特表 2023-542547 新規乳酸菌およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-10

(54)【発明の名称】新規乳酸菌およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20231002BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20231002BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 25/22 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 25/30 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 27/04 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 27/10 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20231002BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20231002BHJP

   A61K 35/745 20150101ALI20231002BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A ZNA

A23L33/135

A61P27/02

A61P29/00

A61P25/28

A61P25/00

A61P25/22

A61P25/30

A61P25/14

A61P25/16

A61P1/04

A61P1/16

A61P3/10

A61P11/00

A61P3/04

A61P13/02

A61P13/10

A61P13/12

A61P27/04

A61P27/06

A61P19/02

A61P27/10

A61P9/10 101

A61P31/04

A61P1/18

A61P1/02

A61K35/747

A61K35/745

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023518932

(86)(22)【出願日】2021-09-17

(85)【翻訳文提出日】2023-03-22

(86)【国際出願番号】 KR2021012888

(87)【国際公開番号】W WO2022065848

(87)【国際公開日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】10-2020-0123129

(32)【優先日】2020-09-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523105336

【氏名又は名称】ピービーエルバイオラブ

【氏名又は名称原語表記】ＰＢＬＢＩＯＬＡＢ

(71)【出願人】

【識別番号】523105347

【氏名又は名称】エヌブイピー、ヘルスケア、カンパニー、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＮＶＰ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】キム、トン、ヒョン

【テーマコード（参考）】

4B018

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018MD86

4B018MD87

4B018ME02

4B018ME14

4B018MF14

4B065AA21X

4B065AA21Y

4B065AA30X

4B065AA30Y

4B065AC20

4B065BA22

4B065CA42

4B065CA43

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC56

4C087BC59

4C087CA09

4C087MA52

4C087MA55

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA12

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZA33

4C087ZA45

4C087ZA66

4C087ZA70

4C087ZA81

4C087ZA96

4C087ZB11

4C087ZB35

4C087ZC35

(57)【要約】

本発明は、新規なラクトバチルスプランタルム、ビフィドバクテリウムビフィダム、ビフィドバクテリウムロンガムまたはその混合物とこれらの用途に関する。本発明による菌株またはその混合物は、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の発現抑制および抗炎症効果に優れ、目からの涙の分泌量を増加させ、角膜および／または網膜での炎症を抑制し、角膜および／または網膜において優れた抗酸化効果および炎症抑制効果を示しており、人体内の疲労物質の含有量を減少させ、神経炎症因子の抑制、ＢＤＮＦの発現増大および認知障害、精神障害改善などの効果を示す。これにより、眼疾患、疲労、炎症性疾患、認知機能障害、精神障害などの治療、改善および予防に有用に用いることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ

【請求項2】

前記ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１は、配列番号１の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を含むものである、請求項１に記載のラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ。

【請求項3】

ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ。

【請求項4】

前記ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５は、配列番号２の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を含むものである、請求項２に記載のビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ。

【請求項5】

ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐ

【請求項6】

前記ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３は、配列番号３の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を含むものである、請求項５に記載のビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐ。

【請求項7】

ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物を含む眼疾患、炎症性疾患、認知機能障害、または精神障害の予防または治療用医薬組成物。

【請求項8】

眼疾患は、目の疲れ、網膜症、角膜炎、黄斑変性、ドライアイ、色素性網膜症、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、増殖網膜症、虚血性網膜症、脈絡膜新生血管、血管新生緑内障、虚血性視神経症、糖尿病性黄斑変性、紅色症、近視、シェーグレン（Ｓｊｏｇｒｅｎ）症候群からなる群から選択されるいずれかである、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

炎症性疾患は、炎症性腸疾患、関節炎、痛風、肝炎、肥満、胃炎、腎炎、糖尿病、結核、気管支炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、膵炎、尿道炎、膀胱炎、膣炎、動脈硬化症、敗血症および歯周炎を含む群から選択されるいずれか１つ以上である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項10】

炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病および不確定の大腸炎からなる群から選択されるいずれか１つ以上である、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

認知機能障害は、アルツハイマー病、ハンチントン病、血管性認知症、ピック（ｐｉｃｋ）病、パーキンソン病、クロイツフェルト－ヤコフ病および認知症からなる群から選択されるいずれか１つ以上である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項12】

精神障害は、不安抑うつ障害、気分障害、不眠症、妄想性障害、強迫性障害、片頭痛、ストレス、記憶障害、自閉症、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、パニック発作および注意力障害からなる群から選択されるいずれか１つ以上である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項13】

ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物を含む眼疾患、炎症性疾患、認知機能障害、または精神障害の予防または改善用食品組成物。

【請求項14】

ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物を含む、疲労改善用食品組成物。

【請求項15】

ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物を含む、眼疾患、認知機能障害、精神障害および炎症性疾患からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患に対する予防または治療方法。

【請求項16】

眼疾患、認知機能障害、精神障害および炎症性疾患からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患の予防または治療に用いるためのラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物。

【請求項17】

眼疾患、認知機能障害、精神障害および炎症性疾患からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患の治療のための薬剤の製造において、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物の用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規な乳酸菌であるラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウムビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）またはその混合物に関する。

【背景技術】

【0002】

加齢、疲労などに関連する眼疾患の多数の場合が、突然ではなく人の年齢または疲労といった他の外的要因などによって徐々に発症する傾向がある。総合的な眼科検診を行った場合に検出され、治療可能であると認められる疾患としては、例えば、黄斑変性、白内障、緑内障、および糖尿病網膜症などが挙げられる。高齢者人口の比率が増加し、目の疲れを起こし得る視覚的刺激を多く受けざるを得ない状況で、前述のような眼疾患の有病率や影響もまた増加している。

【0003】

このような眼疾患の場合、通常は酸化ストレスによる過剰な活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）の産生によって網膜色素上皮細胞の主成分を酸化させ、ミトコンドリアの機能低下およびＤＮＡ損傷に関連する内因性アポトーシス（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）経路を活性化することが、疾患の主な問題として知られている。そこで、ＲＯＳに関連する様々なシグナル経路上の標的を目的として疾患を治療しようとする様々な研究開発が進められている。また、新生血管に伴う炎症反応に対する抑制も血管壁を安定化させ、血漿漏出、網膜浮腫を改善させ、治療効果を増大させることができるため、これに対する改善が共に求められている。また、最近では、このような眼疾患と腸内細菌群集の不均衡との関連性について様々な文献を通じて確認されており、これを微生物を通じて解消しようとする取り組みが一部確認されている。

【0004】

一方、前述のような疾患よりもやや一般的でありふれた疾患としては、目の疲れやドライアイが挙げられる。目の疲れまたはドライアイは、目のかすみ、目のチカチカ、目の異物感、激しい目の乾き、目のヒリヒリ感、目がしみるような痛み、目のツッパリ、目の痛みなどの症状が発現する疾患である。近年、汚染された黄砂、長時間のテレビ視聴、コンピュータやスマートフォンなどの使い過ぎといった外的要因により眼疾患患者が急増している。

【0005】

前述の黄斑変性症、緑内障、目の疲れ、ドライアイなどを含む眼疾患のほとんどは、前で述べた発症機序の外にも、炎症との関連性も非常に高いことを考慮すべきであることが知られている。眼疾患患者の涙液には、健常人よりもＴＮＦ－α、ＩＬ－１βなどの炎症関連サイトカインとＩＬ－８などの炎症関連のケモカインが過剰発現していることが報告されており、眼疾患を伴うシェーグレン症候群を持つＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスからはＩＬ－１０の発現が低く、糞便の腸内細菌群集では正常群とは異なる状態に相当することが知られている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

このような眼疾患の治療や目の疲れを改善するための方法としては、涙に近い成分の人工涙液／点眼薬を使用することが一般的であり、ひどい場合には、涙点を涙点プラグで塞ぐ涙道閉塞治療が利用されている。また、一般的に使用される治療薬は、シクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ）、フルオロメトロン（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｏｌｏｎｅ）などの免疫抑制剤として知られている薬物に該当する。前記のような疾患の治療方法は一時的に疾患を軽減させることができるが、根本的に疾患を治療するには限界があり、これに対する新たな治療法のニーズが多数存在する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

そこで、本発明者らは、免疫調節、認知機能障害、精神障害、炎症性疾患に対する改善効果に加えて、眼における抗酸化制御、血管新生制御、炎症制御、涙量制御などの機能を通じて眼疾患の改善に効果のある新規な菌株を確認し、本発明を完成するに至った。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明の目的は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐを提供することである。

【0009】

本発明の別の目的は、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐを提供することである。

【0010】

本発明の別の目的は、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐを提供することである。

【0011】

本発明のまた別の目的は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物を含む眼疾患、疲労、認知機能障害、精神障害および炎症性疾患からなる群から選択されるいずれか１つ以上の疾患の予防、改善または治療用途を提供する。

【0012】

前記目的を遂行するための様態として、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）（寄託機関：韓国微生物保存センター、寄託日：２０２０．０９．１０．受託番号：ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ）を提供する。

【0013】

本発明のラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１ ＫＣＣＭ１２７８３Ｐは、健康な人の腸内細菌群集（糞便から分離）から分離および同定された乳酸菌であることを特徴とする。

【0014】

本発明のラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１の同定および分類のための１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、本明細書に添付された配列番号１の通りである。したがって、本発明のラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１は、配列番号１の１６Ｓ ｒＤＮＡを含むことができる。

【0015】

前記配列番号１の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の分析の結果、公知のラクトバチルスプランタルム菌株と９９％の相同性を示し、分子系統計学的にラクトバチルスプランタルムと最も高い類縁関係を示した。したがって、前記乳酸菌をラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と同定し、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１と命名し、韓国微生物保存センターに２０２０．０９．１０日付で寄託した（ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ）。

【0016】

本発明のラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１は、グラム陽性菌であり、細胞の形態は、桿菌である。より具体的なラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１の生理学的特性は、当該技術分野の通常の方法に従って分析することができ、その結果は、下記表４に示す通りである。具体的に、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１は、グリセロール、Ｌ－アラビノース、Ｄ－リボース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－グルコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－マンノース、マンニトール、α－メチル－Ｄ－マンノシド、Ｎ－アセチル－グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオス、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｄ－ツラノースおよびグルコネートからなる群から選択される少なくとも１つ以上を炭素源として用いることができる。

【0017】

前記目的を遂行するためのもう一つの様態として、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）（寄託機関：韓国微生物保存センター、寄託日：２０２０．０９．１０．受託番号：ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ）を提供する。

【0018】

本発明のビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５ ＫＣＣＭ１２７８４Ｐは、健常人の腸内細菌群集（糞便から分離）から分離および同定された乳酸菌であることを特徴とする。

【0019】

本発明のビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５ ＫＣＣＭ１２７８４Ｐの同定および分類のための１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、本明細書に添付された配列番号２の通りである。したがって、本発明のビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５は、配列番号２の１６Ｓ ｒＤＮＡを含むことができる。

【0020】

前記配列番号２の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の分析の結果、公知のビフィドバクテリウムビフィダム菌株と９９％の相同性を示し、分子系統計学的にビフィドバクテリウムビフィダムと最も高い類縁関係を示した。したがって、前記乳酸菌をビフィドバクテリウムビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）と同定し、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５と命名し、韓国微生物保存センターに２０２０．０９．１０日付で寄託した（ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ）。

【0021】

前記ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５は、グラム陽性菌であり、細胞の形態は、桿菌である。より具体的なビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５の生理学的特性は、当該技術分野の通常の方法に従って分析することができ、その結果は、下記表５に示す通りである。具体的に、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５は、Ｄ－グルコース、Ｄ－ラクトース、Ｄ－マルトース、Ｄ－ジャイロス、エスクリン、Ｄ－セロビオース、Ｄ－マンノースおよびＤ－ラフィノースからなる群から選択されるいずれか１つ以上を炭素源として用いることができる。

【0022】

前記目的を遂行するためのもう一つの様態として、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）（寄託機関：韓国微生物保存センター、寄託日：２０２１．０９．０６．受託番号：ＫＣＣＭ１３０４６Ｐ）に関する。

【0023】

本発明のビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３ ＫＣＣＭ１３０４６Ｐは、健常人の腸内細菌群集（糞便から分離）から分離及び同定された乳酸菌であることを特徴とする。

【0024】

本発明のビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の同定および分類のための１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、本明細書に添付された配列番号３の通りである。したがって、本発明のビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３は、配列番号３の１６Ｓ ｒＤＮＡを含むことができる。

【0025】

前記配列番号３の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の分析の結果、公知のビフィドバクテリウムロンガム菌株と９９％の相同性を示し、分子系統計学的にビフィドバクテリウムロンガムと最も高い類縁関係を示した。したがって、前記乳酸菌をビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）と同定し、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３と命名した。

【0026】

本発明のビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３は、グラム陽性菌であり、細胞の形態は、桿菌である。より具体的なビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の生理学的特性は、当該技術分野の通常の方法に従って分析することができ、その結果は、下記表６に示す通りである。具体的に、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３は、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンニトール、Ｄ－マルトース、Ｄ－ジャイロス、Ｌ－アラビノース、ゼラチン、エスクリンおよびＤ－マンノースからなる群から選択されるいずれか一つ以上を炭素源として用いることができる。

【0027】

本発明にて述べる、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐ、またはこれらの混合物は、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の発現を抑制する効果に優れ、炎症性サイトカインの発現（例えば、ＴＮＦ－αなど）を抑制し、抗炎症性サイトカインの発現（例えば、ＩＬ－１０など）を増進させる特徴を示す。また、目からの涙の分泌量を増加させ、角膜および／または網膜での炎症を抑制し、角膜および／または網膜において優れた抗酸化効果および炎症抑制効果を示し、人体内の疲労物質（例えば、血中のクレアチニン、乳酸）の含有量を減少させ、コルチコステロンのレベルを減少させる。すなわち、目から発症する炎症を改善させ、細胞内酸化窒素の水準を効果的に阻害し、角膜の損傷を最小限に抑えることができ、網膜の酸化損傷などを防ぐことにより、目の健康を改善させることができる。また、大腸炎を含んで炎症性疾患の改善に効果を示しており、神経炎症因子の抑制、ＢＤＮＦの発現増大、認知機能障害、精神障害の改善などに効果を示す。

【0028】

前記目的を遂行するためのもう一つの様態として、本発明は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物を含む医薬組成物を提供する。本発明において、前記医薬組成物は、上述の乳酸菌のうちのいずれか１種、２種または３種を含む医薬組成物であってもよい。

【0029】

前記目的を遂行するためのもう一つの様態として、本発明は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0030】

前記目的を遂行するためのもう一つの様態として、本発明は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物を含む眼疾患、炎症性疾患、認知機能障害、または精神障害の予防または治療用医薬組成物を提供する。

【0031】

具体的に、本発明のラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１は、眼疾患、炎症性疾患、認知機能障害、および精神障害からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患に対する予防、治療または改善効果を奏することができる。また、具体的に、本発明のビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５は、眼疾患、炎症性疾患、認知機能障害、および精神障害からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患に対する予防、治療または改善効果を奏することができる。また、具体的に、本発明のビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３は、眼疾患、炎症性疾患、認知機能障害、および精神障害からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患に対する予防、治療または改善効果を奏することができる。また、上述の菌株の任意の混合形態の混合物は、眼疾患、炎症性疾患、認知機能障害、および精神障害からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患に対する予防、治療または改善効果を有することができる。

【0032】

前記目的を遂行するための具体的な様態として、本発明は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物を含む眼疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。

【0033】

前記目的を遂行するための具体的な様態として、本発明は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物を含む炎症性疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。

【0034】

前記目的を遂行するための具体的な様態として、本発明は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物を含む認知機能障害の予防または治療用医薬組成物を提供する。

【0035】

前記目的を遂行するための具体的な様態として、本発明は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）ＫＣＣＭ１３０４６Ｐまたはこれらの任意の混合物を含む精神障害の予防または治療用医薬組成物を提供する。

【0036】

本発明において、「眼疾患」とは、眼に生じる疾患であって、眼の前側を覆う構造物である結膜と角膜の異常、眼球の前方及び虹彩や水晶体を含む前方の構造物に生じる異常を含み、眼の構造物で発生する疾患を包括する。

【0037】

このような眼疾患の例示としては、例えば、目の疲れ、網膜症、角膜炎、黄斑変性（乾性および／または湿性含む）、ドライアイ、色素性網膜症、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、増殖網膜症、虚血性網膜症、脈絡膜新生血管、血管新生緑内障、虚血性視神経症、糖尿病性黄斑変性、紅色症、近視、シェーグレン（Ｓｊｏｇｒｅｎ）症候群などを含み、これらに制限されるものではない。好ましくは、眼疾患は、目の疲れ、黄斑変性、ドライアイ、網膜症および角膜炎からなる群から選択されるいずれか一つ以上であってもよい。

【0038】

「目の疲れ」は、近距離での作業時、老眼による調節力の低下により、毛様体筋に過負荷がかかった場合、乾燥した環境によって眼球が乾燥した場合、過度の光露出があった場合などにより発生する目の疲労感を意味する。かすみ、涙、充血、まぶしさ、ツッパリ、異物感などの症状が現れ、ひどい場合には痛みや頭痛が起こることもある。こうした目の疲れは、例えば、涙液膜が維持されず、目の表面が乾き、その結果、角膜や結膜に傷ができ、目の疲労感を引き起こす可能性があり、過度な光刺激によって網膜色素上皮細胞にフリーラジカル（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）が生成され、眼球内の網膜細胞および水晶体に直接損傷を与える可能性がある。

【0039】

「黄斑変性」は、網膜の中心部の近くにあって、精細な視覚を担う黄斑の進行性損傷を意味する。網膜にドルーゼン（黄斑に老廃物が溜まっていく状態）や網膜色素上皮の萎縮などの病変が生じた場合のような乾性黄斑変性症、網膜の下に脈絡膜新生血管が増殖して生じる湿性黄斑変性症などがある。

【0040】

「ドライアイ」は、涙が不足したり、涙が過剰に蒸発して生じるドライアイによって発生する目のかすみ、目のチカチカ、目の異物感、重度の目の乾き、目のヒリヒリ感、目がしみるような痛み、目のツッパリ、目の痛み、目の充血およびドライアイによる頭痛、角膜神経の感覚低下、および各種炎症などを含む。

【0041】

「網膜症」とは、目の網膜に持続的または極度の損傷を引き起こす場合をいい、網膜の末梢血管に循環不全が発生したり、それに沈殿物などが溜まったりすることにより生じる疾患を包括する。糖尿病性網膜症、高血圧網膜症、未熟児網膜症、放射線網膜症などが含まれる。

【0042】

「結膜炎」とは、結膜の炎症により結膜が充血し、目やに、まぶたの内側に毛包ができ、かゆみや異物感を感じる眼疾患を意味する。

【0043】

本発明において、炎症性疾患とは、炎症を主病変とする疾患を総称する意味であって、炎症性腸疾患、関節炎、痛風、肝炎、肥満、胃炎、腎炎、糖尿病、結核、気管支炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、膵炎、尿道炎、膀胱炎、膣炎、動脈硬化症、敗血症および歯周炎を含む群から選択されるいずれか１つ以上であってもよい。

【0044】

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）という用語は、結腸および消化管の炎症状態の１つのクラスを指す。ＩＢＤの主な類型は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病である。ＵＣとクローン病の主な違いは、炎症性変化の位置と特性である。クローン病は、口から肛門までの消化管のあらゆる部分に影響を与える可能性があるのに対し、ＵＣは結腸と直腸に制限される。発現（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の特異性により、クローン病またはＵＣの確定診断が得られない。このような場合、不確定な大腸炎の診断を下すことができる。他の形態のＩＢＤは、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病および不確定の大腸炎が含まれるが、これらに限定されない。

【0045】

すなわち、本発明による炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病および不確定の大腸炎からなる群から選択されるいずれか１つ以上であってもよい。

【0046】

本発明における認知機能障害とは、認知損傷および行動変化を示す障害をいい、記憶力、空間知覚力、判断力、実行機能、言語能力などの機能の低下に起因する疾患を指す。前記認知機能障害は、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、血管性認知症、ピック（ｐｉｃｋ）病、パーキンソン病、クロイツフェルト－ヤコフ病および認知症からなる群から選択されるいずれか１つ以上であってもよいが、これらに限定されない。また、認知機能障害は、前記のような症状に起因する記憶力障害、認知症の症状などを含む。

【0047】

本発明において「精神障害」とは、精神疾患または精神病とも呼ばれ、個人的、社会的機能において問題を引き起こす行動－精神的な異常を指し、これによる身体的症状まで含むことができる。原因としては、先天的な脳の問題があり、深刻なストレス的要因などが含まれ得る。精神障害の種類には、不安抑うつ障害、気分障害、不眠症、妄想性障害、強迫性障害、片頭痛、ストレス、記憶障害、自閉症、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、パニック発作および注意力障害からなる群から選択されるいずれか１つ以上であってもよいが、これらに限定されない。

【0048】

本発明における「神経炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」とは、脳に生じる炎症を意味し、認知機能障害、精神障害関連疾患を引き起こす重要な要因である。脳内の炎症細胞が過剰に活性化すると、炎症誘発性サイトカインの分泌が増加し、このような脳の炎症反応が過剰に活性することにより、脳細胞の損傷によって認知機能障害または精神障害が誘発されることが知られている。

【0049】

本発明の一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３が、マクロファージのＴＮＦ－α、ＩＬ－１βの発現は抑制する反面、ＩＬ－１０の発現は誘導し、優れた抗炎症効果を示すことを確認した。

【0050】

また、本発明の一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３がプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖活性を阻害することによって腸内マイクロバイオータの正常化を達成する効果を示すことを確認した。

【0051】

また、本発明の一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３が眼疾患の動物モデルにおいて、涙の分泌量を回復させ、角膜の炎症を抑制し、炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの発現水準を調節し、網膜のＭＤＡ（マロンジアルデヒド）、ＧＳＨ（グルタチオン）およびＮＯ（ニトリックオキサイド）水準を調節し、血液中の疲労物質（特に、目の疲れと関連性が高い）である乳酸、乳酸脱水素酵素、クレアチニンとコルチコステロンの水準を減少させる結果を確認した。

【0052】

また、本発明の一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３が大腸炎動物モデルにおいて、大腸の長さの減少を抑制し、ＭＰＯ活性を減少させ、大腸での炎症性サイトカインの発現を減少させ、抗炎症性サイトカインの発現水準を増加させる結果を確認した。

【0053】

また、本発明の一実施態様によれば、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３が認知症、不安およびうつ病を有する動物モデルにおいて、胃疾患によって誘発される行動学的問題を改善（自発的交替行動の改善）し、炎症性サイトカインの発現を減少させ、神経炎症を調節し、ＢＤＮＦの発現を増加させ、不安／うつ症状の改善（尾懸垂状態の不動時間の減少）により疾患に対する改善および治療効果を示すことを確認した。

【0054】

前記のような結果は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３が炎症性疾患、眼疾患、認知機能障害、および／または精神障害の予防、治療または改善に優れた効能があることを示す。

【0055】

また、前記医薬組成物は、変化した腸内微生物を正常化させると同時に、 腸免疫を正常化させることによって眼疾患、認知機能障害、精神障害、炎症性疾患およびこれによる合併症の調節、予防、改善および治療に優れた効果を示すことができる。

【0056】

本発明による菌株の形態は、生菌体、死菌体、培養物、破砕物または抽出物の形態のように多様な形態で用いられることができる。本発明による菌株は、菌株を含む条件の下、任意の形態を有しても上述した効果の側面で同等水準以上（特に生菌を中心に考慮し）の結果を示す

【0057】

生菌体はそのまま生きている菌を意味し、死菌体は一定の条件で生菌等を培養後に加熱乾燥、加圧、薬剤処理などの方法で有効成分を分離抽出したことを意味する。

【0058】

培養物は、乳酸菌を公知の液体培地または固体培地で培養して得たものを意味し、本発明による菌株を含む概念である。前記産物は、乳酸菌を含むことができる。前記培地は、公知の液体培地または固体培地から選択することができ、例えば、ＭＲＳ液体培地、ＧＡＭ液体培地、ＭＲＳ寒天培地、ＧＡＭ寒天培地、ＢＬ寒天培地であってもよいが、これらに限定されない。

【0059】

破砕物は、生菌体、死菌体、またはそれらの培養物を機械的、化学的方法により分離加工し、破砕された形態を有することを意味する。例えば、ビーズミル（ｂｅａｄ ｍｉｌｌｓ）、プレス（Ｐｒｅｓｓｅｓ）、ソニケーター（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）またはマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）、酵素処理などによって破砕形態を製造することができる。

【0060】

抽出物とは、生菌体、死菌体及び／又は破砕物を通常公知の抽出方式（公知の抽出溶媒（例えば、水、Ｃ１～Ｃ４のアルコール（メタノール、エタノール等）で抽出して得られる）ことを意味する。

【0061】

本発明では、菌株を混合した混合物において相乗効果を奏することを確認したところ、その任意の混合物の利用形態を含む。

【0062】

併用形態または混合物の利用形態は、例えば、
１）ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１およびビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５
２）ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３；または
３）ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５、およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の形態を含むものであってもよい。

【0063】

すなわち、本発明によるラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１に対してビフィドバクテリウム属菌株を混合することにより、優れた相乗効果を示すことができる。

【0064】

ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１およびビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５は、例えば、菌の数（ＣＦＵ）に基づいて１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９または１：１０であってもよい。好ましくは、９：１～１：１、より好ましくは、４：１～１：１、さらに好ましくは、４：１として用いることができる。

【0065】

ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３は、例えば、菌の数（ＣＦＵ）に基づいて１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９または１：１０であってもよい。好ましくは、菌の数（ＣＦＵ）に基づいて９：１～１：１、より好ましくは、４：１～１：１、さらに好ましくは、４：１として用いることができる。

【0066】

ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５、およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１に対してビフィドバクテリウム属菌株２種の和を基に菌の数を考慮することができる。例えば、菌の数（ＣＦＵ）に基づいて１０（ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１）：１（ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３）、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９または１：１０であってもよい。９：１～１：１、より好ましくは、４：１～１：１、さらに好ましくは、４：１として用いることができる。

【0067】

本発明の一実施形態によれば、前記菌株の混合物、すなわち、併用形態は、眼疾患動物モデルにおいて、涙の分泌量が増加し、角膜損傷が改善され、炎症性サイトカイン、ケモカインの発現を調節することに優れた相乗効果を示しており、また、網膜での抗酸化調節および目の疲れ調節においても優れた効果を示した。

【0068】

本発明の一実施形態によれば、前記菌株の混合物は、また、炎症性疾患（特に、炎症性腸疾患）、認知機能障害、および精神障害についても菌株混合による優れた相乗効果を通じて疾患の治療および改善に優れた効果を示した。

【0069】

特に、腸内マイクロバイオータの正常化の側面で、前記の菌株の混合は、単独菌株に比べて腸内健康維持の側面でより優れた効果を示すことができる。

【0070】

本発明による医薬組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供することができるように当業界で周知の方法を使用して医薬剤形として製造することができる。剤形の製造において、本発明による医薬組成物は、本発明の化合物の活性を阻害しない範囲内でさらに薬学的に許容される担体を含むことができる。

【0071】

前記薬学的に許容される担体は、通常用いられるもの、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油などを含むが、これらに限定されない。また、本発明の医薬組成物は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤、その他の薬学的に許容される添加剤を含むことができる。

【0072】

本発明による医薬組成物の投与は、薬学的に有効な量を投与することができる。「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスクの比率で疾患を予防または治療するのに十分な量を意味する。有効用量レベルは、製剤化方法、患者の状態および体重、患者の性別、年齢、疾患の程度、薬物形態、投与経路および期間、排泄速度、反応感受性などの要因に応じて、当業者によって多様に選択することができる。有効量は、当業者に認識されているように、処理の経路、賦形剤の使用、および他の薬剤と共に使用することができる可能性に応じて変わり得る。しかしながら、好ましい効果のために、経口投与剤の場合、一般に大人１日に体重１ｋｇ当たり本発明の組成物を１日０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１～１００ｍｇ／ｋｇで投与することができるが、前記の投与量は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。

【0073】

本発明の医薬組成物は、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路を介して投与することができる。具体的には、本発明の医薬組成物は、経口または非経口投与（例えば、塗布または静脈内、皮下、腹腔内注射）することができるが、経口投与が好ましい。経口投与のための固形製剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸剤などを含むことができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内服液剤、乳剤、シロップ剤、エアロゾルなどが該当するが、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にも様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤としては、それぞれ通常の方法により滅菌された水溶液、液剤、非水性溶剤、懸濁剤、エマルジョン、点眼剤、眼軟膏剤、シロップ、坐剤、エアロゾルなどの外用剤及び滅菌注射剤の形態で製剤化して使用することができ、好ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、眼軟膏剤、点眼剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤の医薬組成物を調製して使用することができるが、これらに限定されるものではない。局所投与のための製剤は、臨床的処方に従って無水型または水性型であってもよい。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、エチルオラートなどの注射用エステルなどを用いることができる。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。

【0074】

前記目的を達成するための本発明のもう一つの態様によれば、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物を含む、眼疾患、認知機能障害、精神障害および炎症性疾患からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患に対する予防または治療方法に関する。

【0075】

前記「ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１」、「ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５」、「ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３」、「眼疾患」、「認知機能障害」、「精神障害」、および「炎症性疾患」は、前述した通りである。

【0076】

本発明の医薬組成物は、個々の治療剤として投与することができる、または他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤と順次または同時に投与することができる。また、本発明の医薬組成物は、単回または複数回投与することができる。前記要素を全部考慮し、副作用のない最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者であれば容易に決定することができる。

【0077】

本発明の用語「対象体」は、発明による医薬組成物の投与によって症状が改善し得る動物またはヒトを含む。本発明による治療用組成物を個体に投与することにより、眼疾患、認知機能障害、精神障害または炎症性疾患を効果的に予防および治療することができる。

【0078】

本発明における用語「投与」とは、任意の適切な方法でヒトまたは動物に所定の物質を導入することを意味し、本発明による治療用組成物の投与経路は、標的組織に到達できる限り、任意の一般的な経路を介して経口または非経口投与することができる。また、本発明による治療用組成物は、有効成分が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。

【0079】

本発明による医薬組成物の好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択することができる。

【0080】

本発明は、眼疾患、認知機能障害、精神障害および炎症性疾患からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患の予防または治療に用いるためのラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物を提供する。

【0081】

本発明は、炎症性疾患の予防または治療に用いるためのラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物を提供する。

【0082】

本発明は、眼疾患の予防または治療に用いるためのラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物を提供する。

【0083】

本発明は、認知機能障害の予防または治療に用いるためのラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物を提供する。

【0084】

本発明は、精神障害の予防または治療に用いるためのラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物を提供する。

【0085】

本発明は、眼疾患、認知機能障害、精神障害および炎症性疾患からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患の治療のための薬剤の製造において、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物の用途を提供する。

【0086】

本発明は、炎症性疾患の治療のための薬剤の製造において、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物の用途を提供する。

【0087】

本発明は、眼疾患の治療のための薬剤の製造において、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物の用途を提供する。

【0088】

本発明は、認知機能障害の治療のための薬剤の製造において、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物の用途を提供する。

【0089】

本発明は、精神障害の治療のための薬剤の製造において、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物の用途を提供する。

【0090】

本発明のもう一つの側面は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）およびこれらの任意の混合物を含む、眼疾患、認知機能障害、精神障害および炎症性疾患からなる群から選択されるいずれか一つ以上の疾患に対する予防または改善用食品組成物に関する。

【0091】

本発明のもう一つの側面は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）またはこれらの任意の混合物を含む、疲労改善用食品組成物に関する。

【0092】

本発明による食品組成物は、人体内ストレスまたは疲労物質の水準を減少させることによって疲労改善に優れた効果を示す。具体的に、乳酸、乳酸脱水素酵素、クレアチニンの水準とコルチコステロンの水準を減少させ、抗酸化効果を増進させることによって疲労に対する改善に優れた効果を示すことができる。

【0093】

前記「ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１」、「ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５」、「ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３」、「眼疾患」、「認知機能障害」、「精神障害」および「炎症性疾患」は、前述した通りである。

【0094】

具体的に、本発明の食品組成物に含まれる乳酸菌は、その生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物であってもよいが、認知機能障害、眼疾患、精神障害または炎症性疾患障害の予防または改善効果を達成することができる乳酸菌の形態であれば、制限なく使用することができる。

【0095】

前記食品の種類には、特別な制限がない。前記乳酸菌を添加することができる食品は、ソーセージ、肉類、パン、チョコレート類、スナック類、キャンディー類、菓子類、ラーメン、ピザ、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがある。飲料水に製剤化する場合、新規な乳酸菌以外に添加される液体成分としては、これらに限定されないが、通常の飲料のように種々の香味剤又は天然炭水化物等を追加成分として含有することができる。前記の天然炭水化物は、単糖類（例えば、グルコース、フルクトースなど）、二糖類（例えば、マルトース、スクロースなど）および多糖類（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどの従来の糖）、並びにキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。

【0096】

前記食品の種類は、具体的に健康機能食品であってもよい。前記健康機能 食品は、各種栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレート等）、ペクチン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定剤、保存剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。これらの成分は単独でまたは組み合わせて使用することができ、これらの添加剤の比率は、通常、組成物の全重量当たり０．００１～５０重量部の範囲から選択される。

【0097】

前記健康機能食品とは、食品の生体調節機能を強化した食品であって、物理的、生化学的、生物工学的な方法を用いて特定の目的に作用及び発現するように付加価値を付与した食品である。これらの健康機能食品の成分は、生体防御と身体リズムの調節、疾患の防止および回復に関わる身体調節機能を生体に対して十分に発揮するように設計し加工され、食品として許容可能な食品補助添加剤、甘味料または機能性原料を含有することができる。

【0098】

本発明のラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を健康機能食品（または健康機能飲料添加物）として用いる場合、前記ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３をそのまま添加したり、他の食品または食品成分とともに使用し、通常的な方法に従って適宜に使用することができる。前記ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の混合量は、その使用目的（予防、健康または改善、治療的措置）によって適合に決定することができる。

【0099】

［発明の効果］
本発明の新規な乳酸菌およびこれらの任意の混合物は、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の発現抑制効果に優れ、炎症性サイトカインの発現（例えば、ＴＮＦ－αなど）を抑制し、抗炎症性サイトカインの発現（例えば、ＩＬ－１０など）を増進させる特徴を示す。また、目からの涙の分泌量を増加させ、角膜および／または網膜での炎症を抑制し、角膜および／または網膜において優れた抗酸化効果および炎症抑制効果を示しており、人体内の疲労物質（例えば、血中のクレアチニン、乳酸など）の含有量を減少させ、コルチコステロンの水準を減少させる。また、大腸炎を含んで炎症性疾患の改善に効果を示しており、神経炎症因子の抑制、ＢＤＮＦの発現増大および認知障害、精神障害の改善などの効果を示す。これにより、眼疾患、炎症性疾患、認知機能障害、精神障害などの治療、改善および予防に有用に用いることができる。

【0100】

本発明の効果は、前記した効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明または請求範囲に記載された発明の構成より推論可能なあらゆる効果を含むものと理解されるべきである。

【実施例】

【0101】

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記実施例により限定されるものではない。

【0102】

実施例１．ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）およびビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）乳酸菌の分離および同定
１－１．ヒト糞便から乳酸菌の分離
健常人の腸内細菌群衆から新規菌株を確保するために、ヒト糞便をＧＡＭ液体培地（ＧＡＭ ｂｒｏｔｈ；Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）に入れて懸濁した。その後、上澄み液を採取し、ＧＡＭ寒天培地（ｇｅｎｅｒａｌ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｄｉｕｍ；Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）およびＢＬ寒天培地（ＢＬ ａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍ；Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）に移植し、３７℃で約４８時間培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成したラクトバチルス属菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株を分離した。

【0103】

１－２．単離した乳酸菌の同定
ヒト糞便から単離した菌株の生理学的特性および選別した菌株の系統分類学的位置を確認するために、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を分析し、菌株の種を確定し、菌株名を付与した。

【0104】

前記の手順を経て、分離された菌株を以下の表１に示した。

【表1】

【0105】

実施例２．菌株の特性の解析
２－１．マクロファージのＩＬ－１０およびＴＮＦ－αの発現量の測定
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス６週齢（２０～２３ｇ）の腹腔に滅菌された４％のチオグリコール酸（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ）２ｍｌを投与し、９６時間が経過した後にマウスを麻酔させ、マウス腹腔にＲＰＭＩ １６４０培地８ｍｌを投与し、５～１０分後にマウス腹腔内のＲＰＭＩ培地（マクロファージ）を引き抜き、１０００ｇで１０分間遠心分離し、再びＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄した。マクロファージを各ウェル当たり０．５×１０^６の数で２４－ウェルプレートに敷き、前記実施例１で同定された乳酸菌のみを処理するか、乳酸菌と炎症反応誘導物質であるＬＰＳを一緒に２４時間処理した後、上澄み液でＴＮＦ－α、ＩＬ－１０サイトカイン発現量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）によって測定した。

【0106】

まず、上澄み液５０μｌをＴＮＦ－α抗体、ＩＬ－１０抗体がそれぞれコートされた９６ウェルプレートに入れ、常温で２時間反応させた後、リン酸緩衝生理食塩水－ツイン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、発色剤を入れ、２０分間発色させ、４５０ｎｍ波長で吸光度を測定し、計算した。

【0107】

２－２．プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖阻害活性
プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖阻害活性を測定した。ヒトの糞便希釈液１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬと前記実施例１で分離した乳酸菌培養希釈液１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬをＧＡＭ培地１０ｍｌにそれぞれ０．１ｍｌずつ移植し、２４時間嫌気培養し、集菌し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡｓｔｏｏｌ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、まず、９５℃で３０秒処理し、次いで９５℃で５秒、７２℃で３０秒を４２回繰り返し反応させた。

【0108】

ｑＰＣＲプライマーは、下記表２に示した。

【表2】

【0109】

２－３．特性解析結果の確認
表３に示すように、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖抑制活性と、マクロファージでの炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの発現変化を確認した。

【0110】

【表3-1】

【表3-2】

＊乳酸菌の処理最終濃度：１×１０^５ＣＦＵ／ｍｌ＊＋＋＋、＞８０％；＋＋、＞４０－８０％；＋、＞１－４０％；－、＜０－－４０％；－－、＜－４０％.

【0111】

前記表３に示すように、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＫ１５１）およびビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＮＫ１７５）が、ＴＮＦ－α発現に比べてＩＬ－１０発現誘導活性が優れていることが示された。また、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＫ１７３）も優れたＴＮＦ－α発現に比べてＩＬ－１０発現誘導活性が確認された。このような結果から前記菌株が優れた抗炎症活性を示すことを確認した。

【0112】

また、腸内マイクロバイオータの正常化の可能性を考慮するために、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖阻害活性を確認した結果からも、上述の菌株は、優れたプロテオバクテリア門の増殖阻害活性を示した。

【0113】

実施例３．菌株寄託および生理学的特性の確認
３－１．新規菌株の確認および１６ｓ ｒＤＮＡの確認
ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の分離菌株は、いずれもグラム陽性菌であり、桿菌であることを確認した。

【0114】

１６Ｓ ｒＤＮＡを確認した結果、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１の塩基配列を有することが示された。ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１の１６Ｓ ｒＤＮＡを遺伝子バンクのＢＬＡＳＴプログラムを用いて相同性を解析した結果、公知のラクトバチルスプランタルム菌株は、検索されず、公知のラクトバチルスプランタルム菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示した。前記新規な菌株をラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１で命名しており、２０２０年９月１０日に公認寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国ソウル西大門区洪済内２丁目４５ユリムビル）に特許寄託し、ＫＣＣＭ１２７８３Ｐの受託番号が付与された。

【0115】

ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号２の塩基配列を有することが示された。ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５の１６Ｓ ｒＤＮＡを遺伝子バンクのＢＬＡＳＴプログラムを用いて相同性を解析した結果、公知のビフィドバクテリウムビフィダム菌株は、検索されず、公知のビフィドバクテリウムビフィダム菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示した。前記新規な菌株をビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５と命名しており、２０２０年９月１０日に公認寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国ソウル西大門区洪済内２丁目４５ユリムビル）に特許寄託し、ＫＣＣＭ１２７８４Ｐの受託番号が付与された。

【0116】

また、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号３の塩基配列を有することが示された。ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の１６Ｓ ｒＤＮＡを遺伝子バンクのＢＬＡＳＴプログラムを用いて相同性を解析した結果、公知のビフィドバクテリウムロンガム菌株は、検索されず、公知のビフィドバクテリウムロンガム菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示した。前記新規な菌株をビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５と命名しており、２０２１年９月６日に公認寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国ソウル西大門区洪済内２丁目４５ユリムビル）に特許寄託し、ＫＣＣＭ１３０４６Ｐの受託番号が付与された。
３－２．ＡＰＩキットを用いた生化学的同定
ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の生理学的特性中、炭素源を用いて、それぞれＡＰＩ ５０ＣＨ ＫｉｔおよびＡＰＩ ２０Ａ Ｋｉｔ（製造社：ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ’ｓ、ＵＳＡ）による糖発酵試験により解析し、その結果を下記表４～６にそれぞれ示した。

【0117】

【表4】

【0118】

【表5】

【0119】

【表6】

【0120】

前記表４～６において、「＋」は炭素源利用性が陽性である場合を示し、「－」は、炭素源利用性が陰性の場合を示す。前記表４～６に示すように、それぞれ菌株の生化学的特性は、相異しており、同一でないことを確認した。

【0121】

実施例４：死菌体、破砕物の製造
実施例４－１．死菌体の製造
ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５、およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を熱処理条件で９０℃で１０分間３回熱処理を行い、死菌体を製造した。

【0122】

実施例４－２．破砕物（可溶物および不溶物）の製造
ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５、およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を遠心分離して得た生菌を１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬとなるように、滅菌蒸留に懸濁し、４℃で超音波処理し（１分間処理し、１分間休憩を５回繰り返す）、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１５分）し、上澄み液（可溶物）と沈殿物（不溶物）を得た。これを凍結乾燥し、用いた。

【0123】

実施例５．死菌体および破砕物活性の確認
前記実施例４にて製造された死菌体および破砕物を用いて実施例２と同様に、マクロファージにおける抗炎症活性を確認した。

【0124】

その結果、熱処理（９０℃、１０分、３回処理）を通じて製造された死菌体および超音波処理（１分、１０回）し、破砕された破砕物全部ＴＮＦ－α発現に比べて、ＩＬ－１０の発現誘導活性が生菌を処理したときと同様に示されることが確認された。

【0125】

実施例６．眼疾患モデルにおける治療および改善効果の確認
６－１．眼疾患実験動物の作製
８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｓａｍｔａｋｏ、韓国）で購入し、順応１週間後、涙腺を除去するため、２％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔させ、１％のイソフルランで維持しながらマウスの眼球と耳の間の真ん中の毛を除毛し、手術部位を消毒した後、皮膚を１ｃｍ程切開した。切開部位から眼窩外涙腺（ｅｘｏｒｂｉｔａｌ ｌａｃｒｉｍａｌｇｌａｎｄ）を摘出した後、皮膚を縫合し、５日間硫酸アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ）を角膜に処理した。翌日、フェノールレッドｔｈｒｅａｄ涙液量検査紙（ＦＣＩ Ｏｐｔｈａｌｍｉｃｓ Ｚｏｎｅ Ｑｕｉｃｋ、Ｊａｐａｎ）をまぶたの外側の端部の眼球表面に接触させた後、３０秒後、涙によって検査紙の色の変化の長さを測定し、正常対照群（ｓｈａｍ）に比べて有意に涙液分泌量が減少したマウスを実験に用いた。一群当たりのマウスは、８匹だった。

【0126】

１）正常群（ＮＣ）、
２）手術のみで、涙腺を除去していないｓｈａｍ群（ｓｈａｍ）、
３）涙腺を除去し、生理食塩水を投与した群（ＤＥ）、
４）涙腺を除去し、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１を投与した群（ＬＰ）、
５）涙腺を除去し、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５を投与した群（ＢＢ）、
６）涙腺を除去し、ビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を投与した群（ＢＬ）、
７）涙腺を除去し、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１およびビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５ １：１で混合し、投与した群（ＬＢ１）、
８）涙腺を除去し、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１およびビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５ ４：１で混合し、投与した群（ＬＢ２）、
９）ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３ ４：１で混合し、投与した群（ＬＢ３）に分けた。

【0127】

６－２．涙の分泌量の測定
涙の分泌量は、正常群、ｓｈａｍ群、ＤＥ群にはビヒクル（１％のマルトース液）を、ＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群には、乳酸菌を、個々の実験セットでそれぞれ５×１０^８ＣＦＵ／マウス（ｍｏｕｓｅ）／日（ｄａｙ）で０日間投与した（混合投与の場合、上述の投与量を前記ＣＦＵベースの比率に合わせて混合し、投与する）。

【0128】

涙の分泌量は、フェノールレッドｔｈｒｅａｄ涙液量検査紙（ＦＣＩ Ｏｐｔｈａｌｍｉｃｓ Ｚｏｎｅ Ｑｕｉｃｋ、Ｊａｐａｎ）をまぶた外側の端部の眼球表面に接触させた後、３０秒後、涙によって検査紙の色の変化の長さを測定した。

【0129】

その結果を表７に示した。

【0130】

下記表７には、５×１０^８ＣＦＵ／マウス（ｍｏｕｓｅ）／日（ｄａｙ）で１０日間投与した結果を示した。

【表7】

【0131】

前記表７から確認されるように、ビヒクル液を投与した正常群、ｓｈａｍ群、ＤＥ群における涙の分泌量は、それぞれ４．８、４．９、１．２ｍｍであり、眼疾患を誘発したマウスは、１０日後に正常群に比べて涙の分泌量が著しく減少した。ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１を投与したＬＰ群、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５を投与したＢＢ群、１：１の混合菌を投与したＬＢ１群、４：１の混合菌を投与したＬＢ２群およびＬＢ３群では、いずれも乳酸菌の投与により有意に涙の分泌量が増加した。

【0132】

このような結果は、１×１０^８ＣＦＵ／マウス（ｍｏｕｓｅ）／日（ｄａｙ）で投与したマウスにおいても涙の分泌量が増加した。

【0133】

前記涙の増加は、菌株の併用時により高く示されることが確認され、特にビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の場合、単独で投与した時よりもラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１と混合したＬＢ１～ＬＢ３群において、涙の分泌量が著しく増加したことが確認された。

【0134】

前記のような結果は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５、およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３またはこれらの任意の混合物が涙の分泌量を増加させることによって眼疾患の改善に効果があることを示す。

【0135】

６－３．角膜フルオレセイン染色（Ｃｏｒｎｅａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ）の確認
前記６－１のマウスを麻酔させた後、蛍光染料（Ｆｌｕｒｅｓｃｅｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）を用いて角膜の損傷程度を観察した。具体的に２．５％のフルオレセイン溶液を実験動物の眼球に落とした後、コバルトブルーライト下で生体顕微鏡（ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で撮影し、角膜を上、中、下に分けて、それぞれの領域下で角膜炎が最も重度の場合を３点と評価した。

【0136】

【表8】

【0137】

前記表８に示すように、涙腺を除去し、アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）を施したＤＥ群では、正常群に比べて有意に角膜が損傷したが、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を施したＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群では、角膜損傷が有意に改善された。

【0138】

６－４．角膜のサイトカイン発現量の測定
角膜５０ｍｇをプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）が含有された１５０μｌのＲＩＰＡ緩衝液を添加し、均質化した。その後、４℃および１０，０００ｇの条件で１５分間遠心分離し、上澄み液を得て、この上澄み液を５０μｌを９６－ウェルに入れ、ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅ ｋｉｔｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０発現量を測定した。

【0139】

まず、上澄み液５０μｌを、ＴＮＦ－α抗体、ＩＬ－１β抗体およびＩＬ－１０抗体がそれぞれコートされた９６ウェルプレートに入れ、常温で２時間反応させた後、リン酸緩衝生理食塩水－ツイン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、発色剤を入れ、２０分間発色させ、４５０ｎｍ波長で吸光度を測定し、計算した。

【0140】

【表9】

【0141】

前記表９に示すように、涙腺を除去し、アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）を処理したＤＥ群では、正常群に比べて有意に炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α、ＩＬ－１βの発現量が増加し、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０発現量は減少した。一方、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を処理したＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群では、いずれも角膜損傷を有意に軽減させるだけでなく、ＩＬ－１０発現量は増加させ、炎症誘発サイトカインＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βの発現量を減少させた。特に、ＬＰ群、ＬＢ２群およびＬＢ３群において、炎症性および抗炎症性サイトカインの発現調節効果に優れていることが確認されているところ、前記の結果は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、それにビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５、またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を混合した菌株が眼疾患の改善、特に内側での炎症改善に効果的な乳酸菌であることを示唆する。

【0142】

６－５．網膜のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、および一酸化窒素（ＮＯ）量の測定
眼疾患において重要と考えられる抗酸化関連因子およびＮＯを測定し、網膜における炎症レベルの変化を確認するために、以下の実験を行った。

【0143】

細いハサミで摘出した眼球から網膜を分離した。摘出した網膜（１ｍｇ）を０．２ｍＬの冷ＰＢＳに入れ、低温室でホモゲナイザーで均質化した。

【0144】

ＭＤＡ測定：５０μｌの網膜均質液に１％のリン酸０．６ｍｌと０．６％のチオバルビツール酸０．２ｍｌを入れた後、９５℃で４５分間沸かして冷ました後、０．８ｍｌのｎ－ブタノールを入れた後、３，０００ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離した後、上澄み液を取り、５３５ｎｍで吸光度を測定した。ＭＤＡ標準曲線（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）は、１，１，３，３－テトラエトキシプロパン（マロンジアルデヒド、ＭＤＡ）を使用して５３５ｎｍ吸光度を測定した。

【0145】

ＮＯ測定：５０μｌの網膜均質液にＮｉｔｒａｔｅ／Ｎｉｔｒｉｔｅ Ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃアッセイキッド（Ｃａｙｍａｎｃｈｅｍ、７８０００１）を用いて測定した。

【0146】

ＧＳＨ測定：５０μｌの網膜均質液にＧＳＨ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔにある試薬であるｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒ３ ６００μｌ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒ１ ５０μｌ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒ２ ５０μｌを順次混合し、ボルテックスをした後、２５℃の暗いところで１０分間反応させ、４０５ｎｍ吸光度を測定した。

【0147】

ＴＮＦ－α測定：ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅ ｋｉｔｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて測定した。

【0148】

【表10】

【0149】

前記表１０に示すように、涙腺を除去し、アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）を施したＤＥ群では、正常群に比べて網膜のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、一酸化窒素、およびＴＮＦ－α濃度を増加した。

【0150】

一方、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を施したＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群では、いずれも網膜において、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、一酸化窒素およびＴＮＦ－α濃度を低下させた。特に、ＬＰ群、ＬＢ２群およびＬＢ３群では、黄斑変性誘発であるラジカル生成指標であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、および一酸化窒素の生成抑制調節効果が優れていることを確認した。

【0151】

前記の結果は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、これにビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５、またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を混合した菌株が眼球の黄斑変性発生抑制および改善に効果的な乳酸菌であることを示唆する。

【0152】

６－６．血液中のコルチコステロン、クレアチニン、乳酸濃度および乳酸デヒドロゲナーゼ活性の測定
目の疲れを含んで、人体に疲労がたまる場合、疲労関連物質（例えば、乳酸、クレアチニンなど）が多く蓄積し、ストレスと関連性の高いホルモン（例えば、コルチコステロンなど）が多く蓄積する。これによって、前記因子らの発現変化を確認し、疲労現像に対する改善効果を確認した。

【0153】

前記６－１のマウスモデルで採血を行い、試験管にＥＤＴＡと一緒に入れ、３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間ＥＤＴＡ処理し、血漿を分離した。血漿で乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）、クレアチニンの濃度および乳酸デヒドロゲナーゼの活性をＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｇｅ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）の乳酸、クレアチニン、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイキッドを用いて測定した。また、血漿でのコルチコステロンの濃度は、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈｅｂｅｉ、Ｃｈｉｎａ）のＥＬＩＳＡアッセイキッドを使用して測定した。

【0154】

【表11】

【0155】

前記表１１に示すように、涙腺を除去し、アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）を処理したＤＥ群では、正常群に比べて血漿の乳酸、クレアチニン、コルチコステロン濃度およびＬＤＨ活性を増加した。一方、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７３を施したＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群では、いずれも血漿で乳酸、クレアチニン、コルチコステロン濃度およびＬＤＨ活性を低下させた。特に、ＬＰ群、ＬＢ２群およびＬＢ３群において、疲労により生じる指標である乳酸、クレアチニン、コルチコステロン濃度およびＬＤＨ活性を抑制調節効果に優れていることが確認されているところ、前記の結果は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、これにビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５、またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を混合した菌株がドライアイ、手術、ストレスによる疲労を抑制および改善に効果的な乳酸菌であることを示唆する。

【0156】

実施例７．うつ病、不安、疲労、大腸炎疾患モデルの製造と治療効能の確認
７－１．拘束ストレス動物モデルの製造
うつ病およびストレスなどの精神障害を誘導するために、拘束ストレス動物モデルを作製した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（５週齢１９～２１ｇ）を一群に８匹つずとし、１週間実験室に適応させた。一群は、正常群とし、残りの群は、実験群とした。実験群は、３×１０ｃｍの円筒型の拘束ストレス機構にマウスを動けないように固定させた。具体的に、２日に１回ずつ頭が上に行くように２時間ずつ立たせる方法で、拘束ストレス（ＩＳ）を５回繰り返し、最後の拘束ストレス２４時間後から毎日１回ずつ５日間乳酸菌およびその複合物ら（５×１０^８ＣＦＵ／マウス（ｍｏｕｓｅ）／日（ｄａｙ）で投与し、前の菌株の比率と同様に使用する）を投与した。正常群（ＮＣ）には、生理食塩水を投与した。

【0157】

分離した乳酸菌のうつ病／不安および疲労改善効能を確認するための行動実験としては、高架式十字迷路実験、尾懸垂実験、強制水泳実験行い、海馬においけるＩＬ－６、ＢＤＮＦをＥＬＩＳＡ ｋｉｔで測定し、血中のコルチコステロン、ＩＬ－６をＥＬＩＳＡ ｋｉｔまたは解析キットで測定し、大腸におけるＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＭＰＯをＥＬＩＳＡ ｋｉｔによって測定した。

【0158】

７－２．うつ病／認知障害／腸炎疾患モデルの製造
うつ病／認知障害／腸炎に起因する精神障害を誘導するために、糞便移植動物モデルを作製した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（５週齢１９～２１ｇ）を一群に８匹ずつとし、１週間実験室に適応させた。一群は、正常群とし、残りの群は、実験群とした。実験群は、うつ病／認知障害／腸炎のある患者（６０代女性）の糞便（２グラム）を生理食塩水（１８ｍｌ）に懸濁し、５００ｇで５分間遠心分離し、上澄み液を分離した。この上澄み液（０．１ｍｌ）を毎日１回ずつ５日間マウスに糞便移植した。最後に糞便移植（ＦＭＴ）２４時間後から毎日１回ずつ５日間乳酸菌およびその複合物（５×１０^８ＣＦＵ／マウス（ｍｏｕｓｅ）／日（ｄａｙ）で投与し、前の菌株の比率と同様に使用する）を投与した。正常群（ＮＣ）には、生理食塩水を投与した。

【0159】

分離した乳酸菌のうつ病／不安および疲労改善効能を確認するための行動実験としては、高架式十字迷路実験、尾懸垂実験、強制水泳実験を行い、海馬におけるＩＬ－６、ＢＤＮＦをＥＬＩＳＡ ｋｉｔで測定し、血中のコルチコステロン、ＩＬ－６、クレアチニン、乳酸濃度をＥＬＩＳＡ ｋｉｔまたは解析キットで測定し、大腸におけるＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＭＰＯをＥＬＩＳＡ ｋｉｔで測定した。

【0160】

７－３．大腸炎およびこれによる認知症、不安およびうつ病改善効果の確認
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス６週齢（ｓａｍｔａｋｏ、韓国）を購入し、動物実験室（湿度５０±１０％、温度２５±２℃、照明１２時間毎反復、空気ＨＥＰＡ濾過）で一週間順応させて用いた。飼料は、標準実験用飼料（Ｓａｍｙａｎｇ、Ｋｏｒｅａ）を用いており、飲用水は、自由に摂取するようにした。実験動物を軽くエーテルで麻酔し、先が丸い１ｍｌ注射器でＴＮＢＳ２．５ｍｇ／５％のＥｔＯＨを肛門を通じて大腸内に０．１ｍｌを投与し、垂直に持って３０秒間維持した。反面、正常群には、生理食塩水０．１ｍｌを経口投与した。一群を６匹とした。

【0161】

試料（５×１０^８ＣＦＵ／マウス（ｍｏｕｓｅ）／日（ｄａｙ）で投与し、前の菌株比率と同様に使用する。）を翌日から毎日１回ずつ３日間試料を生理食塩水に溶解し、予め決めた用量通りに経口投与し、試料投与が終了した次の日に実験動物を二酸化炭素で窒息死させ、大腸部位の盲腸から肛門直前部位までの大腸を摘出した。一方、大腸の長さ、ＭＰＯ活性、大腸のサイトカイン発現量、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）発現量、Ｙ字型迷路実験、尾懸垂実験などを行い、結果を確保した。

【0162】

７－４．Ｙ字型迷路実験（Ｙ－ｍａｚｅ ｔａｓｋ）
前記動物モデルに対してＹ字型迷路実験を通じて記憶力の改善に効果があることを確認した。

【0163】

具体的に、Ｙ字型迷路測定装置は、３つの通路（ａｒｍ）を伸びてアルファベットＹ字状をしており、各枝は長さ２５ｃｍ、高さ１４ｃｍ、幅５ｃｍで同じ角度に位置した。Ｙ字型迷路の一通路の端に実験動物の頭部が向かうように置き、８分間自在に通路を動き回るようにした。動物の動きを記録し、動物の後肢まで通路に入ったときを通過したもの（ａｒｍ ｅｎｔｒｙ）と見た。動物の動きは交替回数（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）で表されるが、交替回数とは動物が連続して３つの通路を通過したときに一度交替したと定義される。自発的な交替行動量は、実際の交替回数と最大可能な交替回数（すなわち、総交替回数から２を引いた値）の百分率で表示した。

【0164】

７－５．高架式十字迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ、ＥＰＭ）試験
前記動物モデルに対して実験を行った。２０ルクスの明るさで、上にビデオカメラを取り付けた部屋に、高架式十字迷路実験装置［二つのオープンアーム（Ｏｐｅｎ ａｒｍ、３０×７ｃｍ）と、２０ｃｍ高さの壁を有する２つのクローズアーム（Ｅｎｃｌｏｓｅｄ ａｒｍ、３０×７ｃｍ）が床面より５０ｃｍほど高く、中央プラットフォームから高さ７ｃｍずつ伸びている黒いフレキシガラス装置］にマウスを中央に頭がくるようにオープンアームに向かわせ、５分間、オープンアームとクローズアームで過ごした時間と回数を測定した。全実験時間のうち、オープンアームで過ごした時間（Ｔｉｍｅ ｓｐｅｎｔ ｉｎ ｏｐｅｎ ａｒｍｓ、ＯＴ）は、「オープンアームで過ごした時間／（オープンアームで過ごした時間＋クローズアームで過ごした時間）」×１００として算出した。

【0165】

７－６．尾部懸垂実験（Ｔａｉｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｔｅｓｔ、ＴＳＴ）
前記動物モデルに対して実験を行った。直径３５ｃｍおよび高さ５０ｃｍの容器にマウス尻尾の先端１ｃｍ程のどころに固定装置を取り付けた後、地面から５０ｃｍ離れた位置に吊り下げた。合計６分間実験動物の不動時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ）を測定した。

【0166】

７－７．強制水泳試験（Ｆｏｒｃｅｄ Ｓｗｉｍｍｉｎｇ Ｔｅｓｔ、ＦＳＴ）
前記動物モデルに対して実験を行った。高さ４０ｃｍ、直径２０ｃｍの水槽に温度２５±１℃の水を３０ｃｍ高さまで満たした。前記実験例５にて製作した疾患モデルマウスを一匹ずつ水槽に入れ、計６分間のうち最初の２分間は順応時間として測定せず、最後の４分間、実験動物の不動時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ）を測定した（百分率で表示）。不動状態は、頭だけを水から出すための最小限の動きだけをしながら、直立して動かずに浮いている状態を意味する。

【0167】

７－８．大腸の長さの測定
腹部を解剖して大腸を分離し、腸の長さを測定した。

【0168】

７－９．ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性測定
大腸組織１００ｍｇに０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）含有１０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．０）２００μｌを入れ、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）した。次いで、４℃および１０，０００ｇの条件で１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。これを粗酵素液として使用した。粗酵素液５０μｌを０．９５μｌの反応液（１．６ｍＭテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎ）と０．１ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２含有）に入れ、３７℃で反応させながら６５０ｎｍで経時的に吸光度を測定した。前記ミエロペルオキシダーゼの活性は、反応物として生じたＨ_２Ｏ_２の１μｍｏｌ／ｍｌを１ユニット（ｕｎｉｔ）で計算した。

【0169】

７－１０．大腸のサイトカイン発現量の測定
大腸組織１００ｍｇにプロテアーゼ阻害剤カクテルが含有された２５０μｌのＲＩＰＡ緩衝液を添加し、均質化した。次いで、４℃および１０，０００ｇの条件で１５分間遠心分離し、上澄み液を得て、この上澄み液を５０μｌを９６－ウェルに入れ、ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅ ｋｉｔｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６の発現量を測定した。

【0170】

まず、上澄み液５０μｌをＴＮＦ－α抗体、ＩＬ－１β抗体およびＩＬ－６抗体がそれぞれコートされた９６ウェルプレートに入れ、常温で２時間反応させた後、リン酸緩衝生理食塩水－ツイン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、発色剤を入れ、２０分間発色させ、４５０ｎｍ波長で吸光度を測定し、計算した。

【0171】

７－１１．拘束ストレスモデルでの効果確認

【0172】

【表12】

【0173】

拘束ストレス（ＩＳ）を処理した群では、正常群に比べて有意に、ＥＰＭ、ＴＳＴ、ＦＳＴにおいて不安およびうつ病行動が増加したが、ＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群では、拘束ストレスによって増加した不安うつ病行動が有意に抑制されたことを確認した。すなわち、拘束ストレスにより示された不安、うつ病行動は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の投与群の全部において著しく改善されたことが確認され、併用投与によっても改善効果が確認された。

【0174】

【表13】

【0175】

拘束ストレス（ＩＳ）を処理した群では、正常群に比べて有意に、海馬のＩＬ－６、血中のコルチコステロンとＩＬ－６、大腸のＭＰＯ、ＩＬ－１βが増加したが、海馬におけるＢＤＮＦと大腸におけるＩＬ－１０は減少した。しかし、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３は、全部ストレスなどによって、増加していた海馬のＩＬ－６、血中のコルチコステロンとＩＬ－６、大腸のＭＰＯ、ＩＬ－１βが減少しており、反面、海馬で減少していたＢＤＮＦと大腸のＩＬ－１０は増加した。また、併用投与によっても改善効果が優れていることが分かった。

【0176】

７－１２．糞便移植マウスにおける効果の確認

【表14】

【0177】

糞便移植（ＦＭＴ）を行った群では、正常群に比べて有意に、ＥＰＭ、ＴＳＴ、ＦＳＴにおいて不安および抑うつ行動が増加し、Ｙ－ｍａｚｅにおいて認知能が損なわれた行動を示したが、ＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群では、ＦＭＴにより増加した不安うつ行動が有意に抑制され、損傷した認知能が有意に改善されることを確認した。すなわち、糞便移植に示す不安、うつ病行動は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の投与群の全部において、著しく改善されたことが確認され、併用投与によっても改善効果が確認された。

【0178】

【表15】

【0179】

糞便移植を行った群では、正常群に比べて有意に、海馬のＩＬ－６、血中のコルチコステロン、ＩＬ－６、クレアチニンと乳酸、大腸のＭＰＯ、ＩＬ－１βが増加したが、海馬におけるＢＤＮＦと大腸におけるＩＬ－１０は減少した。しかし、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５およびビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３を投与した群では、このような疾患関連因子らの発現水準が調節された。特に、併用投与によっても改善効果が優れていることが確認された。

【0180】

７－１３．ＴＮＢＳ誘導うつ病および認知機能損傷マウスモデルでの治療効果の確認
優先的に、ＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群では、いずれもＴＮＢＳ処理により短くなった大腸の長さが有意に回復されたことを確認した。また、ＭＰＯ活性が有意に改善されたことを確認し、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６発現量が有意に抑制され、一方、ＴＮＢＳにより減少したＩＬ－１０の発現量は、誘導された。

【0181】

さらに、Ｙ字型迷路実験を通じて記憶力の改善に効果があることを確認し、尾懸垂試験実験（ＴＳＴ）を通じて不安／うつ病の改善に効果があることが確認された。

【0182】

【表16】

【0183】

前記表１６に示すように、ＴＮＢＳを処理した群では、正常群に比べて交替回数が減少したが、ＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＰ３群では、ＴＮＢＳにより減少した交替回数が増加され、その中でもＬＰ群、ＢＬ群、ＬＢ２群およびＬＢ３群において、交替回数の増加率が特に優れていることが示された。このような結果は、ラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３の認知機能改善、不安およびうつ病の症状の改善に対する優れた効果があることを示す。また、海馬のＴＮＦ－αおよびＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）発現量測定の結果を表１７に示した。

【0184】

【表17】

【0185】

前記表１７に示すように、ＴＮＢＳを処理した群では、正常群に比べて有意にＴＮＦ－α発現量が増加したが、ＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群においてＴＮＢＳによって増加したＴＮＦ－α発現量を有意に抑制されたことを確認した。一方、ＴＮＢＳにより減少したＢＤＮＦ発現量は、誘導され、その中にＬＰ群、ＬＢ２群およびＬＢ３群のＴＮＦ－α発現抑制およびＢＤＮＦ発現誘導効果に優れていることが示された。また、尾部懸垂試験実験（Ｔａｉｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｔｅｓｔ、ＴＳＴ）測定結果を表１８に示した。

【0186】

【表18】

【0187】

前記表１８に示すように、ＴＮＢＳを処理した群では、正常群に比べて不動状態が有意に増加したが、ＬＰ群、ＢＢ群、ＢＬ群、ＬＢ１群、ＬＢ２群およびＬＢ３群では、ＴＮＢＳにより増加した不動行動が有意に抑制されたことを確認した。このような結果は、本発明のラクトバチルスプランタルムＮＫ１５１、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＫ１７５および／またはビフィドバクテリウムロンガムＮＫ１７３が炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの発現を調節し、炎症性疾患に対する治療効果が示されることがみられた。また、眼疾患において治療効果を示される抗酸化作用、ＮＯ生成抑制などの作用、認知機能において、改善効果、神経炎症の改善などの効果を通じて、炎症性疾患、眼疾患、疲労、認知機能障害、精神障害の予防、改善および治療にも卓越した効果あることが確認された。これにより、本発明の菌株は、プロバイオティクス製品だけでなく、食品、医薬品などで多様な活用が可能であることを確認した。

【0188】

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解される。したがって、上述した実施例はすべての点で例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。例えば、単一の形態で説明されている各構成要素は分散して実施されてもよく、同様に分散して説明されている構成要素も組み合わされた形態で実施されてもよい。

【0189】

本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および範囲、並びにその均等概念から導き出されるすべての変更または変形形態が本発明の範囲に含まれると解釈されるべきである。

【0190】

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２７８３Ｐ
受託日付：２０２００９１０
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２７８４Ｐ
受託日付：２０２００９１０
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１３０４６Ｐ
受託日付：２０２１０９０６

【0191】

【表19】

【0192】

【表20】

【0193】

【表21】

【配列表】

2023542547000001.app

【国際調査報告】