2023-542492 免疫原性組成物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-10

(54)【発明の名称】免疫原性組成物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20231002BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231002BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20231002BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 9/08 20060101ALI20231002BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20231002BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20231002BHJP

   C07K 14/46 20060101ALI20231002BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20231002BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20231002BHJP

   C07K 14/535 20060101ALI20231002BHJP

   C07K 14/545 20060101ALI20231002BHJP

   C07K 14/525 20060101ALI20231002BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20231002BHJP

   C07K 14/57 20060101ALI20231002BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20231002BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20231002BHJP

【ＦＩ】

C12N15/31

A61K39/00 H ZNA

A61K38/02

A61P37/04

A61K38/19

A61P31/12

A61P31/04

A61P31/10

A61P33/00

A61P35/00

A61P37/08

A61K48/00

A61P39/02

A61P9/08

A61K9/06

C07K14/52

C07K14/46

C07K14/715

C07K14/195

C07K14/535

C07K14/545

C07K14/525

C07K14/55

C07K14/57

C12N15/115 Z

C07K14/705

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023514721

(86)(22)【出願日】2021-09-03

(85)【翻訳文提出日】2023-04-27

(86)【国際出願番号】 US2021049077

(87)【国際公開番号】W WO2022051629

(87)【国際公開日】2022-03-10

(31)【優先権主張番号】63/191,020

(32)【優先日】2021-05-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/125,769

(32)【優先日】2020-12-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/074,428

(32)【優先日】2020-09-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＢＲＩＪ

３．ＩＧＥＰＡＬ

４．ＳＰＡＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520445473

【氏名又は名称】フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】カーベジアン，アバク

(72)【発明者】

【氏名】デ ブール，アレクサンドラ・ソフィー

(72)【発明者】

【氏名】エチェラード，ヤン・ポール・ガイ・レジス

(72)【発明者】

【氏名】プルギス，ニコラス・マッカートニー

(72)【発明者】

【氏名】ウェインステイン，エリカ・ガブリエル

(72)【発明者】

【氏名】ネルソン，ジェニファー・エイ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA06

4C076AA09

4C076AA11

4C076AA16

4C076AA24

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC29

4C076CC32

4C076CC34

4C076CC35

4C076FF11

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA03

4C084BA44

4C084DA01

4C084MA13

4C084MA16

4C084MA28

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB13

4C084ZB26

4C084ZB33

4C084ZB35

4C084ZB37

4C084ZC37

4C085AA03

4C085EE01

4C085EE05

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA11

4H045CA40

4H045DA01

4H045DA03

4H045DA04

4H045DA12

4H045DA18

4H045DA50

4H045DA86

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、１つ又は複数の免疫原性ポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドの組成物、医薬調製物、及び使用を提供する。特に、本開示は、１つ又は複数の免疫原性ポリペプチドをコードする環状ポリリボヌクレオチドを特徴とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ポリペプチド免疫原をコードする配列と、（ｂ）アジュバントをコードする配列又は自然免疫系刺激剤である配列とを含む、環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項2】

前記ポリペプチド免疫原をコードする前記配列がＩＲＥＳに作動可能に連結されている、請求項１に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項3】

前記アジュバントをコードする前記配列がＩＲＥＳに作動可能に連結されている、請求項１又は２に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項4】

前記アジュバントがポリペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項5】

前記ポリペプチド免疫原及び前記アジュバントポリペプチドが、前記単一のＩＲＥＳに作動可能に連結された単一のオープンリーディングフレームによってコードされ、前記オープンリーディングフレームが発現すると、前記ポリペプチド免疫原及び前記アジュバントポリペプチドの各々のアミノ酸配列を含むポリペプチドが産生される、請求項４に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項6】

前記ポリペプチド免疫原と前記アジュバントポリペプチドとが、各々、ポリペプチドリンカーによって分離されている、請求項５に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項7】

前記ポリペプチド免疫原と前記アジュバントポリペプチドとが、各々、切断ドメインによって分離されている、請求項５に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項8】

前記切断ドメインが２Ａ自己切断ペプチドである、請求項６に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項9】

前記環状ポリリボヌクレオチドが複数のＩＲＥＳを含む、請求項４に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項10】

第１のＩＲＥＳが、前記ポリペプチド免疫原をコードする前記配列に作動可能に連結され、第２のＩＲＥＳが、前記アジュバントポリペプチドをコードする前記配列に作動可能に連結されている、請求項９に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項11】

前記ポリペプチド免疫原をコードする前記配列の発現が、前記アジュバントをコードする前記配列の発現の少なくとも２倍の高さである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項12】

前記ポリペプチド免疫原をコードする前記配列の発現が、前記アジュバントをコードする前記配列の発現の少なくとも５倍、１０倍、又は１００倍の高さである、請求項１１に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項13】

複数の環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物であって、（ａ）ポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチドと、（ｂ）アジュバントをコードする配列又は自然免疫系刺激剤である配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドとを含む、組成物。

【請求項14】

前記アジュバントがポリペプチドである、請求項１３に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

前記ポリペプチド免疫原及び前記アジュバントが、各々、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている、請求項１３又は１４に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

前記アジュバントが、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項17】

前記サイトカインが炎症誘発性サイトカインである、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項18】

前記炎症誘発性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ－βから選択される、請求項１７に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項19】

前記サイトカインがＴｈ－１誘導サイトカインである、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項20】

前記Ｔｈ－１誘導サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択される、請求項１９に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項21】

前記サイトカインがＴｈ－２誘導サイトカインである、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項22】

前記Ｔｈ－２誘導サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３から選択される、請求項２１に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項23】

前記ケモカインが、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｒａｎｔｅｓ、及びＴＣＡ－３から選択される、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項24】

前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０－Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ２７から選択される、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項25】

前記自然免疫系刺激剤が、ＳＴＩＮＧ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、及びＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１から選択される、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項26】

前記自然免疫系刺激剤が、構成的に活性な突然変異体である、請求項２５に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項27】

前記シグナル伝達分子が、ＳＴＩＮＧ、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＭｙＤ８８、ＩＰＳ１、ＡＳＣ、ＭＡＶＳ、ＭＡＰＫ、ＩＫＫ－α、ＩＫＫ複合体、ＴＢＫ１、Ｂ－カテニン、及びカスパーゼ１から選択される、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項28】

前記転写活性化因子が、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ１、及びＩＲＦ５から選択される、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項29】

前記サイトカイン受容体が、ＩＬ－２βＲ、ＩＦＮ－γＲ、及びＩＬ－６Ｒから選択される、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項30】

前記細菌成分が、フラジェリン及びＭＢＬから選択される、請求項１６に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項31】

前記アジュバントをコードする前記配列が、シグナル配列をさらにコードする、請求項１～３０のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項32】

前記ポリペプチド免疫原をコードする前記配列が、シグナル配列をさらにコードする、請求項１～３１のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項33】

前記ポリペプチド免疫原をコードする前記配列がシグナル配列をコードしない、請求項１～３１のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項34】

前記自然免疫系刺激剤である前記配列が、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーから選択される、請求項１又は１３に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項35】

各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含む環状ポリリボヌクレオチドであって、前記ポリペプチド免疫原の少なくとも２つが少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項36】

少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又は少なくとも９つの配列を含み、各配列が、ポリペプチド免疫原をコードする、請求項３５に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項37】

前記ポリペプチド免疫原のそれぞれをコードする前記配列のそれぞれが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されている、請求項３５又は３６に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項38】

単一のＩＲＥＳを含む、請求項３７に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項39】

前記ポリペプチド免疫原のそれぞれが、単一のＩＲＥＳに作動可能に連結された単一のオープンリーディングフレームによってコードされ、前記オープンリーディングフレームの発現が、前記ポリペプチド免疫原のそれぞれのアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する、請求項３８に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項40】

前記ポリペプチド免疫原がそれぞれ、ポリペプチドリンカーによって分離されている、請求項３９に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項41】

前記ポリペプチド免疫原がそれぞれ、切断ドメインによって分離されている、請求項３９に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項42】

前記切断ドメインが、２Ａ自己切断ペプチドである、請求項４１に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項43】

複数のＩＲＥＳを含む、請求項３７に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項44】

各ＩＲＥＳが、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含むオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、請求項４３に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項45】

前記環状ポリリボヌクレオチドが、アジュバントをコードする少なくとも１つの配列をさらに含む、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項46】

前記アジュバントをコードする前記少なくとも１つの配列がＩＲＥＳに作動可能に連結されている、請求項４５に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項47】

前記アジュバントがポリペプチドである、請求項４５又は４６に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項48】

前記アジュバントが、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である、請求項４７に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項49】

前記環状ポリリボヌクレオチドが、自然免疫系刺激剤である配列をさらに含む、請求項３５～４８のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項50】

自然免疫系刺激剤である前記配列が、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーである、請求項４９に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項51】

（ａ）第１のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチドと、（ｂ）第２のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドとを含む免疫原性組成物であって、前記第１及び第２のポリペプチド免疫原が、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、免疫原性組成物。

【請求項52】

各ポリペプチド免疫原がＩＲＥＳに作動可能に連結されている、請求項５１に記載の免疫原性組成物。

【請求項53】

前記ポリペプチド免疫原の各々が、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３５～５２のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物。

【請求項54】

前記ポリペプチド免疫原の各々が、標的を同定する１つ又は複数のエピトープを含む、請求項３５～５３のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項55】

前記標的が病原体である、請求項５４に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項56】

前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である、請求項５５に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項57】

前記標的が癌細胞である、請求項５４に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項58】

前記標的が毒素又はアレルゲンである、請求項５５に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項59】

請求項１～５８のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項60】

対象において免疫応答を誘発する方法であって、請求項１～５９のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド、免疫原性組成物、又は医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、全体が参照により本明細書に援用される配列表を含む。２０２１年９月２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５１５０９－０４５ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿９．２．２１＿ＳＴ２５と命名され、５２，７８７バイトのサイズである。

【背景技術】

【0002】

ワクチン接種は、ヒト及び動物の両方の健康に多大な貢献をしてきた。１７９６年に最初のワクチンが発明されて以来、ワクチンは、対象において免疫応答を引き起こすことによって多くの感染症を予防する最も成功した方法と見なされるようになった。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によると、免疫付与は現在、すべての年齢層で毎年２００万人から３００万人の死亡を防止している。今日、ワクチンは、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、及びはしかを含む２０を超える感染症の蔓延を予防及び制御するために開発され、天然痘の完全な根絶につながった。新規且つ改良された免疫原性組成物及びその使用を開発する必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本開示は、１つ又は複数の免疫原をコードするポリリボヌクレオチド（例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチド）の組成物、医薬調製物、及び使用を提供する。特に、本開示は、複数の免疫原をコードする環状ポリリボヌクレオチド、少なくとも１つの免疫原をコードしさらに少なくとも１つのアジュバントをコードする環状ポリリボヌクレオチド、及び複数の環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物を提供する。本開示はさらに、１つ又は複数のポリペプチド免疫原をコードする環状ポリリボヌクレオチドを使用する方法に関する。本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドの組成物及び医薬調製物は、投与時に対象における免疫応答を誘発し得る。本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドの組成物及び医薬調製物は、対象の疾患、障害、又は症状を処置又は予防するために使用することができる。

【0004】

一態様では、本明細書には、各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含む環状ポリリボヌクレオチドが提供され、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、及び少なくとも９つ）は、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのポリペプチド免疫原は、少なくとも９５％（例えば、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのポリペプチド免疫原は、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原の各々は、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原の各々は、少なくとも９５％（例えば、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原の各々は、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する。

【0005】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原の各々は、標的を同定する１つ又は複数のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、標的は病原体である。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である。いくつかの実施形態では、病原体はウイルスであり、各ポリペプチド免疫原は、ウイルス免疫原に対応する１つ又は複数のエピトープ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、病原体は細菌であり、各ポリペプチド免疫原は、細菌免疫原に対応する１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、標的は癌細胞である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原は、腫瘍抗原に対応する１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０又はそれ以上）のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、標的は毒素又はアレルゲンである。いくつかの実施形態では、標的は、疾患、障害、又は症状に関連している。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状はウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状は細菌感染症である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状は癌である。

【0006】

別の態様では、本開示は、各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを提供し、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又は少なくとも９つ）は異なるタンパク質を同定し、それらの異なるタンパク質の各々は、同じ標的を同定する。

【0007】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原のそれぞれが、異なるタンパク質を同定する。いくつかの実施形態では、標的は病原体である。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルスであり、異なるタンパク質のそれぞれは、ウイルスに関連するウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、病原体は細菌であり、異なるタンパク質のそれぞれは、細菌に関連する細菌タンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は癌細胞である。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質のそれぞれは、癌細胞に関連する異なる腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、標的は、アレルゲン又は毒素である。

【0008】

別の態様では、本開示は、複数の配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを提供し、各配列は、ポリペプチド免疫原をコードし、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又は少なくとも９つ）が異なる標的を同定する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原のそれぞれは、異なる標的を同定する。いくつかの実施形態では、各標的は、異なる病原体である。いくつかの実施形態では、各標的は、独立して、癌細胞、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である。いくつかの実施形態では、各標的は、異なるウイルスである。いくつかの実施形態では、各標的は、異なる細菌である。いくつかの実施形態では、標的には、ウイルス及び細菌が含まれる。

【0009】

本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドのいずれか１つのいくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５００～２０，０００個（例えば、５００～１０，０００個、５００～９，０００個、５００～８，０００個、５００～５，０００個、５００～４，０００個、５００～３，０００個、１，０００～１０，０００個、１，０００～８，０００個、１，０００～５，０００個、３，０００～８，０００個、４，０００～９，０００個、又は１０，０００～２０，０００個）のリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５００～５，０００個を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１，０００～５，０００個のリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５，０００～１０，０００個のリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも５００個のリボヌクレオチド（例えば、少なくとも６００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、少なくとも２５００個、少なくとも３０００個、少なくとも３５００個、少なくとも４０００個、少なくとも４５００個、少なくとも５０００個、少なくとも５５００個、少なくとも６０００個、少なくとも６５００個、少なくとも７０００個、少なくとも７５００個、少なくとも８０００個、少なくとも８５００個、少なくとも９０００個、又は少なくとも９５００個のリボヌクレオチド）を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又は少なくとも９つの配列を含み、各配列は、ポリペプチド免疫原をコードする。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ又は３つ、２～５（例えば、２、３、又は４）、又は５～１０の配列（例えば、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つの配列）を含み、それぞれの配列が、ポリペプチド免疫原をコードする。

【0011】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原をコードする少なくとも１つの配列は、シグナル配列をさらにコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原をコードする各配列は、シグナル配列をさらにコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原のそれぞれをコードする配列のそれぞれは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、単一のＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原のそれぞれは、単一のＩＲＥＳに作動可能に連結された単一のオープンリーディングフレームによってコードされ、オープンリーディングフレームの発現は、各ポリペプチド免疫原のアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する。

【0012】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原はそれぞれ、ポリペプチドリンカーによって分離されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原はそれぞれ、切断ドメインによって分離されている。いくつかの実施形態では、各スタガー要素（ｓｔａｇｇｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）は、２Ａ自己切断ペプチドである。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、複数のＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、各ＩＲＥＳは、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含むオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている。

【0013】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、アジュバントをコードする少なくとも１つの配列（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも、８、少なくとも９、及び少なくとも１０の配列）をさらに含む。いくつかの実施形態では、アジュバントをコードする少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも、８、少なくとも９、及び少なくとも１０の配列）の配列は、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。

【0014】

別の態様では、本開示は、ポリペプチド免疫原をコードする配列と、アジュバントをコードする配列又は自然免疫系刺激剤である配列とを含む環状ポリリボヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原をコードする配列は、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、アジュバントをコードする配列は、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原及びアジュバントポリペプチドは、単一のＩＲＥＳに作動可能に連結された単一のオープンリーディングフレームによってコードされ、オープンリーディングフレームが発現すると、ポリペプチド免疫原及びアジュバントポリペプチドの各々のアミノ酸配列を含むポリペプチドが生成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原とアジュバントポリペプチドとは、各々、ポリペプチドリンカーによって分離されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原とアジュバントポリペプチドとは、各々、切断ドメインによって分離されている。いくつかの実施形態では、各スタガー要素は、２Ａ自己切断ペプチドである。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、複数のＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、第１のＩＲＥＳは、ポリペプチド免疫原をコードする配列に作動可能に連結され、第２のＩＲＥＳは、アジュバントポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されている。

【0015】

環状ポリリボヌクレオチドが少なくとも１つのポリペプチド免疫原及び少なくとも１つのアジュバント（例えば、ポリペプチドアジュバント）をコードするいくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原をコードする配列の発現は、アジュバントをコードする配列の発現の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原をコードする配列の発現は、アジュバントをコードする配列の発現と実質的に同じである。

【0016】

別の態様において、本開示は、複数の環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物であって、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチドと、アジュバントをコードする配列又は自然免疫系刺激剤である配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原及びアジュバントは、各々、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。

【0017】

いくつかの実施形態では、アジュバントはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である。いくつかの実施形態では、サイトカインは炎症誘発性サイトカインである。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ－βから選択される。いくつかの実施形態では、サイトカインはＴｈ－１誘導サイトカインである。いくつかの実施形態では、Ｔｈ－１誘導サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択される。いくつかの実施形態では、サイトカインはＴｈ－２誘導サイトカインである。いくつかの実施形態では、Ｔｈ－２誘導サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３から選択される。いくつかの実施形態では、ケモカインは、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｒａｎｔｅｓ、及びＴＣＡ－３から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０－Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ２７から選択される。いくつかの実施形態では、自然免疫系刺激剤は、ＳＴＩＮＧ（例えば、ＳＴＩＮＧ^{Ｖ１５５Ｍ}、ＳＴＩＮＧ^{Ｒ２８４Ｍ}、ＳＴＩＮＧ^{Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍ}、又はＳＴＩＮＧ^{Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍ}など、構成的に活性なＳＴＩＮＧ）、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、及びＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１から選択される。いくつかの実施形態では、自然免疫系刺激剤は、構成的に活性な突然変異体である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子は、ＳＴＩＮＧ（例えば、ＳＴＩＮＧ^{Ｖ１５５Ｍ}、ＳＴＩＮＧ^{Ｒ２８４Ｍ}、ＳＴＩＮＧ^{Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍ}、又はＳＴＩＮＧ^{Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍ}など、構成的に活性なＳＴＩＮＧ）、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＭｙＤ８８、ＩＰＳ１、ＡＳＣ、ＭＡＶＳ、ＭＡＰＫ、ＩＫＫ－α、ＩＫＫ複合体、ＴＢＫ１、Ｂ－カテニン、及びカスパーゼ１から選択される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ１、及びＩＲＦ５から選択される。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ＩＬ－２βＲ、ＩＦＮ－γＲ、及びＩＬ－６Ｒから選択される。いくつかの実施形態では、細菌成分は、フラジェリン及びＭＢＬから選択される。

【0018】

本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドのうちのいずれか１つのいくつかの実施形態では、アジュバントをコードする少なくとも１つの配列は、シグナル配列をさらにコードする。いくつかの実施形態では、免疫原をコードする各配列は、シグナル配列をさらにコードする。いくつかの実施形態では、免疫原をコードする少なくとも１つの配列は、シグナル配列をコードしない。いくつかの実施形態では、免疫原をコードする配列はいずれも、シグナル配列をさらにコードしない。

【0019】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、自然免疫系刺激剤である配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、自然免疫系刺激剤である配列は、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーである。

【0020】

本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドのいずれか１つのいくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’末端及び３’末端を有する第１のポリリボヌクレオチドを含み、５’末端及び３’末端はそれぞれ、第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより、第１のポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端を連結して環状ポリリボヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、スプリントライゲーションによって生成される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、３’末端及び５’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドを提供することによって生成され、３’末端及び５’末端それぞれが、イントロンの一部を含み、３’末端のイントロン部分及び５’末端のイントロン部分が、スプライシング反応を触媒し、それによって５’末端及び３’末端を共有結合させて環状ポリリボヌクレオチドを生成する。いくつかの実施形態では、イントロンは、Ｇｒｏｕｐ Ｉ自己スプライシングイントロンである。

【0021】

別の態様では、本開示は、それぞれがポリペプチド免疫原をコードする配列を含む、複数の環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、複数の環状ポリリボヌクレオチドのそれぞれは、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、組成物は、第１のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチドと、第２のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドとを含み、第１及び第２のポリペプチド免疫原は、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチド免疫原は、少なくとも９５％（少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチド免疫原は、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原のそれぞれは、標的を同定する１つ又は複数のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第１のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチド、及び第２のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第１及び第２のポリペプチド免疫原は異なるタンパク質を同定し、各異なるタンパク質は同じ標的を同定する。いくつかの実施形態では、組成物は、第１のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチド、及び第２のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第１のポリペプチド免疫原は第１の標的を同定し、第２のポリペプチド免疫原は第２の標的を同定する。いくつかの実施形態では、各標的は、独立して、癌細胞、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、毒素、又はアレルゲンである。いくつかの実施形態では、標的は病原体である。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である。いくつかの実施形態では、標的は、癌細胞、アレルゲン、又は毒素である。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド免疫原は、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。

【0022】

別の態様では、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの医薬調製物を提供し、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含み、及び環状ポリリボヌクレオチドは、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも２５％（ｗ／ｗ）（例えば、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、７５％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ））を占める。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、７５％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）を占める。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の７５％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、又は１％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）以下（例えば、０．４％（ｗ／ｗ）、０．３％（ｗ／ｗ）、０．２％（ｗ／ｗ）、０．１（ｗ／ｗ）、及び０．０５％（ｗ／ｗ）の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の線状ポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、３０％～４０％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド及び１％～１０％（ｗ／ｗ）、１０％～２０％（ｗ／ｗ）、２０％～３０％（ｗ／ｗ）、３０％～４０％（ｗ／ｗ）、４０％～５０％（ｗ／ｗ）、５０％～６０％（ｗ／ｗ）、又は６０％～７０％（ｗ／ｗ）の線状ポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、４０％～６０％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド及び１％～１０％（ｗ／ｗ）、１０％～２０％（ｗ／ｗ）、２０％～３０％（ｗ／ｗ）、３０％～４０％（ｗ／ｗ）、４０％～５０％（ｗ／ｗ）、５０％～６０％（ｗ／ｗ）の線状ポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、６０％～８０％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド及び１％～１０％（ｗ／ｗ）、１０％～２０％（ｗ／ｗ）、２０％～３０％（ｗ／ｗ）、３０％～４０％（ｗ／ｗ）の線状ポリリボヌクレオチドを含む。

【0023】

別の態様では、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの医薬調製物を提供し、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含み、及び医薬調製物は、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の７５％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、又は１％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の２０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、調製物は、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の１５％（ｗ／ｗ）以下（例えば、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、及び０．５％（ｗ／ｗ））のニックポリリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、調製物は、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む。

【0025】

別の態様では、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの医薬調製物を提供し、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含み、及び医薬調製物は、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の１５％（ｗ／ｗ）以下（例えば、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、及び０．５％（ｗ／ｗ））のニックポリリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、調製物は、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む。

【0026】

本明細書に記載される医薬調製物のうちのいずれか１つのいくつかの実施形態において、医薬調製物は、リムルス試験法によって測定したとき１０ＥＵ／ｋｇ未満（例えば、９ＥＵ／ｋｇ、８ＥＵ／ｋｇ、７ＥＵ／ｋｇ、６ＥＵ／ｋｇ、５ＥＵ／ｋｇ、４ＥＵ／ｋｇ、３ＥＵ／ＫＧ、２ＥＵ／ｋｇ、及び１ＥＵ／ｋｇ）のエンドトキシンを含むか、又はそれを欠いている。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、滅菌前に１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は無菌医薬調製物であり、例えば、無菌条件下で試験したとき１００より少ない生存微生物の増殖を支持する。いくつかの実施形態では、医薬調製物はＵＳＰ＜７１＞の規格に適合している。いくつかの実施形態では、医薬調製物はＵＳＰ＜８５＞の規格に適合している。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、最終薬物製品の中間医薬調製物である。

【0027】

いくつかの実施形態では、医薬調製物は、対象に投与される最終薬物製品である。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、又は５００ｍｇ／ｍＬの濃度の環状ポリリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のデオキシリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、１ミリグラム（ｍｇ）の環状ポリリボヌクレオチド分子当たり０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満の夾雑タンパク質の夾雑タンパク質（例えば酵素）を含む。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、分光光度計によって測定したとき約１．６～２．３（例えば、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、及び２．２）のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、医薬調製物は、細胞タンパク質、細胞デオキシリボ核酸、酵素、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフィー材料から選択されるプロセス関連不純物を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、免疫又は炎症反応の１つ又は複数のマーカーについて精製前と比較して精製後に低下したレベルを有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドである。

【0029】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供するステップ；線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化するステップであって、それにより環状ポリリボヌクレオチド分子の調製物を提供するステップ；及び調製物から線状ポリリボヌクレオチド分子を除去するため調製物を処理するステップを含む方法により生成される。いくつかの実施形態では、本方法は、処理ステップの後に残る調製物中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、調製物をさらに処理するステップをさらに含み、ここでさらに処理するステップは、調製物からニックポリリボヌクレオチド分子を除去するため調製物を処理するステップ；及び／又は調製物からデオキシリボヌクレオチド分子を除去するため調製物を処理するステップ；及び／又は調製物から夾雑タンパク質を除去するため調製物を処理するステップ；及び／又は調製物からエンドトキシンを除去するため調製物を処理するステップを含む。

【0030】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド、組成物、又は医薬調製物のいずれか１つ、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド、組成物、又は医薬調製物のいずれか１つ、及びプロタミン又はプロタミン塩（例えば、硫酸プロタミン）を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、無機アジュバント、小分子アジュバント、及び水中油型エマルジョン、脂質又はポリマー、ペプチド又はペプチドグリカン、炭水化物又は多糖、サポニン、ＲＮＡベースのアジュバント、ＤＮＡベースのアジュバント、ウイルス粒子、細菌アジュバント、ハイブリッド分子、真菌又は卵母細胞微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）、無機ナノ粒子、又は多成分アジュバントである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、無機アジュバントである。いくつかの実施形態では、無機アジュバントは、アルミニウム塩又はカルシウム塩である。いくつかの実施形態では、アジュバントは小分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、イミキモド、レシキモド、又はガルジキモドである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、水中油型エマルジョンである。いくつかの実施形態では、水中油型エマルジョンは、スクアレン、ＭＦ５９、ＡＳ０３、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ製剤、任意選択によりＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０、又は水中油型エマルジョンの不完全フロイントアジュバントである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、脂質又はポリマーである。いくつかの実施形態では、脂質又はポリマーは、ポリマーナノ粒子、任意選択によりＰＬＧＡ、ＰＬＧ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、又はＰＨＢ、リポソーム、任意選択によりビロソーム又はＣＡＦ０１、脂質ナノ粒子又はその成分、リポ多糖（ＬＰＳ）、任意選択によりモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）又はグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）、リポペプチド、任意選択によりＰａｍ２（Ｐａｍ２ＣＳＫ４）又はＰａｍ３（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、又は糖脂質、任意選択によりトレハロースジミコレートである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ペプチド又はペプチドグリカンである。いくつかの実施形態では、ペプチド又はペプチドグリカンは、合成又は精製されたグラム陰性菌又はグラム陽性菌、任意選択によりＮ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＭＤＰ）、フラジェリン融合タンパク質、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、サイトカイン、又はケモカインのすべて又は一部に一致する。いくつかの実施形態では、アジュバントは、炭水化物又は多糖である。いくつかの実施形態では、炭水化物又は多糖は、デキストラン（分枝微生物多糖）、硫酸デキストラン、レンチナン、ザイモサン、βグルカン、Ｄｅｌｔｉｎ、マンナン、又はキチンである。いくつかの実施形態では、アジュバントはサポニンである。いくつかの実施形態では、サポニンは、１つ又は複数の糖側鎖に結合したグリコシド又は多環式アグリコン、任意選択によりＩＳＣＯＭＳ、ＩＳＣＯＭＳマトリックス、又はＱＳ－２１である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＲＮＡベースのアジュバントである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡベースのアジュバントは、ポリＩＣ、ポリＩＣ：ＬＣ、ヘアピンＲＮＡ、任意選択により５’ＰＰＰ含有配列、ウイルス配列、ポリＵ含有配列、ｄｓＲＮＡ、天然又は合成の免疫刺激性ＲＮＡ配列、核酸類似体、任意選択により環状ＧＭＰ－ＡＭＰ又は環状ジＧＭＰなどの環状ジヌクレオチド、又は免疫刺激塩基類似体、任意選択によりＣ８置換又はＮ７，Ｃ８二置換グアニンリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＤＮＡベースのアジュバントである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベースのアジュバントは、ＣｐＧ、ｄｓＤＮＡ、又は天然若しくは合成の免疫刺激性ＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、ウイロソーム、任意選択によりリン脂質細胞膜二重層である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、細菌アジュバントである。いくつかの実施形態では、細菌アジュバントは、フラジェリン、ＬＰＳ、又は細菌毒素、任意選択によりエンテロトキシン、易熱性毒素、又はコレラ毒素である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ハイブリッド分子である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、イミキモドにコンジュゲートしたＣｐＧである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、真菌又は卵母細胞微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）である。いくつかの実施形態では、真菌又は卵母細胞ＭＡＭＰは、キチン又はβグルカンである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、無機ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、無機ナノ粒子は、金ナノロッド、シリカベースのナノ粒子、任意選択によりメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、多成分アジュバントである。いくつかの実施形態では、多成分アジュバントは、ＡＳ０１、ＡＳ０３、ＡＳ０４、完全フロイントアジュバント、又はＣＡＦ０１である。

【0031】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド、組成物、又は医薬調製物のいずれか１つと、アルコールとを含む混合物を含む医薬組成物を提供し、アルコールは、混合物の約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ（例えば、０．５％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖ、３５％ｖ／ｖ、４０％ｖ／ｖ、４５％ｖ／ｖ、５０％ｖ／ｖ、５５％ｖ／ｖ、６０％ｖ／ｖ、６５％ｖ／ｖ、及び７０％ｖ／ｖ）を占める。

【0032】

別の態様では、本開示は、ポリペプチド免疫原をコードする少なくとも１つの配列を含む線状ポリリボヌクレオチドと、アルコールとを含む混合物を含む医薬組成物を提供し、アルコールは、混合物の約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ（例えば、０．５％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖ、３５％ｖ／ｖ、４０％ｖ／ｖ、４５％ｖ／ｖ、５０％ｖ／ｖ、５５％ｖ／ｖ、６０％ｖ／ｖ、６５％ｖ／ｖ、及び７０％ｖ／ｖ）を占める。

【0033】

いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含み、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、及び少なくとも９つ）は、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのポリペプチド免疫原は、少なくとも９５％（例えば、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのポリペプチド免疫原は、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原の各々は、標的を同定する１つ又は複数のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、標的は病原体である。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である。いくつかの実施形態では、病原体はウイルスであり、各ポリペプチド免疫原は、ウイルス免疫原に対応する１つ又は複数のエピトープ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、病原体は細菌であり、各ポリペプチド免疫原は、細菌免疫原に対応する１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、標的は癌細胞である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原は、腫瘍抗原に対応する１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、標的は毒素又はアレルゲンである。いくつかの実施形態では、標的は、疾患、障害、又は症状に関連している。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状はウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状は細菌感染症である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状は癌である。

【0034】

いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含み、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、及び少なくとも９つ）は異なるタンパク質を同定し、異なるタンパク質の各々は同じ標的を同定する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原の各々は、異なるタンパク質を同定する。いくつかの実施形態では、標的は病原体である。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である。いくつかの実施形態では、病原体はウイルスであり、異なるタンパク質の各々は、ウイルスに関連するウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、病原体は細菌であり、異なるタンパク質の各々は、細菌に関連する細菌タンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は癌細胞である。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質の各々は、癌細胞に関連する異なる腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、標的はアレルゲン又は毒素である。

【0035】

いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含み、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、及び少なくとも９つ）は、異なる標的を同定する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原の各々は、異なる標的を同定する。いくつかの実施形態では、各標的は、異なる病原体である。いくつかの実施形態では、各標的は、独立に、癌細胞、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である。いくつかの実施形態では、各標的は、異なるウイルスである。いくつかの実施形態では、各標的は、異なる細菌である。いくつかの実施形態では、標的は、ウイルス及び細菌を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、各配列がポリペプチド免疫原をコードする少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、又は少なくとも９の配列を含む。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、各配列がポリペプチド免疫原をコードする２～３、２～５（例えば、３及び４）、又は５～１０の配列（例えば、６、７、８、及び９の配列）を含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、アジュバントをコードする少なくとも１つの配列（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも、８、少なくとも９、又は少なくとも１０の配列）をさらに含む。いくつかの実施形態では、アジュバントをコードする少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも、８、少なくとも９、又は少なくとも１０の配列）の配列は、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。

【0038】

いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチド免疫原をコードする配列と、アジュバントをコードする配列又は自然免疫系刺激剤である配列とを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原をコードする配列は、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、アジュバントをコードする配列は、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、アジュバントはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である。いくつかの実施形態では、サイトカインは炎症誘発性サイトカインである。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ－βから選択される。いくつかの実施形態では、サイトカインはＴｈ－１誘導サイトカインである。いくつかの実施形態では、Ｔｈ－１誘導サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択される。いくつかの実施形態では、サイトカインはＴｈ－２誘導サイトカインである。いくつかの実施形態では、Ｔｈ－２誘導サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３から選択される。いくつかの実施形態では、ケモカインは、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｒａｎｔｅｓ、及びＴＣＡ－３から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０－Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ２７から選択される。いくつかの実施形態では、自然免疫系刺激剤は、ＳＴＩＮＧ（例えば、ＳＴＩＮＧ^{Ｖ１５５Ｍ}、ＳＴＩＮＧ^{Ｒ２８４Ｍ}、ＳＴＩＮＧ^{Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍ}、又はＳＴＩＮＧ^{Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍ}など、構成的に活性なＳＴＩＮＧ（ｃａＳＴＩＮＧ））、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、及びＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１から選択される。いくつかの実施形態では、自然免疫系刺激剤は、構成的に活性な突然変異体である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子は、ＳＴＩＮＧ（例えば、ＳＴＩＮＧ^{Ｖ１５５Ｍ}、ＳＴＩＮＧ^{Ｒ２８４Ｍ}、ＳＴＩＮＧ^{Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍ}、又はＳＴＩＮＧ^{Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍ}など、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＭｙＤ８８、ＩＰＳ１、ＡＳＣ、ＭＡＶＳ、ＭＡＰＫ、ＩＫＫ－α、ＩＫＫ複合体、ＴＢＫ１、Ｂ－カテニン、及びカスパーゼ１から選択される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ１、及びＩＲＦ５から選択される。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ＩＬ－２βＲ、ＩＦＮ－γＲ、及びＩＬ－６Ｒから選択される。いくつかの実施形態では、細菌成分は、フラジェリン及びＭＢＬから選択される。

【0039】

いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、自然免疫系刺激剤である配列を含む。いくつかの実施形態では、自然免疫系刺激剤である配列は、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーである。

【0040】

いくつかの実施形態では、アルコールは、混合物の約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ（例えば、０．５％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖ、３５％ｖ／ｖ、４０％ｖ／ｖ、４５％ｖ／ｖ、５０％ｖ／ｖ、及び５５％ｖ／ｖ）、約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ（例えば、０．５％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖ、３５％ｖ／ｖ、４０％ｖ／ｖ、及び４５％ｖ／ｖ）、約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ（例えば、０．５％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖ、及び３５％ｖ／ｖ）、約０．３％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ（例えば、０．５％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、及び１５％ｖ／ｖ）、約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ（例えば、０．５％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、及び１０％ｖ／ｖ）、約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ（例えば、０．５％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、２％ｖ／ｖ、３％ｖ／ｖ、及び４％ｖ／ｖ）、約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ（例えば、０．４％ｖ／ｖ、０．５％ｖ／ｖ、０．６％ｖ／ｖ、０．７％ｖ／ｖ、０．８％ｖ／ｖ、及び０．９％ｖ／ｖ）又は約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、アルコールは、混合物の約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。

【0041】

いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール、トリエタノールアミン、フェネチルアルコール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特殊変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースから選択される。いくつかの実施形態では、アルコールはエタノールである。

【0042】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液体、ゲル、ローション、ペースト、クリーム、泡、又はスティックである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約６～８の（例えば、約６．５～７．５の、又は約７の）ｐＨを有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、水とほぼ同じ粘度を有する。

【0043】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、疎水基又は親油基を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、炭化水素を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、カチオン性リポソームを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、脂肪酸、脂質、リポソーム、コレステロール、又はこれらの任意の組み合わせを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、アジュバントをさらに含む組成物。いくつかの実施形態では、アジュバントは、無機アジュバント、小分子アジュバント、及び水中油型エマルション、脂質又はポリマー、ペプチド又はペプチドグリカン、炭水化物又は多糖、サポニン、ＲＮＡベースのアジュバント、ＤＮＡベースのアジュバント、ウイルス粒子、細菌アジュバント、ハイブリッド分子、真菌又は卵母細胞微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）、無機ナノ粒子、又は多成分アジュバントである。いくつかの実施形態では、組成物は細胞透過剤をさらに含む。

【0044】

別の態様では、本開示は、ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド、本明細書に記載される免疫原性組成物、本明細書に記載される医薬調製物を対象の表面積に局所的に適用することを含む方法を提供する。

【0045】

別の態様では、本開示は、ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、（ａ）対象の表面積に滅菌剤を適用すること；及び（ｂ）本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド、本明細書に記載される免疫原性組成物、本明細書に記載される医薬調製物、又は本明細書に記載される医薬組成物と希釈剤とを含む組成物を対象の表面積に適用することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、（ｂ）の組成物は担体を含まない。いくつかの実施形態では、滅菌剤は、アルコール、紫外光、レーザー光、又は熱である。

【0046】

別の態様では、本開示は、ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、（ａ）対象の表面積にアルコールを適用すること；及び（ｂ）本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド、本明細書に記載される免疫原性組成物、本明細書に記載される医薬調製物、又は本明細書に記載される医薬組成物と希釈剤とを含む組成物を対象の表面積に適用することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール、トリエタノールアミン、フェネチルアルコール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特殊変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルコールはエタノールである。

【0047】

いくつかの実施形態では（例えば、本明細書に記載される局所送達のいくつかの実施形態では）、対象の表面積は、皮膚、口腔、鼻腔、胃腸管、気道、又はこれらの任意の組み合わせの表面積から選択される。

【0048】

別の態様では、本開示は、対象の疾患、障害、又は症状を処置又は予防する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド、組成物、医薬調製物、又は医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状は、ウイルス感染、細菌感染、又は真菌感染である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状は癌である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状は、アレルゲンへの曝露に関連している。いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は症状は、毒素への曝露に関連している。

【0049】

別の態様では、本開示は、対象において免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド、組成物、医薬調製物、又は医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、方法は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ウマ、又はネコである。いくつかの実施形態では、対象はトリである。いくつかの実施形態では、トリは、雌鶏、雄鶏、七面鳥、又はオウムである。いくつかの実施形態では、方法は、アジュバントを対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド、又はその調製物若しくは組成物とは別個の分子実体である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、無機アジュバント、小分子アジュバント、及び水中油型エマルジョン、脂質又はポリマー、ペプチド又はペプチドグリカン、炭水化物又は多糖、サポニン、ＲＮＡベースのアジュバント、ＤＮＡベースのアジュバント、ウイルス粒子、細菌アジュバント、ハイブリッド分子、真菌又は卵母細胞微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）、無機ナノ粒子、又は多成分アジュバントである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ポリペプチドアジュバントである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドアジュバントは、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、自然免疫系刺激剤である。いくつかの実施形態では、自然免疫系刺激剤は、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーを含むＲＮＡから選択される。

【0050】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド、組成物、医薬調製物、又は医薬組成物のいずれか１つが、単回用量として対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド、組成物、医薬調製物、又は医薬組成物のいずれか１つが、２回以上、３回以上、４回以上、又は５回以上対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド、組成物、医薬調製物、又は医薬組成物のいずれか１つの投与は、約１週間ごと、約２週間ごと、約３週間ごと、約１ヶ月ごと、約２ヶ月ごと、約３ヶ月ごと、約４ヶ月ごと、約５ヶ月ごと、約６ヶ月ごと、約１年ごと、約２年ごと、約３年ごと、約４年ごと、約５年ごと、又は約１０年ごとに行われる。

【0051】

いくつかの実施形態では、方法は、対象にポリペプチド免疫原（例えば、ポリペプチド免疫原を含むタンパク質サブユニット）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドの配列によってコードされるポリペプチド免疫原に一致する（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を共有する）。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原は、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド、免疫原性組成物、医薬調製物、又は医薬組成物のいずれか１つを投与した後に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原は、対象におけるポリペプチド免疫原に対する免疫応答を維持又は増強する。

【0052】

別の態様では、本開示は、対象における免疫応答を維持又は増強する方法を提供し、この方法は、（ｉ）ポリペプチド免疫原をコードする環状ポリリボヌクレオチドを対象に投与するステップ、及び（ｉｉ）ポリペプチド免疫原を対象に投与するステップを含み、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）の後、１週間～６ヶ月間（例えば、１ヶ月～５ヶ月間、２ヶ月～３ヶ月間、２週間～３ヶ月間、又は３ヶ月～６ヶ月間）行われ、ポリペプチド免疫原の投与は、ステップ（ｉｉ）のポリペプチド免疫原の投与が、対象におけるポリペプチド免疫原に対する免疫応答を維持又は増強する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原は、標的を同定する１つ又は複数のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、標的は病原体である。いくつかの実施形態では、標的は、癌細胞、アレルゲン、又は毒素である。

【0053】

付番された実施形態：
［１］各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含む環状ポリリボヌクレオチドであって、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つが少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、環状ポリリボヌクレオチド。
［２］少なくとも２つのポリペプチド免疫原が、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、項［１］の環状ポリリボヌクレオチド。
［３］少なくとも２つのポリペプチド免疫原が、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する、項［１］又は［２］の環状ポリリボヌクレオチド。
［４］ポリペプチド免疫原の各々が、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、項［１］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５］ポリペプチド免疫原の各々が、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、項［４］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６］ポリペプチド免疫原の各々が、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する、項［４］又は［５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［７］ポリペプチド免疫原の各々が、標的を同定する１つ又は複数のエピトープを含む、項［１］～［６］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［８］標的が病原体である、項［７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９］病原体が、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である、項［８］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０］病原体がウイルスであり、各ポリペプチド免疫原が、ウイルス免疫原に対応する１つ又は複数のエピトープを含む、項［９］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１１］病原体が細菌であり、各ポリペプチド免疫原が、細菌免疫原に対応する１つ又は複数のエピトープを含む、項［９］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１２］標的が癌細胞である、項［７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１３］各ポリペプチド免疫原が、腫瘍抗原に対応する１つ又は複数のエピトープを含む、項［１２］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１４］標的が毒素又はアレルゲンである、項［７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１５］標的が、疾患、障害、又は症状に関連している、項［７］～［１４］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［１６］疾患、障害、又は症状がウイルス感染症である、項［１５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１７］疾患、障害、又は症状が細菌感染症である、項［１５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１８］疾患、障害、又は症状が癌である、項［１５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１９］複数の配列を含む環状ポリリボヌクレオチドであって、各配列が、ポリペプチド免疫原をコードし、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つが異なるタンパク質を同定し、異なるタンパク質のそれぞれが、同じ標的を同定する、環状ポリリボヌクレオチド。
［２０］ポリペプチド免疫原のそれぞれが、異なるタンパク質を同定する、項［１９］の環状ポリリボヌクレオチド。
［２１］標的が、病原体である、項［１９］又は［２０］の環状ポリリボヌクレオチド。
［２２］病原体が、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である、項［２１］の環状ポリリボヌクレオチド。
［２３］病原体が、ウイルスであり、異なるタンパク質のそれぞれが、ウイルスに関連するウイルスタンパク質である、項［２２］の環状ポリリボヌクレオチド。
［２４］病原体が、細菌であり、異なるタンパク質のそれぞれが、細菌に関連する細菌タンパク質である、項［２２］の環状ポリリボヌクレオチド。
［２５］標的が、癌細胞である、項［１９］又は［２０］の環状ポリリボヌクレオチド。
［２６］異なるタンパク質のそれぞれが、癌細胞に関連する異なる腫瘍抗原である、項［２５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［２７］標的が、アレルゲン又は毒素である、項［１９］又は［２０］の環状ポリリボヌクレオチド。
［２８］各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含む環状ポリリボヌクレオチドであって、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つが異なる標的を同定する、環状ポリリボヌクレオチド。
［２９］ポリペプチド免疫原の各々が異なる標的を同定する、項［２８］の環状ポリリボヌクレオチド。
［３０］各標的が異なる病原体である、項［２８］又は［２９］の環状ポリリボヌクレオチド。
［３１］各標的が、独立に、癌細胞、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である、項［３０］の環状ポリリボヌクレオチド。
［３２］各標的が異なるウイルスである、項［３１］の環状ポリリボヌクレオチド。
［３３］各標的が異なる細菌である、項［３１］の環状ポリリボヌクレオチド。
［３４］標的がウイルス及び細菌を含む、項［３１］の環状ポリリボヌクレオチド。
［３５］５００～２０，０００個のリボヌクレオチドを含む、項［１］～［３４］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［３６］５００～１０，０００個のリボヌクレオチドを含む、項［３５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［３７］５００～５，０００個のリボヌクレオチドを含む、項［３６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［３８］少なくとも５００個のリボヌクレオチドを含む、項［１］～［３４］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［３９］少なくとも１，０００個のリボヌクレオチドを含む、項［３８］の環状ポリリボヌクレオチド。
［４０］少なくとも５，０００個のリボヌクレオチドを含む、項［３９］の環状ポリリボヌクレオチド。
［４１］少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又は少なくとも９つの配列を含み、各配列が、免疫原性ポリペプチドをコードする、項［１］～［４０］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［４２］２～３、２～５、又は５～１０の配列を含み、各配列が、ポリペプチド免疫原をコードする、項［１］～［４０］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［４３］ポリペプチド免疫原をコードする少なくとも１つの配列がシグナル配列をさらにコードする、項［１］～［４０］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［４４］ポリペプチド免疫原をコードする各配列が、シグナル配列をさらにコードする、項［１］～［４０］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［４５］ポリペプチド免疫原のそれぞれをコードする配列のそれぞれが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されている、項［１］～［４４］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［４６］単一のＩＲＥＳを含む、項［４５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［４７］ポリペプチド免疫原のそれぞれが、単一のＩＲＥＳに作動可能に連結された単一のオープンリーディングフレームによってコードされ、オープンリーディングフレームの発現が、各ポリペプチド免疫原のアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する、項［４６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［４８］ポリペプチド免疫原がそれぞれ、ポリペプチドリンカーによって分離されている、項［４７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［４９］ポリペプチド免疫原がそれぞれ、切断ドメインによって分離されている、項［４７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５０］各スタガー要素が、２Ａ自己切断ペプチドである、項［４９］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５１］複数のＩＲＥＳを含む、項［４５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５２］各ＩＲＥＳが、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含むオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、項［５１］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５３］アジュバントをコードする少なくとも１つの配列をさらに含む、項［１］～［５２］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［５４］アジュバントをコードする少なくとも１つの配列が、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている、項［５３］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５５］アジュバントがポリペプチドである、項［５３］又は［５４］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５６］アジュバントが、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である、項［５５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５７］サイトカインが炎症誘発性サイトカインである、項［５６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５８］炎症誘発性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ－βから選択される、項［５７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［５９］サイトカインがＴｈ－１誘導サイトカインである、項［５７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６０］Ｔｈ－１誘導サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択される、項［５９］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６１］サイトカインがＴｈ－２誘導サイトカインである、項［５６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６２］Ｔｈ－２誘導サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３から選択される、項［６１］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６３］ケモカインが、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｒａｎｔｅｓ、及びＴＣＡ－３から選択される、項［５６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６４］共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０－Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ２７から選択される、項［５６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６５］自然免疫系刺激剤が、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、及びＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１から選択される、項［５６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６６］自然免疫系刺激剤が、構成的に活性な突然変異体である、項［６５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６７］シグナル伝達分子が、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＭｙＤ８８、ＩＰＳ１、ＡＳＣ、ＭＡＶＳ、ＭＡＰＫ、ＩＫＫ－α、ＩＫＫ複合体、ＴＢＫ１、Ｂ－カテニン、及びカスパーゼ１から選択される、項［５６７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６８］転写活性化因子が、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ１、及びＩＲＦ５から選択される、項［５６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［６９］サイトカイン受容体が、ＩＬ－２βＲ、ＩＦＮ－γＲ、及びＩＬ－６Ｒから選択される、項［５６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［７０］細菌成分が、フラジェリン及びＭＢＬから選択される、項［５６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［７１］少なくとも、アジュバントをコードする配列が、シグナル配列をさらにコードする、項［５３］～［７０］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［７２］自然免疫系刺激剤である配列をさらに含む、項［１］～［７０］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［７３］自然免疫系刺激剤である配列が、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーである、項［７２］の環状ポリリボヌクレオチド。
［７４］（ａ）ポリペプチド免疫原をコードする配列と、（ｂ）アジュバントをコードする配列又は自然免疫系刺激剤である配列とを含む、環状ポリリボヌクレオチド。
［７５］ポリペプチド免疫原をコードする配列が、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている、項［７４］の環状ポリリボヌクレオチド。
［７６］アジュバントをコードする配列が、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている、項［７４］又は［７５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［７７］アジュバントがポリペプチドである、項［７４］～［７６］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［７８］ポリペプチド免疫原及びアジュバントポリペプチドが、単一のＩＲＥＳに作動可能に連結された単一のオープンリーディングフレームによってコードされ、オープンリーディングフレームが発現すると、ポリペプチド免疫原及びアジュバントポリペプチドの各々のアミノ酸配列を含むポリペプチドが生成される、項［７７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［７９］ポリペプチド免疫原とアジュバントポリペプチドとが、各々、ポリペプチドリンカーによって分離されている、項［７８］の環状ポリリボヌクレオチド。
［８０］ポリペプチド免疫原とアジュバントポリペプチドとが、各々、切断ドメインによって分離されている、項［７８］の環状ポリリボヌクレオチド。
［８１］各スタガー要素が２Ａ自己切断ペプチドである、項［８０］の環状ポリリボヌクレオチド。
［８２］複数のＩＲＥＳを含む、項［７７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［８３］第１のＩＲＥＳが、ポリペプチド免疫原をコードする配列に作動可能に連結され、第２のＩＲＥＳが、アジュバントポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されている、項［８２］の環状ポリリボヌクレオチド。
［８４］ポリペプチド免疫原をコードする配列の発現が、アジュバントをコードする配列の発現の２倍である、項［７４］～［８３］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［８５］ポリペプチド免疫原をコードする配列の発現が、アジュバントをコードする配列の発現の５倍、１０倍、又は１００倍である、項［７４］～［８４］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［８６］アジュバントが、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である、項［７４］～［８５］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［８７］サイトカインが炎症誘発性サイトカインである、項［８６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［８８］炎症誘発性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ－βから選択される、項［８７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［８９］サイトカインがＴｈ－１誘導サイトカインである、項［８６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９０］Ｔｈ－１誘導サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択される、項［８９］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９１］サイトカインがＴｈ－２誘導サイトカインである、項［８６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９２］Ｔｈ－２誘導サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３から選択される、項［９１］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９３］ケモカインが、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｒａｎｔｅｓ、及びＴＣＡ－３から選択される、項［８６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９４］共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０－Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ２７から選択される、項［９３］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９５］自然免疫系刺激剤が、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、及びＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１から選択される、項［８６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９６］自然免疫系刺激剤が、構成的に活性な突然変異体である、項［９５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９７］シグナル伝達分子が、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＭｙＤ８８、ＩＰＳ１、ＡＳＣ、ＭＡＶＳ、ＭＡＰＫ、ＩＫＫ－α、ＩＫＫ複合体、ＴＢＫ１、Ｂ－カテニン、及びカスパーゼ１から選択される、項［８６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９８］転写活性化因子が、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ１、及びＩＲＦ５から選択される、項［８６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［９９］サイトカイン受容体が、ＩＬ－２βＲ、ＩＦＮ－γＲ、及びＩＬ－６Ｒから選択される、項［８６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１００］細菌成分が、フラジェリン及びＭＢＬから選択される、項［８６］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０１］アジュバントをコードする配列が、シグナル配列をさらにコードする、項［７４］～［１００］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０２］ポリペプチド免疫原をコードする配列が、シグナル配列をさらにコードする、項［７４］～［１０１］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０３］ポリペプチド免疫原をコードする配列がシグナル配列をコードしない、項［７４］～［１０１］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０４］自然免疫系刺激剤である配列が、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーから選択される、項［７４］又は［７５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０５］５’末端及び３’末端を有する第１のポリリボヌクレオチドを含み、５’末端及び３’末端がそれぞれ、第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、これにより第１のポリリボヌクレオチドの５’末端と３’末端とが連結して環状ポリリボヌクレオチドを形成する、項［１］～［１０４］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０６］スプリントライゲーションによって生成される、項［１０５］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０７］３’末端及び５’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドを提供することによって生成され、３’末端及び５’末端それぞれが、イントロンの一部を含み、３’末端のイントロン部分及び５’末端のイントロン部分が、スプライシング反応を触媒し、それによって５’末端及び３’末端を共有結合させて環状ポリリボヌクレオチドを生成する、項［１］～［１０４］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０８］イントロンが、Ｇｒｏｕｐ Ｉ自己プライシングイントロンである、項［１０７］の環状ポリリボヌクレオチド。
［１０９］それぞれがポリペプチド免疫原をコードする配列を含む、複数の環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物。
［１１０］複数の環状ポリリボヌクレオチドのそれぞれが、項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチドである、項［１０９］の免疫原性組成物。
［１１１］組成物が、（ａ）第１のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチドと、（ｂ）第２のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドとを含み、第１及び第２のポリペプチド免疫原が、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、項［１０９］の免疫原性組成物。
［１１２］第１及び第２のポリペプチド免疫原が、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、項［１１１］の免疫原性組成物。
［１１３］第１及び第２のポリペプチド免疫原が、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する、項［１１１］又は［１１２］の免疫原性組成物。
［１１４］ポリペプチド免疫原の各々が、標的を同定する１つ又は複数のエピトープを含む、項［１１１］～［１１３］のいずれか一項の免疫原性組成物。
［１１５］標的が病原体である、項［１１４］の免疫原性組成物。
［１１６］標的が、癌細胞、アレルゲン、又は毒素である、項［１１５］の免疫原性組成物。
［１１７］（ａ）第１のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチド、及び（ｂ）第２のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第１及び第２のポリペプチド免疫原が、異なるタンパク質を同定し、それぞれの異なるタンパク質が、同じ標的を同定する、項［１０９］の免疫原性組成物。
［１１８］標的が、病原体である、項［１１７］の免疫原性組成物。
［１１９］病原体が、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫である、項［１１８］の免疫原性組成物。
［１２０］病原体が、癌細胞、アレルゲン、又は毒素である、項［１１９］の免疫原性組成物。
［１２１］（ａ）第１のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチド、及び（ｂ）第２のポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第１のポリペプチド免疫原が、第１の標的を同定し、第２のポリペプチド免疫原が、第２の標的を同定する、項［１０９］の免疫原性組成物。
［１２２］各標的が、病原体である、項［１２１］の免疫原性組成物。
［１２３］各標的が、独立して、癌細胞、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、毒素、又はアレルゲンである、項［１２１］又は［１２２］の免疫原性組成物。
［１２４］各ポリペプチド免疫原が、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている、項［１０９］～［１２３］のいずれか一項の免疫原性組成物。
［１２５］複数の環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物であって、（ａ）ポリペプチド免疫原をコードする配列を含む少なくとも第１の環状ポリリボヌクレオチドと、（ｂ）アジュバントをコードする配列又は自然免疫系刺激剤である配列を含む少なくとも第２の環状ポリリボヌクレオチドとを含む組成物。
［１２６］アジュバントがポリペプチドである、項［１２５］の免疫原性組成物。
［１２７］アジュバントが、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である、項［１２６］の免疫原性組成物。
［１２８］サイトカインが炎症誘発性サイトカインである、項［１２７］の免疫原性組成物。
［１２９］炎症誘発性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ－βから選択される、項［１２８］の免疫原性組成物。
［１３０］サイトカインがＴｈ－１誘導サイトカインである、項［１２７］の免疫原性組成物。
［１３１］Ｔｈ－１誘導サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択される、項［１３０］の免疫原性組成物。
［１３２］サイトカインがＴｈ－２誘導サイトカインである、項［１２７］の免疫原性組成物。
［１３３］Ｔｈ－２誘導サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３から選択される、項［１３２］の免疫原性組成物。
［１３４］ケモカインが、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｒａｎｔｅｓ、及びＴＣＡ－３から選択される、項［１２７］の免疫原性組成物。
［１３５］共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０－Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ２７から選択される、項［１３４］の免疫原性組成物。
［１３６］自然免疫系刺激剤が、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、及びＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１から選択される、項［１２７］の免疫原性組成物。
［１３７］自然免疫系刺激剤が、構成的に活性な突然変異体である、項［１３６］の免疫原性組成物。
［１３８］シグナル伝達分子が、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＭｙＤ８８、ＩＰＳ１、ＡＳＣ、ＭＡＶＳ、ＭＡＰＫ、ＩＫＫ－α、ＩＫＫ複合体、ＴＢＫ１、Ｂ－カテニン、及びカスパーゼ１から選択される、項［１２７］の免疫原性組成物。
［１３９］転写活性化因子が、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ１、及びＩＲＦ５から選択される、項［１２７］の免疫原性組成物。
［１４０］サイトカイン受容体が、ＩＬ－２βＲ、ＩＦＮ－γＲ、及びＩＬ－６Ｒから選択される、項［１２７］の免疫原性組成物。
［１４１］細菌成分が、フラジェリン及びＭＢＬから選択される、項［１２７］の免疫原性組成物。
［１４２］ポリペプチド免疫原及びアジュバントが、各々、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている、項［１２５］～［１４１］のいずれか一項の免疫原性組成物。
［１４３］自然免疫系刺激剤である配列が、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーである、項［１２５］の免疫原性組成物。
［１４４］環状ポリリボヌクレオチドが、５’末端及び３’末端を有する第１のポリリボヌクレオチドを含み、５’末端及び３’末端が、各々、第２のリボヌクレオチドにハイブリダイズし、それによって第１のポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端を連結して環状ポリリボヌクレオチドを形成する、項［１］～［１４３］のいずれか一項の免疫原性組成物。
［１４５］スプリントライゲーションによって生成される、項［１］～［１４４］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド。
［１４６］３’末端及び５’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドを提供することであって、３’末端及び５’末端が、各々、イントロンの一部分を含み、３’末端のイントロン部分及び５’末端のイントロン部分がスプライシング反応を触媒して、それにより５’末端及び３’末端を共有結合的にコンジュゲートして環状ポリリボヌクレオチドを生成することにより、環状ポリリボヌクレオチドが生成される、項［１］～［１４３］のいずれか一項の免疫原性組成物。
［１４７］イントロンがＧｒｏｕｐ Ｉ自己スプライシングイントロンである、項［１４６］の免疫原性組成物。
［１４８］環状ポリリボヌクレオチドの医薬調製物であって、環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含み、及び環状ポリリボヌクレオチドが、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも２５％（ｗ／ｗ）を占める、医薬調製物。
［１４９］環状ポリリボヌクレオチドが、医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、７５％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）を占める、項［１４８］の医薬調製物。
［１５０］医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の７５％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、又は１％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、項［１４８］又は［１４９］のいずれか一項の医薬調製物。
［１５１］医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、項［１５０］の医薬調製物。
［１５２］医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の１５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、項［１４８］～［１５１］のいずれか一項の医薬調製物。
［１５３］医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、項［１４８］～［１５２］のいずれか一項の医薬調製物。
［１５４］少なくとも１％（ｗ／ｗ）の線状ポリリボヌクレオチドを含む、項［１４８］又は［１４９］のいずれか一項の医薬調製物。
［１５５］医薬調製物が、３０％～４０％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチドと、１％～１０％（ｗ／ｗ）、１０％～２０％（ｗ／ｗ）、２０％～３０％（ｗ／ｗ）、３０％～４０％（ｗ／ｗ）、４０％～５０％（ｗ／ｗ）、５０％～６０％（ｗ／ｗ）、又は６０％～７０％（ｗ／ｗ）線状ポリリボヌクレオチドとを含む、項［１５４］の医薬組成物。
［１５６］医薬調製物が、４０％～６０％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチドと、１％～１０％（ｗ／ｗ）、１０％～２０％（ｗ／ｗ）、２０％～３０％（ｗ／ｗ）、３０％－４０％（ｗ／ｗ）、４０％－５０％（ｗ／ｗ）、５０％～６０％（ｗ／ｗ）の線状ポリリボヌクレオチドとを含む、項［１５４］の医薬組成物。
［１５７］医薬調製物が、６０％～８０％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチドと、１％～１０％（ｗ／ｗ）、１０％～２０％（ｗ／ｗ）、２０％～３０％（ｗ／ｗ）、３０％～４０％（ｗ／ｗ）の線状ポリリボヌクレオチドとを含む、項［１５４］の医薬組成物。
［１５８］環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含み、及び医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の７５％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、環状ポリリボヌクレオチドの医薬調製物。
［１５９］医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の６０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、項［１５８］の医薬調製物。
［１６０］医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の１５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、項［１５８］又は［１５９］の医薬調製物。
［１６１］医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、項［１５８］～［１６０］のいずれか一項の医薬調製物。
［１６２］環状ポリリボヌクレオチドの医薬調製物であって、環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチド免疫原をコードする配列を含み、及び医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の１５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、医薬調製物。
［１６３］医薬調製物中の総リボヌクレオチド分子の１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、項［１６２］の医薬調製物。
［１６４］リムルス試験法によって測定したとき１０ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はそれを欠いている、項［１４８］～［１６３］のいずれか一項の医薬調製物。
［１６５］滅菌前に１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含む、項［１４８］～［１６３］のいずれか一項の医薬調製物。
［１６６］無菌医薬調製物であり、例えば、無菌条件下で試験したとき１００より少ない生存微生物の増殖を支持する、項［１４８］～［１６５］のいずれか一項の医薬調製物。
［１６７］ＵＳＰ＜７１＞の規格に適合している、項［１４８］～［１６６］のいずれか一項の医薬調製物。
［１６８］ＵＳＰ＜８５＞の規格に適合している、項［１４８］～［６７］のいずれか一項の医薬調製物。
［１６９］最終薬物製品の中間医薬調製物である、項［１４８］～［１６８］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７０］対象に投与される最終薬物製品である、項［１４８］～［１６９］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７１］少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、又は５００ｍｇ／ｍＬの濃度の環状ポリリボヌクレオチド分子を含む、項［１４８］～［１７０］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７２］１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のデオキシリボヌクレオチド分子を含む、項［１４８］～［１７１］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７３］１ミリグラム（ｍｇ）の環状ポリリボヌクレオチド分子当たり０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満の夾雑タンパク質の夾雑タンパク質（例えば酵素）を含む、項［１４８］～［１７２］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７４］分光光度計によって測定したとき約１．６～２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を含む、項［１４８］～［１７３］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７５］細胞タンパク質、細胞デオキシリボ核酸、酵素、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフィー材料から選択されるプロセス関連不純物を実質的に含まない、項［１４８］～［１７４］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７６］免疫又は炎症反応の１つ又は複数のマーカーについて精製前と比較して精製後に低下したレベルを有する、項［１４８］～［１７５］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７７］環状ポリリボヌクレオチドが、項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチドである、項［１４８］～［１７６］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７８］環状ポリリボヌクレオチドが、
（ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供するステップ；
ｂ）線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化するステップであって、それにより環状ポリリボヌクレオチド分子の調製物を提供するステップ；及び
ｃ）調製物から線状ポリリボヌクレオチド分子を除去するため調製物を処理するステップ
を含む方法により生成される、項［１４８］～［１７７］のいずれか一項の医薬調製物。
［１７９］方法が、ｄ）処理ステップの後に残る調製物中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価するステップをさらに含む、項［１７８］の医薬調製物。
［１８０］方法が、ｅ）調製物をさらに処理するステップをさらに含み、さらに処理するステップが、
－調製物からニックポリリボヌクレオチド分子を除去するため調製物を処理するステップ；及び／又は
－調製物からデオキシリボヌクレオチド分子を除去するため調製物を処理するステップ；及び／又は
－調製物から夾雑タンパク質を除去するため調製物を処理するステップ；及び／又は
－調製物からエンドトキシンを除去するため調製物を処理するステップ
を含む、項［１７８］又は［１７９］の医薬調製物。
［１８１］項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物、又は項［１４８］～［１８０］のいずれか一項の医薬調製物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
［１８２］アジュバントをさらに含む、項［１８１］の医薬組成物。
［１８３］アジュバントが、無機アジュバント、小分子アジュバント、及び水中油型エマルジョン、脂質又はポリマー、ペプチド又はペプチドグリカン、炭水化物又は多糖、サポニン、ＲＮＡベースのアジュバント、ＤＮＡベースのアジュバント、ウイルス粒子、細菌アジュバント、ハイブリッド分子、真菌又は卵母細胞微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）、無機ナノ粒子、又は多成分アジュバントである、項［１８２］の医薬組成物。
［１８４］アジュバントが、無機アジュバントである、項［１８３］の医薬組成物。
［１８５］無機アジュバントが、アルミニウム塩又はカルシウム塩である、項［１８４］の医薬組成物。
［１８６］アジュバントが、小分子である、項［１８３］の医薬組成物。
［１８７］小分子が、イミキモド、レシキモド、又はガルジキモドである、項［１８３］の医薬組成物。
［１８８］アジュバントが、水中油型エマルジョンである、項［１８３］の医薬組成物。
［１８９］水中油型エマルジョンが、スクアレン、ＭＦ５９、ＡＳ０３、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ製剤、任意選択によりＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１若しくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０、又は水中油型エマルジョンの不完全フロイントアジュバントである、項［１８８］の医薬組成物。
［１９０］アジュバントが、脂質又はポリマーである、項［１８３］の医薬組成物。
［１９１］脂質又はポリマーが、ポリマーナノ粒子、任意選択によりＰＬＧＡ、ＰＬＧ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、又はＰＨＢ、リポソーム、任意選択によりビロソーム又はＣＡＦ０１、脂質ナノ粒子又はその成分、リポ多糖（ＬＰＳ）、任意選択によりモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）又はグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）、リポペプチド、任意選択によりＰａｍ２（Ｐａｍ２ＣＳＫ４）又はＰａｍ３（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、又は糖脂質、任意選択によりトレハロースジミコレートである、項［１９０］の医薬組成物。
［１９２］アジュバントが、ペプチド又はペプチドグリカンである、項［１８７］の医薬組成物。
［１９３］ペプチドグリカンのペプチドが、合成又は精製されたグラム陰性菌又はグラム陽性菌、任意選択によりＮ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＭＤＰ）、フラジェリン融合タンパク質、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、サイトカイン、又はケモカインのすべて又は一部に一致する、項［１９２］の医薬組成物。
［１９４］アジュバントが、炭水化物又は多糖類である、項［１８３］の医薬組成物。
［１９５］炭水化物又は多糖類が、デキストラン（分枝微生物多糖類）、硫酸デキストラン、レンチナン、ザイモサン、βグルカン、Ｄｅｌｔｉｎ、マンナン、又はキチンである、項［１９４］の医薬組成物。
［１９６］アジュバントがサポニンである、項［１８３］の医薬組成物。
［１９７］サポニンが、１つ又は複数の糖側鎖、任意選択によりＩＳＣＯＭＳ、ＩＳＣＯＭＳマトリックス、又はＱＳ－２１に結合したグリコシド若しくは多環式アグリコンである、項［１９６］の医薬組成物。
［１９８］アジュバントが、ＲＮＡベースのアジュバントである、項［１８３］の医薬組成物。
［１９９］ＲＮＡベースのアジュバントが、ポリＩＣ、ポリＩＣ：ＬＣ、ヘアピンＲＮＡ、任意選択により５’ＰＰＰ含有配列、ウイルス配列、ポリＵ含有配列、ｄｓＲＮＡ、天然又は合成の免疫刺激性ＲＮＡ配列、核酸類似体、任意選択により環状ＧＭＰ－ＡＭＰ又は環状ジＧＭＰなどの環状ジヌクレオチド、又は免疫刺激性塩基類似体、任意選択によりＣ８置換又はＮ７，Ｃ８二置換グアニンリボヌクレオチドである、項［１９８］の医薬組成物。
［２００］アジュバントが、ＤＮＡベースのアジュバントである、項［１８３］の医薬組成物。
［２０１］ＤＮＡベースのアジュバントが、ＣｐＧ、ｄｓＤＮＡ、又は天然若しくは合成の免疫刺激性ＤＮＡ配列である、項［２００］の医薬組成物。
［２０２］アジュバントが、ウイルス粒子である、項［１８３］の医薬組成物。
［２０３］ウイルス粒子が、ビロソーム、任意選択によりリン脂質細胞膜二重層である、項［２０２］の医薬組成物。
［２０４］アジュバントが、細菌アジュバントである、項［１８３］の医薬組成物。
［２０５］細菌アジュバントが、フラジェリン、ＬＰＳ、又は細菌毒素、任意選択によりエンテロトキシン、易熱性毒素、又はコレラ毒素である、項［２０４］の医薬組成物。
［２０６］アジュバントが、ハイブリッド分子である、項［１８３］の医薬組成物。
［２０７］アジュバントが、イミキモドにコンジュゲートしたＣｐＧである、項［２０６］の医薬組成物。
［２０８］アジュバントが、真菌又は卵母細胞微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）である、項［１８３］の医薬組成物。
［２０９］真菌又は卵母細胞ＭＡＭＰが、キチン又はβグルカンである、項［２０８］の医薬組成物。
［２１０］アジュバントが、無機ナノ粒子である、項［１８３］の医薬組成物。
［２１１］無機ナノ粒子が、金ナノロッド、シリカベースのナノ粒子、任意選択によりメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）である、項［２１０］の医薬組成物。
［２１２］アジュバントが、多成分アジュバントである、項［１８３］の医薬組成物。
［２１３］多成分アジュバントが、ＡＳ０１、ＡＳ０３、ＡＳ０４、完全フロイントアジュバント、又はＣＡＦ０１である、項［２１２］の医薬組成物。
［２１４］（ａ）ポリペプチド免疫原をコードする配列を含むポリリボヌクレオチドと、（ｂ）アルコールとを含む混合物を含む医薬組成物であって、アルコールが混合物の約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める、医薬組成物。
［２１５］ポリリボヌクレオチドが、環状ポリリボヌクレオチドである、項［２１４］の医薬組成物。
［２１６］（ａ）項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物、又は項［１４８］～［１８０］のいずれか一項の医薬調製物と、（ｂ）アルコールとを含む混合物を含む医薬組成物であって、アルコールが混合物の約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める、医薬組成物。
［２１７］ポリリボヌクレオチドが、線状ポリリボヌクレオチドである、項［２１４］の医薬組成物。
［２１８］線状ポリリボヌクレオチドが、各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含み、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つが少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、項［２１７］の医薬組成物。
［２１９］少なくとも２つのポリペプチド免疫原が、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する、項［２１８］の医薬組成物。
［２２０］線状ポリリボヌクレオチドが、各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含み、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つが異なるタンパク質を同定し、異なるタンパク質の各々が同じ標的を同定する、項［２１７］の医薬組成物。
［２２１］線状ポリリボヌクレオチドが、各配列がポリペプチド免疫原をコードする複数の配列を含み、ポリペプチド免疫原の少なくとも２つが異なる標的を同定する、項［２１７］の医薬組成物。
［２２２］線状ポリリボヌクレオチドが、各配列がポリペプチド免疫原をコードする少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又は少なくとも９つの配列を含む、項［２１７］～［２２１］のいずれか一項の医薬組成物。
［２２３］環状ポリリボヌクレオチドが、アジュバントをコードする少なくとも１つの配列をさらに含む、項［２１５］の医薬組成物。
［２２４］アジュバントがポリペプチドである、項［２２３］の医薬組成物。
［２２５］アジュバントが、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である、項［２２４］の医薬組成物。
［２２６］環状ポリリボヌクレオチドが、自然免疫系刺激剤である配列をさらに含む、項［２１５］又は［２２３］～［２２５］のいずれか一項の医薬組成物。
［２２７］自然免疫系刺激剤である配列が、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーである、項［２２６］の医薬組成物。
［２２８］アルコールが、混合物の約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ 約０．３％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める、項［２１４］～［２２７］のいずれか一項の医薬組成物。
［２２９］アルコールが、混合物の約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める、項［２１４］～［２２７］のいずれか一項の医薬組成物。
［２３０］アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール、トリエタノールアミン、フェネチルアルコール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特殊変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースから選択される、項［２１４］～［２２９］のいずれか一項の方法。
［２３１］アルコールがエタノールである、項［２３０］の方法。
［２３２］局所投与用に製剤化される、項［２１４］～［２３１］のいずれか一項の医薬組成物。
［２３３］液体、ゲル、ローション、ペースト、クリーム、泡、又はスティックである、項［２１４］～［２３２］のいずれか一項の医薬組成物。
［２３４］約６～８のｐＨを有する、項［２１４］～［２３３］のいずれか一項の医薬組成物。
［２３５］水とほぼ同じ粘度を有する、項［２１４］～［２３４］のいずれか一項の医薬組成物。
［２３６］疎水基又は親油基を実質的に含まない、項［２１４］～［２３５］のいずれか一項の医薬組成物。
［２３７］炭化水素を実質的に含まない、項［２１４］～［２３６］のいずれか一項の医薬組成物。
［２３８］カチオン性リポソームを実質的に含まない、項［２１４］～［２３７］のいずれか一項の医薬組成物。
［２３９］脂肪酸、脂質、リポソーム、コレステロール、又はこれらの任意の組み合わせを実質的に含まない、項［２１４］～［２３８］のいずれか一項の医薬組成物。
［２４０］アジュバントをさらに含む、項［２１４］～［２３９］のいずれか一項の医薬組成物。
［２４１］アジュバントが、無機アジュバント、小分子アジュバント、及び水中油型エマルション、脂質又はポリマー、ペプチド又はペプチドグリカン、炭水化物又は多糖、サポニン、ＲＮＡベースのアジュバント、ＤＮＡベースのアジュバント、ウイルス粒子、細菌アジュバント、ハイブリッド分子、真菌又は卵母細胞微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）、無機ナノ粒子、又は多成分アジュバントである、項［２４０］の医薬組成物。
［２４２］ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、項［２１４］～［２４１］のいずれか一項の医薬組成物を対象の表面積に局所的に適用することを含む方法。
［２４３］ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、
ａ）対象の表面積に滅菌剤を適用すること；及び
ｂ）項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物、項［１４８］～［１８０］のいずれか一項の医薬調製物、又は項［１８１］～［２４２］のいずれか一項の医薬組成物と、希釈剤とを含む組成物を対象の表面積に適用すること
を含む方法。
［２４４］（ｂ）の組成物が担体を含まない、項［２４３］の方法。
［２４５］滅菌剤が、アルコール、紫外光、レーザー光、又は熱である、項［２４３］又は［２４４］の方法。
［２４６］ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、
ａ）対象の表面積にアルコールを適用すること；及び
ｂ）項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物、項［１４８］～［１８０］のいずれか一項の医薬調製物、又は項［１８１］～［２４１］のいずれか一項の医薬組成物と、希釈剤とを含む組成物を対象の表面積に適用すること
を含む方法。
［２４７］アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール、トリエタノールアミン、フェネチルアルコール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特殊変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される、項［２４６］の方法。
［２４８］アルコールがエタノールである、項［２４７］の方法。
［２４９］対象の表面積が、皮膚、口腔、鼻腔、胃腸管、気道、又はこれらの任意の組み合わせの表面積から選択される、項［２４３］～［２４８］のいずれか一項の方法。
［２５０］項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド又は項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
［２５１］イオン性脂質を含む、項［２５０］のＬＮＰ。
［２５２］カチオン性脂質を含む、項［２５０］のＬＮＰ。
［２５３］カチオン性脂質が：

【化1】

の構造を有する、項［２５２］のＬＮＰ。
［２５４］１つ又は複数の中性脂質、例えば、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、ステロイド、例えば、コレステロール、及び／又は１つ又は複数のポリマー複合脂質、例えば、ペグ化脂質、例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＰＥ、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ｃｅｒ、又はＰＥＧジアルキルオキシプロピルカルバメート（ｄｉａｌｋｙｏｘｙｐｒｏｐｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ）をさらに含む、項［２５０］～［２５３］のいずれか一項のＬＮＰ。
［２５５］対象の疾患、障害、又は症状を処置又は予防する方法であって、項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物、項［１４８］～［１８０］のいずれか一項の医薬調製物、項［１８１］～［２４１］のいずれか一項の医薬組成物、又は項［２５０］～［２５４］のいずれか一項のＬＮＰを対象に投与することを含む、方法。
［２５６］疾患、障害、又は症状が、ウイルス感染、細菌感染、又は真菌感染である、項［２５５］の方法。
［２５７］疾患、障害、又は症状が癌である、項［２５５］の方法。
［２５８］疾患、障害、又は症状が、アレルゲンへの暴露に関連する、項［２５５］の方法。
［２５９］疾患、障害、又は症状が、毒素への曝露に関連する、項［２５５］の方法。
［２６０］対象において免疫応答を誘発する方法であって、項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物、項［１４８］～［１８０］のいずれか一項の医薬調製物、項［１８１］～［２４１］のいずれか一項の医薬組成物、又は項［２５０］～［２５４］のいずれか一項のＬＮＰを対象に投与することを含む、方法。
［２６１］対象が哺乳動物である、項［２５５］～［２６０］のいずれか一項の方法。
［２６２］対象がヒトである、項［２６１］の方法。
［２６３］方法が、非ヒト哺乳動物である、項［２６１］の方法。
［２６４］非ヒト哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ウマ、又はネコである、項［２６１］の方法。
［２６５］対象がトリである、項［２５５］～［２６４］のいずれか一項の方法。
［２６６］トリが、雌鶏、雄鶏、七面鳥、又はオウムである、項［２６５］の方法。
［２６７］対象にアジュバントを投与することをさらに含む、項［２５５］～［２６６］のいずれか一項の方法。
［２６８］アジュバントが、無機アジュバント、小分子アジュバント、及び水中油型エマルジョン、脂質又はポリマー、ペプチド又はペプチドグリカン、炭水化物又は多糖、サポニン、ＲＮＡベースのアジュバント、ＤＮＡベースのアジュバント、ウイルス粒子、細菌アジュバント、ハイブリッド分子、真菌又は卵母細胞微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）、無機ナノ粒子、又は多成分アジュバントである、項［２６７］の方法。
［２６９］アジュバントが、ポリペプチドアジュバントである、項［２６７］の方法。
［２７０］ポリペプチドアジュバントが、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫系刺激剤、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である、項［２６９］の方法。
［２７１］アジュバントが、自然免疫系刺激剤である、項［２６７］の方法。
［２７２］自然免疫系刺激物質が、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーを含むＲＮＡから選択される、項［２７１］の方法。
［２７３］項［１］～［１１０］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１１１］～［１５１］のいずれか一項の免疫原性組成物、項［１５２］～［１８４］のいずれか一項の医薬調製物、項［１８５］～［２４５］のいずれか一項の医薬組成物、又は項［２５０］～［２５４］のいずれか一項のＬＮＰが、単回用量として対象に投与される、項［２５５］～［２７２］のいずれか一項の方法。
［２７４］項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物、項［１４８］～［１８０］のいずれか一項の医薬調製物、項［１８１］～［２４１］のいずれか一項の医薬組成物、又は項［２５０］～［２５４］のいずれか一項のＬＮＰが、対象に２回以上、３回以上、４回以上、又は５回以上投与される、項［２５４］～［２６７］のいずれか一項の方法。
［２７５］項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物、項［１４８］～［１８０］のいずれか一項の医薬調製物、項［１８１］～［２４１］のいずれか一項の医薬組成物、又は項［２５０］～［２５４］のいずれか一項のＬＮＰの投与が、約１週間ごと、約２週間ごと、約３週間ごと、約１ヶ月ごと、約２ヶ月ごと、約３ヶ月ごと、約４ヶ月ごと、約５ヶ月ごと、約６ヶ月ごと、約１年ごと、約２年ごと、約３年ごと、約４年ごと、約５年ごと、又は約１０年ごとに行われる、項［２７４］の方法。
［２７６］ポリペプチド免疫原（例えば、ポリペプチド免疫原を含むタンパク質サブユニット）を対象に投与することをさらに含む、項［２５５］～［２７５］のいずれか一項の方法。
［２７７］ポリペプチド免疫原が、環状ポリリボヌクレオチドの配列によってコードされるポリペプチド免疫原に一致する（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を共有する）、項［２７６］の方法。
［２７８］ポリペプチド免疫原が、項［１］～［１０８］のいずれか一項の環状ポリリボヌクレオチド、項［１０９］～［１４７］のいずれか一項の免疫原性組成物、項［１４８］～［１８０］のいずれか一項の医薬調製物、項［１８１］～［２４１］のいずれか一項の医薬組成物、又は項［２５０］～［２５４］のいずれか一項のＬＮＰを投与した後に対象に投与される、項［２７６］の方法。
［２７９］ポリペプチド免疫原が、対象におけるポリペプチド免疫原に対する免疫応答を維持又は増強する、項［２７６］～［２７８］のいずれか一項の方法。
［２８０］対象における免疫応答を維持又は増強する方法であって、（ｉ）ポリペプチド免疫原をコードする環状ポリリボヌクレオチドを対象に投与するステップ、及び（ｉｉ）ポリペプチド免疫原を対象に投与するステップを含む方法であって、ステップ（ｉｉ）が、ステップ（ｉ）の後１週間～６ヶ月の間に行われ、ステップ（ｉｉ）のポリペプチド免疫原の投与が、対象におけるポリペプチド免疫原に対する免疫応答を維持又は増強する、方法。
［２８１］ポリペプチド免疫原が、標的を同定する１つ又は複数のエピトープを含む、項［２８０］の方法。
［２８２］標的が病原体である、項［２８１］の方法。
［２８３］標的が、癌細胞、アレルゲン、又は毒素である、項［２８１］の方法。

【0054】

定義
本開示は、特定の実施形態に関して及び特定の図を参照して説明されるが、本開示は、それらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降に記載される用語は、一般に、特に示されない限り、それらの一般的な意味で理解されるべきである。

【0055】

本明細書で使用されるとき、「適応免疫応答」という用語は、体液性又は細胞性免疫応答のいずれかを意味する。本開示の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子によって媒介される免疫応答を指し、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球によって媒介されるものである。

【0056】

本明細書で使用されるとき、「アジュバント」という用語は、免疫応答を増加させる、例えば、ある免疫原に対する特異的免疫応答を増加させる組成物（例えば、化合物、ポリペプチド、核酸、又は脂質）を指す。免疫応答を増加させることには、抗体応答及び細胞性免疫応答のいずれか一方又は両方の強化又はその特異性の広域化が含まれる。

【0057】

「アルコール」という用語は、ヒドロキシル官能基（－ＯＨ）が炭素に結合している任意の有機化合物を意味する。いくつかの実施形態では、アルコールは、ヒドロキシルが飽和炭素に結合し、次にはそれが他の水素又は炭素原子に結合しているものを含む。本明細書で考察するとおりのアルコールには、限定はされないが、一価アルコール類、多価アルコール類、不飽和脂肪族アルコール類、及び脂環式アルコール類が含まれ得る。いくつかの場合、アルコールとは、エタノールを指し得る。いくつかの場合、アルコールには、限定はされないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール、トリエタノールアミン、フェネチルアルコール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特殊変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースが含まれ得る。

【0058】

本明細書で使用される、疾患、障害、又は症状に「関連する」という用語は、実体と、対象における疾患、障害、又は症状の発生又は重症度との間の原因又は相関のいずれかの関係を指す。例えば、標的が、疾患、障害、又は症状に関連している場合、標的は、疾患、障害、又は症状の原因病原体であり得る。例えば、ウイルスは、ウイルス感染の原因病原体であり得、細菌は、細菌感染の原因病原体であり得、真菌は、真菌感染の原因病原体であり得、又は寄生虫は、寄生虫感染の原因病原体であり得、癌細胞は、癌の原因病原体であり得、毒素は、毒性の原因病原体であり得、又はアレルゲンは、アレルギー反応の原因病原体であり得る。疾患、障害、又は症状に関連する標的は、加えて又は代わりに、疾患、障害、又は症状の発生する可能性の増加又は重症度の増加と相関し得る。

【0059】

本明細書で使用されるとき、「担体」という用語は、対象、組織、又は細胞への組成物（例えば、線状又は環状ポリリボヌクレオチド）の輸送又は送達を容易にする化合物、組成物、試薬、又は分子を意味する。担体の非限定的な例には、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン又はグリコーゲン型物質）、ナノ粒子（例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにカプセル化又は共有結合されるナノ粒子）、リポソーム、フソソーム、生体外で分化した網状赤血球、エキソソーム、タンパク質担体（例えば、ポリリボヌクレオチドに共有結合したタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー又はトランスフェクション試薬）が含まれる。

【0060】

本明細書で使用されるとき、「細胞透過剤」という用語は、細胞に接触すると、細胞への侵入を促進する作用物質を意味する。場合によっては、細胞透過剤は、例えば、細胞膜の負に帯電したリン脂質との直接的な静電相互作用、又は膜タンパク質若しくはリン脂質二重層の構成変化を誘発することによる一時的な孔形成を介して、細胞膜の直接透過を促進する。場合によっては、細胞透過剤は、エンドサイトーシスを介した細胞への移行を促進する。例えば、特定の状況下では、細胞透過剤は、細胞を刺激してエンドサイトーシスプロセスを受け得、それによって細胞膜が細胞内に向かって折り畳まれ得る。特定の実施形態では、細胞透過剤は、細胞膜を透過して輸送する一時的な構造の形成を助ける。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書で提供される細胞透過剤は、細胞膜の透過性を増加させる、又は細胞への分子の内在化を増加させることができ、その結果、細胞透過剤なしの点を除くと同一である送達と比較して、同時に細胞が細胞透過剤と接触する場合、細胞への送達がより効率的になり得る。

【0061】

本明細書で使用されるとき、「ｃｉｒｃＲＮＡ」又は「環状ポリリボヌクレオチド」又は「環状ＲＮＡ」又は「環状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、遊離末端（即ち、遊離３’及び／又は５’末端）を有していない構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば、共有結合（例えば、共有的に閉じている）又は非共有結合を介して環状又は末端のない構造を形成するポリリボヌクレオチド分子を意味する。

【0062】

本明細書で使用されるとき、「環状化効率」という用語は、得られた環状ポリリボヌクレオチドのその非環状出発物質に対する測定値である。

【0063】

本明細書で使用されるとき、「ｃｉｒｃＲＮＡ調製物」又は「環状ポリリボヌクレオチド調製物」又は「環状ＲＮＡ調製物」という用語は、互換的に使用され、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と、希釈剤、担体、第１のアジュバント、又はそれらの組み合わせを含む組成物を意味する。

【0064】

「処置や調節などをするための化合物、組成物、製品など」という文言は、化合物、組成物、製品などを指すと理解されるべきであり、それ自体が処置や調節などの指示された目的に適した化合物、組成物、製品などを指すことを理解されたい。「処置や調節などをするための化合物、組成物、製品など」という文言は、好ましい実施形態として、そのような化合物、組成物、製品などが処置や調節などに使用されることをさらに開示する。

【0065】

「～に使用するための化合物、組成物、製品など」又は「～のための医薬品、医薬組成物、獣医学的組成物、診断組成物などの製造における化合物、組成物、製品などの使用」という文言は、そのような化合物、組成物、製品などが、ヒト又は動物の体に施され得る治療法で使用されるものであることを示す。それらは、処置方法などに関する実施形態及び請求項の同等の開示と見なされる。したがって、実施形態又は請求項が「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物の処置に使用するための化合物」について言及する場合、これは、「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物を処置するための医薬品の製造における化合物の使用」又は「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物に化合物を投与することによる処置の方法」の開示とも考えられる。

【0066】

「希釈剤」という用語は、本明細書に記載の組成物（例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチドを含む組成物）を希釈又は溶解できる不活性溶媒を含むビヒクルを意味する。希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝剤、等張剤、又はそれらの混合物であり得る。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。液体希釈剤の非限定的な例には、水又は他の溶媒、可溶化剤、及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、及び１，３－ブタンジオールが含まれる。固体希釈剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、又は粉砂糖が含まれる。

【0067】

本明細書で使用されるとき、「疾患」、「障害」、及び「症状」という用語はそれぞれ、最適でない健康の状態、例えば、医療専門家によって通常は診断又は処置されている、又は診断又は処置されることになる状態を指す。

【0068】

本明細書で使用されるとき、「エピトープ」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体によって認識、標的化、又は結合される免疫原の一部又は全体を指す。エピトープは、線状エピトープ、例えば、核酸又はアミノ酸の連続的な配列であり得る。エピトープは、立体構造エピトープ、例えば、タンパク質の折り畳まれた立体構造にエピトープを形成するアミノ酸を含むエピトープであり得る。立体構造エピトープは、一次アミノ酸配列からの不連続なアミノ酸を含み得る。別の例として、立体構造エピトープには、その二次構造又は三次構造に基づいて、免疫原性配列の折り畳まれた立体構造にエピトープを形成する核酸が含まれる。

【0069】

本明細書で使用されるとき、「エンクリプトゲン（ｅｎｃｒｙｐｔｏｇｅｎ）」という用語は、免疫細胞による検出を少なくする、逃れる、及び／又は回避するのに役立つ、且つ／又は環状若しくは線状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答の誘発を低減する環状ポリリボヌクレオチドの核酸配列若しくは構造である。

【0070】

本明細書で使用されるとき、「発現配列」という用語は、産物、例えばペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列、又は調節核酸である。ペプチド又はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数の三連ヌクレオチドを含み得、そのそれぞれは、アミノ酸をコードすることができ、「コドン」と呼ばれる。

【0071】

本明細書で使用されるとき、「同定する（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）」又は「同定する（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ）」という用語は、実体の同一性を示す、確立する、又は認識することを指す。例えば、免疫原又はそのエピトープは、標的を同定することができ、即ち、標的が、免疫原又はそのエピトープを含むこと、免疫原又はそのエピトープが、標的に由来すること、及び／又は免疫原又はそのエピトープが、標的の一部又は全体と高い類似性を共有することを意味する。抗体又はＴ細胞受容体の免疫原又はそのエピトープへの結合の認識により、標的を同定することができる。免疫原又はそのエピトープが標的を同定する場合、免疫原又はそのエピトープは、標的を１つ又は複数の他の標的から区別する。同様に、ポリペプチド免疫原は、タンパク質を同定することができる。別の言い方をすれば、ポリペプチド免疫原は、タンパク質又はタンパク質の一部、特にタンパク質のエピトープの成分であるか、その一部であるか、それに由来するか、又はそれと高い類似性を共有する。

【0072】

本明細書で使用されるとき、「自然免疫系刺激剤」という用語は、限定はされないが、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＮＦβ、及び／又はＩＦＮγ）、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦ－α、及び／又はＧＭ－ＣＳＦ）、レチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ、別名ＤＤＸ５８）、メラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５、別名ＩＦＩＨ１）、２’－５’オリゴアデニル酸シンターゼ１（ＯＡＳ１）、ＯＡＳ様タンパク質（ＯＡＳＬ）、及び／又はプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）を含め、一部には、自然免疫に関与する１つ又は複数の遺伝子の発現を誘導することによって自然免疫応答を誘導する物質を指す。自然免疫系刺激剤は、例えば、免疫原をコードするリボヌクレオチドと組み合わせて投与したとき、又はそれと共に製剤化したとき、アジュバントとして作用し得る。自然免疫系刺激剤は、別個の（例えば、ポリリボヌクレオチド中の配列によってコードされない、又はそうした配列として組み込まれていない）分子実体、例えば、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、及びＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１又はその構成的に活性な突然変異体であってもよい。自然免疫系刺激剤は、ポリリボヌクレオチドによってコードされ得る（例えば、それから発現し得る）。ポリリボヌクレオチドには、或いは、又はさらに、自然免疫系刺激剤として作用するリボヌクレオチド配列（例えば、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマー）が含まれ得る。

【0073】

本明細書で使用されるとき、「不純物」という用語は、組成物、例えば、本明細書に記載の医薬組成物中に存在する望ましくない物質である。いくつかの実施形態では、不純物は、プロセス関連不純物である。いくつかの実施形態では、不純物は、最終組成物中の所望の産物以外、例えば活性薬物成分、例えば、本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチド以外の産物関連物質である。本明細書で使用されるとき、「プロセス関連不純物」という用語は、本明細書に記載の線状ポリリボヌクレオチド以外の最終組成物、調製物、又は製品では望ましくない、組成物、調製物、又は製品の製造で使用される、存在する、又は生成される物質である。いくつかの実施形態では、プロセス関連不純物は、ポリリボヌクレオチドの合成又は環状化に使用される酵素である。本明細書で使用されるとき、「産物関連物質」という用語は、組成物、調製物、又は製品、又はそれらの任意の中間体の合成中に生成される物質又は副産物である。いくつかの実施形態では、産物関連物質はデオキシリボヌクレオチド断片である。いくつかの実施形態では、産物関連物質は、デオキシリボヌクレオチドモノマーである。いくつかの実施形態では、産物関連物質は、１つ又は複数の本明細書に記載のポリリボヌクレオチドの誘導体又は断片、例えば、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、又は４つのリボ核酸、モノリボ核酸、ジリボ核酸、又はトリリボ核酸の断片である。

【0074】

本明細書で使用されるとき、「免疫原」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体によって認識される、標的化される、又は結合される１つ又は複数のエピトープを含む任意の分子又は分子構造を指す。特に、免疫原は、対象において免疫応答を誘発する（例えば、本明細書で定義される免疫原性である）。免疫原は、対象において免疫応答を誘発することができ、免疫応答は、免疫系が免疫原に遭遇したときに誘発される一連の分子、細胞、及び生物の事象を指す。免疫応答は、体液性及び／又は細胞性免疫応答であり得る。これらには、抗体の産生とＢ細胞及びＴ細胞の増殖が含まれ得る。免疫応答が生じたかどうかを判断し、その経過を観察するために、免疫化された対象を、特定の免疫原に対する免疫反応物質の出現について監視することができる。ほとんどの免疫原に対する免疫応答は、特定の抗体及び特定のエフェクターＴ細胞の両方の産生を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫原は、宿主にとって外来性である。いくつかの実施形態では、免疫原は、宿主にとって外来性ではない。免疫原は、ポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチド、又は脂質のすべて又は一部を含み得る。免疫原はまた、ポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチド、及び／又は脂質の混合物であり得る。例えば、免疫原は、翻訳的に改変されたポリペプチドであり得る。「ポリペプチド免疫原」は、ポリペプチドを含む免疫原を指す。ポリペプチド免疫原は、１つ又は複数の翻訳後修飾を含むこともでき、且つ／又は１つ又は複数の追加の分子と複合体を形成することができ、且つ／又は三次構造又は四次構造を選択することができ、それぞれが、ポリペプチドの免疫原性を決定することができる、又はポリペプチドの免疫原性に影響を与えることができる。

【0075】

本明細書で使用されるとき、「免疫原性」という用語は、特定の免疫応答アッセイにおいて、物質に対して所定の閾値を超える応答を誘発する潜在能力である。アッセイは、例えば、特定の炎症マーカーの発現、抗体の産生、又は本明細書に記載の免疫原性のアッセイであり得る。いくつかの実施形態では、生物の免疫系又は特定の種類の免疫細胞が免疫原に曝露されると、免疫応答が誘発され得る。

【0076】

免疫原性応答は、全抗体アッセイ、確認試験、抗体の力価測定及びアイソタイピング、並びに中和抗体評価を使用して、対象の血漿又は血清中の抗体を評価することによって評価することができる。全抗体アッセイは、免疫原が投与された対象の血清又は血漿における免疫応答の一部として生成されたすべての抗体を測定する。抗体を検出するために最も一般的に使用される試験は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）であり、ＥＬＩＳＡは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む目的の抗体に結合する、試験される血清中の抗体を検出する。免疫原性応答は、確認アッセイによってさらに評価することができる。全抗体評価に続いて、確認アッセイを使用して、全抗体アッセイの結果を確認することができる。競合アッセイを使用して、抗体が標的に特異的に結合していること、及びスクリーニングアッセイでの陽性所見が、試験血清又は検出試薬とアッセイ中の他の物質との非特異的相互作用の結果ではないことを確認することができる。

【0077】

免疫原性応答は、アイソタイピング及び力価測定によって評価することができる。アイソタイピングアッセイを使用して、関連する抗体アイソタイプのみを評価することができる。例えば、予想されるアイソタイプは、ＩｇＭ及びＩｇＧであり得、ＩｇＭ及びＩｇＧは、アイソタイピング及び力価測定によって特異的に検出及び定量して、存在する全抗体と比較することができる。

【0078】

免疫原性応答は、中和抗体アッセイ（ｎＡｂ）によって評価することができる。中和抗体アッセイ（ｎＡｂ）を使用して、免疫原に応答して産生される抗体が、免疫原を中和し、それによって免疫原が標的に影響を与えることを阻害し、異常な薬物動態挙動を引き起こすかどうかを判断することができる。多くの場合、ｎＡｂアッセイは、標的細胞を抗体とともにインキュベートする細胞ベースのアッセイである。限定されるものではないが、細胞増殖、生存率、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、細胞変性効果阻害（ＣＰＥ）、アポトーシス、リガンド刺激細胞シグナル伝達（Ｌｉｇａｎｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、酵素活性、レポーター遺伝子アッセイ、タンパク質分泌、代謝活性、ストレス、及びミトコンドリア機能を含む様々な細胞ベースのｎＡｂアッセイを使用することができる。検出の読み出しには、吸光度、蛍光、発光、化学発光、又はフローサイトメトリーが含まれる。リガンド結合アッセイを使用して、免疫原と抗体の結合親和性をインビトロで測定し、中和効果を評価することもできる。

【0079】

さらに、細胞性免疫応答の誘発は、対象から得られたＴ細胞上の細胞マーカーを使用して、対象におけるＴ細胞活性化を測定することによって評価することができる。血液サンプル、リンパ節生検、又は組織サンプルを対象から収集し、サンプルからのＴ細胞を１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上）の活性化マーカー：ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１５４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３４、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、又はＣＤ４４について評価することができる。Ｔ細胞活性化は、インビボ動物モデルで同じ方法を使用して評価することもできる。このアッセイは、免疫原をインビトロでＴ細胞（例えば、対象、動物モデル、貯蔵所、又は商業的供給源から得たＴ細胞）に添加し、前述のマーカーを測定してＴ細胞活性化を評価することによっても行うことができる。同様のアプローチを使用して、他の免疫細胞、例えば、好酸球（マーカー：ＣＤ３５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６６、ＣＤ６９、及びＣＤ８１）、樹状細胞（マーカー：ＩＬ－８、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６）、好塩基球（ＣＤ６３、ＣＤ１３、ＣＤ４、及びＣＤ２０３ｃ）、及び好中球（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３５、ＣＤ６６ｂ、及びＣＤ６３）の活性化に対する効果を評価することができる。これらのマーカーは、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び細胞マーカーの測定を可能にする他のアッセイを使用して評価することができる。免疫原の投与前後の結果の比較を使用して、その効果を判断することができる。

【0080】

本明細書で使用されるとき、「免疫応答を誘発する」という用語は、対象による免疫応答を開始すること、増幅すること、又は維持することを指す。免疫応答の誘発は、適応免疫応答又は自然免疫応答を指し得る。免疫応答の誘発は、上記のように測定することができる。

【0081】

本明細書で使用されるとき、「線状対応物」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）を有し、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。いくつかの実施形態では、線状対応物（例えば、環状化前の型）は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）及び同じ又は類似の核酸修飾を有し、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。いくつかの実施形態では、線状対応物は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）及び異なる核酸修飾を有するか、又は環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）を有するが核酸修飾を有しておらず、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。いくつかの実施形態では、線状対応物であるポリリボヌクレオチド分子の断片は、線状対応物ポリリボヌクレオチド分子よりも短い線状対応物ポリリボヌクレオチド分子の任意の部分である。いくつかの実施形態では、線状対応物は、５’キャップをさらに含む。いくつかの実施形態では、線状対応物は、ポリアデノシン尾部をさらに含む。いくつかの実施形態では、線状対応物は、３’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態では、線状対応物は、５’ＵＴＲをさらに含む。

【0082】

本明細書で使用されるとき、「線状ＲＮＡ」又は「線状ポリリボヌクレオチド」又は「線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。５’末端及び３’末端の一方又は両方は、遊離末端であってもよいし、又は別の部分に結合していてもよい。線状ＲＮＡは、環状化されていない（例えば、事前に環状化されていない）ＲＮＡを含み、例えば、スプリントライゲーション、又は化学的、酵素的、リボザイム又はスプライシング触媒による環状化法による環状化のための出発物質として使用することができる。

【0083】

本明細書で使用されるとき、「混合物」という用語は、混合された２つ以上の異なる物質からなる材料を意味する。場合によっては、本明細書に記載の混合物は、２つ以上の異なる物質の均一な混合物であり得、例えば、混合物は、混合物の任意の所与のサンプル全体で、その成分（例えば、２つ以上の物質）が同じ割合を有し得る。場合によっては、本明細書で提供される混合物は、２つ以上の異なる物質の不均一な混合物であり得、例えば、混合物の成分（例えば、２つ以上の物質）の割合は、混合物全体で異なり得る。場合によっては、混合物は溶液であり、例えば、混合物は液相で存在する。場合によっては、液体溶液は、液体溶媒及び溶質を含むと見なすことができる。溶質を液体溶媒に混合することは、「溶解」プロセスと呼ぶことができる。場合によっては、液体溶液は、液体中に液体を含む溶液（例えば、液体溶媒に溶解した液体溶質）、液体中に固体を含む溶液（例えば、液体溶媒に溶解した固体溶質）、又は液体中に気体を含む溶液（例えば、液体溶媒に溶解した固体溶質）である。場合によっては、複数の溶媒及び／又は複数の溶質が存在する。場合によっては、混合物は、コロイド、液体懸濁液、又はエマルジョンである。場合によっては、混合物は固体混合物であり、例えば、混合物は固相で存在する。

【0084】

本明細書で使用されるとき、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合に対して少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを意味する。

【0085】

本明細書で使用されるとき、「裸の送達」という用語は、担体の助けを借りず、細胞への送達を助ける部分への共有結合修飾も使用しない、細胞への送達のための製剤を意味する。裸の送達製剤には、トランスフェクション試薬、カチオン担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のいずれも含まれない。例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの裸の送達製剤は、共有結合修飾なしで環状又は線状ポリリボヌクレオチドを含み、担体を含まない製剤である。

【0086】

本明細書で使用されるとき、「ニックＲＮＡ」又は「ニック線状ポリリボヌクレオチド」又は「ニック線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、環状ＲＮＡの切断又は分解から生じる５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。

【0087】

本明細書で使用されるとき、「非環状ＲＮＡ」という用語は、全ニックＲＮＡ及び線状ＲＮＡを意味する。

【0088】

「～によって入手可能」又は「～によって製造可能」などの用語は、請求項又は実施形態が、化合物、組成物、製品それ自体などを指すこと、即ち、化合物、組成物、製品などが、化合物、組成物、製品などの製造について記載されている方法によって入手又は製造できるが、化合物、組成物、製品などは、記載された方法以外の方法によっても入手又は製造できることを示すために使用される。「～によって得られた」又は「～によって製造された」などの用語は、化合物、組成物、製品が列挙された特定の方法によって得られるか、又は製造されることを示す。「～によって入手可能」及び「～によって製造可能」などの用語はまた、「～によって入手可能」及び「～によって製造可能」などの用語を、「～によって入手可能」及び「～によって製造可能」などの好ましい実施形態として開示していることを理解されたい。

【0089】

本明細書で使用されるとき、「病原体」という用語は、例えば、対象に直接感染することによって、対象に疾患又は疾患の徴候を引き起こす病原体を産生することによって、及び／又は対象の免疫応答を引き出すことによって、対象に疾患又は疾患の徴候を引き起こす感染性病原体を指す。本明細書で使用されるとき、病原体には、限定されるものではないが、細菌、原生動物、寄生虫、真菌、線虫、昆虫、ウイロイド、及びウイルス、又はそれらの任意の組み合わせが含まれ、各病原体は、単独で又は別の病原体と協調して対象に疾患又は徴候を引き出すことができる。

【0090】

本明細書で使用されるとき、「ペイロード」という用語は、本明細書で開示されるポリリボヌクレオチドによって送達される任意の分子を意味する。場合によっては、ペイロードは、核酸、タンパク質、化学物質、リボ核タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせである。場合によっては、ペイロードは、本明細書に開示されるポリリボヌクレオチド内に直接含まれる核酸配列である。場合によっては、ペイロードは、例えば、相補的ハイブリダイゼーションを介して、又はタンパク質－核酸相互作用を介して、本明細書に開示されるポリリボヌクレオチドに結合又は会合する。特定の場合には、ペイロードは、ポリリボヌクレオチド内に含まれる、ポリリボヌクレオチドに結合した、又はポリリボヌクレオチドに会合した核酸配列によってコードされるタンパク質である。場合によっては、「結合」は、２つの分子間の共有結合又は非共有相互作用を意味する。場合によっては、ペイロードとポリリボヌクレオチドとの間の相互作用の文脈で使用される場合の「会合」は、ペイロードが、それらの間の１つ又は複数の他の分子を介してポリリボヌクレオチドに間接的に連結されていることを意味する。場合によっては、結合又は会合が一時的であり得る。場合によっては、ペイロードは、ある条件下ではポリリボヌクレオチドに結合又は会合するが、別の条件下では結合又は会合せず、例えば、周囲のｐＨ条件又は刺激若しくは結合パートナーの存在若しくは非存在に応じてである。

【0091】

「医薬組成物」という用語は、医薬組成物内に含まれる環状又は線状ポリリボヌクレオチドを、療法によるヒト又は動物の体の処置に使用できることを開示することも意図している。したがって、医薬組成物は、「療法に使用するための環状又は線状ポリリボヌクレオチド」と等価であることを意味する。

【0092】

本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つ又は複数の核酸サブユニット又はヌクレオチドを含む分子を意味し、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用することができる。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、又はそれらの変異体から選択される１つ又は複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、ヌクレオシド及び少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸（ＰＯ_３）基を含み得る。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボースのいずれか）、及び１つ又は複数のリン酸基を含み得る。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。ポリリボヌクレオチド又はリボ核酸、又はＲＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のリボヌクレオチドを含む高分子を指し得る。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。

【0093】

ポリデオキシリボヌクレオチド又はデオキシリボ核酸、又はＤＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のデオキシリボヌクレオチドを含む高分子を意味する。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、発光タグやマーカーなどの検出可能なタグ（例えば、フルオロフォア）を含む、例えば、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰから選択することができるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシドポリリン酸を意味する。ヌクレオチドは、成長する核酸鎖に組み込むことができる任意のサブユニットを含み得る。このようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ、或いは、１つ又は複数の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵに特異的であるか、又はプリン（即ち、Ａ又はＧ、又はその変異体）若しくはピリミジン（即ち、Ｃ、Ｔ、又はＵ、又はその変異体）に相補的な任意の他のサブユニットであり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの誘導体若しくは変異体である。場合によっては、ポリヌクレオチドは、いくつか例を挙げると、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）であり、ヌクレオチド配列、及び一本鎖、二本鎖、三本鎖、らせん、ヘアピンなどのその任意の構造的実施形態の両方を包含する。場合によっては、ポリヌクレオチド分子は環状である。ポリヌクレオチドは、様々な長さを有し得る。核酸分子は、少なくとも約１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１キロ塩基（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、又はそれ以上の長さを有し得る。ポリヌクレオチドは、細胞又は組織から単離することができる。本明細書で具体化されるように、ポリヌクレオチド配列は、単離及び精製されたＤＮＡ／ＲＮＡ分子、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及び合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体を含み得る。

【0094】

ポリヌクレオチド、例えば、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及び／又は修飾ヌクレオチドを含む１つ又は複数のヌクレオチド変異体を含み得る。修飾ヌクレオチドの例には、限定されるものではないが、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｄ４６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリンなどが含まれる。場合によっては、ヌクレオチドは、三リン酸部分への修飾を含む、それらのリン酸部分の修飾を含み得る。そのような修飾の非限定的な例としては、より長いリン酸鎖（例えば、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）及びチオール部分の修飾（例えば、α－チオ三リン酸及びβ－チオ三リン酸）が挙げられる。核酸分子はまた、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で（例えば、典型的には相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成するのに利用できる１つ又は複数の原子で、及び／又は典型的には相補的なヌクレオチドとの水素結合を形成できない１つ又は複数の原子で）修飾され得る。核酸分子はまた、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性部分の共有結合を可能にするために、アミノアリル（ａｍｉｎｏ ａｌｌｙ １）－ｄＵＴＰ（ａａ－ｄＵＴＰ）及びアミノヘキシルアクリルアミド－ｄＣＴＰ（ａｈａ－ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含み得る。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対又はＲＮＡ塩基対の代替物は、高い１立方ｍｍ当たりのビット密度、より高い安全性（天然毒素の偶発的又は意図的な合成に対する耐性）、光プログラムされたポリメラーゼにおけるより容易な識別、又は下位二次構造を提供し得る。デノボ及び／又は増幅合成のための天然及び突然変異ポリメラーゼと適合するそのような代替塩基対は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｔｚ Ｋ，Ｍａｌｙｓｈｅｖ ＤＡ，Ｌａｖｅｒｇｎｅ Ｔ，Ｗｅｌｔｅ Ｗ，Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ Ｋ，Ｄｗｙｅｒ ＴＪ，Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ Ｐ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ ＦＥ，Ｍａｒｘ Ａ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ；８（７）：６１２－４に記載されている。

【0095】

本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基（天然又は非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、それらの断片及び他の同等物、変異体、及び類似体が含まれ得る。ポリペプチドは、単一分子であってもよいし、又は二量体、三量体、若しくは四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、単鎖、又は抗体若しくはインスリンなどの多重鎖ポリペプチドを含み得、会合又は連結され得る。最も一般的なジスルフィド結合は、多重鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用することができる。

【0096】

本明細書で使用されるとき、「予防する」という用語は、疾患、障害、又は症状が発生する可能性を低減すること、或いは、その後に発生する疾患又は障害の重症度を軽減することを意味する。治療剤は、疾患又は症状の発生を予防する、又はその重症度を軽減するために、一般集団のメンバーと比較して疾患又は障害が発生するリスクが高い対象に投与することができる。治療剤は、予防として、例えば、疾患又は障害の徴候又は発現の発生の前に投与することができる。

【0097】

本明細書で使用されるとき、「疑似らせん状構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部がらせん構造に折り畳まれている。

【0098】

本明細書で使用されるとき、「疑似二本鎖二次構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部が内部二本鎖を形成している。

【0099】

本明細書で使用されるとき、「調節要素」という用語は、環状又は線状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を変更する、核酸配列などの部分である。

【0100】

本明細書で使用されるとき、「反復ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのストレッチ内又はゲノム全体内の反復核酸配列である。いくつかの実施形態では、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＴＧ（ＵＧ）配列を含む。いくつかの実施形態では、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリーに反復配列を含む。

【0101】

本明細書で使用されるとき、「複製要素」という用語は、複製に有用であるか、又は環状ポリリボヌクレオチドの転写を開始する配列及び／又はモチーフである。

【0102】

本明細書で使用されるとき、対象の体の「表面積」という用語は、対象の体を外部環境に曝露するか、又は曝露する可能性がある対象の任意の領域を意味する。対象の体、例えば哺乳類の体、例えば、ヒトの体の表面積は、皮膚、口腔、鼻腔、耳腔、胃腸管、気道、膣、子宮頸部、子宮内、尿路、及び眼の表面積を含み得る。場合によっては、対象の体の表面積は、多くの場合、上皮細胞が並んでいる外側の領域を指し得る。例えば、皮膚は、本明細書で論じられる表面積の一種であり得、表皮及び真皮から構成され得る。表皮は、皮膚の最外層を形成し、他の多くの種類の細胞のうち上皮細胞の有機集合体を含み得る。

【0103】

本明細書で使用されるとき、「スタガー要素（ｓｔａｇｇｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）」という用語は、翻訳中にリボソームの休止を誘導するヌクレオチド配列などの部分である。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、強力なαヘリックス傾向の後にコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐが続くアミノ酸の非保存配列であり、ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、グリセロールなどの化学的部分、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0104】

本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」という用語は、生物学的、化学的、物理的、及び／又は薬理学的効果を誘発するのに必要なレベルよりも低い、組成物、調製物、又は製品、又はそれらの任意の中間体中の成分のレベルである。いくつかの実施形態では、組成物、調製物、又は製品は、成分のレベルが微量のみ検出可能である場合、又は関連する検出技術（例えば、クロマトグラフィー（カラムを使用する、紙を使用する、ゲルを使用する、ＨＰＬＣを使用する、ＵＨＰＬＣを使用するなど、又はＩＣによって、ＳＥＣによって、逆相によって、アニオン交換によって、混合モードによってなど）又は電気泳動（ＵＲＥＡ ＰＡＧＥ、チップベース、ポリアクリルアミドゲル、ＲＮＡ、キャピラリー、ｃ－ＩＥＦなど）（そのレベルが、質量分析、紫外可視、蛍光、光散乱、屈折率に基づく検出技術又は検出に銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を使用する検出技術を使用する分離前若しくは分離後の誘導体化法を用いる若しくは用いない）により検出可能なレベル未満である場合、成分を実質的に含まない。別法では、組成物、調製物、又は製品が成分を実質的に含むか含まないかは、質量分析による、顕微鏡法による、円偏光二色性（ＣＤ）分光法による、ＵＶ若しくはＵＶ－ｖｉｓ分光測光法による、蛍光分析（例えば、Ｑｕｂｉｔ）による、ＲＮアーゼＨ分析による、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、又は検出に銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を利用する方法による分離技術を使用しないで決定することができる。

【0105】

本明細書で使用されるとき、「実質的に耐性である」という用語は、参照と比較して、エフェクターに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の耐性を有する耐性である。

【0106】

本明細書で使用されるとき、「滅菌剤」という用語は、静菌性、殺菌性であり、且つ／又は微生物を積極的に殺す、微生物を不活性化する、又は微生物の増殖を防止する任意の作用物質を意味する。微生物を殺す滅菌剤は、抗菌剤及び／又は防腐剤であり得る。いくつかの実施形態では、滅菌剤は、アルコール、ヨウ素、又は過酸化水素などの液体である。いくつかの実施形態では、滅菌剤は、ＵＶ光又はレーザー光である。いくつかの実施形態では、滅菌剤は、電気的に、又は他の手段（例えば、蒸気、接触）を介して送達される熱である。

【0107】

本明細書で使用されるとき、「化学量論的翻訳」という用語は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドから翻訳された発現産物の実質的に同等の産生である。例えば、２つの発現配列を有する環状又は線状ポリリボヌクレオチドの場合、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの化学量論的翻訳は、２つの発現配列の発現産物が、実質的に等量を有し、例えば、２つの発現配列間の量（例えば、モル分子量）の差が、約０、又は１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１５％未満、又は２０％未満、又は任意のそれらの間のパーセンテージ未満であり得ることを意味する。

【0108】

本明細書で使用されるとき、「全身送達」又は「全身投与」という用語は、循環系（例えば、血液系又はリンパ系）への医薬組成物又は他の物質の投与経路を意味する。全身投与には、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、経皮投与、又はそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。本明細書で使用されるとき、「非全身送達」又は「非全身投与」という用語は、医薬組成物又は他の物質の全身送達以外の任意の他の投与経路を指すことがあり、例えば、送達される物質は、対象の体の循環系（例えば、血液系及びリンパ系）に入らない。

【0109】

本明細書で使用されるとき、「配列同一性」という用語は、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用して２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定される。したがって、配列は、それらが（デフォルトパラメータを使用して、例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列された場合）少なくとも特定の最小パーセンテージの配列同一性を共有する場合、「実質的に同一」又は「本質的に類似」と呼ぶことができる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長にわたって整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般に、ギャップ作成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ拡張ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰのデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトのスコア行列は、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、デフォルトのスコア行列は、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ ８９，９１５－９１９）。配列アラインメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３又はＥｍｂｏｓｓＷｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１０．０（プログラム「針」を使用）などのコンピュータープログラムを使用して決定することができる。別法又はこれに加えて、パーセント同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用してデータベースで検索することによって決定することができる。配列同一性は、配列の全長にわたる配列同一性を指す。

【0110】

「シグナル配列」は、ポリペプチド配列を分泌経路にターゲティングする新生タンパク質のポリペプチド配列のＮ末端に存在する、例えば、１０～３０のアミノ酸長のポリペプチド配列を指す。

【0111】

本明細書で使用されるとき、「標的」という用語は、１つ又は複数のエピトープを含む任意の実体を指す。例えば、標的は、化学的部分、分子の一部、分子（例えば、アレルゲン若しくは毒素）、高分子（例えば、ポリペプチド、核酸、若しくは炭水化物）、高分子（例えば、リン酸化、グリコシル化、アシル化、アルキル化などの高分子）の翻訳後の修飾状態、高次高分子構造（例えば、２つ以上のポリペプチドの複合体）、細胞（例えば、癌細胞）、細胞の一部（例えば、腫瘍抗原）、細胞表面の受容体、病原体（例えば、ウイルス又はウイルスの一部；細菌若しくは細菌の一部；真菌若しくは真菌の一部；又は寄生虫若しくは寄生虫の一部）、又は組織型であり得る。

【0112】

本明細書で使用されるとき、「処置する」又は「処置すること」という用語は、対象の疾患又は障害（例えば、感染症、癌、毒性、又はアレルギー反応）の治療的処置を指す。処置の効果には、疾患又は疾患若しくは障害の１つ若しくは複数の徴候若しくは発現の逆転、軽減、重症度の軽減、治癒、進行の阻害、再発の可能性の低減、疾患又は障害の状態の安定化（即ち、悪化しないこと）、及び／又は治療的処置がない場合の疾患又は障害の状態及び／又は症状と比較して、疾患又は障害の蔓延の防止が含まれ得る。

【0113】

本明細書で使用されるとき、「終結要素」という用語は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにおける発現配列の翻訳を終結させる核酸配列などの部分である。

【0114】

本明細書で使用されるとき、「局所送達」という用語は、皮膚又は非侵襲的な手段で到達可能な上皮層、例えば、腸及び他の胃腸（ＧＩ）上皮若しくは膣上皮への物質の送達を意味する。医薬組成物の局所送達は、対象に局所的薬力学的効果を及ぼすことができ、例えば、局所的に送達される医薬組成物は、医薬組成物が送達される体の特定の部位（例えば皮膚）に又はそれに近接して薬力学的効果を及ぼす。いくつかの他の実施形態では、本明細書で考察するとおりの医薬組成物の局所送達は、送達様式のみを指して用いられ（例えば、具体的な表面積へと局所的に）、一方、医薬組成物は、局所的又は全身性のいずれの薬力学的効果も及ぼし得る。例えば、医薬組成物は、投与部位に又はそれに近接して局所的に留まることもでき、又は対象身体の循環系（例えば、血液又はリンパ系）に入り、それを通じて典型的には医薬組成物が循環系以外の経路では到達不可能な身体の遠隔部位に医薬組成物を輸送することもできる。

【0115】

本明細書において使用される際、「総リボヌクレオチド分子」という用語は、リボヌクレオチド分子の総量によって測定される際、線状ポリリボヌクレオチド分子、環状ポリリボヌクレオチド分子、モノマーリボヌクレオチド、他のポリリボヌクレオチド分子、そのフラグメント、及びその修飾形態を含むいずれかのリボヌクレオチド分子の総量を意味する。

【0116】

本明細書において使用される際、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質又はペプチド産生の速度又は量である。ある実施形態では、翻訳効率は、例えば、所与の翻訳系、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物のようなインビトロ翻訳系において、又は真核細胞若しくは原核細胞のようなインビボ翻訳系において、例えば所与の期間で、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当たりで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。

【0117】

本明細書で使用されるとき、「翻訳開始配列」という用語は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにおける発現配列の翻訳を開始させる核酸配列である。

【図面の簡単な説明】

【0118】

【図1A】図１Ａ～１Ｂは、各発現配列が免疫原又はアジュバントのいずれかをコードする２つの発現配列を含む例示的環状ＲＮＡの概略図である。図１Ａは、各ＯＲＦが発現配列をコードする２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む環状ポリリボヌクレオチドを示し、ここで各ＯＲＦは、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。図１Ｂは、全てＩＲＥＳに作動可能に連結されている、２Ａ配列によって分離されている２つの発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを示す。

【図1B】図１Ａ～１Ｂは、各発現配列が免疫原又はアジュバントのいずれかをコードする２つの発現配列を含む例示的環状ＲＮＡの概略図である。

【図2】免疫原及びポリヌクレオチドアジュバント配列（例えば、自然免疫系を刺激するヌクレオチド配列）をコードするＯＲＦを含む環状ＲＮＡの概略図を示す。

【図3】複数のポリリボヌクレオチドの概略図を示し、ここで各ポリヌクレオチドは、免疫原又はアジュバントのいずれかをコードするＯＲＦを含む。

【図4】図４は、ＢＪ線維芽細胞及びＨｅＬａ細胞では検出されるが、ビヒクル対照を含むＢＪ線維芽細胞及びＨｅＬａ細胞では検出されなかった環状ＲＮＡによってコードされるＲＢＤ免疫原を示す。

【図5】マウスモデルにおいて、カチオン性ポリマー（例えば、プロタミン）と共に配合された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡの投与後に、持続的抗ＲＢＤ抗体応答が得られたことを示す。

【図6】マウスモデルにおいて、カチオン性ポリマー（例えば、プロタミン）と共に配合された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡの投与後に、抗スパイク応答が得られたことを示す。

【図7】マウスモデルにおいて、カチオン性ポリマー（例えば、プロタミン）と共に配合された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ抗原をコードする環状ＲＮＡの投与後に得られた抗ＲＢＤ ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１アイソタイプレベルを示す。

【図8】環状ＲＮＡ製剤（Ｔｒａｎｓ－ＩＴ配合、プロタミン配合、非配合）、プロタミンビヒクルのみの筋肉内注射後、及び非注射対照マウスの、長期間にわたるインビボでの環状ＲＮＡからのタンパク質発現を示す。

【図9】（ｉ）非配合環状ＲＮＡ製剤（左側のグラフ）、（ｉｉ）ＴｒａｎｓＩＴと共に配合された環状ＲＮＡ（真ん中のグラフ）、及び（ｉｉｉ）プロタミンと共に配合された環状ＲＮＡ（右側のグラフ）との、Ａｄｄａｖａｘ（商標）アジュバントの同時筋肉内送達後の、長期間にわたるインビボでの環状ＲＮＡからのタンパク質発現を示す。それぞれの場合、Ａｄｄａｖａｘ（商標）アジュバントを、０及び２４時間の時点で個々の注射として送達した。

【図10】（ｉ）プロタミンと共に配合された環状ＲＮＡ、（ｉｉ）２４時間の時点でのＡｄｄａｖａｘ（商標）アジュバントの注射と共に、プロタミンと共に配合された環状ＲＮＡ、（ｉｉｉ）プロタミンビヒクルのみの皮内送達後、及び（ｉｖ）非注射対照マウスの、長期間にわたるインビボでの環状ＲＮＡからのタンパク質発現を示す。

【図11】図１１は、プローブの環状及び線状ＲＮＡへの結合、及びその後のＲＮアーゼＨによるＲＮＡの分解を示す。環状ＲＮＡは、複数のバンドとして検出される線状及び鎖状ＲＮＡと比較して単一の切断された線状バンドとして検出される。分解は、変性ポリアクリルアミドゲルでサンプルを泳動させて、ＲＮアーゼＨを添加した場合と添加しない場合の分解バンドを比較することによって検出された。

【図12】線状ＲＮＡバンド強度を線状ＲＮＡ標準と比較することによって変性ポリアクリルアミドゲル上で定量化した線状ＲＮＡ含量を示す。

【図13】変性ポリアクリルアミドゲルの異なるバンドから抽出したＲＮＡの定量化を示す。

【図14】８４％純度の環状ＲＮＡ、７１％純度の環状ＲＮＡ、及びビヒクルのみを使用した実験におけるトランスフェクション後６、２４、４８、７２、９６、及び１２０時間の細胞のガウシアルシフェラーゼ活性を示す。

【図15】ゲル精製後の環状ＲＮＡ調製物のみをトランスフェクトした細胞が、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＯＡＳ、及びＩＦＮ－Ｂなどの自然免疫遺伝子の発現を最小限しか示さなかったのと比較して、環状ＲＮＡと対応する線状ＲＮＡとを両方組み合わせてトランスフェクトした細胞は、これらの自然免疫遺伝子の用量依存的な上方制御を呈したことを示す。

【図16】スタガー要素を有する環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡからの発現産物のタンパク質ブロットを示す画像である。

【図17】自己スプライシングによる例示的環状ＲＮＡの生成を示す。

【図18】例示的線状ＲＮＡ及び環状ＲＮＡの両方をマウスの耳皮膚に局所的に送達し、送達期間後６時間から３日までにわたる耳組織のそれらのＲＮＡレベルを調べた例を示す。

【図19】図１９Ａおよび１９Ｂは、ブースト（エタノール）の助けを借りた線状又は環状ＲＮＡの局所送達後６時間、１日、３日、又は１２日におけるマウスの耳パンチからのｑＰＣＲ結果を要約するプロットである。図１９Ａは、線状ＲＮＡ及び環状ＲＮＡの両方の検出用のプライマーを使用したｑＰＣＲアッセイの結果を示す。図１９Ｂは、環状ＲＮＡの検出用の、しかし線状ＲＮＡの検出用ではないプライマーを使用したｑＰＣＲアッセイの結果を示す。

【図20】組織へのＲＮＡ送達におけるｃｉｒｃＲＮＡ－Ｃｙ５の局所投与結果からの蛍光像（Ｂ／Ｗ）を示す。

【図21】組織へのＲＮＡ送達におけるｃｉｒｃＲＮＡ－Ｃｙ５の局所投与結果からの蛍光像の定量化を示す。

【図22】適用前に組織をエタノールワイプで拭き取ったときの投与後１日目及び４日目の組織へのＲＮＡ送達における環状ＲＮＡの局所投与結果を示す。

【図23】適用前に組織をイソプロピルアルコールワイプで拭き取ったときの投与後１日目及び４日目の組織へのＲＮＡ送達における環状ＲＮＡの局所投与結果を示す。

【図24】ｃｉｒｃＲＮＡを１０％エタノールを伴い投与したときの組織へのＲＮＡ送達におけるｃｉｒｃＲＮＡの局所投与結果を示す。

【図25】図２５は、環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡからの発現産物のタンパク質のブロットを示す画像である。

【図26】図２６は、線状ポリリボヌクレオチド対応物（「線状」）と比較した環状ポリリボヌクレオチド（「末端なし」）の再投与後のマウスにおけるガウシアルシフェラーゼ発現の持続性の増加を実証する実験データを示す。

【図27】図２７は、線状ポリリボヌクレオチド対応物のずらした投与（「線状の３回投与」）、又は環状ポリリボヌクレオチド（「末端なし」）の単回投与、又は線状ポリリボヌクレオチド対応物（「線状」）の単回投与と比較した、環状ポリリボヌクレオチドのずらした投与（末端なしの３回投与」）後のマウスにおけるガウシアルシフェラーゼ発現の持続性の増加を実証する実験データを示す。

【図28】図２８は、線状ポリリボヌクレオチド対応物（「線状ＲＮＡ」）の単回投与と比較した環状ポリリボヌクレオチド（「末端なしＲＮＡ」）の単回投与、単回投与（「線状ＲＮＡ」）と比較した線状ポリリボヌクレオチド対応物のずらした投与（「線状ＲＮＡの３回投与」）、又は単回投与（「末端なしＲＮＡ」）と比較した環状ポリリボヌクレオチドのずらした投与（「末端なしＲＮＡの３回投与」）後のマウスにおけるガウシアルシフェラーゼ発現の持続性の増加を実証する実験データを示す。

【図29】図２９は、担体なしで筋肉内に投与された環状ポリリボヌクレオチドが長期間インビボでタンパク質を発現し、注射後数日での血漿中のタンパク質活性のレベルを示す。

【図30】図３０は、静脈内投与された環状ポリリボヌクレオチドが長期間インビボでタンパク質を発現し、注射後数日での血漿中のタンパク質活性のレベル、及び少なくとも５回再投与できたことを示す。

【図31A】環状ポリリボヌクレオチドからの複数の免疫原発現を示す。ＲＤ免疫原発現が、ＳＡＲＳｓ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びＧＬｕｃポリペプチドをコードする環状ＲＮＡから検出された。

【図31B】環状ポリリボヌクレオチドからの複数の免疫原発現を示す。ＧＬｕｃ活性が、ＳＡＲＳｓ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びＧＬｕｃポリペプチドをコードする環状ＲＮＡから検出された。

【図32A】マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの複数の免疫原の免疫原性を示す。マウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第１の環状ＲＮＡ及びＧＬｕｃポリペプチドをコードする第２の環状ＲＮＡを接種した。抗ＲＢＤ抗体が、注射の１７日後の時点で得られた。

【図32B】マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの複数の免疫原の免疫原性を示す。マウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第１の環状ＲＮＡ及びＧＬｕｃポリペプチドをコードする第２の環状ＲＮＡを接種した。ＧＬｕｃ活性が、注射の２日後の時点で検出された。

【図33A】マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの複数の免疫原の免疫原性を示す。マウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第１の環状ＲＮＡ及びインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡを接種した。抗ＲＢＤ抗体が、注射の１７日後の時点で得られた。

【図33B】マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの複数の免疫原の免疫原性を示す。マウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第１の環状ＲＮＡ及びインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡを接種した。抗ＨＡ抗体が、注射の１７日後の時点で得られた。

【図34A】マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの複数の免疫原の免疫原性を示す。マウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原をコードする第１の環状ＲＮＡ及びインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡを接種した。抗ＲＢＤ（スパイクのドメイン）抗体が、注射の１７日後の時点で得られた。

【図34B】マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの複数の免疫原の免疫原性を示す。マウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原をコードする第１の環状ＲＮＡ及びインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡを接種した。抗ＨＡ抗体が、注射の１７日後の時点で得られた。

【図35】複数の免疫原をコードする環状ＲＮＡを投与されたマウスにおける抗ＨＡ抗体応答を実証する。マウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原、インフルエンザＨＡ免疫原、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びインフルエンザＨＡ免疫原、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びＧＬｕｃポリペプチド、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原をコードする環状ＲＮＡを投与した。赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）を用いて、抗インフルエンザＨＡ抗体を測定した。図２４は、それが単独で投与された場合又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原、例えばＲＢＤ又はスパイクと組み合わせて投与された場合の、インフルエンザＨＡ免疫原をコードする環状ＲＮＡ製剤を投与されたサンプルにおけるＨＡＩ力価を示す。

【図36】（ｉ）Ｇｌｕｃポリペプチドをコードする環状ＲＮＡ、又は（ｉｉ）Ｇｌｕｃポリペプチドをコードする第１の環状ＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡとの組み合わせ、又は（ｉｉｉ）Ｇｌｕｃポリペプチド及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原の両方をコードする環状ＲＮＡでプライミングした２日後のマウスのガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）活性を示す。

【図37A】（ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ、又は（ｉｉ）Ｇｌｕｃポリペプチドをコードする第１の環状ＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡとの組み合わせ、又は（ｉｉｉ）Ｇｌｕｃポリペプチド及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原の両方をコードする環状ＲＮＡでプライミングした１４日後のマウスの抗ＲＢＤ抗体応答を示す。

【図37B】プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって評価したときの、（ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ、又は（ｉｉ）Ｇｌｕｃポリペプチドをコードする第１の環状ＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡとの組み合わせ、又は（ｉｉｉ）Ｇｌｕｃポリペプチド及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原の両方をコードする環状ＲＮＡを投与したマウスにおける抗ＲＢＤ中和抗体を示す。

【図38】Ｇｌｕｃポリペプチド及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡが、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより決定したとき、ＲＢＤ特異的Ｔ細胞応答をプライミングすることを示す。

【図39】ＩＬ－１２が、ＩＬ－１２特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定して、哺乳類細胞で環状ＲＮＡから発現したことを示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡを陰性対照として含めた。

【図40A】マウスモデルにおいて、ＩＬ－１２をコードする第１の環状ＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡとを含む環状ＲＮＡ調製物を注射した２日後の血清中にＩＬ－１２発現が検出されたことを示す。ＰＢＳ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのみを含む調製物の注射を対照として含めた。

【図40B】マウスモデルにおいて、ＩＬ－１２をコードする第１の環状ＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡとを含む環状ＲＮＡ調製物を注射した２日後の血清中に血清ＩＦＮ－γ（ＩＬ１２シグナル伝達のすぐ下流）の増加が検出されたことを示す。ＰＢＳ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのみを含む調製物の注射を対照として含めた。

【図41A】ＩＬ－１２をコードする第１の環状ＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡとを含む環状ＲＮＡ調製物を投与すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数が増加したことを示す。ＰＢＳ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのみを含む調製物の投与を対照として含めた。アスタリスクは、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ保護ありチューキーの事後検定により決定したときの統計的有意性を表す。

【図41B】ＩＬ－１２をコードする第１の環状ＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡとを含む環状ＲＮＡ調製物を投与しても、ＲＢＤ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数に変化は生じなかったことを示す。ＰＢＳ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのみを含む調製物の投与を対照として含めた。

【図41C】ＩＬ－１２をコードする第１の環状ＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡとを含む環状ＲＮＡ調製物を投与すると、ＣＤ４ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生量が増加したことを示す。ＰＢＳ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのみを含む調製物の投与を対照として含めた。アスタリスクは、対応のないｔ検定により決定したときの統計的有意性を表す。

【図41D】ＩＬ－１２をコードする第１の環状ＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする第２の環状ＲＮＡとを含む環状ＲＮＡ調製物を投与すると、ＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生量が増加したことを示す。ＰＢＳ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのみを含む調製物の投与を対照として含めた。アスタリスクは、対応のないｔ検定により決定したときの統計的有意性を表す。

【図42】オボアルブミン（ＯＶＡ）を発現する環状ＲＮＡをＩＬ１２を発現する環状ＲＮＡと組み合わせると、対照（ＯＶＡのみを発現する環状ＲＮＡ）と比較したとき、より強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答が誘導されることを示す。これは、ＩＬ１２を発現する環状ＲＮＡがアジュバントとして作用することを実証している。

【発明を実施するための形態】

【0119】

本開示は、１つ又は複数のポリペプチド免疫原をコードする環状又は線状ポリリボヌクレオチドの組成物及び医薬調製物並びにその使用を提供する。詳細には、本開示は、複数の免疫原をコードする環状又は線状ポリリボヌクレオチド、少なくとも１つの免疫原をコードし、少なくとも１つのアジュバントをさらにコードする環状又は線状ポリリボヌクレオチド、及び複数の環状又は線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。本開示は、１つ又は複数の免疫原をコードする１つ又は複数の環状又は線状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物及び医薬調製物をさらに特徴とする。本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチドの組成物及び医薬調製物は、投与時に対象において免疫応答を誘発し得る。本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチドの組成物及び医薬調製物は、対象における疾患、障害、又は症状を処置又は予防するために使用することができる。

【0120】

ポリリボヌクレオチド
ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載の１つ又は複数の免疫原に加えて、以下に記載の要素も含む。特定の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドである。

【0121】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。

【0122】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、リボソームの結合部位を収容するのに十分なサイズであり得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、環状ポリリボヌクレオチドを生成する、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用する技術的制約の範囲内の大きさであり得る。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントをＤＮＡから生成し、それらの５’及び３’遊離末端をアニールしてＲＮＡの「ストリング」を生成することが可能であり、これが最終的に環状化して、１つの５遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残り得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングして標的に送達する能力によって制限され得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、本開示の免疫原又はそのエピトープなどの有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって、少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド、又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、又は少なくとも７０ヌクレオチドの長さが有用であり得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、１つ又は複数（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、及び５つ以上）の免疫原をコードするのに十分な長さである。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、２～５（例えば、３つ、４つ、及び５つ）の免疫原をコードするのに十分な長さである。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、免疫原及びアジュバントをコードするのに十分な長さである。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、１つ又は複数の免疫原（例えば、２つ以上、３つ以上、及び４つ以上）及び１つ又は複数のアジュバント（例えば、２つ以上、３つ以上、及び４つ以上）をコードするのに十分な長さである。

【0123】

環状ポリリボヌクレオチド要素
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原をコードする配列を含むことに加えて、本明細書に記載の要素の１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いているか、遊離３’末端を欠いているか、ＲＮＡポリメラーゼ認識モチーフを欠いているか、又はそれらの任意の組み合わせを欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットに開示されている任意の特徴又は特徴の任意の組み合わせを含む。

【0124】

免疫原
本明細書に記載される環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、免疫原をコードする少なくとも１つの配列を含み、任意選択で、アジュバントをコードする少なくとも１つの配列をさらに含む。免疫原には、所与の抗体又はＴ細胞受容体によって認識され、標的化され、又は結合される１つ又は複数のエピトープが含まれる。エピトープは、線状エピトープ、例えば、核酸又はアミノ酸の連続的な配列であり得る。エピトープは、立体構造エピトープ、例えば、タンパク質の折り畳まれた立体構造にエピトープを形成するアミノ酸を含むエピトープであり得る。立体構造エピトープは、一次アミノ酸配列からの不連続なアミノ酸を含み得る。別の例として、立体構造エピトープには、その二次構造又は三次構造に基づいて、免疫原性配列の折り畳まれた立体構造にエピトープを形成する核酸が含まれる。

【0125】

いくつかの実施形態では、免疫原は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、リボ核タンパク質、炭水化物（例えば、多糖）、脂質（例えば、リン脂質又はトリグリセリド）、又は核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）のすべて又は一部を含む。

【0126】

他の実施形態では、免疫原には、タンパク質免疫原又はエピトープ（例えば、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、又はリボ核タンパク質由来のペプチド免疫原又はペプチドエピトープ）が含まれる。免疫原は、アミノ酸、糖、脂質、ホスホリル、又はスルホニル基、又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0127】

特定の実施形態では、免疫原は、ポリペプチド免疫原である。

【0128】

ポリペプチド免疫原は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、ユビキチン化、リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、アミド化、ヒドロキシル化、硫酸化、又は脂質化を含み得る。

【0129】

ある実施形態では、免疫原は、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、若しくは少なくとも３０のアミノ酸、又はそれ以上のアミノ酸を含むエピトープを含む。ある実施形態では、エピトープは、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２１以下、２２以下、２３以下、２４以下、２５以下、２６以下、２７以下、２８以下、２９以下、若しくは３０以下のアミノ酸、又はそれ以下のアミノ酸を含む。ある実施形態では、エピトープは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸を含むか又は含有する。ある実施形態では、エピトープは、５個のアミノ酸を含有する。ある実施形態では、エピトープは、６個のアミノ酸を含有する。ある実施形態では、エピトープは、７個のアミノ酸を含有する。ある実施形態では、エピトープは、８個のアミノ酸を含有する。ある実施形態では、エピトープは、約８～約１１個のアミノ酸であり得る。ある実施形態では、エピトープは、約９～約２２個のアミノ酸であり得る。

【0130】

免疫原は、Ｂ細胞によって認識される免疫原、Ｔ細胞によって認識される免疫原、又はそれらの組合せを含み得る。ある実施形態では、免疫原は、Ｂ細胞によって認識される免疫原を含む。ある実施形態では、免疫原は、Ｂ細胞によって認識される免疫原である。る実施形態において、免疫原は、Ｔ細胞によって認識される免疫原を含む。ある実施形態では、免疫原は、Ｔ細胞によって認識される免疫原である。

【0131】

エピトープは、Ｂ細胞によって認識されるもの、Ｔ細胞によって認識される免疫原、又はそれらの組合せを含み得る。ある実施形態では、エピトープは、Ｂ細胞によって認識されるエピトープを含む。ある実施形態では、エピトープは、Ｂ細胞によって認識されるエピトープである。ある実施形態では、エピトープは、Ｔ細胞によって認識されるエピトープを含む。ある実施形態では、エピトープは、Ｔ細胞によって認識されるエピトープである。

【0132】

コンピュータ内で免疫原及びエピトープを同定するための技術は、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｔｒｉｎｃａｄｏ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔ－ａｎｄ Ｂ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，２０１７：２６８０１６０．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１７／２６８０１６０（２０１７））；Ｇｒｉｆｏｎｉ，Ａ，ｅｔ ａｌ．（Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｃａｎ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２７（４）：６７１－６８０（２０２０））；Ｒｕｓｓｉ ＲＣ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＰｍｐＤ：Ｆｉｒｓｔ ｓｔｅｐ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｊ．，４１（２）：１０９－１１７（２０１８））；Ｂａｒｕａｈ Ｖ，ｅｔ ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ‐ａｉｄｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ２０１９‐ｎＣｏＶ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，９２（５），ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｍｖ．２５６９８（２０２０））に開示されている。

【0133】

いくつかの実施形態では、免疫原は、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、免疫原はポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、免疫原はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、免疫原はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、免疫原はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、免疫原はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにコードされる。

【0134】

本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、様々な免疫原を含むか又はコードする。環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、又はそれ以上の免疫原を含むか又はコードする。

【0135】

ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、例えば、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、１００以下、１２０以下、１４０以下、１６０以下、１８０以下、２００以下、２５０以下、３００以下、３５０以下、４００以下、４５０以下、５００以下、又はそれ以下の免疫原を含むか又はコードする。

【0136】

ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００の免疫原を含むか又はコードする。

【0137】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１～１００の免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１～５０の免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１～１０の免疫原を含む、又はコードする；例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の免疫原をコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２つの免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、３つの免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、４つの免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、５つの免疫原を含む、又はコードする。

【0138】

いくつかの実施形態では、複数の免疫原はそれぞれ、同じ標的を同定する。別の言い方をすれば、単一の標的は、複数の免疫原のそれぞれを含み得、複数の免疫原のそれぞれは、同じ標的に由来し得、及び／又は複数の免疫原のそれぞれは、標的の一部又は全体と高度な類似性を共有し得る。例えば、標的は、細胞であり得、免疫原のそれぞれは、その細胞のタンパク質に一致し得る。例えば、標的は、特定の癌細胞であり得、免疫原のそれぞれは、その癌に関連する腫瘍抗原に一致し得る。したがって、いくつかの実施形態では、複数の免疫原のそれぞれは、同じ標的からの異なるタンパク質に由来する。

【0139】

いくつかの実施形態では、複数の免疫原は、異なる標的に由来する。いくつかの実施形態では、複数の免疫原は、所与のウイルスの様々なカプシドタンパク質に由来し得る。例えば、１つの免疫原は、オルソポックスウイルス（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）に由来し得、別の免疫原は、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）に由来し得、第３の免疫原は、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）に由来し得る。例えば、ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードし得、各免疫原は、黄熱病ウイルス、チクングンヤ熱（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、ジカ（Ｚｉｋａ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎に由来する。ポリリボヌクレオチドは、黄熱病ウイルス、チクングンヤ熱（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、ジカ（Ｚｉｋａ）、Ａ型肝炎、又はＢ型肝炎のそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。ポリリボヌクレオチドは、日本脳炎、チクングンヤ熱（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、ジカ（Ｚｉｋａ）、Ａ型肝炎、及びＢ型肝炎のそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードし得、各免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ポックスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、又はヒトパピローマウイルスに由来する。ポリリボヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ポックスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパピローマウイルスのそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードし得、各免疫原は、ヘルペスウイルス（ＣＭＶ、ＥＢＶ、又はＶＺＶ）に由来する。ポリリボヌクレオチドは、ヘルペスウイルス：ＣＭＶ、ＥＢＶ、又はＶＺＶのそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードする場合があり、各免疫原は、帯状疱疹（Ｓｉｎｇｌｅｓ）又は西ナイルウイルスに由来する。ポリリボヌクレオチドは、帯状疱疹（Ｓｈｉｎｇｌｅｓ）及び西ナイルウイルスのそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。

【0140】

いくつかの実施形態では、複数の免疫原は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、複数の免疫原はまた、１００％未満の配列同一性も有する。これは、免疫原が遺伝的浮動によって互いに近縁関係にあるとされ、そのため、単一の環状又は線状ポリリボヌクレオチド組成物又は免疫原性組成物が、集団中に様々な突然変異状態で存在する標的に対して免疫応答を誘導することが可能であり得るか、又は免疫原が遺伝的浮動によって近縁関係にあるとされるような同じ免疫原を有する複数の標的に対して免疫応答を誘導し得ることを指し示すものであり得る。例えば、免疫原は、標的ウイルスの遺伝的浮動によって互いに近縁関係にあるとされてもよい。いくつかの実施形態では、複数の免疫原は、ユニークな、しかし近縁関係にあるウイルスからの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に由来し得る。

【0141】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、免疫原の変異体をコードする。変異体は、天然に存在する変異体（例えば、異なるウイルス属、種、分離株、又は疑似種からの配列データに同定される変異体）であってもよく、又はインシリコで作成された本明細書に開示されるとおりの誘導体配列（例えば、野生型免疫原又はエピトープと比較して１つ又は複数のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する免疫原又はエピトープ）であってもよい。

【0142】

免疫原は、例えば、ウイルス表面タンパク質、ウイルス膜タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質、ウイルススパイクタンパク質、ウイルス侵入タンパク質、ウイルス膜融合タンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルス非構造タンパク質、ウイルス調節タンパク質、ウイルスアクセサリータンパク質、分泌ウイルスタンパク質、ウイルスポリメラーゼタンパク質、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルス糖タンパク質、ウイルスフソゲン、ウイルスらせんカプシドタンパク質、ウイルス正二十面体カプシドタンパク質、ウイルスマトリックスタンパク質、ウイルスレプリカーゼ、ウイルス転写因子、又はウイルス酵素などのウイルスに由来する。

【0143】

いくつかの実施形態では、免疫原は、これらのウイルスのうちの１つに由来する：
オルソミクソウイルス：有用な免疫原は、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、又はマトリックスＭ２タンパク質などのインフルエンザＡ、Ｂ、又はＣウイルスに由来し得る。免疫原がＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンである場合、この免疫原は、任意のサブタイプ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、又はＨ１６に由来し得る。

【0144】

パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科ウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ニューモウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス）、メタニューモウイルス、及びモルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）、ヘニパウイルス（例えば、ニパウイルス（Ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ））に由来するものが含まれる。

【0145】

ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）科：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、大痘瘡及び小痘瘡を含むがこれらに限定されない天然痘ウイルスなどのオルソポックスウイルスに由来するものが含まれる。

【0146】

ピコルナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルディオウイルス、及びアフトウイルスなどのピコルナウイルスに由来するものが含まれる。一実施形態では、エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば１型、２型及び／又は３型ポリオウイルスである。別の実施形態では、エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態では、エンテロウイルスは、コクサッキーＡ又はＢウイルスである。

【0147】

ブニヤウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、カリフォルニア脳炎ウイルスなどのオルソブニヤウイルス、リフトバレー熱ウイルスなどのフレボウイルス、又はクリミア・コンゴ出血熱ウイルスなどのナイロウイルスに由来するものが含まれる。

【0148】

ヘパルナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのヘパルナウイルスに由来するものが含まれる。

【0149】

フィロウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、エボラウイルス（ザイール、コートジボワール、レストン、又はスーダンエボラウイルスを含む）又はマールブルグウイルスなどのフィロウイルスに由来するものが含まれる。

【0150】

トガウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ルビウイルス、アルファウイルス、又はアルテリウイルスなどのトガウイルスに由来するものが含まれる。これには風疹ウイルスが含まれる。

【0151】

フラビウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１型、２型、３型又は４型）ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス、ジカウイルスが含まれる。

【0152】

ペスチウイルス：ウイルス性免疫原には、限定されるものではないが、ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、豚熱（ＣＳＦＶ）、又はボーダー病（ＢＤＶ）などのペスチウイルスに由来するものが含まれる。

【0153】

ヘパドナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルスに由来するものが含まれる。Ｂ型肝炎ウイルス免疫原は、Ｂ型肝炎ウイルス表面免疫原（ＨＢｓＡｇ）であり得る。

【0154】

他の肝炎ウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、又はＧ型肝炎ウイルスに由来するものが含まれる。

【0155】

ラブドウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及びベシクロウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルスに由来するものが含まれる。

【0156】

カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）などのカリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科、及びハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルスに由来するものが含まれる。

【0157】

レトロウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、腫瘍ウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１又はＨＩＶ－２）又はスプマウイルスに由来するものが含まれる。

【0158】

レオウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、オルソレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、又はコルチウイルスに由来するものが含まれる。

【0159】

パルボウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、パルボウイルスＢ１９に由来するものが含まれる。

【0160】

ボカウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ボカウイルスに由来するもの含まれる。

【0161】

ヘルペスウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ヒトヘルペスウイルス由来のもの、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１型及び２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、及びヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）が含まれる。

【0162】

パポバウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、パピローマウイルス及びポリオーマウイルスに由来するものが含まれる。（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３、又は６５、例えば、血清型６、１１、１６及び／又は１８の１つ又は複数であり得る。

【0163】

オルソハンタウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ハンタウイルスに由来するものが含まれる。

【0164】

アレナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、ルジョウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、又はホワイトウォーターアロヨウイルスに由来するものが含まれる。

【0165】

アデノウイルス：ウイルス免疫原には、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ－３６）に由来するものが含まれる。

【0166】

市中感染型呼吸器ウイルス（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓ）：ウイルス免疫原には、市中感染型呼吸器ウイルスに由来するものが含まれる。

【0167】

コロナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ＳＡＲＳコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＭＥＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、及び豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが含まれる。コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチド又はスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）であり得る。コロナウイルス免疫原はまた、エンベロープポリペプチド、膜ポリペプチド、又はヌクレオキャプシドポリペプチドであり得る。

【0168】

いくつかの実施形態では、免疫原は、サカナに感染するウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、免疫原は、サカナに感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。例えば、サカナに感染するウイルスは、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）、チャネルナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（ｓａｌｍｏｎ ｐｉｃｏｒｎａ－ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ）（アトランティックサーモンのピコルナ様ウイルスとしても知られる）、陸封サケウイルス（ｌａｎｄｌｏｃｋｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｖｉｒｕｓ）（ＬＳＶ）、アトランティックサーモンロタウイルス（ＡＳＲ）、マスストロベリー病ウイルス（ＴＳＤ）、ギンザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、又はウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）から選択される。

【0169】

いくつかの実施形態では、免疫原は、対象の宿主細胞に由来する。例えば、ウイルスの侵入を遮断する抗体は、ウイルスが侵入因子として使用する宿主細胞の成分からの免疫原又はエピトープを使用することによって生成することができる。

【0170】

免疫原は、例えば、細菌表面タンパク質、細菌膜タンパク質、細菌エンベロープタンパク質、細菌内膜タンパク質、細菌外膜タンパク質、細菌ペリプラズムタンパク質、細菌侵入タンパク質、細菌膜融合タンパク質、細菌構造タンパク質、細菌非構造タンパク質、分泌細菌タンパク質、細菌ポリメラーゼタンパク質、細菌ＤＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、細菌プロテアーゼ、細菌糖タンパク質、細菌転写因子、細菌酵素、又は細菌毒素などの細菌に由来する。

【0171】

いくつかの実施形態では、免疫原は、これらの細菌の１つから免疫応答を誘発する：ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群ストレプトコッカス（ｇｒｏｕｐ Ｂ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）又はＧＢＳとしても知られる））、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌（ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＡＳ）とも呼ばれる）；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）；表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）；梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）；リッケチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属；ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）：免疫原には、限定されるものではないが、付着因子、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、Ｈ因子結合タンパク質などの膜タンパク質が含まれ；肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；モラクセラ・カタラリース（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）：免疫原には、限定されるものではないが、百日咳毒素又はトキソイド（ＰＴ）、繊維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、パータクチン、凝集原２及び３が含まれ；破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）：典型的な免疫原は破傷風トキソイドであり；コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）：典型的な免疫原はジフテリアトキソイドであり；ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）；肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（免疫原には、限定されるものではないが、毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＡｇｇＥＣ）、びまん性付着性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＡＥＣ）、病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）、及び／又は腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が含まれる）。ＥｘＰＥＣ株には、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）及び髄膜炎／葉血症関連大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＭＮＥＣ）が含まれる。また、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）又はボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ）；レジオネラ・モフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；コクシエラ・バーネティー（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉｄ）；ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、例えば、Ｂ．アボータス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｂ．カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、Ｂ．メリテンシス（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ネオトマエ（Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ）、Ｂ．オビス（Ｂ．ｏｖｉｓ）、Ｂ．スイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、及びＢ．ピンニペディエ（Ｂ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅ）；フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ｆ．フィロミラジア（Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、及びＦ．ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）；淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；軟性下疽菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）又はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）；スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）；エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）；ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）；チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）；及びクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属が含まれる。

【0172】

免疫原は、例えば、真菌表面タンパク質、真菌膜タンパク質、真菌エンベロープタンパク質、真菌内膜タンパク質、真菌外膜タンパク質、真菌ペリプラズムタンパク質、真菌侵入タンパク質、真菌膜融合タンパク質、真菌構造タンパク質、真菌非構造タンパク質、分泌真菌タンパク質、真菌ポリメラーゼタンパク質、真菌ＤＮＡポリメラーゼ、真菌ＲＮＡポリメラーゼ、真菌プロテアーゼ、真菌糖タンパク質、真菌転写因子、真菌酵素、又は真菌毒素などの真菌に由来する。

【0173】

いくつかの実施形態では、真菌免疫原は、以下を含む皮膚糸状菌に由来する：エピデルモフィトン・フロクスム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ）、ミクロスポルム・オードウイニ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｕｄｏｕｉｎｉ）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ）、ミクロスポルム・ジストルツム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ）、ミクロスポルム・エクイヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｅｑｕｉｎｕｍ）、ミクロスポルム・ジプスム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍ）、ミクロスポルム・ナヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｎａｎｕｍ）、トリコフィトン・コンセントリクム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）、トリコフィトン・エクイナム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ）、トリコフィトン・ガリナエ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ）、トリコフィトン・ジプセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｙｐｓｅｕｍ）、トリコフィトン・メグニニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｇｎｉｎｉ）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、トリコフィトン・クインケアナム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・シェーンレイニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ）、トリコフィトン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、トリコフィトン・ベルコーサム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、Ｔ．ベルコーサムアルブム変種（Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ ｖａｒ．ａｌｂｕｍ）、ジスコイデス変種（ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ）、オクラセウム変種（ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ）、トリコフィトン・ビオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、及び／又はトリコフィトン・ファビホルメ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｆａｖｉｆｏｒｍｅ）；又はアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・シドウイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルギルス・フラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、ブラストシゾミセス・カピタツス（Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・エノラーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｏｌａｓｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ステラトイデ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・クセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｕｓｅｉ）、カンジダ・パラクセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｗｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・プソイドトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、クラドスポリウム・カリオニイ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ）、コクジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ジオトリカム・クレバタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｌａｖａｔｕｍ）、ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ミクロスポリジア（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、エンセファリトゾーン属（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ ｓｐｐ．）、セプタタ・インテスティナリス（Ｓｅｐｔａｔａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、及びエンテロシトゾーン・ビエヌーシ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉ）に由来し；あまり一般的ではないが、ブラチオーラ属（Ｂｒａｃｈｉｏｌａ ｓｐｐ）、ミクロスポリジウム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、ノセマ属（Ｎｏｓｅｍａ ｓｐｐ．）、プレイストフォラ属（Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、トラキプレイストフォラ属（Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ビッタホルマ属（Ｖｉｔｔａｆｏｒｍａ ｓｐｐ）、パラコシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ピシウム・インシディオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、ピチロスポラム・オバーレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、サッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、セドスポリウム・アピオスペルム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ）、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコスポロン・ベイゲリ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐｐ．）、フォンセケア属（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐｐ．）、ワンギエラ属（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐｐ．）、バシディオボラス属（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、コニディオボラス属（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ）、ユニケカビ属（Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｐ）、クワレケカビ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ）、クスダマカビ属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｐ）、サクセネア属（Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｓｐｐ．）、アルタナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ）、カーブラリア属（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐｐ）、ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ）、モノリニア属（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ ｓｐｐ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ）、ピソミセス属（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ）、及びクラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）に由来する。

【0174】

免疫原は、例えば、真核寄生虫表面タンパク質、真核寄生虫膜タンパク質、真核寄生虫エンベロープタンパク質、真核寄生虫侵入タンパク質、真核寄生虫膜融合タンパク質、真核寄生虫構造タンパク質、真核寄生虫非構造タンパク質、分泌型真核生物寄生虫タンパク質、真核生物寄生虫ポリメラーゼタンパク質、真核生物寄生虫ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物寄生虫ＲＮＡポリメラーゼ、真核生物寄生虫プロテアーゼ、真核生物寄生虫糖タンパク質、真核生物寄生虫転写因子、真核生物寄生虫酵素、又は真核生物寄生虫毒素に由来する。

【0175】

いくつかの実施形態では、免疫原は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、又は卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）などのプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属からの寄生虫に対する免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫原は、カリギダエ（Ｃａｌｉｇｉｄａｅ）科、特に、レペオフセイラス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ）属及びカリガス（Ｃａｌｉｇｕｓ）属の寄生虫、例えば、レペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｓ）又はカリグス・ロガークレッセイ（Ｃａｌｉｇｕｓ ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）などのウオジラミなどの寄生虫に対する免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫原は、寄生虫トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）に対する免疫応答を誘発する。

【0176】

いくつかの実施形態では、免疫原は、癌免疫原（ネオエピトープなど）である。例えば、免疫原は、急性白血病、星状細胞腫、胆管癌（ｂｉｌｉａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）（胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、骨癌、乳癌、脳幹グリオーマ、細気管支肺胞細胞肺癌、副腎癌、肛門部癌、膀胱癌、内分泌系癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、胸膜／腹膜癌、唾液腺癌、小腸癌、甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵管癌、腎盂癌、膣癌、外陰癌、子宮頸癌、慢性白血病、結腸癌、大腸癌、皮膚黒色腫、上衣腫、類表皮腫、ユーイング肉腫、胃癌、膠芽腫、多形性膠芽腫、神経膠腫、血液悪性腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、肝癌、ホジキン病、眼内黒色腫、カポジ肉腫、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、多発性骨髄腫、筋肉癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、小児悪性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、軟部肉腫、神経鞘腫（ｓｃｈｗａｎｏｍａ）、皮膚癌、脊髄軸腫瘍、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、子宮癌、又は上記の任意の癌の難治型を含む腫瘍及びそれらの転移、又はそれらの任意の組み合わせに関連した新抗原及び／又はネオエピトープである。

【0177】

いくつかの実施形態では、免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である：（ａ）ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１などの癌精巣抗原、並びにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、及びＭＡＧＥファミリーポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、及びＭＡＧＥ－１２（例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、及び膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる）；（ｂ）変異抗原、例えば、ｐ５３（例えば、結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌などの様々な固形腫瘍に関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓癌、及び結腸直腸癌に関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭｌ（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ－８（例えば、頭頸部癌に関連する）、ＣＩＡ０２０５（例えば、膀胱癌に関連する）、ＨＬＡ－Ａ２－Ｒ１７０１、βカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ－ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ０２０５、ＣＤＣ－２７、及びＬＤＬＲ－ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、大腸癌に関連する）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（例えば、様々な白血病に関連する）、炭酸脱水酵素（例えば、腎癌に関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺癌に関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、及び卵巣癌に関連する）、マンマグロビン、α－フェトプロテイン（例えば、肝癌に関連する）、ＫＳＡ（例えば、大腸癌に関連する）、ガストリン（例えば、膵臓癌及び胃癌に関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ－１（例えば、乳癌及び卵巣癌に関連する）、Ｇ－２５０（例えば、腎細胞癌に関連する）、ｐ５３（例えば、乳癌、結腸癌に関連する）、及び癌胎児性抗原（例えば、乳癌、肺癌、及び大腸癌などの胃腸管の癌に関連する）；（ｄ）共有抗原、例えば、ＭＡＲＴ－ｌ／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐｌＯＯ、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質－１／ＴＲＰ１、及びチロシナーゼ関連タンパク質－２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫に関連する）などの黒色腫－メラノサイト分化抗原；（ｅ）例えば前立腺癌に関連する、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ－Ｐ１、ＰＳＭ－Ｐ１、ＰＳＭ－Ｐ２などの前立腺関連抗原；（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫やＢ細胞性リンパ腫に関連する）；（ｇ）新抗原。特定の実施形態では、腫瘍免疫原には、限定されるものではないが、ｐｉ５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、Ｈ－Ｒａｓ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６及びＥ７を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス抗原、ＴＳＰ－１８０、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｍｎ－２３ＨＩ、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ｐｌ６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９ＹＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質サイクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳなどが含まれる。

【0178】

いくつかの実施形態では、免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する：花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、雑草、及び草の花粉アレルゲン）；昆虫又はクモ類のアレルゲン（吸入物、唾液、及び毒アレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリ、及び小昆虫アレルゲン、膜翅目（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ）毒アレルゲン）；動物の毛及びフケアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ネズミ、マウスなどから）；及び食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草、及びハーブからの重要な花粉アレルゲンは、限定されるものではないが、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）及びオリーブ（Ｏｌｅａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ及びＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、スズカケノキ（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含む分類学上のブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）、モクセイ目（Ｏｌｅａｌｅｓ）、マツ目（Ｐｉｎａｌｅｓ）、及びスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）、ロリウム属（Ｌｏｌｉｕｍ）、プレウム属（Ｐｈｌｅｕｍ）、ポア属（Ｐｏａ）、キノドン属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、ダクティリス属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）、ホルカス属（Ｈｏｌｃｕｓ）、ファラリス属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、セケーレ属（Ｓｅｃａｌｅ）、及びソルガム属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）の草を含むポアレス（Ｐｏａｌｅｓ）目、ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、及びパリエタ属（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）のハーブを含むキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）及びイラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）に由来する。その他の重要な吸入アレルゲンは、ヒョウヒダニ属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）及びユーログリフス属（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ）のイエダニ由来のもの、貯蔵庫ダニ、例えば、レピドグリフィス属（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ）、グリシファガス属（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ）、及びチロファガス属（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ）の由来のもの、ゴキブリ、小昆虫、及びノミ、例えば、チャバネゴキブリ属（Ｂｌａｔｅｌｌａ）、ワモンゴキブリ属（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）、ユスリカ属（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ）、及びイヌノミ属（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）に由来のもの、ネコ、イヌ、及びウマなどの哺乳動物に由来のもの、ミツバチ（ミツバチ科）、スズメバチ科（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、及びアリ類（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）を含む膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）の分類学上の目由来のものなどの刺したり噛んだりする昆虫に由来するものを含む毒アレルゲンが含まれる。

【0179】

いくつかの実施形態では、免疫原は、例えば、ヘビ（例えば、ほとんどの種のガラガラヘビ（例えば、ヒガシダイヤガラガラヘビ）、茶色のヘビの種（例えば、キングブラウンスネーク及びイースタンブラウンスネーク）、ラッセルバイパー、コブラ（例えば、インドコブラ、キングコブラ）、特定の種類のアマガサヘビ（例えば、一般的なアマガサヘビ）、マンバ（例えば、ブラックマンバ）、カーペットバイパー、ブームスラング、デュボアトゲオウミヘビ（ｄｕｂｏｉｓ ｓｅａ ｓｎａｋｅ）、タイパン種（例えば、沿岸タイパン（ｃｏａｓｔａｌ ｔａｉｐａｎ）及び内陸タイパン（ｉｎｌａｎｄ ｔａｉｐａｎ）ヘビ）、ランスヘッド（ｌａｎｃｅｈｅａｄ）種（例えば、フェルドランス及びテルシオペロ）、ブッシュマスター、カッパーヘッド、コットンマウス、サンゴヘビ、デスアダー、ベルチャーウミヘビ、タイガースネーク、オーストラリアブラックスネーク（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｂｌａｃｋ ｓｎａｋｅ））、クモ（例えば、ドクイトグモ、クロゴケグモ、クロドクシボグモ（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｗａｎｄｅｒｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒ）、ジョウゴグモ（ｆｕｎｎｅｌ－ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ）、ボタンスパイダー（ｂｕｔｔｏｎ ｓｐｉｄｅｒ）、オーストラリアセアカゴケグモ、カティポ（ｋａｔｉｐｏ）、ニセゴケグモ（ｆａｌｓｅ ｂｌａｃｋ ｗｉｄｏｗ）、チリドクイトグモ（Ｃｈｉｌｅａｎ ｒｅｃｌｕｓｅ ｓｐｉｄｅｒ）、マウスクモ（ｍｏｕｓｅ ｓｐｉｄｅｒ）、ジョウゴグモ（Ｍａｃｒｏｔｈｅｌｅ）種、シカリウス（Ｓｉｃａｒｉｕｓ）種、ヘクスフサルマ（Ｈｅｘｐｔｈａｌｍａ）種、タランチュラの特定種）、サソリ及び他のクモ綱（例えば、ファットテールスコーピオン（ｆａｔ－ｔａｉｌｅｄ ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、デスストーカースコーピオン（ｄｅａｔｈｓｔａｌｋｅｒ ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、インディアン赤サソリ（Ｉｎｄｉａｎ ｒｅｄ ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、セントルロイデス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ）種、ブラジリアンイエロースコーピオン（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｙｅｌｌｏｗ ｓｃｏｒｐｉｏｎ）などのティテュオス（Ｔｉｔｙｕｓ）種）、昆虫（例えば、ミツバチ種、スズメバチ種、ヒアリなどの特定のアリ、鱗翅目の毛虫の一部の種、ムカデの特定の種、レミペド・キシバルバナス・トゥルメンシス（ｒｅｍｉｐｅｄｅ Ｘｉｂａｌｂａｎｕｓ ｔｕｌｕｍｅｎｓｉｓ）、サカナ（例えば、ナマズの特定の種（例えば、ゴンズイ（ｓｔｒｉｐｅｄ ｅｅｌ ｃａｔｆｉｓｈ）及びその他のゴンズイ科（ｅｅｌｔａｉｌ ｃａｔｆｉｓｈ））、アカエイの特定の種（例えば、青斑アカエイ）、ミノカサゴ、オニダルマオコゼ、オニカサゴ、フグ、アイゴ、ゴブリンフィッシュ、ツマジロオコゼ、ストライプブレニー（ｓｔｒｉｐｅｄ ｂｌｅｎｎｙ）、キビレミシマ（ｓｔａｒｇａｚｅｒ）、キマイラ（ｃｈｉｍａｅｒａ）、ハチミシマ（ｗｅｅｖｅｒ）、ツノザメ（ｄｏｇｆｉｓｈ ｓｈａｒｋ））、刺胞動物（例えば、クラゲの特定の種（例えば、イルカンジクラゲ及びハコクラゲ）、ヒドロ虫綱（例えば、カツオノエボシ（Ｐｏｒｔｕｇｕｅｓｅ Ｍａｎ ｏ’Ｗａｒ））、イソギンチャク、サンゴの特定の種）、トカゲ（例えば、アメリカドクトカゲ（ｇｉｌａ ｍｏｎｓｔｅｒ）、メキシコフトアゴヒゲトカゲ（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｒｄｅｄ ｌｉｚａｒｄ）、ヴァラヌス（Ｖａｒａｎｕｓ）の特定の種（例えば、コモドドラゴン）、ペレンティーオオトカゲ（ｐｅｒｅｎｔｉｅ）、及びレースモニター（ｌａｃｅ ｍｏｎｉｔｏｒ））、哺乳動物（例えば、ミナミプラリナトガリネズミ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｓｈｏｒｔ－ｔａｉｌｅｄ ｓｈｒｅｗ）、カモノハシ、ヨーロッパモグラ、ミズトガリネズミ（Ｅｕｒａｓｉａｎ ｗａｔｅｒ ｓｈｒｅｗ）、ミナミミズトガリネズミ（Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｗａｔｅｒ ｓｈｒｅｗ）、プラナリトガリネズミ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｓｈｏｒｔ－ｔａｉｌｅｄ ｓｈｒｅｗ）、エリオットプラリトガリネズミ（Ｅｌｌｉｏｔ’ｓ ｓｈｏｒｔ－ｔａｉｌｅｄ ｓｈｒｅｗ）、特定の種のソレノドン（例えば、キューバソレノドン、ハイチソレノドン）、スローロリス）、軟体動物（例えば、イモガイの特定の種）、頭足類（例えば、タコの特定の種（例えば、ヒョウモンダコ（ｂｌｕｅ－ｒｉｎｇｅｄ ｏｃｔｏｐｕｓ）、イカ、及びコウイカ）、両生類（例えば、ヤドクガエル、ブルーノイシアタマガエル、グリーニングのカエル（Ｇｒｅｅｎｉｎｇ’ｓ ｆｒｏｇ）などのカエル、サンショウウオ（例えば、ファイアサラマンダー（Ｆｉｒｅ ｓａｌａｍａｎｄｅｒ）、イベリリアトゲイモリ（Ｉｂｅｒｉａｎ ｒｉｂｂｅｄ ｎｅｗｔ））からの毒液などの毒液中の毒素に由来する。

【0180】

いくつかの実施形態では、毒素は、植物又は菌類（例えば、キノコ）に由来する。

【0181】

いくつかの実施形態では、毒素免疫原は、シアノトキシン、ジノトキシン（ｄｉｎｏｔｏｘｉｎ）、ミオトキシン、細胞毒素（例えば、リシン、アピトキシン、マイコトキシン（例えば、アフラトキシン）、オクラトキシン、シトリニン、麦角アルカロイド、パツリン、フザリウム、フモニシン、トリコテセン、カルディオトキシン）、テトロドトキシン、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素Ａ、破傷風毒素Ａ、ジフテリア毒素、ダイオキシン、ムスカリン、ブホトキシン、サリン、血液毒、フォトトキシン、壊死性毒、腎毒素、及び神経毒（例えば、カルシセプチン、コブロトキシン、カルシクルジン、ファシキュリン－Ｉ、カリオトキシン）などの毒素に由来する。

【0182】

任意の数の微生物又は癌由来の免疫原を、環状又は線状ポリリボヌクレオチドで使用することができる。場合によっては、免疫原は、上記に開示された１つの微生物に関連するか、又はそれによって発現される。いくつかの実施形態では、免疫原は、上記に開示された２つ以上の微生物に関連するか、又はそれらによって発現される。場合によっては、免疫原は、上記に開示された１つの癌に関連するか、又はそれによって発現される。いくつかの実施形態では、免疫原は、上記に開示された２つ以上の癌に関連するか、又はそれらによって発現される。いくつかの実施形態では、免疫原は、上記に開示された毒素に由来する。いくつかの実施形態では、免疫原は、上記に開示された２つ以上の毒素に由来する。

【0183】

２つ以上の微生物は、関連している、又は関連していない。場合によっては、２つ以上の微生物は、系統発生的に関連している。例えば、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上のウイルス、ウイルスファミリーの２つ以上のメンバー、ウイルスクラスの２つ以上のメンバー、ウイルス系列の２つ以上のメンバー、ウイルス属の２つ以上のメンバー、ウイルス種の２つ以上のメンバー、２つ以上の細菌性病原体由来の免疫原を含む、又はこれらをコードする。いくつかの実施形態では、２つ以上の微生物は、系統発生的に関連していない。

【0184】

場合によっては、２つ以上の微生物は、表現型的に関連している。例えば、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の呼吸器病原体、２つ以上の選択剤、重い疾患に関連する２つ以上の微生物、免疫不全の対象における有害転帰に関連する２つ以上の微生物、妊娠に関連する有害転帰に関連する２つ以上の微生物、出血熱に関連する２つ以上の微生物に由来する免疫原を含む、又はコードする。

【0185】

本開示の免疫原は、野生型配列を含み得る。免疫原を表す場合、「野生型」という用語は、天然であり、ゲノム（例えば、ウイルスゲノム）によってコードされる配列（例えば、核酸配列又はアミノ酸配列）を指す。ある種（例えば、微生物種）は、１つの野生型配列、又は２つ以上の野生型配列（例えば、参照微生物ゲノム中に存在する１つの標準野生型配列、及び突然変異から生じた存在するさらなる変異体野生型配列を有する）を有し得る。

【0186】

免疫原を表す場合、「誘導体」及び「から誘導される」という用語は、１つ以上の核酸又はアミノ酸が野生型配列と異なる、例えば、野生型配列と比べて１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を含有する配列（例えば、核酸配列又はアミノ酸配列）を指す。

【0187】

免疫原誘導体配列は、野生型配列、例えば、野生型核酸、タンパク質、免疫原、又はエピトープ配列に対して、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する配列である。

【0188】

ある実施形態では、免疫原は、コードされるタンパク質の構造に影響を与える１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを含有する。ある実施形態では、免疫原は、コードされるタンパク質の機能に影響を与える１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを含有する。ある実施形態では、免疫原は、細胞によってコードされるタンパク質の発現又はプロセシングに影響を与える１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを含有する。

【0189】

いくつかの実施形態では、免疫原は、コードされた免疫原性核酸の構造に影響を与える１つ又は複数の核酸の挿入、欠失、置換、又はそれらの組み合わせを含む。

【0190】

アミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、翻訳後修飾のための部位を導入し得る（例えば、グリコシル化、ユビキチン化、リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、アミド化、水酸化、硫酸化、若しくは脂質化部位、又は切断のために標的化される配列を導入する）。ある実施形態では、アミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、翻訳後修飾のための部位を除去する（例えば、グリコシル化、ユビキチン化、リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、アミド化、水酸化、硫酸化、又は脂質化部位、又は切断のために標的化される配列を除去する）。ある実施形態では、アミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、翻訳後修飾のための部位を修飾する（例えば、グリコシル化、ユビキチン化、リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、アミド化、水酸化、硫酸化、若しくは脂質化部位、又は切断の効率又は特性を改変するように部位を修飾する）。

【0191】

アミノ酸置換は、保存的又は非保存的置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、類似の生化学的特性（例えば、電荷、サイズ、及び／又は疎水性）の別のアミノ酸の代わりの１つのアミノ酸の置換であり得る。非保存的アミノ酸置換は、異なる生化学的特性（例えば、電荷、サイズ、及び／又は疎水性）を有する別のアミノ酸の代わりの１つのアミノ酸の置換であり得る。保存的アミノ酸変化は、例えば、ポリペプチドの二次又は三次構造に対して最小の影響を与える置換であり得る。保存的アミノ酸変化は、１つの親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。親水性アミノ酸は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｒｇ（Ｒ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの疎水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。疎水性アミノ酸は、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、及びＰｒｏ（Ｐ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ（Ｅ）及びＡｓｐ（Ｄ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。塩基性アミノ酸は、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）及びＬｙｓ（Ｋ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの極性アミノ酸から別の極性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。極性アミノ酸は、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの非極性アミノ酸から別の非極性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。非極性アミノ酸は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）及びＡｌａ（Ａ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの芳香族アミノ酸から別の芳香族アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。芳香族アミノ酸は、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＴｒｐ（Ｗ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの脂肪族アミノ酸から別の脂肪族アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。脂肪族アミノ酸は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）を含み得る。ある実施形態では、保存的アミノ酸置換は、以下のグループ：グループＩ：ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩ：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ：ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；グループＩＶ：ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；グループＶ：ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；及びグループＶＩ：ａｓｐ、ｇｌｕのうちの１つの中の、１つのアミノ酸から別のアミノ酸へのアミノ酸変化である。

【0192】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００個のアミノ酸欠失を含む。

【0193】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０個のアミノ酸置換を含む。

【0194】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、又は５０以下のアミノ酸置換を含む。

【0195】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～３０、１～４０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、２～１５、２～２０、２～３０、２～４０、３～３、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１５、３～２０、３～３０、３～４０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、５～２０、５～３０、５～４０、１０～１５、１５～２０、又は２０～２５個のアミノ酸置換を含む。

【0196】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸置換を含む。

【0197】

１つ以上のアミノ酸置換は、アミノ酸配列内の、又はそれらの組合せＮ末端、Ｃ末端にあり得る。アミノ酸置換は、連続、非連続、又はそれらの組合せであり得る。

【0198】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、１００以下、１２０以下、１４０以下、１６０以下、１８０以下、又は２００以下のアミノ酸欠失を含む。

【0199】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～３０、１～４０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、２～１５、２～２０、２～３０、２～４０、３～３、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１５、３～２０、３～３０、３～４０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、５～２０、５～３０、５～４０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２０～３０、３０～５０、５０～１００、又は１００～２００個のアミノ酸欠失を含む。

【0200】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸欠失を含む。

【0201】

１つ以上のアミノ酸欠失は、アミノ酸配列内のＮ末端、Ｃ末端、又はそれらの組合せにあり得る。アミノ酸欠失は、連続、非連続、又はそれらの組合せであり得る。

【0202】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０個のアミノ酸挿入を含む。

【0203】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、又は５０以下のアミノ酸挿入を含む。

【0204】

ある実施形態では、本開示の抗原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～３０、１～４０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、２～１５、２～２０、２～３０、２～４０、３～３、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１５、３～２０、３～３０、３～４０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、５～２０、５～３０、５～４０、１０～１５、１５～２０、又は２０～２５個のアミノ酸挿入を含む。

【0205】

ある実施形態では、本開示の抗原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸挿入を含む。

【0206】

１つ以上のアミノ酸挿入は、アミノ酸配列内のＮ末端、Ｃ末端、又はそれらの組合せにあり得る。アミノ酸挿入は、連続、非連続、又はそれらの組合せであり得る。

【0207】

いくつかの実施形態では、免疫原は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドによって発現される。いくつかの実施形態では、免疫原は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル増幅の産物である。

【0208】

免疫原は、相当な量で産生させることができる。したがって、免疫原は、産生させることができる任意のタンパク質性分子であり得る。免疫原は、細胞から分泌され得るポリペプチド、又は細胞の細胞質、核、若しくは膜分画に局在し得るポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、本明細書に開示される２つ以上の免疫原を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、エピトープを含む。いくつかの実施形態では、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、本明細書に開示される２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質、例えば、本開示の１つ又は複数の微生物からの複数の予測エピトープを含む人工ペプチド配列を含む。

【0209】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドから発現され得る免疫原は、膜タンパク質であり、例えば、膜タンパク質として一般的に見出されるポリペプチド配列、又は膜タンパク質となるように改変されたポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される環状又は線状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的な免疫原には、細胞内免疫原又は細胞質免疫原が含まれる。

【0210】

いくつかの実施形態では、免疫原は、約４０，０００未満のアミノ酸長、約３５，０００未満のアミノ酸長、約３０，０００未満のアミノ酸長、約２５，０００未満のアミノ酸長、約２０，０００未満のアミノ酸長、約１５，０００未満のアミノ酸長、約１０，０００未満のアミノ酸長、約９，０００未満のアミノ酸長、約８，０００未満のアミノ酸長、約７，０００未満のアミノ酸長、約６，０００未満のアミノ酸長、約５，０００未満のアミノ酸長、約４，０００未満のアミノ酸長、約３，０００未満のアミノ酸長、約２，５００未満のアミノ酸長、約２，０００未満のアミノ酸長、約１，５００未満のアミノ酸長、約１，０００未満のアミノ酸長、約９００未満のアミノ酸長、約８００未満のアミノ酸長、約７００未満のアミノ酸長、約６００未満のアミノ酸長、約５００未満のアミノ酸長、約４００未満のアミノ酸長、約３００未満のアミノ酸長、約２５０未満のアミノ酸長、約２００未満のアミノ酸長、約１５０未満のアミノ酸長、約１４０未満のアミノ酸長、約１３０未満のアミノ酸長、約１２０未満のアミノ酸長、約１１０未満のアミノ酸長、約１００未満のアミノ酸長、約９０未満のアミノ酸長、約８０未満のアミノ酸長、約７０未満のアミノ酸長、約６０未満のアミノ酸長、約５０未満のアミノ酸長、約４０未満のアミノ酸長、約３０未満のアミノ酸長、約２５未満のアミノ酸長、約２０未満のアミノ酸長、約１５未満のアミノ酸長、約１０未満のアミノ酸長、約５未満のアミノ酸長を有し、それらの間の任意のアミノ酸長又はそれ以下が有用であり得る。

【0211】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の免疫原配列を含み、インビボで対象の細胞において持続的に発現するように構成されている。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、後の時点における細胞内での１つ又は複数の発現配列の発現が前の時点と同等又はそれよりも高くなるように構成される。そのような実施形態では、１つ又は複数の免疫原配列の発現を、比較的安定したレベルで維持するか、又は経時的に増加させることができる。免疫原配列の発現は、長期間にわたって比較的安定させることができる。免疫原配列の発現は、一過性に、又は限られた時間だけ、例えば、多くとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、又は１０日間、比較的安定させることができる。

【0212】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、例えば一過性又は長期的に、対象において１つ又は複数の免疫原を発現する。特定の実施形態では、免疫原の発現は、少なくとも約１時間から約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、又はそれよりも長く、それらの間の任意の時間持続する。特定の実施形態では、免疫原の発現は、約３０分以内から約７日間以内、又は約１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１１時間以内、１２時間以内、１３時間以内、１４時間以内、１５時間以内、１６時間以内、１７時間以内、１８時間以内、１９時間以内、２０時間以内、２１時間以内、２２時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、６０時間以内、７２時間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、７日間以内、８日間以内、９日間以内、１０日間以内、１１日間以内、１２日間以内、１３日間以内、１４日間以内、１５日間以内、１６日間以内、１７日間以内、１８日間以内、１９日間以内、２０日間以内、２１日間以内、２２日間以内、２３日間以内、２４日間以内、２５日間以内、２６日間以内、２７日間以内、２８日間以内、２９日間以内、３０日間以内、６０日間以内、又はそれらの間の任意の時間持続する。

【0213】

免疫原の発現は、少なくとも、本明細書に提供される環状又は線状ポリリボヌクレオチドの領域を翻訳することを含む。例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチドを、本開示の１つ又は複数の免疫原を含むポリペプチドを生成するように対象において翻訳し、それにより対象における適応免疫応答（例えば、抗体応答及び／又はＴ細胞応答）の産生を刺激することができる。いくつかの実施形態では、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドを、ヒト又は動物対象における１つ又は複数の免疫原を生成するように翻訳し、それによりヒト又は動物対象における適応免疫応答（例えば、抗体応答及び／又はＴ細胞応答）の産生を刺激する。

【0214】

いくつかの実施形態では、免疫原発現のための方法は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のポリペプチドへの翻訳を含む。いくつかの実施形態では、免疫原発現のための方法は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸、又は少なくとも１０００アミノ酸のポリペプチドへの翻訳を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現のための方法は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸、約７００アミノ酸、約８００アミノ酸、約９００アミノ酸、又は約１０００アミノ酸のポリペプチドへの翻訳を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの、本明細書に提供されるような連続ポリペプチド、本明細書に提供されるような別々のポリペプチド、又は双方への翻訳を含む。

【0215】

いくつかの実施形態では、免疫原発現のための方法は、翻訳産物の修飾、フォールディング、又は他の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、免疫原発現のための方法は、インビボでの、例えば、細胞機構を介する翻訳後修飾を含む。

【0216】

シグナル配列
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される環状又は線状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的な免疫原として、分泌タンパク質、例えば、天然にシグナル配列を含むタンパク質（例えば、免疫原）、又は通常はシグナル配列をコードしないが、１つを含むように修飾されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原は、分泌シグナルを含む。例えば、分泌シグナルは、分泌タンパク質における天然にコードされた分泌シグナルであってもよい。別の例では、分泌シグナルは、分泌タンパク質における修飾された分泌シグナルであってもよい。他の実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原は、分泌シグナルを含まない。

【0217】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、同じ免疫原の複数のコピー、同じ免疫原の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上）のコピーをコードする。いくつかの実施形態では、免疫原の少なくとも１つのコピーは、シグナル配列を含み、免疫原の少なくとも１つのコピーは、シグナル配列を含まない。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原（例えば、複数の異なる免疫原又は１００％未満の配列同一性を有する複数の免疫原）をコードし、ここで複数の免疫原の少なくとも１つは、シグナル配列を含み、複数の免疫原の少なくとも１つのコピーは、シグナル配列を含まない。

【0218】

いくつかの実施形態では、シグナル配列は、例えば、内因性に発現されるとき、野生型シグナル配列であり、対応する野生型免疫原のＮ末端上に存在するものである。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫原に対して異種であり、例えば、野生型免疫原が内因性に発現されるとき、存在しない。免疫原をコードするポリリボヌクレオチド配列は、野生型シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を除去し、且つ／又は異種シグナル配列をコードする配列を付加するように修飾されてもよい。

【0219】

環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、各々シグナル配列を有する又は有しない１つ又は複数のアジュバントをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのアジュバント及び少なくとも１つの免疫原をコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコードされるアジュバントはシグナル配列を含み、少なくとも１つのコードされる免疫原はシグナル配列を含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコードされるアジュバントはシグナル配列を含み、少なくとも１つのコードされる免疫原はシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコードされるアジュバントはシグナル配列を含まず、少なくとも１つのコードされる免疫原はシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされるアジュバントも、コードされる免疫原も、シグナル配列を含まない。

【0220】

いくつかの実施形態では、シグナル配列は、例えば内因的に発現したときの対応する野生型アジュバントのＮ末端に存在する野生型シグナル配列である。いくつかの実施形態では、シグナル配列はアジュバントにとって異種であり、例えば、野生型アジュバントが内因的に発現したときに存在しない。アジュバントをコードするポリリボヌクレオチド配列は、野生型シグナル配列をコードするヌクレオチド配列が取り除かれ、及び／又は異種シグナル配列をコードする配列が付加されるように修飾されてもよい。

【0221】

ポリリボヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（例えば免疫原、又はポリリボヌクレオチドによってコードされるアジュバント）は、免疫原又はアジュバントを分泌経路に導くシグナル配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫原又はアジュバントを特定の細胞小器官（例えば、小胞体、ゴルジ装置、又はエンドソーム）に存在するように導いてもよい。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫原又はアジュバントを細胞から分泌されるように導く。分泌タンパク質の場合、シグナル配列は、分泌後に切断され、成熟タンパク質をもたらし得る。他の実施形態では、シグナル配列は、細胞又は特定の細胞小器官の膜内に包埋されるようになり、タンパク質を細胞、小胞体、又はゴルジ装置の膜に固定する膜貫通セグメントを創出し得る。特定の実施形態では、膜貫通タンパク質のシグナル配列は、ポリペプチドのＮ末端の短い配列である。他の実施形態では、第１の膜貫通ドメインは、タンパク質を膜に標的化する、第１のシグナル配列として作用する。

【0222】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドによってコードされるアジュバントは、分泌シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原は、分泌シグナル配列、膜貫通挿入シグナル配列を含むか、又はシグナル配列を含まない、のいずれかである。

【0223】

調節要素
環状ポリリボヌクレオチド又は線状ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。ある調節要素を用いて、環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数の免疫原及び／又はアジュバントの発現を増加させることができる。同様に、ある調節要素を用いて、環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数の免疫原及び／又はアジュバントの発現を減少させることができる。いくつかの実施形態では、ある調節要素を用いて、免疫原及び／又はアジュバントの発現を増加させることができ、また別の調節要素を用いて、同じ環状又は線状ポリリボヌクレオチドに対する別の免疫原及び／又はアジュバントの発現を減少させることができる。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物（例えば、免疫原又はアジュバント）の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列（例えば、免疫原又はアジュバント）の発現を促進することができる。複数の調節要素がまた、例えば、異なる発現配列の発現を異なって調節するのに使用され得る。ある実施形態では、本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状又は線状ポリリボヌクレオチド、例えば、特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指す。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状若しくは線状ポリリボヌクレオチド、又は環状若しくは線状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指す。ある実施形態では、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。ある実施形態では、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。調節要素のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５４］～［０１６１］に記載されている。

【0224】

翻訳を開始させるコドン、例えば、限定はされないが、開始コドン又は代替的な開始コドンに隣接するヌクレオチドは、環状若しくは線状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率、長さ、及び／又は構造に影響することは知られている（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい；その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）。翻訳を開始させるコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスクすることを用いて、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ及び／又は構造を変更してもよい。

【0225】

一実施形態では、コドンをマスクするか又は隠し、マスクされた開始コドン又は代替的な開始コドンでの翻訳開始の確率を低減するため、マスキング剤を開始コドン又は代替的な開始コドンの近傍で用いてもよい。別の実施形態では、代替的な開始コドンで翻訳が開始する可能性を高めるため、マスキング剤を用いて、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの開始コドンをマスクしてもよい。

【0226】

翻訳開始配列
いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、免疫原をコードし、翻訳開始配列、例えば、開始コドンを含む。いくつかの実施形態では、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。いくつかの実施形態では、翻訳開始配列は、コザック配列を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態では、翻訳開始配列、例えば、コザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態では、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。翻訳開始配列のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６３］～［０１６５］に記載されている。

【0227】

環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０を超える開始コドンなどの２つ以上の開始コドンを含んでもよい。翻訳は、第１の開始コドンで開始し得るか、又は第１の開始コドンの下流で開始し得る。

【0228】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドン、例えば、ＡＵＧでないコドンで開始し得る。環状又は線状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０１６４］に記載のような代替的な翻訳開始配列で開始し得る。

【0229】

いくつかの実施形態では、翻訳は、ロカグレートを伴う真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）の処理によって開始される（翻訳は、４３Ｓスキャニングを遮断し、ＲｏｃＡ－ｅＩＦ４Ａ標的配列を有する転写物からの未成熟な上流の翻訳開始及びタンパク質発現低下を引き起こすことによって抑制される、例えば、ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎａｔｕｒｅ１７９７８を参照）。

【0230】

ＩＲＥＳ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上（例えば、２、３、４、及び５つ）の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に１つ又は複数のＩＲＥＳ配列を含むことで、得られるペプチド及び／又はポリペプチドの分離を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５つ又はそれ以上）の発現配列の両側に隣接する。環状又は線状ポリリボヌクレオチド内に含めるのに適したＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームと会合することが可能なＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、コクサッキーウイルス（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）（ＣＶＢ３）ＩＲＥＳである。ＩＲＥＳのさらなる例が、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書で援用される）のパラグラフ［０１６６］～［０１６８］に記載されている。

【0231】

切断ドメイン
本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、切断ドメイン（例えば、スタガー要素又は切断配列）を含み得る。

【0232】

「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導する、ヌクレオチド配列などの部分を指す。ある実施形態では、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）（配列番号７）である。ある実施形態では、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸、又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。

【0233】

ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態では、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えば、免疫原及び／又はアジュバントの分離をもたらす。ある実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部である。ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列（例えば、免疫原及び／又はアジュバント）を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれが、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列（例えば、免疫原及び／又はアジュバント）から隔てられる。ある実施形態では、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。ある実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。ある実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のうちの発現配列の一部を含む。

【0234】

スタガー要素の例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１７２］～［０１７５］に記載されている。

【0235】

いくつかの実施形態では、環状又は線状リボヌクレオチドによってコードされる複数の免疫原は、各免疫原間のＩＲＥＳによって分離されてもよい。ＩＲＥＳは、全ての免疫原の間で同じＩＲＥＳであってもよい。ＩＲＥＳは、異なる免疫原間で異なってもよい。他の実施形態では、複数の免疫原及び／又はアジュバントは、２Ａ自己切断ペプチドによって分離されてもよい。さらに、環状又は線状リボヌクレオチドによってコードされる複数の免疫原及び／又はアジュバントは、ＩＲＥＳ及び２Ａ配列の双方によって分離されてもよい。例えば、ＩＲＥＳは、第１の免疫原と第２の免疫原の間に存在してもよい一方で、２Ａペプチドは、第２の免疫原及び／又はアジュバントと第３の免疫原及び／又はアジュバントとの間に存在してもよい。特定のＩＲＥＳ又は２Ａ自己切断ペプチドの選択を用いて、ＩＲＥＳ又は２Ａ配列の制御下で免疫原及び／又はアジュバントの発現レベルを制御してもよい。例えば、選択されるＩＲＥＳ及び／又は２Ａペプチドに応じて、ポリペプチドでの発現が増強又は低減されてもよい。

【0236】

連続的発現産物、例えば、免疫原及び／又はアジュバントの産生を回避しながら、ローリングサークル翻訳を維持するため、スタガー要素を含めることで、翻訳中のリボソーム停止を誘導してもよい。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ又は複数の発現配列の少なくとも１つの３’末端にある。スタガー要素は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル翻訳中にリボソームを停止させるように設計され得る。スタガー要素は、限定はされないが、２Ａ様、又はＣＨＹＳＥＬ（配列番号８）（シス作用性ヒドロラーゼエレメント）配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＥＸ_５ＮＰＧＰ（式中、Ｘ_１は、不在又はＧ若しくはＨであり、Ｘ_２は、不在又はＤ若しくはＧであり、Ｘ_３は、Ｄ又はＶ又はＩ又はＳ又はＭであり、Ｘ_５は、任意のアミノ酸（配列番号９）である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。いくつかの実施形態では、この配列は、強力なαらせん性を有するアミノ酸の非保存配列と、それに続くコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（式中、ｘ＝任意のアミノ酸（配列番号７）である）を含む。スタガー要素のいくつかの非限定例として、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１０）、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ（配列番号１１）、ＶＥＰＮＰＧＰ（配列番号１２）、ＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号１３）、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号１４）、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ（配列番号１５）、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号１６）、ＧＤＶＥＮＰＧＰ（配列番号１７）、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ（配列番号１９）、ＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号２０）、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ（配列番号２１）、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号２２）、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号２３）、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ（配列番号２４）、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ（配列番号２５）、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号２６）、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ（配列番号２７）、及びＤＳＥＦＮＰＧＰ（配列番号２８）が挙げられる。

【0237】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスタガー要素は、本明細書に記載のコンセンサス配列のＧ及びＰの間などで、発現産物を切断する。１つの非限定例として、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、発現産物を切断するための少なくとも１つのスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接したスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の後にスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に存在するスタガー要素を含むことで、各発現配列から個別のペプチド及び／又はポリペプチドの翻訳を引き起こす。

【0238】

いくつかの実施形態では、スタガー要素は、翻訳中にリボソーム停止を誘導する、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含んでもよい。これらなどの例は、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと、分子の骨格に対する変化によって区別される。例示的な修飾は、翻訳中にリボソーム停止を誘導し得る、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の修飾、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。本明細書に提供される例示的な修飾のいくつかは、本明細書中の他の箇所に記載されている。

【0239】

いくつかの実施形態では、スタガー要素は、環状又は線状ポリリボヌクレオチド中に他の形態で存在する。例えば、いくつかの例示的な環状又は線状ポリリボヌクレオチドでは、スタガー要素は、環状又は線状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の終結配列、及び第１の発現配列に連続する発現の第１の翻訳開始配列から終結配列を分離するヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかの例において、第１の発現配列の第１のスタガー要素は、環状又は線状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に連続する発現の第１の翻訳開始配列の上流（それに対する５’側）に存在する。いくつかの場合、第１の発現配列及び第１の発現配列に連続する発現配列は、環状又は線状ポリリボヌクレオチド中の２つの別々の発現配列である。第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及びその連続する発現配列の連続的翻訳を可能にし得る。いくつかの実施形態では、第１のスタガー要素は、終結配列を含み、第１の発現配列の発現産物をその連続する発現配列の発現産物から分離し、それにより分離した発現産物を作出する。いくつかの場合、環状又は線状ポリリボヌクレオチド中の連続する配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタガー要素を含む環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される一方で、第２の発現配列に連続する発現配列の第２の翻訳開始配列の上流に存在する第２の発現配列のスタガー要素を含む対応する環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳されない。いくつかの場合、環状又は線状ポリリボヌクレオチド中に発現配列が１つだけ存在し、第１の発現配列及びその連続する発現配列は、同じ発現配列である。いくつかの例示的な環状又は線状ポリリボヌクレオチドでは、スタガー要素は、環状又は線状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の終結配列、及び下流の翻訳開始配列から終結配列を分離するヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかのそのような例では、第１のスタガー要素は、環状又は線状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（に対する５’側）に存在する。いくつかの場合、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び任意の連続する発現配列の継続的翻訳を可能にする。いくつかの実施形態では、第１のスタガー要素は、第１の発現配列の１回目の発現産物を第１の発現配列の次回の発現産物から分離し、それにより分離した発現産物を作出する。いくつかの場合、環状又は線状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタガー要素を含む環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される一方で、対応する環状又は線状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にスタガー要素を含む対応する環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳されない。いくつかの場合、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、対応する環状又は線状ポリリボヌクレオチドにおいて、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにおける第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍大きい。いくつかの場合、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離よりも、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上大きい。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。

【0240】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの切断配列を含む。いくつかの実施形態では、切断配列は、発現配列に隣接する。いくつかの実施形態では、切断配列は、２つの発現配列の間に存在する。いくつかの実施形態では、切断配列は、発現配列内に含まれる。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２～１０の間の切断配列を含む。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２～５の間の切断配列を含む。いくつかの実施形態では、複数の切断配列は、複数の発現配列間に存在し；例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列間に切断配列が存在するように、３つの発現配列及び２つの切断配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、例えば、犠牲的ｃｉｒｃＲＮＡ（ｉｍｍｏｌａｔｉｎｇ ｃｉｒｃＲＮＡ）又は切断可能なｃｉｒｃＲＮＡ又は自己切断ｃｉｒｃＲＮＡ中に切断配列を含む。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、環状又は線状ポリリボヌクレオチド、例えば、ｍｉＲＮＡ、線状ＲＮＡ、より小さい環状又は線状ポリリボヌクレオチドなどの複数の産物への分離を引き起こす、２つ以上の切断配列を含む。

【0241】

いくつかの実施形態では、切断配列は、リボザイムＲＮＡ配列を含む。リボザイム（ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡとも称される、リボ核酸酵素に由来）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、それら自身のホスホジエステル結合の１つの加水分解、又は他のＲＮＡにおける結合の加水分解のいずれかを触媒するが、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも見出されている。触媒ＲＮＡは、インビトロ方法によって「進化」され得る。上で考察されたリボスイッチ活性と同様、リボザイム及びそれらの反応産物は、遺伝子発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、触媒ＲＮＡ又はリボザイムは、リボザイムが、バルク体積からの分子の化学変換を意図して、細胞内の多数のコピーに存在するように、より大きい非翻訳ＲＮＡ内部に配置され得る。いくつかの実施形態では、アプタマー及びリボザイムは、双方とも、同じ非翻訳ＲＮＡ中でコードされ得る。

【0242】

いくつかの実施形態では、切断配列は、切断可能なポリペプチドリンカーをコードする。例えば、ポリリボヌクレオチドは、例えば、２つ以上の免疫原が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる場合、２つ以上の免疫原をコードし得る。例えば、２つ以上の免疫原は、単一のオープンリーディングフレームによってコードされてもよく、その発現は、ＩＲＥＳによって制御される。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、ポリペプチドリンカーをさらにコードすることで、例えば、ＯＲＦの発現産物は、２つ以上の免疫原であり、それぞれがポリペプチドリンカー（例えば、５～２００、５～１００、５～５０、５～２０、５０～１００、又は５０～２００アミノ酸のリンカー）をコードする配列によって分離されるものをコードする。ポリペプチドリンカーは、切断部位、例えば、プロテアーゼ（例えば、ポリリボヌクレオチドの対象への投与後の該対象における内因性プロテアーゼ）によって認識及び切断される切断部位を含んでもよい。かかる実施形態では、２つ以上の免疫原のアミノ酸配列を含む単一の発現産物が発現時に切断されることで、２つ以上の免疫原は、発現後に分離される。例示的なプロテアーゼ切断部位、例えば、メタロプロテイナーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１～２８の任意の１つ又は複数など）、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ２、７～１２、１５、１７～２３、２８～３０及び３３の任意の１つ又は複数など）、セリンプロテアーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、マトリプターゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、又はカテプシンプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ切断部位として作用するアミノ酸配列は、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＭＭＰ９又はＭＭＰ２である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリプターゼである。

【0243】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、犠牲的な環状若しくは線状ポリリボヌクレオチド、切断可能な環状若しくは線状ポリリボヌクレオチド、又は自己切断性の環状若しくは線状ポリリボヌクレオチドである。環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む細胞成分を送達し得る。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、（ｉ）自己切断要素；（ｉｉ）切断動員部位；（ｉｉｉ）分解性リンカー；（ｉｖ）化学的リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列によって分離されたｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、（ｉ）自己切断配列；（ｉｉ）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）；（ｉｉｉ）分解性リンカー（例えば、グリセロール）；（ｉｖ）化学的リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列によって分離されたｓｉＲＮＡを含む。自己切断配列の非限定例として、ハンマーヘッド、スプライシングエレメント、ヘアピン、δ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ）（ＨＤＶ）、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）、及びｇｌｍＳリボザイムが挙げられる。

【0244】

調節要素及び発現産物の比
ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の調節核酸配列を含み、又は調節核酸、例えば、内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節する核酸をコードする１つ以上の発現配列を含む。ある実施形態では、本明細書において提供される環状又は線状ポリリボヌクレオチドの発現配列は、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡなどの、ノンコーディングＲＮＡのような調節核酸に対してアンチセンスである配列を含み得る。

【0245】

例示的な調節核酸が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１７７］～［０１９４］に記載されている。

【0246】

ある実施形態では、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率は、参照、例えば、線状同等物、線状発現配列、又は環状化のための線状ポリリボヌクレオチドより高い。ある実施形態では、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、参照の翻訳効率より少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％、又はそれ以上高い翻訳効率を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより１０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより３００％高い翻訳効率を有する。

【0247】

ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、化学量論的比の発現産物を生成する。ローリングサークル型翻訳は、実質的に同等の比率で発現産物を連続して生成する。ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、発現産物が実質的に同等の比率で生成されるような化学量論的翻訳効率を有する。ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、複数の発現産物、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上の発現配列からの産物の化学量論的翻訳効率を有する。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、発現産物の実質的に異なる比をもたらす。例えば、複数の発現産物の翻訳効率は、１：１０，０００；１：７０００、１：５０００、１：１０００、１：７００、１：５００、１：１００、１：５０、１：１０、１：５、１：４、１：３又は１：２の比を有し得る。いくつかの実施形態では、複数の発現産物の比は、調節要素を用いて変更されてもよい。

【0248】

翻訳
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。ある実施形態では、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。ある実施形態では、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回、又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。

【0249】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「連続した」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチド産物（「別個の」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、全ポリペプチドの少なくとも９９％が別々のポリペプチドであるように設計される。ある実施形態では、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。ある実施形態では、量比率の試験に使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。ある実施形態では、量比率は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。

【0250】

非翻訳領域
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。ある実施形態では、イントロンは、ヒトイントロンである。ある実施形態では、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えば、ＺＫＳＣＡＮ１である。

【0251】

例示的な非翻訳領域が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１９７］～［２０１］に記載されている。

【0252】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含む。例示的なポリＡ配列が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２０２］～［０２０５］に記載されている。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。

【0253】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、アデノシン及びウリジンの１つ又は複数のストレッチが内包されたＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチのシグネチャーは、発現産物のターンオーバー速度を増加させ得る。

【0254】

ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性、又は免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベル）を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌクレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ又は複数コピーを環状ポリリボヌクレオチドに導入してもよく、ＡＲＥのコピーは、発現産物の翻訳及び／又は産生を調節し得る。同様に、ＡＲＥを、同定及び除去し、又は環状ポリリボヌクレオチドに改変することで、細胞内安定性を調節し、ひいては得られるタンパク質の翻訳及び産生に作用することができる。

【0255】

任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが環状ポリリボヌクレオチドの各隣接領域に組み込まれてもよいことは理解されるべきである。

【0256】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、３’ＵＴＲを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、終結配列を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列：１つ又は複数のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ又は複数の複製タンパク質をコードする配列、外因性遺伝子をコードする配列、治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレータ、例えば、翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内因性遺伝子を標的にする１つ又は複数の調節核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、及び治療的ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列、の１つ又は複数を含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲを欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、３’ＵＴＲを欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、終結配列を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いているという事実は、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されない、又はエキソヌクレアーゼの存在下で限られた範囲に限って分解される、例えば、エキソヌクレアーゼの不在下で同等又は類似的であることを意味し得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによって分解されない。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝露されるとき、分解が低下している。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。

【0258】

終結配列
環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の発現配列（例えば、免疫原をコードする及び／又はアジュバントをコードする）を含み得て、各発現配列は、終結配列を有する場合も有しない場合もある。終結配列のさらなる例が、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書で援用される）のパラグラフ［０１６９］～［０１７０］に記載されている。

【0259】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列の長さは、１０ヌクレオチド長を超える。一実施形態では、ポリＡ配列は、１５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１６０、約１８０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約１，１００、約１，２００、約１，３００、約１，４００、約１，５００、約１，６００、約１，７００、約１，８００、約１，９００、約２，０００、約２，５００、及び約３，０００ヌクレオチドであるか又はそれを超える）。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０２０２］～［０２０４］中のポリＡ配列の記述に従って設計される。

【0260】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡを含むか、ポリＡを欠いているか、又は環状ポリリボヌクレオチドの１つ若しくは複数の特性を調節するための修飾ポリＡを有する。いくつかの実施形態では、ポリＡを欠いているか又は修飾ポリＡを有している環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の機能特性、例えば、免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベル）、半減期、発現効率などを改善する。

【0261】

調節核酸
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子の発現を修飾する、調節核酸をコードする１つ又は複数の発現配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるような環状ポリリボヌクレオチドの発現配列は、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡなどの非翻訳ＲＮＡに類する調節核酸に対してアンチセンスである配列を含み得る。

【0262】

一実施形態では、調節核酸は、宿主遺伝子などの遺伝子を標的にする。調節核酸は、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０１７７］及び［０１８１］～［０１８９］に記載の調節核酸のいずれかを含んでもよい。

【0263】

いくつかの実施形態では、発現配列は、本明細書に記載の特徴の１つ又は複数、例えば、１つ又は複数のペプチド又はタンパク質をコードする配列、１つ又は複数の調節要素、１つ又は複数の調節核酸、例えば、１つ又は複数の非翻訳ＲＮＡ、他の発現配列、及びそれらの任意の組み合わせを含む。

【0264】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する短鎖ノンコーディングＲＮＡである。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、又はマイクロＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書及び米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書において教示されるものなどの任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、即ち、成熟マイクロＲＮＡの２～８位の領域内の配列であって、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン・クリック相補性を有する配列を含む。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２～８位又は２～７位を含んでもよい。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含んでもよく、ここで対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡの１位に相対するアデニン（Ａ）によって隣接される。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含んでもよく、ここで対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡの１位に相対するアデニン（Ａ）によって隣接される。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ ６；２７：９１－１０５（その全体が参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。

【0265】

タンパク質結合
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームがＲＮＡ配列内の内部部位に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。

【0266】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含むことで、例えば、免疫応答、例えば、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を逃避する。いくつかの実施形態では、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性としての環状ポリリボヌクレオチドのマスキングを補助するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性又は外来性としての環状ポリリボヌクレオチドの隠蔽を補助するヌクレオチド配列である。

【0267】

線状ＲＮＡへのリボソーム会合の伝統的機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端へのリボソーム結合を含む。リボソームは、５’末端から開始コドンに移動するとすぐに、第１のペプチド結合が形成される。本開示によると、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳の内部開始（即ち、キャップ非依存性）は、遊離末端又はキャップ末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、ポリペプチド伸長を開始コドンで開始させる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば、開始コドンを含む、１つ又は複数のＲＮＡ配列を含む。

【0268】

天然５’ＵＴＲは、翻訳開始における役割を果たす特徴を有する。それは、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のようなシグネチャーを内包する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２９）（ここでＲは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）である）を有し、それにもう一つの「Ｇ」が後続する。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。

【0269】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列をコードする。いくつかの実施形態では、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを特異的標的に標的化し、又は局在化する。いくつかの実施形態では、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。

【0270】

いくつかの実施形態では、タンパク質結合部位として、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。

【0271】

エンクリプトゲン
本明細書に記載の通り、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低減、逃避、又は回避するためのエンクリプトゲンを含む。一態様では、細胞に送達されるとき、参照化合物、例えば、記載された環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いている環状ポリリボヌクレオチドによって誘起される応答との比較として、低下した宿主からの免疫応答をもたらす、環状ポリリボヌクレオチドが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠いている対応物よりも低下した免疫原性（例えば、低下したレベルの、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカー）を有する。

【0272】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンは、安定性を増強する。核酸分子の安定性及び翻訳の観点でのＵＴＲによって発揮される調節的役割について、一連の証拠が増えている。ＵＴＲの調節的特徴は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増強するため、エンクリプトゲンに含まれてもよい。

【0273】

いくつかの実施形態では、５’又は３’ＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチド中でエンクリプトゲンを構成し得る。例えば、ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の修飾の除去は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節する（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベルを調節する）のに有用であり得る。

【0274】

いくつかの実施形態では、発現配列内のＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、例えば、翻訳可能領域の修飾の除去は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節する（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベルを調節する）のに有用であり得る。

【0275】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンは、ｍｉＲＮＡ結合部位又は任意の他の非翻訳ＲＮＡに対する結合部位を含む。例えば、ｍｉＲ－１４２部位の本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドへの組み込みは、造血細胞内での発現を調節するだけでなく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低減又は消失させることができる。

【0276】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンは、タンパク質、例えば、免疫タンパク質がＲＮＡ配列に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含むことで、例えば、免疫応答、例えば、ＣＴＬ応答を逃避する。いくつかの実施形態では、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性としての環状ポリリボヌクレオチドのマスキングを補助するヌクレオチド配列である。

【0277】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンは、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。例示的な修飾は、環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を阻止又は低減し得る、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の修飾、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。例示的な修飾の一部が、本明細書に提供される。

【0278】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主からの免疫応答を、参照化合物、例えば、修飾を欠いている環状ポリリボヌクレオチドによって誘起される応答と比較して低減するための、本明細書中の他の箇所に記載のような１つ又は複数の修飾を含む。特に、１つ又は複数のイノシンの付加は、ＲＮＡをウイルス性に対する内因性として区別することが示されている。例えば、Ｙｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４（その全体が参照により援用される）を参照されたい。

【0279】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡにプロセシング可能なＲＮＡ配列に対する１つ又は複数の発現配列を含み、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、ＲＩＧ－Ｉを標的にし、ＲＩＧ－Ｉの発現を低減する。ＲＩＧ－Ｉは、外来の環状ＲＮＡを感知可能であり、外来の環状ＲＮＡの分解を引き起こす。したがって、ＲＩＧ－１を標的にするｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は任意の他の調節核酸における配列を内包する環状ポリヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫、例えば、宿主細胞免疫を低減し得る。

【0280】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドが細胞の自然免疫応答を低減、逃避、又は回避することを補助する配列、エレメント、又は構造を欠いている。いくつかのそのような実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列、５’末端、３’末端、リン酸基、ヒドロキシル基、又はそれらの任意の組み合わせを欠いてもよい。

【0281】

ヌクレオチドスペーサー配列
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、又はそれ以上のスペーサー配列を含む。

【0282】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む。ある実施形態では、ポリリボヌクレオチドの要素は、スペーサー配列又はリンカーによって互いに隔てられ得る。スペーサー配列の例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２９３］～［０３０２］に記載されている。

【0283】

非核酸リンカー
本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、非核酸リンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載の配列又はエレメントの１つ又は複数の間に非核酸リンカーを有する。一実施形態では、本明細書に記載の１つ又は複数の配列又はエレメントは、リンカーと連結される。非核酸リンカーは、化学結合、例えば、１つ又は複数の共有結合又は非共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、非核酸リンカーは、ペプチド又はタンパク質リンカーである。そのようなリンカーは、２～３０の間、又はそれ以上のアミノ酸であってもよい。本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドはまた、非核酸リンカーを含んでもよい。例示的な非核酸リンカーは、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書で援用される）のパラグラフ［０３０３］～［０３０７］に記載されている。

【0284】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、別の核酸配列をさらに含む。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸を含む他の配列を含み得る。他の配列としては、限定はされないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、若しくは他のＲＮＡｉ分子をコードする配列が挙げられる。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチド中に存在する遺伝子発現産物と異なる遺伝子発現産物を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。

【0285】

安定性及び半減期
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、特定の配列特性を含む。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、特定のヌクレオチド組成物を含んでもよい。いくつかのそのような実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数のプリン（アデニン及び／又はグアノシン）リッチ領域を含んでもよい。いくつかのそのような実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数のプリン欠乏領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数のＡＵリッチ領域又はエレメント（ＡＲＥ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数のアデニンリッチ領域を含んでもよい。

【0286】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書中の他の箇所に記載される１つ又は複数の反復エレメントを含んでもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書中の他の箇所に記載される１つ又は複数の修飾を含む。

【0287】

環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列に対する、１つ又は複数の置換、挿入及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含んでもよい。例えば、親ポリリボヌクレオチドに対する、１つ又は複数の挿入、付加、欠失、及び／又は共有結合修飾を有する環状ポリリボヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例示的な修飾は、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書で援用される）のパラグラフ［０３１０］～［０３２５］中に記載されている。

【0288】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば、二次又は三次構造を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの相補的セグメントは、ペア間、例えば、Ａ－Ｕ及びＣ－Ｇ間の水素結合で共に維持された、二本鎖セグメントに自らフォールディングする。いくつかの実施形態では、ステムとしても知られるらせん体が分子内的に形成され、それはエンドループに連結された二本鎖セグメントを有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。

【0289】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの１つ又は複数の配列は、実質的に一本鎖の領域及び二本鎖の領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖対二本鎖の比は、環状ポリリボヌクレオチドの機能性に影響し得る。

【0290】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの１つ又は複数の配列は、実質的に一本鎖である。いくつかの実施形態では、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ又は複数の配列は、タンパク質又はＲＮＡ結合部位を含んでもよい。いくつかの実施形態では、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、立体構造的に柔軟であることで、相互作用の増強を可能にし得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、タンパク質又は核酸結合に対して結合又は増強するような二次構造を含むことを意図して改変される。

【0291】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、実質的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ又は複数の配列は、立体構造的な認識部位、例えば、リボスイッチ又はアプタザイムを含んでもよい。いくつかの実施形態では、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、立体構造的に強固であってもよい。いくつかのそのような例では、立体構造的に強固な配列は、環状ポリリボヌクレオチドがタンパク質又は核酸に結合することから立体的に妨げることができる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、タンパク質又は核酸結合を回避又は低減するような二次構造を含むことを意図して改変される。

【0292】

１６の塩基対が考えられるが、これらの内の６つ（ＡＵ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＵＧ、ＣＧ）が、実際の塩基対を形成し得る。残りは、ミスマッチと称され、らせん体で非常に低い頻度で生じる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの構造は、その機能及び致死的結果に対する影響を伴わずに容易に破壊することができず、それは二次構造を維持するための選択肢を提供する。いくつかの実施形態では、ステムの一次構造（即ち、それらのヌクレオチド配列）はやはり変化し得るが、らせん領域を依然として維持する。塩基の性質は、高次構造に派生するものであり、二次構造を保持する限り、置換は可能である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん状構造を有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん状構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｕリッチ若しくはＡリッチ配列又はそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、Ｕリッチ及び／又はＡリッチ配列は、三重疑似らせん状構造をもたらすような様式で配列される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん状構造を有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん状構造を有する１つ又は複数のセグメント（例えば、２、３、４、５、６、又はそれ以上）を有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列は、三重疑似らせん状構造をもたらすような様式で配列される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、安定化を補助する、分子内三重疑似らせん状構造を有する。

【0293】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、（例えば、リン酸ジエステル結合によって分離された）２つの疑似らせん状構造を有することで、それらの末端塩基対は積層し、疑似らせん状構造は共線性になり、「同軸的に積層された」部分構造をもたらす。

【0294】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数のモチーフ、例えば、シュードノット、ｇ－四重鎖、ヘリックス、及び同軸積層を有する三次構造を含む。

【0295】

本明細書で開示されるような環状ポリリボヌクレオチドの構造のさらなる例が、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書で援用される）のパラグラフ［０３２６］～［０３３３］に記載されている。

【0296】

その環状化の結果として、環状ポリリボヌクレオチドは、それを線状ＲＮＡと区別するいくつかの特徴を含み得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡと比較して、エキソヌクレアーゼによる分解に対する感受性がより低い。したがって、環状ポリリボヌクレオチドは、特に、エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされるとき、線状ＲＮＡより安定している。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの増加した安定性により、環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチドを生成する細胞形質転換試薬（例えば、免疫原及び／又はアジュバント））としてより有用になる。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの増加した安定性により、環状ポリリボヌクレオチドが、線状ＲＮＡより容易に及びより長く貯蔵可能になる。エキソヌクレアーゼで処理された環状ポリリボヌクレオチドの安定性は、ＲＮＡ分解が起こったかどうかを決定する、当該技術分野において標準的な方法を用いて（例えば、ゲル電気泳動によって）試験され得る。

【0297】

さらに、線状ＲＮＡと異なり、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドが、仔牛小腸ホスファターゼなどのホスファターゼと共にインキュベートされるとき、脱リン酸化に対する感受性がより低い。

【0298】

ある実施形態では、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの調製は、参照、例えば同じヌクレオチド配列を有するが環状されていない線状ポリリボヌクレオチド（例えば、線状同等物）より増加した半減期を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えば、エキソヌクレアーゼに対して抵抗性である。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、自己分解に対して抵抗性である。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、酵素切断部位、例えばダイサー切断部位を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、参照、例えば、線状対応物よりも、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％又は少なくとも約１００００％長い半減期を有する。

【0299】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂中、細胞内で存続する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、有糸分裂後、娘細胞内で存続する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、娘細胞に継代される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの自己複製を媒介する複製エレメントを含む。いくつかの実施形態では、複製エレメントは、環状ポリリボヌクレオチドの、環状ポリリボヌクレオチドに相補的（線状相補的）である線状ポリリボヌクレオチドへの転写を媒介する。いくつかの実施形態では、相補的な線状ポリリボヌクレオチドは、細胞内、インビボで、相補的な環状ポリリボヌクレオチドに環状化され得る。いくつかの実施形態では、相補的なポリリボヌクレオチドは、開始の環状ポリリボヌクレオチドと同一又は類似のヌクレオチド配列を有する、別の環状ポリリボヌクレオチドにさらに自己複製し得る。１つの例示的な自己複製エレメントは、ＨＤＶ複製ドメインを含む（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌ，２０１４，４５０－４５１：１６５－１７３によって記載の通り）。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で、娘細胞に継代する。いくつかの実施形態では、減数分裂を経ている細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で、娘細胞に継代する。いくつかの実施形態では、有糸分裂を経ている細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で、娘細胞に継代する。

【0300】

本明細書で開示されるような環状ポリリボヌクレオチドの安定性及び半減期のさらなる例は、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書で援用される）のパラグラフ［０３０８］～［０３０９］に記載されている。

【0301】

修飾
環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列、特に、親ポリリボヌクレオチドに対する、１つ又は複数の置換、挿入及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含んでもよいことは、本開示の範囲内に含まれる。

【0302】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の転写後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリＡ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化、並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ又は複数の転写後修飾は、ＲＮＡにおいて同定されている１００を超える異なるヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。いくつかの実施形態では、第１の単離核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０３１１］中に記載されるような群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。

【0303】

環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の有用な修飾を含んでもよい。ピリミジン核酸塩基の１つ又は複数の原子は、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（例えば、メチル又はエチル）、又はハロ（例えば、クロロ又はフルオロ）で置換（ｒｅｐｌａｃｅｄ）又は置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）されてもよい。特定の実施形態では、修飾（例えば、１つ又は複数の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれにおいて存在する。修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）又はそれらのハイブリッド）への修飾であってもよい。さらなる修飾は、本明細書中に記載されている。

【0304】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳効率を増加させるための少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベルを低下）させ得る。

【0305】

いくつかの実施形態では、修飾は、化学又は細胞誘導修飾を含んでもよい。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定例が、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０からのＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｐａｎ、“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”によって記載されている。

【0306】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドのリボヌクレオチドに対する化学修飾は、免疫逃避を増強し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、当該技術分野で十分に確立された方法、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ（ここで参照により本明細書中に援用される）に記載されたものによって合成及び／又は修飾されてもよい。修飾は、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化（モノ－、ジ－及びトリ－）、コンジュゲーション、逆結合など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、不安定化塩基、又はパートナーの拡大されたレパートリーと塩基対を形成する塩基との置換）、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基を含む。修飾リボヌクレオチド塩基はまた、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、いくつかの機能的効果を挙げると、環状ポリリボヌクレオチドの、発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化を調節し得る。いくつかの実施形態では、修飾は、双直交性のヌクレオチド、例えば、非天然塩基を含む。例えば、Ｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１７，５３：１２３０９，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｃ０６６６１ａ（ここで参照により援用される）を参照されたい。

【0307】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの１つ又は複数のリボヌクレオチドの糖修飾（例えば、２’位又は４’位）又は糖の置換、並びに骨格修飾は、リン酸ジエステル結合の修飾又は置換を含み得る。環状ポリリボヌクレオチドの具体例として、限定はされないが、リン酸ジエステル結合の修飾又は置換を含む、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合、例えば、ヌクレオシド間修飾を含む、環状ポリリボヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有する環状ポリリボヌクレオチドは、特に、骨格内にリン原子を有しないものを含む。本願を意図して、また時として当該技術分野で参照される通り、ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有しない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドと考えることができる。特定の実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有するリボヌクレオチドを含むことになる。

【0308】

修飾された環状ポリリボヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な３’－５’結合を有するボラノリン酸、これらの２’－５’結合類似体、及びヌクレオシド単位の隣接ペアが、３’－５’と５’－３’又は２’－５’と５’－２’で結合される、反転極性を有するものを含んでもよい。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、負又は正に荷電され得る。

【0309】

環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸塩骨格）に対して修飾され得る。本明細書では、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」及び「リン酸ジエステル」という語句は、互換可能に用いられる。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ又は複数を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、非修飾リン酸部分の、本明細書に記載のような別のヌクレオシド間結合による大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例として、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。ジチオリン酸は、硫黄によって置換された両方の非結合酸素を有する。また、リン酸リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）による結合酸素の置換によって修飾され得る。

【0310】

ａ－チオ置換リン酸部分は、ＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに非天然ホスホロチオエート骨格結合を介して安定性を与えるように提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、細胞環境下で、増強されたヌクレアーゼ抵抗性と、それに続く延長された半減期を有する。環状ポリリボヌクレオチドに連結されたホスホロチオエートは、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化を介して自然免疫応答を低減することが予想される。

【0311】

具体的な実施形態では、修飾ヌクレオシドは、α－チオヌクレオシド（例えば、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－アデノシン、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－グアノシン、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－ウリジン、又は５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－プソイドウリジン）を含む。

【0312】

亜リン酸原子を含まないヌクレオシド間結合を含む、本開示に従って用いられてもよい他のヌクレオシド間結合が、本明細書に記載される。

【0313】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の細胞傷害性ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、二機能性修飾などの環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれてもよい。細胞傷害性ヌクレオシドは、限定はされないが、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフール及びウラシルの組み合わせ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－ｌ－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（ｌＨ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、及び６－メルカプトプリンを含んでもよい。さらなる例として、リン酸フルダラビン、Ｎ４－ベヘノイル－ｌ－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、及びＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。

【0314】

環状ポリリボヌクレオチドは、分子の全長に沿って均一に修飾されてもされなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ又は複数又は全てのタイプ（例えば、天然に存在するヌクレオチド、プリン若しくはピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵの任意の１つ若しくは複数若しくは全て）は、環状ポリリボヌクレオチド、又はその所与の所定の配列領域において均一に修飾されてもされなくてもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、プソイドウリジンを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、イノシンを含み、それは環状ポリリボヌクレオチドを内因性ＲＮＡとウイルス性のＲＮＡとして特徴づける免疫系に寄与し得る。イノシンの組み込みはまた、ＲＮＡ安定性の改善／分解の減少を媒介し得る。例えば、Ｙｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４（その全体が参照により援用される）を参照されたい。

【0315】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド（又はその所与の配列領域）における全てのヌクレオチドが、修飾される。いくつかの実施形態では、修飾は、発現を増強し得るｍ６Ａ；免疫応答を減弱し得るイノシン；ＲＮＡ安定性、又は翻訳リードスルー（スタガー要素）を増強し得るプソイドウリジン、安定性を増強し得るｍ５Ｃ；及び細胞内転位（例えば、核局在化）を補助する２，２，７－トリメチルグアノシンを含んでもよい。

【0316】

異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、環状ポリリボヌクレオチド中の様々な位置に存在してもよい。当業者は、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が環状ポリリボヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることで、環状ポリリボヌクレオチドの機能が実質的に低下しないことを理解するであろう。修飾はまた、非コード領域修飾であってもよい。環状ポリリボヌクレオチドは、（全ヌクレオチド含量、又はヌクレオチドの１つ若しくは複数のタイプ、即ち、Ａ、Ｇ、Ｕ若しくはＣの任意の１つ若しくは複数のいずれかに対して）約１％～約１００％、又は任意の間の百分率（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。

【0317】

構造
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば、二次又は三次構造を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの相補的セグメントは、ペア間、例えば、Ａ－Ｕ及びＣ－Ｇ間の水素結合で共に維持された、二本鎖セグメントに自らフォールディングする。いくつかの実施形態では、ステムとしても知られるらせん体が分子内的に形成され、それはエンドループに連結された二本鎖セグメントを有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。いくつかの実施形態では、疑似二本鎖二次構造を有するセグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又はそれ以上の対合ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する１つ又は複数のセグメント（例えば、２、３、４、５、６、又はそれ以上）を有する。いくつかの実施形態では、セグメントは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又はそれ以上のヌクレオチドだけ分離される。

【0318】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの１つ又は複数の配列は、実質的に一本鎖の領域及び二本鎖の領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖対二本鎖の比は、環状ポリリボヌクレオチドの機能性に影響し得る。

【0319】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの１つ又は複数の配列は、実質的に一本鎖である。いくつかの実施形態では、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ又は複数の配列は、タンパク質又はＲＮＡ結合部位を含んでもよい。いくつかの実施形態では、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、立体構造的に柔軟であることで、相互作用の増強を可能にし得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、タンパク質又は核酸結合に対して結合又は増強するような二次構造を含むことを意図して改変される。

【0320】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位、例えば、少なくとも１つのタンパク質結合部位、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｔＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｒＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｐｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎｏＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｅｘＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｃａＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのＹ ＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｈｎＲＮＡ結合部位、及び／又は少なくとも１つのｔＲＮＡモチーフを有する。

【0321】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のものを含むように設計される。

【0322】

産生方法
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換え技術（例えば、ＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）、化学合成、又はそれらの組合せを用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。

【0323】

ＲＮＡ環を生成するのに使用されるＤＮＡ分子が、天然の元の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態、又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質、例えば、複数の免疫原を含む融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含み得ることは、本開示の範囲内である。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組合せなど、古典的な突然変異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。

【0324】

環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、化学合成及び酵素的合成を含む任意の利用可能な技術に従って調製され得る。ある実施形態では、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。環化又はコンカテマー化の機構は、限定はされないが、化学的、酵素的、スプリントライゲーション）、又はリボザイム触媒方法などの方法によって行われ得る。新たに形成される５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。

【0325】

本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；ｉｎ Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ ＆ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。

【0326】

環状ポリリボヌクレオチドを合成する様々な方法がまた、当該技術分野において記載されている（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット及び国際公開第２０１０／０８４３７１号パンフレットを参照されたい）。

【0327】

環状化
ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、環状化又はコンカテマー化され得る。ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達前にインビトロで環状化され得る。ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で環状化され得る。

【0328】

ａ．細胞外環状化
ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を用いて環状化又はコンカテマー化されて、環状ポリリボヌクレオチドを形成する。ある化学的方法において、核酸（例えば、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端は、互いに近づけると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成し得る化学的に反応性の基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性基を含有し得、３’末端は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、有機溶媒中において、線状ＲＮＡ分子の３’末端における３’－アミノ末端ヌクレオチドが、５’－ＮＨＳ－エステル部分上で求核攻撃を起こして、新たな５’－／３’－アミド結合を形成するようになっている。

【0329】

ある実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて、５’－リン酸化核酸分子（例えば、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新たなホスホロジエステル結合を形成する。例の反応において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って１～１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼと共に１時間にわたって３７℃でインキュベートされる（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために並んだ５’－及び３’－領域の両方と塩基対合することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。ある実施形態では、ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼのようなスプリントリガーゼがスプリントライゲーションに使用され得る。スプリントライゲーションでは、一本鎖ＲＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）は、２つの末端が一本鎖スプリントとのハブリダイゼーション時に並置され得るように線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計され得る。したがって、スプリントリガーゼは、線状環状ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端のライゲーションを触媒して、環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。

【0330】

ある実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリヌクレオチドの合成に使用される。ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかは、インビトロ転写中、得られる環状化のための線状ポリリボヌクレオチドが、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’末端を環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートすることが可能な活性リボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコードし得る。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０～３７℃の温度で１～２４時間行われ得る。

【0331】

ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの非核酸部分を用いることによって環状化又はコンカテマー化される。一態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化するために、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’末端の近傍及び／又は３’末端の近傍の領域又は特徴と反応し得る。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド５’末端及び／又は３’末端に位置するか又は連結されるか又はその近傍にあり得る。考えられる非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的な例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能な結合などの結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるアプタマー又は非核酸リンカーなどのオリゴヌクレオチド又はペプチド部分であり得る。

【0332】

ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド５’及び３’末端における、その近傍における若しくはそのような５’及び３’末端に連結された、原子間、分子表面間の吸引力を引き起こす非核酸部分により、環状化又はコンカテマー化される。非限定的な例として、１つ以上の環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化され得る。分子間力の非限定的な例としては、双極子－双極子力、双極子－誘起双極子力、誘起双極子－誘起双極子力、ファン・デル・ワールス力及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。

【0333】

ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、５’末端の近傍及び３’末端の近傍にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリボザイムの残りの部分に曝されるとき、ペプチドに共有結合し得る。一態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合されたペプチドは、互いに結合して、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化させ得る。別の態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡに共有結合されたペプチドは、限定はされないが、タンパク質ライゲーションなどの当該技術分野において公知の様々な方法を用いたライゲーションに線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを供した後、それらを環状化又はコンカテマー化させ得る。本開示の線状一次構築物若しくは線状ＲＮＡに使用するためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを組み込み且つ／又は共有結合するための方法の非限定的な一覧が米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。

【0334】

ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、例えば、５’トリホスフェートをＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることによって５’モノホスフェートに転化される核酸の５’トリホスフェートを含み得る。代わりに、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’トリホスフェートを５’モノホスフェートに転化することは、（ａ）環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビ由来アルカリホスファターゼ、又は仔牛小腸由来ホスファターゼ）と接触させて、３つ全てのホスフェートを除去する工程；及び（ｂ）工程（ａ）後の５’ヌクレオチドを、１つのホスフェートを追加するキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）と接触させる工程を含む２工程反応によって行われ得る。

【0335】

ある実施形態では、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は１００％である。ある実施形態では、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である。ある実施形態では、提供される環状化方法は、約１０％～約１００％の環状化効率を有し；例えば、環状化効率は、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、及び約９９％であり得る。ある実施形態では、環状化効率は、約２０％～約８０％である。ある実施形態では、環状化効率は、約３０％～約６０％である。ある実施形態では、環状化効率は、約４０％である。

【0336】

ｂ．スプライシング要素
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスプライシング要素を含む。例示的なスプライシング要素が、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２７０］～［０２７５］に記載されている。

【0337】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスプライシング要素を含む。本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スプライシング要素は、環状ポリリボヌクレオチドのスプライシングを媒介し得る完全なスプライシング要素であり得る。或いは、スプライシング要素はまた、完了したスプライシング事象からの残留スプライシング要素であり得る。例えば、ある場合には、線状ポリリボヌクレオチドのスプライシング要素は、線状ポリリボヌクレオチドの環状化をもたらすスプライシング事象を媒介し得、それによって、得られた環状ポリリボヌクレオチドは、このようなスプライシング媒介環状化事象からの残留スプライシング要素を含む。ある場合には、残留スプライシング要素は、いずれのスプライシングも媒介することができない。他の場合、残留スプライシング要素は、特定の状況下で依然としてスプライシングを媒介することができる。ある実施形態では、スプライシング要素は、少なくとも１つの発現配列に隣接している。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接するスプライシング要素を含む。ある実施形態では、スプライシング要素は、各発現配列の１つの側又は両側にあり、発現産物、例えば、ペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。

【0338】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、複製されると、スプライスされた末端が一緒に結合される内部スプライシング要素を含む。いくつかの例は、スプライス部位配列及び短い逆方向反復（３０～４０ｎｔ）、例えばＡｌｕＳｑ２、ＡｌｕＪｒ、及びＡｌｕＳｚ、隣接するイントロン中の逆方向配列、隣接するイントロン中のＡｌｕ要素、及びバックスプライス（ｂａｃｋｓｐｌｉｃｅ）事象に近接するｃｉｓ－配列要素に見られるモチーフ（サプタブル（ｓｕｐｔａｂｌｅ）４富化モチーフ）、例えば、隣接するエクソンを有するバックスプライス部位の２００ｂｐ前にある（上流の）又は後ろにある（下流の）配列を有する小型イントロン（＜１００ｎｔ）を含み得る。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、内部スプライシング要素として本明細書における他の箇所に記載される少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。このような実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリーからの反復配列を含み得る。ある実施形態では、スプライシング反復リボソーム結合タンパク質が、環状ポリリボヌクレオチド生合成（例えば、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ及びＱｕａｋｉｎｇ（ＱＫＩ）スプライシング因子）を調節し得る。

【0339】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの頭－尾結合に隣接する標準スプライス部位を含み得る。

【0340】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの３－ヌクレオチドバルジが隣接する４－塩基対ステムを含むバルジ－ヘリックス－バルジモチーフを含み得る。切断は、バルジ領域中の部位において生じ、末端５’－ヒドロキシル基及び２’、３’－環状ホスフェートを有する特徴的なフラグメントを生成する。環状化は、同じ分子の２’、３’－環状ホスフェートへの５’－ＯＨ基の求核攻撃によって進行して、３’、５’－ホスホジエステル架橋を形成する。

【0341】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ＨＰＲ要素を有する多量体反復ＲＮＡ配列を含み得る。ＨＰＲは、２’，３’－環状ホスフェート及び５’－ＯＨ末端を含む。ＨＰＲ要素は、環状化のために線状ポリリボヌクレオチドの５’－及び３’末端を自己プロセシングし、それによって末端を一緒にライゲートする。

【0342】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、自己スプライシング要素を含み得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）からのイントロンを含み得る。

【0343】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲーションを媒介する配列を含み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするためのＨＤＶ配列（例えば、ＨＤＶ複製ドメイン保存配列、ＧＧＣＵＣＡＵＣＵＣＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＵＣＣＵＣＡＧＵＡＣＵＣＵＵＡＣＵＣＵＵＵＵＣＵＧＵＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＵＧＣＵＧＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＣＡＡＧＵＵＣＧＡＧＣＡＵＧＡＧＣＣ（配列番号５）又はＧＧＣＵＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＵＣＣＵＣＡＧＵＡＣＵＣＵＵＡＣＵＣＵＵＵＵＣＵＧＵＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＵＧＣＵＧＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣ（配列番号６））を含み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするためのループＥ配列（例えば、ＰＳＴＶｄ中）を含み得る。別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己環状化イントロン、例えば、５’及び３’スプライス結合、又は自己環状化触媒イントロン、例えば、グループＩ、グループＩＩ又はグループＩＩＩイントロンを含み得る。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例は、Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄに由来する自己スプライシング置換イントロン－エクソン配列、及びテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡを含み得る。

【0344】

他の環状化方法
ある実施形態では、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内に又は隣接するイントロンにわたって反復又は非反復核酸配列を含む相補的配列を含み得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。ある実施形態では、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１～１０の間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０）の反復核酸配列であって、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント内の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する、反復核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの反復核酸配列であって、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント内の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する、反復核酸配列を含む。ある実施形態では、２つの別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態では、相補的配列は、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端において見られる。ある実施形態では、相補的配列は、約３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを含む。

【0345】

ある実施形態では、環状化の化学的方法が、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。このような方法としては、限定はされないが、クリック化学（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法又はクリック可能な塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホロアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾及びそれらの任意の組合せが挙げられる。

【0346】

ある実施形態では、環状化の酵素的方法は、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。ある実施形態では、ライゲーション酵素、例えばＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボヌクレアーゼの相補鎖又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するのに使用され得る。

【0347】

環状ポリリボヌクレオチドの環状化は、当該技術分野において公知の方法、例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１５，４３（４）：２４５４－２４６５からのＰｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる“ＲＮＡ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”及びＲＮＡ Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７からのＭｕｌｌｅｒ及びＡｐｐｅｌによる“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ”に記載されているものによって行われ得る。

【0348】

環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。例示的な複製要素が、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２８０］～［０２８６］に記載されている。

【0349】

環状ポリリボヌクレオチドの精製
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、精製され、例えば、遊離リボ核酸、線状又はニックＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などは、除去される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、当該技術分野で一般に用いられる任意の公知の方法によって精製されてもよい。非限定的な精製方法の例として、カラムクロマトグラフィー、ゲル切除、サイズ排除などが挙げられる。

【0350】

線状及び環状ＲＮＡの検出
環状ＲＮＡ医薬調製物中の線状ＲＮＡの存在は、予期せぬ、時に望ましくない効果を及ぼし得る。従って、環状ＲＮＡを線状ＲＮＡと比べて濃縮し、分離し、及び／又は精製し得る；線状ＲＮＡをモニタし、評価し、及び／又は制御することのできる方法（例えば、環状ＲＮＡ調製物の製造方法）；及びかかる医薬組成物及び調製物を使用する方法、例えば、治療エフェクターなどのエフェクター又は足場（例えば、アプタマー配列）を細胞、組織又は対象に送達するための方法。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡ調製物は、閾値レベル以下の線状ＲＮＡを有し、例えば、環状ＲＮＡ調製物は、線状ＲＮＡと比べて濃縮されるか、又は線状ＲＮＡが減少するように精製される。

【0351】

概して、医薬調製物中の要素の検出及び定量化は、目的の成分（例えば、環状ＲＮＡ、線状ＲＮＡ、断片、不純物等）若しくは類似の材料（例えば、環状ＲＮＡの標準として環状ＲＮＡ構造と同じ配列の線状ＲＮＡ構造を使用する）のいずれかである参照標準の使用を含み、又は試験試料からの内部標準若しくはシグナルの使用を含む。いくつかの実施形態では、標準を使用して、既知量又は相対量の材料についての検出器からの応答（レスポンスファクター）を確立する。いくつかの実施形態では、レスポンスファクターは、１つ又は複数の濃度の標準から（例えば、線形回帰分析を用いて）決定される。いくつかの実施形態では、次にレスポンスファクターを使用して、その成分に起因するシグナルから目的の材料の量が決定される。いくつかの実施形態では、レスポンスファクターは、１の値であるか、又は１の値を有すると仮定される。

【0352】

いくつかの実施形態では、医薬組成物中の環状ＲＮＡと比べた線状ＲＮＡの検出及び定量化が、線状バージョンの環状ポリリボヌクレオチドとの比較を用いて決定される。いくつかの実施形態では、線状バージョンの環状ポリリボヌクレオチドを使用し、及び１のレスポンスファクターを仮定して作成した検量線を使用して、医薬組成物中の全リボヌクレオチドの質量が決定される。いくつかの実施形態では、複数の既知量の線状バージョンの環状ポリリボヌクレオチドのバンド強度によって作成した検量線を医薬調製物中の環状ポリリボヌクレオチドのバンド強度と比較することにより、医薬調製物中の環状ポリリボヌクレオチドのｗ／ｗパーセンテージが決定される。いくつかの実施形態では、ゲルベースの電気泳動法の間にバンドが生成され、バンド強度がゲルイメージャ（例えば、Ｅ－ｇｅｌイメージャ）によって測定される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物は、本明細書に記載されるとおり評価したとき閾値量未満（例えば、ここで閾値量は、参照基準、例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の医薬品出荷規格である）の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。

【0353】

いくつかの実施形態では、医薬組成物中の全ＲＮＡと比べたニックＲＮＡの検出及び定量化が、環状ＲＮＡを含む調製物のゲル抽出後にシーケンシングすることにより決定される。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の線状ＲＮＡと比べたニックＲＮＡの検出及び定量化が、環状ＲＮＡを含む調製物のゲル抽出後にシーケンシングすることにより決定される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物は、本明細書に記載されるとおり評価したとき閾値量未満（例えば、ここで閾値量は、参照基準、例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の医薬品出荷規格である）のニックＲＮＡ、線状ＲＮＡ、又は線状ＲＮＡとニックＲＮＡとの組み合わせを含む。例えば、調製物中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、調製物中の総リボヌクレオチド分子を基準として３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、又は０．１％以下の線状ポリリボヌクレオチド分子、又はこれらの間にある任意のパーセンテージである。いくつかの実施形態では、調製物中に存在するニックポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、調製物中の総リボヌクレオチド分子を基準として３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、又は０．１％以下、又はこれらの間にある任意のパーセンテージのニックポリリボヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態では、調製物中に存在する線状及びニックポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、調製物中の総リボヌクレオチド分子を基準として４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、又は０．１％以下、又はこれらの間にある任意のパーセンテージの線状ポリリボヌクレオチド分子とニックポリリボヌクレオチド分子との組み合わせである。

【0354】

いくつかの実施形態では、標準は、試料と同じ条件下で実行される。例えば、標準は、試料と同じ種類のゲル、同じ緩衝液、及び同じ露光量で実行される。さらなる実施形態では、標準は、試料と並行して実行される。いくつかの実施形態では、要素の定量化は対象調製物からの複数の試料で（例えば、２回又はトリプリケートで）繰り返され、平均結果が求められる。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡの定量化は、並列キャピラリー電気泳動法を用いて（例えば、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＵＶ検出を伴う分析的ＨＰＬＣを用いて）測定される。

【0355】

精製方法
環状ポリリボヌクレオチドは、望ましくない物質（望ましくない（例えば、線状）ＲＮＡ、酵素、ＤＮＡなど）から分離され、濃縮され、又は精製され得る。いくつかの実施形態では、望ましくない物質は、環状ポリリボヌクレオチドを作製及び／又は製造する過程で存在し、又はそれから発生するものである。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、医薬調製物、医薬組成物、医薬原体、又は医薬製剤の製剤化前に濃縮及び／又は精製され得る。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、医薬調製物、医薬組成物、医薬原体、又は医薬製剤の製剤化中又は製剤化後に濃縮及び／又は精製され得る。

【0356】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、生成中又は生成後に精製することにより、望ましくない要素、例えば、線状ＲＮＡ、又はニックＲＮＡ、並びに認識されている不純物、例えば、遊離リボ核酸（例えば、モノリボ核酸、ジリボ核酸、又はトリリボ核酸）、ＤＮＡ（例えば、宿主細胞ＤＮＡなどの細胞ＤＮＡ）、細胞又はプロセス関連タンパク質不純物（例えば、細胞又はプロセス関連不純物）等が除去され得る。いくつかの実施形態では、不純物は、プロセス関連不純物である。いくつかの実施形態では、プロセス関連不純物は、タンパク質（例えば、細胞タンパク質）、核酸（例えば、細胞核酸）、緩衝液又は緩衝液試薬、酵素、培地／試薬成分（例えば、培地、培地添加剤、遷移金属、又はビタミン）、分取又は分析的ゲル成分（例えば、アクリルアミド破片）、ＤＮＡ、又はクロマトグラフィー材料である。緩衝液試薬は、ＭｇＣｌ_２、ＤＴＴ、ＡＴＰ、ＳＤＳ、Ｎａ、グリコーゲン、トリス－ＨＣＬ、又はＥｔＯＨであってもよい。緩衝液試薬には、限定はされないが、酢酸塩、トリス、重炭酸塩、リン酸塩、クエン酸、乳酸塩、又はＴＥＡが含まれ得る。酵素は、リガーゼであってもよい。リガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２であってもよい。いくつかの実施形態では、不純物は、緩衝液試薬、培地／試薬成分、塩、リガーゼ、ヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ阻害薬、ＲＮアーゼＲ、線状ポリリボヌクレオチド分子、デオキシリボヌクレオチド分子、アクリルアミド破片、又はモノヌクレオチド分子である。

【0357】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、当該技術分野で一般的に用いられる任意の公知の方法によって濃縮又は精製され得る。非限定的な精製方法の例としては、カラムクロマトグラフィー、ゲル切り出し、サイズ排除等が挙げられる。

【0358】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ゲルによって精製される。例えば、環状ＲＮＡが変性ＰＡＧＥ上で分離されてもよく、環状ＲＮＡに対応するバンドが切り出されてもよく、公知の方法を用いてバンドから環状ＲＮＡが溶出されてもよい。溶出した環状ＲＮＡは、次に分析されてもよい。

【0359】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、クロマトグラフィー、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、混合モードクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、例えば、逆相イオン対クロマトグラフィー（ＩＰ－ＲＰ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥ）、アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）、及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、及びこれらの任意の組み合わせによって精製される。

【0360】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの構造的特徴を利用してそれを線状ＲＮＡ又は不純物と分離することによって精製される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、構造的特徴（例えば、自由端の欠如）を利用することによって精製される。例えば、環状ＲＮＡは、環状ＲＮＡと、同じヌクレオチド配列を持つ線状ＲＮＡ対応物との混合プールを含む調製物から、線状ＲＮＡ対応物又はその断片のポリアデニル化を用いて濃縮される。線状ＲＮＡ対応物又はその断片の３’末端をポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリアデニル化することができ、その結果、３’ポリアデニンテールが付加されることになる。いくつかの実施形態では、この３’ポリアデニンテールにより、アフィニティーカラムなど、カラムを使用した線状ＲＮＡ及びその断片のプルダウンが可能となり、環状ＲＮＡが濃縮される。ポリ（Ａ）ポリメラーゼはまた、ビオチン化Ｎ６－ＡＴＰ類似体など、修飾されたアデニンを取り込むこともできる。このように３’ポリアデニンテールにビオチン化Ｎ６－ＡＴＰ類似体を付加すると、ビオチン－ストレプトアビジン結合システムなどのシステムでの線状ＲＮＡ及びその断片のプルダウンが可能となる。対照的に、環状化したＲＮＡは３’末端を有しないため、従ってポリ（Ａ）ポリメラーゼによってポリアデニル化されず、コンジュゲーション用のポリアデニル化されたテールがなく、プルダウンで捕捉されない。従って、プルダウン後、調製物において環状ＲＮＡが濃縮される。

【0361】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡの構造的特徴（例えば、自由端の存在）を利用することによって精製される。例えば、環状ＲＮＡは、環状ＲＮＡと、同じヌクレオチド配列を持つ線状ＲＮＡ対応物との混合プールを含む調製物から、線状ＲＮＡ対応物のポリアデニル化を用いて濃縮される。混合プールにエキソヌクレアーゼを加えて線状ＲＮＡを加水分解することができる。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼは、３’エキソヌクレアーゼ又は５’エキソヌクレアーゼであってもよい。いくつかの実施形態では、３’エキソヌクレアーゼ及び５’エキソヌクレアーゼを使用することができる。

【0362】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、質量基準で少なくとも２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）の純度である。純度は、限定はされないが、質量分析、紫外可視、蛍光、光散乱、屈折率に基づくか、又は銀若しくは色素染色又は放射性崩壊を検出に用いる検出技法を用いた、分離前又は分離後誘導体化方法論を伴う又は伴わないクロマトグラフィー（カラムを使用する、ペーパーを使用する、ゲルを使用する、ＨＰＬＣを使用する、ＵＨＰＬＣを使用する等、又はＩＣによる、ＳＥＣによる、逆相による、陰イオン交換による、混合モードによる等）又は電気泳動法（尿素ＰＡＧＥ、チップベース、ポリアクリルアミドゲル、ＲＮＡ、キャピラリー、ｃ－ＩＥＦ等）などの分離技術の使用など、当業者に公知の幾つもの分析的技法のいずれか１つによって測定し得る。或いは、純度は、質量分析法によるか、顕微鏡法によるか、円偏光二色性（ＣＤ）分光法によるか、紫外又は紫外可視分光光度法によるか、蛍光定量法（例えば、Ｑｕｂｉｔ）によるか、ＲＮアーゼＨ分析によるか、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるか、又は銀若しくは色素染色又は放射性崩壊を検出に利用する方法により分離技術を使用することなく決定し得る。

【0363】

いくつかの実施形態では、純度は、生物学的試験方法（例えば、細胞ベース又は受容体ベースの試験）によって測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される調製物中のリボヌクレオチド質量の総量の少なくとも２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）又は１００％（ｗ／ｗ）が、環状ポリリボヌクレオチド分子に含まれる。パーセントは、限定はされないが、質量分析、紫外可視、蛍光、光散乱、屈折率に基づくか、又は銀若しくは色素染色又は放射性崩壊を検出に用いる検出技法を用いた、分離前又は分離後誘導体化方法論を伴う又は伴わないクロマトグラフィー（カラムを使用する、ペーパーを使用する、ゲルを使用する、ＨＰＬＣを使用する、ＵＨＰＬＣを使用する等、又はＩＣによる、ＳＥＣによる、逆相による、陰イオン交換による、混合モードによる等）又は電気泳動法（尿素ＰＡＧＥ、チップベース、ポリアクリルアミドゲル、ＲＮＡ、キャピラリー、ｃ－ＩＥＦ等）などの分離技術の使用など、当業者に公知の幾つもの分析的技法のいずれか１つによって測定し得る。或いは、純度は、質量分析法によるか、顕微鏡法によるか、円偏光二色性（ＣＤ）分光法によるか、紫外又は紫外可視分光光度法によるか、蛍光定量法（例えば、Ｑｕｂｉｔ）によるか、ＲＮアーゼＨ分析によるか、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるか、又は銀若しくは色素染色又は放射性崩壊を検出に利用する方法により分離技術を使用することなく決定し得る。

【0364】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、１００，０００μｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、６５０ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、又は７５０ｍｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド濃度を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、モノヌクレオチドを実質的に含まないか、又は１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のモノヌクレオチド含量を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、検出限界から最大１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬまでのモノヌクレオチド含量を有する。

【0365】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、質量基準で総ヌクレオチドの０．１％（ｗ／ｗ）、０．２％（ｗ／ｗ）、０．３％（ｗ／ｗ）、０．４％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、０．６％（ｗ／ｗ）、０．７％（ｗ／ｗ）、０．８％（ｗ／ｗ）、０．９％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）以下、又はこれらの間にある任意のパーセンテージのモノヌクレオチド含量を有し、ここで総ヌクレオチド含量は、デオキシリボヌクレオチド分子及びリボヌクレオチド分子の総質量である。

【0366】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、６５０ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、又は７５０ｍｇ／ｍＬ以下の線状ＲＮＡ含量、例えば、線状ＲＮＡ対応物又はＲＮＡ断片を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、検出限界から最大１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、６００ｍｇ／ｍｌ、６５０ｍｇ／ｍｌ、７００ｍｇ／ｍｌ、又は７５０ｍｇ／ｍｌまでの線状ＲＮＡ含量、例えば、線状ＲＮＡ対応物又はＲＮＡ断片を有する。

【0367】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、１０％（ｗ／ｗ）、９．９％（ｗ／ｗ）、９．８％（ｗ／ｗ）、９．７％（ｗ／ｗ）、９．６％（ｗ／ｗ）、９．５％（ｗ／ｗ）、９．４％（ｗ／ｗ）、９．３％（ｗ／ｗ）、９．２％（ｗ／ｗ）、９．１％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、又は０．１％（ｗ／ｗ）以下、又はこれらの間にあるパーセンテージのニックＲＮＡ含量を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、ゼロに等しいような低さのニックＲＮＡ含量を有するか、又はニックＲＮＡを実質的に含まない。

【0368】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、７０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、又は０．１％（ｗ／ｗ）以下、又はこれらの間にあるパーセンテージの線状ＲＮＡとニックＲＮＡとの組み合わせの含量を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）はゼロに等しいような低さのニックＲＮＡと線状ＲＮＡとの組み合わせの含量を有するか、又はニック及び線状ＲＮＡを実質的に含まない。

【0369】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、分離前又は分離後のいずれかの誘導体化方法論を使用する又は使用しない、ＨＰＬＣ、チップ又はゲルベースの電気泳動法による、ＨＰＬＣを含めた分離方法の使用を伴う又は伴わない、質量分析法、紫外分光検出器又は蛍光検出器、光散乱技法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する方法、銀若しくは色素染色又は放射性崩壊を用いる検出方法、又は顕微鏡法、目視方法若しくは分光光度計など、分析的方法論の検出限界以下の線状ＲＮＡ含量、例えば、線状ＲＮＡ対応物又はＲＮＡ断片を有する。

【0370】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、例えば、実施例２の方法によって測定したとき、０．１％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下の線状ＲＮＡを有する。

【0371】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物の線状ポリリボヌクレオチド分子には、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状対応物又はその断片が含まれる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物の線状ポリリボヌクレオチド分子には、線状対応物（例えば、環状化する前のバージョン）が含まれる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物の線状ポリリボヌクレオチド分子には、環状ポリリボヌクレオチドに対応しないもの又はその断片が含まれる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物の線状ポリリボヌクレオチド分子には、環状ポリリボヌクレオチドに対応しないものが含まれる。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチド分子には、環状ポリリボヌクレオチドの対応物と、環状ポリリボヌクレオチドに対応しないもの又はその断片との組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチド分子には、環状ポリリボヌクレオチドの対応物と、環状ポリリボヌクレオチドに対応しないものとの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチド分子断片は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００ヌクレオチド長、又はそれ以上、又はこれらの間にある任意のヌクレオチド数の断片である。

【0372】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、例えば、分光光度計によって測定したとき、約１．６～約２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を有する。いくつかの実施形態では、Ａ２６０／Ａ２８０吸光度比は、約１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、又はこれらの間にある任意の数である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの生成における中間体）は、例えば、分光光度計によって測定したとき、約１．８のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を有する。いくつかの実施形態では、Ａ２６０／Ａ２８０吸光度比は、約１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又はそれ以上である。

【0373】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、不純物を実質的に含まない。様々な実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物中の少なくとも１つの不純物のレベルは、不純物を取り除く精製又は処理の前の組成物と比較して少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）減少している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つプロセス関連不純物のレベルは、不純物を取り除く精製又は処理の前の組成物と比較して少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）減少している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの生成物関連物質のレベルは、不純物を取り除く精製又は処理の前の組成物と比較したとき少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）減少している。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、プロセス関連不純物をそれ以上実質的に含まない。いくつかの実施形態では、プロセス関連不純物には、タンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質）、デオキシリボ核酸（例えば、宿主細胞デオキシリボ核酸などの細胞デオキシリボ核酸）、モノデオキシリボヌクレオチド又はジデオキシリボヌクレオチド分子、酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、又はリガーゼ）、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフィー材料が含まれる。いくつかの実施形態では、不純物は、緩衝液試薬、リガーゼ、ヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ阻害薬、ＲＮアーゼＲ、デオキシリボヌクレオチド分子、アクリルアミドゲル破片、及びモノデオキシリボヌクレオチド分子から選択される。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、１ミリグラム（ｍｇ）の環状ポリリボヌクレオチド分子当たり０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満の夾雑タンパク質のタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質）夾雑物を含む。

【0374】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、ＤＮＡ含量、例えば、鋳型ＤＮＡ又は細胞ＤＮＡ（例えば、宿主細胞ＤＮＡ）を実質的に含まないか、ＤＮＡ含量がゼロに等しいような低さであるか、又は１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のＤＮＡ含量を有する。

【0375】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、ＤＮＡ含量を実質的に含まないか、ＤＮＡ含量がゼロに等しいような低さであるか、又は質量基準で総ヌクレオチドの０．００１％（ｗ／ｗ）、０．０１％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下のＤＮＡ含量を有し、ここで総ヌクレオチド分子は、デオキシリボヌクレオチド含量及びリボヌクレオチド分子の総質量である。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、定量的液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によるヌクレオシドを消化する酵素による全ＤＮＡ消化後に測定したとき（ここでＤＮＡ含量は、ＬＣ－ＭＳによって測定したときの塩基（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）毎の検量線から逆算される）、ＤＮＡ含量を実質的に含まないか、ＤＮＡ含量がゼロに等しいような低さであるか、又は質量基準で総ヌクレオチドの０．００１％（ｗ／ｗ）、０．０１％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下のＤＮＡ含量を有する。

【0376】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌ以下のタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば、酵素、生成関連タンパク質、例えば、キャリアータンパク質）夾雑物を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの生成における中間体）は、検出限界から最大０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌまでのタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）などの生成関連タンパク質、例えば、酵素）夾雑物を有する。

【0377】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、１ミリグラム（ｍｇ）の環状ポリリボヌクレオチド当たり０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）などの生成関連タンパク質、例えば、酵素）夾雑物を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの生成における中間体）は、１ミリグラム（ｍｇ）の環状ポリリボヌクレオチド当たり検出レベルから最大０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇまでのタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）などの生成関連タンパク質、例えば、酵素）夾雑物を有する。

【0378】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、例えば、リムルス（ＬＡＬ）試験法によって測定したときエンドトキシンが低レベルであるか、又は実質的に存在しない。いくつかの実施形態では、医薬調製物又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの生成における中間体は、リムルス試験法によって測定したとき２０ＥＵ／ｋｇ（重量）、１０ＥＵ／ｋｇ、５ＥＵ／ｋｇ、１ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はそれを欠いている。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド組成物はヌクレアーゼ又はリガーゼが低レベルであるか、又は存在しない。

【0379】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、約５０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１９％（ｗ／ｗ）、１８％（ｗ／ｗ）、１７％（ｗ／ｗ）、１６％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１４％（ｗ／ｗ）、１３％（ｗ／ｗ）、１２％（ｗ／ｗ）、１１％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）以下の少なくとも１つの酵素、例えば、ポリメラーゼ、例えば、ＲＮＡポリメラーゼを含む。

【0380】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は無菌であるか、又は微生物を実質的に含まず、例えば、組成物又は調製物は、無菌条件下で試験したとき１００より少ない生存微生物の増殖を支持し、組成物又は調製物はＵＳＰ＜７１＞の規格に適合しており、及び／又は組成物又は調製物はＵＳＰ＜８５＞の規格に適合している。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、滅菌前に１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満、５０ＣＦＵ／１００ｍｌ、４０ＣＦＵ／１００ｍｌ、３０ＣＦＵ／１００ｍｌ、２００ＣＦＵ／１００ｍｌ、１０ＣＦＵ／１００ｍｌ、又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌのバイオバーデンを含む。

【0381】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物は、カラムクロマトグラフィー又はｐＨ／バイアル不活性化など、不純物を取り除く当該技術分野における公知の技法を用いてさらに精製することができる。

【0382】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物は、環状ポリリボヌクレオチド調製物が精製ステップ（又は複数の精製ステップ）を受けたとき、１つ又は複数の精製ステップ前と比較して、対象への投与後に低下したレベルの１つ又は複数の免疫又は炎症反応マーカーを生成する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の免疫又は炎症反応マーカーは、サイトカイン又は免疫応答関連遺伝子である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の免疫又は炎症反応マーカーは、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ、ＩＦＮ－β、ＯＡＳ、及びＯＡＳＬなどの遺伝子の発現である。

【0383】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における中間体）は、発現産物、例えば、タンパク質、例えば、インビトロ翻訳活性を発現する。

【0384】

送達
本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、担体を有する医薬組成物又は担体を有しない医薬組成物に含まれてもよい。

【0385】

本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、薬学的担体及び／又は高分子担体、例えば、リポソームなどの担体を含むように製剤化され、それを必要とする対象（例えば、ヒト又は非ヒトの農業用又は家畜用動物、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に公知の方法によって送達されてもよい。そのような方法として、限定はされないが、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）；エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、マイクロインジェクション、微粒子銃（「遺伝子銃」）、ｆｕｇｅｎｅ、直接音波負荷、細胞圧迫、光学トランスフェクション、プロトプラスト融合、インパレフェクション、マグネトフェクション、エキソソーム媒介移行、脂質ナノ粒子媒介移行、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。送達の方法はまた、例えば、Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５，２６（７）：４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０に記載されている。

【0386】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、「ネイキッド」送達製剤で送達されてもよい。ネイキッド送達製剤は、担体の補助なしに、また環状若しくは線状ポリリボヌクレオチドの共有結合修飾又は環状若しくは線状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全なカプセル封入を伴わずに、環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達する。

【0387】

ネイキッド送達製剤は、担体から遊離された製剤であり、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を補助する部分に結合する共有結合修飾を伴わず、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、部分的でなく、又は完全にカプセル封入される。いくつかの実施形態では、細胞への送達を補助する部分に結合する共有結合修飾を伴わない環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を補助するタンパク質、小分子、粒子、ポリマー、又は生体高分子などの部分に共有結合的に結合されないポリリボヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、プロタミン又はプロタミン塩（例えば、プロタミン硫酸塩）を有する送達製剤で送達されてもよい。

【0388】

細胞への送達を補助する部分に結合する共有結合修飾を伴わないポリリボヌクレオチドは、修飾リン酸基を含まなくてもよい。例えば、細胞への送達を補助する部分に結合する共有結合修飾を伴わないポリリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル若しくはアリールホスホネート、又はホスホトリエステルを含まなくてもよい。

【0389】

いくつかの実施形態では、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体を含まなくてもよい。例えば、ネイキッド送達製剤は、コハク酸フィトグリコーゲンオクテニル、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－ｂ－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ｌ－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ＼Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣ１）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンを含まなくてもよい。

【0390】

ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤（ｎｏｎ－ｃａｒｒｉｅｒ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、非担体賦形剤は、活性細胞の透過効果を示さない不活性成分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、非担体賦形剤は、緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含んでもよい。いくつかの実施形態では、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤、懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、平滑剤、又は油であってもよい。

【0391】

いくつかの実施形態では、ネイキッド送達製剤は、非経口的に許容できる希釈剤などの希釈剤を含んでもよい。希釈剤（例えば、非経口的に許容できる希釈剤）は、液体希釈剤又は固体希釈剤であってもよい。いくつかの実施形態では、希釈剤（例えば、非経口的に許容できる希釈剤）は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝剤、又は等張剤であってもよい。ＲＮＡ可溶化剤の例として、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド、及び２－プロパノールが挙げられる。緩衝剤の例として、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビストリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ヘペス）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン、又はリン酸が挙げられる。等張剤の例として、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、又はスクロースが挙げられる。

【0392】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような医薬調製物、本明細書で開示されるような医薬組成物、開示のような医薬品原体、又は本明細書で開示されるような医薬品製剤は、非経口的な核酸送達系に含まれる。親核酸送達系は、本明細書で開示されるような医薬調製物、本明細書で開示されるような医薬組成物、開示のような医薬品原体、又は本明細書で開示されるような医薬品製剤、及び非経口的に許容できる希釈剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、非経口的な核酸送達系における本明細書で開示されるような医薬調製物、本明細書で開示されるような医薬組成物、開示のような医薬品原体、又は本明細書で開示されるような医薬品製剤は、担体を全く含まない。

【0393】

本開示は、本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチドを含む宿主又は宿主細胞をさらに対象とする。いくつかの実施形態では、宿主又は宿主細胞は、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）、又は他の生物若しくは細胞である。

【0394】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば、記載された環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いている環状ポリリボヌクレオチドによって誘起される応答と比較して、低下した宿主の免疫系による望ましくない応答を有するか、又はそれを生成できない。実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主において非免疫原性である。いくつかの免疫応答として、限定はされないが、体液性免疫応答（例えば、免疫原に特異的な抗体の産生）及び細胞媒介免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。

【0395】

いくつかの実施形態では、宿主又は宿主細胞は、環状ポリリボヌクレオチド又は線状ポリリボヌクレオチドと接触される（例えば、それに送達又は投与される）。いくつかの実施形態では、宿主は、ヒトなどの哺乳動物である。宿主における環状ポリリボヌクレオチド又は線状ポリリボヌクレオチド、発現産物、又は双方の量は、投与後の任意の時点で測定され得る。特定の実施形態では、培養下の宿主成長の時間経過が測定される。成長が環状ポリリボヌクレオチド又は線状ポリリボヌクレオチドの存在下で増強又は低減される場合、環状ポリリボヌクレオチド又は発現産物又は双方は、宿主の成長を増強又は低減するのに有効なものとして同定される。

【0396】

本明細書に記載のような環状又は線状ポリリボヌクレオチド分子を細胞、組織、又は対象に送達する方法は、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。

【0397】

いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、有蹄動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、組織は、結合組織、筋肉組織、神経組織、又は上皮組織である。いくつかの実施形態では、組織は、臓器（例えば、肝臓、肺、脾臓、腎臓など）である。

【0398】

いくつかの実施形態では、送達する方法は、インビボ方法である。例えば、本明細書に記載のような環状ポリリボヌクレオチドの送達方法は、非経口的にそれを必要とする対象に、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。別の例として、環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞又は組織に送達する方法は、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤を細胞又は組織に非経口的に投与することを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、対象における生物学的応答を誘発するのに有効な量である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、対象における細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、担体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、希釈剤を含み、担体を全く含まない。

【0399】

いくつかの実施形態では、医薬組成物、医薬品原体、又は医薬品製剤は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物、医薬品原体、又は医薬品製剤は、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、皮内に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、リンパ内に、皮下に、又は筋肉内に投与される。いくつかの実施形態では、非経口投与は、静脈内、筋肉内、眼科的、皮下、皮内又は局所による。

【0400】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、筋肉内に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、皮下に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、局所的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物、医薬品原体、又は医薬品製剤は、気管内に投与される。

【0401】

いくつかの実施形態では、医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、注射によって投与される。投与は、全身投与又は局所投与であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような送達方法のいずれかは、担体を用いて実施される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようないずれかの送達方法は、担体又は細胞透過剤の補助なしに実施される。

【0402】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物は、投与するステップから少なくとも１日後、少なくとも２日後、少なくとも３日後、少なくとも４日後、又は少なくとも５日後、細胞、組織、又は対象において検出される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在は、投与するステップ前、細胞、組織、又は対象において評価される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在は、投与するステップ後、細胞、組織、又は対象において評価される。

【0403】

製剤
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬製剤は、（ｉ）本明細書で開示される化合物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）；（ｉｉ）緩衝剤；（ｉｉｉ）非イオン界面活性剤；（ｉｖ）等張化剤；及び／又は（ｖ）安定剤を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬製剤は、（ｉ）本明細書で開示される化合物（例えば、線状ポリリボヌクレオチド）；（ｉｉ）緩衝剤；（ｉｉｉ）非イオン界面活性剤；（ｉｖ）等張化剤；及び／又は（ｖ）安定剤を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬製剤は、安定な液体医薬製剤である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬製剤は、プロタミン又はプロタミン塩（例えば、プロタミン硫酸塩）を含む。

【0404】

本開示は、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。本開示は、本明細書に記載の線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。本開示の免疫原性組成物は、希釈剤若しくは担体、アジュバント、又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。本開示の免疫原性組成物はまた、１つ又は複数の免疫調節剤、例えば、１つ又は複数のアジュバントを含んでもよい。アジュバントは、以下にさらに考察される、ＴＨ１アジュバント及び／又はＴＨ２アジュバントを含んでもよい。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、担体を全く含まない希釈剤を含み、環状ポリリボヌクレオチドの対象へのネイキッド送達に使用される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、担体を全く含まない希釈剤を含み、線状ポリリボヌクレオチドの対象へのネイキッド送達に使用される。

【0405】

本開示の免疫原性組成物を用いて、対象における免疫応答を産生させる。免疫応答は、好ましくは、保護的であり、好ましくは、抗体応答（通常はＩｇＧを含む）及び／又は細胞媒介免疫応答を含む。例えば、対象は、免疫応答を誘導するため、本開示の環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫される。別の例では、対象は、免疫原に結合する抗体の産生を刺激するため、免疫原を含む線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫される。これらの使用及び方法によって、対象における免疫応答を産生させることにより、対象は、様々な疾患及び／又は感染に対して、例えば、上で考察のような細菌性及び／又はウイルス性疾患に対して保護され得る。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ワクチン組成物である。本開示に従うワクチンは、予防的（即ち、感染を予防するため）又は治療的（即ち、感染を治療するため）のいずれであってもよいが、典型的には予防的となる。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、動物、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトである。一実施形態では、対象は、ヒトである。他の実施形態では、対象は、例えば、雌ウシ（例えば、乳牛及び肉牛）、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、イヌ、又はネコから選択される、非ヒト哺乳動物である。他の実施形態では、対象は、鳥類、例えば、雌鳥又は雄鶏、シチメンチョウ、オウムである。いくつかの実施形態では、動物は、マウス又はウサギ又は雌ウシでない。特定の実施形態では、免疫原性組成物が予防用途である場合、ヒトは、小児（例えば、幼児又は乳児）又はティーンエイジャーである。別の実施形態では、免疫原性組成物が治療用途である場合、ヒトは、ティーンエイジャー又は成人である。また、小児用が意図される免疫原性組成物は、例えば、安全性、用量、免疫原性などを評価するため、成人に投与されてもよい。

【0406】

本開示に従って調製された免疫原性組成物を用いて、小児及び成人の双方を治療してもよい。ヒト対象は、１歳未満、５歳未満、１～５歳、５～１５歳、１５～５５歳、又は少なくとも５５歳であってもよい。特定の実施形態では、免疫原性組成物を投与するヒト対象は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、及び≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍職員（ａｒｍｅｄ ｓｅｒｖｉｃｅ ａｎｄ ｍｉｌｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ）、妊婦、慢性疾患、又は免疫不全患者である。免疫原性組成物は、これらの群に対して単独で適さないが、集団内でより一般的に使用されてもよい。

【0407】

いくつかの実施形態では、対象は、アジュバントでさらに免疫される。いくつかの実施形態では、対象は、ワクチンでさらに免疫される。

【0408】

免疫化
ある実施形態では、本開示の方法は、対象を、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫化することを含む。ある実施形態では、免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドから発現される。ある実施形態では、免疫化は、環状ポリリボヌクレオチドから発現される免疫原に対する、対象における免疫応答を誘導する。ある実施形態では、免疫化は、対象における免疫反応を誘導する（例えば、環状ポリリボヌクレオチドから発現される免疫原に結合する抗体の産生を誘導する）。ある実施形態では、免疫原性組成物は、単一の組成物中に環状ポリリボヌクレオチド及び希釈剤、担体、第１のアジュバント又はそれらの組合せを含む。ある実施形態では、対象は、第２のアジュバントでさらに免疫化される。ある実施形態では、対象は、ワクチンでさらに免疫化される。

【0409】

ある実施形態では、本開示の方法は、対象を、本明細書に開示される線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫化することを含む。ある実施形態では、免疫原は、線状ポリリボヌクレオチドから発現される。ある実施形態では、免疫化は、線状ポリリボヌクレオチドから発現される免疫原に対する、対象における免疫応答を誘導する。ある実施形態では、免疫化は、線状ポリリボヌクレオチドから発現される免疫原に結合する抗体の産生を誘導する。いくつかの実施形態では、免疫は、細胞媒介免疫応答を誘導する。ある実施形態では、免疫原性組成物は、単一の組成物中に線状ポリリボヌクレオチド及び希釈剤、担体、第１のアジュバント又はそれらの組合せを含む。ある実施形態では、対象は、第２のアジュバントでさらに免疫化される。ある実施形態では、対象は、ワクチンでさらに免疫化される。

【0410】

対象は、いくつもの環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。対象は、例えば、少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。非ヒト化免疫系を有する非ヒト動物は、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０の異なる環状ポリリボヌクレオチド、又はそれ以上の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、対象は、１つ以下の環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、ヒト化免疫系を有する非ヒト動物は、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、２０以下の異なる環状ポリリボヌクレオチド、又は２１未満の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、対象は、約１つの環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、ヒト化免疫系を有する非ヒト動物は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、又は約２０の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、対象は、約１～２０、１～１５、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～２０、２～１５、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～２０、３～１５、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～２０、４～１５、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、４～４、４～３、５～２０、５～１５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、５～１０、１０～１５、又は１５～２０の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。異なる環状ポリリボヌクレオチドは、互いに異なる配列を有する。例えば、それらは、異なる免疫原、重複免疫原、類似の免疫原、又は同じ免疫原（例えば、同じか又は異なる調節要素、開始配列、プロモータ、終止要素、又は本開示の他の要素と共に）を含むか又はコードし得る。対象が、２つ以上の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される場合、２つ以上の異なる環状ポリリボヌクレオチドは、同じか又は異なる免疫原性組成物中にあり、同時に又は異なる時点で免疫化され得る。２つ以上の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物は、同じ解剖学的位置又は異なる解剖学的位置に投与され得る。

【0411】

対象は、いくつもの線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化され得る。対象は、例えば、少なくとも１つの線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。非ヒト化免疫系を有する非ヒト動物は、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０の異なる線状ポリリボヌクレオチド、又はそれ以上の異なる線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、対象は、１つ以下の線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、ヒト化免疫系を有する非ヒト動物は、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、２０以下の異なる線状ポリリボヌクレオチド、又は２１未満の異なる線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、対象は、約１つの線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、ヒト化免疫系を有する非ヒト動物は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、又は約２０の異なる線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、対象は、約１～２０、１～１５、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～２０、２～１５、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～２０、３～１５、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～２０、４～１５、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、４～４、４～３、５～２０、５～１５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、５～１０、１０～１５、又は１５～２０の異なる線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。異なる線状ポリリボヌクレオチドは、互いに異なる配列を有する。例えば、それらは、異なる免疫原、重複免疫原、類似の免疫原、又は同じ免疫原（例えば、同じか又は異なる調節要素、開始配列、プロモータ、終止要素、又は本開示の他の要素と共に）を含むか又はコードし得る。対象が、２つ以上の異なる線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される場合、２つ以上の異なる線状ポリリボヌクレオチドは、同じか又は異なる免疫原性組成物中にあり得、同時に又は異なる時点で免疫化され得る。２つ以上の異なる線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物は、同じ解剖学的位置又は異なる解剖学的位置に投与され得る。

【0412】

２つ以上の異なる線状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に開示される同じ供給源、異なる供給源、又は供給源の異なる組合せからの免疫原を含むか又はコードし得る。２つ以上の異なる線状ポリリボヌクレオチドは、同じウイルス又は異なるウイルス、例えば、異なる分離株からの免疫原を含むか又はコードし得る。

【0413】

ある実施形態では、対象は、いくつもの環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物及び本明細書に開示されるいくつもの線状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、本明細書に開示される１つ以上の環状ポリリボヌクレオチド及び１つ以上の線状ポリリボヌクレオチドを含む。

【0414】

ある実施形態では、免疫原性組成物は、環状ポリリボヌクレオチド及び希釈剤、担体、第１のアジュバント、又はそれらの組合せを含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド及び担体、又は担体を含まない希釈剤を含む。ある実施形態では、担体を含まない希釈剤と共に環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物が、対象への環状ポリリボヌクレオチドのネイキッド送達に使用される。別の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド及び第１のアジュバントを含む。

【0415】

特定の実施形態において、対象に、第２のアジュバントがさらに投与される。アジュバントは、自然免疫応答を促進し、これが、ひいては、対象における適応免疫応答を促進する。アジュバントは、後述される任意のアジュバントであり得る。特定の実施形態において、アジュバントは、免疫原性組成物の一部として環状ポリリボヌクレオチドと共に配合される。特定の実施形態において、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の一部でない。特定の実施形態において、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と別々に投与される。この態様において、アジュバントは、対象に環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と共投与されるか（例えば、同時に投与される）又は異なる時点で投与される。例えば、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、若しくは２４時間後、又はそれらの間の任意の分若しくは時間の後に投与される。ある実施形態では、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、若しくは２４時間前、又はそれらの間の任意の分若しくは時間の前に投与される。例えば、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、若しくは８４日後、又はそれらの間の任意の日数の後に投与される。ある実施形態では、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、若しくは８４日前、又はそれらの間の任意の日数の前に投与される。アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と同じ解剖学的位置又は異なる解剖学的位置に投与される。

【0416】

ある実施形態では、免疫原性組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及び希釈剤、担体、第１のアジュバント、又はそれらの組合せを含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド及び担体、又は担体を含まない希釈剤を含む。ある実施形態では、担体を含まない希釈剤と共に線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物が、対象（例えば、免疫化のための対象）への線状ポリリボヌクレオチドのネイキッド送達に使用される。別の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド及び第１のアジュバントを含む。

【0417】

特定の実施形態において、対象に、第２のアジュバントがさらに投与される。アジュバントは、自然免疫応答を促進し、これが、ひいては、対象における適応免疫応答を促進する。アジュバントは、後述される任意のアジュバントであり得る。特定の実施形態において、アジュバントは、免疫原性組成物の一部として線状ポリリボヌクレオチドと共に配合される。特定の実施形態において、アジュバントは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の一部でない。特定の実施形態において、アジュバントは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と別々に投与される。この態様において、アジュバントは、対象に線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と共投与されるか（例えば、同時に投与される）又は異なる時点で投与される。例えば、アジュバントは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、若しくは２４時間後、又はそれらの間の任意の分若しくは時間の後に投与される。ある実施形態では、アジュバントは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、若しくは２４時間前、又はそれらの間の任意の分若しくは時間の前に投与される。例えば、アジュバントは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、若しくは８４日後、又はそれらの間の任意の日数の後に投与される。ある実施形態では、アジュバントは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、若しくは８４日前、又はそれらの間の任意の日数の前に投与される。アジュバントは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と同じ解剖学的位置又は異なる解剖学的位置に投与される。

【0418】

ある実施形態では、対象は、環状ポリリボヌクレオチドでない第２の薬剤、例えば、ワクチン（後述されるような）でさらに免疫化される。ワクチンは、対象に環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と共投与されるか（例えば、同時に投与される）又は異なる時点で投与される。例えば、ワクチンは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、若しくは２４時間後、又はそれらの間の任意の分若しくは時間の後に投与される。ある実施形態では、ワクチンは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、若しくは２４時間前、又はそれらの間の任意の分若しくは時間の前に投与される。例えば、ワクチンは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、若しくは８４日後、又はそれらの間の任意の日数の後に投与される。ある実施形態では、ワクチンは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、若しくは８４日後、又はそれらの間の任意の日数の後に投与される。

【0419】

ある実施形態では、対象は、線状ポリリボヌクレオチドでない第２の薬剤、例えば、ワクチン（後述されるような）でさらに免疫化される。ワクチンは、対象に線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と共投与されるか（例えば、同時に投与される）又は異なる時点で投与される。例えば、ワクチンは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、若しくは２４時間後、又はそれらの間の任意の分若しくは時間の後に投与される。ある実施形態では、ワクチンは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、若しくは２４時間前、又はそれらの間の任意の分若しくは時間の前に投与される。例えば、ワクチンは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、若しくは８４日後、又はそれらの間の任意の日数の後に投与される。ある実施形態では、ワクチンは、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、若しくは８４日前、又はそれらの間の任意の日数の前に投与される。

【0420】

対象は、所望される応答を得るため、任意の好適な回数にわたり、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで免疫され得る。例えば、プライムブースト免疫法を利用し、系統的及び／又は粘膜免疫を誘発することができる。対象は、例えば、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、又は少なくとも１５回、又はそれ以上にわたり、本開示の、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで免疫され得る。

【0421】

いくつかの実施形態では、対象は、最高で２回、最高で３回、最高で４回、最高で５回、最高で６回、最高で７回、最高で８回、最高で９回、最高で１０回、最高で１５回、又は最高で２０回、又はそれ以下にわたり、本開示の、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで免疫され得る。

【0422】

いくつかの実施形態では、対象は、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１５回、又は約２０回にわたり、本開示の、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで免疫され得る。

【0423】

いくつかの実施形態では、対象は、本開示の、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで１回免疫され得る。いくつかの実施形態では、対象は、本開示の、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで２回免疫され得る。いくつかの実施形態では、対象は、本開示の、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで３回免疫され得る。いくつかの実施形態では、対象は、本開示の、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで４回免疫され得る。いくつかの実施形態では、対象は、本開示の、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで５回免疫され得る。いくつかの実施形態では、対象は、本開示の、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせで７回免疫され得る。

【0424】

好適な時間間隔は、２回以上の免疫化の間隔を空けるように選択され得る。時間間隔は、同じ免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組合せによる複数回の免疫化に適用され得、例えば、同じ免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組合せが、同じ免疫化経路又は異なる免疫化経路を介して、同じ量又は異なる量で投与され得る。時間間隔は、異なる免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせでの複数回の免疫に適用することができ、例えば、異なる免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組み合わせは、同じ量又は異なる量で、同じ免疫経路又は異なる免疫経路を介して投与され得る。時間間隔は、異なる薬剤、例えば、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の免疫原性組成物及び第２の環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の免疫原性組成物での免疫に適用することができる。時間間隔は、異なる薬剤、例えば、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の免疫原性組成物及びタンパク質免疫原（例えば、タンパク質サブユニット）を含む第２の免疫原性組成物での免疫に適用することができる。時間間隔は、第１の線状ポリリボヌクレオチドを含む第１の免疫原性組成物及び第２の線状ポリリボヌクレオチドを含む第２の免疫原性組成物に適用され得る。３回以上の免疫化を含むレジメンでは、免疫化の間の時間間隔は、同じか又は異なり得る。いくつかの例では、２回の免疫化の間に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１７、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４０、４８、又は７２時間が経過する。ある実施形態では、２回の免疫化の間に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１７、１８、２０、２１、２４、２８、又は３０日が経過する。ある実施形態では、２回の免疫化の間に、約１、２、３、４、５、６、７、又は８週間が経過する。ある実施形態では、２回の免疫化の間に、約１、２、３、４、５、６、７、又は８ケ月が経過する。

【0425】

ある実施形態では、２回の免疫化の間に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも３６、若しくは少なくとも７２時間、又はそれ以上が経過する。ある実施形態では、２回の免疫化の間に、１時間以下、２時間以下、３時間以下、４時間以下、５時間以下、６時間以下、７時間以下、８時間以下、９時間以下、１０時間以下、１５時間以下、２０時間以下、２４時間以下、３６時間以下、若しくは７２時間以下、又はそれ以下が経過する。

【0426】

ある実施形態では、２回の免疫化の間に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６ 少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、若しくは少なくとも３０日、又はそれ以上が経過する。ある実施形態では、２回の免疫化の間に、２日以下、３日以下、４日以下、５日以下、６日以下、７日以下、８日以下、９日以下、１０日以下、１５日以下、２０日以下、２１日以下、２２日以下、２３日以下、２４日以下、２５日以下、２６日以下、２７日以下、２８日以下、２９日以下、３０日以下、３２日以下、３４日以下、若しくは３６日以下、又はそれ以下が経過する。

【0427】

ある実施形態では、２回の免疫化の間に、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、若しくは少なくとも８週間、又はそれ以上が経過する。ある実施形態では、２回の免疫化の間に、２週間以下、３週間以下、４週間以下、５週間以下、６週間以下、７週間以下、８週間以下、又はそれ以下が経過する。

【0428】

ある実施形態では、２回の免疫化の間に、少なくとも１ケ月、少なくとも２ケ月、少なくとも３ケ月、少なくとも４ケ月、少なくとも５ケ月、少なくとも６ケ月、少なくとも７ケ月、若しくは少なくとも８ケ月、又はそれ以上が経過する。ある実施形態では、２回の免疫化の間に、２ケ月以下、３ケ月以下、４ケ月以下、５ケ月以下、６ケ月以下、７ケ月以下、８ケ月以下、９ケ月以下、１０ケ月以下、１１ケ月以下、１２ケ月以下、又はそれ以下が経過する。

【0429】

いくつかの実施形態では、本方法は、免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫原性応答を改善するため、薬剤を対象に前投与することを含む。ある実施形態では、薬剤は、本明細書に開示される免疫原（例えば、タンパク質免疫原）である。例えば、本方法は、タンパク質免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドの投与の１～７日前に、タンパク質免疫原を投与することを含む。ある実施形態では、タンパク質免疫原は、タンパク質免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドの投与の１、２、３、４、５、６、又は７日前に投与される。例えば、本方法は、タンパク質免疫原をコードする配列を含む線状ポリリボヌクレオチドの投与の１～７日前にタンパク質免疫原を投与することを含む。ある実施形態では、タンパク質免疫原は、タンパク質免疫原をコードする配列を含む線状ポリリボヌクレオチドの投与の１、２、３、４、５、６、又は７日前に投与される。タンパク質免疫原は、タンパク質製剤として投与され得るか、プラスミド（ｐＤＮＡ）においてコードされ得るか、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）において提示され得るか、脂質ナノ粒子中で製剤化され得るかなどである。

【0430】

いくつかの実施形態では、本方法は、免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドが対象に投与された後、免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫原性応答を改善するため、薬剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、本明細書で開示されるような免疫原（例えば、タンパク質免疫原）である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質免疫原をコードする配列を含む。例えば、本方法は、免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象に投与する１年以内（例えば、１１ケ月、１０ケ月、９ケ月、８ケ月、７ケ月、６ケ月、５ケ月、４ケ月、３ケ月、２ケ月、及び１ケ月以内）にタンパク質免疫原を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドのいずれか１つ又は本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれか１つ及びタンパク質サブユニットを対象に投与することを含む。

【0431】

いくつかの実施形態では、タンパク質免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原と同じアミノ酸配列を有する。例えば、ポリペプチド免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドの配列によってコードされるポリペプチド免疫原とのアミノ酸配列同一性に対応してもよい（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％を共有する）。いくつかの実施形態では、タンパク質免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。例えば、ポリペプチド免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドの配列によってコードされるポリペプチド免疫原と９０％未満（例えば、８０％、７０％、３０％、２０％、又は１０％）のアミノ酸配列同一性を共有してもよい。

【0432】

対象は、任意の好適な数の解剖学的部位で、免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組合せで免疫化され得る。同じ免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組合せが、複数の解剖学的部位に投与され得、同じか又は異なる環状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）又はそれらの組合せを含む異なる免疫原性組成物が、異なる解剖学的部位に投与され得、同じか又は異なる環状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）又はそれらの組合せを含む異なる免疫原性組成物が、同じ解剖学的部位に投与され得、又はそれらの任意の組合せである。例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物が、２つの異なる解剖学的部位に投与され得、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物が、１つの解剖学的部位に投与され得、アジュバントが、異なる解剖学的部位に投与され得る。同じ免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組合せが、複数の解剖学的部位に投与され得、同じか又は異なる線状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）又はそれらの組合せを含む異なる免疫原性組成物が、異なる解剖学的部位に投与され得、同じか又は異なる線状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）又はそれらの組合せを含む異なる免疫原性組成物が、同じ解剖学的部位に投与され得、又はそれらの任意の組合せである。例えば、線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物が、２つの異なる解剖学的部位に投与され得、及び／又は線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物が、１つの解剖学的部位に投与され得、アジュバントが、異なる解剖学的部位に投与され得る。

【0433】

いずれか２つ以上の解剖学的経路における免疫化は、免疫化の同じ経路（例えば、筋肉内）を介するか又は免疫化の２つ以上の経路によるものであり得る。ある実施形態では、本開示の環状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、若しくはワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組合せを含む免疫原性組成物が、対象の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの解剖学的部位に接種される。ある実施形態では、本開示の環状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、若しくはワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組合せを含む免疫原性組成物が、対象の２つ以下、３つ以下、４つ以下、５つ以下、６つ以下、７つ以下、８つ以下、９つ以下、若しくは１０個以下、又はそれ以下の解剖学的部位に接種される。ある実施形態では、本開示の環状ポリリボヌクレオチド又はアジュバントを含む免疫原性組成物が、対象の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の解剖学的部位に接種される。ある実施形態では、本開示の線状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、若しくはワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組合せを含む免疫原性組成物が、対象の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの解剖学的部位に接種される。ある実施形態では、本開示の線状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、若しくはワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はそれらの組合せを含む免疫原性組成物が、対象の２つ以下、３つ以下、４つ以下、５つ以下、６つ以下、７つ以下、８つ以下、９つ以下、若しくは１０個以下、又はそれ以下の解剖学的部位に接種される。ある実施形態では、本開示の線状ポリリボヌクレオチド又はアジュバントを含む免疫原性組成物が、対象の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の解剖学的部位に接種される。

【0434】

免疫化は、任意の好適な経路によるものであり得る。免疫化経路の非限定的な例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内、脳内、眼内、病巣内、脳室内、嚢内、又は実質内、例えば、注射及び注入が挙げられる。ある場合には、免疫化は、吸入によるものであり得る。２つ以上の免疫化は、同じ経路又は異なる経路によって行われ得る。

【0435】

任意の好適な量の環状ポリリボヌクレオチドが、本開示の対象に投与され得る。例えば、対象は、少なくとも約１ｎｇ、少なくとも約１０ｎｇ、少なくとも約１００ｎｇ、少なくとも約１μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１００μｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、又は少なくとも約１ｇの環状ポリリボヌクレオチドで免疫化され得る。ある実施形態では、対象は、約１ｎｇ以下、約１０ｎｇ以下、約１００ｎｇ以下、約１μｇ以下、約１０μｇ以下、約１００μｇ以下、約１ｍｇ以下、約１０ｍｇ以下、約１００ｍｇ以下、又は約１ｇ以下の環状ポリリボヌクレオチドで免疫化され得る。ある実施形態では、対象は、約１ｎｇ、約１０ｎｇ、約１００ｎｇ、約１μｇ、約１０μｇ、約１００μｇ、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約１００ｍｇ、又は約１ｇの環状ポリリボヌクレオチドで免疫化され得る。

【0436】

いくつかの実施形態では、本方法は、対象を免疫原に対する抗体応答について評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドの投与の前及び／又は後に評価がなされる。いくつかの実施形態では、免疫原をコードする配列を含む線状ポリリボヌクレオチドの投与の前及び／又は後に評価がなされる。

【0437】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド、免疫原性組成物、医薬調製物、又は医薬組成物は、表１に提供される投与スケジュールに従い、出生～１５ケ月の間の対象に投与されるか、又は表２の投与スケジュールに従い、１８ケ月～１８年の間の対象に投与される。投与は、当該技術分野で公知の投与スケジュールに従い、例えば、米国疾病対策予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（ＣＤＣ）又は国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）によって記載される通り、実施されてもよい。表１及び表２は、２０２０年８月２９日付けのＣＤＣウェブサイト上に示された特定の障害に対するワクチン接種についての投与スケジュールの概略を提供する。

【0438】

【表1】

【0439】

【表2】

【0440】

局所送達
一部の態様では、本開示は、対象において免疫応答を生じさせるポリリボヌクレオチドの局所送達用の組成物及び医薬組成物を提供する。本組成物及び医薬組成物は、ポリリボヌクレオチドを細胞に送達するためアルコール（例えば、エタノール）を含み得る。本組成物及び医薬組成物は、細胞透過剤を含み得る。細胞透過剤は、細胞へのポリリボヌクレオチドの送達を亢進させるように構成される。ポリリボヌクレオチドは、線状形態又は環状形態のいずれで存在することもできる。

【0441】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、表面積（例えば、局所表面積）に直接投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、対象の表面積に滅菌剤の適用後に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、対象の表面積にアルコールの適用後に適用される。

【0442】

本明細書に開示される組成物は、ポリリボヌクレオチドとエタノールなどのアルコールとを含む混合物を含み得る。本明細書に開示される方法は、ポリリボヌクレオチドとエタノールなどのアルコールとの混合物を含む組成物中のポリリボヌクレオチドを送達することを含み得る。一部の態様では、本開示は、ポリリボヌクレオチドを細胞に送達するためのポリリボヌクレオチドとアルコール（例えば、エタノール）とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは滅菌剤を含む。詳細な実施形態では、キットは、ポリリボヌクレオチドと、アルコールワイプ（例えば、エタノールワイプ、イソプロピルワイプ）とを含む。

【0443】

本明細書に開示される組成物は、ポリリボヌクレオチドと細胞透過剤とを含む混合物を含み得る。本明細書に開示される方法は、ポリリボヌクレオチドと細胞透過剤との混合物を含む組成物中のポリリボヌクレオチドを送達することを含み得る。一部の態様では、本開示は、ポリリボヌクレオチドを細胞に送達するためのポリリボヌクレオチドと細胞透過剤とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは滅菌剤を含む。

【0444】

本明細書に開示される組成物は、ポリリボヌクレオチドと希釈剤とを含むいかなる担体も含まない組成物であり得る。この組成物は、上皮細胞への送達方法において使用することができる。

【0445】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、治療組成物、又は医薬組成物は、表面積（例えば、局所表面積）に直接投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、治療組成物、又は医薬組成物は、対象の表面積に滅菌剤の適用後に適用される。

【0446】

本明細書に提供される組成物、方法、及びキットは、ポリリボヌクレオチドを細胞に送達するための単純且つ有効な溶液を提供することができる。ポリリボヌクレオチドは、細胞透過剤の存在下では、細胞透過剤の非存在下と比べて細胞に一層効率的に送達することができる。いくつかの場合、本明細書に記載される細胞透過剤は、細胞透過剤の非存在下でのポリヌクレオチドの送達効率と比較したとき、ポリヌクレオチドの送達効率を少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、８０００％、１０，０００％、２０，０００％、又は５０，０００％増加させることができる。

【0447】

本明細書で使用されるとき、「局所送達」という用語は、非侵襲的手段で到達可能な皮膚又は上皮層への物質の送達を意味する。局所送達には、腸及び他の胃腸（ＧＩ）上皮又は膣上皮への局所送達が含まれる。医薬組成物の局所送達は、対象に局所的な薬力学的効果を及ぼすことができ、例えば、局所送達される医薬組成物は、医薬組成物が送達される体の特定の部位（例えば皮膚）に又はそれに近接して薬力学的効果を及ぼす。いくつかの他の実施形態では、本明細書で考察するとおりの医薬組成物の局所送達は、送達様式のみを指して用いられ（例えば、具体的な表面積へと局所的に）、一方、医薬組成物は、局所的又は全身性のいずれの薬力学的効果も及ぼし得る。例えば、医薬組成物は、投与部位に又はそれに近接して局所的に留まることもでき、又は対象身体の循環系（例えば、血液又はリンパ系）に入り、それを通じて典型的には医薬組成物が循環系以外の経路では到達不可能な身体の遠隔部位に医薬組成物を輸送することもできる。

【0448】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、皮膚領域への直接適用（例えば、経皮投与又は皮膚投与）用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、対象の鼻道を介した投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、経口投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、眼内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、坐薬としての投与用、膣内投与用、又は粘膜投与用に製剤化される。

【0449】

本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、表面へと、その表面に滅菌剤を適用した後（例えば、ポリリボヌクレオチドの送達のための滅菌剤による表面の前処置後）に適用することができる。表面は、対象の表面積であり得る。対象の表面積は、上皮細胞など、細胞を含む。

【0450】

滅菌剤は、殺菌性、静菌性の、及び／又は微生物を能動的に死滅させ、微生物を不活性化し、又は微生物の増殖を防ぐ任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、滅菌剤は、アルコール、ヨウ素、又は過酸化水素である。滅菌剤は、紫外光又はレーザー光であってもよい。いくつかの実施形態では、滅菌剤は、電気的に、又は蒸気若しくは接触によるなど、他の手段を通じて送達される熱である。

【0451】

滅菌剤は、様々な非侵襲的方法によって対象の表面積に適用することができる。例えば、滅菌剤は、滅菌剤を含むワイプ又はスワブによって適用することができる。いくつかの実施形態では、滅菌剤は、スプレーとして適用される。滅菌剤の適用には、様々な器具を使用することができる。例えば、紫外光又はレーザー光を発生させる器具が使用されてもよい。他の実施形態では、熱を発生させる器具が使用されてもよい。

【0452】

本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、表面へと、エタノールなどのアルコールの適用後（例えば、ポリリボヌクレオチドの送達のためのアルコールによる表面の前処置後）に適用することができる。表面は、対象の表面積であり得る。対象の表面積は、上皮細胞など、細胞を含む。表面へのポリリボヌクレオチドの投与（例えば、適用）前のその表面の前処置に使用されるアルコールは、滅菌剤として作用してもよく、及び／又はポリリボヌクレオチドの細胞透過を亢進させてもよい。一部では、アルコールは、ワイプ又はスワブ（ｓｗａｐ）の形態で表面に適用される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドの投与（例えば、適用）前に表面にアルコールを試すことが許容される。

【0453】

本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、懸濁液、シロップ剤、又はエリキシル剤など、液体製剤であり得る。いくつかの場合、水溶液は、そのまま使用するように包装されるか、又は凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、溶液として、又は懸濁液として送達することができる。一般に、ゲル（例えば、ＤＭＳＯゲル）、ゼリー、クリーム、ローション（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎローション）、坐薬及び軟膏などの製剤は、ある面積に、１つ又は複数の活性薬剤へのより長期間の曝露を提供し得る一方、溶液中の製剤、例えばスプレーは、より即効性の短期曝露を提供し得る。

【0454】

前処置後の表面積に適用される組成物又は医薬組成物は、いかなる担体も含まず、ポリリボヌクレオチドと希釈剤とを含み得る。ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドであり得る。

【0455】

いくつかの場合、本明細書に提供される組成物は、組成物が対象に投与されたときに目的の免疫原に対する免疫応答を引き出すためのインビボでの使用に好適である。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれの形態で存在してもよい。

【0456】

詳細な実施形態では、例えば局所送達用に製剤化された、本明細書に記載されるとおりの組成物及び医薬組成物を使用して、ウイルス免疫原に対する、及び／又はウイルス感染症、例えば、インフルエンザ（例えば、季節性インフルエンザ、汎発性インフルエンザ、Ａ型インフルエンザ、インフルエンザＨ１Ｎ１亜型）、天然痘、チクングニアウイルス（例えばチクングニアウイルス）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、デング熱、ジカ、黄熱病ウイルス、コクサッキーウイルス（例えば、手足口病）、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、エボラウイルス（例えば、エボラ出血熱）、マールブルグウイルス（例えば、マールブルグ出血熱）、ウイルス性細気管支炎、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎）、ヘルペスウイルス（例えば、性器ヘルペス）、ロタウイルス感染症、麻疹感染症、ムンプス感染症、及び風疹感染症から選択されるウイルス感染症の処置又は予防のための免疫応答を誘導することができる。

【0457】

別の実施形態では、例えば局所送達用に製剤化された、本明細書に記載されるとおりの組成物及び医薬組成物を使用して、細菌免疫原に対する、及び／又は細菌感染症、例えば、Ｑ熱、天然痘、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ））、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、連鎖球菌（例えば、連鎖球菌性肺炎）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染症、細菌性下痢、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）細菌（例えば、野兎病）、ジフテリア、及び破傷風から選択される細菌感染症の処置又は予防のための免疫応答を誘導することができる。

【0458】

別の実施形態では、例えば局所送達用に製剤化された、本明細書に記載されるとおりの組成物及び医薬組成物を使用して、寄生虫免疫原に対する、及び／又は寄生虫感染症、例えばマラリアの処置又は予防のための免疫応答を誘導することができる。

【0459】

別の実施形態では、例えば局所送達用に製剤化された、本明細書に記載されるとおりの組成物及び医薬組成物を使用して、毒素に対する、及び／又は毒素、例えば、ボツリヌス毒素及び炭疽から選択される毒素への曝露に伴う毒性の処置又は予防のための免疫応答を誘導することができる。

【0460】

別の実施形態では、例えば局所送達用に製剤化された、本明細書に記載されるとおりの組成物及び医薬組成物を使用して、アレルゲンに対する、及び／又はアレルゲン、例えば、ピーナッツアレルゲン、食物アレルゲン、カバノキ花粉アレルゲン、牧草花粉アレルゲン、ネコアレルゲン、ヒマラヤスギ花粉アレルゲン、チリダニアレルゲン及びブタクサアレルゲンから選択されるアレルゲンへの曝露に伴う症状の処置又は予防のための免疫応答を誘導することができる。

【0461】

別の実施形態では、本明細書に記載されるとおりの組成物及び医薬組成物は、経皮送達用に製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、経皮送達を使用して、以下のいずれかに対する、及び／又はそれの処置又は予防のための免疫応答を誘導し得る：Ｑ熱、天然痘、ピーナッツアレルゲン、ボツリヌス毒素、ウイルス性細気管支炎、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、炭疽、破傷風、及びチリダニアレルゲン。

【0462】

別の実施形態では、本明細書に記載されるとおりの組成物及び医薬組成物は、皮膚送達用に製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、皮膚送達を使用して、以下のいずれかに対する、及び／又はそれの処置又は予防のための免疫応答を誘導し得る：インフルエンザ（例えば、季節性インフルエンザ、汎発性インフルエンザ、Ａ型インフルエンザ、インフルエンザＨ１Ｎ１亜型）、天然痘、チクングニアウイルス（例えばチクングニアウイルス）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、デング熱、ジカ、黄熱病ウイルス、コクサッキーウイルス（例えば手足口病）、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、エボラウイルス（例えば、エボラ出血熱）、マールブルグウイルス（例えば、マールブルグ出血熱）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎）、ヘルペスウイルス（例えば、性器ヘルペス）、ロタウイルス感染症、麻疹感染症、ムンプス感染症、風疹感染症、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ））、連鎖球菌（例えば、連鎖球菌性肺炎）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染症、細菌性下痢、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）細菌（例えば、野兎病）、ジフテリア、破傷風、マラリア、炭疽、食物アレルゲン、カバノキ花粉アレルゲン、牧草花粉アレルゲン、ネコアレルゲン、ヒマラヤスギ花粉アレルゲン、及びチリダニアレルゲン、ブタクサアレルゲン。

【0463】

アルコール
細胞へのポリリボヌクレオチドの送達には、本明細書に記載されるとおりのアルコールを使用することができる。アルコールは、細胞へのポリリボヌクレオチドの送達用の本明細書に記載されるとおりのポリリボヌクレオチドとの混合物中にあり得る。この混合物は、アルコールを少なくとも約０．３％ｖ／ｖアルコール～約７５％ｖ／ｖで含み得る。アルコールはエタノールであってもよい。いくつかの実施形態では、混合物は対象の表面積に適用される。いくつかの実施形態では、混合物は医薬組成物である。

【0464】

アルコールは、１つ又は複数のヒドロキシル官能基を含む任意のアルコールであってよい。いくつかの場合、アルコールは、限定はされないが、一価アルコール、多価アルコール、不飽和脂肪族アルコール、又は脂環式アルコールである。アルコールには、メタノール、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール、トリエタノールアミン、フェネチルアルコール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特殊変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、又はヒドロキシエチルセルロースのうちの１つ又は複数が含まれ得る。特定の実施形態では、アルコールはエタノールである。

【0465】

他の場合には、本明細書に提供される組成物、医薬組成物、及び方法は、アルコールのみを含み、細胞へのポリリボヌクレオチドの送達を亢進させるためのいかなる他の薬剤も有しない、又は使用しない。いくつかの場合、アルコールはエタノールであり、組成物、医薬組成物、及び方法は、細胞へのポリリボヌクレオチドの送達を亢進させるためのいかなる他の薬剤も有しない、又は使用しない。いくつかの場合、アルコールは細胞透過剤である。いくつかの場合、アルコールは細胞透過剤でない。

【0466】

本明細書に開示される組成物には、アルコールとポリリボヌクレオチドとを含む混合物が含まれ得る。いくつかの場合、ポリリボヌクレオチドは、アルコールと予め混合された混合物中に存在する。いくつかの場合、ポリリボヌクレオチドは、細胞への接触前はアルコールと別個に提供される。このような例では、ポリリボヌクレオチドは細胞への適用時にアルコールと接触させて、細胞へのポリリボヌクレオチドの送達用に共に混合された状態にする。特定の理論に拘束されないが、混合物中のアルコールの濃度が送達効率に寄与し得る。従って、いくつかの場合、アルコールは混合物中に所定の濃度で提供される。いくつかの他の場合、アルコール及びポリリボヌクレオチドが当初別個にあるが、送達用に適用時に共に混合されるとき、アルコールは、ポリリボヌクレオチドに対して相対的に、それが混合物中で最小限の所定の濃度に達することが確実となり得るような十分な量で提供される。

【0467】

いくつかの場合、アルコールは、混合物の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％体積／体積（ｖ／ｖ）を占める。いくつかの場合、アルコールは、混合物の最高で約０．０１％、最高で約０．０２％、最高で約０．０３％、最高で約０．０４％、最高で約０．０５％、最高で約０．０６％、最高で約０．０７％、最高で約０．０８％、最高で約０．０９％、最高で約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合、アルコールは、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。

【0468】

いくつかの場合、アルコールは、混合物の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％重量／重量（ｗ／ｗ）を占める。いくつかの場合、アルコールは、混合物の最高で約０．０１％、最高で約０．０２％、最高で約０．０３％、最高で約０．０４％、最高で約０．０５％、最高で約０．０６％、最高で約０．０７％、最高で約０．０８％、最高で約０．０９％、最高で約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｗ／ｗを占める。いくつかの場合、細胞透過剤は、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９８％ｗ／ｗを占める。いくつかの場合、アルコールは、混合物の約１０％ｖ／ｖを占める。

【0469】

いくつかの実施形態では、アルコールは、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又はこれらの間にある任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、アルコールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ、又はこれらの間にある任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。

【0470】

いくつかの場合、本明細書に記載される混合物は、液体溶液である。例えば、アルコールは、液体物質それ自体である。このような場合、ポリリボヌクレオチドもまた液体溶液中に溶解させてもよい。

【0471】

いくつかの場合、エタノールは、混合物の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％体積／体積（ｖ／ｖ）を占める。いくつかの場合、エタノールは、混合物の最高で約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合、エタノールは、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合、エタノールは、混合物の約１０％ｖ／ｖを占める。

【0472】

いくつかの実施形態では、エタノールは、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又はこれらの間にある任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、エタノールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ、又はこれらの間にある任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。

【0473】

細胞透過剤
本明細書に記載の細胞透過剤は、ポリリボヌクレオチドの細胞への送達を増強する任意の物質を含み得る。細胞透過剤は、有機化合物又は無機分子を含み得る。いくつかの場合、細胞透過剤は、限定はされないが、アルカン、アルケン、及びアレーン；ハロゲン置換アルカン、アルケン、及びアレーン；アルコール、フェノール（ベンゼンの誘導体）、エーテル、アルデヒド、ケトン、及びカルボン酸；アミン及びニトリル；並びに有機硫黄（例えば、ジメチルスルホキシド）などの１つ又は複数の官能基を有する有機化合物である。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、極性溶媒に可溶性である。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、極性溶媒に不溶性である。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0474】

細胞透過剤は、１つ又は複数のヒドロキシル官能基を有するアルコールなどの有機化合物を含み得る。いくつかの場合、細胞透過剤は、限定はされないが、一価アルコール、多価アルコール、不飽和脂肪族アルコール、及び脂環式アルコールなどのアルコールを含む。細胞透過剤は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール、トリエタノールアミン、フェネチルアルコール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特殊変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシル化脂肪酸、又はヒドロキシエチルセルロースの１つ又は複数を含み得る。特定の実施形態では、細胞透過剤は、エタノールを含む。

【0475】

他の場合、本明細書に提供される組成物及び方法は、ポリリボヌクレオチドの細胞への送達を増強するため、細胞透過剤としてアルコールのみを含み、他の薬剤を全く有しないか又は使用しない。いくつかの場合、細胞透過剤は、ポリリボヌクレオチドの細胞への送達を増強し得るエタノール及び任意の他のアルコールを含む。いくつかの場合、細胞透過剤は、ポリリボヌクレオチドの細胞への送達を増強し得るエタノール及び任意の他の有機又は無機分子を含む。いくつかの場合、細胞透過剤は、エタノール及びリポソーム又はナノ粒子、例えば、国際公開番号の国際公開第２０１３／００６８２５号パンフレット、国際公開第２０１６／０３６７３５号パンフレット、国際公開第２０１８／１１２２８２Ａ１号パンフレット、及び国際公開第２０１２／０３１０４３Ａ１号パンフレット（それらのそれぞれはその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されたものを含む。いくつかの場合、細胞透過剤は、エタノール及び細胞透過性ペプチド又はタンパク質、例えば、Ｂｅｃｈａｒａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：２０ ｙｅａｒｓ ｌａｔｅｒ，ｗｈｅｒｅ ｄｏ ｗｅ ｓｔａｎｄ？ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８７（１２）：１６９３－１７０２（２０１３）；Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ，２００２）；Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１（２８）：３５９７－６１１（２００３）；Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２（１６）：１８３９－４９（２００５）、米国特許公開番号の米国特許出願公開第２０１３０１２９７２６号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１３７６４４号明細書及び米国特許出願公開第２０１３０１６４２１９号明細書（それらのそれぞれはその全体が参照により本明細書中に援用される））に記載されたものを含む。いくつかの場合、エタノール対他の細胞透過剤の比は、約１：０．００１、約１：０．００２、約１：００５、約１：００８、約１：０．０１、約１：０．０２、約１：０．０５、約１：０．０８、約１：０．１、約１：０．２、約１：０．３、約１：０．４、約１：０．５、約１：０．６、約１：０．７、約１：０．８、約１：０．９、約１：１、約１：１．２、約１：１．５、約１：１．８、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１２０、約１：１５０、約１：２００、約１：２５０、約１：５００、又は約１：１０００である。いくつかの場合、エタノール対他の細胞透過剤の比は、少なくとも約１：０．００１、約１：０．００２、約１：００５、約１：００８、約１：０．０１、約１：０．０２、約１：０．０５、約１：０．０８、約１：０．１、約１：０．２、約１：０．３、約１：０．４、約１：０．５、約１：０．６、約１：０．７、約１：０．８、約１：０．９、約１：１、約１：１．２、約１：１．５、約１：１．８、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１２０、約１：１５０、約１：２００、約１：２５０、又は約１：５００である。

【0476】

本明細書で開示される組成物は、細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドの混合物を含み得る。いくつかの場合、ポリリボヌクレオチドは、細胞透過剤と予備混合された混合物中に存在する。いくつかの場合、ポリリボヌクレオチドは、細胞への接触前、細胞透過剤と別に準備される。これらの場合、ポリリボヌクレオチドは、細胞に適用されるとき、細胞透過剤と接触され、ポリリボヌクレオチドの細胞への送達のため、一緒に混合された状態になる。特定の理論に拘束されないが、混合物中の細胞透過剤の濃度は、送達の効率に寄与し得る。したがって、いくつかの場合、細胞透過剤は、混合物中の所定の濃度で準備される。いくつかの他の場合、細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドが、最初に別々であるが、送達に適用されるときに一緒に混合される場合、細胞透過剤は、混合物中の所定の最小濃度に達することを保証すると思われる、ポリリボヌクレオチドに対する十分な量で準備される。

【0477】

いくつかの場合、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％体積／体積（ｖ／ｖ）を占める。いくつかの場合、細胞透過剤は、混合物の最高で約０．０１％、最高で約０．０２％、最高で約０．０３％、最高で約０．０４％、最高で約０．０５％、最高で約０．０６％、最高で約０．０７％、最高で約０．０８％、最高で約０．０９％、最高で約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合、細胞透過剤は、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。

【0478】

いくつかの場合、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％重量／重量（ｗ／ｗ）を占める。いくつかの場合、細胞透過剤は、混合物の最高で約０．０１％、最高で約０．０２％、最高で約０．０３％、最高で約０．０４％、最高で約０．０５％、最高で約０．０６％、最高で約０．０７％、最高で約０．０８％、最高で約０．０９％、最高で約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｗ／ｗを占める。いくつかの場合、細胞透過剤は、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９８％ｗ／ｗを占める。いくつかの場合、細胞透過剤は、混合物の約１０％ｖ／ｖを占める。

【0479】

いくつかの場合、本明細書に記載の混合物は、溶液である。例えば、細胞透過剤は、液体物質自体である。或いは、細胞透過剤は、固体、液体、又は気体物質であり、液体担体、例えば、水に溶解される。これらの場合、ポリリボヌクレオチドもまた、溶液に溶解され得る。

【0480】

いくつかの場合、エタノールは、混合物の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％体積／体積（ｖ／ｖ）を占める。いくつかの場合、エタノールは、混合物の最高で約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合、エタノールは、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合、エタノールは、混合物の約１０％ｖ／ｖを占める。

【0481】

保存剤
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、単回投与のための材料を含み得る、又は複数回投与のための材料（例えば、「多回投与」キット）を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。組成物又は医薬組成物は、チオメルサール又は２－フェノキシエタノールなどの１つ又は複数の保存剤を含み得る。保存剤を使用し、使用中の微生物汚染を阻止することができる。好適な保存剤は、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、Ｏｎａｍｅｒ Ｍ、又は当業者に公知の他の薬剤を含む。眼科製品では、例えば、そのような保存剤は、０．００４％～０．０２％のレベルで使用することができる。本明細書に記載の組成物において、保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウムは、０．００１％～０．０１％未満、例えば、０．００１％～０．００８％、好ましくは、約０．００５重量％のレベルで使用することができる。

【0482】

ポリリボヌクレオチドは、周囲環境下で大量に存在し得るリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）に感受性を示し得る。本明細書に提供される組成物は、リボヌクレアーゼ活性を阻害し、それによりポリリボヌクレオチドを分解から防ぐ試薬を含み得る。いくつかの場合、組成物又は医薬組成物は、当業者に公知の任意のリボヌクレアーゼ阻害剤を含む。代替的に又は追加的に、本明細書に提供される組成物中のポリリボヌクレオチド、並びに細胞透過剤及び／又は薬学的に許容できる希釈剤若しくは担体、媒体、賦形剤、若しくは他の試薬は、リボヌクレアーゼを含まない環境下で調製され得る。組成物は、リボヌクレアーゼを含まない環境下で製剤化され得る。

【0483】

いくつかの場合、本明細書に提供される組成物は、無菌であり得る。組成物は、当該技術分野で公知の、好適な媒体中の無菌溶液又は懸濁液として製剤化され得る。組成物は、従来の公知の滅菌技術によって滅菌可能であり、例えば、組成物は、滅菌ろ過され得る。

【0484】

塩
いくつかの場合、本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、１つ又は複数の塩を含む。浸透圧を制御するため、ナトリウム塩などの生理学的塩が、本明細書に提供される組成物に含まれ得る。他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、及び／又は塩化マグネシウムなどを含み得る。いくつかの場合、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容できる塩と共に製剤化される。１つ又は複数の薬学的に許容できる塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムイオンなどの無機イオンのものを含み得る。そのような塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、又はマレイン酸などの無機酸又は有機酸の塩を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0485】

緩衝剤／ｐＨ
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、トリス緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（例えば、水酸化アルミニウムアジュバントを有する）；又はクエン酸緩衝剤などの１つ又は複数の緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、いくつかの場合、５～２０ｍＭの範囲内に含まれる。

【0486】

本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、約５．０～約８．５の間、約６．０～約８．０の間、約６．５～約７．５の間、又は約７．０～約７．８の間のｐＨを有し得る。組成物又は医薬組成物は、約７のｐＨを有し得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0487】

洗浄剤／界面活性剤
本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、意図される投与経路に応じて、１種又は複数種の洗浄剤及び／又は界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に「Ｔｗｅｅｎ」と呼ばれる）、例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）という商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；エトキシ（オキシ－ｌ，２－エタンジイル）基の繰り返し数が異なり得るオクトキシノール、例えば、オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール及びオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；並びにソルビタンエステル（一般に、「ＳＰＡＮ」として知られる）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）及びソルビタンモノラウレート、オクトキシノール（オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、又はデオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。１種又は複数種の洗浄剤及び／又は界面活性剤は、微量でのみ含まれ得る。いくつかの例では、組成物は、オクトキシノール－１０及びポリソルベート８０のそれぞれを１ｍｇ／ｍｌ未満含むことができる。本明細書では、非イオン性界面活性剤を使用することができる。界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。いくつかの例では、界面活性剤は、少なくとも１０、少なくとも１５、及び／又は少なくとも１６のＨＬＢを有する。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状の形態で含まれ得る。

【0488】

希釈剤
いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、環状ポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む。

【0489】

希釈剤は、非担体賦形剤であり得る。非担体賦形剤は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドなどの、組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドなどの、組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤の非限定的な例としては、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、滑沢剤、油、及びそれらの混合物が挙げられる。非担体賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認され、細胞透過効果を示さないＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅに列挙された非有効成分のいずれかであり得る。非担体賦形剤は、例えば、獣医学的使用に好適な非ヒト動物への投与に好適な任意の不活性成分であり得る。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な組成物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。

【0490】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、希釈剤を含むものなどのネイキッド送達製剤として送達され得る。ネイキッド送達製剤は、担体を用いずに、修飾又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入、キャップされたポリリボヌクレオチド、又はその複合体なしで、環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達する。

【0491】

ネイキッド送達製剤は、担体を含まない製剤であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さず、又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入なしである。ある実施形態では、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、小分子、粒子、ポリマー、又はバイオポリマーに共有結合されないポリリボヌクレオチドである。細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドは、修飾リン酸基を含まない。例えば、細胞への送達を助ける部分に結合する共共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、アルキル又はアリールホスホネート、又はホスホトリエステルを含まない。

【0492】

ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のうちのいずれか又は全てを含まない。ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンを含まない。

【0493】

ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤を含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、細胞透過効果を示さない不活性成分を含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、緩衝液、例えばＰＢＳを含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、滑沢剤、又は油である。

【0494】

ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、希釈剤を含む。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。ある実施形態では、希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、又は等張剤である。ＲＮＡ可溶化剤の例としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド、及び２－プロパノールが挙げられる。緩衝液の例としては、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン、又はホスフェートが挙げられる。等張剤の例としては、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、又はスクロースが挙げられる。

【0495】

担体
ある実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、環状ポリリボヌクレオチド及び担体を含む。ある実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及び担体を含む。

【0496】

特定の実施形態において、免疫原性組成物は、小胞又は他の膜ベースの担体中に本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、小胞又は他の膜ベースの担体中に本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドを含む。

【0497】

他の実施形態において、免疫原性組成物は、細胞、小胞若しくは他の膜ベースの担体中に又はそれらを介して環状ポリリボヌクレオチドを含む。他の実施形態において、免疫原性組成物は、細胞、小胞若しくは他の膜ベースの担体中に又はそれらを介して線状ポリリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、リポソーム又は他の同様の小胞中に環状ポリリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、リポソーム又は他の同様の小胞中に線状ポリリボヌクレオチドを含む。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層から構成される球形の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそのロードを輸送する（例えば、概説については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。

【0498】

小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作製され得るが；リン脂質が、薬物担体としてリポソームを生成するために、最も一般的に使用される。多重膜小胞脂質の調製のための方法が、当該技術分野において公知である（例えば、多重膜小胞脂質調製に関連するその教示内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照されたい）。脂質膜が水溶液と混合されるとき、小胞形成が自然に起こり得るが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押し出し装置を用いることによって、振とうの形態の力を加えることによって促進され得る（例えば、概説については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。押し出された脂質は、押し出された脂質の調製に関するその教示内容が参照により本明細書に援用される、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載されるように、減少したサイズのフィルタに通して押し出すことによって調製され得る。

【0499】

特定の実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド及び脂質ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子を含む。特定の実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及び脂質ナノ粒子を含む。脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド分子のための生体適合性及び生分解性送達システムを提供する担体の別の例である。脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド分子のための生体適合性及び生分解性送達システムを提供する担体の別の例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特性を保持し、薬物安定性及び負荷容量を改善し、薬物漏出を防止する、修飾された固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な構成要素である。これらのナノ粒子は、薬物送達を、特定の標的に有効に指向し、薬物安定性及び制御薬物放出を改善し得る。リポソーム及びポリマーを組み合わせる新しいタイプの担体である脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）も、用いられ得る。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの補完的な利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは、良好な生体適合性を提供する。したがって、２つの構成要素が、薬物封入効率を増加させ、表面修飾を促進し、水溶性薬物の漏出を防止する。概説については、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。

【0500】

担体のさらなる非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されたタンパク質又は線状ポリリボヌクレオチドに共有結合されたタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー又はトランスフェクション試薬）が挙げられる。炭水化物担体の非限定的な例としては、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、及び無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリンが挙げられる。カチオン性担体の非限定的な例としては、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－ｂ－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ｌ－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ＼Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣ１）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、及びＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）が挙げられる。タンパク質担体の非限定的な例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンが挙げられる。

【0501】

エキソソームはまた、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は調製物の薬物送達ビヒクルとして使用され得る。エキソソームはまた、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド組成物又は調製物の薬物送達ビヒクルとして使用され得る。レビューのためには、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。

【0502】

エクスビボ分化赤血球はまた、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は調製物の担体として使用され得る。エクスビボ分化赤血球はまた、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド組成物又は調製物の担体として使用され得る。例えば、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレット；国際公開第２０１７／１２３６４６号パンフレット；国際公開第２０１７／１２３６４４号パンフレット；国際公開第２０１８／１０２７４０号パンフレット；国際公開第２０１６／１８３４８２号パンフレット；国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレット；国際公開第２０１８／１５１８２９号パンフレット；国際公開第２０１８／００９８３８号パンフレット；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６；米国特許第９，６４４，１８０号明細書；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：４２３；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６を参照されたい。

【0503】

例えば、国際公開第２０１８／２０８７２８号パンフレットに記載されるようなフソソーム組成物も、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。例えば、国際公開第２０１８／２０８７２８号パンフレットに記載されるようなフソソーム組成物も、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。

【0504】

ビロソーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド分子を標的細胞に送達するための担体として使用され得る。ビロソーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド分子を標的細胞に送達するための担体として使用され得る。

【0505】

例えば、国際特許公開番号国際公開第２０１１／０９７４８０号パンフレット、国際公開第２０１３／０７０３２４号パンフレット、国際公開第２０１７／００４５２６号パンフレット、又は国際公開第２０２００４１７８４号パンフレットに記載されるような植物ナノ小胞及び植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）も、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は調製物を送達するための担体として使用され得る。植物ナノ小胞及び植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）も、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド組成物又は調製物を送達するための担体として使用され得る。

【0506】

マイクロバブルも、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。マイクロバブルも、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。例えば、米国特許第７１１５５８３号明細書；Ｂｅｅｒｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２ Ｏｃｔ １；１０６（１４）：１７５６－１７５９；Ｂｅｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１９ Ａｐｒ；１４（４）：１０１５－１０２６；Ｈｅｒｎｏｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００８ Ｊｕｎ ３０；６０（１０）：１１５３－１１６６；Ｒｙｃｈａｋ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１４ Ｊｕｎ；７２：８２－９３を参照されたい。ある実施形態では、マイクロバブルは、アルブミン被覆されたペルフルオロカーボンマイクロバブルである。

【0507】

本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドを含む担体は、複数の粒子を含み得る。粒子は、３０～７００ナノメートル（例えば、３０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、１００～５００、５０～５００、又は２００～７００ナノメートル）の物品サイズ中央値を有し得る。粒子の大きさは、細胞への環状ポリリボヌクレオチドを含むペイロードの沈着に有利に働くように最適化することができる。特定の細胞型への環状ポリリボヌクレオチドの沈着は、異なる粒径に有利であり得る。例えば、粒径は、抗原提示細胞への環状ポリリボヌクレオチドの沈着のために最適化され得る。粒径は、樹状細胞への環状ポリリボヌクレオチドの沈着のために最適化され得る。さらに、粒径は、流入領域リンパ節細胞への環状ポリリボヌクレオチドの沈着のために最適化され得る。

【0508】

脂質ナノ粒子
本開示によって提供される組成物、方法、及び送達システムは、特定の実施形態において、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む任意の好適な担体又は送達モダリティを用い得る。脂質ナノ粒子は、ある実施形態では、１つ以上のイオン性脂質、例えば、非カチオン性脂質（例えば、中性又はアニオン性、又は両性脂質）；１つ以上のコンジュゲート脂質（ＰＥＧコンジュゲート脂質又は全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーにコンジュゲートされた脂質など）；１つ以上のステロール（例えば、コレステロール）を含む。

【0509】

ナノ粒子形成において使用され得る脂質（例えば、脂質ナノ粒子）は、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４に記載されるものを含み－例えば、脂質含有ナノ粒子は、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４中の脂質の１つ以上を含み得る。脂質ナノ粒子は、さらなる要素、例えば、ポリマー、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーを含み得る。

【0510】

ある実施形態では、コンジュゲート脂質は、存在する場合、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、及び国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により援用される）の表２に記載されるもの、並びに上記のものの組合せのうちの１つ以上を含み得る。

【0511】

ある実施形態では、脂質ナノ粒子に組み込まれ得るステロールとしては、参照により援用される国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書に記載されるものなどの、コレステロール又はコレステロール誘導体の１つ以上が挙げられる。さらなる例示的なステロールとしては、参照により本明細書に援用される、Ｅｙｇｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものを含む植物ステロールが挙げられる。

【0512】

ある実施形態では、脂質粒子は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質、及びステロールを含む。これらの構成要素の量は、独立して、所望の特性を達成するために変化され得る。例えば、ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、総脂質の約２０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％の量のイオン化可能な脂質（他の実施形態において、それは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）又は４０～５０％（ｍｏｌ）；約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％であり得る）、総脂質の約５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の量のコンジュゲート脂質、及び総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の量のステロールを含む。総脂質対核酸の比率は、必要に応じて変化され得る。例えば、総脂質対核酸（質量又は重量）比は、約１０：１～約３０：１であり得る。

【0513】

ある実施形態では、脂質対核酸比（質量／質量比；ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲であり得る。脂質及び核酸の量は、所望のＮ／Ｐ比、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＮ／Ｐ比を得るために調整され得る。一般に、脂質ナノ粒子製剤の全脂質含量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0514】

本明細書に記載される組成物、例えば、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド））の送達のための脂質ナノ粒子を形成するために（例えば、他の脂質成分と組み合わせて）使用され得る脂質化合物のいくつかの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。

【化2】

ある実施形態では、式（ｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0515】

【化3】

ある実施形態では、式（ｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0516】

【化4】

ある実施形態では、式（ｉｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0517】

【化5】

ある実施形態では、式（ｖ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0518】

【化6】

ある実施形態では、式（ｖｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0519】

【化7】

ある実施形態では、式（ｖｉｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0520】

【化8】

ある実施形態では、式（ｉｘ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【化9】

式中、
Ｘ^１が、Ｏ、ＮＲ^１、又は直接結合であり、Ｘ^２が、Ｃ２～５アルキレンであり、Ｘ^３が、Ｃ（＝Ｏ）又は直接結合であり、Ｒ^１が、Ｈ又はＭｅであり、Ｒ^３が、Ｃ１～３アルキルであり、Ｒ^２が、Ｃ１～３アルキルであり、又はＲ^２が、それが結合される窒素原子及びＸ^２の１～３個の炭素原子と一緒になって、４員、５員、若しくは６員環を形成し、又はＸ^１が、ＮＲ^１であり、Ｒ^１及びＲ^２が、それらが結合される窒素原子と一緒になって、５員若しくは６員環を形成し、又はＲ^２が、Ｒ^３及びそれらが結合される窒素原子と一緒になって、５員、６員、若しくは７員環を形成し、Ｙ^１が、Ｃ２～１２アルキレンであり、Ｙ^２が、

【化10】

から選択され、
ｎが、０～３であり、Ｒ^４が、Ｃ１～１５アルキルであり、Ｚ^１が、Ｃ１～６アルキレン又は直接結合であり、
Ｚ^２が

【化11】

（いずれかの配向で）であるか又は非存在であり、ただし、Ｚ^１が直接結合であり、Ｚ^２が非存在である場合；
Ｒ^５が、Ｃ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｒ^６が、Ｃ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｗが、メチレン又は直接結合であり、Ｒ^７が、Ｈ又はＭｅ、又はその塩であり、ただし、Ｒ^３及びＲ^２が、Ｃ２アルキルであり、Ｘ^１が、Ｏであり、Ｘ^２が、直鎖状Ｃ３アルキレンであり、Ｘ^３が、Ｃ（＝０）であり、Ｙ^１が、直鎖状Ｃｅアルキレンであり、（Ｙ^２）ｎ－Ｒ^４が、

【化12】

であり、Ｒ^４が、直鎖状Ｃ５アルキルであり、Ｚ^１が、Ｃ２アルキレンであり、Ｚ^２が、非存在であり、Ｗが、メチレンであり、Ｒ^７が、Ｈである場合、Ｒ^５及びＲ^６が、Ｃｘアルコキシでない。

【0521】

ある実施形態では、式（ｘｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0522】

【化13】

ある実施形態では、式（ｘｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0523】

【化14】

ある実施形態では、ＬＮＰは、式（ｘｉｉｉ）の化合物及び式（ｘｉｖ）の化合物を含む。

【0524】

【化15】

ある実施形態では、式（ｘｖ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0525】

【化16】

ある実施形態では、式（ｘｖｉ）の製剤を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【化17】

【0526】

ある実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド））の送達のための脂質ナノ粒子を形成するのに使用される脂質化合物は、以下の反応のうちの１つによって作製される：

【化18】

【0527】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を細胞に送達するために、式（ｘｘｉ）を含むＬＮＰが使用される。いくつかの実施形態では、式（ｘｘｉ）のＬＮＰは、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットによって記載されるＬＮＰ（例えば、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットの表１の脂質など、式（１）の脂質）である。

【化19】

式中、
各ｎは、独立に、２～１５の整数であり；Ｌ_１及びＬ_３は、各々独立に、－ＯＣ（Ｏ）－^＊又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－^＊であり、式中、「^＊」は、Ｒ_１又はＲ_３との結合点を指し；
Ｒ_１及びＲ_３は、各々独立に、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルからなる群から選択される１つ又は複数の置換基によって任意選択で置換されている、線状又は分枝状Ｃ_９～Ｃ_２０アルキル又はＣ_９～Ｃ_２０アルケニルであり；及び
Ｒ_２は、

【化20】

からなる群から選択される。

【0528】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を細胞に送達するために、式（ｘｘｉｉ）を含むＬＮＰが使用される。いくつかの実施形態では、式（ｘｘｉｉ）のＬＮＰは、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットによって記載されるＬＮＰ（例えば、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットの表２の脂質など、式（２）の脂質）である。

【化21】

式中、
各ｎは、独立に、１～１５の整数であり；
Ｒ_１及びＲ_２は、各々独立に、

【化22】

からなる群から選択され

【0529】

Ｒ_３は、

【化23】

からなる群から選択される。

【0530】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を細胞に送達するために、式（ｘｘｉｉｉ）を含むＬＮＰが使用される。いくつかの実施形態では、式（ｘｘｉｉｉ）のＬＮＰは、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットによって記載されるＬＮＰ（例えば、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットの表３の脂質など、式（３）の脂質）である。

【化24】

式中、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、又は－ＯＣ（Ｏ）－^＊から選択され、式中、^＊は、Ｒ_１との結合点を指し；
Ｒ_１は、

【化25】

からなる群から選択され、
及びＲ_２は、

【化26】

からなる群から選択される。

【0531】

ある実施形態では、本明細書に記載される組成物（例えば核酸（例えば環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）又はタンパク質）は、イオン化可能な脂質を含むＬＮＰ中で提供される。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、米国特許第９，８６７，８８８号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１に記載されるようなヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（ＳＭ－１０２）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１３において合成されるような９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（ＬＰ０１）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）実施例７、８、又は９において合成されるようなジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１４及び１６において合成されるような１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、イミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）脂質（３Ｓ、１０Ｒ、１３Ｒ、１７Ｒ）－１０、１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２、３、１４、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－テトラデカヒドロ－ｌＨ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエート、例えば、国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）からの構造（Ｉ）である。

【0532】

ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、カチオン性脂質、イオン化可能なカチオン性脂質、例えば、ｐＨに応じて正荷電若しくは中性形態で存在し得るカチオン性脂質、又は容易にプロトン化され得るアミン含有脂質であり得る。ある実施形態では、カチオン性脂質は、例えば、生理的条件下で、正に荷電することが可能である脂質である。例示的なカチオン性脂質としては、正電荷を有する１つ以上のアミン基を含む。ある実施形態では、脂質粒子は、中性脂質、イオン化可能なアミン含有脂質、生分解性アルキン脂質、ステロイド、多価不飽和脂質を含むリン脂質、構造脂質（例えば、ステロール）、ＰＥＧ、コレステロール及びポリマーコンジュゲート脂質のうちの１つ以上との配合物中のカチオン性脂質を含む。ある実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり得る。本明細書に開示される例示的なカチオン性脂質は、６．０を超える有効ｐＫａを有し得る。実施形態において、脂質ナノ粒子は、第１のカチオン性脂質と異なる有効ｐＫａ（例えば、第１の有効ｐＫａより高い）を有する第２のカチオン性脂質を含み得る。脂質ナノ粒子は、４０～６０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、及び治療剤、例えば、脂質ナノ粒子内に封入されるか又はそれと結合された本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド））を含み得る。ある実施形態では、核酸は、カチオン性脂質と同時に配合される。核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰの表面に吸着され得る。ある実施形態では、核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰ内に封入され得る。ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、例えば、標的化剤で被覆された標的部分を含み得る。実施形態において、ＬＮＰ製剤は、生分解性である。ある実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の脂質、例えば、式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉｉ）及び／又は（ｉｘ）を含む脂質ナノ粒子は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は１００％のＲＮＡ分子を封入する。

【0533】

脂質ナノ粒子製剤に使用され得る例示的なイオン化可能な脂質としては、限定はされないが、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレットの表１に列挙されるものが挙げられる。さらなる例示的な脂質としては、限定はされないが、以下の式の１つ以上：米国特許出願公開第２０１６／０３１１７５９号明細書のＸ；米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１６０１５１２８４号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１７０２１０９６７号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＩ、又はＩＩＡ；米国特許出願公開第２０１５０１４００７０号明細書のＩ－ｃ；米国特許出願公開第２０１３／０１７８５４１号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０３０３５８７号明細書又は米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０１４１６７８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２３９９２６号明細書のＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、又はＶ；米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書のＩ；国際公開第２０１７／１１７５２８号パンフレットのＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１４９８９４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１５／００５７３７３号明細書のＡ；国際公開第２０１３／１１６１２６号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２０１３／００９０３７２号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５２３号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５０４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／００５３５７２号明細書のＡ；国際公開第２０１３／０１６０５８号パンフレットのＡ；国際公開第２０１２／１６２２１０号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２００８／０４２９７３号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６７０号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１４／０２００２５７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２０３４４６号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０００５３６３号明細書のＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１４／０３０８３０４号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、ＩＩＤ、又はＩＩＩ～ＸＸＩＶ；米国特許出願公開第２０１３／０３３８２１０号明細書の；国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレットのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１２／０１０１１４７８号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１２／００２７７９６号明細書のＩ又はＸＸＸＶ；米国特許出願公開第２０１２／００５８１４４号明細書のＸＩＶ又はＸＶＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０３２３２６９号明細書の；米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０２０２８７１号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ；米国特許出願公開第２０１１／００７６３３５号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、又はＸＶＩ；米国特許出願公開第２００６／００８３７８号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／００６４２４２号明細書のＩ又はＸ－Ａ－Ｙ－Ｚ；米国特許出願公開第２０１３／００２２６４９号明細書のＸＶＩ、ＸＶＩＩ、又はＸＶＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１０／００６２９６７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１８９３５１号明細書のＩ～Ｘ；米国特許出願公開第２０１４／００３９０３２号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書のＶ；米国特許出願公開第２０１６／０３１７４５８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１９５９２０号明細書のＩ；米国特許出願公開第１０，２２１，１２７号明細書の５、６、又は１０；国際公開第２０１８／０８１４８０号パンフレットのＩＩＩ－３；国際公開第２０２０／０８１９３８号パンフレットのＩ－５又はＩ－８；米国特許出願公開第９，８６７，８８８号明細書の１８又は２５；米国特許出願公開第２０１９／０１３６２３１号明細書のＡ；国際公開第２０２０／２１９８７６号パンフレットのＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書の１；米国特許出願公開第２０１９／０２４０３４９号明細書のＯＦ－０２；米国特許出願公開第１０，０８６，０１３号明細書の２３；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ（２０２０）のｃＫＫ－Ｅ１２／Ａ６；国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットのＣ１２－２００；Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０１７）の７Ｃ１；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌの３０４－Ｏ１３又は５０３－Ｏ１３；米国特許第９，７０８，６２８号明細書のＴＳ－Ｐ４Ｃ２；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；及び国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレットの（１）、（２）、（３）又は（４）が挙げられる。例示的脂質としては、国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレットの表１～表１６のいずれか１つの脂質がさらに挙げられる。

【0534】

ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例９に記載されるようなＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３ｌＺ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３ｌ－テトラエン－ｌ９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１０に記載されるような脂質ＡＴＸ－００２である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１１に記載されるような（ｌ３Ｚ，ｌ６Ｚ）－Ａ，Ａ－ジメチル－３－ノニルドコサ－ｌ３、ｌ６－ジエン－ｌ－アミン（化合物３２）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１２に記載されるような化合物６又は化合物２２である。

【0535】

例示的な非カチオン性脂質としては、限定はされないが、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、ｌ８－ｌ－ｔｒａｎｓ ＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用され得ることが理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。さらなる例示的な脂質としては、特定の実施形態において、限定はされないが、参照により本明細書に援用される、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものが挙げられる。このような脂質としては、ある実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＤＧＴＳ）との肝臓トランスフェクションを改善することが分かっている植物脂質が挙げられる。

【0536】

脂質ナノ粒子に使用するのに好適な非カチオン性脂質の他の例としては、限定はされないが、非リン脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシ化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。他の非カチオン性脂質が、国際公開第２０１７／０９９８２３号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全内容が参照により本明細書に援用される）に記載される。

【0537】

ある実施形態では、非カチオン性脂質は、オレイン酸又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）の式Ｉ、ＩＩ、若しくはＩＶの化合物である。非カチオン性脂質は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を占め得る。ある実施形態では、非カチオン性脂質含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。実施形態において、イオン化可能な脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲（例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、又は８：１）である。

【0538】

ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、いずれのリン脂質も含まない。

【0539】

ある態様において、脂質ナノ粒子は、膜完全性を提供するために、ステロールなどの成分をさらに含み得る。脂質ナノ粒子に使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロール及びその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、極性類似体、例えば、５ａ－コレスタノール、５３－コプロスタノール、コレステリル－（２^，－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノール；非極性類似体、例えば、５ａ－コレスタン、コレステノン、５ａ－コレスタノン、５ｐ－コレスタノン、及びデカン酸コレステリル；及びそれらの混合物が挙げられる。ある実施形態では、コレステロール誘導体は、極性類似体、例えば、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルである。例示的なコレステロール誘導体が、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書（これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される）に記載される。

【0540】

ある実施形態では、ステロールなどの、膜完全性を提供する成分は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０－５０％（ｍｏｌ）（例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、又は４０～５０％）を占め得る。ある実施形態では、このような成分は、脂質ナノ粒子の総脂質含量の２０～５０％（ｍｏｌ）３０～４０％（ｍｏｌ）である。

【0541】

ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲート脂質分子を含み得る。一般に、これらは、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、及び／又は立体安定化を提供するのに使用される。例示的なコンジュゲート脂質としては、限定はされないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられる。ある実施形態では、コンジュゲート脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）コンジュゲート脂質である。

【0542】

例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、限定はされないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－ｌ，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が挙げられる。さらなる例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、例えば、米国特許第５，８８５，６ｌ３号明細書、米国特許第６，２８７，５９ｌ号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７５６８２、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書、及び米国特許出願第０９９８２３号明細書（これらは全て、全内容が参照により本明細書に援用される）に記載される。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全内容が参照により本明細書に援用される）の式ＩＩＩ、ＩＩＩ－ａ－Ｉ、ＩＩＩ－ａ－２、ＩＩＩ－ｂ－１、ＩＩＩ－ｂ－２、又はＶの化合物である。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書（これらは両方とも、全内容が参照により本明細書に援用される）の式ＩＩのものである。ある実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスタ－５－エン－３［β］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］を含む。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、

【化27】

から選択される構造を含む。

【0543】

ある実施形態では、ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートされた脂質も、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用され得る。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、及びカチオン性ポリマー脂質（ＧＰＬ）コンジュゲートが、ＰＥＧ－脂質の代わりに又はそれに加えて使用され得る。

【0544】

例示的なコンジュゲート脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート及びカチオン性ポリマー－脂質が、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（これらは全て、全内容が参照により本明細書に援用される）の表２に列挙されるＰＣＴ及びＬＩＳ特許出願に記載される。

【0545】

ある実施形態では、ＰＥＧ又はコンジュゲート脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を占め得る。ある実施形態では、ＰＥＧ又はコンジュゲート脂質含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０．５～１０％又は２～５％（ｍｏｌ）である。イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ／コンジュゲート脂質のモル比は、必要に応じて変化され得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモル又は総重量当たり３０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり０～６０％のコレステロール、組成物のモル又は総重量当たり０～３０％の非カチオン性脂質及び組成物のモル又は総重量当たり１～１０％のコンジュゲート脂質を含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり３０～４０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり４０～５０％のコレステロール、及び組成物のモル又は総重量当たり１０～２０％の非カチオン性脂質を含む。ある他の実施形態において、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり５０～７５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり２０～４０％のコレステロール、及び、組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン性脂質及び組成物のモル又は総重量当たり１～１０％のコンジュゲート脂質である。組成物は、組成物のモル又は総重量当たり６０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり２５～３５％のコレステロール、及び組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン性脂質を含有し得る。組成物はまた、組成物のモル又は総重量当たり最大で９０％のイオン化可能な脂質及び組成物のモル又は総重量当たり２～１５％の非カチオン性脂質を含有し得る。製剤はまた、例えば、組成物のモル又は総重量当たり８～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり５～３０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は総重量当たり０～２０％のコレステロール；組成物のモル又は総重量当たり４～２５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり４～２５％の非カチオン性脂質、組成物のモル又は総重量当たり２～２５％のコレステロール、組成物のモル又は総重量当たり１０～３５％のコンジュゲート脂質、及び組成物のモル又は総重量当たり５％のコレステロール；又は組成物のモル又は総重量当たり２～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり２～３０％の非カチオン性脂質、組成物のモル又は総重量当たり１～１５％のコレステロール、組成物のモル又は総重量当たり２～３５％のコンジュゲート脂質、及び組成物のモル又は総重量当たり１～２０％のコレステロール；或いは組成物のモル又は総重量当たり最大で９０％のイオン化可能な脂質及び組成物のモル又は総重量当たり２～１０％の非カチオン性脂質、或いは組成物のモル又は総重量当たり１００％のカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子製剤であり得る。ある実施形態では、脂質粒子製剤は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。ある他の実施形態において、脂質粒子製剤は、６０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。

【0546】

ある実施形態では、脂質粒子は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質（例えばリン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ化脂質を含み、ここで、脂質のモル比は、イオン化可能な脂質では２０～７０モルパーセントの範囲であり、目標は４０～６０であり、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲であり、目標は０～１５であり、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲であり、目標は３０～５０であり、ＰＥＧ化脂質のモルパーセントは、１～６の範囲であり、目標は２～５である。

【0547】

ある実施形態では、脂質粒子は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲート脂質を含む。

【0548】

一態様において、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。

【0549】

ある実施形態では、１つ以上のさらなる化合物も含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得、又はさらなる化合物は、本発明の脂質ナノ粒子に含まれ得る。言い換えると、脂質ナノ粒子は、核酸又は第１の核酸と異なる少なくとも第２の核酸に加えて、他の化合物を含有し得る。限定はされないが、他のさらなる化合物は、小型若しくは大型有機又は無機分子、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びその誘導体、ペプチド模倣薬、核酸、核酸類似体及び誘導体、生体材料から作製された抽出物、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。

【0550】

ある実施形態では、ＬＮＰは、生分解性、イオン化可能な脂質を含む。ある実施形態では、ＬＮＰは、（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，ｌ２－ジエノエート（３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ２－ジエノエート）とも呼ばれる）又は別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、国際公開第２０１９／０６７９９２号パンフレット、国際公開第／２０１７／１７３０５４号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット、及び国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット、並びにその中に提供される参考文献の脂質を参照されたい。ある実施形態では、ＬＮＰ脂質に関するカチオン性及びイオン化可能という用語は、同義的であり、例えば、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じてカチオン性である。

【0551】

ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される、数１０ｎｍ～数１００ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、又は１５０ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、又は約９０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。特定の実施形態において、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約８０ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約１００ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約ｌｍｍ～約５００ｍｍ、約５ｍｍ～約２００ｍｍ、約１０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約８０ｍｍ、約２５ｍｍ～約６０ｍｍ、約３０ｍｍ～約５５ｍｍ、約３５ｍｍ～約５０ｍｍ、又は約３８ｍｍ～約４２ｍｍの範囲である。

【0552】

ＬＮＰは、ある場合には、比較的均質であり得る。多分散指数は、ＬＮＰの均質性、例えば、脂質ナノ粒子の粒度分布を示すのに使用され得る。小さい（例えば、０．３未満の）多分散指数は、一般に、狭い粒度分布を示す。ＬＮＰは、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、又は０．２５の多分散指数を有し得る。ある実施形態では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。

【0553】

ＬＮＰのゼータ電位は、組成物の界面動電位を示すのに使用され得る。ある実施形態では、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表し得る。より高度に荷電された種は、身体内の細胞、組織、及び他の要素と不必要に相互作用し得るため、正又は負の比較的低い電荷を有する脂質ナノ粒子が一般に望ましい。ある実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、又は約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。

【0554】

タンパク質及び／又は核酸の封入の効率は、提供される初期量と比べた、調製後にＬＮＰで封入されるか又は他の形でＬＮＰと結合されるタンパク質及び／又は核酸の量を表す。封入効率は、高い（例えば、ほぼ１００％）のが望ましい。封入効率は、例えば、１つ以上の有機溶媒又は洗浄剤で脂質ナノ粒子を分解する前及び後で脂質ナノ粒子を含有する溶液中のタンパク質又は核酸の量を比較することによって、測定され得る。アニオン交換樹脂が、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するのに使用され得る。蛍光が、溶液中の遊離タンパク質及び／又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するのに使用され得る。本明細書に記載される脂質ナノ粒子の場合、タンパク質及び／又は核酸の封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であり得る。ある実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。ある実施形態では、封入効率は、少なくとも９５％であり得る。

【0555】

ＬＮＰは、任意に、１つ以上のコーティングを含み得る。ある実施形態では、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル、フィルム、又は錠剤に製剤化され得る。本明細書に記載される組成物を含むカプセル、フィルム、又は錠剤は、任意の有用なサイズ、引張り強さ、硬度又は密度を有し得る。

【0556】

ＬＮＰの追加的な例示的脂質、製剤、方法、及び特徴付けについては、国際公開第２０２０／０６１４５７号パンフレット及び国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）により教示されている。ＬＮＰのさらなる例示的脂質、製剤、方法、及び特徴付けについては、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍａｔｅｒ（２０２１）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５７８－０２１－００３５８－０（全体として参照により本明細書に援用される）により教示されている（例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．の図２の例示的脂質及び脂質誘導体を参照のこと）。

【0557】

ある実施形態では、インビトロ又はエクスビボ細胞リポフェクションが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又はＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて行われる。特定の実施形態において、ＬＮＰは、ＧｅｎＶｏｙ＿ＩＬＭイオン化可能な脂質混合物（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて製剤化される。特定の実施形態において、ＬＮＰは、２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノエチル‐［１，３］‐ジオキソラン（ＤＬｉｎ‐ＫＣ２‐ＤＭＡ）又はジリノレイルメチル‐４‐ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）を用いて製剤化され、その製剤及びインビボでの使用が、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１（３４）：８５２９－８５３３（２０１２）（全体が参照により本明細書に援用される）に教示される。

【0558】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰ、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの送達のために最適化されたＬＮＰ製剤が、国際公開第２０１９０６７９９２号パンフレット及び国際公開第２０１９０６７９１０号パンフレット（両方とも参照により援用される）に記載され、環状ポリリボヌクレオチド及び本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドの送達のために有用である。

【0559】

核酸（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）の送達に有用なさらなる特定のＬＮＰ製剤が、米国特許第８１５８６０１号明細書及び米国特許第８１６８７７５号明細書（両方とも参照により援用される）に記載され、これは、ＯＮＰＡＴＴＲＯの名称で販売されているパチシラン中で使用される製剤を含む。

【0560】

ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）ＬＮＰの例示的な投与量は、約０．１、０．２５、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、又は１００ｍｇ／ｋｇ（ＲＮＡ）を含み得る。ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）を含むＡＡＶの例示的な投与量は、約１０^１１、１０^１２、１０^１３、及び１０^１４ｖｇ／ｋｇのＭＯＩを含み得る。

【0561】

アジュバント
アジュバントは、アジュバント及び／又はアジュバントを含む免疫原性組成物を受ける対象において誘発される免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を増強する。いくつかの実施形態では、アジュバントは、本明細書に開示される対象に投与される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、本明細書に記載の免疫応答を生じさせるために、本明細書に記載の方法で使用される。詳細な実施形態では、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドから発現する免疫原に対する対象の免疫応答を促進するために使用される。いくつかの実施形態では、アジュバント及びポリリボヌクレオチドは、別々の組成物で同時投与される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、単一の組成物中にポリリボヌクレオチドと混合又は製剤化され、対象に投与される。いくつかの実施形態では、アジュバント及び環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、別々の組成物で同時投与される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、対象に投与される免疫原性組成物を得るために、単一の組成物中に線状又は環状ポリリボヌクレオチドと混合又は製剤化される。

【0562】

アジュバントは、環状又は線状ポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチド配列）の一成分であってもよく、ポリリボヌクレオチドの発現配列によってコードされるポリペプチドアジュバントであってもよく、ポリリボヌクレオチドによってコードされない分子（例えば、小分子、ポリペプチド、又は核酸分子）であってもよい。アジュバントは、同じ医薬組成物中にポリリボヌクレオチドと共に製剤化され得る。アジュバントは、ポリリボヌクレオチドと組み合わせて別々に（例えば、別々の医薬組成物として）投与され得る。

【0563】

いくつかの実施形態では、アジュバントは、環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上のアジュバントをコードする。例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２～１００個のアジュバントをコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２～１０個のアジュバントをコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２個のアジュバントをコードする。環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされるアジュバントの１つ又は複数は、例えば、発現したポリペプチドアジュバントを分泌経路へと導くＮ末端シグナル配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは３個のアジュバントをコードする。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは４個のアジュバントをコードする。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは５個のアジュバントをコードする。いくつかの実施形態では、アジュバントは、１つ又は複数の免疫原をコードする同じポリリボヌクレオチドによってコードされる。１つ又は複数のアジュバント及び１つ又は複数の免疫原は、同じポリリボヌクレオチド上にて共送達され得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドによってコードされるアジュバントは、自然免疫系刺激剤である配列（例えば、ポリリボヌクレオチド配列）である。自然免疫系刺激剤配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、又は少なくとも５００リボヌクレオチドを含み得る。自然免疫系刺激剤配列は、５～１０００、１０～５００、２０～５００、１０～１００、２０～１００、２０～５０、１００～５００、５００～１０００、又は１０～１０００リボヌクレオチドを含み得る。例えば、自然免疫系刺激剤である配列は、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマーから選択され得る。

【0564】

アジュバントは、ＴＨ１アジュバント及び／又はＴＨ２アジュバントであり得る。本開示で考慮されるさらなるアジュバントとしては、限定はされないが、以下のものの１つ以上が挙げられる：
鉱物含有組成物。本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適な鉱物含有組成物は、アルミニウム塩、及びカルシウム塩などの無機塩を含む。本開示は、水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などの無機塩、又は様々な無機化合物の混合物を含み、化合物は、任意の好適な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）を取る。カルシウム塩は、リン酸カルシウム（例えば、「ＣＡＰ」）を含む。アルミニウム塩は、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などを含む。

【0565】

油乳剤組成物。本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適な油乳剤組成物は、スクアレン－水エマルション、例えば、ＭＦ５９（５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０及び０．５％のＳｐａｎ、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化される）、ＡＳ０３（水中油型エマルション中のα－トコフェロール、スクアレン及びポリソルベート８０）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ製剤（例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含む。

【0566】

小分子。本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適な小分子は、イミキモド又は８４７、レシキモド又はＲ８４８、及びガルジキモド（ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）を含む。

【0567】

ポリマーナノ粒子。本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適なポリマーナノ粒子は、ポリ（ａ－ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニル－ピロリジノン又はポリエステル－アミド、及びそれらの組合せを含む。

【0568】

サポニン（すなわち、グリコシド、１つ以上の糖側鎖に結合された多環式アグリコン）。本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適なサポニン製剤は、精製された製剤、例えば、ＱＳ２１、並びに脂質製剤、例えば、ＩＳＣＯＭ及びＩＳＣＯＭマトリックスを含む。ＱＳ２１は、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）として販売されている。サポニン製剤は、コレステロールなどのステロールも含み得る。サポニン及びコレステロールの組合せは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独自の粒子を形成するのに使用され得る。ＩＳＣＯＭは、典型的に、ホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。任意の公知のサポニンが、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ及びＱＨＣのうちの１つ以上を含む。任意に、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗浄剤を含まなくてもよい。

【0569】

リポ多糖。本開示において使用するのに好適なアジュバントは、腸内細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体を含む。このような誘導体は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）及び３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、４、５又は６つのアシル化鎖を有する３ Ｄｅ－Ｏ－アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。他の非毒性ＬＰＳ誘導体は、モノホスホリル脂質Ａ模倣体、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えばＲＣ－５２９を含む。

【0570】

リポソーム。本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適なリポソームは、ビロソーム及びＣＡＦ０１を含む。

【0571】

脂質ナノ粒子。本開示において使用するのに好適なアジュバントは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及びそれらの成分を含む。

【0572】

リポペプチド（すなわち、１つ以上の脂肪酸残基及び２つ以上のアミノ酸残基を含む化合物）。本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適なリポペプチドは、Ｐａｍ２（Ｐａｍ２ＣＳＫ４）及びＰａｍ３（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）を含む。

【0573】

糖脂質。本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適な糖脂質は、コードファクター（トレハロースジミコラート）を含む。

【0574】

ＭＤＰ（Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン）などの（合成又は精製）グラム陰性又はグラム陽性菌に由来するペプチド及びペプチドグリカンが、本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適である。

【0575】

アジュバントとして使用するのに好適な炭水化物（炭水化物含有）又は多糖は、デキストラン（例えば、分岐微生物多糖）、硫酸デキストラン、レンチナン、ザイモサン、β－グルカン、デルチン（ｄｅｌｔｉｎ）、マンナン、及びキチンを含む。

【0576】

ＲＮＡベースのアジュバント。本開示において使用するのに好適なＲＮＡベースのアジュバントは、ポリＩＣ、ポリＩＣ：ＬＣ、５’三リン酸を有するか又は有さないヘアピンＲＮＡ、ウイルス配列、ポリＵ含有配列、ｄｓＲＮＡ天然又は合成ＲＮＡ配列、及び核酸類似体（例えば、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ又は他の環状ジヌクレオチド、例えば、環状ジ－ＧＭＰ、免疫刺激塩基類似体例えば、Ｃ８－置換及びＮ７，Ｃ８－二置換グアニンリボヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドの線状ポリリボヌクレオチド対応物である。

【0577】

ＤＮＡベースのアジュバント。本開示において使用するのに好適なＤＮＡベースのアジュバントは、ＣｐＧｓ、ｄｓＤＮＡ、及び天然又は合成免疫刺激ＤＮＡ配列を含む。

【0578】

タンパク質又はペプチド。本開示におけるアジュバントとして使用するのに好適なタンパク質及びペプチドは、フラジェリン－融合タンパク質、ＭＢＬ（マンノース結合レクチン）、サイトカイン、及びケモカインを含む。

【0579】

ウイルス粒子。アジュバントとして使用するのに好適なウイルス粒子は、ビロソーム（リン脂質細胞膜二重層）を含む。

【0580】

本開示において使用するためのアジュバントは、フラジェリン、ＬＰＳ、又は細菌毒素（例えば、エンテロトキシン（タンパク質）、例えば、易熱性毒素又はコレラ毒素）など、細菌由来であり得る。本発明において使用するためのアジュバントは、イミキモドにコンジュゲートされたＣｐＧなどのハイブリッド分子であり得る。本開示において使用するためのアジュバントは、キチン又はβ－グルカンなどの、真菌又は卵菌綱（ｏｏｍｙｃｅｔｅ）微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）であり得る。ある実施形態では、アジュバントは、金ナノロッド又はシリカ系ナノ粒子（例えば、メソ多孔質シリカナノ粒子（ＭＳＮ））などの無機ナノ粒子である。ある実施形態では、アジュバントは、多成分アジュバント又はアジュバント系、例えば、ＡＳ０１、ＡＳ０３、ＡＳ０４（ＭＬＰ５＋ミョウバン）、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント：ＩＦＡ＋ペプチドグリカン＋トレハロースジミコラート）、糖脂質免疫調節剤（マイコバクテリア細胞壁に位置するコードファクターの合成変異体であり得るトレハロース６，６－ジベヘネート（ＴＤＢ））で安定化されたＣＡＦ０１（カチオン性リポソームビヒクルの２成分系（ジメチルジオクタデシル－アンモニウム（ＤＤＡ））である。

【0581】

サイトカイン。アジュバントは、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β）、Ｔｈ－１誘導サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８）、又はＴｈ－２誘導サイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３）など、サイトカインをコードする部分的又は完全長ＤＮＡであり得る。

【0582】

ケモカイン。アジュバントは、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｒａｎｔｅｓ、又はＴＣＡ－３など、ケモカインをコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｍＲＮＡ）であり得る。

【0583】

アジュバントは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０－Ｌ、ＣＤ７０、又はＣＤ２７など、共刺激分子をコードする部分的又は完全長ＤＮＡであり得る。

【0584】

アジュバントは、ＴＬＲ４、ＴＬＲ３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、又はＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１など、自然免疫系刺激剤（部分的、完全長、又は突然変異型）；又はｃａＴＬＲ４、ｃａＴＬＲ３、ｃａＴＬＲ３、ｃａＴＬＲ９、ｃａＴＬＲ７、ｃａＴＬＲ８、ｃａＴＬＲ７、ｃａＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、又はｃａＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１など、構成的に活性な（ｃａ）自然免疫系刺激剤をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｍＲＮＡ）であり得る。

【0585】

アジュバントは、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＭｙＤ８８、ＩＰＳ１、ＡＳＣ、ＭＡＶＳ、ＭＡＰＫ、ＩＫＫ－α、ＩＫＫ複合体、ＴＢＫ１、β－カテニン、及びカスパーゼ１など、アダプター又はシグナル伝達分子をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｍＲＮＡ）であり得る。

【0586】

アジュバントは、免疫応答を上方制御することのできる転写活性化因子（例えば、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ１、又はＩＲＦ５）など、転写活性化因子をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｍＲＮＡ）であり得る。アジュバントは、ＩＬ－２β、ＩＦＮ－γ、又はＩＬ－６など、サイトカイン受容体をコードする部分的又は完全長ＤＮＡであり得る。

【0587】

アジュバントは、フラジェリン又はＭＢＬなど、細菌成分をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｍＲＮＡ）であり得る。

【0588】

アジュバントは、自然免疫系の任意の成分をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｍＲＮＡ）であり得る。

【0589】

いくつかの実施形態では、対象には、１つ又は複数の免疫原をコードする環状又は線状ポリリボヌクレオチドがアジュバント（例えば、環状ポリリボヌクレオチドと別個の分子実体であるアジュバント又は別個のポリリボヌクレオチドにコードされるアジュバント）と組み合わせて投与される。本明細書を通して使用される「～と組み合わせて」という用語には、治療レジメンの一部として任意の２つの組成物を投与することが含まれる。これには、例えば、単一の医薬組成物として、ポリリボヌクレオチド及びアジュバントを製剤化することが含まれ得る。これにはまた、例えば、定義された治療又は投薬レジメンに従って、別々の組成物として、ポリリボヌクレオチド及びアジュバントを対象に投与することが含まれる。アジュバントは、ポリリボヌクレオチドの投与の前、実質的に同時に、又は後に、対象に投与され得る。アジュバントは、ポリリボヌクレオチドの投与の前又は後の１日、２日、５日、１０日、２０日、１ケ月、２ケ月、３ケ月、４ケ月、５ケ月、又は６ケ月以内に投与され得る。アジュバントは、ポリリボヌクレオチドと同じ投与経路（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、局所、又は経口）、又は異なる経路によって投与され得る。

【0590】

ワクチン
本明細書に記載される方法のある実施形態では、第２の薬剤がまた、対象に投与され、例えば、第２のワクチンがまた、対象に投与される。ある実施形態では、対象に投与される組成物は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド及び第２のワクチンを含む。ある実施形態では、ワクチン及び環状ポリリボヌクレオチドは、別個の組成物中で共投与される。ワクチンは、環状ポリリボヌクレオチド免疫化と同時に投与され、環状ポリリボヌクレオチド免疫化の前に投与され、又は環状ポリリボヌクレオチド免疫化の後に投与される。

【0591】

例えば、ある実施形態では、対象は、非環状ポリリボヌクレオチドワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）及び環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、対象は、第１の微生物（例えば、肺炎球菌）のための非ポリリボヌクレオチドワクチン及び本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫化される。ワクチンは、任意の細菌感染ワクチン又はウイルス感染ワクチンであり得る。特定の実施形態において、ワクチンは、ＰＣＶ１３又はＰＰＳＶ２３などの肺炎球菌多糖ワクチンである。ある実施形態では、ワクチンは、インフルエンザワクチンである。ある実施形態では、ワクチンは、ＲＳＶワクチン（例えば、パリビズマブ）である。

【0592】

ある実施形態では、対象に投与される組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及びワクチンを含む。ある実施形態では、ワクチン及び線状ポリリボヌクレオチドは、別個の組成物中で共投与される。ワクチンは、線状ポリリボヌクレオチド免疫化と同時に投与され、線状ポリリボヌクレオチド免疫化の前に投与され、又は線状ポリリボヌクレオチド免疫化の後に投与される。

【0593】

例えば、ある実施形態では、対象は、ポリリボヌクレオチド（例えば、非線状ポリリボヌクレオチド）ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）及び免疫原をコードする配列を含む本明細書に開示される線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫化される。ある実施形態では、対象は、第１の微生物（例えば、肺炎球菌）のための非ポリリボヌクレオチドワクチン及び免疫原をコードする配列を含む本明細書に開示される線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫化される。ワクチンは、任意の細菌感染ワクチン又はウイルス感染ワクチンであり得る。特定の実施形態において、ワクチンは、ＰＣＶ１３又はＰＰＳＶ２３などの肺炎球菌多糖ワクチンである。ある実施形態では、ワクチンは、インフルエンザワクチンである。ある実施形態では、ワクチンは、ＲＳＶワクチン（例えば、パリビズマブ）である。

【0594】

他の実施形態
記載された本発明の組成物、方法及び使用の様々な変更及び変形は、当業者であれば、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されたモードの様々な変更は、本発明の範囲内であることが意図される。

【0595】

全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれることが具体的且つ個々に示されたのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0596】

本開示を限定するのではなく例示することが意図される以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作製され、評価され得るかの説明を当業者に提供するために提示される。実施例は、本開示を純粋に例示するものであることが意図されており、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。

【0597】

実施例１：免疫原をコードする環状ＲＮＡの設計
この実施例は、免疫原をコードする環状ＲＮＡの設計を記載する。この実施例では、環状ＲＮＡが、ＩＲＥＳ、免疫原をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサーエレメントを含むように設計される。環状化により、ローリングサークル型翻訳、個別のＯＲＦ発現及び制御されたタンパク質化学量論のための交互のスタガーエレメントを有する複数のＯＲＦ、並びにリボソーム進入のためのＲＮＡを標的とするＩＲＥＳが可能になる。環状ＲＮＡによってコードされる例示的な免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原（ＲＢＤ及びスパイク）、インフルエンザＨ１Ｎ１免疫原、ＨＰＶ免疫原、及び腫瘍ネオ抗原である。

【0598】

実施例２：環状ＲＮＡの生成及び精製
この実施例では、環状ＲＮＡは、２つの例示的な方法のうちの１つによって生成され、ＲＮＡ精製システムで再び精製される。

【0599】

例示的方法１：ＤＮＡスプリントライゲーション
この例示的な方法は、スプリントライゲーションによって環状ＲＮＡを生成する。ＲｐｐＨ処理線状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡを用いて環状化される。非修飾線状ＲＮＡは、ＤＮＡセグメントからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写によって合成される。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で、製造業者の指示に従って処理される。或いは、又は加えて、ＲＮＡは、ＧＴＰより過剰なＧＭＰで転写された。

【0600】

スプリントライゲーションは、以下のように実施される：環状ＲＮＡが、ＲＮＡリガーゼを使用して、転写された線状ＲＮＡ及び１０～４０ヌクレオチド長のＤＮＡスプリントの処理によって生成される。環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を４％変性ＰＡＧＥで分離し、各環状ＲＮＡに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除したＲＮＡゲル断片を破砕し、ＲＮＡをゲル溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）により３７℃で１時間溶出した。或いは、又は加えて、環状ＲＮＡをカラムクロマトグラフィーによって精製した。上清を回収し、破砕したゲルにゲル溶出緩衝液を加えることによってＲＮＡを再度溶出し、１時間インキュベートする。ゲル破片を遠心分離フィルタで除去し、エタノールで沈殿させる。アガロースゲル電気泳動を、純度及び環状化を検証するための品質管理測定として使用する。

【0601】

例示的方法２：自己スプライシングイントロンによる環状化
この例示的な方法は、自己スプライシングによって環状ＲＮＡを生成する。環状ＲＮＡは、インビトロで生成される。非修飾線状ＲＮＡを、先に列挙した全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写する。インビトロ転写反応は、１μｇの鋳型ＤＮＡ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、１０×Ｔ７反応緩衝液、７．５ｍＭ ＡＴＰ、７．５ｍＭ ＣＴＰ、７．５ｍＭ ＧＴＰ、７．５ｍＭ ＵＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、４０Ｕ ＲＮアーゼ阻害剤、及びＴ７酵素を含んだ。転写は３７℃で４時間行う。転写されたＲＮＡを、１ＵのＤＮアーゼＩにより３７℃で１５分間ＤＮアーゼ処理する。自己スプライシングによる環状化を促進するために、２ｍＭの最終濃度まで追加のＧＴＰを添加し、５５℃で１５分間インキュベートする。次いで、ＲＮＡをカラム精製し、ＵＲＥＡ－ＰＡＧＥによって可視化する。

【0602】

実施例３：環状ＲＮＡからのマルチ免疫原発現
この実施例は、環状ＲＮＡからの複数の免疫原の発現を記載する。

【0603】

この実施例では、１つの環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ（配列番号１）、続いて、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１の第１の株、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のヘマグルチニン（ＨＡ）の一部に対応する免疫原１をコードするＯＲＦ（配列番号２）、終止コドン、ＩＲＥＳ（配列番号１）、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１の第２の株、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のヘマグルチニン（ＨＡ）の一部に対応する免疫原２をコードする別のＯＲＦ（配列番号３）、終止コドン、及びスペーサー（配列番号４）を含むように設計される（図１Ａを参照）。この環状ＲＮＡは、本明細書に記載の方法に従って、インビトロ又は細胞内で生成される。

【0604】

簡潔に説明すると、環状ＲＮＡをウサギ網状赤血球ライセート（ＲＲＬ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、ＷＩ、ＵＳＡ）中、３０℃で１．５～３時間インキュベートする。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球ライセート、２０μＭのアミノ酸混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｌ４４６Ａ）、及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ２１１Ａ）を含む。トリクロロ酢酸沈殿法によりヘモグロビンを除去する。沈殿及び遠心分離の後、上清を廃棄し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）に溶解し、７０℃で１５分間インキュベートする。サンプルを、４～１２％勾配のポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ、ＮＰ０３２６ＢＯＸ）上で分離し、続いてウェスタンブロッティングを行う。タンパク質を、セミドライ法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｔｈｅｒｍｏ）に電気泳動で転写させ、ブロットし、特異的抗体でプローブし、Ｃ－Ｄｉｇｉｔスキャナー（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で化学発光によって可視化する。Ｉｍａｇｅ－Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、発現レベルの定量に使用する。

【0605】

さらに、免疫原１及び免疫原２の発現を、ｅＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞由来の培養上清中でＥＬＩＳＡによって測定する。簡潔に説明すると、０．１ｐｍｏｌのｅＲＮＡを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；３１９８５０６２）中、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＬＭＲＮＡ０１５）を用いて１０，０００個のＨｅＬａ細胞にトランスフェクトする。細胞上清を１日目及び２日目に回収する。ＥＬＩＳＡを以下のように行う：１００μＬのＰＢＳ中、４℃で、捕捉抗体をＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ４４２４０４、９６ウェル）上に一晩かけてコーティングする。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、プレートをブロッキングバッファ（２％のＦＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で１時間ブロッキングする。次いで、上清希釈物を１００μＬブロッキングバッファの入った各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、プレートをＨＲＰ検出抗体と共に室温で１時間インキュベートする。テトラメチルベンゼン（Ｐｉｅｒｃｅ ３４０２１）を各ウェルに添加し、５～１５分間反応させた後、２Ｎの硫酸でクエンチする。光学濃度（ＯＤ）値を、４５０ｎｍで測定する。

【0606】

実施例４：免疫原及びアジュバントをコードする環状ＲＮＡ
この実施例は、環状ＲＮＡが免疫原を発現し、さらにアジュバントをコードする能力について記載する。アジュバントは発現してもよく、又は自然免疫系刺激剤配列などの非発現核酸配列に対応してもよい。

【0607】

第１の例では、１つの環状ＲＮＡが、ＩＲＥＳと、それに続いて、免疫原をコードするＯＲＦ、終止コドン、ＩＲＥＳ、アジュバントをコードする別のＯＲＦ、終止コドン、及びスペーサーを含むように設計される（図１Ａを参照）。環状ＲＮＡは、本明細書に記載される方法に従いインビトロ又は細胞のいずれかで作成し、発現させる。

【0608】

第２の例では、１つの環状ＲＮＡが、ＩＲＥＳと、それに続いて、免疫原をコードするＯＲＦ、終止コドンを含むように設計され、さらに、発現しない、自然免疫系（例えば、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマー）を刺激することによってアジュバントとして作用する核酸配列をコードする（図２を参照）。環状ＲＮＡは、本明細書に記載される方法に従いインビトロ又は細胞のいずれかで作成し、発現させる。

【0609】

実施例５：突然変異バリアントに由来する複数の免疫原をコードする環状ＲＮＡ
この実施例では、環状ＲＮＡは、９０％以上１００％未満のアミノ酸配列同一性を共有するような互いの突然変異バリアントである２つのポリペプチド免疫原をコードする（図１Ａ～図１Ｂ）。ポリペプチド免疫原は、各々が、同じタンパク質に対応する１つ又は複数のエピトープを含む。ポリペプチド免疫原は、遺伝的浮動によって近縁関係にあるとされる内因的に存在するポリペプチド免疫原であるか、又はその修飾されたバージョンであってもよい。この環状ＲＮＡは、開始コドン、発現配列、１つ又は複数のスタガー要素、及びＩＲＥＳで設計される（図１Ｂ）。環状化により、スタガー要素によって分離された複数の発現配列のローリングサークル翻訳が可能となる。

【0610】

インフルエンザウイルスに関連するタンパク質赤血球凝集素における突然変異バリアントは当業者に公知である。突然変異バリアントは、ウイルスポリメラーゼの忠実度が低い結果として赤血球凝集素タンパク質に導入され、その結果、赤血球凝集素タンパク質はもはや同一の配列を有しないことになる（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，８３：５１０－５１６）。したがって、赤血球凝集素の様々な突然変異バリアントに対応する複数の免疫原（複数の免疫原の各々が少なくとも９５％の配列同一性を共有する）が、環状ＲＮＡによってコードされる。この環状ＲＮＡは、開始コドン、インフルエンザウイルスの頭部に関連する赤血球凝集素タンパク質に由来するポリペプチド免疫原を含む第１のＯＲＦ、スタガー要素、赤血球凝集素タンパク質の突然変異バリアントに由来するポリペプチド免疫原を含む第２のＯＲＦ、及び任意選択のＩＲＥＳを含む。

【0611】

実施例６：同じ標的に由来する複数の免疫原をコードする環状ＲＮＡ
この実施例では、環状ＲＮＡは２つの異なるタンパク質に由来する２つのポリペプチド免疫原をコードするが、両タンパク質は同じ標的を識別する。環状ＲＮＡは、開始コドン、発現配列、スタガーエレメント、及びＩＲＥＳを用いて設計される（図１Ｂ）。環状化により、スタガーエレメントによって分離された複数の発現配列のローリングサークル型翻訳が可能になる。

【0612】

具体的には、環状ＲＮＡは、開始コドン、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）に由来するポリペプチド免疫原を含む第１のＯＲＦ、任意選択のスタガーエレメント、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質４１（ｇｐ４１）に由来するポリペプチド免疫原を含む第２のＯＲＦ、及び任意選択のＩＲＥＳをコードし、ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質はポリペプチド免疫原の標的である。３つのｇｐ１２０及び３つのｇｐ４１はヘテロ二量体の三量体で結合し、ｇｐ１２０の三量体は頭部領域であり、ｇｐ４１の三量体は尾部領域であり、ＨＩＶ－１のエンベロープスパイクを一緒に形成する。したがって、ｇｐ１２０及びｇｐ４１の両方に由来するポリペプチド免疫原は、ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質を標的とする環状ＲＮＡに含まれる。

【0613】

実施例７：異なる標的に由来する複数の免疫原をコードする環状ＲＮＡ
この例では、環状ＲＮＡは、互いに異なる標的を識別する２つの異なるタンパク質に由来する２つのポリペプチド免疫原をコードする。環状ＲＮＡは、開始コドン、発現配列、スタガーエレメント、及びＩＲＥＳを用いて設計される（図１Ｂ）。環状化により、スタガーエレメントによって分離された複数の発現配列のローリングサークル型翻訳が可能になる。

【0614】

異なる標的に由来する複数の免疫原は、開始コドン、水痘帯状疱疹ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質１（ｇＰ１）に由来するポリペプチド免疫原をコードするＯＲＦ、スタガー配列、及びヘマグルチニンに由来するポリペプチド免疫原を有するように設計されるような環状ＲＮＡによってコードされる。水痘帯状疱疹ウイルスのエンベロープ糖タンパク質は少なくとも６種あり、糖タンパク質ｇＰ１、ｇＰ２、ｇＰ３は、身体が中和抗体を産生するように誘導することができる（Ｚｗｅｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．１９８１；３１（１）：４３６－４４４）。同様に、２つのエンベロープ糖タンパク質、ヘマグルチニン及び融合タンパク質は、モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）の知られた免疫原である。したがって、ｇＰ１に由来するポリペプチド免疫原及びヘマグルチニンに由来するポリペプチド免疫原をコードする環状ＲＮＡは、水痘帯状疱疹ウイルス及びモルビリウイルスの両方を標的とする。

【0615】

実施例８：環状ＲＮＡのマルチ免疫原投与
この実施例は、複数の環状ＲＮＡ分子を投与することによる、対象における複数の免疫原の発現を記載する。

【0616】

この実施例では、環状ＲＮＡ １は、ＩＲＥＳ（配列番号１）、続いて、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１の第１の株、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９由来のヘマグルチニン（ＨＡ）の一部に対応する免疫原１をコードするＯＲＦ（配列番号２）、終止コドン、及びスペーサー（配列番号４）を含むように設計される（図２を参照）。環状ＲＮＡ ２は、ＩＲＥＳ（配列番号１）、続いて、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１の第２の株、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のヘマグルチニン（ＨＡ）の一部に対応する免疫原２をコードするＯＲＦ（配列番号３）、終止コドン、及びスペーサー（配列番号４）を含むように設計される（図３を参照）。これらの環状ＲＮＡは、インビトロ転写（Ｌｕｃｉｇｅｎ；ＡＳ３１０７）、及び本明細書に提供される方法によって記載されるＲＮＡリガーゼを使用するＲＮＡライゲーションによって生成される。

【0617】

本明細書に記載のような複数の異なる免疫原をコードする複数の環状ＲＮＡを、哺乳動物対象への投与のために製剤化する。

【0618】

環状ＲＮＡを、本明細書に含まれる製剤のいずれかに製剤化する。これらの製剤化されたＲＮＡを、０日目に、好適な経路、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内経路によって注射する。

【0619】

分泌された免疫原発現を、哺乳動物対象から採取した血液又は組織において評価する。投与後１、２、７、１４及び２１日目に、抗凝固剤を含まない管に血液サンプルを採取する。血清を、１３００ｇ、４℃で２５分間の遠心分離によって単離し、分泌されたタンパク質発現をＥＬＩＳＡによって測定する。簡単に説明すると、捕捉抗体を、１００μＬのＰＢＳ中、４Ｃで一晩、ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ４４２４０４、９６ウェル）上にコーティングする。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、プレートをブロッキングバッファ（２％のＦＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で１時間ブロッキングする。次いで、上清希釈物を１００μＬブロッキングバッファの入った各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、プレートをＨＲＰ検出抗体と共に室温で１時間インキュベートする。テトラメチルベンゼン（Ｐｉｅｒｃｅ ３４０２１）を各ウェルに添加し、５～１５分間反応させた後、２Ｎの硫酸でクエンチする。光学濃度（ＯＤ）値を、４５０ｎｍで測定する。

【0620】

実施例９：複数の環状ＲＮＡによってコードされる免疫原とアジュバントとの共投与
この実施例は、複数の環状ＲＮＡを対象に投与して免疫応答を刺激することを示す。対象に投与される環状ＲＮＡのうちの１つがポリペプチド免疫原をコードする。対象に投与される別の環状ＲＮＡがアジュバントをコードする（図３）。

【0621】

この例では、ポリペプチド免疫原をコードする環状ＲＮＡが設計され、生成され、精製され、及び製剤として調製される。免疫応答を刺激するため、当業者によればアジュバントとして作用することが公知のポリＵを含む別個の環状ＲＮＡが設計され、生成され、精製され、及び医薬製剤として調製される。ポリペプチド免疫原及びポリＵアジュバントをコードする環状ＲＮＡのこれらの製剤が、互いに異なる製剤で同時に対象に投与される。

【0622】

実施例１０：環状ＲＮＡによってコードされる免疫原及び小分子アジュバントの同時投与
この実施例は、環状ＲＮＡを小分子アジュバントと組み合わせて対象に投与することにより、免疫応答を刺激することを示す。

【0623】

この実施例では、ポリペプチド免疫原をコードする環状ＲＮＡを設計し、生成し、精製し、製剤として調製する。免疫応答を刺激するために、ＭＦ５（登録商標）アジュバントなどの小分子アジュバントを対象に投与する。ポリペプチド免疫原をコードする環状ＲＮＡの製剤及び小分子アジュバントの両方を、対象に同時に対象に投与する。

【0624】

実施例１１：異なる標的に対応するポリペプチド免疫原をそれぞれコードする複数の環状ＲＮＡを含む免疫原性組成物の同時投与
この実施例では、それぞれがポリペプチド免疫原をコードする複数の環状ＲＮＡ（図３）を対象に投与する。

【0625】

モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）標的を識別するために、当該技術分野で知られているエンベロープタンパク質ヘマグルチニンに由来するポリペプチド免疫原をコードする１つの環状ＲＮＡを対象に投与する。水痘帯状疱疹ウイルス標的を識別するために当該技術分野で知られているエンベロープタンパク質糖タンパク質Ｅに由来するポリペプチド免疫原をコードする別の環状ＲＮＡも対象に投与する。両方の環状ＲＮＡを設計し、生成し、精製し、そして製剤として調製する。両環状ＲＮＡを含む製剤を対象に投与する。

【0626】

実施例１２：環状ＲＮＡを用いた哺乳動物における免疫原に対する抗体のインビボ誘導
本明細書に記載の免疫原をコードする環状ポリヌクレオチドを、哺乳動物対象へ投与するために製剤化する。製剤は、生理食塩水によるか、又は本明細書で教示する製剤のいずれかである。環状ポリヌクレオチドを含有するワクチンは、任意選択により、１種又は複数種の樹状標的剤又は部分を含有する。免疫原をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを、０日目に、好適な経路、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内経路によって注入する。免疫刺激剤又は部分をコードするポリヌクレオチドを、免疫応答を刺激するために、免疫原をコードするポリヌクレオチドと同時投与することができる。免疫原をコードする環状ポリヌクレオチドを含有するワクチンの追加のチャレンジを、免疫原に対する抗体が検出されるまで、週１回、隔週、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと又は８週間ごとに行う。免疫原特異的抗体の産生を強化するために、追加のワクチンチャレンジを投与する。

【0627】

実施例１３：哺乳動物細胞における環状ＲＮＡからのタンパク質又は免疫原の発現の検出
ＲＮＡコンストラクトからの非分泌タンパク質又は免疫原の発現効率を測定するために、タンパク質又は免疫原をコードする環状ＲＮＡ（０．１ピコモル）を、本明細書に記載の方法に従って生成し精製する。ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＭＲＮＡ）を用いて、ＨＥＫ２９３（無血清培地の入った９６ウェルプレートに、１ウェル当たり１０，０００個の細胞）に環状ＲＮＡをトランスフェクトする。

【0628】

非分泌タンパク質又は免疫原について、タンパク質発現を、免疫原特異的ＥＬＩＳＡを用いて２４、４８、及び７２時間で測定する。発現を測定するために、溶解バッファ及びプロテアーゼ阻害剤を使用して、適切な時点で各ウェル中の細胞を溶解する。細胞溶解物を回収し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を採取する。

【0629】

分泌されたタンパク質又は免疫原について、免疫原特異的ウエスタンブロットを用いて、２４、４８、及び７２時間で免疫原発現を検出する。簡単に説明すると、哺乳動物細胞からの８０μＬの上清を各ウェルから採取する。採取した培地中のタンパク質レベルをＢＣＡタンパク質アッセイ法によって測定し、同量のタンパク質を４％～１２％勾配のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分離し、ｉＢｌｏｔ２トランスファーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてニトロセルロース膜に移す。抗免疫原抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いて免疫原を検出する。タンパク質バンドからの化学発光シグナルを、ｉＢｒｉｇｈｔ ＦＬ１５００イメージングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってモニターする。

【0630】

実施例１４：哺乳動物細胞における環状ＲＮＡからのＲＢＤ免疫原の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における環状ＲＮＡからのＲＢＤ免疫原の発現を示す。

【0631】

この実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡを、本明細書に記載の方法に従って生成し精製した。

【0632】

ＲＢＤをコードする環状ＲＮＡの発現を、ウエスタンブロットと組み合わされた免疫沈降（ＩＰ－ウエスタン）によって試験した。簡潔に述べると、ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ（０．１ピコモル）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＬＭＲＮＡ０１５）を用いて、ＢＪ線維芽細胞及びＨｅＬａ細胞（１０，０００個の細胞）中にトランスフェクトした。ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ単独を、対照として使用した。上清を、２４時間の時点で収集し、免疫沈降を、タンパク質Ｇ－Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０００３Ｄ）に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ－スパイク糖タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｃａｔ：４０５９２－Ｔ６２）に特異的なウサギ抗体を用いて行い、同じ抗体を用いて、ＰＡＧＥによって分解された免疫沈降された産物を検出した。組み換えＲＢＤ（４２ｎｇ）免疫沈降を、対照として使用し、細胞タンパク質発現を定量した。膜化学発光を、Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ（商標）Ｌｉｔｅウエスタンブロット定量ソフトウェア（Ｌｉ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量した。

【0633】

環状ＲＮＡによってコードされるＲＢＤ免疫原が、ＢＪ線維芽細胞及びＨｅＬａ細胞上清において検出され、対照では検出されなかった（図４）。

【0634】

この実施例は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（分泌されたタンパク質である）が、哺乳動物細胞における環状ＲＮＡから発現されたことを示す。

【0635】

実施例１５：マウスモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原の免疫原性
カチオン性ポリマー（例えば、プロタミン）で製剤化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡの免疫原性を、マウスモデルにおいて評価した。カチオン性ポリマーで製剤化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原に対する抗体の産生もまた、マウスモデルにおいて評価した。

【0636】

この実施例では、環状ＲＮＡをＩＲＥＳ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦ、並びにＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサーエレメントを用いて設計した。環状ＲＮＡを、以下のように生成した。ＤＮＡセグメントからのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、過剰のグアノシン５’モノホスフェートを用いたインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、製造業者の使用説明書に従って精製した。精製した線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡを用いて環状化した。

【0637】

環状ＲＮＡを、以下のようにスプリットライゲーションによって生成した：転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントを混合し、アニーリングし、ＲＮＡリガーゼで処理した。環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を逆相クロマトグラフィーによって分離した。移動相の有機含量を増加させることにより、環状ＲＮＡを線状ＲＮＡから選択的に溶出した。溶出したＲＮＡを分別回収し、環状ＲＮＡの純度を測定した。選択した画分を合わせ、バッファを交換して移動相の塩及び溶媒を除去した。アクリルアミドゲル電気泳動を、純度及び環状化を検証するための品質管理測定として使用した。

【0638】

精製した環状ＲＮＡを純水で１１００ｎｇ／μＬの濃度に希釈した。硫酸プロタミンを乳酸リンゲル液（４０００ｎｇ／μＬ）に溶解した。攪拌しながら、ＲＮＡ：プロタミンの重量比が２：１になるまで、プロタミン－乳酸リンゲル溶液を環状ＲＮＡ溶液の半分に添加した。安定な複合体の形成を確実にするため、溶液をさらに１０分間撹拌した。次いで、残りの環状ＲＮＡを（すなわち、残りの環状ＲＮＡを環状ＲＮＡ：プロタミン溶液に）添加し、溶液を短時間撹拌した。混合物（すなわち、環状ＲＮＡ混合物）の最終濃度を、乳酸リンゲル溶液を用いて調整して、５０μＬ中に２μｇ又は１０μｇのＲＮＡを含有する最終ＲＮＡ濃度を有する環状ＲＮＡ調製物を得た。

【0639】

１群あたり３匹のマウスに対し、０日目及び２１日目に、２μｇ若しくは１０μｇの用量の環状ＲＮＡ調製物、又はプロタミンビヒクル対照を、筋肉内又は皮内にワクチン接種した。各マウスに、Ａｄｄａｖａｘ（商標）アジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、０日目及び２１日目の環状ＲＮＡ調製物を投与した２４時間後に、筋肉内又は皮内に１回投与した。Ａｄｄａｖａｘ（商標）アジュバントは、５０μＬ中の１×ＰＢＳ中５０％で、製造業者の説明書に従って投与した。

【0640】

各マウスからの血液の収集は、サブモル採血によって行った。血液を、環状ＲＮＡの投与後、７、１４、２１、２３、２８、３５、４１、４９、５６、６３、６９、７７、８４、１０８及び１１５日目に抗凝固剤を含まない乾燥チューブに収集した。４℃、１２００ｇ、３０分間の遠心分離により全血から血清を分離した。血清を５６℃で１時間加熱することにより熱不活性化した。個々の熱不活性化血清サンプルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってＲＢＤ特異的ＩｇＧの存在についてアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ４４２４０４ ９６ウェル、Ｎｕｎｃ）に、１００μＬ ＰＢＳ中、４℃で、一晩かけて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２－Ｖ０８Ｂ；１００ｎｇ）をコーティングした。次いで、プレートをブロッキングバッファ（２％のＦＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）で１時間ブロッキングした。次いで、血清希釈物を１００μＬブロッキングバッファの入った各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）洗浄剤（ＴＢＳ－Ｔ）を含む１×トリス緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、プレートを抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５－０３５－０７１）と共に１時間インキュベートし、続いて、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、次いで、テトラメチルベンゼン（Ｐｉｅｒｃｅ ３４０２１）を添加した。ＥＬＩＳＡプレートを５分間反応させ、次いで、２Ｎの硫酸を用いてクエンチした。光学濃度（ＯＤ）値を、４５０ｎｍで測定した。

【0641】

各血清サンプルの光学密度を、バックグラウンド（ＲＢＤでコーティングし、二次抗体のみと共にインキュベートしたプレート）の光学密度で除した。各サンプルのバックグラウンドに対する倍率をプロットした。

【0642】

結果は、環状ＲＮＡ調製物を注入した後、１４、２１、２３、２８、３５、４１、４９、５６、６３、６９、７７、８４、１０８及び１１５日目に抗ＲＢＤ応答が得られたことを示した（図５）。プロタミンビヒクルの注入後では、抗ＲＢＤ抗体は得られなかった。これらの結果は、ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡがマウスにおいて抗原特異的免疫応答を誘導することを示した。

【0643】

同様のＥＬＩＳＡを用いて、スパイク特異的ＩｇＧの存在について血清サンプルをアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ４４２４０４ ９６ウェル、Ｎｕｎｃ）に、１００μＬ ＰＢＳ中、４℃で、一晩かけて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５８９－Ｖ０８Ｂ１；１００ｎｇ）をコーティングした。次いで、プレートをブロッキングバッファ（２％のＦＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で１時間ブロッキングした。次いで、血清希釈物を１００μＬブロッキングバッファの入った各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）洗浄剤（ＴＢＳ－Ｔ）を含む１×トリス緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、プレートを抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５－０３５－０７１）と共に１時間インキュベートし、続いて、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、次いで、テトラメチルベンゼン（Ｐｉｅｒｃｅ ３４０２１）を添加した。ＥＬＩＳＡプレートを５分間反応させ、次いで、２Ｎの硫酸を用いてクエンチした。光学濃度（ＯＤ）値を、４５０ｎｍで測定した。

【0644】

結果は、環状ＲＮＡ調製物を注入した後、３５日目に抗スパイク抗体が得られたことを示した（図６）。ビヒクルの注入後では、抗スパイク抗体は得られなかった。

【0645】

投与後１４日目の血清抗体を、相対ＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａアイソタイプを測定するアッセイを用いて特徴付け（図７）、血清抗体のウイルスを中和する能力を、ＰＲＮＴ中和アッセイを用いて、特徴付けた。その結果、アジュバントを筋肉内投与した２μｇのＲＢＤ環状ＲＮＡが中和能を有することが示された。

【0646】

実施例１６：非ヒト動物への投与用の環状ＲＮＡの製剤化
モデル免疫原としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原又はガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードする環状ＲＮＡを、本明細書に記載される方法に従い設計し、精製した。精製の後、環状ＲＮＡ又はｍＲＮＡを、以下のように配合した。

【0647】

Ａ．環状ＲＮＡ又はｍＲＮＡを、５０μＬ中２．５又は２５ピコモルの最終濃度になるまでＰＢＳ中で希釈して、環状又は線状ＲＮＡ製剤（非配合）を得た。

【0648】

Ｂ．環状ＲＮＡ又はｍＲＮＡを、製造業者の説明（１５％のＴｒａｎｓＩＴ、５％のブースト）にしたがって、脂質担体（例えば、ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ））及びｍＲＮＡブースト試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）と共に配合して、５０μＬ中２．５又は２５ピコモルの最終ＲＮＡ濃度を得て、環状又は線状ＲＮＡ製剤を得た。

【0649】

Ｃ．環状ＲＮＡ又はｍＲＮＡを、カチオン性ポリマー（例えば、プロタミン）と共に配合した。簡潔に述べると、環状ＲＮＡを純水中で希釈した。プロタミン硫酸塩を、乳酸リンゲル液（４０００ｎｇ／μＬ）に溶解させた。撹拌しながら、プロタミン－乳酸リンゲル液を、ＲＮＡ：プロタミンの重量比が２：１になるまで環状ＲＮＡ又はｍＲＮＡ溶液の半分まで加えた。溶液を、さらに１０分間にわたって撹拌して、安定した複合体の形成を確実にした。次に、残りの環状ＲＮＡ又はｍＲＮＡを加え、溶液を短時間撹拌した。環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡ製剤の再終濃度が５０μＬ当たり２．５又は２５ピコモルになるように、溶液の最終濃度を乳酸リンゲル液を用いて調整した。

【0650】

Ｄ．環状ＲＮＡ又はｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子と共に配合した。簡潔に述べると、環状ＲＮＡ又はｍＲＮＡを、２５ｍＭの酢酸塩緩衝液ｐＨ＝４（０．２ｕｍのフィルタに通してろ過された）中で、０．２ｕｇ／ｕＬの濃度になるまで希釈した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、５０／３８．５／１０／１．５ｍｏｌ％のモル比で、イオン化可能な脂質（例えばＡＬＣ０３１５）、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００をエタノール（０．２ｕｍの滅菌フィルタに通してろ過された）にまず溶解させることによって配合した。最終的なイオン化可能な脂質／ＲＮＡ重量比は、８／１ｗ／ｗであった。脂質及びＲＮＡ溶液を、３／１緩衝液／エタノールの流量比及び１ｍｌ／分の総流量で、マイクロ流体システムを用いてマイクロミキサーチップ中で混合した。次に、ＬＮＰを、３時間にわたってＰＢＳ ｐＨ＝７．４中で透析して、エタノールを除去した。ＬＮＰの内部のＲＮＡ濃度及び封入効率を、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを用いて測定した。必要に応じて、ＬＮＰを、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルタ、１００ｋＤａカットオフを用いて、所望のＲＮＡ濃度になるまで濃縮した。粒子のサイズ、濃度、及び電荷を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｎａｙｔｉｃａｌ）を用いて測定した。ＲＮＡ濃度を、ＰＢＳを用いて、０．１又は０．２ｕｇ／ｕｌの最終濃度になるまで調整した。２つのＲＮＡ配列を含む製剤では、ＬＮＰ中で配合する前又は各ＲＮＡが別々に配合された後に、ＲＮＡを混合した。インビボ実験では、ＬＮＰ中で配合された最終ＲＮＡを、滅菌０．２ｕｍ再生セルロースフィルタに通してろ過した。

【0651】

実施例１７：時間調整されたアジュバント送達を使用する、マウスにおける環状ＲＮＡからのガウシアルシフェラーゼのインビボ産生の調節
この実施例は、インビボでの環状ＲＮＡからのタンパク質又は免疫原の発現を示す一方で、アジュバントを送達して免疫応答を刺激する。

【0652】

この実施例では、ＧＬｕｃをコードする環状ＲＮＡを、本明細書に記載の方法に従って生成し、精製した。環状ＲＮＡを実施例１６に記載のように製剤化して、環状ＲＮＡ調製物（例えば、Ｔｒａｎｓ－ＩＴによる製剤化、プロタミンによる製剤化、ＰＢＳ／未製剤化）を得た。マウスに、後肢への単回筋肉内注射によって、各環状ＲＮＡ調製物５０μＬを投与した。別の群のマウスに、プロタミン製剤化環状ＲＮＡ調製物を、背中への単回皮内注射により皮内投与した。

【0653】

免疫応答を刺激するために、ＭＦ５９（登録商標）アジュバントと同様の処方のスクアレンベースの水中油型ナノエマルジョンであるＡｄｄａｖａｘ（商標）アジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、０時間（環状ＲＮＡ調製物との同時送達）又は２４時間後にマウス後肢に注射した。Ａｄｄａｖａｘ（商標）アジュバントを、製造業者の使用説明書に従って５０μＬを投与した。

【0654】

血液サンプル（約２５μＬ）を、各マウスから、サブモル採血によって採取した。環状ＲＮＡの投与の０、６、２４及び４８時間後に、血液をＥＤＴＡチューブに採取した。４℃、１３００ｇで３０分間遠心分離することによって血漿を単離し、分泌酵素であるガウシアルシフェラーゼの活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μＬの１×ＧＬｕｃ基質を５μＬの血漿に加えて、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。ルミノメーター装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で混合した直後に、プレートを読み取った。

【0655】

この実施例は、（ａ）アジュバントを含まない場合（図８）、及びアジュバントを０時間及び２４時間時に送達した場合（図９）、ＴｒａｎｓＩＴ製剤化、プロタミン製剤化、及び未製剤化の環状ＲＮＡ調製物の筋肉内注射によって；また（ｂ）アジュバントを含まない場合、及びアジュバントを２４時間時に送達した場合（図１０）、プロタミン製剤化環状ＲＮＡ調製物の皮内注射によって、インビボで長期間にわたって環状ＲＮＡからタンパク質が首尾よく発現することを実証した。

【0656】

実施例１８：ＲＮアーゼＨ産生核酸分解産物を評価することによる環状ＲＮＡ調製物の特徴付け
この実施例は、ＲＮアーゼＨ産生核酸分解産物についての環状ＲＮＡ調製物の評価が、線状のコンカテマー産物対環状産物を検出することができることを示す。

【0657】

ＲＮＡは、リガーゼとインキュベートした場合、反応しないか、又は分子内若しくは分子間結合を形成することができ、それぞれ環状（遊離末端なし）又はコンカテマーＲＮＡ（線状）を生成する。相補的ＤＮＡプライマー及びＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を認識する非特異的エンドヌクレアーゼのＲＮアーゼＨにより各タイプのＲＮＡを処理することにより、出発ＲＮＡ材料に応じて特定のサイズの固有の数の分解産物を生成すると予想される。

【0658】

ライゲーションされたＲＮＡは、ＲＮアーゼＨ分解によって産生されるＲＮＡの数及びサイズに基づいて、コンカテマーＲＮＡの混入のない環状ＲＮＡ、又はコンカテマーＲＮＡ混入を伴う環状ＲＮＡであることが示され得る。プライマー及びＲＮアーゼＨが環状ＲＮＡに添加される場合、環状ＲＮＡ及びＲＮアーゼＨを有する単一のプライマー二本鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖領域を分解して、単一の線状ＲＮＡ産物を生成する。プライマー及びＲＮアーゼＨがコンカテマーに付加される場合、コンカテマーＲＮＡ及びＲＮアーゼＨを有する少なくとも２つのプライマー二本鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を分解して３つの産物をもたらす。１つの産物は５’末端から第１のプライマー結合領域までのＲＮＡであり、１つの産物は連結されたコンカテマーの数に応じて複数のＲＮＡを含み得る第１のプライマー結合領域と次のプライマー結合領域との間のＲＮＡであり、最終産物は、最後のプライマー結合領域から３’末端までのＲＮＡである。プライマー及びＲＮアーゼＨが線状ＲＮＡに付加されると、線状ＲＮＡを有する単一のプライマー二本鎖は、５’末端からプライマー結合領域へのＲＮＡのための１つの産物、及び３’末端へのプライマー結合領域のための別の産物を生じる。図１１の左側の図はこの戦略を示す。

【0659】

この実施例では、環状ＲＮＡを以下のように生成した。修飾されていない線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写により合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で精製し、ＲＮＡ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で製造業者の使用説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製システムで再び精製した。環状ＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦを有するＩＲＥＳ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサーエレメントを含むように設計した。

【0660】

ＲＮＡの環状化状態を試験するために、０．０５ｐｍｏｌｅ／μｌの線状又は環状ＲＮＡ調製物を、０．２５Ｕ／μｌのＲＮアーゼＨ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を消化するエンドリボヌクレアーゼ、及び３７℃で３０分間、Ｎｌｕｃ ＲＮＡに相補的な１０～３０核酸の０．３ｐｍｏｌｅ／μｌオリゴマーと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を６％変性ＰＡＧＥによって分析した。ゲルをＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎで染色し、Ｅ－ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒで可視化した。可視化したゲル上のバンド強度を測定し、ＩｍａｇｅＪにより分析した。

【0661】

図１１の右側は、この実験における実際の分解産物を示す。ＲＮアーゼＨエンドヌクレアーゼと共にインキュベートされた線状ＲＮＡレーン中のバンドの数は、予想通り２つのバンドを生成したが、一方、レーンＡの場合、単一のバンドが環状ＲＮＡレーンで検出され、環状ＲＮＡが実際に環状であり、コンカテマーではないことを示した。レーンＢ及びレーンＣの場合、線状及びコンカテマー混入によるバンドが、ＲＮアーゼＨレーンに現れる複数の小さい断片バンドの存在のため、ＲＮアーゼＨ処理後に見られた。

【0662】

実施例１９：環状ＲＮＡ調製物中の線状ＲＮＡ（検量線）
この実施例は、環状ＲＮＡ調製物中の線状ＲＮＡの計算を示す。

【0663】

この例では、環状ＲＮＡを以下のとおり作成した。非修飾線状ＲＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によってＤＮＡセグメントから合成した。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で精製し、ＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製システムで再び精製した。環状ＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦを伴うＩＲＥＳと、ＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素とを含むように設計した。

【0664】

転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントをＴ４ ＤＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）で処理することにより、スプリントライゲーションした環状ＲＮＡを作成した。

【0665】

環状ＲＮＡを精製するため、ライゲーション混合物を４％変性ＰＡＧＥ上で分離し、環状ＲＮＡの各々に対応するＲＮＡバンドを切り出した。切り出したＲＮＡゲル断片を破砕し、ＲＮＡをゲル溶出緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳ）で３７℃にて１時間溶出した。上清を回収し、破砕したゲルにゲル溶出緩衝液を加えることによってＲＮＡをもう一度溶出し、１時間インキュベートした。ゲルの破片を遠心フィルタによって取り除き、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。溶出した環状ＲＮＡを６％変性ＰＡＧＥにより分析した。ゲルをＳＹＢＲグリーンで染色し、Ｅ－ｇｅｌイメージャにより可視化した。

【0666】

既知量で同じサイズのＲＮＡ（標準ＲＮＡ）のバンド強度を比較することにより、ゲル上のＲＮＡ量を決定した。検量線を作成して、ゲル上の未知の試料の量を決定した（図１２）。検量線を作成するため、環状ＲＮＡ調製物と並行して、環状ＲＮＡの線状対応物１、０．５、０．２及び０．０５ｐｍｏｌを６％変性ＰＡＧＥにロードした。変性ゲルをＳＹＢＲグリーンで染色し、Ｅ－ｇｅｌイメージャにより可視化した。次にゲル上の各バンド強度を測定し、ＩｍａｇｅＪによって分析した。異なるレーンの各々にロードしたＲＮＡのバンド強度を分析することによって線状ＲＮＡの検量線を作成し（いずれの場合にもＲ^２＞０．９８）、この線状ＲＮＡ検量線に基づき、環状ＲＮＡ調製物中の線状ＲＮＡの量を決定した。

【0667】

異なる試料中の線状ＲＮＡの量は、環状ＲＮＡ調製物Ａについて以下のとおりであった：線状ＲＮＡは、約０．３１モル／モル、又は１１５．９９ｎｇ／３９５ｎｇ、又は３０．２％と計算された。環状ＲＮＡ調製物Ｃについて：線状ＲＮＡは、約０．４５モル／モル、又は２６０．５２ｎｇ／４８８ｎｇ、又は４９．２％と計算された。

【0668】

実施例２０：環状ＲＮＡ調製物中の線状ＲＮＡ（ゲルの切り出し及び抽出）
この実施例は、調製物中の環状ＲＮＡの精製及び定量化を示す。

【0669】

この例では、環状ＲＮＡを以下のとおり作成した。非修飾線状ＲＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によってＤＮＡセグメントから合成した。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で精製し、ＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製システムで再び精製した。環状ＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦを伴うＩＲＥＳと、ＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素とを含むように設計した。

【0670】

転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントをＴ４ ＤＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｍ０２３９）で処理することにより、スプリントライゲーションした環状ＲＮＡを作成した。

【0671】

環状ＲＮＡを精製するため、ライゲーション混合物を６％変性ＰＡＧＥ上で分離し、環状ＲＮＡの各々に対応するＲＮＡバンドを切り出した。切り出したＲＮＡゲル断片を破砕し、ＲＮＡをゲル溶出緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳ）で３７℃にて１時間溶出した。上清を回収し、破砕したゲルにゲル溶出緩衝液を加えることによってＲＮＡをもう一度溶出し、１時間インキュベートした。ゲルの破片を遠心フィルタによって取り除き、ＲＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下にエタノールで沈殿させた。溶出した環状ＲＮＡを６％変性ＰＡＧＥにより分析した。ゲルをＳＹＢＲグリーンで染色し、Ｅ－ｇｅｌイメージャにより可視化した（図１３）。目に見えるバンドを再び切り出し、ゲルブレーカーを使用することによって破砕した。ＲＮＡを抽出するため、破砕したゲルにゲル溶出緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした。上清を回収し、破砕したゲルにゲル溶出緩衝液を加えることによってＲＮＡをもう一度溶出し、１時間インキュベートした。ゲルの破片をｓｐｉｎ Ｘカラムによって取り除き、抽出したＲＮＡをエタノール沈殿させた。個々のバンドから抽出されたＲＮＡをＱｕｂｉｔ３蛍光光度計によって測定した。

【0672】

異なる試料から抽出されたＲＮＡは、以下のとおり定量化された：（調製物Ａ）約１４４６ｎｇ環状ＲＮＡ及び１７６ｎｇ線状ＲＮＡ（８９．１％環状ＲＮＡ）；（調製物Ｂ）約９３４ｎｇ環状ＲＮＡ及び２７０ｎｇ線状ＲＮＡ（７７．５％環状ＲＮＡ）；及び（調製物Ｃ）約３２０ｎｇ環状ＲＮＡ及び３９６ｎｇ線状ＲＮＡ（４４．６％環状ＲＮＡ）。

【0673】

実施例２１：環状ＲＮＡ調製物中の線状ＲＮＡ
この実施例は、調製物中の総リボヌクレオチド分子に対して９１％（ｗ／ｗ）純度の環状ＲＮＡ分子の生成及び続くマウスにおける投与による生物学的効果の発生を示す。

【0674】

この例では、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んだ。

【0675】

この例では、環状ＲＮＡをインビトロで作成した。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁した。

【0676】

最終的な環状ＲＮＡ生成調製物中に線状ポリリボヌクレオチドが残留した。バッチごとに、最終生成調製物を６％ＴＢＥ－尿素ゲル上に流し、バンドをＩｍａｇｅＪを使用して分析することにより、最終生成調製物中の環状ＲＮＡの純度及び残留線状ＲＮＡのパーセンテージを定量化した。純度は、全ＲＮＡ強度と比較した環状ＲＮＡの強度を計算することによって評価し、パーセンテージとして記録した。ここでは、環状ＲＮＡは、調製物中の全ＲＮＡに対して９１％（ｗ／ｗ）の純度であった。

【0677】

投与前、ＰＢＳ及び１０％ＴｒａｎｓＩＴ担体を加えて、１００μＬ最終容積中に所望の最終的な環状ＲＮＡ濃度０．２５ｐｍｏｌを実現した。マウスが、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦをコードする環状ＲＮＡ０．２５ｐｍｏｌの単回静脈内尾静脈注射（１００μＬ）の投与を受けた。

【0678】

各マウスからサブモル量の採血により血液試料（約２５μＬ）を採取した。血液は、投与後０、６時間、１、２、３、７、１４、２１、２８及び３５日の時点でＥＤＴＡチューブに採取した。４℃にて１３００ｇで３０分間遠心することにより血漿を分離し、分泌酵素であるガウシアルシフェラーゼの活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。簡潔に言えば、５０μＬの１×ＧＬｕｃ基質を５μＬの血漿に加え、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを実行した。プレートは、ルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）で混合直後に読み取った。

【0679】

環状ＲＮＡの投与後６時間及び１、２、３、７、１４、及び２１日の時点で血漿中にガウシアルシフェラーゼ活性が検出された。環状ＲＮＡの最も高い発現は注射の約２日後に観察され、高度な発現は長期間にわたり維持され、２１日の時点でもなお検出可能であった。全ての時点で、その活性レベルは、陰性対照（ＰＢＳビヒクルのみ）について観察されたものよりも高かった。

【0680】

この実施例は、調製物中の全ＲＮＡに対して９１％（ｗ／ｗ）の純度の環状ＲＮＡの生成に成功したこと、静脈内注射による送達が成功したこと、及び長期間にわたり血中に検出可能なタンパク質の発現が可能であったことを示す。

【0681】

実施例２２：ゲル精製した環状ＲＮＡ中のニック環状ＲＮＡの定量化
この実施例は、ゲル抽出によって精製した環状ＲＮＡが調製物中の全ＲＮＡ分子に対して１．１％（ｗ／ｗ）以下のニックＲＮＡを含有することを示す。

【0682】

この例では、ＲＮＡは、ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んだ。

【0683】

この例では、環状ＲＮＡをインビトロで作成した。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。この結果、ライゲーション接合部でＲＮＡの環状化が起こり、環状ＲＮＡが生じる。環状ＲＮＡを４％ＰＡＧＥゲルで尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁した。この例では、精製した環状ＲＮＡは、調製物中の全ＲＮＡに対して８０％（ｗ／ｗ）の純度を有すると評価された。

【0684】

この例では、線状ＲＮＡの配列を次世代シーケンシングによって評価した。ＮＧＳパイプライン用に、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡワークフロー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＲＳ－２００－００１２）に記載されるライブラリ調製方法を用いて、精製した環状ＲＮＡ調製物（８０％純度）を調製した。この方法によれば、高忠実度で３’末端の同一性が保たれた。簡潔に言えば、アダプターを溶液中で任意のＲＮＡ分子に利用可能な３’末端又は５’末端を用いてライゲートした。インタクトな環状ＲＮＡでは、このライゲーションは起こらないことになる－結果として、このステップにより非環状ＲＮＡのみが選択された。次にこれらの生成物を逆転写し、増幅すると、ｃＤＮＡライブラリが作成され、続いてこれを精製し、クオリティコントロールを行い、マルチプレックス化した。次にライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｎｉｓｅｑ機でシーケンシングにかけた。

【0685】

上記に記載されるのと同じような方法で、ＲｐｐＨ処理後のインビトロ転写からの線状ＲＮＡ生成物をシーケンシング用に加工した。

【0686】

環状ＲＮＡの作成に使用した鋳型配列にリードをマッピングし戻し、ライゲーション接合部にマッピングされるリードの数を評価することにより、ゲル精製した環状ＲＮＡ調製物中のＩＶＴの線状ＲＮＡ生成物及び非環状ＲＮＡの両方のシーケンシング結果を比較した。

【0687】

この分析では、残る非環状ＲＮＡは、ニックＲＮＡとＩＶＴからの残留線状ＲＮＡ生成物との混合物であるものと仮定される。この例では、非環状ＲＮＡがニックＲＮＡのみを含むと仮定した場合、ライゲーション接合部にマッピングされる断片のパーセンテージは５０％になると予想される。非環状ＲＮＡがＩＶＴからの残留線状ＲＮＡ産物のみを含むと仮定した場合、ライゲーション接合部にマッピングされる断片のパーセンテージは０％になると予想される。これらの統計的仮定及び対照実験を用いて検量線を作成し、これによりニックＲＮＡの定量化が可能になった。これにより、ニックＲＮＡとして非環状ＲＮＡの５．４％という計算値が求まった。

【0688】

この実施例は、精製した環状ＲＮＡ調製物の５．４％（ｗ／ｗ）の非環状ＲＮＡ比率（全ＲＮＡの１．１％（ｗ／ｗ）に相当する）がニックＲＮＡであったことを示す。

【0689】

実施例２３：環状ＲＮＡ調製物中に存在する線状ＲＮＡが減少すると、コードされるタンパク質の発現が増加した
この実施例は、主に環状ＲＮＡの組成物中に存在する線状ＲＮＡが減少すると、細胞においてコードされるタンパク質の発現が増加したことを示す。

【0690】

この実施例では、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んだ。

【0691】

環状ＲＮＡの２つのバッチを作成した。いずれの場合も、環状ＲＮＡはインビトロで作成した。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、及びＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁した。

【0692】

最終的な環状ＲＮＡ生成物中に線状ＲＮＡが残留した。バッチごとに、最終生成物を６％ＴＢＥ－尿素ゲルに流し、バンドをＩｍａｇｅＪを使用して分析することにより、最終生成物中の環状ＲＮＡの純度及び残留線状ＲＮＡのパーセンテージを定量化した。ｃｉｒｃＲＮＡの純度は、全ＲＮＡ強度と比較したｃｉｒｃＲＮＡの強度を計算することによって評価し、パーセンテージとして記録した。ここでは、バッチは７１％純度及び８４％純度であった。

【0693】

各ＲＮＡバッチの０．２ｐｍｏｌを細胞トランスフェクションに使用した。製造者の推奨に従いＲＮＡをＯｐｔｉｍｅｍ及びＭｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｍａｘと組み合わせた。ビヒクルのみの対照も同様に調製したが、ただし、いかなるＲＮＡも含まなかった。時点＝０で、ＢＪ線維芽細胞に各調製物を加えた。

【0694】

ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてガウシアルシフェラーゼの活性を試験した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９９０）に、２０μＬの細胞上清の試料を加えた。トランスフェクションから６、２４、４８、７２、９６及び１２０時間後に試料を取り出した。端的には、各ウェルに１×セレンテラジン基質を加えた。基質を加えて混合した後に、ルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）でプレートを読み取った。

【0695】

８４％純度の環状ＲＮＡを使用した実験において、トランスフェクションから６、２４、４８、７２、９６、及び１２０時間後に細胞中にガウシアルシフェラーゼ活性が検出され（図１２）、これは、ビヒクルのみの対照によって得られる発現よりも高かった。８４％純度の環状ＲＮＡに由来する発現は、７１％純度の環状ＲＮＡに由来する発現よりも有意に高かった。トランスフェクションの２４時間後、ＧＬｕｃ活性は、８４％純度の環状ＲＮＡをトランスフェクトしたとき、７１％純度の環状ＲＮＡをトランスフェクトしたときと比較して３９７倍の高さであった。７１％純度の環状ＲＮＡを使用した実験において、トランスフェクションの６、２４、４８、及び７２時間後に細胞中にＧＬｕｃ活性が検出され（図１４）、これは、ビヒクルのみの対照によって得られる発現よりも高かった。

【0696】

この実施例は、高い純度の（線状ＲＮＡが減少した）環状ＲＮＡほど、コードされるタンパク質の発現が増加し、持続することを実証した。

【0697】

実施例２４：環状ＲＮＡ調製物中に存在する線状ＲＮＡは、細胞の自然免疫応答に用量依存的に影響を及ぼした
この実施例は、環状ＲＮＡ調製物中に存在する線状ＲＮＡが自然免疫応答に用量依存的に悪影響を及ぼしたことを示す。

【0698】

この例では、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを以下のとおり作成した。非修飾線状ＲＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によってＤＮＡセグメントから合成した。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で精製し、ＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製システムで再び精製した。環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳと、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含むように設計した。

【0699】

転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントをＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）で処理することにより、スプリントライゲーションした環状ＲＮＡを作成した。

【0700】

環状ＲＮＡを精製するため、ライゲーション混合物を４％変性ＰＡＧＥ上で分離し、環状及び線状ＲＮＡの各々に対応するＲＮＡバンドを切り出した。線状ＲＮＡを同じ４％変性ＰＡＧＥゲルを使用して精製した。切り出したＲＮＡゲル断片（線状又は環状の）を破砕し、ＲＮＡをゲル溶出緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳ）で３７℃にて１時間溶出した。上清を回収し、破砕したゲルにゲル溶出緩衝液を加えることによってＲＮＡをもう一度溶出し、１時間インキュベートした。ゲルの破片を遠心フィルタによって取り除き、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。

【0701】

ＢＪ線維芽細胞中の環状ＲＮＡレベルをモニタすることにより、ゲル精製後の環状ＲＮＡの調製物中にある様々なレベルの線状ＲＮＡ対応物の影響を決定した。９６ウェルプレート中の細胞に、脂質ベースのトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＬＭＲＮＡ００３）を使用して、ゲル精製後の環状ＲＮＡ調製物、又は等量のゲル精製後の環状ＲＮＡ調製物であって、ただし様々なレベルのゲル精製後の線状ＲＮＡを補足したもののいずれかを懸濁液（リバース）トランスフェクトした。トランスフェクション後６時間及び１～５日の時点でＱ－ＰＣＲによって免疫遺伝子レベルを分析した。端的には、細胞ライセートから、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｃ_Ｔキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４４０２９５３）を使用して、製造者の指示に従いランダムプライミングによりｃＤＮＡを作成した。免疫遺伝子特異的プライマーを使用してＱ－ＰＣＲを実施し、Ｐｆａｆｆｌ法及びβ－アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用して相対的ＲＮＡレベルを計算した。

【0702】

ゲル精製後の環状ＲＮＡ調製物単独をトランスフェクトした細胞中の環状ＲＮＡは、自然免疫遺伝子の限られた発現増加を示した。逆に、環状及び線状ＲＮＡの組合せをトランスフェクトした細胞は、自然免疫遺伝子の用量依存的な上方制御を実証した（図１５）。

【0703】

実施例２５：合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳は、細胞において別個のタンパク質産物を産生した
この実施例は、細胞において、終止エレメント（終止コドン）を欠く、例えば、終止エレメント（終止コドン）の代わりにスタガーエレメントを有する合成環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳によって、別個のタンパク質又は免疫原産物が翻訳されたことを示す。さらに、この実施例は、スタガーエレメントを有する環状ＲＮＡがその線状対応物よりも正確な分子量を有するより多くのタンパク質又は免疫原産物を発現したことを示す。

【0704】

環状ＲＮＡは、終止エレメント（終止コドン）の代わりにスタガーエレメントを有するナノルシフェラーゼ遺伝子（ｎＬＵＣ）を含むように設計した。細胞を、ビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎＬＵＣ：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガーエレメント（２Ａ配列）、３×ＦＬＡＧタグ付きｎＬｕｃ配列、及びスタガーエレメント（２Ａ配列）；又は環状ｎＬＵＣ：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガーエレメント（２Ａ配列）、３×ＦＬＡＧタグ付きｎＬｕｃ配列、及びスタガーエレメント（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図１６に示すように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、正確な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を産生した。

【0705】

２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡバッファを添加することによって細胞を回収した。１４００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を１０～２０％勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルで分析した。

【0706】

ドライトランスファー法を用いてニトロセルロース膜に電気転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットをＥＣＬキットで可視化し、ウェスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪで測定した。

【0707】

図１６に示すように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞で検出された。特に、終止エレメント（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ対応物よりも正確な分子量を有する、より高いレベルの別個のタンパク質産物を産生した。

【0708】

実施例２６：調節核酸部位を有する環状ＲＮＡの調製
この実施例は、調節ＲＮＡ結合部位を有する環状ＲＮＡのインビトロ産生を示す。

【0709】

異なる細胞型は、特定のＲＮＡ配列を標的とする特有の核酸調節機構を有する。環状ＲＮＡにおけるこれらの特定の配列をコードすることにより、異なる細胞型において特有の特性を付与し得る。以下の実施例に示すように、環状ＲＮＡを、マイクロＲＮＡ結合部位をコードするように操作した。

【0710】

この実施例では、環状ＲＮＡは、ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをコードする配列、ｍｉｒ６９２マイクロＲＮＡ結合部位、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサーエレメントを含んだ。

【0711】

環状ＲＮＡを、インビトロで生成した。修飾されていない線状ＲＮＡを、転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに加えて、上に列挙した全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、製造業者の説明書に従ってＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨで処理したＲＮＡを、１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し（図１７）、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させ、ＲＮアーゼを含まない水に再懸濁した。

【0712】

図１７に示すように、ｍｉＲＮＡ結合部位を有する環状ＲＮＡが生成された。

【0713】

実施例２７：局所送達用のＲＮＡの製剤化
この実施例は、局所送達用のＲＮＡの製剤化を示す。

【0714】

ＲＮＡの局所効果を決定するため、ＲＮＡを上皮組織への送達用に製剤化した。

【0715】

本明細書に記載されるとおり、ＲＮＡは、以下に従い細胞透過剤と共に製剤化した：
１０ｎｇ ＲＮＡ、線状又は環状、ＥＧＦ ＯＲＦを含む
５μＬ ８０％エタノール
３５μＬ ＰＢＳ＋グルコース（４．５ｇ／Ｌ）

【0716】

実施例２８：環状ＲＮＡの局所送達
この実施例は、ＲＮＡの局所送達を示す。

【0717】

局所送達効果を決定するため、ＲＮＡを製剤化し、上皮組織に送達した。本明細書に記載されるとおり、ＲＮＡは細胞透過剤と共に製剤化し、耳組織へと局所送達した。

【0718】

環状ＲＮＡの試料を実施例２７にあるとおり製剤化し（５０μＬ）、マウスの両耳に適用した。試料を耳に適用する前に、耳をイソプロピルアルコールワイプで拭き取った。無菌フード内で耳にヒートランプ及びファンを短時間当てることにより、耳上で試料を乾燥させた。マウスをケージに戻して通常の条件下に置いた。

【0719】

選択の時点で（適用後６時間、１日、３日又は１２日）、各ＲＮＡ試料について耳組織（単一の耳パンチによる）を採取した。

【0720】

実施例２９：局所送達後のＲＮＡの持続性
この実施例は、局所送達後のＲＮＡの存在を示す。

【0721】

ＲＮＡの持続性を決定するため、送達されたＲＮＡに関して組織試料を分析した。本明細書に記載されるとおり、ＲＮＡの局所送達後の様々な時点における持続性に関して耳パンチを分析した。

【0722】

実施例２８からの耳パンチ試料及び未処置の耳パンチ試料をＲＮＡ安定化試薬中に採取し、標準的なＲＮＡ組織抽出キット（Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｓｉｍｐｌｙ ＲＮＡ）を使用してＲＮＡを抽出した。

【0723】

各試料に２００μｌの容積の１－チオグリセロール／ホモジナイゼーション溶液を加えた。１ミリリットルのホモジナイゼーション溶液当たり２０μｌの１－チオグリセロールを加えることにより、ワーキング溶液を調製した。或いは、ホモジナイゼーション溶液の３０ｍｌボトルに６００μｌの１－チオグリセロールを加えた。使用前、１－チオグリセロール／ホモジナイゼーション溶液は氷上又は２～１０℃で冷却した。

【0724】

２００μｌの冷１－チオグリセロール／ホモジナイゼーション溶液中において組織試料を、残留する組織断片が見えなくなるまで携帯型ホモジナイザー及び滅菌乳棒でホモジナイズした。完全にホモジナイズするため、各試料につきさらに１５～３０秒ホモジナイズした。

【0725】

異なる時点でＲＮＡの存在を確かめるため、ＲＮＡに関してｑ－ＰＣＲで試料を確かめた。ｑＰＣＲを用いて耳パンチにおける線状及び環状の両方のＲＮＡの存在を測定した。線状及び環状ＲＮＡを検出するため、Ｎｌｕｃ ＯＲＦを増幅するプライマーを使用した。環状ＲＮＡのみの検出には、５’－３’接合部を増幅するプライマーにより、線状でなく、環状のＲＮＡ構築物の検出を可能とした。

【0726】

局所送達の６時間、２４時間、及び７２時間後に線状及び環状ＲＮＡが検出された。注射３日後のマウスの耳において、線状ＲＮＡと比較して高いレベルの環状ＲＮＡが検出された（図１８）。

【0727】

この例に示されるとおり、局所的に投与した線状及び環状ＲＮＡは、インビボで検出可能であった。

【0728】

実施例３０：局所送達後のｍＲＮＡのタンパク質発現
この実施例は、局所送達後のタンパク質の存在について記載する。

【0729】

局所送達されたＲＮＡが翻訳され得るかどうかを決定するため、種々の時点におけるタンパク質又は免疫原発現に関して組織試料をウエスタンブロットにより分析する。ＲＮＡの局所送達後のタンパク質発現に関して耳パンチを分析する。

【0730】

手短に言えば、耳パンチを採取し、ＲＮＡ安定化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に保存する。組織をマイクロチューブホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてＲＩＰＡ緩衝液でホモジナイズし、タンパク質を抽出する。各試料を１４ｋ×ｇで１５分間遠心する。

【0731】

上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳ試料緩衝液（０．１２５Ｍトリス－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、３０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。

【0732】

市販の標準物質（ＢｉｏＲａｄ）をサイズマーカーとして使用する。半乾式法を用いたポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）への電気泳動転写後、化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を使用してブロットを可視化する。

【0733】

耳パンチ試料のＧＦＰタンパク質が可視化され、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡに検出されることが予想される。

【0734】

実施例３１：ＲＮＡ溶液にエタノールが含まれるとき、ＲＮＡの局所投与によって組織へのＲＮＡ送達が起こる
この実施例は、ＲＮＡ溶液にエタノールが含まれるときのインビボでの局所投与による細胞及び組織へのＲＮＡの送達を示す。

【0735】

この例では、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含む環状ＲＮＡを設計した。

【0736】

環状ＲＮＡをインビトロで作成した。ＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。次に環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁した。この例では、環状ＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製もした。

【0737】

この例では、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含む線状ｍＲＮＡを設計した。この例では、修飾した線状ｍＲＮＡをインハウスでインビトロ転写により作成した。この例では、線状ＲＮＡはプソイドウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換し、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャッピングし、５’及び３’ヒトα－グロビンＵＴＲを含めたとともに、ポリアデニル化する。

【0738】

次に、各試料の総試料容積が５０μＬとなり、及び各試料の全ＲＮＡが３．５ｐｍｏｌとなるように、ＲＮＡをＰＢＳ／グルコース（４．５ｇ／Ｌ）及びエタノール（１０％ｖ／ｖ）に希釈した。試薬は全て、混合前に室温に至らせ、混合物は使用直前に調製する。

【0739】

時点＝０で、５０μＬ用量の各試料をＢＡＬＢ／ｃマウスの耳にピペット先端を使用して滴下することにより局所的に適用した。陰性対照として、未処置のマウスを使用した。無菌フード内で耳にヒートランプ及びファンを短時間当てることにより試料を乾燥させた。マウスをケージに戻して通常の条件下に置いた。

【0740】

組織中でのＲＮＡの持続性を決定するため、送達後の様々な時点におけるＲＮＡに関して組織試料をＲＴ－ｑＰＣＲを用いて分析した。投与から６時間、１、３、及び１２日後、各動物から２ｍｍ耳パンチを採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０２０）に保存した。耳パンチからトリゾール抽出を用いて全ＲＮＡを単離した。製造者の指示に従い水相をイソプロパノールで沈殿させて、ペレットを７０％ＥＴＯＨで洗浄した。全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＮＬｕｃ ＯＲＦに特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型にＲＴ－ＰＣＲを実施した。試料は全て、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラーにてトリプリケートでアッセイした。次にＲＮＡレベルをアクチンに対して、及び未処置陰性対照相に対して相対化した。

【0741】

局所投与から６時間及び１、３及び１２日後に組織試料中に環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡが検出され、これは、ビヒクルのみの対照よりも高いシグナルを示した（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。

【0742】

この実施例は、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡが、エタノールと共に送達したとき、局所投与による組織への送達に成功し、長期間にわたって組織中で持続することを示す。

【0743】

実施例３２：環状ＲＮＡの局所投与によって組織へのＲＮＡ送達が起こる
この実施例は、インビボでの局所投与による細胞及び組織への環状ＲＮＡの送達を示す。

【0744】

この例では、タンパク質又は免疫原をコードするＯＲＦを含む環状ＲＮＡを設計した。この場合、環状ＲＮＡは、エリスロポエチンタンパク質（ＥＰＯ）をコードした。

【0745】

環状ＲＮＡをインビトロで作成した。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、線状ＲＮＡをインビトロ転写した。この例では、Ｃｙ５－ＵＴＰを使用してＣｙ５標識ＲＮＡを作成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチドのスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁した。

【0746】

各試料の総試料容積が２５μＬとなり、及び各試料の全ＲＮＡが１２ピコモルとなるように、５％エタノールを含有するＰＢＳ／グルコース（４．５ｇ／Ｌ）に環状ＲＮＡを希釈した。試薬は全て、混合前に室温に至らせ、混合物は使用直前に調製した。

【0747】

時点＝０で、マウスの耳をイソプロピルアルコールワイプで拭き取り、乾燥させて、２５μＬ用量の各試料をＢＡＬＢ／ｃマウスの耳にピペット先端を使用して滴下することにより局所的に適用した。無菌フード内で耳にヒートランプ及びファンを短時間当てることにより試料を乾燥させた。マウスをケージに戻して通常の条件下に置いた。

【0748】

組織への環状ＲＮＡ送達を決定するため、投与後の様々な時点において組織試料を蛍光顕微鏡法により分析した。投与後６時間、１日、及び３日の時点で、各動物から２ｍｍ耳パンチを採取し、氷冷ＰＢＳに保存した。次にＥＶＯＳ ＩＩ蛍光顕微鏡下で組織試料を観察した。次にＩｍａｇｅＪを使用して画像の蛍光を定量化した。

【0749】

局所投与から６時間、１及び３日後に組織試料にＣｙ５シグナルが検出され、何ら蛍光を示さなかった陰性対照よりも高いシグナルを示した（図２０及び図２１）。これは、環状ＲＮＡが組織への送達に成功することを示している。

【0750】

この実施例は、環状ＲＮＡが、皮膚のとき局所投与による送達が成功し、組織に長期間にわたって持続することを示す。

【0751】

実施例３３：非修飾ＲＮＡの鼻粘膜上皮への局所投与によって組織中にＲＮＡが持続するようになる
この実施例は、局所投与による鼻粘膜上皮への非修飾ＲＮＡの送達、並びに局所投与による線状及び環状ＲＮＡの取込みの実現を記載する。

【0752】

この実施例では、ＲＮＡにＩＲＥＳ、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含める。

【0753】

環状ＲＮＡをインビトロで作成する。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロ転写する。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製する。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化する。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮａＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁する。線状ＲＮＡ対応物を作成し、上記に記載される同じＮＬｕｃ ＯＲＦ及びコード成分を含める。

【0754】

ＲＮＡを１ｐｍｏｌ／μＬの濃度に希釈する。クエン酸塩緩衝液中５ｐｍｏｌのＲＮＡを滅菌ＰＢＳと合わせる。１回の適用当たりに使用する総試料容積は、２０μＬである。ビヒクルのみの対照試料を同じように、ただしＲＮＡなしで調製する。試薬は全て、混合前に室温に至らせ、混合物は使用直前に調製する。

【0755】

無菌フード内で、マウスをその両耳で吊り下げた体勢にする。時点＝０で、マイクロピペットを使用して２０μＬ用量の各試料をＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻孔内に徐々に放出する（各鼻孔に１０μＬ）。適用中、口及び逆側の鼻孔を閉じて確実に摂取させる。マウスは、呼吸数が正常に戻るまで、吊り下げた体勢のままにしておく。マウスをケージに戻して通常の条件下に置く。

【0756】

投与後６、２４及び４８時間の時点で、マウスを犠牲にし、マウスから鼻組織を採取する。各組織試料（約２ｍｇ）を２００μＬの冷１－チオグリセロール／ホモジナイゼーション溶液に入れ、残留する組織断片が見えなくなるまで携帯型ホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）及び滅菌乳棒を使用してホモジナイズする。完全にホモジナイズするため、各試料につきさらに１５～３０秒ホモジナイズする。

【0757】

組織中でのＲＮＡの持続性を決定するため、送達後の様々な時点におけるＲＮＡに関して組織試料をｑＰＣＲを用いて分析する。ｑＰＣＲを用いて、抽出した組織中の線状及び環状の両方のＲＮＡを測定する。ＮＬｕｃ ＯＲＦを増幅するプライマーを使用する。環状ＲＮＡのみの検出には、５’－３’接合部を増幅するプライマーにより、線状でなく、環状ＲＮＡ構築物の検出を可能とする。

【0758】

実施例３４：適用前に組織をエタノールワイプで拭き取ったとき、環状ＲＮＡの局所投与によって組織へのＲＮＡ送達が起こる
この実施例は、インビボでの局所投与による細胞及び組織への非修飾環状ＲＮＡの送達を示す。

【0759】

この例では、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含む環状ＲＮＡを設計した。

【0760】

環状ＲＮＡをインビトロで作成した。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁した。

【0761】

次に、各試料の総試料容積が３５μＬとなり、及び各試料の全ＲＮＡが２０ｐｍｏｌとなるように、ＲＮＡをＰＢＳのみ、又は１０％（ｖ／ｖ）エタノール含有ＰＢＳのいずれかに希釈した。陰性対照として、上記に記載したとおり、ただしＲＮＡなしで、ビヒクルのみの対照を調製した。試薬は全て、混合前に室温に至らせ、混合物は使用直前に調製する。

【0762】

時点＝０で、マウスの耳をエタノールワイプで拭き取り、乾燥させて、３５μＬ用量の各試料をＢＡＬＢ／ｃマウスの耳にピペット先端を使用して滴下することにより局所的に適用した。無菌フード内で耳にヒートランプ及びファンを短時間当てることにより試料を乾燥させた。マウスをケージに戻して通常の条件下に置いた。

【0763】

組織中でのＲＮＡの持続性を決定するため、送達後の様々な時点におけるＲＮＡに関して組織試料をＲＴ－ｑＰＣＲを用いて分析した。投与後１及び４日の時点で、各動物から２ｍｍ耳パンチを採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０２０）に保存した。組織を液体窒素中に急速冷却し、ガラス乳鉢及び乳棒でホモジナイズした後、続いてトリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号１５５９６０２６）することにより、耳パンチから全ＲＮＡを単離した。製造者の指示に従い水相をイソプロパノールで沈殿させて、ペレットを７０％ＥＴＯＨで洗浄した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１７６６５００）を使用して全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦに特異的なプライマーを使用して、ｃＤＮＡ鋳型にＲＴ－ＰＣＲを実施した。試料は全て、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラーにてトリプリケートでアッセイした。次にＲＮＡレベルをハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化した。

【0764】

皮膚をエタノールワイプで拭き取った後の局所投与後、ＰＢＳのみの環状ＲＮＡについては１及び４日の時点で、及びＰＢＳ＋１０％ＥｔＯＨ中の環状ＲＮＡについては１日の時点で、組織試料中に環状ＲＮＡが検出され、相対的なビヒクルのみの対照と比べて高いシグナルを示した（図２２）。

【0765】

この実施例は、投与前に皮膚をエタノールワイプで拭き取ったとき、環状ＲＮＡが局所投与による送達に成功し、組織中に長期間にわたって持続することを示す。

【0766】

実施例３５：適用前に組織をイソプロピルアルコールワイプで拭き取ったとき、環状ＲＮＡの局所投与によって組織へのＲＮＡ送達が起こる
この実施例は、インビボでの局所投与による細胞及び組織への非修飾環状ＲＮＡの送達を示す。

【0767】

この例では、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含む環状ＲＮＡを設計した。

【0768】

環状ＲＮＡをインビトロで作成した。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁した。

【0769】

次に、各試料の総試料容積が３５μＬとなり、及び各試料の全ＲＮＡが２０ｐｍｏｌとなるように、ＲＮＡをＰＢＳのみに希釈した。陰性対照として、上記に記載したとおり、ただしＲＮＡなしで、ビヒクルのみの対照を調製した。試薬は全て、混合前に室温に至らせ、混合物は使用直前に調製する。

【0770】

時点＝０で、マウスの耳をイソプロピルアルコールワイプ（ＣＶＳ、２９７５８４）で拭き取り、乾燥させて、３５μＬ用量の各試料をＢＡＬＢ／ｃマウスの耳にピペット先端を使用して滴下することにより局所的に適用した。陰性対照として、イソプロピルアルコールワイプ単独を使用した。無菌フード内で耳にヒートランプ及びファンを短時間当てることにより試料を乾燥させた。マウスをケージに戻して通常の条件下に置いた。

【0771】

組織中でのＲＮＡの持続性を決定するため、送達後の様々な時点におけるＲＮＡに関して組織試料をＲＴ－ｑＰＣＲを用いて分析した。投与後１日及び４日の時点で、各動物から２ｍｍ耳パンチを採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０２０）に保存した。組織を液体窒素中に急速冷却し、ガラス乳鉢及び乳棒でホモジナイズした後、続いてトリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号１５５９６０２６）することにより、耳パンチから全ＲＮＡを単離した。製造者の指示に従い水相をイソプロパノールで沈殿させて、ペレットを７０％ＥＴＯＨで洗浄した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１７６６５００）を使用して全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦに特異的なプライマーを使用して、ｃＤＮＡ鋳型にＲＴ－ＰＣＲを実施した。試料は全て、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラーにてトリプリケートでアッセイした。次にＲＮＡレベルをハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化した。

【0772】

局所投与から１日後及び４日後に組織試料中に環状ＲＮＡが検出され、ビヒクルのみの対照よりも高いシグナルを示した（図２３）。

【0773】

この実施例は、皮膚をイソプロピルアルコールワイプで拭き取った後、末端なしＲＮＡが局所投与による組織への送達に成功し、組織中に長期間にわたって持続することを示す。

【0774】

実施例３６：環状ＲＮＡの局所投与によって組織中のタンパク質発現が起こる
この実施例は、インビボでの局所投与による細胞及び組織への非修飾環状ＲＮＡの送達並びに続くタンパク質発現の実現を示す。

【0775】

この例では、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含む環状ＲＮＡを設計した。

【0776】

環状ＲＮＡをインビトロで作成した。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁した。

【0777】

次に、各試料の総試料容積が３５μＬとなり、及び各試料の全ＲＮＡが２０ｐｍｏｌとなるように、ＲＮＡを１０％（ｖ／ｖ）エタノール含有ＰＢＳに希釈した。陰性対照として、上記に記載したとおり、ただしＲＮＡなしで、ビヒクルのみの対照を調製した。試薬は全て、混合前に室温に至らせ、混合物は使用直前に調製した。

【0778】

時点＝０で、３５μＬ用量の各試料をＢＡＬＢ／ｃマウスの耳にピペット先端を使用して滴下することにより局所的に適用した。無菌フード内で耳にヒートランプ及びファンを短時間当てることにより試料を乾燥させた。マウスをケージに戻して通常の条件下に置いた。

【0779】

組織中のＲＮＡ発現を決定するため、局所送達後の様々な時点でＮＬｕｃ活性に関して組織試料を分析した。送達の４日後にマウスから耳パンチを採取した。各組織試料を断片状に破砕し、１×プロテアーゼ阻害薬カクテルを含有する５０μＬの氷冷ＮＬｕｃ溶解アッセイ緩衝液に入れ、氷上に置いた。次に試料をオービタルシェーカー上７００ｒｐｍで５分間インキュベートし、次に室温で遠心して組織残屑を除去した。次に組織ペレットを乱さないようにしながら５０μＬ上清を新鮮なチューブに移し替えた。５０μＬの各試料を９６ウェルプレートに移し替え、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｎ１１１０）アッセイを製造者の指示に従い実施した。端的には、各ウェルに１μＬのフリマジン基質及び４９μＬのＰＢＳを加え、混合した。基質を加えて混合した後、プレートを１０分間インキュベートし、次にルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）で読み取った。

【0780】

１０％エタノール（ｖ／ｖ）含有ＰＢＳ中の環状ＲＮＡについて局所投与４日後に組織試料中にナノルシフェラーゼ活性が検出され、これは関連性のあるビヒクルのみの対照よりも高いことが観察された（図２４）。

【0781】

この実施例は、環状ＲＮＡが局所投与による送達に成功して機能タンパク質を発現することができ、組織中に長期間にわたって検出可能であったことを実証した。

【0782】

実施例３７：適用前に組織をポビドンヨードで拭き取ったとき、環状ＲＮＡの局所投与によって組織へのＲＮＡ送達が起こる
この実施例は、インビボでの局所投与による細胞及び組織への非修飾環状ＲＮＡの送達を記載する。

【0783】

この例では、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含む環状ＲＮＡを設計する。

【0784】

環状ＲＮＡをインビトロで作成する。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロ転写する。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製する。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡを１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化する。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁する。

【0785】

次に、各試料の総試料容積が３５μＬとなり、及び各試料の全ＲＮＡが２０ｐｍｏｌとなるように、ＲＮＡをＰＢＳのみに希釈する。陰性対照として、上記に記載したとおり、ただしＲＮＡなしで、ビヒクルのみの対照を調製する。試薬は全て、混合前に室温に至らせ、混合物は使用直前に調製する。

【0786】

時点＝０で、滅菌剤である市販のポビドンヨード（１０％）でマウスの耳を拭き取る。過剰なポビドンヨードを滅菌綿スワブで除去し、３５μＬ用量の各試料をＢＡＬＢ／ｃマウスの耳にピペット先端を使用して滴下することにより局所的に適用する。無菌フード内で耳にヒートランプ及びファンを短時間当てることにより、試料を乾燥させる。マウスをケージに戻して通常の条件下に置く。

【0787】

組織中でのＲＮＡの持続性を決定するため、送達後様々な時点でＲＮＡに関して組織試料をＲＴ－ｑＰＣＲを用いて分析する。投与後１日及び４日の時点で、各動物から２ｍｍ耳パンチを採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０２０）に保存する。組織を液体窒素中に急速冷却し、ガラス乳鉢及び乳棒でホモジナイズした後、続いてトリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号１５５９６０２６）することにより、耳パンチから全ＲＮＡを単離する。製造者の指示に従い水相をイソプロパノールで沈殿させて、ペレットを７０％ＥＴＯＨで洗浄する。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１７６６５００）を使用して、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦに特異的なプライマーを使用して、ｃＤＮＡ鋳型にＲＴ－ＰＣＲを実施する。試料は全て、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラーにおいてトリプリケートでアッセイする。次にＲＮＡレベルをハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化する。

【0788】

実施例３８：適用前に組織に過酸化水素スプレーを噴霧したとき、環状ＲＮＡの局所投与によって組織へのＲＮＡ送達が起こる
この実施例は、インビボでの局所投与による細胞及び組織への非修飾環状ＲＮＡの送達を記載する。

【0789】

この例では、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含む環状ＲＮＡを設計する。

【0790】

環状ＲＮＡをインビトロで作成する。上記に挙げたモチーフ全て、並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾線状ＲＮＡをインビトロ転写する。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製する。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡは、１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化することになる。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させて、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）に再懸濁する。

【0791】

次に、各試料の総試料容積が３５μＬとなり、及び各試料の全ＲＮＡが２０ｐｍｏｌとなるように、ＲＮＡをＰＢＳのみに希釈する。陰性対照として、上記に記載したとおり、ただしＲＮＡなしで、ビヒクルのみの対照を調製する。試薬は全て、混合前に室温に至らせ、混合物は使用直前に調製する。

【0792】

時点＝０で、マウスの耳に、滅菌剤である市販の過酸化水素（３％）を噴霧し、滅菌綿スワブで乾燥させて、３５μＬ用量の各試料をＢＡＬＢ／ｃマウスの耳にピペット先端を使用して滴下することにより局所的に適用する。無菌フード内で耳にヒートランプ及びファンを短時間当てることにより、試料を乾燥させる。マウスをケージに戻して通常の条件下に置く。

【0793】

組織中でのＲＮＡの持続性を決定するため、送達後様々な時点でＲＮＡに関して組織試料をＲＴ－ｑＰＣＲを用いて分析する。投与後１日及び４日の時点で、各動物から２ｍｍ耳パンチを採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０２０）に保存する。組織を液体窒素中に急速冷却し、ガラス乳鉢及び乳棒でホモジナイズした後、続いてトリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号１５５９６０２６）することにより、耳パンチから全ＲＮＡを単離する。製造者の指示に従い水相をイソプロパノールで沈殿させて、ペレットを７０％ＥＴＯＨで洗浄する。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１７６６５００）を使用して、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦに特異的なプライマーを使用して、ｃＤＮＡ鋳型にＲＴ－ＰＣＲを実施する。試料は全て、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラーにおいてトリプリケートでアッセイする。次にＲＮＡレベルをハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化する。

【0794】

実施例３９：血液中の分泌された免疫原の検出
血液サンプル（約２５μＬ）を、顎下腺抽出によって分析のために各マウスから採取した。血液が、環状ＲＮＡの投与の０、６時間、２４、４８時間及び７日後の時点で、ＥＤＴＡチューブに採取される。血漿が、４℃で、１３００ｇで３０分間にわたって遠心分離によって単離される。分泌された免疫原の発現が、実施例１４に記載されるような方法を用いて、例えばＲＢＤ免疫原について、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットを用いて評価される。

【0795】

実施例４０：免疫原に対する抗体の検出
この実施例は、免疫原に対する抗体の存在を決定する方法を記載する。

【0796】

ＥＬＩＳＡが、Ｃｈｅｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．（ｍｅｄＲｘｉｖ、ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０４．０６．２００５５４７５（２０２０））によって記載されるように使用される。簡潔に述べると、ウェル当たり１００μＬのＰＢＳ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質が、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレート上に被覆される。次に、ＥＬＩＳＡプレートが、ブロッキングバッファ（５％のＦＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）で１時間にわたってブロックされる。次に、１０倍希釈された血漿が、１時間にわたって１００μＬのブロッキングバッファ中で各ウェルに加えられる。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）洗浄剤（ＰＢＳＴ）を含む１倍リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、結合抗体が、３０分間にわたって抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートされた後、ＰＢＳＴ、次にＰＢＳで洗浄され、テトラメチルベンゼンが加えられる。ＥＬＩＳＡプレートが、５分間にわたって反応させられ、次に、１ＭのＨＣｌ停止緩衝液を用いてクエンチされる。光学密度（ＯＤ）値が、４５０ｎｍで決定される。

【0797】

Ａ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原に対する抗体の場合、使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２－Ｖ０８Ｂ）である。

【0798】

Ｂ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原に対する抗体の場合、使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９１－Ｖ０８Ｈ）である。

【0799】

実施例４１：環状ＲＮＡから発現されるタンパク質の増加
この実施例は、細胞における合成環状ＲＮＡ翻訳を示す。さらに、この実施例は、環状ＲＮＡがその線状対応物よりも正確な分子量の発現産物をより多く産生したことを示す。

【0800】

線状及び環状ＲＮＡは、終止エレメント（終止コドン）を有するナノルシフェラーゼ遺伝子（ｎＬＵＣ）を含むように設計した。細胞を、ビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎＬＵＣ：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガーエレメント（２Ａ配列）、３×ＦＬＡＧタグ付きｎＬｕｃ配列、スタガーエレメント（２Ａ配列）、及び終止エレメント（終止コドン）；又は環状ｎＬＵＣ：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガーエレメント（２Ａ配列）、３×ＦＬＡＧタグ付きｎＬｕｃ配列、スタガーエレメント（２Ａ配列）、及び終止エレメント（終止コドン）でトランスフェクトした。図２５に示すように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、正確な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を産生した。

【0801】

２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡバッファを添加することによって細胞を回収した。１４００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を１０～２０％勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルで分析した。

【0802】

ドライトランスファー法を用いてニトロセルロース膜に電気転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットをＥＣＬキットで可視化し、ウェスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪで測定した。

【0803】

図２５に示すように、環状ＲＮＡは細胞内でタンパク質に翻訳された。特に、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ対応物と比較して、正確な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を産生した。

【0804】

実施例４２：環状ＲＮＡのインビボ再投与
この実施例は、２用量の環状ＲＮＡを使用して、インビボにおける環状ＲＮＡからの発現を駆動する能力を示す。

【0805】

この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサーエレメントを含んだ。

【0806】

環状ＲＮＡを、インビトロで生成した。修飾されていない線状ＲＮＡを、上に列挙した全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、製造業者の説明書に従ってＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＭｏｎａｒｃｈＲＮＡクリーンアップシステムで再び精製した。ＲｐｐＨで処理したＲＮＡを、１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶出し、エタノール沈殿させ、ＲＮＡ保存溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７０００）中に再懸濁した。

【0807】

マウスに、両方とも担体としての脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中に調合した、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦを有する環状ＲＮＡ、又は対照としての線状ＲＮＡ ０．２５μｇの単一尾静脈注射用量を０日目に投与し、２回目の用量を５６日目に投与した。

【0808】

投与後、１、２、７、１１、１６、及び２３日目に、各マウスの尾静脈から血液サンプル（５０μｌ）をＥＤＴＡチューブに採取した。４℃、１３００ｇで２５分間遠心分離することによって血漿を単離し、分泌酵素であるガウシアルシフェラーゼの活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１×ＧＬｕｃ基質を５μＬの血漿に加えて、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。ルミノメーター装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で混合直後に、プレートを読み取った。

【0809】

ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの最初の用量を投与した１、２、７、１１、１６、及び２３日後の血漿中で検出された（図２６）。

【0810】

対照的に、修飾線状ＲＮＡの投与後は、１及び２日目の血漿中でのみ、ガウシアルシフェラーゼ活性が検出された（図２６）。

【0811】

ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの２回目の用量の投与後、２、３、８、及び１５日目の血漿中で再び検出された（図２６）。

【0812】

対照的に、修飾線状ＲＮＡの投与後は、１、２及び３日目の血漿中でのみ、ガウシアルシフェラーゼ活性が検出された。

【0813】

この実施例は、環状ＲＮＡがインビボで長期間タンパク質を発現し、注射後数日、血漿中にタンパク質活性レベルを有することを示した。さらに、実施例は、環状ＲＮＡの再投与が同様の発現プロファイルをもたらすことを示している。

【0814】

実施例４３：環状ＲＮＡのインビボスタガード投与
この実施例は、環状ＲＮＡの連続的なスタガード用量を使用して、インビボにおける環状ＲＮＡからのタンパク質又は免疫原のより高い発現を駆動する能力を示す。

【0815】

この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサーエレメントを含んだ。

【0816】

環状ＲＮＡを、インビトロで生成した。修飾されていない線状ＲＮＡを、上に列挙した全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製し、製造業者の説明書に従ってＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製した。ＲｐｐＨで処理したＲＮＡを、１０～４０ヌクレオチド長のスプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に溶出し、エタノール沈殿させ、ＲＮアーゼを含まない水に再懸濁した。

【0817】

マウスに、両方とも担体としての脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中に調合した、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦを有する環状ＲＮＡ、又は対照としての線状ＲＮＡ ０．２５ｐｍｏｌの尾静脈注射用量を０日目、２日目及び５日目に投与した。

【0818】

投与の６時間後、１、２、３、５、７、１４、２１、２８、３５、４２日後に、各マウスの尾静脈から血液サンプル（５０μｌ）をＥＤＴＡチューブに採取した。４℃、１３００ｇで２５分間遠心分離することによって血漿を単離し、分泌酵素であるガウシアルシフェラーゼの活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１×ＧＬｕｃ基質を５μＬの血漿に加えて、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。ルミノメーター装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で混合した直後に、プレートを読み取った。

【0819】

ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの単回用量を投与した６時間後、１、２、３、５、７、１４、２１、２８日後の血漿中で検出された（図２７及び図２８）。ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡを３用量、投与した場合、その最初の用量を投与した６時間後、１、２、３、５、７、１４、２１、２８、３５日後の血漿中で検出された（図２７及び図２８）。

【0820】

対照的に、修飾線状ＲＮＡの投与後は、６時間後、１、２、３日後の血漿中でのみ、ガウシアルシフェラーゼ活性が検出され、発現レベルはその初回用量を超えて増加することはなかった。線状ＲＮＡ由来タンパク質からの酵素活性は、追加の線状ＲＮＡが投与されたにもかかわらず、ｘ日目以降、バックグラウンドレベルを超えて検出されることはなかった（図２７及び図２８）。

【0821】

この実施例は、環状ＲＮＡがインビボで長期間タンパク質を発現し、複数回の注射後の血漿中のタンパク質活性レベルが上昇することを示した。さらに、実施例は、環状ＲＮＡの反復投与は発現をもたらすが、線状ＲＮＡの反復投与は発現をもたらさないことを示している。

【0822】

実施例４４：筋肉内注射による環状ＲＮＡのネイキッド投与（ｎａｋｅｄ ｄｏｓｅ）及び再投与
この実施例は、筋肉内に投与される２つの用量の環状ＲＮＡを使用して、インビボにおける環状ＲＮＡからのタンパク質又は免疫原のより高い発現を駆動する能力を示す。

【0823】

この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサーエレメントを含んだ。

【0824】

環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、本明細書に記載の方法に従って生成した。

【0825】

次いで、製剤化されていないＲＮＡを生成するために、環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、１００μＬのＰＢＳ中に最終濃度が２．５ピコモルになるように希釈した。

【0826】

２．５ピコモルの用量の、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦを有する環状ＲＮＡを、マウスの後肢に単回筋肉内注射した。注射は０日目に実施し、２回目の用量を４９日目に投与した。ビヒクルのみを対照として使用した。

【0827】

血液サンプル（５０μＬ）を、投与後１、２、７、１１、１６、及び２３日目に、顎下穿刺により、ＥＤＴＡチューブに採取した。４℃、１３００ｇで２５分間遠心分離することによって血漿を単離し、分泌酵素であるガウシアルシフェラーゼの活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μＬの１×ＧＬｕｃ基質を５μＬの血漿に加えて、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。ルミノメーター装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で混合直後に、プレートを読み取った。

【0828】

ガウシアルシフェラーゼ活性は、製剤化されていない環状ＲＮＡの最初の用量を投与した１、２、７、１１、１６、及び２３日後の血漿中で検出された。（図２９）。

【0829】

対照的に、製剤化されていないｍＲＮＡの投与後は、１及び２日後の血漿中でのみ、ガウシアルシフェラーゼ活性が検出された。（図２９）。

【0830】

ガウシアルシフェラーゼ活性は、製剤化されていない環状ＲＮＡの２回目の用量の投与後、２、３、８、及び１５日目の血漿中で再び検出された。（図２９）。

【0831】

対照的に、製剤化されていない修飾ｍＲＮＡの投与後は、１、２、３日後の血漿中でのみ、ガウシアルシフェラーゼ活性が検出された。（図２９）。

【0832】

いずれの場合も、ガウシアルシフェラーゼ活性は溶媒のみの対照よりも大きかった。

【0833】

この実施例は、担体なしで筋肉内に投与された環状ＲＮＡはインビボで長期間タンパク質を発現し、注射後数日、血漿中にタンパク質活性レベルを有することを示した。さらに、実施例は、環状ＲＮＡの再投与が同様の発現プロファイルをもたらすことを示している。

【0834】

実施例４５：５回繰り返される静脈内注射による環状ＲＮＡの担体再投与は、機能性タンパク質の発現をもたらす
この実施例は、筋肉内に投与される５用量の環状ＲＮＡを使用して、インビボにおける環状ＲＮＡからの発現をインビボで駆動する能力を示す。

【0835】

この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサーエレメントを含んだ。

【0836】

環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、本明細書に記載の方法に従って生成した。

【0837】

環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、カチオン性脂質担体を用いて製剤化した。この実施例では、１０％ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）及び５％Ｂｏｏｓｔを、製造業者の説明書に従ってＲＮＡと複合体化した。

【0838】

マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦを含む環状ＲＮＡ ０．２５ピコモルの単一尾静脈注射用量を投与した。注射は、０日目、７１日目、１２０日目、１９６日目、及び３５９日目に行った。ビヒクルのみを対照として使用した。

【0839】

血液サンプル（５０μＬ）を、投与後０．２５、１、２、３、７、１４、２１、２８、及び３５日目に、顎下穿刺により、ＥＤＴＡチューブに採取した。４℃、１３００ｇで２５分間遠心分離することによって血漿を単離し、分泌酵素であるガウシアルシフェラーゼの活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μＬの１×ＧＬｕｃ基質を５μＬの血漿に加えて、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。ルミノメーター装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で混合直後に、プレートを読み取った。

【0840】

Ｔｒａｎｓ－ＩＴ製剤化環状ＲＮＡを投与した場合、ガウシアルシフェラーゼ活性は、初回用量の投与後１、２、３、７、１４、２１及び２８日目；２回目用量の投与後１、２、３、７、１４及び２１日目；３回目用量の投与後１、２、３、７、１４及び２１日目；４回目用量の投与後１、２、３、７、１４、２１及び２８日目；並びに５回目用量の投与後１、２、３、７、１４及び２１日目の血漿中で検出された。（図３０）。

【0841】

対照的に、Ｔｒａｎｓ－ＩＴ製剤化修飾ｍＲＮＡを投与した場合、ガウシアルシフェラーゼ活性は、初回用量の投与後０．２５、１及び２日目；２回目用量の投与後０．２５、１及び２日目；３回目用量の投与後０．２５、１及び２日目；４回目用量の投与後０．２５、１及び２日目；並びに５回目用量の投与後０．２５、１及び２日目の血漿中で検出された。（図３０）。

【0842】

それぞれの場合において、ガウシアルシフェラーゼ活性、したがって発現は、ｍＲＮＡよりも環状ＲＮＡの場合の方が大きかった。

【0843】

この実施例は、静脈内投与された環状ＲＮＡは、インビボで長期間タンパク質を発現し、注射後数日、血漿中にタンパク質活性レベルを有し、少なくとも５回再投与することができることを示した。さらに、実施例は、環状ＲＮＡの再投与が同様の発現プロファイルをもたらすことを示している。

【0844】

実施例４６：哺乳動物細胞における環状ＲＮＡからの複数の免疫原の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における環状ＲＮＡからの複数の免疫原の発現を実証する。

【0845】

実験１
Ｎ末端Ｇｌｕｃ信号配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号３３；アミノ酸配列番号３２）をコードする第１の環状ＲＮＡ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原（核酸配列番号３１；アミノ酸配列番号３０）をコードする第２の環状ＲＮＡを、本明細書に記載される方法によって、設計し、精製した。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、一緒に混合して、混合物を得た。混合物（環状ＲＮＡのそれぞれを１ピコモル）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＬＭＲＮＡ０１５）を用いてＨｅＬａ細胞（２４ウェルプレート中でウェル当たり１００，０００個の細胞）中にトランスフェクトした。対照として、第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡも、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを用いてＨｅＬａ細胞中に別々にトランスフェクトした。

【0846】

ＲＢＤ免疫原発現を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原特異的ＥＬＩＳＡを用いて２４時間の時点で測定した。スパイク免疫原発現を、フローサイトメトリーによって２４時間の時点で測定した。

【0847】

混合物によるトランスフェクションから、ＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ－２ ＲＢＤ免疫原が、ＨｅＬａ細胞上清において検出され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原が、ＨｅＬａ細胞の細胞表面において検出された。第１の環状ＲＮＡによるトランスフェクションから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原が検出されたが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原は検出されなかった。第２の環状ＲＮＡによるトランスフェクションから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原が検出されたが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原は検出されなかった。これは、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原の両方が、環状ＲＮＡの組合せ混合物からの哺乳動物細胞において発現されたことを実証する。

【0848】

実験２
Ｎ末端ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）信号配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号３３；アミノ酸配列番号３２）をコードする第１の環状ＲＮＡ、及びＧＬｕｃポリペプチド（核酸配列番号３７；アミノ酸配列番号３６）をコードする第２の環状ＲＮＡを設計し、本明細書に従った方法により生成した。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＬＭＲＮＡ０１５）と共に別々に複合体形成し、次に、一緒に混合して、混合物を得た。混合物（０．１ピコモルの各環状ＲＮＡ）を、ＨｅＬａ細胞（９６ウェルプレート中のウェル当たり２０，０００個の細胞）中にトランスフェクトした。対照として、第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡも、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを用いてＨｅＬａ細胞中に別々にトランスフェクトした。

【0849】

ＲＢＤ免疫原発現を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原特異的ＥＬＩＳＡを用いて２４時間の時点で測定した。ＧＬｕｃ活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて２４時間の時点で測定した。

【0850】

混合物によるトランスフェクションから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びＧＬｕｃ活性が、２４時間の時点でＨｅＬａ細胞上清において検出された。第１の環状ＲＮＡによるトランスフェクションから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原が検出されたが、ＧＬｕｃ活性は検出されなかった。第２の環状ＲＮＡによるトランスフェクションから、ＧＬｕｃ活性が検出されたが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原は検出されなかった。これは、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びＧＬｕｃ免疫原の両方が、環状ＲＮＡの組合せ混合物からの哺乳動物細胞において発現されたことを実証する。

【0851】

実験３
Ｎ末端Ｇｌｕｃ信号配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号３３；アミノ酸配列番号３２）をコードする第１の環状ＲＮＡ、及びインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からの赤血球凝集素（ＨＡ）免疫原（核酸配列番号３５；アミノ酸配列番号３４）をコードする第２の環状ＲＮＡを、本明細書に従った方法によって設計し、生成した。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、一緒に混合して、混合物を得た。混合物（１ピコモルの各環状ＲＮＡ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＬＭＲＮＡ０１５）を用いてＨｅＬａ細胞（２４ウェルプレート中でウェル当たり１００，０００個の細胞）中にトランスフェクトした。対照として、第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡも、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを用いてＨｅＬａ細胞中に別々にトランスフェクトした。

【0852】

ＲＢＤ免疫原発現を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原特異的ＥＬＩＳＡを用いて２４時間の時点で測定した。ＨＡ免疫原発現を、免疫ブロット法を用いて２４時間の時点で測定した。簡潔に述べると、免疫ブロット法では、トランスフェクションの２４時間後に、細胞を溶解させ、ウエスタンブロットを行って、一次抗体としてインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）モノクローナル抗体（ＭＡ５－２９９２０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））及び二次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ ９７０２３）としてヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）を用いて、ＨＡ免疫原を検出した。ローディングコントロールのために、αチューブリンを、一次抗体としてαチューブリン（ＤＭ１Ａ）マウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＳＴ ＃３８７３）及び二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ、ａｂ ９７０２３）と共に使用した。

【0853】

混合物によるトランスフェクションから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びインフルエンザＨＡ免疫原の両方が検出された。第１の環状ＲＮＡによるトランスフェクションから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤが検出されたが、インフルエンザＨＡ免疫原は検出されなかった。第２の環状ＲＮＡによるトランスフェクションから、インフルエンザＨＡ免疫原が検出されたが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原は検出されなかった。これは、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びインフルエンザＨＡ免疫原の両方が、環状ＲＮＡの組合せ混合物からの哺乳動物細胞において発現されたことを実証する。

【0854】

実験４
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原（核酸配列番号３１；アミノ酸配列番号３０）をコードする第１の環状ＲＮＡ、及びインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からのヘマグルチニン（ＨＡ）（核酸配列番号３５；アミノ酸配列番号３４）をコードする第２の環状ＲＮＡを、本明細書に従った方法によって設計し、生成し、精製した。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、一緒に混合して、混合物を得た。混合物（１ピコモルの各環状ＲＮＡ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＬＭＲＮＡ０１５）を用いてＨｅＬａ細胞（２４ウェルプレート中でウェル当たり１００，０００個の細胞）中にトランスフェクトした。対照として、第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡも、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを用いてＨｅＬａ細胞中に別々にトランスフェクトした。

【0855】

スパイク免疫原発現を、フローサイトメトリーによって２４時間の時点で測定した。ＨＡ免疫原発現を、実験３において上述されるように免疫ブロット法によって２４時間の時点で測定した。

【0856】

混合物によるトランスフェクションから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原及びインフルエンザＨＡ免疫原の両方が検出された。第１の環状ＲＮＡによるトランスフェクションから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原が検出されたが、インフルエンザＨＡ免疫原は検出されなかった。第２の環状ＲＮＡによるトランスフェクションから、インフルエンザＨＡ免疫原が検出されたが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原は検出されなかった。これは、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイク及びインフルエンザＨＡ免疫原の両方が、環状ＲＮＡの組合せ混合物からの哺乳動物細胞において発現されたことを実証する。

【0857】

この実施例は、複数の免疫原が、環状ＲＮＡの異なる組合せを含む環状ＲＮＡ製剤から哺乳動物細胞において発現されたことを示す。

【0858】

実施例４７：環状ＲＮＡからの複数の免疫原発現
この実施例は、哺乳動物細胞における環状ＲＮＡからの複数の免疫原の発現を実証する。

【0859】

実験１
この実施例において、環状ＲＮＡを、ＩＲＥＳ、続いてＧＬｕｃポリペプチドをコードするＯＲＦ、終止コドン、スペーサー、ＩＲＥＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦ、及び終止コドンを含むように設計した。環状ＲＮＡを、本明細書に記載される方法によって生成し、精製した。対照として、以下の環状ＲＮＡを、上述されるように生成した：（ｉ）ＩＲＥＳ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦを有する環状ＲＮＡ；（ｉｉ）ＩＲＥＳ及びＧＬｕｃポリペプチドをコードするＯＲＦを有する環状ＲＮＡ。

【0860】

環状ＲＮＡ（０．１ピコモル）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＬＭＲＮＡ０１５）を用いてＨｅＬａ細胞（９６ウェルプレート中のウェル当たり１０，０００個の細胞）中にトランスフェクトした。

【0861】

ＲＢＤ免疫原発現を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原特異的ＥＬＩＳＡを用いて２４時間の時点で測定した。ＧＬｕｃ活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて２４時間の時点で測定した。

【0862】

ＲＢＤ免疫原発現が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びＧＬｕｃポリペプチドをコードする環状ＲＮＡから検出された（図３１Ａ）。ＧＬｕｃ活性が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びＧＬｕｃをコードする環状ＲＮＡから検出された（図３１Ｂ）。これは、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びＧＬｕｃ免疫原の両方が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びＧＬｕｃ免疫原の両方をコードする環状ＲＮＡから哺乳動物細胞において発現されたことを実証する。

【0863】

実験２
この実施例において、環状ＲＮＡを、ＩＲＥＳ、続いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦ、終止コドン、スペーサー、ＩＲＥＳ、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦ、及び終止コドンを含むように設計した。環状ＲＮＡを、本明細書に記載される方法によって生成し、精製する。

【0864】

環状ＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＬＭＲＮＡ０１５）を用いてＨｅＬａ細胞（９６ウェルプレート中のウェル当たり１０，０００個の細胞）中に様々な濃度でトランスフェクトする。

【0865】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原発現が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原特異的ＥＬＩＳＡを用いて２４時間の時点で測定される。ＭＥＲＳ ＲＢＤ免疫原発現が、検出が可能なＭＥＲＳ ＲＢＤ免疫原特異的抗体を用いて２４時間の時点で測定される。

【0866】

実施例４８：マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの複数の免疫原の免疫原性
この実施例は、複数の環状ＲＮＡ分子を投与することによる、対象における複数の免疫原の発現を実証する。

【0867】

実験１
脂質ナノ粒子中で製剤化された、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ及び（ｂ）モデル免疫原としてＧＬｕｃポリペプチドをコードする環状ＲＮＡを含む環状ＲＮＡ製剤の免疫原性を、マウスモデルにおいて評価した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原に対する抗体の産生及びＧＬｕｃ活性も、マウスモデルにおいて評価した。

【0868】

Ｎ末端Ｇｌｕｃ信号配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号３３；アミノ酸配列番号３２）をコードする第１の環状ＲＮＡ、及びＧＬｕｃポリペプチド（核酸配列番号３７；アミノ酸配列番号３６）をコードする第２の環状ＲＮＡを設計し、本明細書に記載される方法によって設計し、精製した。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、一緒に混合して、混合物を得た。次に、この混合物を、実施例１６に記載されるように脂質ナノ粒子と共に配合して、第１の環状ＲＮＡ製剤を得た。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡはまた、実施例１６に記載されるように脂質ナノ粒子と共に別々に配合し、次に、一緒に混合して、第２の環状ＲＮＡ製剤を得た。

【0869】

３匹のマウスに、０日目に第１の環状ＲＮＡ製剤（１０ｕｇのＲＢＤ＋１０ｕｇのＧＬｕｃの総用量で）及び１２日目に第２の環状ＲＮＡ製剤（１０ｕｇのＲＢＤ＋１０ｕｇのＧＬｕｃの総用量で）を筋肉内に接種させた。さらなるマウス（群当たり３又は４匹）にも、０日目及び１２日目に、（ｉ）脂質ナノ粒子と共に配合された１０ｕｇの用量の第１の環状ＲＮＡ；（ｉｉ）脂質ナノ粒子と共に配合された１０ｕｇの用量の第２の環状ＲＮＡ；又は（ｉｉｉ）ＰＢＳを筋肉内に接種させた。

【0870】

各マウスからの血液採取を、顎下腺抽出によって行った。血液を、第１の環状ＲＮＡ製剤によるプライミングの２及び１７日後の時点で乾燥抗凝固剤フリーチューブ中に採取した。血清を、４℃で３０分間にわたって１２００ｇにおける遠心分離によって、全血から分離した。個々の血清サンプルを、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって、ＲＢＤ特異的ＩｇＧの存在についてアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ４４２４０４ ９６ウェル、Ｎｕｎｃ）を、１００ｕＬの１×コーティング緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２１７０１）中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２－Ｖ０８Ｂ；１００ｎｇ）で、４℃で一晩被覆した。次に、プレートを、ブロッキングバッファ（２％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）で１時間にわたってブロックした。次に、血清希釈物（１：５００、１：１５００、１：４５００、及び１：１３，５００）を、１００ｕＬのブロッキングバッファ中で各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）洗浄剤（ＴＢＳ－Ｔ）を含む１倍トリス－緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、プレートを、１時間にわたって抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７０２３）と共にインキュベートした後、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、次に、テトラメチルベンゼン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２１１０１）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートを、１０～２０分間にわたって反応させ、次に、０．２Ｎの硫酸を用いてクエンチした。光学密度（Ｏ．Ｄ．）値を、４５０ｎｍで決定した。

【0871】

各血清サンプルの光学密度を、バックグラウンド（二次抗体のみと共にインキュベートされた、ＲＢＤで被覆されたプレート）で除算した。各サンプルのバックグラウンドを超える倍数をプロットした。

【0872】

ＧＬｕｃの活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０ｕＬの１×ＧＬｕｃ基質を、１０ｕＬの血清に加えて、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。

【0873】

結果は、抗ＲＢＤ抗体が、プライムの１７日後（すなわち、第１の環状ＲＮＡ製剤の注射の１７日後）の時点で得られ（図３２Ａ）、ＧＬｕｃ活性が、プライムの２日後（すなわち、第１の環状ＲＮＡ製剤の注射の２日後）の時点で検出された（図３２Ｂ）ことを示した。

【0874】

これらの結果は、異なる免疫原をコードする２つの環状ＲＮＡを含む環状ＲＮＡ製剤が、マウスにおける免疫原特異的応答を誘導したことを示した。

【0875】

実験２
脂質ナノ粒子中で製剤化された、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ及び（ｂ）インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）免疫原をコードする環状ＲＮＡを含む環状ＲＮＡ製剤の免疫原性を、マウスモデルにおいて評価した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びインフルエンザＨＡ免疫原に対する抗体の産生も、マウスモデルにおいて評価した。

【0876】

Ｎ末端Ｇｌｕｃ信号配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号３３；アミノ酸配列番号３２）をコードする第１の環状ＲＮＡ、及びインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からの赤血球凝集素（ＨＡ）（核酸配列番号３５；アミノ酸配列番号３４）をコードする第２の環状ＲＮＡを、本明細書に記載される方法によって設計し、精製した。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、一緒に混合して、混合物を得た。次に、この混合物を、実施例１６に記載されるように脂質ナノ粒子と共に配合して、第１の環状ＲＮＡ製剤を得た。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡはまた、実施例１６に記載されるように脂質ナノ粒子と共に別々に配合し、次に、一緒に混合して、第２の環状ＲＮＡ製剤を得た。

【0877】

３匹のマウスに、０日目に第１の環状ＲＮＡ製剤（１０ｕｇのＲＢＤ＋１０ｕｇのＨＡの総用量で）及び１２日目に第２の環状ＲＮＡ製剤（１０ｕｇのＲＢＤ＋１０ｕｇのＨＡの総用量で）を筋肉内に接種させた。さらなるマウス（群当たり３又は４匹）にも、０日目及び１２日目に、（ｉ）脂質ナノ粒子と共に配合された１０ｕｇの用量の第１の環状ＲＮＡ；（ｉｉ）脂質ナノ粒子と共に配合された１０ｕｇの用量の第２の環状ＲＮＡ；又は（ｉｉｉ）ＰＢＳを筋肉内に接種させた。

【0878】

血液採取は、実験１に記載されるとおりであった。ＥＬＩＳＡによるＲＢＤ特異的ＩｇＧの存在が、実験１に記載されるように決定された。

【0879】

個々の血清サンプルを、ＥＬＩＳＡによってＨＡ特異的ＩｇＧの存在についてアッセイした。ＥＬＩＳＡプレートを、ＨＡ組み換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１０８５－Ｖ０８Ｂ；１００ｎｇ）で、４℃で一晩被覆し、プレートを、実験１に記載されるように処理した。各血清サンプルの光学密度を、バックグラウンド（二次抗体のみと共にインキュベートされた、ＨＡで被覆されたプレート）の光学密度で除算した。各サンプルのバックグラウンドを超える倍数をプロットした。

【0880】

結果は、抗ＲＢＤ及び抗ＨＡ抗体が、プライムの１７日後（すなわち、第１の環状ＲＮＡ製剤による注射の１７日後に得られたことを示した（図３３Ａ及び３３Ｂ）。

【0881】

結果はまた、異なる免疫原をコードする２つの環状ＲＮＡを含む環状ＲＮＡ調製物がインビボで発現され、免疫原特異的免疫応答を誘導することを示した。

【0882】

実験３
脂質ナノ粒子中で製剤化された、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原をコードする環状ＲＮＡ及び（ｂ）インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）免疫原をコードする環状ＲＮＡを含む環状ＲＮＡ製剤の免疫原性を、マウスモデルにおいて評価した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及びインフルエンザＨＡ免疫原に対する抗体の産生も、マウスモデルにおいて評価した。

【0883】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原（核酸配列番号３１；アミノ酸配列番号３０）をコードする第１の環状ＲＮＡ、及びインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からの赤血球凝集素（ＨＡ）（核酸配列番号３５；アミノ酸配列番号３４）をコードする第２の環状ＲＮＡを、本明細書に記載される方法によって設計し、生成した。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、一緒に混合して、混合物を得た。次に、この混合物を、実施例１６に記載されるように脂質ナノ粒子と共に配合して、第１の環状ＲＮＡ製剤を得た。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡはまた、実施例１６に記載されるように脂質ナノ粒子と共に別々に配合し、次に、一緒に混合して、第２の環状ＲＮＡ製剤を得た。

【0884】

３匹のマウスに、０日目に第１の環状ＲＮＡ製剤（１０ｕｇのスパイク＋１０ｕｇのＨＡの総用量で）及び１２日目に第２の環状ＲＮＡ製剤（１０ｕｇのスパイク＋１０ｕｇのＨＡの総用量で）を筋肉内に接種させた。さらなるマウス（群当たり３又は４匹）にも、０日目及び１２日目に、（ｉ）脂質ナノ粒子と共に配合された１０ｕｇの用量の第１の環状ＲＮＡ；（ｉｉ）脂質ナノ粒子と共に配合された１０ｕｇの用量の第２の環状ＲＮＡ；又は（ｉｉｉ）ＰＢＳを筋肉内に接種させた。

【0885】

血液採取は、実験１に記載されるとおりであった。血清を、４０Ｃで３０分間にわたって１２００ｇにおける遠心分離によって、全血から分離した。個々の血清サンプルを、実験１に記載されるようにＥＬＩＳＡによってＲＢＤ（すなわち、スパイクのＲＢＤ）特異的ＩｇＧの存在についてアッセイした。

【0886】

個々の血清サンプルを、ＥＬＩＳＡによってＨＡ特異的ＩｇＧの存在についてアッセイした。ＥＬＩＳＡプレートを、ＨＡ組み換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１０８５－Ｖ０８Ｂ；１００ｎｇ）で、４℃で一晩被覆し、プレートを、実験１に記載されるように処理した。各血清サンプルの光学密度を、バックグラウンド（二次抗体のみと共にインキュベートされた、ＨＡで被覆されたプレート）の光学密度で除算した。各サンプルのバックグラウンドを超える倍数をプロットした。

【0887】

結果は、抗ＲＢＤ抗体及び抗ＨＡ抗体が、プライムの１７日後（すなわち、第１の環状ＲＮＡ製剤の注射の１７日後に得られたことを示した（図３４Ａ及び３４Ｂ）。

【0888】

結果はまた、異なる免疫原をコードする２つの環状ＲＮＡを含む環状ＲＮＡ製剤が、マウスにおける免疫原特異的免疫応答を誘導したことを示した。

【0889】

実施例４９：マウスモデルにおける複数の免疫原を含む環状ＲＮＡの免疫原性
この実施例は、複数の免疫原を含む環状ＲＮＡの免疫原性を記載する。この実施例はまた、単一の環状ＲＮＡによってコードされる複数の免疫原に対する、マウスモデルにおける抗体の産生を記載する。

【0890】

実験１
この実施例は、複数の免疫原を含む環状ＲＮＡの免疫原性を記載する。この実施例はまた、マウスモデルにおける単一の環状ＲＮＡによってコードされる複数の免疫原に対する抗体の生成も記載する。

【0891】

この実験では、ＩＲＥＳと、続くＧｌｕｃポリペプチドをコードするＯＲＦ、終止コドン、スペーサー、ＩＲＥＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦ、及び終止コドンを含むように第１の環状ＲＮＡを設計し、実施例４７に記載されるとおり生成し、精製した。以下の環状ＲＮＡもまた、上記に記載したとおり生成した：（ｉ）ＩＲＥＳ及びＧｌｕｃポリペプチドをコードするＯＲＦを含む第２の環状ＲＮＡ；及び（ｉｉ）ＩＲＥＳ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦを含む第３の環状ＲＮＡ。

【0892】

第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、各々、実施例１６に記載されるとおり脂質ナノ粒子で製剤化して、それぞれ第１の環状ＲＮＡ調製物及び第２の環状ＲＮＡ調製物を入手した。第２の環状ＲＮＡ及び第３の環状ＲＮＡもまた別途脂質ナノ粒子で製剤化し、次に共に混合して第３の環状ＲＮＡ調製物を入手した。

【0893】

０日目及び２８日目、各群３匹のマウスに以下のワクチンを筋肉内接種した：（ｉ）第１の環状ＲＮＡ調製物（１回の注射当たり４０ｕｇ用量）；又は（ｉｉ）第２の環状ＲＮＡ調製物（１回の注射当たり１０ｕｇ用量）；又は（ｉｉｉ）第３の環状ＲＮＡ調製物（１回の注射当たり１０ｕｇ Ｇｌｕｃ＋１０ｕｇ ＲＢＤ用量）。

【0894】

各マウスから、顎下から抜き取ることによって採血した。環状ＲＮＡのプライミング後２、１４、２８、３５、４３、４９、６１、６２及び６３日目に、乾燥した抗凝固薬不含チューブに各マウスからの血液を収集した。４℃にて１２００ｇで３０分間遠心することにより、全血から血清を分離した。ＲＢＤ特異的ＩｇＧの存在に関して、個々の血清試料を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ４４２４０４ ９６ウェル、Ｎｕｎｃ）を、１００ｕＬの１×コーティング緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２１７０１）中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２－Ｖ０８Ｂ；１００ｎｇ）によって４℃で一晩コーティングした。次にプレートをブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＴＢＳ）で１時間ブロックした。血清を段階希釈し（４倍、８回：１：５００～１：８１９２０００）、次に各ウェルの１００ｕＬブロッキング緩衝液に加え、室温で１時間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤を含有する１×トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）で３回洗浄した後、プレートを抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７０２３）と共に１時間インキュベートし、続いてＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、次にＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、３４０２１）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートを１０～２０分間反応させておき、次に２Ｎ硫酸を使用して停止させた。光学濃度（Ｏ．Ｄ．）値を４５０ｎｍで決定した。血清力価は、バックグラウンドの５倍のＯ．Ｄ．値を与える最も高い血清希釈度の逆数として定義した。

【0895】

ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１６１５９）を用いてＧｌｕｃの活性を試験した。１０ｕＬの血清に５０ｕＬの１×Ｇｌｕｃ基質を加えてＧｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを実行した。プレートは、ルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）で混合直後に読み取った。

【0896】

結果は、プライミング２日後に（即ち、第１、第２又は第３の環状ＲＮＡ調製物を注射して２日後に）Ｇｌｕｃ活性が検出されたこと（図３６）、及びプライミング１４日後に（即ち、第１、第２又は第３の環状ＲＮＡ調製物を注射して１４日後に）抗ＲＢＤ抗体が入手されたこと（図３７Ａ）を示した。抗ＲＢＤ抗体はまた、環状ＲＮＡのプライミング後２８、３５、４３、４９、６１、６２及び６３日の時点でも入手された（データは示さず）。

【0897】

投与後６３日目の血清抗体について、ＩｇＧ２ａアイソタイプに対する相対的ＩｇＧ１を測定するアッセイを用いて特徴付け、血清抗体がウイルスを中和する能力をプラーク減少中和試験アッセイを用いて特徴付けた。結果は、第１の環状ＲＮＡ調製物及び第３の環状ＲＮＡ調製物を投与したマウスにおいて中和抗体が入手されたことを示した（図３７Ｂ）。

【0898】

これらの結果は、２つの免疫原をコードする単一の環状ＲＮＡが免疫原特異的免疫応答をプライミングできることを示している。加えて、結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦを含む環状ＲＮＡが中和能力を有したことを示している。

【0899】

実験２
脂質ナノ粒子中で製剤化された、ＩＲＥＳ、続いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦ、終止コドン、スペーサー、ＩＲＥＳ、ＭＥＲＳ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦ、及び終止コドンを含むように設計された環状ＲＮＡを含む環状ＲＮＡ製剤の免疫原性が、マウスモデルにおいて評価される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びＭＥＲＳ ＲＢＤ免疫原に対する抗体の産生も、マウスモデルにおいて評価される。

【0900】

次に、この環状ＲＮＡを、実施例１６に記載されるように脂質ナノ粒子と共に配合して、環状ＲＮＡ製剤を得る。

【0901】

マウスに、０日目に及び最初の投与の少なくとも１日後に再度、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、又は５０μｇの量の環状ＲＮＡ製剤を筋肉内に又は皮内に接種させる。

【0902】

血液採取は、実験１に記載されるとおりである。ＥＬＩＳＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ特異的及びＭＥＲＳ ＲＢＤ特異的ＩｇＧの存在が、実験１に記載されるように決定される。

【0903】

個々の血清サンプルが、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ結合抗体、抗ＭＥＲＳ ＲＢＤ結合抗体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原に対する中和抗体、ＭＥＲＳ ＲＢＤ免疫原に対する中和抗体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原に対する細胞応答、及びＭＥＲＳ ＲＢＤ免疫原に対する細胞応答の存在についてアッセイされる。

【0904】

実施例５０：Ｔ細胞応答の評価
実験１
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク又はＲＢＤ特異的Ｔ細胞又はインフルエンザＨＡ特異的Ｔ細胞の存在を検出する。このアッセイは、実施例４８からのマウスの以下の群において行われる：
１．ＲＢＤ
２．ＧＬｕｃ
３．ＨＡ
４．スパイク
５．ＲＢＤ＋ＨＡ
６．スパイク＋ＨＡ
７．ＰＢＳ

【0905】

マウス脾臓を、ブーストの３０日後（すなわち、第１の環状ＲＮＡ製剤による注射の３０日後）に採取し、単一の細胞懸濁液中で処理する。脾細胞を、ＩＦＮ－ガンマ又はＩＬ－４ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）においてウェル当たり０．５Ｍの細胞で平板培養する。脾細胞を、刺激のない状態のままにするか又はＳＡＲＳ ＣｏＶ－２及びＨＡペプチドプール（ＪＰＴ、ＰＭ－ＷＣＰＶ－ＳＲＢ及びＰＭ－ＩＦＮＡ＿ＨＡＣａｌ）で刺激する。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、製造業者のプロトコルに従って処理する。

【0906】

実験２
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ特異的Ｔ細胞の存在を検出した。このアッセイは、実施例４９のマウス群で実施した。

【0907】

プライミング後６３日目に（即ち、第１、第２又は第３の環状ＲＮＡ調製物を注射して６３日後に）マウスの脾臓を摘出し、単一細胞懸濁液となるように処理した。脾細胞を１ウェル当たり０．５Ｍ細胞でＩＦＮ－γ（Ｍａｂｔｅｃｈ）に播いた。脾細胞は、刺激しないままにしておくか、又はＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ ＲＢＤペプチドプール（ＪＰＴ、ＰＭ－ＷＣＰＶ－ＳＲＢＤ）で刺激するか、いずれかであった。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを製造者のプロトコルに従い処理した。

【0908】

結果は、異なる２つの免疫原をコードする単一の環状ＲＮＡを含む環状ＲＮＡの調製物により、免疫原特異的Ｔ細胞応答が誘導されたことを示した（図３８）

【0909】

実施例５１：複数の免疫原をコードする環状ＲＮＡを投与されたマウスにおける抗体応答の評価
この実施例は、複数の免疫原の発現をコードする環状ＲＮＡの投与から得られる抗体応答を実証する。

【0910】

赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）を用いて、マウスからの血清中の赤血球凝集を防止する抗インフルエンザＨＡ抗体を測定した。マウスに、環状ＲＮＡの製剤を投与し、これはそれぞれ、本明細書に記載される方法によって設計され、生成され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原、インフルエンザＨＡ免疫原、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びインフルエンザＨＡ免疫原、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びＧＬｕｃポリペプチド、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原の発現をコードする。血液採取は、実施例４７、実験１に記載されるとおりであり、注射の２日後及び１７日後に行われた。

【0911】

２日目及び１７日目にマウスから採取されたサンプルの２倍連続希釈物を調製した。ウイルスを加えなかった血清対照ウェルを除いて、既知の赤血球凝集素（ＨＡ）力価を有する一定の量のインフルエンザウイルスを、９６ウェルプレートの全てのウェルに、４つの赤血球凝集素単位に相当する濃度まで加えた。プレートを、室温で６０分間静置させ、その後、赤血球サンプルを加え、４℃で３０分間インキュベートさせた。赤血球凝集を防止した最高血清希釈は、血清のＨＡＩ力価であることが決定された。１７日目に採取されたサンプルは、それが単独で投与された場合又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原、例えばＲＢＤ又はスパイクと組み合わせて投与された場合の、インフルエンザＨＡ免疫原をコードする環状ＲＮＡ製剤を投与されたサンプルにおけるＨＡＩ力価を示した（図３５）。１７日目にＨＡＩ力価が、ＨＡ免疫原が投与されていないサンプル、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原単独又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原単独から見られなかった。

【0912】

実施例５２：哺乳類細胞における環状ＲＮＡからのアジュバントの発現
この実施例は、哺乳類細胞における環状ＲＮＡからのポリペプチドアジュバントの発現を示す。

【0913】

この例では、ＩＲＥＳ、アジュバントＩＬ－１２（核酸配列番号３８；アミノ酸配列番号３９）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含むように環状ＲＮＡを設計した。対照として、ＩＲＥＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含む環状ＲＮＡを使用した。これらの環状ＲＮＡを本明細書に記載される方法に従い生成し、精製した。

【0914】

精製した環状ＲＮＡ（０．１及び１ピコモル）をＨｅＬａ細胞へと、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＭＲＮＡ００１）を製造者の指示に従い使用してトランスフェクトした（１ウェル当たり１０，０００細胞）。

【0915】

細胞培養上清中のＩＬ－１２発現をＩＬ－１２特異的ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＢＭＳ６００４）を使用して測定した。データは２レプリケートの平均値及びＳＥＭ値として示す。

【0916】

結果は、環状ＲＮＡによってコードされるＩＬ－１２はＨｅＬａ細胞に発現したが、対照には発現しなかったことを示した（図３９）。この例は、哺乳類細胞において環状ＲＮＡからＩＬ－１２アジュバントが発現したことを示している。

【0917】

実施例５３：マウスモデルにおける環状ＲＮＡからのアジュバントのインビボ発現
この実施例は、環状ＲＮＡからのポリペプチドアジュバントのインビボ発現を示す。

【0918】

この例では、以下の環状ＲＮＡを本明細書に記載される方法に従い生成し、精製した：（ｉ）ＩＲＥＳ及びＩＬ－１２アジュバント（核酸配列番号３８；アミノ酸配列番号３９）をコードするＯＲＦを含む第１の環状ＲＮＡ；及び（ｉｉ）ＩＲＥＳ及びＮ末端Ｇｌｕｃシグナル配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号３３；アミノ酸配列番号３２）をコードするＯＲＦを含む第２の環状ＲＮＡ。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、各々別個に、実施例１６に記載されるとおり脂質ナノ粒子で製剤化し、次に共に混合して第１の環状ＲＮＡ調製物を入手した。

【0919】

０日目、３匹のマウスに、第１の環状ＲＮＡ調製物（１０ｕｇ用量）のワクチンを筋肉内接種した。対照として、各群３匹のマウスに以下のワクチンを筋肉内接種した：（ｉ）脂質ナノ粒子で製剤化した第２の環状ＲＮＡ（１０ｕｇ用量）（即ち、第２の環状ＲＮＡ調製物）；又は（ｉｉ）ＰＢＳ。各マウスから、顎下から抜き取ることによって採血した。環状ＲＮＡ又はＰＢＳの投与から２日後に、各マウスから、乾燥した抗凝固薬不含チューブに血液を収集した。４℃にて１２００ｇで３０分間遠心することにより、全血から血清を分離した。ＩＬ１２の存在に関して、個々の血清試料をサイトカインビーズアレイ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、７４９６２２）を使用してアッセイした。データは３レプリケートの平均値及びＳＥＭ値として示す。

【0920】

結果は、第１の環状ＲＮＡ調製物を注射して２日後の血清中にＩＬ－１２発現が検出されたが、対照はいずれの注射後にも検出されなかったことを示した（図４０Ａ）。

【0921】

発現したＩＬ１２が機能性かどうかを決定するため、環状ＲＮＡ調製物を注射した２日後に血清中の（ＩＬ１２シグナル伝達の直ちに下流の）ＩＦＮ－γ産生を測定した。本明細書に記載される同じサイトカインビーズアレイアッセイで（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、７４９６２２）、血清中にＩＦＮ－γ産生が検出された。データは３レプリケートの平均値及びＳＥＭ値として示す。

【0922】

結果は、血清ＩＦＮ－γの増加を示したことから、環状ＲＮＡから発現したＩＬ１２は機能性であることが指摘される（図４０Ｂ）。

【0923】

実施例５４：複数の環状ＲＮＡによってコードされる免疫原及びアジュバントの共投与によるマウスモデルにおける免疫原性の誘導
この実施例は、対象への複数の環状ＲＮＡの投与によって誘導される免疫原性を示す。投与される１つの環状ＲＮＡが、免疫原をコードする。投与されるもう１つの環状ＲＮＡが、ポリペプチドアジュバントをコードする。

【0924】

この例では、以下の環状ＲＮＡを本明細書に記載される方法に従い生成し、精製した：（ｉ）ＩＲＥＳ及びＩＬ－１２アジュバント（核酸配列番号３８；アミノ酸配列番号３９）をコードするＯＲＦを含む第１の環状ＲＮＡ；及び（ｉｉ）ＩＲＥＳ及びＮ末端Ｇｌｕｃシグナル配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号３３；アミノ酸配列番号３２）をコードするＯＲＦを含む第２の環状ＲＮＡ。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを、各々別個に、実施例１６に記載されるとおり脂質ナノ粒子で製剤化し、次に共に混合して第１の環状ＲＮＡ調製物を入手した。

【0925】

０日目及び１４日目、３匹のマウスに、第１の環状ＲＮＡ調製物（１回の注射当たり各環状ＲＮＡにつき２．５ｕｇ用量）のワクチンを筋肉内接種した。対照として、各群３匹のマウスに以下のワクチンを筋肉内接種した：（ｉ）脂質ナノ粒子で製剤化した第２の環状ＲＮＡ（１回の注射当たり２．５ｕｇ用量）（即ち、第２の環状ＲＮＡ調製物）；又は（ｉｉ）ＰＢＳ。初回投与後２２日でマウスを安楽死させて、脾細胞を単一細胞懸濁液に処理した。脾細胞は、刺激しないままにしておくか、又はＲＢＤペプチドプール（ＪＰＴ、ＰＭ－ＷＣＰＶ－Ｓ－ＲＢＤ－２）で１時間刺激するか、いずれかであった。次に培地にタンパク質輸送阻害剤（モネンシン、ＢＤ ５５４７２４）及びブレフェルジンＡ、ＢＤ ５５５０２９））を加え、続いてさらに５時間培養した。ＢＤ固定・透過処理キット（ＢＤ、５５４７１４）を製造者のプロトコルに従い使用して細胞を染色した。使用した抗体：生死判別色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌ１０１１）、ＣＤ８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＭＡ５－１６７５９）及びＣＤ４４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０３０２６）。染色した細胞をフローサイトメトリーにより分析した。

【0926】

データは、第１の環状ＲＮＡ調製物により、対照、即ち、第２の環状ＲＮＡ調製物と比べてＲＢＤ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数が増加したこと（図４１Ａ）、及びＲＢＤ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞には変化は認められなかったこと（図４１Ｂ）を示している。加えて、第１の環状ＲＮＡ調製物により、ＣＤ４及びＣＤ８の両方のＴ細胞によるＩＦＮ－γ産生量が増加した（図４１Ｃ、図４１Ｄ）。これは、ＩＬ１２を発現する環状ＲＮＡが、免疫原を発現する環状ＲＮＡによって引き出される細胞性免疫応答をブーストするアジュバントとして作用するものであることを示している。データは３レプリケートの平均値及びＳＥＭとして示す。図４１Ａ：アスタリスクは、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ保護ありチューキーの事後検定により決定したときの統計的有意性を表す。図４１Ｃ、図４１Ｄ：アスタリスクは、対応のないｔ検定により決定したときの統計的有意性を表す。

【0927】

実施例５５：複数の環状ＲＮＡによってコードされる免疫原及びアジュバントの共投与後のＴ細胞応答の評価
この実験では、以下の環状ＲＮＡを本明細書に記載される方法に従い生成し、精製した：（ｉ）ＩＲＥＳ、オボアルブミン（ＯＶＡ）（核酸配列番号４０；アミノ酸配列番号４１）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含む第１の環状ＲＮＡ；及び（ｉｉ）ＩＲＥＳ、アジュバントＩＬ－１２（核酸配列番号３８；アミノ酸配列番号３９）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含む第２の環状ＲＮＡ。第１の環状ＲＮＡ及び第２の環状ＲＮＡを共に混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＭＲＮＡ００１）と複合体化して混合物を入手した。対照として、ＩＲＥＳ、ＧｌｕｃポリペプチドをコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含む第３の環状ＲＮＡもまた生成した。

【0928】

Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを製造者の指示に従い使用して、ＥＬ４細胞に以下をトランスフェクトした（１ウェル当たり１０，０００細胞；ＥＬ４細胞はＡＴＣＣから入手した）：
１）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘと複合体化した第１の環状ＲＮＡと第２の環状ＲＮＡとの混合物（０．１ピコモルｅＲＮＡ ＯＶＡ＋０．１ピコモルｅＲＮＡ ＩＬ１２）；
２）第１の環状ＲＮＡ（０．１ピコモル、ｅＲＮＡ ＯＶＡ）；
３）第２の環状ＲＮＡ（０．１ピコモル、ｅＲＮＡ ＩＬ１２）；
４）第３の環状ＲＮＡ（０．１ピコモル、ｅＲＮＡ Ｇｌｕｃ）；
５）トランスフェクション試薬単独（ブランクトランスフェクション）。

【0929】

トランスフェクトしたＥＬ４細胞をＯＴ－Ｉ ＣＤ８ Ｔ細胞（ＯＶＡ特異的Ｔ細胞；Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからのＯＴ－Ｉマウスから単離した）と２日間共培養した。Ｔ細胞の活性化状態をＩＦＮ－γの産生によってモニタした。２日後に上清を回収し、サイトカインビーズアレイ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、７４１０４４）を使用してＩＦＮ－γを検出した。データは３レプリケートの平均値及びＳＥＭとして示す。アスタリスクは、一元配置ＡＮＯＶＡ保護ありチューキーの事後検定により決定したときの統計的有意性を表す。

【0930】

図４２は、ＯＶＡを発現する環状ＲＮＡをＩＬ１２を発現する環状ＲＮＡと組み合わせると、対照（ＯＶＡを発現する環状ＲＮＡのみ）と比較したときより強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答が誘導されることを示している。これは、ＩＬ１２を発現する環状ＲＮＡがアジュバントとして作用することを実証している。

【0931】

この実施例で参照される配列
配列番号１

【化28】

配列番号２

【化29】

配列番号３

【化30】

配列番号４
ａａａａａａｃａａａａａａｃａａａａｃｇｇｃｔａｔｔａａｔａｇｃｃｇａａａａａｃａａａａａａｃａａａａａａａａｃａａａａａａａａａａｃｃａａａａａａａｃａａａａｃａｃａ
配列番号３０

【化31】

配列番号３１

【化32】

配列番号３２

【化33】

配列番号３３

【化34】

配列番号３４

【化35】

配列番号３５

【化36】

配列番号３６

【化37】

配列番号３７

【化38】

配列番号３８

【化39】

配列番号３９

【化40】

配列番号４０

【化41】

配列番号４１

【化42】

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【図33A】

【図33B】

【図34A】

【図34B】

【図35】

【図36】

【図37A】

【図37B】

【図38】

【図39】

【図40A】

【図40B】

【図41A】

【図41B】

【図41C】

【図41D】

【図42】

【配列表】

2023542492000001.app

【国際調査報告】