり、例えば、前記単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）がビオチンである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

以下のステップを含む、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を試料から抽出するための方法：
ｉ）試料中のＮ^６ｍＡｄｅを含む核酸を、請求項２１に記載の方法を用いて、標識するステップ；
ｉｉ）前記核酸が共有結合している前記二官能性プローブを、前記単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）と結合する結合剤と接触させるステップ；および
ｉｉｉ）前記二官能性プローブおよびそれと結合した標識核酸を有する前記結合剤を、前記試料から抽出するステップ。

【請求項23】

前記結合剤がストレプトアビジンを含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記結合剤が、固体支持体上に固定化されており、任意で、前記固体支持体が、磁気マイクロビーズなどのマイクロビーズである、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

前記試料が核酸の集団を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

以下のステップをさらに含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法：
ｉｖ）前記結合剤を、アミン求核剤と接触させて、核酸を遊離させるステップであって、任意で、前記アミン求核剤が以下の式を有する、ステップ：
Ｈ_２Ｎ－Ｒ^Ｎ
式中、－Ｒ^ＮはＣ_１～６アルキル基または－ＮＨ_２である。

【請求項27】

以下のステップを含む、標的核酸内のＮ^６ｍＡｄｅの位置をマッピングするための方法：
ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸を供給するステップであって、前記標的核酸が既知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）請求項２１に記載の方法を用いて、前記標的核酸を標識するステップ：
ｉｉｉ）前記標識核酸が共有結合している前記二官能性プローブを、前記単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）と結合する結合剤と接触させるステップであって、任意で、前記結合剤が固体支持体上に固定化されている、ステップ；
ｉｖ）前記固体支持体と結合した前記核酸を増幅して、核酸断片の集団を生じるステップ；
ｖ）前記核酸断片の集団をシーケンシングして、前記核酸断片のヌクレオチド配列を決定するステップ；および
ｖｉ）前記核酸断片のヌクレオチド配列を、前記標的核酸のヌクレオチド配列と比較するステップであって、前記核酸断片のヌクレオチド配列の終止が、前記標的核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅ残基の位置を示す、ステップ。

【請求項28】

前記結合剤がストレプトアビジンを含み、任意で、前記固体支持体が磁気マイクロビーズなどのマイクロビーズである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸の集団を供給するステップであって、前記標的核酸が未知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）前記集団の最初の部分をシーケンシングして、前記標的核酸の一次ヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む、請求項２７または２８に記載の方法。

【請求項30】

以下のステップを含む、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を標識するための方法：
ｉ）（ａ）ニトロピリジル基（Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－）を含む化合物；
（ｂ）第３級アミン；および
（ｃ）光触媒
を含む反応混合物と、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を接触させるステップであって、その結果、前記化合物がＮ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位に共有結合性に付着する、ステップ。

【請求項31】

前記ニトロピリジル基を含む化合物が以下の式（ＩＩ）の前駆体である、請求項３０に記載の方法：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （ＩＩ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【請求項32】

－Ｌ－が以下である、請求項３１に記載の方法：
－Ｌ^１－Ｌ^２－Ｌ^３－
式中、
－Ｌ^１－は共有結合またはＣ_６～１０アリレン基から選択され；
－Ｌ^２－は、アミド結合、エステル結合、カルボニル結合、アミン結合、またはエーテル結合から選択され；
－Ｌ^３－は、Ｃ_１～１０アルキレンおよびＣ_１～１０ヘテロアルキレンから選択される。

【請求項33】

－Ｘが、Ｃ_２～２０アルキニル、Ｃ_２～２０アルケニル、イソシアニド、アジド、ニトロン、ニトリルオキシド、およびテトラジンから選択される基などのクリック反応パートナー（－Ｃ^１）であり、好ましくは、－Ｃ^１が、エチニル基などのＣ_２～２０アルキニル基である、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

前記前駆体が、以下の式Ｐ１～Ｐ７の化合物から選択される、請求項３１に記載の方法：

【化3】

【請求項35】

前記第３級アミンが、以下の式を有するキヌクリジンである、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法：

【化4】

式中、Ｒは、水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ_１～６アルキル基、Ｃ_１～６アルコキシ基、Ｃ_１～６アシルオキシ基、Ｃ_１～６逆エステル基、または－Ｃ（ＯＨ）Ｒ^１Ｒ^２基（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、Ｃ_１～６アルキルから選択される）から選択される。

【請求項36】

励起状態かまたは還元型のいずれかでの前記光触媒が、低くとも＋１．１０Ｖ ｖｓ ＳＣＥ～高くとも＋１．４５Ｖ ｖｓ ＳＣＥの還元電位を有する、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記光触媒が、ルテニウムまたはイリジウム光触媒、例えば、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］^２＋または［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］^２＋などの遷移金属光触媒である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記反応混合物に照射するステップ、例えば、前記反応混合物に可視光を照射するステップを含む、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記反応混合物が、Ｎ－アセチルデヒドロアラニンメチルエステル（Ａｃ－Ｄｈａ－Ｍｅ）などの活性化アルケンを含む、請求項３０～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであり、任意で、前記核酸がＤＮＡである、請求項３０～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

以下のステップを含む、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を試料から抽出し、および任意で、濃縮するための方法：
ｉ）前記試料中のＮ６－メチルアデニンを含む核酸を、請求項３０～４０のいずれか一項に記載の方法を用いて、標識するステップ；および
ｉｉ）前記標識核酸を前記試料から抽出するステップ；および任意で
ｉｉｉ）前記抽出された核酸を増幅するステップ。

【請求項42】

以下のステップを含む、標的核酸内のＮ^６ｍＡｄｅの位置をマッピングするための方法：
ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸を供給するステップであって、前記標的核酸が既知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）請求項３０～４０のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記標的核酸を標識するステップ：
ｉｉｉ）前記標的核酸を増幅して、核酸断片の集団を生じるステップ；
ｉｖ）前記核酸断片の集団をシーケンシングして、前記核酸断片の塩基配列を決定するステップ；および
ｖ）前記核酸断片のヌクレオチド配列を、前記標的核酸のヌクレオチド配列と比較するステップであって、前記核酸断片のヌクレオチド配列の終止が、前記標的核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅ部位の位置を示す、ステップ。

【請求項43】

ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸の集団を供給するステップであって、前記標的核酸が未知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）前記集団の最初の部分をシーケンシングして、前記標的核酸の一次ヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

ｉｉ）前記標識核酸を、以下の式を有する二官能性プローブと接触させるステップであって、その結果、前記二官能性プローブが前記標識核酸と共有結合する、ステップ
をさらに含む、請求項３０～４０のいずれか一項に記載の方法：
Ｃ^２－Ｌ^４－Ｘ^２
式中、－Ｃ^２は相補性クリック反応パートナーであり、－Ｌ^４－はリンカーであり、－Ｘ^２は標識である。

【請求項45】

－Ｃ^２がアジド基（－Ｎ_３）である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記リンカー －Ｌ^４－が以下である、請求項４４または４５に記載の方法：
－Ｌ^４Ａ－（Ｌ^４Ｂ）_ｎ－
式中、
－Ｌ^４Ａ－はＣ_１～４アルキレンであり；
－Ｌ^４Ｂ－はＣ_１～４ヘテロアルキレンであり；
ｎは０～８である。

【請求項47】

－Ｘ^２が、結合剤と結合する単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）であり、例えば、前記単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）がビオチンである、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

以下のステップを含む、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を試料から抽出するための方法：
ｉ）試料中のＮ^６ｍＡｄｅを含む核酸を、請求項４７に記載の方法を用いて、標識するステップ；
ｉｉ）前記標識核酸が共有結合している前記二官能性プローブを、前記単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）と結合する結合剤と接触させるステップ；および
ｉｉｉ）前記二官能性プローブおよびそれと結合した標識核酸を有する前記結合剤を、前記試料から抽出するステップ。

【請求項49】

前記結合剤がストレプトアビジンを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記結合剤が、固体支持体上に固定化されており、任意で、前記固体支持体が、磁気マイクロビーズなどのマイクロビーズである、請求項４８または４９に記載の方法。

【請求項51】

前記試料が核酸の集団を含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

以下のステップをさらに含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の方法：
ｉｖ）前記結合剤を、アミン求核剤と接触させて、核酸を遊離させるステップであって、任意で、前記アミン求核剤が以下の式を有する、ステップ：
Ｈ_２Ｎ－Ｒ^Ｎ
式中、－Ｒ^ＮはＣ_１～６アルキル基または－ＮＨ_２である。

【請求項53】

以下のステップを含む、標的核酸内のＮ^６ｍＡｄｅの位置をマッピングするための方法：
ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸を供給するステップであって、前記標的核酸が既知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）請求項４７に記載の方法を用いて、前記標的核酸を標識するステップ：
ｉｉｉ）前記標識核酸が共有結合している前記二官能性プローブを、前記単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）と結合する結合剤と接触させるステップであって、任意で、前記結合剤が固体支持体上に固定化されている、ステップ；
ｉｖ）前記固体支持体と結合した前記核酸を増幅して、核酸断片の集団を生じるステップ；
ｖ）前記核酸断片の集団をシーケンシングして、前記核酸断片のヌクレオチド配列を決定するステップ；および
ｖｉ）前記核酸断片のヌクレオチド配列を、前記標的核酸のヌクレオチド配列と比較するステップであって、前記核酸断片のヌクレオチド配列の終止が、前記標的核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅ残基の位置を示す、ステップ。

【請求項54】

前記結合剤がストレプトアビジンを含み、任意で、前記固体支持体が磁気マイクロビーズなどのマイクロビーズである、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸の集団を供給するステップであって、前記標的核酸が未知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）前記集団の最初の部分をシーケンシングして、前記標的核酸の一次ヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む、請求項５３または５４に記載の方法。

【請求項56】

以下の式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｃ^１ （ＩＩＩ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｃ^１は、Ｃ_２～２０アルキニル、例えばエチニル基などのクリック反応パートナーである。

【請求項57】

－Ｌ－が以下である、請求項５６に記載の化合物：
－Ｌ^１－Ｌ^２－Ｌ^３－
式中、
－Ｌ^１－は共有結合またはＣ_６～１０アリレン基から選択され；
－Ｌ^２－は、アミド結合、エステル結合、カルボニル結合、アミン結合、またはエーテル結合から選択され；
－Ｌ^３－は、Ｃ_１～１０アルキレンおよびＣ_１～１０ヘテロアルキレンから選択される。

【請求項58】

以下の式Ｐ１～Ｐ７の化合物から選択される、請求項５６に記載の化合物：

【化5】

【請求項59】

以下の式（Ｉ）の化合物のラジカル受容体としての使用：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （Ｉ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【請求項60】

（ａ）ニトロピリジル基（Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－）を含む化合物；および
（ｂ）第３級アミン；および
（ｃ）光触媒
を含む、キット。

【請求項61】

前記ニトロピリジル基を含む化合物が、以下の式（ＩＩ）の前駆体である、請求項６０に記載のキット：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （ＩＩ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【請求項62】

－Ｌ－が以下である、請求項６１に記載のキット：
－Ｌ^１－Ｌ^２－Ｌ^３－
式中、
－Ｌ^１－は共有結合またはＣ_６～１０アリレン基から選択され；
－Ｌ^２－は、アミド結合、エステル結合、カルボニル結合、アミン結合、またはエーテル結合から選択され；
－Ｌ^３－は、Ｃ_１～１０アルキレンおよびＣ_１～１０ヘテロアルキレンから選択される。

【請求項63】

－Ｘが、Ｃ_２～２０アルキニル、Ｃ_２～２０アルケニル、イソシアニド、アジド、ニトロン、ニトリルオキシド、およびテトラジンから選択される基などのクリック反応パートナー（－Ｃ^１）であり、好ましくは、－Ｃ^１が、エチニル基などのＣ_２～２０アルキニル基である、請求項６１または６２に記載のキット。

【請求項64】

前記前駆体が、以下の式Ｐ１～Ｐ７の化合物から選択される、請求項６１に記載のキット：

【化6】

【請求項65】

前記第３級アミンが、以下の式を有するキヌクリジンである、請求項６０～６４のいずれか一項に記載のキット：

【化7】

式中、Ｒは、水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ_１～６アルキル基、Ｃ_１～６アルコキシ基、Ｃ_１～６アシルオキシ基、Ｃ_１～６逆エステル基、または－Ｃ（ＯＨ）Ｒ^１Ｒ^２基（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、Ｃ_１～６アルキルから選択される）から選択される。

【請求項66】

前記光触媒が、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］^２＋または［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］^２＋などのルテニウムまたはイリジウム光触媒である、請求項６０～６５に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【関連出願】

【0001】

この出願をもたらしたプロジェクトは、Ｍａｒｉｅ Ｓｋｌｏｄｏｗｓｋａ－Ｃｕｒｉｅ助成金契約番号７０２４６２および７８９４０７によりＥｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ’ｓ Ｈｏｒｉｚｏｎ ２０２０研究および発明プログラムから財政的支援を受けている。

【0002】

関連出願
この本件は、２０２０年９月１４日（１４．０９．２０２０）に出願されたＧＢ２０１４４０４．４に関連し、その恩恵を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられている。

【技術分野】

【0003】

本発明は、Ｎ６－メチルアデニンを含有する核酸を標識および単離する方法、ならびに標的核酸におけるＮ６－メチルアデニンの位置をマッピングすることに関する。

【背景技術】

【0004】

ＤＮＡアルファベット － アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）の４文字による配列に保存されたコア遺伝子情報の域を超えて、分子プログラミングの第２層が、基準の核酸塩基への可逆性化学修飾 － いわゆる、エピジェネティックコードの形をとって存在する。細菌は、それら自体のゲノムにおけるＡおよびＣを、それを侵入ＤＮＡから識別するために、ならびにミスマッチ修復およびゲノム複製を調節するために、メチル化することができる（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｒｏｍｅｒｏ ２０１５）。真核生物において、ＤＮＡメチル化は、Ｃにおいてのみ起こると考えられ（Ｓｃｈｕｂｅｌｅｒ ２０１５）、それが、遺伝子制御に関連づけられており、それの機能のより良い理解をもたらす、それの検出およびマッピングのための化学的方法の開発へのかなりの努力を促してきた（Ｈｏｆｅｒ ２０１９）。

【0005】

Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ^６ｍＡｄｅ）は、生物体のＤＮＡとＲＮＡの両方に存在し得るメチル化核酸塩基である。ＤＮＡヌクレオシドのＮ６－メチルデオキシアデノシン（Ｎ^６ｍｄＡｄｏ；Ｎ^６ｍｄＡ）は、真核生物のゲノムＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡに存在し得る。Ｎ^６ｍｄＡはまた、植物、真菌、およびヒトを含む哺乳動物に存在し得、遺伝子制御、神経生物学、および疾患状態において生物学的に重要な役割を果たし得る。ＲＮＡヌクレオシドのＮ６－メチルアデノシン（Ｎ^６ｍＡｄｏ；Ｎ^６ｍＡ）もまた、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｔＲＮＡを含む、原核生物および真核生物のＲＮＡに存在し得る。ＲＮＡにおけるＮ^６ｍＡは、遺伝子発現を調節し、かつ細胞分化を媒介し得、疾患状態においても重要な役割を果たし得る。

【0006】

核酸におけるＮ６－メチルアデニンの存在を、濃縮シーケンシングにより検出する方法は、特にＤＮＡおよびＲＮＡにおけるこの塩基の相対的存在量が低いため、信頼できない場合が多い。

【0007】

ｍ^６ｄＡ－ＤＩＰ－ｓｅｑ、ｍ^６Ａ－ｓｅｑ、ｍ^６ｄＡ－ＣＬＩＰ－ｅｘｏ－ｓｅｑ、およびｍｉＣＬＩＰ／ｍ^６Ａ－ＣＬＩＰなどの抗体免疫沈降方法は、用いられる抗体の結合特異性によって制限される。反復領域およびキャップｍ^６Ａ部位とのこれらの抗体の潜在的な非特異的結合が報告されている。抗体はまた、高密度メチル化領域に対するバイアスを示すことが知られている。これらの理由により、このアプローチにより生じた多くのデータセットは疑わしい。

【0008】

エンドヌクレアーゼ酵素もまた、ＲＮＡおよびＤＮＡにおけるＮ６－メチルアデニンを検出するために用いられている（ｍ６Ａ－ＲＥＦ－ｓｅｑまたはＭＡＺＴＥＲ－ｓｅｑ）。このアプローチは、エンドヌクレアーゼ酵素の認識によって制限され、特定の配列構成におけるＮ６－メチルアデニンを検出することができるだけである。

【0009】

Ｎ６－メチルアデニン検出の他の酵素方法には、デメチラーゼ（ｍ６Ａ－ＳＥＡＬ）、デアミナーゼ（ＤＡＲＴ－ｓｅｑ）、およびメチルトランスフェラーゼの使用が挙げられる。これらの方法は、一般的に複雑である。追加として、ＤＡＲＴ－ｓｅｑはトランスフェクションを必要とし、メチルトランスフェラーゼは、Ｎ６－メチルアデニンへの選択性はなく、二本鎖ＤＮＡは、ｍ６Ａ－ＳＥＡＬの弱い基質である。

【0010】

一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシングおよびナノポアシーケンシングを含む第３世代シーケンシング技術は、Ｎ６－メチルアデニンを検出するために用いることができる。しかしながら、これらの方法によって達成される低い信号雑音比により、信頼できる検出のために非常に高いシーケンシング深度が必要とされる。加えて、これらの技術は、非常に高価であり、大きな真核生物ゲノムのシーケンシングのために日常的には用いられない。

【0011】

Ｎ^６ｍｄＡおよびＮ^６ｍＡの生物学的役割を理解することは、まだ始まったばかりであり、一般的な検出方法の精度は疑問視されているが（Ｌｅｎｔｉｎｉ ２０１８；Ｏ’Ｂｒｏｗｎ ２０１９；Ｄｏｕｖｌａｔａｎｉｏｔｉｓ ２０２０）、それが、第２級アミンのフィーチャーを含有する哺乳動物ＤＮＡにおいて知られた唯一のヌクレオチド修飾であることは、化学的視点から、注目に値する。Ｎ－メチルアミン内のメチル基が伝統的な反応性ではないにしても、このモチーフの排他性は、Ｎ^６ｍＡｄｅを共有結合性に修飾しかつ操作する部位選択的化学的アプローチの基盤であり得る。本発明者らが知る限りでは、現在、核酸配列をＮ６－メチルアデニンにおいて選択的に共有結合性に修飾するための方法は存在しない。

【発明の概要】

【0012】

一般的な態様において、本発明は、Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ^６ｍＡｄｅ）などの第２級アミン構造を含む核酸を標識するための方法を提供する。方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅなどの第２級アミン構造の部位特異的化学修飾を含む。これは、核酸内などのそのフィーチャーの化学的修飾および操作を可能にする。

【0013】

いくつかの実施形態において、方法は、Ｎ６－メチルアデニンラジカルの生成および前記ラジカルのラジカル受容体との反応を含む。その後、核酸におけるＮ^６ｍＡｄｅの存在が、標識核酸の検出により確立され得るか、または標識核酸が抽出され、もしくは標識を用いてさらに修飾され得るかのいずれかであり得る。

【0014】

本発明の第１の態様において、
ｉ）Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ^６ｍＡｄｅ）のＮ６－メチル基にアルファ－アミノラジカルを形成するステップ；および
ｉｉ）前記アルファ－アミノラジカルを、ニトロソピリジル基（Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－）を含むラジカル受容体で捕獲するステップ
を含む、Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ^６ｍＡｄｅ）を含む核酸を標識するための方法が提供される。

【0015】

好ましくは、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を、アミン中心ラジカルカチオンと接触させて、水素原子をＮ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基から取り出すことにより、アルファ－アミノラジカルが形成される。

【0016】

方法は、アミンを酸化して、アミン中心ラジカルカチオンを生成するステップを含み得る。
好ましくは、アミンは、以下の式：

【0017】

【化1】

【0018】

を有するキヌクリジンなどの第３級アミンであり、
式中、Ｒは、水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ_１～６アルキル基、Ｃ_１～６アルコキシ基、Ｃ_１～６アシルオキシ基、Ｃ_１～６逆エステル基、または－Ｃ（ＯＨ）Ｒ^１Ｒ^２基（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、Ｃ_１～６アルキルから選択される）から選択される。より好ましくは、Ｒは水素である。

【0019】

光触媒が、アミンを酸化するために用いられ得る。
好ましくは、励起状態かまたは還元型のいずれかの光触媒は、低くとも＋１．１０Ｖ ｖｓ ＳＣＥ～高くとも＋１．４５Ｖ ｖｓ ＳＣＥの還元電位を有する。より好ましくは、光触媒は、ルテニウムまたはイリジウム光触媒などの遷移金属光触媒である。光触媒は、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］^２＋および［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］^２＋から選択され得る。

【0020】

ラジカル受容体は、以下の式（Ｉ）を有するプローブであり得る：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （Ｉ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【0021】

好ましくは、－Ｘは、Ｃ_２～２０アルキニル、Ｃ_２～２０アルケニル、イソシアニド、アジド、ニトロン、ニトリルオキシド、およびテトラジンから選択される基などのクリック反応パートナー（－Ｃ^１）である。より好ましくは、－Ｃ^１は、エチニル基などのＣ_２～２０アルキニル基である。

【0022】

プローブは、以下の式（ＩＩ）を有する前駆体からインサイチューで形成され得る：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （ＩＩ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【0023】

プローブは、式（ＩＩ）の前駆体を還元することにより形成され得る。
好ましくは、式（ＩＩ）の前駆体を還元するために、およびアミンを酸化して、アミン中心ラジカルカチオンを生成するために同じ光触媒が用いられるなど、光触媒が式（ＩＩ）の前駆体を還元するために用いられる。

【0024】

核酸はＤＮＡであり得る。
方法は、
ｉｉｉ）前記標識核酸を、以下の式を有する二官能性プローブと接触させるステップであって、その結果、前記二官能性プローブが前記標識核酸と共有結合する、ステップ
をさらに含み得る：
Ｃ^２－Ｌ^４－Ｘ^２
式中、－Ｃ^２は相補性クリック反応パートナーであり、－Ｌ^４－はリンカーであり、－Ｘ^２は標識である。

【0025】

好ましくは、－Ｃ^２はアジド基（－Ｎ_３）である。好ましくは、－Ｘ^２は、結合剤と結合する単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）であり、例えば、前記単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）がビオチンである。

【0026】

本発明の第２の態様において、以下のステップを含む、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を試料から抽出するための方法が提供される：
ｉ）試料中のＮ^６ｍＡｄｅを含む核酸を、第１の態様の方法を用いて、標識するステップであって、その結果、前記核酸が、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）を含む二官能性プローブと共有結合する、ステップ；
ｉｉ）前記核酸が共有結合している前記二官能性プローブを、前記単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）と結合する結合剤と接触させるステップ；および
ｉｉｉ）前記二官能性プローブおよびそれと結合した標識核酸を有する結合剤を、前記試料から抽出するステップ。

【0027】

好ましくは、結合剤はストレプトアビジンを含む。好ましくは、結合剤は、固体支持体上に固定化されており、任意で、前記固体支持体が、磁気マイクロビーズなどのマイクロビーズである。

【0028】

試料は核酸の集団を含み得る。
方法は
ｉｖ）前記結合剤をアミン求核剤と接触させて、核酸を遊離させるステップ
をさらに含み得る。

【0029】

好ましくは、アミン求核剤は以下の式を有する：
Ｈ_２Ｎ－Ｒ^Ｎ
式中、－Ｒ^ＮはＣ_１～６アルキル基または－ＮＨ_２である。

【0030】

本発明の第３の態様において、以下のステップを含む、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を標識するための方法が提供される：
ｉ）（ａ）ニトロピリジル基（Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－）を含む化合物；
（ｂ）第３級アミン；および
（ｃ）光触媒
を含む反応混合物と、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を接触させるステップであって、その結果、前記化合物がＮ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位と共有結合性に付着する、ステップ。

【0031】

第１および第２の態様の好ましい特徴は、第３の態様に等しく適用される。
本発明の第４の態様において、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を、ニトロソピリジル基（Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－）を含むラジカル受容体と反応させて、以下の式を有するコンジュゲートを生成するステップを含む、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を標識する方法が提供される：
Ａ－Ｎ＝Ｃ（Ｈ）－Ｎ（ＯＨ）－Ｐｙ－^＊
式中、－Ａは６－プリニル基であり、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、^＊は、前記ラジカル受容体の残部との付着位置を表す。

【0032】

第１および第２の態様の好ましい特徴は、第４の態様に等しく適用される。
本発明の第５の態様において、以下の式（ＩＩＩ）の化合物が提供される：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｃ^１ （ＩＩＩ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｃ^１は、Ｃ_２～２０アルキニル、Ｃ_２～２０アルケニル、またはイソシアニド（－Ｎ^＋≡Ｃ^－）から選択される基などのクリック反応パートナーである。

【0033】

本発明の第６の態様において、ラジカル受容体としての以下の式（Ｉ）の化合物の使用が提供される：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （Ｉ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【0034】

本発明の第７の態様において、以下を含むキットが提供される：
（ａ）ニトロピリジル基（Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－）を含む化合物；および
（ｂ）第３級アミン；および
（ｃ）光触媒。

【0035】

第１および第２の態様の好ましい特徴は、第６および第７の態様に等しく適用される。
本発明の第８の態様において、以下のステップを含む、標的核酸内のＮ^６ｍＡｄｅの位置をマッピングするための方法が提供される：
ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸を供給するステップであって、前記標的核酸が既知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）第１または第３の態様の方法を用いて、前記標的核酸を標識するステップ：
ｉｉｉ）前記標的核酸を増幅して、核酸断片の集団を生じるステップ；
ｉｖ）前記核酸断片の集団をシーケンシングして、前記核酸断片の塩基配列を決定するステップ；および
ｖ）前記核酸断片のヌクレオチド配列を、前記標的核酸のヌクレオチド配列と比較するステップであって、前記核酸断片のヌクレオチド配列の終止が、前記標的核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅ残基の位置を示す、ステップ。

【0036】

第１および第２の態様の好ましい特徴は、第８の態様に等しく適用される。
本発明のこれらを始めとする態様および実施形態は、下記でさらに詳細に記載されている。

【0037】

本発明は、以下に列挙された図を参照して記載される。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】本発明の方法の概略図である。ａ）Ｎ^６ｍｄＡにおける選択的ＨＡＡを示す。ｂ）ニトロソアレーン由来ラジカル受容体および前記ラジカル受容体のインサイチューでの生成に用いられる安定な前駆体ニトロアレーンを示す。ｃ）選択的ＨＡＡと、ニトロソアレーンのインサイチューでの生成を介したラジカルトラッピングとの合併に基づいたＮ^６ｍｄＡの光酸化還元促進性共有結合性修飾の概要を示す。

【図2】Ｎ^６ｍｄＡの共有結合性官能化のための可視光媒介性光酸化還元ストラテジーの概略図である。ａ）Ｎ^６ｍｄＡのＮ６－メチル基でのＨＡＡを示す。ｂ）Ｎ^６ｍｄＡを含むオリゴヌクレオチドにおける［Ｒｕ（ＩＩ）（ｂｐｚ）_３］（ＰＦ６）_２での還元的光触媒性消光サイクルを介した、ＨＡＡおよびラジカルトラッピングによるコンジュゲーションを示す。ｃ）Ｎ^６ｍｄＡを含むオリゴヌクレオチドにおける［Ｒｕ（ＩＩ）（ｐｈｅｎ）_３］Ｃｌ_２での酸化的光触媒性消光サイクルを介した、ＨＡＡおよびラジカルトラッピングによるコンジュゲーションを示す。

【図3】［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］（ＰＦ_６）_２の還元的消光経路（上部のトレース）および［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］Ｃｌ_２の酸化的消光（下部トレース）を用いたＯＤＮ５におけるＮ^６ｍＡｄｅ官能化の反応スキームおよびＬＣＭＳのトレースを示す図である。

【図4】ＤＮＡにおけるＮ^６ｍｄＡでの光酸化還元官能化および下流修飾を示す図である。ａ）オリゴヌクレオチド官能化におけるモジュラーニトロピリジンプローブの使用およびその後の、ヒュスゲン環化付加による同化を示す。ｂ）オリゴヌクレオチド官能化における選択性パラメータが、「ＨＡＡ選択性」（Ｃ－Ｈ結合切断の位置を反映する）および「プローブ選択性」（ニトロピリジンに対するニトロソピリジンによる反応の選択性を反映する）として定義されることを示す。

【図5】アルキン由来ニトロピリジンでの光酸化還元官能化、ビオチン由来アジドでのヒュスゲン環化付加、ストレプトアビジンコーティング化磁気ビーズ上での固定化、逐次洗浄によるオリゴヌクレオチド分離、およびＮ^６ｍｄＡ由来オリゴヌクレオチドの選択的切断を含むプルダウン手順を示す図である。そのプロセスは、＞５０：１の濃縮をもたらす。

【図6】サケ精子（ＳＳ）ＤＮＡの存在下および非存在下での９９ｎｔ ｓｓＤＮＡおよび９９ｂｐ ｄｓＤＮＡを用いたプルダウン実験の結果を示す図である。これは、ＤＮＡ配列の複雑な混合物における濃縮を示す。黒色の点はＮ^６ｍｄＡ残基を示す。

【図7】光酸化還元反応におけるＮ－アセチルデヒドロアラニンメチルエステル（Ａｃ－Ｄｈａ－Ｍｅ、８ｍＭ）の存在が、Ｎ^６ｍＡの脱メチル化（［Ａ］を形成する）の減少、およびＮ－ヒドロキシホルムアミジン誘導体［ＮＨＦ－Ａ］の選択的形成の増加を生じることを示す図である。

【図8】異なる照射時間後、ならびにＮ－アセチルデヒドロアラニンメチルエステル（Ａｃ－Ｄｈａ－Ｍｅ、８ｍＭ）の存在下および非存在下での９９塩基対二本鎖ＤＮＡ配列の回収（ｑＰＣＲによる定量化）を示す図である。その結果は、Ａｃ－Ｄｈａ－Ｍｅの存在が、Ｎ^６ｍＡを官能化するための光酸化還元反応中のオリゴヌクレオチドの分解を減少させることを確認している。

【図9A】合成オリゴヌクレオチドのＮ^６ｍＡ部分における選択的化学的ビオチン化およびストレプトアビジンコーティング化磁気ビーズ上での固定化後のポリメラーゼ停止を試験するためのワークフローの概略を示す図である。

【図9B】１つの主なおよび２つの少数のポリメラーゼ停止産物の存在を確認するＬＣ－ＭＳ分析を示す図である。

【図10】「ビーズ上で」のポリメラーゼ停止実験の産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示す図であり、ポリメラーゼ停止産物のＮ^６ｍＡ依存性出現を明らかに実証している。

【図11】開発された「ビーズ上で」のポリメラーゼストップアプローチを用いた、シーケンシングして、塩基解像度でＮ^６ｍＡをマッピングするためのＤＮＡライブラリーの作製についてのストラテジーの概略図である。

【図12】図１２Ａは、７．５μｇの合成９９ｎｔ ｓｓＤＮＡからＮ^６ｍＡをマッピングするためのＤＮＡライブラリーの作製についてのアプローチを示す図である。図１２Ｂは、得られたライブラリーのＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ分析を示す図である、

【図13】図１３Ａは、１μｇの合成９９ｂｐ ｄｓＤＮＡからＮ^６ｍＡをマッピングするためのＤＮＡライブラリーの作製についてのアプローチを示す図である。図１３Ｂは、得られたライブラリーのＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ分析を示す図である、

【発明を実施するための形態】

【0039】

本発明は、Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ６ｍＡｄｅ）を標識するための方法を提供する。アルファ－アミノラジカルは、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成される。式（Ｉ）のプローブなどのラジカル受容体はアルファ－アミノラジカルを捕獲する。したがって、ラジカル受容体またはプローブは、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位と共有結合し、それにより、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を標識する。この点で、その標識された核酸はまた、Ｎ６－標識核酸とも呼ばれ得る。

【0040】

アルファ－アミノラジカル形成
本発明の方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基にアルファ－アミノラジカルを形成するステップを含む。すなわち、方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基のラジカル化を含む。

【0041】

アルファ－アミノラジカルは、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基から水素原子を取り出すことにより形成され得る。
水素原子取出し（ＨＡＡ）過程は、好ましくは、酵素的ＨＡＡではない。すなわち、本発明の方法は、好ましくは、鉄中心ジオキシゲナーゼなどの酵素を用いてアルファ－アミノラジカルを形成するのではない。

【0042】

好ましくは、求電子性ラジカルカチオンが、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基から水素を取り出すために用いられる。すなわち、方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を求電子性ラジカルカチオンと接触させて、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基から水素を取り出し、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基にアルファ－アミノラジカルを形成するステップを含む。

【0043】

求電子性ラジカルカチオンは、電子（ｅｌｅｃｔｉｏｎ）リッチなＣ－Ｈ結合と反応して、水素原子を取り出し、求核性（電子リッチな）ラジカルを形成する能力がある。Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基のＣ－Ｈ結合などの、ヘテロ原子に隣接して（アルファ）位置するＣ－Ｈ結合は、電子リッチなＣ－Ｈ結合である。そのようなものとして、求電子性ラジカルカチオンは、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－アルファ位にラジカルを選択的に形成する。すなわち、求電子性ラジカルカチオンは、他のアルキルＣ－Ｈ結合より、選択的にＮ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基から水素を取り出して、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基にアルファ－アミノラジカルを形成する。例えば、求電子性ラジカルカチオンは、チミン（５－メチルウラシル）の５－メチル基の代わりに、選択的にＮ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基から水素を取り出し得る。

【0044】

好ましくは、求電子性ラジカルカチオンは、アミン中心ラジカルカチオン（窒素中心ラジカルカチオン）である。さらにより好ましくは、第３級アミン中心ラジカルカチオン（Ｒ_３Ｎ^・＋）が用いられる。

【0045】

第３級アミン中心ラジカルカチオンの例には、トリアリールアミンおよび二環性アミンのアミン中心ラジカルカチオンが挙げられる。
好ましい第３級アミン中心ラジカルカチオンは、キヌクリジン環系を含む。キヌクリジン環系に形成された第３級アミン中心ラジカルは、特にＮ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基のＣ－Ｈ結合に対してよくマッチした、求電子性ラジカルカチオンである。

【0046】

プロトン化キヌクリジンは、１０１ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合解離エネルギー（ＢＤＥ）を有し、そのことは、それのラジカルカチオンが、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基から水素原子を除去するのに十分、反応性であることを意味する。

【0047】

キヌクリジン環系は、置換型または非置換型であり得る。置換型キヌクリジン環系の例には、以下の３－置換型キヌクリジンが挙げられる：

【0048】

【化2】

【0049】

Ｒ位における置換は、特に制限されない。好ましくは、Ｒ位における置換基は、交差反応性を低下させるために、電子リッチなＣ－Ｈ結合を欠く。例えば、Ｒ基は、ヒドロキシル基、Ｃ_１～６アルキル基、Ｃ_１～６アルコキシ基、Ｃ_１～６アシルオキシ基、Ｃ_１～６逆エステル基、または－Ｃ（ＯＨ）Ｒ^１Ｒ^２基（式中、Ｒ^１およびＲ^２はＣ_１～６アルキルから選択される）から選択され得る。

【0050】

適切なエステル（アシルオキシ）基の例には、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^４Ａ（式中、－Ｒ^４ＡはＣ_１～６アルキルから選択される）が挙げられる。
適切な逆エステル基の例には、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ^４Ｂ（式中、－Ｒ^４Ｂは、アセトキシ（－ＯＡｃ）など、Ｃ_１～６アルキルから選択される）が挙げられる。
特に好ましい実施形態において、キヌクリジン環系は、非置換型である。

【0051】

アルファ－アミノラジカル捕獲
本発明の方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを、式（Ｉ）のプローブなどのラジカル受容体を用いて、捕獲するステップを含む。式（Ｉ）のプローブは、アルファ－アミノラジカルと反応し、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位と共有結合し、それにより、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を標識する。その後、標識された核酸は検出され、抽出され、前記プローブを用いてさらに修飾され得る。

【0052】

好ましくは、求電子性ラジカル受容体が、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを捕獲するために用いられる。求電子性ラジカル受容体は、求核性ラジカルと反応して、Ｃ－Ｃ結合などの新しい共有結合を形成する能力がある。Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位に形成された炭素中心ラジカルは、求核性ラジカルである。そのようなものとして、求電子性ラジカル受容体は、それ自体が求電子性ラジカルカチオンなどの他のラジカル種より優先して、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位で形成されたラジカルと選択的に反応する。

【0053】

ニトロン（例えば、５，５－ジメチル－１－ピロリン（ｐｙｙｒｒｏｌｉｎｅ）－Ｎ－オキシド；ＤＭＰＯ）などの基を含む求電子性ラジカル受容体が、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを捕獲するために用いられ得る。

【0054】

好ましいラジカル受容体は、ニトロソ基（Ｏ＝Ｎ－）を含む。特に好ましいラジカル受容体は、ニトロソアリール基を含む。ニトロソアリール基のニトロソ基は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位で形成されたアルファ－アミノラジカルなどの求核性炭素中心ラジカルの奪取に特に適している。したがって、いくつかの実施形態において、方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを、ニトロソアリール基（Ｏ＝Ｎ－Ａｒ－）を含むラジカル受容体で捕獲するステップを含み得る。

【0055】

方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを、ニトロソピリジル基（Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－）を含むラジカル受容体で捕獲するステップを含む。ピリジン環は、それがラジカル受容体の水溶解度を増加させるため、有利である。

【0056】

ラジカル受容体のニトロソピリジル基（Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－）は、さらなる置換基を含有しない場合がある。すなわち、ニトロピリジル基は、水素（Ｈ）と結合して、ニトロソピリジン（Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ）を生じ得る。

【0057】

好ましい実施形態において、方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを、以下の式（Ｉ）のプローブで捕獲するステップを含む：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （Ｉ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【0058】

ピリジンジイル基（－Ｐｙ－）は、２つの自由原子価がそれぞれ、隣接した原子との一重結合の部分を形成する二価ピリジン（Ｐｙ）基である。
ピリジンジイル基（－Ｐｙ－）におけるピリジン環は置換され得る。置換基は、それらがピリジン環のアルファ位のＣ－Ｈ結合などの電子リッチなＣ－Ｈ結合を含有しないならば、特に制限されない。

【0059】

例えば、ピリジンジイル基（－Ｐｙ－）におけるピリジン環は、以下の群から選択される１つ、２つ、または３つの基で非依存的に置換され得る：
分岐Ｃ_４～６アルキル基、例えば、ｔｅｒｔ－ブチル（－ｔＢｕ）、ｔｅｒｔ－ペンチル、およびネオ－ヘキシル
Ｃ_５～２０アリール基またはＣ_５～２０ヘテロアリール基
ハロ基、例えば、ブロモ（－Ｂｒ）
アシル基－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^３Ａ、式中、－Ｒ^３Ａは、Ｃ_１～６アルキルおよびＣ_５～２０アリールから選択され、例えば、アセチル（－Ａｃ）、プロピオニル、ｔｅｒｔ－ブチリル、およびベンゾイル（－Ｂｚ）である
エステル（アシルオキシ）基 －Ｃ（Ｏ）ＯＲ^３Ｂ、式中、－Ｒ^３Ｂは、Ｃ_１～６アルキルおよびＣ_５～２０アリールから選択される
逆エステル基 －ＯＣ（Ｏ）Ｒ^３Ｃ、式中、－Ｒ^３Ｃは、Ｃ_１～６アルキルおよびＣ_５～２０アリールから選択され、例えば、アセトキシ（－ＯＡｃ）である
アミド（カルボキサミド）基 －Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^３Ｄ１Ｒ^３Ｄ２、式中、－Ｒ^３Ｄ１および－Ｒ^３Ｄ２は、水素、Ｃ_１～６アルキル、およびＣ_５～２０アリールから選択される
逆アミド基 －Ｎ（Ｒ^３Ｅ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^３Ｅ２、式中、－Ｒ^３Ｅ１および－Ｒ^３Ｅ２は、水素、Ｃ_１～６アルキル、およびＣ_５～２０アリールから選択され、例えば、アセトアミド（－Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）Ｍｅ）である。

【0060】

ニトロソ基とピリジン環の間の付着位置は、特に制限されない。ニトロソ基は、ピリジン環と、ピリジン窒素原子に対してオルト位、メタ位、またはパラ位で付着し得る。好ましくは、ニトロソ基は、ピリジン環と、ピリジン窒素原子に対してメタ位で付着する。

【0061】

リンカー基とピリジン環の間の付着位置は、特に制限されない。リンカー基は、ピリジン環と、ピリジン窒素原子に対してオルト位、メタ位、またはパラ位で付着し得る。好ましくは、リンカー基は、ピリジン環と、ピリジン窒素原子に対してオルト位またはメタ位で付着する。より好ましくは、ピリジン環は、リンカー基と、ピリジン窒素原子に対してメタ位で付着する。

【0062】

一実施形態において、ニトロソ基とピリジン環の間の付着位置は、ピリジン窒素原子に対してメタ位においてであり、リンカー基とピリジン環の間の付着位置は、ピリジン窒素原子に対してオルト位またはメタ位においてである。すなわち、ニトロソピリジル基 Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－は、以下の式（ＩＶ）または（Ｖ）により表され得る：

【0063】

【化3】

【0064】

好ましくは、ニトロソピリジル基 Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－は、式（ＩＶ）によって表される。
標識－Ｘは、下記で標識－Ｘ^２について論じられているように、検出標識（－Ｘ_Ｄｅｔ）、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）、または修飾標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）を含み得る。

【0065】

好ましい実施形態において、標識 －Ｘは、修飾標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）である。すなわち、方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを、以下の式を有するプローブで捕獲するステップを含む：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ_Ｍｏｄ
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘ_Ｍｏｄは修飾標識である。

【0066】

修飾標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）は、Ｎ^６ｍＡｄｅのさらなる修飾に適した任意の官能基である。そのような官能基ハンドルは、当業者に知られている。典型的な例には、クリック反応パートナー、スルフヒドリル基もしくはアミン基などの求核基、マイケル受容体（例えば、マレイミド基）もしくは活性化エステル（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）などの求電子基、またはクロスカップリング反応パートナーが挙げられる。修飾標識は、保護された形をとり得、その保護基は、修飾標識の使用のために必要に応じて、除去され得る。

【0067】

好ましくは、前記標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）は、クリック反応パートナー（－Ｃ^１）である。したがって、方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを、以下の式を有するラジカル受容体で捕獲するステップを含む：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｃ^１
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、Ｃ^１はクリック反応パートナーである。

【0068】

クリック反応パートナーは、クリック反応において第２の反応パートナーと反応する能力がある任意の反応基を含み得る。好ましくは、クリック反応は、生体直交型クリック反応である。すなわち、生体系内で（例えば、他の生体高分子の存在下で）、その系内で天然生化学的過程に実質的に干渉することなく、起こり得るクリック反応である。

【0069】

クリック反応パートナーの例には、Ｃ_２～２０アルキニル、Ｃ_２～２０アルケニル、イソシアニド（－Ｎ^＋≡Ｃ^－）、アジド（－Ｎ_３）、ニトロン（－Ｒ_１Ｃ＝ＮＲ_２ ^＋Ｏ^－、式中、Ｒ_２はＨではない）、ニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ^＋－Ｏ^－）、およびテトラジンから選択される基が挙げられる。

【0070】

Ｃ_２～２０アルキニル（ａｌｋｅｎｙｌ）基は、Ｃ_２～１０、Ｃ_２～６、またはＣ_２～４アルキニル基であり得る。アルキニル基は、直鎖状または分岐状であり得る。アルキニル基における炭素－炭素の三重結合は、内部または末端にあり得る。

【0071】

Ｃ_２～２０アルケニル基は、Ｃ_２～１０、Ｃ_２～６、またはＣ_２～４アルケニル基であり得る。アルケニル基は、環系へ組み込まれ得る。アルケニル基は、直鎖状または分岐状であり得る。アルケニル基における炭素－炭素の二重結合は、内部または末端にあり得る。

【0072】

好ましくは、クリック反応パートナー －Ｃ^１は、Ｃ_２～２０アルキニル基を含む。より好ましくは、クリック反応パートナー －Ｃ^１は、直鎖状Ｃ_２～２０アルキニル基を含む。さらにより好ましくは、クリック反応パートナー －Ｃ^１は、末端Ｃ_２～２０アルキニル基を含む。

【0073】

一実施形態において、クリック反応パートナー －Ｃ^１は、エチニル基である。すなわち、好ましくは、方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを、以下の式（ＶＩ）を有するプローブで捕獲するステップを含む：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｃ≡ＣＨ （ＶＩ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーである。

【0074】

任意で、標識は、検出標識（－Ｘ_Ｄｅｔ）、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）、または修飾標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）の１つまたは複数を含み得る。例えば、標識は、Ｎ^６ｍＡｄｅの同定または局在性についてフルオロフォアなどの検出標識、およびＮ^６ｍＡｄｅの単離のためのビオチンなどの単離標識を含み得る。

【0075】

プローブのリンカー －Ｌ－は、標識（－Ｘ）のピリジン環への接続（すなわち、共有結合性接続）のための基を含む。適切なリンカーは当技術分野においてよく知られている。

【0076】

典型的には、リンカーは、自由原子価のうちの１つがピリジン環との一重結合の部分を形成しかつ残りの自由原子価が標識（－Ｘ）との一重結合の部分を形成する、二価基を含む。

【0077】

好ましくは、リンカーは安定なリンカーである。すなわち、リンカーは、インビボで実質的に切断または分解されることがない基を含む。安定なリンカーは、典型的には、生理的ｐＨにおいて非反応性であり、インビボで酵素作用によって実質的に分解されることがない。

【0078】

典型的には、リンカーは可動性リンカーである。すなわち、リンカーは、標識（－Ｘ）およびピリジン環が、大きな自由度でお互いに対して運動するのを可能にする。
好ましくは、リンカー －Ｌ－は以下の基を含む：
－Ｌ^１－Ｌ^２－Ｌ^３－
式中、
－Ｌ^１－は共有結合またはＣ_６～１０アリレン基から選択され；
－Ｌ^２－は、アミド結合、エステル結合、カルボニル結合、アミン結合、またはエーテル結合から選択され；
－Ｌ^３－は、Ｃ_１～１０アルキレンおよびＣ_１～１０ヘテロアルキレンから選択される。

【0079】

好ましくは、リンカーユニット －Ｌ^１－は、フェニレン基または共有結合である。
好ましくは、リンカーユニット －Ｌ^２－は、アミド結合 －Ｎ（Ｒ^Ｎ）－Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、Ｒ^Ｎは、ＨもしくはＣ_１６アルキル、またはエステル結合－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－である。より好ましくは、リンカーユニット －Ｌ^２－は、アミド結合 －Ｎ（Ｒ^Ｎ）－Ｃ（＝Ｏ）－である。

【0080】

好ましくは、リンカーユニット －Ｌ^３－は、Ｃ_１～１０アルキレン基である。より好ましくは、リンカーユニット －Ｌ^２－は、Ｃ_１～６アルキレン基である。さらにより好ましくは、リンカーユニット －Ｌ^２－は、Ｃ_１～４アルキレン基である。最も好ましくは、リンカーユニット －Ｌ^２－は、プロパン－１，３－ジイル基である。

【0081】

特に好ましいリンカーには、以下の式（ＶＩＩ）～（ＸＩＩ）を有するリンカーが挙げられる：

【0082】

【化4】

【0083】

式中、
^＊＊は、ピリジンジイル基（－Ｐｙ－）との付着位置を表し、および
^＊は、標識（－Ｘ）との付着位置を表す。

【0084】

ラジカルカチオン形成
好ましい実施形態において、求電子性ラジカルカチオンは、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基から水素を取り出して、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基にアルファ－アミノラジカルを形成するために用いられる。

【0085】

求電子性ラジカルカチオンは、前駆体から、例えば前駆体の酸化によって、形成され得る。ここで、求電子性ラジカルカチオンの形成のための前駆体は、ラジカル前駆体と名付けられる。すなわち、方法は、ラジカル前駆体を酸化して、求電子性ラジカルカチオンを形成するステップを含む。

【0086】

好ましくは、ラジカル前駆体は、第３級アミンなどのアミンであり、それは、酸化されて、第３級アミン中心ラジカルカチオンなどのアミン中心ラジカルカチオンを形成する。
第３級アミンの例には、トリアリールアミンおよび二環性アミンが挙げられる。

【0087】

好ましい第３級アミンは、キヌクリジン環系を含む。キヌクリジン環系は、置換型または非置換型であり得る。置換型キヌクリジン環系の例には、以下の３－置換型キヌクリジンが挙げられる：

【0088】

【化5】

【0089】

Ｒ位における置換は、交差反応性を低下させるためにそれが電子リッチなＣ－Ｈ結合を欠くならば、特に制限されない。例えば、Ｒ基は、ヒドロキシル基、Ｃ_１～６アルキル基、Ｃ_１～６アルコキシ基、Ｃ_１～６アシルオキシ基、Ｃ_１～６逆エステル基、または－Ｃ（ＯＨ）Ｒ^１Ｒ^２基（式中、Ｒ^１およびＲ^２はＣ_１～６アルキルから選択される）から選択され得る。

【0090】

特に好ましい実施形態において、キヌクリジン環系は非置換型である。
ラジカル前駆体を酸化して、求電子性ラジカルカチオンを形成するのに適した任意の酸化剤が用いられ得る。

【0091】

好ましくは、光触媒が、ラジカル前駆体を酸化するために用いられる。すなわち、方法は、ラジカル前駆体を光触媒的に酸化して、求電子性ラジカルカチオンを形成するステップを含む。

【0092】

光触媒は、光を吸収して、電子正孔対（励起状態）を生じる能力がある種である。ラジカル前駆体と光触媒の間の一電子移動（ＳＥＴ）は、求電子性ラジカルカチオンを生成する。

【0093】

好ましくは、光触媒は、可視光光触媒である。すなわち、可視域の光を吸収して、励起状態を形成する光触媒である。これは、光触媒を励起するために紫外（ＵＶ）光を用いる必要性を回避する。ＵＶ光は、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸を損傷または分解し得、それは、標識反応にとって有害である。

【0094】

好ましくは、光触媒についての吸収極大は４００～６００ｎｍ、より好ましくは４００～５００ｎｍ、さらにより好ましくは４００～４５０ｎｍの範囲である。
光触媒の励起状態は、典型的には、アスタリスク（^＊）を用いて示される。例えば、一般的な光触媒Ｍ（０）、励起過程は以下のように書かれ得る：
Ｍ（０）＋ｈｖ→Ｍ（０）^＊
光触媒の励起状態（三重励起状態）は、還元的かまたは酸化的かのいずれかの消光サイクルを通して、基底状態の光触媒を再生し得る。

【0095】

還元的消光サイクルにおいて、励起状態の光触媒は、まず、電子を受容して（還元されて）、より低い酸化状態での種（光触媒の還元型）を生じる。その後、光触媒は、電子を供与して（酸化されて）、基底状態の光触媒を再生する。一般的な光触媒について、還元的消光過程は、以下のように書かれ得る：
Ｍ（０）^＊＋ｅ^－→Ｍ（－１）
Ｍ（－１）－ｅ^－→Ｍ（０）
酸化的消光サイクルについて、励起状態の光触媒は、まず、電子を供与して（酸化されて）、より高い酸化状態での種（光触媒の酸化型）を生じる。その後、光触媒は、電子を受容して（還元されて）、基底状態の光触媒を再生する。一般的な光触媒について、酸化的（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）消光過程は以下のように書かれ得る：
Ｍ（０）^＊－ｅ^－→Ｍ（＋１）
Ｍ（＋１）＋ｅ^－→Ｍ（０）
光触媒は、標準参照電極、例えば、標準甘汞電極（ＳＣＥ）に対するそれらの還元電位によって特徴づけられ得る。光触媒の種（基底状態、励起状態、還元型、酸化型）のそれぞれの還元電位は知られている場合もあるし、またはそれは、標準電気化学的技術を用いて決定され得る。

【0096】

好ましくは、（励起状態かまたは還元型かのいずれかでの）光触媒は、低くとも＋１．１０Ｖ ｖｓ ＳＣＥ、より好ましくは低くとも＋１．１５Ｖ ｖｓ ＳＣＥ、さらにより好ましくは低くとも＋１．２０Ｖ ｖｓ ＳＣＥ、最も好ましくは、低くとも＋１．２５Ｖ ｖｓ ＳＣＥの還元電位を有する。

【0097】

好ましくは、（励起状態かまたは還元型かのいずれかでの）光触媒は、高くとも１．６０Ｖ ｖｓ ＳＣＥ、より好ましくは、高くとも＋１．５５Ｖ ｖｓ ＳＣＥ、さらにより好ましくは、高くとも＋１．５０Ｖ ｖｓ ＳＣＥ、最も好ましくは、高くとも＋１．４５Ｖ ｖｓ ＳＣＥの還元電位を有する。

【0098】

励起状態かまたは還元型かのいずれかでこの範囲内の還元電位を有する光触媒は、第３級アミンを酸化して、キヌクリジンラジカルカチオン（キヌクリジンは＋１．１０Ｖ ｖｓ ＳＣＥの還元電位を有する）などのアミン中心ラジカルカチオンを生成するのによくマッチしている。

【0099】

光触媒は、有機光触媒または遷移金属光触媒であり得る。
有機光触媒の例は、アクリジニウム、ピリリウム、フェノチアジン、フェノキサジン、フェナジン、フタロニトリル、またはフラビン環系に基づいたものである。具体的な例には、トリフェニルピリリウム、９－メシチル－１０－メチルアクリジニウム（Ｍｅｓ－Ａｃｒ）、エオシンＹ、フルオレセイン、リボフラビン、四酪酸リボフラビン、一リン酸リボフラビン、およびフラビンアデニンジヌクレオチドが挙げられる。

【0100】

好ましくは、光触媒は遷移金属光触媒である。
遷移金属光触媒は、典型的には、１つまたは複数のリガンドを含む。リガンドは、遷移金属光触媒において金属を安定化するのに適している任意のリガンドであり得る。

【0101】

２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、同一（ホモレプティック）または異なり（ヘテロレプティック）得る。
遷移金属光触媒についてのリガンドの例には、ビビリジン環系、フェニルピリジン環系、ビピリミジン環系、ビピラジン環系、フェナンスロリン環系、およびトリフェニレン環系に基づいたものが挙げられる。

【0102】

各リガンド環系は、置換型または非置換型であり得る。典型的には、置換には、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～３ハロアルキル、ハロゲン、およびＣ_１～３アルコキシが挙げられる。

【0103】

フェニルピリジンリガンドの例には、２－フェニルピリジン（ｐｐｙ）、２－（４－フルオロフェニル）ピリジン（ｐ－Ｆｐｐｙ）、２－（４－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン（ｐ－ＣＦ３ｐｐｙ）、４－ｔｅｒｔブチル－２－（４－フルオロフェニル）ピリジン（ｐ－Ｆ（ｔＢｕ）ｐｐｙ）、２－（２，４－ジフルオロフェニル）ピリジン（ｄＦｐｐｙ）、４－ｔｅｒｔブチル－２－（２，４－ジフルオロフェニル）ピリジン（ｄＦ（ｔ－Ｂｕ）ｐｐｙ）、２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオロメチル）ピリジン（ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ）、２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－フルオロ－ピリジン（ｄＦ（Ｆ）ｐｐｙ）、２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－メチル－ピリジン（ｄＦ（Ｍｅ）ｐｐｙ）、２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－メトキシ－ピリジン（ｄＦ（ＯＭｅ）ｐｐｙ）、２－（２－フルオロ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）－５－（トリフルオロメチル）ピリジン（ＦＣＦ３（ＣＦ３）ｐｐｙ）、４－メチル－２－（ｐ－トリル）ピリジン（Ｍｅ（Ｍｅ）ｐｐｙ）、および２－（４－フルオロフェニル）－５－メチル－ピリジン（ｐ－Ｆ（Ｍｅ）ｐｐｙ）が挙げられる。

【0104】

ビピリジンリガンドの例には、２，２’－ビピリジン（ｂｐｙ）、４，４’－ジメチル－２，２’－ビピリジン（ｄｍｂｐｙ）、４，４’－ジ－ｔｅｒｔブチル－２，２’－ビピリジン（ｄｔｂｂｐｙ）、４，４’－ビス（トリフルオロメチル）－２，２’－ビピリジン（４，４’－ｄＣＦ３ｂｐｙ）、５，５’－ビス（トリフルオロメチル）－２，２’－ビピリジン（５，５’－ｄＣＦ３ｂｐｙ）が挙げられる。

【0105】

フェニルピリジンリガンドの例には、２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－フルオロピリジン、２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－メトキシピリジン、２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－メチルピリジン、２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオロメチル）ピリジン、２－（４－フルオロフェニル）－５－メチルピリジン、および２－［２－フルオロ－４－（トリフルオロメチル）フェニル］－５－（トリフルオロメチル）ピリジンが挙げられる。

【0106】

ビピリジンリガンドの例には、２，２’－ビピリジン（ｂｐｍ）が挙げられる。
ビピラジンリガンドの例には、２，２’－ビピラジン（ｂｐｚ）が挙げられる。
フェナンスロリンリガンドの例には、１，１０－フェナンスロリン（ｐｈｅｎ）、１，４，５，８－テトラアザフェナンスレン（ｔａｐ）、およびビピリドフェナジン（ｄｐｐｚ）が挙げられる。

【0107】

トリフェニレンリガンドの例には、１，４，５，８，９，１２－ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔ）が挙げられる。
遷移金属光触媒の例は、ルテニウム（Ｒｕ）またはイリジウム（Ｉｒ）を含むものである。

【0108】

ルテニウム光触媒の具体的な例には、［Ｒｕ（ｂｐｙ）_３］^２＋、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］^２＋、［Ｒｕ（ｂｐｍ）_３］^２＋、［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］^２＋、［Ｒｕ（４，４’－ｄＣＦ_３ｂｐｙ）_３］^２＋、［Ｒｕ（ｄｍｂｐｙ）_３］^２＋、および［Ｒｕ（ｄｔｂｂｐｙ）_３］^２＋が挙げられる。

【0109】

イリジウム光触媒の例には、［Ｉｒ（ｐｐｙ）_３］、［Ｉｒ（ｄＦｐｐｙ）_３］、［Ｉｒ（ｐ－Ｆｐｐｙ）_３］、［Ｉｒ（ｐ－Ｆ（Ｍｅ）ｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）］^＋、［Ｉｒ（Ｍｅ（Ｍｅ）ｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）］^＋、［Ｉｒ（ＦＣＦ_３（ＣＦ_３）ｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）］^＋、［Ｉｒ（ｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）］^＋、［Ｉｒ（ｄＦｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）］^＋、［Ｉｒ（ｄＦ（Ｍｅ）ｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）］^＋、［Ｉｒ（ｄＦ（Ｍｅ）ｐｐｙ）_２（４，４’－ｄＣＦ_３ｂｐｙ）］^＋、［Ｉｒ（ｄＦ（Ｆ）ｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）］^＋が挙げられる。

【0110】

好ましくは、遷移金属光触媒はルテニウム光触媒である。
より好ましくは、遷移金属光触媒は、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］^２＋および［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］^２＋から選択される。最も好ましくは、遷移金属光触媒は［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］^２＋である。

【0111】

光触媒（遷移金属光触媒を含む）は、典型的には、１つまたは複数の対イオンを含む。対イオンは、光触媒を安定化するのに適している任意の対イオンであり得る。
典型的には、対イオンは負に帯電している。すなわち、典型的には、対イオンはアニオンである。アニオンの典型的な例には、ハロゲンイオン、ホウ酸イオン、およびリン酸イオンなどの無機アニオンが挙げられる。

【0112】

典型的な無機アニオンには、塩素酸イオン（Ｃｌ^－）、テトラフルオロホウ酸イオン（ＢＦ_４）^－、およびヘキサフルオロリン酸イオン（ＰＦ_６）^－が挙げられる。
任意で、遷移金属光触媒は水和物であり得る。すなわち、遷移金属光触媒は水（Ｈ_２Ｏ）を含有し得る。

【0113】

好ましくは、光触媒は、均一な光触媒である。すなわち、光触媒は、反応物として同じ相で存在する。典型的には、光触媒は、８５％または９０％水溶液などの８０％水溶液において可溶性である。水溶液は、核酸の溶解性のために好まれる。

【0114】

光触媒の水溶解度は、知られている場合もあるし、またはそれは、標準技術を用いて決定され得る。金属系およびリガンド系は、その系の水溶解度を調整するために選択することができる。

【0115】

インサイチューでのプローブ形成
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、前駆体、例えば以下の式（ＩＩ）の前駆体から、インサイチューでラジカル受容体を形成するステップを含む：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （ＩＩ）
式中、式（Ｉ）のプローブについて示されているように、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【0116】

Ｏ_２Ｎ－基は、ニトロ基と呼ばれ得る。インサイチューでニトロピリジン前駆体からニトロソピリジンを生成することは、大量のニトロソピリジンが反応の開始時点で加えられた場合に起こり得る非ラジカル副反応を低下させる。

【0117】

ニトロピリジンのニトロ基は、還元によって、ニトロソ基（Ｏ＝Ｎ－）、例えば、式（Ｉ）のプローブ中に見出されるものへ転化され得る。すなわち、方法は、式（ＩＩ）の前駆体を還元して、式（Ｉ）のプローブを形成するステップを含み得る。

【0118】

ラジカル受容体を形成するために前駆体を還元するのに適した任意の還元剤が、反応に用いられ得る。
好ましくは、ニトロピリジン（Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－）は、光触媒を用いて、ニトロソピリジン（Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－）へ還元され得る。ニトロピリジンのニトロソピリジンへの還元のための適切な光触媒には、求電子性ラジカルカチオンの形成に用いられる光触媒が挙げられる。好ましくは、求電子性ラジカルカチオンの形成に用いられる同じ光触媒がまた、ニトロピリジンをニトロソピリジンへ還元するためにも用いられる。

【0119】

添加剤
本発明の方法は、Ｎ６－メチルアデニンを含む核酸を標識するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、活性化アルケンなどの添加剤を用いて実行される。添加剤は、方法のステップ（アルファ－アミノラジカル形成およびアルファ－アミノラジカル捕獲、ならびに存在するならば、ラジカルカチオン形成およびインサイチューでのプローブ形成）のそれぞれの間、存在し得る。典型的には、添加剤は、標識反応中、反応混合物に存在する。

【0120】

好ましくは、添加剤は、活性化アルケンである。活性化アルケンには、炭素－炭素の二重結合が、電子求引基（ＥＷＧ）および／または電子供与基（ＥＤＧ）とコンジュゲートされているアルケンが挙げられる。

【0121】

適切な電子求引基には、アシル基 －Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（式中、－Ｒは、Ｃ_１～６アルキルおよびＣ_５～２０アリールから選択され、例えば、アセチル（－Ａｃ）、プロピオニル、ｔｅｒｔ－ブチリル、およびベンゾイル（－Ｂｚ）である）；エステル（アシルオキシ）基 －Ｃ（Ｏ）ＯＲ（式中、－Ｒは、Ｃ_１～６アルキルおよびＣ_５～２０アリールから選択され；アミド（カルボキサミド）基 －Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^１Ｒ^２（式中、－Ｒ^１および－Ｒ^２は、水素、Ｃ_１～６アルキル、およびＣ_５～２０アリールから選択される）が挙げられる。

【0122】

適切な電子供与基には、逆エステル基 －ＯＣ（Ｏ）Ｒ（式中、－Ｒは、Ｃ_１～６アルキルおよびＣ_５～２０アリールから選択され、例えば、アセトキシ（－ＯＡｃ）である）；および逆アミド基 －Ｎ（Ｒ^１）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２（式中、－Ｒ^１および－Ｒ^２は、水素、Ｃ_１～６アルキルおよびＣ_５～２０アリールから選択され、例えば、アセトアミド（－Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）Ｍｅ）が挙げられる。
好ましくは、添加剤は、Ｎ－アセチルデヒドロアラニンメチルエステル（Ａｃ－Ｄｈａ－Ｍｅ）である。

【0123】

さらなる態様
本発明のいくつかの態様において、以下のステップを含む、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を標識するための方法が提供される：
ｉ）（ａ）ニトロピリジル基（Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－）を含む化合物；
（ｂ）第３級アミン；および
（ｃ）光触媒
を含む反応混合物と、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を接触させるステップであって、その結果、前記化合物がＮ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位に共有結合性に付着する、ステップ。

【0124】

好ましくは、ニトロピリジル基を含む化合物は、以下の式（ＩＩ）の前駆体である：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （ＩＩ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【0125】

式（ＩＩ）の前駆体のコンポーネント（－Ｐｙ－、－Ｌ－、－Ｘ）のそれぞれについての選好は、上記で示されているような式（Ｉ）のプローブについてのそれらと同じである。

【0126】

第３級アミンについての選好は、上記で第３級アミンについて示されたものと同じである。
光触媒についての選好は、上記で求電子性ラジカルカチオンの形成について示されたものと同じである。

【0127】

典型的には、方法は、反応混合物に照射するステップ、例えば、反応混合物に可視光を照射するステップを含む。好ましくは、方法は、反応混合物に、４００～６００ｎｍの範囲、より好ましくは４００～５００ｎｍ、およびさらにより好ましくは４００～４５０ｎｍの範囲の可視光を照射するステップを含む。

【0128】

反応混合物は、当技術分野において一般的であるように、溶媒などの追加のコンポーネントを含有し得る。特に好ましい溶媒には、水－アセトニトリルの混合物、例えば、８：１または９：１の水：アセトニトリルが挙げられる。

【0129】

反応混合物は、活性化アルケンなどの添加剤を含有し得る。好ましい添加剤は上記で示されており、それには、Ｎ－アセチルデヒドロアラニンメチルエステル（Ａｃ－Ｄｈａ－Ｍｅ）が挙げられる。

【0130】

Ｎ６－メチルアデニン
本発明の方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を標識するステップを含む。典型的には、Ｎ^６ｍＡｄｅは、ヌクレオシド内に含有される。Ｎ^６ｍＡｄｅを含むヌクレオシドには、Ｎ６－メチルアデノシン（Ｎ^６ｍＡｄｏ；Ｎ^６ｍＡ）などのリボヌクレオシド、およびＮ６－メチルデオキシアデノシン（Ｎ^６ｍｄＡｄｏ；Ｎ^６ｍｄＡ）などのデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。典型的には、Ｎ^６ｍＡｄｅは、ヌクレオチド内に含有される。Ｎ^６ｍＡｄｅを含むヌクレオチドには、Ｎ６－メチルアデノシン三リン酸（Ｎ^６ｍＡＴＰ）、Ｎ６－メチルデオキシアデノシン三リン酸（Ｎ^６ｍｄＡＴＰ）、ならびにその一リン酸および二リン酸のバージョンが挙げられる。

【0131】

いくつかの実施形態において、Ｎ^６ｍＡｄｅは、核酸内に含有され得る。核酸は、２つ以上のヌクレオチド単位を含むポリマーである。核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの天然核酸であり得、またはそれは、核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、もしくはトレオース核酸（ＴＮＡ）であり得る。Ｎ^６ｍＡｄｅは、これらの要素のいずれかを含む混合核酸内に含有され得る。

【0132】

Ｎ^６ｍＡｄｅを含有する核酸は、１個または複数のＮ^６ｍＡｄｅ残基を含有し得、すなわち、少なくとも１個の核酸塩基がＮ^６ｍＡｄｅである。例えば、核酸は、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のＮ^６ｍＡｄｅを含有し得る。核酸内の１個または複数のＮ^６ｍＡｄｅ残基は、本明細書に記載された方法を用いて、標識され得る。

【0133】

方法は、試料内のＮ^６ｍＡｄｅを標識するステップを含み得る。試料は、核酸の集団を含み得る。集団は、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む１つまたは複数の核酸を含み得る。集団におけるＮ^６ｍＡｄｅを含む１つまたは複数の核酸は、本明細書に記載された方法を用いて標識され得る。

【0134】

集団における核酸は、一本鎖、二本鎖、一本鎖核酸と二本鎖核酸の混合物であり得る。例えば、細胞ゲノムＤＮＡなどの細胞核酸は、二本鎖であり得、ｃｆＤＮＡなどのセルフリー核酸は、一本鎖核酸と二本鎖核酸の混合物であり得る。

【0135】

好ましくは、集団における核酸は、ＤＮＡ分子、例えば、プラスミド、合成ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、好ましくは哺乳動物またはヒトのゲノムＤＮＡ、およびセルフリー循環ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。

【0136】

他の実施形態において、核酸は、ＲＮＡ分子、例えば、ゲノムＲＮＡ（例えば、哺乳動物、植物、またはウイルスのゲノムＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、および非コードＲＮＡであり得る。ゲノムＲＮＡには、哺乳動物、植物、またはウイルスのゲノムＲＮＡが挙げられ得る。

【0137】

集団における核酸は、１０塩基長～５０ｋ塩基長、例えば、２０塩基長～３０００塩基長であり得る。細胞源から単離された核酸は、１０００塩基長より長くあり得、本明細書に記載されているような使用のために、例えば超音波処理により、断片化され得る。いくつかの実施形態において、シーケンシング技術の選択は、集団における核酸のサイズを決定し得る。例えば、１００～１０００塩基の核酸は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングと適合し得る。

【0138】

いくつかの好ましい実施形態において、集団における核酸は、哺乳動物、好ましくはヒトの核酸であり得る。
本明細書に記載された方法は、試料から核酸の集団を単離するステップを含み得る。例えば、核酸の集団は、無傷のまたは破壊された細胞または細胞材料、例えば、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞の試料から単離され得る。適切な試料には、単離された細胞および組織試料、例えば、固形組織または腫瘍生検を含む生検が挙げられる。いくつかの実施形態において、試料は、細胞材料のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料または他の保存された試料から入手され得る。

【0139】

試料は、個体、好ましくはヒト個体、例えば、癌などの疾患状態を有しもしくは有するのではないかと疑われる患者、または健康モニタリングもしくは評価のための健康なもしくはリスクのある個体、または薬物に対する応答を評価するための、処置を受けることになっている患者から取得され得る。

【0140】

細胞の試料からゲノムＤＮＡを抽出および単離する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ゲノムＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出およびアルコール沈殿、塩化セシウム密度勾配遠心分離、固相陰イオン交換クロマトグラフィー、ならびにシリカゲルに基づいた技術などの任意の適した単離技術を用いて、単離され得る。

【0141】

試料から取得された細胞から単離された全ゲノムＤＮＡは、単離後、本明細書に記載されているような核酸の集団として直接的に用いられ得、または本明細書に記載されているようなプローブで標識する前にさらなる調製ステップに供せられ得る。

【0142】

例えば、ゲノムＤＮＡは、例えば超音波処理、剪断、またはエンドヌクレアーゼ消化により断片化されて、ゲノムＤＮＡ断片を生じ得る。ゲノムＤＮＡの全体または画分が、本明細書に記載されているように用いられ得る。ゲノムＤＮＡの適切な画分は、サイズまたは他の基準に基づき得る。

【0143】

適切な核酸集団には、例えば組織試料およびヒト細胞株由来の、ヒトゲノムＤＮＡ、ならびに線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、酵母、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）などの植物、およびマウスなどの哺乳動物モデルなどのモデル生物体由来のゲノムＤＮＡが挙げられ得る。

【0144】

適切な核酸集団にはまた、癌細胞または腫瘍、異種移植片、および他の癌モデル由来のゲノムＤＮＡ、セルフリー血漿ＤＮＡ、ならびにシングルセルＤＮＡが挙げられ得る。
分画、変性、適応、および／または他の調製ステップ後、核酸集団は、任意で、さらに精製され、本明細書に記載されているようなプローブとの反応のための適切な形で供給され得る。例えば、核酸集団は、本明細書に記載されているような処理の前に、バッファーの非存在下での水溶液中にあり得る。

【0145】

コンジュゲート
ラジカル受容体のニトロソ基とアルファ－アミノラジカルの間の反応は、以下のＮ－ヒドロキシホルムアミジン結合（－Ｎ＝Ｃ（Ｈ）－Ｎ（ＯＨ）－）：

【0146】

【化6】

【0147】

｛式中、^＊は、プローブの残部との付着位置を表す｝
の形成を生じる。
本発明のいくつかの態様において、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を標識する方法が提供され、該方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を、ニトロソピリジル基（Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－）を含むラジカル受容体と反応させて、以下の式：
ＮＡ－Ｎ＝Ｃ（Ｈ）－Ｎ（ＯＨ）－Ｐｙ－^＊
｛式中、ＮＡは核酸であり、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、^＊は、ラジカル受容体の残部との付着位置を表す｝
を有するコンジュゲートを生成するステップを含む。

【0148】

好ましくは、ラジカル受容体は式（Ｉ）のプローブである。そのような場合、方法は、以下の式：
ＮＡ－Ｎ＝Ｃ（Ｈ）－Ｎ（ＯＨ）－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ
｛式中、ＮＡは核酸であり、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、Ｌはリンカーであり、Ｘは標識である｝
を有するコンジュゲートを生成する。

【0149】

式（Ｉ）のプローブのコンポーネント（－Ｐｙ－、－Ｌ－、－Ｘ－）のそれぞれについての選好は、上記で示されている。
任意で、コンジュゲートは、アミン中心ラジカルカチオンなどの求電子性ラジカルカチオンの存在下で生成され得る。適切なアミン中心ラジカルカチオンおよびアミン中心ラジカルカチオンを生成するための適切な方法は、上記の通りである。

【0150】

任意で、式（Ｉ）のプローブは、インサイチューで式（ＩＩ）の前駆体から形成され得る。式（Ｉ）のプローブの形成のための適切な方法は、上記の通りである。

【0151】

プローブ除去
本発明の方法は、Ｎ６－メチルアデニンを含む核酸を標識するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識核酸から標識を除去するステップを含む。

【0152】

プローブのニトロソ基と、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位におけるアルファ－アミノラジカルの間の反応は、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン結合（－Ｎ＝Ｃ（Ｈ）－Ｎ（ＯＨ）－）の形成を生じる。Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基とラジカル受容体の間で形成されたＮ－ヒドロキシホルムアミジン結合の求電子性は、ヒドラジン（Ｎ_２Ｈ_２）などの求核剤による切断に対するそれの感受性を高める。そのような求核剤を用いる切断は、Ｎ６－ヒドラゾノメチルアデニンを遊離させるための迅速かつ穏やかな方法を提供し、試料の潜在的分解を回避する。

【0153】

したがって、方法は、標識核酸を、アミン求核剤などの求核剤と接触させるステップを含み得る。好ましいアミン求核剤には、第１級求核剤が挙げられる。第１級アミン求核剤の例には、以下の式を有する化合物が挙げられる：
Ｈ_２Ｎ－Ｒ^Ｎ
式中、－Ｒ^ＮはＣ_１～６アルキル基または－ＮＨ_２である。
好ましくは、求核剤はヒドラジンである。ヒドラジンは含水ヒドラジンであり得る。

【0154】

さらなる修飾
本発明の方法は、Ｎ６－メチルアデニンを含む核酸を標識するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識核酸をさらに修飾するステップを含む。

【0155】

いくつかの実施形態において、ラジカル受容体は修飾標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）を含む。これは、標識核酸を、修飾標識と共有結合し得る第２の分子と接触させることにより、標識核酸がさらに修飾されるのを可能にする。

【0156】

修飾標識と共有結合し得る分子は、当業者によって選択することができる。典型的には、それらには、クリック反応パートナー、スルフヒドリル基、マレイミド基、アミン基、またはＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性化エステルを含有する分子が挙げられる。

【0157】

スルフヒドリル基またはマレイミド基を含む修飾標識は、そのスルフヒドリル基またはマレイミド基の他方を含む分子と反応して、３－チオスクシンイミジルエーテル結合を形成し得る。アミン基またはＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性化エステルを含む修飾標識は、そのアミン基または活性化エステルの他方を含む分子と反応して、アミド結合を形成し得る。クリック反応パートナーを含む修飾標識は、クリック反応において、第２の（相補的な）クリック反応パートナーを含む分子と反応し得る。

【0158】

好ましい実施形態において、方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを、以下の式を有するプローブで捕獲するステップを含み得る：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ_Ｍｏｄ
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘ_Ｍｏｄは修飾標識である。

【0159】

そのような場合、方法は、標識核酸を、以下の式：
Ｘ_Ｐａｒ－Ｌ^４－Ｘ^２
（式中、－Ｘ_Ｐａｒはパートナー基であり、－Ｌ^４－はリンカーであり、－Ｘ^２は標識である）を有する二官能性プローブと接触させるステップであって、その結果、前記パートナー基が、前記修飾標識と反応して、前記二官能性プローブを前記標識核酸と共有結合させる、ステップをさらに含み得る。

【0160】

特に好ましい実施形態において、方法は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル基に形成されたアルファ－アミノラジカルを、以下の式を有するプローブで捕獲するステップを含み得る：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｃ^１
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、Ｃ^１はクリック反応パートナーである。

【0161】

そのような場合、方法は、標識核酸を、以下の式：
Ｃ^２－Ｌ^４－Ｘ^２
（式中、－Ｃ^２は相補性クリック反応パートナーであり、－Ｌ^４－はリンカーであり、－Ｘ^２は標識である）を有する二官能性プローブと接触させるステップであって、その結果、前記クリック反応パートナーが、反応して、前記二官能性プローブを前記標識核酸と共有結合させる、ステップをさらに含み得る。

【0162】

クリック反応パートナー －Ｃ^２は、クリック反応においてクリック反応パートナー －Ｃ^１と反応する能力がある任意の反応基を含み得る。好ましくは、クリック反応は、生体直交型クリック反応である。すなわち、生体系内で（例えば、他の生体高分子の存在下で）、その系内で天然生化学的過程に実質的に干渉することなく、起こり得るクリック反応である。

【0163】

クリック反応パートナーの例には、Ｃ_２～２０アルキニル、Ｃ_２～２０アルケニル、イソシアニド（－Ｎ^＋≡Ｃ^－）、アジド（－Ｎ_３）、ニトロン（－Ｒ_１Ｃ＝ＮＲ_２ ^＋Ｏ^－、式中、Ｒ_２はＨではない）、ニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ^＋－Ｏ^－）、およびテトラジンが挙げられる。

【0164】

好ましくは、クリック反応パートナー －Ｃ^２は、アジド（－Ｎ_３）、ニトロン（－Ｒ_１Ｃ＝ＮＲ_２ ^＋Ｏ^－、式中、Ｒ_２はＨではない）、ニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ^＋－Ｏ^－）、またはテトラジンから選択される基を含み得る。

【0165】

好ましくは、クリック反応パートナー －Ｃ^２は、アジド基（－Ｎ_３）を含む。すなわち、好ましくは、方法は、標識核酸を、以下の式（ＸＩＩＩ）を有する二官能性プローブと接触させるステップであって、その結果、前記二官能性プローブが前記標識核酸と共有結合する、ステップを含む：
Ｎ_３－Ｌ^４－Ｘ^２ （ＸＩＩＩ）
式中、Ｌ^４－はリンカーであり、－Ｘ^２は標識である。

【0166】

クリック反応パートナー －Ｃ^１がアルキニル基（Ｃ≡Ｃ）を含む場合、クリック反応パートナー －Ｃ^１は、アジド基（－Ｎ_３）を含むクリック反応パートナー －Ｃ^２と、アジド－アルキン環化付加（ＡＡＣ）、例えば、銅（Ｉ）触媒型アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）または歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）を通して、反応し得る。そのような場合、２つのクリック反応パートナー －Ｃ^１と－Ｃ^２の間の反応の生成物は、１，２，３－トリアゾール部分である。

【0167】

クリック反応パートナーＣ^１がアルキン基（Ｃ≡Ｃ）を含む場合、クリック反応パートナーＣ^１は、ニトロン基（－Ｒ_１Ｃ＝ＮＲ_２ ^＋Ｏ^－、式中、Ｒ_２はＨではない）を含むクリック反応パートナーＣ^２と、１，３－双極性環化付加を通して、反応し得る。そのような場合、２つのクリック反応パートナーＣ^１とＣ^２の間の反応の生成物は、イソキサゾリン部分である。

【0168】

クリック反応パートナー －Ｃ^１が、ノルボルネンなどのアルケン（Ｃ＝Ｃ）を含む場合、クリック反応パートナーＣ^１は、ニトリルオキシド基（－Ｃ≡Ｎ^＋－Ｏ^－）を含むクリック反応パートナー －Ｃ^２と、１，３－双極性環化付加を通して、反応し得る。そのような場合、２つのクリック反応パートナー －Ｃ^１と－Ｃ^２の間の反応の生成物は、イソキサゾリン部分である。

【0169】

クリック反応パートナー －Ｃ^１が、トランス－シクロオクテンなどのアルケン（Ｃ＝Ｃ）を含む場合、クリック反応パートナー －Ｃ^１は、テトラジン基を含むクリック反応パートナー －Ｃ^２と、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応、続いて、逆Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応を通して、反応し得る。そのような場合、２つのクリック反応パートナー －Ｃ^１と－Ｃ^２の間の反応の生成物は、ジヒドロピリダジン部分である。

【0170】

あるいは、イソシアニド部分（－Ｎ^＋≡Ｃ^－－）を含むクリック反応パートナー －Ｃ^１は、テトラジンを含むクリック反応パートナー －Ｃ^２と、［４＋１］環化付加、続いて、逆Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応を通して、反応し得る。そのような場合、２つのクリック反応パートナー －Ｃ^１と－Ｃ^２の間の反応の生成物は、ピラゾール部分である。

【0171】

任意で、方法は、標識核酸を、二官能性プローブおよび銅、例えば銅（Ｉ）塩と反応させるステップを含み得る。適切な銅（Ｉ）塩は、直接的に用いられ得る。直接的に用いられ得る銅（Ｉ）塩の例には、臭化第一銅（ＣｕＢｒ）およびヨウ化第一銅（ＣｕＩ）が挙げられる。あるいは、適切な銅（Ｉ）塩は、インサイチューで、銅（ＩＩ）塩の還元により生成され得る。銅（ＩＩ）塩の例には、硫酸銅（ＣｕＳＯ_４）または酢酸銅（Ｃｕ（ＯＡｃ）_２）が挙げられる。還元剤の例には、アスコルビン酸ナトリウムが挙げられる。

【0172】

二官能性プローブのリンカー －Ｌ^４－は、クリック反応パートナー －Ｃ^２の単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）との接続（すなわち、共有結合性接続）のための基を含む。適切なリンカーは当技術分野においてよく知られている。

【0173】

典型的には、リンカーは、自由原子価の１つがクリック反応パートナー －Ｃ^２との一重結合の部分を形成しかつ残りの自由原子価が単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）との一重結合の部分を形成する、二価基を含む。

【0174】

好ましくは、リンカーは安定なリンカーである。すなわち、リンカーは、インビボで実質的に切断または分解されることがない基を含む。安定なリンカーは、典型的には、生理的ｐＨにおいて非反応性であり、インビボで酵素作用によって実質的に分解されることがない。

【0175】

典型的には、リンカーは可動性リンカーである。すなわち、リンカーは、クリック反応パートナー －Ｃ^２および単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）が、お互いに対して大きな自由度で運動することを可能にする。

【0176】

典型的なリンカーは、アルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、およびヘテロアリレンから選択される基を含む。共有結合性接続において異なる基を含む混合型リンカー、例えば、アルキレン－アリレン（アラルキレン）およびヘテロアルキレン－アリレンが、許容され得る。

【0177】

好ましいリンカーは、アルキレンおよびヘテロアルキレン、例えば、Ｃ_２～１２アルキレン基およびＣ_２～１２ヘテロアルキレン基から選択される基を含む。より好ましいリンカーは、ヘテロアルキレン基を含む。さらにより好ましいリンカーは、ポリアルキレングリコール基を含む。最も好ましいリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含む。

【0178】

リンカーは、長さが様々であり得る。典型的には、リンカーは、２つ以上の反復ユニットを含有する。典型的には、リンカーは、多くとも８つの反復ユニットを含有する。すなわち、リンカーは、以下のように表され得る：
－Ｌ^４Ａ－（Ｌ^４Ｂ）_ｎ－
式中、
－Ｌ^４Ａ－はＣ_１～４アルキレンであり；
－Ｌ^４Ｂ－はＣ_１～４ヘテロアルキレンであり；
ｎは０～８である。

【0179】

好ましくは、ｎは０から６の間である。より好ましくは、ｎは２から４の間である。さらにより好ましくは、ｎは３である。
好ましくは、－Ｌ^４Ａ－はＣ_１～３アルキレンである。より好ましくは、－Ｌ^４Ａ－はエチレンである。

【0180】

好ましくは、－Ｌ^４Ｂ－は、Ｃ_１～４アルキレンエーテル基である。Ｃ_１～４アルキレンエーテル基の例には、メチレングリコール（－ＣＨ_２Ｏ－）、エチレングリコール（－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－）、プロピレングリコール（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－）、およびテトラメチレングリコール（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－）が挙げられる。より好ましくは、－Ｌ^４Ｂ－は、エチレングリコール（－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－）である。

【0181】

標識Ｘ^２は、検出標識（－Ｘ_Ｄｅｔ）、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）、または修飾標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）を含み得る。
検出標識（－Ｘ_Ｄｅｔ）は、Ｎ^６ｍＡｄｅの検出に適した基である。典型的な検出標識には、発色団、蛍光標識、もしくはリン光標識などの光感受性基；または放射標識が挙げられる。そのような標識は、分光学的技術などの標準実験技術により検出可能である。

【0182】

単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）は、Ｎ^６ｍＡｄｅの単離に適した基である。例えば、標識核酸を、単離標識と結合する結合剤と接触させることによる単離。典型的な単離標識には、プルダウンアッセイについてのアフィニティタグなどの結合性基が挙げられる。そのような結合性基の例には、ＧＳＴタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、およびビオチンが挙げられる。

【0183】

修飾標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）は、標識核酸のさらなる修飾に適した任意の官能基である。典型的な修飾標識は、上記の式（Ｉ）のプローブについて示されている。
好ましくは、標識－Ｘ^２は、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）を含む。すなわち、好ましくは、方法は、標識核酸を、以下の式：
Ｘ_Ｐａｒ－Ｌ^４－Ｘ_ｉｓｏ
（式中、－Ｘ_Ｐａｒはパートナー基であり、－Ｌ^４－はリンカーであり、－Ｘ_ｉｓｏは単離標識である）を有する二官能性プローブと接触させるステップであって、その結果、前記パートナー基が前記修飾標識と反応して、前記二官能性プローブを前記標識核酸と共有結合させる、ステップを含む。
単離標識の標識核酸への組入れは、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸の単離を可能にする。
好ましくは、単離標識はビオチンである。

【0184】

抽出
本発明の方法は、Ｎ６－メチルアデニンを含む核酸を標識するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識核酸を単離するステップを含む。

【0185】

いくつかの実施形態において、ラジカル受容体プローブは、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）を含む。他の実施形態において、修飾標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）で標識された核酸は、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）を含有する二官能性プローブとの反応により、さらに修飾される。いずれの場合においても、標識核酸は、標識核酸を、単離標識と結合する結合剤と接触させることにより、単離され得る。

【0186】

典型的には、結合剤は、単離標識と選択的に結合する。例えば、結合剤は、単離標識を欠く核酸より、優先的に、単離標識を含む核酸と結合する。適切な結合剤は当技術分野において知られている。

【0187】

典型的な結合剤には、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン抗体、またはニュートラアビジン（ビオチンを結合する）などのビオチン結合性タンパク質；グルタチオン（ＧＳＴタグを結合する）；および抗体（ｍｙｃ－およびＦＬＡＧ－などのエピトープタグを結合する）が挙げられる。

【0188】

好ましくは、結合剤はストレプトアビジンである。
結合剤は、固体支持体に固定化され得る。固体支持体は、捕獲分子が標識核酸の捕獲のために固定化され得る表面を提示する不溶性の非ゼラチン状の物体である。適切な支持体の例には、スライドグラス、マイクロウェル、膜、マイクロビーズ、またはナノ粒子が挙げられる。支持体は、微粒子または固体の形をとり得、例として、プレート、試験管、ビーズ、ボール、フィルター、織物、ポリマー、または膜が挙げられる。結合剤は、例えば、不活性ポリマー、９６ウェルプレート、またはクロマトグラフィーに用いられる固定相に固定され得る。結合剤の、固体支持体の表面への固定化は当技術分野において周知である。いくつかの実施形態において、固体支持体自体が固定化され得る。例えば、マイクロビーズは、第２の固体表面上に固定化され得る。好ましい実施形態において、固体支持体は、磁気マイクロビーズなどのマイクロビーズである。

【0189】

いくつかの実施形態において、標識核酸は、試料から抽出され得る。そのような場合、方法は、標識核酸が結合している固定化結合剤を、試料から抽出するステップを含む。抽出のための適切な方法は当技術分野において知られており、その方法には、濾過、遠心分離、または磁気マイクロビーズが用いられる場合、磁石を用いることによるなどが挙げられる。

【0190】

抽出後、標識核酸が結合している固定化結合剤は洗浄され得る。洗浄は、結合剤と選択的に結合していない試料コンポーネント、例えば、非標識核酸または他の試料コンポーネントを除去する。

【0191】

単離後、標識核酸は、固定化結合剤から遊離され得る。結合した基質を遊離させるための方法は当技術分野においてよく知られている。
上記で述べられているように、プローブは、アミン求核剤などの求核剤を用いて、除去され得る。好ましい実施形態において、標識核酸は、アミン求核剤を用いて、固定化結合剤から遊離され得る。すなわち、標識核酸が結合している固定化結合剤を、アミン求核剤と接触させ得る。典型的なアミン求核剤には、第１級求核剤が挙げられる。第１級アミン求核剤の例には、以下の式を有する化合物が挙げられる：
Ｈ_２Ｎ－Ｒ^Ｎ
式中、－Ｒ^ＮはＣ_１～６アルキル基または－ＮＨ_２である。

【0192】

好ましくは、求核剤はヒドラジンである。ヒドラジンは含水ヒドラジンであり得る。
遊離した核酸は、アデニン上にＮ６－（ヒドラゾノメチル）基（－Ｎ＝Ｃ（Ｈ）＝Ｎ－ＮＨ_２）を含む。すなわち、遊離した核酸は、以下の式によって表され得る：
ＮＡ－Ｎ＝Ｃ（Ｈ）＝Ｎ－ＮＨ_２
式中、ＮＡは核酸である。

【0193】

濃縮（Enrichment）
一実施形態において、Ｎ^６ｍＡｄｅ含有核酸は、核酸集団から抽出され得る。Ｎ^６ｍＡｄｅ含有核酸は、本発明の方法を用いて、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）で標識され得る。標識Ｎ^６ｍＡｄｅ含有核酸は、標識Ｎ^６ｍＡｄｅ含有核酸を、固定化結合剤などの結合剤と接触させることにより単離され得る。標識Ｎ^６ｍＡｄｅ含有核酸が結合している固定化結合剤は、核酸集団から抽出され得る。

【0194】

抽出後、固定化結合剤は洗浄され得る。洗浄は、結合剤に結合していない試料コンポーネントを除去する。例えば、標識Ｎ^６ｍＡｄｅを欠く核酸。典型的には、洗浄手順は、水性バッファーなどの、核酸を除去することができる溶媒で洗浄することを含む。

【0195】

単離後、標識Ｎ^６ｍＡｄｅ含有核酸は、固定化結合剤から遊離され得る。結合した基質を遊離させるための方法は当技術分野においてよく知られている。
上記で述べられているように、プローブは、アミン求核剤などの求核剤を用いて、除去され得る。好ましい実施形態において、Ｎ^６ｍＡｄｅ含有核酸は、ヒドラジンを用いて、固定化結合剤から遊離され得る。すなわち、標識Ｎ^６ｍＡｄｅ含有核酸が結合している固定化結合剤を、ヒドラジンと接触させ得る。

【0196】

本発明者らは、標識方法において形成された微量の副産物が、ラジカル受容体をグアニン（Ｇｕａ）に付着させることを見出している。本発明者らはまた、標識核酸が結合している固定化結合剤の処理が、優先的に標識Ｎ^６ｍＡｄｅ含有核酸を遊離させ、標識Ｇｕａ含有核酸を結合剤に保持することも見出している。

【0197】

検出
本発明の方法は、Ｎ６－メチルアデニンを含む核酸を標識するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識核酸を検出するステップを含む。

【0198】

いくつかの実施形態において、プローブは、検出標識（－Ｘ_Ｄｅｔ）を含む。これは、標識核酸が、検出標識を検出する実験技術を用いて、検出されるのを可能にする。典型的な実験技術には、蛍光分光法（蛍光標識を利用する）、リン光分析法（リン光標識を利用する）、および質量分析法または核磁気共鳴法（放射標識を利用する）が挙げられる。

【0199】

検出は、細胞内で起こり得る。細胞は、インビトロであり得、単離された細胞、例えば、単離された細胞株または個体から単離された細胞であり得る。あるいは、細胞は、インビトロで、かつ生きている生物体内であり得る。

【0200】

マッピング
本発明の方法は、Ｎ６－メチルアデニンを含む核酸を標識するステップを含む。核酸をＮ^６ｍＡｄｅにおいて標識することは、その核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅの位置が決定されることを可能にする。

【0201】

したがって、本発明は、以下のステップを含む、標的核酸内のＮ^６ｍＡｄｅの位置をマッピングするための方法を提供する：
ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸を供給するステップであって、前記標的核酸が既知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）本明細書に記載されたＮ^６ｍＡｄｅを標識するための方法を用いて、標的核酸を標識するステップ；
ｉｉｉ）標的核酸を増幅して、核酸断片の集団を生じるステップ；
ｉｖ）前記核酸断片の集団をシーケンシングして、前記核酸断片の塩基配列を決定するステップ；および
ｖ）前記核酸断片のヌクレオチド配列を標的核酸のヌクレオチド配列と比較するステップであって、前記核酸断片のヌクレオチド配列の終止が、前記標的核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅ残基の位置を示す、ステップ。

【0202】

増幅（複製）ステップは、任意の適切な増幅方法を用いて、実行され得る。適切な増幅方法は知られており、それには、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例として、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１９；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ０９５１０９参照）が挙げられる。

【0203】

増幅ステップは典型的には、標識核酸を適切なポリメラーゼまたはポリメラーゼ断片と接触させることを含む。適切なポリメラーゼには、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。適切なポリメラーゼ断片には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が挙げられる。

【0204】

増幅ステップは典型的には、ポリメラーゼ反応の開始のために、標識核酸を適切なプライマーと接触させることを含む。標的核酸の一次ヌクレオチド配列が知られている場合、適切なプライマーは、公知の技術を用いてデザインされ得る。プライマーの核酸へのハイブリダイゼーションについての適切な技術およびプロトコールは、知られている。

【0205】

好ましくは、方法は、アダプターを標的核酸の１つまたは両方の末端にライゲーションするステップを含む。適切なアダプターは、典型的には、プライマー結合部位（ユニバーサルシーケンシングプライマーなどのプライマーに相補的である領域）を含む。これは、増幅またはシーケンシングプロセスが、既知のプライマーを用い得るように、既知の配列を提供する。アダプターは、追加として、固体支持体（例えば、フローセルまたはビーズ）と結合したオリゴヌクレオチドに相補的である領域を含む。これは、核酸が、固体支持体上に固定化されるのを可能にする。アダプターは、追加として、固有のインデックス配列を含み得る。これは、試料の識別子を提供し、シングルシーケンシングランまたはフローセルレーンにおける複数の試料の多重化／プールを可能にする。適切なアダプターは当技術分野において知られており、典型的には、用いられるシーケンシングプラットフォームに依存する。適切なシーケンシングプラットフォームには、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標）およびＴｒｕＳｅｑ（商標））、ＬｉｆｅＴｅｃｈ ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ ４５４、およびＰａｃＢｉｏ ＲＳが挙げられる。

【0206】

アダプターを核酸にライゲーションするための適切な方法は知られている。例えば、二本鎖ゲノム核酸の集団は、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）またはクレノウ（ｅｘｏ－）などのｄＡテーリングポリメラーゼでの増幅または伸長後などに、ｄＡオーバーハング（ｄＡテール）を含有し得るか、または二本鎖核酸分子が、平滑末端化され得、ｄＡオーバーハングが付加されて、最初のシーケンシングアダプターのライゲーションを促進し得る。ｄＡオーバーハングを平滑末端化核酸分子に付加するための適切な方法は知られている。

【0207】

典型的には、標的核酸の１つまたは両方の末端とのアダプターのライゲーションは、標識反応の前に実施される。
増幅反応は、標識Ｎ^６ｍＡｄｅ部位に達した時点で、停止（終止）し得る。したがって、増幅ステップは、Ｎ^６ｍＡｄｅ部位の直前の部位（－１位）において終止する核酸断片の集団を生じる。増幅ステップは「ポリメラーゼストップ」アッセイとして知られ得る。

【0208】

停止はまた、Ｎ^６ｍＡｄｅ部位の反対の位置（０位）およびＮ^６ｍＡｄｅ部位の後の位置（＋１位）においても起こり得る。しかしながら、本発明者らは、これらの停止事象があまり頻繁ではないこと、および停止が主に－１位において起こることを観察している。したがって、増幅ステップの主な産物は、完全長標的核酸に対して－１位において終止する核酸断片である。

【0209】

増幅反応の停止（終止）は、より大きい（より立体的にかさ高い）基が標識反応中に導入された場合、向上し得る。本発明者らは、核酸を単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）で標識すること、およびその標識核酸を、固体支持体上に固定化された結合剤で結合することが、適切な部位（－１位）における増幅反応の終止を確実にするのに特に効果的であることを見出している。そのような場合、増幅反応は、核酸が固体支持体に結合している間に、実行することができる（例えば、「ビーズ上で（ｏｎ ｂｅａｄ）」の増幅）。

【0210】

核酸は、核酸を、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）を含むラジカル受容体プローブと接触させることにより、または修飾標識（－Ｘ_Ｍｏｄ）で標識された核酸を、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）を含有する二官能性プローブでさらに修飾することにより、単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）で標識され得る。

【0211】

したがって、好ましい実施形態において、標的核酸内のＮ^６ｍＡｄｅの位置をマッピングするための方法は、以下のステップを含む：
ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸を供給するステップであって、前記標的核酸が既知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）前記標的核酸を、本明細書に記載されているような単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）で標識するステップ；
ｉｉｉ）前記単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）と結合する結合剤と前記核酸を接触させるステップであって、前記結合剤が固体支持体上に固定化されている、ステップ；
ｉｖ）前記固体支持体上に結合した標的核酸を増幅して、核酸断片の集合を生じるステップ；
ｖ）前記核酸断片の集合をシーケンシングして、核酸断片のヌクレオチド配列を決定するステップ；および
ｖｉ）前記核酸断片のヌクレオチド配列を、前記標的核酸のヌクレオチド配列と比較するステップであって、前記核酸断片のヌクレオチド配列の終止が、前記標的核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅ残基の位置を示す、ステップ。

【0212】

適切な単離標識（－Ｘ_Ｉｓｏ）は、－Ｘ^２基について上記で示されている。好ましくは、単離標識はビオチンである。
適切な結合剤は、抽出ステップについて上記で示されている。好ましくは、結合剤はストレプトアビジンである。

【0213】

適切な固体支持体は、抽出ステップについて上記で示されている。好ましくは、固体支持体は、磁気マイクロビーズなどのマイクロビーズである。
増幅ステップ後（かつシーケンシングステップ前）、標識は、核酸から除去され得る。上記で述べられているように、本明細書で開示されたプローブ化合物（例えば、式Ｉのプローブ）は、Ｎ^６ｍＡｄｅのＮ６－メチル位と反応して、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン結合を形成する。このＮ－ヒドロキシホルムアミジン結合は、求核剤を用いて、切断され得る。したがって、方法は、増幅ステップ後、標識核酸を求核剤と接触させて、標識を除去するステップを含み得る。適切な求核剤は、上記で、プローブ除去ステップについて示されており、同じ選好が適用される。

【0214】

増幅ステップは、Ｎ^６ｍＡｄｅ部位の直前の部位（－１位）で停止する。したがって、増幅ステップは、結果として、完全長標的核酸と結合した（ハイブリダイズした）核酸断片を生じる。したがって、二本鎖核酸部分および一本鎖オーバーハング部分がある。好ましくは、一本鎖オーバーハングは、シーケンシングステップ前に除去される。一本鎖核酸を除去または消化するための方法は、知られている。好ましくは、エキソヌクレアーゼが用いられる。したがって、方法は、シーケンシングステップ前に、核酸をエキソヌクレアーゼと接触させて、オーバーハングを除去するステップを含み得る。

【0215】

シーケンシングステップは、任意の適切なシーケンシング技術またはプラットフォームを用いて実行され得る。適切なシーケンシング技術およびプラットフォームには、サンガーシーケンシング、Ｓｏｌｅｘａ－Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標）またはＴｒｕＳｅｑ（商標））、ライゲーションに基づいたシーケンシング（ＳＯＬｉＤ（商標））、ピロシーケンシング、１分子リアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ（商標））、ＰａｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅシーケンシング、および半導体アレイシーケンシング（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標））が挙げられる。好ましくは、シーケンシングは、次世代シーケンシングによって実施される。より好ましくは、Ｓｏｌｅｘａ－Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標））が用いられる。

【0216】

核酸シーケンシングについての適切なプロトコール、試薬、および装置は知られており、市販されている。具体的な例には、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＦＳ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）が挙げられる。

【0217】

用いられるシーケンシング技術またはプラットフォームは、標的核酸とライゲーションされたアダプターと適合性がある。すなわち、アダプターは、増幅反応についてのプライマー結合部位、およびシーケンシングプラットフォームについてのプライマー結合部位を含む。これらの２つのプライマー結合部位は、同じまたは異なり得る。

【0218】

方法は、核酸断片のヌクレオチド配列を標的核酸のヌクレオチド配列と比較するステップを含む。増幅ステップは、Ｎ^６ｍＡｄｅ位置に達した時点で、停止（終止）する（すなわち、ポリメラーゼ停止は、Ｎ^６ｍＡｄｅの反対側のヌクレオチドの取込みの直前に、－１位で起こる）。したがって、核酸断片のヌクレオチド配列を標的核酸のヌクレオチド配列とアライメントおよび比較することは、標的核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅの位置を示す。

【0219】

いくつかの実施形態において、シーケンシングは、繰り返されて、核酸断片の配列リードの１セットを提供する。例えば、１０個以上、１００個以上、または１０００個以上の配列リードが決定され得る。

【0220】

配列リードは、日常的なバイオインフォマティクス技術により分析され得る。例えば、低品質の配列リード、およびアダプターをシーケンシングすることからのみ生じるリードは、除去され得、配列リードは、参照配列とアライメントされ得る。

【0221】

核酸断片の同定された配列リードは、分析されて、核酸集団においてＮ^６ｍＡｄｅ部位の場所を決定し得る。核酸集団がゲノムＤＮＡである場合、核酸断片は、分析されて、ゲノムにおけるＮ^６ｍＡｄｅ部位の場所を決定し得る。例えば、集団における核酸の配列における位置で終止する核酸断片の配列リードは、その位置におけるＮ^６ｍＡｄｅ部位の存在を示し得る。いくつかの実施形態において、集団における核酸の配列における位置で終止する配列リードの、他の位置に対する比率の増加は、その位置におけるＮ^６ｍＡｄｅ部位の存在を示し得る。

【0222】

核酸集団におけるＮ^６ｍＡｄｅ部位のパターンまたはマップは、配列リードのセットから決定され得る。細胞の試料から取得されたゲノムＤＮＡ分子の集団について、細胞のゲノムまたはゲノムの一部におけるＮ^６ｍＡｄｅ部位のパターンまたはマップは、配列リードのセットから決定され得る。

【0223】

上記で示されたマッピング方法において、標的核酸の一次ヌクレオチド配列は知られている。すなわち、基準塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）の配列は知られている。しかしながら、本発明の方法はまた、一次ヌクレオチド配列が知られていない標的核酸のヌクレオチド配列におけるＮ^６ｍＡｄｅの位置を決定するために用いることができる。そのような場合、方法は、標準シーケンシング技術を用いて標的核酸の一次ヌクレオチド配列を決定するステップを含む。サンガーシーケンシングおよびＳｏｌｅｘａ－Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標）またはＴｒｕＳｅｑ（商標））などの標準シーケンシング技術は、アデニン（Ａ）とＮ６－メチルアデニンを区別せず、その位置においてＡと読む。

【0224】

したがって、方法は以下のステップを含み得る：
ｉ）Ｎ^６ｍＡｄｅを含む標的核酸の集団を供給するステップであって、前記標的核酸が未知の一次ヌクレオチド配列を有する、ステップ；
ｉｉ）前記集団の最初の部分をシーケンシングして、前記標的核酸の一次ヌクレオチド配列を決定するステップ。

【0225】

未知のヌクレオチド配列を有する標的核酸の一次ヌクレオチド配列を決定するための方法は知られている。適切なシーケンシング技術およびプラットフォームには、サンガーシーケンシング、Ｓｏｌｅｘａ－Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標）またはＴｒｕＳｅｑ（商標））、ライゲーションに基づいたシーケンシング（ＳＯＬｉＤ（商標））、ピロシーケンシング、１分子リアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ（商標））、ＰａｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅシーケンシング、および半導体アレイシーケンシング（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標））が挙げられる。好ましくは、シーケンシングは、次世代シーケンシングによって実施される。より好ましくは、Ｓｏｌｅｘａ－Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標））が用いられる。

【0226】

核酸シーケンシングについての適切なプロトコール、試薬、および装置は知られており、市販されている。具体的な例には、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＦＳ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）が挙げられる。

【0227】

シーケンシングステップは典型的には、標的核酸の１つまたは両方の末端へアダプターをライゲーションするステップを含む。適切なアダプターは、任意で固体支持体（例えば、フローセルまたはビーズ）との結合のための部位と共に、既知のプライマーを用い得るシーケンシングプロセスについてのプライマー結合部位、および／または固有のインデックス配列を含む。適切なアダプターは当技術分野において知られており、典型的には、用いられるシーケンシングプラットフォームに依存する。適切なシーケンシングプラットフォームには、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標）およびＴｒｕＳｅｑ（商標））、ＬｉｆｅＴｅｃｈ ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ ４５４、およびＰａｃＢｉｏ ＲＳが挙げられる。
アダプターを核酸にライゲーションするための適切な方法は知られている。

【0228】

使用
本発明のいくつかの態様において、ラジカル受容体として以下の式（Ｉ）の化合物の使用が提供される：
Ｏ＝Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （Ｉ）
式中、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、Ｘは標識である。

【0229】

式（Ｉ）の化合物の各コンポーネントについての選好は上記に示されている。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ^６ｍＡｄｅ）のＮ６－メチル位に形成されるアルファ－アミノラジカルに対するラジカル受容体として用いられる。

【0230】

化合物
本発明のいくつかの態様において、以下の式（ＩＩＩ）の化合物が提供される：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｃ^１ （ＩＩＩ）
式中、－Ｐｙ－ピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｃ^１は、アルキニル、アルケニル、またはイソシアニド（－Ｎ^＋≡Ｃ^－）から選択される基などのクリック反応パートナーである。

【0231】

式（ＩＩＩ）の化合物のコンポーネント（－Ｐｙ－、－Ｌ－）のそれぞれについての選好は、上記で示されているような式（Ｉ）のプローブについての選好と同じである。
特に好ましい実施形態において、以下の式を有する化合物が提供される：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｃ≡ＣＨ
式中、式（Ｉ）のプローブについて示されているように、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、同じ選好が適用される。

【0232】

特に好ましい実施形態において、式Ｐ１～Ｐ７の化合物から選択される化合物が提供される。好ましくは、化合物はＰ７である。

【0233】

【表A】

【0234】

キット
本発明の一態様は、以下を含むキットに関する：
（ａ）ニトロピリジル基（Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－）を含む化合物；および
（ｂ）第３級アミン；および
（ｃ）光触媒。

【0235】

ニトロピリジル基を含む適切な化合物は、上記で示されている。好ましくは、ニトロピリジル基を含む化合物は以下の式（ＩＩ）の前駆体である：
Ｏ_２Ｎ－Ｐｙ－Ｌ－Ｘ （ＩＩ）
式中、上記で示されているように、－Ｐｙ－はピリジンジイル基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｘは標識である。

【0236】

適切な第３級アミンは上記で示されている。好ましくは、第３級アミンは以下の式を有するキヌクリジンである：

【0237】

【化7】

【0238】

式中、Ｒは、水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ_１～６アルキル基、Ｃ_１～６アルコキシ基、Ｃ_１～６アシルオキシ基、Ｃ_１～６逆エステル基、または－Ｃ（ＯＨ）Ｒ^１Ｒ^２基（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、Ｃ_１～６アルキルから選択される）から選択される。

【0239】

適切な光触媒は、上記で示されている。好ましくは、光触媒は、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］^２＋または［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］^２＋などのルテニウムまたはイリジウム光触媒である。

【0240】

キットは、適切な容器において、および／または適切なパッケージングで、提供され得る。
任意で、キットは、使用説明書、例えば、Ｎ^６ｍＡｄｅを含む核酸を標識する方法におけるキットの使用方法に関する書面での使用説明書を含み得る。

【0241】

キットは、核酸単離試薬をさらに含み得る。適切な試薬は当技術分野において周知であり、それには、スピンクロマトグラフィーカラムが挙げられる。
キットは、Ｎ^６ｍＡｄｅを含有する核酸への化合物の付着のための標識バッファーをさらに含み得る。

【0242】

キットは、特異的な結合剤をさらに含み得る。結合剤は、キットにおける化合物の単離標識と特異的に結合し得る。例えば、特異的な結合メンバーは、ビオチン単離標識と結合し得る。適切な結合剤には、ストレプトアビジンが挙げられる。結合剤は、固体支持体上に固定化されておりまたは固定可能であり得る。

【0243】

キットは、固体支持体をさらに含み得る。固体支持体は、結合剤でコーティングされており、またはコーティング可能であり得る。適切な固体支持体は、上で記載されており、それには、磁気ビーズが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態において、化合物の単離標識はビオチンであり、固体支持体はストレプトアビジンコーティング化磁気ビーズである。磁気ビーズの精製のために、キットに磁石が含まれ得る。

【0244】

任意で、キットは、化合物を核酸から除去するための試薬、または核酸を結合剤から遊離させるための試薬を含み得る。化合物を核酸から除去するための適切な試薬には、上記で示されているように、アミン求核剤およびヒドラジンが挙げられる。

【0245】

キットは、バッファー溶液、シーケンシング試薬、および他の試薬などの、方法に必要とされる１つまたは複数の他の試薬を含み得る。
キットは、シーケンシングアダプター、および単離された核酸の末端へのシーケンシングアダプターの付着のための１つまたは複数の試薬、例えばＴ４リガーゼ、を含み得る。

【0246】

キットは、増幅プライマーを用いる核酸集団の増幅のための１つまたは複数の試薬を含み得る。適切な試薬には、耐熱性ポリメラーゼ、例えば、高い識別力のポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、および適切なバッファーが挙げられ得る。

【0247】

キットは、対照として用いられる１つまたは複数のオリゴヌクレオチドをさらに含み得る。適切な陽性対照オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＮ^６ｍＡｄｅを含む核酸であり得る。

【0248】

適切な陰性対照オリゴヌクレオチドは、Ｎ^６ｍＡｄｅを欠く核酸であり得る。
Ｎ^６ｍＡｄｅの標識、濃縮、または検出に用いられるキットは、方法の実施のための１つまたは複数の物品および／または試薬、例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ単離および精製試薬を含む、試験試料自体を供給するための手段、試料取扱い容器（そのようなコンポーネントは一般的には無菌である）、ならびにバッファー溶液、シーケンシング試薬、および他の試薬などの、方法に必要とされる他の試薬を含み得る。

【0249】

塩、溶媒和化合物、および他の形
ラジカル受容体、プローブ、前駆体、および光触媒の塩の例には、全ての塩が挙げられ、例えば、非限定的に、ＨＣｌ塩およびＨＢｒ塩などの強い鉱酸の酸付加塩、ならびにメタンスルホン酸塩などの強い有機酸の付加塩である。塩のさらなる例には、硫酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩またはトリクロロ酢酸塩などの酢酸塩が挙げられる。

【0250】

本明細書に記載された、ラジカル受容体、プローブ、前駆体、光触媒、または任意の他の化合物への言及は、その化合物の溶媒和化合物への言及でもある。溶媒和化合物の例には、水和物が挙げられる。

【0251】

本明細書に記載された、ラジカル受容体、プローブ、前駆体、光触媒、または任意の他の化合物には、原子が、天然に存在する、または天然に存在しない同位元素によって置き換えられている化合物が挙げられる。一実施形態において、その同位元素は、安定同位元素である。したがって、本明細書に記載された化合物には、例えば、重水素含有化合物およびその他同種類のものが挙げられる。例えば、Ｈは、任意の同位体の形をとり得、例えば、^１Ｈ、^２Ｈ（Ｄ）、および^３Ｈ（Ｔ）である；Ｃは、任意の同位体の形をとり得、例えば、^１２Ｃ、^１３Ｃ、および^１４Ｃである；Ｏは、任意の同位体の形をとり得、例えば、^１６Ｏおよび^１８Ｏである、などである。

【0252】

本明細書に記載された化合物のいずれも、１つまたは複数の特定の幾何学的、光学的、鏡像異性の、ジアステレオ異性の、エピマーの、アトロプの（ａｔｒｏｐｉｃ）、立体異性の、互変異性の、立体構造的、またはアノマーの形をとって存在し得、それには、シス型およびトランス型；Ｅ型およびＺ型；ｃ型、ｔ型、およびｒ型；エンド型およびエキソ型；Ｒ型、Ｓ型、およびメソ型；Ｄ型およびＬ型；ｄ型およびｌ型；（＋）型および（－）型；ケト型、エノール型、およびエノラート型；シン型およびアンチ型；シンクリナル型およびアンチクリナル型；α型およびβ型；アキシャル型およびエクトリアル型；ボート型、イス型、ツイスト型、エンベロープ型、および半イス型；ならびにそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されず、以下、まとめて、「異性体」（または「異性型」）と呼ばれる。

【0253】

下記で論じられているように互変異性の形を除いて、本明細書で用いられる場合、用語「異性体」から、構造（または構成）異性体（すなわち、単に空間における原子の位置によるだけというよりむしろ、原子間の接続の点で異なる異性体）が明確に排除されることは留意されたい。例えば、メトキシ基、－ＯＣＨ_３への言及は、それの構造異性体、ヒドロキシメチル基、－ＣＨ_２ＯＨへの言及と解釈されるべきではない。同様に、オルト－クロロフェニルへの言及は、それの構造異性体、メタ－クロロフェニルへの言及と解釈されるべきではない。しかしながら、構造のクラスへの言及は、そのクラス内に入る構造異性型を十分、含み得る（例えば、Ｃ_１～６アルキルは、ｎ－プロピルおよびイソ－プロピルを含む；ブチルは、ｎ－、イソ－、ｓｅｃ－、およびｔｅｒｔ－ブチルを含む；メトキシフェニルは、オルト－、メタ－、およびパラ－メトキシフェニルを含む）。

【0254】

他に定めのない限り、特定の化合物への言及は、全てのそのような異性型（その混合物（例えば、ラセミ混合物）も含む）を含む。そのような異性型の調製（例えば、不斉合成）および分離（例えば、分別再結晶およびクロマトグラフィー法）のための方法は、当技術分野において知られているか、または本明細書に教示された方法もしくは公知の方法を公知の様式で適応させることにより容易に得られるかのいずれかである。

【0255】

本発明の一態様は、実質的に精製された形での、および／または夾雑物を実質的に含まない形での化合物に関する。
一実施形態において、実質的に精製された形は、少なくとも５０重量％、例えば少なくとも６０重量％、例えば少なくとも７０重量％、例えば少なくとも８０重量％、例えば少なくとも９０重量％、例えば少なくとも９５重量％、例えば少なくとも９７重量％、例えば少なくとも９８重量％、例えば少なくとも９９重量％である。

【0256】

定めのない限り、実質的に精製された形は、任意の立体異性型または鏡像異性型の化合物を指す。例えば、一実施形態において、実質的に精製された形は、立体異性体の混合物、すなわち、他の化合物に対して精製されたものを指す。一実施形態において、実質的に精製された形は、１つの立体異性体、例えば、光学的純粋な立体異性体を指す。一実施形態において、実質的に精製された形は、鏡像異性体の混合物を指す。一実施形態において、実質的に精製された形は、鏡像異性体の等モルの混合物（すなわち、ラセミ混合物、ラセミ体）を指す。一実施形態において、実質的に精製された形は、１つの鏡像異性体、例えば、光学的純粋な鏡像異性体を指す。

【0257】

一実施形態において、夾雑物は、５０重量％以下、例えば４０重量％以下、例えば３０重量％以下、例えば２０重量％以下、例えば１０重量％以下、例えば５重量％以下、例えば３重量％以下、例えば２重量％以下、例えば１重量％を占める。

【0258】

定めのない限り、夾雑物は、他の化合物、すなわち、立体異性体と鏡像異性体を除く化合物を指す。一実施形態において、夾雑物は、他の化合物および他の立体異性体を指す。一実施形態において、夾雑物は、他の化合物および他の鏡像異性体を指す。

【0259】

一実施形態において、実質的に精製された形は、少なくとも６０％光学的純粋（すなわち、モルベースで化合物の６０％が、所望の立体異性体または鏡像異性体であり、４０％が、望まれていない立体異性体または鏡像異性体である）、例えば少なくとも７０％光学的純粋、例えば少なくとも８０％光学的純粋、例えば少なくとも９０％光学的純粋、例えば少なくとも９５％光学的純粋、例えば少なくとも９７％光学的純粋、例えば少なくとも９８％光学的純粋、例えば少なくとも９９％光学的純粋である。

【0260】

定義
アルキル基は、一価飽和炭化水素基である。アルキル基は、Ｃ_１～６アルキル基、例えば、Ｃ_１～４、Ｃ_１～３、またはＣ_１～２アルキル基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_１～６）は、炭化水素主鎖における炭素原子の数を表示する。アルキル基は直鎖状または分岐状であり得る。

【0261】

Ｃ_１～６直鎖状アルキル基の例には、メチル（－Ｍｅ）、エチル（－Ｅｔ）、ｎ－プロピル（－ｎＰｒ）、ｎ－ブチル（－ｎＢｕ）、ｎ－ペンチル（－Ａｍｙｌ）、およびｎ－ヘキシルが挙げられる。Ｃ_１～６分岐状アルキル基の例には、イソ－プロピル（－ｉＰｒ）、イソ－ブチル（－ｉＢｕ）、ｓｅｃ－ブチル（－ｓＢｕ）、ｔｅｒｔ－ブチル（－ｔＢｕ）、イソ－ペンチル、ｓｅｃ－ペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオ－ペンチル、イソ－ヘキシル、ｓｅｃ－ヘキシル、ｔｅｒｔ－ヘキシル、およびネオ－ヘキシルが挙げられる。

【0262】

アルケニル基は、１つまたは複数の炭素－炭素二重結合を含有する一価不飽和炭化水素である。アルケニル基は、Ｃ_２～２０アルケニル基、例えば、Ｃ_２～１０、Ｃ_２～６、またはＣ_２～４アルケニル基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_１～６）は、炭化水素主鎖における炭素原子の数を表示する。アルケニル基は、直鎖状または分岐状であり得る。アルケニル基は、環系へ組み入れられ得る。

【0263】

直鎖状アルケニル基の例には、エテニル（ビニル）、１－プロペニル、２－プロペニル（アリル）、１－ブテニル、１－ペンテニル、および１－ヘキセニルが挙げられる。分岐状アルケニル基の例には、イソプロペニル（１－メチルビニル）が挙げられる。環系へ組み入れられたアルケニル基の例には、ノルボルネン、オキサノルボルネン、およびトランス－シクロオクテン（ｃｙｃｌｏｃｔｅｎｅ）が挙げられる。

【0264】

アルキニル基は、１つまたは複数の炭素－炭素三重結合を含有する一価不飽和炭化水素である。アルキニル基は、Ｃ_２～２０アルキニル基、例えば、Ｃ_２～１０、Ｃ_２～６、またはＣ_２～４アルキニル基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_１～６）は、炭化水素主鎖における炭素原子の数を表示する。アルキニル基は、直鎖状または分岐状であり得る。アルキニル基は、環系へ組み入れられ得る。

【0265】

直鎖状アルキニル基の例には、エチニルおよび２－プロピニル（プロパルギル）が挙げられる。環系へ組み入れられたアルキニル基の例には、シクロオクチン（ＯＣＴ）が挙げられる。

【0266】

アリール基は、環原子の全部が炭素原子である芳香環を含む一価炭化水素基である。アリール基は、Ｃ_５～２０アリール基、例えば、Ｃ_５～１４、Ｃ_５～１０、またはＣ_５～６アリール基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_５～１０）は、環原子の数または範囲を表示する。アリール基は、単環式であり得、またはそれは、縮合環系における２つ以上の環を含み得る。縮合環系において、アリール基は、２つ以上の環を含み、その環の少なくとも１つが、環原子の全部が炭素原子である芳香環であり、かつ各環が、それぞれの隣接する（縮合している）環と、２個の隣接環原子を共有する。したがって、橋頭原子は、直接的に結合している。

【0267】

単環式アリール基の例には、ベンゼンに由来した基（フェニル）が挙げられる。縮合環を含むアリール基の例には、以下に由来した基が挙げられる：インダン（２，３ジヒドロ－１Ｈ－インデン）、インデン、イソインデン；ナフタレン、ジアリン（１，２－ジヒドロナフタレン）、テトラリン（１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン）、アズレン；アセナフテン；フルオレン、フェナレン；ならびにアントラセンおよびフェナントレン。

【0268】

ヘテロアリール基は、１個または複数の環原子がヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、およびＳである芳香環を含むアリール基である。ヘテロアリール基は、Ｃ_５～２０ヘテロアリール基、例えば、Ｃ_５～１４、Ｃ_５～１０、またはＣ_５～６ヘテロアリール基であり得る。ヘテロアリール基は、単環式であり得、またはそれは、縮合環系における２つ以上の環を含み得る。縮合環系において、ヘテロアリール基は、２つ以上の環を含み、その環の少なくとも１つが、１個または複数の環原子がヘテロ原子である芳香環であり、かつ各環が、それぞれの隣接する（縮合している）環と、２個の隣接環原子を共有する。したがって、橋頭原子は、直接的に結合している。

【0269】

単環式Ｃ_５～２０ヘテロアリール基の例には、以下に由来した基が挙げられる：ピロール（アゾール）、ピラゾール（１，２－ジアゾール）、イミダゾール（１，３－ジアゾール）、トリアゾール、テトラゾール；フラン（オキソール）；チオフェン（チオール）；オキサゾール、イソキサゾール、オキサジアゾール（例えば、フラザン）、オキサトリアゾール；チアゾール、イソチアゾール；ピリジン（アジン）、ピリダジン（１，２－ジアジン）、ピリミジン（１，３－ジアジン）、ピラジン（１，４－ジアジン）、トリアジン；およびイソキサジン。

【0270】

縮合環を含むＣ_５～２０ヘテロアリール基の例には、以下に由来した基が挙げられる：インドール、イソインドール、インドリジン、インドリン、イソインドリン、プリン、ベンズイミダゾール、インダゾール、アザインドール、ベンゾトリアゾール；ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、インドリジン、インドリン、イソインドリン、プリン、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンゾキサゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾジオキソール、ベンゾフラザン、ベンゾトリアゾール、ベンゾチオフラン、ベンゾチアゾール、ベンゾチアジアゾール；ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、インドリジン、インドリン、イソインドリン、プリン、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンゾキサゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾジオキソール、ベンゾフラザン、ベンゾトリアゾール、ベンゾチオフラン、ベンゾチアゾール、ベンゾチアジアゾール；ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、インドリジン、インドリン、イソインドリン、プリン、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンゾキサゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾジオキソール、ベンゾフラザン、ベンゾトリアゾール、ベンゾチオフラン、ベンゾチアゾール、ベンゾチアジアゾール；キノリン、イソキノリン、キノリジン、キノキサリン、フタラジン、キナゾリン、シンノリン、ナフチリジン、ピリドピリミジン、ピリドピラジン、プテリジン；クロメン、イソクロメン、クロマン、イソクロマン、ベンゾジオキサン、キノリン、イソキノリン、キノリジン、ベンゾキサジン、ベンゾジアジン、ピリドピリジン、キノキサリン、キナゾリン。シンノリン、フタラジン、ナフチリジン、プテリジン；ベンゾジアゼピン；カルバゾール、カルボリン、ペリミジン、ピリドインドール；カルバゾール、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、カルボリン、ペリミジン、ピリドインドール；アクリジン、フェナジン、フェナンチリジン、フェナントロリン、フェナジン、アクリジン、キサンテン、チオキサンテン、オキサントレン、フェノキサチイン、フェナジン、フェノキサジン、フェノチアジン、チアントレン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン。

【0271】

ヒドロキシル基は、－ＯＨまたはこの基の水酸化物の形である。
アルコキシ基は、－ＯＲであり、式中、Ｒはアルキル基である。アルコキシ基の例には、メトキシ（－ＯＭｅ）、エトキシ（－ＯＥｔ）、ｎ－プロポキシ（－Ｏ（ｎＰｒ））、イソプロポキシ（－Ｏ（ｉＰｒ））、ｎ－ブトキシ（－Ｏ（ｎＢｕ））、ｓｅｃ－ブトキシ（－Ｏ（ｓＢｕ））、イソ－ブトキシ（－Ｏ（ｉＢｕ））、およびｔｅｒｔ－ブトキシ（－Ｏ（ｔＢｕ））が挙げられる。

【0272】

アシル基は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈまたは－Ｃ（＝Ｏ）Ｒであり、式中、－Ｒは、置換型または非置換型のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールから選択される。アシル基の例には、ホルミル、アセチル（－Ａｃ）、プロピオニル、ｔｅｒｔ－ブチリル、およびベンゾイル（－Ｂｚ）が挙げられる。

【0273】

アシルオキシ（エステル）基は、－Ｃ（Ｏ）ＯＲであり、式中、－Ｒは、置換型または非置換型のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールから選択される。

【0274】

逆エステル基は、－ＯＣ（Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒは、置換型または非置換型のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールから選択される。逆エステル基の例には、アセトキシ（－ＯＡｃ）が挙げられる。

【0275】

アミド（カルボキサミド）基は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^１Ｒ^２であり、式中、－Ｒ^１および－Ｒ^２は、非依存的に、置換型または非置換型のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールから選択される。アミド基の例には、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ_３、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＥｔ、および－Ｃ（＝Ｏ）ＮＥｔ_２、加えて、例えば、ピペリジノカルボニル、モルホリノカルボニル、チオモルホリノカルボニル、およびピペラジノカルボニルにおいてのような、Ｒ^１およびＲ^２が、それらが結合している窒素原子と共に、ヘテロサイクリック構造を形成するアミド基が挙げられるが、それらに限定されない。

【0276】

逆アミド基は、－Ｎ（Ｒ^１）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２であり、式中、－Ｒ^１および－Ｒ^２は、非依存的に、置換型または非置換型のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールから選択される。逆アミド基の例には、アセトアミド（－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｍｅ）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｅｔ、および－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｐｈが挙げられる。Ｒ^１およびＲ^２は一緒に、例えば、スクシンイミジル、マレイミジル、およびフタルイミジルにおいてのように、サイクリック構造を形成し得る。

【0277】

アルキレン（アルカンジイル）基は、２つの自由原子価が非依存的に、一重結合の部分を形成して、隣接原子を分離させる、二価飽和炭化水素基である。
アルキレン基は、Ｃ_１～６アルキレン基、例えば、Ｃ_１～４またはＣ_１～３アルキレン基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_１～６）は、炭化水素主鎖における原子の数を表示する。アルキレン基は直鎖状または分岐状であり得る。直鎖状アルキレン基の例には、メタンジイル（メチレン架橋）、エタン－１，２－ジイル（エチレン架橋）、プロパン－１，３－ジイル、ブタン－１，４－ジイル、ペンタン－１，５－ジイル、およびヘキサン－１，６－ジイルが挙げられる。分岐状アルキレン基の例には、エタン－１，１－ジイルおよびプロパン－１，２－ジイルが挙げられる。

【0278】

ヘテロアルキレン基は、１個または複数の炭素原子がヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、およびＳと置き換えられているアルキレン基である。ヘテロアルキレン基は、Ｃ_１～６ヘテロアルキレン基、例えば、Ｃ_１～４またはＣ_１～３ヘテロアルキレン基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_１～６）は、炭素原子かヘテロ原子かに関わらず、ヘテロアルキレン主鎖における原子の数を表示する。ヘテロアルキレン基は直鎖状または分岐状であり得る。直鎖状ヘテロアルキレン基の例には、オキシメチレン（例えば、ポリオキシメチレン、ＰＯＭ）、エチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、エチレンイミン（例えば、直鎖状ポリエチレンイミン、ＰＥＩ；ポリアジリジン）、およびテトラメチレングリコール（例えば、ポリテトラメチレングリコール、ＰＴＭＥＧ；ポリテトラヒドロフラン）に由来した基が挙げられる。分岐状ヘテロアルキレン基の例には、プロピレングリコール（例えば、ポリプロピレングリコール ＰＰＧ）に由来した基が挙げられる。窒素原子がヘテロアルキレン基に存在する場合、その窒素原子は、非置換型（ＮＨ）であり得、または任意で、アルキル基で置換され得る。硫黄原子がヘテロアルキレン基に存在する場合、その硫黄原子は、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、またはＳ（Ｏ）_２であり得る。

【0279】

シクロアルキレン基は、環原子の全部が炭素原子である環を含み、かつ２つの自由原子価がそれぞれ、隣接原子と一重結合の部分を形成する、二価飽和炭化水素基である。シクロアルキレン基は、Ｃ_５～６シクロアルキレン基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_５～６）は、環原子の数または範囲を表示する。シクロアルキレン基は単環式であり得る。単環式シクロアルキレン基の例には、１，３－シクロペンチレンおよび１，４－シクロへキシレンが挙げられる。

【0280】

ヘテロシクロアルキレン（ヘテロシクレン）基は、１個もしくは複数の炭素原子がヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、およびＳと置き換えられている、または１個もしくは複数の炭素原子がオキソ置換基（＝Ｏ）を有する、シクロアルキレン基である。ヘテロシクロアルキレン基は、Ｃ_５～６ヘテロシクロアルキレン基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_５～６）は、炭素原子かヘテロ原子かに関わらず、環原子の数または範囲を表示する。ヘテロシクロアルキレン基は単環式であり得る。窒素原子がヘテロアルキレン基に存在する場合、その窒素原子は、非置換型（ＮＨ）であり得、または任意で、アルキル基で置換され得る。硫黄原子がヘテロアルキレン基に存在する場合、その硫黄原子は、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、またはＳ（Ｏ）_２であり得る。

【0281】

アリレン（アレンジイル）基は、環原子の全部が炭素原子である芳香環を含み、かつ２つの自由原子価がそれぞれ、隣接原子と一重結合の部分を形成する、二価炭化水素基である。アリレン基は、Ｃ_６～１０アリレン基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_６～１０）は、環原子の数または範囲を表示する。アリレン基は、単環式であり得、またはそれは、２つ以上の環を含み得る。単環式アリレン基の例には、１，４－フェニレン（１，４－ベンゼンジイル）が挙げられる。二環式アリレン基の例には、２，６－ナフタレンジイルが挙げられる。

【0282】

ヘテロアリレン基は、１個もしくは複数の環原子がヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、およびＳである、または１個もしくは複数の炭素原子がオキソ置換基（＝Ｏ）を有する、芳香環を含むアリレン基である。ヘテロアリレン基は、Ｃ_６～１０ヘテロアリレン基であり得る。この関連において、接頭辞（例えば、Ｃ_６～１０）は、炭素原子かヘテロ原子かに関わらず、環原子の数または範囲を表示する。ヘテロアリレン基は、単環式であり得、またはそれは、２つ以上の環を含み得る。単環式ヘテロアリレン基の例には、２，５－ピリジンジイルおよび２，５－ピロールジイルが挙げられる。

【0283】

アミド結合は、－Ｎ（Ｒ^Ｎ）－Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、－Ｒ^Ｎは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびアリールから選択される。アミン結合は、窒素原子かまたは炭素原子のいずれかが隣接基と結合するように、方向づけられ得る。

【0284】

エステル結合は－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－である。エステル結合は、エーテルの酸素原子かまたはカルボニルの炭素原子のいずれかが隣接基と結合するように、方向づけられ得る。
カルボニル結合は－Ｃ（＝Ｏ）－である。

【0285】

アミン結合は、－Ｎ（Ｒ^Ｎ）－であり、式中、Ｒ^Ｎは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびアリールから選択される。
エーテル（オキシ）結合は、－Ｏ－である。

【0286】

他の選好
上記の実施形態のありとあらゆる適合性組合せが、あたかもありとあらゆる組合せが個々にかつ明確に列挙されているかのように、本明細書で明確に開示される。

【0287】

本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示を鑑みれば、当業者に明らかだろう。
本明細書で用いられる場合の「および／または」は、その２つの特定された特徴またはコンポーネントのそれぞれの、その他方と共でまたは無しでの、特定の開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、および（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの特定の開示として、あたかもそれぞれが本明細書で個々に示されているかのように、解釈されるべきである。

【0288】

文脈上、他に指示がない限り、上記で示された特徴の説明および定義は、本発明のいかなる特定の態様にも実施形態にも限定されず、記載されている全ての態様および実施形態へ等しく適用される。

【0289】

本発明のある特定の態様および実施形態は、ここで、実施例として、かつ上記の図を参照して、例証される。
配列
本発明は、以下に挙げられた配列識別番号を参照して、本明細書に記載される：
配列番号１：ＤＮＡ鋳型１
配列番号２：ＤＮＡ鋳型２
配列番号３：リバースプライマー１
配列番号４：リバースプライマー２

【実施例】

【0290】

実験および結果
１．一般的な注釈
プロトン核磁気共鳴（^１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、周囲温度で、４００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ分光計（４００ＭＨｚ）または５００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ Ｓｍａｒｔ Ｐｒｏｂｅ分光計（５００ＭＨｚ）において記録された。化学シフト（δ）は、ｐｐｍで報告され、ＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）、ＤＭＳＯ－ｄ６（２．５０ｐｐｍ）、メタノール－ｄ４（３．３１ｐｐｍ）における残留プロトンに対して最も近い０．０１ｐｐｍへ引用され、結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で引用された。結合定数は、最も近い０．１Ｈｚへ引用され、多重度は、以下の慣例に従って報告された：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｑｎｔ＝五重線、ｓｘｔ＝六重線、ｓｐｔ＝七重線、ｏｃｔ＝八重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝幅広線、および関連した組合せ、例えば、ｄｄ＝二重の二重線。同時発生した結合定数が観察されている場合、プロトン共鳴の見かけ（ａｐｐ）の多重度が報告されている。データは、以下の通り、報告された：化学シフト（多重度、結合定数、プロトンの数、および分子帰属）。

【0291】

炭素核磁気共鳴（１３Ｃ ＮＭＲ）スペクトルは、周囲温度で、４００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ分光計（１０１ＭＨｚ）または５００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ Ｓｍａｒｔ Ｐｒｏｂｅ分光計（１２６ＭＨｚ）において記録された。化学シフト（δ）は、ｐｐｍで報告され、ＣＤＣｌ３（７７．１６ｐｐｍ）、ＤＭＳＯ－ｄ６（３９．５２ｐｐｍ）、およびメタノール－ｄ４（４９．００ｐｐｍ）における残留溶媒ピークに対して最も近い０．１ｐｐｍへ引用された。ＤＥＰＴ１３５、ＮＯＥ実験、および２次元実験（ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、およびＨＳＱＣ）が、適切な場合、帰属を裏付けるために用いられたが、本明細書には含まれなかった。

【0292】

ＬＣＭＳスペクトルは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ）と接続されたＡｍａｚｏｎ Ｘ ＥＳＩ－ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ）において記録された。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、１０ｍＭトリエチルアミンおよび１００ｍＭヘキサフルオロ－２－プロパノールの水溶液に対して、５～３０％メタノールの勾配を用いて、ＴＭＳエンドキャッピングを有するＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（１２５Å、２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）で分析された。小分子は、０．１％ギ酸を含む水に対して、０．１％ギ酸を含む０～１００％アセトニトリルの勾配で、Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム（１００Å、２．６μｍ、５０×２．１ｍｍ）において分析された。官能基化の研究におけるヌクレオシドおよび官能基化ＯＤＮｓの消化後のヌクレオシドは、１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む水に対して、０～１００％アセトニトリルの勾配で、Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム（１００Å、２．６μｍ、５０×２．１ｍｍ）において分析された。示されたマスクロマトグラムは基準ピーククロマトグラムであり、ＵＶ吸収は、２６０ｎｍにおいて記録された。

【0293】

小分子の高解像度質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－ＭＳ ９０３０ ＱＴｏＦを用いて行われた。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、１０ｍＭトリエチルアミンおよび１００ｍＭヘキサフルオロ－２－プロパノールの水溶液に対して、５～３０％メタノールの勾配を用いて、ＴＭＳエンドキャッピングを有するＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（１２５Å、２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）で分析された。小分子は、０．１％ギ酸を含む水に対して、０．１％ギ酸を含む０～１００％アセトニトリルの勾配で、Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム（１００Å、２．６μｍ、５０×２．１ｍｍ）において分析された。

【0294】

分析薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、あらかじめコーティングされたＭｅｒｃｋガラス裏打ちのシリカゲルプレート（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ ０．２ｍｍ）を用いて実施された。可視化は、紫外線（２５４ｎｍ）および必要に応じて、塩基性過マンガン酸カリウム溶液での化学染色を用いて達成された。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、空気の陽圧下のＦｌｕｋａもしくはＭａｔｅｒｉａｌ Ｈａｒｖｅｓｔのシリカゲル（２３０～４００メッシュ）、または５０μｍ Ｓｉ－ＨＰ ＰｕｒｉＦｌａｓｈカラムを用いるＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ Ｒｆ ２００（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ）システムにおいて行われた。

【0295】

自動ゲル電気泳動は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２２００ ＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎならびにＤ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅｓおよび試料バッファーを用いて実施された。

【0296】

ｑＰＣＲは、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実施され、データは、ＣＦＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｍａｎａｇｅｒ ３．１（ＢｉｏＲａｄ）を用いて処理された。ｑＰＣＲ反応（体積：１０μＬ）は、ＤＮＡ較正または試料混合物（１μＬ）、対応するフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ、１μＭ）、ならびにＢｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５μＬ）を含有した。反応は、製造会社のプロトコールに従って実行された。較正曲線が、分析された試料中の標的ＤＮＡの量を決定するために作成された。

【0297】

反応のための短いＯＮＤｓを含むオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮｓ）、９９ｎｔ ｓｓＤＮＡ鎖、ならびに９９ｎｔ ｄｓＤＮＡ鎖の合成のための鋳型およびプライマーは、カスタム合成され、ＡＴＤＢｉｏまたはＳｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈによりＨＰＬＣ精製され、ｍｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏへの溶解後、さらなる精製なしに用いられた。

【0298】

試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＴＣＩ、またはＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手され、さらなる精製なしに用いられた。酵素溶液は、Ｚｙｍｏ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、およびＳｉｇｍａから入手され、直接、用いられた。プローブ化合物である、５－ニトロ－２－フェニルピリジンおよび３－ニトロ－４－フェニルピリジンは、商業的供給源（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手できた。

【0299】

ジクロロメタン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、トルエン、および石油エーテル（４０～６０）は、標準方法を用いて、乾燥および蒸留された。水は、ｍｉｌｌｉＱシステムにおいて精製された。用いられた他の溶媒は、無水として購入され、他に指定がない限り、さらなる精製なしに用いられた。
反応は、他に指定がない限り、窒素雰囲気下で実行された。反応は、ＬＣＭＳによりモニターされた。

【0300】

一般的手順
一般的手順Ａ：短いＯＤＮにおけるＮ ^６ ｍｄＡのキヌクリジンおよび誘導体での官能化：
２ｍｌマイクロ波バイアルに、ＯＤＮ基質（ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ、１２．５μＬ中２００μＭ）を含有する溶液を加えた。別のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、適当量のキヌクリジンまたはそれの誘導体を、［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］（ＰＦ_６）_２（ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ中２０％ＭｅＣＮの１ｍｌにおいて２ｍｇ、２．３ｍＭ、１２．５μＬ）または［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］Ｃｌ_２（ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ中２０％ＭｅＣＮにおいて２ｍＭ、１２．５μＬ）のストック溶液を用いて溶解した。その後、その後者の混合物を、ＯＤＮ溶液に加え、１５～２０秒間のフラッシング後、マイクロ波バイアルを窒素雰囲気下で密封した。その後、バイアルを、１５Ｗ ＣＦＬバルブから５ｃｍの所へ置いた。反応物を、５時間、照射し、ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ（２５μＬ）で希釈し、予洗されたＭｉｎｉ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｏｌｉｇｏ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｒｏｃｈｅ）に通して濾過した。得られた混合物を、ＬＣＭＳにより直接、分析した。

【0301】

一般的手順Ｂ：短いＯＤＮにおけるＮ ^６ ｍｄＡの３－ニトロピリジンおよび誘導体での官能化：
２ｍｌマイクロ波バイアルに、ＯＤＮ基質（ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ、１２．５μＬ中２００μＭ）を含有する溶液を加えた。別のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、キヌクリジン（５．５ｍｇ、５０μｍｍｏｌ）および適当量の３－ニトロピリジンまたはそれぞれの誘導体を、［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］（ＰＦ_６）_２（ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ中２０％ＭｅＣＮの１ｍｌにおいて２ｍｇ、２．３１ｍＭ、１２．５μＬ）またはＲｕ（ｐｈｅｎ）_３Ｃｌ_２（ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ中２０％ＭｅＣＮの１ｍＬにおいて１．５ｍｇ、２．１ｍＭ、１２．５μＬ）のストック溶液を用いて溶解した。その後、その後者の混合物を、前記オリゴ溶液に加え、マイクロ波バイアルを窒素雰囲気下で密封し、１５～２０秒間、フラッシングした。その後、バイアルを、１５ Ｗ ＣＦＬもしくは５５ Ｗ ＣＦＬバルブからおよそ１ｃｍの所に、または５５Ｗ ＣＦＬバルブの内側の蒸留水浴中に置いた（その場合、温度管理のために送風機を用いた）。反応物を、１０分間（他に指示がないならば）、照射し、水（２５μＬ）で希釈し、予洗されたＭｉｎｉ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｏｌｉｇｏ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｒｏｃｈｅ）に通して濾過した。得られた混合物を、ＬＣＭＳにより直接、分析した。

【0302】

一般的手順Ｃ：短いＯＤＮにおける官能化Ｎ ^６ ｍｄＡへのクリック反応
１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおける一般的手順Ｂから生じたＯＤＮ混合物（２５μＬ）へ、キヌクリジン（１０μＬのｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ中に溶解された５．５ｍｇ、５０μｍｏｌ）、アジド－ＰＥＧ_３－ビオチンコンジュゲート（２０ｍＭ、５μＬ）、アスコルビン酸ナトリウム（４０ｍＭ、５μＬ）、およびＣｕＳＯ_４（２ｍＭ、５μＬ）を加えた。最終濃度：キヌクリジン：１Ｍ、アジド－ＰＥＧ_３－ビオチンコンジュゲート：２ｍＭ、アスコルビン酸ナトリウム：４ｍＭ、ＣｕＳＯ_４：０．２ｍＭ。室温での３０分間の反応後、反応物を、予洗されたＭｉｎｉ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｏｌｉｇｏ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｒｏｃｈｅ）に通して濾過した。得られた混合物を、ＬＣＭＳにより直接、分析した。

【0303】

一般的手順Ｄ：短いＮ ^６ ｍｄＡ ＯＤＮのストレプトアビジン磁気ビーズでの濃縮
１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ微量遠心管における一般的手順Ｃから生じたＯＤＮ混合物へ、５×適応した結合バッファー（４０μＬ；２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）およびｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ（２００μＬの最終体積として）を加えた。ストレプトアビジンＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（登録商標）常磁性粒子（３００μＬの１ｍｇ／ｍｌ懸濁液）を、１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ微量遠心管において懸濁し、磁気スタンド上で保存バッファーから分離し、０．５×ＳＳＣバッファー（２００μＬ；７５ｍＭ ＮａＣｌ、７．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）で２回、および１×適応した結合バッファー（２００μＬ；５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）で１回、洗浄した。そのオリゴ溶液（２００μＬ）を、常磁性粒子に加え、室温での１０分間のインキュベーション後、上清を、ＬＣＭＳ分析のために収集した。そのビーズは、１×適応した結合バッファー（３×２００μＬ）で入念に洗浄し、その後、２００ｕｌ適応した結合バッファーを含む新しい微量遠心管へ移し、適応した結合バッファー（１×２００μＬ）で別の機会に、洗浄した。その後、それらを、１００ｍＭ ＮａＯＨ（２００μＬで、室温、３×１０分間）中でインキュベートし、最後に、再び、適応した結合バッファー（３×２００μＬ）で洗浄した。保持されたオリゴヌクレオチドの溶出を、１０％含水ヒドラジン（２５μＬ）との室温で５分間のインキュベーションにより実施し、続いて、水（２５μＬ）でさらに洗浄した。２５ｕＬの両方の画分を組み合わせ、予洗されたＭｉｎｉ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｏｌｉｇｏ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｒｏｃｈｅ）を通して濾過し、ＬＣＭＳにより直接、分析した。

【0304】

一般的手順Ｅ：濃縮のための９９ｎｔ ｓｓＤＮＡにおけるＮ ^６ ｍｄＡの３－ニトロピリジンプローブでの官能化
２ｍｌマイクロ波バイアルに、２つのＯＤＮ基質（メチル化および非メチル化、ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ中２μＭ、各１２．５μＬ）の混合物を加えた。別のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、キヌクリジン（８．２５ｍｇ、７５μｍｏｌ）および３－ニトロピリジンプローブ（０．３ｍｇ、１．３μｍｏｌ）を、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］Ｃｌ_２（ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ中３０％ＭｅＣＮの１ｍｌにおける３ｍＭ、１２．５μＬ）の保存溶液を用いて溶解した。その後、後者の混合物をＯＤＮ混合物に加えた。サケ精子ＤＮＡを加えた反応物について、２ｕｌのサケ精子ｓｓＤＮＡ溶液（５ｍｇ／ｍｌ、ａｂｃａｍ ａｂ２２９２７８）を、光酸化還元反応の前に、加えた。最終濃度：ＯＤＮｓ：各０．６７μＭ、キヌクリジン：２Ｍ、３－ニトロピリジンプローブ：３３ｍＭ、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］Ｃｌ_２：１ｍＭ、Ｈ_２Ｏ中１０％ＭｅＣＮ。マイクロ波バイアルを、１５～２０秒間のフラッシング後、窒素雰囲気下で密封した。その後、そのバイアルを、５５Ｗ ＣＦＬバルブの内側へ置いた。温度を送風機で維持しながら、その混合物に、５分間、照射し、引き続いて、反応後、予洗されたＭｉｃｒｏ ＢｉｏＳｐｉｎ ６ ｃｏｌｕｍｎ（ＢｉｏＲａｄ）に通して濾過した。

【0305】

一般的手順Ｆ：９９ｎｔ ｓｓＤＮＡにおける官能化Ｎ ^６ ｍｄＡへのクリック反応
１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおける一般的手順Ｅから生じたＯＤＮ混合物へ、キヌクリジン（８．２５ｍｇ、１０μＬ Ｈ_２Ｏ中７５μｍｏｌｅ）、アジド－ＰＥＧ_３－ビオチンコンジュゲート（２０ｍＭ、７．５μＬ）、アスコルビン酸ナトリウム（４０ｍＭ、７．５μＬ）、およびＣｕＳＯ_４（２ｍＭ、７．５μＬ）を加えた。最終濃度：キヌクリジン：１Ｍ、アジド－ＰＥＧ_３－ビオチンコンジュゲート：２ｍＭ、アスコルビン酸ナトリウム：４ｍＭ、ＣｕＳＯ_４：０．２ｍＭ。室温での３０分間の反応後、その混合物を、予洗されたＭｉｃｒｏ ＢｉｏＳｐｉｎ ６ ｃｏｌｕｍｎ（ＢｉｏＲａｄ）に通して２回、濾過した。

【0306】

一般的手順Ｇ：濃縮のための９９ｎｔ ｄｓＤＮＡにおけるＮ ^６ ｍｄＡの３－ニトロピリジンプローブでの官能化
２ｍｌマイクロ波バイアルに、２つのｄｓＯＤＮ基質（メチル化および非メチル化、ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ中０．２５～０．３５μＭ、各８．３μＬ）の混合物を加えた。別のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、キヌクリジン（５．５ｍｇ、５０μｍｏｌ）および３－ニトロピリジンプローブ（０．２ｍｇ）を、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］Ｃｌ_２（ｍｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ中３０％ＭｅＣＮの１ｍｌにおける３ｍＭ、８．３μＬ）の保存溶液を用いて溶解した。その後、後者の混合物をＯＤＮ混合物に加えた。サケ精子ＤＮＡを加えた反応物について、２ｕｌのサケ精子ｓｓＤＮＡ溶液（５ｍｇ／ｍｌ、ａｂｃａｍ ａｂ２２９２７８）を、光酸化還元反応の前に、加えた。最終濃度：ＯＤＮｓ：各０．０８～０．１２μＭ、キヌクリジン：２Ｍ、３－ニトロピリジンプローブ：３３ｍＭ、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３］Ｃｌ_２：１ｍＭ、Ｈ_２Ｏ中１０％ＭｅＣＮ。マイクロ波バイアルを、１５～２０秒間のフラッシング後、窒素雰囲気下で密封した。その後、そのバイアルを、５５Ｗ ＣＦＬバルブの内側へ置いた。温度を送風機で維持しながら、その混合物に、５分間、照射し、引き続いて、反応後、予洗されたＭｉｃｒｏ ＢｉｏＳｐｉｎ ６ ｃｏｌｕｍｎ（ＢｉｏＲａｄ）に通して濾過した。

【0307】

一般的手順Ｈ：９９ｎｔ ｄｓＤＮＡにおける官能化Ｎ ^６ ｍｄＡへのクリック反応
１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおける一般的手順Ｅから生じたＯＤＮ混合物へ、キヌクリジン（５．５ｍｇ、５μＬ Ｈ_２Ｏ中５０μｍｏｌｅ）、アジド－ＰＥＧ_３－ビオチンコンジュゲート（２０ｍＭ、７．５μＬ）、アスコルビン酸ナトリウム（４０ｍＭ、７．５μＬ）、およびＣｕＳＯ_４（２ｍＭ、μＬ）を加えた。最終濃度：キヌクリジン：１Ｍ、アジド－ＰＥＧ_３－ビオチンコンジュゲート：２ｍＭ、アスコルビン酸ナトリウム：４ｍＭ、ＣｕＳＯ_４：０．２ｍＭ。室温での３０分間のインキュベーション後、その反応物を、予洗されたＭｉｃｒｏ ＢｉｏＳｐｉｎ ６ ｃｏｌｕｍｎ（ＢｉｏＲａｄ）に通して２回、濾過した。

【0308】

一般的手順Ｉ：Ｎ ^６ ｍｄＡ ９９ｎｔ ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ ＯＤＮのストレプトアビジン磁気ビーズでの濃縮
１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ微量遠心管における一般的手順Ｃから生じたＯＤＮ混合物（７５μＬまたは５０μＬ）へ、５×適応した結合バッファー（４０μＬ；２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）、ポリ［ｄＩ：ｄＣ］（５μＬ；５μｇ／μｌ）、および水（２００μＬの総体積へと、８０μＬまたは１０５μＬ）を加えた。ストレプトアビジンＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（登録商標）常磁性粒子（１００μＬの１ｍｇ／ｍｌ懸濁液）を、磁気スタンド上で保存バッファーから分離し、０．５×ＳＳＣバッファー（２００μＬ；７５ｍＭ ＮａＣｌ、７．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）で２回、およびポリ［ｄＩ：ｄＣ］（５μＬ；５μｇ／μＬ）を含む、１×適応した結合バッファー（２００μＬ；５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）で１回、洗浄した。そのオリゴ溶液（２００μＬ）を、予洗された常磁性粒子に加え、室温での１０分間のインキュベーション後、上清を、ｑＰＣＲによる両方のＯＤＮ配列の定量化のために収集した。そのビーズは、１×適応した結合バッファー（３×２００μＬ）で３回、洗浄し、その後、２００ｕｌ適応した結合バッファーを含む新しい微量遠心管へ移し、適応した結合バッファー（２００μＬ）で別の機会に、洗浄した。その後、それらを、１００ｍＭ ＮａＯＨ中、室温、１０分間、３回（３×２００μＬ）、インキュベートし、最後に、再び、適応した結合バッファーで３回（３×２００μＬ）、洗浄した。結合したオリゴヌクレオチドの溶出を、１０％含水ヒドラジン（２５μＬ）との室温で５分間のインキュベーションにより実施した。水（２５μＬ）での常磁性粒子の追加の洗浄後、両方の画分を組み合わせ、Ｚｙｍｏ Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）スピンカラムを用いて（製造会社のプロトコールに従って）精製し、そのオリゴヌクレオチドを、１５μＬ ｍｉｌｌｉＱ水で溶出した。ｑＰＣＲによる両方のＯＤＮ配列を定量化することによる濃縮因子の決定のために、この精製された画分の７．５μＬを保持した。他の７．５μＬを、５×適応した結合バッファー（１０μＬ）および水（３２．５μＬ）で希釈し、予洗されたストレプトアビジンＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（登録商標）常磁性粒子で処理して（１００μＬの１ｍｇ／ｍｌ懸濁液）、非選択性ビオチン化オリゴヌクレオチドの少しの残留物も除去した。上清を、Ｚｙｍｏ Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）スピンカラムを用いて、製造会社のプロトコールに従って、精製し、そのオリゴヌクレオチドを、１５μＬ ｍｉｌｌｉＱ水で溶出した。濃縮因子を、両方のＯＤＮ配列をｑＰＣＲにより定量化することにより、決定した。
キヌクリジンの誘導体および３－ニトロピリジン化合物の合成および特徴づけ

【0309】

一般的手順Ｊ：アリールボロン酸のクロロ－またはブロモ－３－ニトロピリジンへのＳｕｚｕｋｉカップリング
適切なクロロ－またはブロモ－３－ニトロピリジンおよびアリールボロン酸を、アルゴンの雰囲気下で、ＴＨＦおよびＨ_２Ｏ中２０％（ｗｔ）Ｎａ_２ＣＯ_３の１：１（ｖ／ｖ）混合物に溶解した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０～２０ｍｏｌ％）を加え、その混合物を、２時間、還流した。Ｈ_２Ｏでの希釈後、その混合物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×）で抽出した。組み合わせた有機層を、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、溶媒を蒸発させた。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。

【0310】

一般的手順Ｋ：芳香族アミンまたはカルボン酸の５－ヘキシン酸またはプロパルギルアミン／４－ペンチン－１－アミンとのアミドカップリング
適切なカルボン酸（１等量）、アミン（１等量）、およびＥｔ_３Ｎ（１等量）を、アルゴンの雰囲気下で、脱水ＤＭＦ中に溶解した。その混合物を、０℃に冷却し、ｐｙＢＯＰ（１等量）を加えた。その混合物を、一晩、撹拌し、ゆっくり室温に達するようにした。その後、それを、Ｈ_２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせた有機層を、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、溶媒を蒸発させた。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。

【0311】

（３－（ヘキサ－５－インアミド）フェニル）ボロン酸

【0312】

【化8】

【0313】

３－アミノフェニルボロン酸一水和物（３１０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）および５－ヘキシン酸（０．２２ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）から一般的手順Ｋに従って合成して、１５ｍｏｌ％トリピロリジノホスフィンオキシド（３４４ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、６７％）を含有する白色固体としての生成物を得て、それを、次のｓｕｚｕｋｉカップリングのためにさらに精製することなしに用いた。
¹H NMR (400 MHz, メタノール-d₄) δ (ppm) 7.84 - 7.72 (m, 1H), 7.61 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.51 - 7.22 (m, 2H), 3.14 (td, J = 6.6, 3.7 Hz, 2H), 2.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.32 - 2.23 (m, 1H), 1.88 (p, J = 7.3 Hz, 2H). ¹³C NMR (101 MHz, メタノール-d₄) δ (ppm) 173.8, 139.2, 130.2, 129.1, 126.2, 122.6, 84.1, 70.3, 36.6, 25.7, 18.7 (1つの四級芳香族Cが検出されず).ＨＲＭＳ（ＨＭＲＳ）－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：測定値［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２３２．１１３５、Ｃ_１２Ｈ_１５ＢＮＯ_３理論値 ２３２．１１４０．
Ｎ－（３－（５－ニトロピリジン－２－イル）フェニル）ヘキサ－５－インアミド

【0314】

【化9】

【0315】

２－ブロモ－５－ニトロピリジン（１０２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）および（３－（ヘキサ－５－インアミド）フェニル）ボロン酸（１１６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）から一般的手順Ｊに従って合成して、淡黄色固体としての生成物（５２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、３４％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 9.48 (dd, J = 2.7, 0.6 Hz, 1H), 8.53 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1H), 8.35 (見かけ上s, 1H), 7.94 (dd, J = 8.8, 0.6 Hz, 1H), 7.83 (見かけ上d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.68 (見かけ上d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.49 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.42 - 7.32 (bs, 1H), 2.57 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.36 (td, J = 6.8, 2.6 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.99 (qnt, J = 7.1 Hz, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 170.9, 162.0, 145.3, 143.2, 138.9, 138.0, 132.1, 130.0, 123.6, 122.1, 120.4, 119.0, 83.5, 70.0, 36.1, 24.0, 17.9;ＨＲＭＳ（ＨＭＲＳ）－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：測定値［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３１０．１１８８、Ｃ_１７Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_３理論値 ３１０．１１８６。

【0316】

Ｎ－（３－（５－ニトロピリジン－３－イル）フェニル）ヘキサ－５－インアミド

【0317】

【化10】

【0318】

３－ブロモ－５－ニトロピリジン（５１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）および（３－（ヘキサ－５－インアミド）フェニル）ボロン酸（５３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）から一般的手順Ｊに従って合成して、淡いオレンジ色固体としての生成物（４６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、６５％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 9.42 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 9.13 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.66 (見かけ上t, J = 2.3 Hz, 1H), 8.01 (見かけ上s, 1H), 7.52 - 7.42 (m, 3H), 7.37 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 2.58 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.36 (td, J = 6.7, 2.6 Hz, 2H), 2.03 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.97 (見かけ上q, J = 7.0 Hz, 2H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 171.0, 153.2, 144.6, 143.6, 139.1, 137.4, 136.2, 130.3, 129.3, 123.2, 120.5, 118.7, 83.5, 69.7, 36.1, 23.9, 17.9.ＨＲＭＳ（ＨＭＲＳ）－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：測定値［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３１０．１１８１、Ｃ_１７Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_３理論値 ３１０．１１８６。

【0319】

Ｎ－（３－（３－ニトロピリジン－４－イル）フェニル）ヘキサ－５－インアミド

【0320】

【化11】

【0321】

４－クロロ－３－ニトロピリジン（１５０ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）および（３－（ヘキサ－５－インアミド）フェニル）ボロン酸（２００ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）から一般的手順Ｊに従って合成して、オフホワイト色固体としての生成物（１８７ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、７０％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 9.08 (s, 1H), 8.81 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.70 (見かけ上s, 1H), 7.51 (見かけ上d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 - 7.31 (bs, 1H), 7.07 (見かけ上d, J = 7.8 Hz, 1H), 2.54 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.34 (td, J = 6.8, 2.6 Hz, 2H), 2.02 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.96 (qnt, J = 7.0 Hz, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 170.7, 152.9, 145.5, 145.2, 134.5, 129.7, 125.8, 123.4, 120.6, 118.9, 83.3, 69.6, 35.9, 23.7, 17.8;ＨＲＭＳ（ＨＭＲＳ）－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：測定値［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３１０．１１８９、Ｃ_１７Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_３理論値 ３１０．１１８６。

【0322】

３－（３－ニトロピリジン－４－イル）安息香酸

【0323】

【化12】

【0324】

４－クロロ－３－ニトロピリジン（２００ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）および３－カルボキシフェニルボロン酸（２３１ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）から一般的手順Ｊに従って、反応時間を延長して（２０時間の還流）、合成して、淡いオレンジ色固体としての生成物（１６２ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、４７％）を得た。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 9.19 (s, 1H), 8.88 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.61 (見かけ上t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 4.9 Hz, 1H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ168.9, 153.1, 145.6, 145.1, 143.1, 135.2, 132.7, 131.2, 130.1, 129.4, 129.3, 125.8.ＨＲＭＳ（ＨＭＲＳ）－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：測定値［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２４５．０５５１、Ｃ_１２Ｈ_９Ｎ_２Ｏ_４理論値 ２４５．０５５７。

【0325】

３－（３－ニトロピリジン－４－イル）－Ｎ－（ペンタ－４－イン－１－イル）ベンズアミド

【0326】

【化13】

【0327】

３－（３－ニトロピリジン－４－イル）安息香酸（１８ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）および４－ペンチン－１－アミン塩酸塩（１１ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）から一般的手順Ｋに従って合成して、オフホワイト色固体としての生成物（１７ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ、７４％）を得た。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 9.15 (s, 1H), 8.85 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.83 (ddd, J = 7.7, 1.8, 1.1 Hz, 1H), 7.80 (dt, J = 1.8, 0.9 Hz, 1H), 7.54 (td, J = 7.7, 0.6 Hz, 1H), 7.46 - 7.41 (m, 2H), 6.47 (見かけ上s, 1H), 3.61 (td, J = 6.7, 5.8 Hz, 2H), 2.34 (td, J = 6.8, 2.7 Hz, 2H), 2.03 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 1.88 (見かけ上p, J = 6.8 Hz, 2H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ166.8, 153.2, 145.6, 145.3, 143.5, 135.8, 135.4, 130.6, 129.4, 127.7, 126.7, 126.0, 83.76, 69.7, 39.7, 28.0, 16.5;ＨＲＭＳ（ＨＭＲＳ）－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：測定値［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３１０．１１８２、Ｃ_１７Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_３理論値 ３１０．１１８６。

【0328】

５－ニトロ－Ｎ－（ペンタ－４－イン－１－イル）ピコリンアミド

【0329】

【化14】

【0330】

５－ニトロピリジン－２－カルボン酸（１４１ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）および４－ペンチン－１－アミン塩酸塩（１００ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）から一般的手順Ｋに従って合成して、オフホワイト色固体としての生成物（１６６ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 9.37 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.64 (dd, J = 8.5, 2.3 Hz, 1H), 8.42 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.16 (見かけ上s, 1H), 3.64 (見かけ上q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.33 (td, J = 6.9, 2.6 Hz, 2H), 2.02 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.90 (見かけ上p, J = 6.9 Hz, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 162.4, 154.2, 145.7, 143.9, 132.9, 123.0, 83.2, 69.6, 39.0, 28.2, 16.3;ＨＲＭＳ（ＨＭＲＳ）－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：測定値［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２３４．０８６８、Ｃ_１１Ｈ_１２Ｎ_３Ｏ_３理論値 ２３４．０８７９。

【0331】

Ｎ－（５－ニトロピリジン－３－イル）ヘキサ－５－インアミド，２ｂ

【0332】

【化15】

【0333】

３－アミノ－５－ニトロピリジン（１３９ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）および５－ヘキシン酸（０．１１ｍｌ、１．００ｍｍｏｌ）から一般的手順Ｋに従って合成して、淡いオレンジ色固体としての生成物（９６ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ、４１％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 9.16 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 9.02 (見かけ上t, J = 2.5 Hz, 1H), 8.90 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 2.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.36 (td, J = 6.7, 2.7 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 1.99 (見かけ上p, J = 7.0 Hz, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 171.9, 145.1, 143.2, 137.3, 136.9, 123.2, 83.2, 70.0, 35.9, 23.57, 17.9;ＨＲＭＳ（ＨＭＲＳ）－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：測定値［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２３４．０８７６、Ｃ_１１Ｈ_１２Ｎ_３Ｏ_３理論値 ２３４．０８７９。

【0334】

５－ニトロ－Ｎ－（プロパ－２－イン－１－イル）ピコリンアミド

【0335】

【化16】

【0336】

５－ニトロピリジン－２－カルボン酸（１４１ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）およびプロパルギルアミン（５４μｌ、０．８４ｍｍｏｌ）から一般的手順Ｋに従って合成して、淡黄色の固体としての生成物（１２４ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、７２％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 9.39 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.65 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1H), 8.42 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.15 (見かけ上s, 1H), 4.30 (dd, J = 5.6, 2.6 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 2.6 Hz, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 162.0, 153.6, 145.9, 144.0, 132.9, 123.2, 78.8, 72.3, 29.7;ＨＲＭＳ（ＨＭＲＳ）－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：測定値［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２０６．０５５７、Ｃ_９Ｈ_８Ｎ_３Ｏ_３理論値 ２０６．０５６６。

【0337】

Ｎ ^６ ｍｄＡ含有ｄｓＤＮＡの酵素的合成
ｄｓＤＮＡを、非メチル化鋳型（配列、下記参照）、それに応じたリバースプライマー（配列、下記参照）、および基準ｄＮＴＰｓのセット（非メチル化ｄｓＤＮＡを合成するための）かまたはｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｎ^６ｍｄＡＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物（太字で示された位置にＮ^６ｍｄＡを有するｄｓＤＮＡを合成するための）かのいずれかを用いた、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）でのプライマー伸長により酵素的に合成した。

【0338】

配列番号１：ＤＮＡ鋳型１
ＡＡＣＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＡＧＡＡＣＧＡＡＧＣＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＣＡＣＧＡＡＡＣＧＡＴＧＣＡＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＴＧＴＴＧ
配列番号２：ＤＮＡ鋳型２
ＡＡＣＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＡＧＡＣＧＡＣＣＡＡＣＡＣＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＣＧＡＡＡＣＧＡＡＧＣＡＴＧＣＧＣＣＧＡＡＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＣＧ
配列番号３：リバースプライマー１
ＣＡＡＣＡＧＣＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＡ
配列番号４：リバースプライマー２
ＣＧＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＧＡＡ
配列番号５：オリゴヌクレオチド５
ＣＴＴＧＡＣＡＧ［Ｎ^６ｍｄＡ］ＣＴＡＧ
配列番号６：４１ｎｔ ｓｓＤＮＡ
ＧＣＧＣ ＴＴＧＧ ＣＴＧＧ ＴＧＧＧ ＴＧＡＴ ＴＣＴＧ ＣＡＡＣ ＴＣ［Ｎ^６ｍｄＡ］Ｇ ＡＴＣＡ ＴＧＣＴ Ａ
一連の５～１０個の並行反応は、以下の最適な濃度で実行された：

【0339】

【表B】

【0340】

反応は、以下の最適な温度サイクルを用いて実行された：

【0341】

【表C】

【0342】

反応により、並行ＰＣＲ反応物を組み合わせて、ＰＣＲ産物を、ＧｅｎｅＪｅｔ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、製造会社のプロトコールに従って精製した（ｉＰｒＯＨの使用なしで）。その産物を、自動ゲル電気泳動（Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ）およびＬＣＭＳにより分析して、合成された鎖のアイデンティティを確認した。

【0343】

２．結果
核酸は、いくつかの型のＣ（ｓｐ^３）－Ｈ結合を含有することができ、それぞれが、近位の化学的環境により与えられる立体的、誘導的、および共役的効果により影響され得る微妙に異なる固有反応性を有する。しかしながら、化学試薬を用いてのこれらのＣ（ｓｐ^３）－Ｈ結合の識別は、大きな課題を提示する。Ｎ^６ｍｄＡのメチル基におけるＣ－Ｈ結合は、非常に高い結合解離エネルギー（ＢＤＥ、約９２～９４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有し得る（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ １９９９）。さらに、そのような試薬は、多量の類似した強度のまたはより弱いＣ－Ｈ結合（例えば、デオキシリボースユニットは、それぞれが類似したＢＤＥを有する、多くの異なるＣ－Ｈ結合を含有する；チミジンにおけるメチル基（エピジェネティック的に標識された５－メチルシトシン）は、より低いＢＤＥ（約８９～９０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有する活性化Ｃ－Ｈ結合を示す）の間で、極めて低い有効濃度（真核生物におけるＮ^６ｍｄＡレベルは、１００万個あたり２、３個のＮ^６ｍｄＡ／Ａほど、少なくあり得る）で存在し得る強いＣ－Ｈ結合をターゲットする必要がある（Ｂｌａｎｋｓｂｙ ２００３）。これらの必須の選択性の必要条件と同時に、Ｎ^６ｍｄＡ官能化ストラテジーは、「ＤＮＡ上」のα－アミノラジカルを生産的に奪取して、オリゴヌクレオチドへ安定な共有結合を形成しなければならない。これらの問題に取り組むことに伴う課題は、多面的である：第１に、酵素的脱メチル化を促進すると考えられる近接駆動性リバウンド機構の使用は、合成シナリオにおいて実行可能である可能性が低く、それゆえに、カップリングステップは、ＤＮＡ由来α－アミノラジカルの予想される短い寿命に適応するために速くなければならない；および第２に、ＨＡＡおよび共有結合性官能化ステップは、有害なおよび非選択的反応性を示すことなく、協調して作動しなければならない。これらの困難は、水溶液中でかつＤＮＡ構造に損傷し得る酸性または酸化的条件を避けながら、すでに低濃度で機能しなければならない化学的解決の可能性に制約を課す。

【0344】

Ｎ^６ｍｄＡのメチル基におけるＣ－Ｈ結合は、それらの、Ｎ６原子上の孤立電子対との相互作用の結果として、部分的に極性化され、かつ「ヒドリド性」特性を示す可能性が高いと認識された（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９９；Ｊｅｆｆｒｅｙ ２０１５）（図１Ａ）。

【0345】

対照的に、チミンのメチル基におけるＣ－Ｈ結合は、より弱いとは言え、より低い極性化ピリミジンヘテロ環に隣接している結果として、相対的に中性であると認識された。このわずかな電気的効果は、求電子性水素原子取出剤と、Ｎ^６ｍｄＡにおけるＮ６－メチルアミンモチーフのよりヒドリド性が高いＣ－Ｈ結合との間の動力学的に調節された極性マッチを可能にするのに十分異なる反応性プロファイルを提供し得る。生じたＣ－Ｈ結合切断は、修飾ヌクレオチド上にα－アミノラジカルの形成をもたらし得る。奪取試薬は、初発のＮ^６ｍｄＡ由来α－アミノラジカルと迅速に反応し、それの前駆体より安定な開殻種を形成し得る。そこで、スピントラッピング試薬の配備は、この課題へ有望な溶液を提供し得ると考えられた。スピントラッピング試薬（ＳＴＲ）は、持続性ラジカル生成物の形をとるラジカルを捕獲するための、過剰量で用いられる、非常に反応性が高い分子であり、複雑な系において短命な種の同定を可能にすることができる。ＳＴＲの中で、ニトロソアレーンは、求核性炭素中心ラジカルの奪取に特に適しており、その性質は、Ｎ^６ｍｄＡ由来α－アミノラジカルに固有でなければならない（図１Ｂ）。

【0346】

しかしながら、ニトロソアレーン由来ＳＴＲは求電子性が高く、求核剤との無差別的非ラジカル反応性を示す場合が多く、容易な二量体化を起こしかつ非生産的生成物へ容易に分解し得る。これらの問題に折り合いをつけるために、ニトロソアレーンはまた、それ自体がラジカル反応であるＨＡＡステップと、有害な反応性を示すことなく、適合しなければならない。ＳＴＲが、ＨＡＡステップを促進するために必要とされる化学作用の結果としてインサイチューで生成され、それにより、この反応種の近接性を初発のＮ^６ｍｄＡ由来ラジカルへ密接に結びつけるプロセスがデザインされ得るならば、これらの問題は、回避することができる。したがって、水溶性ニトロアレーンを還元するための穏やかな方法は、ニトロソアレーンＳＴＲのインサイチューでの生成のためにＨＡＡステップと並行して利用され、選択的官能化プロセスをもたらし得ると仮定された。

【0347】

キヌクリジン１から生成されたキヌクリジンラジカルカチオン（ｉｎｔ Ｉ）を、Ｎ^６ｍｄＡに対する求電子性水素原子取出剤として選択した（図１Ｃ）。
プロトン化キヌクリジンは、１０１ｋｃａｌ／ｍｏｌのＢＤＥを有し（Ｌｉｕ １９９６）、それのラジカルカチオンが、Ｎ^６ｍｄＡ－メチル基から水素原子を除去するのに十分、反応性であることを意味する。キヌクリジンラジカルカチオンは、Ｉｒ触媒性光酸化還元媒介性単一電子酸化による穏やかな反応条件下で生成され得、強い電子リッチなＣ－Ｈ結合に対する極性にマッチした反応性を示す。Ｒｕ（ｂｐｚ）_３（ＰＦ６）_２は、十分な水溶解度を示し、かつそれの三重項励起状態の還元的消光サイクルは、キヌクリジンの酸化電位とよくマッチしている（キヌクリジンＥ^ｏｘ＝１．１０Ｖ ｖｓ ＳＣＥと比較して、Ｅ［Ｒｕ（ＩＩ）^＊／Ｒｕ（Ｉ）］＝１．４５Ｖ）ため、適切な光触媒として機能することができると推測された。したがって、還元的消光サイクルは、ｉｎｔ Ｉを生成することができ、ｉｎｔ Ｉは、Ｎ^６ｍｄＡを、選択的ＨＡＡを通して結合して、所望のα－アミノラジカル（ｉｎｔ ＩＩ）を形成することができた。結果的に、還元的消光サイクルは、［Ｒｕ（Ｉ）（ｂｐｚ）_３］^－（活性触媒へ戻る酸化を必要とする種）を生じることができる。この機構的必要条件は、［Ｒｕ（Ｉ）（ｂｐｚ）_３］^－から電子を受容するために、３－ニトロピリジン ２ａ（水溶性有機酸化体）を用いて、活用することができ（４－ニトロピリジンについての推定値Ｅ^ｒｅｄ＝－０．４４Ｖ ｖｓ ＳＣＥ）、それにより、ラジカルアニオンｉｎｔ ＩＩＩを生じる（加えて、活性触媒に戻る）。ニトロピリジンラジカルアニオンは、バルク溶媒（またはおそらく、Ｎ^６ｍｄＡ）と共にｉｎｔ ＩＶへと水素原子転移を起こして、水を脱離して、ＳＴＲ、３－ニトロソピリジン ３ａを形成し得る。重要なことには、３－ニトロソピリジン（３ａ）の濃度は、触媒の光化学的活性によって調節され、ＳＴＲの潜在的有害な、化学量論比を超えるレベルの存在を回避することができる。その後、３－ニトロソピリジンのＮ^６ｍｄＡ由来α－アミノラジカルｉｎｔ ＩＩとの反応は、ニトロキシド持続性ラジカル（ｉｎｔ Ｖ）を生成し、ｉｎｔ Ｖは、最終的に、酸化的崩壊を起こして、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン結合４の形をとる、核酸塩基のＮ６位において共有結合性修飾を形成することができる。

【0348】

最初の研究は、代表的なオリゴヌクレオチド５（ＣＴＴＧＡＣＡＧ［Ｎ^６ｍｄＡ］ＣＴＡＧ）へのＨＡＡプロトコールを確立することに焦点を合わせた。一連の探索的実験により、５、１、および［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］（ＰＦ_６）_２の溶液の１５Ｗ ＣＦＬバルブでの室温、５時間の照射が、４％の生成物転化を以て、オリゴヌクレオチド６の形成をもたらし、ＬＣ－ＭＳ分析により決定されたように、単一のキヌクリジン分子が共有結合性に組み入れられていたことが明らかにされた（図２Ａ）。

【0349】

６へのコンジュゲーションはまた、いくつかの脱メチル化オリゴヌクレオチド（ＣＴＴＧＡＣＡＧＡＣＴＡＧ ７、１６％）の形成も伴った。６および７の形成は、Ｎ^６ｍｄＡのＮ６基に形成されたα－アミノラジカルｉｎｔ ＩＩおよびイミニウムイオンｉｎｔ－ＶＩへのその後の反応と一致し、ｉｎｔ－ＶＩは、キヌクリジンと反応して、修飾オリゴヌクレオチド（６）を形成し、または加水分解され得る（７への脱メチル化）。ＨＡＡステップの確証によって励まされて、３－ニトロピリジン ２ａからのニトロソアレーンＳＴＲ ３ａのインサイチューでの生成、およびそれの、Ｎ^６ｍｄＡ由来α－アミノラジカルの奪取を、次に調べた。オリゴヌクレオチド５、キヌクリジン、［Ｒｕ（ｂｐｚ）_３］（ＰＦ６）_２、および３－ニトロピリジン ２ａの溶液の、室温で１０分間の照射が、コンジュゲート８を生じることが見出された；８は、ＬＣ－ＭＳ分析により同定され、１４％の生成物転化であり、３－ニトロピリジンのＮ^６ｍｄＡとの正式の脱水型カップリングから生じて、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン結合を形成する（表１）。８へのコンジュゲーションは、この場合もやはり、脱メチル化オリゴヌクレオチド７の形成を伴った（２６％）。オリゴヌクレオチドコンジュゲート８は、室温で、中性または塩基性溶液中（ｐＨ＝７～１１）、およそ１２時間の半減期を有する。

【0350】

Ｎ^６ｍｄＡ ＯＤＮ ５の、異なる３－ニトロピリジン誘導体との選択的官能化反応についての反応条件および収率は、下記のスキーム１および表１に示されている。

【0351】

【化17】

【0352】

【表1】

【0353】

^a 他の反応条件は一般的手順Bに従う
^b LCMSによるアッセイ収率
^c 種がLCMSにおいて共溶出した。おおよその収率はMSシグナル強度による
光触媒プロセスは還元的消光サイクルにより進行し得るが（図１Ｃおよび２Ｂ）、その変換はまた、相補的な酸化的消光サイクルによっても作用され得、Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３Ｃｌ_２などのより還元性の高い光触媒を用いたならば、反応パートナーの結合の順序を効果的に逆転させることができる（Ｅ［Ｒｕ（ＩＩ）＊／Ｒｕ（ＩＩＩ）］＝－０．８７Ｖ）。

【0354】

この場合、３－ニトロピリジン ２ａは、光触媒の三重項励起状態型を酸化的にクエンチして、最初に、［Ｒｕ（ＩＩＩ）（ｐｈｅｎ）_３］中間体と一緒に、ラジカルアニオン、ニトロソアレーン前駆体ｉｎｔ ＩＩＩ（図２Ｂ）を生成し、それは、その後、キヌクリジン１を結合して、ＨＡＡステップに必要とされるラジカルカチオンｉｎｔ Ｉを形成する。

【0355】

結果として、触媒としてのＲｕ（ｐｈｅｎ）_３Ｃｌ_２との反応物の照射が、１６％生成物転化を以て、所望のＮ－ヒドロキシホルムアミジン－Ｎ^６ｍｄＡオリゴヌクレオチドコンジュゲート８を供給することが見出された。脱メチル化オリゴヌクレオチド７への３０％転化も観察された。酸化的消光ステップ中に形成された［Ｒｕ（ＩＩＩ）（ｐｈｅｎ）_３］種が、対応する還元的消光サイクルにおけるＲｕ（ＩＩ）（ｂｐｚ）_３光触媒から形成された三重項励起状態中間体（Ｅ［Ｒｕ（ＩＩ）^＊／Ｒｕ（Ｉ）］＝＋１．４５Ｖ）（キヌクリジンをそれのラジカルカチオンへ酸化しかつ光触媒を再生するのにまだ十分、反応性である）より、低い酸化力（Ｅ［Ｒｕ（ＩＩＩ）／Ｒｕ（ＩＩ）］＝＋１．２６Ｖ）を有することは注目すべきである。３－ニトロピリジンおよび高濃度のキヌクリジンによる［Ｒｕ（ＩＩＩ）（ｐｈｅｎ）_３］の三重項励起状態の一定の酸化的消光と共にＲｕ（ＩＩＩ）（ｐｈｅｎ）_３中間体のより低い酸化力は、ＤＮＡの、特にＧ核酸塩基における、酸化的損傷を防止し得る。これは、触媒としてＲｕ（ｐｈｅｎ）_３Ｃｌ_２を用いる変換が、［Ｒｕ（ＩＩ）（ｂｐｚ）_３］（ＰＦ６）_２の使用と比較してよりクリアな反応プロファイルを生じるという観察において反映されている（図３）。

【0356】

次に、下流同化の能力がある潜在的反応官能性を、目的に合わせた核酸断片へ組み入れた。デザイン拡張プロセスにより、アルキン含有のアミド結合型ニトロピリジン ２ｂが、Ｒｕ（ｐｈｅｎ）_３Ｃｌ_２、キヌクリジン、および１０分間の照射での処理により、５とカップリングして、所望のアルキン含有オリゴヌクレオチド９を形成し得ることが明らかにされた（図４Ａ）。

【0357】

２ｂが潜在的競合性ヒドリド性Ｃ－Ｈ結合を欠き、かつアミド置換基が３－ニトロピリジンコアの酸化的反応性に影響するようには思われないことは、注目に値する。新しく導入されたアルキン官能性を利用して、９とＰＥＧ３ビオチン由来アジド１０との間の「クリック」ヒュスゲン環化付加が、効果的な反応のために特定の条件を必要とすること；硫酸銅およびアスコルビン酸ナトリウムの溶液が、ビオチンコンジュゲート化オリゴヌクレオチド１１への環化付加を促進するためにキヌクリジンの添加（おそらく、銅触媒のリガンドとして作用する）を必要とし、９２％の生成物転化であったことが見出された。

【0358】

様々なアルキン官能化Ｎ^６ｍｄＡ ＯＤＮのアジド－ＰＥＧ_３－ビオチンのヒュスゲン環化付加についての反応条件および収率は、スキーム２および表２に示されている。ＴＨＴＰＡ：トリス（ベンジルトリアゾイルメチル）アミン、ＴＣＥＰ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、Ｎａ－ａｓｃ．：アスコルビン酸ナトリウム。

【0359】

【化18】

【0360】

【表2】

【0361】

重要なことには、Ｎ^６ｍｄＡ残基なしのオリゴヌクレオチド（７）上への２ｂまたは他の３－ニトロピリジンアルキン誘導体での光酸化還元変換は、生成物転化を示さず、その変換がこのフィーチャーに対して選択的であることを示している（スキーム３）。さらに、この反応から獲得された質量スペクトルデータの注意深い分析は、いかなるヌクレオチドにおいても３－ニトロピリジンユニットに由来した修飾の検出可能な痕跡も示さなかった。５における膨大な数の類似したＣ－Ｈ結合にも関わらず、Ｎ^６ｍｄＡ残基のメチル基が官能化されるＨＡＡステップがそのように極めて選択的である（核酸における他の位置と比較した、「ＨＡＡ選択性」と名付けられたＮ^６ｍＡｄｅにおける反応、＞１００：１）ことは、驚くべきである。これらの結果は、Ｎ^６ｍｄＡの官能化への優れた選択性を示すだけでなく、Ｎ^６メチル基上の新しい標識の位置を明白に確認している。実際、ＨＡＡがデオキシリボース部分または任意の基準核酸塩基上で非選択的に起こり得るならば、標識オリゴヌクレオチド７が検出されたであろう。

【0362】

【化19】

【0363】

しかしながら、２ｂとの光酸化還元条件下で、無傷３－ニトロピリジンの包含を反映する質量イオン（Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン由来オリゴヌクレオチド９より高い１６質量単位）を有する痕跡レベルのオリゴヌクレオチドが、検出可能であった。この痕跡レベルのオフターゲット修飾の構造は解明されなかったが、一連の対照実験により、３－ニトロピリジンの痕跡レベルの付加がＧ残基において起こったことが明らかにされた。Ｇにおける３－ニトロピリジンの包含と比較した、所望のＮ^６ｍｄＡ由来Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン結合の形成への選択性は、１個のＧ核酸塩基あたりのＮ^６ｍｄＡについて５０：１（この場合もやはり、著しく高い比率）と計算された（「プローブ選択性」と名付けられた、ニトロアレーンの包含に対するニトロソピリジンによる反応）。

【0364】

ビオチンモチーフに固有の多用途的な生化学的性質は、修飾Ｎ^６ｍｄＡ由来オリゴヌクレオチドを他の核酸断片から、ストレプトアビジンに基づいたプルダウン手順（標的オリゴヌクレオチドの固定化、洗浄、切断、および回収）により単離するための手段を提供し、それは、複雑な混合物におけるＮ^６ｍｄＡ含有オリゴヌクレオチドの検出を可能にすることができた。ストレプトアビジンプルダウンプロトコールからの基質回収のための知られた方法は、そのタンパク質足場を変性するようにデザインされている相対的に厳しい条件を含む。しかしながら、本光酸化還元コンジュゲーション手順は、より不安定な官能基である、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン結合を導入する。したがって、本発明者らは、有意により穏やかな求核剤媒介性切断条件が、標識オリゴヌクレオチドの回収に用いることができると判断した。これは重要であり、光酸化還元反応混合物の質量分析が、Ｇにおける非選択的官能化から生じた痕跡量の生成物は、求電子性Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン結合を含有しないことを示唆したからである。結果的に、これらのＧにおける官能化のオフターゲット生成物は、切断中、ストレプトアビジンビーズ上に保持され得、それにより、Ｎ^６ｍｄＡ由来オリゴヌクレオチドの光酸化還元ステップおよび濃縮に観察される選択性を増強し得ると推測された。この仮説に導かれて、オリゴヌクレオチド５およびニトロピリジン２ｂでの光コンジュゲーションを、本方法が核酸混合物内でＮ^６ｍｄＡ含有オリゴヌクレオチドを濃縮するために用いることができるかどうかを試験するための手段として、異なるが、重要なことには、非メチル化オリゴヌクレオチドＣＧＴＡＣＴＡＧＡＣＧ １２の存在下で、行った（図５Ａ）。Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン生成物９は、１０％の転化で形成され、反応していない５、脱メチル化オリゴヌクレオチド７、対照オリゴヌクレオチド１２、および痕跡量のＧ－ニトロピリジン官能化オリゴヌクレオチド（５０：１ プローブ選択性、Ｎ^６ｍｄＡ／Ｇ）と一緒に、ＬＣ－ＭＳにより観察された。

【0365】

Ｎ－ホルムアミジン基は、Ｎ－ホルミル誘導体を含有する加水分解された生成物の２セットを提供する別個の加水分解プロセスに従う（Ｖｉｎｃｅｎｔ １９９９）。この固有のフィーチャーを考慮して、加水分解研究を、標識オリゴヌクレオチド９に関して行って、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン構造結合のアイデンティティを確認した（スキーム３）予想通り、光酸化還元コンジュゲーション（生成物９を含有する）から獲得された反応混合物の酢酸バッファー、ｐＨ＝４．７での６０分間の処理は、以下の３つの新しい生成物を提供した：Ｎ－ホルミルオリゴヌクレオチド１５、３－Ｎ－ヒドロキシピリジン誘導体１６、および３－Ｎ－ホルミル－Ｎ－ヒドロキシピリジン誘導体１７（全ての生成物は、ＨＲＭＳにより特徴づけられた）。重要なことには、オリゴヌクレオチド７が同じ手順（光酸化還元および加水分解）に供せられた対照実験は、１００ｐｐｍまでの誤差範囲での計算された正確な質量のスキャンによる加水分解生成物のいずれの形成も生じなかった。合わせると、これらの結果は、光酸化還元Ｎ^６ｍｄＡ生成物におけるＮ－ヒドロキシホルムアミジン結合の存在を疑う余地なく確認している。

【0366】

【化20】

【0367】

Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン結合についての追加の証拠は、水の代わりに求核剤としてヒドラジンを用いる反応性研究により提供された（スキーム４）。この場合、対応するＮ－ＮＨ_２ホルムアミジン生成物１４を、プルダウン手順の終わりに、ＨＲＭＳにより検出した。固定化ＤＮＡ断片１３の１０％ヒドラジン水溶液での５分間の処理は、少量の７（１４の加水分解による）と共にＮ－ＮＨ_２ホルムアミジン生成物１４を生じた。新しいヒドラジン生成物、加えてそれの酸化状態（それの分子量により確認された）の形成は、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン部分のアイデンティティについてのさらなる証明である。

【0368】

【化21】

【0369】

Ｎ－ヒドロキシホルムアミジンの存在の別のしるしは、ＨＲＭＳおよび同位体パターン研究中の生成物９および対応するクリック生成物１１のＮｉ（ＩＩ）およびＺｎ（ＩＩ）付加物の検出である（スキーム５）。興味深いことに、Ｎｉ（ＩＩ）およびＺｎ（ＩＩ）付加物は、良い二座リガンドとしてこれらの特定の部分を記載する以前の報告によれば（Ｋｒａｊｅｔｅ ２００４；Ｃｉｂｉａｎ ２０１６）、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン部分を含有するオリゴヌクレオチド（９および１１）についてのみ目に見える。

【0370】

【化22】

【0371】

９のビオチン－アジド１０での環化付加は、選択的Ｎ^６ｍｄＡビオチンコンジュゲート化オリゴヌクレオチド１１を提供した。そのオリゴヌクレオチド混合物のストレプトアビジンコーティング化磁気ビーズでの処理は、ビオチンを含有する全ての種（１３、加えて、Ｇ残基における非選択的反応から生じた痕跡レベルの生成物）の固定化を可能にし、逐次の洗浄手順により非標識オリゴヌクレオチドの除去を可能にした。上記で述べたように、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン結合の求電子性は、含水ヒドラジンとの反応に対するそれの感受性を高くさせ、少量の７（１４の加水分解から生じる）およびストレプトアビジンコーティング化ビーズにより無差別に保持されていた痕跡量のその他のオリゴヌクレオチドと共にＮ６－（ヒドラゾノメチル）ｄＡ含有オリゴヌクレオチド１４の遊離をもたらすことが見出された。１４と７の両方の回収は、出発配列におけるＮ^６ｍｄＡの存在についての直接的証拠を提供し、全ての他のオリゴヌクレオチドに対するそれらの比率は、５０：１より高い濃縮を生じている。観察される光酸化還元プローブ選択性の結果として得ることができる最大理論的濃縮値は、オリゴヌクレオチド１４が３個のＧ残基を含有する（１個のＧ残基あたりＮ^６ｍｄＡ ５０：１のプローブ選択性）ため、約１７：１であることに留意することは特に重要である。したがって、＞５０：１の観察された濃縮は、ヒドラジン切断手順が、Ｇにおける反応の生成物（おそらく、ビーズ上に保持されている）に対して、Ｎ^６ｍｄＡ由来オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおけるＮ－ヒドロキシホルムアミジン結合へ選択的であり、観察された高い濃縮をもたらすことを、明らかに実証している。

【0372】

Ｎ^６ｍｄＡ選択的オリゴヌクレオチド官能化および濃縮プロトコールは、より長い一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ断片に関してさらに実証された。今、濃縮された画分を分析し、かつプルダウン後に、最初にメチル化されたＤＮＡ配列とメチル化されていないＤＮＡ配列の両方の増幅可能な量を決定するために定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、光酸化還元に基づいた官能化プロトコールが、２つの９９ヌクレオチドｓｓＤＮＡ断片の混合物からＮ^６ｍｄＡ含有オリゴヌクレオチドを濃縮し、６．４：１の濃縮であることが見出された（図６、上部鎖がＮ^６ｍｄＡ含有オリゴヌクレオチドである実験ｉ）。重要なことに、同じ核酸配列を用いるが、他方（下方）の配列にＮ^６ｍｄＡ残基を有する、図６における並行実験ｉｉは、類似したレベルの濃縮を示した。これらの結果は、Ｎ^６ｍｄＡが濃縮に必要とされ、かつ観察された濃縮が、用いられたＤＮＡ配列に依存しないことを強調することを確認している。

【0373】

ｄＡに対してＮ^６ｍｄＡの濃度が非常に低い、細胞ＤＮＡ試料の複雑なマトリックスを模倣するために、ｓｓＤＮＡ断片を、サケ精子ＤＮＡの１０倍過剰量と組み合わせて、１：３８３（０．２６％）のＮ^６ｍｄＡ／ｄＡ比を有する混合物を作製した。光コンジュゲーションおよびプルダウン手順をこれらの試料に適用して、図６における結果は、サケ精子ＤＮＡの非存在下での実験（約６．４：１、図６における実験ｉ＆ｉｉ）と比較して、Ｎ^６ｍｄＡ含有ｓｓＤＮＡ断片がおよそ１０．５：１（図６における実験ｉｉｉ＆ｉｖ）のレベルへ濃縮されたことを示している。

【0374】

二本鎖ＤＮＡにおいて、Ｎ^６ｍｄＡのメチル基は、二本鎖らせんの主な溝へ突出していると考えられ、その局所的化学的環境から生じる潜在的な有害な立体的および電気的効果により、複雑な核酸試料の光酸化還元官能化に追加の課題を与える。この過密にも関わらず、サケ精子ＤＮＡと組み合わせられている、Ｎ^６ｍｄＡ含有９９塩基対ｄｓＤＮＡおよび非メチル化二本鎖断片の混合物（Ｎ^６ｍｄＡ／ｄＡ比は１：３４３３、０．０３％である）への逐次的な光酸化還元コンジュゲーション、クリック反応、およびプルダウン手順を適用することで、Ｎ^６ｍｄＡ含有ＤＮＡ配列が４：１の濃縮で回収されたことが見出された（上部鎖がＮ^６ｍｄＡ含有ｄｓＤＮＡである、図６における実験ｖ）。理論的プローブ選択性が１：１のはずである（５０個のＧ残基を含有するｄｓＤＮＡ断片に基づいて）ことに留意することは重要である。同じ核酸配列を用いるが、第２の鋳型において２個のＮ^６ｍｄＡ残基を有する（下方のｄｓＤＮＡ鎖；Ｎ^６ｍｄＡ／ｄＡ比は１：１７１７、０．０６％である）、図６における並行実験ｖｉは、Ｎ^６ｍｄＡ由来オリゴヌクレオチドについて８：１の濃縮の増加を示し、ポジティブな累積的効果を示唆した（図６）。

【0375】

まとめると、この実験セットは、より長いｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡに関しての、加えて、過剰なＤＮＡを有する複雑な試料における、開発された化学作用の適用可能性を実証し、Ｎ^６ｍｄＡ－ＤＮＡ鎖の濃縮についての概念の証明を提供し、かつこの未開のメチル化ヌクレオチドをマッピングすることにおける将来的適用の可能性を見せている。

【0376】

細胞の生化学的機構は、核酸におけるＡのメチル化状態を制御することができるが、本発明者らは、「ＤＮＡ上」のα－アミノラジカルを発生させかつ奪取して、Ｎ^６ｍｄＡ残基において安定な共有結合性修飾を形成する選択的化学的変換を開発した。可視光活性化光酸化還元触媒により指揮されて、Ｎ^６ｍｄＡのＮ６－メチル基における極性のマッチした水素原子取出ステップが、α－アミノラジカルを発生させ、異なるインサイチューの反応と合致して、ニトロソピリジンのスピントラッピング試薬を形成し、それらがまとまって、オリゴヌクレオチド配列へモジュラー官能基ハンドルを導入するラジカルクロスカップリングプロセスをもたらす。重要なことには、このストラテジーは、ゲノムＤＮＡにおいてＮ^６ｍｄＡを位置づけるための化学的方法が構築され得、潜在的に、このエピジェネティックな修飾の役割をさらに解明するだろうシーケンシング方法をもたらす、基礎的なテクノロジーを提供し、また、細胞機能を制御する多くの型のＲＮＡにおいてメチル化核酸塩基をターゲットすることも受け入れられるはずである。

【0377】

同じストラテジーが、ＲＮＡにおけるＮ^６ｍＡ残基を官能化するために用いることができる。Ｎ^６ｍＡを含有するＲＮＡオリゴヌクレオチドは、スキーム６において光酸化還元反応を用いて官能化される。

【0378】

【化23】

【0379】

Ａｃ－Ｄｈａ－Ｍｅでの光酸化還元反応結果の向上
光酸化還元反応における添加剤としての異なる活性化アルケンの使用を調べた。Ｎ－アセチルデヒドロアラニンメチルエステル（Ａｃ－Ｄｈａ－Ｍｅ）の存在が、結果として、Ｎ－ヒドロキシホルムアミジン（ＮＨＦ）形成についての収率のわずかな上昇を生じることが見い出された（短いモデルオリゴヌクレオチド５に実施されたアルキニル化３－ニトロピリジンプローブとの反応について、６～１３％に対して１５～２０％（ＬＣＭＳ）；図７）。

【0380】

より長いオリゴヌクレオチド基質に関するＡｃ－Ｄｈａ－Ｍｅの存在下での光酸化還元反応の分析は、より小さくなりながらのより高い収率に加えて、痕跡量の副反応および基質オリゴヌクレオチドの分解は減少し得ることをさらに示した。この観察は、異なる照射時間での光酸化還元反応による９９塩基対（ｂｐ）二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ基質の回収を定量化することにより確認された（図８）。

【0381】

短いモデルのオリゴヌクレオチドに関する「ビーズ上で」のプライマー伸長
ヌクレオチド内のＮ^６ｍＡｄｅ部位の場所をマッピングするための光酸化還元標識反応の使用を調べた。本発明者らは、標識反応が、プライマー伸長反応においてポリメラーゼストップ事象を含み得、その結果として、Ｎ^６ｍＡｄｅ部位の直前で終わる切り詰め型ヌクレオチドを生じると推論した。しかしながら、そのような方法は、ＮＨＦ結合の相対的な不安定性およびＮ^６ｍＡｄｅ上に付着した化学的部分の不十分なかさ高さが、中断なしのポリメラーゼリードスルーを生じ得るため、難題である。したがって、本発明者らは、以前に記載されているように、Ｎ^６ｍＡｄｅのビオチン化を進め、ストレプトアビジンコーティング化磁気粒子上に官能化オリゴヌクレオチドを固定化することに決定した。本発明者らは以前、ストレプトアビジンに結合したＮ^６ｍＡｄｅ－ビオチン－ＮＨＦがより安定であることを観察しただけでなく、ストレプトアビジンとの密接な相互作用がまた、目的の部位においてポリメラーゼリードスルーを阻止すると推論された。さらに、濃縮とポリメラーゼストップを組み合わせるという可能性は、構想されたゲノムワイドな塩基解像度Ｎ^６ｍＡマッピング適用における感度を大幅に増加させると推論された。

【0382】

４１ｎｔ ｓｓＤＮＡ配列での最初の実験は、有望な結果をもたらした（図９）。Ｎ^６ｍＡｄｅにおけるビオチン化およびストレプトアビジンコーティング化磁気ビーズ上での固定化により、３７℃で、２０分間にわたるプライマー、ヌクレオシド三リン酸、およびクレノウ断片（３’－５’エキソ－）での処理は、完全に伸長したプライマーと共に生じた、明らかに識別可能なポリメラーゼ停止産物を生じた。その産物のＬＣＭＳ分析は、その主な産物が、官能化Ｎ６ｍＡの反対側のヌクレオチドの組込み直前（－１位）でのポリメラーゼ停止によることを示した。２つの少数の産物は、０位（官能化の部位の反対側）および＋１位における組込み後の停止から生じた。

【0383】

ポリメラーゼ停止事象は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、より長い（９９ｎｔ）ｓｓＤＮＡにおいても観察することができた。図１０は、Ｎ^６ｍＡｄｅを含有するオリゴヌクレオチドについての別個のポリメラーゼストップシグナルを示し、一方、メチル化なしの同じ配列についてはバンドは見ることができなかった。様々な実験からの異なるゲル上での濃度測定分析は、３０～５０％としてのポリメラーゼ停止効率の推定値を認めた。ポリメラーゼの部分的リードスルーが、固定化鋳型上で起こり得るかどうか、またはそれが、完全プライマー伸長に先行するＮＨＦ結合の切断によるのではないのかどうかはまだ知られていない。とは言え、完全長産物と停止産物の両方が、主に、ＮＨＦ結合の求核性切断により回収され、バッファーでの単純な洗浄によるのではないことが、図１０のゲル画像において見ることができ、ポリメラーゼのリードスルーが、ＮＨＦ結合切断後よりむしろ、固定化鋳型上で起こることを示している。

【0384】

「ビーズ上で」のポリメラーゼストップアプローチでのＮ ^６ ｍＡの塩基解像度マッピングを目指して
「ビーズ上で」のポリメラーゼストップについての証拠を手にして、Ｎ^６ｍＡｄｅをマッピングするための方法を目指す最終ステップは、次世代シーケンシングによりＮ^６ｍＡｄｅ出現を読み出すことを可能にするｄｓＤＮＡライブラリー調製ワークフローを確立することであった。最も単刀直入なアプローチは、ＲｅｃＪｆなどのｓｓＤＮＡ特異的５’－３’エキソヌクレアーゼを用いて、ＮＨＦ切断後のｓｓＤＮＡを選択的に消化することにより、切り詰め型ｄｓＤＮＡ鎖を生成することであると考えられた。図１１に描かれているように、得られた平滑末端ｄｓＤＮＡ断片を用いて、その後、標準ｄｓＤＮＡライブラリー調製へ進むことができた。

【0385】

このアプローチを試験する第１の試みにおいて、異なる位置における１個のＮ^６ｍＡｄｅ塩基および「ビーズ上で」のプライマー伸長反応に用いられ得る３’末端におけるプライマー領域を特徴とする２つの異なる９９ｎｔ ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの７．５μｇを用いた（図１２Ａ）。ＲｅｃＪ_ｆ消化後の回収された材料の一部（それぞれ、４０ｎｇ）を用いて、標準ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ ＤＮＡライブラリー調製を実施した。アダプターライゲーションおよび最終増幅後の精製ステップを、０．９× ＮＥＢ精製ビーズを用いて、製造会社のプロトコールに従って、サイズ選択なしに実行した。

【0386】

興奮させることには、増幅および精製されたライブラリーのＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎによる分析は、２つの主要なバンド；予想された完全長断片（最初の９９ｎｔ配列から、加えてライゲーションされたアダプターまでの２２１ｂｐ）に対応する１つ、および最初のＮ^６ｍＡ部位におけるポリメラーゼ停止の成功として予想される長さを有する、最初の断片に対応する１つ（それぞれ、３４ｎｔ断片および６３ｎｔ断片から、加えて、ライゲーションされたアダプターまでの、１５６ｂｐおよび１８５ｂｐ）に対応する１つを示した（図１２Ｂ）。これは、これらのライブラリーのシーケンシングおよび出力データにおける配列包括度の急落の同定が、塩基解像度においてＮ^６ｍＡｄｅ出現を検出することを可能にすることを示した。

【0387】

プロトコールがまた、より少量の試料およびｄｓＤＮＡにも適用できることを確認するために、３つの異なる合成９９ｂｐ ｄｓＤＮＡ（全て、異なる位置に１個または２個のＮ^６ｍＡ塩基を含有する）の１μｇを同じプロトコールに供した（図１３Ａ）。シーケンシングライブラリー調製について、ＲｅｃＪ_ｆ消化後に回収されたＤＮＡの１ｎｇを用いた。ライブラリー調製中の精製ステップのさらなる最適化が必要とされ、０．９× ＮＥＢ精製ビーズを用いる場合の少しずつのｄｓＤＮＡ長カットオフが、結果として、より短い断片の部分的損失を生じるためである。２５ｂｐの鋭いカットオフを有するスピンカラムを用いる精製（ＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ精製キット）は、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ分析によるわずかに不純なライブラリー（おそらくプライマー二量体の増幅による、約１２０ｂｐの追加のバンドを有した）を生じた。興奮させることには、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎによる分析はまた、最初のＮ^６ｍＡ位置におけるポリメラーゼ停止による予想された断片を示し（図１３Ｂ）、１μｇ ｄｓＤＮＡ試料から始めた場合、類似した結果を得ることができることを確認した。

【0388】

参考文献
この明細書で言及された全ての文書は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

2023542302000001.app

【国際調査報告】