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特表2023-542900４－１ＢＢを標的とする単一ドメイン抗体、その融合タンパク質、その医薬組成物及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-12
(54)【発明の名称】４－１ＢＢを標的とする単一ドメイン抗体、その融合タンパク質、その医薬組成物及び使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20231004BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231004BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231004BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231004BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231004BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231004BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231004BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231004BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231004BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231004BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231004BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231004BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231004BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231004BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231004BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20231004BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20231004BHJP
A61K 47/68 20170101ALN20231004BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K19/00
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61P37/06
A61P25/00
A61P37/02
A61P19/02
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K39/395 G
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K51/10 200
A61K49/00
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023517935
(86)(22)【出願日】2021-09-17
(85)【翻訳文提出日】2023-05-15
(86)【国際出願番号】 CN2021118955
(87)【国際公開番号】W WO2022057875
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】202010981835.5
(32)【優先日】2020-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202011025265.9
(32)【優先日】2020-09-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521530738
【氏名又は名称】普米斯生物技術（珠海）有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＴＨＥＵＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１０Ｂ， ＢＵＩＬＤＩＮＧ ４， ＮＯ １ ＫＥＪＩ ７ＴＨ ＲＯＡＤ， ＴＡＮＧＪＩＡＷＡＮ ＴＯＷＮ， ＸＩＡＮＧＺＨＯＵ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＺＨＵＨＡＩ， ＧＵＡＮＧＤＯＮＧ ５１９０８０， ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チャイ ティエンハン
(72)【発明者】
【氏名】ミャオ シアオニウ
(72)【発明者】
【氏名】シュイ イーフォン
(72)【発明者】
【氏名】ワン チャオ
(72)【発明者】
【氏名】ツン アンディ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC41
4C076CC50
4C076EE59
4C076FF70
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC05
4C085CC31
4C085DD62
4C085DD88
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG06
4C085HH03
4C085HH11
4C085HH13
4C085KA03
4C085KA04
4C085KA26
4C085KA27
4C085KA29
4C085KB82
4C085LL18
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
４－１ＢＢを標的とする単一ドメイン抗体、その融合タンパク質、医薬組成物及びその使用に関する。具体的には、関連する単一ドメイン抗体は１個の重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ表Ｂのいずれかの項目に示す通りである。単一ドメイン抗体はヒト４－１ＢＢに結合すると同時にカニクイザル４－１ＢＢに交差結合することができ、更に外部架橋の助けを借りて、優れた抗腫瘍活性と安全性を有するＴ細胞が活性化される。
【選択図】図７Ａ
【選択図】図７Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域を含む抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体であって、重鎖可変領域はＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号４１～８０から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号８１～１２０から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１２１～１６０から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の項目１～４０のいずれか１個に示される、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体。
【表1】
【請求項2】
抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体の４個のフレームワーク領域の内の任意の１個、２個、３個又は４個全てがヒト化されており、好ましくは、第２のフレームワーク領域がヒト化されていて、必要に応じて第１、第３又は第４のフレームワーク領域も改変されており、
好ましくは、前記抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、ヒトの抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体に対して７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、又は８０％以上の同一性を有し、
好ましくは、前記抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体において、フレームワーク領域１は配列番号１７０のアミノ酸配列を有し、フレームワーク領域２は配列番号１７１又は配列番号１７２のアミノ酸配列を有し、フレームワーク領域３は配列番号１７３のアミノ酸配列を有し、フレームワーク領域４は配列番号１７４のアミノ酸配列を有する、
請求項１に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体。
【請求項3】
４－１ＢＢ抗原に対するＫＤがＥ－０７未満、５Ｅ－０８未満、４Ｅ－０８未満、３Ｅ－０８未満、又は２Ｅ－０８未満であり、好ましくは、前記ＫＤはＦｏｒｔｅＢｉｏによって測定される、請求項１～２のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体。
【請求項4】
４－１ＢＢ抗原に対する結合部位がウレルマブ及びウトミルマブとは異なる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体。
【請求項5】
ヒト４－１ＢＢに特異的に結合すると同時にカニクイザル４－１ＢＢに交差結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体。
【請求項6】
天然状態において４－１ＢＢリガンドの４－１ＢＢへの結合をブロックしない、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体。
【請求項7】
配列番号１～４０のいずれか１個のアミノ酸配列を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体と、ヒトＩｇＧのＦｃ断片又はヒトＩｇＧの定常領域とを含む融合タンパク質。
【請求項9】
ＥＵナンバリングシステムによれば、前記ヒトＩｇＧのＦｃ断片又は前記ヒトＩｇＧの重鎖定常領域はＬ２３４Ａ変異とＬ２３５Ａ変異を含み、或いは、前記ＩｇＧのＦｃ断片はＧ２３７Ａ変異を更に含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記ヒトＩｇＧのＦｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ断片であり、前記ヒトＩｇＧの重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域である、
請求項８～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記ヒトＩｇＧのＦｃ断片は、Ｌ２３４Ａ変異とＬ２３５Ａ変異を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ断片であり、場合によっては、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片はＧ２３７Ａ変異を更に含み、好ましくは、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片は配列番号１６７のアミノ酸配列を有する、
請求項８～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記ヒトＩｇＧのＦｃ断片又は前記ヒトＩｇＧの定常領域は、前記抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のＣ末端に直接又はリンカーフラグメントを介して連結されている、請求項８～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸分子。
【請求項14】
請求項１３に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載の単離核酸分子又は請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項16】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を調製するための方法であって、適切な条件下で請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程と、細胞培養物から抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は融合タンパク質を回収する工程と、を含む方法。
【請求項17】
抗体部分とカップリング部分を含むコンジュゲートであって、前記抗体部分は請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質であり、前記カップリング部分は検出可能な標識であり、好ましくは、前記カップリング部分は放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色物質又は酵素である、コンジュゲート。
【請求項18】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むか、或いは請求項１７に記載のコンジュゲートを含むキットであって、好ましくは、前記単一ドメイン抗体又は前記融合タンパク質に特異的に結合することができる二次抗体を更に含み、必要に応じて、前記二次抗体は放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色物質又は酵素等の検出可能な標識を更に含むキット。
【請求項19】
試料中の４－１ＢＢの存在又はレベルを検出するために用いるキットの製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項20】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むか、或いは請求項１７に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤を更に含む医薬組成物。
【請求項21】
悪性腫瘍又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための薬物の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質或いは請求項１７に記載のコンジュゲートの使用であって、好ましくは、前記悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、乳がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん及び頭頸部がんから成る群から選択され、
好ましくは、前記自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、ループ様症候群及びコラーゲン誘発関節炎から成る群から選択される使用。
【請求項22】
悪性腫瘍又は自己免疫疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質或いは請求項１７に記載のコンジュゲートの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含み、好ましくは、前記悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、乳がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん及び頭頸部がんから成る群から選択され、
好ましくは、前記自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、ループ様症候群及びコラーゲン誘発関節炎から成る群から選択される方法。
【請求項23】
悪性腫瘍又は自己免疫疾患の治療及び／又は予防に使用される、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質或いは請求項１７に記載のコンジュゲートであって、好ましくは、前記悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、乳がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん及び頭頸部がんから成る群から選択され、
好ましくは、前記自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、ループ様症候群及びコラーゲン誘発関節炎から成る群から選択される、
抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は融合タンパク質或いはコンジュゲート。
【請求項24】
配列番号１～４０のいずれか１個のアミノ酸配列、又は、上述のアミノ酸配列のいずれかの派生配列であり、１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢナノボディの４－１ＢＢ結合親和性を保持することができるアミノ酸配列、
を有するＶＨＨ鎖を有することを特徴とする抗４－１ＢＢナノボディ。
【請求項25】
Ｎ末端からＣ末端に向かって式Ｉで示される構造を有することを特徴とする融合タンパク質。Ｚ１－Ｌ－Ｚ２（式Ｉ）
（式中、Ｚ１は、請求項２４に記載の抗４－１ＢＢナノボディの１個以上（好ましくは１～２個、より好ましくは１個）のＶＨＨ鎖を表し、
Ｚ２は免疫グロブリンのＦｃ断片を表し、
Ｌは任意のリンカー配列を表す）
【請求項26】
請求項２４に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は請求項２５に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項27】
請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項28】
請求項２７に記載の発現ベクターを含むか、又は請求項２６に記載のポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項29】
抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を生成するための方法であって、（ａ）抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質の生成に適した条件下で請求項２８に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を含む培養物を得る工程と、
（ｂ）前記培養物から前記抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を単離又は回収する工程と、
を含む方法。
【請求項30】
（ａ）請求項２４に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は請求項２５に記載の融合タンパク質と、（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素から成る群から選択されるカップリング部分と、
を含むことを特徴とするイムノコンジュゲート。
【請求項31】
（ａ）４－１ＢＢ分子を検出するための試薬又は（ｂ）腫瘍を治療するための薬物の製造における、請求項２４に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は請求項２５に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項32】
（ｉ）請求項２４に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、請求項２５に記載の融合タンパク質、又は請求項３０に記載のイムノコンジュゲートと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項33】
（ｉ）請求項２４に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は請求項２５に記載の融合タンパク質の配列と、（ｉｉ）必要に応じて、発現及び／又は精製に役立つタグ配列と、
を含むことを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項34】
４－１ＢＢタンパク質と抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片との水素結合及び／又は疎水性相互作用によって形成されることを特徴とするタンパク質複合体であって、前記水素結合は、前記４－１ＢＢタンパク質内の１１８位のＡｓｐ、１２３位のＬｅｕ、１３０位のＡｒｇ、１３２位のＶａｌ、１３４位のＣｙｓ、１３５位のＧｌｙ、及び１３７位のＳｅｒから成る群から選択される４個を超える（好ましくは５個を超える、より好ましくは６個を超える、最も好ましくは７個の）作用部位を含み、
更に、前記疎水性相互作用は、前記４－１ＢＢタンパク質内の１２３位のＬｅｕ、１２４位のＶａｌ、１３３位のＶａｌ、及び１３６位のＰｒｏから成る群から選択される２個を超える（好ましくは３個を超える、より好ましくは４個を超える）部位で構成される作用界面を有し、
前記４－１ＢＢタンパク質のアミノ酸ナンバリングは、配列番号１６８のナンバリングに基づく、
タンパク質複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物医学の分野に属し、４－１ＢＢを標的とする単一ドメイン抗体、その融合タンパク質、その医薬組成物及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４－１ＢＢは、ＣＤ１３７又はＴＮＦＲＦ９としても知られており、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。４－１ＢＢは２５５アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００１５５２）であり、１７アミノ酸を含むＮ末端シグナルペプチド、１６９アミノ酸の細胞外領域、２７アミノ酸の膜貫通領域、及び４２アミノ酸のＣ末端細胞内領域で構成されている。４－１ＢＢは主に活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、単球、好中球及び好酸球で発現し、腫瘍血管の内皮細胞も４－１ＢＢを発現することが報告されている。
【0003】
Ｔ細胞の活性化プロセス中、４－１ＢＢ分子はＴ細胞へ共刺激シグナルを提供することができる。Ｔ細胞受容体が抗原と接触すると、４－１ＢＢの発現が増加し、リガンドへの４－１ＢＢの結合によってＮＦ－κＢシグナル伝達経路が活性化され、その結果、Ｔ細胞が活性化して増殖するが、４－１ＢＢは活性化細胞のアポトーシスを阻害することもできる。動物モデル及びインビトロ実験によって、抗４－１ＢＢモノクローナル抗体が抗腫瘍活性を有することが確認されている。抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を選択的に誘導し、ＩＦＮ－γ等の炎症促進性サイトカインの発現をアップレギュレートし、抗原特異的エフェクターＴ細胞の死滅効果を高め、それによって腫瘍クリアランスを促進することができる。抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、ＮＫ細胞の増殖も引き起こすことができ、それによってＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を高めることができる。抗４－１ＢＢ抗体は、腫瘍細胞の血管内皮細胞を誘導して接着分子の発現をアップレギュレートし、活性化Ｔリンパ球の腫瘍組織への浸潤を促進することもできる。更に、抗４－１ＢＢアンタゴニスト抗体は、動物モデルにおいて、自己免疫性脳脊髄炎、ループス様症候群、コラーゲン誘発関節炎等の自己免疫疾患を軽減することもできる。
【0004】
従って、腫瘍と幾つかの自己免疫疾患の治療において、４－１ＢＢは重要な潜在的標的である。具体的には、結腸直腸がん、肺がん、乳がん及び黒色腫等の前臨床動物モデルにおいて、４－１ＢＢを標的とするアゴニスト分子は、単剤として、又は抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＨＥＲ－２及びその他の抗体と組み合わせて有意な抗腫瘍活性を示している（Etxeberria I, et al. ESMO Open 2020; 4:e000733.）。現在、２種の４－１ＢＢ抗体、即ち、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社が開発）とウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６、Ｐｆｉｚｅｒ社が開発）が臨床試験中である。ウレルマブは強力なスーパーアゴニストであることが研究で示されているが、肝毒性や疲労等の副作用もある。一方、ウトミルマブは安全性において有利であるが、ウレルマブと比較してアゴニスト活性が限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
従って、当該分野では、４－１ＢＢを標的とするより効率的な抗体とその関連薬の開発が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、集中的な研究と創造的な作業によって抗ヒト４－１ＢＢナノボディを開発した。具体的には、本発明者らは、ヒト由来の４－１ＢＢ抗原タンパク質を用いてラマを免疫化し、高品質の免疫ナノボディ遺伝子ライブラリーを得た。その中で、本発明者らは、免疫ナノボディ遺伝子ライブラリーをスクリーニングして、ヒト及びカニクイザル４－１ＢＢに同時に結合することができ、活性化させるために外部架橋を必要とする抗４－１ＢＢナノボディの２種の株を得た。次に、２種のナノボディを配列最適化に供し、遺伝子操作された変異体を発現させて精製し、抗体親和性、カニクイザル４－１ＢＢとの交差結合、及びＴ細胞を活性化する能力の観点で更なるスクリーニングを行い、インビトロにて高発現可能で、特異性の高いナノボディ株種を得た。実験結果から、本発明の抗４－１ＢＢナノボディと融合タンパク質は分子量が小さく、カニクイザル４－１ＢＢと交差することができ、４－１ＢＢリガンドと４－１ＢＢの自然な相互作用をブロックせず、強いＴ細胞活性化と良好な安全性を有することが分かる。従って、以下の発明を提供する。
【0007】
本発明の一様相は、重鎖可変領域を含む抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体であって、重鎖可変領域はＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号４１～８０から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号８１～１２０から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１２１～１６０から選択されるアミノ酸配列を有する、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体に関する。
【0008】
本発明の一様相は、重鎖可変領域を含む抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体であって、重鎖可変領域はＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含み、これらはそれぞれ、以下の項目１～４０に示すアミノ酸配列のいずれか１個を有する、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体に関する。
【表1】
【0009】
本発明では、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のＣＤＲはＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される（Ehrenmann F, Kaas Q, Lefranc M P. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF[J]. Nucleic acids research, 2009;38(suppl_1):D301-D307を参照されたい）。
【0010】
本発明では、特に明記しない限り、４－１ＢＢはヒト４－１ＢＢを意味する。本発明の幾つかの実施形態では、４－１ＢＢは配列番号１６８のアミノ酸配列を有する。
【0011】
本発明の幾つかの実施形態では、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体において、その４個のフレームワーク領域の内の任意の１個、２個、３個又は４個全てがヒト化されており、
好ましくは、第２のフレームワーク領域がヒト化されていて、必要に応じて第１、第３又は第４のフレームワーク領域も改変されており、
好ましくは、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、ヒトの抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体に対して７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、又は８０％以上の同一性を有し、
好ましくは、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体において、フレームワーク領域１は配列番号１７０のアミノ酸配列を有し、フレームワーク領域２は配列番号１７１又は配列番号１７２のアミノ酸配列を有し、フレームワーク領域３は配列番号１７３のアミノ酸配列を有し、フレームワーク領域４は配列番号１７４のアミノ酸配列を有する。
好ましくは、第２のフレームワーク領域がヒト化されていて、必要に応じて第１、第３又は第４のフレームワーク領域も改変されており、
好ましくは、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、ヒトの抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体に対して７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、又は８０％以上の同一性を有し、
好ましくは、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体において、フレームワーク領域１は配列番号１７０のアミノ酸配列を有し、フレームワーク領域２は配列番号１７１又は配列番号１７２のアミノ酸配列を有し、フレームワーク領域３は配列番号１７３のアミノ酸配列を有し、フレームワーク領域４は配列番号１７４のアミノ酸配列を有する。
【0012】
本発明の幾つかの実施形態では、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、４－１ＢＢに対するＫＤがＥ－０７未満、５Ｅ－０８未満、４Ｅ－０８未満、３Ｅ－０８未満、又は２Ｅ－０８未満であり、好ましくは、ＫＤはＦｏｒｔｅＢｉｏによって測定される。
【0013】
本発明の幾つかの実施形態では、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、ウレルマブ及びウトミルマブと比べて、４－１ＢＢ抗原に対する結合部位が異なる。
【0014】
本発明の幾つかの実施形態では、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、ヒト４－１ＢＢに特異的に結合し、カニクイザル４－１ＢＢに交差結合する。
【0015】
本発明の幾つかの実施形態では、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、天然状態（例えば、哺乳動物、特に人体）において４－１ＢＢリガンドの４－１ＢＢへの結合をブロックしない。
【0016】
本発明の幾つかの実施形態では、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、配列番号１～４０のいずれか１個のアミノ酸配列を有する。
【0017】
本発明の他の様相は、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体と、ヒトＩｇＧのＦｃ断片又はヒトＩｇＧの定常領域とを含む融合タンパク質に関する。
【0018】
本発明の幾つかの実施形態では、融合タンパク質は、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体と、ヒトＩｇＧのＦｃ断片又はヒトＩｇＧの定常領域で構成されている。
【0019】
本発明の幾つかの実施形態では、融合タンパク質は、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体、リンカー、及びヒトＩｇＧのＦｃ断片又はヒトＩｇＧの定常領域で構成されている。
【0020】
本発明の幾つかの実施形態では、融合タンパク質において、ＥＵナンバリングシステムによれば、ヒトＩｇＧのＦｃ断片又はヒトＩｇＧの重鎖定常領域はＬ２３４Ａ変異とＬ２３５Ａ変異を含み、或いは、ＩｇＧのＦｃ断片はＧ２３７Ａ変異を更に含む。
【0021】
本発明の幾つかの実施形態では、融合タンパク質は抗４－１ＢＢ重鎖抗体である。重鎖抗体とは軽鎖を持たない抗体を意味し、現在ではＶＨＨ－Ｆｃ抗体の通称である。
【0022】
本発明の幾つかの実施形態では、融合タンパク質において、
ヒトＩｇＧのＦｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ断片であり、
ヒトＩｇＧの重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域である。
ヒトＩｇＧのＦｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ断片であり、
ヒトＩｇＧの重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域である。
【0023】
本発明の幾つかの実施形態では、融合タンパク質において、
ヒトＩｇＧのＦｃ断片は、Ｌ２３４Ａ変異とＬ２３５Ａ変異を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ断片であり、場合によっては、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片はＧ２３７Ａ変異を更に含み、
好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片は配列番号１６７のアミノ酸配列を有する。
ヒトＩｇＧのＦｃ断片は、Ｌ２３４Ａ変異とＬ２３５Ａ変異を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ断片であり、場合によっては、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片はＧ２３７Ａ変異を更に含み、
好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片は配列番号１６７のアミノ酸配列を有する。
【0024】
本発明の幾つかの実施形態では、融合タンパク質において、
ヒトＩｇＧのＦｃ断片又はヒトＩｇＧの定常領域は、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結されている。
ヒトＩｇＧのＦｃ断片又はヒトＩｇＧの定常領域は、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結されている。
【0025】
本発明の幾つかの実施形態では、融合タンパク質において、
ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片又はヒトＩｇＧ１の定常領域は、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結されている。
ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片又はヒトＩｇＧ１の定常領域は、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結されている。
【0026】
本発明の他の様相は、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は本発明のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸分子に関する。
【0027】
本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクターにも関する。
【0028】
本発明は、本発明の単離核酸分子又は本発明のベクターを含む宿主細胞にも関する。
【0029】
本発明の他の様相は、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は本発明のいずれか一項に記載の融合タンパク質を調製するための方法であって、適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、細胞培養物から抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は融合タンパク質を回収する工程と、を含む方法に関する。
【0030】
本発明の他の様相は、抗体部分とカップリング部分を含むコンジュゲートであって、抗体部分は本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は本発明のいずれか一項に記載の融合タンパク質であり、カップリング部分は検出可能な標識であり、好ましくは、カップリング部分は放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色物質又は酵素である、コンジュゲートに関する。
【0031】
本発明の他の様相は、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は本発明のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むか、或いは本発明のコンジュゲートを含むキットであって、
好ましくは、単一ドメイン抗体又は融合タンパク質に特異的に結合することができる二次抗体を更に含み、必要に応じて、二次抗体は放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色物質又は酵素等の検出可能な標識を更に含む、キットに関する。
好ましくは、単一ドメイン抗体又は融合タンパク質に特異的に結合することができる二次抗体を更に含み、必要に応じて、二次抗体は放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色物質又は酵素等の検出可能な標識を更に含む、キットに関する。
【0032】
本発明の他の様相は、試料中の４－１ＢＢの存在又はレベルを検出するためのキットの製造における、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は本発明のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用に関する。
【0033】
本発明の他の様相は、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は本発明のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むか、或いは本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤も含む医薬組成物に関する。
【0034】
本発明の他の様相は、悪性腫瘍又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための薬物の製造における、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は本発明のいずれか一項に記載の融合タンパク質或いは本発明のコンジュゲートの使用であって、
好ましくは、悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、乳がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん及び頭頸部がんから成る群から選択され、
好ましくは、自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、ループ様症候群及びコラーゲン誘発関節炎から成る群から選択される、使用に関する。
好ましくは、悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、乳がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん及び頭頸部がんから成る群から選択され、
好ましくは、自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、ループ様症候群及びコラーゲン誘発関節炎から成る群から選択される、使用に関する。
【0035】
本発明の他の様相は、悪性腫瘍又は自己免疫疾患の治療及び／又は予防するための方法であって、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は本発明のいずれか一項に記載の融合タンパク質或いは本発明のコンジュゲートの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法において、
好ましくは、悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、乳がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん及び頭頸部がんから成る群から選択され、
好ましくは、自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、ループ様症候群及びコラーゲン誘発関節炎から成る群から選択される、方法に関する。
好ましくは、悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、乳がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん及び頭頸部がんから成る群から選択され、
好ましくは、自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、ループ様症候群及びコラーゲン誘発関節炎から成る群から選択される、方法に関する。
【0036】
本発明の幾つかの実施形態では、この方法において、本発明のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体又は融合タンパク質の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程は、外科的治療の前又は後、及び／又は放射線療法の前又は後に行う。
【0037】
本発明の幾つかの実施形態では、この方法において、
本発明の単一ドメイン抗体又は融合タンパク質は単回用量が体重１キログラム当たり０．１～１００ｍｇ、好ましくは４．８～２４ｍｇ又は１～１０ｍｇであるか、或いは本発明の単一ドメイン抗体又は融合タンパク質は単回用量が１対象当たり１０～１０００ｍｇ、好ましくは５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇ又は２００ｍｇであり、
好ましくは、３日間に１回、４日間に１回、５日間に１回、６日間に１回、１０日間に１回、１週間に１回、２週間に１回又は３週間に１回投与を行い、
好ましくは、静脈内点滴又は静脈内注射によって投与を行う。
本発明の単一ドメイン抗体又は融合タンパク質は単回用量が体重１キログラム当たり０．１～１００ｍｇ、好ましくは４．８～２４ｍｇ又は１～１０ｍｇであるか、或いは本発明の単一ドメイン抗体又は融合タンパク質は単回用量が１対象当たり１０～１０００ｍｇ、好ましくは５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇ又は２００ｍｇであり、
好ましくは、３日間に１回、４日間に１回、５日間に１回、６日間に１回、１０日間に１回、１週間に１回、２週間に１回又は３週間に１回投与を行い、
好ましくは、静脈内点滴又は静脈内注射によって投与を行う。
【0038】
悪性腫瘍又は自己免疫疾患の治療及び／又は予防に使用される、本発明のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体又は本発明のいずれか一項に記載の融合タンパク質或いは本発明のコンジュゲートであって、
好ましくは、悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、乳がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん及び頭頸部がんから成る群から選択され、
好ましくは、自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、ループ様症候群及びコラーゲン誘発関節炎から成る群から選択される。
好ましくは、悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、乳がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん及び頭頸部がんから成る群から選択され、
好ましくは、自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、ループ様症候群及びコラーゲン誘発関節炎から成る群から選択される。
【0039】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、通常２対のポリペプチド鎖で構成される免疫グロブリン分子を意味し、各対は１個の「軽」（Ｌ）鎖と１個の「重」（Ｈ）鎖を有する。抗体の軽鎖はκ軽鎖とλ軽鎖に分類することができる。重鎖はμ、δ、γ、α、又はεに分類することができ、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義されている。軽鎖及び重鎖内で、可変領域と定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を更に含む。各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）で構成されている。重鎖定常領域は３個のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）で構成されている。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。軽鎖定常領域は１個のドメインＣＬで構成されている。抗体定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）や古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）等の宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。ＶＨ領域とＶＬ領域は、可変性の高い領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）に細分化することもでき、その中にはフレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在している。ＶＨとＶＬの各々は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順序で配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲで構成されている。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨとＶＬ）はそれぞれ抗体結合部位を形成する。領域又はドメインへのアミノ酸の割り当ては、Bethesda M.d.,Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, (1987 and 1991))、又はChothia & Lesk J. Mol. Biol. 1987;196:901-917; Chothia et al. Nature 1989;342:878-883、又はＩＭＧＴナンバリングシステム（Ehrenmann F, Kaas Q, Lefranc M P. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF[J]. Nucleic acids research, 2009;38(suppl_1):D301-D307の定義を参照）の定義に従う。
【0040】
「抗体」という用語は、如何なる特定の抗体生成方法にも限定されない。例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を包含する。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体とすることができる。
【0041】
本明細書で使用される「ｍＡｂ」及び「モノクローナル抗体」という用語は、相同性の高い抗体分子の群、即ち、自発的に起こり得る自然突然変異を除いて、同一の抗体分子の群に由来する抗体又は抗体の断片を意味する。ｍＡｂは抗原上の単一のエピトープに対して非常に特異的である。モノクローナル抗体と比較して、ポリクローナル抗体は通常、少なくとも２種以上の異なる抗体を含み、これらの異なる抗体は通常、抗原上の異なるエピトープを認識する。モノクローナル抗体は通常、Kohler et al.(Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity [J]. nature, 1975;256(5517):495)によって最初に報告されたハイブリドーマ技術を用いて得ることができ、組換えＤＮＡ技術を用いて得ることもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。
【0042】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）のＣＤＲ領域の全部又は一部を非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置換して得た抗体又は抗体断片を意味し、この場合、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性、又は反応性を有する非ヒト（例えば、マウス、ラット、又はウサギ）抗体とすることができる。また、レシピエント抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）内の一部のアミノ酸残基を非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基で置換するか、又は他の抗体のアミノ酸残基で置換して、抗体の性能を更に改善又は最適化することもできる。ヒト化抗体の詳細については、例えば、Jones et al., Nature 1986; 321:522 525; Reichmann et al., Nature, 1988; 332:323329; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992; 2:593-596; and Clark, Immunol. Today 2000; 21: 397-402を参照。場合によっては、抗体の抗原結合断片は二重特異性抗体であり、ＶＨドメインとＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖で発現されるが、用いられるリンカーが短すぎて、同一鎖の２個のドメイン間の対合ができないため、ドメインを他の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させて２個の抗原結合部位を形成する（例えば、Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:6444 6448 and Poljak R. J. et al., Structure 1994; 2:1121 1123を参照）。
【0043】
本明細書に記載の融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えによって２種の遺伝子で共発現されるタンパク質産物である。抗体と抗原結合断片を生成及び精製する方法は当技術分野では周知である（例えば、Cold Spring Harbor's Antibody Laboratory Technique Guide, Chapters 5-8 and Chapter 15）。
【0044】
本明細書で使用される「単離」又は「単離された」という用語は、人工的手段による天然状態からの獲得を意味する。「単離された」物質又は成分が天然に存在する場合、それが存在する天然環境が変化しているか、物質が天然環境から単離されているか、又はその両方が生じている。例えば、単離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドが生きている動物に天然に存在する場合、この天然状態から高純度で単離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドを単離されたと称する。「単離」又は「単離された」という用語は、人工物質又は合成物質の混合を除外するものではなく、物質の活性に影響を与えない他の不純物の存在を除外するものでもない。
【0045】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸送達媒体を意味する。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現させることができる場合、そのベクターを発現ベクターと称する。形質転換、形質導入又はトランスフェクションによってベクターを宿主細胞に導入し、ベクターが保有する遺伝物質要素を宿主細胞で発現させることができる。ベクターは当業者には周知であり、その例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、λファージやＭ１３ファージ等のファージ、及び動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用できる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは発現を制御する様々な要素を含むことができ、その例としては、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素、及びレポーター遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。更に、ベクターは複製起点を含むこともできる。
【0046】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、ベクターを導入するのに使用できる細胞を意味し、その例としては、大腸菌や枯草菌等の原核細胞、酵母細胞やアスペルギルス等の真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞やＳｆ９等の昆虫細胞、線維芽細胞やＣＨＯ細胞、ＧＳ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ヒト細胞等の動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0047】
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、対象及び有効成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合する担体及び／又は賦形剤を意味し、当技術分野では周知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）、その例としては、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤としてはリン酸緩衝液が挙げられるが、これに限定されず、界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ－８０等のカチオン性、アニオン性又は非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されず、イオン強度増強剤としては塩化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。
【0048】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の効果を達成するか、又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量を意味する。例えば、疾患（例えば、腫瘍）を予防するための有効量とは、疾患（例えば、腫瘍）の発生を予防、停止、又は遅延させるのに十分な量を意味し、疾患を治療するための有効量とは、疾患を有する患者の疾患及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に予防するのに十分な量を意味する。そのような有効量を決定することは十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療に使用する有効量は、治療する疾患の重症度、患者自身の免疫系の通常の状態、年齢、体重及び性別等の患者の通常の条件、薬物の投与方法、同時に施す他の治療法等によって決まる。
【0049】
また、本発明は以下の項１～１１のいずれか一項にも関する。
【0050】
１．配列番号１～４０のいずれか１個のアミノ酸配列を有するか、又は
上述のアミノ酸配列のいずれか１個の派生配列であり、１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢナノボディの４－１ＢＢ結合親和性を保持することができるアミノ酸配列、
を有するＶＨＨ鎖を有することを特徴とする抗４－１ＢＢナノボディ。
上述のアミノ酸配列のいずれか１個の派生配列であり、１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢナノボディの４－１ＢＢ結合親和性を保持することができるアミノ酸配列、
を有するＶＨＨ鎖を有することを特徴とする抗４－１ＢＢナノボディ。
【0051】
２．Ｎ末端からＣ末端に向かって式Ｉで示される構造を有することを特徴とする融合タンパク質。
Ｚ１－Ｌ－Ｚ２（式Ｉ）
（式中、Ｚ１は、項１に記載の抗４－１ＢＢナノボディのＶＨＨ鎖の１個以上（好ましくは１～２個、より好ましくは１個）を表し、
Ｚ２は免疫グロブリンのＦｃ断片を表し、
Ｌは任意のリンカー配列を表す）
Ｚ１－Ｌ－Ｚ２（式Ｉ）
（式中、Ｚ１は、項１に記載の抗４－１ＢＢナノボディのＶＨＨ鎖の１個以上（好ましくは１～２個、より好ましくは１個）を表し、
Ｚ２は免疫グロブリンのＦｃ断片を表し、
Ｌは任意のリンカー配列を表す）
【0052】
３．項１に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は項２に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【0053】
４．項３に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【0054】
５．項４に記載の発現ベクターを含むか、又は項３に記載のポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれていることを特徴とする宿主細胞。
【0055】
６．抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質の生成に適した条件下で項５に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を含む培養物を得る工程と、
（ｂ）培養物から抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を単離又は回収する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
（ａ）抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質の生成に適した条件下で項５に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を含む培養物を得る工程と、
（ｂ）培養物から抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を単離又は回収する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【0056】
７．（ａ）項１に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は項２に記載の融合タンパク質と、
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素から成る群から選択されるカップリング部分と、
を含むことを特徴とするイムノコンジュゲート。
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素から成る群から選択されるカップリング部分と、
を含むことを特徴とするイムノコンジュゲート。
【0057】
８．（ａ）４－１ＢＢ分子を検出するための試薬又は（ｂ）腫瘍を治療するための薬物の製造における、項１に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は項２に記載の融合タンパク質の使用。
【0058】
９．（ｉ）項１に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、項２に記載の融合タンパク質、又は項７に記載のイムノコンジュゲートと、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする医薬組成物。
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする医薬組成物。
【0059】
１０．（ｉ）項１に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は項２に記載の融合タンパク質の配列と、
（ｉｉ）必要に応じて、発現及び／又は精製に役立つタグ配列と、
を含むことを特徴とする組換えタンパク質。
（ｉｉ）必要に応じて、発現及び／又は精製に役立つタグ配列と、
を含むことを特徴とする組換えタンパク質。
【0060】
１１．４－１ＢＢタンパク質と抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片との水素結合及び／又は疎水性相互作用によって形成されることを特徴とするタンパク質複合体であって、
水素結合は、４－１ＢＢタンパク質内の１１８位のＡｓｐ、１２３位のＬｅｕ、１３０位のＡｒｇ、１３２位のＶａｌ、１３４位のＣｙｓ、１３５位のＧｌｙ、及び１３７位のＳｅｒから成る群から選択される４個を超える（好ましくは５個を超える、より好ましくは６個を超える、最も好ましくは７個の）作用部位を含み、
更に、疎水性相互作用は、４－１ＢＢタンパク質内の１２３位のＬｅｕ、１２４位のＶａｌ、１３３位のＶａｌ、及び１３６位のＰｒｏから成る群から選択される２個を超える（好ましくは３個を超える、より好ましくは４個を超える）部位で構成される作用界面を有し、
４－１ＢＢタンパク質のアミノ酸ナンバリングは、配列番号１６８のナンバリングに基づく、
タンパク質複合体。
水素結合は、４－１ＢＢタンパク質内の１１８位のＡｓｐ、１２３位のＬｅｕ、１３０位のＡｒｇ、１３２位のＶａｌ、１３４位のＣｙｓ、１３５位のＧｌｙ、及び１３７位のＳｅｒから成る群から選択される４個を超える（好ましくは５個を超える、より好ましくは６個を超える、最も好ましくは７個の）作用部位を含み、
更に、疎水性相互作用は、４－１ＢＢタンパク質内の１２３位のＬｅｕ、１２４位のＶａｌ、１３３位のＶａｌ、及び１３６位のＰｒｏから成る群から選択される２個を超える（好ましくは３個を超える、より好ましくは４個を超える）部位で構成される作用界面を有し、
４－１ＢＢタンパク質のアミノ酸ナンバリングは、配列番号１６８のナンバリングに基づく、
タンパク質複合体。
【0061】
本発明は以下の第１～第１５の様相のいずれか一様相にも関する。
【0062】
本発明の第１の様相では、配列番号１～４０のいずれか１個のアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を有する抗４－１ＢＢナノボディであって、
上述のアミノ酸配列の内のいずれかのアミノ酸配列は、必要に応じて１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢナノボディの４－１ＢＢ結合親和性を保持することができる派生配列を更に含む、抗４－１ＢＢナノボディが提供される。
上述のアミノ酸配列の内のいずれかのアミノ酸配列は、必要に応じて１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢナノボディの４－１ＢＢ結合親和性を保持することができる派生配列を更に含む、抗４－１ＢＢナノボディが提供される。
【0063】
他の好ましい実施形態では、抗４－１ＢＢナノボディは、配列番号３、３５、３７、３８、３９又は４０のいずれか１個のアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を有する。
【0064】
本発明の第２の様相では、Ｎ末端からＣ末端に向かって式Ｉで示される構造を有する融合タンパク質が提供される。
Ｚ１－Ｌ－Ｚ２（式Ｉ）
（式中、Ｚ１は、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディのＶＨＨ鎖の１個以上（好ましくは１～２個、より好ましくは１個）を表し、
Ｚ２は免疫グロブリンのＦｃ断片を表し、
Ｌは任意のリンカー配列を表す）
Ｚ１－Ｌ－Ｚ２（式Ｉ）
（式中、Ｚ１は、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディのＶＨＨ鎖の１個以上（好ましくは１～２個、より好ましくは１個）を表し、
Ｚ２は免疫グロブリンのＦｃ断片を表し、
Ｌは任意のリンカー配列を表す）
【0065】
他の好ましい実施形態では、融合タンパク質は二量体であり、二量体はＺ２のＦｃ断片間のジスルフィド結合によって形成される。
【0066】
他の好ましい実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である。
【0067】
他の好ましい実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１又はその変異体である。
【0068】
他の好ましい実施形態では、Ｌは、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、又はこれらの組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0069】
他の好ましい実施形態では、Ｚ２は配列番号１６７のアミノ酸配列を有する。
【0070】
他の好ましい実施形態では、Ｚ２は、配列番号１６７のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有する。
【0071】
他の好ましい実施形態では、「実質的に同一」という用語は、最大で５０個（好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、最も好ましくは１～３個）のアミノ酸が異なっており、その差異がアミノ酸の置換、欠失又は付加を含むことを意味する。
【0072】
他の好ましい実施形態では、「実質的に同一」という用語は、アミノ酸配列が、対応するアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有することを意味する。
【0073】
他の好ましい実施形態では、融合タンパク質の式Ｉにおいて、Ｚ１は配列番号１～４０のいずれかのアミノ酸配列を有し、Ｌは無く、Ｚ２は配列番号１６７のアミノ酸配列を有し、
上述のアミノ酸配列の内のいずれかのアミノ酸配列は、必要に応じて１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢ結合親和性を保持することができる派生配列を更に含む。
上述のアミノ酸配列の内のいずれかのアミノ酸配列は、必要に応じて１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢ結合親和性を保持することができる派生配列を更に含む。
【0074】
他の好ましい実施形態では、融合タンパク質の式Ｉにおいて、Ｚ１は配列番号３、３５、３７、３８、３９又は４０のいずれかのアミノ酸配列を有し、Ｌは無く、Ｚ２は配列番号１６７のアミノ酸配列を有し、
上述のアミノ酸配列の内のいずれかのアミノ酸配列は、必要に応じて１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢ結合親和性を保持することができる派生配列を更に含む。
上述のアミノ酸配列の内のいずれかのアミノ酸配列は、必要に応じて１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢ結合親和性を保持することができる派生配列を更に含む。
【0075】
他の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号１～４０のいずれか１個の配列と配列番号１６７の配列を含むアミノ酸配列を有する。
【0076】
他の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号３、３５、３７、３８、３９又は４０のいずれか１個の配列と配列番号１６７の配列を含むアミノ酸配列を有する。
【0077】
本発明の第３の様相では、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【0078】
他の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
【0079】
本発明の第４の様相では、本発明の第３の様相に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【0080】
本発明の第５の様相では、本発明の第４の様相に記載の発現ベクターを含むか、又は本発明の第３の様相に記載のポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれている宿主細胞が提供される。
【0081】
他の好ましい実施形態では、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞を含む。
【0082】
他の好ましい実施形態では、宿主細胞は大腸菌、酵母細胞、及び哺乳動物細胞から成る群から選択される。
【0083】
本発明の第６の様相では、抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を生成するのに適した条件下で本発明の第５の様相に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を含む培養物を得る工程と、
（ｂ）培養物から抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を単離又は回収する工程と、
を含む方法が提供される。
（ａ）抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を生成するのに適した条件下で本発明の第５の様相に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を含む培養物を得る工程と、
（ｂ）培養物から抗４－１ＢＢナノボディ又は融合タンパク質を単離又は回収する工程と、
を含む方法が提供される。
【0084】
本発明の第７の様相では、
（ａ）本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質と、
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素から成る群から選択されるカップリング部分と、
を含むイムノコンジュゲートが提供される。
（ａ）本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質と、
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素から成る群から選択されるカップリング部分と、
を含むイムノコンジュゲートが提供される。
【0085】
他の好ましい実施形態では、カップリング部分は薬物又は毒素である。
【0086】
他の好ましい実施形態では、カップリング部分は検出可能な標識である。
【0087】
他の好ましい実施形態では、カップリング部分は、蛍光又は発光標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）又はＣＴ（コンピュータＸ線断層撮影法）造影剤、又は検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２等）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、薬物前駆体活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）又はビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）、又は任意の形態のナノ粒子等から選択される。
【0088】
他の好ましい実施形態では、イムノコンジュゲートは、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質の多価（例えば、二価）の形態を含む。
【0089】
他の好ましい実施形態では、「多価」という用語は、イムノコンジュゲートが、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、又は第２の様相に記載の融合タンパク質の複数の繰り返しを含むアミノ酸配列を有することを意味する。
【0090】
本発明の第８の様相では、（ａ）４－１ＢＢ分子を検出するための試薬、又は（ｂ）腫瘍を治療するための薬物の製造における、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質の使用が提供される。
【0091】
他の好ましい実施形態では、検出はフロー検出と細胞免疫蛍光検出を含む。
【0092】
本発明の第９の様相では、
（ｉ）本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質、又は本発明の第７の様相に記載のイムノコンジュゲートと、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、
を含む医薬組成物が提供される。
（ｉ）本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質、又は本発明の第７の様相に記載のイムノコンジュゲートと、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、
を含む医薬組成物が提供される。
【0093】
他の好ましい実施形態では、医薬組成物は注射剤の形態である。
【0094】
他の好ましい実施形態では、医薬組成物を使用して腫瘍を治療するための薬物を調製し、腫瘍は、胃がん、肝臓がん、白血病、腎臓腫瘍、肺がん、小腸がん、骨がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、結腸がん、子宮頸がん、リンパ腫、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、黒色腫、頭頸部がん、上咽頭がん、甲状腺腫瘍、舌がん、又はこれらの組み合わせから成る群から選択される。
【0095】
本発明の第１０の様相では、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質の次の使用の内の一以上が提供される。
（ｉ）ヒト４－１ＢＢ分子の検出のための使用、
（ｉｉ）フロー検出のための使用、
（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のための使用、
（ｉｖ）腫瘍の治療のための使用、及び
（ｖ）腫瘍診断のための使用
（ｉ）ヒト４－１ＢＢ分子の検出のための使用、
（ｉｉ）フロー検出のための使用、
（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のための使用、
（ｉｖ）腫瘍の治療のための使用、及び
（ｖ）腫瘍診断のための使用
【0096】
他の好ましい実施形態では、使用は非診断的且つ非治療的である。
【0097】
本発明の第１１の様相では、
（ｉ）本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質の配列と
（ｉｉ）必要に応じて、発現及び／又は精製を助けるためのタグ配列と、
を含む組換えタンパク質が提供される。
（ｉ）本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質の配列と
（ｉｉ）必要に応じて、発現及び／又は精製を助けるためのタグ配列と、
を含む組換えタンパク質が提供される。
【0098】
他の好ましい実施形態では、タグ配列は６Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｆｃタグ、又はそれらの組み合わせを含む。
【0099】
他の好ましい実施形態では、組換えタンパク質は４－１ＢＢタンパク質に特異的に結合する。
【0100】
本発明の第１２の様相では、薬剤、試薬、検出プレート又はキットを調製するのに使用される、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質、又は本発明の第７の様相に記載のイムノコンジュゲートが提供されるが、
試薬、検出プレート又はキットは、試料中の４－１ＢＢタンパク質を検出するために使用され、
薬剤は、様々な血液腫瘍及び固形腫瘍を治療又は予防するために使用される。
試薬、検出プレート又はキットは、試料中の４－１ＢＢタンパク質を検出するために使用され、
薬剤は、様々な血液腫瘍及び固形腫瘍を治療又は予防するために使用される。
【0101】
他の好ましい実施形態では、腫瘍は、胃がん、リンパ腫、肝臓がん、白血病、腎臓腫瘍、肺がん、小腸がん、骨がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、結腸がん、副腎腫瘍、黒色腫、頭頸部がん、上咽頭がん、甲状腺腫瘍、舌がん、又はこれらの組み合わせを含む。
【0102】
本発明の第１３の様相では、試料中の４－１ＢＢタンパク質を検出するための方法であって、
（１）本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質に試料を接触させる工程と、
（２）抗原抗体複合体が形成されているかどうか検出する工程と、
を含み、
複合体の形成は試料中の４－１ＢＢタンパク質の存在を示す、
方法が提供される。
（１）本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ又は本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質に試料を接触させる工程と、
（２）抗原抗体複合体が形成されているかどうか検出する工程と、
を含み、
複合体の形成は試料中の４－１ＢＢタンパク質の存在を示す、
方法が提供される。
【0103】
他の好ましい実施形態では、検出は定性的検出と定量的検出を含む。
【0104】
本発明の第１４の様相では、疾患を治療するための方法であって、
本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質、又は本発明の第７の様相に記載のイムノコンジュゲートをそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法が提供される。
本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディ、本発明の第２の様相に記載の融合タンパク質、又は本発明の第７の様相に記載のイムノコンジュゲートをそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法が提供される。
【0105】
他の好ましい実施形態では、対象は哺乳動物を含む。
【0106】
他の好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【0107】
本発明の第１５の様相では、４－１ＢＢタンパク質と抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片との相互作用によって形成されるタンパク質複合体が提供される。
【0108】
他の好ましい実施形態では、相互作用は水素結合と疎水性相互作用を含む。
【0109】
他の好ましい実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体は抗４－１ＢＢナノボディである。
【0110】
他の好ましい実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体は本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディである。
【0111】
他の好ましい実施形態では、複合体は、４－１ＢＢタンパク質と抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片との水素結合及び／又は疎水性相互作用によって形成され、
水素結合は、４－１ＢＢタンパク質内の１１８位のＡｓｐ、１２３位のＬｅｕ、１３０位のＡｒｇ、１３２位のＶａｌ、１３４位のＣｙｓ、１３５位のＧｌｙ、及び１３７位のＳｅｒから成る群から選択される４個を超える（好ましくは５個を超える、より好ましくは６個を超える、最も好ましくは７個の）作用部位を含み、
更に、疎水性相互作用は、４－１ＢＢタンパク質内の１２３位のＬｅｕ、１２４位のＶａｌ、１３３位のＶａｌ、及び１３６位のＰｒｏから成る群から選択される２個を超える（好ましくは３個を超える、より好ましくは４個を超える）部位で構成される作用界面を有し、
４－１ＢＢタンパク質のアミノ酸ナンバリングは、配列番号１６８のナンバリングに基づく。
水素結合は、４－１ＢＢタンパク質内の１１８位のＡｓｐ、１２３位のＬｅｕ、１３０位のＡｒｇ、１３２位のＶａｌ、１３４位のＣｙｓ、１３５位のＧｌｙ、及び１３７位のＳｅｒから成る群から選択される４個を超える（好ましくは５個を超える、より好ましくは６個を超える、最も好ましくは７個の）作用部位を含み、
更に、疎水性相互作用は、４－１ＢＢタンパク質内の１２３位のＬｅｕ、１２４位のＶａｌ、１３３位のＶａｌ、及び１３６位のＰｒｏから成る群から選択される２個を超える（好ましくは３個を超える、より好ましくは４個を超える）部位で構成される作用界面を有し、
４－１ＢＢタンパク質のアミノ酸ナンバリングは、配列番号１６８のナンバリングに基づく。
【0112】
他の好ましい実施形態では、疎水性相互作用の作用界面は、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片内の３２位のＶａｌ、３３位のＡｌａ、３７位のＴｙｒ、４７位のＬｅｕ、５２位のＩｌｅ、９７位のＴｙｒ、１０２位のＴｙｒ、及び１１５位のＴｒｐから成る群から選択される４個を超える（好ましくは５個を超える、より好ましくは６個を超える、最も好ましくは７個を超えるか又は８個を超える）部位を更に含み、
抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸ナンバリングは、配列番号１６９又は３９のナンバリングに基づく。
抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸ナンバリングは、配列番号１６９又は３９のナンバリングに基づく。
【0113】
他の好ましい実施形態では、複合体中の４－１ＢＢタンパク質は配列番号１６８のアミノ酸配列を有する。
【0114】
他の好ましい実施形態では、複合体中の抗４－１ＢＢナノボディは配列番号１６９又は３９のアミノ酸配列を有する。
【0115】
他の好ましい実施形態では、水素結合は１１８位のＡｓｐ、１２３位のＬｅｕ、１３０位のＡｒｇ、１３２位のＶａｌ、１３４位のＣｙｓ、１３５位のＧｌｙ、及び／又は１３７位のＳｅｒに位置し、
アミノ酸ナンバリングは配列番号１６８のナンバリングに基づく。
アミノ酸ナンバリングは配列番号１６８のナンバリングに基づく。
【0116】
他の好ましい実施形態では、疎水性相互作用界面は、４－１ＢＢタンパク質の１２３位のＬｅｕ、１２４位のＶａｌ、１３３位のＶａｌ及び／又は１３６位のＰｒｏに位置し、抗４－１ＢＢナノボディの３２位のＶａｌ、３３位のＡｌａ、３７位のＴｙｒ、４７位のＬｅｕ、５２位のＩｌｅ、９７位のＴｙｒ、１０２位のＴｙｒ、及び１１５位のＴｒｐに位置し、
４－１ＢＢタンパク質のアミノ酸ナンバリングは配列番号１６８のナンバリングに基づき、抗４－１ＢＢナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸ナンバリングは配列番号１６９又は３９のナンバリングに基づく。
４－１ＢＢタンパク質のアミノ酸ナンバリングは配列番号１６８のナンバリングに基づき、抗４－１ＢＢナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸ナンバリングは配列番号１６９又は３９のナンバリングに基づく。
【0117】
用語
本開示をより容易に理解できるようにするため、特定の用語を最初に定義する。本出願においては、本明細書で特に明記しない限り、以下の各用語は後述する意味を有するものとする。他の定義は本出願全体に亘って記載されている。
本開示をより容易に理解できるようにするため、特定の用語を最初に定義する。本出願においては、本明細書で特に明記しない限り、以下の各用語は後述する意味を有するものとする。他の定義は本出願全体に亘って記載されている。
【0118】
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値又は組成の許容誤差範囲内の値又は組成を意味し得るが、その値又は組成がどのように測定又は決定されるかに一部依存する。
【0119】
本明細書において、「与える」及び「投与する」という用語は互換的に使用され、当業者に知られている様々な方法や送達系（例えば、注射又は注入による静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄又は他の非経口投与経路）のいずれかによって、本発明の生成物を対象に物理的に導入することを意味する。
【0120】
本発明のナノボディ
本明細書において、「本発明のナノボディ」、「本発明の抗４－１ＢＢナノボディ」、「本発明の４－１ＢＢナノボディ」という用語は互換的に使用され、これらは全て、４－１ＢＢ（ヒト４－１ＢＢを含む）を特異的に認識して結合することができるナノボディを意味する。特に好ましいのは、配列番号１～４０のいずれか１個のアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を有するナノボディであり、より好ましくは、配列番号３、３５、３７、３８、３９又は４０のいずれか１個のアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を有するナノボディである。
本明細書において、「本発明のナノボディ」、「本発明の抗４－１ＢＢナノボディ」、「本発明の４－１ＢＢナノボディ」という用語は互換的に使用され、これらは全て、４－１ＢＢ（ヒト４－１ＢＢを含む）を特異的に認識して結合することができるナノボディを意味する。特に好ましいのは、配列番号１～４０のいずれか１個のアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を有するナノボディであり、より好ましくは、配列番号３、３５、３７、３８、３９又は４０のいずれか１個のアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を有するナノボディである。
【0121】
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）」及び「ナノボディ」という用語は同じ意味を有し、抗体重鎖可変領域をクローニングすることによって構築された唯一の重鎖可変領域で構成されたナノボディ（ＶＨＨ）を意味し、完全な機能を有する最小の抗原結合断片である。通常、軽鎖と重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を天然に欠いている抗体を得た後、抗体の重鎖可変領域をクローニングして、唯一の重鎖可変領域で構成されたナノボディ（ＶＨＨ）を構築する。
【0122】
本明細書で使用される「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、２個の同一の軽鎖（Ｌ）と２個の同一の重鎖（Ｈ）で構成された、同一の構造的特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。重鎖と軽鎖の各々は、一定間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合も有する。各重鎖は一端に可変領域（ＶＨ）を有し、その後に複数の定常領域が続く。各軽鎖は一端に可変領域（ＶＬ）を有し、他端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域の反対側にあり、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域の反対側にある。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖の可変領域間の界面を形成する。
【0123】
本明細書で使用される「可変」という用語は、抗体可変領域のある部分が配列において異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合と特異性に寄与することを意味する。しかし、可変性は抗体可変ドメイン全体に亘って均等には分布されていない。可変性は、軽鎖及び重鎖可変領域内の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と称される３個のセグメントに集中している。可変ドメインのより保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と称される。天然の重鎖及び軽鎖の可変領域は各々、大まかに折り畳まれた構成であり、場合によっては部分的に折り畳まれた構造を形成することもある、結合ループを形成する３個のＣＤＲによって接続された４個のＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接し、他の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位を形成する（Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pp. 647-669 (1991)を参照）。定常領域は抗体の抗原への結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示し、例えば、抗体の抗体依存性細胞毒性に関与している。
【0124】
当業者に知られているように、イムノコンジュゲートと融合発現産物は、本発明の抗体又はその断片に薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素及び他の診断用分子又は治療用分子を結合することによるコンジュゲートを含む。本発明は、抗４－１ＢＢタンパク質抗体又はその断片に結合することができる細胞表面標識又は抗原を更に含む。
【0125】
本明細書において、「重鎖可変領域」及び「ＶＨ」という用語は互換的に使用される。
【0126】
本明細書において、「可変領域」及び「相補性決定領域（ＣＤＲ）」という用語は互換的に使用される。
【0127】
本発明の好ましい実施形態では、抗体の重鎖可変領域は３個の相補性決定領域、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【0128】
本発明の好ましい実施形態では、抗体の重鎖は上述の重鎖可変領域と重鎖定常領域を含む。
【0129】
本発明においては、「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、又は「本発明のポリペプチド」という用語は互換的に使用され、これらは全て、４－１ＢＢタンパク質に特異的に結合するポリペプチド、例えば、開始メチオニンを含んでも含まなくてもよい、重鎖可変領域を有するタンパク質又はペプチドを意味する。
【0130】
本発明は更に、本発明の抗体を含む追加のタンパク質又は融合発現産物を提供する。具体的には、本発明は、重鎖可変領域が本発明の抗体の重鎖に対して同一であるか、又は少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同である限り、この可変領域を有する任意のタンパク質又はタンパク質コンジュゲート及び融合発現産物（即ち、イムノコンジュゲート及び融合発現産物）を含む。
【0131】
一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と称される重鎖可変領域に位置する３個の特定の領域によって説明することができ、この可変領域は４個のフレームワーク領域（ＦＲ）に分かれているが、この４個のＦＲは比較的保存されたアミノ酸配列を有し、結合反応には直接関与しない。これらのＣＤＲは環状構造を形成し、その間のＦＲが形成するβシートは空間構造において互いに近接している。重鎖のＣＤＲと軽鎖の対応するＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。同種の抗体のアミノ酸配列を比較することによって、ＦＲ又はＣＤＲ領域を構成するアミノ酸を決定することができる。ナノボディは４個のフレームワーク領域（フレームワーク）も有し、その内の第１、第３及び第４のフレームワーク領域（フレームワーク領域１、フレームワーク領域３及びフレームワーク領域４）はヒト抗体との相同性が高く、ヒト化プロセス中に改変する必要は少ないが、第２のフレームワーク領域、即ち、フレームワーク領域２（フレームワーク２）は改変することが好ましい。
【0132】
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、その少なくとも一部が抗原との結合に関与しているため特に興味深い。従って、ＣＤＲが本明細書で特定されたＣＤＲと９０％を超える（好ましくは９５％を超える、最も好ましくは９８％を超える）相同性を有する限り、本発明はＣＤＲを有する抗体重鎖可変領域を有する分子を含む。
【0133】
本発明は、インタクトな抗体だけでなく、免疫学的活性を有する抗体断片、又は抗体及び他の配列によって形成される融合タンパク質も含む。従って、本発明は、抗体の断片、誘導体及び類似体を更に含む。
【0134】
本明細書で使用される「断片」、「誘導体」及び「類似体」という用語は、本発明の抗体と同じ生物学的機能又は活性を実質的に保持するポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチド断片、誘導体又は類似体は、（ｉ）１個以上の置換された保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）を有するポリペプチド（そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号でコードされていてもされていなくてもよい）、又は（ｉｉ）１個以上のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、又は（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドを他の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を延ばす化合物、例えば、ポリエチレングリコール）に融合させて形成されるポリペプチド、又は（ｉｖ）追加のアミノ酸配列をポリペプチド配列に融合させて形成されるポリペプチド（例えば、リーダー配列又は分泌配列又はポリペプチドを精製するための配列又はプロタンパク質配列によって形成されるか、又は６Ｈｉｓタグによって形成される融合タンパク質）とすることができる。本明細書の開示に鑑み、そのような断片、誘導体及び類似体は当業者の範囲内である。
【0135】
本発明の抗体とは、４－１ＢＢタンパク質結合活性を有し、上述のＣＤＲ領域を含むポリペプチドを意味する。この用語は更に、本発明の抗体と同様の機能を有し、上述のＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異型も包含する。このような変異としては、１個以上（通常は１～５０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個）のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換、及びＣ末端及び／又はＮ末端における１個又は数個（通常２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）のアミノ酸の付加が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。例えば、当技術分野では、特性が近い又は類似したアミノ酸で置換しても、通常、タンパク質の機能は変化しない。他の例として、Ｃ末端及び／又はＮ末端へ１個又は数個のアミノ酸を付加しても、通常、タンパク質の機能は変化しない。この用語は、本発明の抗体の活性断片及び活性誘導体も包含する。
【0136】
ポリペプチドの変異体としては、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然変異体、誘導変異体、高ストリンジェント又は低ストリンジェントな条件下で本発明の抗体のＤＮＡとハイブリダイズ可能なＤＮＡによってコードされるタンパク質、及び本発明の抗体に対する抗血清を用いて得られるポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
【0137】
本発明は更に、単一ドメイン抗体又はその断片を含む融合タンパク質等の他のポリペプチドを提供する。実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体の断片を更に含む。通常、この断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続アミノ酸を有する。
【0138】
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、最大で１０個、好ましくは最大で８個、より好ましくは最大で５個、最も好ましくは最大で３個のアミノ酸配列を、本発明の抗体のアミノ酸配列に比べて特性が類似又は近いアミノ酸で置換して形成されるポリペプチドを意味する。このような保存的変異ポリペプチドは、表Ａに記載のアミノ酸置換によって生成されることが好ましい。
【表2】
【0139】
本発明は更に、上述の抗体又はその断片又はその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡの形態とすることができる。ＤＮＡの形態はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖又は二本鎖とすることができる。ＤＮＡはコード鎖又は非コード鎖のいずれかとすることができる。
【0140】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列及び様々な追加のコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（及び任意の追加のコード配列）及び非コード配列を含む。
【0141】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含することができ、又は追加のコード配列及び／又は非コード配列を包含することもできる。
【0142】
本発明は更に、上述の配列にハイブリダイズし、２個の配列間で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、（１）より低いイオン強度及びより高い温度、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃でのハイブリダイゼーションと溶出、又は（２）変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％フィコール等の存在下、４２℃等でのハイブリダイゼーション、又は（３）２個の配列間の同一性が少なくとも９０％、好ましくは９５％を超える場合にのみ生じるハイブリダイゼーションを意味する。更に、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を有する。
【0143】
本発明の抗体又はその断片の全長ヌクレオチド配列は通常、ＰＣＲ増幅、組換え又は人工合成によって得ることができる。実行可能な方法は、特に断片の長さが短い場合には、人工合成を用いて関連配列を合成することである。通常、非常に長い配列を有する断片は、複数の小さな断片を合成した後、それを連結させて得る。更に、重鎖のコード配列を発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）と融合させて融合タンパク質を形成することもできる。
【0144】
一旦関連配列を得たら、組換え法を用いて関連配列を大量に得ることができる。通常、ベクターにクローニングし、細胞に形質転換した後、増殖した宿主細胞から常法によって関連配列を単離する。本発明に関与する生体分子（核酸、タンパク質等）には、単離された形態の生体分子が含まれる。
【0145】
現在、本発明のタンパク質（又はその断片、又はその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成によって完全に得ることができる。次に、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（例えば、ベクター）や細胞にＤＮＡ配列を導入することができる。更に、化学合成によって本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【0146】
本発明は、上述の適切なＤＮＡ配列及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターにも関する。このようなベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換し、タンパク質を発現させることができる。
【0147】
宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞、又は酵母細胞等の下等真核細胞、又は哺乳類細胞等の高等真核細胞とすることができる。代表的な例は、大腸菌、ストレプトマイセス、ネズミチフス菌等の細菌細胞、酵母等の真菌細胞、ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞等の動物細胞である。
【0148】
組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって行うことができる。宿主が大腸菌等の原核生物である場合、ＤＮＡを取り入れることが可能なコンピテント細胞を指数増殖期の後に回収し、当技術分野で周知の手順によってＣａＣｌ２で処理することができる。他の方法はＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションによって形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物の場合、次のＤＮＡトランスフェクション方法、即ち、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージング等の従来の機械的方法を用いることができる。
【0149】
得られた形質転換体を従来の方法によって培養し、本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現させることができる。培養に使用する培地は、使用する宿主細胞に応じて様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養を行う。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、選択したプロモーターを適切な方法（例えば、温度シフトや化学的誘導）によって誘導し、細胞を更に一定期間に亘って培養する。
【0150】
上述の方法における組換えポリペプチドは、細胞内又は細胞膜上で発現させるか、又は細胞外に分泌させることができる。必要に応じて、組換えタンパク質は、その物理的、化学的及び他の特性を利用して、様々な分離方法によって単離及び精製することができる。このような方法は当業者に周知である。このような方法の例としては、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧破壊、超処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び他の様々な液体クロマトグラフィー技術やこれらの方法の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0151】
本発明の抗体は単独で使用するか、又は検出可能な標識（診断目的用）、治療剤、ＰＫ（タンパク質キナーゼ）修飾部分、又はこれらの物質の任意の組み合わせと併用することができる。
【0152】
診断目的用の検出可能な標識としては、蛍光標識又は発光標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）又はＣＴ（コンピュータ断層撮影法）造影剤、又は検出可能な生成物を生成できる酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【0153】
本発明の抗体と併用することができる治療剤としては、１．放射性核種、２．生物毒素、３．ＩＬ－２等のサイトカイン、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス、６．リポソーム、７．ナノ磁性粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）又はビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、９．化学療法剤（例えば、シスプラチン）又は任意の形態のナノ粒子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0154】
本発明の融合タンパク質
本明細書において「本発明の融合タンパク質」とは、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディと免疫グロブリンのＦｃ断片の両方を有する融合タンパク質を意味する。
本明細書において「本発明の融合タンパク質」とは、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディと免疫グロブリンのＦｃ断片の両方を有する融合タンパク質を意味する。
【0155】
本発明では、融合タンパク質が提供され、ナノボディ融合タンパク質はＮ末端からＣ末端に向かって式Ｉで示される構造を有する。
Ｚ１－Ｌ－Ｚ２（式Ｉ）
（式中、Ｚ１は、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディの１個以上のＶＨＨ鎖を表し、
Ｚ２は免疫グロブリンのＦｃ断片を表し、
Ｌは任意のリンカー配列を表す）
Ｚ１－Ｌ－Ｚ２（式Ｉ）
（式中、Ｚ１は、本発明の第１の様相に記載の抗４－１ＢＢナノボディの１個以上のＶＨＨ鎖を表し、
Ｚ２は免疫グロブリンのＦｃ断片を表し、
Ｌは任意のリンカー配列を表す）
【0156】
好ましくは、免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４等（好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４）、又はＩｇＧ１の異なる変異型とすることができる。
【0157】
一実施形態では、融合タンパク質は二量体であり、二量体はＺ２のＦｃ断片間のジスルフィド結合によって形成される。
【0158】
一実施形態では、Ｌは、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、又はこれらの組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0159】
好ましい実施形態では、Ｚ２は配列番号１６７のアミノ酸配列を有する。
【0160】
他の実施形態では、Ｚ２は、配列番号１６７のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有する。
【0161】
好ましくは、「実質的に同一」という用語は、最大で５０個（好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、最も好ましくは１～３個）のアミノ酸が異なっており、その差異がアミノ酸の置換、欠失又は付加を含むことを意味する。
【0162】
好ましくは、「実質的に同一」という用語は、アミノ酸配列が、対応するアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有することを意味する。
【0163】
本発明の好ましい実施形態では、融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号１～４０のいずれかの配列と配列番号１６７の配列を含み、
上述のアミノ酸配列の内のいずれかのアミノ酸配列は、必要に応じて１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢ結合親和性を保持することができる派生配列を更に含む。
上述のアミノ酸配列の内のいずれかのアミノ酸配列は、必要に応じて１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基が付加、欠失、改変及び／又は置換されており、４－１ＢＢ結合親和性を保持することができる派生配列を更に含む。
【0164】
本発明の融合タンパク質は、高い二重標的結合親和性と強い特異性という利点を有し、それによって抗腫瘍免疫機能を更に高める。
【0165】
医薬組成物
本発明は組成物も提供する。好ましくは、この組成物は、上述の抗体又はその活性断片又はその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。通常、このような材料は、無毒性、不活性で薬学的に許容される水性担体媒体で処方することができ、そのｐＨは通常約５～８、好ましくは約６～８であるが、ｐＨ値は処方される物質の性質と治療する条件に応じて変更することができる。調製された医薬組成物は、従来の経路（例えば、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与又は局所投与が挙げられるが、これらに限定されない）によって投与することができる。
本発明は組成物も提供する。好ましくは、この組成物は、上述の抗体又はその活性断片又はその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。通常、このような材料は、無毒性、不活性で薬学的に許容される水性担体媒体で処方することができ、そのｐＨは通常約５～８、好ましくは約６～８であるが、ｐＨ値は処方される物質の性質と治療する条件に応じて変更することができる。調製された医薬組成物は、従来の経路（例えば、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与又は局所投与が挙げられるが、これらに限定されない）によって投与することができる。
【0166】
本発明の医薬組成物は、４－１ＢＢタンパク質分子を結合するのに直接使用することができるため、腫瘍の治療に使用することができる。更に、追加の治療剤を併用することもできる。
【0167】
本発明の医薬組成物は、安全且つ有効な量（例えば、０．００１～９９重量％、好ましくは０．０１～９０重量％、より好ましくは０．１～８０重量％）の本発明の上述の単一ドメイン抗体（又はそのコンジュゲート）と薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。そのような担体としては、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。医薬処方は投与方法とマッチさせる必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水又はグルコースや他のアジュバントを含む水溶液を用い、従来法によって注射剤の形態で調製することができる。注射剤や溶液剤等の医薬組成物は無菌条件下で製造することが好ましい。治療有効量、例えば、１日当たり約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重で有効成分を投与する。更に、本発明のポリペプチドを追加の治療剤と共に使用することもできる。
【0168】
医薬組成物を使用する場合、安全且つ有効な量のイムノコンジュゲートを哺乳動物に投与するが、安全且つ有効な量は通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であって、殆どの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重以下であり、好ましくは、投与量は約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。しかし、特定の投与量については投与経路や患者の健康状態等の因子も考慮するべきであり、これは、熟練した医師の技術の範囲内である。
【0169】
標識ナノボディ
本発明の好ましい実施形態では、ナノボディは検出可能な標識を有する。より好ましくは、標識は同位体、金コロイド標識、着色標識又は蛍光標識から成る群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、ナノボディは検出可能な標識を有する。より好ましくは、標識は同位体、金コロイド標識、着色標識又は蛍光標識から成る群から選択される。
【0170】
金コロイド標識は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。本発明の好ましい実施形態では、抗４－１ＢＢナノボディをコロイド金で標識して金コロイド標識ナノボディを得る。
【0171】
本発明の抗４－１ＢＢナノボディは良好な特異性と高い力価を有する。
【0172】
検出方法
本発明は４－１ＢＢタンパク質を検出するための方法にも関する。この方法は概して次の段階、即ち、細胞試料及び／又は組織試料を得る段階と、試料を媒体に溶解する段階と、溶解した試料中の４－１ＢＢタンパク質のレベルを検出する段階を含む。
本発明は４－１ＢＢタンパク質を検出するための方法にも関する。この方法は概して次の段階、即ち、細胞試料及び／又は組織試料を得る段階と、試料を媒体に溶解する段階と、溶解した試料中の４－１ＢＢタンパク質のレベルを検出する段階を含む。
【0173】
本発明の検出方法では、使用する試料は特に限定されないが、細胞保存液中に存在する細胞含有試料が代表例である。
【0174】
キット
本発明は、本発明の抗体（又はその断片）又は融合タンパク質又は検出プレートを含むキットも提供する。本発明の好ましい実施形態では、キットは容器、取扱説明書、緩衝液等を更に含む。
本発明は、本発明の抗体（又はその断片）又は融合タンパク質又は検出プレートを含むキットも提供する。本発明の好ましい実施形態では、キットは容器、取扱説明書、緩衝液等を更に含む。
【0175】
本発明は、４－１ＢＢのレベルを検出するための検出キットであって、４－１ＢＢタンパク質を認識可能な抗体、試料を溶解するための溶解媒体、検出に必要な一般的な試薬と緩衝液、例えば、各種緩衝液、検出標識、検出基板等を含む検出キットも提供する。この検査キットはインビトロ診断装置とすることができる。
【0176】
用途
上述のように、本発明のナノボディは様々な生物学的及び臨床的応用価値を有し、その用途は４－１ＢＢに関連する疾患の診断と治療、基礎医学研究、生物学研究及び他の分野に関する。
上述のように、本発明のナノボディは様々な生物学的及び臨床的応用価値を有し、その用途は４－１ＢＢに関連する疾患の診断と治療、基礎医学研究、生物学研究及び他の分野に関する。
【0177】
好ましい用途は４－１ＢＢに対する臨床診断と標的療法に関する。
【発明の効果】
【0178】
本発明の有益な効果
本発明は以下の技術的効果のいずれか１個以上を達成する。
１）本発明のナノボディは分子量が小さい。
２）本発明のナノボディは、ヒト４－１ＢＢタンパク質に高度に特異的に結合すると同時に、カニクイザルタンパク質に交差結合することができる。
３）本発明のナノボディは、活性化機能を発揮するのに外部架橋を必要とするため、優れた活性と安全性を有する。
４）本発明のナノボディは、天然状態では４－１ＢＢリガンドの４－１ＢＢへの結合をブロックしない。
５）ウレルマブは、抗４－１ＢＢアゴニスト分子として、その超活性化活性に起因する臨床的な肝毒性を有する。本発明の抗体の重要な利点は、ウレルマブやウトミルマブとは４－１ＢＢへの結合部位が異なり、その活性化活性がウレルマブとウトミルマブの間にあることである。
本発明は以下の技術的効果のいずれか１個以上を達成する。
１）本発明のナノボディは分子量が小さい。
２）本発明のナノボディは、ヒト４－１ＢＢタンパク質に高度に特異的に結合すると同時に、カニクイザルタンパク質に交差結合することができる。
３）本発明のナノボディは、活性化機能を発揮するのに外部架橋を必要とするため、優れた活性と安全性を有する。
４）本発明のナノボディは、天然状態では４－１ＢＢリガンドの４－１ＢＢへの結合をブロックしない。
５）ウレルマブは、抗４－１ＢＢアゴニスト分子として、その超活性化活性に起因する臨床的な肝毒性を有する。本発明の抗体の重要な利点は、ウレルマブやウトミルマブとは４－１ＢＢへの結合部位が異なり、その活性化活性がウレルマブとウトミルマブの間にあることである。
【図面の簡単な説明】
【0179】
【発明を実施するための形態】
【0180】
本発明において、関与する抗４－１ＢＢナノボディとそのＣＤＲの配列番号を以下の表Ｂに示す。
【表3】
【0181】
ここで、各ナノボディのＣＤＲはＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される。
備考：表Ｃにおいて、配列番号４１～１６０はＣＤＲ配列であり、幾つかの配列は同一の場合もあるが、表記の便宜上、異なる番号を使用する。
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【0182】
本発明を実施するための具体的なモデル
以下の具体的な実施例と共に本発明について更に説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ用いられ、本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解されたい。以下の実施例で具体的な条件が与えられていない実験方法は通常、Sambrook et al., Molecular cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載の条件等の従来の条件に従って行うか、又は製造業者が推奨する条件に従って行う。特に明記しない限り、百分率（％）と部は重量による。
以下の具体的な実施例と共に本発明について更に説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ用いられ、本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解されたい。以下の実施例で具体的な条件が与えられていない実験方法は通常、Sambrook et al., Molecular cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載の条件等の従来の条件に従って行うか、又は製造業者が推奨する条件に従って行う。特に明記しない限り、百分率（％）と部は重量による。
【実施例】
【0183】
実施例１：ナノボディライブラリーの構築
１．１ 動物の免疫化
ヒト４－１ＢＢ抗原（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）１ｍｇを等量のフロイントアジュバントと混合し、これを用いて２頭のアルパカ（ラマ）を週１回免疫化し、免疫化を計４回行ってＢ細胞を刺激し、抗原特異的ナノボディを発現させた。４回の免疫化後、アルパカの末梢血５０ｍＬを採取し、リンパ球分離培地でリンパ球を分離した。ＲＮＡ抽出試薬トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を用いた逆転写によってアルパカの全ｃＤＮＡを得た。
１．１ 動物の免疫化
ヒト４－１ＢＢ抗原（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）１ｍｇを等量のフロイントアジュバントと混合し、これを用いて２頭のアルパカ（ラマ）を週１回免疫化し、免疫化を計４回行ってＢ細胞を刺激し、抗原特異的ナノボディを発現させた。４回の免疫化後、アルパカの末梢血５０ｍＬを採取し、リンパ球分離培地でリンパ球を分離した。ＲＮＡ抽出試薬トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を用いた逆転写によってアルパカの全ｃＤＮＡを得た。
【0184】
１．２ ナノボディ遺伝子の増幅
ＰＣＲの第１ラウンドでは、ｃＤＮＡからＩｇＧ２配列とＩｇＧ３配列を増幅した。
ＰＣＲの第１ラウンドでは、ｃＤＮＡからＩｇＧ２配列とＩｇＧ３配列を増幅した。
【表12】
【0185】
第１ラウンドのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを切断して回収した７５０ｂｐの断片を第２ラウンドのＶＨＨ配列増幅に使用した。第２ラウンドのＰＣＲ増幅のプライマーは次の通りである。
【表13】
【0186】
第２ラウンドのＰＣＲ産物を鋳型に使用して第３ラウンドのＰＣＲを行い、ＶＨＨ遺伝子にホモロジーアームを付加した。第３ラウンドのＰＣＲ増幅のプライマーは次の通りである。
【表14】
【0187】
ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社から購入）を用いて標的断片を回収した。
【0188】
１．３ ライブラリー構築
直線化酵母ディスプレイベクターと第３ラウンドのＰＣＲ産物を混合し、サッカロミセスセレヴィシエ（ＡＴＣＣ（登録商標）２０８２８）に電気形質転換して、２頭のアルパカから抗４－１ＢＢナノボディライブラリーを構築した。
直線化酵母ディスプレイベクターと第３ラウンドのＰＣＲ産物を混合し、サッカロミセスセレヴィシエ（ＡＴＣＣ（登録商標）２０８２８）に電気形質転換して、２頭のアルパカから抗４－１ＢＢナノボディライブラリーを構築した。
【0189】
実施例２：４－１ＢＢナノボディのスクリーニング
２．１ ヒト４－１ＢＢタンパク質のビオチン標識
適量の２回蒸留水を用いてヒト４－１ＢＢタンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）を溶解し、ビオチン標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）の製品説明書に従ってビオチンを溶解し、タンパク質溶液と混合し、４℃で２時間インキュベートした。脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）を使用して余分なビオチンを除去した。脱塩カラム前処理と試料回収の操作は全て、製品説明書に記載の手順を参照した。
２．１ ヒト４－１ＢＢタンパク質のビオチン標識
適量の２回蒸留水を用いてヒト４－１ＢＢタンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）を溶解し、ビオチン標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）の製品説明書に従ってビオチンを溶解し、タンパク質溶液と混合し、４℃で２時間インキュベートした。脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）を使用して余分なビオチンを除去した。脱塩カラム前処理と試料回収の操作は全て、製品説明書に記載の手順を参照した。
【0190】
２．２ ４－１ＢＢに特異的に結合可能な酵母のＭＡＣＳ（磁気活性化セルソーティング）濃縮
実施例１で構築したＶＨＨライブラリーをＳＤ－ＣＡＡ増殖培地（６．７ｇのＹＮＢ、５ｇのカザミノ酸、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４、及び２％グルコースを含む１ＬのＳＤ－ＣＡＡ増殖培地）に播種し、３０℃、２２５ｒｐｍで一晩培養した。適量の酵母細胞を採取し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して培地を除去し、酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ誘導培地に再懸濁させ、一晩誘導した。誘導後のライブラリー濃度を測定し、適量の酵母細胞を採取し、遠心分離して培地を除去した。酵母細胞を５０ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させ、遠心分離して上清を除去した。酵母細胞を１０ｍＬの洗浄緩衝液に再懸濁させた。
実施例１で構築したＶＨＨライブラリーをＳＤ－ＣＡＡ増殖培地（６．７ｇのＹＮＢ、５ｇのカザミノ酸、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４、及び２％グルコースを含む１ＬのＳＤ－ＣＡＡ増殖培地）に播種し、３０℃、２２５ｒｐｍで一晩培養した。適量の酵母細胞を採取し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して培地を除去し、酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ誘導培地に再懸濁させ、一晩誘導した。誘導後のライブラリー濃度を測定し、適量の酵母細胞を採取し、遠心分離して培地を除去した。酵母細胞を５０ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させ、遠心分離して上清を除去した。酵母細胞を１０ｍＬの洗浄緩衝液に再懸濁させた。
【0191】
ビオチン標識４－１ＢＢタンパク質（最終濃度は１００ｍＭ）を添加し、室温で３０分間インキュベートし、遠心分離によって酵母細胞を回収し、酵母細胞を５０ｍＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。酵母細胞を５ｍＬの洗浄緩衝液に再懸濁させ、２００μＬのＳＡ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社から購入）を添加し、逆さにして１０分間インキュベートした。酵母細胞と磁気ビーズの混合物を洗浄緩衝液で３回洗浄し、混合物をＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社から購入）に添加した。ＬＳカラムを磁気スタンドに置き、洗浄緩衝液で洗浄して、非特異的に結合した酵母細胞を除去した。磁気スタンドからカラムを取り出し、洗浄緩衝液を添加して酵母細胞を溶出させた。溶出した酵母細胞を遠心分離し、２００ｍＬのＳＤ－ＣＡＡ増殖培地に移して増幅を行った。
【0192】
２．３ 高親和性酵母細胞を得るためのフローサイトメトリーソーティング
ＭＡＣＳによって濃縮した酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ増殖培地に播種し、振盪フラスコ内で３０℃、２２５ｒｐｍで一晩培養した。酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ誘導培地（６．７ｇのＹＮＢ、５ｇのカザミノ酸、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４と共に２％ガラクトース、２％ラフィノース及び０．１％グルコースを含む１ＬのＳＤ－ＣＡＡ誘導培地）に再懸濁させ、一晩誘導した。１：２００希釈抗ｃ－Ｍｙｃマウス抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）と１００ｎＭビオチン標識４－１ＢＢ抗原を添加し、室温で１０分間インキュベートした。ＰＢＳを添加して酵母細胞を３回洗浄し、１：５００希釈ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）とストレプトアビジンＡＰＣ結合蛍光抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を添加し、暗所にて４℃で１５分間インキュベートした。２ｍＬのＰＢＳを添加して細胞を再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ装置を用い、４－１ＢＢ抗原に対する結合能の高い酵母細胞をソーティングして得た。
ＭＡＣＳによって濃縮した酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ増殖培地に播種し、振盪フラスコ内で３０℃、２２５ｒｐｍで一晩培養した。酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ誘導培地（６．７ｇのＹＮＢ、５ｇのカザミノ酸、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４と共に２％ガラクトース、２％ラフィノース及び０．１％グルコースを含む１ＬのＳＤ－ＣＡＡ誘導培地）に再懸濁させ、一晩誘導した。１：２００希釈抗ｃ－Ｍｙｃマウス抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）と１００ｎＭビオチン標識４－１ＢＢ抗原を添加し、室温で１０分間インキュベートした。ＰＢＳを添加して酵母細胞を３回洗浄し、１：５００希釈ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）とストレプトアビジンＡＰＣ結合蛍光抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を添加し、暗所にて４℃で１５分間インキュベートした。２ｍＬのＰＢＳを添加して細胞を再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ装置を用い、４－１ＢＢ抗原に対する結合能の高い酵母細胞をソーティングして得た。
【0193】
２．４ ４－１ＢＢナノボディ候補分子の遺伝子の取得
ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳ濃縮によって得た４－１ＢＢ抗原に対する結合能の高い酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ増幅培地にて３０℃、２２５ｒｐｍで一晩培養し、酵母プラスミド抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ社から購入）を用いてプラスミドを抽出した。このプラスミドをＴｏｐ１０コンピテント細胞（Ｔｉａｎｇｅｎ社から購入）に電気形質転換し、アンピシリン耐性プレートにコーティングし、３７℃で一晩培養した。単一クローンを採取し、配列決定してＶＨＨ遺伝子配列を得た。
ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳ濃縮によって得た４－１ＢＢ抗原に対する結合能の高い酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ増幅培地にて３０℃、２２５ｒｐｍで一晩培養し、酵母プラスミド抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ社から購入）を用いてプラスミドを抽出した。このプラスミドをＴｏｐ１０コンピテント細胞（Ｔｉａｎｇｅｎ社から購入）に電気形質転換し、アンピシリン耐性プレートにコーティングし、３７℃で一晩培養した。単一クローンを採取し、配列決定してＶＨＨ遺伝子配列を得た。
【0194】
実施例３：重鎖抗体融合タンパク質の構築と発現精製
３．１ ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターへの抗体遺伝子の構築
実施例２で得たＶＨＨ遺伝子配列をヒトＩｇＧ１のＦｃ断片に連結し（ＬＡＬＡ変異）、直線化したｐＣＤＮＡ３．１ベクターを相同リコンビナーゼ（Ｖａｚｙｍｅ社から購入）とＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで二重消化したが、手順は製品説明書に従って行った。相同組換え産物をＴｏｐ１０コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリン耐性プレートにコーティングし、３７℃で一晩培養し、単一クローンを採取して配列決定した。
３．１ ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターへの抗体遺伝子の構築
実施例２で得たＶＨＨ遺伝子配列をヒトＩｇＧ１のＦｃ断片に連結し（ＬＡＬＡ変異）、直線化したｐＣＤＮＡ３．１ベクターを相同リコンビナーゼ（Ｖａｚｙｍｅ社から購入）とＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで二重消化したが、手順は製品説明書に従って行った。相同組換え産物をＴｏｐ１０コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリン耐性プレートにコーティングし、３７℃で一晩培養し、単一クローンを採取して配列決定した。
【0195】
３．２ 細胞トランスフェクション
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システムキット（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）を使用して、プラスミドをＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞に導入した。トランスフェクション方法は製品説明書に従って行った。細胞を５日間培養した後、上清を回収し、プロテインＡ磁気ビーズ（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉｎｓｉｒｕｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を用いたソーティング法によって標的タンパク質を精製した。磁気ビーズを適量の結合緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）（磁気ビーズの体積の１～４倍）に再懸濁させ、精製する試料に添加し、穏やかに振盪させながら室温で１時間インキュベートした。試料を磁気スタンド（Ｓｕｚｈｏｕ Ｂｅａｖｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）に置き、上清を廃棄し、磁気ビーズを結合緩衝液で３回洗浄した。溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）を磁気ビーズの体積の３～５倍添加し、室温で５～１０分間振盪した後、磁気スタンドに戻し、溶出緩衝液を回収し、中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５４）を添加した回収チューブに移し、十分に混合した。精製した４－１ＢＢ抗体融合タンパク質試料を以下の実施例４～実施例７で使用した。
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システムキット（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）を使用して、プラスミドをＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞に導入した。トランスフェクション方法は製品説明書に従って行った。細胞を５日間培養した後、上清を回収し、プロテインＡ磁気ビーズ（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉｎｓｉｒｕｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を用いたソーティング法によって標的タンパク質を精製した。磁気ビーズを適量の結合緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）（磁気ビーズの体積の１～４倍）に再懸濁させ、精製する試料に添加し、穏やかに振盪させながら室温で１時間インキュベートした。試料を磁気スタンド（Ｓｕｚｈｏｕ Ｂｅａｖｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）に置き、上清を廃棄し、磁気ビーズを結合緩衝液で３回洗浄した。溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）を磁気ビーズの体積の３～５倍添加し、室温で５～１０分間振盪した後、磁気スタンドに戻し、溶出緩衝液を回収し、中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５４）を添加した回収チューブに移し、十分に混合した。精製した４－１ＢＢ抗体融合タンパク質試料を以下の実施例４～実施例７で使用した。
【0196】
実施例４：４－１ＢＢ抗体融合タンパク質の親和性測定
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は既存の方法（Estep, P et al., Solution-based measurement of high-throughput antibody-antigen affinity and epitope classification, MAbs, 2013.5(2):p.270-8）に従って行った。即ち、センサーをアッセイ緩衝液にて３０分間オフラインで平衡化した後、６０秒間オンラインで検出してベースラインを確立し、上述のように得た精製抗体をオンラインでＡＨＱセンサーにロードした。次に、センサーを１００ｎＭの４－１ＢＢ抗原に入れて５分間作用させ、センサーをＰＢＳに移し、５分間解離させた。動態学の分析は１：１結合モデルを使用して行った。
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は既存の方法（Estep, P et al., Solution-based measurement of high-throughput antibody-antigen affinity and epitope classification, MAbs, 2013.5(2):p.270-8）に従って行った。即ち、センサーをアッセイ緩衝液にて３０分間オフラインで平衡化した後、６０秒間オンラインで検出してベースラインを確立し、上述のように得た精製抗体をオンラインでＡＨＱセンサーにロードした。次に、センサーを１００ｎＭの４－１ＢＢ抗原に入れて５分間作用させ、センサーをＰＢＳに移し、５分間解離させた。動態学の分析は１：１結合モデルを使用して行った。
【0197】
実験結果を以下の表４に示した。
【表15】
【0198】
この結果から、本発明の抗４－１ＢＢ分子の一価親和性が１Ｅ－０８のレベルにあり、アゴニスト分子の開発の要件を満たすことが分かった。
【0199】
実施例５：ヒト４－１ＢＢ ＣＨＯ－Ｓ細胞への４－１ＢＢ抗体融合タンパク質の結合
ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈ４－１ＢＢ細胞）は、ＭＣＳ（多重クローニング部位）にクローニングされたヒト４－１ＢＢｃＤＮＡをコードするｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）のトランスフェクションによって生成した。増殖したＣＨＯ－ｈ４－１ＢＢ細胞の細胞密度を２×１０６個／ｍＬに調整し、９６ウェルフロープレートに１００μＬ／ウェルで添加し、遠心分離して以降の使用に備えた。精製した４－１ＢＢ抗体をＰＢＳで３倍希釈した（４００ｎＭから開始して計１２点）。上述の細胞含有９６ウェルフロープレートに上述の希釈試料を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）（Ａｂｃａｍ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳに再懸濁させた細胞を１００μＬ／ウェルで添加し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ社製）フローサイトメーターで検出し、対応するＭＦＩを計算した。
ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈ４－１ＢＢ細胞）は、ＭＣＳ（多重クローニング部位）にクローニングされたヒト４－１ＢＢｃＤＮＡをコードするｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）のトランスフェクションによって生成した。増殖したＣＨＯ－ｈ４－１ＢＢ細胞の細胞密度を２×１０６個／ｍＬに調整し、９６ウェルフロープレートに１００μＬ／ウェルで添加し、遠心分離して以降の使用に備えた。精製した４－１ＢＢ抗体をＰＢＳで３倍希釈した（４００ｎＭから開始して計１２点）。上述の細胞含有９６ウェルフロープレートに上述の希釈試料を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）（Ａｂｃａｍ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳに再懸濁させた細胞を１００μＬ／ウェルで添加し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ社製）フローサイトメーターで検出し、対応するＭＦＩを計算した。
【0200】
【0201】
この結果から、本発明の精製試料は全てＣＨＯ－ｈ４－１ＢＢ細胞への結合活性を有し、幾つかの精製試料の活性は対照抗体ウレルマブ（米国特許出願公開第２００９００６８１９２号）と同等であることが分かった。
【0202】
実施例６：カニクイザル４－１ＢＢタンパク質への４－１ＢＢ抗体融合タンパク質の結合
カニクイザル４－１ＢＢ－ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ社から購入）を説明書に従って溶解し、ＥＬＩＳＡコーティング溶液（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社から購入）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩放置し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％ＢＳＡ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社から購入）にて室温で１時間ブロックした。コーティング溶液を廃棄し、１％ＢＳＡで３倍段階希釈（２００ｎＭから開始して計１２点）した４－１ＢＢ抗体を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ（ａｂｃａｍ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ発色溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で３分間反応させ、ＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、４５０ｎｍでの吸光度値を読み取った。
カニクイザル４－１ＢＢ－ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ社から購入）を説明書に従って溶解し、ＥＬＩＳＡコーティング溶液（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社から購入）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩放置し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％ＢＳＡ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社から購入）にて室温で１時間ブロックした。コーティング溶液を廃棄し、１％ＢＳＡで３倍段階希釈（２００ｎＭから開始して計１２点）した４－１ＢＢ抗体を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ（ａｂｃａｍ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ発色溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で３分間反応させ、ＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、４５０ｎｍでの吸光度値を読み取った。
【0203】
実験結果を図２Ａと図２Ｂに示した。本発明の幾つかの精製試料（例えば、Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６とＡ－Ｎａ－１９）及び対照抗体ウトミルマブは、カニクイザル４－１ＢＢタンパク質に対して良好な結合活性を有していたが、対照抗体ウレルマブ（米国特許出願公開第２００９００６８１９２号）は、カニクイザル４－１ＢＢタンパク質に対する結合活性が弱かった。
【0204】
実施例７：４－１ＢＢ抗体融合タンパク質による初代Ｔ細胞の活性化の測定
ＯＫＴ－３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入）を滅菌ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社から購入）で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェル細胞培養平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）に５０μＬ／ウェルでコーティングし、ＰＢＳで段階希釈した抗４－１ＢＢ抗体を５０μＬ／ウェルで同時に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。凍結したヒトＰＢＭＣ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｉｌｉ社から購入）を蘇生させ、ヒトＴ細胞単離精製キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社から購入）を用いてＴ細胞を単離し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（ＬＯＮＺＡ社から購入）にＴ細胞を再懸濁させ、細胞密度が０．５×１０６個／ｍＬとなるように調整し、以降の使用に備えた。抗体コーティング終了後、コーティング溶液を廃棄し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄し、上述のＴ細胞懸濁液を２００μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートし、上清を回収してＩＦＮ－γ含有量を検出した。
ＯＫＴ－３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入）を滅菌ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社から購入）で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェル細胞培養平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）に５０μＬ／ウェルでコーティングし、ＰＢＳで段階希釈した抗４－１ＢＢ抗体を５０μＬ／ウェルで同時に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。凍結したヒトＰＢＭＣ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｉｌｉ社から購入）を蘇生させ、ヒトＴ細胞単離精製キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社から購入）を用いてＴ細胞を単離し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（ＬＯＮＺＡ社から購入）にＴ細胞を再懸濁させ、細胞密度が０．５×１０６個／ｍＬとなるように調整し、以降の使用に備えた。抗体コーティング終了後、コーティング溶液を廃棄し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄し、上述のＴ細胞懸濁液を２００μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートし、上清を回収してＩＦＮ－γ含有量を検出した。
【0205】
実験結果を図３Ａと図３Ｂに示した。本発明の幾つかの精製試料は、ヒト初代Ｔ細胞を活性化してＩＦＮ－γを分泌することができ、幾つかの試料（例えば、Ａ－Ｎａ－１６、Ａ－Ｎａ－１８、Ａ－Ｎａ－１９）は対照抗体ウレルマブ（米国特許出願公開第２００９００６８１９２号）に匹敵する活性を有しており、幾つかの試料（例えば、Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６、Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１７）はウレルマブとウトミルマブの間の活性を有していた。
【0206】
実施例８：４－１ＢＢ抗体のヒト化と発現
ヒトにおけるモノクローナル抗体の免疫原性を低下させるために、Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６抗体とＡ－Ｎａ－１９抗体をヒト化した。ヒト化の方法は、ＶＨＨヒト化の一般的なフレームワーク移植方法によって行い、同時に抗体フレームワーク２（フレームワーク２）の一部のアミノ酸を文献で報告されている方法（Vincke, C., et al., General strategy for humanizing camelid single-domain antibodies and identifying universal humanized nanobody scaffolds. J Biol Chem 284 (5): 3273-3284）に従って変異させて行った。配列番号３９～４０と配列番号３７～３８の配列がそれぞれ得られた。
ヒトにおけるモノクローナル抗体の免疫原性を低下させるために、Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６抗体とＡ－Ｎａ－１９抗体をヒト化した。ヒト化の方法は、ＶＨＨヒト化の一般的なフレームワーク移植方法によって行い、同時に抗体フレームワーク２（フレームワーク２）の一部のアミノ酸を文献で報告されている方法（Vincke, C., et al., General strategy for humanizing camelid single-domain antibodies and identifying universal humanized nanobody scaffolds. J Biol Chem 284 (5): 3273-3284）に従って変異させて行った。配列番号３９～４０と配列番号３７～３８の配列がそれぞれ得られた。
【0207】
本研究では、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を使用してＬ－Ｙｒ－１３＆１４－１６抗体とＡ－Ｎａ－１９抗体のヒト化配列のヒト化レベルを評価し、結果を表５に示した。
【0208】
【表16】
【0209】
タンパク質構築と発現精製方法は実施例３と同じであった。精製した遺伝子操作抗体をヒト４－１ＢＢ ＣＨＯ－Ｓ細胞への結合について試験し、検出方法は実施例４と同じであった。結果を図４Ａと図４Ｂに示した。遺伝子操作抗体はヒト４－１ＢＢ ＣＨＯ－Ｓ細胞への結合活性を維持していた。
【0210】
精製した遺伝子操作抗体をカニクイザル４－１ＢＢ ＣＨＯ－Ｓ細胞への結合について試験した。結果を図５Ａと図５Ｂに示した。この結果から、遺伝子操作したＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６抗体は、カニクイザル４－１ＢＢ ＣＨＯ－Ｓ細胞への結合活性を維持したが、遺伝子操作したＡ－Ｎａ－１９抗体ＨＺ－Ａ－Ｎａ－１９－１及びＨＺ－Ａ－Ｎａ－１９－２は、カニクイザル４－１ＢＢ ＣＨＯ－Ｓ細胞に対する結合活性が有意に低下したことが分かった。
【0211】
精製した遺伝子操作抗体を初代Ｔ細胞の活性化について試験し、検出方法は実施例７と同じであった。結果を図６Ａと図６Ｂに示した。この結果から、遺伝子操作したＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－１とＨＺ－Ａ－Ｎａ－１９－１が初代Ｔ細胞を活性化する活性を維持したことが分かった。
【0212】
実施例９：４－１ＢＢリガンドブロッキング試験
増殖したＣＨＯ－ｈ４－１ＢＢ細胞を細胞密度が２×１０６個／ｍＬとなるように調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルフロープレートに添加し、遠心分離して以降の使用に備えた。精製した４－１ＢＢ抗体をＰＢＳで４００ｎＭに希釈し、上述の希釈試料を５０μＬ／ウェルで上述の細胞含有９６ウェルフロープレートに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン－４－１ＢＢリガンドタンパク質（ＡＣＲＯ社から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで２００倍希釈したＳＡＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで添加して細胞を再懸濁させ、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ社製）フローサイトメーターで検出を行い、対応するＭＦＩを計算した。
増殖したＣＨＯ－ｈ４－１ＢＢ細胞を細胞密度が２×１０６個／ｍＬとなるように調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルフロープレートに添加し、遠心分離して以降の使用に備えた。精製した４－１ＢＢ抗体をＰＢＳで４００ｎＭに希釈し、上述の希釈試料を５０μＬ／ウェルで上述の細胞含有９６ウェルフロープレートに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン－４－１ＢＢリガンドタンパク質（ＡＣＲＯ社から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで２００倍希釈したＳＡＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで添加して細胞を再懸濁させ、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ社製）フローサイトメーターで検出を行い、対応するＭＦＩを計算した。
【0213】
結果を図７Ａに示した。この結果から、遺伝子操作した４－１ＢＢ抗体ＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－１にはリガンドブロッキング活性がなく、対照抗体ウトミルマブ（米国特許出願公開第２０１２０２３７４９８号）にはリガンドブロッキング活性があり、ウレルマブには部分的なブロッキング活性があることが分かった。
【0214】
実施例１０：抗体とＴＮＦＲＳＦメンバーの結合検出
ヒト４－１ＢＢ－ｈｉｓ、ＧＩＴＲ－ｈｉｓ、ＯＸ４０－ｈｉｓ、ＣＤ４０－ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ社から購入）を説明書に従って溶解し、ＥＬＩＳＡコーティング溶液（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社から購入）で１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、４℃で一晩放置し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％ＢＳＡ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社から購入）を２００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間ブロックした。コーティング溶液を廃棄し、１％ＢＳＡで希釈した４－１ＢＢ抗体を１００μＬ／ウェル、２００ｎＭで３個の複製ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ（ａｂｃａｍ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ発色溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加して室温で３分間反応させ、ＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、４５０ｎｍでの吸光度値を読み取った。
ヒト４－１ＢＢ－ｈｉｓ、ＧＩＴＲ－ｈｉｓ、ＯＸ４０－ｈｉｓ、ＣＤ４０－ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ社から購入）を説明書に従って溶解し、ＥＬＩＳＡコーティング溶液（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社から購入）で１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、４℃で一晩放置し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％ＢＳＡ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社から購入）を２００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間ブロックした。コーティング溶液を廃棄し、１％ＢＳＡで希釈した４－１ＢＢ抗体を１００μＬ／ウェル、２００ｎＭで３個の複製ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ（ａｂｃａｍ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ発色溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入）を１００μＬ／ウェルで添加して室温で３分間反応させ、ＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、４５０ｎｍでの吸光度値を読み取った。
【0215】
結果を図７Ｂに示した。この結果から、ＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－１抗体が４－１ＢＢタンパク質にのみ結合し、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの他のメンバーには結合しないことが分かった。本発明の抗体は良好な特異性を有し、インビボでは腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの他のメンバーを活性化せず、それによって潜在的な副作用を回避することが示された。
【0216】
実施例１１：４－１ＢＢとＶＨＨセグメントの複合体の結晶構造の特定
本発明の４－１ＢＢナノボディのその抗原タンパク質への結合モードを更に検討するため、本実施例では、Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－１を選択して抗原複合体の結晶化実験を行った。
本発明の４－１ＢＢナノボディのその抗原タンパク質への結合モードを更に検討するため、本実施例では、Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－１を選択して抗原複合体の結晶化実験を行った。
【0217】
ここでは結晶の形成を促進するために、最適化後、最終的な結晶複合体中の抗４－１ＢＢ抗体のアミノ酸配列を、Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－１のＶＨＨ鎖配列（即ち、配列番号３９）のＣ末端においてＬｅｕとＧｌｙを付加して形成した配列（配列番号１６９）とした。Ｃ末端において付加したＬｅｕ及びＧｌｙ残基は、結晶化を促進するための所定の技術的操作に過ぎず、ナノボディＬ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－１のヒト４－１ＢＢタンパク質への結合モードには影響を及ぼさないことに留意されたい。
【0218】
本実験では、Ｘ線回折法を用いて４－１ＢＢとＶＨＨセグメントの複合体の結晶構造を特定した。ヒト４－１ＢＢタンパク質（配列番号１６８）と抗４－１ＢＢＶＨＨタンパク質（配列番号１６９）の両方がＨＥＫ２９３系によって発現した。４－１ＢＢをＶＨＨと１：１のモル比で混合し、結晶化用の複合体試料を調製した。複合体（８．５ｍｇ／ｍＬ）を結晶化試薬と１：１の比率で混合し、１８℃で結晶化させた。ＪＢＫキットの培養条件で４日後に結晶を観察したが、その結晶形態を図８に示した。
【0219】
上海光源でＸ線回折実験用に単結晶を選択し、３．１４Åの解像度の回折データを得た。データ処理はＸＤＳソフトウェアを使用して行った。分子置換法を用い、４－１ＢＢ（ＰＤＢ ＩＤ：６ｍｇｐ）とＶＨＨ（ＰＤＢ ＩＤ：４ｘｔ１）の構造をモデルとして結晶相を特定した。Ｒｅｆｍａｃ５を用いて結晶構造の精密化を行った。ＣＯＯＴを用いてモデル検査、手動再構成、及び構造検証を行った。複合体結晶はＰ４１２１２空間群に属し、その単位格子パラメータは次の通りであった。ａ＝１０６．８５Å、ｂ＝１０６．８５Å、ｃ＝１４６．４１Å、α＝９０．００°、β＝９０．００°、γ＝９０．００°。特定の結晶データの統計値を表６に示した。
【表17】
【0220】
構造解析後に得た４－１ＢＢ－ＶＨＨ複合体の結晶構造を図９に示した。エピトープ分析によって、４－１ＢＢとＶＨＨの間の主な水素結合が４－１ＢＢのＡｓｐ１１８、Ｌｅｕ１２３、Ａｒｇ１３０、Ｖａｌ１３２、Ｃｙｓ１３４、Ｇｌｙ１３５及びＳｅｒ１３７等のアミノ酸に集中していることが分かった（図１０）。更に、４－１ＢＢのＬｅｕ１２３、Ｖａｌ１２４、Ｖａｌ１３３及びＰｒｏ１３６とＶＨＨのＶａｌ３２、Ａｌａ３３、Ｔｙｒ３７、Ｌｅｕ４７、Ｉｌｅ５２、Ｔｙｒ９７、Ｔｙｒ１０２及びＴｒｐ１１５は疎水性相互作用界面を構成していた（図１１）。
【0221】
ウレルマブと４－１ＢＢの結合部位は４－１ＢＢのＮ末端に位置し、主に結合に関与する４－１ＢＢのアミノ酸にはＰｒｏ２７、Ａｓｎ４０、Ａｓｎ４２、及びＧｌｎ４３が含まれていた。ウトミルマブは主に４－１ＢＢのＣＲＤ３（システインに富むドメイン）とＣＲＤ４に結合し、主に結合に関与する４－１ＢＢのアミノ酸には、Ａｒｇ６６、Ｇｌｙ９６、Ｓｅｒ１００、Ｃｙｓ１０２、Ｌｙｓ１１４、Ａｒｇ１３０及びＡｒｇ１３４が含まれていた（Chin SM, Kimberlin CR, Roe-Zurz Z, et al. Structure of the 4-1BB/4-1BBL complex and distinct binding and functional properties of utomilumab and urelumab. Nat Commun 2018;9:4679.）。更に理論的には、ウトミルマブの結合エピトープは、空間では４－１ＢＢリガンドと競合関係にあったため、４－１ＢＢのそのリガンドへの結合に対して一定のブロッキング効果があると考えられる。
【0222】
本発明の具体的な実施形態を詳細に説明してきたが、当業者であれば、開示された全ての教示に基づいて、その詳細に対して様々な変更や置換を行うことができ、このような変更は全て本発明の範囲内であることを理解するであろう。本発明の全範囲は添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物によって与えられる。
【配列表フリーテキスト】
【0223】
配列番号１： 単一ドメイン抗体
配列番号２： 単一ドメイン抗体
配列番号３： 単一ドメイン抗体
配列番号４： 単一ドメイン抗体
配列番号５： 単一ドメイン抗体
配列番号６： 単一ドメイン抗体
配列番号７： 単一ドメイン抗体
配列番号８： 単一ドメイン抗体
配列番号９： 単一ドメイン抗体
配列番号１０： 単一ドメイン抗体
配列番号１１： 単一ドメイン抗体
配列番号１２： 単一ドメイン抗体
配列番号１３： 単一ドメイン抗体
配列番号１４： 単一ドメイン抗体
配列番号１５： 単一ドメイン抗体
配列番号１６： 単一ドメイン抗体
配列番号１７： 単一ドメイン抗体
配列番号１８： 単一ドメイン抗体
配列番号１９： 単一ドメイン抗体
配列番号２０： 単一ドメイン抗体
配列番号２１： 単一ドメイン抗体
配列番号２２： 単一ドメイン抗体
配列番号２３： 単一ドメイン抗体
配列番号２４： 単一ドメイン抗体
配列番号２５： 単一ドメイン抗体
配列番号２６： 単一ドメイン抗体
配列番号２７： 単一ドメイン抗体
配列番号２８： 単一ドメイン抗体
配列番号２９： 単一ドメイン抗体
配列番号３０： 単一ドメイン抗体
配列番号３１： 単一ドメイン抗体
配列番号３２： 単一ドメイン抗体
配列番号３３： 単一ドメイン抗体
配列番号３４： 単一ドメイン抗体
配列番号３５： 単一ドメイン抗体
配列番号３６： 単一ドメイン抗体
配列番号３７： 単一ドメイン抗体
配列番号３８： 単一ドメイン抗体
配列番号３９： 単一ドメイン抗体
配列番号４０： 単一ドメイン抗体
配列番号４１： ＣＤＲ
配列番号４２： ＣＤＲ
配列番号４３： ＣＤＲ
配列番号４４： ＣＤＲ
配列番号４５： ＣＤＲ
配列番号４６： ＣＤＲ
配列番号４７： ＣＤＲ
配列番号４８： ＣＤＲ
配列番号４９： ＣＤＲ
配列番号５０： ＣＤＲ
配列番号５１： ＣＤＲ
配列番号５２： ＣＤＲ
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配列番号５４： ＣＤＲ
配列番号５５： ＣＤＲ
配列番号５６： ＣＤＲ
配列番号５７： ＣＤＲ
配列番号５８： ＣＤＲ
配列番号５９： ＣＤＲ
配列番号６０： ＣＤＲ
配列番号６１： ＣＤＲ
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配列番号８１： ＣＤＲ
配列番号８２： ＣＤＲ
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配列番号８９： ＣＤＲ
配列番号９０： ＣＤＲ
配列番号９１： ＣＤＲ
配列番号９２： ＣＤＲ
配列番号９３： ＣＤＲ
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配列番号９５： ＣＤＲ
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配列番号９７： ＣＤＲ
配列番号９８： ＣＤＲ
配列番号９９： ＣＤＲ
配列番号１００： ＣＤＲ
配列番号１０１： ＣＤＲ
配列番号１０２： ＣＤＲ
配列番号１０３： ＣＤＲ
配列番号１０４： ＣＤＲ
配列番号１０５： ＣＤＲ
配列番号１０６： ＣＤＲ
配列番号１０７： ＣＤＲ
配列番号１０８： ＣＤＲ
配列番号１０９： ＣＤＲ
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配列番号１１１： ＣＤＲ
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配列番号１１４： ＣＤＲ
配列番号１１５： ＣＤＲ
配列番号１１６： ＣＤＲ
配列番号１１７： ＣＤＲ
配列番号１１８： ＣＤＲ
配列番号１１９： ＣＤＲ
配列番号１２０： ＣＤＲ
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配列番号１２６： ＣＤＲ
配列番号１２７： ＣＤＲ
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配列番号１３０： ＣＤＲ
配列番号１３１： ＣＤＲ
配列番号１３２： ＣＤＲ
配列番号１３３： ＣＤＲ
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配列番号１３６： ＣＤＲ
配列番号１３７： ＣＤＲ
配列番号１３８： ＣＤＲ
配列番号１３９： ＣＤＲ
配列番号１４０： ＣＤＲ
配列番号１４１： ＣＤＲ
配列番号１４２： ＣＤＲ
配列番号１４３： ＣＤＲ
配列番号１４４： ＣＤＲ
配列番号１４５： ＣＤＲ
配列番号１４６： ＣＤＲ
配列番号１４７： ＣＤＲ
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配列番号１４９： ＣＤＲ
配列番号１５０： ＣＤＲ
配列番号１５１： ＣＤＲ
配列番号１５２： ＣＤＲ
配列番号１５３： ＣＤＲ
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配列番号１５５： ＣＤＲ
配列番号１５６： ＣＤＲ
配列番号１５７： ＣＤＲ
配列番号１５８： ＣＤＲ
配列番号１５９： ＣＤＲ
配列番号１６０： ＣＤＲ
配列番号１６１： プライマー
配列番号１６２： プライマー
配列番号１６３： プライマー
配列番号１６４： プライマー
配列番号１６５： プライマー
配列番号１６６： プライマー
配列番号１６７： ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片
配列番号１６８： ヒト４－１ＢＢタンパク質
配列番号１６９： 結晶複合体中の抗４－１ＢＢ抗体のアミノ酸配列
配列番号１７０： フレームワーク１
配列番号１７１： フレームワーク２
配列番号１７２： フレームワーク２
配列番号１７３： フレームワーク３
配列番号１７４： フレームワーク４
配列番号２： 単一ドメイン抗体
配列番号３： 単一ドメイン抗体
配列番号４： 単一ドメイン抗体
配列番号５： 単一ドメイン抗体
配列番号６： 単一ドメイン抗体
配列番号７： 単一ドメイン抗体
配列番号８： 単一ドメイン抗体
配列番号９： 単一ドメイン抗体
配列番号１０： 単一ドメイン抗体
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配列番号１３： 単一ドメイン抗体
配列番号１４： 単一ドメイン抗体
配列番号１５： 単一ドメイン抗体
配列番号１６： 単一ドメイン抗体
配列番号１７： 単一ドメイン抗体
配列番号１８： 単一ドメイン抗体
配列番号１９： 単一ドメイン抗体
配列番号２０： 単一ドメイン抗体
配列番号２１： 単一ドメイン抗体
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配列番号２８： 単一ドメイン抗体
配列番号２９： 単一ドメイン抗体
配列番号３０： 単一ドメイン抗体
配列番号３１： 単一ドメイン抗体
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配列番号３３： 単一ドメイン抗体
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配列番号１５３： ＣＤＲ
配列番号１５４： ＣＤＲ
配列番号１５５： ＣＤＲ
配列番号１５６： ＣＤＲ
配列番号１５７： ＣＤＲ
配列番号１５８： ＣＤＲ
配列番号１５９： ＣＤＲ
配列番号１６０： ＣＤＲ
配列番号１６１： プライマー
配列番号１６２： プライマー
配列番号１６３： プライマー
配列番号１６４： プライマー
配列番号１６５： プライマー
配列番号１６６： プライマー
配列番号１６７： ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片
配列番号１６８： ヒト４－１ＢＢタンパク質
配列番号１６９： 結晶複合体中の抗４－１ＢＢ抗体のアミノ酸配列
配列番号１７０： フレームワーク１
配列番号１７１： フレームワーク２
配列番号１７２： フレームワーク２
配列番号１７３： フレームワーク３
配列番号１７４： フレームワーク４
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】