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特表2023-542382がんの処置に有用なＳＮ３８のペプチド性コンジュゲート

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-06

(54)【発明の名称】がんの処置に有用なＳＮ３８のペプチド性コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

A61K 47/64 20170101AFI20230929BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20230929BHJP

A61K 47/65 20170101ALI20230929BHJP

C07K 7/00 20060101ALI20230929BHJP

A61K 31/4745 20060101ALN20230929BHJP

【ＦＩ】

A61K47/64

A61P35/00

A61K47/65

C07K7/00 ZNA

A61K31/4745

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023518802

(86)(22)【出願日】2021-09-27

(85)【翻訳文提出日】2023-05-22

(86)【国際出願番号】 EP2021076546

(87)【国際公開番号】W WO2022064052

(87)【国際公開日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】20382854.6

(32)【優先日】2020-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515000214

【氏名又は名称】フンダシオインスティトゥデレセルカバイオメディカ（イーエレベーバルセロナ）

(71)【出願人】

【識別番号】514267962

【氏名又は名称】ウニベルシタデバルセローナ

(71)【出願人】

【識別番号】519397781

【氏名又は名称】オスピタルサンジュアンダデウ

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】サンチェスナヴァロ，マカレナ

(72)【発明者】

【氏名】テイクスィドトゥラ，メリチェイ

(72)【発明者】

【氏名】ジェネオラシレギ，ナゴレ

(72)【発明者】

【氏名】ジラルトジェド，アーネスト

(72)【発明者】

【氏名】モンテロカルカボソ，アンヘル

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB22

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA66

4C086NA13

4C086ZB26

4H045AA10

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA72

4H045EA20

4H045FA20

(57)【要約】

ＳＮ３８のペプチド性コンジュゲート、その調製方法、それらを含む医薬組成物、および抗がん剤としてのそれらの治療適応症。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容され得る塩

（Ｚ）－（Ｌ）－Ｐ－（Ｗ）ｓ－（Ｙ）

（Ｉ）

式中、
Ｚは、医薬活性成分ＳＮ３８またはその薬学的に許容される塩の基であり、前記医薬活性成分ＳＮ３８は式（ＩＩ）を有し、Ｚは、前記医薬活性成分の２つのヒドロキシル基（ａ）または（ｂ）の１つのみによって独立してリンカーＬに結合しており；

【化1】

Ｌは、２～８個のビラジカルＬ´から構成されるビラジカルであり、式：
－Ｌ´_ａ－（Ｌ´_ｂ）_ｎ－Ｌ´_ｃ－
を有するリンカーであり；
Ｌ_ａ´は、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）ｒ－Ｏ－；－（ＣＨ_２）ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－（ＣＨ_２）ｒ－ＮＨ－；－（ＣＨ_２）ｒ－Ｓ－；－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｓｉ（Ｒ_１）（Ｒ_２）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－Ｓｉ（Ｒ_１）（Ｒ_２）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｓｉ（Ｒ_１）（Ｒ_２）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｓｉ（Ｒ_１）（Ｒ_２）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－ＳＯ_２－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－ＳＯ_２－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－ＳＯ_２－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－ＳＯ_２－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ_１）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ_１）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ_１）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ_１）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－ＣＨ（ＯＨ）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－ＣＨ（ＯＨ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－ＣＨ（ＯＨ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－ＣＨ（ＯＨ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；

【化2】

からなる群から選択されるビラジカルであり、Ｌ_８～Ｌ_１１のいずれかにおける置換基は、環の任意の位置にあり得；

【化3】

【化4】

からなる群から選択されるビラジカルであり；

Ｌ_ｃ´は、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－ＮＨ－ＣＨ－（（ＣＨ_２）_ｒＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－、－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；

【化5】

からなる群から選択されるビラジカルであり、

Ｐは、
（ａ）アミド結合であるＸ_１とＸ_２との間のペプチド内結合を有するアミノ酸配列Ｘ_１ＫＡＰＥＴＡＬＸ_２を含むペプチドであって、Ｘ_１は、ＤａｐおよびＤａｂからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ｄ（アスパラギン酸）およびＥ（グルタミン酸）からなる群から選択されるペプチド；すなわち

【化6】

（ｂ）ジスルフィド結合またはジセレニド結合であり、Ｘ_３ＫＡＰＥＴＡＬＸ_４ＡＡＡであるアミノ酸配列を含むペプチド内結合を少なくとも有する１２～２０アミノ酸残基長のペプチドであって；Ｘ_３とＸ_４との間に少なくともペプチド内ジスルフィド結合またはジセレニド結合を有し、Ｘ_３とＸ_４とが等しく、Ｃ（システイン）、Ｓｅｃ（セレノシステイン）、およびＰｅｎ（ペニシラミン）からなる群から選択されるペプチド；

【化7】

（ｃ）ジスルフィド結合又はジセレニド結合であり、Ｘ_５とＸ_６との間に少なくともペプチド内ジスルフィド結合またはジセレニド結合を有するＸ_５ＫＡＰＥＴＡＬＸ_６；Ｘ_５ＫＡＰＥＴＡＬＸ_６Ａ；およびＸ_５ＫＡＰＥＴＡＬＸ_６ＡＡからなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド内結合を少なくとも有する９～１１アミノ酸残基長のペプチドであって、Ｘ_５とＸ_６とが等しく、Ｃ（システイン）、Ｓｅｃ（セレノシステイン）およびＰｅｎ（ペニシラミン）からなる群から選択されるペプチド、すなわち

【化8】

（ｄ）１６アミノ酸残基を有し、アミノ酸配列Ｘ_７ＮＸ_８ＫＡＰＥＴＡＬＸ_９ＡＡＡＸ_１０Ｈを含み、Ｘ_７とＸ_９との間およびＸ_８とＸ_１０との間にペプチド内ジスルフィド結合またはジセレニド結合を有するペプチドであって、Ｘ_７～Ｘ_１０は、独立して、Ｃ（システイン）、Ｓｅｃ（セレノシステイン）およびＰｅｎ（ペニシラミン）からなる群から選択され；但し、Ｘ_７とＸ_９とは等しく、Ｘ_８－Ｘ_１０は等しいペプチド、すなわち

【化9】

ならびに（ｅ）アミノ酸配列Ｘ_１ＫＡＰＥＴＡＬＸ_２を含むペプチドであって、Ｘ_１は、ＤａｐおよびＤａｂからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ｄ（アスパラギン酸）およびＥ（グルタミン酸）からなる群から選択される、ペプチド（配列番号７）
からなる群から選択されるペプチドのビラジカルであり；

Ｗは、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－および－ＮＨ－ＣＨ（（ＣＨ_２）_ｒＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択されるビラジカルであり；

Ｙは、－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＯＲ_３、および－ＮＨＲ_３からなる群から選択される基であり、；

ｓは、独立して０～１から選択される整数であり；

ｎは、０～６の整数であり；

ｒは、独立して１～５から選択される整数であり；

ｋは、５～８の整数であり；

Ｒ_１およびＲ_２は、独立して、（Ｃ_１～Ｃ_６）－アルキルから選択され；

Ｒ_３は、（Ｃ_１～Ｃ_６）－アルキルからなる群から選択される基であり；

Ｌ_ａ´は、エステル、エーテル、ウレタン、シリルエーテル、スルホネート、ホスフェート、ケタール、ヘミケタール、カーボネートおよびカルバメート結合からなる群から選択される結合を介して基Ｚに結合し、該結合は、Ｌ_ａ´式の描画の左側のＣ＝Ｏ、ＳＯ_２、Ｓｉ、Ｐ、ＣＨまたはＣＨ_２基とＳＮ３８のヒドロキシル基の１つとの間に形成され；

ｎ＝０の場合、Ｌ_ａ´は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してラジカルＬ_ｃ´に結合し、該結合は、Ｌ_ａ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｃ´式の左側の官能基との間に形成され；

ｎ＝１の場合、Ｌ_ａ´は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィドエステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してラジカルＬ_ｂ´に結合し、該結合は、Ｌ_ａ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｂ´式の左側の官能基との間に形成され；Ｌ_ｂ´は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してラジカルＬ_ｃ´に結合し、該結合は、Ｌ_ｂ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｃ´式の描画の左側の官能基との間に形成され；

ｎが１より大きい場合、Ｌ_ｂ´は、等しいかまたは異なり、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステルおよびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してそれらの間で結合し；一方のＬ_ｂ´末端は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してＬ_ａ´に結合し、該結合は、Ｌ_ａ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｂ´式の描画の左側の官能基との間に形成され；もう一方のＬ_ｂ´末端は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してＬ_ｃ´に結合し、該結合は、Ｌ_ｂ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｃ´式の描画の左側の官能基との間に形成され；

Ｌ_ｃ´は、Ｌ_ｃ´式の描画の右側のカルボニル基およびペプチド配列Ｐの第１のアミノ酸のアミノ基とで形成されたアミド結合を介してビラジカルＰに結合し；

ｓ＝０の場合、Ｐは、アミド、カルボン酸またはエステル結合を介してＹに直接結合し、該結合は、配列Ｐの最後のアミノ酸のＣ末端のＣ＝Ｏと、－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＯＲ_３または－ＮＨＲ_３である基Ｙとの間に形成され；

ｓ＝１の場合、Ｐは、配列Ｐの最後のアミノ酸のＣ末端のＣ＝Ｏと形成されるアミド結合を介して基Ｗに結合し、該結合は、Ｗ式の描画の左側の官能基と、描画の配列の右側の配列Ｐの最後のアミノ酸のＣ末端の官能基（Ｃ＝Ｏ）との間に形成され、Ｗは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｙ、または－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ（（ＣＨ_２）_ｒＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－ＹのようにＹに結合している）。

【請求項2】

Ｚが、医薬有効成分のヒドロキシル基（ｂ）によってリンカーＬに結合している、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項3】

Ｚが、医薬有効成分のヒドロキシル基（ａ）によってリンカーＬに結合している、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項4】

Ｐが、
（ａ）ＤａｐとＤとの間にアミド結合であるペプチド内結合を有するアミノ酸配列ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤを含むペプチド、すなわち

【化10】

（ｂ）ジスルフィド結合であり、システイン１と９との間に少なくともペプチド内ジスルフィド結合を有するＣＫＡＰＥＴＡＬＣＡＡＡであるアミノ酸配列を含む、ペプチド内結合を少なくとも有する９～２０アミノ酸残基長のペプチド、すなわち

【化11】

（ｃ）ジスルフィド結合であり、システイン１と９との間に少なくともペプチド内ジスルフィド結合を有するＣＫＡＰＥＴＡＬＣ；ＣＫＡＰＥＴＡＬＣＡ；およびＣＫＡＰＥＴＡＬＣＡＡからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド内結合を少なくとも有する９～１１アミノ酸残基長のペプチド、すなわち、

【化12】

（ｄ）１６アミノ酸残基を有し、アミノ酸配列ＣＮＣＫＡＰＥＴＡＬＣＡＡＡＣＨを含み、システイン１および１１である第１および第３のシステインの間、並びにシステイン３および１５である第２および第４のシステインの間にペプチド内ジスルフィド結合を有するペプチド、すなわち、

【化13】

（ｅ）アミノ酸配列ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤ（配列番号１４）を含むペプチド
からなる群から選択されるペプチドのビラジカルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項5】

Ｐが、
（ａ）アミノ酸配列ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤを有するペプチドであって、ＤａｐとＤとの間にアミド結合であるペプチド内結合を有するペプチド（配列番号７）；
（ｂ）１位および９位のシステイン間に少なくともペプチド内ジスルフィド結合を有するアミノ酸配列ＣＫＡＰＥＴＡＬＣを有するペプチド（配列番号１０）；
（ｃ）アミノ酸配列ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤを有するペプチド（配列番号１４）
からなる群から選択されるペプチドのビラジカルである、請求項４に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項6】

Ｐが、ＤａｐとＤとの間にアミド結合であるペプチド内結合を有するペプチドＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤ（配列番号７）のビラジカルである、請求項５に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項7】

Ｌ_ａ´が、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、Ｌ_６、Ｌ_７およびＬ_１２からなる群から選択されるビラジカルである、請求項１から６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項8】

Ｌが、３～８個のビラジカルから構成されるビラジカルであるリンカーであり、ｎが１～６の整数である、請求項１～７のいずれかに記載の化合物。

【請求項9】

Ｌ_ａ´が、下記式のＬ_３であり、Ｌ_ｃ´が、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－である、請求項８に記載の化合物。

【化14】

【請求項10】

Ｌ_ｂ´が、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－、－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；および－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載の化合物。

【請求項11】

Ｌが、２つのビラジカルから構成されるビラジカルであるリンカーであり、ｎ＝０であり、Ｌ_ａ´がＬ_１２であり、Ｌ_ｃ´がＬ_１３である、請求項１～６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項12】

Ｌが、２つのビラジカルから構成されるビラジカルであるリンカーであり、ｎ＝０であり、Ｌ_ａ´が－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－であり、Ｌ_ｃ´がＬ_１５である、請求項１～６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項13】

式（Ｉａ）を有する、請求項１に記載の化合物。

【化15】

【請求項14】

式（Ｉｂ）を有する、請求項１に記載の化合物。

【化16】

【請求項15】

式（Ｉｃ）を有する、請求項１に記載の化合物。

【化17】

【請求項16】

式（Ｉｄ）を有する、請求項１に記載の化合物。

【化18】

【請求項17】

式（Ｉｅ）を有する、請求項１に記載の化合物。

【化19】

【請求項18】

治療有効量の請求項１～１７のいずれかに記載の化合物を、適切な量の薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む医薬組成物。

【請求項19】

医薬品として使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項20】

ヒトを含む哺乳動物のがんの処置に使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項21】

前記がん処置が、頭蓋外固形腫瘍、眼腫瘍およびＣＮＳ腫瘍からなる群から選択される腫瘍の処置を含む、請求項２０に記載の使用のための化合物。

【請求項22】

前記がんが、成人神経膠腫、小児神経膠腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、ＤＩＰＧ、神経芽腫および横紋筋肉腫からなる群から選択される、請求項２０または２１に記載の使用のための化合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２８日に出願された欧州特許出願ＥＰ２０３８２８５４．６の利益を主張する。

【0002】

本発明は、抗がん剤であるＳＮ３８の送達系、それらの調製方法、およびそれらの治療適応症の分野に関する。

【背景技術】

【0003】

がんは、動物およびヒトの両方の死を引き起こし得る腫瘍細胞の蓄積を特徴とする不均一な疾患である。がんまた、小児および青年の間の主要な疾患による死因の１つである。過去５０年間にわたって、いくつかの種類のがん、特に小児がんの処置においてかなりの進歩があったが、他の種類に対する進歩は限られている。小児における腫瘍の年間発生率は、１００万人当たり１００～１６０症例である。１５歳未満の子供５００人に１人の年間リスクがある。この発生率は、先進国ではわずかに低い。脳および脊髄腫瘍は、全新生物の２５％を占める（全小児固形腫瘍の４０～５０％）。進歩にもかかわらず、これらの患者の生存データは依然として低く、約５５％である。これは、白血病または頭蓋外腫瘍に罹患した患者等の他のタイプの患者に見られる近年の実質的な生存の増加と対照的である。

【0004】

がんを処置する従来の方法には、外科的処置、化学療法剤の投与、および最近では、治療部分にコンジュゲートされ得る抗体または抗体フラグメントの投与を含む免疫応答に基づく治療が含まれる。しかしながら、今日まで、そのような処置の成功は限られている。

【0005】

植物由来の抗がん性化合物の４つの主要な構造分類の１つであるカンプトテシンは、ピロール（３，４β）キノリン部分を含有する五環式環構造、Ｓ配置ラクトン形態およびカルボキシレート形態からなる細胞傷害性アルカロイドである。イリノテカンは、中国の観賞木カンプトテカ・アクミナタ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａａｃｕｍｉｎａｔａ）に見出される天然カンプトテシンから作製される。いくつかの種類のがんは、ある時点でイリノテカンで処置されており、そのうち、成人の場合は多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、小児の場合はびまん性内在性橋神経膠腫（ＤＩＰＧ）、小児神経膠芽腫（ｐＧＢＭ）、神経芽腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫および網膜芽細胞腫である。

【0006】

神経膠腫は、脳または脊椎のグリア細胞で発生する腫瘍群であり、全脳腫瘍および中枢神経系腫瘍の約３０％、ならびに全悪性脳腫瘍の８０％を構成する。多くの場合、脳神経膠腫の処置は、手術、放射線療法および化学療法を用いた併用アプローチである。ＤＩＰＧは主に小児、通常は５～７歳の小児に発症する。残念なことに、これは、６０～７０％を構成する脳幹腫瘍の大部分であり、すべての中で最も悪い予後を有するものである。有効な処置は示されておらず、平均生存期間は９ヶ月である。放射線照射およびステロイドの投与は、緩和効果を有し、非常に控え目に生存率を高める唯一の処置である。これまでのところ、有用な化学療法はなく、複数の臨床試験が試験されており、好ましい結果は得られていない。小児神経膠芽腫は、半球腫瘍の１／３を構成する別の腫瘍群である。これは、８年および１２年にピーク発生率を有する。神経膠芽腫は成人患者にも影響を及ぼし、１００．０００人の集団あたり約２～３例である。

【0007】

ユーイング肉腫は、小児および青年における悪性骨腫瘍の第２の原因である。年間発生率は、人口１００万人当たり０．６人である。５歳まではまれであり、ピーク発生率は１０歳から１５歳の間であり、女性よりも男性に多く影響を及ぼすが、性別におけるこの関係は年齢範囲によって異なる。開始するための最も一般的な場所は、骨盤（股関節）骨、胸壁（肋骨もしくは肩甲骨等）、または脚の骨の中央である。ユーイング肉腫はまた、骨損傷の非存在下で骨格外病変として存在し得る。この変異型では、リンパ拡散のリスクが高く、処置は通常横紋筋肉腫と同様である。

【0008】

軟部組織肉腫は横紋筋肉腫と非横紋筋肉腫とに分けられる。横紋筋肉腫は、小児の全軟部組織肉腫の５０％を占める。これは、頻度が神経芽腫およびウィルムス腫瘍に続く第３の固形頭蓋外腫瘍である。年齢ピークは二峰性であり、最初のピークは２～５歳の間であり、２番目のピークは１５～１９歳の間の青年期である。成人の肉腫は主に四肢に発生するが、小児では骨格筋および軟部組織の両方で、体内の任意の位置に発生し得る。小児における最も影響を受ける領域は、頭頸部および泌尿生殖路である。四肢は患者の２０％において影響を受ける。腫瘍を完全に切除することができる位置に腫瘍が見られる場合を除いて、全生存期間は不良であり、四肢切断または排尿を必要とすることがある。生存率は、場所によって７～７０％と異なる。

【0009】

神経芽腫は、小児の最も一般的な頭蓋外固形腫瘍である。その胚起源のために、神経芽腫は実質的に交感神経系の任意の部分に見出すことができるが、局所領域疾患の最も一般的な局在は副腎上にある（４４％）。診断時の年齢が１．５歳～６歳の小児は依然として従来の処置で治癒することができるが、転移性疾患（ステージ４神経芽腫）と診断された場合、生存確率が低下する。新たに診断された患者の約５０％は、骨への転移（６０％）、骨髄への転移（５０％）、リンパ節への転移（４２％）および／または肝臓への転移（１５％）を既に示し、集中的な化学療法処置、外科手術および放射線療法を必要とするが、それらの生存率は依然として低く、過去数十年にわたって進歩はほとんどない。

【0010】

最後に、網膜芽細胞腫は、小児における眼腫瘍の最も一般的な原因であり、全世界的な発生率は出生２０，０００人に１人である。これは、典型的には、生後２年以内に起こる。３０～４０％は両側性であり、これらの場合、常に陽性の家族歴がある。片側のうち１０％が、１３番染色体に位置するＲｂ遺伝子の生殖系列突然変異を有する。早期に検出された場合、それらは９５％の生存率を有する。世界のある特定の地域では、診断が遅れると、生存率は２０％未満まで劇的に低下する。処置は、達成される腫瘍制御に依存する。腫瘍退縮が化学療法および近接照射療法によって制御されない場合、摘出が推奨される。摘出が行われたとしても、場合によっては、視神経への腫瘍浸潤があり、これにより追加の化学療法処置が強制される。

【0011】

イリノテカンの有効性は、低い変換率、高い患者間変動性および用量制限的胃腸毒性をもたらすその肝臓活性化によって制限されることが証明されている。
ＳＮ３８は、イリノテカンの活性代謝産物であり、肝臓カルボキシルエステラーゼによるイリノテカンの加水分解を介して形成され、ＵＧＴ１Ａ１によるグルクロン酸化を介して代謝される。これは以下の式を有する。

【化1】

【0012】

その発見以来、その強力な抗新生物効果のためにあらゆる科学者の注目を集めている。ＳＮ３８は、イリノテカン自体よりも１０００倍高い活性を有し、イリノテカンよりも同じ種類のがんを処置するために使用することができる。インビトロ細胞傷害性アッセイは、イリノテカンに対するＳＮ３８の効力が２倍～２０００倍変動することを示す。それでも、ＳＮ３８は、化学的、薬理学的および毒性レベルにおいても有意な制限を有する。化学的レベルでは、水に可溶性であるイリノテカンとは異なり、ＳＮ３８は水、ならびにほとんどの溶媒および油に実質的に不溶性であり、したがってＳＮ３８を患者に投与することは実行不可能である。多くの溶媒が試験されており、ジメチルスルホキシド、ギ酸およびＴｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標）ＨＰ、ならびにＮａＯＨ０．１ＭでＳＮ３８を０．５％で可溶化することしかできないが、このＮａＯＨ０．１Ｍ水溶液の塩基性ｐＨはＳＮ３８を不活性化する。高い親油性特性および薬物の水溶液中でのその不安定性は、極性非プロトン性溶媒で投与することを必要とし、これに伴う全ての不都合が生じる。さらに、第２の問題は、末端ラクトン環の存在であり、これが水溶液中で不安定にし、非酵素的かつｐＨ依存的な加水分解を生じて、トポイソメラーゼの阻害に強力ではないヒドロカルボン酸環を形成する。したがって、中性または塩基性ｐＨでは、バランスはより活性の低い種にシフトし、より酸性のｐＨでは、ラクトンの形成が有利であり。阻害力がより大きい。薬物はまた、位置２０に不斉炭素を含有し、Ｓ型は薬理学的に活性な立体配置である。

【0013】

薬物の好ましくない特徴を考慮し、いくつかの研究は、不溶性の問題を解決し、したがって強力な作用機構を利用するために、プロドラッグとしてのＳＮ３８の製剤へとつながった。プロドラッグの使用の代わりに薬物を放出するために、いくつかのコンジュゲート戦略がＳＮ３８に適用されている。

【0014】

それらのいくつかは、可溶性コンジュゲートからのＳＮ３８の遅い放出に基づいており、例えば、特許文献１は、溶解性を改善するためのポリ（エチレングリコール）と多アームＰＥＧとのコンジュゲーションを提案しており、これはエステル加水分解によりＳＮ３８を放出する。しかしながら、これらのコンジュゲートは、有効であるためには高レベルで投与されなければならない。

【0015】

特許文献２は、低用量および長期曝露レジームを可能にするために、低速でβ脱離機構を介してポリエチレングリコールからＳＮ３８を放出するいくつかのコンジュゲートを開示している。

【0016】

Ｆ．Ｋｏｉｚｕｍｉらは、非特許文献１において、前臨床試験においてイリノテカンを凌駕した自己集合ナノ粒子（ＮＰ）からのＳＮ３８に化学的にコンジュゲートさせたポリ（エチレングリコール）－ポリ（グルタミン酸）ブロックコポリマーを開示している。

【0017】

他のコンジュゲート戦略は、例えば、肝臓活性化を迂回し、イリノテカンと比較して胃腸毒性および患者間変動性を低減するためのペプチド性コンジュゲートの使用に基づいている。

【0018】

したがって、ＦＭｅｙｅｒ－Ｌｏｓｉｃらは、非特許文献２において、エステラーゼ切断可能リンカーを介してカチオン性ペプチド（Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ）にＳＮ３８をコンジュゲートさせて、イリノテカンの関連する毒性なしに、イリノテカンよりも有意に高いレベルのＳＮ３８を送達し、前臨床モデルにおいてＤＴＳ－１０８の治療域を増加させることを提案している。

【0019】

特許文献３は、ヒトＨＣＴ－１１６細胞株に対して有意な抗腫瘍活性を有することが示されているコンジュゲートＤＰＶ１０４７－ＭＩＣ－ＳＮ３８（ＤＰＶ－１０４７はペプチドＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶであり；ＭＩＣは６－マレイミドヘキサン酸残基であり；ＳＮ３８は７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンである）等のチオエーテル結合によるリンカーを介したカンプトテシン細胞透過性ペプチドコンジュゲートの調製を開示している。

【0020】

最後に、特許文献４は、腫瘍－血管標的化抗腫瘍剤、ＩＦ７－ＳＮ３８の合成を開示しており、抗腫瘍剤は、リンカー４－｛４－［（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキサミド］メチル｝シクロヘキサン－１－カルボン酸を介して抗がん剤（ＳＮ３８）にコンジュゲートした配列ＩＦＬＬＷＱＲ（ＩＦ７）を有するアネキシン－１結合ペプチドを含む。

【0021】

この化合物は、脳腫瘍を標的とし、受動的トランスサイトーシス機構によって血液脳関門を克服する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0022】

【特許文献1】米国特許第８２９９０８９号明細書

【特許文献2】国際公開第２０１５／０５１３０７号パンフレット

【特許文献3】国際公開第２００７／１１３６８７号パンフレット

【特許文献4】国際公開第２０１８／０６４６８３号パンフレット

【非特許文献】

【0023】

【非特許文献1】“ＮｏｖｅｌＳＮ３８－ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒｉｃｍｉｃｅｌｌｅｓ，ＮＫ０１２，ｅｒａｄｉｃａｔｅｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｂｕｌｋｙｔｕｍｏｒｓ”，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００６，ｖｏｌ．６６（２０）ｐｐ．１００４８－５６

【非特許文献2】“ＤＴＳ－１０８，ＡｎｏｖｅｌＰｅｐｔｉｄｉｃｐｒｏｄｒｕｇｏｆＳＮ３８：ＩｎｖｉｖｏＥｆｆｉｃａｃｙａｎｄＴｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃＳｔｕｄｉｅｓ”，ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２００８，ｖｏｌ．１４，ｉｓｓｕｅ７，ｐｐ．２１４５－２１５３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0024】

がんの処置のためのＳＮ３８の適切な投与およびバイオアベイラビリティを可能にするためのＳＮ３８のコンジュゲートを提供する努力にもかかわらず、ＳＮ３８を効率的に投与するための改善されたシステムを見出すという、満たされていない医学的必要性が依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0025】

本発明者らは、ＳＮ３８と、特定の種類のリンカーを介してＳＮ３８に結合し、ＳＮ３８と同様に脳がんおよび頭蓋外がん由来のいくつかの細胞株に対して抗腫瘍活性を維持するペプチドの特定の群とのコンジュゲートを開発した。ＳＮ３８の新たなコンジュゲートは水への高い溶解度を示し、実質的に不溶性であるＳＮ３８とは異なり、そのような溶解度のために患者に投与することができた。ＳＮ３８の新たなコンジュゲートの活性は、インビトロでのイリノテカンの活性よりもはるかに高い。有利には、それらはインビトロで、ヒト血清中で良好な安定性を示す。

【0026】

コンジュゲートの一部を形成するペプチドは公知であり、ＷＯ２０１５／００１０１５Ａ１において以前に説明された。この文献は、これらのペプチドが血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力を有し、それ自体ではＢＢＢを通過することができないカーゴ、特にタンパク質および抗体等の大きなカーゴを輸送する能力を有することを開示している。それらは、ＢＢＢを横断するために能動輸送機構を使用する。Ｂ．Ｏｌｌｅｒらは、´´ＭｉｎｉＡｐ－４：ＡＶｅｎｏｍ－ＩｎｓｐｉｒｅｄＰｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｆｏｒＢｒａｉｎＤｅｌｉｖｅｒｙ´´，ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔＥｄ２０１６，ｖｏｌ．５５，ｐｐ．５７２－５７５において、ペプチドＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤに焦点を当て、それがプロテアーゼに耐性であり、ヒト細胞ベースのモデルにおいて、およびインビボでも血液脳関門を横切って多様なカーゴを効率的に送達することができることを開示した。

【0027】

本発明者らは、ＳＮ３８の場合、ＷＯ２０１５／００１０１５Ａ１に開示されているもののある特定のペプチドおよび上記文献に開示されているリンカーよりも大きい特定のサイズのリンカーとのコンジュゲーションによって、抗腫瘍活性の良好な結果が得られることを見出した。これらのコンジュゲートは、ＳＮ３８と同様の抗腫瘍活性を維持することができ、イリノテカンのインビトロ活性よりも最大１００倍優れているため、他のコンジュゲートに対して有利である。

【0028】

実験の項で提供される比較データは、ＳＮ３８が同じリンカーを介して別のペプチド（ＴＨＲｒｅ）にコンジュゲートされた場合、抗腫瘍活性の一部／全部が失われ（本発明の実施例７および比較例１）、本発明のリンカーとは異なるリンカーも使用された場合（比較例２）、結果はさらに悪いことを示している。

【0029】

したがって、本発明の第１の態様は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩に関し、

（Ｚ）－（Ｌ）－Ｐ－（Ｗ）_ｓ－（Ｙ）

（Ｉ）

式中、Ｚは、医薬活性成分ＳＮ３８またはその薬学的に許容される塩の基であり、医薬活性成分ＳＮ３８は式（ＩＩ）を有し、Ｚは、医薬活性成分の２つのヒドロキシル基（ａ）または（ｂ）の１つのみによって独立してリンカーＬに結合しており；

【化2】

Ｌは、２～８個のビラジカルＬ´から構成されるビラジカルであり、式：
－Ｌ´_ａ－（Ｌ´_ｂ）_ｎ－Ｌ´_ｃ；
を有するリンカーであり；

Ｌ_ａ´は、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）ｒ－Ｏ－；－（ＣＨ_２）ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－（ＣＨ_２）ｒ－ＮＨ－；－（ＣＨ_２）ｒ－Ｓ－；－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｓｉ（Ｒ_１）（Ｒ_２）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－Ｓｉ（Ｒ_１）（Ｒ_２）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｓｉ（Ｒ_１）（Ｒ_２）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｓｉ（Ｒ_１）（Ｒ_２）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－ＳＯ_２－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－ＳＯ_２－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－ＳＯ_２－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－ＳＯ_２－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ_１）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ_１）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ_１）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ_１）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－ＣＨ（ＯＨ）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－ＣＨ（ＯＨ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－ＣＨ（ＯＨ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－ＣＨ（ＯＨ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；

【化3】

からなる群から選択されるビラジカルであり、Ｌ_８～Ｌ_１１のいずれかにおける置換基は、環の任意の位置にあり；

【化4】

Ｌ_ｂ´は、独立して、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－；－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｒ－；－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－；－ＮＨ－ＣＨ－（（ＣＨ_２）_ｒＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－；－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－；－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；Ｌ_１；Ｌ_２；Ｌ_３；Ｌ_４；およびそれらの組合せ；
からなる群から選択されるビラジカルであり；

Ｌ_ｃ´は、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－ＮＨ－ＣＨ－（（ＣＨ_２）_ｒＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－；－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；Ｌ_１、Ｌ_２；Ｌ_３；Ｌ_４；

【化5】

からなる群から選択されるビラジカルであり；

Ｐは、（ａ）アミド結合であるＸ_１とＸ_２との間のペプチド内結合を有するアミノ酸配列Ｘ_１ＫＡＰＥＴＡＬＸ_２を含むペプチドであって、Ｘ_１は、Ｄａｐ（２，３－ジアミノプロピオン酸）およびＤａｂ（２，４－ジアミノブタン酸）からなる群から選択され、Ｘ_２は、Ｄ（アスパラギン酸）およびＥ（グルタミン酸）からなる群から選択されるペプチド；すなわち

【化6】

（アミノ酸Ｄａｐについては、コードＤａｐおよびＤｐｒが本明細書において等しく使用される）；
（ｂ）ジスルフィド結合またはジセレニド結合であり、Ｘ_３ＫＡＰＥＴＡＬＸ_４ＡＡＡであるアミノ酸配列を含むペプチド内結合を少なくとも有する１２～２０アミノ酸残基長のペプチドであって；Ｘ_３とＸ_４との間に少なくともペプチド内ジスルフィド結合またはジセレニド結合を有し、Ｘ_３とＸ_４とが等しく、Ｃ（システイン）、Ｓｅｃ（セレノシステイン）、およびＰｅｎ（ペニシラミン）からなる群から選択されるペプチド；すなわち

【化7】

【化8】

【化9】

ならびに（ｅ）アミノ酸配列Ｘ_１ＫＡＰＥＴＡＬＸ_２を含むペプチドであって、Ｘ_１は、ＤａｐおよびＤａｂからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ｄ（アスパラギン酸）およびＥ（グルタミン酸）からなる群から選択される、ペプチド（配列番号７）、すなわち直鎖ペプチド
からなる群から選択されるペプチドのビラジカルであり；

Ｗは、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－および－ＮＨ－ＣＨ（（ＣＨ_２）_ｒＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択されるビラジカルであり、；Ｙは、－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＯＲ_３、および－ＮＨＲ_３からなる群から選択される基であり；

ｓは、独立して０～１から選択される整数であり；ｎは、０～６の整数であり；ｒは、独立して１～５から選択される整数であり；ｋは、５～８の整数であり；Ｒ_１およびＲ_２は、独立して、（Ｃ_１～Ｃ_６）－アルキルから選択され；Ｒ_３は、（Ｃ_１～Ｃ_６）－アルキルからなる群から選択される基であり；

Ｌ_ａ´は、エステル、エーテル、ウレタン、シリルエーテル、スルホネート、ホスフェート、ケタール、ヘミケタール、カーボネートおよびカルバメート結合からなる群から選択される結合を介して基Ｚに結合し、結合は、Ｌ_ａ´式の描画の左側のＣ＝Ｏ、ＳＯ_２、Ｓｉ、Ｐ、ＣＨまたはＣＨ_２基とＳＮ３８のヒドロキシル基の１つとの間に形成され；

ｎ＝０の場合、Ｌ_ａ´は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してラジカルＬ_ｃ´に結合し、結合は、Ｌ_ａ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｃ´式の左側の官能基との間に形成され；

ｎ＝１の場合、Ｌ_ａ´は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してラジカルＬ_ｂ´に結合し、結合は、Ｌ_ａ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｂ´式の左側の官能基との間に形成され；Ｌ_ｂ´は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してラジカルＬ_ｃ´に結合し、結合は、Ｌ_ｂ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｃ´式の描画の左側の官能基との間に形成され；

ｎが１より大きい場合、Ｌ_ｂ´は、等しいかまたは異なり、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステルおよびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してそれらの間で結合し；１つのＬ_ｂ´末端は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してＬ_ａ´に結合し、結合は、Ｌ_ａ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｂ´式の描画の左側の官能基との間に形成され；別のＬ_ｂ´末端は、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してＬ_ｃ´に結合し、結合は、Ｌ_ｂ´式の描画の右側の官能基とＬ_ｃ´式の描画の左側の官能基との間に形成され；

Ｌ_ｃ´は、Ｌ_ｃ´式の描画の右側のカルボニル基およびペプチド配列Ｐの第１のアミノ酸のアミノ基と形成されたアミド結合を介してビラジカルＰに結合し；

ｓ＝０の場合、Ｐは、アミド、カルボン酸またはエステル結合を介してＹに直接結合し、結合は、配列Ｐの最後のアミノ酸のＣ末端のＣ＝Ｏと、－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＯＲ_３または－ＮＨＲ_３である基Ｙとの間に形成され；

ｓ＝１の場合、Ｐは、配列Ｐの最後のアミノ酸のＣ末端のＣ＝Ｏと形成されるアミド結合を介して基Ｗに結合し、結合は、Ｗ式の描画の左側の官能基と、描画の配列の右側の配列Ｐの最後のアミノ酸のＣ末端の官能基（Ｃ＝Ｏ）との間に形成され、Ｗは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｙ、または－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ（（ＣＨ_２）_ｒＮＨ_２）－Ｃ（＝Ｏ）－ＹのようにＹに結合している。

【0030】

上記または下記の配列の２つのアミノ酸間の線は、２つのアミノ酸の側鎖間のペプチド内結合を表す。特定の実施形態において、上記または下記の配列の２つのアミノ酸間の線は、２つのアミノ酸の側鎖間のペプチド内結合を表す。

【0031】

本発明の第２の態様は、治療有効量の上記に定義される化合物を、適切な量の薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む医薬組成物に関する。

【0032】

本発明の第３の態様は、医薬品として使用するための上記に定義される化合物に関する。

【0033】

本発明の第４の態様は、ヒトを含む哺乳動物のがんの処置に使用するための上記化合物に関する。

【0034】

本発明の第５の態様は、がんの処置に使用するための式（Ｉ）の化合物に関し、式（Ｉ）の化合物は、化学療法剤との併用療法および／またはカルボキシルエステラーゼ阻害剤との併用で使用するためのものである。

【0035】

化合物（Ｉａ）は、Ｇ２Ｂ－００１またはＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４とも呼ばれる。これらの名称は、本明細書では等しく使用される。化合物（Ｉｂ）は、Ｇ２Ｂ－００１直系とも呼ばれる。化合物（Ｉｃ）は、Ｇ２Ｂ－００３とも呼ばれる。化合物（Ｉｄ）は、Ｇ２Ｂ－００４とも呼ばれる。化合物（Ｉｅ）は、Ｇ２Ｂ－００５とも呼ばれる。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】成人神経膠腫Ｕ８７のがん細胞株に対する、本明細書においてＧ２Ｂ－００１またはＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４とも呼ばれる化合物（Ｉａ）（実施例７）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。ＭｉｎｉＡｐ４は、ＤａｐとＤとの間にアミドのペプチド内結合を有するＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤである。

【図2】成人神経膠腫Ｕ３７３のがん細胞株に対する、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図3】ＤＩＰＧ細胞モデルＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７に対する、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図4】ＤＩＰＧモデルＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－０１１に対する、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図5】小児高悪性度神経膠腫モデルＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１に対する、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図6】網膜芽細胞腫細胞モデルＨＳＪＤ－ＲＢＴ－５に対する、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図7】網膜芽細胞腫細胞モデルＨＳＪＤ－ＲＢＴ－７に対する、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図8】網膜芽細胞腫細胞モデルＨＳＪＤ－ＲＢＴ－１４に対する、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図9】ユーイング肉腫細胞株Ａ６７３に対する、ＳＮ３８リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図10】横紋筋肉腫細胞株Ｒｄに対する、ＳＮ３８リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図11】横紋筋肉腫細胞株ＲＨ４に対する、ＳＮ３８リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図12】神経芽腫細胞株ＬＡＮ－１に対する、ＳＮ３８リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図13】神経芽腫細胞株Ｓｋ－Ｎ－ＪＤに対する、ＳＮ３８リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図14】神経芽腫細胞モデルＨＳＪＤ－ＮＢ－００４に対する、ＳＮ３８リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図15】神経芽腫細胞モデルＨＳＪＤ－ＮＢ－００５に対する、ＳＮ３８リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図16】神経芽腫細胞モデルＨＳＪＤ－ＮＢ－０１６に対する、ＳＮ３８リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）ならびに関連化合物ＳＮ３８およびイリノテカンの比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図17】腫瘍細胞増殖の５０％を阻害するＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）薬物濃度（ＩＣ５０値）の培養物間の比較を示す図である。個々のデータ（点）が示されている。統計：反復測定（対応あり）２元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定。

【図18】０日目に１回の静脈内注射により２００ｍｇ／ｋｇのＭＴＤでＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４化合物（Ｉａ）で処置された３匹のマウス（処置）、および０日目に生理食塩水を静脈内注射された２匹の対照マウス（対照）の個々の体重曲線を示す図である。

【図19】実施例１０に詳述されているように、イリノテカン、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）または生理食塩水（対照）で処置されたマウスの、最大個体体重からの体重減少％として表される平均体重変動を示す図である。平均データ（点）およびＳＤ（バー）が示されている。

【図20】細胞株ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７に対するＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）および比較例２（ＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ）の比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図21】細胞株ＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１に対するＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）および比較例２（ＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ）の比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図22】細胞株ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７に対するＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）、比較例１（ＳＮ３８－リンカーＡ－ＴＨＲｒｅ）および比較例２（ＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ）の比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図23】細胞株ＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１に対するＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）、比較例１（ＳＮ３８－リンカーＡ－ＴＨＲｒｅ）および比較例２（ＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ）の比較抗増殖活性を示す図である。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図24】時間に対するインビトロでの３７℃でのヒト血清中のＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）の安定性を示す図である。

【図25】時間に対するインビトロでの３７℃でのラット、マウス、イヌおよびヒト血漿中のＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）の安定性を示す図である。

【図26】時間に対するインビトロでの３７℃でのヒト血清中のＧ２Ｂ－００１直系（Ｉｂ）の安定性を示す図である。

【図27】ＤＩＰＧ細胞モデルＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７に対する、Ｇ２Ｂ－００１直系（Ｉｂ）、Ｇ２Ｂ－００１（Ｉａ）および関連化合物ＳＮ３８の比較抗増殖活性を示す。値は、１００％とみなされる対照未処理細胞のＭＴＳシグナルの％として表される。点の値は、化合物濃度での３～６回の反復からの平均およびＳＤを表す。

【図28】イリノテカン（黒点）、Ｇ２Ｂ－００３（Ｉｃ）（実線）または生理食塩水対照（破線）のいずれかで処置された３匹のマウスにおける皮下神経芽腫腫瘍体積（２つの腫瘍の平均およびＳＤ）を示す図である。腫瘍モデルは、ＨＳＪＤ－ＮＢ－０１３と命名された患者由来異種移植片であった。

【発明の詳細な説明】

【0037】

特に明記しない限り、本明細書で引用されるアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。１文字コードおよび３文字コードは、区別なく使用されている。以下のアミノ酸について、以下の略語が使用されている：ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）およびペニシラミン（Ｐｅｎ）。本発明の文脈において、ペニシラミンは、Ｄ－ペニシラミンのみを包含する。

【0038】

上述の本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、無機または有機の酸または塩基を含む薬学的に許容される非毒性の酸または塩基から形成される任意の塩を包含する。治療目的で使用される場合、薬学的に許容されなければならないことを除いて、塩に関する制限はない。

【0039】

式（Ｉ）の化合物のいくつかは塩基性化合物であるため、塩は、無機酸および有機酸を含む薬学的に許容される非毒性の酸から調製され得る。そのような酸には、例えば、塩化水素酸、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸などが含まれる。

【0040】

特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、Ｚが医薬有効成分のヒドロキシル基（ｂ）によってリンカーＬに結合している化合物である。

【0041】

別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、Ｚが医薬有効成分のヒドロキシル基（ａ）によってリンカーＬに結合している化合物である。

【0042】

別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、Ｐが以下からなる群から選択されるペプチドのビラジカルである化合物である：（ａ）アミド結合であるＤａｐとＤとの間のペプチド内結合を有するアミノ酸配列ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤを含むペプチド、すなわち

【化10】

（ｂ）ジスルフィド結合であり、システイン１と９との間に少なくともペプチド内ジスルフィド結合を有するＣＫＡＰＥＴＡＬＣＡＡＡであるアミノ酸配列を含むペプチド内結合を少なくとも有する９～２０アミノ酸残基長のペプチド、すなわち、

【化11】

【化12】

【化13】

【0043】

Ｘ_１～Ｘ_１０について特定のアミノ酸が選択された配列番号８～配列番号１３では、特定のペプチド内結合がその配列に描かれている。

【0044】

別の特定の実施形態において、本発明のペプチドにおける少なくとも１つのペプチド内結合は、１つのペプチド内結合である。別の特定の実施形態において、本発明のペプチドにおける少なくとも１つのペプチド内結合は、２つのペプチド内結合を指す。

【0045】

別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ＰがペプチドＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤ（配列番号１４）、すなわち直鎖ペプチドのビラジカルである化合物である。

【0046】

特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｐが、（ａ）アミノ酸配列ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤを含むペプチドであって、ＤａｐとＤとの間にアミド結合であるペプチド内結合（ＭｉｎｉＡｐ４とも呼ばれる）を有するペプチド（配列番号８）、ならびに（ｂ）１位および９位のシステイン間に少なくともペプチド内ジスルフィド結合を有するＣＫＡＰＥＴＡＬＣ（配列番号１０）からなる群から選択されるペプチドのビラジカルである化合物である。

【0047】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｐが、アミド結合であるＤａｐとＤとの間のペプチド内結合を有するペプチドＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤ（配列番号８）のビラジカルである化合物である。

【0048】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合せて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ａ´が、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－；Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、Ｌ_６、Ｌ_７およびＬ_１２からなる群から選択されるビラジカルである化合物である。

【0049】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合せて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ａ´が、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｓ－；－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、Ｌ_６、およびＬ_７からなる群から選択されるビラジカルである化合物である。

【0050】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌが、３～８個のビラジカルから構成されるビラジカルであるリンカーであり、ｎが１～６の整数である化合物である。別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌが５～８個のビラジカルから構成されるビラジカルであるリンカーである化合物である。別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌが、６～８個のビラジカルから構成されるビラジカルであるリンカーである化合物である。別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌが、６～７個のビラジカルから構成されるビラジカルであるリンカーである化合物である。

【0051】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌが、６個のビラジカルから構成されるビラジカルであるリンカーである化合物である。

【0052】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ａ´がＬ_３であり、Ｌ_ｃ´が－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－である化合物である。別のより特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ａ´がＬ_３であり、Ｌ_ｂ´が、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－、－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｏ－；および－（ＣＨ_２）_ｒ－ＮＨ－ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され；Ｌ_ｃ´が－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－である化合物である。

【0053】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌが、２個のビラジカルから構成されるビラジカルであるリンカーであり、ｎ＝０である化合物である。

【0054】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ａ´がＬ_１２であり、Ｌ_ｃ´がＬ_１３である化合物である。

【0055】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ａ´が－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－であり、Ｌ_ｃ´がＬ_１５である化合物である。

【0056】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ａ´が、Ｌ_ａ´式の描画の左側のＣ＝Ｏ基と形成されたエステル結合である結合を介して基Ｚに、および式の描画の右側の官能基と形成されたアミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実行可能な結合を介して基Ｌ_ｂ´に結合している化合物である。

【0057】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ａ´が、Ｌ_ａ´式の描画の左側のＣ＝Ｏ基と形成されたエステル結合である結合を介して基Ｚに、および式の描画の右側の官能基と形成されたアミド結合である化学的に実行可能な結合を介して基Ｌ_ｂ´に結合している化合物である。

【0058】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ａ´が、Ｌ_ａ´式の描画の左側のＣ＝Ｏ基と形成されたカーボネートまたはカルバメート結合である結合を介して基Ｚに、および式の描画の右側の官能基と形成されたアミド結合（ＮＨ－ＣＯまたはＣＯ－ＮＨ）である化学的に実行可能な結合を介して基Ｌ_ｂ´に結合している化合物である。

【0059】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ｂ´が、描かれたＬ_ｂ´式の左側の官能基と共にラジカルＬ_ａ´と化学的に実行可能な結合を形成する化合物であり；Ｌ_ｂ´は、描かれたＬ_ｂ´式の右側の官能基と形成されたアミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実行可能な結合を介してラジカルＬ_ｃ´に結合し；ｎが１より大きい場合、Ｌ_ｂ´は等しいかまたは異なり、アミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィドエステルおよびチオエステルからなる群から選択される化学的に実現可能な結合を介してそれらの間で結合し；一方のＬ_ｂ´末端はＬ_ａ´に結合し、他方のＬ_ｂ´末端はＬ_ｃ´に結合している。

【0060】

別の特定の実施形態において、上記または下記の特定の実施形態のいずれかと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物は、Ｌ_ｃ´が、描かれたＬ_ｃ´式の右側のカルボニル基、およびペプチド配列Ｐの第１のアミノ酸のアミノ基と形成されたアミド結合を介してビラジカルＰに、および式の描画の左側の官能基と形成されたアミン、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、およびチオエステルからなる群から選択される化学的に実行可能な結合を介して基Ｌ_ｂ´に結合している化合物である。

【0061】

別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式（Ｉ）中、Ｐは、ＤａｐとＤとの間のペプチド内結合を有するＭｉｎｉＡｐ４＝ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤであり、Ｙ＝ＣＯＮＨ_２、Ｗ＝０であり、リンカーは、以下のリンカーＡであり、ＳＮ３８は、ヒドロキシル（ｂ）によってリンカーに結合している。

【化14】

【0062】

この化合物は、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４とも呼ばれる。

【0063】

別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式（Ｉ）中、Ｐは、ＤａｐとＤとの間のペプチド内結合を有さないＭｉｎｉＡｐ４＝ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤ直系であり、Ｙ＝ＣＯＮＨ_２、Ｗ＝０であり、リンカーは、以下のリンカーＡであり、ＳＮ３８は、ヒドロキシル（ｂ）によってリンカーに結合している。

【化15】

【0064】

この化合物は、本明細書においてＧ２Ｂ－００１直系とも呼ばれる。

【0065】

別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉｃ）の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式（Ｉ）中、Ｐは、ＤａｐとＤとの間のペプチド内結合を有するＭｉｎｉＡｐ４＝ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤであり、Ｙ＝ＣＯＮＨ_２、Ｗ＝０であり、リンカーは、以下のリンカーＡであり、ＳＮ３８は、ヒドロキシル（ａ）によってリンカーに結合している。

【化16】

【0066】

この化合物は、本明細書においてＧ２Ｂ－００３直系とも呼ばれる。

【0067】

リンカーＡは、以下によって形成される。
Ｌａ´：右がｒ＝４、左がｒ＝３であるＬ_３：

【化17】

Ｌｂ´：１単位のビラジカル－ＮＨ－（ＣＨ_２）_３－Ｏ－、２単位のビラジカル－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－および１単位のビラジカル－（ＣＨ_２）_３－ＮＨ－；ならびにＬｃ´：－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_２－Ｃ（＝Ｏ）－；ビラジカルは、以下の図のように連結され、リンカーＡに対応する。

【化18】

【0068】

別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉｄ）の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式（Ｉ）中、Ｐは、ＤａｐとＤとの間のペプチド内結合を有するＭｉｎｉＡｐ４＝ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤであり、Ｙ＝ＣＯＮＨ_２、Ｗ＝０であり、リンカーは、以下のリンカーＣであり、ＳＮ３８は、ヒドロキシル（ａ）によってリンカーに結合している。

【化19】

【0069】

この化合物は、本明細書においてＧ２Ｂ－００４直系とも呼ばれる。リンカーＣは、以下によって形成される。Ｌａ´：Ｌ_１２およびＬｃ´：Ｌ_１３、およびｎ＝０。

【0070】

別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉｅ）の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式（Ｉ）中、Ｐは、ＤａｐとＤとの間のペプチド内結合を有するＭｉｎｉＡｐ４＝ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤであり、Ｙ＝ＣＯＮＨ_２、Ｗ＝０であり、リンカーは、以下のリンカーＤであり、ＳＮ３８は、ヒドロキシル（ａ）によってリンカーに結合している。

【化20】

【0071】

この化合物は、本明細書においてＧ２Ｂ－００５直系とも呼ばれる。リンカーＤは、以下によって形成される。Ｌａ´：ｒ＝１である－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）ｒ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｌｂ´：Ｌ_１５およびｎ＝０。

【0072】

式（Ｉ）の化合物は、化学合成によって全体的または部分的に生成することができる。式（Ｉ）の化合物の調製に必要なアミノ酸は市販されている。式（Ｉ）の化合物は、例えば液相での合成によって、または好ましくは固相ペプチド合成によって容易に調製することができ、それに関していくつかの手順が公開されている（Ｍ．Ａｍｂｌａｒｄ，ｅｔａｌ．，´´Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｔｏｃｏｌｓｏｆｍｏｄｅｒｎｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００６，Ｖｏｌ．３３，ｐ．２３９－２５４を参照されたい）。式（Ｉ）の化合物はまた、液相合成および／または固相合成の任意の組み合わせによって調製することもできる。例えば、固相合成によってペプチドＰの本体を合成し、続いて溶液中の保護基を除去することによって調性することができるＳＮ－３８のリンカーＬおよびペプチドＰへの結合は、固相または溶液中で行うことができる。リンカーＬの構造はまた、液相合成および／または固相合成の任意の組み合わせによって調製することもできる。

【0073】

本発明のペプチドはまた、ＤＮＡ鋳型の作製および発現ベクターへのサブクローニングによっても得ることができる（Ｊ．Ｈ．Ｌｅｅｅｔａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．３０Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１．Ｖｏｌ．２６８．Ｐｐ．２００４－２０１２を参照されたい）。

【0074】

式（Ｉａ）の化合物ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４は、式（ＩＩＩ）の化合物を上記の式（ＩＶ）の化合物と反応させて式（Ｉａ）の化合物を得ることを含むプロセスにより調製することができる。

【化21】

【0075】

式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩の調製は、当技術分野において公知の方法によって行うことができる。例えば、それらは、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含む親化合物から調製することができる。一般に、そのような塩は、例えば、水中または有機溶媒中またはそれらの混合物中で、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論量的量の適切な薬学的に許容される塩基または酸と反応させることによって調製される。

【0076】

治療有効量の上記に定義される式（Ｉ）の化合物を、適切な量の薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む医薬組成物もまた、本発明の一部である。本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、投与された場合に、対処される疾患の１つまたは複数の症状の発症を予防するか、またはある程度緩和するのに十分な化合物の量を指す。当然ながら、本発明に従って投与される化合物の特定の用量は、投与される化合物、経由する投与、処置される特定の状態、および同様の考慮事項を含む、症例を取り巻く特定の状況によって決定される。

【0077】

「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載の化合物と、希釈剤または担体等の他の化学成分との混合物を指す。医薬組成物は、生物への化合物の投与を容易にする。「薬学的に許容される賦形剤または担体」という用語は、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを指す。各成分は、医薬組成物の他の成分と適合性であるという意味で薬学的に許容されなければならない。これはまた、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または利益／リスク比に見合った他の問題もしくは合併症なしに、人間および動物の組織または器官と接触する使用に適切でなければならない。

【0078】

本発明の組成物は、体内への注射、注入または移植に適した非経口形態で投与され得る。

【0079】

本発明の化合物の重要な特徴は、試験した腫瘍細胞株の細胞増殖を阻害するそれらの生物活性である。実施例に例示されるように、本発明の化合物は、いくつかのがん細胞株において抗腫瘍特性を示す。

【0080】

すでに説明されたように、実験の項で提供される比較データは、ＳＮ３８が同じリンカー（リンカーＡ）を介して以下の式の別のペプチド（ＴＨＲｒｅ）にコンジュゲートされた場合、抗腫瘍活性の一部／全部が失われ、本発明のリンカーとは異なるリンカーも使用された場合（リンカーＢ）、結果はさらに悪いことを示している。リンカーＢは、－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_２－Ｃ（＝Ｏ）－である。ＴＨＲｒｅは、以下の式を有する：Ｈ－Ｄ－Ｐｒｏ－Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ｐｒｏ－Ｄ－Ｓｅｒ－Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｐｒｏ－Ｄ－Ｐｒｏ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｈｉｓ－Ｄ－Ｔｈｒ－ＣＯＮＨ_２。しかしながら、本発明の例示された化合物は、予想外にも、ＳＮ３８と同様に、脳がんおよび頭蓋外がん由来のいくつかの細胞株に対する抗腫瘍活性を維持し、イリノテカンよりもはるかに高く、インビトロで、ヒト血清中で良好な安定性を有する。

【0081】

したがって、医薬として使用するための、上で定義した式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩は、本発明の一部である。

【0082】

試験された全ての種類のがんにおいて活性であるため、ヒトを含む哺乳動物のがんの処置に使用するための上で定義された式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もまた、本発明の一部である。この態様はまた、ヒトを含む哺乳動物のがんを処置および／または予防するための医薬品を調製するための上で定義された式（Ｉ）の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩の使用として説明することができる。本発明はまた、がんに罹患しているまたはがんに罹患しやすいヒトを含む哺乳動物の処置方法であって、治療有効量の式（Ｉ）の化合物または上で定義されたそれらの薬学的に許容される塩を薬学的に許容される賦形剤または担体と共に上記患者に投与することを含む方法に関する。

【0083】

特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、がん処置は、頭蓋外固形腫瘍、眼腫瘍およびＣＮＳ腫瘍からなる群から選択される腫瘍の処置を含む。別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、がんは、成人神経膠腫、小児神経膠腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、ＤＩＰＧ、神経芽腫および横紋筋肉腫からなる群から選択される。別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、小児神経膠腫は、びまん性内在性橋神経膠腫（ＤＩＰＧ）および小児高悪性度神経膠腫からなる群から選択される。別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、がんは、びまん性内在性橋神経膠腫である。別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、がんは、網膜芽細胞腫である。別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、がんは、ユーイング肉腫である。別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、がんは、神経芽腫である。別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、がんは、横紋筋肉腫である。別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、がんは、成人神経膠腫である。

【0084】

別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物、化合物は、Ａ６７３、ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７、ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－０１１、ＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１、Ｒｄ、ＲＨ４、ＨＳＪＤ－ＲＢＴ－５、ＨＳＪＤ－ＲＢＴ－７、ＨＳＪＤ－ＲＢＴ－１４、Ｕ３７３、Ｕ８７、ＬＡＮ－１、ＳＫ－Ｎ－ＪＤ、ＨＳＪＤ－ＮＢ－００４、ＨＳＪＤ－ＮＢ－００５、ＨＳＪＤ－ＮＢ－０１３およびＨＳＪＤ－ＮＢ－０１６からなる群から選択されるがん細胞株に対して活性である。

【0085】

別の特定の実施形態において、化合物は、上で定義された使用のための化合物であり、式（Ｉ）の化合物は、静脈内ボーラスおよび／または静脈内注入によって投与される。

【0086】

本発明の化合物は、他の公知の化学療法剤と同じ様式で、すなわち、処置される状態に応じて、同時にまたは逐次的に、他の処置と組み合わせて使用することができる。それらは、単独で、または他の適切な生物活性化合物と組み合わせて使用され得る。したがって、本発明の式（Ｉ）の化合物は、化学療法剤との併用療法におけるヒトを含む哺乳動物のがんの処置に使用するための化合物である。また、本発明の式（Ｉ）の化合物は、エステル安定剤と組み合わせてヒトを含む哺乳動物のがんの処置に使用するための化合物である。適切なエステル安定剤は、カルボキシルエステラーゼ阻害剤である。カルボキシルエステラーゼ阻害剤の例は、Ｍ．Ｊ．ＨａｔｆｉｅｌｄａｎｄＰ．Ｍ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔ．２０１１，ｖｏｌ．２１（８），ｐｐ．１１５９－１１７１に見出すことができる。

【0087】

特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、カルボキシルエステラーゼ阻害剤と組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、カルボキシルエステラーゼ阻害剤と同時に投与される。別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、治療有効間隔内で、任意の順序で別個に投与される。

【0088】

特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、別の化学療法剤と組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、別の化学療法剤と同時に投与される。別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、治療有効間隔内で、任意の順序で別個に投与される。

【0089】

別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、別の化学療法剤およびカルボキシルエステラーゼ阻害剤と組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、別の化学療法剤およびカルボキシルエステラーゼ阻害剤と同時に投与される。別の特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、別の化学療法剤およびカルボキシルエステラーゼ阻害剤と、治療有効間隔内で、任意の順序で別個に投与される。

【0090】

本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む」という単語およびその単語の変化形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、またはステップを除外することを意図するものではない。さらに、「含む」という言葉は、「からなる」の場合を包含する。本発明の追加の目的、利点、および特徴は、本明細書を検討することで当業者に明らかになるか、または本発明の実践によって学ぶことができる。以下の実施例および図面は、例示として提供されており、本発明を限定することを意図するものではない。図面に関連し、特許請求の範囲において括弧内に配置された参照符号は、単に特許請求の範囲の明瞭性を高めることを試みるためのものであり、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、本発明は、本明細書に記載の具体的な好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。

【実施例】

【0091】

保護されたアミノ酸、ハンドルおよび樹脂は、ＬｕｘｅｍｂｏｕｒｇＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（テルアビブ、イスラエル）、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ（ストラスブール、フランス）、ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍＡＧ（レウフェルフィンゲン、スイス）、ＢａｃｈｅｍＡＧ（ブーベンドルフ、スイス）またはＩｒｉｓＢｉｏｔｅｃｈ（マルクトレドヴィッツ、ドイツ）から供給された。使用された他の試薬および溶媒を表１に要約する。

【0092】

【表1】

【0093】

手動合成に関する一般的な考慮点：固相ペプチド伸長および他の固相操作は、ポリエチレン多孔性ディスクを取り付けたポリプロピレンシリンジ内で、手動で行った。溶媒および可溶性試薬を吸引によって除去した。異なる合成ステップ間の洗浄は、毎回１０ｍＬの溶媒／樹脂ｇを使用して、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５×３０秒）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）（５×３０秒）で行った。

【0094】

マイクロ波支援合成に関する一般的な考慮点：マイクロ波支援固相ペプチド合成は、ＬｉｂｅｒｔｙＢｌｕｅＡｕｔｏｍａｔｅｄＭｉｃｒｏｗａｖｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにおいて、Ｈ－リンクアミドプロチド樹脂（投入量：０．５６ｍｍｏｌ／ｇ）を用いて行った。直鎖ペプチドを、樹脂に対して５過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸（０．２Ｍ）を使用して、０．５ｍｍｏｌ規模で合成した。

【0095】

同定試験：同定および合成の制御に使用した試験は以下の通りであった：Ａ）固相結合第一級アミンの検出にはＫａｉｓｅｒ比色アッセイ（Ｅ．Ｋａｉｓｅｒｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７０，ｖｏｌ．３４，ｐｐ．５９５－５９８）；Ｂ）固相に結合した第二級アミンにはｐ－ニトロフェニルエステル試験（Ａ．Ｍａｄｄｅｒｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９，ｐｐ．２７８７－２７９１）。

【0096】

化合物の手動合成中に使用したプロトコル：以下の方法およびプロトコルを使用して、化合物を１００μｍｏｌスケールで合成した：手動合成用の樹脂は、基Ｙに応じて選択した：ＹがＯＨである場合、末端はＣＯＯＨであり、利用可能なものの中でも２－クロロトリチルクロリド樹脂が選択される。ＹがＮＨ_２である場合、末端はＣＯＮＨ_２であり、利用可能なものの中でもリンクアミドＭＢＨＡ樹脂が選択される。

【0097】

樹脂の初期調整：樹脂を、ＭｅＯＨ（５×３０秒）、ＤＭＦ（５×３０秒）、ＤＣＭ（５×３０秒）、ＤＣＭ中１％ＴＦＡ（１×３０秒および２×１０分）、ＤＣＭ（５×３０秒）、ＤＭＦ（５×３０秒）、ＤＣＭ（５×３０秒）、ＤＣＭ中５％ＤＩＥＡ（１×３０秒、２×１０分）、ＤＣＭ（５×３０秒）、ＤＭＦ（５×３０秒）で洗浄することによって調整した。

【0098】

Ｆｍｏｃ基の除去：９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基の除去を、ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて、３０秒の処理、続いてそれぞれ１０分の２回の処理を用いて行った。ＤＢＵ、トルエン、ピペリジン、ＤＭＦ（５％、５％、２０％、７０％）による２回のさらなる処理（２×５分）を行い、第二級アミン（プロリン）からのＦｍｏｃ基の除去を確実にした。

【0099】

１００μｍｏｌスケールについて説明されるカップリング方法：

【0100】

カップリング方法１：ＤＭＦ（１～３ｍＬ／ｇ樹脂）に溶解した保護されたアミノ酸（４当量、４００μｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（４当量、４００μｍｏｌ、１２８ｍｇ）を樹脂に順次添加し、続いてＤＩＥＡを添加した（８当量、８００μｍｏｌ、１３６μｌ）。混合物を断続的に手動で撹拌しながら１時間反応させた。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。カップリングの程度をＫａｉｓｅｒ比色アッセイによって確認した。Ｆｍｏｃ基を、３０秒処理および１０分の２回処理を用い、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液（ｖ／ｖ）で除去した。脱保護すべきアミノ酸がプロリンである場合、ＤＢＵ、トルエン、ピペリジン、ＤＭＦ（５％、５％、２０％、７０％）を用いたさらなる処理（２×５分）を適用して、Ｆｍｏｃ基の除去を確実にした。

【0101】

カップリング方法２：ＤＭＦ（１～３ｍＬ／ｇ樹脂）に溶解した保護されたアミノ酸（４当量、４００μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（４当量、４００μｍｏｌ、２０８ｍｇ）、ＨＯＡｔ（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、１６３ｍｇ）を樹脂に順次添加し、続いてＤＩＥＡを添加した（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、２０４μＬ）。混合物を断続的に手動で撹拌しながら１時間反応させた。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。カップリング反応を同じ条件で２回行った。カップリングの程度をＫａｉｓｅｒ比色アッセイによって確認した。Ｆｍｏｃ基を、３０秒処理および１０分の２回処理を用い、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液（ｖ／ｖ）で除去した。脱保護すべきアミノ酸がプロリンである場合、ＤＢＵ、トルエン、ピペリジン、ＤＭＦ（５％、５％、２０％、７０％）を用いたさらなる処理（２×５分）を適用して、Ｆｍｏｃ基の除去を確実にした。

【0102】

カップリング方法３：ＤＭＦ（１～３ｍＬ／ｇ樹脂）に溶解した保護されたアミノ酸（４当量、４００μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（４当量、４００μｍｏｌ、２０８ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、１６２ｍｇ）を樹脂に順次添加し、続いてＤＩＥＡを添加した（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、２０４μＬ）。混合物を断続的に手動で撹拌しながら１時間反応させた。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。カップリング反応を同じ条件で２回行った。カップリングの程度をＫａｉｓｅｒ比色アッセイによって確認した。Ｆｍｏｃ基を、３０秒処理および１０分の２回処理を用い、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液（ｖ／ｖ）で除去した。脱保護すべきアミノ酸がプロリンである場合、ＤＢＵ、トルエン、ピペリジン、ＤＭＦ（５％、５％、２０％、７０％）を用いたさらなる処理（２×５分）を適用して、Ｆｍｏｃ基の除去を確実にした。

【0103】

カップリング方法４、スケール１００μｍｏｌ：ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中の保護されたアミノ酸（３当量、３００μｍｏｌ）、ＤＩＣ（３当量、３００μｍｏｌ、４６μＬ）およびＯｘｙｍａ（３当量、３００μｍｏｌ、４３ｍｇ）。混合物を断続的に手動で撹拌しながら４５分間反応させた。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。カップリングの程度をＫａｉｓｅｒ比色アッセイによって確認した。Ｆｍｏｃ基を、３０秒処理および１０分の２回処理を用い、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液（ｖ／ｖ）で除去した。脱保護すべきアミノ酸がプロリンである場合、ＤＢＵ、トルエン、ピペリジン、ＤＭＦ（５％、５％、２０％、７０％）を用いたさらなる処理（２×５分）を適用して、Ｆｍｏｃ基の除去を確実にした。

【0104】

カップリング方法５、スケール１００μｍｏｌ：ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中の保護されたアミノ酸（３当量、３００μｍｏｌ）、ＤＩＣ（３当量、３００μｍｏｌ、４６μＬ）およびＨＯＢｔ（３当量、３００μｍｏｌ、４１ｍｇ）。混合物を断続的に手動で撹拌しながら４５分間反応させた。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。カップリングの程度をＫａｉｓｅｒ比色アッセイによって確認した。Ｆｍｏｃ基を、３０秒処理および１０分の２回処理を用い、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液（ｖ／ｖ）で除去した。脱保護すべきアミノ酸がプロリンである場合、ＤＢＵ、トルエン、ピペリジン、ＤＭＦ（５％、５％、２０％、７０％）を用いたさらなる処理（２×５分）を適用して、Ｆｍｏｃ基の除去を確実にした。

【0105】

マイクロ波支援自動合成中に使用したプロトコル：以下の方法およびプロトコルを使用して、化合物を５００μｍｏｌスケールで合成した：マイクロ波支援自動合成用の樹脂は、基Ｙに応じて選択した：ＹがＯＨである場合、末端はＣＯＯＨであり、利用可能なものの中でもＣｌ－ＴＣＰ（Ｃｌ）ＰｒｏＴｉｄｅ樹脂が選択される。ＹがＮＨ_２である場合、末端はＣＯＮＨ_２であり、利用可能なものの中でもリンクアミドＰｒｏＴｉｄｅ樹脂が選択される。

【0106】

【0107】

マイクロ波支援自動ペプチド合成のためのカップリングおよび脱保護条件：

【0108】

カップリング条件：

【数1】

【0109】

脱保護条件：

【数2】

【0110】

ペプチド配列Ｐの環化のための方法：

【0111】

環化方法１：ジスルフィド又はジセレニド結合：樹脂からの開裂後に溶液中で、またはＣｙｓ、ＳｅｃもしくはＰｅｎ残基の選択的脱保護後に樹脂上で環化を行った。ペプチドを、１００μＭの濃度で、水性重炭酸アンモニウム緩衝液１０ｍＭおよびｐＨ８．０に溶解した。溶液を室温で２４時間激しく撹拌した。その後、生成物をＴＦＡでｐＨ２～３に酸性化し、凍結し、凍結乾燥した。

【0112】

環化方法２：アミド結合：樹脂上で環化を行った。Ｆｍｏｃ基を、３０秒処理および１０分の２回処理を用い、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液（ｖ／ｖ）で除去した。Ｂｏｃ_２Ｏ（３当量、１０００μｍｏｌ、５６ｍｇ）およびＤＩＥＡ（３０当量、３０００μｍｏｌ、２４０μＬ）を用いて、Ｎ末端アミンをＢｏｃ保護基で保護した。最初に、ＤＣＭ中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．１当量、１０μＭ、１２ｍｇ）、フェニルシラン（１０当量、１０００μｍｏｌ、１２３ｍｇ）の添加によってＯＡｌ基およびＡｌｌｏｃ基を脱保護した（３×１５分）。樹脂をＤＣＭ中０．０２Ｍジエチルカルバミン酸ナトリウムで洗浄した（３×５分）。次いで、ＰｙＢＯＰ（４当量、４００μｍｏｌ、２０８ｍｇ）、ＨＯＡｔ（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、１６３ｍｇ）、ＤＭＦ（１～３ｍＬ／ｇ樹脂）およびＤＩＥＡ（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、２０４μＬ）を添加することによって、Ｄａｐのアミノ基とアスパラギン酸のカルボキシレート基とのカップリングを達成した。カップリングを１．５時間放置し、一晩繰り返した。

【0113】

環化方法３：アミド結合：樹脂上で環化を行った。Ｆｍｏｃ基を、３０秒処理および１０分の２回処理を用い、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液（ｖ／ｖ）で除去した。Ｂｏｃ_２Ｏ（３当量、１０００μｍｏｌ、５６ｍｇ）およびＤＩＥＡ（３０当量、３０００μｍｏｌ、２４０μＬ）を用いて、Ｎ末端アミンをＢｏｃ保護基で保護した。最初に、ＤＣＭ中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．１当量、１０μＭ、１２ｍｇ）、フェニルシラン（１０当量、１０００μｍｏｌ、１２３ｍｇ）の添加によってＯＡｌ基およびＡｌｌｏｃ基を脱保護した（３×１５分）。樹脂をＤＣＭ中０．０２Ｍジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで洗浄した（３×５分）。次いで、３０分の４当量のＯｘｙｍａ（４００μｍｏｌ、５７ｍｇ）および４のＮ，Ｎ´－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（４００μｍｏｌ、６１μＬ）の２サイクルによって、Ｄａｐのアミノ基とアスパラギン酸のカルボキシレート基とのカップリングを達成した。

【0114】

環化方法４：アミド結合：樹脂上で環化を行った。Ｆｍｏｃ基を、３０秒処理および１０分の２回処理を用い、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液（ｖ／ｖ）で除去した。Ｂｏｃ_２Ｏ（３当量、１０００μｍｏｌ、５６ｍｇ）およびＤＩＥＡ（３０当量、３０００μｍｏｌ、２４０μＬ）を用いて、Ｎ末端アミンをＢｏｃ保護基で保護した。最初に、ＤＣＭ中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．１当量、１０μＭ、１２ｍｇ）、フェニルシラン（１０当量、１０００μｍｏｌ、１２３ｍｇ）の添加によってＯＡｌ基およびＡｌｌｏｃ基を脱保護した（３×１５分）。樹脂をＤＣＭ中０．０２Ｍジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで洗浄した（３×５分）。次いで、１時間の４当量のＤＩＣ（４００μｍｏｌ、６１μＬ）および４のＨＯＢｔ（４００μｍｏｌ、５４ｍｇ）の２サイクルによって、Ｄａｐのアミノ基とアスパラギン酸のカルボキシレート基とのカップリングを達成した。

【0115】

リンカーＬを構築するための一般的な方法：

【0116】

ジスルフィドを形成するための一般的な方法：ジスルフィド結合は、２つのチオールの反応によって達成することができる。チオールを１００μＭの濃度で１０ｍＭおよびｐＨ８．０の重炭酸アンモニウム緩衝水溶液に溶解し、溶液を室温で２４時間激しく撹拌する。その後、溶液をＴＦＡでｐＨ２～３に酸性化し、凍結し、凍結乾燥した。

【0117】

チオエーテルを形成するための一般的な方法：チオエーテル結合は、Ｐ．Ｌ．Ｂａｒｋｅｒｅｔａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９２．Ｖｏｌ３５．Ｐｐ．２０４０－２０４８に記載されているように、Ｎ末端ブロモアセチル基とシステインチオールとの反応により達成される。

【0118】

エーテルを形成するための一般的な方法：エーテル形成は、好ましくはＧｒｅｅｎｅ´ｓＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．ＰｅｔｅｒＧ．Ｍ．Ｗｕｔｓ．２０１４ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ｐａｇｅｓ２６－２９に記載されている塩基性条件下で、ヒドロキシル基とハロアルキル化合物との反応によって達成することができる。

【0119】

エステルを形成するための一般的な方法：エステル形成は、Ｇｒｅｅｎｅ´ｓＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．ＰｅｔｅｒＧ．Ｍ．Ｗｕｔｓ．２０１４ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ｐａｇｅｓ２７１－２７９に記載されているように、酸触媒の存在下でのフィッシャーエステル化等の典型的なエステル化条件を使用したヒドロキシル基とカルボン酸との反応によって、または代替としてヒドロキシル基と対応する酸塩化物との反応により達成することができる。

【0120】

チオエステルを形成するための一般的な方法：チオエステル結合は、Ｍ．Ｋａｚｅｍｉｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｕｌｆｕｒＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，ｖｏｌ．３６：６，ｐｐ．６１３－６２３に記載されているように、チオールとカルボン酸との反応によって達成される。

【0121】

ウレタンを形成するための一般的な方法：ヒドロキシル基とイソシアネートとの反応は、Ｍ．Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６３，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．６８７８－６８８５に記載されているように、対応するウレタンを生成し得る。

【0122】

シリルエーテルを形成するための一般的な方法：ヒドロキシル基とハロトリアルキルシリルとの反応により、対応するシリルエーテルが得られる。Ｇｒｅｅｎｅ´ｓＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．ＰｅｔｅｒＧ．Ｍ．Ｗｕｔｓ．２０１４ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ｐａｇｅｓ４５６－４６３に記載されているように、酸捕捉剤が通常必要である。

【0123】

スルホネートを形成するための一般的な方法：Ｆ．Ｄａｖｉｄｅｔａｌ．，Ｏｒｇ．ＰｒｏｃｅｓｓＲｅｓ．Ｄｅｖ．２０１０，１４，４，９９９－１００７に記載されているように、ヒドロキシル基とアルキルまたはアリールスルホニルハライドとの反応は、対応するスルホネートエステルを生成する。

【0124】

ホスフェートを形成するための一般的な方法：脱水条件下または光延反応条件を使用したヒドロキシル基と１個のヒドロキシ基を有するジアルキルまたはジアリールリン酸エステルとの反応は、置換基の１つがヒドロキシル基に結合した鎖である対応するリン酸エステルを形成することができる。

【0125】

ケタールを形成するための一般的な方法：ケタールは、Ｇｒｅｅｎｅ´ｓＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．ＰｅｔｅｒＧ．Ｍ．Ｗｕｔｓ．２０１４ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ｐａｇｅｓ６９－７７に記載されているように、ヒドロキシル基とハロメチレンオキシアルキル化合物との反応によって、または酸性条件下で置換ジヒドロピランもしくはジヒドロフランにヒドロキシル基を付加することによって形成することができる。

【0126】

ヘミケタールを形成するための一般的な方法：ヒドロキシル基とアルデヒドとの接触は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｆｆｓｎｏｔｅｓ．ｃｏｍ／ｓｔｕｄｙ－ｇｕｉｄｅｓ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｏｒｇａｎｉｃ－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ｉｉ／ａｌｄｅｈｙｄｅｓ－ａｎｄ－ｋｅｔｏｎｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎｓ－ｏｆ－ａｌｄｅｈｙｄｅｓ－ａｎｄ－ｋｅｔｏｎｅｓに記載されているように、対応するヘミケタールの形成をもたらし得る。

【0127】

カルバメートを形成するための一般的な方法：カルバメートは、Ｇｒｅｅｎｅ´ｓＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．ＰｅｔｅｒＧ．Ｍ．Ｗｕｔｓ．２０１４ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．．ｐａｇｅｓ３７１－３７４に記載されているように、ヒドロキシル基とハロホルメートまたはイソシアネートとの反応によって形成することができる。

【0128】

カーボネートを形成するための一般的な方法：カーボネートは、ＥｕｒＪＰｈａｒｍＢｉｏｐｈａｒｍ，２０１７，ｖｏｌ．１１５，ｐｐ．１４９－１５８に記載されているようにＳＮ３８とＰＮＰＣとの、またはＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，ｖｏｌ．５１，ｐｐ．６９１６－６９２６に記載されているようにトリホスゲンとの反応によって形成することができる。

【0129】

Ｆｍｏｃ－ＴＴＤＳ－ＯＨのカップリング：Ｆｍｏｃ－ＴＴＤＳ－ＯＨ（２当量）のカップリングは、３０分のＤＭＦ中の４当量のオキシマおよび４のＮ，Ｎ´－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、またはＤＣＭ中の４当量のＤＩＣおよび４のＨＯＢｔの２サイクルのいずれかによって２時間で達成された。続いて、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基の除去を、ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて、３０秒の処理、続いてそれぞれ１０分の２回の処理を用いて行った。

【0130】

５－ヘキシン酸のカップリング：５－ヘキシン酸（２当量、２００μｍｏｌ、２３ｍｇ）のカップリングは、３０分のＤＭＦ：ＤＣＭ（１：１）中の４当量のＯｘｙｍａ（４００μｍｏｌ、５７ｍｇ）および４のＮ，Ｎ´－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（４００μｍｏｌ、６１μＬ）、もしくはＤＭＦ：ＤＣＭ１：１中の４当量のＤＩＣ（４００μｍｏｌ、６１μＬ）および４のＨＯＢｔ（４００μｍｏｌ、５４ｍｇ）のＤＣＭ中の２サイクルで４時間、またはＤＭＦ：ＤＣＭ１：１中の２当量のＰｙＢＯＰ（４００μｍｏｌ、２０８ｍｇ）、６当量のＨＯＡｔ（６００μｍｏｌ、８１．５ｍｇ）および６当量のＤＩＥＡ（６００μｍｏｌ、１０２μＬ）でＤＭＦ中１．５時間のいずれかによって達成された。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。同じ条件下でカップリングを繰り返した。カップリングの程度を、Ｋａｉｓｅｒ比色アッセイを用いて監視した。

【0131】

ジグリコール酸無水物のカップリング：ジグリコール酸無水物（１０当量、１０００μｍｏｌ、１１６ｍｇ）のカップリングは、ＤＭＦ中１０当量のＤＩＥＡ（１０００μｍｏｌ、１７４μＬ）の６０分の２サイクルにより達成された。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。同じ条件下でカップリングを繰り返した。カップリングの程度を、Ｋａｉｓｅｒ比色アッセイを用いて監視した。

【0132】

樹脂から切断するための一般的な方法：樹脂の最終的な切断および側鎖脱保護：これは、樹脂をＴＦＡ（９５％）、Ｈ_２Ｏ（２．５％）およびＴＩＳ（２．５％）で処理することによって行った（２時間）。得られた生成物にｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルを添加し、混合物を遠心分離した（３×８分）。上清を捨て、ペレットをＨ_２Ｏ、ＭｅＣＮおよびＴＦＡの混合物（１０００：１０００：１）に再懸濁した。生成物を濾別し、凍結した。

【0133】

化合物の特性評価のための一般的な方法：化合物を、ＵＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙハイクラスシステム（ＰＤＡ検出器、サンプルマネージャＦＮＴおよび四級溶媒マネージャ、ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラム、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用した。すべての場合において、２分間の線形勾配を使用した）およびＵＰＬＣ－ＭＳ分光法（エレクトロスプレーイオン源ＥＳＩ－ＭＳＭｉｃｒｏｍａｓｓＺＱに連結され、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、マサチューセッツ州）を使用したＷａｔｅｒｓハイクラス（ＰＤＡ検出器、サンプルマネージャＦＮＴおよび四級溶媒マネージャ））によって特性評価した。ＢＥＨＣ１８カラム（５０×２．１ｍｍ×１．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用する。流速は０．６ｍＬ／分とし、溶媒としてＭｅＣＮ（０．０７％ギ酸）およびＨ_２Ｏ（０．１％ギ酸）を用いた。試料を正イオン化で分析した：イオン噴霧電圧は３０Ｖであり、キャピラリ温度は１ｋＶであった。正確な質量を、質量分析計によって得た：直接注入（自動ナノエレクトロスプレー）での試料導入を伴うＬＴＱ－ＦＴＵｌｔｒａ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＮａｎｏＭａｔｅ（ＡｄｖｉｏｎＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、イタカ、ニューヨーク州、米国）は、使い捨ての導電性ピペットチップを備えた３８４ウェルプレート（タンパク質Ｌｏｂｉｎｄ）から試料を吸引し、質量分析計に向けてｎａｎｏＥＳＩチップ（２０×２０アレイの４００個のノズルからなる）を通して試料を注入した。スプレー電圧は１．７０ｋＶであり、送達圧力は０．５０ｐｓｉであった。イオン化はＮａｎｏＥＳＩ正イオン化であった。

【0134】

ＮＭＲ実験は、ＴＣＩクライオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅＩＩＩ６００ＭＨｚ分光計で行った。３～４ｍＭの９０％Ｈ_２Ｏ／１０％Ｄ_２Ｏに化合物を溶解することによって試料を調製し、ｐＨを２～３に調整した。化学シフトは、内部のナトリウム－３－（トリメチルシリル）プロパンスルホネート（ＤＳＳ）を基準とした。水シグナルの抑制は、励起スカルプティングによって達成された。残基特異的帰属が２Ｄ全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）および相関分光法（ＣＯＳＹ）実験から得られたが、２Ｄ核Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ効果分光法（ＮＯＥＳＹ）は配列特異的帰属を可能にした。２Ｄ１Ｈ１３ＣＨＳＱＣスペクトルから、１３Ｃ共鳴が帰属された。２７８Ｋで取得されたＮＯＥＳＹスペクトルを除いて、全ての実験は２９８Ｋで行われた。２７８～３０８Ｋで取得された一連の一次元スペクトルから、アミドプロトン温度係数が決定された。ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ混合時間は、それぞれ７０および２５０ｍｓであった。

【0135】

実施例１：（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル（４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´，４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）カーボネートの調製

【0136】

２５０ｍｌフラスコで、１．５ｇの７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン（ＳＮ３８）、１．３当量のジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（１．１５ｍＬ）および過剰の乾燥ピリジン（９ｍＬ）を、１５０ｍｌの乾燥ＤＣＭに添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、反応混合物をＨＣｌ（０，５Ｎ）×３、飽和ＮａＨＣＯ_３×１およびブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を真空下で除去した。さらなる精製は行わなかった。逆相ＵＰＬＣ－ＰＤＡ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中０～１００％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１．８９分。収率：９６％、［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：４９３．５Ｄａ。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ７．８１（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．２５－７．２０（ｍ、１Ｈ）、６．９１－６．８５（ｍ、１Ｈ）、５．３２（ｄ、Ｊ＝１６．３、１Ｈ）、４．８６（ｄ、Ｊ＝１Ｈｚ、６Ｈ）、３．８５（ｓ、１Ｈ）、２．７３（ｑ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．６０（ｓ、１Ｈ）、１．５７－１．４１（ｍ、３Ｈ）、１，２１（ｓ、１０Ｈ）、０．９９（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、３Ｈ）、０．６１（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、３Ｈ）。

【0137】

実施例２：（Ｓ）－９－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）オキシ）－４，１１－ジエチル－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´、４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル５－アジドペンタノエートの調製

【0138】

丸底フラスコ中で、４００ｍｇの（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル（４，１１ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４ジオキソ－３，４，１２，１４テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´、４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）カーボネート（実施例１）、１．６当量の５－アジド－ペンタン酸（１９３ｍｇ）をＮ_２でパージした後、乾燥ＤＣＭに溶解した。混合物を０℃で冷却した。次いで、１．４当量のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ´－エチルカルボジイミド塩酸塩（２１８ｍｇ）を添加し、混合物を０℃で１時間および室温で一晩撹拌した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３×３、ＨＣｌ（０，１Ｎ）×２およびブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空下で除去した。化合物をさらに精製することなく使用した。［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：６１８．３６Ｄａ。

【0139】

実施例３：（Ｓ）－４，１１－ジエチル－９－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´，４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル５－アジドペンタノエートの調製（実施例１～３の結果としてのアジドによるＳＮ３８の修飾）

【0140】

丸底フラスコ中で、１．５ｇの（Ｓ）－９－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）オキシ）－４，１１－ジエチル－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´，４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル５－アジドペンタノエート（実施例２）を、５０ｍｌのＨＣｌ（ジオキサン中の４Ｎ）中、室温で２時間撹拌した。その後、溶媒を真空下で除去し、粗混合物を、９５％を超える純度で（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％））を用いてシリカで精製した。実施例１からの総収率：８％、［Ｍ＋Ｈ］^＋：５１８，５８Ｄａ。逆相ＵＰＬＣ－ＰＤＡ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中０～１００％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１．８１９分。［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：５１８．５８Ｄａ。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ１．００（ｔ、３Ｈ）、１．３８（ｔ、３Ｈ）、１．６５（ｍ、２Ｈ）、１．６９（ｍ、２Ｈ）、２．２０（ｍ、２Ｈ）、２．５６（ｍ、２Ｈ）、３．１３（ｑ、３Ｈ）、３．２７（ｔｄ、２Ｈ）、５．２０（ｓ、２Ｈ）、５．３９－５．７２（ｄｄ、２Ｈ）、７．４２（ｄ、１Ｈ）、７．４８（ｓ、１Ｈ）、７．６２（ｄｄ、１Ｈ）、８．４５（ｄ、１Ｈ）。

【0141】

実施例４：（Ｓ）－９－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）オキシ）－４，１１－ジエチル－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´、４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イルｔｅｒｔ－ブチルスクシネートの調製

【0142】

１ｍｍｏｌの実施例１からの（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル（４，１１ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４ジオキソ－３，４，１２，１４テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´、４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）および１．５当量のモノ－ｔｅｒｔ－ブチルスクシネートを丸底フラスコに添加し、Ｎ_２でパージした。試薬を２０ｍｌの乾燥ＤＣＭに溶解し、０℃で冷却した。次いで、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ´－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）を添加し、混合物を０℃で１時間および室温で一晩撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３×３、ＨＣｌ（０，１Ｎ）×２およびブラインで洗浄した。次いで、これをＭｇＳＯ_４で乾燥させ、揮発性物質を蒸発させ、乾燥させた。化合物をさらに精製することなく使用した。収率７２％。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ０．９２（ｔ、３Ｈ）、１．３０（ｓ、９Ｈ）、１．３３（ｍ、３Ｈ）、１．３８（ｑ、２Ｈ）、１．４２（ｓ、２Ｈ）、１．５５（ｓ、９Ｈ）、２．１４（ｄｄｑ、２Ｈ）、２．４９（ｔｄ、２Ｈ）、２．６９（ｍ、２Ｈ）、２．８６（ｄｄ、２Ｈ）、３．０９（ｍ、２Ｈ）、５．２０（ｓ、２Ｈ）、５．３２（ｄ、２Ｈ）、５．６１（ｄ、２Ｈ）。

【0143】

実施例５：（Ｓ）－４－（（４，１１ジエチル－９－ヒドロキシ－３，１４ジオキソ－３，４，１２，１４テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´，４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸の調製（実施例４および５の結果としてのコハク酸によるＳＮ３８の修飾）

【0144】

丸底フラスコ中で、（Ｓ）－９－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）オキシ）－４，１１－ジエチル－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´，４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イルｔｅｒｔ－ブチルスクシネート（実施例４）を、２０ｍｌのＨＣｌ（ジオキサン中４Ｎ）中、室温で２時間撹拌した。その後、溶媒を蒸発させ、粗混合物をＴｅｌｅｄｙｎｅ－ＩＳＣＯ、勾配０～５０で精製した。収率３２％および９５％を超える純度で所望の化合物が得られた。収率３２％。逆相ＵＰＬＣ－ＰＤＡ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中０～１００％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１．４９８分。［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：４９１．２７Ｄａ。^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ１．０２（ｔ、３Ｈ）、１．３９（ｔ、３Ｈ）、２．２２（ｍ、２Ｈ）、２．６１（ｔ、２Ｈ）、２．８４（ｍ、２Ｈ）、３．１６（ｑ、２Ｈ）、５．２７（ｓ、２Ｈ）、５．４５（ｄ、２Ｈ）、５．６０（ｄ、２Ｈ）、７．３３（ｓ、１Ｈ）、７．４２（ｄｑ、１Ｈ）、８．０３（ｄ、１Ｈ）。

【0145】

アルキン－アジド環化付加のための方法：アルキン－アジド環化付加（クリック反応）カップリングを、Ｓ．Ｆ．Ｍ．ｖａｎＤｏｎｇｅｎｅｔａｌ．；ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２００９，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．２０－２３に記載されているプロトコルを使用して溶液中で行った。

【0146】

この反応は、ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｃｌｉｃｋ－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ｄｎａ－ｌａｂｅｌｉｎｇ）に記載されている手順に従ってマイクロ波なしで行ったが、この反応は完了するのに約２日を要した。ＣｕをリガンドＴＨＴＰＡと共に使用した。ＳＮ３８－Ｎ_３はＨ_２Ｏに溶けなかったため、また水にも混合物（水／ＤＭＳＯ）にも溶けないことから、緩衝液およびＤＭＳＯの代わりにＤＭＦのみを使用して反応を行った。

【0147】

代替として、アルキン－ＴＴＤＳ－ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤとＳＮ３８－Ｎ_３とのアルキン－アジド付加環化（クリック反応）は、マイクロ波を使用して行った：１０ｍｌのＳＮ３８－Ｎ_３（１．５当量）のマイクロ波バイアルに、アルキン－ＴＴＤＳ－ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤ（１当量）、ＣｕＴＨＴＰＡ（０．１５当量）およびアスコルビン酸ナトリウム（０．３当量）を添加し、３ｍｌのＤＭＦに溶解した。全ての反応中、３０℃で、ＭＷ（ｄｉｓｃｏｖｅｒＳＰＭＷ）で支援して混合物を２～４時間撹拌した。粗混合物をＨＰＬＣ半分取（Ｃ１８）で精製した。

【0148】

アルキン－アジド環化付加（クリック化学）のための試薬の調製：５５％ＤＭＳＯ中１００ｍＭ銅（ＩＩ）－ＴＨＰＴＡストック：５０ｍｇの硫酸銅（ＩＩ）五水和物を１ｍＬの蒸留水に溶解し、１１６ｍｇのトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）リガンドを１．１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。次いで、２つの溶液を混合した。

【0149】

５ｍＭアスコルビン酸ストック：１８ｍｇのアスコルビン酸を２０ｍＬの蒸留水に溶解した。

【0150】

生成物の精製および特性評価のための一般的な方法：化合物を、半分取スケールでＲＰ－ＨＰＬＣにより精製し、ＵＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙハイクラスシステム（ＰＤＡ検出器、サンプルマネージャＦＮＴおよび四級溶媒マネージャ、ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラム、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用した。すべての場合において、２分間の線形勾配を使用した）およびＵＰＬＣ－ＭＳ分光法（エレクトロスプレーイオン源ＥＳＩ－ＭＳＭｉｃｒｏｍａｓｓＺＱに連結され、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、マサチューセッツ州）を使用したＷａｔｅｒｓハイクラス（ＰＤＡ検出器、サンプルマネージャＦＮＴおよび四級溶媒マネージャ））によって特性評価した。ＢＥＨＣ１８カラム（５０×２．１ｍｍ×１．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用する。流速は０．６ｍＬ／分とし、溶媒としてＭｅＣＮ（０．０７％ギ酸）およびＨ_２Ｏ（０．１％ギ酸）を用いた。試料を正イオン化で分析した：イオン噴霧電圧は３０Ｖであり、キャピラリ温度は１ｋＶであった。正確な質量を、質量分析計によって得た：直接注入（自動ナノエレクトロスプレー）での試料導入を伴うＬＴＱ－ＦＴＵｌｔｒａ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＮａｎｏＭａｔｅ（ＡｄｖｉｏｎＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、イタカ、ニューヨーク州、米国）は、使い捨ての導電性ピペットチップを備えた３８４ウェルプレート（タンパク質Ｌｏｂｉｎｄ）から試料を吸引し、質量分析計に向けてｎａｎｏＥＳＩチップ（２０×２０アレイの４００個のノズルからなる）を通して試料を注入した。スプレー電圧は１．７０ｋＶであり、送達圧力は０．５０ｐｓｉであった。イオン化はＮａｎｏＥＳＩ正イオン化であった。全てのペプチドが９５％を超える純度で得られた。

【0151】

実施例６：Ｄａｐ側鎖アミノ基とＡｓｐ側鎖カルボン酸との間にアミド結合を有するヘキシン酸－ＴＴＤＳ－Ｄａｐ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－ＮＨ_２（ヘキシン酸－ＴＴＤＳ－配列番号７）の調製。

【0152】

第１の保護アミノ酸の樹脂への手動カップリングには、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＡｌ）－ＯＨ（１１８．５ｍｇ）を用いてカップリング法４を適用した。その後のアミノ酸を、カップリング方法４を使用して以下のように順次カップリングした：

【0153】

【数3】

【0154】

ＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１）中の４６μＬのＤＩＣおよび４３ｍｇのＯｘｙｍａを使用する。混合物を断続的に手動で撹拌しながら４５分間反応させた。各カップリング後、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基の除去を、ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて、３０秒の処理、続いてそれぞれ１０分の２回の処理を用いて行った。ＤＢＵ、トルエン、ピペリジン、ＤＭＦ（５％、５％、２０％、７０％）による２回のさらなる処理（２×５分）を行い、第二級アミン（プロリン）からのＦｍｏｃ基の除去を確実にした。環化方法２に従い、樹脂上で環化を行った：Ｆｍｏｃ基を、３０秒処理および１０分の２回処理を用い、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液（ｖ／ｖ）で除去した。Ｂｏｃ_２Ｏ（３当量、１０００μｍｏｌ、５６ｍｇ）およびＤＩＥＡ（３０当量、３０００μｍｏｌ、２４０μＬ）を用いて、Ｎ末端アミンをＢｏｃ保護基で保護した。最初に、ＤＣＭ中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．１当量、１０μＭ、１２ｍｇ）、フェニルシラン（１０当量、１０００μｍｏｌ、１２３ｍｇ）の添加によってＯＡｌ基およびＡｌｌｏｃ基を脱保護した（３×１５分）。樹脂をＤＣＭ中０．０２Ｍジエチルカルバミン酸ナトリウムで洗浄した（３×５分）。次いで、ＰｙＢＯＰ（４当量、４００μｍｏｌ、２０８ｍｇ）、ＨＯＡｔ（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、１６３ｍｇ）、ＤＭＦ（１～３ｍＬ／ｇ樹脂）およびＤＩＥＡ（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、２０４μＬ）を添加することによって、Ｄａｐのアミノ基とアスパラギン酸のカルボキシレート基とのカップリングを達成した。カップリングを１．５時間放置し、一晩繰り返した。

【0155】

Ｆｍｏｃ－ＴＴＤＳ－ＯＨのカップリング：Ｆｍｏｃ－ＴＴＤＳ－ＯＨ（２当量、２００μｍｏｌ、１０８．５３ｍｇ）のカップリングを、ＤＣＭ中４当量のＤＩＣ（４００μｍｏｌ、６１μＬ）および４のＨＯＢｔ（４００μｍｏｌ、５４ｍｇ）によって２時間で達成した。続いて、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基の除去を、ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて、３０秒の処理、続いてそれぞれ１０分の２回の処理を用いて行った。

【0156】

５－ヘキシン酸のカップリング：樹脂上に固定されたペプチドへの５－ヘキシン酸のカップリングには、以下のプロトコルを使用した：ＤＭＦ（１～３ｍＬ／ｇ樹脂）中のヘキシン酸（４当量、４００μｍｏｌ、４５ｍｇ）、ＰｙＢＯＰ（４当量、４００μｍｏｌ、２０８ｍｇ）およびＨＯＡｔ（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、１６３ｍｇ）を樹脂に順次添加し、続いて１２当量のＤＩＥＡ（１．２ｍｍｏｌ、２０４μＬ）を添加した。混合物を断続的に手動で撹拌しながら１．５時間反応させた。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。同じ条件下でカップリングを繰り返した。カップリングの程度を、Ｋａｉｓｅｒ比色アッセイを用いて監視した。

【0157】

次いでペプチドを切断し、凍結乾燥した。生成物の特性評価逆相ＵＰＬＣ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中２０～６０％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：０．９３９分。ＵＰＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：１３０８．１５Ｄａ；収率（合成および精製）：７．５％。

【0158】

実施例７：式（Ｉａ）の化合物、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４の調製

【0159】

実施例６のように調製したヘキシン酸－ＴＴＤＳ－ＭｉｎｉＡｐ４から出発し、実施例３のように調製したＳＮ３８－Ｎ_３を用いて、以下のプロトコルに従いＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４とも呼ばれる式（Ｉａ）の化合物を達成した：

【0160】

マイクロ波バイアルに、１０ｍｌの１．５当量の（Ｓ）－４，１１－ジエチル－９－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´，４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル５－アジドペンタノエート、１当量のアルキン－ＴＴＤＳ－ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤ、０．１５当量のＣｕＴＨＰＴＡおよび０．３当量のアスコルビン酸ナトリウムを添加し、３ｍｌのＤＭＦに溶解した。全ての反応中、３０℃で、ＭＷ（ＣＥＭｄｉｓｃｏｖｅｒＳＰＭＷ）で支援して混合物を２～４時間撹拌した。粗生成物を半分取スケールでＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。９５％を超える純度で化合物が得られた。生成物の特性評価：逆相ＵＰＬＣ－ＰＤＡ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中０～１００％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１．４６２分。ＵＰＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：１８２４．７６Ｄａ；収率（合成および精製）：３０％。

【0161】

比較例１：ＳＮ３８リンカーＡ－ＴＨＲｒｅ

【0162】

この比較例では、使用されるアミノ酸は全てＤ－アミノ酸である。第１の保護アミノ酸の樹脂への手動カップリングには、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（１５９ｍｇ）を用いてカップリング法４を適用した。その後のアミノ酸を、カップリング方法４を使用して以下のように順次カップリングした：

【数4】

【0163】

【0164】

【0165】

【0166】

このヘキシン酸－ＴＴＤＳ－ＴＨＲｒｅにより、実施例３のように調製したＳＮ３８－Ｎ_３を使用して、以下のプロトコルに従いＳＮ３８－リンカーＡ－ＴＨＲｒｅを達成した：１０ｍｌの１．５当量の（Ｓ）－４，１１－ジエチル－９－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´，４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル５－アジドペンタノエート、１当量のアルキン－ＴＴＤＳ－ＴＨＲｒｅ、０，１５当量のＣｕＴＨＰＴＡおよび０，３当量のアスコルビン酸ナトリウムを添加し、３ｍｌのＤＭＦに溶解した。全ての反応中、３０℃で、ＭＷ（ＣＥＭｄｉｓｃｏｖｅｒＳＰＭＷ）で支援して混合物を２～４時間撹拌した。粗生成物を半分取スケールでＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。９５％を超える純度で化合物が得られた。生成物の特性評価：逆相ＵＰＬＣ－ＰＤＡ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中０～１００％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１．５９７分。ＵＰＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：２４０３．８６Ｄａ。

【0167】

比較例２：ＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ

【0168】

【数5】

【0169】

【0170】

次いでペプチドを切断し、凍結乾燥した。このＴＨＲｒｅにより、実施例５のように調製したＳＮ３８－コハク酸を使用して、以下のプロトコルに従いＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅを達成した：丸底フラスコに、１．５当量の（Ｓ）－４－（（４，１１－ジエチル－９－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´，４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸、１．２当量のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ´－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）および１．２当量のＮ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を、Ｎ_２雰囲気下および０℃で添加し、次いで乾燥ＤＭＦを添加し、１０分間撹拌した。その後、ＴＨＲｒｅを添加し、室温で反応させた。粗生成物を半分取スケールでＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。９５％を超える純度で化合物が得られた。生成物の特性評価：逆相ＵＰＬＣ－ＰＤＡ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中０～１００％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１．５４３分。ＵＰＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋２Ｈ］_ｅｘｐ ^＋２：９８２．３２Ｄａ。

【0171】

実施例８ａ：水への溶解度の評価。

【0172】

２５ｍｇのＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４をＨ_２Ｏに溶解すると、完全に透明な溶液を示した。これは、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４が、ＳＮ３８について説明された水への溶解度（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１６，１３，３７９－３９０）の４００倍を超える５ｍｇ／ｍＬ超の水への溶解度を有することを意味する。

【0173】

Ｇ２Ｂ－００１直系（Ｉｂ）、Ｇ２Ｂ－００３（Ｉｃ）、Ｇ２Ｂ－００４（Ｉｄ）およびＧ２Ｂ－００５（Ｉｅ）は、１ｍｇ／ｍＬの水への良好な溶解度を示す。

【0174】

実施例８ｂ：ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４の濁度測定溶解度の評価。

【0175】

ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を段階希釈して、ＤＭＳＯ中０．１、０．３、１および３ｍＭの溶液を得た。次いで、最終ＤＭＳＯ濃度が１％になり、最終試験化合物濃度が１、３、１０、３０および１００μＭになるように、各試験化合物濃度を緩衝液（０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４）中で１００分の１にさらに希釈した。実験を３７℃で行い、各濃度を７つの反復ウェルでインキュベートした。プレートを３７℃で２時間インキュベートした後、吸光度を６２０ｎｍで測定した。ニカルジピンおよびピレンを対照化合物として含めた。ニカルジピンの溶解度はｐＨ依存性であるが、ピレンの溶解度はｐＨ非依存性である。溶解度は、ビヒクル対照（緩衝液中１％ＤＭＳＯ）を上回る吸光度の増加をもたらす試験化合物の濃度から推定した。表２を参照されたい。

【0176】

【表2】

【0177】

予想通り、１００マイクロモルまでＧ２Ｂ－００１の溶解度の問題は見られなかった。

【0178】

実施例９：化合物（Ｉａ）の抗腫瘍活性：がん細胞株：びまん性内在性橋神経膠腫、成人神経膠腫および小児固形腫瘍網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫および神経芽腫に対するＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｇ２Ｂ－００１とも呼ばれる）。

【0179】

本発明者らは、新規化合物（Ｉａ）ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭＩｎｉＡｐ４（Ｇ２Ｂ－００１とも呼ばれる）の活性を、密接に関連する薬物の１つであるＳＮ３８およびイリノテカンと比較した。

【0180】

がん細胞株は、ＨｏｓｐｉｔａｌＳａｎｔＪｏａｎｄｅＤｅｕ（バルセロナ、スペイン）で維持される貯蔵所から得た。これらの実験で使用されたがん細胞株には、成人神経膠腫（Ｕ３７３およびＵ８７細胞株）、びまん性内在性橋神経膠腫を含む小児神経膠腫（ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７、ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－０１１）、および小児高悪性度神経膠腫（ＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１）、網膜芽細胞腫（ＨＳＪＤ－ＲＢＴ－５、ＨＳＪＤ－ＲＢＴ－７およびＨＳＪＤ－ＲＢＴ－１４）、ユーイング肉腫（Ａ６７３）、横紋筋肉腫（ＲｄおよびＲＨ４）および神経芽腫（ＬＡＮ－１およびＳＫ－Ｎ－ＪＤ細胞株ならびにＨＳＪＤ－ＮＢ－００４、ＨＳＪＤ－ＮＢ－００５およびＨＳＪＤ－ＮＢ－０１６患者由来細胞モデル）のがん型が含まれた。簡単に説明すると、３０００～３０，０００個のがん細胞を９６ウェルプレート内で培養し、２４時間後に細胞を化合物ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）（濃度範囲１～０．０００００００１μＭ）、ＳＮ３８（濃度範囲１～０．０００００００１μＭ）またはイリノテカン（濃度範囲１００～０．０００００１μＭ）に曝露した。培養中の細胞に薬物を添加するために、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）およびイリノテカンを、水中１ｍｇ／ｍＬの濃度のストック溶液から培養培地中で調製した。ＳＮ３８は、ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬの濃度のストック溶液から培養培地中で調製した。テトラゾリウム化合物［３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム］（ＭＴＳアッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ、フィッチブルク、ウィスコンシン州）を使用して、薬物との７２時間のインキュベーション後に細胞生存率を決定した。細胞増殖の５０％の低減を引き起こすのに必要な薬物の濃度（ＩＣ５０および９５％信頼区間）を、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ８ソフトウェア（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を用いて計算した。成人神経膠腫細胞株Ｕ８７（図１）およびＵ３７３（図２）、ＤＩＰＧモデルＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７（図３）およびＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－０１１（図４）を含む小児神経膠腫、ならびに小児高悪性度神経膠腫モデルＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１（図５）、網膜芽細胞腫モデルＨＳＪＤ－ＲＢＴ－５（図６）、ＨＳＪＤ－ＲＢＴ－７（図７）およびＨＳＪＤ－ＲＢＴ－１４（図８）、ユーイング肉腫細胞株Ａ６７３（図９）、横紋筋肉腫細胞株Ｒｄ（図１０）およびＲＨ４（図１１）、神経芽腫細胞株ＬＡＮ－１（図１２）およびＳＫ－Ｎ－ＪＤ（図１３）、ならびに神経芽腫患者由来細胞モデルＨＳＪＤ－ＮＢ－００４（図１４）、ＨＳＪＤ－ＮＢ－００５（図１５）およびＨＳＪＤ－ＮＢ－０１６（図１６）について、活性曲線を構築した。

【0181】

確立されたＩＣ５０値を表３に示す。

【0182】

【表3】

【0183】

図１７に示すように、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）について得られたＩＣ５０の値は、薬物イリノテカン（Ｐ＜０．０００１；対応ありＡＮＯＶＡ検定）よりも有意に低かった。

【0184】

実施例１０：単回および反復静脈内注射におけるＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）のインビボ忍容性。

【0185】

無胸腺ヌードマウス（１０週齢；群あたり８匹のマウス）におけるイリノテカンおよびＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）（Ｇ２Ｂ－００１とも呼ばれる）の毒性を評価するために、最初に、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）の最大耐量（ＭＴＤ）を静脈内注射によって試験した。３匹のマウスに２００、５００および１０００ｍｇ／ｋｇの用量レベルで注射し、その後１４日間の死亡または体重減少を含む症状を観察した。ＭＴＤは２００ｍｇ／ｋｇに確立された。この用量レベルでは、未処置対照動物と比較して、マウスは生存し、その後１４日間苦痛の即時的症状または有意な体重減少を示さなかった（図１８）。

【0186】

単回ｉ．ｖ．でのＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）のＭＴＤの確立時に、本発明者らは、臨床的に関連する複数回投与レジメンでイリノテカンで処置したマウスおよび等モル投与量でのＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）で処置したマウスの平均体重を比較した。簡単に説明すると、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によるイリノテカン１０ｍｇ／ｋｇ（１～５、８～１２および２９～３３日目の１５回の投与）、または静脈内（ｉ．ｖ．）へのＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）３０ｍｇ／ｋｇ（１、３、５、８、１０、１２、２９、３１、３３日目の９回の投与）でマウスを処置した。このレジメンは、マウスにおける最大可能数のｉ．ｖ．注射と考えられた。１～５日目、８～１２日目および２９～３３日目に、対照マウスを生理食塩水でｉ．ｐ．で処置した。

【0187】

マウス体重を４０日目まで測定し、平均値およびＳＤ値を各群について図１９に表す。マウスは、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）処置の結果、対照と比較して有意な体重減少を示さなかった。ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）（Ｉａ）処置マウスの体重は、臨床的に関連する用量のイリノテカンで処置したマウスの体重と同様であった。

【0188】

実施例１１：ＳＮ３８のコンジュゲート、ＳＮ３８とＭｉｎｉＡｐ４（ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４、実施例７）およびＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒ（比較例２）の比較活性。

【0189】

本発明者らは、ＭｉｎｉＡｐ４（ＳＮ３８－ｌｉｎｋｅｒＡ－ＭｉｎｉＡｐ４、実施例７、Ｇ２Ｂ－００１とも呼ばれる）およびＳＮ３８リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ（比較例２）とコンジュゲートした新規化合物ＳＮ３８の活性を比較した。元の化合物ＳＮ３８を参照として使用した。これらの実験で使用したがん細胞株は、びまん性内在性橋神経膠腫ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７を含む小児神経膠腫、および小児高悪性度神経膠腫ＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１であった。簡単に説明すると、３０００個のがん細胞を９６ウェルプレート内で培養し、２４時間後に細胞を化合物化合物（Ｉａ）（濃度範囲１～０．０００００００１μＭ）、ＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ（濃度範囲１～０．０００００００１μＭ）およびＳＮ３８（濃度範囲１～０．０００００００１μＭ）に曝露した。培養中の細胞に薬物を添加するために、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）およびＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅを、水中１ｍｇ／ｍＬの濃度のストック溶液から培養培地中で調製した。ＳＮ３８は、ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬの濃度のストック溶液から培養培地中で調製した。ＭＴＳアッセイを使用して、薬物との７２時間のインキュベーション後の細胞生存率を決定した。細胞増殖の５０％の低減を引き起こすのに必要な薬物の濃度（ＩＣ５０および９５％信頼区間）を、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ８ソフトウェア（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を用いて計算した。細胞ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７（図２０）およびＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１（図２１）について活性曲線を構築した。確立されたＩＣ５０値を表４に示す。観察され得るように、ＴＨＲｒｅへのＳＮ３８コンジュゲーションは、ＭｉｎｉＡｐ４へのコンジュゲーションよりも低い活性をもたらした。

【0190】

【表4】

【0191】

実施例１２．化合物ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）、比較例１（ＳＮ３８－リンカーＡ－ＴＨＲｒｅ）および比較例２（ＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ）の比較活性（ペプチドならびにペプチドおよびリンカーの両方の効果）。

【0192】

前の実施例１１では、化合物（Ｉａ）および比較例２（ＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ）は異なるサイズのリンカーで構成されていたため、本発明者らは、両方の化合物の活性を、化合物（Ｉａ）を有する比較例１（ＳＮ３８－リンカーＡ－ＴＨＲｒｅ）および同じリンカーを有する比較例１のうちの１つと比較した。

【0193】

これらの実験で使用したがん細胞株は、びまん性内在性橋神経膠腫ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７を含む小児神経膠腫、および小児高悪性度神経膠腫ＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１であった。簡単に説明すると、３０００個のがん細胞を９６ウェルプレート内で培養し、２４時間後に細胞を化合物（Ｉａ）、比較例１および比較例２（それぞれの濃度範囲１～０．００１μＭ）に曝露した。すべての化合物を、１ｍｇ／ｍＬの濃度の水溶液のストック溶液から培養培地中で調製した。ＭＴＳアッセイを使用して、薬物との７２時間のインキュベーション後の細胞生存率を決定した。細胞増殖の５０％の低減を引き起こすのに必要な薬物の濃度（ＩＣ５０および９５％信頼区間）を、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ８ソフトウェア（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を用いて計算した。細胞ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７（図２２）およびＨＳＪＤ－ＧＢＭ－００１（図２３）について活性曲線を構築した。比較例１（ＳＮ３８－リンカーＡ－ＴＨＲｒｅ）および比較実施例２（ＳＮ３８－リンカーＢ－ＴＨＲｒｅ）は、化合物（Ｉａ）よりも低い活性を示した。したがって、化合物（Ｉａ）の驚くべき活性は、比較例１および比較例２と比較して、ペプチドＭｉｎｉＡｐ４によるものだけでなく、空間リンカーによるものであった。確立されたＩＣ５０値を表５に示す。

【0194】

【表5】

【0195】

実施例１３：時間に対するインビトロでの３７℃でのヒト血清中のＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４の安定性。

【0196】

ヒト血清中のＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）（実施例７）の安定性について、緩衝液ＨＢＳＳ中、９０％ヒト血清の存在下、３７℃で２００μＭの濃度でインキュベートした。一定の時間範囲で、１００μＬのアリコートを収集し、血清タンパク質を沈殿させるためにこれに４００μＬの冷メタノールを添加した。試料を３０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、濾過し、ＵＰＬＣ－ＰＤＡおよびＵＰＬＣ－ＭＳによって分析して、ＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）の分解度を決定した。２４時間で有意な分解は観察されず、これは半減期がこの時間枠よりも長いことを意味する（図２４）。

【0197】

実施例１４：時間に対するインビトロでの３７℃でのラット、マウス、イヌおよびヒト血漿中のＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｇ２Ｂ－００１）（Ｉａ）の安定性。

【0198】

３７℃でのヒト、マウス、イヌおよびラット血漿中のＳＮ３８－リンカーＡ－ＭｉｎｉＡｐ４（Ｉａ）（実施例７）の安定性を評価するために、化合物を、各種について各時点（０時間、１時間、４時間、８時間および２４時間）で三連で血漿試料中２００μＭで調製した。インキュベーションが完了したら、冷メタノール（比４：１、メタノール：血漿）を添加することによって血漿タンパク質を直ちに沈殿させ、チューブを数秒振盪した（ボルテックス）。試料を４℃で３０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を回収し、インジェクションプレートに移し、ＬＣ－ＭＳシステムに注入した。

【0199】

化合物回収率は、分析物を添加して処理した生物学的試料中の分析物応答と、分析物を添加して処理したメタノール試料中の応答とを比較することによって決定した。

【0200】

血漿安定性アッセイを、未処置のボランティア／動物由来のブランク血漿を使用して行った。Ｋ２－ＥＤＴＡを抗凝固剤として使用した。使用したヒトブランク血漿はＨｏｓｐｉｔａｌＳａｎｔＰａｕから入手し、使用したマウスブランク血漿はＪａｎｖｉｅｒから入手し、使用したイヌブランク血漿はＩｓｏｑｕｉｍｅｎから入手し、使用したラットブランク血漿はＤｒａｃｏｎｉｓＰｈａｒｍａから入手した。

【0201】

ヒト、マウス、イヌおよびラット血漿中の２００μＭでのＧ２Ｂ－００１の半減期は、半減期が８～２４時間であったマウスおよびイヌの血漿中の化合物Ｇ２Ｂ－００１を除いて、２４時間を超えていた（図２５）。

【0202】

【表6】

【0203】

実施例１５：Ｄａｐ側鎖アミノ基とＡｓｐ側鎖カルボン酸との間にアミド結合を有さないヘキシン酸－ＴＴＤＳ－Ｄａｐ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－ＮＨ_２（ヘキシン酸－ＴＴＤＳ－配列番号１４）直系の調製。ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤ（配列番号１４）、すなわち線状ペプチド。

【0204】

【数6】

【0205】

【0206】

【0207】

５－ヘキシン酸のカップリング：樹脂上に固定されたペプチドへの５－ヘキシン酸のカップリングには、以下のプロトコルを使用した：ＤＭＦ（１～３ｍＬ／ｇ樹脂）中のヘキシン酸（４当量、４００μｍｏｌ、４５ｍｇ）、ＰｙＢＯＰ（４当量、４００μｍｏｌ、２０８ｍｇ）およびＨＯＡｔ（１２当量、１．２ｍｍｏｌ、１６３ｍｇ）を樹脂に順次添加し、続いて１２当量のＤＩＥＡ（１．２ｍｍｏｌ、２０４μＬ）を添加した。混合物を断続的に手動で撹拌しながら１．５時間反応させた。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。同じ条件下でカップリングを繰り返した。カップリングの程度をＫａｉｓｅｒ比色アッセイを用いて監視した。

【0208】

ＤＣＭ中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．１当量、１０μＭ、１２ｍｇ）、フェニルシラン（１０当量、１０００μｍｏｌ、１２３ｍｇ）の添加によってＯＡｌ基およびＡｌｌｏｃ基を脱保護した（３×１５分）。樹脂をＤＣＭ中０．０２Ｍジエチルカルバミン酸ナトリウムで洗浄した（３×５分）。

【0209】

次いでペプチドを切断し、凍結乾燥した。生成物の特性評価逆相ＨＰＬＣ：Ｘｂｒｉｄｇｅ２５ｃｍ３．５μｍカラムを使用した３０分でＨ_２Ｏ中１０～６０％ＭｅＣＮの直線勾配、１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１１．５２６分。収率（合成および精製）：９％。

【0210】

実施例１６：Ｄａｐ側鎖アミノ基とＡｓｐ側鎖カルボン酸との間にアミド結合を有さない式（Ｉｂ）、Ｇ２Ｂ－００１直系の化合物の調製。

【0211】

実施例１５のように調製したヘキシン酸－ＴＴＤＳ－ＭｉｎｉＡｐ４直系から出発し、実施例３のように調製したＳＮ３８－Ｎ_３を用いて、以下のプロトコルに従いＧ２Ｂ－００１直系とも呼ばれる式（Ｉｂ）の化合物を達成した：

【0212】

マイクロ波バイアルに、１０ｍｌの１．５当量の（Ｓ）－４，１１－ジエチル－９－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３´，４´：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル５－アジドペンタノエート、１当量のアルキン－ＴＴＤＳ－ＤａｐＫＡＰＥＴＡＬＤ直系、０．１５当量のＣｕＴＨＰＴＡおよび０．３当量のアスコルビン酸ナトリウムを添加し、３ｍｌのＤＭＦに溶解した。全ての反応中３０℃でＭＷ（ＣＥＭｄｉｓｃｏｖｅｒＳＰＭＷ）で支援して混合物を２～４時間撹拌した。粗生成物を半分取スケールでＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。９５％を超える純度で化合物が得られた。生成物の特性評価：逆相ＨＰＬＣ－ＭＳ：Ｌｕｎａ３μｍＣ１８（２）１００Ａ５０×２．１ｍｍカラムを使用した７分でＨ_２Ｏ中０～８０％ＭｅＣＮの直線勾配、０．８５ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）およびＨ_２Ｏ（０．１％ギ酸）を溶媒として使用；保持時間：５．０８分。ＵＰＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：１８４５．１０Ｄａ；収率（合成および精製）：２２％。

【0213】

実施例１７：Ｎ_３－Ｐｅｎ－ＳＮ３８の調製

【0214】

二口丸底フラスコ内に、１当量のＳＮ－３８（６００ｍｇ）を添加し、１グラム当たり１００ｍｌの乾燥ＤＣＭ（６０ｍｌ）に溶解した。濁った溶液が観察された。この反応混合物を０～２℃に冷却し、６当量のＤＩＥＡ（２ｍｌ）を添加し、１５分間撹拌した。１５分後、３当量のＮ_３－Ｐｅｎ－Ｃｌ（７００ｍｇ）を少量ずつ添加した［５００ｕＬの乾燥ＤＣＭに溶解］。これを１５分間冷却し、次いで室温で撹拌を続けた。反応の進行をＨＰＬＣによって確認した。出発材料が３％未満になったら、反応物を後処理に供した。

【0215】

反応混合物の初期体積約４５ｍｌを、乾燥ＤＣＭを用いてさらに３００ｍｌに調整した。

【0216】

これを蒸留水（反応混合物の最終体積の２０％体積）３×３分×６０ｍｌで３回抽出した。硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）を用いてＤＣＭ層を３０分間乾燥させ、ロータリーエバポレータで蒸発させた。得られた固体を８０：２０Ｈｅｘ：エーテルで２回処理し、デシケータ内で乾燥させるために保存した。後処理後の収量、７３０ｍｇ。生成物の特性評価逆相ＨＰＬＣ：クロマトグラフィー用Ｃ－１８シリカゲルＲ（５μｍ）を充填したＳＳカラム２５０×４．６ｍｍを使用した、３０分でＨ_２Ｏ中１０～９０％ＭｅＣＮの直線勾配、１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）を溶媒として使用、１９．７３０分。観察された質量＝５１８．２０Ｄａ、計算された質量＝５１７．１９Ｄａ。

【0217】

【化22】

【0218】

実施例１８：式（Ｉｃ）の化合物、Ｇ２Ｂ－００３の調製

【0219】

実施例６のように調製したヘキシン酸－ＴＴＤＳ－ＭｉｎｉＡｐ４直系から出発し、実施例１７のように調製したＮ_３－Ｐｅｎ－ＳＮ３８を用いて、以下のプロトコルに従いＧ２Ｂ－００３とも呼ばれる式（Ｉｃ）の化合物を達成した。

【0220】

１０ｍｌのバイアルに、１．５当量のＮ３－Ｐｅｎ－ＳＮ３８、１当量のヘキシン酸－ＴＴＤＳ－ＭｉｎｉＡｐ４、０．１５当量ＣｕＴＨＰＴＡおよび０．３当量のアスコルビン酸ナトリウムを添加し、３ｍｌのＤＭＦに溶解した。

【0221】

全ての反応中３０℃でマイクロ波（ＣＥＭｄｉｓｃｏｖｅｒＳＰＭＷ）で支援して混合物を２～４時間撹拌した。粗生成物を半分取スケールでＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。９５％を超える純度で化合物が得られた。生成物の特性評価：逆相ＨＰＬＣ：Ｘｂｒｉｄｇｅ２５ｃｍ３．５μｍカラムを使用した３０分でＨ_２Ｏ中２０～７０％ＭｅＣＮの直線勾配、１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１２．００分。ＵＰＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：１８２６．１５Ｄａ；収率（合成および精製）：１７％。

【0222】

実施例１９：ＳＮ３８－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－Ｇｌｙ－ＣＯＯＨの調製

【0223】

乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のグリシン－ＣＯＯＢｕ^ｔ（１当量）およびＤＭＡＰ（２当量）の溶液を、乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（１．３当量）の溶液に滴下により添加し、得られた溶液を５０℃で一晩撹拌した。次いで、反応混合物をＤＣＭ（１５０ｍＬ）中に希釈し、０．５ＮＨＣｌ（１００ｍＬ）で洗浄した。水層をＤＣＭ（５×１００ｍＬ）で洗浄し、すべての有機画分を回収し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＤＣＭ：Ｅｔ_２Ｏ；５：４：１）によって精製した。

【0224】

得られたＰＮＰ－Ｇｌｙ－ＣＯＯＢｕ^ｔ（１当量）を、乾燥ＤＣＭ中、ＤＭＡＰ（２当量）の存在下でＳＮ３８（１．２当量）と反応させた。反応物を５０℃で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。

【0225】

ＳＮ３８－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－Ｇｌｙ－ＣＯＯＢｕ^ｔをＴＦＡ：ＤＣＭ：ＴＩＳ（４０：４０：２０）で６時間処理することによってｔ－ブチルエステル基を除去した。その後、溶媒を蒸発させた。トルエンを２回添加して微量のＴＦＡを除去した。さらなる精製は行わなかった。

【0226】

実施例２０：Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＳＮ３８の調製

【0227】

丸底フラスコ内で、１当量の７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン（ＳＮ３８）、１当量のＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（ｉｒｉｓｂｉｏｔｅｃｈ製）、２当量のＤＩＥＡおよび触媒性ＤＭＡＰを、乾燥ＤＭＦ中、室温で１６時間撹拌した。その後、反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、ＨＣｌ（０．５Ｍ）（×３）およびブライン（×４）で洗浄した。次いで、これをＭｇＳＯ_４で乾燥させ、揮発性物質を蒸発させ、粗混合物をシリカクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ；２０：１；１５：１：９：１）によって精製した。５２％の収率および９０％を超える純度で所望の化合物が得られた。収率５２％。逆相ＵＰＬＣ－ＰＤＡ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中０～１００％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１．４２分。［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：８９８．４Ｄａ。

【0228】

実施例２１：Ｈ_２Ｎ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ．ＰＡＢ－ＳＮ３８の調製

【0229】

丸底フラスコ中で、実施例２０のように調製した１当量のＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＳＮ３８を、ＤＣＭ：ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ（４４．７５：４９．７５：０．５）の混合物中で５分間撹拌した。その後、溶媒を蒸発させた。トルエンを２回添加して微量のＴＦＡを除去した。さらなる精製は行わなかった。

【0230】

実施例２２：Ｇ２Ｂ－００４（Ｉｄ）の調製

【0231】

ジグリコール－ＭｉｎｉＡｐ４（上述の標準的方法、カップリング方法４を用いて調製）および２当量のＨ_２Ｎ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＳＮ３８（実施例２１のように調製）から出発し、ＰｙＢＯＰ（４当量）、ＤＭＦ（１～３ｍＬ／ｇ樹脂）に溶解したＨＯＡｔ（１２当量）を用い、続いてＤＩＥＡ（１２当量）を添加して、Ｇ２Ｂ－００４を調製した。混合物を断続的に手動で撹拌しながら１時間反応させた。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。カップリング反応を２回行った（１時間および一晩）。

【0232】

次いでＧ２Ｂ－００４を切断し、凍結乾燥した。生成物の特性評価逆相ＵＰＬＣ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中０～１００％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１．１７分。ＵＰＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：１８０７．８４Ｄａ；収率（合成および精製）：２１％。

【0233】

実施例２３：Ｇ２Ｂ－００５（Ｉｅ）の調製

【0234】

Ｎｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＭｉｎｉＡｐ４を、上述の標準的方法（カップリング方法４）を用いて調製した。

【0235】

Ｎｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＭｉｎｉＡｐ４および実施例１９のように調製した２当量のＳＮ３８－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－Ｇｌｙ－ＯＨから出発し、ＤＭＦ（１～３ｍＬ／ｇ樹脂）に溶解したＰｙＢＯＰ（４当量）、ＨＯＡｔ（１２当量）を用い、続いてＤＩＥＡ（１２当量）を添加して、Ｇ２Ｂ－００５を調製した。混合物を断続的に手動で撹拌しながら１時間反応させた。溶媒を吸引により除去し、樹脂をＤＭＦ（５×３０秒）およびＤＣＭ（５×３０秒）で洗浄した。カップリング反応を２回行った（１時間および一晩）。

【0236】

次いでＧ２Ｂ－００５を切断し、凍結乾燥した。生成物の特性評価逆相ＵＰＬＣ：ＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８（５０×２ｍｍ×１．７μｍ）カラムを使用した２分でＨ_２Ｏ中０～１００％ＭｅＣＮの直線勾配、０．６１ｍＬ／分、ＭｅＣＮ（０．０３６％ＴＦＡ）およびＨ_２Ｏ（０．０４５％ＴＦＡ）を溶媒として使用；保持時間：１．５１分。ＵＰＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］_ｅｘｐ ^＋：１６４０．７７Ｄａ；収率（合成および精製）：１８％。

【0237】

実施例２４：時間に対するインビトロでの３７℃でのヒト血漿中のＧ２Ｂ－００１直系（Ｉｂ）の安定性。

【0238】

３７℃でのヒト血漿中のＧ２Ｂ－００１直系（Ｉｂ）（実施例１６）の安定性を評価するために、化合物を、各時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間）で三連で血漿試料中２００μＭで調製した。インキュベーションが完了したら、冷メタノール（比４：１、メタノール：血漿）を添加することによって血漿タンパク質を直ちに沈殿させ、チューブを数秒振盪した（ボルテックス）。試料を４℃で３０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を回収し、インジェクションプレートに移し、ＬＣ－ＭＳシステムに注入した。化合物回収率は、分析物を添加して処理した生物学的試料中の分析物応答と、分析物を添加して処理したメタノール試料中の応答とを比較することによって決定した。

【0239】

血漿安定性アッセイを、未処置のボランティア由来のブランク血漿を使用して行った。Ｋ２－ＥＤＴＡを抗凝固剤として使用した。使用したヒトブランク血漿は、ＨｏｓｐｉｔａｌＳａｎｔＰａｕから得た。

【0240】

ヒトにおける２００μＭでのＧ２Ｂ－００１直系（Ｉｂ）の半減期は２４時間を超えていた（図２６）。

【0241】

【表7】

【0242】

実施例２５：がん細胞株に対するＧ２Ｂ－００１直系と呼ばれる新規化合物（Ｉｂ）の抗腫瘍活性：びまん性内在性橋神経膠腫

【0243】

本発明者らは、新規化合物（Ｉｂ）Ｇ２Ｂ－００１直系（実施例１６）の活性を、密接に関連する薬物の１つであるＧ２Ｂ－００１（Ｉａ）およびＳＮ３８と比較した。

【0244】

これらの実験で使用したがん細胞株は、ＨＳＪＤ－ＤＩＰＧ－００７であった。簡単に説明すると、３０００個のがん細胞を９６ウェルプレート内で培養し、２４時間後に細胞を化合物Ｇ２Ｂ－００１（Ｉａ）、化合物Ｇ２Ｂ－００１直系（Ｉｂ）、およびＳＮ－３８（それぞれの濃度範囲１～０．００１μＭ）に曝露した。ＭＴＳアッセイを使用して、薬物との７２時間のインキュベーション後の細胞生存率を決定した。Ｇ２Ｂ－００１（Ｉａ）およびＧ２Ｂ－００１直系（Ｉｂ）は、同様の活性を示した（図２７）。したがって、化合物Ｇ２Ｂ－００１（Ｉａ）のインビトロ活性は、化合物Ｇ２Ｂ－００１（Ｉｂ）への化学修飾後に維持された。実験の内部基準として、ＳＮ－３８は、実施例９で報告された活性と同様の活性を示した。確立されたＩＣ５０値を表８に示す。

【0245】

【表8】

【0246】

実施例２６：神経芽腫の患者由来異種移植片におけるＧ２Ｂ－００３（Ｉｃ）およびイリノテカンの比較抗腫瘍活性。腫瘍モデルは、ＨＳＪＤ－ＮＢ－０１３であった。

【0247】

本発明者らは、３匹の無胸腺ヌードマウスの両脇腹に皮下的に新たに切除した腫瘍（１匹のマウスから得た）を挿入した。生着したら（１００～５００ｍｍ^３の範囲の腫瘍体積）、マウスをイリノテカン、Ｇ２Ｂ－００３（Ｉｂ）または生理食塩水（対照）で、すべて静脈内で処置した。１、２、３、４、５、８、９、１０、１１および１２日目に、１匹のマウスに１０ｍｇ／ｋｇのイリノテカンを１０回投薬した。１、２、３、４、５および８日目に、１匹のマウスに１００ｍｇ／ｋｇのＧ２Ｂ－００３（Ｉｂ）を６回投薬した。１匹のマウスにイリノテカンと同じレジメンを使用して生理食塩水を投与した。腫瘍体積を４４日目まで、または１５００ｍｍ^３を超える体積まで測定した。イリノテカンおよびＧ２Ｂ－００３の処置は、測定可能で長期持続性の抗腫瘍応答を達成した（図２８）が、対照腫瘍はより速く増殖した。したがって、イリノテカンおよびＧ２Ｂ－００３（Ｉｃ）のインビボ活性は、この腫瘍モデルにおいて類似していた。

【0248】

引用文献リスト
特許文献
US8299089B2
WO2015/051307A1
WO2017/113687A2
WO2018/064683A1
WO2015/001015A1

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【図1】