特表 2023-542343 エピレグリンおよびアンフィレグリンを用いた上皮増殖因子受容体指向性療法に対する応答の予測

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-06

(54)【発明の名称】エピレグリンおよびアンフィレグリンを用いた上皮増殖因子受容体指向性療法に対する応答の予測

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20230929BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230929BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230929BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230929BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230929BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20230929BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230929BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20230929BHJP

【ＦＩ】

G01N33/574 A

A61P35/00

A61K45/00

A61K39/395 T

A61P43/00 121

A61K31/4745

G01N33/53 Y

G01N33/574 D

C07K16/28 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023518111

(86)(22)【出願日】2021-09-17

(85)【翻訳文提出日】2023-05-10

(86)【国際出願番号】 US2021050777

(87)【国際公開番号】W WO2022066512

(87)【国際公開日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】62/706,988

(32)【優先日】2020-09-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511286517

【氏名又は名称】ヴェンタナ メディカル システムズ， インク．

(71)【出願人】

【識別番号】514302621

【氏名又は名称】ユニバーシティ・オブ・リーズ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＬＥＥＤＳ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】バイ， アイザック ユーユー

(72)【発明者】

【氏名】バレット， ジェニファー ヘレン

(72)【発明者】

【氏名】エリオット， ファイユ

(72)【発明者】

【氏名】リュー， ウェン－ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】クワーク， フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】リッチマン， スーザン ダイアン

(72)【発明者】

【氏名】セリグマン， ジェニファー フランセス

(72)【発明者】

【氏名】シーモア， マシュー トーマス

(72)【発明者】

【氏名】シャンムガム， カンダウェル

(72)【発明者】

【氏名】シン， シャリーニ

(72)【発明者】

【氏名】ウェスト， ニコラス ポール

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアムズ， クリストファー ジェームズ マイケル

(72)【発明者】

【氏名】チャン， リーピン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084AA20

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC412

4C084ZC511

4C084ZC751

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB11

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG08

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB22

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC51

4C086ZC75

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

抗ＥＧＦＲ療法に対する応答の予測を可能にする方法であって、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）またはエピレグリン（ＥＲＥＧ）を染色するための組織化学的または細胞化学的染色方法を含む方法が提供される。ＥＲＥＧおよびＡＲＥＧのそれぞれについて腫瘍細胞陽性パーセントを決定し、決定された陽性パーセントを所定のカットオフと比較することを含み得るが、これらに限定されないスコアリングアルゴリズムが提供される。所定のカットオフは、陽性カットオフ（パーセンテージがカットオフ以上である場合、患者はＥＧＦＲ指向性療法で処置される）、陰性カットオフ（パーセンテージがカットオフ未満である場合、患者はＥＧＦＲ指向性療法で処置されない）、または陽性および陰性の両方のカットオフのいずれかであり得る。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍を有する患者を処置する方法であって、前記方法は、前記腫瘍がＡＲＥＧ ＨＩＧＨまたはＥＲＥＧ ＨＩＧＨのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含む治療コースを前記患者に投与することであって、前記腫瘍が、第１の所定のカットオフ以上のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、前記腫瘍はＡＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされ、前記腫瘍が、第２の所定のカットオフ以上のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、前記腫瘍はＥＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされる、投与することを含む、方法。

【請求項2】

前記第１の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内であり、前記第２の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが２０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが２５％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが３０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが３３．３％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが４０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが５０％である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記結腸直腸腫瘍が左側腫瘍である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記結腸直腸腫瘍が右側腫瘍である、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記ＥＧＦＲ指向性治療剤が抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が、セツキシマブまたはパニツムマブである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記治療コースが、前記患者に化学療法を投与することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記化学療法がイリノテカンを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記腫瘍が、ＥＧＦＲモノクローナル抗体療法に対する抵抗性を付与する検出可能な量の突然変異を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記腫瘍がＲＡＳ野生型（ＲＡＳ－ｗｔ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記腫瘍の試料がホルマリン固定パラフィン包埋組織切片である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ＥＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージが、自動化された方法によって定量される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

腫瘍を有する患者を処置する方法であって、前記方法は、前記腫瘍がＡＲＥＧ ＬＯＷおよびＥＲＥＧ ＬＯＷの両方である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない治療コースを前記患者に投与することであって、前記腫瘍が、第１の所定のカットオフ未満のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、前記腫瘍はＡＲＥＧ ＬＯＷであり、前記腫瘍が、第２の所定のカットオフ未満のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、前記腫瘍はＥＲＥＧ ＬＯＷとみなされる、投与することを含む、方法。

【請求項16】

前記第１の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内であり、前記第２の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが２０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが２５％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが３０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが３３．３％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが４０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが５０％である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記結腸直腸腫瘍が左側腫瘍である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記結腸直腸腫瘍が右側腫瘍である、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記ＥＧＦＲ指向性治療剤が抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が、セツキシマブまたはパニツムマブである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記治療コースが、前記患者に化学療法を投与することを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記化学療法がイリノテカンを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記腫瘍が、ＥＧＦＲモノクローナル抗体療法に対する抵抗性を付与する検出可能な量の突然変異を含まない、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記腫瘍がＲＡＳ野生型（ＲＡＳ－ｗｔ）である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記腫瘍の試料がホルマリン固定パラフィン包埋組織切片である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

ＥＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージが、自動化された方法によって定量される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

ＥＧＦＲ指向性治療剤を含む治療コースを受ける、腫瘍を有する患者を選択する方法であって、前記方法は、
（ａ）ヒトＡＲＥＧタンパク質について前記腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｂ）ヒトＥＲＥＧタンパク質について前記腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｃ）前記腫瘍の前記試料中のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、前記パーセンテージを第１の所定のカットオフと比較することと、
（ｄ）前記腫瘍の前記試料中のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、前記パーセンテージを第２の所定のカットオフと比較することと、
を含み、
前記患者は、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞の前記パーセンテージが前記第１の所定のカットオフ以上であるか、またはＥＲＥＧ＋腫瘍細胞の前記パーセンテージが前記第２の所定のカットオフ以上である場合、前記ＥＧＦＲ指向性治療剤を含む前記治療コースを受けるように選択される、方法。

【請求項30】

前記第１の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内であり、前記第２の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが２０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが２５％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが３０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが３３．３％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが４０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが５０％である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記結腸直腸腫瘍が左側腫瘍である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記結腸直腸腫瘍が右側腫瘍である、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記ＥＧＦＲ指向性治療剤が抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が、セツキシマブまたはパニツムマブである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記治療コースが、前記患者に化学療法を投与することを含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記化学療法がイリノテカンを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記腫瘍が、ＥＧＦＲモノクローナル抗体療法に対する抵抗性を付与する検出可能な量の突然変異を含まない、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記腫瘍がＲＡＳ野生型（ＲＡＳ－ｗｔ）である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記腫瘍の前記試料がホルマリン固定パラフィン包埋組織切片である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

ＥＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージが、自動化された方法によって定量される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない療法を受ける、腫瘍を有する患者を選択する方法が提供され、前記方法は、
（ａ）ヒトＡＲＥＧタンパク質について前記腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｂ）ヒトＥＲＥＧタンパク質について前記腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｃ）前記腫瘍の前記試料中のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、前記パーセンテージを第１の所定のカットオフと比較することと、
（ｄ）前記腫瘍の前記試料中のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、前記パーセンテージを第２の所定のカットオフと比較することと、
を含み、
前記患者は、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞の前記パーセンテージが前記第１の所定のカットオフ未満であり、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞の前記パーセンテージが前記第２の所定のカットオフ未満である場合、前記ＥＧＦＲ指向性治療剤を受けるように選択される、方法。

【請求項44】

前記第１の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内であり、前記第２の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが２０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが２５％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが３０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが３３．３％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２０％であり、前記第２の所定のカットオフが４０％であるか、または、前記第１の所定のカットオフが２５％であり、前記第２の所定のカットオフが５０％である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記結腸直腸腫瘍が左側腫瘍である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記結腸直腸腫瘍が右側腫瘍である、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

前記ＥＧＦＲ指向性治療剤が抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が、セツキシマブまたはパニツムマブである、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

処置コースが、前記患者に化学療法を投与することを含む、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記化学療法がイリノテカンを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記腫瘍が、ＥＧＦＲモノクローナル抗体療法に対する抵抗性を付与する検出可能な量の突然変異を含まない、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記腫瘍がＲＡＳ野生型（ＲＡＳ－ｗｔ）である、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記腫瘍の前記試料がホルマリン固定パラフィン包埋組織切片である、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

ＥＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージが、自動化された方法によって定量される、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

腫瘍を有する患者を処置する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記腫瘍がＡＲＥＧ ＨＩＧＨまたはＥＲＥＧ ＨＩＧＨのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を前記患者に投与することであって、前記腫瘍が、第１の所定の陽性カットオフ以上のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、前記腫瘍はＡＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされ、前記腫瘍が、第２の所定の陽性カットオフ以上のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、前記腫瘍はＥＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされる、投与することと、
（ｂ）前記腫瘍がＡＲＥＧ ＬＯＷおよびＥＲＥＧ ＬＯＷの両方である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない療法コースを前記患者に投与することであって、前記腫瘍が、第１の所定の陰性カットオフ未満のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、前記腫瘍はＡＲＥＧ ＬＯＷとみなされ、前記腫瘍が、第２の所定の陰性カットオフ未満のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、前記腫瘍はＥＲＥＧ ＬＯＷとみなされる、投与することと、
を含む、方法。

【請求項58】

前記第１の所定の陽性カットオフが３０％～５０％の範囲内であり、前記第１の所定の陰性カットオフが２０％～３０％の範囲内である、および／または前記第２の所定の陽性カットオフが３０％～５０％の範囲内であり、前記第２の所定の陰性カットオフが２０％～３０％の範囲内である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記第１の所定の陽性カットオフが５０％であり、前記第１の所定の陰性カットオフが２０％であり、前記第２の所定の陽性カットオフが５０％であり、前記第２の所定の陰性カットオフが２０％である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記結腸直腸腫瘍が左側腫瘍である、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記結腸直腸腫瘍が右側腫瘍である、請求項６０に記載の方法。

【請求項63】

前記ＥＧＦＲ指向性治療剤が抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が、セツキシマブまたはパニツムマブである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記療法コースが、前記患者に化学療法を投与することを含む、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記化学療法がイリノテカンを含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記腫瘍が、ＥＧＦＲモノクローナル抗体療法に対する抵抗性を付与する検出可能な量の突然変異を含まない、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記腫瘍がＲＡＳ野生型（ＲＡＳ－ｗｔ）である、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記腫瘍の試料がホルマリン固定パラフィン包埋組織切片である、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

ＥＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージが、自動化された方法によって定量される、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

腫瘍を有する患者の処置を選択する方法であって、前記方法は、
（ａ）ヒトＡＲＥＧタンパク質について前記腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｂ）ヒトＥＲＥＧタンパク質について前記腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｃ）前記腫瘍の前記試料中のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、前記パーセンテージを第１の所定の陽性カットオフおよび第１の所定の陰性カットオフと比較することと、
（ｄ）前記腫瘍の前記試料中のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、前記パーセンテージを第２の所定の陽性カットオフおよび第２の所定の陰性カットオフと比較することと、
（ｅ）前記腫瘍がＡＲＥＧ ＨＩＧＨまたはＥＲＥＧ ＨＩＧＨのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含む処置コースを受けるように前記患者を選択することであって、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞の前記パーセンテージが前記第１の所定の陽性カットオフ以上である場合、前記腫瘍はＡＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされ、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞の前記パーセンテージが前記第２の所定の陽性カットオフ以上である場合、前記腫瘍はＥＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされる、選択することと、
（ｆ）前記腫瘍がＡＲＥＧ ＬＯＷおよびＥＲＥＧ ＬＯＷの両方である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない処置コースを受けるように前記患者を選択することであって、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞の前記パーセンテージが前記第１の所定の陰性カットオフ未満である場合、前記腫瘍はＡＲＥＧ ＬＯＷとみなされ、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞の前記パーセンテージが前記第２の所定の陰性カットオフ未満である場合、前記腫瘍はＥＲＥＧ ＬＯＷとみなされる、選択することと、
を含む、方法。

【請求項72】

前記第１の所定の陽性カットオフが３０％～５０％の範囲内であり、前記第１の所定の陰性カットオフが２０％～３０％の範囲内である、および／または前記第２の所定の陽性カットオフが３０％～５０％の範囲内であり、前記第２の所定の陰性カットオフが２０％～３０％の範囲内である、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記第１の所定の陽性カットオフが５０％であり、前記第１の所定の陰性カットオフが２０％であり、前記第２の所定の陽性カットオフが５０％であり、前記第２の所定の陰性カットオフが２０％である、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記結腸直腸腫瘍が左側腫瘍である、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記結腸直腸腫瘍が右側腫瘍である、請求項７４に記載の方法。

【請求項77】

前記ＥＧＦＲ指向性治療剤が抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が、セツキシマブまたはパニツムマブである、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記処置コースが、前記患者に化学療法を投与することを含む、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記化学療法がイリノテカンを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記腫瘍が、ＥＧＦＲモノクローナル抗体療法に対する抵抗性を付与する検出可能な量の突然変異を含まない、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記腫瘍がＲＡＳ野生型（ＲＡＳ－ｗｔ）である、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記腫瘍の前記試料がホルマリン固定パラフィン包埋組織切片である、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

ＥＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージが、自動化された方法によって定量される、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／７０６，９８８号の出願日の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

本開示は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）指向性療法に対する応答を予測するための組織化学的または細胞化学的方法、システムおよび組成物に関する。本開示はまた、ＥＲＥＧ指向性治療剤に対する応答を予測するために組織学または細胞学標本を解析する方法に関する。より詳細には、本開示は、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）に対して陽性の腫瘍の試料中の腫瘍細胞のパーセンテージおよびＥＲＥＧに対して陽性の腫瘍の試料中の腫瘍細胞のパーセンテージの両方に基づく、ＥＧＦＲ指向性治療剤に対する応答の予測に使用するためのスコアリング方法に関する。
共同研究契約の参照

【0003】

本出願は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．とＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｅｄｓとの間の共同研究契約の１または複数の当事者によってまたはそれらを代表して行われた。

【背景技術】

【0004】

結腸癌患者の約２０％は、転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）を呈する。これらの患者の半数超（５０～６０％）はやがて不治の進行疾患を発症し、その５年生存率はおよそ１２．５％である。ｍＣＲＣにおいては、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）経路および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）経路という２つのシグナル伝達経路が、治療薬開発の焦点となっている。現在、ｍＣＲＣ患者の大多数は、ＥＧＦＲ標的療法またはＶＥＧＦ標的療法のいずれかと組み合わせた細胞傷害性化学療法を受ける。ＥＧＦＲは、ＣＲＣ症例の約７０％において過剰発現され、アウトカム不良と関連付けられている。セツキシマブまたはパニツムマブなどのモノクローナル抗体によるＥＧＦＲを標的とした阻害は、ｍＣＲＣ患者を処置するために２００４年および２００６年にＦＤＡによって承認された。両方の薬物は、１０～１５％の奏効率で非常に類似した有効性を有する。

【0005】

ＥＧＦＲ指向性療法に対する応答性に関する信頼性ある正の予測因子は、長らく存在していない。

【0006】

臨床試験では、ＥＧＦＲ阻害剤が、ＲＡＳ経路突然変異を欠いている患者において最も有効であることが示されている。ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＢＲＡＦなどのＲＡＳシグナル伝達経路のメンバーにおける点突然変異は、ＥＧＦＲが薬理的に不活性化したかどうかにかかわらず、下流ＲＡＳ－ＭＡＰＫシグナル伝達の持続的活性化をもたらす。ＲＡＳおよびＢＲＡＦの突然変異に加えて、ｃＭＥＴまたはＥＧＦＲの増幅などの他の代替的機構が、セツキシマブまたはパニツムマブに対する抵抗性に関与する。ＰＩ３ＫまたはＰＴＥＮ喪失の突然変異（ＲＡＳまたはＢＲＡＦの突然変異と共に起こることが多い）も、応答の欠如に関連する可能性がある。実際、ＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＰＩ３Ｋの突然変異は、ＥＧＦＲを標的とするモノクローナル抗体に対するｄｅ ｎｏｖｏ抵抗性を示すｍＣＲＣ患者の６０％超を占める。ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦおよびＰＩ３Ｋ野生型腫瘍を有する患者（四重野生型患者）の４０％のうち、これらの患者のおよそ半数（１５％のみ）が抗ＥＧＦＲ療法の利益を受け、２０％超はノンレスポンダーである。Ｐｅｒｋｉｎｓらを参照のこと。

【0007】

リガンドのエピレグリン（ＥＲＥＧ）およびアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）を含むＥＧＦＲリガンドの過剰発現は、抗ＥＧＦＲ療法の予測因子として示唆されている。ｍＣＲＣ患者の一試験では、抗ＥＧＦＲ療法の追加は、最良の支持療法単独と比較して、高いＥＲＥＧ発現レベルを有する患者の生存を５．１ヶ月から９．８ヶ月に増加させた。この結果は、ＥＧＦＲリガンドの発現が、ＥＧＦＲ阻害剤療法のためのｍＣＲＣ患者をスクリーニングするのに臨床的に有用なバイオマーカーとなり得ることを示唆している。しかしながら、ＰＣＲベースの検出系は、リガンドを発現する細胞の分布および相対的存在量などの空間的文脈を欠いている。

【0008】

ＥＧＦＲリガンドの免疫組織化学的解析は様々な結果を有している。例えば、Ｋｈｅｌｗａｔｔｙらは、野生型ＥＧＦＲおよび少なくとも１つのそのリガンドの共発現（ＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞＞５％およびリガンド染色強度２＋のカットオフにおいて）が、より短い無増悪生存、ひいてはＥＧＦＲ指向性治療剤に対するより低い奏効率と有意に相関することを示した。しかしながら、同著者らの試料において、ＥＧＦＲ染色は主に細胞質に認められ、そのため同著者らは、ＥＧＦＲの内部移行により、ＥＧＦＲ療法が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を及ぼすことが不可能になるとの理論を立てた。同著者らはさらに、試験における患者の最大４０％が以前にセツキシマブ療法を受けていた可能性があり、これが表面からのＥＧＦＲの下方制御に寄与した可能性があることに注目した。したがって、Ｋｈｅｌｗａｔｔｙは、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲリガンドの発現パターンとＥＧＦＲ指向性治療薬への応答との間の明確な相関性について記述していない。一方、Ｙｏｓｈｉｄａら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１３年３月、第１３９巻、第３号、３６７～３７８ページ）は、７つのうち４つのリガンド（ＡＲＥＧ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＴＧＦα、およびＥＲＥＧ）とＥＧＦＲ療法への臨床応答との間に良好な相関性があることを見出し、ＨＩＧＨカテゴリでスコアリングするために少なくとも２つのリガンドを必要とするスコアリングアルゴリズムを示唆している。しかしながら、Ｙｏｓｈｉｄａのアプローチは、ＥＧＦＲリガンドの１つのみを過剰発現するが高レベルであり得る欠損患者のリスクをもたらす。

【発明の概要】

【0009】

本開示は、一般に、ＡＲＥＧに対して陽性の腫瘍の試料中の腫瘍細胞のパーセンテージおよびＥＲＥＧに対して陽性の腫瘍の試料中の腫瘍細胞のパーセンテージの両方に基づく、ＥＧＦＲ指向性治療剤に対する応答の予測に使用するためのスコアリング方法に関する。

【0010】

一実施形態では、腫瘍を有する患者を処置する方法が提供され、本方法は、腫瘍がＡＲＥＧ ＨＩＧＨまたはＥＲＥＧ ＨＩＧＨのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を患者に投与することであって、腫瘍が、第１の所定のカットオフ以上のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされ、腫瘍が、第２の所定のカットオフ以上のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされる、投与することを含む。

【0011】

別の実施形態では、腫瘍を有する患者を処置する方法が提供され、本方法は、腫瘍がＡＲＥＧ ＬＯＷおよびＥＲＥＧ ＬＯＷの両方である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない処置を患者に投与することであって、腫瘍が、第１の所定のカットオフ未満のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＬＯＷであり、腫瘍が、第２の所定のカットオフ未満のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＬＯＷとみなされる、投与することを含む。

【0012】

別の実施形態では、ＥＧＦＲ指向性治療剤を受けるように腫瘍を有する患者を選択する方法が提供され、本方法は、（ａ）ヒトＡＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、（ｂ）ヒトＥＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、（ｃ）腫瘍の試料中のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第１の所定のカットオフと比較することと、（ｄ）腫瘍の試料中のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第２の所定のカットオフと比較することと、を含み、患者は、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第１の所定のカットオフ以上であるか、またはＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第２の所定のカットオフ以上である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を受けるように選択される。

【0013】

別の実施形態では、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない療法を受ける、腫瘍を有する患者を選択する方法が提供され、本方法は、（ａ）ヒトＡＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、（ｂ）ヒトＥＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、（ｃ）腫瘍の試料中のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第１の所定のカットオフと比較することと、（ｄ）腫瘍の試料中のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第２の所定のカットオフと比較することと、を含み、患者は、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第１の所定のカットオフ未満であり、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第２の所定のカットオフ未満である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を受けるように選択される。

【0014】

いくつかの実施形態では、前述の方法の第１の所定のカットオフは、２０％～５０％の範囲内、例えば２０％、２５％、３０％、約３３．３％、４０％、および５０％である。

【0015】

いくつかの実施形態では、前述の方法の第２の所定のカットオフは、２０％～５０％の範囲内、例えば２０％、２５％、３０％、約３３．３％、４０％、および５０％である。

【0016】

いくつかの実施形態では、前述の方法の第１の所定のカットオフは２０％であり、前述の方法の第２の所定のカットオフは２０％である。

【0017】

いくつかの実施形態では、前述の方法の第１の所定のカットオフは２５％であり、前述の方法の第２の所定のカットオフは２５％である。

【0018】

いくつかの実施形態では、前述の方法の第１の所定のカットオフは３０％であり、前述の方法の第２の所定のカットオフは３０％である。

【0019】

いくつかの実施形態では、前述の方法の第１の所定のカットオフは３３．３％であり、前述の方法の第２の所定のカットオフは３３．３％である。

【0020】

いくつかの実施形態では、前述の方法の第１の所定のカットオフは４０％であり、前述の方法の第２の所定のカットオフは４０％である。

【0021】

いくつかの実施形態では、前述の方法の第１の所定のカットオフは５０％であり、前述の方法の第２の所定のカットオフは５０％である。

【0022】

一実施形態では、腫瘍を有する患者を処置する方法が提供され、本方法は、（ａ）腫瘍がＡＲＥＧ ＨＩＧＨまたはＥＲＥＧ ＨＩＧＨのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を患者に投与することであって、腫瘍が、第１の所定の陽性カットオフ以上のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされ、腫瘍が、第２の所定の陽性カットオフ以上のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされる、投与することと、（ｂ）腫瘍がＡＲＥＧ ＬＯＷおよびＥＲＥＧ ＬＯＷの両方である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない療法コースを患者に投与することであって、腫瘍が、第１の所定の陰性カットオフ未満のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＬＯＷとみなされ、腫瘍が、第２の所定の陰性カットオフ未満のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＬＯＷとみなされる、投与することと、を含む。

【0023】

一実施形態では、腫瘍を有する患者の処置を選択する方法が提供され、本方法は、（ａ）ヒトＡＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、（ｂ）ヒトＥＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、（ｃ）腫瘍の試料中のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第１の所定の陽性カットオフおよび第１の所定の陰性カットオフと比較することと、（ｄ）腫瘍の試料中のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第２の所定の陽性カットオフおよび第２の所定の陰性カットオフと比較することと、（ｅ）腫瘍がＡＲＥＧ ＨＩＧＨまたはＥＲＥＧ ＨＩＧＨのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含む処置コースを受けるように患者を選択することであって、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第１の所定の陽性カットオフ以上である場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされ、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第２の所定の陽性カットオフ以上である場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされる、選択することと、（ｆ）腫瘍がＡＲＥＧ ＬＯＷおよびＥＲＥＧ ＬＯＷの両方である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない処置コースを受けるように患者を選択することであって、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第１の所定の陰性カットオフ未満である場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＬＯＷとみなされ、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第２の所定の陽性カットオフ未満である場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＬＯＷとみなされる、選択することと、を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、第１の所定の陽性カットオフは、３０％～５０％の範囲内、例えば３０％、約３３．３％、４０％、および５０％であり、第１の所定の陰性カットオフは、２０％～３０％の範囲内、例えば２０％、２５％、および３０％である。

【0025】

１つの特定の実施形態では、第１の所定の陽性カットオフは５０％であり、第１の所定の陰性カットオフは２０％である。

【0026】

いくつかの実施形態では、第２の所定の陽性カットオフは、３０％～５０％の範囲内、例えば３０％、約３３．３％、４０％、および５０％であり、第２の所定の陰性カットオフは、２０％～３０％の範囲内、例えば２０％、２５％、および３０％である。

【0027】

１つの特定の実施形態では、第２の所定の陽性カットオフは５０％であり、第２の所定の陰性カットオフは２０％である。

【0028】

１つの特定の実施形態では、第１および第２の所定の陽性カットオフは５０％であり、第１および第２の所定の陰性カットオフは２０％である。

【0029】

いくつかの実施形態では、前述の方法の腫瘍は結腸直腸腫瘍である。

【0030】

いくつかの実施形態では、前述の方法のＥＧＦＲ指向性治療剤は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えばセツキシマブおよび／またはパニツムマブである。

【0031】

いくつかの実施形態では、前述の方法の療法は、患者に化学療法、例えばイリノテカンを含む化学療法を投与することをさらに含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない前述の方法の療法は、患者に化学療法、例えばイリノテカンを含む化学療法を投与することを含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、前述の方法の腫瘍は、ＥＧＦＲモノクローナル抗体療法に対する抵抗性を付与する突然変異を有する検出可能な量のＲＡＳタンパク質を含まない。

【0034】

いくつかの実施形態では、前述の方法の腫瘍はＲＡＳ野生型（ＲＡＳ－ｗｔ）である。

【0035】

いくつかの実施形態では、前述の方法の結腸直腸腫瘍は左側腫瘍である。

【0036】

いくつかの実施形態では、前述の方法の結腸直腸腫瘍は右側腫瘍である。

【0037】

前述の方法のいくつかの実施形態では、試料は結腸直腸腫瘍の切除物に由来する。

【0038】

前述の方法のいくつかの実施形態では、試料は結腸直腸腫瘍の生検試料である。

【0039】

いくつかの実施形態では、前述の方法の腫瘍の試料はホルマリン固定パラフィン包埋組織切片である。

【0040】

前述の方法のいくつかの実施形態では、ＥＲＥＧを発現する細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧを発現する細胞のパーセンテージは、自動化された方法によって定量される。
参照による配列表の組込み

【0041】

参照により本明細書に援用されるのは、２０２０年９月２０日に作成された「Ｐ３６４０５ＵＳ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５」（１４，４８４バイトのサイズ）のファイル名を有する、コンピュータ可読形式で本明細書と共に提出された配列表である。

【図面の簡単な説明】

【0042】

特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料を支払うことにより、特許庁によって提供されることになる。

【0043】

【図1】試験サンプルの内訳を示すフロー図。

【0044】

【図2】３０個のＰＩＣＣＯＬＯ検証ＦＯＶに関するアルゴリズムとコンセンサス病理学者のスコアとの間の一致－ＡＲＥＧ総腫瘍数（Ａ）；ＡＲＥＧ陽性率（Ｂ）；ＥＲＥＧ総腫瘍数（Ｃ）；ＥＲＥＧ陽性率（Ｄ）。

【0045】

【図3】ＡＲＥＧ対ＥＲＥＧ ＩＨＣ陽性率の散布図。５０％カットポイントに基づく４つの象限がラベル付けされている：（Ａ）ＡＲＥＧ ＬＯＷ／ＥＲＥＧ ＨＩＧＨ；（Ｂ）ＡＲＥＧ ＨＩＧＨ／ＥＲＥＧ ＨＩＧＨ；（Ｃ）ＡＲＥＧ ＬＯＷ／ＥＲＥＧ ＬＯＷ；（Ｄ）ＡＲＥＧ ＨＩＧＨ／ＥＲＥＧ ＬＯＷ。高リガンドエクスプレッサー（青色ドット；象限Ａ、Ｂ、およびＤ）は、５０％を超えるＡＲＥＧおよび／またはＥＲＥＧ陽性率として定義される；低リガンドエクスプレッサー（赤色ドット；象限Ｃ）は、両方とも５０％未満のＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ陽性率として定義される。５０％カットポイントは点線で示されている。

【0046】

【図4】（Ａ）低リガンドエクスプレッサー群および（Ｂ）高リガンドエクスプレッサー群におけるＲＡＳ－ｗｔ患者についてのＰＦＳカプラン・マイヤー曲線。

【発明を実施するための形態】

【0047】

本開示は、概して、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲリガンドの発現についての結腸直腸腫瘍試料の組織化学的染色および評価のための方法、システム、および組成物に関する。開示される方法、システム、および組成物は、とりわけ、腫瘍がＥＧＦＲ指向性治療剤に応答する尤度に従って結腸直腸癌患者を階層化するために有用である。
Ｉ．用語

【0048】

別途説明されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、開示される開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別途の指示がない限り、複数形の参照対象を含む。

【0049】

本開示の実施形態の実践および／または試験に好適な方法および材料を以下に記述する。このような方法および材料は単なる例であり、限定を意図するものではない。本明細書に記述されるものと同様または均等の他の方法および材料を使用してもよい。

【0050】

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体があらゆる目的で参照により援用される。矛盾がある場合には、本明細書が用語の説明を含めて優先するものとする。

【0051】

本開示の様々な実施形態の確認を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する。

【0052】

投与：薬剤、例えば組成物、薬物などを任意の有効な経路によって対象に提供または供与すること。例示的な投与経路としては、経口、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、および静脈内など）、舌下、直腸、経皮（例えば、局所）、鼻腔内、経膣、および吸入の各経路が挙げられるが、これらに限定されない。

【0053】

抗体：少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含み、抗原のエピトープと特異的に結合するペプチド（例えば、ポリペプチド）。文脈によって特に指示されない限り、「抗体」という用語は、抗体断片を明示的に含むと解釈されるものとする。いくつかの実施形態では、抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含み、軽鎖および重鎖は、互いにカップリング（例えば、共有結合）され得る。

【0054】

抗体断片：インタクトな抗体が結合する抗原と結合する、インタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0055】

バイオマーカー：本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、試料中に見出され、試料または試料の取得元である対象を特徴づけるために使用され得る、任意の分子または分子群を指すものとする。例えば、バイオマーカーは、その存在、非存在、または相対的存在量が、特定の病状に特徴的である；疾患の重篤度、または尤度、または疾患進行もしくは後退を示す；かつ／または病理学的症状が特定の処置に応答することを予測する、分子または分子群であり得る。

【0056】

バイオマーカー特異的試薬：細胞試料または組織試料中の１つまたは複数のバイオマーカーに直接、特異的に結合することができる特異的結合剤。「［標的］バイオマーカー特異的試薬」という語句は、挙げられた標的バイオマーカーに特異的に結合することができるバイオマーカー特異的試薬を指すものとする。

【0057】

対比染色：組織切片の全体の「様相」を見ることができるようにし、組織標的の検出のために使用される主な色の基準となる色素による、組織切片の染色。このような色素は、細胞核、細胞膜、または細胞全体を染色することができる。色素の例としては、核ＤＮＡに結合して強い青色光を発するＤＡＰＩ；核ＤＮＡに結合して強い青色光を発するヘキストの青色染色剤；および核ＤＮＡに結合して強い赤色光を発するヨウ化プロピジウムが挙げられる。細胞内細胞骨格ネットワークの対比染色は、蛍光性色素にコンジュゲートしているファロイジンを使用して行うことができる。ファロイジンは、細胞の細胞質内のアクチン線維に密に結合することで、これを顕微鏡下で明らかに視認できるようにする毒素である。

【0058】

検出可能な部分：試料に付着した検出可能な部分または標識の存在および／または濃度を示す検出可能なシグナル（例えば視覚的、電気的、または他のシグナル）を生じさせることができる分子または材料。検出可能なシグナルは、光子（高周波周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数および紫外周波数の光子を含む）の吸収、放出および／または散乱を含む、いかなる既知または未発見の機構によって生成されてもよい。例示的な検出可能な部分としては、色素原性、蛍光性、リン光性、および発光性の分子および材料、ある物質を別の物質に変換して検出可能な差をもたらす（例えば、無色の物質を有色の物質に、もしくはその逆に変換させることによる、または沈殿物を生じさせること、もしくは試料の混濁度を増加させることによる）触媒（例えば酵素）が挙げられる（ただし、これらに限定されるものではない）。いくつかの例では、検出可能な部分は、クマリン、フルオレセイン（またはフルオレセイン誘導体およびアナログ）、ローダミン、レゾルフィン、ルミノフォア、およびシアニンを含むいくつかの一般的な化学物質クラスに属するフルオロフォアである。蛍光分子の追加例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ－Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，第１１版に見出すことができる。他の実施形態では、検出可能な部分は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’－ビスカルボキシペンチル－５，５’－ジスルホナト－インド－ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、およびローダミン１１０（ローダミン）を含む色素のような、明視野顕微鏡法を介して検出可能な分子である。

【0059】

検出試薬：細胞試料中のバイオマーカーに結合したバイオマーカー特異的試薬の近傍に検出可能な部分を付着させ、それによって試料を染色するために使用される任意の試薬。非限定的な例としては、二次検出試薬（例えば、一次抗体に結合することができる二次抗体、ビオチンまたはアビジンと特異的に結合するあらゆるもの）、三次検出試薬（例えば、二次抗体に結合することができる三次抗体）、特異的結合剤と直接的または間接的に会合した酵素、そのような酵素との反応性があり蛍光性または色素原性の染色剤の付着をもたらす化学物質、染色工程と染色工程との間に使用される洗浄試薬などが挙げられる。

【0060】

モノクローナル抗体：実質的に均一な抗体の集団を有する抗体調製物、すなわち、集団を構成する個々の抗体が同一である、かつ／または同じエピトープと結合するが、可能性のある変異体抗体、例えば、天然に存在する突然変異を含むもの、またはモノクローナル抗体調製物の生産中に生じるものは除き、このような変異体は通常微量で存在する。ポリクローナル抗体とは異なり、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。

【0061】

ポリクローナル抗体：異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む抗体調製物。

【0062】

試料：診断目的で対象から取得され、特異的結合剤を使用して材料中のバイオマーカーの存在もしくは非存在および／または量を試験することと適合性である様式で処理される任意の材料。診断目的の例としては、対象における疾患の診断もしくは予後判定を行うこと、および／または特定の治療レジメンに対する疾患の応答を予測すること、および／または治療レジメンに対する対象の応答をモニタリングすること、および／または疾患の進行もしくは再発についてモニタリングすることが挙げられる。
（ａ）細胞試料：インタクトな細胞を含む試料、例えば、細胞培養物、細胞を含む血液または他の体液試料、細胞塗抹標本（例えば、Ｐａｐ塗抹標本および子宮頸部単層）、細針吸引物（ＦＮＡ）、液体ベースの細胞学試料、および病理学的、組織学的、または細胞学的な解釈のために採取された手術標本。
（ｂ）組織試料：試料の取得元となった対象に存在していた際の細胞間の断面的な空間的関係を維持する細胞試料。「組織試料」は、一次組織試料（すなわち、対象によって産生された細胞および組織）と異種移植片（すなわち、対象に植え込まれた外来細胞試料）との両方を包含するものとする。

【0063】

切片：名詞として使用される場合は、通常はミクロトームを使用して切断される、顕微鏡的解析に好適な組織試料の薄片。動詞として使用される場合は、通常はミクロトームを使用して、組織試料の切片を作ること。

【0064】

連続切片：組織試料から順に切断された一連の切片のうちのいずれか１つ。２つの切片が互いの「連続切片」とみなされるためには、それらが組織からの連続した切片である必要は必ずしもないが、通常は、組織学的染色後に構造を互いと照合することができるように、同じ断面的関係にある同じ組織構造を含むべきである。

【0065】

特異的結合：本明細書で使用される場合、「特異的結合」、「に特異的に結合する」、または「に対して特異的な」という語句は、生物学的分子を含む分子の不均一集団の存在下における標的の存在を決定する、標的と特異的結合剤との間の結合のような、測定可能で再現性のある相互作用を指す。例えば、標的に特異的に結合する結合性実体は、他の標的に結合するのと比べてより高い親和性で、より高いアビディティで、より容易に、かつ／またはより長い持続期間で標的と結合する抗体であり得る。

【0066】

特異的結合剤：細胞試料または組織試料に関連する標的化学構造（例えば、試料によって発現されるバイオマーカー、または試料に結合したバイオマーカー特異的試薬）に特異的に結合することができる物質の任意の組成物。例としては、特定のヌクレオチド配列に対して特異的な核酸プローブ；抗体およびその抗原結合性断片；ならびにＡＤＮＥＣＴＩＮ（１０番目のＦＮ３フィブロネクチンに基づく足場；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ－Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．）、ＡＦＦＩＢＯＤＹ（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡのＺドメインに基づく足場；Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＡＶＩＭＥＲ（ドメインＡ／ＬＤＬ受容体に基づく足場；Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ｄＡｂ（ＶＨまたはＶＬ抗体ドメインに基づく足場；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＰＬＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートタンパク質に基づく足場；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、ＣＨ）、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮ（リポカリンに基づく足場；Ｐｉｅｒｉｓ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、ＤＥ）、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（ＶＨＨ（ラクダ科のＩｇ）に基づく足場；Ａｂｌｙｎｘ Ｎ／Ｖ、Ｇｈｅｎｔ、ＢＥ）、ＴＲＡＮＳ－ＢＯＤＹ（トランスフェリンに基づく足場；Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、ＳＭＩＰ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、およびＴＥＴＲＡＮＥＣＴＩＮ（Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）、テトラネクチンに基づく足場；Ｂｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａ Ａ／Ｓ、Ａａｒｈｕｓ、ＤＫ）を含む工学操作された特異的結合性構造体が挙げられるが、これらに限定されない。そのような工学操作された特異的結合性構造体の説明は、Ｗｕｒｃｈら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ ｔｏ Ｗｈｏｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔａｔｕｓ ｏｎ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第９巻、５０２～５０９ページ（２００８年）に概説されており、その内容は参照により援用される。

【0067】

染色：名詞として使用される場合、「染色剤」という用語は、明視野顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法などを含む顕微鏡的解析のための細胞試料中の特定の分子または構造を可視化するために使用され得る任意の物質を指すものとする。動詞として使用される場合、「染色」という用語は、細胞試料への染色剤の付着をもたらす任意のプロセスを指すものとする。

【0068】

対象：試料の取得元または由来となった哺乳動物。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。
ＩＩ．ＥＧＦＲリガンドについての組織化学的または細胞化学的標識試料

【0069】

本発明の方法は、ヒトＥＲＥＧタンパク質およびヒトＡＲＥＧタンパク質についての組織化学的または細胞化学的染色腫瘍試料に基づく。

【0070】

Ａ．試料および試料調製

【0071】

本発明の方法は、例えば、腫瘍生検試料、切除試料、細胞塗抹標本、細針吸引物（ＦＮＡ）、液体ベースの細胞学試料などを含む、腫瘍から得られた組織試料または組織試料の細胞学的調製物に対して行われる。

【0072】

一実施形態では、試料は、固定組織試料である。組織試料の固定は、可能な限り生きた状態に近い状態で細胞および組織の構成成分を保存し、それらが大きな変化なしに調製用手順を受けることを可能にする。細胞死の際に始まる自己融解および細菌性分解のプロセスが停止され、試料中の細胞および組織の構成成分が安定化されることで、後の組織処理段階に耐えられるようになる。固定剤は、架橋結合剤（アルデヒドなど、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒド、ならびに非アルデヒド架橋結合剤）、酸化剤（例えば、四酸化オスミウムおよびクロム酸などの金属イオンおよび錯体）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノール、およびエタノール）、未知の機構の固定剤（例えば、塩化第二水銀、アセトン、およびピクリン酸）、組合せ試薬（例えば、Ｃａｒｎｏｙ固定剤、メタカーン（ｍｅｔｈａｃａｒｎ）、Ｂｏｕｉｎ液、Ｂ５固定剤、Ｒｏｓｓｍａｎ液、およびＧｅｎｄｒｅ液）、マイクロ波、およびその他の固定剤（例えば、排除体積固定および蒸気固定）に分類することができる。バッファー、界面活性剤、タンニン酸、フェノール、金属塩（例えば塩化亜鉛、硫酸亜鉛、およびリチウム塩）、およびランタンなどの添加剤が固定剤に含まれていてもよい。試料の調製において最も一般的に使用されている固定剤はホルムアルデヒドであり、通常はホルマリン溶液（水性（典型的には緩衝）溶液中のホルムアルデヒド）の形態である。一実施形態では、本発明の方法で使用される試料は、ホルマリンベースの固定剤における固定を含む方法によって固定される。一例では、固定剤は１０％中性緩衝ホルマリンである。これらの例にかかわらず、組織は、使用されるバイオマーカー特異的試薬および特異的検出試薬と適合性である任意の固定媒体を使用したプロセスによって固定することができる。

【0073】

いくつかの例では、固定組織試料は、包埋媒体に包埋される。包埋媒体は、組織および／または細胞を将来解析するために保存するのに役立つように組織および／または細胞が包埋される不活性材料である。包埋はまた、組織試料を薄い切片にスライスすることを可能にする。包埋媒体としては、パラフィン、セロイジン、ＯＣＴ（商標）化合物、寒天、プラスチック、またはアクリルが挙げられる。一実施形態では、試料は、ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋されて、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックを形成する。典型的な包埋プロセス（例えばＦＦＰＥブロックのために使用されるもの）では、試料を固定した後、典型的には約７０％から約１００％の範囲の漸増するアルコール濃度を使用する一連のアルコール浸漬に供して、試料を脱水する。アルコールは、一般的にはアルカノール、特にメタノールおよび／またはエタノールである。特定の作業実施形態では、これらの連続脱水工程で７０％、９５％、および１００％のエタノールを使用した。最後のアルコール処理工程の後、試料は次に、一般的に清澄化液と呼ばれる別の有機溶媒に浸漬される。清澄化液は、（１）残留するアルコールを除去し、（２）後のワックス処理工程のために試料の疎水性を高める。
清澄化溶媒は通常、キシレンなどの芳香族有機溶媒である。清澄化した試料に包埋材料を適用することによってブロックが形成され、ここから組織切片を（例えばミクロトームを使用することによって）切断することができる。

【0074】

これらの例にかかわらず、取得される組織試料または細胞学試料が、関心対象のバイオマーカーについての試料の染色、ならびにこの染色およびＥＲＥＧもしくはＡＲＥＧを発現する細胞の数を定量するための後の顕微鏡的評価またはデジタル画像法に使用される試薬と適合性である限り、本開示は特定の処理工程を必要としない。

【0075】

Ｂ．試料の選択

【0076】

Ｂ１．腫瘍ステージ

【0077】

一実施形態では、試料の由来となる腫瘍は、ＥＲＥＧタンパク質および／またはＡＲＥＧタンパク質について染色される前にステージ分類される。ステージ０結腸直腸癌は、結腸の内層を越えて成長していない癌である。ステージＩ結腸直腸癌は、結腸壁自体の外側または付近のリンパ節内に拡散していない癌である。ステージＩＩ結腸直腸癌は、結腸壁を通過し、場合によっては付近の組織内まで成長しているが、リンパ節へは拡散していない癌である。ステージＩＩＩ結腸直腸癌は、付近のリンパ節まで拡散しているが、身体の他の部分へは拡散していない癌である。ステージＩＶ結腸直腸癌は、結腸から遠位の臓器および組織まで拡散している癌である。一実施形態では、試料は、ステージＩＩＩまたはステージＩＶ結腸直腸癌である場合に染色のために選択される。別の実施形態では、試料は、ステージＩＶ結腸直腸癌である場合に染色のために選択される。

【0078】

Ｂ２．ＥＧＦＲ抵抗性突然変異

【0079】

腫瘍は、ＥＧＦＲ指向性治療剤に対する抵抗性を付与する突然変異の存在についてスクリーニングされ得る。そのような突然変異の例としては、ＲＡＳ癌遺伝子（例えば、Ｐｒｉｏｒ、Ｗａｒｉｎｇ、Ｖａｌｅ、Ｋａｐｒａｐｅｔｉｓ、Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ、およびＶａｎ Ｃｕｔｓｅｍを参照されたい）およびＢＲＡＦ遺伝子（例えば、Ｂｏｋｅｍｅｙｅｒを参照されたい）における活性化突然変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、試料または対象は、ＥＧＦＲリガンドについての染色が実施される前にＲＡＳ野生型と決定されたものである。本明細書で使用される場合、「野生型ＲＡＳ」は、試料または対象が、少なくとも、ＥＧＦＲモノクローナル抗体療法に対する抵抗性を付与するＮＲＡＳおよびＫＲＡＳにおける突然変異（現在知られているか今後発見されるかを問わない）に関するＲＡＳ突然変異スクリーニングアッセイで陰性の試験結果を示していることを意味するものとする。一実施形態では、ＲＡＳ突然変異スクリーニングアッセイは、ＮＲＡＳの少なくともコドン１２および１３ならびにＫＲＡＳのコドン１２および１３における活性化突然変異の存在または非存在を決定することを含み、試料または対象がＮＲＡＳのコドン１２および１３ならびにＫＲＡＳのコドン１２および１３の各々の活性化突然変異を含んでいなければ、試料は「ＲＡＳ野生型」とみなされる。別の実施形態では、ＲＡＳ突然変異スクリーニングアッセイは、ＮＲＡＳの少なくともコドン１２、１３、５９、６１、１１７、および１４６ならびにＫＲＡＳのコドン１２、１３、５９、６１、１１７、および１４６における活性化突然変異の存在または非存在を決定することを含み、試料または対象がＮＲＡＳのコドン１２、１３、５９、６１、１１７、および１４６ならびにＫＲＡＳのコドン１２、１３、５９、６１、１１７、および１４６の各々の活性化突然変異を含んでおらず、野生型ＲＡＳステータスを有すると決定されれば、試料は「ＲＡＳ野生型」とみなされる。Ｒａｓ突然変異ステータスについてのスクリーニングは、組織試料の取得元となった対象と同じ対象の腫瘍および血液試料に由来する組織試料を含め、対象由来の種々の異なるタイプの試料に対して実施され得る。Ｒａｓ突然変異ステータスについてスクリーニングするための多くの異なる方法が知られており、これには、配列決定、パイロシークエンシング、リアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲ、配列決定を伴う制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、対立遺伝子特異的増幅変異検出系（ＡＲＭＳ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ）、または配列決定を伴うＣＯＬＤ－ＰＣＲ（低変性温度ＰＣＲでの共増幅：ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｔ ｌｏｗｅｒ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ＰＣＲ）に基づく方法が含まれる。Ｒａｓ突然変異についてスクリーニングする例示的な方法の他の特定のものとしては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に依存する血液ベースのスクリーニング方法（例えば、Ｓｃｈｍｉｅｇｅｌら、Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．、第１１巻、第２号、２０８～１９ページ（２０１７年２月）を参照されたい（ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳのエクソン２、３、および４に関するエマルションデジタルＰＣＲベースのアッセイを循環セルフリーＤＮＡアッセイに適用することによる突然変異についてのスクリーニング））、ならびに、サンガー配列決定、超並列配列決定（パイロシークエンシング、循環可逆的終結、半導体配列決定、またはホスホ結合蛍光性ヌクレオチド技術に基づく配列決定方法論を含む）、またはＰＣＲベースのアッセイ（定量的ＰＣＲおよびデジタルＰＣＲを含む）を使用した、腫瘍組織試料中のＫＲＡＳおよびＮＲＡＳのエクソン２、３、および４における突然変異についてのスクリーニングのような、組織ベースの方法。本開示は、Ｒａｓ突然変異ステータスについてのスクリーニングに関して、いずれか特定の方法に限定されるものではない。

【0080】

Ｂ３．側性

【0081】

いくつかの実施形態では、結腸直腸腫瘍の側性が染色の前に決定される。結腸直腸腫瘍は、右側腫瘍（盲腸から脾弯曲部に生じる腫瘍）と左側腫瘍（脾弯曲部から直腸に生じる腫瘍）とに分けることができる。実施例に示されるように、本スコアリング方法は、左側腫瘍および右側腫瘍の両方において有用である。腫瘍の右側性は、典型的には、ＥＧＦＲ指向性治療剤に対する応答の負の予測因子であることに留意すべきである（例えば、Ｔｅｊｐａｒを参照されたい）。しかしながら、本実施例に示されるように、本スコアリング方法は、左側腫瘍および右側腫瘍の両方における応答を予測するのに有用である。

【0082】

Ｂ４．ＥＧＦＲステータス

【0083】

いくつかの実施形態では、腫瘍のＥＧＦＲステータスが決定される。ＥＧＦＲステータスを決定する任意の方法（現在知られているか将来開発されるかを問わない）が使用され得る。特定例では、ＥＧＦＲステータスは、免疫組織化学（ＩＨＣ）または免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって決定される。完全長ヒトＥＧＦＲのカノニカルなアミノ酸配列を配列番号１に示す。当業者には理解されるように、正確なアミノ酸配列は対象ごとに異なり得る。一実施形態では、ＩＨＣアッセイまたはＩＣＣアッセイは、配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合することができる抗体を用いて行われる。ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体の非限定的な例を表１に記載する。

【表1】

一実施形態では、ＥＧＦＲバイオマーカー特異的試薬は、ＥＧＦＲの細胞内ドメインに対するモノクローナル抗体である。別の実施形態では、ＥＧＦＲバイオマーカー特異的試薬は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体である。別の実施形態では、ＥＧＦＲバイオマーカー特異的試薬は、完全長ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体との両方を認識するモノクローナル抗体である。

【0084】

Ｃ．ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ組織化学的および細胞化学的染色

【0085】

ＥＲＥＧおよびＡＲＥＧの標識は、標的バイオマーカーとバイオマーカー特異的試薬との間の特異的結合を容易にする条件下で組織切片または細胞学的調製物をバイオマーカー特異的試薬と接触させることによって達成され得る。次に、この試料を、バイオマーカー特異的試薬と相互作用する検出試薬のセットと接触させて、試料における標的バイオマーカーの近傍での検出可能な部分の付着を容易にし、それによって標的バイオマーカーに局在化した検出可能なシグナルを生成する。任意に、バイオマーカー染色試料を造影剤（ヘマトキシリン染色剤など）で更に染色して、高分子構造を可視化してもよい。

【0086】

本明細書で開示される組織化学的および細胞化学的染色法は、バイオマーカー特異的試薬と、試料によって発現されるバイオマーカーとの間の特異的結合を支持する条件下で、結腸直腸腫瘍の組織切片または細胞学的調製物を、ヒトＥＲＥＧタンパク質およびヒトＡＲＥＧタンパク質のための１つまたは複数のバイオマーカー特異的試薬と接触させることを含む。ＥＲＥＧおよびＡＲＥＧは、まずプロペプチドとして発現され、これは細胞表面で切断されて活性シグナル伝達ドメインを遊離させる。ヒトＥＲＥＧおよびＡＲＥＧ（およびそれらのプロペプチド）のカノニカルなアミノ酸配列を、表２に記載する。当業者には理解されるように、正確なアミノ酸配列は対象ごとに異なり得る。

【表2】

【0087】

一実施形態では、ヒトＥＲＥＧタンパク質に対するバイオマーカー特異的試薬は、配列番号２を含むポリペプチドに特異的に結合することができるバイオマーカー特異的試薬である。一実施形態では、ヒトＡＲＥＧタンパク質に対するバイオマーカー特異的試薬は、配列番号３を含むポリペプチドに特異的に結合することができるバイオマーカー特異的試薬である。

【0088】

一実施形態では、ＥＲＥＧバイオマーカー特異的試薬は抗体である。ＥＲＥＧ特異的抗体の非限定的な例を表３に記載する。

【表3】

【0089】

一実施形態では、ＥＲＥＧバイオマーカー特異的試薬は、表３から選択されるモノクローナル抗体である。

【0090】

一実施形態では、ＡＲＥＧバイオマーカー特異的試薬は抗体である。ＡＲＥＧ特異的抗体の非限定的な例を表４に記載する。

【表4】

【0091】

一実施形態では、ＡＲＥＧバイオマーカー特異的試薬は、表４から選択される。

【0092】

試料に結合した後、検出試薬のセットを用いてバイオマーカー特異的試薬を可視化する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、顕微鏡法、例えば明視野顕微鏡法と適合性である染色剤（または検出可能な部分）を付着させる。

【0093】

いくつかの実施形態では、発色団または検出可能な部分の共有結合的付着は、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を用いて達成され、これは触媒レポーター付着（ＣＡＲＤ）とも呼ばれている。開示が参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第５，５８３，００１号は、検出可能な標識シグナルを増幅するために触媒レポーター付着に依存する分析物依存性酵素活性化システムを使用して分析物を検出および／または定量する方法を開示している。ＣＡＲＤ法またはＴＳＡ法における酵素の触媒作用は、標識フェノール分子を酵素と反応させることによって増強される。ＴＳＡを利用する現代の方法は、有意なバックグラウンドシグナル増幅をもたらさずに、ＩＨＣアッセイおよびＩＳＨアッセイから得られるシグナルを効果的に増加させる（例えば、チラミド増幅試薬に関する開示についてその全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２／０１７１６６８号を参照されたい）。これらの増幅アプローチのための試薬は、以前は達成できなかった堅牢な診断能力を提供するために臨床的に重要な標的に適用されている（ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ、カタログ番号７６０－０９９）。

【0094】

他の実施形態では、発色団または検出可能な部分の共有結合的付着は、キノンメチド化学を用いて行われる。２０１９年１月１日に交付された「Ｑｕｉｎｏｎｅ Ｍｅｔｈｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許第１０，１６８，３３６号は、ＴＳＡのように、バックグラウンドシグナルを有意に増加させることなくシグナル増幅を増加させるために使用され得る技術（「ＱＭＳＡ」）を記載している。特に、開示が参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第１０，１６８，３３６号は、新規なキノンメチドアナログ前駆体、およびキノンメチドアナログ前駆体を使用して生体試料中の１つまたは複数の標的を検出する方法を記載している。特定の実施形態では、検出方法は、試料を検出抗体またはプローブと接触させること、次いで試料を、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）酵素および結合部分を含む標識コンジュゲートと接触させることを含み、結合部分は抗体またはプローブを認識する（例えば、ハプテンもしくは種特異的抗体エピトープ、またはそれらの組合せに結合することによって）。標識コンジュゲートのアルカリホスファターゼ酵素は、検出可能な部分を含むキノンメチドアナログ前駆体と相互作用し、それによって反応性キノンメチドアナログを形成し、これは標的の近位にまたは直接的に生体試料に共有結合する。次いで、検出可能な標識は、視覚的にまたは画像化技術などによって検出される。

【0095】

検出可能な部分を付着させるための別の技術は、「クリック」ケミストリーを用いて、試料中の検出可能な部分と形態学的マーカーまたはバイオマーカーとの間に共有結合を形成する。「クリックケミストリー」は、ＳｈａｒｐｌｅｓｓおよびＭｅｌｄａｌのグループによって独自に定義された化学哲学であり、小さなユニットを結合することによって物質を迅速かつ確実に生成するように調整された化学を説明する。「クリックケミストリー」は、信頼性が高く自律的な有機反応のコレクションに適用されている（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．；Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００１，４０，２００４－２０２１）。検出可能な標識を生体試料上に共有結合的に付着させる文脈において、クリックケミストリー技術は米国特許出願公開第２０１９／０２０４３３０号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。この技術では、上記のチラミド付着または同じく上記のキノンメチド付着のいずれかを使用して、クリックケミストリー反応に関与することができる第１の反応基を生体試料に共有結合的に固定する。次いで、クリックケミストリー反応に関与することができる対応する第２の反応基を有する検出系の第２の成分を第１の反応基と反応させて、第２の成分を生体試料に共有結合させる。特定の実施形態では、記載される技術は、生体試料を第１の標的に特異的な第１の検出プローブと接触させることを含む。第１の検出プローブは、一次抗体または核酸プローブであり得る。続いて、試料を、第１の酵素を含む第１の標識コンジュゲートと接触させる。いくつかの実施形態では、第１の標識コンジュゲートは、一次抗体（抗体の取得元となった種など）または核酸プローブにコンジュゲートされた標識（ハプテンなど）のいずれかに特異的な二次抗体である。次に、生体試料をクリックコンジュゲートのペアの第１のメンバーと接触させる。第１の酵素は、チラミドまたはキノンメチド前駆体を有するクリックコンジュゲートのペアの第１のメンバーを切断し、それにより、第１のメンバーを、第１の標的の近位にまたは直接的に生体試料に共有結合する反応性中間体に変換する。次に、クリックコンジュゲートのペアの第２のメンバーを生体試料と接触させ、クリックコンジュゲートのペアの第２のメンバーは、第１のレポーター部分（例えば発色団）および第２の反応性官能基を含み、クリックコンジュゲートの第１のペアの第２のメンバーの第２の反応性官能基は、クリックコンジュゲートのペアの第１のメンバーの第１の反応性官能基と反応することができる。最後に、第１のレポーター部分からのシグナルが検出される。

【0096】

本発明の方法において有用な検出試薬を含む市販の検出試薬またはキットの非限定的な例として、以下が挙げられる：各々Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚｏｎａ）から入手可能である、ＶＥＮＴＡＮＡ ｕｌｔｒａＶｉｅｗ検出系（ＨＲＰおよびＡＰを含む酵素にコンジュゲートしている二次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ ｉＶＩＥＷ検出系（ビオチン化抗種二次抗体およびストレプトアビジン－コンジュゲート酵素）；ＯｐｔｉＶｉｅｗ検出系（ハプテンにコンジュゲートしている抗種二次抗体および酵素多量体にコンジュゲートしている抗ハプテン三次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ増幅キット（一次抗体結合部位に付着する酵素の数を増幅させるために前述のＶＥＮＴＡＮＡ検出系のいずれでも使用することができる非コンジュゲート二次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ増幅系（ハプテンにコンジュゲートしている抗種二次抗体、酵素多量体にコンジュゲートしている抗ハプテン三次抗体、および同じハプテンにコンジュゲートしているチラミド）；ＶＥＮＴＡＮＡ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（例えばＤＩＳＣＯＶＥＲＹイエローキット、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルキット、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹシルバーキット、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹレッドキット、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹローダミンキットなど）ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＯｍｎｉＭａｐ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＵｌｔｒａＭａｐ抗ハプテン抗体、二次抗体、色素原、フルオロフォア、および色素キット；ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎおよびＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ＋ＩＨＣ検出系（二次抗体がＨＲＰまたはＡＰと直接重合して、抗体に対して高い比率の酵素を有する緻密なポリマーになったもの）；ならびにＤＡＫＯ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）＋Ｓｙｓｔｅｍ（二次抗体にコンジュゲートしている酵素標識ポリマー）。

【0097】

本明細書における組織化学的または細胞化学的方法は、自動化染色機（または他のスライド処理機）で実施されてもよく、手作業で実施されてもよく、または自動化工程と手作業工程との組合せを特徴としてもよい。一実施形態では、本明細書に記載される組織化学的および細胞化学的染色法は、自動化ＩＨＣ染色デバイスで実施される。自動化ＩＨＣ染色デバイスの特定例としては、次のものが挙げられる：ｉｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）、ＷＡＶＥ（Ｃｅｌｅｒｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳおよびＤＡＫＯ ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ ＬＩＮＫ ４８（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ ＵＬＴＲＡ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ ＧＸ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＵＬＴＲＡ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ、ならびにＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。自動化ＩＨＣ染色デバイスは、全体が参照により本明細書に援用されるＰｒｉｃｈａｒｄ、Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ．、第１３８巻、１５７８～１５８２ページ（２０１４年）にも記載されている。更に、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、米国特許第５，６５０，３２７号、同第５，６５４，２００号、同第６，２９６，８０９号、同第６，３５２，８６１号、同第６，８２７，９０１号、および同第６，９４３，０２９号、ならびに米国公開特許出願第２００３０２１１６３０号および同第２００４００５２６８５号を含め、自動化された解析を実施するためのシステムおよび方法を開示するいくつかの米国特許の譲受人であり、これらは各々、その全体が参照により本明細書に援用される。本開示の方法は、任意の適切な自動化ＩＨＣ染色デバイスで実施されるように適合され得る。

【0098】

本開示は、自動化システムの使用に限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組織化学的標識方法は、手作業で適用される。または、特定の工程を手作業で実施し、他の工程を自動化システムで実施してもよい。

【0099】

所望であれば、形態学的に関連性のあるエリアの識別を補助するため、かつ／または関心領域（ＲＯＩ）を識別するために、バイオマーカー染色スライドを対比染色してもよい。対比染色剤の例としては、色素原性核対比染色剤、例えば、ヘマトキシリン（青色から紫色に染色する）、メチレンブルー（青色に染色する）、トルイジンブルー（核を濃青色に、多糖類をピンク色から赤色に染色する）、核ファストレッド（ケルンエヒトロート色素とも呼ばれ、赤色に染色する）、およびメチルグリーン（緑色に染色する）；非核色素原性染色剤、例えばエオシン（ピンク色に染色する）；４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、青色に染色する）、ヨウ化プロピジウム（赤色に染色する）、ヘキスト染色剤（青色に染色する）、核グリーンＤＣＳ１（緑色に染色する）、核イエロー（ヘキストＳ７６９１２１は、中性ｐＨ下では黄色に染色し、酸性ｐＨ下では青色に染色する）、ＤＲＡＱ５（赤色に染色する）、ＤＲＡＱ７（赤色に染色する）を含む蛍光性核染色剤；蛍光性非核染色剤、例えばフルオロフォア標識ファロイジン（線維状アクチンを染色する、色はコンジュゲートフルオロフォアに依存する）；ワンギーソン（ワンギーソン染色剤は、コラーゲンと他の結合組織、例えば筋組織との間の相違を強調するために使用される染色剤である）；アルシアンブルー（アルシアンブルーは、グリコサミノグリカンおよび酸性ムチンなどの物質に特異性を与え（水中でアルシアンブルー８Ｇ吸光度最大６１５ｎｍ）、酸性ムチンおよび粘膜物質を青色に、対比染色剤ニュートラルレッドを使用する場合は核を赤みがかったピンク色にさせるフタロシアニン色素である）；ワイゲルトのレゾルシンフクシン（ワイゲルトの弾性）（このタイプの染色剤は、弾性繊維を着色するために使用される。これにより、それらは青黒色に染色され、核は薄青黒色になり、コラーゲンはピンク色または赤色になり、他の組織は黄色になる）が挙げられる。

【0100】

いくつかの実施形態では、対比染色剤は、以下から選択される：酸フクシン（Ｃ．Ｉ．４２６８５；吸光度最大５４６ｎｍ）、アルシアンブルー８ＧＸ（Ｃ．Ｉ．７４２４０；吸光度最大６１５ｎｍ）、アリザリンレッドＳ（Ｃ．Ｉ．５８００５；吸光度最大５５６および５９６ｎｍ）、オーラミンＯ（Ｃ．Ｉ．４１０００；吸光度最大３７０および４３２ｎｍ）、アゾカルミンＢ（Ｃ．Ｉ．５００９０；吸光度最大５１６ｎｍ）、アゾカルミンＧ（Ｃ．Ｉ．５００８５；吸光度最大５１１ｎｍ）、アズールＡ（Ｃ．Ｉ．５２００５；アズールＢと同様の吸光度）、アズールＢ（Ｃ．Ｉ．５２０１０；吸光度最大６３９ｎｍ）、塩基性フクシン（Ｃ．Ｉ．４２５１０；吸光度最大５４７～５５２ｎｍ）、ビスマルクブラウンＹ（Ｃ．Ｉ．２１０００；吸光度最大６４３ｎｍ）、ブリリアントクレシルブルー（Ｃ．Ｉ．５１０１０；吸光度最大６２２ｎｍ）、カルミン（Ｃ．Ｉ．７５４７０；吸光度最大プロトン化４９０～４９５、塩基中および金属塩と組み合わせた場合に増加）、クロラゾールブラックＥ（Ｃ．Ｉ．３０２３５；吸光度最大５００～５０４ｎｍおよび５７４～６０２ｎｍ）、コンゴーレッド（Ｃ．Ｉ．２２１２０；吸光度最大４９７ｎｍ）、クレシルバイオレット（吸光度最大５９６～６０１ｎｍ）、クリスタルバイオレット（Ｃ．Ｉ．４２５５５；吸光度最大５９０ｎｍ）、ダローレッド（吸光度最大５０２ｎｍ）、エチルグリーン（Ｃ．Ｉ．４２５９０；吸光度最大６３５ｎｍ４２０ｎｍ）、ファストグリーンＦＣＦ（Ｃ．Ｉ．４２０５３；吸光度最大６２４ｎｍ、ｐＨ依存性）、ギムザ染色剤（不純なアズールＢ、メチレンブルーおよびエオシンＹの混合物）、インジゴカルミン（Ｃ．Ｉ．７３０１５；吸光度最大６０８ｎｍ）、ヤヌスグリーンＢ（Ｃ．Ｉ．１１０５０；吸光度最大６３０ｎｍ）、ジェンナー染色剤１８９９、ライトグリーンＳＦ（Ｃ．Ｉ．４２０９５；吸光度最大４２２および６３０ｎｍ）、マラカイトグリーン（Ｃ．Ｉ．４２０００；吸光度最大６１４および４２５ｎｍ）、マルチウスイエロー（Ｃ．Ｉ．１０３１５；吸光度最大４２０～４３２ｎｍ）、メチルオレンジ（Ｃ．Ｉ．１３０２５；吸光度最大５０７ｎｍ）、メチルバイオレット２Ｂ（Ｃ．Ｉ．４２５３５；吸光度最大５８３～５８７ｎｍ）、メチレンブルー（Ｃ．Ｉ．５２０１５；吸光度最大６５６～６６１ｎｍ）、メチレンバイオレット（ベルントゼン）、（Ｃ．Ｉ．５２０４１；吸光度最大５８０～６０１ｎｍ）、ニュートラルレッド（Ｃ．Ｉ．５００４０；ｐＨおよび溶媒に応じた吸光度最大４５４、５２９、５４１ｎｍ）、ニグロシン（Ｃ．Ｉ．５０４２０；吸光度最大５７０～５８０ｎｍ）、ナイルブルーＡ（Ｃ．Ｉ．５１１８０；吸光度最大６３３～６６０ｎｍ）、核ファストレッド（Ｃ．Ｉ．６０７６０；吸光度最大５３５および５０５ｎｍ）、オイルレッドＯ（Ｃ．Ｉ．２６１２５；吸光度最大５１８および３５９ｎｍ）、オレンジＧ（Ｃ．Ｉ．１６２３０；吸光度最大４７５ｎｍ）、オレンジＩＩ（Ｃ．Ｉ．１５５１０；吸光度最大４８３ｎｍ）、オルセイン（吸光度最大５７５～５９０ｐＨ依存性、パラローズアニリン（Ｃ．Ｉ．４２５００；吸光度最大５４５ｎｍ）、フロキシンＢ（Ｃ．Ｉ．４５４１０；吸光度最大５４８および５１０ｎｍ）、ピロニンＢ（Ｃ．Ｉ．４５０１０；ピロニンＹと密接に関連）、ピロニンＹ（Ｃ．Ｉ．４５００５；吸光度最大５４６～５４９ｎｍ）、レサズリン（吸光度最大水中で５９８ｎｍ、メタノール中で４７８）、ローズベンガル（Ｃ．Ｉ．４５４３５；吸光度最大５４６ｎｍ）、サフラニンＯ（Ｃ．Ｉ．５０２４０；吸光度最大５３０ｎｍ）、ズダンブラックＢ（Ｃ．Ｉ．２６１５０；吸光度最大５９８ｎｍおよび４１５ｎｍ）、ズダンＩＩＩ（Ｃ．Ｉ．２６１００；吸光度最大５０３～５０７および５０３ｎｍ）、ズダンＩＶ（Ｃ．Ｉ．２６１０５；吸光度最大５２０ｎｍ）、テトラクローム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン（Ｃ．Ｉ．５２０００；吸光度最大５９８～６０２ｎｍ）、トルイジンブルー（Ｃ．Ｉ．５２０４０；吸光度最大６２６～６３０ｎｍ）、ワイゲルトのレゾルシンフクシン（最大吸光度５０８ｎｍ）、ライト染色、およびそれらの任意の組合せ。これらの例の各々において、「Ｃ．Ｉ．」は、Ｃｏｌｏｒ Ｉｎｄｅｘ（商標）を指す。Ｃｏｌｏｒ Ｉｎｄｅｘ（商標）は、その認識されている使用クラス、その色相およびシリアル番号（関連する着色剤タイプがＣｏｌｏｒ Ｉｎｄｅｘに登録されている時系列を単に反映している）によって市販品を記述する。この定義により、特定の製品を、必須の着色剤が同じ化学構成であり、その必須の着色剤が単一の化学反応または一連の反応から生じる他の製品と共に分類することが可能になる。

【0101】

ある特定の実施形態では、バイオマーカー染色切片の連続切片（またはバイオマーカー染色切片自体）が形態学的に染色され得る。基本的な形態学的染色技法は、多くの場合、第１の色素で核構造を染色し、第２の染色剤で細胞質構造を染色することに依存する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色剤ならびにＬｅｅ染色剤（メチレンブルーおよび塩基性フクシン）を含むがこれらに限定されない、多くの形態学的染色剤が知られている。市販のＨ＆Ｅステイナーの例としては、ＲｏｃｈｅによるＶＥＮＴＡＮＡ ＳＹＭＰＨＯＮＹ（個別スライドステイナー）およびＶＥＮＴＡＮＡ ＨＥ ６００（個別スライドステイナー）のＨ＆Ｅステイナー；Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＤａｋｏ ＣｏｖｅｒＳｔａｉｎｅｒ（バッチステイナー）；Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｎｕｓｓｌｏｃｈ ＧｍｂＨによるＬｅｉｃａ ＳＴ４０２０ Ｓｍａｌｌ Ｌｉｎｅａｒ Ｓｔａｉｎｅｒ（バッチステイナー）、Ｌｅｉｃａ ＳＴ５０２０ Ｍｕｌｔｉｓｔａｉｎｅｒ（バッチステイナー）、およびＬｅｉｃａ ＳＴ５０１０ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ＸＬシリーズ（バッチステイナー）のＨ＆Ｅステイナーが挙げられる。
ＩＩＩ．細胞定量

【0102】

本スコアリングアルゴリズムは、ＥＲＥＧ染色細胞（ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞）およびＡＲＥＧ染色細胞（ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞）の両方のパーセンテージの定量に基づく。陽性染色された細胞のパーセンテージは、手動でまたは自動化された方法によって決定され得る。

【0103】

手動の方法では、熟練したユーザ（病理学者など）は、染色された試料の拡大画像を観察し、それぞれのマーカーについて陽性に染色する視野内の細胞のパーセンテージを推定する。試料が組織切片である場合、当業者は、解析のために視野（ＦＯＶ）内の関心領域（ＲＯＩ）を識別してもよく（腫瘍辺縁を識別し、腫瘍辺縁内の細胞のみを評価するなど）、または単にＦＯＶ内のすべての細胞を評価してもよい。

【0104】

一実施形態では、自動化された定量化がデジタル病理システムで行われる。デジタル病理システムには、以下の２つの基本的な構成要素がある：（１）染色された試料のデジタル画像を生成するためのスキャニングシステム、および（２）画像内の特定の特徴を識別および定量化するための画像解析システム。本発明の方法の例示的なデジタル病理ワークフローでは、染色された試料は、染色プラットフォーム上でデジタル化され、次いで、画像解析システムによって解析されて、細胞の総数およびバイオマーカー染色細胞の総数に対応する画像内の特徴を識別および定量化する。次いで、それぞれのマーカーについて陽性に染色する細胞のパーセンテージを、これらの２つの値から導き出してもよい。これは、いくつかの異なる形態をとることができる。例えば、システムは、「細胞」に対応する画像内のオブジェクトを識別し、次いで、陽性バイオマーカー染色を示す適切な染色パターンを含む細胞の数を識別し得る。あるいは、システムは、画像の領域および陽性バイオマーカー染色と相関するその領域のパーセンテージを計算することができる。さらに別の実施形態では、システムは、細胞膜に対応する画像のすべての領域を識別し、陽性バイオマーカー染色に対応するその領域のパーセンテージを計算することができる。多くの他の構成を想像または使用することができる。手動および自動の両方の方法のアウトプットは、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージである。

【0105】

デジタル病理用途のための様々なスキャナ（蛍光および明視野の両方）の詳細な概要は、Ｆａｒａｈａｎｉら、Ｗｈｏｌｅ ｓｌｉｄｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｔ’ｌ、第７巻、２３～３３ページ（２０１５年６月）に見出すことができ、その内容は参照によりその全体が援用される。市販のスライドスキャナの例としては、次のものが挙げられる：３ＤＨｉｓｔｅｃｈ ＰＡＮＮＯＲＡＭＩＣ ＳＣＡＮ ＩＩ；ＤｉｇｉＰａｔｈ ＰＡＴＨＳＣＯＰＥ；Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＮＡＮＯＺＯＯＭＥＲ ＲＳ、ＨＴ、およびＸＲ；Ｈｕｒｏｎ ＴＩＳＳＵＥＳＣＯＰＥ ４０００、４０００ＸＴ、およびＨＳ；Ｌｅｉｃａ ＳＣＡＮＳＣＯＰＥ ＡＴ、ＡＴ２、ＣＳ、ＦＬ、およびＳＣＮ４００；Ｍｉｋｒｏｓｃａｎ Ｄ２；Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０－ＳＬ；Ｏｍｎｙｘ ＶＬ４、およびＶＬ１２０；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＭＩＮＡ；Ｐｈｉｌｉｐｓ ＵＬＴＲＡ－ＦＡＳＴ ＳＣＡＮＮＥＲ；Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＶＩＳＩＯＮＴＥＫ；Ｕｎｉｃ ＰＲＥＣＩＣＥ ５００、およびＰＲＥＣＩＣＥ ６００ｘ；ＶＥＮＴＡＮＡ ＩＳＣＡＮ ＣＯＲＥＯおよびＩＳＣＡＮ ＨＴ；ならびにＺｅｉｓｓ ＡＸＩＯ ＳＣＡＮ．Ｚ１。他の例示的なシステムおよび特徴は、例えば、ＷＯ２０１１－０４９６０８、または、２０１１年９月９日に出願され、ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡＳＳＥＴＴＥＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥと題する米国特許出願第６１／５３３，１１４号に見出すことができ、これらの内容は、その全体が参照により援用される。

【0106】

本明細書で開示される自動化された方法を実施するのに有用である例示的な市販の画像解析ソフトウェアパッケージとしては、ＶＥＮＴＡＮＡ ＶＩＲＴＵＯＳＯソフトウェアスイート（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；ＴＩＳＳＵＥ ＳＴＵＤＩＯ、ＤＥＶＥＬＯＰＥＲ ＸＤ、およびＩＭＡＧＥ ＭＩＮＥＲソフトウェアスイート（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ）；ＢＩＯＴＯＰＩＸ、ＯＮＣＯＴＯＰＩＸ、およびＳＴＥＲＥＯＴＯＰＩＸソフトウェアスイート（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ）；ならびにＨＡＬＯプラットフォーム（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。
ＩＶ．処置選択

【0107】

処置レジメンは、ＥＲＥＧ染色細胞（ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞）およびＡＲＥＧ染色細胞（ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞）の両方のパーセンテージを所定のカットオフと比較することによって選択される。

【0108】

使用される所定のカットオフは、患者がＥＧＦＲ指向性療法に対して陽性の応答を有する尤度を示し得るか、または患者がＥＧＦＲ指向性療法に対して陰性の応答を有する尤度を示すカットオフであり得る。本明細書で使用される場合、「ＥＧＦＲ指向性療法に対する陽性の応答」は、カットオフが、ＥＧＦＲ指向性療法による処置後の少なくとも１つの全生存および無増悪生存の改善に関連することを意味する。本明細書で使用される場合、「ＥＧＦＲ指向性療法に対する陰性の応答」は、カットオフが、ＥＧＦＲ指向性療法による処置後の少なくとも１つの全生存および無増悪生存の悪化に関連することを意味する。

【0109】

一実施形態では、ＥＧＦＲ指向性治療剤に対する陽性の応答に関連するカットオフが使用される。ＥＲＥＧおよびＡＲＥＧについて別々のカットオフを開発し、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージをＥＲＥＧ特異的カットオフと比較し、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージをＡＲＥＧ特異的カットオフと比較する。患者は、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージがＥＲＥＧについての所定のカットオフを超えるか、またはＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージがＡＲＥＧについての所定のカットオフを超えるかのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性療法を受けるように選択される。

【0110】

一実施形態では、ＥＧＦＲ指向性治療剤に対する陰性の応答に関連するカットオフが使用される。ＥＲＥＧおよびＡＲＥＧについて別々のカットオフを開発し、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージをＥＲＥＧ特異的カットオフと比較し、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージをＡＲＥＧ特異的カットオフと比較する。患者は、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージがＥＲＥＧについての所定のカットオフを超えるか、またはＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージがＡＲＥＧについての所定のカットオフを超えるかのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性療法を受けるように選択される。ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージの両方がそれぞれの所定のカットオフを下回る場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない治療コースが患者に選択される。

【0111】

別の実施形態では、各マーカーに対して以下の２つのカットオフが使用される：（ａ）ＥＧＦＲ指向性治療剤に対する陽性の応答に関連するカットオフ（「陽性カットオフ」）、および（ｂ）ＥＧＦＲ指向性治療剤に対する陰性の応答に関連するカットオフ（「陰性カットオフ」）。ＥＲＥＧおよびＡＲＥＧについて別々のカットオフを開発し、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを陽性ＥＲＥＧ特異的カットオフおよび陰性ＥＲＥＧ特異的カットオフの両方と比較し、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを陽性ＡＲＥＧ特異的カットオフおよび陰性ＡＲＥＧ特異的カットオフの両方と比較する。処置選択は表５に示す通りである。

【表5】

例示的な他の因子としては、ミスマッチ修復欠損腫瘍に対する免疫療法、右側原発を有する患者に対する血管新生阻害剤、ならびにＢＲＡＦ突然変異腫瘍に対するＢＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤の利用可能性および有効性が挙げられる。

【0112】

一実施形態では、抗ＥＧＦＲ治療剤はＥＧＦＲ抗体である。これらの療法は、典型的には、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する抗体または抗体断片に依存する。一実施形態では、ＥＧＦＲ抗体ベースの療法は、セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む。

【0113】

一実施形態では、ＥＧＦＲ指向性治療剤は、ステージＩＩＩ結腸直腸腫瘍を有するＲＡＳ野生型対象のための処置レジメンに組み込まれる。このステージでは、腫瘍の外科的除去または部分的な結腸切除（付近のリンパ節の除去を含む）に続いてアジュバント化学療法および／または放射線療法が実施されるのが一般的だが、ある特定の患者に対しては手術なしで化学療法が（任意に放射線療法と組み合わせて）使用され得る。このステージで使用される非限定的な併用療法には、ＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵ、ロイコボリン、およびオキサリプラチン）またはＣａｐｅＯｘ（カペシタビンおよびオキサリプラチン）が含まれる。１つの特定の非限定的な実施形態では、ステージＩＩＩ結腸直腸癌を処置する方法は、以下を含み得る：
・ＥＧＦＲ指向性治療剤を受けるように選択された患者に対して：ＥＧＦＲ抗体ベースの療法を、任意に、フルオロピリミジンベースの化学療法またはフルオロピリミジンベースの併用化学療法（ＦＯＬＦＯＸまたはＣａｐｅＯｘなど）と組み合わせて投与すること、または
・ＥＧＦＲ指向性治療剤を受けないように選択された患者に対して：ＥＧＦＲ抗体ベースのものを含まない療法コースを投与すること。

【0114】

別の実施形態では、ＥＧＦＲ指向性治療剤は、ステージＩＶ結腸直腸腫瘍を有するＲＡＳ野生型対象のための処置レジメンに組み込まれる。ステージＩＶ結腸直腸腫瘍のための治療レジメンは、典型的には、腫瘍の外科的除去または部分的な結腸切除（付近のリンパ節の除去を含む）および転移（可能な場合）ならびにアジュバントもしくはネオアジュバント化学療法および／または放射線療法を含む。腫瘍の外科的除去または部分的な結腸切除（付近のリンパ節の除去を含む）および転移（可能な場合）、ならびに化学療法および／または放射線療法は、典型的にはこのステージで実施される。一般的な化学療法には、ロイコボリンならびに／または他の化学療法および／もしくは標的療法と任意に組み合わせたフルオロピリミジンベースの化学療法が含まれる。このステージで使用される非限定的な併用療法としては、次のものが挙げられる：
・ＦＯＬＦＯＸ：ロイコボリン、５－ＦＵ、およびオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）；
・ＦＯＬＦＩＲＩ：ロイコボリン、５－ＦＵ、およびイリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）；
・ＣａｐｅＯＸ：カペシタビン（ゼローダ）およびオキサリプラチン；
・ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ：ロイコボリン、５－ＦＵ、オキサリプラチン、およびイリノテカン；
・上記の組合せのうちの１つに加え、ＶＥＧＦを標的とする薬物（ベバシズマブ［アバスチン］、ｚｉｖ－アフリベルセプト［ＺＡＬＴＲＡＰ］、またはラムシルマブ［ＣＹＲＡＭＺＡ］など）、またはＥＧＦＲを標的とする薬物（セツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ］またはパニツムマブ［ＶＥＣＴＩＢＩＸ］など）のいずれか；
・標的薬物の有無を問わず、５－ＦＵおよびロイコボリン；
・標的薬物の有無を問わず、カペシタビン；
・標的薬物の有無を問わず、イリノテカン；
・セツキシマブ単独；
・パニツムマブ単独；
・レゴラフェニブ（ＳＴＩＶＡＲＧＡ）単独；ならびに
・トリフルリジンおよびチピラシル（ＬＯＮＳＵＲＦ）。
・１つの特定の非限定的な実施形態では、ステージＩＶ結腸直腸癌を処置する方法は、以下を含み得る：
・ＥＧＦＲ指向性治療剤を受けるように選択された対象に対して、ＥＧＦＲ抗体ベースの療法を、任意に、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＣａｐｅＯＸ、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ、５－ＦＵおよびロイコボリン、カペシタビン、イリノテカン、ならびにＶＥＧＦを標的とする薬物（例えば、ベバシズマブ、ｚｉｖ－アフリベルセプト、およびラムシルマブなど）からなる群から選択される１つまたは複数の追加の療法と組み合わせて投与すること、または
・ＥＧＦＲ指向性治療剤の投与を受けないように選択された対象に対して、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない療法コース（例えば、ＶＥＧＦを標的とする薬物、ＦＯＬＦＯＸ（ＶＥＧＦを標的とする薬物と任意に組み合わせられる）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ＶＥＧＦを標的とする薬物と任意に組み合わせられる）、ＣａｐｅＯＸ（ＶＥＧＦを標的とする薬物と任意に組み合わせられる）、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ（ＶＥＧＦを標的とする薬物と任意に組み合わせられる）、５－ＦＵおよびロイコボリン（ＶＥＧＦを標的とする薬物と任意に組み合わせられる）、カペシタビン（ＶＥＧＦを標的とする薬物と任意に組み合わせられる）、イリノテカン（ＶＥＧＦを標的とする薬物と任意に組み合わせられる）、レゴラフェニブ、またはトリフルリジンおよびチピラシル（ＶＥＧＦを標的とする薬物と任意に組み合わせられる））を投与すること。
Ｖ．実施例

【0115】

Ａ．患者、材料、および方法

【0116】

４６０例のＫＲＡＳｃ．１２、１３、５９～６１－ｗｔ患者を以前に第二選択のイリノテカン（Ｉｒ）対（ｖｓ）パニツムマブと併用したイリノテカン（ＩｒＰａｎ）に無作為化した。ＳｅｙｍｏｕｒらおよびＭｉｄｄｌｅｔｏｎらを参照されたい。現在の試験は、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧに対するＩＨＣが成功した（ｎ＝３１３）適切に保存された病理学的材料（４６０例中３２６例［７０．９％］の患者）（試験参加時に採取された組織）を有するすべての同意患者を含む。ＩＨＣが失敗し、反復解析に利用可能な腫瘍組織が不十分であった１３例が存在した。ＫＲＡＳｃ．１４６、ＮＲＡＳｃ．１２、１３、５９～６１、ＢＲＡＦｃ．１７９９Ｔ＞Ａについてのさらなる突然変異解析を以前に行った。一次解析は、ＫＲＡＳｃ．１２、１３、５９～６１、１４６およびＮＲＡＳｃ．１２、１３、５９～６１ｗｔ（「ＲＡＳ－ｗｔ」）であった患者で行った。

【0117】

各ＦＦＰＥブロックからの３つの厚さ４μｍの組織切片を、別個のＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ、Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、ＵＫ）上に切り出した。ＶＥＮＴＡＮＡ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＵＬＴＲＡ自動ステイナー（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）および予めプログラムされたプロトコルを使用して、１つの切片を抗ＡＲＥＧ（ＳＰ２７２）（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）で染色し、別の切片を抗ＥＲＥＧ（ＳＰ３２６）（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）ウサギモノクローナル抗体で染色した。第３の切片を、青味試薬としてマイヤーのヘマトキシリンおよびスコットの水道水代替物を使用して、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。スライドのデジタル画像を、ＶＥＮＴＡＮＡ ＤＰ２００スキャナを用いて２００倍の倍率で生成した。研究者らは、患者の処置割当て、突然変異プロファイル、および臨床アウトカムを知らされていなかった。

【0118】

ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧに対して陽性に染色された腫瘍細胞のパーセンテージを評価するためのＡＩアルゴリズムは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ；Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）によって開発された。アルゴリズムを検証するために、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧに対して染色した結腸直腸癌標本の社内開発コホートを使用して生成した３０枚のデジタルスライド画像から、腫瘍領域内の３０視野（ＦＯＶ）を最初にランダムに選択した。２名の病理学者が独立して、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧのそれぞれに対して陽性または陰性としてＦＯＶ内のすべての腫瘍細胞に注釈を付けた。４つの染色パターン：膜状、細胞質状、細胞膜状および点状が観察された。いずれか１つのこれらの染色パターンが見られた場合、腫瘍細胞を陽性とみなした。一致相関係数（ＣＣＣ）を使用して、病理学者間の一致およびアルゴリズム生成結果と病理学者生成結果との間の一致を評価した。全スライド画像を解析するために使用される場合のアルゴリズムを検証するために、ＡＩアルゴリズムＩＨＣの読出しを、ＰＩＣＣＯＬＯコホートからの腫瘍領域内のｑＲＴ－ＰＣＲ結果と相関させた。

【0119】

腫瘍領域に病理学者が注釈を付け、開発されたＡＩアルゴリズムをスライド全体に適用し、次いで腫瘍領域からデータを抽出した。ＡＩアルゴリズムは、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧのそれぞれについてＩＨＣ陽性腫瘍細胞のパーセンテージを決定した。サンプルを、ＩＨＣ陽性率によってＨｉｇｈ（ＡＲＥＧ ｈｉｇｈまたはＥＲＥＧ Ｈｉｇｈのいずれか）およびｌｏｗ（ＡＲＥＧ ｌｏｗおよびＥＲＥＧ ｌｏｗの両方）エクスプレッサーに二分した。Ｓｅｌｉｇｍａｎｎらによって感度および特異度の計算の基礎として報告された以前のｍＲＮＡ二分化を参照して、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ ＩＨＣカットポイント（各１％～１００％、したがって１００２＝１万の組合せ）のすべての可能な組合せについて受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。最大ヨーデン指標（Ｍａｘ_ｃ［感度_ｃ＋特異度_ｃ－１］、すなわち、感度と特異度の合計は、それぞれに等しい重み付けがされたときに最大であった）を計算して、ｍＲＮＡアッセイのものと最もよく整合したＩＨＣカットポイントを識別した。Ｙｏｕｄｅｎを参照されたい。これを、一次解析における検討のためのＩＨＣカットポイントを定義するために採用した。

【0120】

主要評価項目は無増悪生存（ＰＦＳ）であった。副次的評価項目は、全生存（ＯＳ）および固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）奏効率（ＲＲ）であった。ＰＦＳおよびＲＲデータは、一次ＰＩＣＣＯＬＯ試験解析から変化しなかったが、更新された２年ＯＳデータをこの解析で使用した。

【0121】

すべての統計解析にはＳｔａｔａを使用した（Ｓｔａｔａ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅｌｅａｓｅ １６［２０１９］；ＳｔａｔａＣｏｒｐ）。ベースライン患者特性を、両側ｔ検定、ウィルコクソン順位和検定（非正規分布度数分布を有する変数について）、およびピアソンχ^２検定（カテゴリ変数について）を用いて、処置群間（ＩｒＰａｎ対Ｉｒ）で比較した。患者特性を、同じ検定を使用して全試験集団と比較した。箱ひげ図およびウィルコクソン順位和検定を使用して、ＢＲＡＦ－ｗｔ症例と突然変異症例との間の連続ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ ＩＨＣ陽性率の分布、左（脾弯曲部から直腸）対右ＰＴＬ、および最後に腹膜転移の存在対非存在を比較した。

【0122】

リガンド発現（すなわち、ＩＨＣ陽性率）を、最初に、Ｃｏｘ比例ハザードモデルにおいて、二分分類子（高対低）および各リガンドを連続変数として別々に使用して、Ｉｒ単独で処置したすべての患者において予後マーカーとして評価した。ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧを連続変数として評価した場合、リガンド陽性率を１０倍に縮小して、ハザード比（ＨＲ）の解釈可能性を高めた。解析を最初に調整せずに実施し、次いで、世界保健機関のパフォーマンスステータス［ＷＨＯ ＰＳ］、以前の療法に対する応答、および以前の化学療法（あり対なし）について調整した。以前の療法に対する応答は３０例の患者では不明であり、これらの３０例の患者の値を補完するために多重補完を使用した。多重ロジスティック回帰を、２０の補完データセットに基づいて、以前の応答の予測因子として「以前のオキサリプラチン療法」および「以前の化学療法」を使用して行った。

【0123】

次いで、リガンド発現を、ＩＨＣリガンドステータス（ＡＲＥＧまたはＥＲＥＧのいずれか高い対ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧの両方低い）によって層別化し、処置効果（ＩｒＰａｎ対Ｉｒ）を評価し、尤度比検定を使用してリガンド－処置相互作用について検定する未調整Ｃｏｘ比例ハザードモデルにおいて、ＰＦＳおよびＯＳに対するパニツムマブ療法の利益の予測マーカーとして評価した。次いで、これらのモデルを、ＢＲＡＦ突然変異、ＰＴＬおよび腹膜転移の存在について別々に調整して繰り返し、リガンド－処置相互作用がこれらの可能性のある交絡因子についての調整後も持続したかどうかを決定した。未調整モデルをＲＡＳおよびＢＲＡＦ－ｗｔ群でも繰り返し、二分ＡＲＥＧおよび二分ＥＲＥＧも別々に考慮した（５０％カットポイント）。カプラン・マイヤー（ＫＭ）曲線をプロットした。一致確率は、ハレルのＣ指標を用いて評価した。

【0124】

ＲＲに対するＩｒＰａｎ対Ｉｒの効果に対する未調整リスク比を、二分リガンドＩＨＣによって層別化された一般化線形モデル（対数リンク付き）から推定した。次いで、リガンド－処置相互作用の尤度比検定を行った。

【0125】

Ｂ．結果

【0126】

このバイオマーカー試験の患者コホートと主試験集団との間に特性の有意差はなかった（データは示さず）。合計３１３例の患者のうち２７４例（８８％）がＲＡＳ－ｗｔであり、そのうち４９例（１８％）がＢＲＡＦ突然変異を有していた（図１）。２４２例（８８％）のＲＡＳ－ｗｔ患者が疾患進行事象を有し、２４８例（９１％）が死亡した。

【0127】

Ｂ１．アルゴリズム開発

【0128】

解析した３０個のＦＯＶのそれぞれにおける総腫瘍細胞数ならびにＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ ＩＨＣ陽性率を評価することについて、２名の独立した病理学者の間で強い一致があった。各病理学者のスコアはまた、ＡＩアルゴリズムの評価と高度に相関していた（図２）。

【0129】

Ｂ２．リガンド発現

【0130】

ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ ＩＨＣ陽性率は強く相関していた（スピアマン相関係数０．７７、Ｐ＜０．０００５）。ＩＨＣおよびｍＲＮＡの両方のデータが利用可能であった患者のサブセットの中で（３１３例の患者のうち１８６例［５９％］）、２つの測定値はリガンドのそれぞれについて正の相関があった（スピアマン相関係数：ＡＲＥＧ０．６４、Ｐ＜０．０００１；ＥＲＥＧ０．８０、Ｐ＜０．０００１）。

【0131】

一次解析のために、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ ＩＨＣ陽性率を、臨床適用への経路を助けるために、二分マーカー（いずれかのリガンドの高発現対両方の低発現）として事前に評価した。ＩＨＣおよびｍＲＮＡの両方のデータが利用可能であった場合、最大ヨーデン指標は０．５８１であり、これにより、ＡＲＥＧについては４７％のＩＨＣ陽性およびＥＲＥＧについては５２％の「高」カットポイント対「低」カットポイントが決定された。これらのカットポイントでの感度および特異度は、それぞれ０．７１６および０．８６５であった。これらのカットポイントの使用によって、試験サンプル（ｎ＝３１３）が１５９例（５０．８％）の高症例および１５４例（４９．２％）の低症例に分けられた。将来の実地臨床における手動のＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ解釈を容易にするために、今後の解析における両方のマーカーについて最適なカットポイントを５０％に丸めた。ＥＲＥＧ ＩＨＣ陽性率対ＡＲＥＧ ＩＨＣ陽性率の散布図を、５０％カットポイントを示す点線と共に図３に示す。高リガンド群および低リガンド群は、各処置群において患者の均一な分布を有していた。右側ＰＴＬ、ＢＲＡＦ突然変異ステータスおよび腹膜転移を有する患者は、高リガンド群よりも低リガンド群の方が有意に多かった（表６）。

【表6】

【0132】

Ｂ３．複合二分バイオマーカーとしてのＡＲＥＧ／ＥＲＥＧパフォーマンスス

【0133】

Ｉｒ単独で処置された患者または調整された解析において、ＰＦＳ（未調整ＨＲ、１．２２［９５％ＣＩ、０．８６～１．７５］；Ｐ＝０．２７）またはＯＳ（未調整ＨＲ、１．０１［９５％ＣＩ、０．７１～１．４３］；Ｐ＝０．９８）に対するＩＨＣリガンドステータス（高対低）の予後効果の証拠はなかった（表７）。

【表7】

【0134】

一次仮説は、高リガンドＩＨＣスコアがＲＡＳ－ｗｔ患者におけるパニツムマブのＰＦＳ利益を予測するであろうということであった。この仮説は、表８および図４に示すように、データによって支持された。

【表8】

【0135】

高リガンドＩＨＣ陽性を有するＲＡＳ－ｗｔ患者において、ＩｒＰａｎによるＰＦＳの中央値は、Ｉｒ単独での３．２ヶ月と比較して、８．０ヶ月であった（ＨＲ、０．５４［９５％ＣＩ、０．３７～０．７９］；Ｐ＝０．００１）。逆に、低リガンドＩＨＣ陽性を有する患者では、パニツムマブ療法からの利益はなかった（ＩｒＰａｎ対ＩｒのＰＦＳの中央値：３．４対４．４ヶ月；ＨＲ、１．０５［９５％ＣＩ、０．７４～１．４９］；ｐ＝０．７８）（表８、図４）。リガンド－処置相互作用は、未調整（ｐ＝０．０２）であろうと調整（ｐ＝０．０２）であろうと有意であった。ＯＳについての結果はさほど顕著ではなく（相互作用ｐ＝０．１９）、おそらく試験全体でパニツムマブのＯＳ効果が欠如していたためであった。ＲＡＳ－ｗｔ亜集団およびＢＲＡＦ－ｗｔ亜集団内では、効果サイズは類似していたが、サンプルサイズがより小さいために有意性は低かった（ＰＦＳ相互作用ｐ＝０．２１）（表８）。

【0136】

高リガンドＩＨＣ陽性を有するＲＡＳ－ｗｔ患者では、ＲＲがイリノテカンへのパニツムマブの追加によって有意に改善され（ＩｒＰａｎ対Ｉｒ：４８％対６％；リスク比、７．８［９５％ＣＩ、２．９０～２０．６９］；ｐ＜０．０００１）、一方、低リガンドＩＨＣ陽性を有する患者では、ＲＲは２つの処置群間で有意差を示さなかった（ＩｒＰａｎ対Ｉｒ：２５％対１４％；リスク比、１．８［９５％ＣＩ、０．８９～３．６５］；ｐ＝０．１０）（表９）。

【表9】

【0137】

Ｂ４．別々のバイオマーカーとしてのＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ

【0138】

二次解析として、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ ＩＨＣ陽性率を連続変数として別々に調べた。複合二分分類子の一次解析と同様に、ＡＲＥＧもＥＲＥＧも、連続変数としてのＰＦＳまたはＯＳの予後を示すものではなかった（表１０）。ＥＲＥＧは、パニツムマブによるＰＦＳの利益を予測するものであった（相互作用ｐ＝０．０１）。ＡＲＥＧについて同じ知見に向かう傾向が見られたが、リガンド－処置相互作用は有意性に達しなかった（相互作用ｐ＝０．０６）。ＡＲＥＧもＥＲＥＧも、パニツムマブ療法のＯＳ利益を予測するものではなかった（表１１）。

【表10】

【表11】

【0139】

Ｂ５．可能性のある交絡因子の効果

【0140】

ＢＲＡＦ突然変異、右側ＰＴＬおよび腹膜転移の存在が低リガンドＩＨＣ陽性と関連していたことを考慮して、ＲＡＳ－ｗｔ患者においてＰＦＳについて見られるリガンドレベルによる異なる処置効果が代わりにこれらの因子によって引き起こされるかどうかを検討した（表１２）。二分分類子は、ＢＲＡＦ（相互作用Ｐ＝０．０２）、ＰＴＬ（相互作用Ｐ＝０．０１）および腹膜転移（相互作用Ｐ＝０．０１）について調整した後も、パニツムマブ療法の利益の有意な予測因子のままであった。各リガンドを連続変数として別々に調べた場合、同様の結果が見られた。したがって、リガンド処置効果は、これらの潜在的な交絡因子とは無関係であると思われる。

【表12】

【0141】

結腸の右側（盲腸から脾弯曲部）に由来する腺癌は、より頻繁に、ＢＲＡＦ、ＰＴＥＮおよびＰＩＫ３ＣＡ突然変異、ならびにミスマッチ修復酵素欠損に関連する。ＣＲＹＳＴＡＬ（ＦＯＬＦＩＲＩ＋／－セツキシマブ）およびＰＲＩＭＥ（ＦＯＬＦＯＸ＋／－パニツムマブ）試験のレトロスペクティブ解析により、左側ＰＴＬを有するが右側ＰＴＬを有さないＲＡＳ－ｗｔ患者における抗ＥＧＦＲ剤からのＯＳ利益を実証して、腫瘍側性－そのような分子特性の代理としての－と抗ＥＧＦＲ療法との間の関係が広く調べられている。これらのデータは、全国の処置ガイドラインに情報を提供するために使用されており、ＮＣＣＮは、右側ＰＴＬ患者に第一選択の状況で抗ＥＧＦＲ剤を提供すべきではないと推奨している。ここで、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧタンパク質の発現は、右側ＰＴＬよりも左側ＰＴＬの方が高かった。しかしながら、本発明者らの二分分類子は、この因子の調整後もパニツムマブの利益の有意な予測因子のままであり、処置コースの初期に抗ＥＧＦＲ療法を適切に提供され得る右ＰＴＬ患者を識別することにおけるその潜在的な臨床的有用性を示している。

【0142】

Ｂ６．複合ＡＲＥＧ／ＥＲＥＧモデルの検討－代替カットポイント

【0143】

５０％ＩＨＣ陽性カットポイントは、以前に検証されたｍＲＮＡ発現ベースのアッセイで開発された中央／上部の三分位カットポイントと密接に整合しているため、選択した。調査目的のために、異なるカットポイントを使用したＰＦＳに対するパニツムマブの利益を調べた（表１３）。カットポイントを２０％に低下させることにより、実際にはパニツムマブの追加によりＰＦＳが有意に劣っており（ＨＲ、１．７３［９５％ＣＩ、１．０２～２．９５］；ｐ＝０．０４）、おそらくこの処置によって害された低リガンドＩＨＣ陽性率を有する患者が識別された。高リガンド群では、ＰＦＳに対するＩｒＰａｎ対ＩｒについてのＨＲは、２０％から５０％カットポイントまでの約０．５５のＨＲで顕著な利益を示した。リガンド－処置相互作用はこの範囲全体にわたって有意なままであり、異なる臨床シナリオで異なるカットポイントを使用する可能性を示している。さらに、カットポイントが２０％に低下したとき、化学療法へのパニツムマブの追加によって害されたと思われる非常に低いリガンドエクスプレッサーの群が識別された。

【表13】

【0144】

Ｂ７．生検と切除の比較

【0145】

試験サンプル内で、１９０（６１％）個の腫瘍標本を切除物から採取し、１２３（３９．３％）個の腫瘍標本を生検から採取した。本発明者らの二分モデルが、調べた腫瘍標本型に関係なく信頼性が高いままであることを確実にするために、本発明者らはまた、これらのサブグループを別々に解析した（表１４）。ＰＦＳに対する処置（ＩｒＰａｎ対Ｉｒ）の効果についてのＨＲは、切除を受けた患者ではパニツムマブの追加を支持したが（ＨＲ、０．６２［９５％ＣＩ、０．４４～０．８６］；ｐ＝０．００５）、生検のみを受けた患者では支持しなかった（ＨＲ、１．０６［９５％ＣＩ、０．７０～１．６２］；ｐ＝０．７８）。これはおそらく、これらの患者が、ルーチンの術後サーベイランス中に検出される疾患の再発ではなく、広く転移性の疾患を呈する可能性が高かったためである。とは言え、生検のみを受けた患者の中では、イリノテカンへのパニツムマブの追加が、低リガンドエクスプレッサーではなく高リガンドエクスプレッサーに利益をもたらし得ることを示唆する傾向が残っていた。リガンド－処置相互作用は、どちらの標本型についても有意性に達しなかったが、これはおそらく、このサブグループ解析におけるサンプルサイズがより小さいためである。

【表14】

参考文献
Ｂｏｋｅｍｅｙｅｒら、Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｔｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｓ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ＫＲＡＳ ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：Ｐｏｏｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＹＳＴＡＬ ａｎｄ ＯＰＵＳ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．（２０１２年）、４８（１０）、１４６６～１４７５ページ。
Ｄｏｕｉｌｌａｒｄら、Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ－ＦＯＬＦＯＸ４ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２０１３年）、３６９（１１）、１０２３～１０３４ページ。
Ｋａｒａｐｅｔｉｓら、Ｋ－ｒａｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｒｏｍ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２００８年）、３５９（１７）、１７５７～１７６５ページ。
Ｋｈｅｌｗａｔｔｙら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１７年１月３１日）；第８巻、第５号、７６６６～７６７７ページ。
Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｂｉｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ｕｓｉｎｇ ｏｒａｌ ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ＆ａｍｐ；Ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ ｉｎ ＣＯＬＯｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｉａｌ（ＰＩＣＣＯＬＯ）．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ（２０１３年）、第４９巻、第１６号、３５０７～３５１６ページ。
Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｂｅｙｏｎｄ ＫＲＡＳ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１５巻、第７号、１０４３～５２ページ（２０１４年）。
Ｐｒｉｏｒら、Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｒａｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１２年５月）、第７２巻、第１０号、２４５７～６７ページ。
Ｓｅｙｍｏｕｒら、Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ ａｎｄ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ｖｅｒｓｕｓ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ａｌｏｎｅ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＫＲＡＳ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（ＰＩＣＣＯＬＯ）：ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．（２０１３年）、第１４巻、第８号、７４９～７５９ページ。
Ｔｅｊｐａｒら、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｔｕｍｏｒ Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ＲＡＳ Ｗｉｌｄ－Ｔｙｐｅ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ、ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．（２０１７年）、３（２）、１９４ページ。
Ｖａｌｅら、Ｄｏｅｓ ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ？Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．２０１２年；３８（６）、６１８～６２５ページ。
Ｖａｎ Ｃｕｔｓｅｍら、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ，ａｎｄ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ｐｌｕｓ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．（２０１５年）、３３（７）、６９２～７００ページ。
Ｗａｒｉｎｇら、ＲＡＳ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ（２０１６年６月）、第１５巻、第２号、９５～１０３ページ。
Ｙｏｓｈｉｄａら、Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ＥＧＦＲ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１３年３月）、第１３９巻、第３号、３６７～３７８ページ。
Ｙｏｕｄｅｎ、Ｉｎｄｅｘ ｆｏｒ ｒａｔｉｎｇ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ、Ｃａｎｃｅｒ（１９５０年）、第３巻、第１号、３２～３５ページ。
追加の実施形態
追加の実施形態１。腫瘍を有する患者を処置する方法であって、本方法は、腫瘍がＡＲＥＧ ＨＩＧＨまたはＥＲＥＧ ＨＩＧＨのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含む治療コースを患者に投与することであって、腫瘍が、第１の所定のカットオフ以上のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされ、腫瘍が、第２の所定のカットオフ以上のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされる、投与することを含む、方法。
追加の実施形態２。腫瘍を有する患者を処置する方法であって、本方法は、腫瘍がＡＲＥＧ ＬＯＷおよびＥＲＥＧ ＬＯＷの両方である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない治療コースを患者に処置投与することであって、腫瘍が、第１の所定のカットオフ未満のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＬＯＷであり、腫瘍が、第２の所定のカットオフ未満のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＬＯＷとみなされる、投与することを含む、方法。
追加の実施形態３。ＥＧＦＲ指向性治療剤を含む治療コースを受ける、腫瘍を有する患者を選択する方法であって、本方法は、
（ａ）ヒトＡＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｂ）ヒトＥＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｃ）腫瘍の試料中のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第１の所定のカットオフと比較することと、
（ｄ）腫瘍の試料中のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第２の所定のカットオフと比較することと、を含み、
患者は、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第１の所定のカットオフ以上であるか、またはＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第２の所定のカットオフ以上である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含む治療コースを受けるように選択される、方法。
追加の実施形態４。ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない療法を受ける、腫瘍を有する患者を選択する方法が提供され、本方法は、
（ａ）ヒトＡＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｂ）ヒトＥＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｃ）腫瘍の試料中のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第１の所定のカットオフと比較することと、
（ｄ）腫瘍の試料中のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第２の所定のカットオフと比較することと、を含み、
患者は、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第１の所定のカットオフ未満であり、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第２の所定のカットオフ未満である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を受けるように選択される。
追加の実施形態５。第１の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内であり、第２の所定のカットオフが２０％～５０％の範囲内である、追加の実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
追加の実施形態６。
第１の所定のカットオフが２０％であり、第２の所定のカットオフが２０％であるか、または
第１の所定のカットオフが２５％であり、第２の所定のカットオフが２５％であるか、または
第１の所定のカットオフが２０％であり、第２の所定のカットオフが３０％であるか、または
第１の所定のカットオフが２５％であり、第２の所定のカットオフが３３．３％であるか、または
第１の所定のカットオフが２０％であり、第２の所定のカットオフが４０％であるか、または
第１の所定のカットオフが２５％であり、第２の所定のカットオフが５０％である、追加の実施形態５に記載の方法。
追加の実施形態７。腫瘍を有する患者を処置する方法であって、本方法は、
（ａ）腫瘍がＡＲＥＧ ＨＩＧＨまたはＥＲＥＧ ＨＩＧＨのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を患者に投与することであって、腫瘍が、第１の所定の陽性カットオフ以上のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされ、腫瘍が、第２の所定の陽性カットオフ以上のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされる、投与することと、
（ｂ）腫瘍がＡＲＥＧ ＬＯＷおよびＥＲＥＧ ＬＯＷの両方である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない療法コースを患者に投与することであって、腫瘍が、第１の所定の陰性カットオフ未満のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＬＯＷとみなされ、腫瘍が、第２の所定の陰性カットオフ未満のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを有すると組織化学的または細胞化学的に決定された場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＬＯＷとみなされる、投与することと、を含む、方法。
追加の実施形態８。腫瘍を有する患者の処置を選択する方法であって、本方法は、
（ａ）ヒトＡＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｂ）ヒトＥＲＥＧタンパク質についての腫瘍の試料を組織化学的または細胞化学的に染色することと、
（ｃ）腫瘍の試料中のＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第１の所定の陽性カットオフおよび第１の所定の陰性カットオフと比較することと、
（ｄ）腫瘍の試料中のＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、該パーセンテージを第２の所定の陽性カットオフおよび第２の所定の陰性カットオフと比較することと、
（ｅ）腫瘍がＡＲＥＧ ＨＩＧＨまたはＥＲＥＧ ＨＩＧＨのいずれかである場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含む処置コースを受けるように患者を選択することであって、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第１の所定の陽性カットオフ以上である場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされ、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第２の所定の陽性カットオフ以上である場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＨＩＧＨとみなされる、選択することと、
（ｆ）腫瘍がＡＲＥＧ ＬＯＷおよびＥＲＥＧ ＬＯＷの両方である場合、ＥＧＦＲ指向性治療剤を含まない処置コースを受けるように患者を選択することであって、ＡＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第１の所定の陰性カットオフ未満である場合、腫瘍はＡＲＥＧ ＬＯＷとみなされ、ＥＲＥＧ＋腫瘍細胞のパーセンテージが第２の所定の陰性カットオフ未満である場合、腫瘍はＥＲＥＧ ＬＯＷとみなされる、選択することと、を含む、方法。
追加の実施形態９。
第１の所定の陽性カットオフが３０％～５０％の範囲内であり、第１の所定の陰性カットオフが２０％～３０％の範囲内である、および／または
第２の所定の陽性カットオフが３０％～５０％の範囲内であり、第２の所定の陰性カットオフが２０％～３０％の範囲内である、追加の実施形態７または追加の実施形態８に記載の方法。
追加の実施形態１０。
第１の所定の陽性カットオフが５０％であり、
第１の所定の陰性カットオフが２０％であり、
第２の所定の陽性カットオフが５０％であり、
第２の所定の陰性カットオフが２０％である、追加の実施形態９に記載の方法。
追加の実施形態１１。腫瘍が結腸直腸腫瘍である、追加の実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
追加の実施形態１２。結腸直腸腫瘍が左側腫瘍である、追加の実施形態１１に記載の方法。
追加の実施形態１３。結腸直腸腫瘍が右側腫瘍である、追加の実施形態１１に記載の方法。
追加の実施形態１４。試料が結腸直腸腫瘍の切除物に由来する、追加の実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の方法。
追加の実施形態１５。試料が結腸直腸腫瘍の生検試料である、追加の実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の方法。
追加の実施形態１６。追加の実施形態１～１５に記載の方法のＥＧＦＲ指向性治療剤が抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である、追加の実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
追加の実施形態１７。抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が、セツキシマブまたはパニツムマブである、追加の実施形態１６に記載の方法。
追加の実施形態１８。処置コースが、患者に化学療法を投与することを含む、追加の実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
追加の実施形態１９。化学療法がイリノテカンを含む、追加の実施形態１８に記載の方法。
追加の実施形態２０。腫瘍が、ＥＧＦＲモノクローナル抗体療法に対する抵抗性を付与する検出可能な量の突然変異を含まない、追加の実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
追加の実施形態２１。腫瘍がＲＡＳ野生型（ＲＡＳ－ｗｔ）である、追加の実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
追加の実施形態２２。腫瘍の試料がホルマリン固定パラフィン包埋組織切片である、追加の実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
追加の実施形態２３。ＥＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージおよびＡＲＥＧを発現する腫瘍細胞のパーセンテージが、自動化された方法によって定量される、追加の実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【配列表】

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【国際調査報告】