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特表2023-542535ＡＴＴＢ細胞系、それに由来するトランスジェニック細胞系、およびそれらを製造する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-10
(54)【発明の名称】ＡＴＴＢ細胞系、それに由来するトランスジェニック細胞系、およびそれらを製造する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20231002BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20231002BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20231002BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20231002BHJP
C12N 15/33 20060101ALN20231002BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12Q1/70
C12Q1/02
C12Q1/66
C12N15/33 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518825
(86)(22)【出願日】2021-09-24
(85)【翻訳文提出日】2023-05-17
(86)【国際出願番号】 US2021051947
(87)【国際公開番号】W WO2022067034
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】63/082,701
(32)【優先日】2020-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520426357
【氏名又は名称】アルベルト・アインシュタイン・カレッジ・オブ・メディシン
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＢＥＲＴ ＥＩＮＳＴＥＩＮ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ジェイコブズ，ウィリアム アール
(72)【発明者】
【氏名】レオン，ローレンス
(72)【発明者】
【氏名】ルコセ，レジ
(72)【発明者】
【氏名】デ オリベイラ，アンナ パウラ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ10
4B063QR58
4B063QX02
4B065AA01Y
4B065AA90X
4B065AA95Y
4B065AB04
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA43
4B065CA44
4B065CA46
4B065CA60
(57)【要約】
遺伝子改変哺乳動物細胞および遺伝子改変哺乳動物細胞系は、哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された組換え配列を含み、組換え配列はスメグマ菌由来のＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む。トランスジェニック哺乳動物細胞およびトランスジェニック哺乳動物細胞系は、哺乳動物ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含み、異種の核酸がトランスジェニック哺乳動物細胞による発現のために構成された異種の遺伝子を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｖｅｒｏ細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された組換え配列を含む遺伝子改変哺乳動物細胞であって、前記組換え配列がスメグマ菌由来のＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む、遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項2】
前記哺乳動物細胞がＶｅｒｏ細胞であり、前記標的遺伝子座が前記Ｖｅｒｏ細胞ゲノムの第６染色体上のアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）を含む、請求項１に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項3】
ａｔｔＢ部位が、ＡＡＶＳ１遺伝子座の１５２９位と１５３０位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２１５５位と２１５６位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２４０８位と２４０９位との間、またはそれらの組合せに挿入されている、請求項２に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項4】
前記組換え配列を含むＡＡＶＳ１遺伝子座が配列番号２２の４キロベースの配列を有する、請求項２に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項5】
前記ａｔｔＢ配列がＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＴＣＴＣＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＣＡＴ（配列番号２）の配列を有する、請求項１に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項6】
請求項１に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞を含む細胞系。
【請求項7】
Ｖｅｒｏ細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された組換え配列を含む遺伝子改変哺乳動物細胞を産生する方法であって、前記組換え配列がスメグマ菌由来のＢｘｂ１ａｔｔＢ配列を含み、前記方法が、前記標的遺伝子座上の標的部位とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡと、
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと
を含む複合体を提供することと；
前記ａｔｔＢ配列を含む一本鎖ＤＮＡ配列を提供することと；
前記複合体および前記一本鎖ＤＮＡ配列をＶｅｒｏ細胞へ導入して、前記標的遺伝子座に挿入された前記Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む遺伝子改変Ｖｅｒｏ細胞を得ることと
を含む、方法。
【請求項8】
前記標的遺伝子座が哺乳動物細胞ゲノムの第６染色体上のアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列が、ＡＡＶＳ１遺伝子座の１５２９位と１５３０位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２１５５位と２１５６位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２４０８位と２４０９位との間、またはそれらの組合せに挿入される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、前記標的部位とｇＲＮＡとのハイブリダイゼーションに際して、前記標的部位においてＤＮＡ切断を触媒する、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
前記一本鎖ＤＮＡ配列が配列番号１の配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
前記ガイドＲＮＡが配列番号１０、配列番号２０、配列番号２１またはそれらの組合せの配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項13】
哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞であって、前記異種の核酸が前記トランスジェニック哺乳動物細胞による発現のために構成された異種の遺伝子を含む、トランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項14】
前記哺乳動物細胞がＶｅｒｏ細胞であり、前記標的遺伝子座が前記哺乳動物細胞ゲノムの第６染色体上のアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）を含む、請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項15】
前記異種の核酸が、ＡＡＶＳ１遺伝子座の１５２９位と１５３０位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２１５５位と２１５６位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２４０８位と２４０９位との間、またはそれらの組合せに挿入されている、請求項１４に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項16】
組み込まれた前記異種の核酸の第１の末端におけるａｔｔＬ配列と、組み込まれた前記異種の核酸分子の第２の末端におけるａｔｔＲ配列とを含む、請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項17】
前記異種の核酸が、前記異種の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項18】
前記異種の核酸が、抗生物質耐性マーカー、ＳＶ４０配列またはそれらの組合せをコードする遺伝子を含まない、請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項19】
前記異種の遺伝子がウイルス遺伝子、レポーター遺伝子またはそれらの組合せを含む、請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項20】
前記異種の遺伝子がウイルス遺伝子を含み、哺乳動物細胞系が、前記ウイルス遺伝子の欠失を有する単一サイクル感染性ウイルスの複製を支持する、請求項１９に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項21】
前記ウイルス遺伝子が単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、天然痘、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、日本脳炎ウイルス、出血熱ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２またはそれらの組合せ由来の遺伝子を含む、請求項１９に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項22】
前記ウイルス遺伝子が必須遺伝子、または必須遺伝子と非必須遺伝子との組合せを含む、請求項１９に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項23】
前記ウイルス遺伝子がＨＳＶ遺伝子を含み、前記ＨＳＶ遺伝子がグリコプロテインＢ、グリコプロテインＣ、グリコプロテインＤ、グリコプロテインＥ、グリコプロテインＧ、グリコプロテインＨ、グリコプロテインＩ、グリコプロテインＪ、グリコプロテインＫ、グリコプロテインＬ、グリコプロテインＭ、グリコプロテインＮ、ＵＬ２０、ＵＬ４５、ＵＳ９もしくはそれらの組合せまたはそれらの組合せを含む、請求項１９に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項24】
細胞系が、ＨＳＶ－２ ｇＤ遺伝子の欠失を含むゲノムを有する単一サイクル感染性ＨＳＶ－２、またはＨＳＶ－１ ｇＤ遺伝子の欠失を含むゲノムを有する単一サイクル感染性ＨＳＶ－１の複製を支持する、請求項２３に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項25】
前記標的遺伝子座に組み込まれた１～５０コピーの前記異種の核酸を含む、請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項26】
請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞を含む細胞系。
【請求項27】
トランスジェニック哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞を産生する方法であって、請求項１に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞を、
異種の遺伝子と、バクテリオファージＢｘｂ１由来のａｔｔＰ配列を含む組換え配列とを含む異種の核酸、および
バクテリオファージＢｘｂ１インテグラーゼと核局在化配列とをコードするｍＲＮＡ
と接触させることと；
前記Ｂｘｂ１インテグラーゼによって媒介される、前記遺伝子改変哺乳動物細胞のＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列と前記異種の核酸の前記ａｔｔＰ配列との間の配列特異的組換えによって、前記遺伝子改変哺乳動物細胞の前記標的遺伝子座において前記異種の核酸を挿入して、前記トランスジェニック哺乳動物細胞を産生することと
を含む方法。
【請求項28】
前記ａｔｔＰ配列がＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＡＣＧＧＴＡＣＡＡＡＣＣ（配列番号３）の配列を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記接触させることが、前記遺伝子改変哺乳動物細胞に前記異種の核酸および前記ｍＲＮＡをトランスフェクトすることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記異種の核酸が、異種の遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモーターおよび適宜、選択可能マーカーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項31】
前記異種の核酸が、異種の遺伝子配列に作動可能に連結された選択可能マーカーをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項32】
前記選択可能マーカーがネズミチフス菌ｈｉｓＤ遺伝子配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記哺乳動物細胞がＶｅｒｏ細胞であり、前記標的遺伝子座がＶｅｒｏ細胞ゲノムの第６染色体上のアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）を含み、前記異種の核酸が、ＡＡＶＳ１遺伝子座の１５２９位と１５３０位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２１５５位と２１５６位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２４０８位と２４０９位との間、またはそれらの組合せに挿入される、請求項２７に記載の方法。
【請求項34】
前記異種の核酸が、抗生物質耐性マーカー、ＳＶ４０配列またはそれらの組合せをコードする遺伝子を含まない、請求項２７に記載の方法。
【請求項35】
前記トランスジェニック哺乳動物細胞が、前記標的遺伝子座に挿入された１～５０コピーの前記異種の核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項36】
前記異種の遺伝子がウイルス遺伝子、レポーター遺伝子またはそれらの組合せを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項37】
前記遺伝子改変哺乳動物細胞が、前記標的遺伝子座上の標的部位とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとを含む複合体を提供することと；
スメグマ菌由来の前記Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む一本鎖ＤＮＡ配列を提供することと；
前記複合体および前記一本鎖ＤＮＡ配列を前記哺乳動物細胞へ導入して、前記標的遺伝子座に挿入された前記Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む哺乳動物細胞を得ることと
を含むプロセスによって調製される、請求項２７に記載の方法。
【請求項38】
必須遺伝子の欠失を有するゲノムを含む単一サイクル感染性ウイルスを繁殖させる方法であって、哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された少なくとも１コピーの前記必須遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物細胞を提供することであって、前記トランスジェニック哺乳動物細胞が前記必須遺伝子によってコードされるタンパク質を構成的に発現する、提供することと；
前記トランスジェニック哺乳動物細胞を前記単一サイクル感染性ウイルスと接触させることと；
前記単一サイクル感染性ウイルスを前記トランスジェニック哺乳動物細胞によって発現された前記タンパク質により補完して、前記単一サイクルウイルスを繁殖させることと
を含む方法。
【請求項39】
前記接触させることは、前記単一サイクル感染性ウイルスによる前記トランスジェニック哺乳動物細胞の感染を促進する条件下において、前記単一サイクル感染性ウイルスを前記トランスジェニック哺乳動物細胞へ添加することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
異種の核酸が選択マーカーとしてのｈｉｓＤをさらに含み、前記方法が、前記トランスジェニック哺乳動物細胞を、ヒスチジノールを含む選択培地において、前記単一サイクル感染性ウイルスの産生を最大限にするために好適な期間および好適な条件下において培養することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項41】
前記単一サイクル感染性ウイルスが単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、天然痘、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、日本脳炎ウイルス、出血熱ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２またはそれらの組合せを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項42】
前記単一サイクル感染性ウイルスが単一サイクル感染性ＨＳＶ－１または単一サイクル感染性ＨＳＶ－２であり、前記必須遺伝子がグリコプロテインＢ、グリコプロテインＣ、グリコプロテインＤ、グリコプロテインＥ、グリコプロテインＧ、グリコプロテインＨ、グリコプロテインＩ、グリコプロテインＪ、グリコプロテインＫ、グリコプロテインＬ、グリコプロテインＭ、グリコプロテインＮ、ＵＬ２０、ＵＬ４５、ＵＳ９またはそれらの組合せを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項43】
試料中の感染性ウイルスを検出および／または定量するための方法であって、哺乳動物細胞のゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞を提供することであって、前記異種の核酸がレポーター遺伝子に作動可能に連結されたウイルスプロモーターを含む、提供することと；
前記トランスジェニック哺乳動物細胞を前記試料と接触させることであって、前記試料中に存在する感染性ウイルスが前記ウイルスプロモーターをトランス活性化し、前記トランスジェニック哺乳動物細胞内の前記レポーター遺伝子の発現を誘導する、接触させることと；
前記レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する哺乳動物細胞の数を定量して、前記感染性ウイルスを定量することと
を含む方法。
【請求項44】
前記接触させることが、前記トランスジェニック哺乳動物細胞を前記試料中に存在するウイルスに感染させることを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記トランスジェニック哺乳動物細胞において前記レポーター遺伝子の発現を検出することをさらに含む、請求項４３に記載の細胞に基づくレポーターアッセイ。
【請求項46】
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、ｎａｎｏＬｕｃ、ベータ－ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質、Ｖｅｎｕｓ、モノマー赤外蛍光タンパク質（ｍＩＦＰ）、ＬｓｓｍＯｒａｎｇｅ（Ｌｏｎｇ Ｓｔｏｋｅｓ Ｓｈｉｆｔ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｏｒａｎｇｅ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＴａｇＲＦＰ６５７（Ｔａｇ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ６５７）、ｍＯｒａｎｇｅ２（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｏｒａｎｇｅ２）、ｍＡｐｐｌｅ（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｐｐｌｅ）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｍＴａｇＢＦＰ２（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｔａｇ Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｃｈｅｒｒｙ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｃｅｒｕｌｅａｎ３）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）またはそれらの組合せを含む蛍光タンパク質をコードする、請求項４３に記載の細胞に基づくレポーターアッセイ。
【請求項47】
前記試料が、対象からの生体試料、またはバルクウイルスのバッチから採取された試料である、請求項４３に記載の方法。
【請求項48】
前記生体試料が血清、唾液、血漿、全血、鼻咽頭拭き取り検体、尿、便、呼吸液、脳脊髄液またはそれらの組合せを含む、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２４日出願の米国仮出願第６３／０８２，７０１号の優先権を主張し、当該出願は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年９月２４日出願の米国仮出願第６３／０８２，７０１号の優先権を主張し、当該出願は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府からの支援についての申告
本発明は、米国国立衛生研究所－国立アレルギー感染疾患研究所（ＮＩＨ－ＮＩＡＩＤ）により与えられたグラント番号ＡＩ１１７３２１の下に政府からの支援によって行われた。
本発明は、米国国立衛生研究所－国立アレルギー感染疾患研究所（ＮＩＨ－ＮＩＡＩＤ）により与えられたグラント番号ＡＩ１１７３２１の下に政府からの支援によって行われた。
【背景技術】
【0003】
ウイルス繁殖のための１つまたは複数の必須機能が欠損した単一サイクル感染性ウイルス（ｓｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖｉｒｕｓ）が開発されている。グリコプロテインＤにおいて欠失を有する（ΔｇＤ－２）単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）株が、ｇＤ遺伝子のゲノム欠失（ΔｇＤ－２と命名された）を含有する遺伝子改変単一サイクル感染性ＨＳＶ－２株を生成するために開発された。前臨床マウス研究において、このΔｇＤ－２ワクチン株は高タイター非中和性Ａｂｓを誘発し、それはＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を活性化して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導した。２用量を皮下投与すると、雌および／または雄マウスはＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２の臨床単離物による致死的な膣または皮膚曝露に対して完全に保護され、潜伏感染の確立が妨げられた。さらに、雌マウスにワクチン接種すると、それらの仔は生後１週間におけるその後のＨＳＶ曝露に対して保護された。
【0004】
ウイルス繁殖に必須の遺伝子の欠失を含有する単一サイクル感染性ウイルスは、ウイルス必須遺伝子を導入遺伝子として発現する補完的な細胞において効率的に増殖させることができる。ウイルス性導入遺伝子は、細胞のゲノムにランダムに挿入され得る。ΔｇＤ－２の場合、ウイルスはＶＤ６０細胞系において増殖する。ＶＤ６０細胞は培養物中にｇＤタンパク質を産生し、ΔｇＤ－２を有効に補完するために使用されてきた［Cheshenko, N., et al, FASEB J, 2013. 27(7): p. 2584-99］。ＶＤ６０細胞系において培養されたΔｇＤ－２株の、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２に対する殺ウイルス性免疫を誘発するためのワクチンとしての有効性は実証されている［Petro, C. et al, Elife, 2015, 4；Petro, C.D. et al, JCI Insight, 2016, 1(12)］。ＶＤ６０細胞系は、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）ＫＯＳ株由来の６キロベース（ｋｂ）のＢａｍＨＩ Ｊ ＤＮＡ断片［グリコプロテインＤ（ｇＤ）遺伝子を含む］を、Ｖｅｒｏ細胞のゲノムＤＮＡへ、ＢａｍＨＩ Ｊ断片、ＣＯＬＥ１プラスミドレプリコン、アンピシリン耐性遺伝子、ＳＶ４０複製起源、および選択可能マーカーとしてサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｈｉｓＤ遺伝子を含有するプラスミドを使用して、ランダムに組み込むことによって構築された。ＶＤ６０細胞系は、少なくとも１００コピーの挿入されたＤＮＡ断片を有するが、正確なコピー数は定量するのが困難であった。さらに、ＶＤ６０細胞系は不特定の様式で繁殖されており、Ｖｅｒｏ細胞は発癌性になることが示されている。
【0005】
規定の条件下で産生および培養され、かつ細胞ゲノムの規定の位置に導入遺伝子が安定して挿入されている新しい細胞系が望ましい。また、ウイルスを含むワクチンを製造するプロセス全体を通してウイルスの効力を評価するために有効に使用され得るトランスジェニック細胞系を提供することは有益であり得る。さらに、対象からの試料中のウイルスの存在を検出するための診断アッセイにおいて使用され得るトランスジェニック細胞系もまた有益であり得る。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、Ｖｅｒｏ細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された組換え配列を含む遺伝子改変哺乳動物細胞であって、組換え配列がスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＢｘｂ１ａｔｔＢ配列を含む、遺伝子改変哺乳動物細胞を提供する。
【0007】
また、本開示は、哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された組換え配列を含む哺乳動物細胞を産生する方法であって、組換え配列がスメグマ菌由来のＢｘｂ１ａｔｔＢ配列を含み、方法が、標的遺伝子座上の標的部位とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼとを含む複合体を提供することと；Ｂｘｂ１ａｔｔＢ配列を含む一本鎖ＤＮＡ配列を提供することと；複合体および一本鎖ＤＮＡ配列を哺乳動物細胞へ導入して、標的遺伝子座に挿入されたＢｘｂ１ａｔｔＢ配列を含む哺乳動物細胞を得ることとを含む、方法を提供する。
【0008】
本開示は、哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞であって、異種の核酸（ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ）がトランスジェニック哺乳動物細胞による発現のために構成された異種の遺伝子を含む、トランスジェニック哺乳動物細胞を提供する。
【0009】
また、本開示は、トランスジェニック哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞を産生する方法であって、本明細書において開示される遺伝子改変哺乳動物細胞を、異種の遺伝子とバクテリオファージＢｘｂ１由来のａｔｔＰ配列を含む組換え配列とを含む異種の核酸、およびバクテリオファージＢｘｂ１インテグラーゼと核局在化配列とをコードするｍＲＮＡと接触させることと；Ｂｘｂ１インテグラーゼによって媒介される、遺伝子改変哺乳動物細胞のＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列と異種の核酸のａｔｔＰ配列との間の配列特異的組換えによって、遺伝子改変哺乳動物細胞の標的遺伝子座において異種の核酸を挿入して、トランスジェニック哺乳動物細胞を産生することとを含む方法を提供する。
【0010】
本開示は、必須遺伝子の欠失を有するゲノムを含む単一サイクル感染性ウイルスを繁殖させる方法であって、哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された少なくとも１コピーの必須遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物細胞を提供することであって、トランスジェニック哺乳動物細胞が必須遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する、提供することと；トランスジェニック哺乳動物細胞を単一サイクル感染性ウイルスと接触させることと；単一サイクル感染性ウイルスをトランスジェニック哺乳動物細胞によって発現されたタンパク質により補完して、単一サイクル感染性ウイルスを繁殖させることとを含む方法を提供する。
【0011】
また、本開示は、試料中の感染性ウイルスを検出および／または定量する方法であって、哺乳動物細胞のゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞を提供することであって、異種の核酸がレポーター遺伝子に作動可能に連結されたウイルスプロモーターを含む、提供することと；トランスジェニック哺乳動物細胞を試料と接触させることであって、試料中に存在する感染性ウイルスがウイルスプロモーターをトランス活性化し、トランスジェニック哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の発現を誘導する、接触させることと；レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質を発現する哺乳動物細胞の数を定量して、感染性ウイルスを定量することとを含む方法を提供する。
【0012】
上記に説明される特色および他の特色は、以下の図面および詳細な説明によって例示される。
【0013】
以下の図は例示的な実施形態であり、同様の要素には同様の番号を付している。特許または出願ファイルは、色を施した少なくとも１つの図面を含有する。色付き図面を伴うこの特許または特許出願公開公報の複製物は、必要な手数料の受領および支払いに際して事務局によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図4】図４Ａは、ａｔｔＢを含有する可能性のあるＶｅｒｏ細胞クローンを特定するＰＣＲ結果を示すアガロースゲルであり、ａｔｔＢを含有する可能性のあるＶｅｒｏ細胞クローンは＋記号によって示される。図４Ｂは、クローニングされたＶｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞の第６染色体におけるＢｘｂ１ ａｔｔＢの部位特異的挿入を確証するＰＣＲ結果を示す。
【図6】図６は、ＶＤ６０Ｌクローンの、ΔｇＤ－２：：ＲＰＦの繁殖を支持する能力を試験するプラークアッセイの結果を示し、ＶＤ６０細胞、ＶＤ６０Ｌ細胞およびＶｅｒｏ細胞におけるＲＦＰの発現を示すカラー写真を含む。
【発明を実施するための形態】
【0015】
細胞の染色体における規定の位置に挿入されたスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む哺乳動物細胞系が、本明細書において開示される。特に、本開示は、Ｖｅｒｏ細胞ゲノムにおける規定の遺伝子座においてＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む遺伝子改変Ｖｅｒｏ細胞を提供する。
【0016】
挿入されたＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む哺乳動物細胞系は、例えば、（１）単一サイクル感染性ウイルスの増殖を補完し、その繁殖を促進するか、（２）試料中に存在する生存可能な単一サイクル感染性ウイルスを迅速に検出し、かつ／もしくはその量を定量するか、または（３）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／もしくは抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシスを測定するための抗原特異的レポーター細胞として使用することができるトランスジェニック細胞系を開発するために使用することができる。また、少なくとも１種の異種のタンパク質を発現する、遺伝子改変哺乳動物細胞に由来するトランスジェニック哺乳動物細胞が開示される。遺伝子改変哺乳動物細胞およびトランスジェニック哺乳動物細胞を産生する方法、ならびにこれらの細胞を使用する方法が開示される。
【0017】
「遺伝子座」という用語は、染色体上の特定の位置を指す。公知の遺伝子座は、公知の遺伝子情報、例えば１つまたは複数の多型マーカー部位を含有し得る。
【0018】
「標的遺伝子座」は、細胞における目的の遺伝子またはポリヌクレオチドが組み込まれるＤＮＡの領域、例えば染色体ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡの領域である。
【0019】
「核酸コンストラクト」または「異種の核酸」または「ベクター」は、本明細書において使用される場合、特定の宿主細胞にとって外来性の供給源に由来するか、または同じ供給源に由来する場合その元の形態から改変されている核酸配列、特にＤＮＡ配列を指す。核酸コンストラクトまたは異種の核酸は、天然において一緒に見出されない１つまたは複数の機能単位を含むように構築され、核酸（または複数の核酸）を宿主細胞へ移行させるように設計される。例として、環状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージ由来のＣＯＳ配列を含有するプラスミド）、異種の（非ネイティブ）核酸配列を含むウイルスゲノムなどが挙げられる。異種の核酸は、ＤＮＡ配列であり得る。異種の核酸は、導入遺伝子または異種の遺伝子のＤＮＡ配列を含む。異種の核酸を含む宿主細胞は、異種の遺伝子を発現する。また、核酸コンストラクトは、ベクターと称される場合がある。
【0020】
「遺伝子」という用語は、生物学的機能と関連付けられるＤＮＡのセグメントを指す。したがって、遺伝子は、それらの発現に必要とされるコード配列および／または調節配列を含む。また、遺伝子は、例えば、他のタンパク質についての認識配列を形成する、発現されないＤＮＡセグメントを含み得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または公知の配列情報もしくは予測される配列情報からの合成を含む、様々な供給源から得ることができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含み得る。
【0021】
「異種の核酸」は、特定の宿主ゲノムにとって外来性の供給源に由来するか、または同じ供給源に由来する場合その元の形態から改変されている核酸配列またはポリヌクレオチド、特にＤＮＡ配列を指す。異種の核酸は、天然において一緒に見出されない１つまたは複数の機能単位を含むように構築され、核酸（または複数の核酸）を宿主ゲノムへ移行させるように設計される。例として、環状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド、シャトルプラスミド）、コスミド（ラムダファージ由来のｃｏｓ配列を含有するプラスミド）、異種の（非ネイティブ）核酸配列を含むウイルスゲノムなどが挙げられる。
【0022】
「遺伝子」という用語は、生物学的機能と関連付けられるヌクレオチド配列を指す。したがって、遺伝子は、その発現に必要とされるコード配列および／または調節配列を含む。また、遺伝子は、例えば、他のタンパク質についての認識配列を形成する、非コードＤＮＡセグメント、例えば調節エレメントを含み得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または公知の配列情報もしくは予測される配列情報からの合成を含む、様々な供給源から得ることができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含み得る。「導入遺伝子」または「異種の遺伝子」とは、宿主細胞にとって外来性の供給源に由来するか、または同じ供給源に由来する場合その元の形態から改変されている遺伝子を指す。したがって、この用語は、細胞にとって外来性もしくは異種であるか、または細胞にとって同種であるがそのエレメントが普通見出されない宿主細胞核酸内の位置に存在するＤＮＡセグメントを指す。異種の遺伝子が発現されると、異種のポリペプチドを産出する。「安定して組み込まれた」という用語は、宿主ゲノムに組み込まれ、細胞複製物として複製し、後代に伝えられる異種の核酸を指す。本開示において、宿主細胞はＶｅｒｏ細胞であり、異種の核酸は、Ｖｅｒｏ細胞ゲノムに組み込まれ、後代細胞に渡される。
【0023】
ＤＮＡセグメント（ヌクレオチド配列）は、別のＤＮＡセグメントと機能的関係に置かれている場合「作動可能に連結され」ている。例えば、シグナル配列についてのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドをコードする遺伝子についてのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写を刺激する場合、その配列に作動可能に連結されている。一般的に、作動可能に連結されているＤＮＡ配列は連続しており、シグナル配列の場合、連続し、かつ読取り相にある。しかしながら、例えば、エンハンサーは、それらが転写を制御するコード配列と連続している必要はない。連結は、便利な制限酵素部位における、またはそれの代わりに挿入されるアダプターもしくはリンカーにおけるライゲーションによって達成される。
【0024】
「組換え体」という用語は、細胞について使用される場合、細胞が異種の核酸を複製するか、または異種の核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内において見出されないポリヌクレオチドを含有し得る。
【0025】
細胞は、外因性または異種のＤＮＡ、例えばＤＮＡコンストラクトが細胞の内側に導入された場合、そのようなＤＮＡによって「形質転換され」ているかまたは「トランスフェクトされ」ている。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれ（共有結合され）ても、組み込まれ（共有結合され）なくてもよい。
【0026】
「トランスジェニック」という用語は、細胞または細胞の祖先に導入された特定の遺伝子改変を含む細胞を指す。そのような改変は、１つまたは複数の点突然変異、欠失、挿入またはそれらの組合せを含み得る。本開示において、トランスジェニックとは、細胞に導入された異種の核酸を含む細胞を指す。
【0027】
「組換え部位」は、本明細書において説明されるリコンビナーゼ酵素によって認識される特定のポリヌクレオチド配列である。典型的に、２つの異なる部位が関与しており（「相補的部位」と呼ばれる）、１つは標的核酸（例えば、真核生物の染色体またはエピソーム）に存在し、もう１つは標的組換え部位に組み込まれる核酸上に存在する。「ａｔｔＢ」および「ａｔｔＰ」という用語は、それぞれ、元々細菌標的およびファージドナー由来の結合（または組換え）部位を指し、本明細書において使用される。本明細書において言及されるａｔｔＢ部位は、特にＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である。組換え部位は、コアまたはスペーサー領域によって分離される左右のアームを含み得る。ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間における組換え、およびこれに付随する標的における核酸の組込みに際して、組み込まれたＤＮＡに隣接する組換え部位は、「ａｔｔＬ」および「ａｔｔＲ」と称される。
【0028】
「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、転写を適切に開始するために必要とされるプロモーターの最小限の部分であるコアプロモーターを含み、調節エレメント、例えば転写因子結合部位もまた含み得る。調節エレメントは、転写を促進してもよく、転写を阻害してもよい。プロモーターにおける調節エレメントは、転写アクチベーターまたは転写リプレッサーの結合部位であり得る。プロモーターは、構成的であっても、誘導性であってもよい。構成的プロモーターは、常に活性であり、かつ／または転写の基礎レベルを超える遺伝子の転写を定常的に指示するプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、細胞に添加されるか、または細胞において発現される分子または因子によって誘導されることが可能なプロモーターである。誘導性プロモーターは、誘導の非存在下でも基礎レベルの転写を産生し得るが、誘導は、典型的に、そのタンパク質の有意により多い産生をもたらす。
【0029】
「プロモーター－レポーターコンストラクト」とは、レポーター遺伝子の転写を駆動するプロモーターであって、次にレポーター遺伝子がレポータータンパク質に翻訳される、プロモーターを含有するＤＮＡベクターまたはプラスミドを指す。「レポーター」または「レポータータンパク質」は、その発現が細胞事象、例えば感染などの細胞事象に相関しているタンパク質である。レポータータンパク質の発現は、様々な方法を使用して測定することができ、発現されるレポータータンパク質の種類に依存する。
【0030】
「トランス活性化」という用語は、本明細書において使用される場合、調節遺伝子によってコードされる因子であって、その調節遺伝子が、その因子が結合および活性化する遺伝子配列と必ずしも連続していない、因子による遺伝子配列の活性化を指す。
【0031】
「単一サイクル感染性ウイルス」は、不能化感染性単一サイクル（ＤＩＳＣ）ウイルスとも称され、ウイルスゲノム合成、アセンブリーおよび／もしくはウイルス粒子放出または新しい宿主細胞の再感染に関与する１つまたは複数の必須機能が欠損しているウイルスである。そのようなウイルスは、失われている遺伝子産物またはその機能をトランスで提供する補完的な細胞系において繁殖される。
【0032】
哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された組換え配列を含む遺伝子改変哺乳動物細胞が、本明細書において開示される。組換え配列は、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む。遺伝子改変Ｖｅｒｏ細胞を含む細胞系もまた開示される。
【0033】
使用される哺乳動物細胞の種類は、特に限定されない。一態様において、細胞は、上皮細胞またはリンパ腫細胞である。一態様において、上皮細胞はＶｅｒｏ細胞である。一態様において、リンパ腫細胞はＲＭＡ細胞である。
【0034】
ａｔｔＢ配列（本明細書において互換的に「ａｔｔＢ部位」とも称される）は、Ｖｅｒｏ細胞ゲノム内の所定の標的遺伝子座上の規定の標的部位に挿入され得る。ａｔｔＢ部位および標的遺伝子座の数は限定されず、ａｔｔＢ部位は哺乳動物細胞ゲノム内の単一の標的遺伝子座に挿入されてもよく、複数の（すなわち、２つ以上の）標的遺伝子座に挿入されてもよい。ａｔｔＢ部位は、標的遺伝子座の単一の標的部位において挿入されてもよく、複数の部位（すなわち、２つ以上の部位）において挿入されてもよい。
【0035】
一態様において、哺乳動物細胞はＶｅｒｏ細胞であり、標的遺伝子座は、Ｖｅｒｏ細胞ゲノムの第６染色体上に位置するアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）を含む。一態様において、ａｔｔＢ配列は、遺伝子改変Ｖｅｒｏ細胞のゲノムの第６染色体のＡＡＶＳ１遺伝子座の１５２９位と１５３０位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２１５５位と２１５６位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２４０８位と２４０９位との間、またはそれらの組合せに挿入される。一態様において、組換え配列を含むＡＡＶＳ１遺伝子座は、配列番号２２の４キロベースの配列を有する。
【0036】
また、Ｖｅｒｏ細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入されたスメグマ菌由来のａｔｔＢ配列を含む遺伝子改変哺乳動物細胞を産生する方法が、本明細書において開示される。方法は、標的遺伝子座上の標的部位とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼとを含む複合体を提供することと；ａｔｔＢ配列を含む一本鎖ＤＮＡ配列を提供することと；複合体および一本鎖ＤＮＡ配列を哺乳動物細胞へ導入して、標的遺伝子座に挿入されたａｔｔＢ配列を含む哺乳動物細胞を得ることとを含む。一態様において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的部位とｇＲＮＡとのハイブリダイズに際して、ＡＡＶＳ１遺伝子座における標的部位においてＤＮＡ切断を触媒する。
【0037】
遺伝子改変哺乳動物細胞および哺乳動物細胞系の生成は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの使用を含む。ＣＲＩＳＰＲとは、細菌および古細菌によって適応防御のために使用されるＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ＩＩ型システムを指す。Ｃａｓ９とは、エンドヌクレアーゼ酵素であるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９を指す。このシステムは、細菌および古細菌が、例えばウイルスまたはプラスミド由来の外来性核酸を、配列特異的様式で検出およびサイレンシングすることを可能にする。ＩＩ型システムにおいて、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）はＣａｓ９と相互作用し、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性が、ｇＲＮＡに存在する配列に相補的なＤＮＡ配列を標的化するように方向付ける。ｇＲＮＡは標的ＤＮＡの相補的配列と塩基対形成し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性は標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断部位を生成する。
【0038】
本質的に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼならびに２つのＲＮＡ種：ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に結合し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を標的ＤＮＡ遺伝子座へ方向付けるガイドＲＮＡのヌクレオチド配列を含む。ｃｒＲＮＡヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列に相補的な部分と、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に相補的な追加のエレメントとを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡにハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質に結合し、活性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を提供する。ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとを一緒に融合して単一のＲＮＡ分子に組み合わせた、標的ＤＮＡのＣａｓ９媒介性切断を方向付けることができる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）種であってもよい。したがって、ｓｇＲＮＡ種は、Ｃａｓ９結合およびヌクレアーゼ活性に必要な配列と、目的の標的ＤＮＡに相補的な標的配列とを含有する。代わりに、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが分離している２部分ガイドＲＮＡもまた用いることができる。
【0039】
「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体」という用語は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質と複合体形成したガイドポリヌクレオチドを含む複合体を指す。最も単純な形態においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の形成は、標的ポリヌクレオチドにおけるまたは標的ポリヌクレオチドに近い（例えば標的ポリヌクレオチドから１～２０塩基対以内の）１つまたは両方のポリヌクレオチド鎖の切断をもたらす。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の形成は、典型的に、標的配列の３塩基対上流（５’）の１つまたは両方のポリヌクレオチド鎖の切断をもたらす。
【0040】
本開示において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡに組換え部位としてａｔｔＢ部位を挿入するために使用される。ａｔｔＢ部位は、Ｂｘｂ１ファージがＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位を介して組み込まれる、スメグマ菌由来のＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である［Barletta, R.G. et al., J Gen Microbiol, 1992. 138(1): p. 23-30；Mediavilla, J. et al., Mol Microbiol, 2000. 38(5): p. 955-70；Ghosh, P. et al., Mol Cell, 2003. 12(5): p. 1101-11；Nkrumah, L.J. et al., at Methods, 2006. 3(8): p. 615-21；およびOhja, A., et al., Cell, 2005. 123(5): p. 861-73］。
【0041】
本開示の態様において、哺乳動物細胞はＶｅｒｏ細胞である。Ｖｅｒｏ細胞は、１９６２年に日本の千葉の千葉大学の安村（Ｙａｓａｍｕｒａ）および川喜多によって正常成体アフリカミドリザル［クロロセブス・セバエウス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ Ｓｅｂａｅｕｓ）］の腎臓から単離されたＶｅｒｏ細胞系由来の腎臓上皮である。Ｖｅｒｏ細胞は、ゲノム内の標的遺伝子座における正確に規定された位置（標的部位）においてａｔｔＢ遺伝子組込み部位を含有するように操作されている。Ｖｅｒｏ細胞におけるａｔｔＢ遺伝子組込み部位の挿入のために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、標的遺伝子座内の正確な位置に二本鎖ＤＮＡ切断部位を導入するように設計され、Ｖｅｒｏ細胞にトランスフェクトされる。標的遺伝子座上の標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断部位を作出する少なくとも１つのガイドＲＮＡが設計される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、ガイドＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼとを、複合体を形成するために好適な条件下において組み合わせることによって形成される。形成されると、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、ａｔｔＢ部位を含む一本鎖ＤＮＡ配列と組み合わせられ、Ｖｅｒｏ細胞にコトランスフェクトされて、損傷したＤＮＡを切除する（「切断および貼り付け」作業と類似する）。このようにして、ａｔｔＢ部位は、標的遺伝子座上の標的部位に挿入される。
【0042】
一態様において、標的遺伝子座は、アデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）遺伝子座である。ＡＡＶＳ１遺伝子座［ヒトの「ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ」遺伝子座；Mali et al, Science, 2013 Fe. 15; 339 (6121):823-826］のクロロセブス・セバエウスオルソログは、Ｖｅｒｏ細胞において特定された。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＡＡＶＳ１遺伝子座内の正確な位置において二本鎖ＤＮＡ切断部位を導入するように設計され、Ｖｅｒｏ細胞にトランスフェクトされた。３種の合成ｓｇＲＮＡ：（１）Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列の１５２９位と１５３０位との間に二本鎖切断部位を作出するｓｇＲＮＡ、（２）Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列の２１５５位と２１５６位との間に二本鎖切断部位を作出するｓｇＲＮＡ、および（３）Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列の２４０８位と２４０９位との間に二本鎖切断部位を作出するｓｇＲＮＡは、ＡＡＶＳ１遺伝子座において二本鎖ＤＮＡ切断部位を作出するように設計された。一態様において、Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１の１５２９位と１５３０位との間に二本鎖切断部位を作出するｓｇＲＮＡは、配列番号１０の配列を有する。一態様において、Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１の２１５５位と２１５６位との間に二本鎖切断部位を作出するｓｇＲＮＡは、配列番号２０の配列を有する。一態様において、Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１の２４０８位と２４０９位との間に二本鎖切断部位を作出するｓｇＲＮＡは、配列番号２１の配列を有する。
【0043】
一態様において、複合体（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体）は、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼとを、複合体を形成するために好適な条件下において組み合わせることによって形成される。形成されると、複合体は、ａｔｔＢ部位を含む一本鎖ＤＮＡ配列（一本鎖ＤＮＡ修復鋳型）と組み合わせられる。ａｔｔＢ配列を含有する一本鎖ＤＮＡ配列は、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体と共に、Ｖｅｒｏ細胞にコトランスフェクトされる。一態様において、一本鎖ＤＮＡ配列は、Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１上流および下流配列が両側に隣接する、スメグマ菌由来の３８ヌクレオチドのａｔｔＢ配列を含む。一態様において、一本鎖ＤＮＡ配列は、配列番号１の配列を有する。編集された細胞が所望の位置にａｔｔＢ配列を含有することの確認は、ＰＣＲおよびサンガー配列解析によって達成される。コトランスフェクションはエレクトロポレーション法によって促進することができるが、これに限定されない。一態様において、ａｔｔＢ部位は、ＡＡＶＳ１遺伝子座上の標的部位において挿入される。一態様において、標的部位は、ＡＡＶＳ１遺伝子座の１５２９位と１５３０位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２１５５位と２１５６位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２４０８位と２４０９位との間、またはそれらの組合せに存在する。
【0044】
ａｔｔＢ組換え部位を含有する遺伝子改変Ｖｅｒｏ細胞、および対応する細胞系は、本明細書において「Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞」または「Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞系」と称される。一態様において、Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞を含むＶｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞系が提供される。一態様において、Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞系は、Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞から本質的になるかまたはからなる。
【0045】
また、哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞であって、異種の核酸がトランスジェニック哺乳動物細胞（ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｍｍａｌｉａｎ）による発現のために構成された異種の遺伝子を含む、トランスジェニック哺乳動物細胞が、本明細書において開示される。また、トランスジェニック哺乳動物細胞を含む細胞系が開示される。一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞は、トランスジェニック哺乳動物細胞ゲノム内の標的遺伝子座に安定して挿入された少なくとも１つの異種の遺伝子を含む。トランスジェニック哺乳動物細胞における異種の核酸の発現は、構成的、誘導性またはそれらの組合せであり得る。
【0046】
また、本開示は、哺乳動物細胞ゲノムの標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞を産生する方法を提供する。一態様において、哺乳動物細胞はＶｅｒｏ細胞であり、核酸はＶｅｒｏ細胞ゲノムの第６染色体に組み込まれる。方法は、哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された第１の組換え配列を含む遺伝子改変哺乳動物細胞（例えば、Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞）を提供することであって、第１の組換え配列がスメグマ菌由来のａｔｔＢ配列を含む（例えば、Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞）、提供することと；異種の遺伝子とバクテリオファージＢｘｂ１由来のａｔｔＰ配列を含む第２の組換え配列とを含む異種の核酸を提供することと；バクテリオファージＢｘｂ１インテグラーゼと核局在化配列とをコードするｍＲＮＡを提供することと；遺伝子改変哺乳動物細胞を、異種の核酸およびｍＲＮＡと接触させることと；Ｂｘｂ１インテグラーゼによって媒介される配列特異的組換えによって、異種の核酸を標的遺伝子座における第１の組換え配列に組み込んで、トランスジェニック哺乳動物細胞を産生することとを含む。一態様において、接触させることは、異種の核酸およびｍＲＮＡを、第１の組換え配列を含む遺伝子改変Ｖｅｒｏ細胞に導入することを含む。
【0047】
本開示において、Ｂｘｂ１組込みシステムは、トランスジェニック哺乳動物細胞および対応する哺乳動物細胞系を生成するために使用される。本明細書において開示される通り、トランスジェニック哺乳動物細胞は、細胞ゲノムの標的遺伝子座においてａｔｔＢ遺伝子組込み部位を含有する遺伝子改変細胞のさらなる遺伝子改変によって産生され、この組込み部位へ、補完的な遺伝子が高効率で容易に挿入される。
【0048】
Ｂｘｂ１組込みシステムは、（１）スメグマ菌由来の３８塩基対（ｂｐ）ａｔｔＢ配列（ＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＴＣＴＣＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＣＡＴ；配列番号２）、（２）バクテリオファージＢｘｂ１由来の４８塩基対ａｔｔＰ配列（ＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＡＣＧＧＴＡＣＡＡＡＣＣ；配列番号３）および（３）バクテリオファージＢｘｂ１セリンインテグラーゼ（Ｂｘｂ１インテグラーゼ）からなる。Ｂｘｂ１組込みシステムは、その標的ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の組換えを開始および完了するためにＢｘｂ１セリンインテグラーゼ酵素のみを必要とする高効率組換えシステムであることが実証されている。（Xu, et al. BMC Biotechnol, 2013. 13: p. 87）。
【0049】
Ｂｘｂ１マイコバクテリオファージによって産生されるＢｘｂ１インテグラーゼは、同一ではないファージ（ａｔｔＰ）結合部位と細菌（ａｔｔＢ）結合部位との間の組換えを媒介する。ａｔｔＢおよびａｔｔＰ標的部位の各々は、逆反復が両側に隣接する組込みコアを含有する。Ｂｘｂ１セリンインテグラーゼによって促進された組換えは、ａｔｔＢ標的部位における遺伝子改変をもたらす。このようにして、哺乳動物細胞におけるａｔｔＢ配列の組込みは、特異的ファージ結合（ａｔｔＰ）配列を含有するＤＮＡのための挿入部位として作用する。このことは、ａｔｔＢ配列を含有する細胞（例えば、Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ）が、Ｂｘｂ１セリンインテグラーゼによって媒介される、特定のファージ結合（ａｔｔＰ）配列を含有する異種の核酸分子の組込み／挿入のための基質として作用することを可能にする。
【0050】
ａｔｔＢとａｔｔＰとの間の組換えは、追加の成分を伴わずにＢｘｂ１インテグラーゼによって組み換えることができないハイブリッド部位ａｔｔＬおよびａｔｔＲの形成をもたらす。以前に組み込まれた核酸配列の切除を媒介するためには、ＲＤＦ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）と呼ばれるファージにコードされる別のタンパク質が、Ｂｘｂ１インテグラーゼに加えて必要とされる。しかしながら、ＲＤＦを伴わないＢｘｂ１インテグラーゼ単独の存在下においては、組込み反応は一方向性であり、宿主共同因子を必要としない。したがって、異種の核酸分子の組込み後、トランスジェニック哺乳動物細胞は、組み込まれた異種の核酸の第１の末端に隣接するａｔｔＬ配列と、組み込まれた異種の核酸分子の第２の末端に隣接するａｔｔＲ配列とを含む。
【0051】
ａｔｔＢおよび／またはａｔｔＰ部位は、例えばそれらの各々のコア配列の突然変異によって、組換え効率を増加するように、かつ／またはＢｘｂ１セリンインテグラーゼの結合親和性を増加するように改変することができる。一態様において、ａｔｔＢ部位は、配列番号２に９５％、または９８％、または９９％、または１００％相同の核酸配列を有する。一態様において、ａｔｔＰ部位は、配列番号３に９５％、または９８％、または９９％、または１００％相同の核酸配列を有する。
【0052】
ａｔｔＬ部位または配列は、ＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＡＣＧＧＴＡＣＡＡＡＣＣ（配列番号２９）の核酸配列を有する。一態様において、ａｔｔＲ部位または配列は、ＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＣＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＣＡＴ（配列番号３０）の核酸配列を有する。
【0053】
ａｔｔＢ部位を含有する哺乳動物細胞（ａｔｔＢ含有細胞）のゲノムＤＮＡにおいて異種の核酸の部位特異的組込みを促進するために、ａｔｔＢ含有細胞を、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、およびＨＳＶ遺伝子とａｔｔＰ配列とを含む異種の核酸と接触させる。Ｂｘｂ１インテグラーゼは、細胞にトランスフェクトされる、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡ配列によって、ａｔｔＢ含有細胞に導入される。特に、異種の核酸（ＤＮＡ配列）、およびＢｘｂ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡ配列は、ａｔｔＢ含有細胞にコトランスフェクトされる。また、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡは、核局在化配列／シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列を含み得る。ＮＬＳは、細胞質から核へのタンパク質（合成されたＢｘｂ１インテグラーゼ）の輸送を媒介するシグナルとして作用する短鎖ペプチド（例えば、４～２０個のアミノ酸）である。ＮＬＳ配列は公知であり、ウイルスタンパク質内に存在する配列、例えばＨＩＶ－２、インフルエンザウイルス、アデノウイルスおよび／またはシミアンウイルス－４０（ＳＶ－４０）由来の配列を含む。一態様において、ＮＬＳは、核局在化を標的化する１０個のアミノ酸のペプチドである。一態様において、ＮＬＳはＳＶ－４０由来のＮＬＳである。
【0054】
一態様において、ｍＲＮＡ配列は、Ｂｘｂ１インテグラーゼおよび核局在化配列をコードする。一態様において、ｍＲＮＡは、プロモーター、Ｔ７プロモーターの下流にＢｘｂ１インテグラーゼ遺伝子およびＳＶ４０核局在化配列を含有するプラスミドからインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で合成される。一態様において、ａｔｔＰ含有プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において増幅される。ａｔｔＰ部位を含む異種の核酸がｍＲＮＡとコトランスフェクトされる場合、ｍＲＮＡは、アミノ末端に核局在化ペプチドを有するＢｘｂ１インテグラーゼに翻訳され、異種の核酸を伴うＢｘｂ１インテグラーゼの核への進入を可能にし、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ組込み反応をもたらす。
【0055】
異種の核酸の挿入／組込みのための標的遺伝子座および／または標的部位は、ａｔｔＢ配列が哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれている位置によって規定される。ａｔｔＢ配列の標的部位および／または標的遺伝子座は限定されない。一態様において、異種の核酸は、単一の標的遺伝子座に、または複数の標的遺伝子座に挿入される。一態様において、異種の核酸は、標的遺伝子座における単一の標的部位に、または標的遺伝子座における複数の部位に挿入される。
【0056】
一態様において、哺乳動物細胞はＶｅｒｏ細胞であり、異種の核酸の挿入／組込みのための標的遺伝子座はＶｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞の第６染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座を含む。特に、異種の核酸は、ＡＡＶＳ１遺伝子座内の特定の位置（標的部位）において組み込まれ／挿入される。一態様において、異種の核酸は、ＡＡＶＳ１遺伝子座の１５２９位と１５３０位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２１５５位と２１５６位との間、ＡＡＶＳ１遺伝子座の２４０８位と２４０９位との間、またはそれらの組合せに挿入され得る。一態様において、異種の核酸は、ＡＡＶＳ１遺伝子座の１５２９位と１５３０位との間に挿入される。
【0057】
異種の核酸は、ａｔｔＢ含有細胞のａｔｔＢ部位におけるその挿入を促進するように設計される。そのようにするために、異種の核酸は、バクテリオファージＢｘｂ１由来のａｔｔＰ配列を含む組換え配列を含む。
【0058】
また、異種の核酸は、哺乳動物細胞のゲノムにおける組込み後、異種の遺伝子の発現を促進するように設計される。一態様において、異種の核酸は、異種の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは異種の遺伝子からの一次転写物の合成を駆動する。例示的なプロモーターとして、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターおよび合成プロモーターが挙げられる。
【0059】
また、他の有用なエレメントが、異種の核酸に含まれ得る。例えば、異種の核酸は、選択可能マーカーをコードする遺伝子、細菌複製起源、ウイルス複製起源またはそれらの組合せをさらに含み得る。また、異種の核酸は、ＷＰＲＥ、大腸菌コスミド配列（ｃｏｓ配列）、細菌プロモーター、膜貫通ドメインおよび／またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような、導入遺伝子発現をモジュレートするか、または抗原のクローニングを改善するために使用され得る他の配列を含み得る。膜貫通ドメイン、例えば、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメインは、異種の遺伝子に融合されるか、または異種の遺伝子と共に使用されて、細胞膜表面上での異種の遺伝子産物の発現を可能にし得る。ポリＡシグナル配列はポリアデニル化および転写終止を促進し、異種の遺伝子の下流に位置する。例示的なポリＡシグナル配列として、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｈＧＨｐＡ）、免疫グロブリンカッパシグナルおよびウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル（ｒｂＧｌｏｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0060】
異種の遺伝子の発現は、選択可能マーカーをコードする遺伝子（本明細書において「レポーター遺伝子」および「レポータータンパク質」とも称される）の発現に基づいて定性的かつ／または定量的に評価され得る。一態様において、異種の核酸は、異種の遺伝子に作動可能に連結された選択可能マーカーをさらに含む。選択可能マーカーをコードする遺伝子は、異種のポリペプチドをコードする遺伝子の上流および／または下流に挿入することができる。一態様において、選択可能マーカー遺伝子は、異種のポリペプチドをコードする遺伝子の下流に挿入される。一態様において、選択可能マーカーは、プロモーターに、および異種のポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結される。選択可能マーカーは、それを発現する細胞から識別でき、かつ容易に測定することができる視覚的に特定可能な特徴を誘導し得る。代わりに、選択可能マーカーは、選択剤の存在下において増殖する能力を宿主細胞に与えるマーカー、または必要とされる栄養素の非存在下において増殖する能力を宿主細胞に与えるマーカーであり得る。
【0061】
選択可能マーカーをコードする遺伝子の非限定的な例として、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、蛍光タンパク質、発光タンパク質、ｈｉｓＤまたはそれらの組合せをコードする遺伝子が挙げられる。一態様において、選択可能マーカーは、ネズミチフス菌由来のｈｉｓＤをコードする遺伝子である。
【0062】
一態様において、選択可能マーカーはネズミチフス菌ｈｉｓＤ遺伝子であり得る。有利に、異種の核酸は、抗生物質耐性マーカー、ＳＶ４０配列またはそれらの組合せを含有しない。したがって、一態様において、また、トランスジェニック哺乳動物細胞は、抗生物質耐性マーカー、ＳＶ４０配列またはそれらの組合せを含有しない。一態様において、ＳＶ４０配列はＳＶ４０複製起源である。
【0063】
一態様において、異種の核酸はプラスミドである。一態様において、プラスミドは、ａｔｔＰ部位、プロモーター、プロモーターに作動可能に連結された異種の遺伝子および選択可能マーカー（例えば、ｈｉｓＤ遺伝子）を含む。プラスミドは、ａｔｔＢ含有細胞にトランスフェクトされ、ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の部位特異的組換えによってゲノムに組み込まれる。一態様において、プラスミドは、抗生物質耐性マーカー、ＳＶ４０配列またはそれらの組合せを含まないかまたは含有しない。一態様において、プラスミドは、抗生物質耐性マーカーおよびＳＶ４０配列を欠く（これらを含まないかまたは含有しない）。
【0064】
本開示は、哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞であって、異種の核酸がトランスジェニック哺乳動物細胞による発現のために構成された異種の遺伝子を含む、トランスジェニック哺乳動物細胞を提供する。一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞は、標的遺伝子座に挿入された少なくとも１コピーの異種の核酸を含む。一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞は、標的遺伝子座に挿入された１～５０コピーの、または１～２０コピーの、または１～１０コピーの異種の核酸を含む。
【0065】
一態様において、異種の核酸は、ウイルス遺伝子、レポーター遺伝子またはそれらの組合せを含む異種の遺伝子を含む。
【0066】
挿入されたＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む細胞系は、単一サイクル感染性ウイルスの増殖を補完し、かつ繁殖を促進するトランスジェニック細胞系を開発するために使用することができる。一態様において、異種の核酸はウイルス遺伝子を含む。ウイルス遺伝子は、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスまたはそれらの組合せ由来であり得る。ウイルス遺伝子は、単一のウイルス遺伝子またはウイルス遺伝子の組合せを含み得る。ウイルス遺伝子は、ウイルス遺伝子からの一次転写物の合成を駆動するプロモーターに作動可能に連結される。トランスジェニック哺乳動物細胞および対応する細胞系は、異種の核酸によりコードされるウイルス遺伝子を安定して発現する。一態様において、プロモーターは構成的プロモーターであり、ウイルス遺伝子はトランスジェニック哺乳動物細胞により構成的に発現される。一態様において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＫＧ１）プロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ベータアクチンプロモーターまたはそれらの組合せを含む。
【0067】
ウイルス遺伝子は、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、天然痘、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、日本脳炎ウイルス、出血熱ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、ジカウイルス、デングウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、インフルエンザＡウイルスまたはそれらの組合せ由来の遺伝子を含み得る。ウイルス遺伝子は限定されず、哺乳動物細胞において発現することができる任意のウイルス遺伝子であり得る。
【0068】
ウイルス遺伝子は、必須遺伝子、非必須遺伝子、または必須遺伝子と非必須遺伝子との組合せであり得る。「必須遺伝子」とは、ウイルスの複製および新しい感染性ウイルス粒子またはビリオンの産生（ウイルスの増殖）に必要とされるウイルスゲノムによってコードされる遺伝子を指す。一態様において、ウイルス遺伝子は必須遺伝子である。
【0069】
一態様において、異種の核酸はＨＳＶ遺伝子を含む。ＨＳＶ遺伝子は、単一のＨＳＶ遺伝子またはＨＳＶ遺伝子の組合せであり得る。一態様において、異種の核酸は少なくとも１つのＨＳＶ遺伝子を含む。一態様において、異種の核酸は、少なくとも２または少なくとも３または少なくとも４つのＨＳＶ遺伝子を含む。ＨＳＶ遺伝子は、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）またはそれらの組合せ由来（ＨＳＶ－１由来の遺伝子およびＨＳＶ－２由来の遺伝子）であり得る。一態様において、ＨＳＶ遺伝子は、ＨＳＶ必須遺伝子、またはＨＳＶ必須遺伝子とＨＳＶ非必須遺伝子との組合せを含む。ＨＳＶゲノムは、必須または非必須のいずれかとして分類することができるおよそ９０種の様々な遺伝子をコードする。一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞および対応する細胞系は、異種の核酸によってコードされるＨＳＶ遺伝子を安定して発現し、対応するＨＳＶ遺伝子のゲノム改変を含む単一サイクル感染性ＨＳＶウイルスの複製を支持する（補完する）。一態様において、ゲノム改変は、ＨＳＶゲノムにおけるＨＳＶ遺伝子の完全なまたは部分的な欠失である。
【0070】
必須ＨＳＶ遺伝子の非限定的な例は、ウイルスの脂質エンベロープに含有されるタンパク質、例えば、グリコプロテインＢ（ｇＢ）、グリコプロテインＣ（ｇＣ）、グリコプロテインＤ（ｇＤ）、グリコプロテインＥ（ｇＥ）、グリコプロテインＧ（ｇＧ）、グリコプロテインＨ（ｇＨ）、グリコプロテインＩ（ｇＩ）、グリコプロテインＪ（ｇＪ）、グリコプロテインＫ（ｇＫ）、グリコプロテインＬ（ｇＬ）、グリコプロテインＭ（ｇＭ）、グリコプロテインＮ（ｇＮ）、ＵＬ２０、ＵＬ４５、ＵＳ９またはそれらの組合せをコードする遺伝子を含む。一態様において、ＨＳＶ遺伝子は、ｇＤ遺伝子、ｇＧ遺伝子、ｇＩ遺伝子、ｇＪ遺伝子またはそれらの組合せを含む。一態様において、ＨＳＶ遺伝子はグリコプロテインＤを含む。一態様において、ＨＳＶ遺伝子は、グリコプロテインＤ遺伝子、グリコプロテインＧ遺伝子、グリコプロテインＩ遺伝子、グリコプロテインＪ遺伝子またはそれらの組合せを含む。一態様において、ＨＳＶ遺伝子は、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）グリコプロテインＤ遺伝子、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）グリコプロテインＤ遺伝子またはそれらの組合せを含む。
【0071】
一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞はＶｅｒｏ細胞であり、ＨＳＶ－１グリコプロテインＤ遺伝子、ＨＳＶ－２グリコプロテインＤ遺伝子またはそれらの組合せを含む。一態様において、異種の核酸は、ＨＳＶ－１ ｇＤ、ｇＤ、ｇＪおよびｇＩ遺伝子を含む１３．９ｋＢ配列であり、配列番号１９に対応する配列を有する。ａｔｔＢ部位に挿入されたＨＳＶ－１グリコプロテイン遺伝子を含むこれらのトランスジェニックＶｅｒｏ細胞、および対応する細胞系は、本明細書において「ＶＤ６０Ｌ細胞」または「ＶＤ６０Ｌ細胞系」と称される。一態様において、ＶＤ６０Ｌ細胞系は、ＶＤ６０Ｌ細胞から本質的になるかまたはからなる。ＶＤ６０Ｌ細胞は、ＨＳＶ－１グリコプロテイン遺伝子を安定して発現し、１つまたは複数のこれらの遺伝子のうちのゲノム欠失を含有する遺伝子改変単一サイクル感染性ＨＳＶ－１株を補完する。ゲノム欠失は、完全な欠失であっても、部分的な欠失であってもよい。一態様において、ＶＤ６０Ｌ細胞は、ＨＳＶ－２ ｇＤ遺伝子のゲノム欠失（ΔｇＤ－２）を含有する単一サイクル感染性ＨＳＶ－２株を補完する。ＶＤ６０Ｌ細胞および対応する細胞系は規定の条件下において産生および維持されるので、ウイルスの産生に伴う任意の潜在的な安全性の懸念は最小限になる。
【0072】
必須遺伝子の欠失を有するゲノムを含む単一サイクル感染性ウイルスを繁殖させる方法であって、Ｖｅｒｏ細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に挿入された少なくとも１コピーの必須遺伝子を含むトランスジェニックＶｅｒｏ細胞を提供することであって、トランスジェニックＶｅｒｏ細胞が必須遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する、提供することと；トランスジェニックＶｅｒｏ細胞を単一サイクル感染性ウイルスと接触させることと；単一サイクル感染性ウイルスを、トランスジェニックＶｅｒｏ細胞において発現されたタンパク質により補完して、単一サイクル感染性ウイルスを繁殖させることとを含む方法が、本明細書において開示される。一態様において、標的遺伝子座は、Ｖｅｒｏ細胞ゲノムの第６染色体上のアデノ随伴ウイルス組込み部位（ＡＡＶＳ１）を含む。
【0073】
単一サイクル感染性ウイルスは、近隣の感染していない細胞へ拡がることができる成熟ビリオンの形成を妨げるように遺伝子改変されているウイルスである。単一サイクル感染性ウイルスは、宿主細胞の初期感染後に感染性ウイルス粒子を形成することができず、単一ラウンドのみの複製および感染を起こす。遺伝子改変は、典型的に、必須ウイルス遺伝子について行われ、宿主細胞における成熟ビリオンの形成を有効に妨げる、ウイルス遺伝子の完全なもしくは部分的な欠失、またはウイルス遺伝子の突然変異であり得る。その結果、単一サイクル感染性ウイルスは、失われている遺伝子が、操作された細胞（補完的な細胞）によってトランスで供給された場合のみ、溶解性感染を確立し、繁殖することができる。一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞はウイルス遺伝子を安定して発現し、同じ遺伝子の遺伝子改変（例えば、欠失）を有するゲノムを含む単一サイクル感染性ウイルスの複製を表現型的に補完する。この補完の結果として、単一サイクル感染性ウイルスは、トランスジェニック哺乳動物細胞において複製し、新しい感染性ウイルス粒子を産生することができる。トランスジェニック哺乳動物細胞および対応するトランスジェニック哺乳動物細胞系は、規定の条件下において産生および維持されるので、単一サイクル感染性ウイルスの産生に伴ういかなる潜在的な安全性の懸念も最小限である。
【0074】
一態様において、単一サイクル感染性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、天然痘、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、日本脳炎ウイルス、出血熱ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２またはそれらの組合せを含む。
【0075】
一態様において、単一サイクル感染性ウイルスは、必須遺伝子、もしくは必須遺伝子と非必須遺伝子との組合せの部分的なまたは完全な欠失を含む単一サイクル感染性ＨＳＶ（ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２）である。一態様において、欠失したＨＳＶ必須遺伝子は、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ２０、ＵＬ４５、ＵＳ９またはそれらの組合せを含む。一態様において、欠失したＨＳＶ遺伝子は、ｇＤ、ｇＧ、ｇＩ、ｇＪまたはそれらの組合せを含む。一態様において、ＨＳＶ遺伝子は、グリコプロテインＤを含む。一態様において、ＨＳＶ遺伝子は、ｇＤ、ｇＧ、ｇＩおよびｇＪを含む。一態様において、ＨＳＶ遺伝子は、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）グリコプロテインＤ遺伝子、単純ヘルペスウイルス－１（ａ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－１）（ＨＳＶ－２）グリコプロテインＤ遺伝子またはそれらの組合せを含む。
【0076】
一態様において、単一サイクル感染性ＨＳＶは、ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２のゲノムにおけるグリコプロテインＤ遺伝子の欠失を含む単一サイクル感染性ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２である。一態様において、単一サイクル感染性ＨＳＶは、単一サイクル感染性ＨＳＶ－２である。一態様において、単一サイクル感染性ウイルスは、ＨＳＶ－２のゲノムにおけるｇＤ遺伝子の欠失を含むＨＳＶ－２を含む。一態様において、単一サイクル感染性ウイルスＨＳＶは、ｇＤ遺伝子のゲノム欠失を有するΔｇＤ－２株である。一態様において、異種の核酸遺伝子は、トランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞のゲノムに安定して組み込まれ、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）グリコプロテインＤ遺伝子、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－２）グリコプロテインＤ遺伝子またはそれらの組合せを含む。単一サイクル感染性ウイルスＨＳＶ、例えばΔｇＤ－２株を補完することができるＶＤ６０細胞系は、１９８８年にＤａｖｉｄ Ｊｏｈｎｓｏｎによって最初に開発された［Ligas MW & Johnson DC (1988), J Virol 62(5):1486-1494］。簡潔に説明すると、ＨＳＶ－１のＫＯＳ株由来の６ｋｂ ＢａｍＨＩ断片が、ｈｉｓＤ遺伝子を含有する大腸菌プラスミドにライゲートされ、その後、Ｖｅｒｏ細胞へトランスフェクトされた。ΔｇＤ－２：：ＧＦＰウイルスの容易な補完を可能にしたヒスチジノール耐性クローンが単離された［Cheshenko N, et al. (2014) J Virol 88(17):10026-10038；Petro C, et al. (2015), Elife 4］。ＶＤ６０細胞はΔｇＤ－２ウイルスを補完するが、補完するだけでなく、異常な組換えまたは相同組換えの可能性を最小限にする新しい細胞系（ＶＤ６０Ｌ）を提供することが望ましい。ＶＤ６０Ｌ細胞は、ΔｇＤ－２ウイルスを繁殖するため、および試料（例えば、ワクチン調製物のアリコート）中に存在する生存可能な単一サイクルウイルス感染性粒子（例えば、ΔｇＤ－２）の数を検出するために使用することができる。
【0077】
トランスジェニックＶｅｒｏ細胞系において繁殖されたΔｇＤ－２は、対象への投与のために製剤化され得る。ＶＤ６０細胞系において培養されたΔｇＤ－２株の、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２に対する殺ウイルス性免疫を誘発するためのワクチンとしての有効性は実証されている［Petro, C. et al, Elife, 2015, 4；Petro, C.D. et al, JCI Insight, 2016, 1(12)；ＷＯ２０１５／１３４３６８］。したがって、トランスジェニックＶｅｒｏ細胞系において繁殖されたΔｇＤ－２は、対象におけるＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２同時感染を処置または予防するために使用することができる。一態様において、トランスジェニックＶｅｒｏ細胞系において繁殖されたΔｇＤ－２は、対象におけるＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２同時感染によって引き起こされる疾患を処置または予防するために使用することができる。
【0078】
一態様において、培養した（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄまたはｃｕｌｔｕｒｅｄ）トランスジェニック哺乳動物細胞の、単一サイクル感染性ウイルスとの接触は、単一サイクル感染性ウイルスによるトランスジェニック哺乳動物細胞の感染を促進する条件下において、単一サイクル感染性ウイルスを、培養したトランスジェニック哺乳動物細胞へ添加することを含む。トランスジェニック哺乳動物細胞を単一サイクル感染性ウイルスに感染させるために使用される条件は限定されず、任意の好適な条件を使用することができる。一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞はＶＤ６０Ｌ細胞である。
【0079】
一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞における単一サイクル感染性ウイルスの繁殖は、感染したトランスジェニック哺乳動物細胞を、単一サイクル感染性ＨＳＶの産生を最大限にするために好適な期間および好適な条件（例えば、温度、相対湿度、ＣＯ２雰囲気）下において培養することをさらに含む。単一サイクル感染性ウイルスの最大産生をもたらす条件は変動し、限定されず、例えば、感染した細胞を、３７℃の温度において５％のＣＯ２雰囲気にて所定の時間間隔培養することを含み得る。
【0080】
一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞は、挿入された異種の核酸によってコードされる選択マーカーを含む。一態様において、方法は、選択培地においてトランスジェニック哺乳動物細胞を培養することをさらに含む。一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞はｈｉｓＤを選択マーカーとして含み、選択培地はヒスチジノールを含む。培養培地中のヒスチジノールの量は限定されず、過度の実験を伴うことなく当業者が決定することができる。
【0081】
また、挿入されたＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列を含む遺伝子改変哺乳動物細胞（ａｔｔＢ含有細胞）は、試料中に存在する生存可能な単一サイクル感染性ウイルスを迅速に検出し、かつ／またはその量を定量するトランスジェニック哺乳動物細胞系を開発するために使用することができる。そのようなトランスジェニック哺乳動物細胞系は、ウイルスプロモーターに融合されたレポーター遺伝子を含有し、レポーター遺伝子は、トランスでウイルスプロモーターを活性化することができるウイルスに細胞が感染した際に発現される。一態様において、異種の遺伝子は、ウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子である。
【0082】
レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質、発光タンパク質またはそれらの組合せをコードし得る。非限定的な例として、ルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ（ｎａｎｏＬｕｃ）、ベータ－ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質、（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、モノマー赤外蛍光タンパク質（ｍＩＦＰ）、ＬｓｓｍＯｒａｎｇｅ（Ｌｏｎｇ Ｓｔｏｋｅｓ Ｓｈｉｆｔ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｏｒａｎｇｅ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＴａｇＲＦＰ６５７（Ｔａｇ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ６５７）、ｍＯｒａｎｇｅ２（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｏｒａｎｇｅ２）、ｍＡｐｐｌｅ（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｐｐｌｅ）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｍＴａｇＢＦＰ２（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｔａｇ Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｃｈｅｒｒｙ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｃｅｒｕｌｅａｎ３）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）またはそれらの組合せが挙げられる。しかしながら、レポーター遺伝子はこれらに限定されず、他の好適なレポーター遺伝子もまた使用することができる。
【0083】
ウイルスプロモーターのトランス活性化がレポーター遺伝子によってコードされるレポータータンパク質の発現をもたらすように、ウイルスプロモーターは、レポーター遺伝子に作動可能に連結され得る。例えば、異種の核酸は、プロモーター－レポーターコンストラクトを含み得る。特に、プロモーターは、ウイルスの調節遺伝子によってコードされ、かつウイルスプロモーターに特異的である因子によってトランス活性化される。プロモーターは誘導性プロモーターであり、プロモーターを作動させることができる遺伝子をコードするウイルスの存在下において作動する。したがって、トランスジェニック哺乳動物細胞が、ウイルスプロモーターをトランス活性化することができるウイルスと接触し、これに感染した場合、ウイルスはウイルスプロモーターをトランス活性化し、トランスジェニック哺乳動物細胞におけるレポーター遺伝子の発現を誘導する。このようにして、試料中に存在する感染性ウイルス粒子の数は、レポータータンパク質を発現する細胞の数を定量することによって測定することができる。感染した細胞におけるレポータータンパク質の発現は、感染していない細胞において検出された蛍光のバックグラウンドレベルと比較され得る。レポータータンパク質の発現は、免疫蛍光細胞を検出および定量するために好適な任意の方法、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光顕微鏡法などの方法を使用して検出することができる。
【0084】
一態様において、ウイルスプロモーターは、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、天然痘、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、日本脳炎ウイルス、出血熱ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２またはそれらの組合せ由来であり、トランスジェニック哺乳動物細胞が各々のウイルスに感染することによってトランス活性化（誘導）される。
【0085】
一態様において、ウイルスプロモーターは、ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２由来のプロモーターである。ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２プロモーターは、ＩＣＰ０プロモーター、ＩＣＰ４プロモーター、ＩＣＰ２７プロモーター、ＩＣＰ８プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ビリオンタンパク質５（ＶＰ５）プロモーターまたはそれらの組合せを含み得る。
【0086】
単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）複製中の遺伝子発現は、時間的に調節される。ウイルスＤＮＡ複製前に遺伝子発現の初期相が起こり、最初期ウイルスｍＲＮＡは感染全体を通して発現され続ける。遺伝子発現の初期相は、２つの段階：新規のタンパク質合成の非存在下において起こるαまたは最初期（ＩＥ）段階、および少なくともいくつかのＩＥ遺伝子の作動を必要とするβまたは真の初期（Ｅ）段階に分けることができる。ＨＳＶ－１遺伝子発現の後期段階もまた、２つの段階：ウイルスＤＮＡ複製前にわずかに検出することができるβγまたは「漏出性」後期遺伝子、およびウイルスＤＮＡ合成後にのみ検出することができるγ後期（Ｌ）ｍＲＮＡに分けることができる。
【0087】
細胞に進入した後、ＨＳＶカプシドおよび外被は徐々に緩み、分離する。ヌクレオカプシドは核ポアへ輸送され、ウイルスＤＮＡを核へ放出し；ウイルス粒子の外被に存在するＶＰ１６タンパク質は、それ自体は核局在化シグナルを所有しないが、細胞因子ＨＣＦ－１によって核へ輸送される。ＶＰ１６は最初期（ＩＥ）遺伝子プロモーターに結合して、特にＩＥ遺伝子に対して作用するトランス活性化因子としてＩＥ遺伝子の転写を刺激する。ＨＳＶ ＩＥ遺伝子転写は、強力な転写エンハンサー複合体をアセンブルするウイルス（ＶＰ１６）転写因子および細胞（すなわち、ＨＣＦ－１、Ｏｃｔ－１、ＳＰ１およびＧＡＢＰ）転写因子によって媒介される。コアドメインは、２つの細胞タンパク質、Ｏｃｔ－１およびＨＣＦ－１と相互作用して、ウイルスＩＥ遺伝子プロモーターにおける特異的シス調節エレメントにおいてＤＮＡ結合複合体を形成する。ＩＥ発現の主要な駆動因子は、細胞コアクチベーターＨＣＦ－１である。ＨＣＦ－１は、ヒストンデメチラーゼ（ＪＭＪＤ２／ＫＤＭ４およびＬＳＤ１／ＫＤＭ１Ａ）ならびにヒストンＨ３Ｋ４メチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴＤ１ＡおよびＭＬＬ１／ＫＭＴ２Ａ）を含有する複合体の部分として、ＩＥ遺伝子についてアセンブルされるクロマチンをモジュレートすることにおいて重要な役割を果たす。この複合体は、ＩＥプロモーターにおけるヘテロクロマチンのアセンブリーを制限し、活性真性染色質クロマチン状態への移行を促進する。ＨＣＦ－１タンパク質は、溶解性感染性サイクルおよび潜伏からの再活性化の両方についての中心的な調節成分である（Vogel and Kristie, 2013 - doi.org/10.3390/v5051272；Liang et al., 2009-DOI: 10.1038/nm.2051 , 2013-DOI: 10.1126/scitranslmed.3005145）。
【0088】
一部の細胞タンパク質およびウイルスタンパク質、例えば、熱ショックタンパク質９０α（Ｈｓｐ９０α）は、ＶＰ１６によって媒介されるＩＥ遺伝子の転写を調節し得る。ウイルス外被タンパク質ｐＵＬ１４、ＶＰ１１／１２（ＵＬ４６によってコードされる）およびＶＰ１３／１４（ＵＬ４７によってコードされる）は、ＶＰ１６によって媒介されるＩＥ遺伝子転写の効率を向上させることができ、これはＶＰ１６の核入力を促進することにおいて同じ役割を果たし得る（Lee et al., 2008；Yamauchi et al., 2008；Hernandez Duran et al., 2019）。別の外被タンパク質であるプロテインキナーゼＵＳ３は、ウイルスの放出を調節し、リン酸化によって外被からのＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４およびＶＰ１６の解離を促進し、ウイルス遺伝子の転写を開始するためにできるだけ早く核への進入を可能にし得る。（Kato and Kawaguchi, 2018；Hernandez Duran et al., 2019）。ＨＳＶ－１ＩＥタンパク質ＩＣＰ２２は、ＩＥ遺伝子の転写を阻害し得るが、ＶＰ１６は阻害を緩和し得る。ＶＰ１６とＩＣＰ２２との間に直接的な相互作用はないが、ＩＣＰ２２は、これもまたＶＰ１６に結合する様々な転写因子と相互作用することができる。（Cun et al., 2009；Guo et al., 2012）。それゆえ、ＶＰ１６およびＩＣＰ２２によるＩＥ遺伝子の転写調節は、両方の転写因子および関連する転写因子の一部の未知の作用を通して達成され得る。
【0089】
異種の遺伝子としてレポーター遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物細胞は、試料中に存在するウイルスを検出および／もしくは定量するため、ならびに／または保存されたウイルス試料の感染性を決定するために使用することができる。本開示は、細胞に基づくレポーターアッセイを使用して試料中の感染性ウイルスを検出および／または定量する方法を提供する。細胞に基づくレポーターアッセイおよび検出方法は、例えば、哺乳動物細胞の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞であって、異種の核酸がレポーター遺伝子に作動可能に連結されたウイルスプロモーターを含む、トランスジェニック哺乳動物細胞を利用する。
【0090】
一般的に、感染性（つまり、生きている）ウイルスの存在について試料を試験するため、ウイルスを含有することが分かっている試料中に存在する感染性ウイルスの量を定量するため、および／または保存されたウイルス試料の感染性を決定するための上皮細胞、例えばＶｅｒｏ細胞の使用は、プラークアッセイに基づく。プラークアッセイは、細胞のウイルス感染を促進するために好適な条件下で、Ｖｅｒｏ細胞を、ウイルスを含有する試料へ曝露することと；ある期間待機して、ウイルスが細胞内で繁殖して新しい感染性粒子を産生するかどうかを決定することと；個々のプラークをカウントすることによって感染性粒子を定量することとを含む。単一サイクル感染性ウイルスの場合、単一サイクル感染性ウイルスで失われている遺伝子を発現する補完的な細胞が、そのようなアッセイにおいて使用される。しかしながら、ウイルスの効力を測定するそのような方法は、時間および労力の両方を要する。比較的短期間内で行うことができる、試料中のウイルスの量を定量する方法は、非常に有利であろう。
【0091】
本開示は、試料中の感染性ウイルスを定量するための細胞に基づくレポーターアッセイを提供する。細胞に基づくレポーターアッセイは、プロモーター－レポーターコンストラクトを含む異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞を利用する。細胞に基づくレポーターアッセイは、試料中の感染性ウイルスの存在を検出するため、およびウイルス感染性（効力）を測定するために使用することができる。また、細胞に基づくレポーターアッセイは、感染性ウイルスの存在について生体試料を試験するために使用することができる。また、細胞に基づくレポーターアッセイは、効力アッセイとして使用することができる。また、対象からの生体試料において感染性ウイルスを検出するための方法が、本明細書において開示される。本明細書において開示されるアッセイおよび方法は、短期間で行うことができ、試料中に存在するウイルスの量を正確に定量することができる。
【0092】
一態様において、アッセイおよび／または方法において使用されるトランスジェニック哺乳動物細胞を、ウイルスを含むかまたはウイルスを含むことが疑われる試料と接触させる。一態様において、試料は、バルクウイルスの保存前、保存中または保存後にバルクウイルスのバッチから採取される。ウイルスの感染性は保存中に潜在的に減少する場合があり、したがって、予測されるウイルス量が保存後に試験試料中に存在するかどうかを決定する迅速かつ有効な方法、すなわち、経時的な保存中のウイルス安定性を測定する方法を有することは有益である。アッセイ結果は、バルクウイルスをどうするか、例えば、それがさらなる使用（例えば、製造）に好適であるかどうか、またはその代わりにそれを改変もしくは廃棄すべきかどうかを決定するために使用することができる。また、アッセイは、生きているウイルス、例えば単一サイクル感染性ウイルスを含むワクチンのバッチから採取した試料について行うことができ、この場合、アッセイ結果は、バッチをどうするか、例えば、バッチが医療専門家による使用のために利用可能にするのに好適であるかどうかを決定するために使用することができる。
【0093】
一態様において、試料は対象からの生体試料である。一態様において、ウイルスは生体試料中に存在するか、または生体試料中に存在することが疑われる。感染性ウイルスの存在について対象からの生体試料を迅速かつ正確に試験する（スクリーニングする）ことができるアッセイは、対象の迅速な診断および処置を提供することにおいて有益であろう。生体試料は、血清、唾液、血漿、全血、鼻咽頭拭き取り検体、尿、便、呼吸液、脳脊髄液またはそれらの組合せを含み得るが、これらに限定されない。
【0094】
一態様において、接触させることは、トランスジェニック哺乳動物細胞に、試料中に存在するウイルスを感染させることを含む。トランスジェニック哺乳動物細胞の感染後、ウイルスはウイルスプロモーターをトランス活性化し、これは哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子の発現を誘導する。
【0095】
一態様において、ウイルス感染性を測定するための細胞に基づくレポーターアッセイ法は、哺乳動物細胞のゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞を提供することであって、異種の核酸がレポーター遺伝子に作動可能に連結されたウイルスプロモーターを含む、提供することと；トランスジェニック哺乳動物細胞を試料と接触させることであって、試料中に存在する感染性ウイルスがウイルスプロモーターをトランス活性化し、これは哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子の発現を誘導する、接触させることと；レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する哺乳動物細胞の数を定量して、感染性ウイルスを定量することとを含む。
【0096】
一態様において、対象からの生体試料において感染性ウイルスを検出する方法は、対象からの生体試料を、哺乳動物細胞のゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含むトランスジェニック哺乳動物細胞と接触させることであって、異種の核酸がレポーター遺伝子に作動可能に連結されたウイルスプロモーターを含む、接触させることと；トランスジェニック哺乳動物細胞を生体試料と接触させることであって、試料中に存在する感染性ウイルスがウイルスプロモーターをトランス活性化し、これは哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子の発現を誘導する、接触させることと；レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する哺乳動物細胞の数を定量して、感染性ウイルスを定量することとを含む。
【0097】
一態様において、接触させることは、トランスジェニック哺乳動物細胞をウイルスに感染させることを含む。一態様において、細胞に基づくレポーターアッセイおよび／または方法は、トランスジェニック哺乳動物細胞においてレポートされる遺伝子（ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｇｅｎｅ）の発現を誘導することをさらに含む。一態様において、トランスジェニック哺乳動物細胞はＶｅｒｏ細胞であり、標的遺伝子座は、Ｖｅｒｏ細胞ゲノムの第６染色体上のアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）を含む。
【0098】
また、細胞に基づくレポーターアッセイを含む診断方法、または生体試料において感染性ウイルスを検出する方法が、本明細書において開示される。
【0099】
また、本開示は、抗原特異的抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を定量化および特徴付けるために使用することができるトランスジェニック哺乳動物細胞を提供する。
【0100】
一態様において、本開示は、細胞集団におけるＡＤＣＣの割合または量を定量化する方法であって、トランスジェニック哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含む複数のトランスジェニック哺乳動物細胞を提供することであって、異種の核酸が、トランスジェニック哺乳動物細胞の細胞膜上での発現のために構成された異種の抗原遺伝子と、トランスジェニック哺乳動物細胞の細胞質における発現のために構成された蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを含む、提供することと；複数のトランスジェニック哺乳動物細胞を抗体および免疫細胞集団と接触させることと；１つまたは複数の時点において蛍光を呈する複数のトランスジェニック哺乳動物細胞の量を定量化することとを含む方法を提供する。
【0101】
一態様において、本開示は、細胞集団におけるＡＤＣＰの割合または量を定量化する方法であって、トランスジェニック哺乳動物細胞ゲノムの染色体上の標的遺伝子座に安定して組み込まれた異種の核酸を含む複数のトランスジェニック哺乳動物細胞を提供することであって、異種の核酸が、トランスジェニック哺乳動物細胞の細胞膜上での発現のために構成された異種の抗原遺伝子と、トランスジェニック哺乳動物細胞の細胞質における発現のために構成された蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを含む、提供することと；複数のトランスジェニック哺乳動物細胞を抗体および食細胞集団と接触させることと；１つまたは複数の時点において蛍光を呈する食細胞の量を定量化してＡＤＣＰの割合または量を定量化することとを含む方法を提供する。
【0102】
一態様において、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ法のために設計されたトランスジェニック哺乳動物細胞はＲＭＡ細胞である。ＲＭＡ細胞は、Ｃ５７／Ｂｌ６マウス由来のＴ細胞リンパ腫細胞系である。Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位を含む遺伝子改変ＲＭＡ細胞（ＲＭＡ－ａｔｔＢＢｘｂ１）は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡと、ａｔｔＰ部位および抗原をコードする遺伝子を含む異種の核酸とをコトランスフェクトされ得る。抗原をコードする遺伝子は、シグナル配列および膜貫通ドメインに融合され、構成的プロモーターに作動可能に連結され、トランスフェクトした細胞の表面上で発現する。細胞が抗原に加えてレポーター遺伝子もまた発現するように、異種の核酸は構成的プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子をさらに含む。
【0103】
異種の抗原遺伝子は、目的の標的、例えば、ウイルス、細菌、寄生生物に特異的な免疫応答を誘導する抗原をコードする。本明細書において使用される場合、「抗原」とは、対象において目的の標的への免疫応答、例えば、体液性および／または細胞媒介性応答を誘発することができるポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【0104】
異種の抗原遺伝子は、ウイルス、細菌または寄生生物由来の遺伝子であり得る。ウイルスは病原性ウイルスである場合があり、その例として、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、コクサッキーウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、デングウイルス、ドーリウイルス、東部ウマ脳炎（ＥＥＥ）ウイルス、エボラウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ハンタウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎）、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ノーウォークウイルス、天然痘、パルボウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、重症熱性血小板減少症候群（ＳＦＴＳ）ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルスまたはそれらの組合せが挙げられる。
【0105】
細菌は、病原性細菌である場合があり、その例として、放線菌属の種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、桿菌属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、バルトネラ属の種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、ボルデテラ属の種［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ．（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｓｐ．）］、ボレリア属の種（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｓｐ．）、ブルセラ属の種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ．）、カンピロバクター属の種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クラミジア属の種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐ．）、クロストリジウム属の種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属の種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、コクシエラ属の種（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属の種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、腸球菌属の種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、大腸菌属の種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、フランシセラ属の種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐ．）、ガードネレラ属の種（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｓｐ．）、ヘモフィルス属の種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．）、ヘリコバクター属の種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クレブシエラ属の種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、レジオネラ属の種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、レプトスピラ属の種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、リステリア属の種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．）、マイコバクテリウム属の種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、マイコプラズマ属の種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．）、ナイセリア属の種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、ノカルジア属の種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．）、リケッチア属の種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐ．）、パスツレラ属の種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐ．）、プロテウス属の種（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．）、シュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、サルモネラ属の種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属の種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属の種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、ブドウ球菌属の種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、連鎖球菌属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、トレポネーマ属の種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．）、ビブリオ属の種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）、エルシニア属の種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）またはそれらの組合せが挙げられる。
【0106】
寄生生物は、病原性寄生生物である場合があり、その例として、アカントアメーバ属の種（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐｐ．）、バラムチア属の種（Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ ｓｐｐ．）、バベシア属の種（Ｂａｂｅｓｉａ ｓｐ．）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ブラストシスチス属の種［Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｃ ｓｐ．）］、クリプトスポリジウム属の種［Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｉｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）］、シクロスポラ・カイエタネンシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、イソスポーラ・ベリ［Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｏ）］、リーシュマニア属の種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐ．）、ネグレリア・フォーレリ［Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｅｒｉ）］、マラリア原虫属の種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐ．）、リノスポリジウム・セーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｅｂｅｒｉ）、肉胞子虫属の種（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、トリコモナス属の種（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、トリパノソーマ属の種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐ．）またはそれらの組合せが挙げられる。
【0107】
トランスジェニック細胞系は、特異的抗体および特異的エフェクター細胞との組合せにおいてＡＤＣＣまたはＡＤＣＰの標的として使用される。抗体およびエフェクター細胞は、抗原が由来する微生物（ウイルス、細菌、寄生生物）に曝露され、かつ／もしくはこれに感染した個体から、または微生物に特異的なワクチンをワクチン接種された個体から得られる。
【0108】
ＡＤＣＣの量は、顕微鏡またはＦＡＣＳによって、赤色蛍光の損失を定量することによって測定することができる。
【0109】
ＡＤＣＰの量は、蛍光トランスジェニック細胞のファゴサイトーシスによって示されるマクロファージの比率を定量することによって測定することができる。
【0110】
本明細書において開示されるＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ法は、感染環境をシミュレートし、非常に汎用性であり、ポリクローナル血清、様々な種類の細胞系、および例えば様々なマウス株の使用を可能にする。
【0111】
本開示は、非限定的な以下の実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【0112】
実験の詳細
Ｖｅｒｏ細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座の確証
配列相同性に基づいて、ヒト第１９染色体上のアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）遺伝子座のオルソロガスな部位は、Ｖｅｒｏ細胞系の霊長類源であるクロロセブス・セバエウスにおいて第６染色体上にある。Ｖｅｒｏ細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座を確証するために、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）由来のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡｚｏｌ試薬を使用して製造業者の推奨に従って抽出した。精製したゲノムＤＮＡを、表１のプライマー対を使用するＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。
Ｖｅｒｏ細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座の確証
配列相同性に基づいて、ヒト第１９染色体上のアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）遺伝子座のオルソロガスな部位は、Ｖｅｒｏ細胞系の霊長類源であるクロロセブス・セバエウスにおいて第６染色体上にある。Ｖｅｒｏ細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座を確証するために、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）由来のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡｚｏｌ試薬を使用して製造業者の推奨に従って抽出した。精製したゲノムＤＮＡを、表１のプライマー対を使用するＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。
【0113】
表１
【表1】
【0114】
精製したＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングにより、増幅された領域はヒトＡＡＶＳ１遺伝子座と９０％同一であることが確証された。配列番号２２の配列を有する４０８６ｂｐコンセンサス配列を生成し、Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１と命名し、これはＶｅｒｏ細胞の第６染色体（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０２３６４７．１）上の座標４７７０５４５７～４７７０９５４３に対応した。
【0115】
Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的化するＣａｓ９ガイドＲＮＡの設計
Ｃｈｏｐ Ｃｈｏｐサーバー（https://chopchop.cbu.uib.no/）を使用して、サンガーシークエンシングを通して得たＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位をアップロードし、アルゴリズム検索を行うことによって、推定ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の特定を行った。ＡＡＶＳ１配列の１５２９位と１５３０位との間、２４０８位と２４０９位との間、２１５５位と２１５６位との間、２０３７位と２０３８位との間、および１４１６位と１４１７位との間に二本鎖ＤＮＡ切断部位を作出するための５つの異なる合成単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を生成した。ｇＲＮＡ配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ ＤＮＡ）によって合成され、ｇＲＮＡ安定性を増加させる改変を含んだ。上位３つの候補合成ガイドＲＮＡ、特にｓｇＲＮＡを選択し、ＲＮＡ安定性を増加させる改変を含む化学合成のために、ＩＤＴ ＤＮＡに送った。図２は、Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位、ならびに上位３つの候補単鎖ｇＲＮＡ：（１）Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列の１５２９位と１５３０位との間に二本鎖切断部位を作出するｇＲＮＡ、（２）Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列の２１５５位と２１５６位との間に二本鎖切断部位を作出するｇＲＮＡ、および（３）Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列の２４０８位と２４０９位との間に二本鎖切断部位を作出するｇＲＮＡの位置の略図である。
Ｃｈｏｐ Ｃｈｏｐサーバー（https://chopchop.cbu.uib.no/）を使用して、サンガーシークエンシングを通して得たＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位をアップロードし、アルゴリズム検索を行うことによって、推定ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の特定を行った。ＡＡＶＳ１配列の１５２９位と１５３０位との間、２４０８位と２４０９位との間、２１５５位と２１５６位との間、２０３７位と２０３８位との間、および１４１６位と１４１７位との間に二本鎖ＤＮＡ切断部位を作出するための５つの異なる合成単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を生成した。ｇＲＮＡ配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ ＤＮＡ）によって合成され、ｇＲＮＡ安定性を増加させる改変を含んだ。上位３つの候補合成ガイドＲＮＡ、特にｓｇＲＮＡを選択し、ＲＮＡ安定性を増加させる改変を含む化学合成のために、ＩＤＴ ＤＮＡに送った。図２は、Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位、ならびに上位３つの候補単鎖ｇＲＮＡ：（１）Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列の１５２９位と１５３０位との間に二本鎖切断部位を作出するｇＲＮＡ、（２）Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列の２１５５位と２１５６位との間に二本鎖切断部位を作出するｇＲＮＡ、および（３）Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列の２４０８位と２４０９位との間に二本鎖切断部位を作出するｇＲＮＡの位置の略図である。
【0116】
Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位の１５２９位と１５３０位との間に二本鎖切断部位を作出する合成ｇＲＮＡの配列は、配列番号１０の配列を有する。配列番号１０の下線部分は、２０ヌクレオチドのｃｒＲＮＡ領域を表す。
mA*mG*mA* rGrGrA rArCrA rArUrA rCrArA rArUrU rCrGrG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArG rArArA rUrArG rCrArA rGrUrU ArArA rArUrA rArGrG rCrUrA rGrUrC rCrGrU rUrArU rCrArA rCrUrU rGrArA rArArA rGrUrG rGrCrA rCrCrG rArGrU rCrGrG rUrGrC mU*mU*mU* rU（配列番号１０）
mA*mG*mA* rGrGrA rArCrA rArUrA rCrArA rArUrU rCrGrG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArG rArArA rUrArG rCrArA rGrUrU ArArA rArUrA rArGrG rCrUrA rGrUrC rCrGrU rUrArU rCrArA rCrUrU rGrArA rArArA rGrUrG rGrCrA rCrCrG rArGrU rCrGrG rUrGrC mU*mU*mU* rU（配列番号１０）
【0117】
Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１の２１５５位と２１５６位との間に二本鎖切断部位を作出する合成ｇＲＮＡの配列は、配列番号２０の配列を有する。配列番号２０の下線部分は、２０ヌクレオチドのｃｒＲＮＡ領域を表す。
mC*mC*mU* rGrCrA rArGrA rUrGrC rCrGrU rGrArC rArGrG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArG rArArA rUrArG rCrArA rGrUrU rArArA rArUrA rArGrG rCrUrA rGrUrC rCrGrU rUrArU rCrArA rCrUrU rGrArA rArArA rGrUrG rGrCrA rCrCrG rArGrU rCrGrG rUrGrC mU*mU*mU* rU（配列番号２０）
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【0118】
Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１の２４０８位と２４０９位との間に二本鎖切断部位を作出する合成ｇＲＮＡの配列は、配列番号２１の配列を有する。配列番号２１の下線部分は、２０ヌクレオチドのｃｒＲＮＡ領域を表す。
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【0119】
Ｖｅｒｏ相同配列が両側に隣接するａｔｔＢを含有する一本鎖ＤＮＡの設計
１５２９位の上流のＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列に対応する４０ヌクレオチドおよび１５２９位の下流のＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列に対応する４０ヌクレオチドが両側に隣接する３８ヌクレオチドのａｔｔＢ配列を含有する一本鎖ＤＮＡ断片を、ＩＤＴ ＤＮＡに化学合成させた。配列を以下に示す。
１５２９位の上流のＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列に対応する４０ヌクレオチドおよび１５２９位の下流のＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１配列に対応する４０ヌクレオチドが両側に隣接する３８ヌクレオチドのａｔｔＢ配列を含有する一本鎖ＤＮＡ断片を、ＩＤＴ ＤＮＡに化学合成させた。配列を以下に示す。
【化1】
【0120】
配列番号１において、下線のヌクレオチドはｃｒＲＮＡに対応する配列を示し、一方で、太字のヌクレオチドはａｔｔＢ配列を示す。
【0121】
Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体および一本鎖オリゴヌクレオチドのコトランスフェクション
４マイクロリットル（μｌ）のＣａｓ９タンパク質（ＮＥＢ緩衝液３中の２０μＭ、８０ｐｍｏｌ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を、Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位を標的化する１μｌの合成ｇＲＮＡ（トリス－ＥＤＴＡ中の１００μＭ、１００ｐｍｏｌ、ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）と混合することによって、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体を形成した。混合物を室温で２０分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、４０ｂｐのＶｅｒｏ相同配列が両側に隣接する３８ｂｐのａｔｔＢ配列を含有する１μｌの一本鎖ＤＮＡ（トリス－ＥＤＴＡ中の１００μＭ、１００ｐｍｏｌ、ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を添加した（配列番号１）。この混合物に、２０μｌのＶｅｒｏ細胞懸濁液（全部で細胞２．５ｘ１０５個、Ｌｏｎｚａ Ｂｕｆｆｅｒ ＳＦ中にて）を添加した。この混合物を１６ウェルのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップの単一のチャンバーに移し、細胞にヌクレオフェクション（エレクトロポレーション法に基づくトランスフェクション）をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘユニット（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を使用してプログラムＤＮ－１００により行った。
４マイクロリットル（μｌ）のＣａｓ９タンパク質（ＮＥＢ緩衝液３中の２０μＭ、８０ｐｍｏｌ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を、Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位を標的化する１μｌの合成ｇＲＮＡ（トリス－ＥＤＴＡ中の１００μＭ、１００ｐｍｏｌ、ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）と混合することによって、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体を形成した。混合物を室温で２０分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、４０ｂｐのＶｅｒｏ相同配列が両側に隣接する３８ｂｐのａｔｔＢ配列を含有する１μｌの一本鎖ＤＮＡ（トリス－ＥＤＴＡ中の１００μＭ、１００ｐｍｏｌ、ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を添加した（配列番号１）。この混合物に、２０μｌのＶｅｒｏ細胞懸濁液（全部で細胞２．５ｘ１０５個、Ｌｏｎｚａ Ｂｕｆｆｅｒ ＳＦ中にて）を添加した。この混合物を１６ウェルのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップの単一のチャンバーに移し、細胞にヌクレオフェクション（エレクトロポレーション法に基づくトランスフェクション）をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘユニット（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を使用してプログラムＤＮ－１００により行った。
【0122】
エレクトロポレーション法後、細胞懸濁液を、１ミリリットル（ｍｌ）の５％のＦＢＳ／ＤＭＥＭを含有する１２ウェルプレートの２つのウェルに移し、３７℃において５％のＣＯ２にてインキュベートした。細胞をコンフルエンスまで増殖させ（１週間）、トリプシン処理し、限界希釈法によるクローン選択のため９６ウェルプレートに播種した。
【0123】
ａｔｔＢ挿入の存在について細胞をスクリーニングする
相同組換えの確認をＰＣＲにより確認した。Ｖｅｒｏ ａｔｔＢ細胞の一部を溶解し、ゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、Ｖｅｒｏトランスフェクタントを含有する９６ウェルプレートを、２つの９６ウェルプレートに播種して複製した。１プレートは細胞を培養し続けるために使用し、一方で、第２のプレートの細胞は、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）中の５０μｌの１μｇ／ｍｌのプライマーゼを各ウェルに添加することによって溶解した。３７℃において５分間インキュベートした後、細胞を剥がし、９６ウェルＰＣＲプレートへ移した。プレートを密閉し、９５℃に１５分間加熱し、冷却した。ゲノムＤＮＡを、ａｔｔＢ部位（プライマー１５２９ａｔｔＢ＿Ｆ：配列番号２５、表２）およびＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位の１５２９位（プライマー１５２９ａｔｔＢ＿Ｒ：配列番号２６、表２）に結合するプライマー対を使用するＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって直接的に分析した。
相同組換えの確認をＰＣＲにより確認した。Ｖｅｒｏ ａｔｔＢ細胞の一部を溶解し、ゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、Ｖｅｒｏトランスフェクタントを含有する９６ウェルプレートを、２つの９６ウェルプレートに播種して複製した。１プレートは細胞を培養し続けるために使用し、一方で、第２のプレートの細胞は、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）中の５０μｌの１μｇ／ｍｌのプライマーゼを各ウェルに添加することによって溶解した。３７℃において５分間インキュベートした後、細胞を剥がし、９６ウェルＰＣＲプレートへ移した。プレートを密閉し、９５℃に１５分間加熱し、冷却した。ゲノムＤＮＡを、ａｔｔＢ部位（プライマー１５２９ａｔｔＢ＿Ｆ：配列番号２５、表２）およびＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位の１５２９位（プライマー１５２９ａｔｔＢ＿Ｒ：配列番号２６、表２）に結合するプライマー対を使用するＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって直接的に分析した。
【0124】
図３は、１５２９位に挿入されたａｔｔＢを有するＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位の略図である。図４Ａは、ａｔｔＢを含有する可能性のあるＶｅｒｏ細胞クローン（＋記号によって示されるレーン）を特定する結果を示す。また、図４Ｂは、Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞の第６染色体におけるＢｘｂ１ ａｔｔＢの部位特異的挿入を確証するＰＣＲ結果を示す。
【0125】
ａｔｔＢを含有するＶｅｒｏ細胞（ＶｅｒＢ細胞）の特定を確認するためのサンガーシークエンシング
Ｖｅｒｏ／ａｔｔＢについての初期スクリーニングからの候補クローンを、Ｔ－２５フラスコへ拡張した。第２ラウンドのスクリーニングのために、推定ａｔｔＢ挿入部位（Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳナンバリングシステムにおける１５２９位）を囲む領域を増幅することによって生成したＰＣＲ産物についてサンガーシークエンシングを行った。各クローン由来のおよそ１ｘ１０６個の細胞を、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（ＮＥＢカタログＴ３０１０Ｌ、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して溶解した。精製した鋳型を、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ Ｑ５マスターミックス（カタログ番号ＮＥＢ Ｍ０５４４、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用するＰＣＲに使用した。シークエンシングに使用したプライマーは、フォワードプライマー１２０１Ｆ（ＡＡＴＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧ、配列番号２７）およびリバースプライマー２４７１Ｒ（ＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣ、配列番号２８）であった。サンガー解析により、クローン３ＣへのａｔｔＢの挿入の成功を確認し、この新しいＶｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞系を細胞系ＶｅｒＢ１５２９αと命名した。
Ｖｅｒｏ／ａｔｔＢについての初期スクリーニングからの候補クローンを、Ｔ－２５フラスコへ拡張した。第２ラウンドのスクリーニングのために、推定ａｔｔＢ挿入部位（Ｖｅｒｏ ＡＡＶＳナンバリングシステムにおける１５２９位）を囲む領域を増幅することによって生成したＰＣＲ産物についてサンガーシークエンシングを行った。各クローン由来のおよそ１ｘ１０６個の細胞を、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（ＮＥＢカタログＴ３０１０Ｌ、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して溶解した。精製した鋳型を、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ Ｑ５マスターミックス（カタログ番号ＮＥＢ Ｍ０５４４、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用するＰＣＲに使用した。シークエンシングに使用したプライマーは、フォワードプライマー１２０１Ｆ（ＡＡＴＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧ、配列番号２７）およびリバースプライマー２４７１Ｒ（ＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣ、配列番号２８）であった。サンガー解析により、クローン３ＣへのａｔｔＢの挿入の成功を確認し、この新しいＶｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞系を細胞系ＶｅｒＢ１５２９αと命名した。
【0126】
ＨＳＶ－１遺伝子ＵＳ４－ＵＳ７を含有するｈｉｓＤ－ａｔｔＰコスミド（ｐＢＲＬ９６９）の構築
ＶＤ６０細胞から、プライマーＣＣＧＣＴＧＴＴＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＡＣＣ（配列番号１１）およびＣＣＡＡＣＴＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＧＧＴＣＧ（配列番号１２）を使用して、４．３ｋｂのＨＳＶ１ ＢａｍＨＩ Ｊ断片を増幅し（Ligas, et al, 1988., J. Virol., 62, 1486-1494）、ｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ Ｔｏｐｏベクターにクローニングした。断片は、それぞれグリコプロテインＧ、Ｊ、ＤおよびIをコードする、ＨＳＶ－１由来のＵｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ６およびＵｓ７遺伝子を含む。断片をＥｃｏＲＩ消化によって単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）によって平滑末端化し、ｈｉｓＤベクターｐＹＵＢ２９４１のＢｓｔ１１０７Ｉ部位においてクローニングし、ｐＹＵＢ２９４２を得た。ｈｉｓＤ遺伝子を大腸菌におけるマーカーとして使用するために、プラスミドｐｔｗＢから、表２に示される配列を有するプライマーｐｔｗＢ＿５９９６およびｐｔｗＢ＿６０８２を使用して、ＥＭ７プロモーターを増幅した。
ＶＤ６０細胞から、プライマーＣＣＧＣＴＧＴＴＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＡＣＣ（配列番号１１）およびＣＣＡＡＣＴＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＧＧＴＣＧ（配列番号１２）を使用して、４．３ｋｂのＨＳＶ１ ＢａｍＨＩ Ｊ断片を増幅し（Ligas, et al, 1988., J. Virol., 62, 1486-1494）、ｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ Ｔｏｐｏベクターにクローニングした。断片は、それぞれグリコプロテインＧ、Ｊ、ＤおよびIをコードする、ＨＳＶ－１由来のＵｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ６およびＵｓ７遺伝子を含む。断片をＥｃｏＲＩ消化によって単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）によって平滑末端化し、ｈｉｓＤベクターｐＹＵＢ２９４１のＢｓｔ１１０７Ｉ部位においてクローニングし、ｐＹＵＢ２９４２を得た。ｈｉｓＤ遺伝子を大腸菌におけるマーカーとして使用するために、プラスミドｐｔｗＢから、表２に示される配列を有するプライマーｐｔｗＢ＿５９９６およびｐｔｗＢ＿６０８２を使用して、ＥＭ７プロモーターを増幅した。
【0127】
得られた生成物をｐＹＵＢ２９４２のＡｃｃ６５Ｉ部位にクローニングし、ｐＹＵＢ２９４３を得た。ｐＢＲＬ８３４から、表２に示される配列を有するプライマーｐＢＲＬ８３４＿３５２－ａｔｔＰ＿Ｆ（フォワード）およびｐＢＲＬ８３４＿ａｔｔＰ＿Ｒ（リバース）によりＢｘｂ１ ａｔｔＰを増幅し、ｐＹＵＢ２９４３のＰｓｉＩ部位にクローニングし、ｐＢＲＬ９６１を作出した。ｐＹＵＢ３２８由来のラムダｃｏｓを、プライマーｐＹＵＢ３２８－ｃｏｓＢＦ（フォワード）およびｐＹＵＢ３２８－ｃｏｓＢＲ（リバース）（表２に示される配列）を使用することにより増幅し、その後、ｐＢＲＬ９６１のＢｓｐＨＩ断片を、大腸菌株ＵＴＨ４３１４（Ｆ－ｈｉｓＤ４３１４、ｔｈｙＡ３２１、ｄｅｏ－７１）におけるこの断片と置換することによって、抗生物質マーカーを伴わないｈｉｓＤコスミドであるｐＢＲＬ９６９（図８）を構築した。
【0128】
表２
【表2】
【0129】
Ｂｘｂ１をコードするｍＲＮＡの合成
ＨＡタグ付けしたＢｘＢ１遺伝子およびＴ７プロモーターの下流のＳＶ４０核局在化配列を含有するｐＣＡＧＧＳプラスミド（ｐＣＡＧＧＳ／ＨＡ－ＮＬＳ ＢｘＢ１）を、ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ｍＳｃｒｉｐｔ ｍＲＮＡ産生キット（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用するインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型として使用した。インビトロで転写したｍＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡミニプレップキット（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して精製した。
ＨＡタグ付けしたＢｘＢ１遺伝子およびＴ７プロモーターの下流のＳＶ４０核局在化配列を含有するｐＣＡＧＧＳプラスミド（ｐＣＡＧＧＳ／ＨＡ－ＮＬＳ ＢｘＢ１）を、ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ｍＳｃｒｉｐｔ ｍＲＮＡ産生キット（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用するインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型として使用した。インビトロで転写したｍＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡミニプレップキット（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して精製した。
【0130】
Ｖｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞へのｐＢＲＬ９６９の組込み
ＢｘＢ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡとプラスミドｐＢＲＬ９６９とをコトランスフェクトすることによって、Ｖｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞について、適合するＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位を含有するプラスミドとの組換えを行った。１００μｌのＬｏｎｚａ ＳＦ緩衝液中において２μｇのプラスミドｐＢＲＬ９６９、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードする１μｇのｍＲＮＡ、およびＶｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞２ｘ１０６個を混合することによって、トランスフェクション複合体を形成した。この混合物を、１００μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキュベットに移し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘユニットを使用してプログラムＤＮ－１００によりエレクトロポレーション法を行った。
ＢｘＢ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡとプラスミドｐＢＲＬ９６９とをコトランスフェクトすることによって、Ｖｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞について、適合するＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位を含有するプラスミドとの組換えを行った。１００μｌのＬｏｎｚａ ＳＦ緩衝液中において２μｇのプラスミドｐＢＲＬ９６９、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードする１μｇのｍＲＮＡ、およびＶｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞２ｘ１０６個を混合することによって、トランスフェクション複合体を形成した。この混合物を、１００μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキュベットに移し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘユニットを使用してプログラムＤＮ－１００によりエレクトロポレーション法を行った。
【0131】
エレクトロポレーション法後、細胞懸濁液を、２０ｍｌの５％のＦＢＳ／ＤＭＥＭを含有する１５０ｍｍ直径の組織培養皿に移した。３日後、培地を除去し、２ｍＭのヒスチジノールを補充した２０ｍｌの５％のＦＢＳ／－ヒスチジンＤＭＥＭにより置換した。培養１週間後、クローニングリングを使用して個々の細胞（クローン）を選択した。個々のクローンを１２ウェルプレートへ移し、拡張した。非選択細胞を集め、ゲノムＤＮＡ解析のために溶解した。ゲノムＤＮＡを、ＨＳＶ ｇＧ遺伝子（プライマーｇＧ）およびＶｅｒｏ ＡＡＶＳ１部位の２４７１位に結合するプライマー対を使用するＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。図４Ｂは、Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞の第６染色体におけるＨＳＶ遺伝子含有プラスミドの部位特異的挿入を確証するＰＣＲ結果を示す。プラスミドＤＮＡのＢｘｂ１組込みの挿入頻度は約１０～２０％である。Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞に組み込まれた核酸は、配列番号１９に対応する配列を有する。
【0132】
ΔｇＤ－２の繁殖およびプラークアッセイにおいて決定されるそれらの感染性タイターを支持するクローンの能力について、クローンを試験した。播種した細胞に、ＲＦＰを発現するΔｇＤ－２ウイルスを０．１のＭＯＩにおいて感染させ、感染２４時間後に回収した。超音波によって、感染した細胞からウイルスを抽出した。細胞屑を除去するための遠心分離後、上清をアッセイして、ウイルスの量を定量した。プラークアッセイの結果を図６および以下の表３に示す。
【0133】
表３
【表3】
【0134】
ｇＤタンパク質の発現およびウイルス繁殖についてのＶＤ６０Ｌ細胞の試験
スクリーニングからのクローンを、ΔｇＤ－２：：ＲＦＰによる感染後にｇＤを発現するそれらの能力について、およびΔｇＤ－２：：ＲＦＰの繁殖を支持するそれらの能力について試験した。ΔｇＤ－２：：ＲＦＰは、ｇＤ遺伝子（ΔｇＤ－２）が欠失され、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を強く発現する遺伝子により置換されている、操作されたＨＳＶ－２ウイルスである。ΔｇＤ－２：：ＲＦＰ組換え体は、以前にマウスにおいて感染に対する保護を示したΔｇＤ－２から作製される。
スクリーニングからのクローンを、ΔｇＤ－２：：ＲＦＰによる感染後にｇＤを発現するそれらの能力について、およびΔｇＤ－２：：ＲＦＰの繁殖を支持するそれらの能力について試験した。ΔｇＤ－２：：ＲＦＰは、ｇＤ遺伝子（ΔｇＤ－２）が欠失され、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を強く発現する遺伝子により置換されている、操作されたＨＳＶ－２ウイルスである。ΔｇＤ－２：：ＲＦＰ組換え体は、以前にマウスにおいて感染に対する保護を示したΔｇＤ－２から作製される。
【0135】
ＶＤ６０およびＶＤ６０Ｌ細胞に、ΔｇＤ－２：：ＲＦＰ組換え体を感染させ、細胞におけるｇＤおよびＲＦＰの発現および発現を評価した。播種した細胞に０．０１のＭＯＩにおいて感染させ、感染２日後にパラホルムアルデヒド中において固定した。ｇＤに対して生じさせたマウス抗体およびマウスＩｇＧに対する蛍光二次抗体を使用する免疫蛍光染色によって、グリコプロテインｇＤの発現を観察した。クローン４の結果を図７に示す。図６は、ＶＤ６０およびＶＤ６０Ｌクローンにおいて、ΔｇＤ－２：：ＲＦＰによる０．１のＭＯＩにおける感染はウイルス繁殖およびＣＰＥをもたらすことを示す。
【0136】
また、私たちは、ΔｇＤ－２を補完するための代替のＨＳＶ－１配列の使用を提案する。
例えば、
Ａ．ＫＯＳ株または他の任意のＨＳＶ－１株由来のｇＤ－１の単一のコピー；
Ｂ．ＥＦ－１αなどの外因性細胞プロモーターに融合した、ＫＯＳ株または他の任意のＨＳＶ－１株由来のｇＤ－１のオープンリーディング；
Ｃ．上記のＡまたはＢ由来の遺伝子の多数のコピー；
Ｄ．ＫＯＳまたは他の任意のＨＳＶ－１株由来のグリコプロテインＧ、Ｊ、ＤおよびＩをコードする遺伝子の多数のコピー。
例えば、
Ａ．ＫＯＳ株または他の任意のＨＳＶ－１株由来のｇＤ－１の単一のコピー；
Ｂ．ＥＦ－１αなどの外因性細胞プロモーターに融合した、ＫＯＳ株または他の任意のＨＳＶ－１株由来のｇＤ－１のオープンリーディング；
Ｃ．上記のＡまたはＢ由来の遺伝子の多数のコピー；
Ｄ．ＫＯＳまたは他の任意のＨＳＶ－１株由来のグリコプロテインＧ、Ｊ、ＤおよびＩをコードする遺伝子の多数のコピー。
【0137】
上記の実験は、第６染色体上の標的遺伝子座に組み込まれたａｔｔＢ配列を含有する遺伝子改変Ｖｅｒｏ細胞（Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ）の産生を例示する。ａｔｔＢ部位を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用してＶｅｒｏ細胞系のＡＡＶＳ１部位における多数の特定の位置に導入したが、これらに限定されず、ＡＡＶＳ１内の他の部位またはゲノム内の他の遺伝子座もまた標的化することができる。Ｖｅｒｏ ａｔｔＢ細胞系は、ワクチンウイルスの産生およびアッセイ開発両方のための、補完的な細胞系およびレポーター細胞系を生成するための高効率システムを提供することになる。
【0138】
また、ＨＳＶ－１グリコプロテインＤがＶｅｒｏ細胞ゲノムＤＮＡの第６染色体上の標的遺伝子座に挿入されている、遺伝子改変Ｖｅｒｏ細胞が、本明細書において開示される。原理の証明として、ＨＳＶ－１グリコプロテインＤ遺伝子を含み、かつ抗生物質耐性マーカーおよびＳＶ４０配列を欠く新しいプラスミドを、Ｖｅｒｏ／ａｔｔＢ細胞に組み込んで、グリコプロテインＤを発現するＶＤ６０Ｌ細胞を産生した。ＶＤ６０Ｌ細胞は、ΔｇＤ－２を補完することが実証された。さらに、インテグラーゼおよび核局在化配列をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトすることによって、Ｂｘｂ１インテグラーゼを発現する方法もまた開発した。この方法は、ａｔｔＢ部位へのａｔｔＰプラスミドの効率的な組込みを媒介する。
【0139】
図１は、Ｖｅｒｏ：ａｔｔＢ細胞系およびＶＤ６０Ｌ細胞系を調製する方法の要約を例示する。
【0140】
ワクチン調製物中の感染性弱毒化ウイルス粒子の量を迅速に評価するためのＨＳＶ－２誘導性レポーター細胞系
私たちは、ＨＳＶプロモーターに融合されたレポーター遺伝子（例えば、ＲＦＰ、ＧＦＰ、ｎａｎｏＬｕｃ）を含有し、かつそれが、細胞がΔｇＤ－２ウイルスに感染した際に発現される、トランスジェニックＶｅｒｏ細胞系を開発することを提案する。トランスジェニックＶｅｒｏ細胞系は、本明細書において開示されるＶｅｒｏ ａｔｔＢ細胞系に由来することになる。トランスジェニック細胞系を調製するための例示的なプラスミドコンストラクト（ｐＢＲＬ９１６）を図９に示す。プラスミドｐＢＲＬ９１６は、真核細胞における選択マーカーとしての、ＳＶ４０プロモーターから発現するブラスチシジン耐性のための遺伝子；Ｖｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞におけるａｔｔＢ部位への組込みを可能にするＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位；多量体化を可能にするバクテリオファージラムダｃｏｓ部位（ｃｉｔｅ）；および典型的に休止状態であるが、Ｖｅｒｏ細胞がΔｇＤ－２ウイルスに感染した場合に活性化される、実験的に規定されたＨＳＶ－２プロモーターにより発現される赤色蛍光タンパク質遺伝子を含む。以下のＨＳＶ－２遺伝子由来のプロモーターをｐＢＲＬ９１６にクローニングし、ΔｇＤ－２ウイルスによる感染後１～２時間以内に最適活性を評価する。以下のＨＳＶ－２プロモーターを試験する。
ＩＣＰ０
ＩＣＰ４
ＩＣＰ２７
ＩＣＰ８
ＴＫ
ＶＰ５
私たちは、ＨＳＶプロモーターに融合されたレポーター遺伝子（例えば、ＲＦＰ、ＧＦＰ、ｎａｎｏＬｕｃ）を含有し、かつそれが、細胞がΔｇＤ－２ウイルスに感染した際に発現される、トランスジェニックＶｅｒｏ細胞系を開発することを提案する。トランスジェニックＶｅｒｏ細胞系は、本明細書において開示されるＶｅｒｏ ａｔｔＢ細胞系に由来することになる。トランスジェニック細胞系を調製するための例示的なプラスミドコンストラクト（ｐＢＲＬ９１６）を図９に示す。プラスミドｐＢＲＬ９１６は、真核細胞における選択マーカーとしての、ＳＶ４０プロモーターから発現するブラスチシジン耐性のための遺伝子；Ｖｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞におけるａｔｔＢ部位への組込みを可能にするＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位；多量体化を可能にするバクテリオファージラムダｃｏｓ部位（ｃｉｔｅ）；および典型的に休止状態であるが、Ｖｅｒｏ細胞がΔｇＤ－２ウイルスに感染した場合に活性化される、実験的に規定されたＨＳＶ－２プロモーターにより発現される赤色蛍光タンパク質遺伝子を含む。以下のＨＳＶ－２遺伝子由来のプロモーターをｐＢＲＬ９１６にクローニングし、ΔｇＤ－２ウイルスによる感染後１～２時間以内に最適活性を評価する。以下のＨＳＶ－２プロモーターを試験する。
ＩＣＰ０
ＩＣＰ４
ＩＣＰ２７
ＩＣＰ８
ＴＫ
ＶＰ５
【0141】
最適プロモーター－レポーターコンストラクトを決定するために、プロモーターの各々を、ｐＢＲＬ９１６ベクターにクローニングし、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡと共にＶｅｒｏ：：ａｔｔＢ細胞へコトランスフェクトし、ブラスチシジンにより選択する。得られる細胞系にΔｇＤ－２を感染させ、ＦＡＣＳまたは９６ウェルプレートルミノメーターによってレポーターの発現を解析する。レポーター発現を測定するために最適な感染後時間を決定する。レポーター活性をプラーク形成単位と相関させる標準曲線を求め、このようにして、ワクチンのタイターを、日ではなく数時間で評価することができる。
【0142】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を定量化し、特徴付けるための抗原標的細胞系
ウイルス感染またはウイルスワクチンによるワクチン接種に応答して個体により産生されるＦｃ受容体活性化抗体、特にＦｃγＲＩＶ活性化抗体のレベルは、現在、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍｏｕｓｅ ＦｃγＲＩＶ ＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙを使用して測定される。このアッセイは、ｎａｎｏＬｕｃ遺伝子がＳＴＡＴプロモーターに融合されている、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞系を利用する。このアッセイはＦｃγＲＩＶ活性化抗体レベルを定量するために有用である一方で、それは、感染した細胞の死滅を媒介する免疫細胞の種類を評価しない。加えて、ＡＤＣＣ免疫において、様々な免疫エフェクターが様々な役割を果たし得る。それゆえ、私たちは、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを定量化し、これらを区別することができる細胞系を開発することを提案する。
ウイルス感染またはウイルスワクチンによるワクチン接種に応答して個体により産生されるＦｃ受容体活性化抗体、特にＦｃγＲＩＶ活性化抗体のレベルは、現在、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍｏｕｓｅ ＦｃγＲＩＶ ＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙを使用して測定される。このアッセイは、ｎａｎｏＬｕｃ遺伝子がＳＴＡＴプロモーターに融合されている、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞系を利用する。このアッセイはＦｃγＲＩＶ活性化抗体レベルを定量するために有用である一方で、それは、感染した細胞の死滅を媒介する免疫細胞の種類を評価しない。加えて、ＡＤＣＣ免疫において、様々な免疫エフェクターが様々な役割を果たし得る。それゆえ、私たちは、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを定量化し、これらを区別することができる細胞系を開発することを提案する。
【0143】
これを達成するために、私たちは、Ｃ５７／Ｂｌ６マウス由来のＴ細胞リンパ腫であるＲＭＡ細胞系を使用することを計画する。私たちは、ａｔｔＢ配列を、ＲＭＡ細胞におけるマウス染色体の非必須領域へ導入する。得られるＲＭＡ－ａｔｔＢＢｘｂ１細胞系に、細胞の表面上に標的抗原を発現するように操作したプラスミドとＢｘｂ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡとをコトランスフェクトする。得られるトランスジェニックＲＭＡ細胞は、細胞の表面上に抗原を発現する。細胞表面上に抗原標的を発現することに加えて、この細胞は、細胞質において赤色蛍光も構成的に発現する。例えば、レポーター遺伝子（例えば、ＲＦＰ遺伝子）はＥＦ１α（伸長因子１α）遺伝子の高効率プロモーターに融合され、その発現は蛍光顕微鏡を使用してまたはＦＡＣＳによって容易に検出されることになる。
【0144】
【0145】
ｐＢＲＬ９１４（図１０）は、感染した細胞の表面上に、デングウイルス株ＤＥＮＶ２由来のＮＳ１タンパク質を発現するように設計されている。ＮＳ１タンパク質をコードする遺伝子は、免疫グロブリンカッパ由来のシグナル配列、および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）由来の膜貫通ドメインに融合されている。また、ｐＢＬＲ９１４は、ＳＶ－４０プロモーターから発現される真核細胞における選択マーカーとしてのブラスチシジン耐性、ＥＦ－１αプロモーターにより発現される赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＲＭＡ－ａｔｔＢＢｘｂ１細胞におけるａｔｔＢ部位への組込みを可能にするＢｘｂ１由来のａｔｔＰ部位、および多量体化を可能にするバクテリオファージラムダｃｏｓをコードする。
【0146】
ｐＢＲＬ９１５（図１１）は、ブラスチシジン耐性遺伝子が、大腸菌のｈｉｓＤ突然変異体を補完し、かつ真核細胞においてヒスチジノールに対する耐性を与えるために融合されたネズミチフス菌由来のｈｉｓＤ遺伝子と置換されていることを除いては、ｐＢＲＬ９１４と実質的に同じである。この耐性は、抗生物質耐性選択の必要性を除去する。
【0147】
操作された細胞系は、特異的抗体および特異的エフェクター細胞との組合せにおいてＡＤＣＣまたはＡＤＣＰの標的として使用される。抗体およびエフェクター細胞は、抗原が由来する微生物（ウイルス、細菌、寄生生物）に曝露され、かつ／もしくはこれに感染した個体から、またはワクチンをワクチン接種された個体から得られる。ＡＤＣＣは、顕微鏡またはＦＡＣＳによって、赤色蛍光の損失を定量することによって測定される。ＡＤＣＰは、蛍光トランスジェニック細胞のファゴサイトーシスによって示されるマクロファージの比率によって測定される。
【0148】
組成物、方法および物品は、代わりに、本明細書において開示される任意の適切な材料、工程または成分を含むか、からなるかまたはから本質的になる場合がある。組成物、方法および物品は、加えてまたは代わりに、組成物、方法および物品の機能または目的の達成に別の場合には必要ではない任意の材料（もしくは種）、工程または成分を欠くか、または実質的に含まないように調合され得る。
【0149】
本明細書において開示されるすべての範囲は終点を包含し、終点は独立して互いに組合せ可能である（例えば「最大２５重量％、またはより特に５重量％～２０重量％」の範囲は、「５重量％～２５重量％」の範囲の終点およびすべての中間の値を包含することなどである）。「組合せ」とは、配合物、混合物、合金、反応生成物などを包含する。「第１」、「第２」などの用語は任意の順序、量または重要性を示さず、むしろ、１つの要素を別の要素から区別するために使用される。「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は量の限定を示さず、本明細書において別に示されるかまたは文脈が明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈すべきである。「または」は、明らかに別に言及されない限り、「および／または」を意味する。「一部の実施形態」、「一実施形態」などの明細書全体を通した言及は、実施形態と関係して説明される特定の要素が本明細書において説明される少なくとも１つの実施形態に含まれ、他の実施形態において存在してもよく、存在しなくてもよいことを意味する。加えて、説明される要素は、様々な実施形態において任意の好適な様式にて組み合わせてもよいと理解すべきである。「それらの組合せ」とは非限定的であり、列挙される成分または特性のうちの少なくとも１つを、適宜、列挙されていない同様または同等の成分または特性と共に含む任意の組合せを含む。
【0150】
別に規定しない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本出願が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。すべての引用される特許、特許出願および他の参考文献は、それらの全体を参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本出願における用語が、組み込まれる参考文献における用語と矛盾するかまたは食い違う場合、本出願の用語が、組み込まれる参考文献の食い違う用語よりも優先する。
【0151】
実施形態が説明されているが、現在予想されないかまたは予想され得ない代替物、改変、変形、改善および実質的同等物が、出願人または他の当業者に想起され得る。したがって、附属の特許請求の範囲は、公開されたときおよびそれらが修正され得るとき、すべてのそのような代替物、改変、変形、改善および実質的な同等物を包含すると意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0002】
政府からの支援についての申告
本発明は、米国国立衛生研究所－国立アレルギー感染疾患研究所（ＮＩＨ－ＮＩＡＩＤ）により与えられたグラント番号ＡＩ１１７３２１の下に政府からの支援によって行われた。本発明は、米国国立衛生研究所により与えられたＡＩ１１７３２１の下に政府からの支援によって行われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所－国立アレルギー感染疾患研究所（ＮＩＨ－ＮＩＡＩＤ）により与えられたグラント番号ＡＩ１１７３２１の下に政府からの支援によって行われた。本発明は、米国国立衛生研究所により与えられたＡＩ１１７３２１の下に政府からの支援によって行われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【国際調査報告】