▶ サンシャイン・グオジアン・ファーマシューティカル（シャンハイ）カンパニー・リミテッドの特許一覧
特表2023-542394ヒトＩＬ－３３に結合する抗体、その調製方法および用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-06
(54)【発明の名称】ヒトＩＬ－３３に結合する抗体、その調製方法および用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230929BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20230929BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230929BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230929BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230929BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230929BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230929BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230929BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20230929BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230929BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230929BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20230929BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230929BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230929BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20230929BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230929BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230929BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230929BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20230929BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230929BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230929BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230929BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230929BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230929BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230929BHJP
A61P 27/04 20060101ALI20230929BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230929BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230929BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/24 ZNA
C12P21/08
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K14/54
A61K39/395 N
A61K39/395 L
A61K45/00
A61K51/10 100
A61K49/00
A61K47/68
A61K47/55
A61P1/04
A61P1/16
A61P11/00
A61P11/02
A61P11/06
A61P13/12
A61P17/06
A61P17/00
A61P25/00
A61P27/02
A61P27/04
A61P35/00
A61P43/00 105
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518831
(86)(22)【出願日】2021-09-26
(85)【翻訳文提出日】2023-03-31
(86)【国際出願番号】 CN2021120785
(87)【国際公開番号】W WO2022063281
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】202011023301.8
(32)【優先日】2020-09-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523029928
【氏名又は名称】サンシャイン・グオジアン・ファーマシューティカル（シャンハイ）カンパニー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】グオ，ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】チャン，シュエサイ
(72)【発明者】
【氏名】シュー，フィティン
(72)【発明者】
【氏名】リー，チンロウ
(72)【発明者】
【氏名】チャオ，リー
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ジャンヒ
(72)【発明者】
【氏名】フアン，ハオミン
(72)【発明者】
【氏名】ズー，ジェンピン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA20
4B064CC24
4B064CD13
4B064CD21
4B064DA01
4B064DA08
4B065AA91X
4B065AA91Y
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AB05
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB12
4B065BB25
4B065BB37
4B065CA25
4B065CA44
4C076CC01
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC09
4C076CC10
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC18
4C076CC27
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF34
4C084AA12
4C084AA17
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA331
4C084ZA341
4C084ZA591
4C084ZA681
4C084ZA751
4C084ZA811
4C084ZA891
4C084ZA961
4C084ZB022
4C084ZB111
4C084ZB131
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZC192
4C084ZC412
4C084ZC712
4C085AA14
4C085AA16
4C085AA25
4C085AA27
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C085HH03
4C085KA04
4C085KA05
4C085KA26
4C085KA29
4C085LL05
4C085LL09
4C085LL17
4C085LL18
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、高親和性方式でヒトＩＬ－３３に結合し、ＳＴ２とＩＬ－３３との結合をブロックし、ＩＬ－３３高発現疾患（例えば、喘息、アトピー性／アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等）を治療するための薬物の調製に適用され、良好な臨床適用の見通しを有する、ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ヒトＩＬ－３３に対する当該抗体またはその抗原結合断片の結合親和性ＥＣ５０は、１ｎＭ未満であることを特徴とする、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記抗体の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２２に示されるＬ－ＣＤＲ２を有し、以下に示す特徴を有する、請求項１に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片：（ｔ１）ＩＬ－３３の受容体ＳＴ２への結合をブロックし、
（ｔ２）ＩＬ－３３によって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞のＩＬ－６分泌を阻害し、
（ｔ３）ＩＬ－３３タンパク質の阻害は、ヒトＰＢＭＣのＩＦＮγ分泌を誘導し、
（ｔ４）ＩＬ－３３の阻害は、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌を誘導し、ならびに
（ｔ５）ＩＬ－３３の阻害は、ＫＵ８１２細胞のＩＬ－５およびＩＬ１３の分泌を誘導すること。
【請求項3】
（ａ）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６および１７に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９および２０に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２４および２５に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに（ｂ）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２および２３に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２７に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２８に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１または２に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されたとおりであることを特徴とする、請求項３に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されたとおりであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、３１、３３、３４または３５に示されたとおりであることを特徴とする、請求項３に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されたとおりであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８または３９に示されたとおりであることを特徴とする、請求項３に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されたとおりであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３４または３５に示されたとおりであることを特徴とする、請求項３に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項10】
前記抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項11】
前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域および軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されたとおりであることを特徴とする、請求項１０に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項12】
前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片とＩＬ－３３タンパク質との結合エピトープは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に対応する、４５位のリジン（Ｋ４５）、４９位のバリン（Ｖ４９）、６５位のアスパラギン酸（Ｄ６５）、５０位のロイシン（Ｌ５０）、６０位のセリン（Ｓ６０）、５２位のセリン（Ｓ５２）、４８位のリジン（Ｋ４８）、５１位のロイシン（Ｌ５１）、５３位のチロシン（Ｙ５３）、５５位のグルタミン酸（Ｅ５５）からなる群から選択される部位を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項13】
請求項１－１２のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
【請求項14】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されたとおりであることを特徴とする、請求項１３に記載のヌクレオチド分子。
【請求項15】
重鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４２、４３、４５、４６または４７に示されたとおりであり、軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりであることを特徴とする、請求項１３に記載のヌクレオチド分子。
【請求項16】
重鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５０または５１に示されたとおりであり、軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されたとおりであることを特徴とする、請求項１３に記載のヌクレオチド分子。
【請求項17】
重鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６または４７に示されたとおりであり、軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されたとおりであることを特徴とする、請求項１３に記載のヌクレオチド分子。
【請求項18】
請求項１３－１７のいずれか１項に記載のヌクレオチド分子を含むことを特徴とする、発現担体。
【請求項19】
請求項１８に記載の発現担体を含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項20】
請求項１－１２のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を調製する方法であって、ａ）発現条件下で、請求項１９に記載の宿主細胞を培養することにより、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を発現する段階と、
ｂ）ａ）に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離および精製する段階とを含む、方法。
【請求項21】
請求項１－１２のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項22】
抗体薬物コンジュゲートであって、（ａ）請求項１－１２のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む抗体部分と、および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはその組み合わせからなる群から選択される前記抗体部分とカップリングするカップリング部分とを含むことを特徴とする、前記抗体薬物コンジュゲート。
【請求項23】
喘息、関節炎、アトピー性／アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、全身性硬化症、肝線維症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、糖尿病性腎疾患、炎症性腸疾患、乾癬、好酸球性食道炎、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、ドライアイ、腫瘍を治療するための薬物の調製における、請求項１－１２のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片または請求項２１に記載の組成物、請求項２２に記載の抗体薬物コンジュゲートの使用。
【請求項24】
喘息、関節炎、アトピー性／アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、全身性硬化症、肝線維症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、糖尿病性腎疾患、炎症性腸疾患、乾癬、好酸球性食道炎、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、ドライアイ、腫瘍を治療する方法であって、必要とする対象に請求項１－１２のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片、請求項２１に記載の組成物または請求項２２に記載の薬物コンジュゲート、またはその組み合わせを投与する段階を含むことを特徴とする、方法。
【請求項25】
ＩＬ－３３タンパク質の突然変異体であって、野生型ヒトＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列に対応して、前記突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に対応する、
（Ｚ１）４５位のリジン（Ｋ４５）、
（Ｚ２）４９位のバリン（Ｖ４９）、
（Ｚ３）６５位のアスパラギン酸（Ｄ６５）、
（Ｚ４）５０位のロイシン（Ｌ５０）、
（Ｚ５）６０位のセリン（Ｓ６０）、
（Ｚ６）５２位のセリン（Ｓ５２）、
（Ｚ７）４８位のリジン（Ｋ４８）、
（Ｚ８）５１位のロイシン（Ｌ５１）、
（Ｚ９）５３位のチロシン（Ｙ５３）、
（Ｚ１０）５５位のグルタミン酸（Ｅ５５）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異を含むことを特徴とする、前記ＩＬ－３３タンパク質の突然変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、ヒトＩＬ－３３に結合する抗体、その調製方法および用途に関する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン３３（ＩＬ－３３）は、多機能サイトカインであり、ＩＬ－１ファミリーの新しいメンバーである。ＩＬ－３３遺伝子によってコードされ、平滑筋細胞、上皮細胞および内皮細胞等の構造細胞で構造的に発現し、マクロファージおよび樹状細胞において、ＩＬ－３３は、炎症性因子の誘導によって発現される。研究によると、ＩＬ－３３は、二機能性タンパク質であることが分かる。一方、ＩＬ－３３は、細胞核に局在し、転写因子の役割を発揮し、もう一方、ＩＬ－３３は、細胞外に分泌され、その受容体であるＳＴ２と相互作用することでサイトカインの役割を発揮する。サイトカインとして、ＩＬ－３３は、ＴＨ－２型サイトカインであり、アラーミン（Ａｌａｒｍｉｎ）と考えられ、ＳＴ２と結合することにより、ＴＨ－２細胞がＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＬ－１３等のＴＨ－２型サイトカインを分泌するように誘導する。さらに、ＩＬ－３３は、マスト細胞、好塩基球性細胞にＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα等の炎症性サイトカインおよびケモカインを分泌させ、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞にＩＦＮγ等のＴＨ－１型サイトカインを分泌させる。
【0003】
喘息は、気管支喘息とも呼ばれる。気管支喘息は、様々な細胞および細胞成分が関与する慢性気道炎症である。喘息は、ＣＤ４＋Ｔｈ－２細胞によって引き起こされる気道炎症とずっと考えられてきた。しかしながら、抗ＣＤ４抗体は、ＣＤ４＋細胞をほぼ完全に枯渇させるが、喘息マウスの肺におけるＩＬ－４、ＩＬ－５またはＩＬ－１３の産生を完全に減少させず、これは、これらのＴｈ－２サイトカインの他の細胞源が必ず存在することを示唆する。ＩＬ－３３は、ＳＴ２を発現するＩＬＣ２ｓからＩＬ－５およびＩＬ－１３を産生することができ、これは、Ｔｈ－２細胞が存在しなくても、ＩＬ－５によって誘導される好酸球増多症およびＩＬ－１３によって誘導される粘液産生が誘導されることを示唆する。さらに、喘息患者の肺におけるＩＬ－３３の発現レベルは、健常者の肺よりも高く、重症喘息患者の肺組織におけるＩＬ－３３の発現は、特に顕著である。ＩＬ－３３は、重症喘息の小児の喘息線維芽細胞におけるコラーゲン合成を促進し、これは、ＩＬ－３３が重症喘息に特徴的な気道リモデリングの発生および発展に一定な役割を果たすことを示唆する。アレルギー性気道炎症は、抗ＩＬ－３３抗体治療によって軽減されることができる。ＩＬ－３３は、ＳＴ２を発現するＴｈ－２細胞を活性化することができるため、Ｔｈ－２細胞およびＩＬＣ２細胞によって産生されるＩＬ－５およびＩＬ－１３は、喘息の発病過程に関与する。これらの発見は、ＩＬ－３３が自然免疫と獲得免疫との間の橋渡しを調整して、重度の喘息表現型を発症できることを示唆する。喘息に加えて、ＩＬ－３３経路は、アトピー性／アレルギー性皮膚炎、関節炎、慢性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、全身性硬化症、肝線維症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、糖尿病性腎疾患、炎症性腸疾患、乾癬、好酸球性食道炎、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、ドライアイ、腫瘍等の様々な病症の治療にも関与する。本発明は、高親和性方式でＩＬ－３３に結合し、且つＩＬ－３３活性を効果的に中和するＩＬ－３３阻害剤を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
上記の技術的課題を解決するために、本発明の発明者らは、抗原免疫、ハイブリドーマスクリーニング、抗体発現および精製から生物活性同定まで、多数の試験を行い、スクリーニングしてヒトＩＬ－３３に特異的に結合するマウス抗体を獲得し、これに基づいて、さらに構築してそのキメラ抗体およびヒト化抗体を獲得する。
【0005】
従って、本発明の目的は、ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド分子を提供し、前記ヌクレオチド分子を含む発現担体を提供し、前記発現担体の宿主細胞を提供し、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の調製方法を提供し、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供し、薬物の調製における前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の適用を提供する。
【0006】
上記の目的を達成するために、本発明は、次のような技術的解決策を採用する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の一態様は、ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ヒトＩＬ－３３に対する当該抗体またはその抗原結合断片の結合親和性ＥＣ５０は、１ｎＭ未満である。
【0008】
別の好ましい例において、前記抗体の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２２に示されるＬ－ＣＤＲ２を有し、次のような特徴を有し、
（ｔ１）ＩＬ－３３の受容体ＳＴ２への結合をブロックし、
（ｔ２）ＩＬ－３３によって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞のＩＬ－６分泌を阻害し、
（ｔ３）ＩＬ－３３タンパク質の阻害は、ヒトＰＢＭＣのＩＦＮγ分泌を誘導し、
（ｔ４）ＩＬ－３３の阻害は、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌を誘導し、ならびに
（ｔ５）ＩＬ－３３の阻害は、ＫＵ８１２細胞のＩＬ－５およびＩＬ１３の分泌を誘導する。
（ｔ１）ＩＬ－３３の受容体ＳＴ２への結合をブロックし、
（ｔ２）ＩＬ－３３によって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞のＩＬ－６分泌を阻害し、
（ｔ３）ＩＬ－３３タンパク質の阻害は、ヒトＰＢＭＣのＩＦＮγ分泌を誘導し、
（ｔ４）ＩＬ－３３の阻害は、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌を誘導し、ならびに
（ｔ５）ＩＬ－３３の阻害は、ＫＵ８１２細胞のＩＬ－５およびＩＬ１３の分泌を誘導する。
【0009】
別の好ましい例において、ヒトＩＬ３３に対する前記抗体のＫｄ値は、マウスＩＬ３３に対するＫｄ値よりもはるかに小さい（２０倍またはそれ以上の差）。
【0010】
別の好ましい例において、前記抗体は、
（ａ）重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、前記Ｈ－ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８において最大２個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換え、Ｈ－ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９において最大４個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換え、Ｈ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０において７個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換え、ならびに
（ｂ）軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含み、前記Ｌ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１において最大２個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換え、前記Ｌ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示され、前記Ｌ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３において最大３個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換える。
（ａ）重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、前記Ｈ－ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８において最大２個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換え、Ｈ－ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９において最大４個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換え、Ｈ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０において７個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換え、ならびに
（ｂ）軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含み、前記Ｌ－ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１において最大２個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換え、前記Ｌ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示され、前記Ｌ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されたとおりであるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３において最大３個のアミノ酸が突然変異した突然変異体を置き換える。
【0011】
好ましい解決策として、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６および１７示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９および２０に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２４および２５に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに
（ｂ）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２および２３に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２７に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２８に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含む。
（ａ）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６および１７示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９および２０に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２４および２５に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに
（ｂ）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２および２３に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２７に示されるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２８に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含む。
【0012】
別の好ましい例において、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ１）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６および１７に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに （ｂ１）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２および２３に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３と、または
（ａ２）アミノ酸配列がそれぞれ１８、１９および２０に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに
（ｂ２）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２および２３に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３と、または
（ａ３）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２４および２５に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに （ｂ３）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２７に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３と、または
（ａ４）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９および２０に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに （ｂ４）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２８に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含む。
（ａ１）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６および１７に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに （ｂ１）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２および２３に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３と、または
（ａ２）アミノ酸配列がそれぞれ１８、１９および２０に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに
（ｂ２）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２および２３に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３と、または
（ａ３）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２４および２５に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに （ｂ３）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２７に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３と、または
（ａ４）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９および２０に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに （ｂ４）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２８に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含む。
【0013】
別の好ましい例において、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ２）アミノ酸配列がそれぞれ１８、１９および２０に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに
（ｂ２）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２および２３に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３と、または
（ａ３）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２４および２５に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに （ｂ３）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２７に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含む。
（ａ２）アミノ酸配列がそれぞれ１８、１９および２０に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに
（ｂ２）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２および２３に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３と、または
（ａ３）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２４および２５に示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに （ｂ３）アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２７に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含む。
【0014】
別の好ましい例において、上記のＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６または７個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を受けた誘導ＣＤＲ配列を含み、また、前記誘導ＣＤＲ配列を含むＶＨおよびＶＬで構成される誘導抗体は、ＩＬ－３３に対する結合親和性を保持することができる。
【0015】
本発明の「抗体（Ａｂ）」は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖には、規則的に間隔された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖の一端には可変領域（ＶＨ）があり、その後には定常領域である。各軽鎖の一端には、可変領域（ＶＬ）があり、他端には、定常領域があり、軽鎖の定常領域は、重鎖の最初の定常領域と対向し、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域と対向する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つの抗体で形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）等を含む。
【0016】
本発明の「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、即ち、当該集団に含まれる個々の抗体は、少数の可能性のある自然に発生する突然変異を除いて、同じである。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して非常に特異的である。さらに、従来のポリクローナル抗体製剤（通常、異なる決定基に対する異なる抗体を使用する）とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。
【0017】
それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによって汚染されないことである。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を示し、これは、抗体を産生するための特定の方法を必要とすると解釈されるべきではない。
【0018】
本発明の「抗原結合断片」とは、ヒトＩＬ－３３に特異的に結合できる抗体の断片を指す。本発明の抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片等を含む。Ｆａｂ断片は、パパインで抗体を消化することによって産生される断片である。
【0019】
Ｆ（ａｂ’）２断片は、ペプシンで抗体を消化することによって産生される断片である。
【0020】
Ｆｖ断片は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を非共有結合で緊密に結合する二量体構成である。
【0021】
好ましい解決策として、前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【0022】
本発明の「マウス抗体」とは、ラットまたはマウス、好ましくはマウス由来の抗体を指す。本発明のマウス抗体は、ヒトＩＬ－３３を抗原としてマウスを免疫し、且つハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることにより得られる。
【0023】
本発明の「キメラ抗体」とは、ある種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列と、ならびに別の種に由来する定常領域配列とを含む抗体、例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。好ましくは、本発明のキメラ抗体は、マウス抗体８６４Ｆ３、８７４Ｆ７、８７１Ｇ１重鎖可変領域および突然変異を含むヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域から組み替えられ、軽鎖可変領域は、ヒトｋａｐｐａ鎖の定常領域から組み替えられる。
【0024】
本発明の「ヒト化抗体」とは、そのＣＤＲが非ヒト種（好ましくはマウス）の抗体に由来し、抗体分子中の残りの部分（フレームワーク領域および定常領域を含む）がヒト抗体に由来することを指す。さらに、フレームワーク領域の残基が変更されて、結合親和性を維持することができる。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、マウス抗体８６４Ｆ３、８７４Ｆ７、８７１Ｇ１のＣＤＲ領域およびヒト抗体の非ＣＤＲ領域から組み替えられ、重鎖可変領域は、突然変異を含むヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域と組み替えられ、軽鎖可変領域は、ヒトｋａｐｐａ鎖の定常領域と組み替えられ、重要な影響を与える一部の残基に対して、突然変異して得られる。
【0025】
好ましい解決策として、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片を含む。
【0026】
好ましい解決策として、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されたとおりである。
【0027】
好ましい解決策として、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されたとおりであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、３１、３３、３４または３５に示されたとおりである。
【0028】
好ましい解決策として、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されたとおりであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８または３９に示されたとおりである。
【0029】
好ましい解決策として、前記抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される。
【0030】
好ましい解決策として、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されたとおりであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３４または３５に示されたとおりである。
【0031】
別の好ましい例において、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されたとおりであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されたとおりであるか、または前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されたとおりであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されたとおりである。別の好ましい例において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、４０または３６に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性または配列相同性を有する。
【0032】
別の好ましい例において、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、３１、３３、３４、３５、３７、３８または３９に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性または配列相同性を有する。
【0033】
好ましい解決策として、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域および軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されたとおりである。
【0034】
別の好ましい例において、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片とＩＬ－３３タンパク質との結合エピトープは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に対応する、 ４５位のリジン（Ｋ４５）、４９位のバリン（Ｖ４９）、６５位のアスパラギン酸（Ｄ６５）、５０位のロイシン（Ｌ５０）、６０位のセリン（Ｓ６０）、５２位のセリン（Ｓ５２）、４８位のリジン（Ｋ４８）、５１位のロイシン（Ｌ５１）、５３位のチロシン（Ｙ５３）、５５位のグルタミン酸（Ｅ５５）からなる群から選択される部位を含み、
より好ましくは、４５位のリジン（Ｋ４５）、４９位のバリン（Ｖ４９）、６５位のアスパラギン酸（Ｄ６５）、５０位のロイシン（Ｌ５０）からなる群から選択される部位を含む。
より好ましくは、４５位のリジン（Ｋ４５）、４９位のバリン（Ｖ４９）、６５位のアスパラギン酸（Ｄ６５）、５０位のロイシン（Ｌ５０）からなる群から選択される部位を含む。
【0035】
別の好ましい例において、前記部位は野生型ヒトＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列に対応して、前記アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ：ＮＰ＿２５４２７４．１の１１２位のＳｅｒ至２７０位のＴｈｒである。
【0036】
本発明の別の態様は、ヌクレオチド分子を提供し、前記ヌクレオチド分子は、上記のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする。
【0037】
好ましい解決策として、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたとおりであるか、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されたとおりである。
【0038】
好ましい解決策として、重鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４２、４３、４５、４６または４７に示されたとおりであり、軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりである。
【0039】
好ましい解決策として、重鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５０または５１に示されたとおりであり、軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されたとおりである。
【0040】
好ましい解決策として、重鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６または４７に示されたとおりであり、軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されたとおりである。
【0041】
本発明に記載のヌクレオチド分子の調製方法は、当技術分野における従来の調製方法であり、好ましくは、ＰＣＲ法等の遺伝子クローニング技術によって、上記のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を取得するか、または人工的な全配列合成の方法によって上記のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を取得する段階等の調製方法を含む。
【0042】
当業者は、上記のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、置き換え、欠失、変更、挿入または増加を適切に導入することによって、ポリヌクレオチド相同体を提供できることを分かる。本発明のポリヌクレオチドの相同体は、当該ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片遺伝子をコードする一つまたは複数の塩基に対して、抗体の活性が維持される範囲内で置き換え、欠失または増加を実施することによって調製される。
【0043】
本発明の別の態様は、発現担体を提供し、前記発現担体は、上記のヌクレオチド分子を含む。
【0044】
ここで、前記発現担体は、当技術分野の従来の発現担体であり、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および／または配列、ならびに他の適切な配列の発現担体等の適切な調節配列を含むことを指す。前記発現担体は、適切なファージまたはファージミド等のウイルスまたはプラスミドであり得、より多くの技術的な詳細については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照しない。核酸操作のための多くの既知の技術およびプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌらによって編集されたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第二版を参照する。本発明に記載の発現担体は、好ましくは、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）、ｐＤＨＦＲ、ｐｃＤＮＡ４、ｐＤＨＦＦ、ｐＧＭ－ＣＳＦまたはｐＣＨＯ １．０である。
【0045】
本発明は、宿主細胞をさらに提供し、前記宿主細胞は、上記の発現担体を含む。
【0046】
本発明に記載の宿主細胞は、上記の組換え発現担体がそれ自体で安定的に複製できる限り、当技術分野における従来の様々な宿主細胞であり、携帯される前記ヌクレオチドは、効果的に発現されることができる。ここで、前記宿主細胞は、原核発現細胞および真核発現細胞を含み、前記宿主細胞は、好ましくは、ＣＯＳ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈ ａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＴＧ１、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（一本鎖抗体またはＦａｂ抗体を発現する）またはＣＨＯ－Ｋ１細胞（完全長ＩｇＧ抗体を発現する）を含む。前述の発現担体を宿主細胞に形質転換することによって、本発明の好ましい組換え発現形質転換体を得ることができる。ここで、前記形質転換方法は、当技術分野における従来の形質転換法であり、好ましくは化学的形質転換法、熱ショック法またはエレクトロポレーションである。
【0047】
本発明の別の態様は、上記のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を調製する方法を提供し、前記方法は、次のような段階を含み、
ａ）発現条件下で、上記の宿主細胞を培養することにより、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を発現する段階と、
ｂ）ａ）に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離および精製する段階とを含む。
ａ）発現条件下で、上記の宿主細胞を培養することにより、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を発現する段階と、
ｂ）ａ）に記載のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離および精製する段階とを含む。
【0048】
本発明に記載の宿主細胞の培養方法、前記抗体の分離および精製の方法は、当技術分野における従来の方法であり、具体的な操作方法については、対応する細胞培養技術マニュアルおよび抗体分離・精製技術マニュアルを参照する。本発明に開示されるヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の調製方法は、発現条件下で、上記の宿主細胞を培養することにより、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を発現する段階と、前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離および精製段階とを含む。上記の方法を用いて、組換えタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動上で単一のバンドのような実質的に均一な物質に精製することができる。
【0049】
アフィニティークロマトグラフィー法を使用して、本発明で開示される前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離および精製することができ、使用するアフィニティーカラム的の特性に応じて、高塩緩衝液、ｐＨ変更等の従来の方法を使用して、アフィニティーカラム上に結合した前記ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を溶出することができる。本発明の発明者らは、得られたヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片について検出実験を行い、実験結果は、当該ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片が、高い親和性で抗原に結合し、より高い親和性を有することを示す。
【0050】
本発明の別の態様は、組成物を提供し、前記組成物は、上記のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容される担体を含む。
【0051】
本発明によって提供されるヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片は、薬学的に許容される担体と医薬製剤である組成物を構成することにより、より安定的に治療効果を発揮し、これらの製剤は、本発明で開示されるヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の立体構造の完全性を確保することができ、同時にタンパク質の多官能基を保護して、その分解を防ぐ（縮合、脱アミノ化または酸化を含むが、これらに限定されない）。一般に、液体製剤の場合、通常、２℃－８℃条件下で少なくとも１年間安定的に保存でき、凍結乾燥製剤の場合、３０℃条件下で少なくとも６が月間安定的に保存する。前記二重特異性抗体製剤は、懸濁、水性注射、凍結乾燥等の製薬分野で一般的に使用される製剤であり得る。
【0052】
本発明で開示されるヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の水性注射または凍結乾燥製剤については、薬学的に許容される担体は、好ましくは、界面活性剤、溶液安定剤、等張調節剤および緩衝液の一つまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。ここで、界面活性剤は、好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ｔｗｅｅｎ２０または８０）等の非イオン性界面活性剤、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（例えば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル、リノレイルまたはステアリルサルコシン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭ等を含むが、これらに限定されず、その加えた量は、ヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片の粒子か傾向が最小限であるべきである。溶液安定剤は、好ましくは、等の一つまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されず、還元性糖および非還元性糖等の糖類、グルタミン酸ナトリウムまたはヒスチジン等のアミノ酸類、三価アルコール、高級糖アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール類を含むが、これ限定されず、溶液安定剤の加えた量は、最後で形成される製剤が当業者によって安定であると考えられる期間内で、安定したままであるような量で添加される。等張調節剤は、好ましくは、塩化ナトリウム、マンニトールの一つまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。緩衝液は、好ましくは、Ｔｒｉｓ、ヒスチジン緩衝液、リン酸塩緩衝液の一つまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0053】
本発明の別の態様は、抗体薬物コンジュゲートを提供し、前記抗体薬物コンジュゲートは、
（ａ）上記のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む抗体部分と、および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはその組み合わせからなる群から選択される前記抗体部分とカップリングするカップリング部分とを含む。
（ａ）上記のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む抗体部分と、および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはその組み合わせからなる群から選択される前記抗体部分とカップリングするカップリング部分とを含む。
【0054】
本発明の別の態様は、喘息、関節炎、アトピー性／アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、全身性硬化症、肝線維症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、糖尿病性腎疾患、炎症性腸疾患、乾癬、好酸球性食道炎、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、ドライアイ、腫瘍を治療するための薬物の調製における上記のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片または医薬組成物、抗体薬物コンジュゲートの適用を提供する。前記関節炎は、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、痛風性関節炎、反応性関節炎、感染性関節炎、外傷性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎などを含む。
【0055】
本発明のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片およびその組成物をヒトを含む動物に投与する場合、投与量は、患者の年齢と体重、疾患の性質と重症度、および投与経路によって異なるが、動物実験の結果および様々な状況を参照して、総量が一定の範囲を超えることはできない。具体的には、静脈内注射の投与量は、１－１８００ｍｇ／日である。
【0056】
本発明の別の態様は、必要とする対象に上記のヒトＩＬ－３３に結合する抗体またはその抗原結合断片または医薬組成物、抗体薬物コンジュゲート、またはその組み合わせを投与する段階を含むことを特徴とする、喘息、関節炎、アトピー性／アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、全身性硬化症、肝線維症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、糖尿病性腎疾患、炎症性腸疾患、乾癬、好酸球性食道炎、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、ドライアイ、腫瘍を治療する方法を提供する。
【0057】
本発明の別の態様は、ＩＬ－３３タンパク質の突然変異体を提供し、野生型ヒトＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列に対応して、前記突然変異体は、
（Ｚ１）４５位のリジン（Ｋ４５）、
（Ｚ２）４９位のバリン（Ｖ４９）、
（Ｚ３）６５位のアスパラギン酸（Ｄ６５）、
（Ｚ４）５０位のロイシン（Ｌ５０）、
（Ｚ５）６０位のセリン（Ｓ６０）、
（Ｚ６）５２位のセリン（Ｓ５２）、
（Ｚ７）４８位のリジン（Ｋ４８）、
（Ｚ８）５１位のロイシン（Ｌ５１）、
（Ｚ９）５３位のチロシン（Ｙ５３）、
（Ｚ１０）５５位のグルタミン酸（Ｅ５５）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異を含む。
（Ｚ１）４５位のリジン（Ｋ４５）、
（Ｚ２）４９位のバリン（Ｖ４９）、
（Ｚ３）６５位のアスパラギン酸（Ｄ６５）、
（Ｚ４）５０位のロイシン（Ｌ５０）、
（Ｚ５）６０位のセリン（Ｓ６０）、
（Ｚ６）５２位のセリン（Ｓ５２）、
（Ｚ７）４８位のリジン（Ｋ４８）、
（Ｚ８）５１位のロイシン（Ｌ５１）、
（Ｚ９）５３位のチロシン（Ｙ５３）、
（Ｚ１０）５５位のグルタミン酸（Ｅ５５）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異を含む。
【0058】
別の好ましい例において、前記野生型ヒトＩＬ－３３タンパク質の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されたとおりである。
【0059】
別の好ましい例において、前記突然変異体は、
（Ｚ１）４５位のリジン（Ｋ４５）、
（Ｚ２）４９位のバリン（Ｖ４９）、
（Ｚ３）６５位のアスパラギン酸（Ｄ６５）、
（Ｚ４）５０位のロイシン（Ｌ５０）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異を含み、および／または
前記突然変異体は、
（Ｚ５）６０位のセリン（Ｓ６０）、
（Ｚ６）５２位のセリン（Ｓ５２）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異を含み、および／または
前記突然変異体は、
（Ｚ７）４８位のリジン（Ｋ４８）、
（Ｚ８）５１位のロイシン（Ｌ５１）、
（Ｚ９）５３位のチロシン（Ｙ５３）、
（Ｚ１０）５５位のグルタミン酸（Ｅ５５）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異を含む。
（Ｚ１）４５位のリジン（Ｋ４５）、
（Ｚ２）４９位のバリン（Ｖ４９）、
（Ｚ３）６５位のアスパラギン酸（Ｄ６５）、
（Ｚ４）５０位のロイシン（Ｌ５０）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異を含み、および／または
前記突然変異体は、
（Ｚ５）６０位のセリン（Ｓ６０）、
（Ｚ６）５２位のセリン（Ｓ５２）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異を含み、および／または
前記突然変異体は、
（Ｚ７）４８位のリジン（Ｋ４８）、
（Ｚ８）５１位のロイシン（Ｌ５１）、
（Ｚ９）５３位のチロシン（Ｙ５３）、
（Ｚ１０）５５位のグルタミン酸（Ｅ５５）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異を含む。
【0060】
別の好ましい例において、ヒトＩＬ－３３に結合する抗体に対する野生型ＩＬ－３３タンパク質の親和性と比較して、ヒトＩＬ－３３に結合する抗体に対する前記ＩＬ－３３タンパク質の突然変異体の親和性は、１倍減少し、好ましくは５倍減少し、より好ましくは１０倍減少し、より好ましくは２５倍減少し、最も好ましくは５０倍減少する。
【0061】
別の好ましい例において、前記突然変異体は、
（Ｚ１１）４１位のリジン（Ｋ４１）、
（Ｚ１２）４２位のリジン（Ｋ４２）、
（Ｚ１３）４３位のアスパラギン酸（Ｄ４３）、
（Ｚ１４）４４位のグルタミン酸（Ｅ４４）、
（Ｚ１５）４６位のリジン（Ｋ４６）、
（Ｚ１６）４７位のアスパラギン酸（Ｄ４７）、
（Ｚ１７）５４位のチロシン（Ｙ５４）、
（Ｚ１８）５６位のセリン（Ｓ５６）、
（Ｚ１９）５７位のグルタミン（Ｑ５７）、
（Ｚ２０）５８位のヒスチジン（Ｈ５８）、
（Ｚ２１）５９位のプロリン（Ｐ５９）、
（Ｚ２２）６１位のアスパラギン（Ｎ６１）、
（Ｚ２３）６２位のグルタミン酸（Ｅ６２）、
（Ｚ２４）６３位のセリン（Ｓ６３）、
（Ｚ２５）６７位のバリン（Ｖ６７）、
（Ｚ２６）６８位のアスパラギン酸（Ｄ６８）、
（Ｚ２７）７０位のリジン（Ｋ７０）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異をさらに含む。
（Ｚ１１）４１位のリジン（Ｋ４１）、
（Ｚ１２）４２位のリジン（Ｋ４２）、
（Ｚ１３）４３位のアスパラギン酸（Ｄ４３）、
（Ｚ１４）４４位のグルタミン酸（Ｅ４４）、
（Ｚ１５）４６位のリジン（Ｋ４６）、
（Ｚ１６）４７位のアスパラギン酸（Ｄ４７）、
（Ｚ１７）５４位のチロシン（Ｙ５４）、
（Ｚ１８）５６位のセリン（Ｓ５６）、
（Ｚ１９）５７位のグルタミン（Ｑ５７）、
（Ｚ２０）５８位のヒスチジン（Ｈ５８）、
（Ｚ２１）５９位のプロリン（Ｐ５９）、
（Ｚ２２）６１位のアスパラギン（Ｎ６１）、
（Ｚ２３）６２位のグルタミン酸（Ｅ６２）、
（Ｚ２４）６３位のセリン（Ｓ６３）、
（Ｚ２５）６７位のバリン（Ｖ６７）、
（Ｚ２６）６８位のアスパラギン酸（Ｄ６８）、
（Ｚ２７）７０位のリジン（Ｋ７０）からなる群から選択される一つまたは複数の部位で発生する突然変異をさらに含む。
【0062】
別の好ましい例において、前記ＩＬ－３３タンパク質の突然変異体は、（Ｚ１）－（Ｚ２７）の一つまたは複数のアミノ酸をアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）に突然変異させることを含む。
【0063】
別の好ましい例において、前記ＩＬ－３３タンパク質の突然変異体における突然変異は、
Ｋ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｓ５２Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｌ５１Ａ、Ｙ５３Ａ、Ｅ５５Ａ、Ｋ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｄ４３Ａ、Ｅ４４Ａ、Ｋ４６Ａ、Ｄ４７Ａ、Ｙ５４Ａ、Ｓ５６Ａ、Ｑ５７Ａ、Ｈ５８Ａ、Ｐ５９Ａ、Ｎ６１Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｓ６３Ａ、Ｖ６７Ａ、Ｄ６８Ａ、Ｋ７０Ａ、またはその組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、Ｋ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｓ５２Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｌ５１Ａ、Ｙ５３Ａ、Ｅ５５Ａからなる群から選択される一つまたは複数であり、より好ましくは、Ｋ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｓ５２Ａからなる群から選択される一つまたは複数であり、最も好ましくはＫ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｌ５０Ａからなる群から選択される一つまたは複数である。
Ｋ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｓ５２Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｌ５１Ａ、Ｙ５３Ａ、Ｅ５５Ａ、Ｋ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｄ４３Ａ、Ｅ４４Ａ、Ｋ４６Ａ、Ｄ４７Ａ、Ｙ５４Ａ、Ｓ５６Ａ、Ｑ５７Ａ、Ｈ５８Ａ、Ｐ５９Ａ、Ｎ６１Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｓ６３Ａ、Ｖ６７Ａ、Ｄ６８Ａ、Ｋ７０Ａ、またはその組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、Ｋ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｓ５２Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｌ５１Ａ、Ｙ５３Ａ、Ｅ５５Ａからなる群から選択される一つまたは複数であり、より好ましくは、Ｋ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｓ５２Ａからなる群から選択される一つまたは複数であり、最も好ましくはＫ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｌ５０Ａからなる群から選択される一つまたは複数である。
【0064】
別の好ましい例において、前記ＩＬ－３３タンパク質の突然変異体は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるアミノ酸配列を一つまたは複数、好ましくは１－２０個、より好ましくは１－１５個、より好ましくは１－１０個、より好ましくは１－８個、より好ましくは１－３個、最も好ましくは１個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成される、ＩＬ－３３抗体結合機能を有する誘導されるポリペプチドからなる群から選択される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるアミノ酸配列を一つまたは複数、好ましくは１－２０個、より好ましくは１－１５個、より好ましくは１－１０個、より好ましくは１－８個、より好ましくは１－３個、最も好ましくは１個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成される、ＩＬ－３３抗体結合機能を有する誘導されるポリペプチドからなる群から選択される。
【0065】
別の好ましい例において、前記ＩＬ－３３タンパク質の突然変異体的アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５と比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列相同性を有する。
【0066】
本発明の別の態様は、抗ヒトＩＬ－３３抗体結合エピトープを評価するための方法を提供し、
（Ｓ１）抗ヒトＩＬ－３３抗体を提供する段階と、
（Ｓ２）野生型ＩＬ－３３タンパク質に結合する親和性Ａ２と比較して、ＩＬ－３３突然変異体に対する前記抗ヒトＩＬ－３３抗体の親和性Ａ１を検出する段階とを含み、ここで、前記ＩＬ－３３突然変異体は、Ｋ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｓ６０ＡまたはＳ５２Ａの一つまたは複数の種の部位突然変異を含み、親和性低下率がＡ１／Ａ２≧２．５倍、好ましくは≧１０倍である場合、前記抗ヒトＩＬ－３３抗体結合野生型ＩＬ－３３タンパク質の線形および／または空間エピトープは、Ｋ４５、Ｖ４９、Ｌ５０、Ｄ６５、Ｓ６０ＡまたはＳ５２Ａ部位の一つまたは複数の種を含むことを示し、ここで、前記抗ヒトＩＬ－３３抗体は、
アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２４および２５示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに
アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２７に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含む。
（Ｓ１）抗ヒトＩＬ－３３抗体を提供する段階と、
（Ｓ２）野生型ＩＬ－３３タンパク質に結合する親和性Ａ２と比較して、ＩＬ－３３突然変異体に対する前記抗ヒトＩＬ－３３抗体の親和性Ａ１を検出する段階とを含み、ここで、前記ＩＬ－３３突然変異体は、Ｋ４５Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｓ６０ＡまたはＳ５２Ａの一つまたは複数の種の部位突然変異を含み、親和性低下率がＡ１／Ａ２≧２．５倍、好ましくは≧１０倍である場合、前記抗ヒトＩＬ－３３抗体結合野生型ＩＬ－３３タンパク質の線形および／または空間エピトープは、Ｋ４５、Ｖ４９、Ｌ５０、Ｄ６５、Ｓ６０ＡまたはＳ５２Ａ部位の一つまたは複数の種を含むことを示し、ここで、前記抗ヒトＩＬ－３３抗体は、
アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２４および２５示されるような重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ならびに
アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２２および２７に示されるような軽鎖の相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３とを含む。
【0067】
当技術分野の常識に適用することに基づいて、上記の各好ましい条件は、任意に組み合わせ、即ち、本発明の各好ましい例を得ることができる。
【0068】
本発明で使用される試薬および原材料は、すべて市販されている。
【発明の効果】
【0069】
本発明の肯定的かつ進歩的な効果は、現在臨床上でＩＬ－３３が強く発現する疾患に対する新規、特異的で、効果的な治療薬を急務に開発して、このような疾患に苦しむ人々の生活の質を向上させ、患者により効果的な治療アプローチを提供することである。本発明の抗体は、ヒトＩＬ－３３に対して良好な親和性を有し、ＩＬ－３３とその受容体ＳＴ２との結合をブロックすることができ、様々な疾患の治療に使用されることができ、良好な臨床適用の見通しを有する。
【図面の簡単な説明】
【0070】
【図1A】ヒトＩＬ－３３に対するマウス抗体の結合活性。
【図1B】ヒトＩＬ－３３に対するマウス抗体の結合活性。
【図2A】ＩＬ－３３に対するＳＴ２の結合をブロックするマウス抗体の活性。
【図2B】ＩＬ－３３に対するＳＴ２の結合をブロックするマウス抗体の活性。
【図3A】ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３誘導性ＩＬ－６発現に対するマウス抗体の阻害効果。
【図3B】ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３誘導性ＩＬ－６発現に対するマウス抗体の阻害効果。
【図3C】ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３誘導性ＩＬ－６発現に対するマウス抗体の阻害効果。
【図4】ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３誘導性ＩＬ－８発現に対するマウス抗体の阻害効果。
【図5】蟹食猿ＩＬ－３３抗原に対するマウス抗体の交差活性。
【図6】マウス抗体のインビボでの中和活性を評価するための脾臓重量実験。
【図7】ヒトＩＬ－３３に対するキメラ抗体の結合活性。
【図8】ＩＬ－３３に対するＳＴ２の結合をブロックするキメラ抗体の活性。
【図9A】ヒトＩＬ－３３に対する各ヒト化抗体の結合活性。
【図9B】ヒトＩＬ－３３に対する各ヒト化抗体の結合活性。
【図9C】ヒトＩＬ－３３に対する各ヒト化抗体の結合活性。
【図9D】ヒトＩＬ－３３に対する各ヒト化抗体の結合活性。
【図10】ＩＬ－３３に対するＳＴ２の結合をブロックするヒト化抗体の活性。
【図11】ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３誘導性ＩＬ－６発現に対するヒト化抗体の阻害効果。
【図12】ＩＬ－３３誘導性ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌に対するヒト化抗体の阻害効果。
【図13】ＩＬ－３３誘導性ＮＫ細胞からのＩＦＮγ分泌に対するヒト化抗体の阻害効果。
【図14】ヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１は、ＩＬ－３３誘導性ＫＵ８１２細胞からのＩＬ－５分泌を効果的に阻害することができる。
【図15】ヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１は、ＩＬ－３３誘導性ＫＵ８１２細胞からのＩＬ－１３分泌を効果的に阻害することができる。
【図16】ヒト化抗体のインビボでの薬力学的活性を評価するための脾臓重量実験。
【図17】ヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１のインビボでの薬力学的活性を評価するための脾臓重量実験。
【図18】ヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１は、マウスの末梢血ＩＬ－５分泌を効果的に阻害することができる。
【図19】ヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１は、マウスの末梢血においてヒトＩＬ－３３の刺激によって引き起こされる好酸球の増加を効果的に減少させることができる。
【図20】８７４Ｆ７－Ｈｕ１に対するＩＬ－３３突然変異体タンパク質（Ｅ４４Ａ、Ｋ４５Ａ、Ｋ４６Ａ、Ｑ５７Ａ、Ｈ５８Ａ、Ｐ５９Ａ、Ｓ６０Ａ）の親和性。
【図21】８７４Ｆ７－Ｈｕ１に対するＩＬ－３３突然変異体タンパク質（Ｋ４８Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｌ５１Ａ、Ｓ５２Ａ、Ｙ５３Ａ、Ｅ５５Ａ）の親和性。
【図22】８７４Ｆ７－Ｈｕ１に対するＩＬ－３３突然変異体タンパク質（Ｎ６１Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｓ６３Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｖ６７Ａ、Ｄ６８Ａ、Ｋ７０Ａ）の親和性。
【図23】８７４Ｆ７－Ｈｕ１に対するＩＬ－３３突然変異体タンパク質（Ｌ５０Ａ）の親和性。
【図24】ＩＬ－３３結晶化の３Ｄ構造図における８７４Ｆ７－Ｈｕ１の結合に影響を与える重要なアミノ酸部位の位置。
【発明を実施するための形態】
【0071】
本発明者らは、広範囲かつ綿密な研究、大量のスクリーニングの後、優れた親和性を有する一連の抗ＩＬ－３３ヒト化抗体を得た。具体的には、本発明のヒト化抗体は、ＩＬ－３３とその受容体ＳＴ２との結合をブロックし、ＩＬ－３３によって誘導されるＰＢＭＣおよびＮＫ細胞からのＩＦＮγ分泌を阻害し、ＩＬ－３３を阻害して好塩基性白血病細胞ＫＵ８１２を誘導してＩＬ－５およびＩＬ－１３を分泌させることができる。本発明のヒト化抗体は、生体内で明らかな中和活性を有する。マウス動物実験において、本発明のヒト化抗体を投与して単回治療すると、マウスの末梢血におけるヒトＩＬ－３３の刺激によって引き起こされる好酸球の増加を効果的に減少させることができる。本発明の抗体は、様々なＩＬ－３３関連病症の治療に使用されることが期待される。これに基づいて、本発明を完成させた。
【0072】
用語
本発明において、「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ、略してＡｂ）」または「免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、略してＩｇＧ）」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有するヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）の重鎖間でのジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖および軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖の一端には、可変領域（ＶＨ）があり、その後には定常領域であり、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインで構成される。各軽鎖の一端には、可変領域（ＶＬ）があり、他端には、定常領域があり、軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬを含み、軽鎖の定常領域は、重鎖の定常領域のＣＨ１ドメインと対になり、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域と対になる。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞特性効果（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）等に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４サブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）を含む。抗体の重鎖と軽鎖とは、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインとの間のジスルフィド結合によって共有結合され、抗体の二つの重鎖は、ヒンジ領域間に形成されるポリペプチド間ジスルフィド結合によって共有結合される。
本発明において、「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ、略してＡｂ）」または「免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、略してＩｇＧ）」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有するヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）の重鎖間でのジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖および軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖の一端には、可変領域（ＶＨ）があり、その後には定常領域であり、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインで構成される。各軽鎖の一端には、可変領域（ＶＬ）があり、他端には、定常領域があり、軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬを含み、軽鎖の定常領域は、重鎖の定常領域のＣＨ１ドメインと対になり、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域と対になる。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞特性効果（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）等に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４サブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）を含む。抗体の重鎖と軽鎖とは、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインとの間のジスルフィド結合によって共有結合され、抗体の二つの重鎖は、ヒンジ領域間に形成されるポリペプチド間ジスルフィド結合によって共有結合される。
【0073】
本発明において、「Ｆａｂ」および「Ｆｃ」という用語は、パパインが抗体を二つの完全に同一のＦａｂセグメントおよび一つのＦｃセグメントに分解することができることを指す。Ｆａｂセグメントは、抗体の重鎖のＶＨおよびＣＨ１ならびに軽鎖のＶＬおよびＣＬドメインで構成される。Ｆｃセグメントは、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインで構成される、結晶化可能な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）である。Ｆｃセグメントは、抗原結合活性を有さず、抗体とエフェクター分子または細胞と相互作用する部位である。
【0074】
本発明において、「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域が通常１５～２５個のアミノ酸のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して連結されることによって形成される、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）である。
【0075】
本発明において、「可変」という用語は、抗体の可変領域の特定の部分の配列が異なることを表し、それは、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合および特異性を形成する。しかしながら、可変性は、抗体可変ドメイン全体に均等に分されていない。それは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つの断片に集中する。可変領域のより保存的な部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、四つのＦＲ領域を含み、それらは、接続環を形成する三つのＣＤＲによって接続された大抵β－フォールディング構成にあり、場合によっては部分的なβフォールディング構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に近接され、かつ別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、巻Ｉ、６４７～６６９ページ（１９９１）を参照する）。
【0076】
本明細書で使用されるように、「フレームワーク領域」（ＦＲ）という用語は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列、即ち、単一種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存される免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変領域のそれらの部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－ＬおよびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる四つのＦＲを有する。対応的に、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と呼ばれることができ、且つ重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）として表されることができる。好ましくは、本発明のＦＲは、ヒト抗体ＦＲまたはその誘導体であり、前記ヒト抗体ＦＲの誘導体は、天然に存在するヒト抗体ＦＲと実質的に同一であり、即ち、配列同一性は、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に達する。
【0077】
ＣＤＲのアミノ酸配列を知ると、当業者は、フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを容易に決定することができる。
【0078】
本明細書で使用されるように、「ヒトフレームワーク領域」という用語は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％またはそれ以上、具体的には、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％である）であるフレームワーク領域である。
【0079】
本明細書で使用されるように、「リンカー」という用語は、軽鎖および重鎖のドメインが交換された二重可変領域免疫グロブリンにフォールディングするのに十分な可動性を提供するために、免疫グロブリンドメインに挿入された一つまたは複数のアミノ酸残基を指す。本発明において、好ましいリンカーとは、リンカーＬｉｎｋｅｒ１およびＬｉｎｋｅｒ２を指し、ここで、Ｌｉｎｋｅｒ１は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のＶＨおよびＶＬと接続し、Ｌｉｎｋｅｒ２は、ｓｃＦｖを別の抗体の重鎖と接続するために使用される。
【0080】
適切なリンカーの例としては、モノグリシン（Ｇｌｙ）、またはセリン（Ｓｅｒ）残基を含み、リンカーのアミノ酸残基のマーカーおよび配列は、リンカーで達成する必要がある二次構造要素のタイプによって異なる。
【0081】
本発明において、本発明の抗体は、その保存的突然変異体をさらに含み、これは、本発明の二重特異性抗体のアミノ酸配列と比較して、最大１０個、好ましくは最大８個、より好ましくは最大５個、最も好ましくは最愛３個のアミノ酸が性質の類似または近似のアミノ酸によって置き換えられてポリペプチドを形成することを指す。これらの保存的突然変異ポリペプチドは、好ましくは、表Ａに従ってアミノ酸を置き換えることによって産生される。
【表1】
【0082】
本発明において、「抗」、「結合」、「特異的結合」という用語は、抗体とその抗原との間の反応等、二つの分子間のランダムでない結合反応を指す。通常、抗体は、約１０－７Ｍ未満、例えば、約１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満またはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で当該抗原に結合する。本発明において、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指し、抗体と抗原との間の結合親和性を説明するために使用される。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原の結合が強くなり、抗体と抗原との間の親和性が高くなる。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ機器で表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、略してＳＰＲ）を使用して抗体と抗原との結合親和性を測定するか、またはＥＬＩＳＡを使用して抗体と抗原との結合の相対的親和性を測定する。
【0083】
本発明において、「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合するポリペプチド決定基を指す。本発明のエピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。
【0084】
本発明は、前記抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
【0085】
関連する配列を得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。通常、これは、それを担体にクローニングし、次に細胞に形質転換し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。
【0086】
本発明は、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含む担体にさらに関する。これらの担体は、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。
【0087】
医薬組成物および適用
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、ならびに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、静脈内注射、静脈内点滴、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射（腹膜内等）、頭蓋内注射、または腔内注射をふくむ（これらに限定されない）。本発明において、「医薬組成物」という用語は、本発明の二重特異性抗体を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬製剤組成物を形成することにより、より安定的に治療効果を発揮することができ、これらの製剤は、本発明で開示される二重特異性抗体のアミノ酸コア配列のコンフォメーションの完全性を確保し、同時にタンパク質の多官能基を分解（縮合、脱アミノ化または酸化を含むがこれらに限定されない）から保護することができる。本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の二重特異性抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。このような担体は、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、ならびに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、静脈内注射、静脈内点滴、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射（腹膜内等）、頭蓋内注射、または腔内注射をふくむ（これらに限定されない）。本発明において、「医薬組成物」という用語は、本発明の二重特異性抗体を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬製剤組成物を形成することにより、より安定的に治療効果を発揮することができ、これらの製剤は、本発明で開示される二重特異性抗体のアミノ酸コア配列のコンフォメーションの完全性を確保し、同時にタンパク質の多官能基を分解（縮合、脱アミノ化または酸化を含むがこれらに限定されない）から保護することができる。本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の二重特異性抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。このような担体は、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。
【0088】
本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤および溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有效量であり、例えば、毎日の約１０μg／kg体重～約５０ｍｇ／kg体重である。さら
に、本発明の二重特異性抗体は、他の治療剤とともに使用することもできる。
に、本発明の二重特異性抗体は、他の治療剤とともに使用することもできる。
【0089】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の二重特異性抗体またはその免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μg／kg体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／kg体重を超えなく、好ましくは、
当該投与量は、約１０μg／kg体重～約１０ｍｇ／kg体重である。もちろん，具体的な投
与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。
当該投与量は、約１０μg／kg体重～約１０ｍｇ／kg体重である。もちろん，具体的な投
与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。
【0090】
抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明は、本発明の抗体に基づく抗体薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）をさらに提供する。
本発明は、本発明の抗体に基づく抗体薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）をさらに提供する。
【0091】
典型的には、前記抗体薬物コンジュゲートは、前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体は、前記エフェクター分子にカップリングし、好ましくは、化学カップリングである。ここで、前記エフェクター分子は、好ましくは治療活性を有する薬物である。
【0092】
さらに、前記エフェクター分子は、毒性タンパク質、化学療法薬、小分子薬または放射性核種のうちの一つまたは複数の種であり得る。
【0093】
本発明の抗体は、カップリング剤を介して前記エフェクター分子にカップリングされることができる。前記カップリング剤の例としては、非選択的カップリング剤、カルボキシル基を用いたカップリング剤、ペプチド鎖、ジスルフィド結合を用いたカップリング剤のうちの任意の一つまたは複数の種であり得る。前記非選択的カップリング剤は、エフェクター分子と抗体とを共有結合させる化合物、例えば、グルタルアルデヒドなどを指す。前記カルボキシル基を用いたカップリング剤は、シスアコニット酸無水物カップリング剤（例えば、シスアコニット酸無水物）、アシルヒドラゾンカップリング剤（カップリング部位は、アシルヒドラゾンである）のうちの任意の一つまたは複数の種であり得る。
【0094】
抗体上の特定の残基（例えば、ＣｙｓまたはＬｙｓ等）は、様々な官能基と結合するために使用され、ここで、イメージング試薬（例えば、発色団および蛍光団）、診断試薬（例えば、ＭＲＩ造影剤および放射性同位体）、安定剤（例えば、グリコールポリマー）ならびに治療剤を含む。抗体は、機能剤にカップリングされて、抗体－機能剤のコンジュゲートを形成することができる。機能剤（例えば、薬物、検出試薬、安定剤）は、抗体にカップリング（共有結合）される。機能剤は、抗体に直接、またはリンカーを介して間接的に結合することができる。
【0095】
抗体は、薬物にカップリングされることにより、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣｓ）を形成することができる。典型的に、ＡＤＣは、薬物と抗体との間に位置するリンカーを含む。リンカーは、分解性または非分解性リンカーであり得る。分解性リンカーは、通常、細胞内環境、例えば、リンカーを分解する目的の部位で分解を受けやすく、それによって抗体から薬物を放出する。適切な分解性リンカーは、例えば、細胞内プロテアーゼ（例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼ）によって分解可能なペプチジル含有リンカーを含む酵素的に分解可能なリンカー、またはグルクロニダーゼによって分解可能なグルクロニド含有リンカー等の糖リンカーを含む。ペプチジルリンカーは、例えば、バリン－シトルリン，フェニルアラニン－リジンまたはバリン－アラニンなどの二ペプチドを含むことができる。他の適切な分解性リンカーは、例えば、ｐＨ感受性リンカー（例えば、５．５未満のｐＨで加水分解するリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカー）および還元条件下で分解できるリンカー（例えば、ジスルフィド結合リンカー）を含む。非分解性リンカーは、通常、抗体がプロテアーゼによって加水分解される条件下で薬物を放出する。
【0096】
抗体に結合される前に、リンカーは、特定のアミノ酸残基と反応できる活性な反応基を有し、結合は、活性な反応基を介して実現される。スルフヒドリル特異的活性な反応基が好ましく、マレイミド化合物、ハロゲン化アミド（例えば、ヨード、臭化または塩素化）、ハロエステル（例えば、ヨード、臭化または塩素化）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、臭化または塩素化）、ハロゲン化ベンジル（例えば、ヨード、臭化または塩素化）、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、対イオンが酢酸塩、塩素イオンまたは硝酸塩である３，６－ビス－（水銀メチル）ジオキサン等の水銀誘導体、ならびにポリメチレンジメチルスルフィドチオスルホネートを含む。リンカーは、例えば、チオスクシンイミドを介して抗体に結合したマレイミドを含むことができる。
【0097】
薬物は、任意の細胞毒性、細胞成長阻害性または免疫阻害性の薬物であり得る。実施形態において、リンカーは、抗体および薬物と結合し、薬物は、リンカーと結合を形成できる官能基を有する。例えば、薬物は、リンカーと結合を形成できるアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、またはケト基を有することができる。薬物がリンカーに直接結合される場合、薬物は、抗体に結合される前に、反応性活性基を有する。
【0098】
有用な薬物のクラスは、例えば、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、化学増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビン化アルカロイド等を含む。本発明において、薬物－リンカーは、一つの簡単安段階でＡＤＣを形成することができる。他の実施形態において、二官能性リンカー化合物は、２段階または多段階方法でＡＤＣを形成するために使用されることができる。例えば、システイン残基は、最初の段階でリンカーの反応活性部分と反応され、また、その後の段階で、リンカー上の官能基が薬物と反応されることにより、ＡＤＣを形成する。
【0099】
通常、リンカー上の官能基は、薬物部分上の適切な反応活性基との特定の反応を促進するために選択される。非限定的な例としては、アジドベースの部分を使用して、薬物部分の反応性アルキニル基と特異的に反応させることができる。薬物は、アジドとアルキニル基との間の１，３－双極性環状付加を介してリンカーに共有結合される。他の有用な官能基は、例えば、ケトンおよびアルデヒド（ヒドラジドおよびアルコキシアミンとの反応に適する）、ホスフィン（アジドとの反応に適する）、イソシアネートおよびイソチオシアネート、ならびにＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルなどの活性化されるエステル（アミンおよびアルコールとの反応に適する）を含む。「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第二版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に記載されるような、これらおよび他の結合策略は、当業者に周知である。当業者は、薬物部分およびリンカーの選択的反応については、反応性官能基の相補対が選択される場合、当該相補対の各メンバーは、リンカーおよび薬物の両方に使用されることができることを理解されたい。
【0100】
本発明は、抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するのに十分な条件下で、抗体を薬物－リンカー化合物と結合させる段階をさらに含むことができる、ＡＤＣを調製するための方法を提供する。
【0101】
特定の実施形態において、本発明の方法は、抗体－リンカーコンジュゲートを形成するのに十分な条件下で、抗体を二官能性リンカー化合物と結合させる段階を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、リンカーを介して薬物部分を抗体に結合させるのに十分な条件下で、抗体リンカーコンジュゲートを薬物部分に結合させる段階をさらに含む。
【0102】
いくつかの実施形態において、抗体薬物コンジュゲートＡＤＣは、次のような分子式を有し、
【化1】
【0103】
ここで、
Ａｂは、抗体であり、
ＬＵは、リンカーであり、
Ｄは、薬物であり、
下付きｐは、１～８の値から選択される。
Ａｂは、抗体であり、
ＬＵは、リンカーであり、
Ｄは、薬物であり、
下付きｐは、１～８の値から選択される。
【0104】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。実施例は、担体やプラスミドの構築、タンパク質をコードする遺伝子の担体やプラスミドへの挿入、プラスミドの宿主細胞への導入等の、従来の方法の詳細な説明を含まないこのような方法は、当業者に周知であり、また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ、Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを含む多数の刊行物に記載されている．
以下の実施例で使用される実験材料およびソース、ならびに実験試薬の調製方法は、以下に具体的にせつめいされる。
以下の実施例で使用される実験材料およびソース、ならびに実験試薬の調製方法は、以下に具体的にせつめいされる。
【0105】
実験材料および試薬：
Ｂａｌｂ／ｃマウス：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄから購入される。
Ｂａｌｂ／ｃマウス：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄから購入される。
【0106】
ＰＢＭＣ：Ａｕｓｓｅｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入され、カタログ番号ＰＢ００４－Ｃ。
【0107】
ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ：ＩＬ－３３配列のＳｅｒ１１２－Ｔｈｒ２７０（ＮＣＢＩ登録番号は、ＮＰ＿２５４２７４．１である）をＥ．ｃｏｌｉ発現担体にクローニングして、発現し、ＩＬ－３３のＣ－末端に６×Ｈｉｓタグを付加して、Ｎｉ＋アフィニティークロマトグラフィーカラムによる精製を容易にし、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されたとおりである。
【0108】
蟹食猿ＩＬ－３３－ｈｉｓ：ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入され、カタログ番号９０９１２－ＣＮＡＥ。
【0109】
ＩＬ－３３－ｈｉｓ－ｂｉｏｔｉｎタンパク質：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入され、カタログ番号２０２１７、ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔの試薬説明書に従ってＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質をｂｉｏｔｉｎ化する。
【0110】
Ｒａｔ－Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＬ－６：ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入され、カタログ番号５５４５４３。
【0111】
ｂｉｏｔｉｎ Ｒａｔ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６：ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入され、カタログ番号５５４５４６。
【0112】
Ｍｏｕｓｅ－Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入され、カタログ番号５５１２２１。
【0113】
ｂｉｏｔｉｎ ｍｏｕｓｅ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入され、カタログ番号５５４５５０。
【0114】
ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入され、カタログ番号ＡＰ１８１Ｐ。
【0115】
ＨＲＰ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ二次抗体：Ｓｉｇｍａから購入され、カタログ番号Ａ０１７０。
【0116】
ＨＲＰ標識のｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ二次抗体：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入され、カタログ番号５５４０６６。
【0117】
ＩＬ－６キット：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、カタログ番号８８－７０６６－７７。
【0118】
ＩＬ－８キット：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、カタログ番号ＢＭＳ２０４－３ＴＥＮ
ＩＬ－１２：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入され、カタログ番号ＣＴ０１１－Ｈ０８Ｈ。
ＩＬ－１２：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入され、カタログ番号ＣＴ０１１－Ｈ０８Ｈ。
【0119】
ＳＴ２－Ｆｃタンパク質：ヒトＳＴ２配列（ＮＣＢＩ登録番号は、ＮＰ＿００３８４７．２である）とヒトＩｇＧ１とのＦｃ領域配列を融合させ、真核発現担体ＰＴＴ５にクローニングし、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞をトランスフェクトすることにより、融合発現を行い、その後、発現上清を収集し、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムによって精製される。ＳＴ２－Ｆｃアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されたとおりである。
【0120】
ＴＭＢ：ＢＤから購入され、カタログ番号５５５２１４。
【0121】
１％Ｇｌｕｔｍｉｎｅ（グルタミン）、１％Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（ピルビン酸ナトリウム）、１％ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（最小必須培地－非必須アミノ酸溶液）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ペニシリン－ストレプトマイシン）、β－メルカプトエタノール、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）：すべてＧｉｂｃｏ会社から購入される。
【0122】
ＳＡタンパク質：Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｓｉｇｍａから購入され、カタログ番号８５８７８－１ＭＧ。
【0123】
ＳＦＭ培地：ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ会社から購入されカタログ番号１２０４５－０７６。
【0124】
ＲＰＭＩ１６４０完全培地：Ｇｉｂｃｏから購入される。
【0125】
実験機器：
電気融合装置具：ＢＴＸ会社から購入される。
電気融合装置具：ＢＴＸ会社から購入される。
【0126】
マイクロプレートリーダー：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入され、モデル番号ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０。
【0127】
本発明の抗体配列は、次の表に示された通りである。
【表2】
【0128】
実施例１．抗原免疫動物およびハイブリドーマの調製およびスクリーニング
段階１：マウスの抗原免疫
原核の組換え発現ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質で定期的に腹腔内にＢａｌｂ／ｃマウスを免疫する。初日、可溶性ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質を、フロイントの完全アジュバントで乳化するか、または水溶性アジュバント（ｑｕｉｃｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ）で完全に混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスを腹腔内注射し（ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ ５０μｇ／マウス）、１４日目に、可溶性ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質をフロイントの不完全アジュバントで乳化するか、または水溶性アジュバント（ｑｕｉｃｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ）で完全に混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスを腹腔内追加免疫し（ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ ５０μｇ／マウス）、３６日目に、前回と同様に可溶性ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質で動物を追加免疫し（ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ ５０μｇ／マウス）、３週間後にヒトＩＬ－３３－ｈｉｓを腹腔内注射して活性化し、３～４日後、マウス脾臓を採取して融合実験を行う。
段階１：マウスの抗原免疫
原核の組換え発現ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質で定期的に腹腔内にＢａｌｂ／ｃマウスを免疫する。初日、可溶性ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質を、フロイントの完全アジュバントで乳化するか、または水溶性アジュバント（ｑｕｉｃｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ）で完全に混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスを腹腔内注射し（ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ ５０μｇ／マウス）、１４日目に、可溶性ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質をフロイントの不完全アジュバントで乳化するか、または水溶性アジュバント（ｑｕｉｃｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ）で完全に混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスを腹腔内追加免疫し（ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ ５０μｇ／マウス）、３６日目に、前回と同様に可溶性ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質で動物を追加免疫し（ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ ５０μｇ／マウス）、３週間後にヒトＩＬ－３３－ｈｉｓを腹腔内注射して活性化し、３～４日後、マウス脾臓を採取して融合実験を行う。
【0129】
段階２：ハイブリドーマの調製およびスクリーニング
マウスの最後のショック免疫から３～４日後、従来のハイブリドーマ技術的解決策を用いて、マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０とを電気融合装置によって電気融合する。融合後の細胞を完全培地に均一に懸濁し、完全培地は、即ちＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭ Ｆ１２培地とを１：１で混合した後に１％Ｇｌｕｔｍｉｎｅ（グルタミン）、１％Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（ピルビン酸ナトリウム）、１％ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（最小必須培地－非必須アミノ酸溶液）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ペニシリン－ストレプトマイシン）、５０μＭβ－メルカプトエタノールおよび２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）で構成される培地を加え、１０５個の細胞／１００μｌ／ウェルに従って、合計３６枚の９６ウェル培養プレートに分割して一晩培養し、翌日、各ウェルに１００μｌ／ウェルの２×ＨＡＴ含有完全培地を加え、９６ウェルプレートの培養液を２００μｌ／ウェル（１×ＨＡＴを含む）とする。７～１２日後、上清を回収し、間接酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によってヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ結合活性が陽性であるハイブリドーマウェルをスクリーニングする。
マウスの最後のショック免疫から３～４日後、従来のハイブリドーマ技術的解決策を用いて、マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０とを電気融合装置によって電気融合する。融合後の細胞を完全培地に均一に懸濁し、完全培地は、即ちＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭ Ｆ１２培地とを１：１で混合した後に１％Ｇｌｕｔｍｉｎｅ（グルタミン）、１％Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（ピルビン酸ナトリウム）、１％ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（最小必須培地－非必須アミノ酸溶液）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ペニシリン－ストレプトマイシン）、５０μＭβ－メルカプトエタノールおよび２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）で構成される培地を加え、１０５個の細胞／１００μｌ／ウェルに従って、合計３６枚の９６ウェル培養プレートに分割して一晩培養し、翌日、各ウェルに１００μｌ／ウェルの２×ＨＡＴ含有完全培地を加え、９６ウェルプレートの培養液を２００μｌ／ウェル（１×ＨＡＴを含む）とする。７～１２日後、上清を回収し、間接酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によってヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ結合活性が陽性であるハイブリドーマウェルをスクリーニングする。
【0130】
ここで、間接酵素免疫測定法によってヒトＩＬ－３３－ｈｉｓ結合活性陽性ハイブリドーマウェルをスクリーニングする方法は、次のとおりである。組換えヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質をコーティング液（５０ｍＭ炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルをマイクロタイタープレートに加え、４℃下で一晩コーティングする。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（２％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を加え、３７℃下で１時間静置後にＰＢＳＴでプレートを１回洗浄して備蓄する。回収したハイブリドーマ上清を、ブロックしたマイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルで順次加え、３７℃下で１時間静置する。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を加え、３７℃下で３０分間静置し、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、残った液滴を吸水紙にできるだけパッティング乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所に５分間静置し、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、被験抗体と標的抗原ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓとの結合能を分析する。
【0131】
血清を含む完全培地でスクリーニングによって得られた１０のハイブリドーマ細胞株を増幅し、無血清培養液ＳＦＭ培地に変換するように遠心分離して、細胞密度が１～２×１０７／ｍｌになるようにし、５％ＣＯ２、３７℃条件下で２週間培養し、遠心分離によって培養上清を得、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、１０のマウス由来の抗ヒトＩＬ－３３モノクローナル抗体を得る。それぞれ８７４Ｆ７、８７１Ｇ１、８６４Ｆ３、８８７Ｂ９、８５８Ｄ５、８６８Ｈ１０、６０４Ａ８、６０４Ａ１２、６４６Ｆ８、６５１Ｈ２と命名される。
【0132】
実施例２．ヒトＩＬ－３３に対するマウス抗体の結合活性のＥＬＩＳＡ法による測定
間接酵素免疫測定法によってヒトＩＬ－３３に対するマウス抗体の結合能を測定する。
間接酵素免疫測定法によってヒトＩＬ－３３に対するマウス抗体の結合能を測定する。
【0133】
具体的な方法は、次のとおりである。ビオチン－アビジン（ＳＡ）を事前にコーティングし、コーティング液（５０ｍＭ炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌに希釈し、プレートを４℃下で一晩コーティングし、３７℃下で５％脱脂粉乳で２時間ブロックする。－８０℃で保存して備蓄する。ビオチン化組換えヒトＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質をコーティング液（５０ｍＭ炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６）で０．５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルを事前にコーティングしたＳＡプレートに３７℃下で０．５時間加える。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１％ＢＳＡで勾配希釈した被験抗体をブロックしたマイクロタイタープレートに順次加えて１００μｌ／ウェルとし、３７℃下で１時間静置する。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を加え、３７℃下で３０分間静置し、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、残った液滴を吸水紙にできるだけパッティング乾かし乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所に５分間静置し、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、被験抗体と標的抗原ヒトＩＬ－３３－ｈｉｓとの結合能を分析する。
【0134】
結果は、図１Ａ、１Ｂに示されるように、抗体は、すべて良好な結合活性を有する。８７４Ｆ７、８７１Ｇ１、８６４Ｆ３、８８７Ｂ９、８５８Ｄ５、８６８Ｈ１０抗体のＥＣ５０は、それぞれ０．１１ｎＭ、０．１４ｎＭ、０．２７ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．１８ｎＭ、０．３６ｎＭである。６０４Ａ８、６０４Ａ１２、６４６Ｆ８、６５１Ｈ２抗体のＥＣ５０は、それぞれ０．１１ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．１０ｎＭ、０．１３ｎＭである。
【0135】
実施例３．ＩＬ－３３へのＳＴ２結合をブロックするマウス抗体の活性の測定
ＳＴ２は、これまでに発見されたＩＬ－３３の唯一の受容体であり、ＩＬ－３３は、サイトカインとして、ＳＴ２シグナル伝達経路に依存してその生理学的機能を発揮し、抗体のブロック活性は、その中和活性を反映することができる。具体的な方法は、次のとおりである。２μｇ／ｍｌのＳＴ２ ＰＢＳ溶液でプレートを４℃下で一晩コーティングし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％脱脂粉乳で３７℃下で２時間ブロックし、ＰＢＳＴで３回洗浄して備蓄し、１％ＢＳＡで希釈した２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３３－ｈｉｓ－ｂｉｏｔｉｎ抗原と１％ＢＳＡで勾配希釈した被験抗体１：１とを等量で混合し、３７℃下で時間インキュベートし、この混合液を事前にコーティングしたＳＴ２プレートに加え、３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１：８０００でＨＲＰ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ二次抗体を加え、３７℃下で０．５時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、残った液滴を吸水紙にできるだけパッティング乾かし乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所に５分間静置し、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取る。
ＳＴ２は、これまでに発見されたＩＬ－３３の唯一の受容体であり、ＩＬ－３３は、サイトカインとして、ＳＴ２シグナル伝達経路に依存してその生理学的機能を発揮し、抗体のブロック活性は、その中和活性を反映することができる。具体的な方法は、次のとおりである。２μｇ／ｍｌのＳＴ２ ＰＢＳ溶液でプレートを４℃下で一晩コーティングし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％脱脂粉乳で３７℃下で２時間ブロックし、ＰＢＳＴで３回洗浄して備蓄し、１％ＢＳＡで希釈した２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３３－ｈｉｓ－ｂｉｏｔｉｎ抗原と１％ＢＳＡで勾配希釈した被験抗体１：１とを等量で混合し、３７℃下で時間インキュベートし、この混合液を事前にコーティングしたＳＴ２プレートに加え、３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１：８０００でＨＲＰ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ二次抗体を加え、３７℃下で０．５時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、残った液滴を吸水紙にできるだけパッティング乾かし乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所に５分間静置し、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取る。
【0136】
結果は、図２Ａ、２Ｂに示されるように、図２Ａに示される抗体８７４Ｆ７、８７１Ｇ１、８６４Ｆ３、８８７Ｂ９、８５８Ｄ５、８６８Ｈ１０は、すべて良好なブロック活性を有し、ＩＣ５０は、それぞれ０．９０ｎＭ、０．７４ｎＭ、０．２３ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．２７ｎＭである。図２Ｂに示される抗体６０４Ａ８、６０４Ａ１２、６４６Ｆ８、６５１Ｈ２は、ブロック活性がないか、または非常に弱い。
【0137】
実施例４．ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３誘導性ＩＬ－６発現に対するマウス抗体の阻害効果
ＨＵＶＥＣ細胞を用いて抗ＩＬ－３３抗体の生物学的活性を測定する。具体的な方法は、次のとおりである。Ｔ７５培養フラスコでＨＵＶＥＣ細胞を培養し、ＨＵＶＥＣ細胞を第５世代細胞に継代し、Ｔ７５培養フラスコ中のＨＵＶＥＣ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのトリプシンで１０分間消化し、細胞が落ちるのを待ち、１０ｍｌの培地で消化を停止させ、計数し、１００μｌ／ウェル、６０００個／ウェルでプレーティングする。残りは、Ｔ７５培養フラスコに培養し続けて凍結保存する。ＩＬ－３３－ｈｉｓを培地で２０ｎｇ／ｍｌに希釈し、被験抗体を４０μｇ／ｍｌから、４倍で８段階希釈し、４ウェルを空白とし、希釈後に抗原および抗体をそれぞれ５０μｌ取って細胞プレートに加え、均一に混合する。即ち、ＩＬ－３３－ｈｉｓの最終濃度は、５ｎｇ／ｍｌである。混合後に３７℃下で１２時間～１８時間インキュベートする。上清を取ってＩＬ－６の濃度を測定する。測定方法は、ＩＬ－６キットの取扱説明書を参照する。次のような式に従ってＩＬ－６抑制率を計算し、且つＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによってフィッティング分析を実行する。
ＨＵＶＥＣ細胞を用いて抗ＩＬ－３３抗体の生物学的活性を測定する。具体的な方法は、次のとおりである。Ｔ７５培養フラスコでＨＵＶＥＣ細胞を培養し、ＨＵＶＥＣ細胞を第５世代細胞に継代し、Ｔ７５培養フラスコ中のＨＵＶＥＣ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのトリプシンで１０分間消化し、細胞が落ちるのを待ち、１０ｍｌの培地で消化を停止させ、計数し、１００μｌ／ウェル、６０００個／ウェルでプレーティングする。残りは、Ｔ７５培養フラスコに培養し続けて凍結保存する。ＩＬ－３３－ｈｉｓを培地で２０ｎｇ／ｍｌに希釈し、被験抗体を４０μｇ／ｍｌから、４倍で８段階希釈し、４ウェルを空白とし、希釈後に抗原および抗体をそれぞれ５０μｌ取って細胞プレートに加え、均一に混合する。即ち、ＩＬ－３３－ｈｉｓの最終濃度は、５ｎｇ／ｍｌである。混合後に３７℃下で１２時間～１８時間インキュベートする。上清を取ってＩＬ－６の濃度を測定する。測定方法は、ＩＬ－６キットの取扱説明書を参照する。次のような式に従ってＩＬ－６抑制率を計算し、且つＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによってフィッティング分析を実行する。
【0138】
抑制率＝（ＯＤＡｇＩＬ－３３－ＯＤ投与）／（ＯＤＡｇＩＬ－３３－ＯＤ空白）×１００％。
【0139】
結果は、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃに示されるように、８７４Ｆ７、８７１Ｇ１、８６４Ｆ３、８８７Ｂ９、８５８Ｄ５、８６８Ｈ１０、６０４Ａ８、６０４Ａ１２、６５１Ｈ２の阻害活性のＩＣ５０は、それぞれ０．６５ｎＭ、１．６６ｎＭ、１．５２ｎＭ、４．５３ｎＭ、１２．２５ｎＭ、９．３５ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．１３ｎＭ、０．０４ｎＭである。さらに、抗体６０４Ａ８、６０４Ａ１２、６５１Ｈ２の最大抑制率は、比較的に低い。
【0140】
実施例５．ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３誘導性ＩＬ－８発現に対するマウス抗体の阻害効果
ＨＵＶＥＣ細胞を用いて抗ＩＬ－３３抗体の生物学的活性を測定する。具体的な方法は、次のとおりである。Ｔ７５培養フラスコでＨＵＶＥＣ細胞を培養し、ＨＵＶＥＣ細胞を第５世代細胞に継代し、Ｔ７５培養フラスコ中のＨＵＶＥＣ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのトリプシンで１０分間消化し、細胞が落ちるのを待ち、１０ｍｌの培地で消化を停止させ、計数し、１００μｌ／ウェル、６０００個／ウェルでプレーティングする。残りは、Ｔ７５培養フラスコに培養し続けて凍結保存する。ＩＬ－３３－ｈｉｓを培地で２０ｎｇ／ｍｌに希釈し、被験抗体を４０μｇ／ｍｌから、４倍で８段階希釈し、４ウェルを空白とし、希釈後に抗原および抗体をそれぞれ５０μｌ取って細胞プレートに加え、均一に混合する。即ち、ＩＬ－３３－ｈｉｓの最終濃度は、５ｎｇ／ｍｌである。混合後に３７℃下で１２時間～１８時間インキュベートする。上清を取ってＩＬ－８の濃度を測定する。測定方法は、ＩＬ－８キットの取扱説明書を参照する。次のような式に従ってＩＬ－８抑制率を計算し、且つＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによってフィッティング分析を実行する。
ＨＵＶＥＣ細胞を用いて抗ＩＬ－３３抗体の生物学的活性を測定する。具体的な方法は、次のとおりである。Ｔ７５培養フラスコでＨＵＶＥＣ細胞を培養し、ＨＵＶＥＣ細胞を第５世代細胞に継代し、Ｔ７５培養フラスコ中のＨＵＶＥＣ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのトリプシンで１０分間消化し、細胞が落ちるのを待ち、１０ｍｌの培地で消化を停止させ、計数し、１００μｌ／ウェル、６０００個／ウェルでプレーティングする。残りは、Ｔ７５培養フラスコに培養し続けて凍結保存する。ＩＬ－３３－ｈｉｓを培地で２０ｎｇ／ｍｌに希釈し、被験抗体を４０μｇ／ｍｌから、４倍で８段階希釈し、４ウェルを空白とし、希釈後に抗原および抗体をそれぞれ５０μｌ取って細胞プレートに加え、均一に混合する。即ち、ＩＬ－３３－ｈｉｓの最終濃度は、５ｎｇ／ｍｌである。混合後に３７℃下で１２時間～１８時間インキュベートする。上清を取ってＩＬ－８の濃度を測定する。測定方法は、ＩＬ－８キットの取扱説明書を参照する。次のような式に従ってＩＬ－８抑制率を計算し、且つＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによってフィッティング分析を実行する。
【0141】
抑制率＝（ＯＤＡｇＩＬ－３３－ＯＤ投与）／（ ＯＤＡｇＩＬ－３３－ＯＤ空白）×１００％。
【0142】
結果は、図４に示されるように、抗体８５８Ｄ５、８６８Ｈ１０の活性は、弱く、抗体８７４Ｆ７、８７１Ｇ１、８６４Ｆ３、８８７Ｂ９のＩＣ５０は、それぞれ０．３５ｎＭ、０．１６ｎＭ、１．４６ｎＭ、８．９０ｎＭである。
【0143】
実施例６．蟹食猿ＩＬ－３３抗原に対するマウス抗体の交差活性の測定
間接酵素免疫測定法によって蟹食猿ＩＬ－３３に対するマウス抗体の結合能を測定する。具体的な方法は、次のとおりである。ビオチン－アビジン（ＳＡ）を事前にコーティングし、コーティング液（５０ｍＭ炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌに希釈し、プレートを４℃下で一晩コーティングし、３７℃下で５％脱脂粉乳で２時間ブロックする。－８０℃で保存して備蓄する。ビオチン化組換え蟹食猿ＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質をコーティング液（５０ｍＭ炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルを事前にコーティングしたＳＡプレートに３７℃下で０．５時間加える。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１％ＢＳＡで勾配希釈した被験抗体をブロックしたマイクロタイタープレートに順次加えて１００μｌ／ウェルとし、３７℃下で１時間静置する。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を加え、３７℃下で３０分間静置し、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、残った液滴を吸水紙にできるだけパッティング乾かし乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所に５分間静置し、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、被験抗体と標的抗原蟹食猿ＩＬ－３３－ｈｉｓとの結合能を分析する。
間接酵素免疫測定法によって蟹食猿ＩＬ－３３に対するマウス抗体の結合能を測定する。具体的な方法は、次のとおりである。ビオチン－アビジン（ＳＡ）を事前にコーティングし、コーティング液（５０ｍＭ炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌに希釈し、プレートを４℃下で一晩コーティングし、３７℃下で５％脱脂粉乳で２時間ブロックする。－８０℃で保存して備蓄する。ビオチン化組換え蟹食猿ＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質をコーティング液（５０ｍＭ炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルを事前にコーティングしたＳＡプレートに３７℃下で０．５時間加える。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１％ＢＳＡで勾配希釈した被験抗体をブロックしたマイクロタイタープレートに順次加えて１００μｌ／ウェルとし、３７℃下で１時間静置する。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を加え、３７℃下で３０分間静置し、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、残った液滴を吸水紙にできるだけパッティング乾かし乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所に５分間静置し、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、被験抗体と標的抗原蟹食猿ＩＬ－３３－ｈｉｓとの結合能を分析する。
【0144】
結果は、図５に示されるように、抗体は、すべて蟹食猿ＩＬ－３３タンパク質に良好に結合することができる。抗体８７４Ｆ７、８７１Ｇ１、８６４Ｆ３、８８７Ｂ９、８５８Ｄ５、８６８Ｈ１０、６０４Ａ８、６０４Ａ１２、６４６Ｆ８、６５１Ｈ２のＥＣ５０は、それぞれ０．０３ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０６ｎＭである。
【0145】
実施例７．マウス抗体のインビボでの中和活性の評価
抗原ＩＬ－３３を動物に静脈内投与すると、体内の炎症反応に変化が生じ、脾臓細胞の増殖により脾臓の重量増加を引き起こし、この方法は、インビボでのＩＬ－３３の中和における抗体薬物の活性を評価するために使用されることができる。具体的な方法は、次のとおりである。雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス、体重１８－２０ｇ、ランダムに六つのグループに分け、各グループに１０匹の動物を割り当てる。第１のグループ、通常の対照群、第２のグループ、ＩＬ－３３－ｈｉｓ抗原攻撃群、グループ分け後に２日目から０．４ｕｇ／匹ＩＬ－３３抗原を６日間連続して毎日腹腔内注射し、第３のグループ、８６４Ｆ３治療群、グループ分け当日、８６４Ｆ３抗体５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射し、グループ分け後に２日目から０．４ｕｇ／匹ＩＬ－３３抗原を６日間連続して毎日腹腔内注射し、第４のグループ、８７１Ｇ１治療群、グループ分け当日、８７１Ｇ１抗体５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射し、グループ分け後に２日目から０．４ｕｇ／匹ＩＬ－３３－ｈｉｓ抗原を６日間連続して毎日腹腔内注射し、第５のグループ、８７４Ｆ７治療群、グループ分け当日、８７４Ｆ７抗体５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射し、グループ分け後に２日目から０．４ｕｇ／匹ＩＬ－３３抗原を６日間連続して毎日腹腔内注射する。グループ分け後７日目に、動物を秤量し、安楽死させた動物の脾臓の重量を秤量する。
抗原ＩＬ－３３を動物に静脈内投与すると、体内の炎症反応に変化が生じ、脾臓細胞の増殖により脾臓の重量増加を引き起こし、この方法は、インビボでのＩＬ－３３の中和における抗体薬物の活性を評価するために使用されることができる。具体的な方法は、次のとおりである。雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス、体重１８－２０ｇ、ランダムに六つのグループに分け、各グループに１０匹の動物を割り当てる。第１のグループ、通常の対照群、第２のグループ、ＩＬ－３３－ｈｉｓ抗原攻撃群、グループ分け後に２日目から０．４ｕｇ／匹ＩＬ－３３抗原を６日間連続して毎日腹腔内注射し、第３のグループ、８６４Ｆ３治療群、グループ分け当日、８６４Ｆ３抗体５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射し、グループ分け後に２日目から０．４ｕｇ／匹ＩＬ－３３抗原を６日間連続して毎日腹腔内注射し、第４のグループ、８７１Ｇ１治療群、グループ分け当日、８７１Ｇ１抗体５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射し、グループ分け後に２日目から０．４ｕｇ／匹ＩＬ－３３－ｈｉｓ抗原を６日間連続して毎日腹腔内注射し、第５のグループ、８７４Ｆ７治療群、グループ分け当日、８７４Ｆ７抗体５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射し、グループ分け後に２日目から０．４ｕｇ／匹ＩＬ－３３抗原を６日間連続して毎日腹腔内注射する。グループ分け後７日目に、動物を秤量し、安楽死させた動物の脾臓の重量を秤量する。
【0146】
実験結果は、図６に示されるように、ＰＢＳ対照群の脾臓重量の平均値は、８６．９±９．４ｍｇであるが、抗原Ａｇ－ＩＬ－３３群の体重増加は、１９５．７±２６．９ｍｇと大幅に増加した。８６４Ｆ３、８７１Ｇ１、８７４Ｆ７抗体投与群の脾臓重量の平均値は、それぞれ１０６．３±２４．５ｍｇ、７７．７±１７．５ｍｇ、８９．９±１４．７ｍｇであり、すべて有意な中和活性を有する。
【0147】
実施例８．キメラ抗体の調製
本実施例は、分子生物学の関連する方法によって、ハイブリドーマ８６４Ｆ３、８７４Ｆ７および８７１Ｇ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を得、キメラ抗体をさらに構築する。
本実施例は、分子生物学の関連する方法によって、ハイブリドーマ８６４Ｆ３、８７４Ｆ７および８７１Ｇ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を得、キメラ抗体をさらに構築する。
【0148】
Ｔｒｉｚｏｌを介して８６４Ｆ３、８７４Ｆ７および８７１Ｇ１の三つのハイブリドーマ細胞のＲＮＡを抽出し、且つｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを取得し、次にｃＤＮＡをテンプレートとして、それぞれマウス抗体の重鎖および軽鎖の縮重プライマー（「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｖｏｌｕｍｅ １、Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒｏｌａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｔｅｆａｎ Ｄuｂｅｌ、組み合わせたプラ
イマーの配列は、３２３ページから）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ生成物をシーケンシングし、且つｋａｂａｔデータベースによって分析し、得られた配列がマウス抗体の可変領域配列であることを確認する。
イマーの配列は、３２３ページから）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ生成物をシーケンシングし、且つｋａｂａｔデータベースによって分析し、得られた配列がマウス抗体の可変領域配列であることを確認する。
【0149】
関連する配列の上方は、次のとおりである。
【0150】
８６４Ｆ３は、二つの重鎖可変領域遺伝子配列を有し、完全長は、すべて３６３ｂｐであり、それぞれ１２１個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたとおりであり、アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたとおりであり、８６４Ｆ３軽鎖可変領域遺伝子配列の完全長は、３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されたとおりであり、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりである。
【0151】
８７４Ｆ７重鎖可変領域遺伝子配列の完全長は、３６３ｂｐであり、１２１個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されたとおりであり、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されたとおりであり、８７４Ｆ７軽鎖可変領域遺伝子配列の完全長は、３１８ｂｐであり、１０６個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたとおりであり、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されたとおりである。
【0152】
８７１Ｇ１重鎖可変領域遺伝子配列の完全長は、３６３ｂｐであり、１２１個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたとおりであり、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたとおりであり、８７１Ｇ１軽鎖可変領域遺伝子配列の完全長は、３１８ｂｐであり、１０６個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されたとおりであり、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されたとおりである。
【0153】
三つの好ましいマウス由来の抗ＩＬ－３３抗体の三つのＨ－ＣＤＲおよび三つのＬ－ＣＤＲの同一性は、比較的に高く、特に、すべてが同一のＬ－ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２２）を有する。
【0154】
得られた各ハイブリドーマ重鎖可変領域配列とヒトＩｇＧ４定常領域（Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む）（アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されたとおりである）とをスプライシングし、軽鎖可変領域配列とヒトｋａｐｐａ鎖定常領域（アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されたとおりである）とをスプライシングし、各キメラ抗体の重鎖および軽鎖をｐｃＤＮＡ３．４発現担体にそれぞれ構築し、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、得られた各キメラ抗体をＰｒｏｔｅｉｎ Ａによって精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびＳＥＣ－ＨＰＬＣによって、発現した各抗体の分子量が約１５０ｋＤであることが判明され、抗体純度＞９５％であり、定量化し、アリコート化し、－８０℃下で凍結保存して備蓄する。
【0155】
実施例９．ＥＬＩＳＡ法によるヒトＩＬ－３３に対する各キメラ抗体の結合活性の測定 ＳＡタンパク質を２μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃下で一晩コーティングし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で３回洗浄し、ＰＢＳで２％ＢＳＡを２００μＬ／ウェルに調製し、室温下で２時間ブロックし、ＰＢＳＴで２回洗浄後、ＰＢＳＴで調製した１％ＢＳＡでＩＬ－３３－ｈｉｓ－ｂｉｏｔｉｎタンパク質を１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルをＥＬＩＳＡプレートに加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで調製した１％ＢＳＡで３倍勾配に従って各モノクローナル抗体をそれぞれ希釈し、最高濃度は、１０μｇ／ｍＬであり、１２勾配に希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、各サンプルについて２個のデュープリケートウェルを並行して行い、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴで調製した１％ＢＳＡで適切な比率に従ってＨＲＰ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ二次抗体を希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄後にＴＭＢ発色液を１００μＬ／ウェル加えて、目的の色に発色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて７０μＬ／ウェルで発色反応を停止させ、各反応溶液を均等に振とうし、からマイクロプレートリーダーによってＯＤ４５０ｎｍを測定し、データを分析し、ＥＣ５０を計算する。
【0156】
実験結果は、図７に示されたとおりであり、キメラ抗体８６４Ｆ３－ｃｈ２、８６４Ｆ３－ｃｈ１、８７１Ｇ１－ｃｈ、８７４Ｆ７－ｃｈのＥＣ５０は、それぞれ０．１７３ｎＭ、０．１２７ｎＭ、０．１７８ｎＭ、０１４４ｎＭであり、各キメラ抗体がＩＬ－３３に対して良好な親和性を有することを示す。
【0157】
実施例１０．ＩＬ－３３に対するＳＴ２結合をブロックするキメラ抗体の活性の測定
ＥＬＩＳＡコーティング液でＳＴ２－Ｆｃタンパク質を１μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルでコーティングし、ウェットボックスに入れ、４℃下で１６時間コーティングし、ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、次いでＰＢＳで調製した２％ＢＳＡで２００μＬ／ウェルを室温下で２時間ブロックし、ＰＢＳＴで１回洗浄し、パッティング乾かし，余分なブロッキング溶液を除去し、１％ＢＳＡ ＰＢＳＴで３倍勾配に従って各モノクローナル抗体をそれぞれ希釈し、最高濃度は、４０μｇ／ｍＬであり、１１勾配に希釈し、希釈した抗体と１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３３－ｈｉｓ－ｂｉｏｔｉｎタンパク質とを１：１で混合し、均一に混合した後にＥＬＩＳＡウェルに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、各濃度について２個のデュープリケートウェルを並行して行い（抗体最高濃度の最終濃度は、２０μｇ／ｍＬであり、ＩＬ－３３－ｈｉｓ－ｂｉｏｔｉｎの最終濃度は、５ｎｇ／ｍＬである）、結合していないかまたは非特異的に結合した一次抗体を洗い流し、抗体の説明書の要求に従って、抗体希釈液でＨＲＰ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ二次抗体を適切な濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙上でパッティング乾かし、余分な液体を除去し、ＴＭＢ発色液１００μＬ／ウェルを加え、適切な深さまで発色させ、７０μＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて発色を停止させ、多機能マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍ波長での吸光度を測定し、データを分析する。
ＥＬＩＳＡコーティング液でＳＴ２－Ｆｃタンパク質を１μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルでコーティングし、ウェットボックスに入れ、４℃下で１６時間コーティングし、ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、次いでＰＢＳで調製した２％ＢＳＡで２００μＬ／ウェルを室温下で２時間ブロックし、ＰＢＳＴで１回洗浄し、パッティング乾かし，余分なブロッキング溶液を除去し、１％ＢＳＡ ＰＢＳＴで３倍勾配に従って各モノクローナル抗体をそれぞれ希釈し、最高濃度は、４０μｇ／ｍＬであり、１１勾配に希釈し、希釈した抗体と１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３３－ｈｉｓ－ｂｉｏｔｉｎタンパク質とを１：１で混合し、均一に混合した後にＥＬＩＳＡウェルに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、各濃度について２個のデュープリケートウェルを並行して行い（抗体最高濃度の最終濃度は、２０μｇ／ｍＬであり、ＩＬ－３３－ｈｉｓ－ｂｉｏｔｉｎの最終濃度は、５ｎｇ／ｍＬである）、結合していないかまたは非特異的に結合した一次抗体を洗い流し、抗体の説明書の要求に従って、抗体希釈液でＨＲＰ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ二次抗体を適切な濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙上でパッティング乾かし、余分な液体を除去し、ＴＭＢ発色液１００μＬ／ウェルを加え、適切な深さまで発色させ、７０μＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて発色を停止させ、多機能マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍ波長での吸光度を測定し、データを分析する。
【0158】
実験結果は、図８に示されるように、キメラ抗体８７４Ｆ７－ｃｈ、８７１Ｇ１－ｃｈ、８６４Ｆ３－ｃｈ１、８６４Ｆ３－ｃｈ２のＩＣ５０は、それぞれ０．６３４ｎＭ、０．８５３ｎＭ、４５．２４５ｎＭ、０．５８０ｎＭであり、各キメラ抗体は、ＩＬ－３３ブロック型抗体であり、ＩＬ－３３のその受容体ＳＴ２への結合を効果的にブロックすることができ、また、８７４Ｆ７－ｃｈ、８７１Ｇ１－ｃｈおよび８６４Ｆ３－ｃｈ２が好ましいことを示す。
【0159】
実施例１１．ヒト化抗体の調製
各候補マウス抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列を分析し、Ｋａｂａｔ規則に従って、マウス抗体の三つの抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）および四つのフレームワーク領域（ＦＲ）を決定する。ここで、８６４Ｆ３重鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＨＣＤＲ１：ＮＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、
ＨＣＤＲ２：ＶＩＲＡＧＧＳＳＤＹＮＳＡＬＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、
ＨＣＤＲ３：ＤＨＹＦＳＮＳＹＧＧＳＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）または
ＨＣＤＲ１：ＫＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、
ＨＣＤＲ２：ＶＬＲＡＧＧＴＩＳＹＮＳＡＬＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、
ＨＣＤＲ３：ＤＨＹＹＹＳＳＦＧＧＦＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）であり、
軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＬＣＤＲ１：ＬＡＳＱＴＩＡＴＷＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、
ＬＣＤＲ２：ＡＡＴＲＬＡＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）および
ＬＣＤＲ３：ＱＱＬＹＮＴＰＹＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）である。
各候補マウス抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列を分析し、Ｋａｂａｔ規則に従って、マウス抗体の三つの抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）および四つのフレームワーク領域（ＦＲ）を決定する。ここで、８６４Ｆ３重鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＨＣＤＲ１：ＮＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、
ＨＣＤＲ２：ＶＩＲＡＧＧＳＳＤＹＮＳＡＬＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、
ＨＣＤＲ３：ＤＨＹＦＳＮＳＹＧＧＳＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）または
ＨＣＤＲ１：ＫＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、
ＨＣＤＲ２：ＶＬＲＡＧＧＴＩＳＹＮＳＡＬＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、
ＨＣＤＲ３：ＤＨＹＹＹＳＳＦＧＧＦＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）であり、
軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＬＣＤＲ１：ＬＡＳＱＴＩＡＴＷＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、
ＬＣＤＲ２：ＡＡＴＲＬＡＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）および
ＬＣＤＲ３：ＱＱＬＹＮＴＰＹＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）である。
【0160】
８７４Ｆ７重鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＨＣＤＲ１：ＫＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、
ＨＣＤＲ２：ＶＬＲＡＧＧＳＴＧＹＮＳＡＬＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、
ＨＣＤＲ３：ＤＨＹＹＹＳＳＹＧＧＦＶＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）であり、
軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＬＣＤＲ１：ＬＡＳＱＴＩＧＡＷＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、
ＬＣＤＲ２：ＡＡＴＲＬＡＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）および
ＬＣＤＲ３：ＱＱＬＤＳＳＰＹＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）である。
ＨＣＤＲ１：ＫＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、
ＨＣＤＲ２：ＶＬＲＡＧＧＳＴＧＹＮＳＡＬＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、
ＨＣＤＲ３：ＤＨＹＹＹＳＳＹＧＧＦＶＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）であり、
軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＬＣＤＲ１：ＬＡＳＱＴＩＧＡＷＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、
ＬＣＤＲ２：ＡＡＴＲＬＡＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）および
ＬＣＤＲ３：ＱＱＬＤＳＳＰＹＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）である。
【0161】
８７１Ｇ１重鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＨＣＤＲ１：ＫＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、
ＨＣＤＲ２：ＶＬＲＡＧＧＴＩＳＹＮＳＡＬＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、
ＨＣＤＲ３：ＤＨＹＹＹＳＳＦＧＧＦＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）であり、
軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＬＣＤＲ１：ＬＡＳＱＴＩＧＡＷＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、
ＬＣＤＲ２：ＡＡＴＲＬＡＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）および
ＬＣＤＲ３：ＱＱＬＮＳＴＰＹＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）である。
ＨＣＤＲ１：ＫＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、
ＨＣＤＲ２：ＶＬＲＡＧＧＴＩＳＹＮＳＡＬＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、
ＨＣＤＲ３：ＤＨＹＹＹＳＳＦＧＧＦＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）であり、
軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、
ＬＣＤＲ１：ＬＡＳＱＴＩＧＡＷＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、
ＬＣＤＲ２：ＡＡＴＲＬＡＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）および
ＬＣＤＲ３：ＱＱＬＮＳＴＰＹＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）である。
【0162】
マウス抗体のＣＤＲ配列は、次の表１ａに示されたとおりである。
【表3】
【0163】
Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースから上記の各マウス抗体の非ＦＲ領域に最もよく一致するヒト化テンプレートを選択する。次いでマウス抗体のＣＤＲ領域を選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域を置き換え、重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ４定常領域（Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む）と組換えられ、軽鎖可変領域は、ヒトｋａｐｐａ鎖定常領域と組換えられ、同時に当該抗体の三次元構造に基づいて、埋め込まれた残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、および各抗体のＶＬおよびＶＨのコンフォメーションに重要な影響を与える残基に対して復帰突然変異を行い、最終的に複数のヒト化抗体を得、各ヒト化抗体およびキメラ抗体に対応する重鎖、軽鎖可変領域および配列は、表１ｂに示されたとおりである。各ヒト化抗体の重鎖および軽鎖をｐｃＤＮＡ３．４発現担体にそれぞれ構築し、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、ＰｒｏｔｅｉｎＡによって精製して各ヒト化抗体を得、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびＳＥＣ－ＨＰＬＣによって、各抗体の分子量の正しさおよび純度＞９５％であることを確認する。
【表4】
【0164】
実施例１２．ＥＬＩＳＡ法によるヒトＩＬ－３３に対する各ヒト化抗体の結合活性の測定
ＥＬＩＳＡ法によって、ヒトＩＬ－３３に対する上記の各ヒト化抗体の結合親和性を測定し、関連する実験方法は、実施例９を参照する。
ＥＬＩＳＡ法によって、ヒトＩＬ－３３に対する上記の各ヒト化抗体の結合親和性を測定し、関連する実験方法は、実施例９を参照する。
【0165】
実験結果は、図９Ａ～９Ｄに示されたとおりであり、キメラ抗体８６４Ｆ３－ｃｈ２およびヒト化抗体８６４Ｆ３－ＨｕＧ、８６４Ｆ３－Ｈｕ１、８６４Ｆ３－Ｈｕ２のＥＣ５０は、それぞれ０．１６９ｎＭ、０．７６０ｎＭ、０．２４９ｎＭ、０．１８１ｎＭであり、キメラ抗体８６４Ｆ３－ｃｈ２と比較して、ヒトＩＬ－３３に対するヒト化抗体８６４Ｆ３－ＨｕＧ、８６４Ｆ３－Ｈｕ１、８６４Ｆ３－Ｈｕ２の親和性の損失は、比較的に多く、キメラ抗体８６４Ｆ３－ｃｈ２および８６４Ｆ３－Ｈｕ３、８６４Ｆ３－Ｈｕ４、８６４Ｆ３－Ｈｕ５のＥＣ５０は、それぞれ０．１２４ｎＭ、０．１３８ｎＭ、０．１３５ｎＭ、０．１４６ｎＭであり、キメラ抗体８６４Ｆ３－ｃｈ２と比較して、ヒトＩＬ－３３に対する８６４Ｆ３－Ｈｕ３、８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８６４Ｆ３－Ｈｕ５の親和性は、ほぼ変わらない。
【0166】
キメラ抗体８７４Ｆ７－ｃｈおよびヒト化抗体８７４Ｆ７－Ｈμｇ、８７４Ｆ７－Ｈｕ１、８７４Ｆ７－Ｈｕ２のＥＣ５０は、それぞれ０．１７７ｎＭ、０．１７０ｎＭ、０．１２９ｎＭ、０．１３６ｎＭである。キメラ抗体８７４Ｆ７－ｃｈと比較して、ヒトＩＬ－３３に対するヒト化抗体８７４Ｆ７－Ｈｕ１および８７４Ｆ７－Ｈｕ２の親和性は、損失が発生しない。
【0167】
キメラ抗体８７１Ｇ１－ｃｈおよびヒト化抗体８７１Ｇ１－ＨｕＧ、８７１Ｇ１－Ｈｕ１、８７１Ｇ１－Ｈｕ２のＥＣ５０は、それぞれ与０．２５５ｎＭ、０．１８７ｎＭ、０．１９１ｎＭ、０．１７６ｎＭである。キメラ抗体８７１Ｇ１－ｃｈと比較して、ヒトＩＬ－３３に対するヒト化抗体８７１Ｇ１－Ｈｕ１、８７１Ｇ１－Ｈｕ２および８７１Ｇ１－ＨｕＧの親和性は、損失が発生しない。
【0168】
実施例１３．ＩＬ－３３へのＳＴ２結合をブロックするヒト化抗体の活性の測定
ＥＬＩＳＡ法によって、ＩＬ－３３およびその受容体ＳＴ２の結合に対するブロック効果を測定し、関連する実験方法は、実施例１０を参照する。
ＥＬＩＳＡ法によって、ＩＬ－３３およびその受容体ＳＴ２の結合に対するブロック効果を測定し、関連する実験方法は、実施例１０を参照する。
【0169】
実験結果は、図１０に示されたとおりであり、ＩＬ－３３およびＳＴ２タンパク質の結合に対するヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４、８６４Ｆ３－Ｈｕ５、８７１Ｇ１－Ｈｕ１、８７１Ｇ１－Ｈｕ２、８７４Ｆ７－Ｈｕ１、８７４Ｆ７－Ｈｕ２のブロック効果のＩＣ５０値は、それぞれ０．５１２ｎＭ、０．４７３ｎＭ、０．４０４ｎＭ、０．３６１ｎＭ、０．４５１ｎＭ、０．３５０ｎＭである。各ヒト化抗体は、すべてＩＬ－３３およびＳＴ２結合に対するブロック効果を保持することを示す。
【0170】
実施例１４．ＩＬ－３３に対するヒト化モノクローナル抗体の結合動力学の測定
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇと共有結合したチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入され、カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）を使用して各被験抗体を補充し、関連する動作パラメーターは、次のとおりである。抗体濃度は、２μｇ／ｍＬであり、接触時間は、７５秒であり、流速は、１０μＬ／ｍｉｎであり、再生接触時間は、３０秒である。ＨＢＳ－ＥＰ ｐＨ７．４緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入され、カタログ番号ＢＲ－１００６－６９）でＩＬ－３３－ｈｉｓ抗原を希釈し、最高濃度は、５０ｎＭであり、０．３９ｎＭに２倍希釈し、デュープリケートウェルおよび０濃度ポイントを設定し、再生緩衝液として６Ｍ塩酸グアニジン溶液を使用し、次のパラメーターに従ってＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋにサンプルう注入し、結合時間は、１８０ｓであり、解離時間は、９００ｓであり、流速は、３０Ｌ／ｍｉｎであり、再生接触時間は、３０ｓである。実行完了
後、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、「１：１結合動態モデル（ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｍｏｄｅｌ）」に従ってデータを分析し、ＩＬ－３３に対する各抗体の結合動力学パラメーターを得る。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇと共有結合したチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入され、カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）を使用して各被験抗体を補充し、関連する動作パラメーターは、次のとおりである。抗体濃度は、２μｇ／ｍＬであり、接触時間は、７５秒であり、流速は、１０μＬ／ｍｉｎであり、再生接触時間は、３０秒である。ＨＢＳ－ＥＰ ｐＨ７．４緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入され、カタログ番号ＢＲ－１００６－６９）でＩＬ－３３－ｈｉｓ抗原を希釈し、最高濃度は、５０ｎＭであり、０．３９ｎＭに２倍希釈し、デュープリケートウェルおよび０濃度ポイントを設定し、再生緩衝液として６Ｍ塩酸グアニジン溶液を使用し、次のパラメーターに従ってＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋにサンプルう注入し、結合時間は、１８０ｓであり、解離時間は、９００ｓであり、流速は、３０Ｌ／ｍｉｎであり、再生接触時間は、３０ｓである。実行完了
後、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、「１：１結合動態モデル（ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｍｏｄｅｌ）」に従ってデータを分析し、ＩＬ－３３に対する各抗体の結合動力学パラメーターを得る。
【0171】
結果は、表２に示されたとおりであり、ＩＬ－３３に対する各ヒト化抗体の結合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）および平衡解離定数（ＫＤ）は、同程度である。
【表5】
【0172】
実施例１５．ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３誘導性ＩＬ－６発現に対するヒト化抗体の阻害効果
本実施例は、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質誘導性ＩＬ－６発現に対する各ヒト化抗体の阻害效果を測定することにより、各ヒト化抗体の活性を評価する。具体的な実験段階は、次のとおりである。Ｔ７５培養フラスコ中のＨＵＶＥＣ細胞を消化して計数した後に完全培地に１００μＬ／ウェル、６０００細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃下でインキュベーターで２時間培養した後、細胞が壁に接着してから投与を開始し、完全培地で被験抗体を希釈し、最高濃度は、２００ｎＭであり、９勾配に５倍希釈し、陽性空白対照および陰性空白対照を設定し、希釈後に抗体と２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３－ｈｉｓとを１：１の体積で混合する（抗体を細胞に加えた後に最高濃度の最終濃度は、５０ｎＭであり、ＩＬ－３３－ｈｉｓの最終濃度は、５ｎｇ／ｍＬである）。
本実施例は、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質誘導性ＩＬ－６発現に対する各ヒト化抗体の阻害效果を測定することにより、各ヒト化抗体の活性を評価する。具体的な実験段階は、次のとおりである。Ｔ７５培養フラスコ中のＨＵＶＥＣ細胞を消化して計数した後に完全培地に１００μＬ／ウェル、６０００細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃下でインキュベーターで２時間培養した後、細胞が壁に接着してから投与を開始し、完全培地で被験抗体を希釈し、最高濃度は、２００ｎＭであり、９勾配に５倍希釈し、陽性空白対照および陰性空白対照を設定し、希釈後に抗体と２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３－ｈｉｓとを１：１の体積で混合する（抗体を細胞に加えた後に最高濃度の最終濃度は、５０ｎＭであり、ＩＬ－３３－ｈｉｓの最終濃度は、５ｎｇ／ｍＬである）。
【0173】
室温下で３０分間インキュベートし、１００μＬ抗体／ＩＬ－３３－ｈｉｓ混合液を取って細胞液に加えて穏やかに混合し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２０時間作用させた後に、遠心分離によって上清を収集して－８０℃で保存し、ＩＬ－６を測定する。
【0174】
ＥＬＩＳＡコーティング液でＲａｔ－Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＬ－６タンパク質を２．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルでコーティングし、ウェットボックスに入れ、４℃下で１６時間コーティングし、ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、結合していないタンパク質を除去し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙上でパッティング乾かし、余分な液体を除去し、次いでＰＢＳで調製した２％ＢＳＡを２００μＬ／ウェルで室温下で１－２時間ブロックし、ＰＢＳで調製した１％ＢＳＡで３倍勾配に従ってＩＬ－６標準品を希釈し、最高濃度は、３０ｎｇ／ｍＬである。均一に混合した後にＥＬＩＳＡウェルに１００μＬ／ウェルを加え、１００μＬ／ウェルの上記の細胞上清をＥＬＩＳＡウェルに加え、室温下で１時間インキュベートし、標準曲線については、各サンプルに二つのデュープリケートウェルを並行して行い、結合していないかまたは非特異的に結合した一次抗体を洗い流し、抗体希釈液でｂｉｏｔｉｎ Ｒａｔ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６を１：１０００で希釈し、均一に混合した後にＥＬＩＳＡウェルに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、結合していないかまたは非特異的に結合した抗体を洗い流し、ＨＲＰ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ二次抗体を適切な濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙上でパッティング乾かし、余分な液体を除去し、ＴＭＢ発色液を加え、適切な深さまで発色させ、５０μＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて発色を停止させ、多機能マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍ波長での吸光度を測定し、データを分析する。
【0175】
実験結果は、図１１に示されたとおりであり、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３誘導性ＩＬ－６発現に対するヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４、８６４Ｆ３－Ｈｕ５、８７１Ｇ１－Ｈｕ１、８７１Ｇ１－Ｈｕ２、８７４Ｆ７－Ｈｕ１、８７４Ｆ７－Ｈｕ２の阻害効果のＩＣ５０値は、それぞれ０．０７３ｎＭ、０．１４７ｎＭ、０．２１０ｎＭ、０．１７５ｎＭ、０．０５１ｎＭ、０．０５０ｎＭである。各ヒト化抗体は、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質誘導性ＩＬ－６分泌を効果的に阻害できることを示し、特に８７４Ｆ７－Ｈｕ１および８７４Ｆ７－Ｈｕ２の効果が、比較的に優れる。
【0176】
実施例１６．ＩＬ－３３誘導性ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌に対するヒト化抗体の阻害効果
本実施例は、ＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質誘導性ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌に対する各ヒト化抗体の阻害効果を測定して、各ヒト化抗体の活性を評価する。具体的な実験段階は、次のとおりである。新鮮なＰＢＭＣを遠心分離によって計数し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０完全培地で４×１０６細胞／Ｍｌに希釈し、９６ウェルＵ型細胞培養プレートにＰＢＭＣ細胞を加え、各ウェルは、５０μＬ（２×１０５細胞／ウェル）であり、３７℃のインキュベーターで入れて回復し、ＲＰＭＩ１６４０完全培地で抗体を希釈し、最高濃度は、２００ｎＭであり（最終濃度は、５０ｎＭである）、３倍勾配に従って希釈し、希釈後に各ウェルに等量の４０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３－ｈｉｓを加え（最終濃度は、１０ｎｇ／ｍＬである）、３７℃下で３０分間インキュベートし、５０μＬの４０ｎｇ／ｍＬ完全培地で希釈したＩＬ－１２を上記のＰＢＭＣ細胞培養プレートに加え、次に１００μＬ抗体とＩＬ－３３－ｈｉｓ混合液とを加え、均等に混合後、３７℃の細胞インキュベーターに入れて２４時間培養し、細胞培養プレートを５００ｇで５分間遠心分離し、検出のために各ウェルから１８０μＬの上清を採取する。
本実施例は、ＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質誘導性ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌に対する各ヒト化抗体の阻害効果を測定して、各ヒト化抗体の活性を評価する。具体的な実験段階は、次のとおりである。新鮮なＰＢＭＣを遠心分離によって計数し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０完全培地で４×１０６細胞／Ｍｌに希釈し、９６ウェルＵ型細胞培養プレートにＰＢＭＣ細胞を加え、各ウェルは、５０μＬ（２×１０５細胞／ウェル）であり、３７℃のインキュベーターで入れて回復し、ＲＰＭＩ１６４０完全培地で抗体を希釈し、最高濃度は、２００ｎＭであり（最終濃度は、５０ｎＭである）、３倍勾配に従って希釈し、希釈後に各ウェルに等量の４０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３－ｈｉｓを加え（最終濃度は、１０ｎｇ／ｍＬである）、３７℃下で３０分間インキュベートし、５０μＬの４０ｎｇ／ｍＬ完全培地で希釈したＩＬ－１２を上記のＰＢＭＣ細胞培養プレートに加え、次に１００μＬ抗体とＩＬ－３３－ｈｉｓ混合液とを加え、均等に混合後、３７℃の細胞インキュベーターに入れて２４時間培養し、細胞培養プレートを５００ｇで５分間遠心分離し、検出のために各ウェルから１８０μＬの上清を採取する。
【0177】
ＥＬＩＳＡコーティング液でＭｏｕｓｅ－Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入され、カタログ番号５５１２２１）を１μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルでコーティングし、ウェットボックスに入れ、４℃下で１６時間コーティングし、ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙上でパッティング乾かし、余分な液体を除去し、次いでＰＢＳで調製した２％ＢＳＡを２００μＬ／ウェルで室温下で１－２時間ブロックし、ＰＢＳＴで１回洗浄し、余分なブロッキング溶液を除去し、ＥＬＩＳＡプレートをパッティング乾かし、余分な液体を除去し、ＩＦＮγ標準品を希釈し、最高濃度は、２５０ｎｇ／ｍＬであり、１／２１２勾配に希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに１００μＬ／ウェルを加え、各サンプルに二つのデュープリケートウェルを並行して行い、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬの上記の被験細胞上清を加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡ ＰＢＳＴを１：１０００で希釈したｂｉｏｔｉｎ ｍｏｕｓｅ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＦＮγを１００μＬ／ウェル加え（ＢＤから購入され、カタログ番号５５４５５０）、室温下で１時間インキュベートし、結合していないかまたは非特異的に結合した抗体を洗い流し、抗体の説明書の要求に従って、１％ＢＳＡ ＰＢＳＴでＨＲＰ標識Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤから購入され、カタログ番号５５４０６６）を適切な濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙上でパッティング乾かし、余分な液体を除去し、ＴＭＢ発色液１００μＬ／ウェルを加え、適切な深さまで発色させ、５０μＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて、発色を停止させ、多機能マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍ波長でのその吸光度を測定し、データを分析する。
【0178】
実験結果は、図１２に示されたとおりであり、ＩＬ－３３誘導性ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌に対するヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４、８６４Ｆ３－Ｈｕ５、８７１Ｇ１－Ｈｕ１、８７１Ｇ１－Ｈｕ２、８７４Ｆ７－Ｈｕ１、８７４Ｆ７－Ｈｕ２の阻害効果ＩＣ５０値は、それぞれ１．２２４ｎＭ、０．８３９ｎＭ、１．３９５ｎＭ、１．０６１ｎＭ、０．８５０ｎＭ、１．７３６ｎＭである。各ヒト化抗体は、ＩＬ－３３－ｈｉｓタンパク質誘導性ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌を効果的に阻害し、ここで、８７４Ｆ７－Ｈｕ２の活性は、比較的に低い。
【0179】
実施例１７．ＩＬ－３３誘導性ＮＫ細胞からのＩＦＮγ分泌に対するヒト化抗体の阻害効果
新鮮なＰＢＭＣを遠心分離によって計数した後、Ｎｋ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉから購入され、カタログ番号１３０－０９２－６５７）の説明書に従ってＮＫ細胞を分離する。ＰＢＳでＮＫ細胞を２回洗浄後に計数し、１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地で０．８×１０６細胞／ｍＬに希釈し、ウェルあたり５０μＬの細胞懸濁液に従って９６ウェル細胞培養プレートをプレーティングする。１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地で各抗体を希釈し、最終的な最大効果濃度は、１００ｎＭであり、１／４勾配希釈する。希釈後に最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであるＩＬ－３３－ｈｉｓを各ウェルに加え、３７℃の細胞インキュベーターで３０分間インキュベートする。次に完全培地で希釈した最終濃度が２ｎｇ／ｍＬであるＩＬ－１２を上記のＮＫ細胞を含む９６ウェル細胞培養プレートに加え、最後に上記の１００μＬの抗体とＩＬ－３３との混合液を加え、３７℃の細胞インキュベーターで２４時間インキュベートした後、細胞培養上清を収集してＩＦＮγの分泌レベルを測定する。
新鮮なＰＢＭＣを遠心分離によって計数した後、Ｎｋ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉから購入され、カタログ番号１３０－０９２－６５７）の説明書に従ってＮＫ細胞を分離する。ＰＢＳでＮＫ細胞を２回洗浄後に計数し、１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地で０．８×１０６細胞／ｍＬに希釈し、ウェルあたり５０μＬの細胞懸濁液に従って９６ウェル細胞培養プレートをプレーティングする。１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地で各抗体を希釈し、最終的な最大効果濃度は、１００ｎＭであり、１／４勾配希釈する。希釈後に最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであるＩＬ－３３－ｈｉｓを各ウェルに加え、３７℃の細胞インキュベーターで３０分間インキュベートする。次に完全培地で希釈した最終濃度が２ｎｇ／ｍＬであるＩＬ－１２を上記のＮＫ細胞を含む９６ウェル細胞培養プレートに加え、最後に上記の１００μＬの抗体とＩＬ－３３との混合液を加え、３７℃の細胞インキュベーターで２４時間インキュベートした後、細胞培養上清を収集してＩＦＮγの分泌レベルを測定する。
【0180】
ＩＦＮγの検出方法は、実施例１６を参照する。実験結果は、図１３に示されたとおりであり、ヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４、８６４Ｆ３－Ｈｕ５、８７１Ｇ１－Ｈｕ１、８７１Ｇ１－Ｈｕ２、８７４Ｆ７－Ｈｕ１、８７４Ｆ７－Ｈｕ２は、ＩＬ－３３誘導性ＮＫ細胞からのＩＦＮγ分泌に対して阻害効果を有し、ＩＣ５０値は、それぞれ０．９０４ｎＭ、１．０２１ｎＭ、０．８５１ｎＭ、０．９００ｎＭ、０．７４２ｎＭ、１．５５９ｎＭである。
【0181】
実施例１８．ＩＬ－３３誘導性ＫＵ８１２細胞からのＩＬ－５およびＩＬ－１３分泌に対するヒト化抗体の阻害効果
対数増殖期の好塩基性白血病細胞ＫＵ８１２を収集し、遠心分離い、計数し、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地（完全培地、Ｇｉｂｃｏから購入され、カタログ番号１１９６５－０９２）で再懸濁し、ウェルあたり２００００細胞に従って、９６ウェルの細胞培養プレートをプレーティングする。完全培地で各被験抗体を調製し、３倍勾配希釈を投与群とし、各群は、９勾配に段階希釈し、抗体の最高作業濃度は、２００μｇ／ｍＬであり、同時に完全培地でＩＬ－３３－ｈｉｓを調製し、作業濃度は、７００ｎｇ／ｍｌであり、１：１に従って均等に混合後、上記の９６ウェル細胞培養プレートを加え、各ウェルの最終体積は、２００μＬであり、非投与群を陰性対照として設定し、ＩＬ－３３のみの追加を単剤対照群と設定し、各濃度に二つのデュープリケートウェルを並行して行い、３７℃の細胞インキュベーターで４８時間培養し続け、上清を収集してＩＬ－５およびＩＬ－１３の分泌量を測定する。
対数増殖期の好塩基性白血病細胞ＫＵ８１２を収集し、遠心分離い、計数し、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地（完全培地、Ｇｉｂｃｏから購入され、カタログ番号１１９６５－０９２）で再懸濁し、ウェルあたり２００００細胞に従って、９６ウェルの細胞培養プレートをプレーティングする。完全培地で各被験抗体を調製し、３倍勾配希釈を投与群とし、各群は、９勾配に段階希釈し、抗体の最高作業濃度は、２００μｇ／ｍＬであり、同時に完全培地でＩＬ－３３－ｈｉｓを調製し、作業濃度は、７００ｎｇ／ｍｌであり、１：１に従って均等に混合後、上記の９６ウェル細胞培養プレートを加え、各ウェルの最終体積は、２００μＬであり、非投与群を陰性対照として設定し、ＩＬ－３３のみの追加を単剤対照群と設定し、各濃度に二つのデュープリケートウェルを並行して行い、３７℃の細胞インキュベーターで４８時間培養し続け、上清を収集してＩＬ－５およびＩＬ－１３の分泌量を測定する。
【0182】
ＥＬＩＳＡコーティング液でａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＬ－５（ＢＤから購入され、カタログ番号５５４４８８）およびａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＬ－１３（ＢＤから購入され、カタログ番号５５４５７０）抗体をそれぞれ５ｕｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルでコーティングし、ウェットボックスに入れ、４℃下で１６時間コーティングする。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、結合していない抗原を除去し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙上でパッティング乾かし、余分な液体を除去し、次いでＰＢＳで調製した２％ＢＳＡを２００μＬ／ウェルで室温下で１時間ブロックする。
【0183】
ＰＢＳＴで１回洗浄し、余分なブロッキング溶液洗い流し、ＥＬＩＳＡプレートをパッティング乾かし、余分な液体を除去し、ＰＢＳＴで調製した１％ＢＳＡで３倍勾配に従ってｈｕ－ＩＬ－５標準品をそれぞれ希釈し、最高濃度は、５０ｎｇ／ｍＬであり、１２勾配に希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で１時間インキュベートし、各サンプルに２個のデュープリケートウェルを並行して行う。１００μＬ／ウェルの収集した細胞上清を加える。ＰＢＳＴで調製した１％ＢＳＡで３倍勾配に従ってｈｕ－ＩＬ－１３標準品をそれぞれ希釈し、最高濃度は、１０ｎｇ／ｍＬであり、１２勾配に希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で２時間インキュベートし、各サンプルに２個のデュープリケートウェルを並行して行う。５０μＬ／ウェルの収集した細胞上清を加える。結合していないかまたは非特異的に結合した一次抗体を洗い流し、抗体の説明書の要求に従って、抗体希釈液でＢｉｏｔｉｎ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ－ＩＬ－５（ＢＤから購入され、カタログ番号５５４４９１）およびＢｉｏｔｉｎ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ－ＩＬ－１３（ＢＤから購入され、カタログ番号５５５０５４）二次抗体を適切な濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で２時間インキュベートする。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙上でパッティング乾かし、余分な液体を除去し、抗体希釈液でＨＲＰ標識したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤから購入され、カタログ番号５５４０６６）を適切な濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ウェルを加え、室温下で３０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙上でパッティング乾かし、余分な液体を除去し、ＴＭＢ発色液１００μＬ／ウェルを加え、適切な深さまで発色させ、５０μＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて発色を停止させ、多機能マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍ波長での吸光度を測定し、データを分析する。
【0184】
実験結果は、図１４に示されたとおりであり、ヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１は、ＩＬ－３３誘導性ＫＵ８１２細胞からのＩＬ－５の分泌を効果的に阻害でき、そのＩＣ５０は、それぞれ２７．６０５ｎＭおよび７．８２８ｎＭである。
【0185】
図１５に示されたとおりであり、ヒト化抗体８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１も、ＩＬ－３３誘導性ＫＵ８１２細胞からのＩＬ－１３の分泌を効果的に阻害でき、そのＩＣ５０は、それぞれ１４．７４５ｎＭおよび５．２１９ｎＭでT<
実施例１９．異なる種のＩＬ－３３タンパク質に対するヒト化抗体の交差反応性
実験方法は、実施例１４を参照し、ここで、抗原は、それぞれ蟹食猿ＩＬ－３３タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入され、カタログ番号９０９１２－ＣＮＡＥ）およびマウスＩＬ－３３タンパク質（Ｒ＆Ｄから購入され、３６２６－ＭＬ－０１０／ＣＦ）を使用し、同時に対象としてヒトＩＬ－３３タンパク質を設定する。実験結果は、表３に示されたとおりであり、８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１は、すべて蟹食猿ＩＬ－３３タンパク質と交差反応を示し、また、各抗体およびヒトＩＬ－３３タンパク質の結合特徴と一致する。さらに、８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１は、マウスＩＬ－３３タンパク質と一定の交差反応を有するが、その親和性は、各抗体のヒトＩＬ－３３タンパク質への結合よりも有意に吹くくなる。
実施例１９．異なる種のＩＬ－３３タンパク質に対するヒト化抗体の交差反応性
実験方法は、実施例１４を参照し、ここで、抗原は、それぞれ蟹食猿ＩＬ－３３タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入され、カタログ番号９０９１２－ＣＮＡＥ）およびマウスＩＬ－３３タンパク質（Ｒ＆Ｄから購入され、３６２６－ＭＬ－０１０／ＣＦ）を使用し、同時に対象としてヒトＩＬ－３３タンパク質を設定する。実験結果は、表３に示されたとおりであり、８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１は、すべて蟹食猿ＩＬ－３３タンパク質と交差反応を示し、また、各抗体およびヒトＩＬ－３３タンパク質の結合特徴と一致する。さらに、８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１は、マウスＩＬ－３３タンパク質と一定の交差反応を有するが、その親和性は、各抗体のヒトＩＬ－３３タンパク質への結合よりも有意に吹くくなる。
【表6】
【0186】
実施例２０．ヒト化抗体のインビボでの中和活性評価
具体的な実験段階は、実施例７を参照し、各実験群は、１０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを有する。
具体的な実験段階は、実施例７を参照し、各実験群は、１０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを有する。
【0187】
図１６に示されたとおりであり、結果は、対照群（脾臓重量８０．５５ｍｇ）と比較して、ＩＬ－３３抗原群の脾臓重量が１７６．４９ｍｇと有意に増加したことを示す。８６４Ｆ３－Ｈｕ４、８６４Ｆ３－Ｈｕ５、８７１Ｇ１－Ｈｕ１、８７１Ｇ１－Ｈｕ２、８７４Ｆ７－Ｈｕ１および８７４Ｆ７－Ｈｕ２抗体投与群の脾臓重量の平均値は、それぞれ７８．３９ｍｇ、８６．６ｍｇ、９２．８２ｍｇ、９８．８７ｍｇ、７５．６３ｍｇおよび７７．４９ｍｇであり、各ヒト化抗体がインビボで有意な中和活性を有することが分かる。
【0188】
実施例２１．ヒト化抗体のインビボでの薬力学的活性測定
実験方法は、実施例７を産所水、実験結果は、図１７に示されたとおりであり、ヒトＩＬ－３３に腹腔内注射した後、マウスの脾臓肥大（ＩＬ－３３群）を有意に刺激することができ、脾臓重量は、約１９４．６ｍｇであり、対照群（ヒトＩＬ－３３刺激なし）は、７６．１ｍｇであり、それぞれ５ｍｇ／ｋｇの８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１を１回の治療として投与する場合、マウスの脾臓肥大を効果的に阻害することができ、脾臓重量は、それぞれ６５．４ｍｇおよび５５．９ｍｇである。
実験方法は、実施例７を産所水、実験結果は、図１７に示されたとおりであり、ヒトＩＬ－３３に腹腔内注射した後、マウスの脾臓肥大（ＩＬ－３３群）を有意に刺激することができ、脾臓重量は、約１９４．６ｍｇであり、対照群（ヒトＩＬ－３３刺激なし）は、７６．１ｍｇであり、それぞれ５ｍｇ／ｋｇの８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１を１回の治療として投与する場合、マウスの脾臓肥大を効果的に阻害することができ、脾臓重量は、それぞれ６５．４ｍｇおよび５５．９ｍｇである。
【0189】
上記の実験が終了する場合、各群のマウスを安楽死させ、末梢血中の好酸球およびＩＬ－５のレベルをそれぞれ検出する。
【0190】
上記のマウスの全血の一部を採取して通常のＥＰ管に入れ、４℃下で５時間以上静置して完全に凝固させる。凝固後にＥＰ管を４℃に予冷した遠心分離機に入れて８０００ｒｍｐで６分間遠心分離する。遠心分離後に血清を取り出し、新しい遠心分離管に入れ、再び４℃に予冷した遠心分離機で８０００ｒｍｐで６ふんかん遠心分離する。遠心分離後に上清を取り出し、アリコート化し、－８０で保存する。ＢＤ ＣＢＡ Ｍｏｕｓｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｅｎｓｉｖｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入され、カタログ番号５６２２４６）の説明書の要求に従って、標準品および被験血清サンプルを希釈する。次にＭｏｕｓｅ ＩＬ－５ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入され、カタログ番号５６２２３４）の説明書の要求に従って、各サンプルを処理し、検出パラメーターを設定してフローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ）で各サンプルを検出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって上記で採集したデータを分析し、標準曲線に従って各実験群の血清サンプル中のＩＬ－５含有量を計算する。
【0191】
実験結果は、図１８に示されたとおりであり、対照群（ヒトＩＬ－３３刺激なし）と比較して、ヒトＩＬ－３３に腹腔内注射した後、マウスの末梢血中のＩＬ－５の分泌（ＩＬ－３３群）を約７８．６倍として有意に刺激することができ、それぞれ５ｍｇ／ｋｇの８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１を投与して１回治療する場合、マウスの末梢血ＩＬ－５の分泌を効果的に阻害することができ、それぞれは、対照群の１．７倍および０．９倍である。
【0192】
上記のマウスの全血の一部を採取してＥＤＴＡ抗凝固管に入れ、上下に逆にして均等にし、４℃下で静置して備蓄する。１０ｍＬの丸底遠心分離管を取り、その中の各管に２μＬのｍｏｕｓｅ Ｆｃ ｂｌｏｃｋｅｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入され、カタログ番号５５３１４２）を加える。サンプルごとに５０μＬの血液サンプルを１０ｍＬの遠心分離管に取り、軽くピペッティングして、血液サンプルとｂｌｏｃｋｅｒとを均等に混合する。氷上に置いて１５分間インキュベートする。各遠心分離管に２μＬの混合した三つの抗体、即ち０．５μＬのＣＤ４５．２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１０４）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTMから購入され、カタログ番号４５－０４５４－８２）、０．５μＬのＣＤ１７０（Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１ＲＮＭ４４Ｎ）、ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTMから購入され、カタログ番号１２－１７０２－８２）、および１μＬのＬｙ－６Ｇ／Ｌｙ－６Ｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＲＢ６－８Ｃ５）、ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTMから購入され、カタログ番号４７－５９３１－８２）を加え、氷上の暗所で１時間インキュベートする。遠心分離管に５００ｍＬの１×Ｌｙｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入され、カタログ番号５５５８９９）を加え、均等に混合し、室温下で赤血球を５分間溶解する。遠心分離管を３５０ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、管に３ｍＬの予冷したＰＢＳを加えて細胞を洗浄し、３５０ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、管に５００μＬ予冷したフィルター処理したＰＢＳを加え、沈降した細胞を軽る弾く。細胞懸濁液を細胞メッシュでフロー管にろ過し、フローサイトメーターによって各サンプル中の白血球に対する好酸球の比率を分析する。
【0193】
実験結果は、図１９に示されたとおりであり、対照群相比（ヒトＩＬ－３３刺激なし）と比較して、ヒトＩＬ－３３に腹腔内注射した後、マウスの末梢血中の好酸球の増加（ＩＬ－３３群）を約１０．５倍として有意に刺激することができ、それぞれ５ｍｇ／ｋｇの８６４Ｆ３－Ｈｕ４および８７４Ｆ７－Ｈｕ１を投与して１回治療する場合、マウスの末梢血中のヒトＩＬ－３３刺激によって引き起こされる好酸球の増加を効果的に減少させることができ、それぞれは、対照群の１．６倍および１．５８倍である。
【0194】
実施例２２．ＩＬ－３３に対するヒト化抗体の結合エピトープの測定
ＩＬ－３３成熟タンパク質によるアミノ酸配列：
ＭＳＩＴＧＩＳＰＩＴＥＹＬＡＳＬＳＴＹＮＤＱＳＩＴＦＡＬＥＤＥＳＹＥＩＹＶＥＤＬＫＫＤＥＫＫＤＫＶＬＬＳＹＹＥＳＱＨＰＳＮＥＳＧＤＧＶＤＧＫＭＬＭＶＴＬＳＰＴＫＤＦＷＬＨＡＮＮＫＥＨＳＶＥＬＨＫＣＥＫＰＬＰＤＱＡＦＦＶＬＨＮＭＨＳＮＣＶＳＦＥＣＫＴＤＰＧＶＦＩＧＶＫＤＮＨＬＡＬＩＫＶＤＳＳＥＮＬＣＴＥＮＩＬＦＫＬＳＥＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）（アミノ酸配列は、ＮＰ＿２５４２７４．１の１１２位のＳｅｒから２７０位のＴｈｒまでのＮＣＢＩに由来する）、次のような１６のポリペプチドを合成してＩＬ－３３に対するヒト化抗体の結合エピトープを特徴付け、各ポリペプチドのアミノ酸配列は、表４に示されたとおりであり、そのＮ－末端では、すべてマーカーをｂｉｏｔｉｎ化する。
ＩＬ－３３成熟タンパク質によるアミノ酸配列：
ＭＳＩＴＧＩＳＰＩＴＥＹＬＡＳＬＳＴＹＮＤＱＳＩＴＦＡＬＥＤＥＳＹＥＩＹＶＥＤＬＫＫＤＥＫＫＤＫＶＬＬＳＹＹＥＳＱＨＰＳＮＥＳＧＤＧＶＤＧＫＭＬＭＶＴＬＳＰＴＫＤＦＷＬＨＡＮＮＫＥＨＳＶＥＬＨＫＣＥＫＰＬＰＤＱＡＦＦＶＬＨＮＭＨＳＮＣＶＳＦＥＣＫＴＤＰＧＶＦＩＧＶＫＤＮＨＬＡＬＩＫＶＤＳＳＥＮＬＣＴＥＮＩＬＦＫＬＳＥＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）（アミノ酸配列は、ＮＰ＿２５４２７４．１の１１２位のＳｅｒから２７０位のＴｈｒまでのＮＣＢＩに由来する）、次のような１６のポリペプチドを合成してＩＬ－３３に対するヒト化抗体の結合エピトープを特徴付け、各ポリペプチドのアミノ酸配列は、表４に示されたとおりであり、そのＮ－末端では、すべてマーカーをｂｉｏｔｉｎ化する。
【表7】
【0195】
各ポリペプチド断片に対する抗体の結合活性を測定するために、コーティング液（５０ｍＭの炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６）でビオチン－アビジン（ＳＡ）を２μｇ／ｍＬに事前に希釈し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートを４℃下で一晩コーティングし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで調製した２％ＢＳＡで２００μＬ／ウェルで室温下で２時間ブロックする。ＰＢＳＴで１回洗浄し、最終濃度が１０μｇ／ｍＬである８６４Ｆ３および８７４Ｆ７を１００μＬ／ウェルでそれぞれ加え、室温下で１時間インキュベートする。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を加え、室温下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、残った液滴を吸水紙にできるだけパッティング乾かし乾かし、各ウェルに１００μＬのＴＭＢ発色液を加えて、適切な深さまで発色させ、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、被験抗体と各ポリペプチド断片との結合能を分析する。実験結果は、表５に示されたとおりであり、８７４Ｆ７は、Ｐｅｐ６に有意に結合できるが、他のペプチドには結合できないことが分かる。
【表8】
【0196】
上記の実験結果に基づき、８７４Ｆ７－Ｈｕ１とマウスＩＬ－３３タンパク質との結合Ｋｄ値は、３．３２×１０－８であり、上記のＩＬ－３３成熟タンパク質のアミノ酸配列に従って選択する。
【0197】
「ＫＫＤＥＫＫＤＫＶＬＬＳＹＹＥＳＱＨＰＳＮＥＳＧＤＧＶＤＧＫ」領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５の４１位－７０位）は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるアラニンスキャニング部位特異的突然変異がかけられ、次に原核の発現および精製が行われ、次のようなアミノ酸部位突然変異のＩＬ－３３突然変異体タンパク質をそれぞれ取得する。
【0198】
Ｋ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｄ４３Ａ、Ｅ４４Ａ、Ｋ４５Ａ、Ｋ４６Ａ、Ｄ４７Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｖ４９Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｌ５１Ａ、Ｓ５２Ａ、Ｙ５３Ａ、Ｙ５４Ａ、Ｅ５５Ａ、Ｓ５６Ａ、Ｑ５７Ａ、Ｈ５８Ａ、Ｐ５９Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｎ６１Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｓ６３Ａ、Ｄ６５Ａ、Ｖ６７Ａ、Ｄ６８Ａ、Ｋ７０Ａ
次に実施例９の実験方法を参照して、８７４Ｆ７－Ｈｕ１に対する上記の各突然変異体タンパク質の親和性をそれぞれ測定し、同時に任意の突然変異のないＩＬ－３３タンパク質（ＷＴ－１、ＷＴ－２、ＷＴ－３、ＷＴ－４）を対照として設定する。
次に実施例９の実験方法を参照して、８７４Ｆ７－Ｈｕ１に対する上記の各突然変異体タンパク質の親和性をそれぞれ測定し、同時に任意の突然変異のないＩＬ－３３タンパク質（ＷＴ－１、ＷＴ－２、ＷＴ－３、ＷＴ－４）を対照として設定する。
【0199】
代表的な実験結果は、それぞれ図２０－図２３および表６に示されたとおりであり、ＷＴと比較して、Ｋ４５、Ｖ４９、Ｌ５０、Ｄ６５の突然変異後、８７４Ｆ７－Ｈｕ１とＩＬ－３３との親和性が大幅に低下したことが分かり、２５倍以上低下し、Ｓ６０、Ｓ５２の突然変異後、８７４Ｆ７－Ｈｕ１とＩＬ－３３との親和性が大幅に低下したことが分かり、１０－２５倍低下し、Ｋ４８、Ｌ５１、Ｙ５３、Ｅ５５の突然変異後、８７４Ｆ７－Ｈｕ１とＩＬ－３３との親和性が一定に低下し、２．５－１０倍低下する。これは、８７４Ｆ７－Ｈｕ１とＩＬ－３３との結合に影響を与える重要な部位が主にＫ４５、Ｖ４９、Ｄ６５、Ｌ５０であり、その次がＳ６０、Ｓ５２であり、その後がＫ４８、Ｌ５１、Ｙ５３、Ｅ５５であることも示す。
【0200】
ＩＬ－３３結晶の３Ｄ構造図（ＰＤＢ：２ＫＬＬにより）における上記の各部位の位置は、図２４に示されたとおりであり、これも、８７４Ｆ７－Ｈｕ１とＩＬ－３３との結合エピトープが上記の重要なアミノ酸部位を含む線形および空間エピトープであることをさらに示す。
【表9】
【0201】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】
【国際調査報告】