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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-06
(54)【発明の名称】受容体ＴＡＣ技術による膜結合タンパク質の下方制御
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230929BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230929BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20230929BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230929BHJP
C07K 14/715 20060101ALI20230929BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20230929BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230929BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230929BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230929BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20230929BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230929BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230929BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230929BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230929BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20230929BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230929BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230929BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230929BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230929BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230929BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C12N9/00
C07K14/705
C07K14/715
C07K14/725
C07K16/28
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/52 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
A61K35/12
A61K35/17
A61K35/15
A61P35/00
A61P43/00 105
A61K48/00
A61K38/16
A61K35/76
【審査請求】有
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023516810
(86)(22)【出願日】2021-09-13
(85)【翻訳文提出日】2023-03-13
(86)【国際出願番号】 CN2021117886
(87)【国際公開番号】W WO2022053036
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】63/077,658
(32)【優先日】2020-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/144,945
(32)【優先日】2021-02-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/173,476
(32)【優先日】2021-04-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521442039
【氏名又は名称】山東博安生物技術股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＢＯＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３９， Ｋｅｊｉ Ａｖｅｎｕｅ， Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔａｉ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】523091073
【氏名又は名称】ボーン ボストン エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】周立
(72)【発明者】
【氏名】石峰
(72)【発明者】
【氏名】ハリス， ミッシェル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA27
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA41
4C084CA53
4C084NA14
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C087AA01
4C087BB37
4C087BB65
4C087BC83
4C087NA14
4C087ZB21
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA51
4H045DA75
4H045DA89
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
新規な融合タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又はベクターを含む組成物、前記核酸、ベクター又は組成物又は薬物組成物を含む宿主細胞を提供する。さらに、細胞における標的膜結合タンパク質（ＭＢＰ）レベルを低下させる（下方制御する）方法、低下した標的膜結合タンパク質レベルを有する細胞を産生する方法、又は疾患を処置する方法、又は一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞の被験者への投与に関連する、該被験者のＧｖＨＤを低下させるか又は予防する方法を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
融合タンパク質であって、膜結合タンパク質（ＭＢＰ）の分解を媒介する分解タグタンパク質であって、ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数、又は分解を媒介する細胞表面受容体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインから選択される分解タグタンパク質、及び
膜貫通連結ドメインであって、
１） 第１の膜貫通ドメインと第１のコネキシンとを含む第１の膜貫通連結ドメインであって、
該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＩＬ２Ｒ又はその変異体の一つ又は複数のサブユニットもしくはドメインの膜貫通ドメインから選択され、該第１のコネキシンは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片のうちの一つ又は複数から選択され、且つ該第１の膜貫通ドメインと該第１のコネキシンは直接又は間接的に連結され、
好ましくは、上記１） の膜貫通連結ドメインを有する融合タンパク質は第１のシグナルペプチドをさらに含む第１の膜貫通連結ドメイン、又は、
２） 該分解対象のＭＢＰ又はその変異体の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通連結ドメインを含む膜貫通連結ドメインを含み、
好ましくは、該ＭＢＰは膜結合受容体であり、さらに好ましくは、哺乳動物由来の膜結合受容体であり、最も好ましくは、ヒト膜結合受容体であり、
好ましくは、該ユビキチンリガーゼは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインを含み、
好ましくは、分解を媒介するこれらの細胞表面受容体は、インターロイキン受容体又はその変異体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインを含み、
好ましくは、上記１） における該分解対象のＭＢＰの抗原結合断片は、該ＭＢＰ又はその変異体に特異的に結合するｓｃＦｖ、ナノ抗体を含み、
好ましくは、上記２） における該分解対象のＭＢＰ又はその変異体の膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の膜貫通ドメインを含み、
さらに好ましくは、上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含み、
さらに好ましくは、上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項2】
該膜結合受容体は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７又はその変異体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインから選択され、該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質（ＣＨＩＰ）のＣ末端、ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ、ＦボックスＷＤ４０含有タンパク質７（ＦＢＷ７）、ＦＢＷ７．２－２９３、ヒッペル－リンドウ（ＶＨＬ）、ＶＨＬ．１５２－２１３、スポット型ＢＴＢ－ＰＯＺタンパク質（ＳＰＯＰ）、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）、マウス二重微小染色体２ホモログ（ＭＤＭ２）、後期促進複合体（ＡＰＣ）、ＵＢＲ５、ＬＮＸ、カシタスＢ系統リンパ腫形質転換配列様タンパク質１（ＣＢＬＬ１）、ＨＥＣＴドメイン及びアンキリン反復配列含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＡＣＥ１）、ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＥＣＷ１）、ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ２（ＨＥＣＷ２）、ＨＥＣＴ及びＲＬＤドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＥＲＣ１）、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＣ５、ＨＥＲＣ６、ＨＵＷＥ１、ＩＴＣＨ、神経前駆細胞発現の発生的下方制御タンパク質４（ＮＥＤＤ４）、神経前駆細胞発現の発生的下方制御遺伝子４様タンパク質（ＮＥＤＤ４Ｌ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（サイクロフィリン）様２（ＰＰＩＬ２）、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳ４、ＲＡＮＢＰ２、ＲＮＦ４、ＲＢＸ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＴＵＢ１、ＴＯＰＯＲＳ、ＴＲＩＰ１２、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ３Ｄ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ５、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、Ｐａｒｋｉｎ、ＭＫＲＮ１、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２． ｒＩＣというタンパク質又はその短縮化型から選択され、好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＣＨＩＰ、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２． ｒＩＣを含み、且つ、さらに好ましくは、該ＣＨＩＰ、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２． ｒＩＣはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２１－２６、６２、７９、８１又は８３のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
インターロイキン受容体のこれらのサブユニット又はドメインは、ＩＬ－２Ｒのリソソーム標的化モチーフを含み、好ましくは、該ＩＬ－２Ｒのリソソーム標的化モチーフは、Ｌ２Ｒβ ｊｍドメインを含み、さらに好ましくは、該Ｌ２Ｒβ ｊｍドメイン（ＩＬ２Ｒβｊｍ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５８に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
上記１）における該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ４、又はその変異体の膜貫通ドメインから選択され、好ましくは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン変異体、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、又はＣＤ４膜貫通ドメインはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ８９、１８又は１５に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該第１のシグナルペプチドはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １９又は２０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
上記１） における該ＭＢＰの該抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７の抗体もしくは抗原結合断片から選択され、好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、又はＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ５の抗原結合断片は、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ７の抗原結合断片は、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖを含み、ＰＤ－Ｌ１の抗原結合断片は、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ４７の抗原結合断片は、αＣＤ４７ ｓｃＦｖを含み、さらに好ましくは、該ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ又はαＣＤ４７ ｓｃＦｖはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２－１３のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの膜貫通ドメインを含み、好ましくは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含み、さらに好ましくは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの第２のシグナルペプチド、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの膜貫通ドメイン（ＴＭ）はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６７、７０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの細胞外ドメイン（ＥＭ）はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６６、６９に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの第２のシグナルペプチドはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６５、６８に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ（ＣＤ３ζ．ΔＩＣ）の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメインと膜貫通ドメイン及び該ＣＤ３ε（ＣＤ３ε．ΔＩＣ）の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメインと膜貫通ドメインはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６１、６４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
該融合タンパク質は、ヒンジ又はＰ２Ａ－ＧＦＰのうちの一つ又は複数をさらに含み、好ましくは、該ヒンジは、ＣＤ８αヒンジ又はＣＤ４ヒンジから選択され、さらに好ましくは、ＣＤ８αヒンジ又はＣＤ４ヒンジはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １６又は１４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ヒンジは、該第１の膜貫通ドメインのＮ末端に隣接しており、
好ましくは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５７に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該Ｐ２Ａ－ＧＦＰ配列は、該融合タンパク質のＣ末端に位置する、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、ａ） 該第１のコネキシン、該分解タグタンパク質、該第１の膜貫通ドメインであって、
好ましくは、該第１のコネキシンは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７の抗体もしくは抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、又はＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ５の抗原結合断片は、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ７の抗原結合断片は、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖを含み、ＰＤ－Ｌ１の抗原結合断片は、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ４７の抗原結合断片は、αＣＤ４７ ｓｃＦｖを含み、
好ましくは、該分解タグタンパク質は、該Ｅ３ユビキチンリガーゼを含み、さらに好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８を含み、
好ましくは、該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含むもの、
ｂ） 該第１のコネキシン、該第１の膜貫通ドメイン、該分解タグタンパク質であって、
好ましくは、該第１のコネキシンは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３の抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖを含み、
好ましくは、該分解タグタンパク質は、該Ｅ３ユビキチンリガーゼを含み、さらに好ましくは、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＧＲＡＩＬ．ＩＣを含み、
好ましくは、該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン変異体、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインのうちの一つ又は複数から選択されるもの、
ｃ） 上記２）における該第２の膜貫通連結ドメイン、分解を媒介するこれらの細胞表面受容体であって、
好ましくは、上記２）における該第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ又はＣＤ３ε．ΔＩＣを含み、
好ましくは、分解を媒介するこれらの細胞表面受容体はＩＬ２Ｒβｊｍを含むもの、又は、
ｄ） 上記２）における該第２の膜貫通連結ドメイン、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数であって、
好ましくは、上記２）における該第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ．ΔＩＣを含み、
好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数は、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ、ＲＮＦ１５２． ｒＩＣを含むものを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、ａ）：
ＬＧ１１２、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１４、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＦＢＷ７－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１５、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＶＨＬ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１６、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＰＯＰ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１７、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＯＣＳ２－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１８、ＳＰ－ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２３、ＳＰ－ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２４、ＳＰ－ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２５、ＳＰ－Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２６、ＳＰ－Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１９、ＳＰ－ＢＭＡ０３１． ｗｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２０、ＳＰ－ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１３７、ＳＰ－αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１３８、ＳＰ－αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５２、ＳＰ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５３、ＳＰ－αＣＤ４７ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ｂ）：
ＬＧ２２２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－１ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ２２２．１、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ２２２．２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ４ヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ｃ）：
ＭＬＢ０１４、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０４６、ＣＤ３ε．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ｄ）：
ＬＧ１７１、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１７１ｐ１、ＣＡＧ－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ２１３、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＬＧ１７４、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＲＮＦ１３３． ＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＬＧ１８０、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＬＧ１８３、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１５２． ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを含み、
任意選択的に、該融合タンパク質は、Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ及び／又はＳＰを含まない、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくは、それは、該融合タンパク質の、ＣＡＧ又はＥＦ１ａを含む発現プロモーターをさらに含み、
さらに好ましくは、該ＣＡＧ又はＥＦ１ａはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ７２又は８８に示す核酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する核酸配列を含み、
さらに好ましくは、該ａ） 融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａであり、
さらに好ましくは、該ｂ） 融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａであり、
さらに好ましくは、該ｃ） 融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａであり、
さらに好ましくは、ｄ） 融合タンパク質における該ＬＧ１７１ｐ１の発現プロモーターは、ＣＡＧであり、さらに好ましくは、ｄ） 融合タンパク質における他の融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａである、ベクター。
【請求項8】
請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項9】
第１の核酸と第２の核酸とを含み、又は第１の核酸を有する第１のベクター、及び第２の核酸を有する第２のベクターを含み、又は第１の核酸と第２の核酸を有するベクターを含む組成物であって、（１） 該第１の核酸は、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードし、
（２） 該第２の核酸は以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、
（ａ） 所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ） 膜貫通ドメインであって、好ましくはＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はＩＬ２Ｒ膜貫通ドメインであり、さらに好ましくはＣＤ８α膜貫通ドメインである膜貫通ドメイン、及び
（ｃ） 一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含み、好ましくは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメント、
好ましくは、該所定の抗原は腫瘍関連抗原であり、さらに好ましくは、該腫瘍関連抗原は、ＣＥＡ、クローディン１８．２、ＧＰＣ３、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４６、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣａｍ、ＧＤ２、ＥｐｈＡ２、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＣＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＥＢＶ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ－２又はＣＤ３からなる群から選択され、最も好ましくは、該腫瘍関連抗原はＣＥＡである、組成物。
【請求項10】
請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載のベクター又は請求項８又は９に記載の組成物を含む細胞であって、好ましくは、該細胞は、哺乳動物細胞であり、さらに好ましくは、ヒト細胞であり、さらに好ましくは、該細胞は、Ｔ細胞又は初代Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は非免疫細胞であり、最も好ましくは、該細胞は、同種異体細胞である、細胞。
【請求項11】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載のベクター又は請求項８又は９に記載の組成物又は請求項１０に記載の細胞を含む、薬物組成物。
【請求項12】
細胞における標的膜結合タンパク質レベルを低下させる方法であって、請求項６に記載の核酸、請求項７に記載のベクター、又は請求項８又は９に記載の組成物を細胞に導入することを含み、好ましくは、該細胞は、哺乳動物細胞であり、さらに好ましくは、ヒト細胞であり、さらに好ましくは、該細胞は、Ｔ細胞又は初代Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は非免疫細胞であり、最も好ましくは、該細胞は、同種異体細胞である、方法。
【請求項13】
疾患を処置する方法であって、それを必要とする被験者に請求項８又は９に記載の組成物を有する同種異体細胞の治療有効量を投与するか、又はそれを必要とする被験者に請求項１０に記載の細胞の治療有効量を投与することを含み、好ましくは、該細胞は、Ｔ細胞又は初代Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は非免疫細胞であり、好ましくは、該被験者は、減少した移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を有する、方法。
【請求項14】
細胞群における膜結合タンパク質（ＭＢＰ）を下方制御する方法であって、請求項１０に記載の細胞を該細胞群に添加することを含み、ここで、該細胞は、前記ＭＢＰに特異的に結合するｓｃＦｖを含む融合タンパク質を発現し、及び／又は該細胞は、膜貫通ドメインを有する該ＭＢＰの成分又はその断片を含む融合タンパク質を発現し、好ましくは、該細胞群は、Ｔ細胞群であり、好ましくは、ヒト初代Ｔ細胞群であり、且つここで、該ＭＢＰは、ＣＤ３であり、好ましくは、ヒトＣＤ３である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年９月１３日に提出された、名称が「受容体ＴＡＣ技術による膜結合タンパク質の下方制御」の米国仮特許出願第６３／０７７，６５８号、２０２１年２月２日に提出された、名称が「受容体ＴＡＣ技術による膜結合タンパク質の下方制御」の米国仮特許出願第６３／１４４，９４５号、及び２０２１年４月１１日に提出された、名称が「受容体ＴＡＣ技術による膜結合タンパク質の下方制御」の米国仮特許出願第６３／１７３，４７６号の利益を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、山東ボアンバイオテクノロジー株式会社（ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＢＯＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．）とボアンボストン有限責任会社（Ｂｏａｎ Ｂｏｓｔｏｎ ＬＬＣ）との共同研究契約に基づいて完成したものである。
【0003】
本出願は、膜結合タンパク質（ＭＢＰ）の下方制御に関し、且つ特に、受容体ＴＡＣ技術による膜結合タンパク質の下方制御に関する。本出願は、新規な融合タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又はベクターを含む組成物、前記核酸、ベクター又は組成物又は薬物組成物を含む宿主細胞を提供する。本出願はさらに、細胞における標的膜結合タンパク質（ＭＢＰ）レベルを低下させる（下方制御する）方法、低下した標的膜結合タンパク質レベルを有する細胞を産生する方法、又は疾患を処置する方法、又は一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞の被験者への投与に関連する、該被験者のＧｖＨＤを低下させるか又は予防する方法を提供する。
【背景技術】
【0004】
血液悪性腫瘍の処置におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の初期の成功は、免疫療法方策の新たな領域の急成長を示唆している（Ｓｅｌｅｄｔｓｏｖ， Ｖ．Ｉ．， Ｇｏｎｃｈａｒｏｖら， Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ［人類ワクチンと免疫療法］ １１， ８５１-８６９ （２０１５））。ＣＡＲは、デザイナー受容体であり、通常、ＣＤ３ζ ＩＴＡＭモチーフと共刺激ドメインに由来する（例えば、４－１ＢＢ又はＣＤ２８に由来する）モジュール活性化ドメインを有する（Ｗｅｉｎｋｏｖｅ， Ｒ．， Ｇｅｏｒｇｅ， Ｐ．ら， Ｃｌｉｎ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ［臨床と形質転換免疫学］ ８， ｅ１０４９ （２０１９））。代替法も考案されているが、これらの受容体の標的認識は、通常、ＣＡＲの細胞外末端上のｓｃＦｖドメインにより提供される（Ｋｕｈｎ， Ｎ．Ｆ．ら Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ［癌細胞］ ３５， ４７３－４８８． ｅ６ （２０１９））。
【0005】
承認された二つのＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ薬剤（ＫｙｍｒｉａｈとＹｅｓｃａｒｔａ）及びＡｂｅｃｍａ（ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ）は、いずれも自家由来製品である。それらは、個々の患者の自己Ｔ細胞から作製される。自家ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔは、難治性と再発性癌患者において以前にはない有効性を示したが、実際に将来の重大な課題を表し、それらは複雑な製造を必要とし、患者の違いのために、ＣＡＲ－Ｔ細胞の品質には、通常、有意な差があり、且つこれは、生成物の品質の違い、ひいては生産の失敗（失敗率１４％まで）をもたらす（Ｂｅｒｓｅｎｅｖ， Ａ． Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ［輸血］ （２０１７）． ｄｏｉ： １０．１１１１／ｔｒｆ． １４１１０）、（Ｄａｉ， Ｘ．， Ｍｅｉら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ［バイオテクノロジー雑誌］ （２０１９））。しかしながら、生成物の製造に必要なリードタイムが約３～ ４週間であるため、疾患進行によりそれほど待つことができない患者は臨床試験に参加することができず、コストも高すぎて、ほとんどの患者集団は負担できない。Ｋｙｍｒｉａｈの場合、患者一人当たりのコストは＄４７５，０００であるが、Ｙｅｓｃａｒｔａの場合、＄３７３，０００である。
【0006】
一方、同種異体（既製）ＣＡＲ－Ｔは、多くの優位性を提供する。細胞は、バッチで前もって調製し、数千の用量を提供することができ、生成物を凍結し、貯蔵し、且つすぐに使用するために分配し、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より良好な細胞品質を有する健康なドナーから作製され、各バッチの細胞は、均一な品質を有し、これは、患者に対するリードタイムを最小限に抑え、且つ商品のコストが有意に削減することができる（Ｒａｆｉｑ， Ｓ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ［自然総説：臨床腫瘍学］ （２０２０））、（Ｄｅｐｉｌ， Ｓ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ［自然総説：薬物発見］ （２０２０））。
【0007】
現在、患者の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない同種異体生成物を作製する方法がいくつかある：それらは、遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された一定間隔の短い回文反復配列）により媒介されたＴＣＲノックダウン）によって作製することができ、又はそれらは、ＴＣＲのｓｉＲＮＡ下方制御によって作製することができ、又はそれらは、天然にＧｖＨＤを誘発しない細胞（例えば、臍帯血又はＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞（Ｌｉ， Ｙ．ら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ［細胞性幹細胞］ （２０１８））、ＮＫ９２細胞株、又はγδ Ｔ細胞など）によって作製することができる（Ｍａｒｃｕｓ， Ａ．ら， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ［生物療法専門家の意見］ （２０１４））、（Ｄｅｐｉｌ， Ｓ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ［自然総説：薬物発見］ （２０２０））、（Ｔｈｅｍｅｌｉ， Ｍ．， Ｒｉｖｉeｒｅら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ［細胞性幹細胞］ （２０１５））、（Ｒｅｚｖａｎｉ， Ｋ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ［分子療法］ （２０１７））。
【0008】
遺伝子編集技術による重大な挑戦は、オフターゲット修飾のリスクが常に存在することである。オフターゲット修飾率は、５０％まで高くなる可能性があり（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．Ｈ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ －Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ［分子療法－核酸］ （２０１５））、これは、望ましくない突然変異をもたらす恐れがあり、患者にとって重大なリスクとなる。なお、製造プロセスは、二つの修飾ステップを必要とするため、複雑であり、第１のステップは、ＣＡＲをＴ細胞にトランスフェクトすることであり、第２のステップは、ＣＲＩＳＰＲメカニズムを導入してＴＣＲをノックアウトすることである。
【0009】
一方、ＮＫ細胞及びγδ Ｔ細胞とインビボでの持続性及び増殖との関連が不良であり、これはその効果に顕著な影響を及ぼす。それらはまた、インビトロでの拡張も困難である（Ｌｉ， Ｙ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ［細胞性幹細胞］ （２０１８））、（Ｒｅｚｖａｎｉ， Ｋ．，ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ［分子療法］ （２０１７））、（Ｓｈｉｍａｓａｋｉ， Ｎ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ［自然総説：薬物発見］ （２０２０））。
【0010】
どのようにして、以上で言及した欠陥を回避するとともにＴ細胞又は他の細胞における膜結合タンパク質（ＭＢＰ）を下方制御するかは、解決すべき課題である。
【発明の概要】
【0011】
本出願は、新規な融合タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又はベクターを含む組成物、前記核酸、ベクター又は組成物又は薬物組成物を含む細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。本出願はさらに、細胞における標的膜結合タンパク質（ＭＢＰ）レベルを低下させる（下方制御する）方法、低下した標的膜結合タンパク質レベルを有する細胞を産生する方法、又は疾患を処置する方法、又は一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞の被験者への投与に関連する、該被験者のＧｖＨＤを低下させるか又は予防する方法を提供する。
【0012】
本出願では、膜結合タンパク質（ＭＢＰ）の下方制御は、分解タグタンパク質により媒介された分解によって実現され、ここで、該分解タグタンパク質は、分解を媒介する細胞表面受容体のユビキチンリガーゼ及び／又はドメイン（例えば、ＩＬ２Ｒβサブドメイン、Ｌ２Ｒβ ｊｍドメイン）を含む。分解タグタンパク質（例えば、ユビキチンリガーゼ又はＩＬ２Ｒβ）による分解対象のＭＢＰのタグ特異性又は標的化特異性（又は認識特異性）は、分解対象のＭＢＰの抗体（又は抗原結合断片）によって媒介され（即ち、抗体により媒介された基質認識であり）、又は膜貫通ドメインを有する分解対象の膜結合タンパク質又は複合体のサブユニット又はドメインによって媒介される（即ち、膜貫通ドメインにより媒介された基質認識である）。本出願の技術案は、細胞のタイプに関係なく、細胞表面上の任意の標的に適用することができる。
【0013】
一態様では、本出願の融合タンパク質は、
膜結合タンパク質（ＭＢＰ）の分解を媒介する分解タグタンパク質であって、ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数、又は分解を媒介する細胞表面受容体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインから選択される分解タグタンパク質、及び
膜貫通連結ドメインであって、
１） 第１の膜貫通ドメインと第１のコネキシンとを含む第１の膜貫通連結ドメインであって、
該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はＩＬ２Ｒ又はその変異体の一つ又は複数のサブユニットもしくはドメインの膜貫通ドメインから選択され、該第１のコネキシンは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片のうちの一つ又は複数から選択され、且つ該第１の膜貫通ドメインと該第１のコネキシンは直接又は間接的に連結され、
好ましくは、上記１） の該膜貫通連結ドメインを含む融合タンパク質は第１のシグナルペプチドをさらに含む第１の膜貫通連結ドメイン、又は、
２） 該分解対象のＭＢＰ又はその変異体の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通連結ドメインを含む膜貫通連結ドメインを含む。
膜結合タンパク質（ＭＢＰ）の分解を媒介する分解タグタンパク質であって、ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数、又は分解を媒介する細胞表面受容体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインから選択される分解タグタンパク質、及び
膜貫通連結ドメインであって、
１） 第１の膜貫通ドメインと第１のコネキシンとを含む第１の膜貫通連結ドメインであって、
該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はＩＬ２Ｒ又はその変異体の一つ又は複数のサブユニットもしくはドメインの膜貫通ドメインから選択され、該第１のコネキシンは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片のうちの一つ又は複数から選択され、且つ該第１の膜貫通ドメインと該第１のコネキシンは直接又は間接的に連結され、
好ましくは、上記１） の該膜貫通連結ドメインを含む融合タンパク質は第１のシグナルペプチドをさらに含む第１の膜貫通連結ドメイン、又は、
２） 該分解対象のＭＢＰ又はその変異体の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通連結ドメインを含む膜貫通連結ドメインを含む。
【0014】
特定の実施例において、好ましくは、ＭＢＰは膜結合受容体であり、さらに好ましくは、哺乳動物由来の膜結合受容体であり、最も好ましくは、ヒト膜結合受容体であり、
好ましくは、ユビキチンリガーゼは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインを含み、
好ましくは、分解を媒介する細胞表面受容体は、インターロイキン受容体又はその変異体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインを含み、
好ましくは、上記１）における分解対象のＭＢＰの抗原結合断片は、該ＭＢＰ又はその変異体に特異的に結合するｓｃＦｖ又はナノ抗体を含み、
好ましくは、上記２） における分解対象のＭＢＰ又はその変異体の膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の膜貫通ドメインを含み、
さらに好ましくは、上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含み、
さらに好ましくは、上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含む。
好ましくは、ユビキチンリガーゼは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインを含み、
好ましくは、分解を媒介する細胞表面受容体は、インターロイキン受容体又はその変異体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインを含み、
好ましくは、上記１）における分解対象のＭＢＰの抗原結合断片は、該ＭＢＰ又はその変異体に特異的に結合するｓｃＦｖ又はナノ抗体を含み、
好ましくは、上記２） における分解対象のＭＢＰ又はその変異体の膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の膜貫通ドメインを含み、
さらに好ましくは、上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含み、
さらに好ましくは、上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含む。
【0015】
別の特定の実施例において、好ましくは、膜結合受容体は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７又はその変異体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインから選択され、
該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質（ＣＨＩＰ）のＣ末端、ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ、ＦボックスＷＤ４０含有タンパク質７（ＦＢＷ７）、ＦＢＷ７．２－２９３、ヒッペル－リンドウ（ＶＨＬ）、ＶＨＬ．１５２－２１３、スポット型ＢＴＢ－ＰＯＺタンパク質（ＳＰＯＰ）、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）、マウス二重微小染色体２ホモログ（ＭＤＭ２）、後期促進複合体（ＡＰＣ）、ＵＢＲ５、ＬＮＸ、カシタスＢ系統リンパ腫形質転換配列様タンパク質１（ＣＢＬＬ１）、ＨＥＣＴドメイン及びアンキリン反復配列含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＡＣＥ１）、ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＥＣＷ１）、ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ２（ＨＥＣＷ２）、ＨＥＣＴ及びＲＬＤドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＥＲＣ１）、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＣ５、ＨＥＲＣ６、ＨＵＷＥ１、ＩＴＣＨ、神経前駆細胞発現の発生的下方制御タンパク質４（ＮＥＤＤ４）、神経前駆細胞発現の発生的下方制御遺伝子４様タンパク質（ＮＥＤＤ４Ｌ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（サイクロフィリン）様２（ＰＰＩＬ２）、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳ４、ＲＡＮＢＰ２、ＲＮＦ４、ＲＢＸ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＴＵＢ１、ＴＯＰＯＲＳ、ＴＲＩＰ１２、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ３Ｄ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ５、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、Ｐａｒｋｉｎ、ＭＫＲＮ１、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２．ｒＩＣというタンパク質又はその短縮化型から選択され、、好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＣＨＩＰ、ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２．ｒＩＣを含み、且つ、さらに好ましくは、該ＣＨＩＰ、ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２．ｒＩＣはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２１－２６、６２、７９、８１又は８３のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
インターロイキン受容体のサブユニット又はドメインは、ＩＬ－２Ｒのリソソーム標的化モチーフを含み、好ましくは、該ＩＬ－２Ｒのリソソーム標的化モチーフは、Ｌ２Ｒβ ｊｍドメインを含み、さらに好ましくは、該Ｌ２Ｒβ ｊｍドメイン（ＩＬ２Ｒβｊｍ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５８に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
上記１） における該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ４、又はその変異体の膜貫通ドメインから選択され、好ましくは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン変異体、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、又はＣＤ４膜貫通ドメインはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ８９、１８又は１５に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該第１のシグナルペプチドはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １９又は２０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
上記１） におけるＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７の抗体もしくは抗原結合断片から選択され、好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、又はＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ５の抗原結合断片は、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ７の抗原結合断片は、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖを含み、ＰＤ－Ｌ１の抗原結合断片は、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ４７の抗原結合断片は、αＣＤ４７ ｓｃＦｖを含み、さらに好ましくは、該ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ又はαＣＤ４７ ｓｃＦｖはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２－１３のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの膜貫通ドメインを含み、好ましくは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含み、さらに好ましくは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの第２のシグナルペプチド、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの膜貫通ドメイン（ＴＭ）はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６７、７０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの細胞外ドメイン（ＥＭ）はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６６、６９に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの第２のシグナルペプチドはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６５、６８に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメインと膜貫通ドメイン及び該ＣＤ３ε（ＣＤ３ε． ΔＩＣ）の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメインと膜貫通ドメインはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６１、６４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質（ＣＨＩＰ）のＣ末端、ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ、ＦボックスＷＤ４０含有タンパク質７（ＦＢＷ７）、ＦＢＷ７．２－２９３、ヒッペル－リンドウ（ＶＨＬ）、ＶＨＬ．１５２－２１３、スポット型ＢＴＢ－ＰＯＺタンパク質（ＳＰＯＰ）、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）、マウス二重微小染色体２ホモログ（ＭＤＭ２）、後期促進複合体（ＡＰＣ）、ＵＢＲ５、ＬＮＸ、カシタスＢ系統リンパ腫形質転換配列様タンパク質１（ＣＢＬＬ１）、ＨＥＣＴドメイン及びアンキリン反復配列含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＡＣＥ１）、ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＥＣＷ１）、ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ２（ＨＥＣＷ２）、ＨＥＣＴ及びＲＬＤドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＥＲＣ１）、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＣ５、ＨＥＲＣ６、ＨＵＷＥ１、ＩＴＣＨ、神経前駆細胞発現の発生的下方制御タンパク質４（ＮＥＤＤ４）、神経前駆細胞発現の発生的下方制御遺伝子４様タンパク質（ＮＥＤＤ４Ｌ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（サイクロフィリン）様２（ＰＰＩＬ２）、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳ４、ＲＡＮＢＰ２、ＲＮＦ４、ＲＢＸ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＴＵＢ１、ＴＯＰＯＲＳ、ＴＲＩＰ１２、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ３Ｄ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ５、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、Ｐａｒｋｉｎ、ＭＫＲＮ１、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２．ｒＩＣというタンパク質又はその短縮化型から選択され、、好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＣＨＩＰ、ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２．ｒＩＣを含み、且つ、さらに好ましくは、該ＣＨＩＰ、ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２．ｒＩＣはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２１－２６、６２、７９、８１又は８３のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
インターロイキン受容体のサブユニット又はドメインは、ＩＬ－２Ｒのリソソーム標的化モチーフを含み、好ましくは、該ＩＬ－２Ｒのリソソーム標的化モチーフは、Ｌ２Ｒβ ｊｍドメインを含み、さらに好ましくは、該Ｌ２Ｒβ ｊｍドメイン（ＩＬ２Ｒβｊｍ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５８に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
上記１） における該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ４、又はその変異体の膜貫通ドメインから選択され、好ましくは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン変異体、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、又はＣＤ４膜貫通ドメインはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ８９、１８又は１５に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該第１のシグナルペプチドはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １９又は２０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
上記１） におけるＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７の抗体もしくは抗原結合断片から選択され、好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、又はＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ５の抗原結合断片は、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ７の抗原結合断片は、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖを含み、ＰＤ－Ｌ１の抗原結合断片は、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ４７の抗原結合断片は、αＣＤ４７ ｓｃＦｖを含み、さらに好ましくは、該ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ又はαＣＤ４７ ｓｃＦｖはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２－１３のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの膜貫通ドメインを含み、好ましくは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含み、さらに好ましくは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの第２のシグナルペプチド、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの膜貫通ドメイン（ＴＭ）はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６７、７０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの細胞外ドメイン（ＥＭ）はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６６、６９に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの第２のシグナルペプチドはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６５、６８に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ＣＤ３ζ（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメインと膜貫通ドメイン及び該ＣＤ３ε（ＣＤ３ε． ΔＩＣ）の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメインと膜貫通ドメインはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６１、６４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0016】
特定の実施例において、融合タンパク質は、ヒンジ又はＰ２Ａ－ＧＦＰのうちの一つ又は複数をさらに含み、
好ましくは、該ヒンジは、ＣＤ８αヒンジ又はＣＤ４ヒンジから選択され、さらに好ましくは、ＣＤ８αヒンジ又はＣＤ４ヒンジはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １６又は１４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ヒンジは、該第１の膜貫通ドメインのＮ末端に隣接しており、
好ましくは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５７に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該Ｐ２Ａ－ＧＦＰ配列は、該融合タンパク質のＣ末端に位置する。
好ましくは、該ヒンジは、ＣＤ８αヒンジ又はＣＤ４ヒンジから選択され、さらに好ましくは、ＣＤ８αヒンジ又はＣＤ４ヒンジはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １６又は１４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該ヒンジは、該第１の膜貫通ドメインのＮ末端に隣接しており、
好ましくは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５７に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、該Ｐ２Ａ－ＧＦＰ配列は、該融合タンパク質のＣ末端に位置する。
【0017】
別の特定の実施例において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、
ａ） 第１のコネキシン、分解タグタンパク質、第１の膜貫通ドメインであって、
好ましくは、該第１のコネキシンは、分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７の抗体もしくは抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、又はＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ５の抗原結合断片は、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ７の抗原結合断片は、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖを含み、ＰＤ－Ｌ１の抗原結合断片は、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ４７の抗原結合断片は、αＣＤ４７ ｓｃＦｖを含み、
好ましくは、該分解タグタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを含み、さらに好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、又はＳＯＣＳ２．１４３－１９８を含み、
好ましくは、該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含むもの、
ｂ） 第１のコネキシン、第１の膜貫通ドメイン、分解タグタンパク質であって、
好ましくは、該第１のコネキシンは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３の抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖを含み、
好ましくは、該分解タグタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを含み、さらに好ましくは、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＧＲＡＩＬ．ＩＣを含み、
好ましくは、該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン変異体、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインのうちの一つ又は複数から選択されるもの、
ｃ） 上記２） における第２の膜貫通連結ドメイン、分解を媒介する細胞表面受容体であって、
好ましくは、上記２） における該第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ又はＣＤ３ε．ΔＩＣを含み、
好ましくは、分解を媒介するこれらの細胞表面受容体はＩＬ２Ｒβｊｍを含むもの、又は、
ｄ） 上記２） における第２の膜貫通連結ドメイン、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数、
好ましくは、上記２） における該第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ．ΔＩＣを含み、
好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数は、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ、ＲＮＦ１５２．ｒＩＣを含むものを含む。
ａ） 第１のコネキシン、分解タグタンパク質、第１の膜貫通ドメインであって、
好ましくは、該第１のコネキシンは、分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７の抗体もしくは抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、又はＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ５の抗原結合断片は、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ７の抗原結合断片は、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖを含み、ＰＤ－Ｌ１の抗原結合断片は、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ４７の抗原結合断片は、αＣＤ４７ ｓｃＦｖを含み、
好ましくは、該分解タグタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを含み、さらに好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、又はＳＯＣＳ２．１４３－１９８を含み、
好ましくは、該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含むもの、
ｂ） 第１のコネキシン、第１の膜貫通ドメイン、分解タグタンパク質であって、
好ましくは、該第１のコネキシンは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３の抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖを含み、
好ましくは、該分解タグタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを含み、さらに好ましくは、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＧＲＡＩＬ．ＩＣを含み、
好ましくは、該第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン変異体、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインのうちの一つ又は複数から選択されるもの、
ｃ） 上記２） における第２の膜貫通連結ドメイン、分解を媒介する細胞表面受容体であって、
好ましくは、上記２） における該第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ又はＣＤ３ε．ΔＩＣを含み、
好ましくは、分解を媒介するこれらの細胞表面受容体はＩＬ２Ｒβｊｍを含むもの、又は、
ｄ） 上記２） における第２の膜貫通連結ドメイン、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数、
好ましくは、上記２） における該第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ．ΔＩＣを含み、
好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数は、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ、ＲＮＦ１５２．ｒＩＣを含むものを含む。
【0018】
別の特定の実施例において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、
ａ）：
ＬＧ１１２、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１４、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＦＢＷ７－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１５、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＶＨＬ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１６、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＰＯＰ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１７、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＯＣＳ２－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１８、ＳＰ－ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２３、ＳＰ－ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２４、ＳＰ－ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２５、ＳＰ－Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２６、ＳＰ－Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１９、ＳＰ－ＢＭＡ０３１．ｗｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２０、ＳＰ－ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１３７、ＳＰ－αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１３８、ＳＰ－αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５２、ＳＰ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５３、ＳＰ－αＣＤ４７ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ｂ）：
ＬＧ２２２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－１ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ２２２．１、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ２２２．２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ４ヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ｃ）：
ＭＬＢ０１４、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０４６、ＣＤ３ε．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ｄ）：
ＬＧ１７１、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１７１ｐ１、ＣＡＧ－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ２１３、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＬＧ１７４、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１３３．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＬＧ１８０、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＬＧ１８３、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１５２．ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを含み、
任意選択的に、該融合タンパク質は、Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ（即ち、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）及び／又はＳＰを含まない。
ａ）：
ＬＧ１１２、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１４、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＦＢＷ７－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１５、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＶＨＬ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１６、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＰＯＰ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１７、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＯＣＳ２－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１８、ＳＰ－ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２３、ＳＰ－ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２４、ＳＰ－ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２５、ＳＰ－Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２６、ＳＰ－Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１９、ＳＰ－ＢＭＡ０３１．ｗｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２０、ＳＰ－ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１３７、ＳＰ－αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１３８、ＳＰ－αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５２、ＳＰ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５３、ＳＰ－αＣＤ４７ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ｂ）：
ＬＧ２２２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－１ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ２２２．１、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ２２２．２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ４ヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ｃ）：
ＭＬＢ０１４、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０４６、ＣＤ３ε．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ｄ）：
ＬＧ１７１、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１７１ｐ１、ＣＡＧ－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ２１３、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＬＧ１７４、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１３３．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＬＧ１８０、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１２２．ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、
ＬＧ１８３、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１５２．ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを含み、
任意選択的に、該融合タンパク質は、Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ（即ち、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）及び／又はＳＰを含まない。
【0019】
別の態様では、本出願は、本出願の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。
【0020】
別の態様では、本出願は、本出願の核酸を含むベクターを提供する。
【0021】
特定の実施例において、好ましくは、融合タンパク質の発現プロモーターは、ＣＡＧ又はＥＦ１ａを含み、
さらに好ましくは、ＣＡＧ又はＥＦ１ａはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ７２又は８８に示す核酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する核酸配列を含み、
さらに好ましくは、ａ） 融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａであり、
さらに好ましくは、ｂ） 融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａであり、
さらに好ましくは、ｃ） 融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａであり、
さらに好ましくは、ｄ） 融合タンパク質におけるＬＧ１７１ｐ１の発現プロモーターは、ＣＡＧであり、さらに好ましくは、ｄ） 融合タンパク質における他の融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａである。
さらに好ましくは、ＣＡＧ又はＥＦ１ａはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ７２又は８８に示す核酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する核酸配列を含み、
さらに好ましくは、ａ） 融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａであり、
さらに好ましくは、ｂ） 融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａであり、
さらに好ましくは、ｃ） 融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａであり、
さらに好ましくは、ｄ） 融合タンパク質におけるＬＧ１７１ｐ１の発現プロモーターは、ＣＡＧであり、さらに好ましくは、ｄ） 融合タンパク質における他の融合タンパク質の発現プロモーターは、ＥＦ１ａである。
【0022】
別の態様では、本出願は、本出願の核酸又はベクターを含む組成物を提供する。
【0023】
別の態様では、組成物は、第１の核酸と第２の核酸を含み、又は第１の核酸を有する第１のベクター、及び第２の核酸を有する第２のベクターを含み、又は第１の核酸と第２の核酸を有するベクターを含み、ここで、
（１） 該第１の核酸は、本出願の融合タンパク質をコードし、
（２） 該第２の核酸は以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、
（ａ） 所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ） 膜貫通ドメイン、及び
（ｃ） 一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含み、好ましくは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメント。
（１） 該第１の核酸は、本出願の融合タンパク質をコードし、
（２） 該第２の核酸は以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、
（ａ） 所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ） 膜貫通ドメイン、及び
（ｃ） 一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含み、好ましくは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメント。
【0024】
特定の実施例において、組成物における融合タンパク質は、上記ａ） －ｄ） 融合タンパク質のうちの一つ又は複数から選択され、該組成物は、第１の核酸と第２の核酸とを含み、又は第１の核酸を有する第１のベクター及び第２の核酸を有する第２のベクターを含み、又は第１の核酸と第２の核酸を有するベクターを含む。
【0025】
特定の実施例において、所定の抗原は、腫瘍関連抗原である。
【0026】
別の特定の実施例において、腫瘍関連抗原は、ＣＥＡ、クローディン１８．２、ＧＰＣ３、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４６、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣａｍ、ＧＤ２、ＥｐｈＡ２、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＣＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＥＢＶ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ－２又はＣＤ３からなる群から選択される。
【0027】
別の特定の実施例において、腫瘍関連抗原は、ＣＥＡである。
【0028】
別の態様では、本出願は、本出願の核酸又はベクター又は組成物を含む細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。
【0029】
特定の実施例において、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは、ヒト細胞である。
【0030】
別の特定の実施例において、宿主細胞は、Ｔ細胞又は初代Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は非免疫細胞である。
【0031】
別の特定の実施例において、宿主細胞は、同種異体細胞である。
【0032】
別の態様では、本出願は、本出願の融合タンパク質、核酸、ベクター、組成物又は細胞を含む薬物組成物を提供する。
【0033】
特定の実施例において、組成物は、一つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【0034】
別の態様では、本出願は、細胞における標的膜結合タンパク質レベルを低下させる方法を提供し、該方法は、本出願の核酸、ベクター、又は組成物を細胞に導入することを含む。
【0035】
特定の実施例において、細胞（例えば、宿主細胞）は、哺乳動物細胞であり、好ましくは、ヒト細胞である。
【0036】
別の実施例において、宿主細胞は、Ｔ細胞又は初代Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は非免疫細胞である。
【0037】
別の実施例において、宿主細胞は、同種異体細胞である。
【0038】
別の態様では、本出願は、低下した標的膜結合タンパク質レベルを有する細胞を産生する方法を提供し、該方法は、本出願の核酸、ベクター、又は組成物を細胞に導入することを含む。好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞であり、さらに好ましくは、ヒト細胞であり、さらに好ましくは、細胞は、Ｔ細胞又は初代Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は非免疫細胞であり、最も好ましくは、細胞は、同種異体細胞である。
【0039】
別の態様では、本出願は、疾患を処置する方法を提供し、該方法は、それを必要とする被験者に本出願の組成物を有する同種異体細胞の治療有効量を投与するか、又はそれを必要とする被験者に本出願の細胞の治療有効量を投与することを含み、ここで、好ましくは、該被験者は、減少した移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を有する。好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞であり、さらに好ましくは、ヒト細胞であり、さらに好ましくは、細胞は、Ｔ細胞又は初代Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は非免疫細胞であり、最も好ましくは、細胞は、同種異体細胞である。
【0040】
別の態様では、本出願は、一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞の被験者への投与に関連する、該被験者のＧｖＨＤを低下させるか又は予防する方法を提供し、該方法は、
（１） 本出願の核酸又はベクター又は組成物で一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞をトランスフェクトすること、及び
（２） 該被験者にＣＡＲ Ｔ細胞を投与することを含む。
（１） 本出願の核酸又はベクター又は組成物で一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞をトランスフェクトすること、及び
（２） 該被験者にＣＡＲ Ｔ細胞を投与することを含む。
【0041】
別の態様では、本出願は、細胞群における膜結合タンパク質（ＭＢＰ）を下方制御する方法を提供し、該方法は、前記細胞群に本出願の宿主細胞を添加することを含み、ここで、該宿主細胞は、前記ＭＢＰに特異的に結合するｓｃＦｖを含む融合タンパク質を発現し、及び／又は該宿主細胞は、膜貫通ドメインを有するＭＢＰの成分又はその断片を含む融合タンパク質を発現する。
【0042】
別の態様では、宿主細胞群は、Ｔ細胞群であり、好ましくは、ヒト初代Ｔ細胞群である。
【0043】
別の態様では、ＭＢＰは、ＣＤ３であり、好ましくは、ヒトＣＤ３である。
【0044】
本出願の利点は以下のとおりである。
１） 本出願の融合タンパク質は、細胞における標的膜結合タンパク質（ＭＢＰ）レベルを低下させる（下方制御する）ことができ、及び
２） 本出願のＣＡＲ Ｔ細胞は、被験者のＧｖＨＤを低下させるか又は予防することができる。
１） 本出願の融合タンパク質は、細胞における標的膜結合タンパク質（ＭＢＰ）レベルを低下させる（下方制御する）ことができ、及び
２） 本出願のＣＡＲ Ｔ細胞は、被験者のＧｖＨＤを低下させるか又は予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【0045】
本開示の新しい特徴は、添付の特許請求の範囲において特別に説明される。以下の発明を実施するための形態において、本開示の特徴と利点をより良く理解できるように、実施例と例の方式で説明した。
【図1】受容体組織に対する潜在的なＧｖＨＤ応答を回避するように同種異体ＣＡＲ－Ｔ宿主細胞を産生する図である。Ｔ細胞、ドナーＴ細胞は、異なる発育／成熟経験により、異なる受容体に注入される場合、外因性抗原（ＧｖＨＤ）に対する強い免疫応答を潜在的に誘発することができ、例えば、細胞毒性、サイトカイン放出症候群及び神経毒性である。ドナー細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体を分解することによって、このような悪い影響を大幅に排除することができる。
【図2】ＴＣＲ／ＣＤ３分解構築体と参考構築体の概略図である。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を分解するために、一連のＥ３リガーゼ又はその変異体（Ｅ３リガーゼの機能ドメイン）（例えば、ＦＢＷ７、ＶＨＬ、ＳＰＯＰ及びＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ）は、ヒトＣＤ３を対象とするｓｃＦｖに連結することによって試験された。クローンＳＰ３４又はＯＫＴ３をｓｃＦｖの産生に用いた。これらの構築体のうちのいくつかは、ＣＤ８αヒンジ／膜貫通ドメインによって細胞膜にさらに固着された。本明細書は、ＬＳ００８構築体（ＣＤ１９ ＣＡＲ）を陰性コントロールとして用いる。細胞質構築体（ＬＧ０８９、ＬＧ０９１、ＬＧ０９２、ＬＧ０８５構築体）は、ＣＤ３の抗体又は抗原結合断片をＥ３リガーゼ／ユビキチンに結合させることによって得られるが、該細胞質構築体は、ＳＰ配列とヒンジ／ＴＭ配列を有さず、且つ細胞の細胞質に発現される。細胞質又は膜固着構築体（ＬＧ０２１、ＬＧ０２２、ＬＧ０２３、ＬＧ０２４構築体）は、Ｅ３リガーゼ／ユビキチン配列を有さず、ＣＤ３の抗体又は抗原結合断片のみを有する。ＣＤ３の抗体又は抗原結合断片をＥ３リガーゼ／ユビキチンに結合させることによってＴＣＲ／ＣＤ３分解構築体（ＬＧ１１２、ＬＧ１１３）を得て、且つ該構築体は、ＳＰ配列とヒンジ／ＴＭ配列の両方を有する。
【図3A-3E】細胞質構築体（ＬＧ０８９、ＬＧ０９１、ＬＧ０９２、ＬＧ０８５）によるヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体への影響である。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、活性化された初代Ｔ細胞を収集し、ＴＣＲ／ＣＤ３分解のための細胞質構築体の一つを発現するプラスミドの存在下でエレクトロポレーションを行った。二日後に、細胞を収穫し、ＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。図３Ａは、システミックコントロールｐｍａｘＧＦＰとＬＳ００８が初代Ｔ細胞において良好なトランスフェクト効率を有し、且つこの二つの構築体のいずれにおいてもＴＣＲα／βとＣＤ３の下方制御がないことを示した。図３Ｂ－３ＥのＦＡＣＳ結果により、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（例えば、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３ ｓｃＦｖ）コンジュゲートＥ３リガーゼ（ＦＢＷ７（図３Ｂ）、ＶＨＬ（図３Ｃ）、ＳＰＯＰ（図３Ｄ）及びｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ（図３Ｅ）を含む）が細胞質に発現される場合、明らかなＴＣＲ／ＣＤ３複合体分解がないことが示されている。
【図4A-4D】膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ０２１、ＬＧ０２２、ＬＧ０２３、ＬＧ０２４）は、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の下方制御を付与する。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、細胞を収集し、且つＴＣＲ／ＣＤ３分解のための細胞質／膜固着構築体の一つを発現する１ μｇ ＤＮＡプラスミドを用いて、エレクトロポレーションを行った。二日後に、細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。ＳＰ３４ ｓｃＦｖ（ＬＧ０２１）（図４Ａ）又はＯＫＴ３ ｓｃＦｖ（ＬＧ０２３）（図４Ｃ）依存性構築体が細胞質に発現される場合、明らかなＴＣＲ／ＣＤ３複合体下方制御がない。同様に、膜固着ＳＰ３４ ｓｃＦｖ構築体（ＬＧ０２２）も、いかなる影響も示していない（図４Ｂ）。しかしながら、膜固着の形でＯＫＴ３ ｓｃＦｖ配列を用いる場合、有意なＴＣＲ／ＣＤ３複合体下方制御（ＬＧ０２４）が観察された（図４Ｄ）。
【図5】膜固着ＯＫＴ３構築体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の下方制御を付与する。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ０２４）を発現するトランスポゾンの両方を用いてＪｕｒｋａｔ細胞をエレクトロポレーションした。Ｊｕｒｋａｔ細胞を５７日目まで維持し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）で染色した後にフローサイトメトリー試験を行い、安定に組み込まれたトランスポゾン（膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ０２４）を発現する）を有する細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の有意な分解（ＧＦＰ陽性）が示された。
【図6A-6D】Ｅ３リガーゼとＯＫＴ３ ｓｃＦｖ構築体との細胞質連結（ＬＧ１１３）よりも、Ｅ３リガーゼとＯＫＴ３ ｓｃＦｖ構築体との膜外連結（ＬＧ１１２）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞株におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体のより良い下方制御を付与する。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び異なる膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ１１２、ＬＧ１１３）を発現するトランスポゾンの両方でＪｕｒｋａｔ細胞をエレクトロポレーションした。３日目にＪｕｒｋａｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）で染色した後にフローサイトメトリー分析を行った。図６Ａは、システミックコントロールｐｍａｘＧＦＰとＬＳ００８がＪｕｒｋａｔ細胞において良好なトランスフェクト効率を有し、且つこの二つの構築体のいずれにおいてもＴＣＲα／βとＣＤ３の下方制御がないことを示した。Ｅ３ユビキチンリガーゼのない膜固着ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ構築体（ＬＧ０２４）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲ－ＣＤ３複合体の有意な下方制御を示した（図６Ｂ）。ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲが、細胞質方式（ＬＧ１１３）（図６Ｄ）ではなく、外膜方式（近端連結）（ＬＧ１１２）（図６Ｃ）でＯＫＴ３ ｓｃＦｖと連結する場合、より強いＴＣＲ／ＣＤ３複合体の下方制御を得た。
【図7A-7D】Ｅ３リガーゼとＯＫＴ３ ｓｃＦｖ構築体との細胞質連結（ＬＧ１１３）よりも、Ｅ３リガーゼとＯＫＴ３構築体との膜外連結（ＬＧ１１２）は、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体のより良い下方制御を付与する。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、活性化された初代Ｔ細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び異なる膜固着ＯＫＴ３構築体を発現するトランスポゾンの両方でエレクトロポレーションした。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。図７Ａは、システミックコントロールｐｍａｘＧＦＰとＬＳ００８が初代Ｔ細胞において良好なトランスフェクト効率を有し、且つこの二つの構築体のいずれにおいてもＴＣＲα／βとＣＤ３の下方制御がないことを示した。本発明者らがＪｕｒｋａｔ細胞株で発見したのと似たように、ｈＣＨＩＰ．ｄＴＰＲが、細胞質方式（ＬＧ１１３）（図７Ｄ）ではなく、外膜方式（近端連結）（ＬＧ１１２）（図７Ｃ）でＯＫＴ３ ｓｃＦｖと連結する場合、分解はより有意になり得る。Ｅ３ユビキチンリガーゼのない膜固着ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ構築体（ＬＧ０２４）（図７Ｂ）に比べて、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＣＨＩＰ．ｄＴＰＲ）が構築体全体の細胞質部分（ＬＧ１１３、図７Ｄ）に位置する場合、ＴＣＲ／ＣＤ３分解に有意な変化がないことを発見した。
【図8A-8E】異なるＥ３リガーゼを有するＴＣＲ／ＣＤ３分解構築体である。（図８Ａ）膜固着ＯＫＴ３ ｓｃＦｖに連結される異なるＥ３リガーゼ（ＦＢＷ７と、ＶＨＬと、ＳＰＯＰと、ＳＯＣＳ２とを含む）を有する一連の構築体を設計し合成した。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、初代Ｔ細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び異なる膜固着ＯＫＴ３構築体を発現するトランスポゾンの両方でエレクトロポレーションした。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。ＦＢＷ７（図８Ｂ）、ＶＨＬ（図８Ｃ）、ＳＰＯＰ（図８Ｄ）及びＳＯＣＳ２（図８Ｅ）のＴＣＲ／ＣＤ３下方制御影響を試験した。
【図9A-9F】異なるＣＤ３を標的化するｓｃＦｖを有するＴＣＲ／ＣＤ３分解構築体である。（図９Ａ）異なるＴＣＲ－ＣＤ３を標的化するｓｃＦｖ（ＳＰ３４と、ＵＣＨＴ１と、ＵＣＨＴ１と． Ｙ１７７Ｔと、Ｌ２Ｋと、Ｆ６Ａとを含む）を有する一連のＴＣＲ／ＣＤ３分解構築体を設計し合成した。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、初代Ｔ細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとトランスポゾンＤＮＡ構築体の両方でエレクトロポレーションした。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。ＳＰ３４（図９Ｂ）、ＵＣＨＴ１（図９Ｃ）、ＵＣＨＴ１． Ｙ１７７Ｔ（図９Ｄ）、Ｌ２Ｋ（図９Ｅ）及びＦ６Ａ（図９Ｆ）によるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御影響を試験した。
【図10A-10E】Ｅ３リガーゼ（ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ）は、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御を最適化するのに必要である。（図１０Ａ）ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲが存在するか又は存在しない場合に、ＴＣＲを標的化するｓｃＦｖ（ＢＭＡ０３１又はＢＭＡ０３１． Ｈ６Ｌ１２）を有する一連のＴＣＲ分解構築体を設計し合成した。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとトランスポゾンＤＮＡ構築体の両方でエレクトロポレーションした。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲが存在する（図１０Ｂ）（図１０Ｃ）か又は存在しない（図１０Ｄ）（図１０Ｅ）場合に、ＢＭＡ０３１（ＬＧ１１９、図１０Ｂ）（ＬＧ１３３、図１０Ｄ）又はＢＭＡ０３１． Ｈ６Ｌ１２（ＬＧ１２０、図１０Ｃ）（ＬＧ１３４、図１０Ｅ）によるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御影響を試験した。
【図11A-11B】ＣＤ３下方制御がＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２刺激により、低いＪｕｒｋａｔ細胞活性化を付与することを示した。図１１Ａは、ベースラインにおいて、全ての細胞のＣＤ６９（Ｔ細胞活性化マーカー）発現レベルが低いことを示し、図１１Ｂは、刺激後４時間で、Ｔ細胞ＬＳ００８によりトランスフェクトされた細胞に比べて、ＬＧ０２４又はＬＧ１１２によりトランスフェクトされたＧＦＰ＋細胞におけるＣＤ６９発現レベルが有意に低下したことを示した。
【図12A-12C】ＣＤ５又はＣＤ７下方制御構築体と検証である。図１２Ａは、一連のＣＤ５又はＣＤ７分解構築体を設計し合成することを示した。図１２Ｂは、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖがＣＤ５への強い下方制御を付与したことを示し、図１２Ｃは、αＣＤ７． ＴＨ６９ ｓｃＦｖ（ＣＤ７を標的化するｓｃＦｖ）が、ヒト初代Ｔ細胞においても、有意な下方制御影響を示すことを示した。
【図13A-13B】Ｅ３ ＣＨＩＰ構築体によるＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７の下方制御である。図１３Ａは、それぞれＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７に対して特異的であるＥ３構築体ＭＬＢ０５２とＭＬＢ０５３の概略図を示した。各構築体は、標的抗原に特異的なＮ末端ＳｃＦｖドメインと、ＴＰＲドメインを欠損したＥ３リガーゼＣＨＩＰの短縮化型で構成される。Ｅ３分解剤構築体（ＭＬＢ０５２又はＭＬＢ０５３）は、可撓性ヒンジと膜貫通固着によって膜を固着する。ＰＤ－Ｌ１について、１） Ｊｕｒｋａｔ細胞の二つの異なる集団（ＧＦＰ＋とＧＦＰ－）の代表的なフローサイトメトリー図（即ち、図１３Ｂの左列の上小図）を示し、ＰＥコンジュゲート抗ＰＤ－Ｌ１抗体でＪｕｒｋａｔ細胞を染色し、２） トランスフェクトされていないＪｕｒｋａｔ親細胞（即ち、図１３Ｂの右列の上小図の破線で示される領域）に対して、ＧＦＰ＋発現においてゲーティングする、Ｅ３－ＣＨＩＰを発現する細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現のヒストグラム（即ち、図１３Ｂの右列の上小図の破線で示される領域）である。ＣＤ ４７について、１） 抗ＣＤ４７ Ｅ３ ＣＨＩＰでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（ＧＦＰ＋）（即ち、図１３Ｂの左列の下小図）及びＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４７一抗で染色されたＪｕｒｋａｔ細胞の代表的なフローサイトメトリー図であり、２） トランスフェクトされていない親コントロール細胞（図１３Ｂの右列の下小図）に対して、ＧＦＰ＋発現においてゲーティングする、Ｅ３ ＣＨＩＰトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞のＣＤ４７発現のヒストグラムを示した。
【図14A-14B】Ｅ３ ＣＨＩＰに連結されるＣＤ３標的化構築体（ＬＧ０２４）によるＴＣＲ発現のパラクリン下方制御である。図１４Ａは、ＴＣＲ発現のパラクリン下方制御を示すための共培養アッセイのゲーティングポリシーを示した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色陽性細胞（即ち、ＬＧ０２４トランスフェクトされていないＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ＋細胞）とＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色陰性細胞（即ち、ＬＧ０２４トランスフェクトＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ-細胞）に対して行われたゲーティングにより、これらの異なる集団の特徴付けが可能になった（図１４Ａの左列）。ＬＧ０２４トランスフェクト細胞（即ち、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ-細胞）を、Ｅ３リガーゼ構築体を発現するＧＦＰ陽性集団、及びトランスフェクトされていないＧＦＰ陰性集団にさらにゲーティングした（図１４Ａの中間列）。ＰＥコンジュゲートαＣＤ３（クローンＨｉｔ３ａ）で細胞を染色して、ＴＣＲ表面発現を評価した（図１４Ａの左列）。図１４Ｂは、ＬＧ０２４でエレクトロポレーションしたＪｕｒｋａｔ細胞（即ち、ＬＧ０２４トランスフェクトされたＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ-細胞）を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色で標識した親ストックＪｕｒｋａｔ細胞（即ち、ＬＧ０２４トランスフェクトされていないＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ＋細胞）で連続的に希釈したことを示した。Ｅ３リガーゼを発現する細胞部分に対する連続的希釈は、非発現細胞における表面分子の抗原特異的下方制御を示す。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色で標識した親細胞によりＬＧ０２４トランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞を連続的に希釈して、Ｅ３リガーゼ陽性細胞の総割合を、７８％、５７％、４４％、３１％、２２％、１６％、１１％、及び０％にする。親集団（即ち、トランスフェクトされていない集団）は、灰色陰影ヒストグラム（即ち、塗りつぶされた領域）として示されている。トランスフェクトされた集団を、ＧＦＰ陽性（黒の実線で標識された領域）とＧＦＰ陰性（黒の破線で標識された領域）にさらにゲーティングした。ＰＥコンジュゲートＣＤ３抗体（クローンＨｉｔ３ａ）を用いて細胞を染色して、ＴＣＲ表面発現を確定した。
【図15A-15D】異なるヒンジ／膜貫通ドメインの、ＣＤ３を標的化するｓｃＦｖ（即ち、ＳＰ３４）とＧＲＡＩＬ． ＩＣとの両方により媒介されたＪｕｒｋａｔにおけるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御に対する影響である。図１５Ａは、ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１及びＬＧ２２２．２の構築体図を示し、図１５Ｂ－Ｄは、ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１又はＬＧ２２２．２を発現するＰｉｇｇｙＢａｃベクターとＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとの組み合わせによるＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーションを示した。エレクトロポレーション後３日目に、ＣＤ３とＴＣＲα／β染色によってＴＣＲ表面発現を評価した。
【図16A-16C】異なるヒンジ／膜貫通ドメインの、ＣＤ３を標的化するｓｃＦｖ（即ち、ＳＰ３４）とＧＲＡＩＬ． ＩＣとの両方によって媒介されたヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御に対する影響である。図１６Ａ－１６Ｃは、ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１又はＬＧ２２２．２を発現するＰｉｇｇｙＢａｃベクターとＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとの組み合わせで、ヒト初代Ｔ細胞を予め活性化しエレクトロポレーションすることを示した。エレクトロポレーション後３日目に、ＣＤ３とＴＣＲα／β染色によってＴＣＲ表面発現を評価した。
【図17】受容体エンドサイトーシスの概要である。細胞表面受容体は、グリセリン媒介性エンドサイトーシス又はグリセリン非依存性エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、細胞内小胞に内在化された。その内腔内に表面受容体細胞外ドメインが含まれている小胞は、さらなる選別のために、アダプタータンパク質によって初期エンドソームに輸送される。表面受容体は、リサイクリングエンドソームにより、初期エンドソームから細胞表面に輸送されるか、又は多胞体内に凝集することができる。表面又は代替可能な細胞内に選別する経路は、これらの表面受容体の膜貫通ドメインと細胞内ドメインにおけるモチーフに依存している。受容体を多胞体から後期エンドソームにさらに加工し、且つ最終的にリソソームに加工し、ここで、内腔の低いｐＨ、及びリソソームプロテアーゼは、細胞表面受容体及びその関連物質の分解を引き起こす。
【図18A】ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ（ＭＬＢ０１４）と、ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ（ＭＬＢ０４６）キメラタンパク質（即ち、融合タンパク質）の概略図である。本発明者らの設計は、ＣＤ３ζ（ＭＬＢ０１４）とＣＤ３ε（ＭＬＢ０４６）の細胞外配列と膜貫通配列を、ＩＬ２Ｒβ細胞内ドメイン（即ち、ＩＬ２Ｒβ ｊｍ）の前の２７個のアミノ酸に直接融合させることに基づくものであり、これらのアミノ酸は、そのリソソーム標的化モチーフを有する。ＣＤ３ζとＣＤ３ε膜貫通ドメインを含むことにより、本発明者らの構築体は、マルチサブユニットＴＣＲ複合体に組み込まれた。
【図18B】ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２ＲβｊｍとＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍキメラタンパク質（即ち、融合タンパク質）の発現は、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるＴＣＲ下方制御を引き起こす。ＣＤ３融合タンパク質を発現するＰｉｇｇｙＢａｃベクターとＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡでＪｕｒｋａｔ細胞エレクトロポレーションして、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ（ＭＬＢ０１４）又はＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ（ＭＬＢ０４６）の発現を誘導した。エレクトロポレーション後５日目に、ＣＤ３染色によってＴＣＲ表面発現を評価した。ＴＣＲが絶対異種複合体であるため、ＣＤ３の下方制御は、全体的なＴＣＲ下方制御を示した。これらのデータにより、ＭＬＢ０１４／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体又はＭＬＢ０４６／（ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）のＴＣＲ複合体への組み込みが、複合体全体の内在化の増加を促進することが示されている。
【図18C】ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２ＲβｊｍとＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍキメラタンパク質の発現は、ドナー由来の細胞におけるＴＣＲ下方制御を引き起こす。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞と同様に、ＰｉｇｇｙＢａｃベクターとＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡで初代Ｔ細胞をエレクトロポレーションして、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ（ＭＬＢ０１４）又はＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ（ＭＬＢ０４６）の発現を誘導した。エレクトロポレーション後５日目に、ＣＤ３（上小図）とＴＣＲα／β（下小図）に対する染色によってＴＣＲ発現を評価した。これらのデータにより、初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞では同様な潜在的メカニズムが働いているが、初代Ｔ細胞ではＴＣＲ下方制御の効率が低下したことが示されている。
【図19】ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ（ＬＧ１７１）の概略図である。本発明者らの設計は、ＣＤ３ζ（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ又はＣＤ３ζ短縮化）の細胞外配列と膜貫通配列、及び膜固着Ｅ３リガーゼＧＲＡＩＬ（ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）の細胞内ドメインに基づくものである。ＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含むことにより、本発明者らの構築体は、マルチサブユニットＴＣＲ複合体に組み込むことができる。
【図20】ＬＧ１７１キメラタンパク質の発現は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御を引き起こす。ＣＤ３融合タンパク質を発現するＰｉｇｇｙＢａｃベクター（即ち、ＬＧ１７１）とＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡでＪｕｒｋａｔ細胞をエレクトロポレーションして、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ（ＬＧ１７１）の発現を誘導した。エレクトロポレーション後３日目に、ＣＤ３とＴＣＲα／β染色によってＴＣＲ表面発現を評価した。
【図21】ＬＧ１７１キメラタンパク質の発現は、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御を引き起こす。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞と同様に、ＰｉｇｇｙＢａｃベクターＬＧ１７１とＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼで初代Ｔ細胞をエレクトロポレーションして、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ（ＬＧ１７１）の発現を誘導した。エレクトロポレーション後３日目に、ＣＤ３とＴＣＲα／βに対する染色によってＴＣＲ発現を評価した。同様に、ＴＣＲ／ＣＤ３発現の下方制御は、ＧＦＰ＋部分において有意である。
【図22】ＬＧ２１２（Ｅ３リガーゼなし）は、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ発現を低下させることができない。ＰｉｇｇｙＢａｃベクターＬＧ２１２とＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼで初代Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後３日目に、ＣＤ３とＴＣＲα／βに対する染色によってＴＣＲ発現を評価した。ヒト初代Ｔ細胞にＣＤ３ζ（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）のみを用いた場合、ＴＣＲ／ＣＤ３の下方制御がないことが見られた。
【図23A-23C】ＧＲＡＩＬ細胞内ドメインにおける突然変異又はドメインスイッチは、ＬＧ１７１において、ＬＧ２１２（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）に似ているＴＣＲ下方制御を付与する。ＬＧ１７１． ＺＦ（ドメインスイッチを含む）、ＬＧ１７１． Ｈ２Ｎ２（ポイント突然変異を含む）構築体は、図２３Ａに示されている。ＦＡＣＳ（図２３Ｂ）とウエスタンブロット（図２３Ｃ）試験の両方は、ＧＲＡＩＬの機能性ジンクフィンガードメインがＬＧ１７１におけるより良いＴＣＲ／ＣＤ３下方制御に必要である（図２１）ことを示した。
【図24】ＬＧ１７１キメラタンパク質の発現は、ＣＤ５又はＣＤ７に対する非特異的下方制御を付与することができない。初代Ｔ細胞におけるＬＧ１７１の下方制御作用は、ＣＤ５とＣＤ７のいずれも影響を受けないため、ＴＣＲ／ＣＤ３に特異的である。
【図25A-25C】ＣＡＧプロモーターを有するＬＧ１７１ｐ１は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３に対する下方制御を付与する。ＬＧ１７１ｐ１融合タンパク質構築体は、図２５Ａに示されている。図２５Ａは、ＣＡＧプロモーターでＬＧ１７１におけるＥＦ１ａプロモーターを置換することによる構築体ＬＧ１７１ｐ１の産生を示し、図２５Ｂは、ＣＡＧプロモーターによる、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３に対する下方制御の付与を示した。ＬＧ１７１ｐ１融合タンパク質を発現するＰｉｇｇｙＢａｃベクターとＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡでＪｕｒｋａｔ細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後３日目に、ＣＤ３とＴＣＲα／β染色によってＴＣＲ表面発現を評価した。図２５Ｃは、ＣＡＧプロモーターによる、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３に対する持続的な下方制御の付与を示した。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞と同様に、ＰｉｇｇｙＢａｃベクターＬＧ１７１ｐ１とＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼで初代Ｔ細胞を予め活性化しエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後３、７及び１３日目に、ＣＤ３とＴＣＲα／β染色によってＴＣＲ表面発現を評価した。
【図26A-26B】ＬＧ２１３における下方制御は、主にＣＤ３ζ短縮化によって引き起こされる。ＣＨＩＰ． ΔＴＰＲを全長ＣＤ３ζ又はＣＤ３ζ． ΔＩＣに連結して新たなキメラ（ＬＧ１３２、ＬＧ２１３）を産生し、ＴＣＲ標的化に用いる（図２６Ａ）。ＬＧ１３２又はＬＧ２１３でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞におけるＴＣＲレベルのＦＡＣＳデータである。全長ＣＤ３ζを有するＬＧ１３２で影響がないことに比べて、ＬＧ２１３における下方制御は、主にＣＤ３ζ短縮化によって引き起こされる（図２６Ｂ）。
【図27A-27C】ＣＤ３ζ短縮化に基づく別のＥ３キメラ及びＴＣＲ下方制御におけるその効果である。図２７Ａは、ＣＤ３ ζ短縮化に基づく別のＥ３リガーゼ及びそのキメラ構築体の構築体設計を示した。図２７Ｂは、Ｅ３リガーゼ及びそのキメラ構築体の、ＴＣＲ下方制御におけるＦＡＣＳデータである。図２７Ｃにおいて、ウエスタンブロットデータにより、β－アクチンをマーカーとして用い、ＣＤ３ζに基づく別のＥ３キメラ構築体においてＴＣＲが有意に低下した。
【図28A-28B】ＬＧ１７１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞における活性化の低下である。図２８Ａは、ＬＧ１７１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞における活性化の低下（ＣＤ６９上方制御の弱化）を示し、図２８Ｂは、ＬＧ１７１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞における活性化の低下（ｐｐＥＲＫ上方制御の弱化）を示した。指摘された構築体でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞をαＣＤ３／ＣＤ２８で短時間刺激した。ＦＡＣＳによってＣＤ６９（図２８Ａ）とｐｐＥＲＫ（図２８Ｂ）をチエックした。
【図29A-29C】ＬＧ１７１とＬＧ１７１ｐ１でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞における活性化の低下である。指摘された構築体でトランスフェクトされたヒト初代Ｔ細胞をＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）で刺激し、ＣＤ６９上方制御とＩＦＮ－γサイトカイン分泌に用いる。ＦＡＣＳによってＣＤ６９上方制御をチエックした（図２９Ａ）。２４時間後に、上清を収集し、且つＩＦＮ－γレベルを試験した（図２９Ｂ）。ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮ－γレベルを試験する前に、モックＴ細胞（処理されていないＴ細胞）又はＬＧ１７１ｐ１トランスフェクトＴ細胞を同種異体ｍＤＣ細胞と５日間共培養した（図２９Ｃ）。図２９Ａは、ＬＧ１７１（ＣＤ６９）でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞における活性化の低下を示した。図２９Ｂは、ＬＧ１７１とＬＧ１７１ｐ１（ＩＦＮ－γ）でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞における活性化の低下を示した。図２９Ｃは、ＬＧ１７１ｐ１（ＩＦＮ－γ）でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞における活性化の低下を示した。
【発明を実施するための形態】
【0046】
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本出願が属する分野で一般に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を説明するために、以下の定義が適用され、適切な場合に、単数形で使用される用語は複数も含み、その逆も同様である。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形の「一個／種（ａ／ａｎ）」と「該（ｔｈｅ）」は、複数形も意味し、例えば、「宿主細胞」を言及する場合、複数のこのような宿主細胞を含む。
【0047】
本明細書で使用されるように、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体」（ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とも呼ばれる）は、Ｔ細胞表面の多量体複合体であり、その活性化がＴ細胞の活性化を引き起こす。該複合体は、（ｉ） ＴＣＲ、及び （ｉｉ） ＣＤ３ Ｔ細胞共受容体を含む。以下に示すように、ＴＣＲは、α鎖とβ鎖とを含む。ＣＤ３ Ｔ細胞共受容体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、二本のＣＤ３ε鎖及び二本のζ鎖を補助分子として含む。
【0048】
ＴＣＲは、Ｔ細胞の抗原特異的活性化を可能にする。各Ｔ細胞は、いずれもクローン性ＴＣＲを発現し、これらのクローン性ＴＣＲは、Ｔ細胞と抗原提示細胞ＡＰＣ（ＭＨＣクラスＩＩを介する）又は任意の他の細胞タイプ（ＭＨＣクラスＩを介する）とが物理的に接触する中に特異性ペプチド／ＭＨＣ複合体を認識する。ＴＣＲは、ジスルフィド結合によって連結された膜固着ホモ二量体タンパク質であり、通常、高可変αとβ鎖で構成される。ＴＣＲの各本の鎖は、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域の二つの細胞外ドメインを含み、両方はいずれも反平行βシートを形成する免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインである。定常領域は、細胞膜の近位端に位置し、その後に膜貫通領域と短い細胞質尾部が続くが、可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。ＴＣＲ α鎖とＴＣＲ β鎖の可変ドメインは、それぞれ三つの超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、これは、特定のペプチド／ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲの特異性に寄与する。β鎖の可変領域は、通常抗原に接触しない別の超可変領域（ＨＶ４）をさらに有する。
【0049】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は十から約２５個のアミノ酸の短鎖リンカーペプチドで接続された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）との融合タンパク質である。該リンカーは、通常、グリシン（柔軟性に対する）、及びセリン又はトレオニン（溶解性に対する）に富むものであるとともに、ＶＨのＮ－末端とＶＬのＣ－末端を接続することができ、又はその逆も可能である。定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、該タンパク質は、元の抗体の特異性を依然として保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ， Ｊ．Ｓ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ［酵素的方法］ ２０３ （１９９１） ４６－９６に記述されている。また、抗体断片は、単鎖ポリペプチドを含み、これらの単鎖ポリペプチドは、ＶＨドメインの特徴を有し、即ち、ＶＬドメインと共に機能性抗原結合部位にアセンブルすることができ、又は、これらの単鎖ポリペプチドは、ＶＬドメインの特徴を有し、即ち、ＶＨドメインと共に機能性抗原結合部位にアセンブルすることによって、全長抗体の抗原結合特性を提供することができる。
【0050】
本明細書で使用されるように、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的変異体、例えば、処置すること「ｔｒｅａｔ」又は「ｔｒｅａｔｉｎｇ」）などの）は、処置される個体の自然経過を変更しようとする試みにおける臨床介入を指し、予防のために実施することもでき、臨床病態の経過中に実施することもできる。処置の所望の効果は、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の、任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮減、転移の予防、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解または予後の改善を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、本出願の分子は、疾患の発展を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせることに用いられる。
【0051】
本明細書で使用されるように、「癌」又は「腫瘍」という用語は、増殖性疾患を指し、例えば、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、リンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、気管支肺胞上皮癌、骨癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域癌、胃部癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外膣癌、ホジキン、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌又は尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髓芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、上記癌のうちのいずれか一つを含む難治性型式、又は上記癌のうちの一つ又は複数の組み合わせである。
【0052】
様々な実施形態を説明する前に、理解すべきこととして、本開示の教示は、説明された特定の実施形態に限定されるものではなく、そのようなものとして、当然、変化し得る。さらに理解すべきこととして、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のものであり、本教示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではない。
【0053】
本出願は、特定の有利な特徴（例えば、宿主細胞に発現される場合に、膜結合タンパク質（ＭＢＰ）レベルを低下させる）を有する新規な融合タンパク質を提供する。
【0054】
本出願では、膜結合タンパク質（ＭＢＰ）の下方制御は、分解タグタンパク質により媒介された分解によって実現され、ここで、該分解タグタンパク質は、分解を媒介する細胞表面受容体のユビキチンリガーゼ及び／又はドメイン（例えば、ＩＬ２Ｒβサブドメイン）を含む。分解タグタンパク質（例えば、ユビキチンリガーゼ又はＩＬ２Ｒβ）による分解対象のＭＢＰのタグ特異性又は標的化特異性（又は認識特異性）は、分解対象のＭＢＰの抗体（又はその抗原結合断片）によって媒介され（即ち、抗体により媒介された基質認識であり）、又は膜貫通ドメインを有する分解対象の膜結合タンパク質又は複合体のサブユニット又はドメインによって媒介される（即ち、膜貫通ドメインにより媒介された基質認識である）。本出願の技術案は、細胞のタイプに関係なく、細胞表面上の任意の標的に用いることができる。好ましくは、分解対象のＭＢＰは、膜結合受容体又は受容体複合体であってもよく、さらに好ましくは、膜結合受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であってもよい。そのため、好ましくは、本出願は、受容体ＴＡＣ（受容体を標的化するキメラ）標的化ユビキチンにより媒介される分解によってＴＣＲを下方制御して、同種異体キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を産生することに関するか、又は融合タンパク質（例えば、分解タグタンパク質と融合する膜貫通ドメイン（例えば、分解を媒介するＥ３ユビキチンリガーゼ及び／又は細胞表面受容体のドメイン）を有する分解対象膜結合タンパク質成分を含む融合タンパク質又はその断片）の産生に関し、分解タグタンパク質は、ＴＣＲ複合体形成プロセスにおいて、マルチサブユニットＴＣＲ複合体に組み込んで、ＴＣＲ複合体の下方制御を引き起こすことができる。特に、抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）又はその抗原結合断片を、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｈｓｃ７０と相互作用するタンパク質のＣ末端（ＣＨＩＰ））と細胞外で融合させ、その後に、分解を媒介する膜貫通ドメイン、又はＥ３ユビキチンリガーゼ又は細胞表面受容体を、膜貫通ドメインを有する、分解対象膜結合タンパク質もしくは複合体の成分又はその断片に細胞内で融合させる。宿主細胞（例えば、初代Ｔ細胞）に発現される場合、ＭＢＰ（例えば、ＴＣＲ複合体）は、有意に下方制御される。これは、タンパク質分解に基づく新しいＭＢＰ下方制御技術である。この技術は、治療用途又は研究目的のために、任意のＭＢＰ、特に表面受容体に用いることができる。
【0055】
（１） 本出願の融合タンパク質
１． 融合タンパク質ａ）：
本出願は、以下を含む融合タンパク質ａ）を開示し、第１のコネキシン、分解タグタンパク質、第１の膜貫通ドメイン。
１． 融合タンパク質ａ）：
本出願は、以下を含む融合タンパク質ａ）を開示し、第１のコネキシン、分解タグタンパク質、第１の膜貫通ドメイン。
【0056】
いくつかの実施例において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のコネキシンと、分解タグタンパク質と、第１の膜貫通ドメインとを含む。
【0057】
いくつかの実施例において、第１のコネキシンは、分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７の抗体もしくは抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、又はＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ５の抗原結合断片は、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ７の抗原結合断片は、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖを含み、ＰＤ－Ｌ１の抗原結合断片は、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ４７の抗原結合断片は、αＣＤ４７ ｓｃＦｖを含む。
【0058】
いくつかの実施例において、分解タグタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを含み、さらに好ましくは、該Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８を含み、
いくつかの実施例において、第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施例において、第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。
【0059】
いくつかの実施例において、融合タンパク質ａ） は、第１のシグナルペプチドをさらに含む。
【0060】
任意選択的に、ｓｃＦｖとＥ３リガーゼとの間のリンカー（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９１）であってもよい。
【0061】
任意選択的に、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＣＤ８ ＴＭ）とＥ３リガーゼとの間のリンカー（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９１）であってもよい。
【0062】
２． 融合タンパク質ｂ）：
本出願は、以下を含む融合タンパク質ｂ）を開示し、第１のコネキシン、第１の膜貫通ドメイン、分解タグタンパク質。
本出願は、以下を含む融合タンパク質ｂ）を開示し、第１のコネキシン、第１の膜貫通ドメイン、分解タグタンパク質。
【0063】
いくつかの実施例において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のコネキシンと、第１の膜貫通ドメインと、分解タグタンパク質とを含む。
【0064】
いくつかの実施例において、第１のコネキシンは、分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、該分解対象のＭＢＰの抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ３の抗体又は抗原結合断片を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３の抗原結合断片は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖを含み、
いくつかの実施例において、分解タグタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを含み、さらに好ましくは、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＧＲＡＩＬ．ＩＣを含み、
いくつかの実施例において、第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン変異体、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインのうちの一つ又は複数から選択される。
いくつかの実施例において、分解タグタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを含み、さらに好ましくは、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＧＲＡＩＬ．ＩＣを含み、
いくつかの実施例において、第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン変異体、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインのうちの一つ又は複数から選択される。
【0065】
いくつかの実施例において、融合タンパク質ｂ） は、第１のシグナルペプチドをさらに含む。
【0066】
任意選択的に、融合タンパク質ｂ）（例えば、ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１、ＬＧ２２２．２）のＴＭドメインのＣ末端に結合する細胞内ドメイン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９０）であってもよい。
【0067】
３． 融合タンパク質ｃ）：
本出願は、以下を含む融合タンパク質ｃ）を開示し、上記２） における第２の膜貫通連結ドメイン、分解を媒介する細胞表面受容体。
本出願は、以下を含む融合タンパク質ｃ）を開示し、上記２） における第２の膜貫通連結ドメイン、分解を媒介する細胞表面受容体。
【0068】
いくつかの実施例において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、上記２） における第２の膜貫通連結ドメインと、分解を媒介する細胞表面受容体とを含む。
【0069】
いくつかの実施例において、上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ又はＣＤ３ε．ΔＩＣを含み、
いくつかの実施例において、分解を媒介する細胞表面受容体は、ＩＬ２Ｒβｊｍを含む。
いくつかの実施例において、分解を媒介する細胞表面受容体は、ＩＬ２Ｒβｊｍを含む。
【0070】
４． 融合タンパク質ｄ）：
本出願は、以下を含む融合タンパク質ｄ）を開示し、上記２） における第２の膜貫通連結ドメイン、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数。
本出願は、以下を含む融合タンパク質ｄ）を開示し、上記２） における第２の膜貫通連結ドメイン、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数。
【0071】
いくつかの実施例において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、上記２） における第２の膜貫通連結ドメイン、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数を含む。
【0072】
いくつかの実施例において、上記２） における第２の膜貫通連結ドメインは、ＣＤ３ζ．ΔＩＣを含む。
【0073】
いくつかの実施例において、Ｅ３ユビキチンリガーゼ又はその変異体のうちの一つ又は複数は、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ、ＲＮＦ１５２． ｒＩＣを含む。
【0074】
５． 融合タンパク質に使用される配列
いくつかの実施例において、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ又はαＣＤ４７ ｓｃＦｖはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２－１３のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ、Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ、Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１ ｓｃＦｖ、ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ又はαＣＤ４７ ｓｃＦｖはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２－１３のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0075】
いくつかの実施例において、ＣＨＩＰ、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＦＢＷ７．２－２９３、ＶＨＬ．１５２－２１３、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ＳＯＣＳ２．１４３－１９８、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２． ｒＩＣはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２１－２６、６２、７９、８１又は８３のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0076】
いくつかの実施例において、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン変異体、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、又はＣＤ４膜貫通ドメインはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ８９、１８又は１５に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0077】
いくつかの実施例において、融合タンパク質ａ） は、第１のシグナルペプチドをさらに含み、好ましくは、第１のシグナルペプチドはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １９又は２０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される。
【0078】
いくつかの実施例において、融合タンパク質ｂ） は、第１のシグナルペプチドをさらに含み、好ましくは、第１のシグナルペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １９に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される。
【0079】
いくつかの実施例において、ＣＤ３ζ．ΔＩＣとＣＤ３ε．ΔＩＣはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６１、６４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに好ましくは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの膜貫通ドメイン（ＴＭ）はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６７、７０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの細胞外ドメイン（ＥＭ）はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６６、６９に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、ＣＤ３ζ又はＣＤ３εの第２のシグナルペプチドはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ６５、６８に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0080】
いくつかの実施例において、Ｌ２Ｒβ ｊｍドメイン（ＩＬ２Ｒβｊｍ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５８に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0081】
非限定的な例において、本出願の融合タンパク質は、ヒンジ又はＰ２Ａ－ＧＦＰのうちの一つ又は複数をさらに含む。
【0082】
いくつかの実施例において、ヒンジは、ＣＤ８αヒンジ、又はＣＤ４ヒンジから選択され、さらに好ましくは、ＣＤ８αヒンジ又はＣＤ４ヒンジはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １６又は１４に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、ヒンジは、第１の膜貫通ドメインのＮ末端に隣接している。
【0083】
いくつかの実施例において、Ｐ２Ａ－ＧＦＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５７に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、Ｐ２Ａ－ＧＦＰ配列は、融合タンパク質のＣ末端に位置する。
【0084】
６． 第１の膜貫通連結ドメインは、第１の膜貫通ドメインと第１のコネキシンとを含む
第１のコネキシン：膜結合タンパク質の抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）
膜結合タンパク質の抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、分解タグタンパク質と膜結合タンパク質との結合（又は特異的結合、特異的認識）を媒介するコネキシン（即ち、抗体媒介の基質認識）として用いることができる。
第１のコネキシン：膜結合タンパク質の抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）
膜結合タンパク質の抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、分解タグタンパク質と膜結合タンパク質との結合（又は特異的結合、特異的認識）を媒介するコネキシン（即ち、抗体媒介の基質認識）として用いることができる。
【0085】
単鎖可変断片
本出願のｓｃＦｖは、膜結合タンパク質（ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７を含むが、これらに限定されない）と特異的に結合するものであり、好ましくは、それらの膜結合タンパク質の細胞外部分と結合する。好ましくは、ｓｃＦｖは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の成分（又はサブユニット）と特異的に結合するものである。
本出願のｓｃＦｖは、膜結合タンパク質（ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７を含むが、これらに限定されない）と特異的に結合するものであり、好ましくは、それらの膜結合タンパク質の細胞外部分と結合する。好ましくは、ｓｃＦｖは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の成分（又はサブユニット）と特異的に結合するものである。
【0086】
そのため、いくつかの実施例において、ｓｃＦｖは、ＣＤ３と特異的に結合し、例えば、ＣＤ３は、哺乳動物に由来するＣＤ３であり、好ましくは、ヒトＣＤ３である。
【0087】
第１の膜貫通ドメイン：
第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＩＬ２Ｒ又はその変異体の一つ又は複数サブユニットもしくはドメインの膜貫通ドメインから選択される。
第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＩＬ２Ｒ又はその変異体の一つ又は複数サブユニットもしくはドメインの膜貫通ドメインから選択される。
【0088】
７． 第２の膜貫通連結ドメインは、分解対象のＭＢＰ又はその変異体の膜貫通ドメインを含む
分解対象のＭＢＰ又はその変異体（コネキシン２）の膜貫通ドメイン
いくつかの実施例において、膜貫通ドメインを有する分解対象膜結合タンパク質又はその変異体の一つ又は複数サブユニット又はドメイン（又は断片）は、分解タグタンパク質の膜結合タンパク質への組み込みを媒介する（又は組み込みによる特異的認識）、例えば、膜結合タンパク質形成中の分解タグタンパク質の膜結合タンパク質への組み込みを媒介する（即ち、膜貫通ドメインにより媒介される基質認識）ためのコネキシンとして用いることができる。
分解対象のＭＢＰ又はその変異体（コネキシン２）の膜貫通ドメイン
いくつかの実施例において、膜貫通ドメインを有する分解対象膜結合タンパク質又はその変異体の一つ又は複数サブユニット又はドメイン（又は断片）は、分解タグタンパク質の膜結合タンパク質への組み込みを媒介する（又は組み込みによる特異的認識）、例えば、膜結合タンパク質形成中の分解タグタンパク質の膜結合タンパク質への組み込みを媒介する（即ち、膜貫通ドメインにより媒介される基質認識）ためのコネキシンとして用いることができる。
【0089】
いくつかの実施例において、分解対象膜結合タンパク質は、膜結合受容体である。
【0090】
いくつかの実施例において、膜結合受容体は、ＣＤ３であり、好ましくは、哺乳動物に由来するＣＤ３であり、さらに好ましくは、ヒトＣＤ３である。
【0091】
いくつかの実施例において、コネキシン２は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の膜貫通ドメインを含む。
【0092】
いくつかの実施例において、コネキシン２は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体のうちの一つ又は複数の細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含む。
【0093】
いくつかの実施例において、コネキシン２は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３α、ＣＤ３β又はその変異体における一つ又は複数の第２のシグナルペプチド、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。
【0094】
８． 分解タグタンパク質１：Ｅ３ユビキチンリガーゼ
「Ｅ３ユビキチンリガーゼ」又は「Ｅ３リガーゼ」又は「ユビキチンリガーゼ」（ＵＬ）は、本明細書では、本出願に基づく二官能化合物におけるユビキチンリガーゼ部分の一つ又は複数の標的酵素結合部位を説明するためのものである。Ｅ３ ＵＬは、Ｅ２ユビキチン結合酵素と組み合わせてユビキチンを標的タンパク質におけるリジンに結合させるタンパク質であり、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、プロテアソームによって分解される特定のタンパク質基質を標的化する。そのため、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、単独で、又はＥ２ユビキチン結合酵素と複合して、ユビキチンを標的タンパク質に転移させる。一般的には、ユビキチンリガーゼは、第２のユビキチンが第１のユビキチンに結合し、第３のユビキチンが第２のユビキチンに結合するなどのように、ポリユビキチン化に関与する。ポリユビキチン化は、タンパク質を標識してプロテアソームによって分解する。しかしながら、モノユビキチン化に限定されるいくつかのユビキチン化イベントが存在し、ここで、ユビキチンリガーゼは、単一のユビキチンのみを基質分子に添加する。モノユビキチン化タンパク質は、プロテアソームの標的化によって分解するものではなく、例えば、ユビキチンに結合できるドメインを有する他のタンパク質に結合することによって、その細胞位置又は機能を代替可能に変更することができる。より複雑なこととして、ユビキチンにおける異なるリジンは、Ｅ３により標的化されて鎖を形成することができる。最も一般的なリジンは、ユビキチン鎖におけるＬｙｓ４８である。これは、ポリユビキチンを製造するためのリジンであり、プロテアソームにより認識される。
「Ｅ３ユビキチンリガーゼ」又は「Ｅ３リガーゼ」又は「ユビキチンリガーゼ」（ＵＬ）は、本明細書では、本出願に基づく二官能化合物におけるユビキチンリガーゼ部分の一つ又は複数の標的酵素結合部位を説明するためのものである。Ｅ３ ＵＬは、Ｅ２ユビキチン結合酵素と組み合わせてユビキチンを標的タンパク質におけるリジンに結合させるタンパク質であり、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、プロテアソームによって分解される特定のタンパク質基質を標的化する。そのため、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、単独で、又はＥ２ユビキチン結合酵素と複合して、ユビキチンを標的タンパク質に転移させる。一般的には、ユビキチンリガーゼは、第２のユビキチンが第１のユビキチンに結合し、第３のユビキチンが第２のユビキチンに結合するなどのように、ポリユビキチン化に関与する。ポリユビキチン化は、タンパク質を標識してプロテアソームによって分解する。しかしながら、モノユビキチン化に限定されるいくつかのユビキチン化イベントが存在し、ここで、ユビキチンリガーゼは、単一のユビキチンのみを基質分子に添加する。モノユビキチン化タンパク質は、プロテアソームの標的化によって分解するものではなく、例えば、ユビキチンに結合できるドメインを有する他のタンパク質に結合することによって、その細胞位置又は機能を代替可能に変更することができる。より複雑なこととして、ユビキチンにおける異なるリジンは、Ｅ３により標的化されて鎖を形成することができる。最も一般的なリジンは、ユビキチン鎖におけるＬｙｓ４８である。これは、ポリユビキチンを製造するためのリジンであり、プロテアソームにより認識される。
【0095】
いくつかの実施例において、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、以下のタンパク質又はその短縮化型から選択され、ＧＲＡＩＬ、Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質（ＣＨＩＰ）のＣ末端、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ、ＦボックスＷＤ４０含有タンパク質７（ＦＢＷ７）、ＦＢＷ７．２－２９３、ヒッペル－リンドウ（ＶＨＬ）、ＶＨＬ．１５２－２１３、スポット型ＢＴＢ－ＰＯＺタンパク質（ＳＰＯＰ）、ＳＰＯＰ．１６７－３７４、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）、マウス二重微小染色体２ホモログ（ＭＤＭ２）、後期促進複合体（ＡＰＣ）、ＵＢＲ５、ＬＮＸ、カシタスＢ系統リンパ腫形質転換配列様タンパク質１（ＣＢＬＬ１）、ＨＥＣＴドメイン及びアンキリン反復配列含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＡＣＥ１）、ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＥＣＷ１）、ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ２（ＨＥＣＷ２）、ＨＥＣＴ及びＲＬＤドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＥＲＣ１）、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＣ５、ＨＥＲＣ６、ＨＵＷＥ１、ＩＴＣＨ、神経前駆細胞発現の発育下方制御タンパク質４（ＮＥＤＤ４）、神経前駆細胞発現発生的下方制御遺伝子４様タンパク質（ＮＥＤＤ４Ｌ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（サイクロフィリン）様２（ＰＰＩＬ２）、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳ４、ＲＡＮＢＰ２、ＲＮＦ４、ＲＢＸ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＴＵＢ１、ＴＯＰＯＲＳ、ＴＲＩＰ１２、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ３Ｄ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ５、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、Ｐａｒｋｉｎ、ＭＫＲＮ１、ＧＲＡＩＬ．ＩＣ、ＲＮＦ１３３．ＩＣ、ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ又はＲＮＦ１５２． ｒＩＣ。
【0096】
本出願において、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、分解タグタンパク質として用いられ、且つＥ３ユビキチンリガーゼにより媒介されるＭＢＰ分解も、細胞外及び／又は細胞内で実現することができる。
【0097】
分解タグタンパク質２：分解を媒介する細胞表面受容体の一つ又は複数のサブユニット又はドメイン
分解を媒介する細胞表面受容体の一つ又は複数のサブユニット又はドメイン（即ち、分解タグタンパク質）は、ＭＢＰ又はその成分の分解（又はエンドサイトーシスと分解、エンドサイトーシス後の分解）を媒介するタンパク質であってもよく、且つ例えば、細胞表面受容体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインにより媒介されるＭＢＰ又はその成分の分解は、細胞内において、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、リソソーム又は他の分解経路によって実現することができ、且つＭＢＰ又はその成分のエンドサイトーシスの後に実現され得る。
分解を媒介する細胞表面受容体の一つ又は複数のサブユニット又はドメイン（即ち、分解タグタンパク質）は、ＭＢＰ又はその成分の分解（又はエンドサイトーシスと分解、エンドサイトーシス後の分解）を媒介するタンパク質であってもよく、且つ例えば、細胞表面受容体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインにより媒介されるＭＢＰ又はその成分の分解は、細胞内において、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、リソソーム又は他の分解経路によって実現することができ、且つＭＢＰ又はその成分のエンドサイトーシスの後に実現され得る。
【0098】
膜結合タンパク質（ＭＢＰ）の形成中に、ＭＢＰを形成するためのＭＢＰの成分との融合によって、分解を媒介する細胞表面受容体の一つ又は複数のサブユニット又はドメインを、ＭＢＰ又はその成分に特異的に組み込む。また、ＭＢＰを形成するためのＭＢＰの成分は、ＭＢＰの一つ又は複数のドメインであってもよく、任意選択的に、ＣＤ３ε又はＣＤ３ζの一つ又は複数のドメインである。
【0099】
細胞表面受容体はＭＢＰに属してもよいが、分解を媒介する細胞表面受容体は、通常、分解対象のＭＢＰとは異なる。
【0100】
いくつかの実施例において、分解を媒介し且つ本出願の分解タグタンパク質として用いられる細胞表面受容体は、インターロイキン受容体、又はそれから派生した変異体を含む。
【0101】
いくつかの実施例において、インターロイキン受容体のサブユニット又はドメインは、ＩＬ－２Ｒのリソソーム標的化モチーフを含み、好ましくは、ＩＬ－２Ｒのリソソーム標的化モチーフは、Ｌ２Ｒβ ｊｍドメインを含む。
【0102】
９． 膜貫通ドメイン
「膜貫通ドメイン」は、質膜を貫通する、約１５個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を含む。さらに好ましくは、膜貫通ドメインは、約少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、又は４５個のアミノ酸残基を含み、且つ質膜を貫通する。膜貫通ドメインは、疎水性残基に富むものであり、且つ通常、α螺旋構造を有する。好ましい実施例では、膜貫通ドメインの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上のアミノ酸は疎水性であり、例えば、ロイシン、イソロイシン、チロシン又はトリプトファンである。膜貫通ドメインは、例えば、Ｚａｇｏｔｔａ， Ｗ． Ｎ．ら （１９９６） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ［神経科学年鑑］ １９： ２３５－２６３に記述されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
「膜貫通ドメイン」は、質膜を貫通する、約１５個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を含む。さらに好ましくは、膜貫通ドメインは、約少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、又は４５個のアミノ酸残基を含み、且つ質膜を貫通する。膜貫通ドメインは、疎水性残基に富むものであり、且つ通常、α螺旋構造を有する。好ましい実施例では、膜貫通ドメインの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上のアミノ酸は疎水性であり、例えば、ロイシン、イソロイシン、チロシン又はトリプトファンである。膜貫通ドメインは、例えば、Ｚａｇｏｔｔａ， Ｗ． Ｎ．ら （１９９６） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ［神経科学年鑑］ １９： ２３５－２６３に記述されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0103】
融合タンパク質における膜貫通ドメインの機能は、前記融合タンパク質を細胞表面に固着することであり、且つそのため、該機能を実現する任意の膜貫通ドメインは、いずれも本出願に用いることができる。
【0104】
本出願に適用可能な膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はＩＬ２Ｒ膜貫通ドメイン、即ち、上記６における第１の膜貫通ドメインから選択され得る。
【0105】
本出願に適用可能な膜貫通ドメインは、コネキシン自身のドメインの膜貫通ドメイン、即ち、上記７における膜貫通ドメインであってもよい。
【0106】
（２） 融合タンパク質、ＣＡＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、及び前記核酸又はベクターを含む組成物
本出願は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。融合タンパク質をコードする核酸は、一般的な方法によって、特定の融合タンパク質のアミノ酸配列から容易に製造することができる。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、前述のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ又はＧｅｎＢａｎｋの登録番号から得られてもよく、各ドメインのアミノ酸配列に用いられ、且つ本開示の核酸は、標準的な分子生物学及び／又は化学的なプロセスを用いて製造することができる。例えば、ヌクレオチド配列に基づいて核酸を合成することができ、且つ本開示の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーから得られたＤＮＡ断片を組み合わせることによって製造することができる。
本出願は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。融合タンパク質をコードする核酸は、一般的な方法によって、特定の融合タンパク質のアミノ酸配列から容易に製造することができる。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、前述のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ又はＧｅｎＢａｎｋの登録番号から得られてもよく、各ドメインのアミノ酸配列に用いられ、且つ本開示の核酸は、標準的な分子生物学及び／又は化学的なプロセスを用いて製造することができる。例えば、ヌクレオチド配列に基づいて核酸を合成することができ、且つ本開示の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーから得られたＤＮＡ断片を組み合わせることによって製造することができる。
【0107】
本開示の核酸は、適切なプロモーターの制御下で発現されるように別の核酸に連結され得る。プロモーターの例は、薬剤（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）などの作用によって、遺伝子又は機能的に連結される構築体の発現を構成的に促進するプロモーターと、遺伝子又は機能的に連結される構築体の発現を誘導するプロモーターとを含む。核酸を有効に転写するために、本開示の核酸はさらに、プロモーター又は転写開始部位と協働する他の調節エレメントと連結してもよく、例えば、エンハンサー配列、又はターミネーター配列を含む核酸である。本開示の核酸に加えて、核酸発現を確認するための標識物となり得る遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子）を組み込んでもよい。
【0108】
実施例では、核酸は、特定の宿主に発現するためのコドン最適化核酸である。
【0109】
本出願は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。用語「ベクター」、「発現ベクター」、及び「発現構築体」又は「構築体」は、同義的に使用されてもよく、且ついずれも、細胞におけるタンパク質の発現のために設計されたプラスミド、ウィルス又は他の核酸として定義される。ベクター又は構築体は、遺伝子を宿主細胞に導入するためのものであり、それによって、ベクターは、細胞におけるポリメラーゼと相互作用して、該ベクター／構築体におけるコードされたタンパク質を発現する。発現ベクター及び／又は発現構築体は、染色体の外又は染色体に組み込まれた細胞内に存在し得る。染色体に組み込まれた場合、発現ベクター又は発現構築体を含む核酸は、発現ベクター又は発現構築体となる。
【0110】
本出願は、本明細書に記載の少なくとも一つの核酸又は少なくとも一つのベクターを含む組成物をさらに提供する。
【0111】
本出願は、組成物をさらに提供し、それは、第１の核酸と第２の核酸とを含み、第１の核酸を有する第１のベクター及び第２の核酸を有する第２のベクターを含み、又は第１の核酸と第２の核酸を有するベクターを含み、ここで、
（１） 該第１の核酸は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードし、
（２） 該第２の核酸は、以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、
（ａ） 所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ） 膜貫通ドメイン、及び
（ｃ） 一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含み、好ましくは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメント。
（１） 該第１の核酸は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードし、
（２） 該第２の核酸は、以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、
（ａ） 所定の抗原に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ） 膜貫通ドメイン、及び
（ｃ） 一つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含み、好ましくは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む細胞質セグメント。
【0112】
いくつかの実施例において、所定の抗原は、腫瘍関連抗原である。
【0113】
いくつかの実施例において、腫瘍関連抗原は、ＣＥＡ、クローディン１８．２、ＧＰＣ３、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４６、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣａｍ、ＧＤ２、ＥｐｈＡ２、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＣＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＥＢＶ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ－２及びＣＤ３からなる群から選択される。
【0114】
いくつかの実施例において、腫瘍関連抗原は、ＣＥＡである。
【0115】
（３） 宿主細胞
本出願は、本明細書に記載の核酸又はベクター又は組成物を含む宿主細胞を提供する。そのため、発現する場合、本明細書に記載の融合タンパク質は、細胞療法のための宿主細胞の表面上に発現される。
本出願は、本明細書に記載の核酸又はベクター又は組成物を含む宿主細胞を提供する。そのため、発現する場合、本明細書に記載の融合タンパク質は、細胞療法のための宿主細胞の表面上に発現される。
【0116】
いくつかの実施例において、宿主細胞は、同種異体細胞である。
【0117】
いくつかの実施例において、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは、霊長類細胞であり、さらに好ましくは、ヒト細胞である。
【0118】
いくつかの実施例において、宿主細胞は、Ｔ細胞、又は初代Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は非免疫細胞から選択される。
【0119】
（４） 薬物組成物
本出願の薬物組成物は、融合タンパク質を発現する細胞、好ましくは、融合タンパク質とＣＡＲを発現する細胞を含み、本明細書に記載のように、一つ又は複数の薬学的又は生理学的に許容されるキャリア剤、希釈剤又は賦形剤と組み合わせる。このような組成物は、中性緩衝塩水、リン酸塩緩衝塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、ショ糖、デキストラン、又はマンニトールなどの炭水化合物、タンパク質、ポリペプチド又はグリシンのようなアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含んでもよい。一態様では、本出願の組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
本出願の薬物組成物は、融合タンパク質を発現する細胞、好ましくは、融合タンパク質とＣＡＲを発現する細胞を含み、本明細書に記載のように、一つ又は複数の薬学的又は生理学的に許容されるキャリア剤、希釈剤又は賦形剤と組み合わせる。このような組成物は、中性緩衝塩水、リン酸塩緩衝塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、ショ糖、デキストラン、又はマンニトールなどの炭水化合物、タンパク質、ポリペプチド又はグリシンのようなアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含んでもよい。一態様では、本出願の組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
【0120】
本出願の薬物組成物は、処置（又は予防）される疾患に適切な方式で投与され得る。投与の総量と頻度は、患者の状態及び患者の疾患のタイプと重症度などの要素によって確定されるが、適切な投与量は臨床試験によって確定され得る。
【0121】
適切な薬学的に許容される賦形剤は、当業者によく知られるものである。薬学的に許容される賦形剤の例として、リン酸塩緩衝塩水（例えば、０．０１ Ｍ リン酸塩、０．１３８ Ｍ ＮａＣｌ、０．００２７ Ｍ ＫＣＩ、ｐＨ ７．４）、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩）を含む水溶液、塩水、エチレングリコール又はエタノール溶液、及び有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩又は安息香酸塩）が挙げられる。いくつかの実施例において、湿潤剤又は乳化剤、及びｐＨ緩衝剤などのアジュバントを使用してもよい。いくつかの実施例において、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ［レミントン薬物科学］（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ． ［マク出版］， ニュージャージー州１９９１）（全ての目的のために、それは全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記述されている薬学的に許容される賦形剤を適切に使用してもよい。本出願の組成物は、非経口投与に適する既知の形態、例えば、注射又は注入に製剤化され得る。いくつかの実施例において、本出願の組成物は、製剤添加剤、例えば、懸濁剤、防腐剤、安定剤及び／又は分散剤、及び保存中に有効期間を延長する保存剤を含んでもよい。
【0122】
（５） 処置方法
本出願は、それを必要とする被験者の疾患を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の薬物組成物の有効量を該被験者に投与することを含む。
本出願は、それを必要とする被験者の疾患を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の薬物組成物の有効量を該被験者に投与することを含む。
【0123】
いくつかの実施例において、疾患は癌である。
【0124】
いくつかの実施例において、癌は、悪性血液疾患又は固形腫瘍である。
【0125】
いくつかの実施例において、癌は、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、リンパ腫、食道癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、頭頸癌、又は胆嚢癌である。
【0126】
（６） 低下した標的膜結合タンパク質レベルを有する細胞を産生する方法
本出願は、低下した標的膜結合タンパク質レベルを有する細胞を産生する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の核酸、ベクター、又は組成物を細胞に導入することを含む。
本出願は、低下した標的膜結合タンパク質レベルを有する細胞を産生する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の核酸、ベクター、又は組成物を細胞に導入することを含む。
【0127】
（７） ＧｖＨＤを低下させるか又は予防する方法
本出願は、一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞の被験者への投与に関連する、該被験者のＧｖＨＤを低下させるか又は予防する方法を提供し、該方法は、
（１） 本明細書に記載の核酸又はベクターで一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞をトランスフェクトすること、及び
（２） 該被験者にＣＡＲ Ｔ細胞を投与することを含む。
本出願は、一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞の被験者への投与に関連する、該被験者のＧｖＨＤを低下させるか又は予防する方法を提供し、該方法は、
（１） 本明細書に記載の核酸又はベクターで一つ又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞をトランスフェクトすること、及び
（２） 該被験者にＣＡＲ Ｔ細胞を投与することを含む。
【0128】
（８） 細胞群における膜結合タンパク質（ＭＢＰ）を下方制御する方法
本出願は、細胞群における膜結合タンパク質（ＭＢＰ）を下方制御する方法を提供し、該方法は、前記細胞群に本出願の宿主細胞を添加することを含み、ここで、該宿主細胞は、前記ＭＢＰに特異的に結合するｓｃＦｖを含む融合タンパク質を発現し、及び／又は該宿主細胞は、膜貫通ドメインを有するＭＢＰの成分又はその断片を含む融合タンパク質を発現する。
本出願は、細胞群における膜結合タンパク質（ＭＢＰ）を下方制御する方法を提供し、該方法は、前記細胞群に本出願の宿主細胞を添加することを含み、ここで、該宿主細胞は、前記ＭＢＰに特異的に結合するｓｃＦｖを含む融合タンパク質を発現し、及び／又は該宿主細胞は、膜貫通ドメインを有するＭＢＰの成分又はその断片を含む融合タンパク質を発現する。
【0129】
好ましくは、宿主細胞群は、Ｔ細胞群であり、好ましくは、ヒト初代Ｔ細胞群である。
【0130】
好ましくは、ＭＢＰは、ＣＤ３であり、好ましくは、ヒトＣＤ３である。
【0131】
本開示における例示的な配列
＊Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（即ち、Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）配列を含まず、＊＊イタリック体は、Ｐ２Ａ配列を示す。
【0132】
例１
Ｉ． システミックコントロール構築体
ＬＳ００８、ＳＰ－αＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ（図２）、ＣＤ１９ ＣＡＲであり、即ち、本明細書は、ＬＳ００８を陰性コントロールとして用いる。
Ｉ． システミックコントロール構築体
ＬＳ００８、ＳＰ－αＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ（図２）、ＣＤ１９ ＣＡＲであり、即ち、本明細書は、ＬＳ００８を陰性コントロールとして用いる。
【0133】
ＩＩ． 例２－３に使用される構築体
例２：
ＬＧ０８９、ＳＰ３４ ｓｃＦｖのＮ末端に連結されるＥ３リガーゼＦＢＷ７断片（２－２９３）（ＦＢＷ７－ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、
ＬＧ０９１、ＳＰ３４ ｓｃＦｖのＣ末端に連結されるＥ３リガーゼＶＨＬ断片（１５２－２１３）（ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ＶＨＬ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、
ＬＧ０９２、ＳＰ３４ ｓｃＦｖのＣ末端に連結されるＥ３リガーゼＳＰＯＰ断片（１６７－３７４）（ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ＳＰＯＰ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）；
ＬＧ０８５、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＣ末端に連結されるＥ３リガーゼＣＨＩＰ断片（１２８－３０３、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ）（ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、
例３：
ＬＧ０２１、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ０２２、膜固着されたシグナルペプチド（ＳＰ）－ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ０２３、細胞質ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ０２４、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＩＩＩ． 例４－１７に使用される構築体
例４：
ＬＧ１１２、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１３、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
例５：
ＬＧ１１４、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＦＢＷ７－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１５、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＶＨＬ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１６、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＰＯＰ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１７、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＯＣＳ２－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
例６：
ＬＧ１１８、ＳＰ－ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２３、ＳＰ－ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２４、ＳＰ－ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２５、ＳＰ－Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２６、ＳＰ－Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
例７：
ＬＧ１１９、ＳＰ－ＢＭＡ０３１． ｗｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２０、ＳＰ－ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ１３３、ＳＰ－ＢＭＡ０３１． ｗｔ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ１３４、ＳＰ－ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
例９－１０：
ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７下方制御構築体
ＬＧ１３７、ＳＰ－αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１３８、ＳＰ－αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５２、ＳＰ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５３、ＳＰ－αＣＤ４７ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
任意選択的に、ｓｃＦｖとＥ３リガーゼとの間のリンカー（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９１）であってもよい。
任意選択的に、ＣＤ８ ＴＭとＥ３リガーゼとの間のリンカー（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９１）であってもよい。
例１２：
ＬＧ２２２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－１ －ＧＲＡＩＬ． ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ２２２．１、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ２２２．２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ４ヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ． ＩＣ－Ｐ２Ａ－Ｅｇｆｐ
任意選択的に、ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１、ＬＧ２２２．２のＴＭドメインのＣ末端に結合する細胞内ドメイン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９０）であってもよい。
例１３：
ＭＬＢ０１４、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０４６、ＣＤ３ε．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
例１４：
ＬＧ１７１、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ２１２、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ１７１． ＺＦ、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＺＦ突変異体－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１７１．Ｈ２Ｎ２、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ． Ｈ２Ｎ２突変異体－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１７１ｐ１、ＣＡＧ－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
例１５：
ＬＧ１３２、ＣＤ３ζ－ＣＨＩＰ． ＤＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ２１３、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＣＨＩＰ． ＤＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＲＮＦ１３３、ＲＮＦ１３３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１７４、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１３３． ＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＲＮＦ１２２、ＲＮＦ１２２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１８０、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＲＮＦ１５２、ＲＮＦ１５２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１８３、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１５２． ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ。
例２：
ＬＧ０８９、ＳＰ３４ ｓｃＦｖのＮ末端に連結されるＥ３リガーゼＦＢＷ７断片（２－２９３）（ＦＢＷ７－ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、
ＬＧ０９１、ＳＰ３４ ｓｃＦｖのＣ末端に連結されるＥ３リガーゼＶＨＬ断片（１５２－２１３）（ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ＶＨＬ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、
ＬＧ０９２、ＳＰ３４ ｓｃＦｖのＣ末端に連結されるＥ３リガーゼＳＰＯＰ断片（１６７－３７４）（ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ＳＰＯＰ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）；
ＬＧ０８５、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＣ末端に連結されるＥ３リガーゼＣＨＩＰ断片（１２８－３０３、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ）（ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、
例３：
ＬＧ０２１、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ０２２、膜固着されたシグナルペプチド（ＳＰ）－ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ０２３、細胞質ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ０２４、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＩＩＩ． 例４－１７に使用される構築体
例４：
ＬＧ１１２、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１３、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
例５：
ＬＧ１１４、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＦＢＷ７－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１５、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＶＨＬ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１６、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＰＯＰ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１１７、ＳＰ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＳＯＣＳ２－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
例６：
ＬＧ１１８、ＳＰ－ＳＰ３４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２３、ＳＰ－ＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２４、ＳＰ－ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２５、ＳＰ－Ｌ２Ｋ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２６、ＳＰ－Ｆ６Ａ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
例７：
ＬＧ１１９、ＳＰ－ＢＭＡ０３１． ｗｔ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１２０、ＳＰ－ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ１３３、ＳＰ－ＢＭＡ０３１． ｗｔ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ１３４、ＳＰ－ＢＭＡ０３１．Ｈ６Ｌ１２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
例９－１０：
ＣＤ５、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７下方制御構築体
ＬＧ１３７、ＳＰ－αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＬＧ１３８、ＳＰ－αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５２、ＳＰ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０５３、ＳＰ－αＣＤ４７ ｓｃＦｖ－ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
任意選択的に、ｓｃＦｖとＥ３リガーゼとの間のリンカー（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９１）であってもよい。
任意選択的に、ＣＤ８ ＴＭとＥ３リガーゼとの間のリンカー（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９１）であってもよい。
例１２：
ＬＧ２２２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－１ －ＧＲＡＩＬ． ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ２２２．１、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ８αヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ２２２．２、ＳＰ－ＳＰ３４－ＣＤ４ヒンジ／ＴＭ －ＧＲＡＩＬ． ＩＣ－Ｐ２Ａ－Ｅｇｆｐ
任意選択的に、ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１、ＬＧ２２２．２のＴＭドメインのＣ末端に結合する細胞内ドメイン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９０）であってもよい。
例１３：
ＭＬＢ０１４、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
ＭＬＢ０４６、ＣＤ３ε．ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ、
例１４：
ＬＧ１７１、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ２１２、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
ＬＧ１７１． ＺＦ、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＺＦ突変異体－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１７１．Ｈ２Ｎ２、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ． Ｈ２Ｎ２突変異体－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１７１ｐ１、ＣＡＧ－ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ．ＩＣ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ
例１５：
ＬＧ１３２、ＣＤ３ζ－ＣＨＩＰ． ＤＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ２１３、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＣＨＩＰ． ＤＴＰＲ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＲＮＦ１３３、ＲＮＦ１３３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１７４、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１３３． ＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＲＮＦ１２２、ＲＮＦ１２２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１８０、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＲＮＦ１２２． ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＲＮＦ１５２、ＲＮＦ１５２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
ＬＧ１８３、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ－ＲＮＦ１５２． ｒＩＣ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ。
【0134】
例２
細胞質構築体（ＬＧ０８９、ＬＧ０９１、ＬＧ０９２、ＬＧ０８５）によるヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対する検証
ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤（ステムセル テクノロジーズ社（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、活性化された初代Ｔ細胞を収集し、且つＴＣＲ／ＣＤ３分解のための細胞質構築体（ＬＧ０８９、ＬＧ０９１、ＬＧ０９２、ＬＧ０８５構築体）の一つを発現するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）－ＰＢドナープラスミドを用いて、エレクトロポレーションを行った。二日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））の両方を染色した。ｐｍａｘＧＦＰ（ＧＦＰのみを発現するプラスミド）とＬＳ００８の両方は、いずれも初代Ｔ細胞での良好なトランスフェクト効率を示し、且つこの二つの構築体のいずれにおいてもＴＣＲα／βとＣＤ３の下方制御がない（図３Ａ）。しかしながら、ＳＰ３４ ｓｃＦｖとＯＫＴ３ ｓｃＦｖを用いて、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とＥ３リガーゼ（ＦＢＷ７（図３Ｂ）、ＶＨＬ（図３Ｃ）、ＳＰＯＰ（図３Ｄ）及びｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ（図３Ｅ）を含む）との結合を促進する場合、ＧＦＰ＋細胞には、依然として、明らかなＴＣＲ／ＣＤ３複合体の分解がなく、現在のシステムにおける潜在的な誤った標的化の影響を示した。
細胞質構築体（ＬＧ０８９、ＬＧ０９１、ＬＧ０９２、ＬＧ０８５）によるヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対する検証
ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤（ステムセル テクノロジーズ社（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、活性化された初代Ｔ細胞を収集し、且つＴＣＲ／ＣＤ３分解のための細胞質構築体（ＬＧ０８９、ＬＧ０９１、ＬＧ０９２、ＬＧ０８５構築体）の一つを発現するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）－ＰＢドナープラスミドを用いて、エレクトロポレーションを行った。二日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））の両方を染色した。ｐｍａｘＧＦＰ（ＧＦＰのみを発現するプラスミド）とＬＳ００８の両方は、いずれも初代Ｔ細胞での良好なトランスフェクト効率を示し、且つこの二つの構築体のいずれにおいてもＴＣＲα／βとＣＤ３の下方制御がない（図３Ａ）。しかしながら、ＳＰ３４ ｓｃＦｖとＯＫＴ３ ｓｃＦｖを用いて、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とＥ３リガーゼ（ＦＢＷ７（図３Ｂ）、ＶＨＬ（図３Ｃ）、ＳＰＯＰ（図３Ｄ）及びｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ（図３Ｅ）を含む）との結合を促進する場合、ＧＦＰ＋細胞には、依然として、明らかなＴＣＲ／ＣＤ３複合体の分解がなく、現在のシステムにおける潜在的な誤った標的化の影響を示した。
【0135】
例３
膜固着された構築体（ＬＧ０２１、ＬＧ０２２、ＬＧ０２３、ＬＧ０２４）によるヒト初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞株におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対する検証。
膜固着された構築体（ＬＧ０２１、ＬＧ０２２、ＬＧ０２３、ＬＧ０２４）によるヒト初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞株におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対する検証。
【0136】
ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、活性化された初代Ｔ細胞を収集し、且つＴＣＲ／ＣＤ３分解のための細胞質／膜固着構築体（ＬＧ０２１、ＬＧ０２２、ＬＧ０２３、ＬＧ０２４）の一つを発現するプラスミドを用いて、エレクトロポレーションを行った。二日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）との両方を染色した。その結果、Ｅ３リガーゼ／ユビキチンのないＳＰ３４ ｓｃＦｖの使用は、細胞質で発現（ＬＧ０２１）しても（図４Ａ）、細胞膜で発現（ＬＧ０２２）しても（図４Ｂ）、ＴＣＲ／ＣＤ３のいかなる下方制御も引き起こすことができなかった。ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ（ＬＧ０２３）の細胞質発現（図４Ｃ）は、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ（ＬＧ０２１）と似ている影響を示すが、発現が細胞膜に固着される場合（ＬＧ０２４）、ＧＦＰ＋細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の下方制御を確かに誘発した（図４Ｄ）。
【0137】
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ０２４）を発現するトランスポゾンの両方を用いてＪｕｒｋａｔ細胞をエレクトロポレーションした。Ｊｕｒｋａｔ細胞を５７日目まで維持し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）で染色した後にフローサイトメトリー試験を行い、安定に組み込まれたトランスポゾン（膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ０２４）を発現する）を有する細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の有意な分解（ＧＦＰ陽性 ＞ ８５％、図５）が示された。
【0138】
例４
Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ１１２、ＬＧ１１３）との連結によるＪｕｒｋａｔ細胞株とヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対する検証
１． Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて構築体（ＬＧ１１２、ＬＧ１１３）を検証した
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び、異なる方式でＥ３ユビキチンリガーゼに連結される、膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ１１２、ＬＧ１１３）を発現するトランスポゾンの両方でＪｕｒｋａｔ細胞をエレクトロポレーションした。３日目にＪｕｒｋａｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）で染色した後にフローサイトメトリー分析を行った。図６Ａは、システミックコントロールｐｍａｘＧＦＰとＬＳ００８がＪｕｒｋａｔ細胞において良好なトランスフェクト効率を有し、且つこの二つの構築体のいずれにおいてもＴＣＲα／βとＣＤ３の下方制御がないことを示した。図６Ｂにより、Ｅ３ユビキチンリガーゼのない膜固着ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ構築体（ＬＧ０２４）がＪｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲ－ＣＤ３複合体の有意な下方制御を示したことが示された。ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲが、細胞質方式（ＬＧ１１３）（図６Ｄ）ではなく、外膜方式（近端連結）（ＬＧ１１２）（図６Ｃ）でＯＫＴ３ ｓｃＦｖと連結する場合、より強いＴＣＲ／ＣＤ３複合体の下方制御を得た。
Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ１１２、ＬＧ１１３）との連結によるＪｕｒｋａｔ細胞株とヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対する検証
１． Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて構築体（ＬＧ１１２、ＬＧ１１３）を検証した
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び、異なる方式でＥ３ユビキチンリガーゼに連結される、膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ１１２、ＬＧ１１３）を発現するトランスポゾンの両方でＪｕｒｋａｔ細胞をエレクトロポレーションした。３日目にＪｕｒｋａｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）で染色した後にフローサイトメトリー分析を行った。図６Ａは、システミックコントロールｐｍａｘＧＦＰとＬＳ００８がＪｕｒｋａｔ細胞において良好なトランスフェクト効率を有し、且つこの二つの構築体のいずれにおいてもＴＣＲα／βとＣＤ３の下方制御がないことを示した。図６Ｂにより、Ｅ３ユビキチンリガーゼのない膜固着ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ構築体（ＬＧ０２４）がＪｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲ－ＣＤ３複合体の有意な下方制御を示したことが示された。ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲが、細胞質方式（ＬＧ１１３）（図６Ｄ）ではなく、外膜方式（近端連結）（ＬＧ１１２）（図６Ｃ）でＯＫＴ３ ｓｃＦｖと連結する場合、より強いＴＣＲ／ＣＤ３複合体の下方制御を得た。
【0139】
２． ヒト単離初代Ｔ細胞で構築体（ＬＧ１１２、ＬＧ１１３）を検証した
ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、初代Ｔ細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び異なる膜固着ＯＫＴ３構築体を発現するトランスポゾンの両方でエレクトロポレーションした。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。図７Ａは、システミックコントロールｐｍａｘＧＦＰとＬＳ００８が初代Ｔ細胞において良好なトランスフェクト効率を有し、且つこの二つの構築体のいずれにおいてもＴＣＲα／βとＣＤ３の下方制御がないことを示した。本発明者らがＪｕｒｋａｔ細胞株で発見したのと似たように、ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲが、非細胞質方式（ＬＧ１１３）（図７Ｄ）ではなく、外膜方式（近端連結）（ＬＧ１１２）（図７Ｃ）でＯＫＴ３ ｓｃＦｖと連結する場合、分解はより有意になり得る。Ｅ３ユビキチンリガーゼのない膜固着ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ構築体（ＬＧ０２４）（図７Ｂ）に比べて、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ）が構築体全体の細胞質部分（ＬＧ１１３、図７Ｄ）に位置する場合、ＴＣＲ／ＣＤ３分解に有意な変化がないことを発見した。
ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、初代Ｔ細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び異なる膜固着ＯＫＴ３構築体を発現するトランスポゾンの両方でエレクトロポレーションした。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。図７Ａは、システミックコントロールｐｍａｘＧＦＰとＬＳ００８が初代Ｔ細胞において良好なトランスフェクト効率を有し、且つこの二つの構築体のいずれにおいてもＴＣＲα／βとＣＤ３の下方制御がないことを示した。本発明者らがＪｕｒｋａｔ細胞株で発見したのと似たように、ｈＣＨＩＰ． ｄＴＰＲが、非細胞質方式（ＬＧ１１３）（図７Ｄ）ではなく、外膜方式（近端連結）（ＬＧ１１２）（図７Ｃ）でＯＫＴ３ ｓｃＦｖと連結する場合、分解はより有意になり得る。Ｅ３ユビキチンリガーゼのない膜固着ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ構築体（ＬＧ０２４）（図７Ｂ）に比べて、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ）が構築体全体の細胞質部分（ＬＧ１１３、図７Ｄ）に位置する場合、ＴＣＲ／ＣＤ３分解に有意な変化がないことを発見した。
【0140】
例５ヒト初代Ｔ細胞における異なるＥ３リガーゼと膜固着ＯＫＴ３構築体との連結によるＴＣＲ／ＣＤ３複合体下方制御への影響の検証
膜固着ＯＫＴ３ ｓｃＦｖに連結される、異なるＥ３リガーゼ（ＦＢＷ７と、ＶＨＬと、ＳＰＯＰと、ＳＯＣＳ２とを含む）を有する一連の構築体を設計し合成した（図８Ａ）。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、初代Ｔ細胞を収集し、ＴＣＲ／ＣＤ３分解のための膜固着構築体の一つを発現するプラスミドでエレクトロポレーションを行った。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。結果により、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖを用いる場合、Ｅ３リガーゼ（ＦＢＷ７（図８Ｂ）と、ＶＨＬ（図８Ｃ）と、ＳＯＣＳ２（図８Ｅ）とを含む）は、ＴＣＲ／ＣＤ３のわずかな下方制御を誘発し得ることが示された。興味深いこととして、ＳＰＯＰは、ヒト初代Ｔ細胞において、ＴＣＲ／ＣＤ３のより強い下方制御を付与することができる（図８Ｄ）。
膜固着ＯＫＴ３ ｓｃＦｖに連結される、異なるＥ３リガーゼ（ＦＢＷ７と、ＶＨＬと、ＳＰＯＰと、ＳＯＣＳ２とを含む）を有する一連の構築体を設計し合成した（図８Ａ）。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、初代Ｔ細胞を収集し、ＴＣＲ／ＣＤ３分解のための膜固着構築体の一つを発現するプラスミドでエレクトロポレーションを行った。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。結果により、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖを用いる場合、Ｅ３リガーゼ（ＦＢＷ７（図８Ｂ）と、ＶＨＬ（図８Ｃ）と、ＳＯＣＳ２（図８Ｅ）とを含む）は、ＴＣＲ／ＣＤ３のわずかな下方制御を誘発し得ることが示された。興味深いこととして、ＳＰＯＰは、ヒト初代Ｔ細胞において、ＴＣＲ／ＣＤ３のより強い下方制御を付与することができる（図８Ｄ）。
【0141】
例６異なるＣＤ３を標的化するｓｃＦｖにより媒介されるＴＣＲ／ＣＤ３分解の検証
異なるＣＤ３を標的化するｓｃＦｖ（ＳＰ３４と、ＵＣＨＴ１と、ＵＣＨＴ１と． Ｙ１７７Ｔと、Ｌ２Ｋと、Ｆ６Ａとを含む）を有する一連のＴＣＲ／ＣＤ３分解構築体を設計し合成した（図９Ａ）。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、初代Ｔ細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとトランスポゾンＤＮＡ構築体の両方でエレクトロポレーションした。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。結果により、構築体において外膜方式でＣＨＩＰ． ｄＴＰＲに直接連結することによって、ＳＰ３４ ｓｃｆｖ（図９Ｂ）とＦ６Ａ ｓｃｆｖ（図９Ｆ）がＴＣＲ／ＣＤ３の下方制御を誘発し得ることが示され、しかし、ＵＣＨＴ１ ｓｃｆｖ（図９Ｃ）、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃｆｖ（図９Ｄ）、及びＬ２Ｋ ｓｃｆｖ（図９Ｅ）は、ヒト初代Ｔ細胞において、ＴＣＲ／ＣＤ３のより強い下方制御を付与することができる（図９Ｂ－９Ｆ）。
異なるＣＤ３を標的化するｓｃＦｖ（ＳＰ３４と、ＵＣＨＴ１と、ＵＣＨＴ１と． Ｙ１７７Ｔと、Ｌ２Ｋと、Ｆ６Ａとを含む）を有する一連のＴＣＲ／ＣＤ３分解構築体を設計し合成した（図９Ａ）。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、初代Ｔ細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとトランスポゾンＤＮＡ構築体の両方でエレクトロポレーションした。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。結果により、構築体において外膜方式でＣＨＩＰ． ｄＴＰＲに直接連結することによって、ＳＰ３４ ｓｃｆｖ（図９Ｂ）とＦ６Ａ ｓｃｆｖ（図９Ｆ）がＴＣＲ／ＣＤ３の下方制御を誘発し得ることが示され、しかし、ＵＣＨＴ１ ｓｃｆｖ（図９Ｃ）、ＵＣＨＴ１．Ｙ１７７Ｔ ｓｃｆｖ（図９Ｄ）、及びＬ２Ｋ ｓｃｆｖ（図９Ｅ）は、ヒト初代Ｔ細胞において、ＴＣＲ／ＣＤ３のより強い下方制御を付与することができる（図９Ｂ－９Ｆ）。
【0142】
例７ Ｅ３リガーゼ（ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲ）は、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御を最適化するのに必要である。
【0143】
ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲが存在するか又は存在しない場合に、ＴＣＲを標的化するｓｃＦｖ（ＢＭＡ０３１又はＢＭＡ０３１． Ｈ６Ｌ１２）を有する一連のＴＣＲ分解構築体を設計し合成した（図１０Ａ）。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとトランスポゾンＤＮＡ構築体の両方でエレクトロポレーションした。三日後に、初代Ｔ細胞を収穫し、且つＣＤ３（ＰＥ）とＴＣＲα／β（ＡＰＣ）の両方を染色した。結果により、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲの存在下で、ＴＣＲを標的化するｓｃＦｖ（ＢＭＡ０３１とＢＭＡ０３１． Ｈ６Ｌ１２）の両方は、いずれも強いトランスフェクトとＴＣＲ／ＣＤ３複合体の明らかな下方制御を引き起こすことが示された（図１０Ｂ－図１０Ｃ）。しかしながら、ＣＨＩＰ． ｄＴＰＲが存在しない場合、初代Ｔ細胞は、トランスフェクト中に生存できない可能性があり、この場合に、細胞のごく一部しか目的の遺伝子の発現成功を示しない（図１０Ｄ－図１０Ｅ）。なお、ＬＧ０２４（Ｅ３リガーゼのない別のＴＣＲ／ＣＤ３下方制御構築体）は、ヒト初代Ｔ細胞において、良好なトランスフェクト（図４Ｄ）又はＴＣＲ／ＣＤ３下方制御（図７Ｂ）を実現することができなかった。そのため、Ｅ３リガーゼは、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御を最適化するのに必要であると考えられる。
【0144】
例８ Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＣＤ３／ＣＤ２８刺激によってＣＤ３下方制御は低い活性化を付与する。
【0145】
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ、及び異なる膜固着ＯＫＴ３構築体（ＬＧ０２４、ＬＧ１１２）を発現するトランスポゾン又はコントロールＬＳ００８の両方でＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞をエレクトロポレーションした。細胞を１４日間維持し、且つＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ／活性化剤再刺激前後の活性化状態をチェックした。構築体ＬＧ０２４、ＬＧ１１２の発現は、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞（即ち、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞）における組み合わせＧＦＰ発現（図１１Ａ－１１Ｂにおける右小図の縦座標）から推定された。ＣＤ６９（図１１Ａ－１１Ｂにおける右小図の横座標）は、Ｔ細胞活性化の数時間内に上方制御する活性化マーカーであり、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ６９一抗（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてＣＤ６９発現を評価した。結果により、ベースラインにおいて、全ての細胞のＣＤ６９（Ｔ細胞活性化マーカー）発現レベルが低い（図１１Ａ）ことが示された。しかしながら、ＬＳ００８によりトランスフェクトされた細胞からのＴ細胞に比べて、ＬＧ０２４又はＬＧ１１２によりトランスフェクトされたＧＦＰ＋細胞におけるＣＤ６９発現レベルは、刺激後に有意に低下した（図１１Ｂ）。この発見は、ＴＣＲ／ＣＤ３下方制御が、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２刺激によってＴ細胞活性化に対する低い応答性を付与することを示している。
【0146】
例９ ＣＤ５又はＣＤ７下方制御構築体と検証。
【0147】
一連のＣＤ５又はＣＤ７分解構築体を設計し合成した（図１２Ａ）。ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下で、ステムセル社のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ／活性化剤を用いて、ヒト単離初代Ｔ細胞をインビトロで３日間活性化した。そして、初代Ｔ細胞を収集し、且つＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡとトランスポゾンＤＮＡ構築体の両方でエレクトロポレーションした。四日後に、細胞を収穫し、且つＣＤ５（ＰＥ）とＣＤ７（ＡＰＣ）の両方の発現を染色した（図１２Ｂ－図１２Ｃ）。結果により、αＣＤ５．１４ ｓｃＦｖがＣＤ５の強い下方制御を付与したことが示された（図１２Ｂ）。ＣＤ７について、αＣＤ７．ＴＨ６９ ｓｃＦｖ（ＣＤ７を標的化するｓｃＦｖ）も、ヒト初代Ｔ細胞において、有意な下方制御影響を示した（図１２Ｃ）。
【0148】
例１０ Ｅ３ ＣＨＩＰ構築体によるＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７の下方制御
トランスポゾンにより媒介されるＥ３リガーゼ構築体の送達は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、表面分子の発現を修飾するために用いられる（図１３Ｂ）。ＥＦ１αプロモーターは、抗原特異性ＳｃＦｖ－Ｅ３リガーゼキメラ融合タンパク質の発現を駆動するために用いられる。Ｐ２Ａ配列は、Ｅ３リガーゼシステムを発現する細胞を同定し特徴付けるように、同時ＧＦＰ発現を駆動するために用いられる（図１３Ａ）。ＭＬＢ０５２又はＭＬＢ０５３を発現するＰｉｇｇｙＢａｃベクター及びＰｉｇｇｙ ＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡでＪｕｒｋａｔ細胞をエレクトロポレーションした。トランスポゾンがＪｕｒｋａｔ細胞ゲノムに安定的に組み込まれた後、エレクトロポレーション後５日目に、フローサイトメトリーによってＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７の分解を評価した。ＧＦＰ陽性細胞（即ち、Ｅ３リガーゼ構築体を発現するもの）に対するゲーティングは、ＰＤ－Ｌ１表面発現の限界下方制御を示した（即ち、図１３Ｂ右列の上小図における黒線標識領域が少しに左に向かって破線標識領域まで移動する）。標準的な細胞培養条件（５％ ＣＯ２、５ ｍＭのＨＥＰＥＳと１０％ ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ培地において）で、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＰＤ－Ｌ１を強く発現しなかった。ＭＬＢ０５３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞における同じゲーティングポリシーは、Ｅ３リガーゼ構築体を発現するそれらの細胞において、ＣＤ４７発現の強い下方制御を示した（即ち、図１３Ｂ右列の下小図における黒線標識領域が少しに左に向かって破線標識領域まで移動する）。予想されるように、親Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ４７の明るい染色を示した（破線標識領域）。
トランスポゾンにより媒介されるＥ３リガーゼ構築体の送達は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、表面分子の発現を修飾するために用いられる（図１３Ｂ）。ＥＦ１αプロモーターは、抗原特異性ＳｃＦｖ－Ｅ３リガーゼキメラ融合タンパク質の発現を駆動するために用いられる。Ｐ２Ａ配列は、Ｅ３リガーゼシステムを発現する細胞を同定し特徴付けるように、同時ＧＦＰ発現を駆動するために用いられる（図１３Ａ）。ＭＬＢ０５２又はＭＬＢ０５３を発現するＰｉｇｇｙＢａｃベクター及びＰｉｇｇｙ ＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡでＪｕｒｋａｔ細胞をエレクトロポレーションした。トランスポゾンがＪｕｒｋａｔ細胞ゲノムに安定的に組み込まれた後、エレクトロポレーション後５日目に、フローサイトメトリーによってＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７の分解を評価した。ＧＦＰ陽性細胞（即ち、Ｅ３リガーゼ構築体を発現するもの）に対するゲーティングは、ＰＤ－Ｌ１表面発現の限界下方制御を示した（即ち、図１３Ｂ右列の上小図における黒線標識領域が少しに左に向かって破線標識領域まで移動する）。標準的な細胞培養条件（５％ ＣＯ２、５ ｍＭのＨＥＰＥＳと１０％ ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ培地において）で、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＰＤ－Ｌ１を強く発現しなかった。ＭＬＢ０５３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞における同じゲーティングポリシーは、Ｅ３リガーゼ構築体を発現するそれらの細胞において、ＣＤ４７発現の強い下方制御を示した（即ち、図１３Ｂ右列の下小図における黒線標識領域が少しに左に向かって破線標識領域まで移動する）。予想されるように、親Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ４７の明るい染色を示した（破線標識領域）。
【0149】
例１１ Ｅ３ ＣＨＩＰに連結される、ＣＤ３を標的化する構築体（ＬＧ１１２）のＴＣＲ発現のパラクリン下方制御。
【0150】
Ｅ３リガーゼ構築体が抗原特異性方式で隣接する細胞上の表面分子を下方制御し得ることを証明するために、本発明者らは、形質導入によりＬＧ１１２を発現するＪｕｒｋａｔ細胞と親ストック細胞との間の共培養試験を設計した。二つの集団を区別するために、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色染料で親Ｊｕｒｋａｔ細胞を標識した。
【0151】
図１４Ａは、ゲーティングポリシーの概要を提供し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色陽性親細胞（即ち、ＬＧ０２４トランスフェクトされていないＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ＋細胞）とＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色陰性Ｅ３リガーゼによりトランスフェクトされた細胞（即ち、ＬＧ０２４トランスフェクトされたＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ-細胞）との間の説明を示した。図１４Ａ左列の上小図において、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色陰性集団（即ち、ＬＧ０２４トランスフェクトされたＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ-細胞）は、Ｅ３リガーゼ構築体を発現するＧＦＰ陽性集団（図１４Ａ中間列の右塗りつぶされた領域）と、Ｅ３リガーゼ構築体を発現しないＧＦＰ陰性集団（図１４Ａ中間列の左塗りつぶされた領域）にさらに細分化された。Ｅ３リガーゼ陽性細胞（即ち、ＧＦＰ陽性集団、７７．８％）とＥ３リガーゼ陰性細胞（即ち、ＧＦＰ陰性集団、２２．２％）との高い比で、細胞群全体を発現するＴＣＲ発現が低く、例えば、ＣＤ３染色によって確定された（即ち、図１４Ａ右列的上小図）。
【0152】
図１４Ｂは、Ｅ３リガーゼ陽性細胞のパーセントが、親Ｊｕｒｋａｔ細胞による連続的希釈により低下し、約７８％陽性から１１％陽性まで低下することにより、本発明者らがＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色陽性親細胞群におけるＴＣＲ表面発現の増加を観察したことを示した。そのため、このシステムにおいて、隣接する細胞におけるＴＣＲ発現は、集団においてＥ３リガーゼを発現する細胞の数と負の相関を示している。これらの結果により、本発明者らのＥ３リガーゼ構築体が、パラクリン方式によって、非Ｅ３リガーゼを発現する細胞における標的分子の抗原特異性下方制御を促進することが示された。注意すべきこととして、Ｅ３リガーゼを発現する細胞におけるＴＣＲ下方制御の程度は、隣接する細胞の発現プロファイルにも依存し、ここで、Ｅ３リガーゼを発現する細胞部分がより高い場合にノックダウンがより完全である。Ｅ３リガーゼ陽性細胞の数を希釈することは、該集団におけるＴＣＲ陽性細胞の増加に示すように、トランスフェクトされた細胞群におけるＣｅｌｌＴｒａｃｅ紫色陰性ＧＦＰ陰性細胞の表現型をレスキューした。
【0153】
例１２ヒンジ／膜貫通ドメイン（ＴＭ）の選択は、ＳＰ３４とＧＲＡＩＬ． ＩＣの両方により媒介されたＴＣＲ／ＣＤ３複合体の下方制御に影響を与える。
【0154】
ＣＤ３とＧＲＡＩＬ． ＩＣ（Ｅ３機能ドメイン）との間の特異的結合を増強するために、ＣＤ３を標的化するｓｃＦｖ、ＳＰ３４を用い、且つ図１５Ａに列挙されるような異なるヒンジ／膜貫通ドメインを介してＧＲＡＩＬ． ＩＣに連結した。Ｊｕｒｋａｔとヒト初代Ｔ細胞の両方において、全ての三つの構築体ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１及びＬＧ２２２．２を試験した。
【0155】
１． Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１及びＬＧ２２２．２を試験した。
【0156】
エレクトロポレーション後３日目に、Ｊｕｒｋａｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲ α／β抗体を用いて、ＴＣＲ発現を染色した。融合タンパク質構築体におけるＧＦＰ共発現に基づいて、構築体を発現する細胞を同定した。結果により、ＣＤ３ζ．ΔＩＣ（ＬＧ２２２）（図１５Ｂ）とＣＤ４ヒンジ／ＴＭ（ＬＧ２２２．２）（図１５Ｄ）の両方が、いずれもＣＤ８ａヒンジ／ＴＭ（ＬＧ２２２．１）（図１５Ｃ）により優れており、後者において、ＧＦＰ＋細胞のごく一部のみが細胞表面上のＴＣＲ／ＣＤ３下方制御を示すことが示された（図１５Ｃの左から右への三番目と四番目の小図における左上領域）。
【0157】
２． ヒト初代Ｔ細胞において、ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１及びＬＧ２２２．２を試験した。
【0158】
エレクトロポレーション後３日目に、ＬＧ２２２、ＬＧ２２２．１又はＬＧ２２２．２構築体を発現するためにエレクトロポレーションされた予め活性化初代Ｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲα／β抗体を用いて、ＴＣＲ／ＣＤ３発現を評価した（図１６Ａ－１６Ｃ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞と似ているように、ＣＤ３ζ． ΔＩＣドメインを用いた構築体は、ＴＣＲ／ＣＤ３発現の有意な下方制御を実現した（図１６Ａ、ＬＧ２２２）。ＣＤ８ａヒンジ／ＴＭドメインを用いて、ＧＦＰ＋細胞のごく一部のみにおいて、ＴＣＲ／ＣＤ３下方制御を付与した（図１６Ｂ、ＬＧ２２２．１）。しかしながら、構築体ＬＧ２２２．２の複数の重複が良好なＧＦＰ発現を実現しなかったため、ＴＣＲ／ＣＤ３下方制御についての信頼性のある結論を引き出すことができなかった（図１６Ｃ、ＬＧ２２２．２）。
【0159】
例１３ ＣＤ３－ＩＬ２Ｒβ膜近傍融合タンパク質の発現はＴＣＲ複合体表面の不安定性を促進する
ＭＬＢ０１４／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体とＭＬＢ０４６／（ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体は、図１８Ａに示されている。
ＭＬＢ０１４／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体とＭＬＢ０４６／（ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体は、図１８Ａに示されている。
【0160】
１． ＭＬＢ０１４又はＭＬＢ０４６でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞
ＭＬＢ０１４／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体又はＭＬＢ０４６／（ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体によりエレクトロポレーションした後５日目に、Ｊｕｒｋａｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３抗体（即ち、抗ＣＤ３抗体）を用いて、ＴＣＲ発現を染色した。融合タンパク質構築体におけるＧＦＰ共発現に基づいて、構築体を発現する細胞を同定した。ＧＦＰ陽性集団に対するゲーティングにより、検出可能なＴＣＲ表面発現に大きな陰性シフトが存在することが示されている（図１８Ｂの左から右への二番目と三番目の小図における左上領域）。これらのデータにより、ＭＬＢ０１４／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体又はＭＬＢ０４６／（ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）のＴＣＲ複合体への組み込みが、複合体全体の内在化の増加を促進することが示されている（図１８Ｂ）。
ＭＬＢ０１４／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体又はＭＬＢ０４６／（ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体によりエレクトロポレーションした後５日目に、Ｊｕｒｋａｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３抗体（即ち、抗ＣＤ３抗体）を用いて、ＴＣＲ発現を染色した。融合タンパク質構築体におけるＧＦＰ共発現に基づいて、構築体を発現する細胞を同定した。ＧＦＰ陽性集団に対するゲーティングにより、検出可能なＴＣＲ表面発現に大きな陰性シフトが存在することが示されている（図１８Ｂの左から右への二番目と三番目の小図における左上領域）。これらのデータにより、ＭＬＢ０１４／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体又はＭＬＢ０４６／（ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）のＴＣＲ複合体への組み込みが、複合体全体の内在化の増加を促進することが示されている（図１８Ｂ）。
【0161】
２． ＭＬＢ０１４又はＭＬＢ０４６でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞
エレクトロポレーション後５日目に、ＭＬＢ０１４／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体又はＭＬＢ０４６／（ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）を発現するためにエレクトロポレーションされた初代Ｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲα／β抗体を用いて、ＴＣＲ発現を評価した（図１８Ｃ）。ここでは、初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ発現の下方制御が、Ｊｕｒｋａｔ細胞ほど明らかではなかったが、ＧＦＰ発現とＴＣＲ又はＣＤ３発現との間に負の相関が依然として観察された（図１８Ｃの左から右への二列目と三列目の各小図における左上領域）。これらのデータにより、初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞では同様な潜在的メカニズムが働いているが、初代Ｔ細胞ではＴＣＲ下方制御の効率が低下したことが示されている。
エレクトロポレーション後５日目に、ＭＬＢ０１４／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）構築体又はＭＬＢ０４６／（ＣＤ３ε． ΔＩＣ－ＩＬ２Ｒβｊｍ）を発現するためにエレクトロポレーションされた初代Ｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲα／β抗体を用いて、ＴＣＲ発現を評価した（図１８Ｃ）。ここでは、初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ発現の下方制御が、Ｊｕｒｋａｔ細胞ほど明らかではなかったが、ＧＦＰ発現とＴＣＲ又はＣＤ３発現との間に負の相関が依然として観察された（図１８Ｃの左から右への二列目と三列目の各小図における左上領域）。これらのデータにより、初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞では同様な潜在的メカニズムが働いているが、初代Ｔ細胞ではＴＣＲ下方制御の効率が低下したことが示されている。
【0162】
例１４ ＬＧ１７１／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ／ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）融合タンパク質の発現は、Ｊｕｒｋａｔ細胞とヒト初代Ｔ細胞の両方におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体発現の下方制御を促進する
１． ＬＧ１７１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞
ＬＧ１７１／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ／ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）融合タンパク質構築体は、図１９に示されている。
１． ＬＧ１７１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞
ＬＧ１７１／（ＣＤ３ζ． ΔＩＣ／ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）融合タンパク質構築体は、図１９に示されている。
【0163】
ＬＧ１７１（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）融合タンパク質構築体によるエレクトロポレーション後３日目に、Ｊｕｒｋａｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３抗体とαＴＣＲ α／β抗体を用いて、ＴＣＲ発現を染色した。融合タンパク質構築体におけるＧＦＰ共発現に基づいて、構築体を発現する細胞を同定した。ＧＦＰ陽性集団に対するゲーティングは、多くのシフトが検出不可能なＴＣＲ表面発現であることを示している。これらのデータは、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ／ＧＲＡＩＬ． ＩＣ構築体のＴＣＲ複合体への組み込みが、複合体全体の不安定性の増加を促進することを示している（図２０）。
【0164】
２． ＬＧ１７１でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞
エレクトロポレーション後３日目に、ＬＧ１７１（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）構築体を発現するためにエレクトロポレーションされた初代Ｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲα／β抗体を用いて、ＴＣＲ／ＣＤ３発現を評価した（図２１）。同様に、ＴＣＲ／ＣＤ３発現の下方制御は、ＧＦＰ＋部分において有意である。これらのデータは、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ融合タンパク質を用いる同様な潜在的メカニズムが、初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞の両方において有効であることを示している。
エレクトロポレーション後３日目に、ＬＧ１７１（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）構築体を発現するためにエレクトロポレーションされた初代Ｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲα／β抗体を用いて、ＴＣＲ／ＣＤ３発現を評価した（図２１）。同様に、ＴＣＲ／ＣＤ３発現の下方制御は、ＧＦＰ＋部分において有意である。これらのデータは、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ融合タンパク質を用いる同様な潜在的メカニズムが、初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞の両方において有効であることを示している。
【0165】
３． ＬＧ２１２（Ｅ３リガーゼなし）
ＰｉｇｇｙＢａｃベクターＬＧ２１２とＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼで初代Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後３日目に、ＣＤ３とＴＣＲα／βに対する染色によってＴＣＲ発現を評価した。ヒト初代Ｔ細胞において短縮化されたＣＤ３ζ（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）のみを用いる場合、本発明者らは、いかなるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御も見られなかった（図２２）。
ＰｉｇｇｙＢａｃベクターＬＧ２１２とＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼで初代Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後３日目に、ＣＤ３とＴＣＲα／βに対する染色によってＴＣＲ発現を評価した。ヒト初代Ｔ細胞において短縮化されたＣＤ３ζ（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）のみを用いる場合、本発明者らは、いかなるＴＣＲ／ＣＤ３下方制御も見られなかった（図２２）。
【0166】
４． 構築体ＬＧ１７１． ＺＦ（ドメインスイッチを含む）又はＬＧ１７１． Ｈ２Ｎ２（ポイント突然変異を含む）でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞
ＣＤ８αヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ８５）を有するＧＲＡＩＬにおいて、ジンクフィンガードメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ８４）を切り替えるか、又はポイント突然変異をジンクフィンガードメインに導入することによって、二つ以上の構築体ＬＧ１７１． ＺＦ、ＬＧ１７１． Ｈ２Ｎ２を産生した（図２３Ａ）。ＦＡＣＳ（図２３Ｂ）とウエスタンブロット（図２３Ｃ）試験の両方は、ＧＲＡＩＬの機能性ジンクフィンガードメインがＬＧ１７１におけるより良いＴＣＲ／ＣＤ３下方制御に必要である（図２１）ことを示した。
ＣＤ８αヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ８５）を有するＧＲＡＩＬにおいて、ジンクフィンガードメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ８４）を切り替えるか、又はポイント突然変異をジンクフィンガードメインに導入することによって、二つ以上の構築体ＬＧ１７１． ＺＦ、ＬＧ１７１． Ｈ２Ｎ２を産生した（図２３Ａ）。ＦＡＣＳ（図２３Ｂ）とウエスタンブロット（図２３Ｃ）試験の両方は、ＧＲＡＩＬの機能性ジンクフィンガードメインがＬＧ１７１におけるより良いＴＣＲ／ＣＤ３下方制御に必要である（図２１）ことを示した。
【0167】
５． ＬＧ１７１キメラタンパク質は、ＣＤ５又はＣＤ７の非特異的下方制御を付与することができない
Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞と同様に、ＰｉｇｇｙＢａｃベクターＬＧ１７１とＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼで初代Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後３日目に、フローサイトメトリーによってＣＤ５とＣＤ７発現の両方を評価した。初代Ｔ細胞におけるＬＧ１７１の下方制御作用は、ＣＤ５とＣＤ７のいずれも影響を受けないため、ＴＣＲ／ＣＤ３に特異的である（図２４）。
Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞と同様に、ＰｉｇｇｙＢａｃベクターＬＧ１７１とＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼで初代Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後３日目に、フローサイトメトリーによってＣＤ５とＣＤ７発現の両方を評価した。初代Ｔ細胞におけるＬＧ１７１の下方制御作用は、ＣＤ５とＣＤ７のいずれも影響を受けないため、ＴＣＲ／ＣＤ３に特異的である（図２４）。
【0168】
６． ＬＧ１７１ｐ１／（ＣＡＧ／ＣＤ３ζ． ΔＩＣ／ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）でトランスフェクトされたＴ細胞
ＣＡＧプロモーターは、Ｊｕｒｋａｔ細胞とヒト初代Ｔ細胞の両方において、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対して、有意で持続的な下方制御を付与する良好な代替物である。
ＣＡＧプロモーターは、Ｊｕｒｋａｔ細胞とヒト初代Ｔ細胞の両方において、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対して、有意で持続的な下方制御を付与する良好な代替物である。
【0169】
他の例において試験したＥＦ１ａプロモーターに加えて、さらにＬＧ１７１に基づいてＣＡＧプロモーターを設計し研究した。この目的を実現するために、Ｊｕｒｋａｔとヒト初代Ｔ細胞の両方において、新たな構築体ＬＧ１７１ｐ１を設計し（図２５Ａ）試験した。
【0170】
６．１ ＬＧ１７１ｐ１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞
ＬＧ１７１ｐ１／（ＣＡＧ／ＣＤ３ζ． ΔＩＣ／ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）融合タンパク質構築体によるエレクトロポレーション後３日目に（図２５Ｂ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲ α／β抗体を用いて、ＴＣＲ発現を染色した。融合タンパク質構築体におけるＧＦＰ共発現に基づいて、構築体を発現する細胞を同定した。ＧＦＰ陽性集団に対するゲーティングは、Ｊｕｒｋａｔにおける多くのシフトが検出不可能なＴＣＲ表面発現であることを示している（図２５Ｂの左から右へ三番目と四番目の小図における左上領域）。これらのデータは、ＣＡＧプロモーターが、Ｊｕｒｋａｔにおいて、有意な遺伝子発現レベルを付与するＥＦ１ａの良好な代替物であり得ることを示している。
ＬＧ１７１ｐ１／（ＣＡＧ／ＣＤ３ζ． ΔＩＣ／ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）融合タンパク質構築体によるエレクトロポレーション後３日目に（図２５Ｂ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲ α／β抗体を用いて、ＴＣＲ発現を染色した。融合タンパク質構築体におけるＧＦＰ共発現に基づいて、構築体を発現する細胞を同定した。ＧＦＰ陽性集団に対するゲーティングは、Ｊｕｒｋａｔにおける多くのシフトが検出不可能なＴＣＲ表面発現であることを示している（図２５Ｂの左から右へ三番目と四番目の小図における左上領域）。これらのデータは、ＣＡＧプロモーターが、Ｊｕｒｋａｔにおいて、有意な遺伝子発現レベルを付与するＥＦ１ａの良好な代替物であり得ることを示している。
【0171】
６．２ ＬＧ１７１ｐ１でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞
エレクトロポレーション後３日目に、ＬＧ１７１ｐ１構築体を発現するためにエレクトロポレーションされた予め活性化初代Ｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲα／β抗体を用いて、ＴＣＲ／ＣＤ３発現を評価した（図２５Ｃ）。同様に、ＴＣＲ／ＣＤ３発現の下方制御は、ＧＦＰ＋部分において有意である（図２５Ｃの左から右への三列目と四列目の各小図における左上領域）。これらのデータは、ＬＧ１７１ｐ１融合タンパク質を用いる同様な潜在的メカニズムが、初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞の両方において有効であることを示している。さらに顕著なことに、長期フォローアップは、ＴＣＲ／ＣＤ３の下方制御が１３日目まで維持されないことを示した。（図２５Ｃ）
例１５異なるＥ３リガーゼを有するＴＣＲ／ＣＤ３分解構築体（ＧＲＡＩＬ． ＩＣ以外の異なるＥ３リガーゼを有するＣＤ３ζ． ΔＩＣ）。
エレクトロポレーション後３日目に、ＬＧ１７１ｐ１構築体を発現するためにエレクトロポレーションされた予め活性化初代Ｔ細胞を収穫し、且つαＣＤ３とαＴＣＲα／β抗体を用いて、ＴＣＲ／ＣＤ３発現を評価した（図２５Ｃ）。同様に、ＴＣＲ／ＣＤ３発現の下方制御は、ＧＦＰ＋部分において有意である（図２５Ｃの左から右への三列目と四列目の各小図における左上領域）。これらのデータは、ＬＧ１７１ｐ１融合タンパク質を用いる同様な潜在的メカニズムが、初代Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞の両方において有効であることを示している。さらに顕著なことに、長期フォローアップは、ＴＣＲ／ＣＤ３の下方制御が１３日目まで維持されないことを示した。（図２５Ｃ）
例１５異なるＥ３リガーゼを有するＴＣＲ／ＣＤ３分解構築体（ＧＲＡＩＬ． ＩＣ以外の異なるＥ３リガーゼを有するＣＤ３ζ． ΔＩＣ）。
【0172】
１． 本発明者らは、さらに、ＬＧ１７１と似ている設計で、ＴＣＲ下方制御のためのＣＨＩＰを試験した（図２６Ａ）。全長ＣＤ３ζを有するＬＧ１３２で影響がないことに比べて、ＬＧ２１３における下方制御は、主にＣＤ３ζ截断（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）によって引き起こされる（図２６Ｂ）。
【0173】
２． さらに、ＬＧ１７１と似ている設計で、他のＥ３リガーゼ（ＲＮＦ１３３と、ＲＮＦ１２２と、ＲＮＦ１５２とを含む）を試験した（図２７Ａ）。ＦＡＣＳとウエスタンブロットの両方は、一致した結果を示し、Ｅ３リガーゼ機能ドメインがＣＤ３ζ短縮化と連結した場合、ＴＣＲが下方制御された（図２７Ｂ－２７Ｃ）。
【0174】
例１６ ＬＧ１７１（ＣＤ６９、ｐｐＥＲＫ、ＩＦＮ－γ）でトランスフェクトされた細胞における活性化低下
１． 指摘された構築体でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ６９、ｐｐＥＲＫレベル
活性化の影響をチェックするために、ＣＤ３／ＣＤ２８（抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体）により、指摘された構築体でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を短時間刺激し、且つそして、ＣＤ６９上方制御と細胞内ＥＲＫリン酸化（即ち、ｐｐＥＲＫ又はＥＲＫ）レベルを試験した。二つのアッセイは、ＬＧ１７１がＣＤ６９の上方制御及びＥＲＫリン酸化を有意に弱化したことを示している（図２８Ａ－図２８Ｂ）。ＣＤ３ｚ短縮化（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）は、ＧＦＰ、ＣＤ３ζ、ＧＲＡＩＬよりも短い時間の刺激（２０ ｍｉｎ、図２８Ｂ）においてＥＲＫリン酸化を遅延することができるが（塗りつぶされた領域が左に向かって黒線標識領域まで移動する）、細胞が４時間刺激された場合、依然としてＣＤ６９上方制御を低下させることができなかった（図２８Ａ）。しかしながら、ＬＧ１７１において、ＣＤ６９、ｐｐＥＲＫの上方制御は両方とも有意に遅延され／抑制され、ＣＤ３ζ短縮化（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）とＧＲＡＩＬとの間の相乗効果を示した。
１． 指摘された構築体でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ６９、ｐｐＥＲＫレベル
活性化の影響をチェックするために、ＣＤ３／ＣＤ２８（抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体）により、指摘された構築体でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を短時間刺激し、且つそして、ＣＤ６９上方制御と細胞内ＥＲＫリン酸化（即ち、ｐｐＥＲＫ又はＥＲＫ）レベルを試験した。二つのアッセイは、ＬＧ１７１がＣＤ６９の上方制御及びＥＲＫリン酸化を有意に弱化したことを示している（図２８Ａ－図２８Ｂ）。ＣＤ３ｚ短縮化（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）は、ＧＦＰ、ＣＤ３ζ、ＧＲＡＩＬよりも短い時間の刺激（２０ ｍｉｎ、図２８Ｂ）においてＥＲＫリン酸化を遅延することができるが（塗りつぶされた領域が左に向かって黒線標識領域まで移動する）、細胞が４時間刺激された場合、依然としてＣＤ６９上方制御を低下させることができなかった（図２８Ａ）。しかしながら、ＬＧ１７１において、ＣＤ６９、ｐｐＥＲＫの上方制御は両方とも有意に遅延され／抑制され、ＣＤ３ζ短縮化（即ち、ＣＤ３ζ． ΔＩＣ）とＧＲＡＩＬとの間の相乗効果を示した。
【0175】
２． 指摘された構築体でトランスフェクトされた初代Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γレベル
本発明者らは、ヒト初代Ｔ細胞活性化への影響をさらに試験した。予め活性化された初代Ｔ細胞を指摘された構築体でトランスフェクトした。数日後、ＣＤ６９上方制御とＩＦＮ－γサイトカイン分泌のために、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）でＴ細胞を再刺激した。本発明者らがＪｕｒｋａｔ細胞株で発見したのと似たように、ＬＧ１７１又はＬＧ１７１ｐ１（ＣＡＧプロモーター）でトランスフェクトされたヒト初代Ｔ細胞は、有意に低いＣＤ６９上方制御（図２９Ａ）とＩＦＮ－γ分泌（図２９Ｂ）を示した。より強いＴＣＲ架橋化学物質ＰＨＡ－Ｌ（図２９Ｂ）を用いる場合、ＧＦＰコントロールに比べて、ＬＧ１７１とＬＧ１７１ｐ１も低いＩＦＮ－γ分泌を付与し、これは、同種異体Ｔ細胞注入中に潜在的ＧｖＨＤ応答を回避する、より安全なポリシーを示した。
本発明者らは、ヒト初代Ｔ細胞活性化への影響をさらに試験した。予め活性化された初代Ｔ細胞を指摘された構築体でトランスフェクトした。数日後、ＣＤ６９上方制御とＩＦＮ－γサイトカイン分泌のために、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）でＴ細胞を再刺激した。本発明者らがＪｕｒｋａｔ細胞株で発見したのと似たように、ＬＧ１７１又はＬＧ１７１ｐ１（ＣＡＧプロモーター）でトランスフェクトされたヒト初代Ｔ細胞は、有意に低いＣＤ６９上方制御（図２９Ａ）とＩＦＮ－γ分泌（図２９Ｂ）を示した。より強いＴＣＲ架橋化学物質ＰＨＡ－Ｌ（図２９Ｂ）を用いる場合、ＧＦＰコントロールに比べて、ＬＧ１７１とＬＧ１７１ｐ１も低いＩＦＮ－γ分泌を付与し、これは、同種異体Ｔ細胞注入中に潜在的ＧｖＨＤ応答を回避する、より安全なポリシーを示した。
【0176】
この発見をさらに証明するために、ＭＬＲアッセイを用いた（図２９Ｃ）。詳細には、モックＴ細胞又はＬＧ１７１ｐ１でトランスフェクトされたＴ細胞を、インビトロで派生した同種異体成熟ＤＣ細胞と５日間共培養した。そして、ＥＬＩＳＡによって上清におけるＩＦＮ－γレベルを試験した。同様に、二つの異なるドナーからの成熟ＤＣで試験する場合、ＬＧ１７１ｐ１は、ＩＦＮ－γ分泌を有意に低下させた。
【0177】
例１７ ＬＧ１７１． ＣｌｄｎＣａｒの発現と殺傷効率
現在、臨床的使用が承認された全てのＣＡＲ Ｔ細胞療法は、いずれも自家Ｔ細胞エンジニアリングと再移植に依存する。ドナー間療法を標準化しＣＡＲ Ｔ細胞療法のコストを削減するために、強力な同種異体Ｔ細胞技術の開発が必要とされている。
現在、臨床的使用が承認された全てのＣＡＲ Ｔ細胞療法は、いずれも自家Ｔ細胞エンジニアリングと再移植に依存する。ドナー間療法を標準化しＣＡＲ Ｔ細胞療法のコストを削減するために、強力な同種異体Ｔ細胞技術の開発が必要とされている。
【0178】
１． ＣｌｄｎＣａｒとＬＧ１７１． ＣｌｄｎＣａｒ融合タンパク質構築体は、図３０Ａに示されている。本発明者らは、ＧＲＡＩＬに基づく受容体ＴＡＣをコードする第１の核酸（即ち、ＬＧ１７１又はＣＤ３ζ－ＧＲＡＩＬ． ＩＣ）とＣＡＲ（クローディン１８．２ ＣＡＲ）をコードする第２の核酸を単一のトランスポゾンベクターに組み合わせて、ＬＧ１７１． ＣｌｄｎＣａｒ（即ち、ＬＧ１７１／クローディン１８．２ ＣＡＲ組み合わせ発現構築体）を産生した。
【0179】
２． αＣＤ３ε（抗ＣＤ３抗体、ＣＤ３発現に用いられる）によってＴＣＲ下方制御を検出し、αＦ（ａｂ’）２染色（ｓｃＦｖ発現に用いられる）によってＣＡＲ発現を検出した。結果は、図３０Ｂに示されている。
【0180】
受容体ＴＡＣ／ＣＡＲ構築体を発現するＴ細胞はＧＦＰ発現でゲーティングを行った（図３０Ｂの左小図と右小図における上から下への一番目のピーク）。図３０Ｂの左小図から、ＣｌｄｎＣａｒ（上から下へ三番目のピーク）でトランスフェクトされたＴ細胞に比べて、ＬＧ１７１． ＣｌｄｎＣａｒ（最低ピーク）とＬＧ１７１（上から下への二番目のピーク）でトランスフェクトされたＴ細胞が、ＴＣＲ発現を欠損することが分かった。図３０Ｂの右小図から、ＬＧ１７１でトランスフェクトされたＴ細胞がｓｃＦｖ発現（上から下への二番目のピーク）を欠損したが、ＣｌｄｎＣａｒでトランスフェクトされたＴ細胞（上から下への三番目のピーク）に比べて、ＬＧ１７１． ＣｌｄｎＣａｒでトランスフェクトされたＴ細胞が、正常なｓｃＦｖ発現（最低ピーク）を有することが分かった。
【0181】
３． ＴＣＲ欠損Ｔ細胞におけるＣＡＲ機能性を試験するために、本発明者らは、ＨＥＫ－ｃｌｄｎ１８．２細胞（これらの細胞は形質導入されてＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する）とＨＥＫ２９３Ｔ細胞（即ち、親ＨＥＫ細胞）（これらの細胞はクローディン１８．２陰性である）に対するその細胞毒性潜在性を測定し、結果は、図３０Ｃに示されている。
【0182】
図３０Ｃの左小図から、クローディン１８．２陰性親ＨＥＫ細胞株（即ち、ＨＥＫ）に対する細胞毒性が検出されなかったことが分かった。図３０Ｃの右小図から、ＬＧ１７１／クローディン１８．２ ＣＡＲ組み合わせ発現構築体（即ち、ＬＧ１７１． ＣｌｄｎＣａｒ）を発現するＴ細胞が、クローディン１８．２ ＣＡＲ（即ち、ＣｌｄｎＣａｒ）コントロールプラスミド（即ち、ＨＥＫ－ＣＬＤＮ １８．２）を発現する細胞と同様な抗原特異的細胞毒性を示すことが分かった。抗原特異的細胞開裂は、Ｅ： Ｔ比の増加と共に増加した。ＬＧ１７１を単独で発現するＴ細胞は、クローディン１８．２を発現する標的細胞に対する応答の細胞毒性が最小であることを示し、この影響が確かにＣＡＲにより媒介されたことを示している。
【0183】
４． 総合的には、本発明者らは、Ｅ３リガーゼ融合タンパク質が、ＴＣＲ発現を下方制御し、Ｔ細胞活性化を防止するために用いることができ、且つこの影響が、ＴＣＲ特異的であり、且つ共発現システムではＣＡＲ効果に影響を与えないことをすでに証明した。そのため、本発明者らは、受容体ＴＡＣプラットフォームは、タンパク質レベル下で、ＴＣＲ発現を操作することによって同種異体ＣＡＲ Ｔ細胞を産生する新しい方式を表していると考えられる。
【0184】
他の実施例
理解すべきこととして、発明を実施するための形態を結び付けながら本開示を説明したが、以上の説明は、本開示の範囲を限定するものではなく、説明することを意図しており、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。その他の態様、利点及び修正は以下の請求項の範囲内にある。
理解すべきこととして、発明を実施するための形態を結び付けながら本開示を説明したが、以上の説明は、本開示の範囲を限定するものではなく、説明することを意図しており、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。その他の態様、利点及び修正は以下の請求項の範囲内にある。
【0185】
以上に説明された様々な実施例は、組み合わせて別の実施例を提供することができる。本明細書で言及され及び／又は出願データシートに列記される全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許発行物は、いずれも全体として参照により本明細書に組み込まれる。別の実施例を提供するために、種々の特許、出願、及び刊行物の概念を使用する必要があれば、これらの実施例の各態様を修正することができる。
【0186】
これら及び他の変更は上記詳細説明に鑑みて上記実施形態に対しなされ得る。総体的に言えば、以下の請求項では、使用される用語は請求項を本明細書と特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定するものと解釈すべきではなく、このような請求項の権利を付与される等価物の全範囲と共にすべての可能な実施形態を含むように解釈すべきである。そのため、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図23C】
【図24】
【図25A】
【図25B】
【図25C】
【図26A】
【図26B】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図28A】
【図28B】
【図29A】
【図29B】
【図29C】
【図30A】
【図30B】
【図30C】
【配列表】
【国際調査報告】