▶ ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチ ファンデーション，インコーポレーテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-12
(54)【発明の名称】ＰＩＶ５ベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20231004BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20231004BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20231004BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231004BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231004BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20231004BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z ZNA
C12N15/50
A61K39/215
A61P31/14
A61P37/04
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518132
(86)(22)【出願日】2021-09-21
(85)【翻訳文提出日】2023-05-11
(86)【国際出願番号】 US2021051196
(87)【国際公開番号】W WO2022061264
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】63/080,862
(32)【優先日】2020-09-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/217,361
(32)【優先日】2021-07-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522219098
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチ ファンデーション，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヘー，ビアオ
【テーマコード（参考）】
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085BA71
4C085CC08
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG03
4C085GG08
4C085GG10
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA09
4C087CA12
4C087MA52
4C087MA59
4C087MA65
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB33
(57)【要約】
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９に対する安全で、安定で、有効且つ費用効果的なワクチンとして使用するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープスパイク（Ｓ）タンパク質を発現するパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ウイルスの構築物を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクターであって、前記異種ポリペプチドが、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む、ウイルス発現ベクター。
【請求項2】
前記コロナウイルスＳタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のコロナウイルスＳタンパク質を含む、請求項１に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項3】
前記コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部が、ＰＩＶ５の融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部で置換されている、請求項１に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項4】
前記コロナウイルスＳタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のコロナウイルスＳタンパク質を含み、且つ、前記コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部が、ＰＩＶ５の融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部で置換されている、請求項１に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項5】
前記異種ポリペプチドが、アミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８に変異を含むコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項6】
アミノ酸残基Ｗ８８６におけるアミノ酸置換が、トリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含み、及び／又はアミノ酸残基Ｗ８８８における前記アミノ酸置換が、フェニルアラニン（Ｆ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含む、請求項５に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項7】
前記ＰＩＶ５ゲノムの小型疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に前記異種ヌクレオチド配列が挿入されている、請求項１～６のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項8】
前記異種ヌクレオチド配列でＳＨ遺伝子のヌクレオチド配列を置換する、請求項１～６のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項9】
前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入されている、請求項１～６のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項10】
前記異種ヌクレオチド配列が、前記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間よりも、リーダーの近くに挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子の上流に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列のすぐ下流に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムの融合（Ｆ）タンパク質遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子とマトリックスタンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入され；前記ＰＩＶ５のＦ若しくはＨＮ遺伝子の一部が前記異種ヌクレオチド配列で置換された場合に挿入され；前記ＳＨ遺伝子のヌクレオチド配列内に挿入され、前記ＮＰ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、前記Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、前記Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、前記Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、前記ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、且つ／又は前記Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列内に挿入される、請求項１～６のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項11】
前記ＰＩＶ５ゲノムがさらに１つ以上の変異を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項12】
前記１つ以上の変異が、前記Ｖ／Ｐ遺伝子の変異、前記Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の変異、前記Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の変異、前記Ｖタンパク質のＣ末端を欠失する変異、前記小型疎水性（ＳＨ）タンパク質を欠失する変異、前記融合（Ｆ）タンパク質の変異、前記リンタンパク質（Ｐ）の変異、前記大型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む変異、アポトーシスを誘導する変異、又はこれらの組合せを含む、請求項１１に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項13】
前記１つ以上の変異が、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５－Ｐ－Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組合せを含む、請求項１１に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子。
【請求項15】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター及び／又は請求項１４に記載のウイルス粒子を含む組成物。
【請求項16】
細胞内で異種コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質を発現させる方法であって、前記方法は、請求項１～１５のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物と前記細胞を接触させることを含む方法。
【請求項17】
コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する方法であって、前記方法は、請求項１～１５のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項18】
前記免疫応答が、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）に対して、対象にワクチン接種をする方法であって、前記方法は、請求項１～１５のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項20】
前記ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物が、鼻腔、筋肉内、局所、又は経口投与される、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
継続出願データ
本出願は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０８０，８６２号明細書及び２０２１年７月１日に出願された米国仮特許出願第６３／２１７，３６１号明細書の利益を主張する。
本出願は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０８０，８６２号明細書及び２０２１年７月１日に出願された米国仮特許出願第６３／２１７，３６１号明細書の利益を主張する。
【0002】
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋ Ｏｆｆｉｃｅ）に、３８キロバイトサイズの「０２３５－０００２９４ＷＯ０１＿ＳＴ２５」と題するＡＳＣＩＩテキストファイルとして電子的に提出され、２０２１年９月１５日に作成された配列表を含む。配列表に含まれる情報は、本明細書に参照として組み込まれる。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋ Ｏｆｆｉｃｅ）に、３８キロバイトサイズの「０２３５－０００２９４ＷＯ０１＿ＳＴ２５」と題するＡＳＣＩＩテキストファイルとして電子的に提出され、２０２１年９月１５日に作成された配列表を含む。配列表に含まれる情報は、本明細書に参照として組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年１２月に中国、武漢で肺炎の原因として初めて特定され、その後世界的に蔓延し、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックを引き起こした新型コロナウイルスである。このウイルスは、２０２１年９月８日現在、世界中で２億２千百万人超に感染し、４，５７４，０００人超の死亡の原因となり、集団免疫がなければ、いつでも蔓延し続けることができる（ワールドワイドウェブのｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｍｅｒｇｅｎｃｉｅｓ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｎｏｖｅｌ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－２０１９を参照のこと）。ソーシャルディスタンス、ＰＰＥの使用、及び接触追跡による広範な試験、検疫措置、並びに唯一のＦＤＡ承認ワクチン及び緊急使用許可（Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｕｓｅ Ａｕｔｈｏｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＥＵＡ）に従うＦＤＡ承認ワクチンの限られた供給が、現在、ウイルスの拡散を制限するために利用できる唯一の手段である。死亡を防ぎ、伝播を低減するワクチンが緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明は、異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を有するパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）ゲノムを有するウイルス発現ベクターを含み、ここで、上記異種ポリペプチドは、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む。
【0005】
ウイルス発現ベクターのいくつかの態様では、コロナウイルスＳタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のコロナウイルスＳタンパク質を含む。
【0006】
ウイルス発現ベクターのいくつかの態様では、コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部は、ＰＩＶ５の融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部で置換されている。
【0007】
ウイルス発現ベクターのいくつかの態様では、コロナウイルスＳタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のコロナウイルスＳタンパク質を含み、ここで、コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部は、ＰＩＶ５の融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部で置換されている。
【0008】
ウイルス発現ベクターのいくつかの態様では、異種ポリペプチドは、アミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８に変異を有するコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む。いくつかの態様では、アミノ酸残基Ｗ８８６におけるアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含み、及び／又はアミノ酸残基Ｗ８８８におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含む。
【0009】
本発明のウイルス発現ベクターのいくつかの態様では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムの小型疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に挿入される。
【0010】
本発明のウイルス発現ベクターのいくつかの態様では、異種ヌクレオチド配列は、ＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列を置換する。
【0011】
本発明のウイルス発現ベクターのいくつかの態様では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入される。
【0012】
本発明のウイルス発現ベクターのいくつかの態様では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間よりもリーダーの近くに挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子の上流に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列のすぐ下流に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムの融合（Ｆ）タンパク質遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子とマトリックスタンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子の間に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子の間に挿入され；ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入され；ＰＩＶ５のＦ又はＨＮ遺伝子の一部が異種ヌクレオチド配列で置換された場合に挿入され；ＳＨ遺伝子のヌクレオチド配列内に挿入され、ＮＰ遺伝子のヌクレオチド配列内に挿入され、Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、且つ／又はＬ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入される。
【0013】
本発明のウイルス発現ベクターのいくつかの態様では、ＰＩＶ５ゲノムは、１つ以上の変異をさらに含む。いくつかの態様では、１つ以上の変異は、Ｖ／Ｐ遺伝子の変異、Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の変異、Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の変異、Ｖタンパク質のＣ末端が欠失した変異、小型疎水性（ＳＨ）タンパク質が欠失した変異、融合（Ｆ）タンパク質の変異、リンタンパク質（Ｐ）の変異、大型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む変異、アポトーシスを誘導する変異、又はこれらの組合せを含む。いくつかの態様では、１つ以上の変異は、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５－Ｐ－Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組合せを含む。
【0014】
本発明は、本明細書に記載のウイルス発現ベクターを有するウイルス粒子を含む。
【0015】
本発明は、本明細書に記載のウイルス発現ベクター又は本明細書に記載のウイルス粒子の組成物を含む。
【0016】
本発明は、細胞において異種コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質を発現させる方法を含み、この方法は、本明細書に記載されるウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物と上記細胞を接触させることを含む。
【0017】
本発明は、コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質に対して対象に免疫応答を誘導する方法を含み、この方法は、本明細書に記載されるウイルス発現ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は本組成物を上記対象に投与することを含む。いくつかの態様では、免疫応答は、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を含む。いくつかの態様では、ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物は、鼻腔内、筋肉内、局所、又は経口で投与される。
【0018】
本発明は、コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）に対して対象にワクチン接種する方法を含み、この方法は、本明細書に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物は、鼻腔内、筋肉内、局所、又は経口投与される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】ｐＤＡ２７のプラスミドクローニングの概略を示す。
【図2】ｐＤＡ２７から生成されたＣＶＸ－ＵＧＡ１の構築物を示す。
【図3】シーケンシング・フラグメントを示すプラスミドマップを示す。
【図4】ｐＡＢ７６プラスミドを用いてＣＶＸ－ＵＧＡ１ワクチンを構築する工程を示す。
【図5】ウイルスレスキュー及びプラーク精製のための概略的スキームを示す。
【図6】ＣＶＸ－ＵＧＡ１に感染し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１モノクローナル抗体でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓについて染色されたＭＤＢＫ細胞の免疫蛍光アッセイ画像を示す。
【図7】ｐＤＡ１６プラスミドのマップを示す。
【図8】ｎＣＯＶ１９－Ｓ－ヒト－Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔプラスミドのマップを示す。
【図9】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-1】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-2】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-3】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-4】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-5】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-6】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-7】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-8】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-9】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図9-10】ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミド（配列番号１）のマップ及び配列を示す。
【図10】ｐＣＡＧＧＳ－ＮＰプラスミドのマップを示す。
【図11】ｐＣＡＧＧＳ－Ｐプラスミドのマップを示す。
【図12】ｐＣＡＧＧＳ－Ｌプラスミドのマップを示す。
【図13】ｐＢＨ４３７－ｐＣＡＧＧＳ－Ｔ７プラスミドのマップを示す。
【図14】ｐＢＨ２７６プラスミドのマップを示す。
【図15】ｐＢＨ１６１プラスミドのマップを示す。
【図16】ｐＣＨ１０プラスミドのマップを示す。
【図17】ｐＡＢ７６プラスミドのマップを示す。
【図18A】組織培養細胞及びマウスにおけるＣＶＸＧＡ１の生成及びＣＶＸＧＡ１の分析を示す。図１８Ａは、ＣＶＸＧＡ１のスキームを示す。ＰＩＶ５は、７つの遺伝子を有し、８つのタンパク質、即ち、ＮＰ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、ＨＮ、Ｌをコードする。リーダー配列及びトレーラー配列は、ウイルスＲＮＡ合成に重要である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳは、シグナルペプチド（ＳＰ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、融合ペプチド（ＦＰ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び細胞質尾部（ＣＴ）を含む。ＣＶＸＧＡ１は、そのＣＴがＰＩＶ５のＦのＣＴに置換され、ＰＩＶ５のＳＨとＨＮの間に挿入されたＳを含む。
【図18B】組織培養細胞及びマウスにおけるＣＶＸＧＡ１の生成及びＣＶＸＧＡ１の分析を示す。図１８Ｂは、Ｓ発現の検出を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ発現を検出するために、免疫蛍光アッセイを実施した。ＭＤＢＫ細胞を模擬感染、又はＰＩＶ５若しくはＣＶＸＧＡ１に１多重度感染（ＭＯＩ）で感染させた。感染から２日後に、細胞を固定し、透過処理し、ＰＩＶ５－Ｖ／Ｐ（抗ベクター）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに特異的な抗体で染色した。イムノブロッティングを用いて発現を検出するために、Ｖｅｒｏ細胞をＰＩＶ５、ＣＶＸＧＡ１に１ ＭＯＩで感染させ、感染から２４時間（ｈｐｉ）後に溶解させた。ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ及び抗ＰＩＶ５－Ｖ／Ｐでイムノブロットした。
【図18C-18D】組織培養細胞及びマウスにおけるＣＶＸＧＡ１の生成及びＣＶＸＧＡ１の分析を示す。図１８Ｃは、ＣＶＸＧＡ１による合胞体形成を示す。Ｖｅｒｏ細胞を、ＰＩＶ５又はＣＶＸＧＡ１に０．１のＭＯＩで感染させた。４８ｈｐｉに、細胞を撮影した。図１８Ｄは、ＣＶＸＧＡ１で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗Ｓ力価を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たりｎ＝５）は、１０４、１０５、及び１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）の用量のＣＶＸＧＡ１を用いて、鼻腔内（ＩＮ）経路を介して免疫した。免疫から２８日後（ｄｐｉ）にマウスを採血し、ＥＬＩＳＡを用いて抗Ｓ力価を測定した。図１８ＤのサンプルのＲＢＤの力価は、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。図１８Ｄのサンプルの中和力価は、実施例２の材料及び方法に記載されるように決定した。
【図18E-18F】組織培養細胞及びマウスにおけるＣＶＸＧＡ１の生成及びＣＶＸＧＡ１の分析を示す。図１８Ｅは、ＣＶＸＧＡ１で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）力価を示す。図１８ＤのサンプルのＲＢＤの力価は、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。図１８Ｆは、ＣＶＸＧＡ１で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける中和力価を示す。図１８Ｄのサンプルの中和力価は、実施例２の材料及び方法に記載されるように決定した。
【図19A-19C】ＣＶＸＧＡ１による鼻腔内ワクチン接種が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後のＡｄ－ｈＡＣＥ２感作ＢＡＬＢ／ｃマウスの臨床的及び病理学的疾患を軽減することを示す。図１９Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＶＸＧＡ１ワクチン研究のための実験プロトコルの概略図を示す。処置群（Ｇｐ）は、以下を含む：Ｇｐ１：筋肉内（ＩＭ）経路によるＤＭＥＭ免疫；Ｇｐ２：鼻腔内（ＩＮ）経路でのＣＶＸＧＡ１免疫；Ｇｐ３：アラム（Ａｌｕｍ）アジュバントを用い、ＩＭ経路で投与されたＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２。次に、全ての動物をＡｄ－ｈＡＣＥ２によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して感作させ、５日後に１×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種した。他の測定値及び群当たりの動物数を表示する。予防接種後の日数はｄｐｉで示される。図１９Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のマウスモデルにおける転帰を示す。Ａｄ５－ｈＡＣＥ２形質導入ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５０μｌのＤＭＥＭ中の１×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内感染させた。６～８週齢のマウスの体重変化を毎日モニターした（ＤＭＥＭ：ｎ＝６、ＣＶＸＧＡ１：ｎ＝１４、ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：群当たりｎ＝６匹）。ＣＶＸＧＡ１で免疫されたマウスは、有意に少ない体重減少を示した。＊Ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．００５；マン・ホイットニー検定。図１９Ｃは、ＣＶＸＧＡ１ワクチンが、肺疾患の重症度を低下させることを示す。肺疾患の病理組織学的スコアリングの結果。単核細胞浸潤は全ての群に存在し、顆粒球浸潤は、ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でＩＭ免疫した後、２回目のブースター用量を受けたマウスで増加した。ｎ＝４。
【図19D】ＣＶＸＧＡ１による鼻腔内ワクチン接種が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後のＡｄ－ｈＡＣＥ２感作ＢＡＬＢ／ｃマウスの臨床的及び病理学的疾患を軽減することを示す。図１９Ｄは、ＣＶＸＧＡ１ワクチンが、肺疾患を軽減することを示している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の５日後、肺を摘出し、亜鉛ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。肺の代表的なＨ＆Ｅ染色を表示する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後５日目にＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２群で、好酸球浸潤が認められた（下のパネル及び挿入図の矢印により示される）。好酸球浸潤は右のグラフに記録されている。バー＝２５５及び５１μｍ、それぞれ、上部パネル及び下部パネル。
【図20A】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２０Ａは、フェレット免疫及びウイルスチャレンジの概略図を示す。６匹ずつのフェレットの群を、１０６ＰＦＵの用量で鼻腔内に免疫（ＣＶＸＧＡ１）又は模擬免疫（ＰＢＳ）した。ワクチン排出（Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）のために鼻洗浄を実施し、免疫後毎週採血した。チャレンジから３９日後（ｄｐｃ）に、４×１０５ＰＦＵ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をフェレットに鼻腔内チャレンジした。鼻洗浄及び直腸スワブは、１、３、５、及び７ｄｐｃに実施した。半分（ｎ＝６）のフェレットは、感染から４日後に人道的に安楽死させた。試験は７ｄｐｃに終了した。
【図20B-20C】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２０Ｂは、ＩＮ免疫後のフェレットにおける抗ＲＢＤ血清ＩｇＧを示す。ＥＬＩＳＡにより、血清抗ＲＢＤ ＩｇＧ力価を評価した。２８ｄｐｉの力価を示す。図２０Ｃは、免疫後の中和力価を示す。２８ｄｐｉの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和力価は、ＶＳＶ－ＣｏＶ－ＳＡＲＳ２－Ｓ疑似粒子を使用して測定した。＋ＲＨＳ（陽性回収ヒト血清）を陽性対照とし、培地のみを陰性対照とした。
【図20D-20F】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２０Ｄは、チャレンジ後の鼻洗浄液中のウイルスＲＮＡを示す。１、３、５及び７ｄｐｃの鼻洗浄液中のウイルスＲＮＡの量を、材料及び方法に記載されているように、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて決定した。図２０Ｅは、チャレンジ後の肺におけるウイルスＲＮＡを示す。４ｄｐｃ及び７ｄｐｃの肺におけるウイルスＲＮＡの量は、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて決定した。図２０Ｆは、チャレンジ後の気管中のウイルスＲＮＡを示す。４ｄｐｃ及び７ｄｐｃでの気管内のウイルスＲＮＡの量は、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて決定した。
【図21A】ネコにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２１Ａは、免疫処置及びチャレンジの概略図である。４匹ずつの群のネコをＩＮ又は皮下（ｓｕｂＱ）経路により１０６ＰＦＵの用量のＰＢＳ、ＣＶＸＧＡ１で免疫した。ｓｕｂＱ群の場合、ネコには、２１ｄｐｉに同じ用量でブースター接種した。最初の免疫から４２日後に、ＩＮ経路により４×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でネコをチャレンジした。１４ｄｐｃに実験が終了するまで１日おきに鼻洗浄液及び直腸スワブを収集した。
【図21B-21D】ネコにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２１Ｂは、免疫後のネコにおける抗Ｓ力価を示す。抗Ｓ血清ＩｇＧの力価は、ＥＬＩＳＡ法により測定した。２８ｄｐｉの血清の力価が示されている。図２１Ｃは、免疫後のネコにおける抗ＲＢＤ力価を示す。血清中の抗ＲＢＤの力価は、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。２８ｄｐｉの血清の力価を示す。図２１Ｄは、免疫後の鼻腔洗浄液における抗Ｓ ＩｇＡ力価を示す。鼻洗浄液中の抗Ｓ ＩｇＡの力価は、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。２８ｄｐｉの力価を示した。
【図21E】ネコにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２１Ｅは、チャレンジ後の鼻洗浄液中のウイルス力価を示す。ネコの鼻洗浄液中で回収されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性粒子は、ウイルスチャレンジ後に、フォーカス形成単位（ＦＦＵ）として定量化し、ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍＬとして表示される。
【図22A-22C】Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＣＶＣＧＡ１の免疫原性を示す。図２２Ａは、免疫処置の概略図である。Ｃ５７Ｂｌ６マウス（１群当たりｎ＝５）を、ＰＢＳ、用量１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＰＩＶ５、又は用量６×１０３ＰＦＵのＣＶＸＧＡ１で、鼻腔内（ＩＮ）経路により免疫した。免疫から２８日後に、マウスを犠牲にした。ターミナル採血し、脾細胞を採取した。図２２Ｂは、マウスにおける抗Ｓ力価を示す。抗Ｓ力価は、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。図２２Ｃは、細胞性免疫応答を示す。細胞性免疫応答は、Ｅｌｉｓｐｏｔを用いて決定した。脾細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ペプチドライブラリーで刺激した。結果は、１０６脾細胞当たりのＩＦＮ－γ分泌細胞の数として表示した。エラーバーは、平均の標準誤差である。＊（Ｐ＜０．０５）ＰＩＶ５とワクチン群の間の有意性。
【図23A-23C】ＣＶＸＧＡ１によるＡｄ－ｈＡＣＥ２感作マウスの防御を示す。図２３Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＰＩＶ５ベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン試験のための実験プロトコルの概略図である。処置群は、以下を含んだ：群（Ｇｐ）１：ＤＭＥＭ免疫処置ＩＮ；Ｇｐ２：ＣＶＸＧＡ１免疫処置５×１０３ＰＦＵ ＩＮ；Ｇｐ３：ＣＶＸＧＡ１免疫処置５×１０４ＰＦＵ ＩＮ。続いて、全ての動物をＡｄ－ｈＡＣＥ２によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して感作させ、５日後に１×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種した。他の測定値及び群当たりの動物数が表示される。予防接種後の日数はｄｐｉで示される。図２３Ｂは、ＣＶＸＧＡ１免疫処置、続いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を受けたマウスの転帰を示す。Ａｄ５－ｈＡＣＥ２形質導入ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０μｌのＤＭＥＭ中の１×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内感染させた。６～８週齢のマウスの体重変化を毎日モニターした（ｎ＝５匹／群）。５×１０４ＰＦＵのＣＶＸＧＡ１で免疫処置したマウスは、５×１０３ＰＦＵを投与したマウスよりも体重減少が少なかった（＊Ｐ値＜０．０５；＊＊Ｐ値＜０．００５；マン・ホイットニー検定）。図２３Ｃは、ＣＶＸＧＡ１鼻腔内免疫が、肺組織ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価を低下させることを示す。ウイルス動態を取得するために、肺を摘出し、１ｄｐｉにホモジナイズし、プラークアッセイによりウイルス力価を測定した。力価は、肺組織当たりのＰＦＵとして表される（ｎ＝３匹／群）。５×１０４ＰＦＵのＣＶＸＧＡ１で免疫されたマウスは、肺組織力価のより大きな低下を示した（＊Ｐ値＜０．０５；＊＊Ｐ値＜０．００５；マン・ホイットニー検定）。
【図24A-24B】マウスにおける不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫原性を示す。図２４Ａは、不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるプライムブースト免疫後のマウスの抗Ｓレベルを示す。図１９Ａに記載のように不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で免疫したマウスからの血清中の抗Ｓレベルは、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。図２４Ｂは、不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるプライムブースト免疫後のマウスの抗ＲＢＤレベルを示す。図１９Ａに記載のように不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で免疫したマウス由来の血清中の抗ＲＢＤレベルは、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【図25A-25C】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２５Ａは、免疫後の血清中の抗Ｓ ＩｇＧ力価を示す。７、２８ｄｐｉ及び７ｄｐｃにおける血清中の抗Ｓレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて決定し、グラフ化した。図２５Ｂは、鼻洗浄液中の抗Ｓ ＩｇＡを示す。２８ｄｐｉに収集した鼻洗浄液中のＩｇＡレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。図２５は、５ｄｐｃの鼻洗浄液中のウイルス及びウイルスＲＮＡの検出を示す。５ｄｐｃでの鼻洗浄液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価は、プラークアッセイ後、免疫蛍光アッセイを用いて測定し、ミリリットル当たりのＦＦＵ（蛍光フォーカス形成単位）としてグラフ化した。５ｄｐｃの鼻洗浄液のｑＲＴ－ＰＣＲ結果は、図２０Ｄと同じであった。
【図25D-25E】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２５は、５ｄｐｃの鼻洗浄液中のウイルス及びウイルスＲＮＡの検出を示す。５ｄｐｃでの鼻洗浄液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価は、プラークアッセイ後、免疫蛍光アッセイを用いて測定し、ミリリットル当たりのＦＦＵ（蛍光フォーカス形成単位）としてグラフ化した。５ｄｐｃの鼻洗浄液のｑＲＴ－ＰＣＲ結果は、図２０Ｄと同じであった。図２５Ｄは、４ｄｐｃでの肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の検出を示す。チャレンジから４日後にサンプリングされたフェレットの肺切片をホルマリン中に固定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原Ｎの免疫組織化学のために処理した。図２５Ｅは、チャレンジ前後の抗Ｓの比較である。２８ｄｐｉ（破線）及び７ｄｐｃ（実線）のフェレットにおける抗Ｓのレベルは、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【図26A-26B】ネコにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２６Ａは、中和抗体価を示す。２８ｄｐｉに収集した血清を、ＶＳＶ－ＣｏＶ－ＳＡＲＳ２－Ｓ擬似粒子を用いてアッセイした。＋ＲＨＳ（陽性回収ヒト血清）を陽性対照として使用した。図２６Ｂは、鼻洗浄液中のウイルスＲＮＡの検出を示す。１、３、５、７、９、１１、１３、及び１４ｄｐｃの鼻洗浄液中のウイルスＲＮＡの量は、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて決定した。
【図26C-26D】ネコにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図２６Ａは、中和抗体価を示す。図２６Ｃは、チャレンジ前後の抗Ｓの比較である。４１ｄｐｉ及び１４ｄｐｃのフェレット中の抗Ｓのレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。図２６Ｄは、チャレンジ前後の抗Ｎの比較である。４１ｄｐｉ及び１４ｄｐｃのフェレット中の抗Ｎのレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。
【図27】ＣＶＸＧＡ１で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける中和力価を示す。サンプルの中和力価は、材料及び方法に記載のように決定した。エラーバーは、平均の標準誤差を表し、Ｐ値は、一元配置分散分析を用いて計算した。＊Ｐ値＜０．０５、＊＊＊Ｐ値＜０．００１。
【図28】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対してＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスを防御するＣＶＸＧＡ１による鼻腔内ワクチン接種の結果を示す。マウスは、以下：鼻腔内ＤＭＥＭ；鼻腔内（１０６ＰＦＵ、ＩＮ）経路でＣＶＸＧＡ１免疫処置；アルムアジュバントを用いてＩＭ経路で投与されたＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＶ－ＳＡＲＳ２）、それに続いて２１ｄｐｉにブースター用量；ＩＮ経路で野生型ＰＩＶ５（１０６ ＰＦＵ）を受けた。免疫処置から５週間後、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスに、５０μｌのＤＭＥＭ中の４×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内感染させた。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。図２８Ａは、重量減少を示し、図２６Ｂは、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおける生存転帰を示す。６～８週齢のマウスの体重変化を毎日モニターした（ＤＭＥＭ：ｎ＝９、ＣＶＸＧＡ１：ｎ＝８、ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：群当たりｎ＝１０匹、ＰＩＶ５：ｎ＝１０）。ＣＶＸＧＡ１免疫マウスは、体重減少がなく、生存した。ＤＭＥＭ及びＰＩＶ５処置マウスは衰弱した。１匹のＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２処置マウスが生存した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の日数は、ｐ．ｉ．日数により示される。図２８Ａ及び図２８Ｂは、ＣＶＸＧＡ１ワクチンが、肺組織力価を低下させ、脳へのウイルスの拡散を防ぐことを示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から５日後に、Ａ及びＢにおいて群から肺（ｎ＝４）及び脳（ｎ＝４）組織を取得し、滴定した。詳細については、「材料及び方法」を参照されたい。検出限界（ＬＯＤ）：エラーバーは、平均の標準誤差を表す。＊＊Ｐ値＜０．０１；ダネットの事後検定による一元配置分散分析。
【図29A-29D】ＣＶＸＧＡ１で免疫したＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の組織病理学的分析を示す。図２９Ａ～図２９Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から５日後の固定肺組織の組織構造を示す。ＤＭＥＭ、ＣＶＸＧＡ１、ＵＶ－ＳＡＲＳ２、又はＰＩＶ５を投与されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染マウスの代表的な画像。図２９Ａは、表示された群からの肺組織におけるウイルス抗原（Ｎタンパク質、褐色染色）の代表的な分布を示す（群当たりｎ＝４）。他の群の散在する免疫染色と比較してＣＶＸＧＡ１群のまばらな限局性免疫染色に注目されたい。バー＝２２０μｍ。図２９Ｂは、ヘマトキシリン及びエオジン染色組織を示す（群当たりｎ＝４）。好酸球浸潤は、ＵＶ－ＳＡＲＳ２群でのみ認められた（挿入図内の矢印、バー＝４５μｍ）。図２９Ｃは、ヘマトキシリン及びエオジン染色組織を示す（群当たりｎ＝４）。間質性肺疾患は、ＣＶＸＧＡ１において軽減した。バー＝９０μｍ。図２９Ｄは、肺組織の組織病理学的スコアリングを示す（詳細については「方法」を参照、群当たりｎ＝４）。４群全ての組織を、好酸球性浸潤、血管周囲浸潤、及び間質性肺疾患について順位スコアリングした。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ダネットの事後検定による一元配置分散分析。
【図30A-30C】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性を示す。図３０Ａは、フェレット免疫処置及びウイルスチャレンジの概略を示す。６匹ずつのフェレットの群を、鼻腔内に１０６ＰＦＵの用量で免疫（ＣＶＸＧＡ１）又は模擬免疫（ＰＢＳ）処置した。免疫処置から３９日後（ｄｐｉ）に、４×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をフェレットに鼻腔内チャレンジした。鼻洗浄及び直腸スワブは、チャレンジから１、３、５、及び７日後（ｄｐｃ）に実施した。半分（ｎ＝６）のフェレットを、感染から４日後に人道的に安楽死させた。試験は７ｄｐｃに終了した。図３０Ｂは、免疫後のフェレットにおける抗ＲＢＤ血清ＩｇＧを示す。ＥＬＩＳＡにより、血清抗ＲＢＤ ＩｇＧ力価を評価した。２８ｄｐｉの力価を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。図３０Ｃは、免疫後の中和力価を示す。２８ｄｐｉの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和力価は、ＶＳＶ－ＣｏＶ－ＳＡＲＳ２－Ｓウイルスを用いて測定した。＋ＲＨＳ（陽性回収ヒト血清）を陽性対照として使用し、培地のみを陰性対照として使用した。エラーバーは、平均の標準誤差を表し、Ｐ値は、一元配置分散分析を用いて計算した。＊Ｐ値＜０．０５、＊＊＊Ｐ値＜０．０００１。
【図31A-31C】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１の有効性を示す。図３１Ａは、ｑＲＴ－ＰＣＲによるチャレンジ後１、３、５、及び７の鼻洗浄液中のウイルスＲＮＡの検出を示す。ウイルスＲＮＡは、ｍｌ当たりのゲノムコピーとして定量化し、「材料及び方法」に記載されているようにｌｏｇ１０ゲノム／ｍｌとして表示した。各符号は、異なるフェレット（ＰＢＳが６匹及びＣＶＸＧＡ１が６匹）を表す。ＰＢＳフェレットは黒い符号で、ＣＶＸＧＡ１ワクチン接種フェレットは、赤い符号である。１ｐｆｕ／ＰＣＲ反応（ｒｘｎ）が、感染性ウイルス粒子と非感染性ゲノムレムナントを区別するために表記されている。検出限界（ＬＯＤ）を最下位の破線で示す。図３１Ｂは、４、７ｄｐｃに採取した肺組織中のウイルスＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲによる検出を示す。ウイルスＲＮＡを定量し、反応毎のゲノムコピー（ｒｘｎ）として表した。図３１Ｃは、４、７ｄｐｃに採取した気管組織中ウイルスＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲによる検出を示す。ウイルスＲＮＡを定量し、反応毎のゲノムコピー（ｒｘｎ）として表した。
【図32A-32B】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１免疫による伝播阻止の有効性を示す。図３２Ａは、フェレット免疫処置、ウイルスチャレンジ、及び伝播の概略図を示す。６匹ずつのフェレットの群を、１０６ＰＦＵの用量で鼻腔内に、免疫（ＣＶＸＧＡ１）、空ウイルスベクター又は模擬免疫（ＰＢＳ）処置した。４２ｄｐｉにフェレットを、４×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内チャレンジした。１、３、５、７、９、及び１１ｄｐｃに、鼻洗浄液を収集した。チャレンジから４日後に半分のフェレットを人道的に安楽死させた。試験は、１１ｄｐｃに終了した。２ｄｐｃに、１匹のチャレンジしたフェレットを１匹のナイーブフェレットと混合し、混合から１、３、５、７、及び９日後に鼻洗浄液をナイーブフェレットから収集した（それぞれ、３、５、７、９、及び１１ｄｐｃ）。図３２Ｂは、鼻洗浄液中の１、３、５、７、９及び１１ｄｐｃにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２の検出を示す。生存ウイルスは、「材料及び方法」に記載されているように、フォーカス形成単位アッセイ（ＦＦＡ、ＦＦＵ／ｍｌ）を用いて検出した。各符号は異なるフェレットを表す。検出限界（ＬＯＤ）を最下位の破線で示す。
【図33A-33C】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性を示す。図３３Ａは、免疫処置の概略図を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当たりｎ＝５）を、ＰＢＳ、１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）用量のＰＩＶ５、又は６×１０３ＰＦＵ用量のＣＶＸＧＡ１を用い、鼻腔内（ＩＮ）経路で免疫した。免疫から２８日後に、マウスを犠牲にした。ターミナル血液及び脾細胞を収集した。図３３Ｂは、マウスにおける抗Ｓ抗体価を示す。抗Ｓ力価は、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。エラーバーは平均の標準誤差を示す。図３３Ｃは、細胞性免疫応答を示す。細胞性免疫応答は、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて決定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ペプチドライブラリーで脾細胞を刺激した。結果は、１０６脾細胞当たりのＩＦＮ－γ分泌細胞数として表した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。＊（Ｐ＜０．０５）ＰＩＶ５及びワクチン群の間の有意性。分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてダネットの多重比較検定。
【図34A-34E】ＣＶＸＧＡ１による鼻腔内ワクチン接種が、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスを致死的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から防御することを示す。マウスは、以下：筋肉内（ＩＭ）経路でＤＭＥＭ；鼻腔内（ＩＮ）経路でＣＶＸＧＡ１免疫；アルムアジュバントを用いてＩＭ経路で投与されるＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＶ－ＳＡＲＳ２）、続いて１４ｄｐｉに２回目のブースター用量を受けた。免疫処置から４週間後、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスに、５０μｌのＤＭＥＭ中１０６ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内感染させた。図３４Ａは、重量減少を示し、図３４Ｂは、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおける生存転帰を示す。６～８週齢のマウスの体重変化を毎日モニターした（ＤＭＥＭ：ｎ＝５、ＣＶＸＧＡ１：ｎ＝６、ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：群当たりｎ＝５匹）。全てのマウスに体重減少があったが、ＣＶＸＧＡ１免疫マウスだけが生存した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の日数は、ｄｐｉにより示される。＊Ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．００５；２元配置分散分析。図３４Ｃ及び図３４Ｄは、ＣＶＸＧＡ１ワクチンが、肺組織力価を低下させ、脳へのウイルス拡散を防ぐことを示す分析である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の５日後に、肺（ｎ＝４）と脳（ｎ＝４）の組織を取得し、滴定した。（Ｎ／Ｄ：不検出）＊Ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．００５；一元配置分散分析。図３４Ｅは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの５日後の肺組織の組織学及びスコアリングを示す。左パネル：ＤＭＥＭ、ＣＶＸＧＡ１、又はＵＶ－ＳＡＲＳ２群の代表的な組織学。好酸球浸潤（挿入図の矢印）がＵＶ－ＳＡＲＳ２群に認められた。好酸球浸潤は、右のグラフに記載されている。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＵＶ－ＳＡＲＳ２対ＤＭＥＭ又はＣＶＸＧＡ１、一元配置分散分析。バー＝３８７及び７８μｍ（それぞれ上段と下段）。
【図35A-35B】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図３５Ａは、フェレット上気道におけるＣＶＸＧＡ１の免疫後複製を示す。免疫後３、７、及び１４日目に、フェレット鼻洗浄液を収集した。Ｖｅｒｏ細胞でプラークアッセイを実施した。鼻洗浄液ＣＶＸＧＡ１は、ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）として定量した。図３５Ｂは、免疫後の血清中の抗Ｓ ＩｇＧ力価を示す。７、１４、２１、２８ｄｐｉ、及び７ｄｐｃの血清中の抗Ｓレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。データポイントは、個々のフェレットの重複値の平均値＋／－ＳＤを表す（ｎ＝６ｄｐｉ；ｎ＝３ｄｐｃ）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較検定を用いた二元配置分散分析。図３５Ｃは、鼻洗浄液中の抗Ｓ ＩｇＡを示す。２８ｄｐｉに収集した鼻洗浄液中のＩｇＡレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。データポイントは、プールされたサンプル（ｎ＝６）を３回反復＋／－ＳＤで表す。図３５Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ前後の抗Ｓ血清ＩｇＧ反応の比較を示す。２８ｄｐｉ（破線）及び７ｄｐｃ（実線）でのフェレット中の抗Ｓ ＩｇＧのレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。データポイントは、個々のフェレットについての２回反復値の平均値＋／－ＳＤを表す（ｎ＝６ｄｐｉ；ｎ＝３ｄｐｃ）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較検定を用いた二元配置分散分析。
【図35C-35D】フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１の免疫原性及び有効性を示す。図３５Ｃは、鼻洗浄液中の抗Ｓ ＩｇＡを示す。２８ｄｐｉに収集した鼻洗浄液中のＩｇＡレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。データポイントは、プールされたサンプル（ｎ＝６）を３回反復＋／－ＳＤで表す。図３５Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ前後の抗Ｓ血清ＩｇＧ反応の比較を示す。２８ｄｐｉ（破線）及び７ｄｐｃ（実線）でのフェレット中の抗Ｓ ＩｇＧのレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。データポイントは、個々のフェレットについての２回反復値の平均値＋／－ＳＤを表す（ｎ＝６ｄｐｉ；ｎ＝３ｄｐｃ）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較検定を用いた二元配置分散分析。
【図36A-36C】フェレットＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２感染のためのＡＢＳＬ３実験室を示す。図３６Ａは、図３１で説明した実験のための実験室レイアウトを示す。チャレンジ試験は、ＢＳＬ３－Ａｇ実験室で完了した。実験室には、単一のＨＥＰＡ給気と二重ＨＥＰＡ排気が装備されており、外部の「クリーンな」廊下に対して負圧を維持する。頑丈なケージ底部を備える個別換気ケージ（ＩＶＣ）とプラスチックケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）には、ＨＥＰＡ供給及び排気が供給された。図３６Ｂは、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，Ｉｎｃの従来のフェレットケージの代表的な画像を示す。従来のフェレットラックは各々、有孔床と取り外し可能なステンレス鋼ドアを備えるプラスチック製ケージインサート、プラスチック製排泄物パン、Ｊフィーダー、及びリキシット（ｌｉｘｉｔ）を備える自動ウォーターマニホールドを装備した６つの個別のケージを有する。図３６Ｃは、ケージラック内の群の場所を示す。ナイーブフェレットは、ＩＶＣに収容された後、従来の（オープン）ケージ内で、チャレンジされたフェレットと混合した。個々のケージには、ワクチン治療群、及びナイーブ接触動物を示す「Ｃ」という動物識別符号でラベルが貼られている。Ｇｐ３は、ＣＶＸＧＡ１ほどうまく機能しなかったワクチン候補を表す：これらのフェレットは、３ｄｐｃに、鼻腔にチャレンジウイルスを受けた。
【図37A】ＣＶＸＧＡ１で免疫されたフェレットのウイルスＲＮＡレベル及びそれらの直接接触を示す。図３７Ａは、鼻洗浄液中のＲＮＡレベルを示す。ｑＲＴ－ＰＣＲを介して１、３、５、７、及び９ｄｐｃに収集された鼻洗浄液中のウイルスＲＮＡの検出。ウイルスＲＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて定量した。各ポイントは、異なる動物を表し、感染性ウイルス粒子と非感染性ゲノムレムナントを区別するために１ｐｆｕ／ＰＣＲ反応（ｒｘｎ）が表記される。最下位の破線により検出限界（ＬＯＤ）を示す。
【図37B】ＣＶＸＧＡ１で免疫されたフェレットのウイルスＲＮＡレベル及びそれらの直接接触を示す。図３７Ｂは、チャレンジ済フェレットの肺におけるＲＮＡレベルを示す。４日後及び１０ｄｐｃに肺サンプルを収集した。ウイルスＲＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲで定量し、ＰＦＵ／ｍＬは、標準曲線で計算した。各ポイントは異なる動物を表し、感染性ウイルス粒子と非感染性ゲノムレムナントを区別するために１ＰＦＵ／ｍＬが表記される。最下位の破線により検出限界（ＬＯＤ）を示す。
【図38】ＣＶＸ－ＵＧＡ２ベクター構築物の概略を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープスパイク（Ｓ）タンパク質を発現するパラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）ウイルスの構築物を、ＣＯＶＩＤに対するワクチンとして使用するために作製した。これらの構築物は、ワクチンとしての有効性を示しており、単回用量の鼻腔内免疫が、フェレット及びネコにおいて殺菌免疫を誘導する。
【0021】
コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、現在世界中に蔓延している新たに出現した感染症である。これは、新規コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３８２，７２７－７３３（２０２０））。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年１２月に中国の武漢で最初に確認され、その後、世界中に蔓延して、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックを引き起こした。このウイルスは、２０２１年９月８日現在、世界中で２億２，１００万人超に感染し、４，５７４，０００人超の死亡の原因となり、集団免疫がなければ、いつでも蔓延し続けることができる（ワールドワイドウェブのｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｍｅｒｇｅｎｃｉｅｓ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｎｏｖｅｌ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－２０１９を参照のこと）。ソーシャルディスタンス、並びに接触追跡による広範な試験及び検疫措置が、ウイルスの拡散を制限するために利用できる唯一の手段である。これ以上の死亡を防ぎ、感染を低減するワクチンが緊急に必要とされている。
【0022】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、βコロナウイルス（β ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）科に属する一本鎖ＲＮＡエンベロープウイルスである（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３９５，５６５－５７４（２０２０））。９８６０アミノ酸をコードする長さ２９，８８１ヌクレオチド（ｎｔ）（ＧｅｎＢａｎｋ配列アクセッションＭＮ９０８９４７）のゲノム全体を特性決定するために、ＲＮＡベースのメタゲノム次世代シーケンシングアプローチが適用された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ９，３１３－３１９（２０２０））。ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な全ゲノム配列決定ゲノムには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２０１９－ｎＣｏＶ ＷＨＵ０１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９８８６６８）及びＮＣ＿０４５５１２（いずれも中国武漢からの分離株である）、並びに＞９９．９％同一である少なくとも７つの追加の配列（ＭＮ９３８３８４．１、ＭＮ９７５２６２．１、ＭＮ９８５３２５．１、ＭＮ９８８７１３．１、ＭＮ９９４４６７．１、ＭＮ９９４４６８．１、及びＭＮ９９７４０９．１）がある。
【0023】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスであるパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）は、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科のルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）属のメンバーであり、これは、流行性耳下腺炎（おたふく風邪）ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス２型及び４型、ニューカッスル病ウイルス、センダイウイルス、ＨＰＩＶ３、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなどの多くの重要なヒト及び動物病原体を含む。ＰＩＶ５は、以前はサルウイルス－５（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ－５）（ＳＶ５）として知られていた。ＰＩＶ５は多くの動物やヒトに感染するウイルスであるが、ＰＩＶ５と関連するヒトの症状又は疾患は知られていない。ほとんどのパラミクソウイルスとは異なり、ＰＩＶ５は、細胞変性効果をほとんど伴わずに正常細胞に感染する。マイナス鎖ＲＮＡウイルスとして、ＰＩＶ５のゲノムは非常に安定している。ＰＩＶ５は、その生活環にＤＮＡ相がなく、細胞質内でのみ複製することから、ＰＩＶ５は宿主ゲノムに組み込むことができない。そのため、ＰＩＶ５をベクターとして使用することにより、宿主細胞ＤＮＡの遺伝子改変から起こり得る意図しない結果を回避する。ＰＩＶ５は、ＷＨＯ及びＦＤＡによりワクチン産生のために承認されたＶｅｒｏ細胞などの細胞内で高力価まで増殖し得る。このように、ＰＩＶ５は、ワクチンベクターとして多くの利点を賦与する。
【0024】
本発明のＰＩＶ５ベースのワクチンベクターは、種々の野生型、変異型、又は組換え（ｒＰＩＶ５）株のいずれをベースとしてもよい。野生型株としては、限定するものではないが、以下：ＰＩＶ５株Ｗ３Ａ、ＷＲ（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｕｍｂｅｒ ＶＲ－２８８（商標））、イヌパラインフルエンザウイルス株７８－２３８（ＡＴＣＣ番号ＶＲ－１５７３）（Ｅｖｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ６８，１６５－１７２（１９８１）；Ｅｖｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ １７７，１１３２－１１３４（１９８０））、イヌパラインフルエンザウイルス株Ｄ００８（ＡＴＣＣ番号ＶＲ－３９９）（Ｂｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １２６，１４０－１４５（１９６７））、ＭＩＬ、ＤＥＮ、ＬＮ、ＭＥＬ、クリプトウイルス、ＣＰＩ＋、ＣＰＩ－、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔ１及びＳＥＲが挙げられる。例えば、（Ｂａｕｍｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７，２１８－２２３（１９８７）；Ｃｈａｔｚｉａｎｄｒｅｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８５，３００７－３０１６（２００４）；Ｃｈｏｐｐｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３，２２４－２３３（１９６４））を参照されたい。さらに、市販のケンネルコフ（ｋｅｎｎｅｌ ｃｏｕｇｈ）ワクチンに使用されるＰＩＶ５株、例えば、ＢＩ、ＦＤ、Ｍｅｒｃｋ、及びＭｅｒｉａｌワクチンを使用してもよい。
【0025】
本発明のＰＩＶ５ワクチンベクターは、限定はされないが、Ｈｅら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７（２）：２４９－６０，１９９７）に詳細に記載される逆遺伝学系をはじめとする様々な方法のいずれかを用いて構築され得る。ＰＩＶ５は８つのウイルスタンパク質をコードする。ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）、及び大型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質は、ウイルスＲＮＡゲノムの転写及び複製に重要である。Ｖタンパク質は、ウイルス病原性及びウイルスＲＮＡ合成において重要な役割を果たす。融合（Ｆ）タンパク質である糖タンパク質は、細胞へのウイルスの侵入に不可欠なｐＨ非依存的方法で、細胞同士及びウイルスと細胞の融合の両方を媒介する。Ｆタンパク質の構造が決定され、効率的な融合のための重要なアミノ酸残基が同定された。ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質も、宿主細胞からのウイルスの侵入及び放出に関与している。マトリックス（Ｍ）タンパク質は、ウイルス構築及び出芽に重要な役割を果たす。疎水性（ＳＨ）タンパク質は、４４残基の疎水性内在性膜タンパク質であり、細胞質内にそのＮ末端を有する膜に配向している。パラミクソウイルスの分子生物学の論文については、例えば（Ｌａｍｂ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １，９５７－９９５（２０１３）；Ｗｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｈｅ Ｐｏｗｅｒ ｏｆ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６１－１１９（２００４））を参照されたい。
【0026】
本発明のＰＩＶ５ベースのワクチンベクターでは、限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質など、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列がＰＩＶ５ゲノムに挿入される。宿主細胞へのコロナウイルスの侵入は、膜貫通Ｓ糖タンパク質によって媒介される（Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ １０５，９３－１１６（２０１９））。コロナウイルスＳ糖タンパク質は、表面が露出しており、宿主細胞への侵入を媒介することから、感染時の中和抗体の主要な標的であり、治療及びワクチン設計の焦点となっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳタンパク質は、Ｓ１とＳ２の２つのサブユニットから構成される。Ｓ１サブユニットは、宿主受容体アンジオテンシン変換酵素２を認識して、それに結合する受容体結合ドメインを含み、Ｓ２サブユニットは、２－ヘプタッドリピートドメインを介して６－ヘリックスバンドルを形成することによりウイルス細胞膜融合を媒介する（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ４１，１１４１－１１４９ ２０２０））。
【0027】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの全長は、１２７３アミノ酸（ａａ）であり、Ｎ末端に位置するシグナルペプチド（アミノ酸１～１３）、Ｓ１サブユニット（１４～６８５残基）、及びＳ２サブユニット（６８６～１２７３残基）から構成され；最後の２つの領域は、それぞれ受容体結合と膜融合を担う。Ｓ１サブユニットには、Ｎ末端ドメイン（１４～３０５残基）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ、３１９～５４１残基）が存在し；融合ペプチド（ＦＰ）（７８８～８０６残基）、ヘプタペプチドリピート配列１（ＨＲ１）（９１２～９８４残基）、ＨＲ２（１１６３～１２１３残基）、ＴＭドメイン（１２１３～１２３７残基）、及び細胞質ドメイン（１２３７～１２７３残基）は、Ｓ２サブユニットを含む（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７，７６５－７６７（２０２０））。
【0028】
本発明のいくつかのＰＩＶ５ベースのワクチンベクターでは、限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部が、ＰＩＶ５の融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部で置換されるように修飾されている。このようなＰＩＶ５構築物の例としては、ＰＩＶ５構築物ＣＶＸ－ＧＡ１があり、これは、本明細書では、ＣＶＸＧＡ１、ＣＶＸ－ＵＧＡ１、ｐＤＡ２７、又はＤＡ２７とも呼ばれる。ＣＶＸ－ＧＡ１のプラスミドマップを図２及び図９に示し、図９には、構築物の配列が含まれる。
【0029】
本発明のいくつかのＰＩＶ５ベースのワクチンベクターでは、限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、Ｓタンパク質が、アミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８にアミノ酸置換を含むように修飾されている。いくつかの態様では、アミノ酸残基Ｗ８８６におけるアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含み、及び／又はアミノ酸残基Ｗ８８８におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含む。
【0030】
本発明のいくつかのＰＩＶ５ベースのワクチンベクターでは、限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部がＰＩＶ５の融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部に置換されるようにする修飾と、アミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８にアミノ酸置換を含むようにする修飾の両方を含む。いくつかの態様では、アミノ酸残基Ｗ８８６でのアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含み、且つ／又はアミノ酸残基Ｗ８８８でのアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含む。このようなＰＩＶ５構築物の例としては、ＣＶＸ－ＧＡ２のＰＩＶ５構築物があり、これは、本明細書において、ＣＶＸＧＡ２又はＣＶＸ－ＵＧＡ２とも称される。ＣＶＸ－ＧＡ１のプラスミドマップを図３８に示す。
【0031】
限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムの様々な位置のいずれかに挿入され得る。
【0032】
いくつかの好ましい実施形態では、限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムの小型疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に挿入され得る。
【0033】
限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子の間に挿入され得る。いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間の位置に挿入されない。いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子の間以外の位置に挿入される。
【0034】
限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との間に挿入され得る。
【0035】
限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子の間に挿入され得る。
【0036】
限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＦ遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入され得る。
【0037】
限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子とマトリックスタンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入され得る。
【0038】
限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入され得る。
【0039】
限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列のすぐ下流に挿入され得る。
【0040】
限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノム内のＰＩＶ５遺伝子の全部又は一部を置換するために挿入され得る。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶ５ゲノムのＦ、ＨＮ、又はＳＨ遺伝子を置換してもよい。異種ヌクレオチド配列をＩＶ５遺伝子内に挿入して、それにより、キメラポリペプチドの発現をもたらしてもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ＳＨ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＮＰ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内、Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内、ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内、及び／又はＰＩＶ５ゲノムのＬ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され得る。
【0041】
本発明のＰＩＶ５ウイルスワクチンはまた、ＰＩＶ５ゲノムのこれら８つのタンパク質のうちの１つ以上において突然変異、改変、又は欠失を有し得る。例えば、ＰＩＶ５ウイルス発現ベクターは、限定はされないが、本明細書に記載のもののいずれかを含め、１つ以上の変異を含み得る。いくつかの態様では、２つ以上（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又はそれ以上）の変異の組合せが有利となり得、増強された活性を示し得る。
【0042】
変異は、限定はされないが、以下：Ｖ／Ｐ遺伝子の変異、Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の変異、Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の変異、Ｖタンパク質のＣ末端を欠失する変異、小型疎水性（ＳＨ）タンパク質を欠失する変異、融合（Ｆ）タンパク質の変異、リンタンパク質（Ｐ）の変異、大型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の変異、イヌパラインフルエンザウイルスの残基を組み込んだ変異、及び／又は合胞体形成を増強する変異を含む。
【0043】
変異として、限定はされないが、以下：ｒＰＩＶ５－Ｖ／Ｐ－ＣＰＩ－、ｒＰＩＶ５－ＣＰＩ－、ｒＰＩＶ５－ＣＰＩ＋、ｒＰＩＶ５Ｖ ΔＣ、ｒＰＩＶ－Ｒｅｖ、ｒＰＩＶ５－ＲＬ、ｒＰＩＶ５－Ｐ－Ｓ１５７Ａ、ｒＰＩＶ５－Ｐ－Ｓ３０８Ａ、ｒＰＩＶ５－Ｌ－Ａ１９８１Ｄ及びｒＰＩＶ５－Ｆ－Ｓ４４３Ｐ、ｒＰＩＶ５－ＭＤＡ７、ｒＰＩＶ５ ΔＳＨ－ＣＰＩ－、ｒＰＩＶ５ ΔＳＨ－Ｒｅｖ、及びこれらの組合せを挙げることができる。
【0044】
ＰＩＶ５は、多くの細胞型において細胞変性効果（ＣＰＥ）をほとんど伴わずに生産的に細胞に感染することができる。いくつかの細胞型では、ＰＩＶ５感染は、合胞体の形成、即ち、多くの細胞同士の融合を引き起こし、それが細胞死を招く。変異は、合胞体形成を促進する１つ以上の変異を含み得る（例えば（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７０，１７－３０（２０００））を参照）。
【0045】
ＰＩＶ５のＶタンパク質は、ウイルスにより誘導されるアポトーシスを阻止する上で重要な役割を果たす。Ｖタンパク質の保存されたシステインリッチＣ末端（ｒＰＩＶ５Ｖ ΔＣ）を欠失した組換えＰＩＶ５は、小胞体（ＥＲ）ストレスにより開始される可能性が高い内因性アポトーシス経路を介して様々な細胞にアポトーシスを誘導する（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８，５０６８－５０７８（２００４））。ｒＰＩＶ５－ＣＰＩ－などのＶ／Ｐ遺伝子産物のＮ末端に変異を有する変異型組換えＰＩＶ５も、アポトーシスを誘導する（Ｗａｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６，１０１０９－１０１２１（２００２））。変異には、限定はされないが、ｒＰＩＶ５ ΔＳＨ、ｒＰＩＶ５－ＣＰＩ－、ｒＰＩＶ５ＶΔＣ、及びこれらの組合せが含まれる。
【0046】
また、本発明には、限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を有するＰＩＶ５ゲノムを含むビリオン及び感染性ウイルス粒子も含まれる。
【0047】
本発明にはまた、本明細書に記載のＰＩＶ５ウイルス構築物又はビリオンのうちの１つ以上を含む組成物も含まれる。このような組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。使用される場合、薬学的に許容される担体とは、ヒト又は他の脊椎動物への投与に適した１つ以上の適合性の固体若しくは液体充填剤、希釈剤又は封入物質を指す。こうした担体は、パイロジェンフリーであり得る。本発明はまた、本明細書に記載のウイルスベクター及び組成物を作製及び使用する方法も含む。
【0048】
本開示の組成物は、選択された投与経路に適合させた様々な形態で医薬製剤に製剤化され得る。当業者は、組成物が、投与様式及び投薬単位に応じて変化し得ることを理解するであろう。
【0049】
本発明の薬剤は、限定はされないが、静脈内、局所、経口、鼻腔内、皮下、腹腔内、筋肉内、及び腫瘍内送達を含む様々な方法で投与することができる。いくつかの態様では、本発明の薬剤は、制御又は持続放出のために製剤化され得る。鼻腔内免疫の１つの利点は、粘膜免疫応答を誘導する可能性にある。
【0050】
さらに、限定はされないが、本明細書に記載のもののいずれかを含むＰＩＶ５ウイルス発現ベクターを作製及び使用する方法も本発明に含まれる。
【0051】
例えば、本発明は、細胞をＰＩＶ５ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は本明細書に記載の組成物と接触又はそれに感染させることによって、限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質を上記細胞に発現する方法を含む。
【0052】
本発明は、ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は本明細書に記載の組成物を対象に投与することにより、限定はされないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などのコロナウイルスＳタンパク質に対する免疫応答を上記対象に誘導する方法を含む。免疫応答は、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を含み得る。免疫応答は、自然免疫応答及び／又は適応免疫応答を増強し得る。
【0053】
本発明は、限定はされないが、本明細書に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を対象に投与することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などの異種コロナウイルスＳタンパク質を上記対象に発現する方法を含む。
【0054】
本発明は、本明細書に記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を対象に投与することによって、上記対象をワクチン接種する方法を含む。
【0055】
本発明の方法と共に、多様な投与様式のいずれかを使用することができる。例えば、投与は、静脈内、局所、経口、鼻腔内、皮下、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、卵内、母体などであり得る。いくつかの態様では、投与は粘膜表面に対して行う。ワクチンは、ワクチンを飲料水に導入するか、又は動物の環境に噴霧するなどの大量投与技術によって投与してもよい。注射により投与する場合、免疫原性組成物又はワクチンは非経口的に投与され得る。非経口投与としては、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、又は腹腔内注射による投与が挙げられる。
【0056】
本開示の薬剤は、一度に投与してもよく、単回用量として、又は間隔を置いて投与される複数回用量として投与してもよい。例えば、本発明の薬剤は、反復して、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８回、又はそれ以上投与され得る。正確な投与量及び治療期間は、治療される疾患に応じて変動し、既知の試験プロトコルを使用して、又はインビボ若しくはインビトロ試験データからの外挿によって経験的に決定され得ることが理解される。濃度及び投与量の値は、緩和しようとする状態の重症度によっても変化し得ることに留意すべきである。さらに、任意の特定の対象について、個々の必要性、並びに組成物を投与するか、又は投与を監督する人の専門的判断に従って経時的に、具体的な投与レジメンを調節すべきであること、及び、本明細書に記載される任意の濃度範囲が例示的に過ぎず、特許請求の範囲に記載される組成物及び方法の範囲又は実施を制限しようとするものではないことも理解すべきである。
【0057】
いくつかの治療的実施形態において、薬剤の「有効量」は、少なくとも１つの病理学的パラメータの減少をもたらす量である。従って、例えば、本開示のいくつかの態様では、有効量は、薬剤で治療されていない個体におけるパラメータの予想される減少と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の減少を達成する上で有効な量である。
【0058】
いくつかの態様では、国際公開第２０１３／１１２６９０号パンフレット及び国際公開第２０１３／１１２７２０号パンフレット（これは、本明細書によりその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＰＩＶ５ベースの構築物及び方法のいずれかを本発明に使用してもよい。
【0059】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、例えば、哺乳動物を含む生物を表す。哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長類、及び他の非ヒト脊椎動物が含まれるが、これらに限定されない。対象は、「個人」、「患者」、又は「宿主」であり得る。非ヒト脊椎動物には、家畜動物（限定はされないが、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタなど）、限定はされないが、イヌ若しくはネコなどのペット又はコンパニオンアニマル、及び実験動物が含まれる。また、非ヒト対象には、非ヒト霊長類、並びに例えば、限定はされないが、ラット又はマウスなどのげっ歯類も含まれる。非ヒト対象はまた、限定するものではないが、家禽、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ミンク、及びウサギも含む。
【0060】
本明細書で使用される場合、「インビトロ」は、細胞培養中であり、「インビボ」は、対象の体内である。本明細書で使用される場合、「単離された」とは、その自然環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されたか、組換え技術を用いて生産されたか、又は化学的若しくは酵素的に合成され、従って、その天然の状態から「人工的に」改変された材料を指す。
【0061】
本発明の例示的な実施形態として、限定はされないが、以下のものが挙げられる：
１．異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクターであって、上記異種ポリペプチドが、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む、ウイルス発現ベクター。
２．上記コロナウイルスＳタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のコロナウイルスＳタンパク質を含む、実施形態１に記載のウイルス発現ベクター。
３．上記コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部が、ＰＩＶ５の融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部で置換されている、実施形態１に記載のウイルス発現ベクター。
４．上記コロナウイルスＳタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のコロナウイルスＳタンパク質を含み、且つ、上記コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部が、ＰＩＶ５の上記融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部で置換されている、実施形態１に記載のウイルス発現ベクター。
５．上記異種ポリペプチドが、アミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８に変異を含むコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む、実施形態１～４のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター。
６．アミノ酸残基Ｗ８８６におけるアミノ酸置換が、トリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含み、及び／又はアミノ酸残基Ｗ８８８におけるアミノ酸置換が、フェニルアラニン（Ｆ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含む、実施形態５に記載のウイルス発現ベクター。
７．上記ＰＩＶ５ゲノムの小型疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に異種ヌクレオチド配列が挿入されている、実施形態１～６のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
８．上記異種ヌクレオチド配列で上記ＳＨ遺伝子のヌクレオチド配列を置換する、実施形態１～６のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
９．上記異種ヌクレオチド配列が、上記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入されている、実施形態１～６のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
１０．上記異種ヌクレオチド配列が、上記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子の間よりも、リーダーの近くに挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子の上流に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列のすぐ下流に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムの融合（Ｆ）タンパク質遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子とマトリックスタンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子の間に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との間に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入され；上記ＰＩＶ５のＦ若しくはＨＮ遺伝子の一部が上記異種ヌクレオチド配列で置換された場合に挿入され；ＳＨ遺伝子のヌクレオチド配列内に挿入され、ＮＰ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、且つ／又はＬ遺伝子のヌクレオチド配列内に挿入される、実施形態１～６のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
１１．上記ＰＩＶ５ゲノムがさらに１つ以上の変異を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
１２．上記１つ以上の変異が、Ｖ／Ｐ遺伝子の変異、Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の変異、Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の変異、Ｖタンパク質のＣ末端を欠失する変異、小型疎水性（ＳＨ）タンパク質を欠失する変異、融合（Ｆ）タンパク質の変異、リンタンパク質（Ｐ）の変異、大型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む変異、アポトーシスを誘導する変異、又はこれらの組合せを含む、実施形態１１に記載のウイルス発現ベクター。
１３．上記１つ以上の変異が、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５－Ｐ－Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組合せを含む、実施形態１１又は１２に記載のウイルス発現ベクター。
１４．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子。
１５．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター及び／又は請求項１４に記載のウイルス粒子を含む組成物。
１６．細胞内で異種コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質を発現させる方法であって、上記方法は、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物と上記細胞を接触させることを含む方法。
１７．コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する方法であって、上記方法は、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を上記対象に投与することを含む方法。
１８．上記免疫応答が、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を含む、実施形態１７に記載の方法。
１９．コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）に対して、対象にワクチン接種をする方法であって、上記方法は、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を上記対象に投与することを含む方法。
２０．前記ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物が、鼻腔、筋肉内、局所、又は経口投与される、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の方法。
１．異種ポリペプチドを発現する異種ヌクレオチド配列を含むパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）ゲノムを含むウイルス発現ベクターであって、上記異種ポリペプチドが、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む、ウイルス発現ベクター。
２．上記コロナウイルスＳタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のコロナウイルスＳタンパク質を含む、実施形態１に記載のウイルス発現ベクター。
３．上記コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部が、ＰＩＶ５の融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部で置換されている、実施形態１に記載のウイルス発現ベクター。
４．上記コロナウイルスＳタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のコロナウイルスＳタンパク質を含み、且つ、上記コロナウイルスＳタンパク質の細胞質尾部が、ＰＩＶ５の上記融合（Ｆ）タンパク質の細胞質尾部で置換されている、実施形態１に記載のウイルス発現ベクター。
５．上記異種ポリペプチドが、アミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８に変異を含むコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む、実施形態１～４のいずれか１項に記載のウイルス発現ベクター。
６．アミノ酸残基Ｗ８８６におけるアミノ酸置換が、トリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含み、及び／又はアミノ酸残基Ｗ８８８におけるアミノ酸置換が、フェニルアラニン（Ｆ）のアルギニン（Ｒ）への置換を含む、実施形態５に記載のウイルス発現ベクター。
７．上記ＰＩＶ５ゲノムの小型疎水性タンパク質（ＳＨ）遺伝子とヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間に異種ヌクレオチド配列が挿入されている、実施形態１～６のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
８．上記異種ヌクレオチド配列で上記ＳＨ遺伝子のヌクレオチド配列を置換する、実施形態１～６のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
９．上記異種ヌクレオチド配列が、上記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子との間に挿入されている、実施形態１～６のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
１０．上記異種ヌクレオチド配列が、上記ＰＩＶ５ゲノムのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子と大型ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子の間よりも、リーダーの近くに挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子の上流に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列のすぐ下流に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムの融合（Ｆ）タンパク質遺伝子とＳＨ遺伝子との間に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのＶＰ遺伝子とマトリックスタンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのＭ遺伝子とＦ遺伝子の間に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子とＶ／Ｐ遺伝子との間に挿入され；上記ＰＩＶ５ゲノムのリーダー配列とヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子との間に挿入され；上記ＰＩＶ５のＦ若しくはＨＮ遺伝子の一部が上記異種ヌクレオチド配列で置換された場合に挿入され；ＳＨ遺伝子のヌクレオチド配列内に挿入され、ＮＰ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、Ｖ／Ｐ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、Ｍ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、Ｆ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、ＨＮ遺伝子ヌクレオチド配列内に挿入され、且つ／又はＬ遺伝子のヌクレオチド配列内に挿入される、実施形態１～６のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
１１．上記ＰＩＶ５ゲノムがさらに１つ以上の変異を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター。
１２．上記１つ以上の変異が、Ｖ／Ｐ遺伝子の変異、Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の変異、Ｖ及びＰタンパク質の共有Ｎ末端の残基２６、３２、３３、５０、１０２、及び／又は１５７の変異、Ｖタンパク質のＣ末端を欠失する変異、小型疎水性（ＳＨ）タンパク質を欠失する変異、融合（Ｆ）タンパク質の変異、リンタンパク質（Ｐ）の変異、大型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の変異、イヌパラインフルエンザウイルス由来の残基を組み込む変異、アポトーシスを誘導する変異、又はこれらの組合せを含む、実施形態１１に記載のウイルス発現ベクター。
１３．上記１つ以上の変異が、ＰＩＶ５ＶΔＣ、ＰＩＶ５ΔＳＨ、ＰＩＶ５－Ｐ－Ｓ３０８Ｇ、又はそれらの組合せを含む、実施形態１１又は１２に記載のウイルス発現ベクター。
１４．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子。
１５．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター及び／又は請求項１４に記載のウイルス粒子を含む組成物。
１６．細胞内で異種コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質を発現させる方法であって、上記方法は、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物と上記細胞を接触させることを含む方法。
１７．コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する方法であって、上記方法は、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を上記対象に投与することを含む方法。
１８．上記免疫応答が、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を含む、実施形態１７に記載の方法。
１９．コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）に対して、対象にワクチン接種をする方法であって、上記方法は、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物を上記対象に投与することを含む方法。
２０．前記ウイルス発現ベクター、ウイルス粒子、又は組成物が、鼻腔、筋肉内、局所、又は経口投与される、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の方法。
【0062】
用語「及び／又は」は、列挙された要素の１つ若しくは全て、又は列挙された要素のいずれか２つ以上の組合せを意味する。
【0063】
「好ましい」及び「好ましくは」という用語は、特定の状況下で特定の利益をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかし、他の実施形態も、同じ又は他の状況下で好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【0064】
用語「含む」及びその変形は、これらの用語が、説明及び特許請求の範囲に出現する場合、限定する意味はない。
【0065】
特に指定しない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び「少なくとも１つ」は、置き換え可能に使用され、１つ又は２つ以上を意味する。
【0066】
特に指定しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などを表す数値は全て、用語「約」により、全てのケースで変更されるものとして理解すべきである。従って、他に反対の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明により取得しようと努められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、また、同等物の原則を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数に基づき、通常の丸め法を適用して解釈されるべきである。
【0067】
本発明の広い範囲を規定する数値範囲及びパラメータは近似値ではあるものの、具体例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。但し、全ての数値は、本質的に、それぞれの試験測定値で見出された標準偏差から必然的に生じる範囲を含む。
【0068】
個別のステップを含む本明細書に開示されるいずれの方法についても、上記ステップは、任意の実行可能な順序で実施してよい。また、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組合せを同時に実施してもよい。
【0069】
この説明は、例示的な実施形態を示す。出願全体を通して複数の箇所で、例のリストを通してガイダンスが提供され、それらの例は様々な組合わせで使用することができる。いずれの場合も、記載されるリストは、代表的群として用いられるに過ぎず、排他的なリストとして解釈すべきではない。
【0070】
見出しは全て、読者の便宜のためのものであり、指定のない限り、見出しに続く本文の意味を制限するために使用すべきではない。
【0071】
本発明を以下の実施例により説明する。特定の実施例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載される本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきであることを理解されたい。
【実施例】
【0072】
実施例１
ＣＶＸ－ＵＧＡ１の構築物
ＣＶＸ－ＵＧＡ１は、プラスミドｐＤＡ２７（ｐＤＡ２７）から生成した。プラスミドｐＤＡ２７は、ｎＣＯＶ１９－Ｓ－ヒト－Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの高コピープラスミド）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ遺伝子を有し、その細胞質尾部は、遺伝子ＳＨ及びＨＮ遺伝子の間のプラスミドｐＤＡ１６（低コピープラスミド）バックボーンに挿入されたＰＩＶ５ Ｆ細胞質尾部で置換されている。Ｓ遺伝子配列は、ＭＮ９０８９４７に基づくものであり、ヒトでの発現のためにコドン最適化されている。プラスミドｐＤＡ１６は、ＰＩＶ５ウイルスゲノム全体及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。低コピーｐＤＡ１６プラスミドの配列は、十分に検証されている。
ＣＶＸ－ＵＧＡ１の構築物
ＣＶＸ－ＵＧＡ１は、プラスミドｐＤＡ２７（ｐＤＡ２７）から生成した。プラスミドｐＤＡ２７は、ｎＣＯＶ１９－Ｓ－ヒト－Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの高コピープラスミド）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ遺伝子を有し、その細胞質尾部は、遺伝子ＳＨ及びＨＮ遺伝子の間のプラスミドｐＤＡ１６（低コピープラスミド）バックボーンに挿入されたＰＩＶ５ Ｆ細胞質尾部で置換されている。Ｓ遺伝子配列は、ＭＮ９０８９４７に基づくものであり、ヒトでの発現のためにコドン最適化されている。プラスミドｐＤＡ１６は、ＰＩＶ５ウイルスゲノム全体及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。低コピーｐＤＡ１６プラスミドの配列は、十分に検証されている。
【0073】
ｐＤＡ２７を得るための工程を図１に示す。細胞質尾部をＰＩＶ５ Ｆ尾部で置換したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ遺伝子を、ｎＣＯＶ１９－Ｓ－ヒト－ＧｅｎｓｃｒｉｐｔプラスミドからＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応に使用されるＤＡ１９３－Ｆ及びＤＡ１９４－Ｒプライマーは、ｐＤＡ１６プラスミドと重複する領域を有し、ＤＡ１９４－Ｒプライマーは、ＰＩＶ５ Ｆ尾部配列を含む。ｐＤＡ１６プラスミドをバックボーンとして用いた。プラスミドをＮｏｔＩ及びＭｌｕＩ制限酵素で消化して、ＰＩＶ５ ＳＨ及びＨＮ遺伝子の間に挿入された以前の遺伝子を除去した。ｐＤＡ２７プラスミドは、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）アセンブリによって構築した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Ｆ尾部ＰＣＲ産物を消化ｐＤＡ１６及びギブソンアセンブリマスターミックスと合わせ、５０℃で１時間インキュベートした。
【0074】
図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳがｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）のＰＩＶ５ゲノムに挿入された位置を示す。次に、新しいｐＤＡ２７プラスミドをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手したＴＯＰ１０コンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレートに平板培養した。クロラムフェニコール及びプラスミドを含有するＬＢ培地で単一コロニーを精製し、表１及び表２に列挙するプライマーを用いて、図３に示す５つのフラグメントのＰＣＲ増幅により配列決定した。
【0075】
プラスミドをディープシーケンシングに送り、ＰＩＶ５（ＳＨ－ＨＮ）－ＣｏＶ－２－Ｓ－Ｆ尾部ゲノムの部分だけでなく、プラスミド配列全体を取得し、配列を検証した。適切な配列を確認した後、ウイルスのレスキューが行われた。この工程を図５に示す。
【0076】
ＣＶＸ－ＵＧＡ１ワクチンを構築するための別の方法は、ｐＡＢ７６プラスミドの構築によるものである。このプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を含む高コピーバックボーン（ｐＵＣ１９）を有する以外は、ｐＤＡ２７と全く同じＰＩＶ５（ＳＨ－ＨＮ）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓゲノムを含む。ｐＡＢ７６のための工程を図４に示す。
【0077】
ｐＣＨ１０プラスミドを使用して、高コピーｐＵＣ１９バックボーンを取得した。プラスミドをＲｓｒＩＩ及びＡａｔＩＩ制限酵素で消化した。
【0078】
ｐＤＡ２７プラスミド（低コピー）を用いて、ＰＩＶ５（ＳＨ－ＨＮ）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Ｆ尾部を取得した。プラスミドを、ＲｓｒＩＩ及びＡａｔＩＩ制限酵素を含むｐＤＡ２７プラスミドで消化した。
【0079】
消化産物（ｐＵＣ１９高コピーバックボーン及びＰＩＶ５（ＳＨ－ＨＮ）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Ｆ尾部）を高速ライゲーションプロトコルに従って連結して、最終プラスミドを取得した。
【0080】
図１又は図２に示す工程のいずれかを用いて、種子ＣＶＸ－ＵＧＡ１の生産に使用される最終プラスミドを生成することができる。ｐＤＡ２７とｐＡＢ７６のＰＩＶ５（ＳＨ－ＨＮ）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Ｆ尾部ゲノムは同一である。唯一の違いは、ｐＤＡ２７が、低コピープラスミド（クロラムフェニコール耐性）であり、ｐＡＢ７６が高コピープラスミド（アンピシリン耐性）であることである。
【0081】
組換えベクターウイルスのレスキューのために、ｐＤＡ２７プラスミドを、ＰＩＶ５ ＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミドと一緒にＢＨＫ－２１細胞（ＡＴＣＣから取得）にトランスフェクトして、上清からの組換えウイルスのレスキューを可能にした。レスキュープラスミドは、ＣＡＧＧＳ－ＮＰ、ｐＣＡＧＧＳ－Ｐ、ＣＡＧＧＳ－Ｌ、及びｐＢＨ４３７－Ｔ７である。レスキュープラスミドの完全配列を確認した後、ウイルスレスキューに使用した。ウイルスレスキューに使用した培地は、ＴＰＢ（ＢＤから入手）、ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅから入手）、及びＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｌｏｎｚａから入手）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏから入手）であった。
【0082】
７日間のインキュベーションの後、ベクターウイルスを含有する５ｍＬの上清を得、１０×ＳＰＧと混合し、－８０℃で保存した。この凍結ストックのアリコートを段階希釈して、単一のプラークを有する６ウェルを得ることを目的として、６ウェルプレート中でＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣから得られた）に対するプラークアッセイを実施した。１０００ｕＬのピペットチップを用いて、単一のプラークを突いて、ＦＢＳ及びＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ培地中で再懸濁した。次に、再懸濁したプラークを使用して、６ｃｍ皿内のナイーブＶｅｒｏ細胞に感染させた。７日後に、単一プラーク精製物を含む６ｃｍ皿からの上清（５ｍＬ）を１０×ＳＰＧと混合した後、－８０℃で保存した。上清の一部（１４０ｕＬ）を使用して、ＲＮＡ抽出を行い、ＲＴ－ＰＣＲを用いて、配列を確認した。表１に記載のものと同じプライマーを用いて、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。
【0083】
【表1】
【0084】
【表2】
【0085】
ＣＶＸ－ＵＧＡ１をレスキューしてマスターシードを生成するために、ＤＡ２７又はＡＢ７６プラスミドを、ＰＩＶ５ ＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミドと一緒に２９３Ｔ無血清細胞（ＡＴＣＣから取得）にトランスフェクトし、上清からの組換えウイルスのレスキューを可能にする。翌日、２９３Ｔ無血清トランスフェクト細胞をトリプシン処理し、Ｖｅｒｏ－ＳＦ（無血清）細胞と１０ｃｍ培養皿内で共培養した後、７日間インキュベートする。７日間のインキュベーションの後、ベクターウイルスを含む５ｍＬの上清を取得し、１０×ＳＰＧと混合した後、－８０℃で保存する。この凍結ストックのアリコートを段階希釈して、６ウェルプレート内のＶｅｒｏ－ＳＦ細胞に対してプラークアッセイを実施し、単一のプラークを有する６ウェルを得た。１０００ｕＬのピペットチップを使用して、単一のプラークを突いて、ＶＰ－ＳＦＭ培地に再懸濁する。次に、再懸濁されたプラークを用いて、６ｃｍ培養皿内のナイーブＶｅｒｏ－ＳＦ細胞に感染させる。７日後、単一プラーク精製物を含む６ｃｍ培養皿からの上清（５ｍＬ）を１０×ＳＰＧと混合し、－８０℃で保存した。単一プラーク精製物の最初のラウンドからのアリコートをプレマスターシードワクチンの製造用の種子接種材料として使用することにより、無血清培地（ＶＰ－ＳＦＭ培地）中での適格ＧＭＰ産生Ｖｅｒｏ－ＳＦ細胞バンクを用いて、ＧＭＰ実験室でマスターシードを生成する。
【0086】
ＣＶＸ－ＵＧＡ１ウイルスレスキューは、ｐＤＡ２７及びｐＡＢ７６が、厳密なＰＩＶ５（ＳＨ－ＨＮ）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Ｆ尾部ゲノムを有することから、それらのいずれかを用いて実施することができる。唯一の違いは、ｐＤＡ２７が低コピープラスミドであり、ｐＡＢ７６が高コピープラスミドであることである。
【0087】
ＣＶＸ－ＵＧＡ１を得るために後のレスキューに使用されるプラスミドは、動物由来フリー製品を使用して調製する。目標は、細胞以外の動物由来成分を含まないＣＶＸ－ＵＧＡ１（２９３Ｔ－無血清、Ｖｅｒｏ－無血清、及び動物産物由来フリー）を生産することである。
【0088】
シード構築物によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓタンパク質の産生は、免疫蛍光アッセイによって確認した。これを図６に示す。一次抗体：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１ウサギモノクローナル抗体及び二次抗体：ＫＰＬ製のＣｙ３標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）。
【0089】
免疫蛍光アッセイによるＣＶＸ－ＵＧＡ１感染ＭＤＢＫ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの検出。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１モノクローナル抗体、次に、二次抗体としてのＣｙ３標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて検出した。また、感染細胞は、対照としての抗ＰＩＶ５－Ｐ／Ｖ（ＰＫ）抗体、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＦＩＴＣ）二次抗体で標識した。ＤＡＰＩ（４＝，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール；青色）を核染色剤として用いた。後の実験のためには、ＭＤＢＫ細胞の代わりにＶｅｒｏ－ＳＦ細胞が使用される。
【0090】
ｐＤＡ１６プラスミドのマップを図７に示す。このプラスミドは、ＰＩＶ５ゲノムとＰＣＤＶ１遺伝子を含有する。これは、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有する低コピープラスミドである。
【0091】
ｎＣＯＶ１９－Ｓ－ヒト－Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔプラスミドのマップを図８に示す。これは、アンピシリン耐性遺伝子を含む高コピープラスミドである。これは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから入手した。
【0092】
ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミドのマップ及び配列を図９に示す。このプラスミドは、低コピープラスミドであり、これは、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。
【0093】
ｐＣＡＧＧＳ－ＮＰプラスミドのマップを図１０に示す。このプラスミドは、高コピープラスミドであり、これは、アンピシリン耐性遺伝子を含有する。ｐＢＨ２７６プラスミド由来のＰＩＶ５ ＮＰ ＤＮＡ配列をｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドにサブクローニングした。詳細については、Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６，３９５２－３９６４，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｊｖｉ．７６．８．３９５２－３９６４．２００２を参照されたい。
【0094】
ｐＣＡＧＧＳ－Ｐプラスミドのマップを図１１に示す。このプラスミドは、高コピープラスミドであり、これは、アンピシリン耐性遺伝子を含有する。ｐＢＨ２７６プラスミド由来のＰＩＶ５ Ｐ ＤＮＡ配列をｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドにサブクローニングした。詳細については、Ｗａｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７６：９２８４－９２９７，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｊｖｉ．７６．１８．９２８４－９２９７．２００２を参照されたい。
【0095】
ｐＣＡＧＧＳ－Ｌプラスミドのマップを図１２に示す。このプラスミドは、高コピープラスミドであり、これは、アンピシリン耐性遺伝子を含有する。ｐＢＨ２７６プラスミド由来のＰＩＶ５ Ｌ ＤＮＡ配列をｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドにサブクローニングした。詳細については、Ｗａｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７６：９２８４－９２９７，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｊｖｉ．７６．１８．９２８４－９２９７．２００２を参照されたい。
【0096】
ｐＢＨ４３７－ｐＣＡＧＧＳ－Ｔ７プラスミドのマップを図１３に示す。このプラスミドは、高コピープラスミドであり、これは、アンピシリン耐性遺伝子を含有する。ｐＢＨ１６１プラスミド由来のＴ７ポリメラーゼＤＮＡ配列をｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドにサブクローニングした。
【0097】
ｐＢＨ２７６プラスミドのマップを図１４に示す。このプラスミドは、ＰＩＶ５ゲノムを含有する。これは、アンピシリン耐性遺伝子を含む高コピープラスミドである。詳細については、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９－２６０，ｄｏｉ：１０．１００６／ｖｉｒｏ．１９９７．８８０１を参照されたい。
【0098】
ｐＢＨ１６１プラスミドのマップを図１５に示す。このプラスミドは、高コピープラスミドであり、アンピシリン耐性遺伝子を含有する。詳細については、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；９：１４２－１５１，ｄｏｉ：１０．１００６／ｐｒｅｐ．１９９６．０６６３を参照されたい。
【0099】
ｐＣＨ１０プラスミドのマップを図１６に示す。このプラスミドは、ＰＩＶ５ゲノムを含有する。これは、アンピシリン耐性遺伝子を有する高コピープラスミドである。
【0100】
ｐＡＢ７６プラスミドのマップを図１７に示す。このプラスミドは、高コピープラスミドであり、これは、アンピシリン耐性遺伝子を含有する。
【0101】
プロトコル
Ｖｅｒｏ－ＳＦの継代培養手順
このプロトコルで使用される体積は、７５ｃｍ２フラスコ用である。
パスツールピペット及び真空ポンプを用いて培地を取り出し、廃棄する。
細胞層を１０ｍＬのＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリーダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で短時間すすぐ。
５ｍＬのＴｒｙｐＬＥをフラスコに添加する。細胞が剥離するまで３７℃でインキュベートする。倒立顕微鏡を用いて細胞単層を観察し、フラスコの表面からの完全な細胞の剥離を確認する。
細胞が剥離するのを待っている間、凝集を防止するためにフラスコを叩いたり振ったりして細胞を攪拌しないこと。剥離しにくい細胞は、３７℃で配置して、分散を促進してもよい。
１０ｍＬの予熱したＶＰ－ＳＦＭ培地をフラスコに添加し、１０ｍＬのセロロジカルピペットで穏やかにピペット操作することにより、細胞を吸引する。フラスコをあらゆる方向に傾けて、フラスコを入念にすすぐ。
細胞懸濁液を１５ｍＬコニカルチューブに移し、１２５ｇで１０分スピンする。
上清を廃棄し、細胞を新鮮なＶＰ－ＳＦＭに再懸濁させる。細胞懸濁液の適切なアリコートを新しい培養容器に添加する。
培養物を３７℃でインキュベートする。
細胞は、最初の継代培養後に最もよく増殖する。
継代培養比：１：４希釈。
培地交換：週２回。
Ｖｅｒｏ－ＳＦの継代培養手順
このプロトコルで使用される体積は、７５ｃｍ２フラスコ用である。
パスツールピペット及び真空ポンプを用いて培地を取り出し、廃棄する。
細胞層を１０ｍＬのＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリーダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で短時間すすぐ。
５ｍＬのＴｒｙｐＬＥをフラスコに添加する。細胞が剥離するまで３７℃でインキュベートする。倒立顕微鏡を用いて細胞単層を観察し、フラスコの表面からの完全な細胞の剥離を確認する。
細胞が剥離するのを待っている間、凝集を防止するためにフラスコを叩いたり振ったりして細胞を攪拌しないこと。剥離しにくい細胞は、３７℃で配置して、分散を促進してもよい。
１０ｍＬの予熱したＶＰ－ＳＦＭ培地をフラスコに添加し、１０ｍＬのセロロジカルピペットで穏やかにピペット操作することにより、細胞を吸引する。フラスコをあらゆる方向に傾けて、フラスコを入念にすすぐ。
細胞懸濁液を１５ｍＬコニカルチューブに移し、１２５ｇで１０分スピンする。
上清を廃棄し、細胞を新鮮なＶＰ－ＳＦＭに再懸濁させる。細胞懸濁液の適切なアリコートを新しい培養容器に添加する。
培養物を３７℃でインキュベートする。
細胞は、最初の継代培養後に最もよく増殖する。
継代培養比：１：４希釈。
培地交換：週２回。
【0102】
２９３Ｔ－ＳＦの継代培養手順
このプロトコルで使用される体積は、７５ｃｍ２フラスコ用である。
パスツールピペット及び真空ポンプを用いて培地を取り出し、廃棄する。
細胞層を１０ｍＬのＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリーダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で短時間すすぐ。
１０ｍＬの予熱したＢａｌａｎＣＤ ＨＥＫ２９３培地をフラスコに添加し、１０ｍＬのセロロジカルピペットで穏やかにピペット操作することにより細胞を再懸濁する。
細胞懸濁液を１５ｍＬコニカルチューブに移し、１２５ｇで１０分スピンする。
上清を廃棄し、細胞を新鮮なＢａｌａｎＣＤ ＨＥＫ２９３培地に再懸濁させる。細胞懸濁液の適切なアリコートを新しい培養容器に添加する。
培養物を３７℃でインキュベートする。
細胞は最初の継代培養後に最もよく増殖する。
継代培養比：１：４希釈。
培地交換：週２回。
このプロトコルで使用される体積は、７５ｃｍ２フラスコ用である。
パスツールピペット及び真空ポンプを用いて培地を取り出し、廃棄する。
細胞層を１０ｍＬのＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリーダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で短時間すすぐ。
１０ｍＬの予熱したＢａｌａｎＣＤ ＨＥＫ２９３培地をフラスコに添加し、１０ｍＬのセロロジカルピペットで穏やかにピペット操作することにより細胞を再懸濁する。
細胞懸濁液を１５ｍＬコニカルチューブに移し、１２５ｇで１０分スピンする。
上清を廃棄し、細胞を新鮮なＢａｌａｎＣＤ ＨＥＫ２９３培地に再懸濁させる。細胞懸濁液の適切なアリコートを新しい培養容器に添加する。
培養物を３７℃でインキュベートする。
細胞は最初の継代培養後に最もよく増殖する。
継代培養比：１：４希釈。
培地交換：週２回。
【0103】
ＢＨＫ－２１及びＶｅｒｏ細胞の継代培養手順
このプロトコルで使用される体積は、７５ｃｍ２フラスコ用である。
パスツールピペット及び真空ポンプ（ＩＶ－１８）を用いて培地を取り出し、廃棄する。
細胞層を１０ｍＬのＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリーダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で短時間すすぐ。
５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡをフラスコに添加する。フラスコを傾けて表面を覆い、余剰物を除去する。
細胞が剥離するまで３７℃でインキュベートする。倒立顕微鏡を用いて細胞単層を観察し、フラスコの表面からの完全な細胞の剥離を確認する。
細胞が剥離するのを待っている間、凝集を防止するためにフラスコを叩いたり振ったりして細胞を攪拌しないこと。剥離しにくい細胞は、３７℃で配置して、分散を促進してもよい。
２０ｍＬの予熱したそれぞれの培地をフラスコに添加し、１０ｍＬのセロロジカルピペットを用いて、細胞を再懸濁させる。フラスコをあらゆる方向に傾けて、フラスコを入念にすすぐ。細胞懸濁液の適切なアリコートを新しい培養容器に添加する。
培養物を３７℃でインキュベートする。
ＢＨＫの培地は、ＤＭＥＭ＋ＴＰＢ＋ＦＢＳ＋ＰｅｎＳｔｒｅｐ、Ｖｅｒｏの培地は、ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ＋ＰｅｎＳｔｒｅｐである。
このプロトコルで使用される体積は、７５ｃｍ２フラスコ用である。
パスツールピペット及び真空ポンプ（ＩＶ－１８）を用いて培地を取り出し、廃棄する。
細胞層を１０ｍＬのＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリーダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で短時間すすぐ。
５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡをフラスコに添加する。フラスコを傾けて表面を覆い、余剰物を除去する。
細胞が剥離するまで３７℃でインキュベートする。倒立顕微鏡を用いて細胞単層を観察し、フラスコの表面からの完全な細胞の剥離を確認する。
細胞が剥離するのを待っている間、凝集を防止するためにフラスコを叩いたり振ったりして細胞を攪拌しないこと。剥離しにくい細胞は、３７℃で配置して、分散を促進してもよい。
２０ｍＬの予熱したそれぞれの培地をフラスコに添加し、１０ｍＬのセロロジカルピペットを用いて、細胞を再懸濁させる。フラスコをあらゆる方向に傾けて、フラスコを入念にすすぐ。細胞懸濁液の適切なアリコートを新しい培養容器に添加する。
培養物を３７℃でインキュベートする。
ＢＨＫの培地は、ＤＭＥＭ＋ＴＰＢ＋ＦＢＳ＋ＰｅｎＳｔｒｅｐ、Ｖｅｒｏの培地は、ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ＋ＰｅｎＳｔｒｅｐである。
【0104】
ＰＩＶ５レスキュー（トランスフェクション）
１日前：
ＢＨＫ－２１細胞を６０ｍｍ組織培養皿に１：８希釈で平板培養する（翌日、７５％コンフルエント）。
当日：
生物学的安全キャビネット内の１．６ｍＬマイクロ遠心チューブ中で、プラスミドＤＮＡ、ｐＣＡＧＧｓ－ＮＰ、ｐＣＡＧＧｓ－Ｐ、ｐＣＡＧＧｓ－Ｌ、及びｐＢＨ４３７（ｐＣＡＧＧＳ－Ｔ７）を混合する。
添加と添加の間にピペット操作により混合する。
ＪｅｔＰＲＩＭＥバッファーとＪｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬を添加する。
室温で１５分間インキュベートする。
トランスフェクション混合物を細胞に滴下する。
続く７日間、ＥＶＯＳを用い、合胞体について細胞をモニターする。
合胞体が存在したら、クライオチューブ中に１ｍＬの培地の収集を開始し、１０×ＳＰＧと混合する。
－８０℃で保存する。
１日前：
ＢＨＫ－２１細胞を６０ｍｍ組織培養皿に１：８希釈で平板培養する（翌日、７５％コンフルエント）。
当日：
生物学的安全キャビネット内の１．６ｍＬマイクロ遠心チューブ中で、プラスミドＤＮＡ、ｐＣＡＧＧｓ－ＮＰ、ｐＣＡＧＧｓ－Ｐ、ｐＣＡＧＧｓ－Ｌ、及びｐＢＨ４３７（ｐＣＡＧＧＳ－Ｔ７）を混合する。
添加と添加の間にピペット操作により混合する。
ＪｅｔＰＲＩＭＥバッファーとＪｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬を添加する。
室温で１５分間インキュベートする。
トランスフェクション混合物を細胞に滴下する。
続く７日間、ＥＶＯＳを用い、合胞体について細胞をモニターする。
合胞体が存在したら、クライオチューブ中に１ｍＬの培地の収集を開始し、１０×ＳＰＧと混合する。
－８０℃で保存する。
【0105】
ＰＩＶ５レスキュー共培養物（トランスフェクション）
１日前：
２９３Ｔ－ＳＦ細胞を６ウェル組織培養皿に１：６（約７５％コンフルエント）希釈で平板培養する。
Ｖｅｒｏ－ＳＦ細胞を１：２０（約５０％コンフルエント）希釈で１０ｃｍ皿に平板培養する。
１日前：
２９３Ｔ－ＳＦ細胞を６ウェル組織培養皿に１：６（約７５％コンフルエント）希釈で平板培養する。
Ｖｅｒｏ－ＳＦ細胞を１：２０（約５０％コンフルエント）希釈で１０ｃｍ皿に平板培養する。
【0106】
当日：
生物学的安全キャビネットにおいて、無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを含有する１．６ｍＬマイクロ遠心チューブ中で、プラスミドＤＮＡ、ｐＣＡＧＧｓ－ＮＰ、ｐＣＡＧＧｓ－Ｐ、ｐＣＡＧＧｓ－Ｌ、及びｐＢＨ４３７（ｐＣＡＧＧＳ－Ｔ７）を混合する。
添加と添加の間にピペット操作により混合する。
Ｐ３０００試薬を添加する。
無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを含有する別の１．６ｍＬマイクロ遠心チューブに、リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬を添加する。
室温で２０分インキュベートする。
トランスフェクション混合物を細胞に滴下する。
翌日：
２９３Ｔ－ＳＦをトリプシン処理し、１ｍＬのＶＰ－ＳＦＭ中によく再懸濁させ、別の１５ｍＬコニカルチューブに移す。
１０ｃｍＶｅｒｏ－ＳＦをトリプシン処理し、３ｍＬのＶＰ－ＳＦＭに再懸濁させ、１５ｍＬコニカルチューブに移す。
６ｍＬのＶＰ－ＳＦＭを１５ｍＬコニカルチューブに添加する。
よく混合し、１５ｍＬコニカルチューブから１０ｍＬ全部を新しい１０ｃｍ皿に添加する。
続く７日間、ＥＶＯＳを用い、合胞体について細胞をモニターする。
合胞体が存在したら、クライオチューブで１ｍＬの培地の収集を開始し、１０×ＳＰＧと混合する。
－８０℃で保管する。
生物学的安全キャビネットにおいて、無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを含有する１．６ｍＬマイクロ遠心チューブ中で、プラスミドＤＮＡ、ｐＣＡＧＧｓ－ＮＰ、ｐＣＡＧＧｓ－Ｐ、ｐＣＡＧＧｓ－Ｌ、及びｐＢＨ４３７（ｐＣＡＧＧＳ－Ｔ７）を混合する。
添加と添加の間にピペット操作により混合する。
Ｐ３０００試薬を添加する。
無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを含有する別の１．６ｍＬマイクロ遠心チューブに、リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬を添加する。
室温で２０分インキュベートする。
トランスフェクション混合物を細胞に滴下する。
翌日：
２９３Ｔ－ＳＦをトリプシン処理し、１ｍＬのＶＰ－ＳＦＭ中によく再懸濁させ、別の１５ｍＬコニカルチューブに移す。
１０ｃｍＶｅｒｏ－ＳＦをトリプシン処理し、３ｍＬのＶＰ－ＳＦＭに再懸濁させ、１５ｍＬコニカルチューブに移す。
６ｍＬのＶＰ－ＳＦＭを１５ｍＬコニカルチューブに添加する。
よく混合し、１５ｍＬコニカルチューブから１０ｍＬ全部を新しい１０ｃｍ皿に添加する。
続く７日間、ＥＶＯＳを用い、合胞体について細胞をモニターする。
合胞体が存在したら、クライオチューブで１ｍＬの培地の収集を開始し、１０×ＳＰＧと混合する。
－８０℃で保管する。
【0107】
ウイルスプラーク精製
１ｍＬの凍結レスキューアリコートを取り出し、プラークアッセイを実施する。
７日後、１０００ｕＬのピペットチップを用いて個別のプラークを突き、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＶ－１のプロトコルに従う前日に９０％のコンフルエントで平板培養したＶｅｒｏ－ＳＦ細胞の６ｃｍ皿に添加する。ＶＰ－ＳＦＭ培地を使用する。
７日目に、１４０ｕＬの培地サンプルを収集し、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキットを用いて、ＲＮＡ抽出のために使用する。
残りの培地（４．８ｍＬ）をクライオチューブ（Ｃｒｙｏ Ｔｕｂｅ）に集め、１０×ＳＰＧと混合する。
－８０℃で保存する。
１ｍＬの凍結レスキューアリコートを取り出し、プラークアッセイを実施する。
７日後、１０００ｕＬのピペットチップを用いて個別のプラークを突き、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＶ－１のプロトコルに従う前日に９０％のコンフルエントで平板培養したＶｅｒｏ－ＳＦ細胞の６ｃｍ皿に添加する。ＶＰ－ＳＦＭ培地を使用する。
７日目に、１４０ｕＬの培地サンプルを収集し、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキットを用いて、ＲＮＡ抽出のために使用する。
残りの培地（４．８ｍＬ）をクライオチューブ（Ｃｒｙｏ Ｔｕｂｅ）に集め、１０×ＳＰＧと混合する。
－８０℃で保存する。
【0108】
ＰＩＶ５プラークアッセイ
全てのステップは、生物学的安全キャビネットで実施する。
１日前：
Ｖｅｒｏ－ＳＦ細胞を６ウェル培養プレートに１：３希釈（翌日９５％コンフルエント）で平板培養する。
当日：
インキュベーター内でＰＩＶ５ウイルスを３７℃で解凍し、解凍後は氷上に保持する。
以下のように、ウイルスが解凍する間に、マルチチャンネルピペットを用い、未希釈サンプルから出発して、１０～５希釈で終わる１０倍希釈の９６ウェルプレートを調製し、ウイルスの名称、継代番号、収集日、希釈係数を記したラベルを６ウェルプレートに貼る。
２００ｕＬの未希釈サンプルを第１のウェルに添加する
１８０ｕＬの感染培地をウェル２～６に添加する
第１のウェルから２０ｕＬを取り出し、第２のウェルに移し、マルチチャンネルピペットのピペット操作＋混合機能を使用して、入念に混合する。チップを廃棄する。
前ステップをさらに５回繰り返す。
パスツールピペットと真空ポンプを用いて細胞から培地を吸引する。９００ｕＬのＶＰ－ＳＦＭ培地を６ウェル培養プレートの各ウェルに添加する。
６ウェル培養プレートを１ウェルあたり１００ｕＬのウイルス希釈液で感染させる。濃度の最も低いものから最も高いものまで移動する同じチップを使用し、１時間インキュベートする。
感染の１時間後に培地を吸引する。
各ウェルに４ｍＬのオーバーレイを添加する。オーバーレイ：１つの６ウェル培養プレートにつき、１３ｍＬの２％ＬＭＰ寒天培地と１３ｍＬの２Ｘ ＶＰ－ＳＦＭ培地を混合する。
３７℃で７日間インキュベートする。
全てのステップは、生物学的安全キャビネットで実施する。
１日前：
Ｖｅｒｏ－ＳＦ細胞を６ウェル培養プレートに１：３希釈（翌日９５％コンフルエント）で平板培養する。
当日：
インキュベーター内でＰＩＶ５ウイルスを３７℃で解凍し、解凍後は氷上に保持する。
以下のように、ウイルスが解凍する間に、マルチチャンネルピペットを用い、未希釈サンプルから出発して、１０～５希釈で終わる１０倍希釈の９６ウェルプレートを調製し、ウイルスの名称、継代番号、収集日、希釈係数を記したラベルを６ウェルプレートに貼る。
２００ｕＬの未希釈サンプルを第１のウェルに添加する
１８０ｕＬの感染培地をウェル２～６に添加する
第１のウェルから２０ｕＬを取り出し、第２のウェルに移し、マルチチャンネルピペットのピペット操作＋混合機能を使用して、入念に混合する。チップを廃棄する。
前ステップをさらに５回繰り返す。
パスツールピペットと真空ポンプを用いて細胞から培地を吸引する。９００ｕＬのＶＰ－ＳＦＭ培地を６ウェル培養プレートの各ウェルに添加する。
６ウェル培養プレートを１ウェルあたり１００ｕＬのウイルス希釈液で感染させる。濃度の最も低いものから最も高いものまで移動する同じチップを使用し、１時間インキュベートする。
感染の１時間後に培地を吸引する。
各ウェルに４ｍＬのオーバーレイを添加する。オーバーレイ：１つの６ウェル培養プレートにつき、１３ｍＬの２％ＬＭＰ寒天培地と１３ｍＬの２Ｘ ＶＰ－ＳＦＭ培地を混合する。
３７℃で７日間インキュベートする。
【0109】
ＰＩＶ５ウイルスの増殖
１日前：
Ｖｅｒｏ－ＳＦ細胞を１７５ｃｍ２フラスコに１：３希釈で平板培養する（翌日は９５％コンフルエント）。
当日：
接種材料を調製する。２０ｍＬのＶＰ－ＳＦＭ培地中ＭＯＩ＝０．０１のウイルス。
パスツールピペットと真空ポンプを用いて、細胞から維持培地を吸引する
Ｖｅｒｏ－ＳＦ細胞を３７℃で２時間感染させる。１５分毎にプレートを揺動。
接種材料を吸引し、４０ｍＬのＶＰ－ＳＦＭ培地を添加する。
３７℃で７日間インキュベートする。
７日目：
回収した培地を５０ｍＬコニカルチューブに入れ、１５００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心分離し、細胞残屑を除去する。
３８ｍＬの上清を新しい５０ｍＬコニカルチューブに移す。
３．８ｍＬの１０×ＳＰＧを添加し、１ｍＬのアリコートをクライオチューブ中に作製する。
チューブは、次のようにラベル付けする。
ウイルス名プラーク＃
細胞継代
日付イニシャル
ウイルスアリコートを－８０℃で保存する。
１日前：
Ｖｅｒｏ－ＳＦ細胞を１７５ｃｍ２フラスコに１：３希釈で平板培養する（翌日は９５％コンフルエント）。
当日：
接種材料を調製する。２０ｍＬのＶＰ－ＳＦＭ培地中ＭＯＩ＝０．０１のウイルス。
パスツールピペットと真空ポンプを用いて、細胞から維持培地を吸引する
Ｖｅｒｏ－ＳＦ細胞を３７℃で２時間感染させる。１５分毎にプレートを揺動。
接種材料を吸引し、４０ｍＬのＶＰ－ＳＦＭ培地を添加する。
３７℃で７日間インキュベートする。
７日目：
回収した培地を５０ｍＬコニカルチューブに入れ、１５００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心分離し、細胞残屑を除去する。
３８ｍＬの上清を新しい５０ｍＬコニカルチューブに移す。
３．８ｍＬの１０×ＳＰＧを添加し、１ｍＬのアリコートをクライオチューブ中に作製する。
チューブは、次のようにラベル付けする。
ウイルス名プラーク＃
細胞継代
日付イニシャル
ウイルスアリコートを－８０℃で保存する。
【0110】
実施例２
パラインフルエンザウイルス５ベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンによる単回用量鼻腔内免疫は、フェレット及びネコの鼻腔に殺菌免疫を生成する
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、新型ベータコロナウイルスであり、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの原因である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から防御するためのワクチンが、拡散を減らし、これ以上の死亡率を制限するために緊急に必要とされる。パンデミックに対抗するための有効な手段を見出すために、多数のワクチン候補が評価されている。上気道は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の初期部位であり、多くの感染者にとって、依然としてウイルス複製の主要部位である。高いウイルス負荷とこの領域からの排出は、症状の発症の数日前に開始し、発症後数日間続く可能性がある。これらの部位での感染を制御することは、パンデミックに対抗するために重要である。今日まで、大型動物モデルの鼻腔など、上気道に殺菌免疫を賦与するワクチンはなかった。この実施例は、マウスモデルにおけるワクチン候補を最適化し、その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を発現するパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）による単回用量鼻腔内免疫が、フェレット及びネコにおいて殺菌免疫を誘導したことを実証した。この粘膜ワクチン戦略は、上気道でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を阻害し、下気道への感染の進行を予防した。最も重要なことは、上気道で殺菌免疫を誘導するワクチン候補は、伝播を制限するため、集団におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を低減する可能性が高い。
パラインフルエンザウイルス５ベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンによる単回用量鼻腔内免疫は、フェレット及びネコの鼻腔に殺菌免疫を生成する
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、新型ベータコロナウイルスであり、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの原因である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から防御するためのワクチンが、拡散を減らし、これ以上の死亡率を制限するために緊急に必要とされる。パンデミックに対抗するための有効な手段を見出すために、多数のワクチン候補が評価されている。上気道は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の初期部位であり、多くの感染者にとって、依然としてウイルス複製の主要部位である。高いウイルス負荷とこの領域からの排出は、症状の発症の数日前に開始し、発症後数日間続く可能性がある。これらの部位での感染を制御することは、パンデミックに対抗するために重要である。今日まで、大型動物モデルの鼻腔など、上気道に殺菌免疫を賦与するワクチンはなかった。この実施例は、マウスモデルにおけるワクチン候補を最適化し、その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を発現するパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）による単回用量鼻腔内免疫が、フェレット及びネコにおいて殺菌免疫を誘導したことを実証した。この粘膜ワクチン戦略は、上気道でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を阻害し、下気道への感染の進行を予防した。最も重要なことは、上気道で殺菌免疫を誘導するワクチン候補は、伝播を制限するため、集団におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を低減する可能性が高い。
【0111】
上気道の副鼻腔上皮は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の初期部位であり、多くの個体にとって、依然としてウイルス複製の主要部位である。高レベルのウイルス複製は、上気道で起こり（Ｗｏｅｌｆｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５８１，４６５－４６９（２０２０））、鼻咽頭からの排出は、初期症状の後数日間継続し得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９２，２２８６－２２８７（２０２０））。肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び呼吸不全の進行性下気道症状は、ＣＯＶＩＤ－１９の罹患率及び死亡率の多くに寄与しており、肺以外の他の臓器系の関与のエビデンスが増えている。上気道及び下気道は、ＣＯＶＩＤ－１９の病因の極めて重要な部位であるため、肺に進行する前に上気道でのウイルス複製を停止させることは、予防ワクチンの重要な目標である。これまでの主要なワクチンは、免疫動物及びヒト臨床試験で頑健な抗体反応を生み出し、非ヒト霊長類モデルにおける下気道でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を低減した（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３８３、１５４４－１５５５（２０２０）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，７７－８１（２０２０）；Ｍｅｒｃａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，（２０２０）；ｖａｎ Ｄｏｒｅｍａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ，（２０２０）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８２，７１３－７２１ ｅ７１９（２０２０））。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を防止する上で重要な上気道の完全な防御を達成することは困難であった。現時点で、これらのワクチン候補が、伝播を阻止できるかどうかについての報告はない。
【0112】
パラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）は、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、狂犬病、及び他の多様な病原体に対するワクチンベクターとして評価されているパラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８７、２９８６－２９９３（２０１３）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ｍＢｉｏ １１，（２０２０）；Ｍｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８７， ３６３－３７１（２０１３）；Ｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ３２、３０５０－３０５７（２０１４）；Ｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９１，（２０１７））。動物モデルにおいて、ＰＩＶ５は安全であり、イヌのケンネルコフを除いて、どの疾患とも関連していない（Ｃｏｒｎｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｖｅｔ Ｒｅｃ ９８，３０１－３０２（１９７６））。鼻腔内投与される生存ＰＩＶ５含有ケンネルコフワクチンは、４０年以上にわたって使用されて、優れた安全性記録を残している。ケンネルコフワクチンで免疫処置されたイヌは、ＰＩＶ５を最大５日間排出することができ、免疫処置された動物と密接に接触しているヒトに対し安全であった（Ｋｏｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２，１６９４－１６９８（１９８１）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７，ｅ５０１４４（２０１２））。ＰＩＶ５は、鼻腔内投与されると、気道における局所的な防御ＩｇＡ応答、並びに全身性の自然及び適応免疫応答を誘発するため、呼吸器疾患のワクチンベクターとして特に適している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９１，（２０１７））。近年、ＰＩＶ５ベースのＭＥＲＳワクチンの単回鼻腔内用量は、中和抗体及び細胞性免疫応答を誘導し、ＭＥＲＳのマウスモデルにおけるＭＥＲＳ－ＣｏＶによる致死的チャレンジに対して１００％防御された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ｍＢｉｏ １１，（２０２０））。この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御のための有望なワクチン候補を提供する。
【0113】
ＰＩＶ５ベースのＭＥＲＳ－ＣｏＶワクチン開発に使用したのと類似の戦略を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質を発現するＰＩＶ５（ＣＶＸＧＡ１と称する）を作製し（図１８Ａ）、免疫蛍光法及びウエスタンブロットによりそのＳ糖タンパク質発現を確認した（図１８Ｂ）。ＣＶＸＧＡ１感染細胞中には、完全長Ｓ以外に、切断産物Ｓ１も検出され、これは、Ｓがプロセシングされたことを示している（図１８Ｂ）。Ｓは、細胞同士の融合及びウイルスと細胞の融合を促進して、ウイルスの侵入を容易にするため、Ｓによる免疫は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御免疫を生成する。Ｓのネイティブ（融合前）立体配座は、最適な防御のための望ましい免疫を誘導すると考えられる。ＣＶＸＧＡ１によって発現されるＳが機能的であるかどうかを調べるために、ＡＣＥ２受容体を発現するＶｅｒｏ細胞をＣＶＸＧＡ１に感染させた。ＣＶＸＧＡ１感染細胞にのみ、合胞体形成（細胞同士の融合）が観察され、これは、ＣＶＸＧＡ１によって発現されるＳタンパク質が機能的であることを示している（図１８Ｃ）。ＣＶＸＧＡ１の免疫原性を検証するために、免疫したマウスに、様々な用量のＣＶＸＧＡ１を鼻腔内免疫した。抗Ｓ抗体の用量依存的な増加が、単回鼻腔内投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスに検出された（図１８Ｄ）。同様に、Ｓの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を認識する抗体が、ＣＶＸＧＡ１で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて用量依存的に検出された（図１８Ｅ）。さらには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体が、免疫処置したＢＡＬＢ／ｃマウスに、用量依存的に検出された（図１８Ｆ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、６×１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）という低用量で単回鼻腔内（ＩＮ）免疫処置した後、有意な抗体産生及び細胞応答が観察された（図２２）。これらの結果は、ＣＶＸＧＡ１による鼻腔内単回用量免疫処置がマウスで頑健な免疫応答を生み出したことを示している。
【0114】
ＣＶＸＧＡ１の有効性を決定するために、３つの補完的動物モデルを使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して機能的なＡＣＥ２受容体を欠失しているため、感染に対して抵抗性である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するアデノウイルスベクター形質導入（Ａｄ５－ｈＡＣＥ２）感作マウスによるヒトＡＣＥ２の導入は、一過性の肺炎感染を引き起こした。このマウスモデルを用いて、ＣＶＸＧＡ１の有効性を評価した。ＣＶＸＧＡ１による鼻腔内ワクチン接種は、体重減少からマウスを保護する（図２３）と共に、肺組織力価、及び組織組織病理学的変化も低減した。マウスの完全な防御がないのは、これらの実験で使用した低用量（マウス当たり最大５×１０４ＰＦＵ）によるものと考えられる。或いは、Ａｄ５－ｈＡＣＥ２形質導入が、このモデルにおける殺菌免疫の欠如の主な要因である可能性もある。ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による免疫は、より高い抗Ｓ抗体価を生み出したが、中和抗体は検出されず（図２４）、不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対してマウスを防御しなかった（図１９Ｂ）。ＣＶＸＧＡ１は、不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも低い抗Ｓ力価を生成したが、不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも良好にマウスを防御しており、これは、ＣＶＸＧＡ１によって生成された細胞性免疫が、この結果に一定の役割を果たした可能性が高いことを示唆している。これは、Ａｄ５－ＡＣＥ２で感作し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジしたＣＶＸＧＡ１免疫マウスの肺における殺菌免疫の欠如と一致するものである。
【0115】
以前、ＰＩＶ５ベースのＭＥＲＳワクチンと不活化ＭＥＲＳ－ＣｏＶワクチンをマウスで比較したところ、不活化ＭＥＲＳ－ＣｏＶによる免疫が過敏性免疫応答を引き起こしたことが判明したが、これは、ウイルスチャレンジ後の肺への好酸球の流入によって示された。この観察と同様に、ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による免疫は、好酸球浸潤と関連していたが、ＣＶＸＧＡ１免疫マウスは、チャレンジ後にそのような浸潤がなく、これは、ＣＶＸＧＡ１が過敏性応答を誘発しなかったことを示唆している（図１９Ｃ、Ｄ）。対照的に、全ての処置群は、同様の程度の単核細胞浸潤を有した（図１９Ｃ）。
【0116】
フェレットは、広く使用されているヒト呼吸器感染症のモデルであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して感受性が高く、直接接触及びエアロゾルを介してウイルスを他の動物に伝播し得る（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，（２０２０）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０２０）；Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，３４９６（２０２０））。フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１有効性を検証するために、動物をＰＢＳ又はＣＶＸＧＡ１で鼻腔内免疫した（図２０Ａ）。ＣＶＸＧＡ１免疫は、抗Ｓ ＩｇＧ（図２５Ａ）、抗ＲＢＤ ＩｇＧ（図２０Ｂ）及び図２０Ｃの中和抗体の高力価によって明らかなように、頑健な抗体応答を生成した。低レベルの抗Ｓ ＩｇＡが鼻洗浄液中に検出された（図２５Ｂ）。鼻腔内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をチャレンジしたところ、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットからの鼻洗浄液中にウイルスＲＮＡは検出されなかった（図２０Ｄ）。対照的に、全ての模擬免疫フェレットに、ウイルスＲＮＡが検出された（図２０Ｄ及び表３）。ウイルスＲＮＡ検出を感染性フォーカス形成アッセイと比較するために、チャレンジ後５日目（ｄｐｃ）からの鼻洗浄液中の感染性ウイルスを、感染性フォーカス形成アッセイを用いて決定した。
【0117】
【表3】
【0118】
ｑＲＴ－ＰＣＲによるウイルスＲＮＡゲノムの検出は、感染性フォーカス形成アッセイと同等であった（図２５Ｃ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質は、ＰＢＳ免疫された、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２チャレンジフェレットの気道及び実質において４ｄｐｃで検出された（図２５Ｄ）。ウイルスＲＮＡは、模擬免疫フェレットの気管及び肺でも検出されたが、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットの気管及び肺では検出されなかった（図２０Ｅ及び２０Ｆ）。フェレットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を評価するために、実験終了時（７ｄｐｃ）に抗Ｓ抗体レベルを定量化した。ＣＶＸＧＡ１免疫群における抗Ｓレベルは、チャレンジ後に増加し（図２５Ｅ）、Ｓ抗原に対する記憶応答及び曝露を示している。これらの結果は、ＣＶＸＧＡ１免疫が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２によるチャレンジ後の殺菌免疫を誘導し、最も重要なことには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の複製及び伝播の重要な部位である鼻腔で誘導されたことを示している。
【0119】
ネコは、自然にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しやすく、実験室において、設定によっては、ウイルスを伝播し得る。ＣＶＸＧＡ１免疫が上気道感染を阻止するかどうかを判断するために、ネコをアジュバントなしで鼻腔内（ＩＮ）及び皮下（ｓｕｂＱ）経路によりＣＶＸＧＡ１で免疫した（図２１Ａ）。免疫応答を増強するために、ｓｕｂＱ経路により免疫した群にブースター接種した（図２１Ａ）。ｓｕｂＱ（プライムブースト）及びＩＮ免疫の両方が、同様の抗体応答を生じた（図２１Ｂ及び２１Ｃ並びに図２６Ａ）。注目すべきことに、ＩＮ免疫は、鼻洗浄液中に検出可能な抗Ｓ ＩｇＡを産生した（図２１Ｄ）。チャレンジ後、模擬免疫群（ＰＢＳ）のネコは全て、チャレンジ後１日目に鼻洗浄液中に高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価を有した（平均６．２７×１０４ＦＦＵ／ｍｌ超）。驚くことに、ＩＮ免疫群では、４匹中２匹（５０％）に検出可能なウイルスがなく、４匹中２匹でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価が２３０倍低下した（平均２．７×１０２ＦＦＵ／ｍｌ）。興味深いことに、ｓｕｂＱ免疫はＩＮ免疫と同様の血清抗体価を生成したが、１ｄｐｃに鼻腔の感染を防御しなかった（６．１６×１０４ＦＦＵ／ｍｌ）。しかし、ｓｕｂＱ免疫されたネコは、模擬免疫されたネコよりも早く感染を排除した：５ｄｐｃまでに、４匹のネコのうち３匹はウイルスが検出されなかったが、模擬免疫動物は全て感染したままであった（図２１Ｅ）。７ｄｐｃまでに、全てのネコの鼻洗浄液にウイルスは検出されなかった。これらの結果は、ウイルスＲＮＡについてｑＲＴ－ＰＣＲを用いて確認した（図２６Ｂ）。７ｄｐｃの鼻洗浄液には生存ウイルスは検出されなかったが、ＰＢＳ群には１１ｄｐｃまでウイルスゲノムが検出されたことは注目に値し、以前の報告と一致している。
【0120】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に対する動物の曝露を決定するために、実験終了時に抗Ｎ抗体レベルを測定した（１４ｄｐｃ）。１４ｄｐｃに、全てのネコに抗Ｎ抗体が検出され；ＰＢＳ－及びｓｕｂＱ免疫ネコは、ＩＮ免疫動物よりも高い抗Ｎレベルを有した（図２６Ｃ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する曝露と一致して、ＩＮ免疫動物には、チャレンジ後に抗Ｓ力価の増加があった（図２６Ｄ）。ｓｕｂＱ免疫は、ＩＮ免疫に匹敵する抗Ｓ応答を生成したが、鼻腔における感染を予防しなかったという知見は、高い血清抗体応答が鼻腔の感染を予防しないという観察結果と一致している。個々の動物の免疫応答を評価すると、血清抗体価と鼻腔の防御との間に相関は観察されず、抗Ｓ抗体価が副鼻腔における防御の予測因子ではないことがさらに確認された（表４）。
【0121】
【表4】
【0122】
この試験は、ＰＩＶ５ベースの鼻腔内ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが、動物の殺菌免疫を生成し得ることを実証するものである。このワクチン候補のさらなる開発によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播を阻止することができるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが提供され得る。ケンネルコフワクチンは、数十年にわたって安価で製造されてきた。ＰＩＶ５ベクターに基づく安全、効果的且つ安価なＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの制御に寄与し得る。
【0123】
材料及び方法
ウイルス及び細胞
細胞質尾部がＰＩＶ５のＦの尾部で置換され、ＰＩＶ５のＳＨとＨＮの間に挿入されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを有するＰＩＶ５の完全長ゲノムをコードする、ＣＶＸＧＡ１プラスミド。以前記載されているように、ウイルスレスキューを実施した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４－３６２，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２３２１－１２）。簡単に説明すると、ＣＶＸＧＡ１プラスミド、並びにＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれコードする４つのヘルパープラスミド、ｐＰＩＶ５－ＮＰ、ｐＰＩＶ５－Ｐ、ｐＰＩＶ５－Ｌ、及びｐＴ７－ポリメラーゼを、リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に、６ｃｍプレートにおいて９０％コンフルエントのＢＨＫ２１細胞に共トランスフェクトした。培地に放出されたウイルスをＶｅｒｏ細胞で増幅した。ウイルスの回収は、Ｖｅｒｏ細胞中の合胞体形成によって示される。次に、Ｖｅｒｏ細胞からの単一プラークとしてウイルスをプラーク精製した。ＣＶＸＧＡ１ウイルスのプラーク精製単一クローンの完全長ゲノムを、記載される通りに配列決定した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４－３６２，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２３２１－１２）。２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて５～７日間ベロ細胞中でウイルスを増殖させた。培地を回収し、３０００ｒｐｍでペレット化し、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上遠心分離機を用いて１０分間細胞残渣を除去した。ウイルス上清に１０％スクロースリン酸グルタミン酸（ＳＰＧ）バッファーを添加し、液体窒素中で急速凍結し、回収後すぐに－８０℃で保存した。
ウイルス及び細胞
細胞質尾部がＰＩＶ５のＦの尾部で置換され、ＰＩＶ５のＳＨとＨＮの間に挿入されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを有するＰＩＶ５の完全長ゲノムをコードする、ＣＶＸＧＡ１プラスミド。以前記載されているように、ウイルスレスキューを実施した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４－３６２，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２３２１－１２）。簡単に説明すると、ＣＶＸＧＡ１プラスミド、並びにＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれコードする４つのヘルパープラスミド、ｐＰＩＶ５－ＮＰ、ｐＰＩＶ５－Ｐ、ｐＰＩＶ５－Ｌ、及びｐＴ７－ポリメラーゼを、リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に、６ｃｍプレートにおいて９０％コンフルエントのＢＨＫ２１細胞に共トランスフェクトした。培地に放出されたウイルスをＶｅｒｏ細胞で増幅した。ウイルスの回収は、Ｖｅｒｏ細胞中の合胞体形成によって示される。次に、Ｖｅｒｏ細胞からの単一プラークとしてウイルスをプラーク精製した。ＣＶＸＧＡ１ウイルスのプラーク精製単一クローンの完全長ゲノムを、記載される通りに配列決定した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８７：３５４－３６２，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２３２１－１２）。２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて５～７日間ベロ細胞中でウイルスを増殖させた。培地を回収し、３０００ｒｐｍでペレット化し、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上遠心分離機を用いて１０分間細胞残渣を除去した。ウイルス上清に１０％スクロースリン酸グルタミン酸（ＳＰＧ）バッファーを添加し、液体窒素中で急速凍結し、回収後すぐに－８０℃で保存した。
【0124】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス又は組織ホモジネート上清をＤＭＥＭで段階希釈した。ＶｅｒｏＥ６細胞の１２ウェルプレートを５％ＣＯ２、３７℃で１時間接種し、１５分毎に穏やかに揺り動かした。接種材料を除去した後、４％ＦＢＳを含む１．２％アガロースでプレートを覆った。３日後、オーバーレイを除去し、０．１％クリスタルバイオレット染色を用いてプラークを可視化した。ウイルス力価をＰＦＵ／ｍＬ組織として定量した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、４，０１６μＷ／ｃｍ２のワット数を使用して１時間紫外線に曝露することによって不活性化した。
【0125】
全ての細胞株を５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。ベロ細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。ＢＨＫ２１細胞は、１０％トリプトースリン酸ブロス（ＴＰＢ）、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで増殖させた。
【0126】
免疫蛍光及びイムノブロッティング
ＣＶＸＧＡ１又はＰＩＶ５に１のＭＯＩで感染させた２４ウェルプレート内のＭＤＢＫ細胞で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ発現の免疫蛍光を実施した。感染から２日後（ｄｐｉ）に、細胞をＰＢＳで洗浄してから、２％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を０．１％ＰＢＳ－サポニン溶液中で透過処理し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号４０１５０－Ｒ００７）及び抗ＰＩＶ５－Ｖ／Ｐを１：２００希釈で１ｈｐｉインキュベートした後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ウサギ（ＫＰＬ、カタログ番号０２－１５－１６）及びＣｙ３標識ヤギ抗マウス（ＫＰＬ、カタログ番号０７２－０１－１８－０６）二次抗体を細胞に添加した。細胞を３０分間インキュベートし、蛍光顕微鏡（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、検査及び写真撮影を行った。
ＣＶＸＧＡ１又はＰＩＶ５に１のＭＯＩで感染させた２４ウェルプレート内のＭＤＢＫ細胞で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ発現の免疫蛍光を実施した。感染から２日後（ｄｐｉ）に、細胞をＰＢＳで洗浄してから、２％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を０．１％ＰＢＳ－サポニン溶液中で透過処理し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号４０１５０－Ｒ００７）及び抗ＰＩＶ５－Ｖ／Ｐを１：２００希釈で１ｈｐｉインキュベートした後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ウサギ（ＫＰＬ、カタログ番号０２－１５－１６）及びＣｙ３標識ヤギ抗マウス（ＫＰＬ、カタログ番号０７２－０１－１８－０６）二次抗体を細胞に添加した。細胞を３０分間インキュベートし、蛍光顕微鏡（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、検査及び写真撮影を行った。
【0127】
ＣＶＸＧＡ１又はＰＩＶ５に１のＭＯＩで感染させた１２ウェルプレート内のＶｅｒｏ細胞に対して、イムノブロッティングを実施した。２４ｈｐｉに、５％β－メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１６１０７３７）を用いて細胞を溶解させた。ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に泳動させ、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＺＨＵ１０７６）及び抗ＰＩＶ５－Ｖ／Ｐ抗体でイムノブロットした。
【0128】
Ｓ及びＳのＲＢＤの精製
融合前安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク細胞外ドメインのｃＤＮＡをコードするプラスミド（Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３６７：１２６０－１２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｂ２５０７）を合成し（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ｐＴｗｉｓｔ ＣＭＶ Ｈｙｇｒｏベクターにクローニングした。単量体スパイク受容体結合ドメインをコードするプラスミドをＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＮＲ－５２３０９）から入手した。プラスミドは、選択に使用した１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換することによって増殖した。製造者のプロトコルに従い、ＥＺＮＡプラスミドマキシキット（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、プラスミドを精製した。トランスフェクション１リットルにつき、１ｍｇのプラスミドＤＮＡを、６６ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）中４ｍｇの２５，０００分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）と混合した。３０分後、ＤＮＡ－ＰＥＩ混合物をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ）中のＨＥＫ２９３Ｆ細胞（１００万細胞／ｍｌ）に添加した。５～７日後、培養物を遠心分離して、細胞をペレット化し、上清を０．４５μｍ滅菌フィルターで濾過した。ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、濾過済培養上清から組換えタンパク質を精製した。各カラムを２０％エタノール中に保存し、５カラム容量（ＣＶ）の洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、及び２０ｍＭイミダゾール）で洗浄した後、サンプルをカラムにロードした。サンプルの適用後、カラムを１０ＣＶの洗浄バッファーで洗浄した。６ＣＶの溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、及び２５０ｍＭイミダゾール）を用いて、タンパク質をカラムから溶出した。タンパク質を濃縮し、３０ｋＤａカットオフ（ミリポアシグマ）のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニットを用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にバッファー交換した。
融合前安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク細胞外ドメインのｃＤＮＡをコードするプラスミド（Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３６７：１２６０－１２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｂ２５０７）を合成し（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ｐＴｗｉｓｔ ＣＭＶ Ｈｙｇｒｏベクターにクローニングした。単量体スパイク受容体結合ドメインをコードするプラスミドをＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＮＲ－５２３０９）から入手した。プラスミドは、選択に使用した１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換することによって増殖した。製造者のプロトコルに従い、ＥＺＮＡプラスミドマキシキット（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、プラスミドを精製した。トランスフェクション１リットルにつき、１ｍｇのプラスミドＤＮＡを、６６ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）中４ｍｇの２５，０００分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）と混合した。３０分後、ＤＮＡ－ＰＥＩ混合物をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ）中のＨＥＫ２９３Ｆ細胞（１００万細胞／ｍｌ）に添加した。５～７日後、培養物を遠心分離して、細胞をペレット化し、上清を０．４５μｍ滅菌フィルターで濾過した。ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、濾過済培養上清から組換えタンパク質を精製した。各カラムを２０％エタノール中に保存し、５カラム容量（ＣＶ）の洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、及び２０ｍＭイミダゾール）で洗浄した後、サンプルをカラムにロードした。サンプルの適用後、カラムを１０ＣＶの洗浄バッファーで洗浄した。６ＣＶの溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、及び２５０ｍＭイミダゾール）を用いて、タンパク質をカラムから溶出した。タンパク質を濃縮し、３０ｋＤａカットオフ（ミリポアシグマ）のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニットを用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にバッファー交換した。
【0129】
ＥＬＩＳＡ
プライム後及びブースト後の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ体液性反応を定量化するために、マウス血清をＥＬＩＳＡで分析した。ＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ ９６ウェルマイクロプレートを、１００ｕＬの精製ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（１ｕｇ／ｍＬ）でコーティングした。血清を２倍に段階希釈し、プレート上で２時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）を１：２５００に希釈し、ウェル上で１時間インキュベートした。ＫＰＬ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、プレートを進行させ、ＢｉｏＴｅｋ Ｅｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）を用いて、ＯＤ４５０値を検出した。抗体エンドポイントは、最高血清希釈のｌｏｇ１０として計算され、そこで、ＯＤ４５０は、ナイーブ血清の平均ＯＤ４５０を２標準偏差上回った。
プライム後及びブースト後の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ体液性反応を定量化するために、マウス血清をＥＬＩＳＡで分析した。ＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ ９６ウェルマイクロプレートを、１００ｕＬの精製ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（１ｕｇ／ｍＬ）でコーティングした。血清を２倍に段階希釈し、プレート上で２時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）を１：２５００に希釈し、ウェル上で１時間インキュベートした。ＫＰＬ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、プレートを進行させ、ＢｉｏＴｅｋ Ｅｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）を用いて、ＯＤ４５０値を検出した。抗体エンドポイントは、最高血清希釈のｌｏｇ１０として計算され、そこで、ＯＤ４５０は、ナイーブ血清の平均ＯＤ４５０を２標準偏差上回った。
【0130】
Ｆｅｒｒｅｔ ＩｇＧを検出するために、培地結合９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ ６５５００１）を、滅菌１×リン酸緩衝生理食塩水（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２１－０４０－ＣＶ）中の完全長ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２全スパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（Ａｍａｎａ ｅｔ ａｌ．２０２０、Ｎａｔ Ｍｅｄ；２６：１０３３－１０３６、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０２０－０９１３－１５）のいずれか２０ｕｇで、４℃にて一晩コーティングした。自動プレート洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ ４０５ ＴＳ Ｗａｓｈｅｒ）を用いて、３００ｕＬの０．０５％ＰＢＳ－Ｔでプレートを３回洗浄した。洗浄は全て、同じ技術を用いて行った。ウェルを２００ｕＬのブロッキングバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン＋０．０５％ＰＢＳ－Ｔ中の３％脱脂粉乳）で遮断し、室温で２時間インキュベートした後、洗浄した。熱不活性化血清をブロッキングバッファーで希釈し、適切なウェルに１００ｕｌを添加し、室温で２時間インキュベートした後、洗浄ステップに付した。ブロッキングバッファーで１：５０００～１：１００００に希釈したヤギ抗フェレットＩｇＧ ＨＲＰ共役抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａ１４０－１０８Ｐ）を１ウェルあたり１００ｕＬで添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、排液して、残留溶液を除去した。ペルオキシダーゼ活性を検出するためのＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩）錠剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ９１８７）を２０ｍＬのＤＩＨ２０中に調製し、ウェル当たり１００ｕＬで添加した。８分の進行時間後、５０ｕＬの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止した。直ちに、プレートを４９０ｎｍの吸光度で読み取った（ＢｉｏＴｅｋ、Ｃｙｔａｔｉｏｎ７ ｍａｃｈｉｎｅ）。バックグラウンドシグナルは、ヤギ抗フェレットＩｇＧ ＨＲＰ抗体を受けた捕捉タンパク質コートウェルから得られた平均吸光度値から算出した。
【0131】
ネコＩｇＧを検出するために、フェレットＩｇＧアッセイの場合と同様に、９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレートをコーティング及び遮断した。熱不活化血清をブロッキングバッファーで希釈し、適切なウェルに１００ｕｌを添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ブロッキングバッファーで１：１００００に希釈したヤギ抗ネコＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａ２０－１２０Ｐ）をウェル当たり１００ｕＬで添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、排液して、残留溶液を除去した。プレートを進行させ、フェレットＩｇＧ ＥＬＩＳＡと同様に読み取った。バックグラウンドシグナルは、ヤギ抗ネコＩｇＧ ＨＲＰ抗体を受けた捕捉タンパク質コートウェルから得られた平均吸光度値から算出した。
【0132】
ネコＩｇＡを検出するために、フェレットＩｇＧ検出と同様に、ＥＬＩＳＡマイクロプレートをコーティング、遮断、及び洗浄した。各鼻洗浄液サンプル（ＰＢＳ中に収集）の２倍段階希釈をブロッキングバッファーで行い、１００ｕｌを適切なウェルに添加した。鼻洗浄希釈液を室温で２時間インキュベートし、洗浄し、ブロッキングバッファーで１：１００００に希釈したヤギ抗ネコＩｇＡ ＨＲＰ共役抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａ２０－１０１Ｐ）を１ウェル当たり１００ｕＬで添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、排液して、残留溶液を除去した。プレートを進行させた後、フェレットＩｇＧ ＥＬＩＳＡと同様に読み取った。バックグラウンドシグナルは、スパイクコートヤギ抗ネコＩｇＡ ＨＲＰのみの対照ウェルから得られた吸光度値の平均から算出した。
【0133】
フェレットＩｇＡを検出するために、ＥＬＩＳＡマイクロプレートをコーティングし、遮断し、フェレットＩｇＧ検出の場合と同様に洗浄した。プールされた熱不活性化鼻洗浄サンプル（ＰＢＳで収集）の２倍段階希釈をブロッキングバッファーで実施し、１００ｕｌを適切なウェルに添加した。鼻洗浄希釈液を室温で２時間インキュベートし、洗浄し、ブロッキングバッファーで１：２０００に希釈したヤギ抗フェレットＩｇＡ ＡＰ結合抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、６１８－１０５－００６）を１ウェル当たり１００ｕＬで添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、排液して、残留溶液を除去した。アルカリホスファターゼ活性を検出するためのＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ｐ－ニトロフェニルリン酸錠剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎ１８９１）を５ｍＬのＤＩ Ｈ２０で調製し、ウェル当たり２００ｕＬで添加した。プレートを光から保護するためにホイルで包んでから、室温で３０～４５分間インキュベートした。８分の進行時間後、５０ｕＬの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して、反応を停止した。直ちに、プレートを４０５ｎｍの吸光度で読み取った（ＢｉｏＴｅｋ、Ｃｙｔａｔｉｏｎ７ ｍａｃｈｉｎｅ）。バックグラウンドシグナルは、ヤギ抗フェレットＩｇＡ ＡＰ抗体を受けた捕捉タンパク質コートウェルから得られた平均吸光度値から算出した。
【0134】
インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴマウスＩＦＮ－γセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を細胞性免疫応答の分析に使用した。アッセイを実施する２４時間前に、ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴプレートを精製済抗マウスＩＦＮ－γ抗体でコーティングした。マウスの脾臓（ｎ＝５、群当たり）を免疫処置から２８日後に採取し、５ｍＬのＨＢＳＳを含有する１５ｍＬコニカルチューブに添加した。脾臓を、７０μＭ細胞ストレーナーを通して押し出し、それをＡＣＫ溶解バッファーと一緒にインキュベートした後、ＨＢＳＳで洗浄し、完全腫瘍培地（ＣＴＭ）に５×１０６細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁することによって、脾細胞を調製した。捕捉抗体溶液をプレートから除去し、次に、プレートをＰＢＳで５～６回洗浄した。続いて、プレートをＣＴＭで９０分間遮断した。ブロッキング溶液を廃棄し、５０μＬのＣＴＭで全タンパク質を覆う０．１μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓペプチドをウェルに添加した。５０μＬの脾細胞をプレートに添加し（２．５×１０５細胞／ウェル）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴ Ｓｅｔ説明書に従って、スポットを免疫染色し、ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）分析装置（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＣＴＬ）を用いて計数した。結果は、１０６脾細胞当たりのＩＦＮ－γ分泌細胞の数として表示した。
ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴマウスＩＦＮ－γセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を細胞性免疫応答の分析に使用した。アッセイを実施する２４時間前に、ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴプレートを精製済抗マウスＩＦＮ－γ抗体でコーティングした。マウスの脾臓（ｎ＝５、群当たり）を免疫処置から２８日後に採取し、５ｍＬのＨＢＳＳを含有する１５ｍＬコニカルチューブに添加した。脾臓を、７０μＭ細胞ストレーナーを通して押し出し、それをＡＣＫ溶解バッファーと一緒にインキュベートした後、ＨＢＳＳで洗浄し、完全腫瘍培地（ＣＴＭ）に５×１０６細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁することによって、脾細胞を調製した。捕捉抗体溶液をプレートから除去し、次に、プレートをＰＢＳで５～６回洗浄した。続いて、プレートをＣＴＭで９０分間遮断した。ブロッキング溶液を廃棄し、５０μＬのＣＴＭで全タンパク質を覆う０．１μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓペプチドをウェルに添加した。５０μＬの脾細胞をプレートに添加し（２．５×１０５細胞／ウェル）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴ Ｓｅｔ説明書に従って、スポットを免疫染色し、ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）分析装置（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＣＴＬ）を用いて計数した。結果は、１０６脾細胞当たりのＩＦＮ－γ分泌細胞の数として表示した。
【0135】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２によるマウスの免疫処置及び感染
免疫処置。この試験では、６～８週齢の雌マウス（Ｅｎｖｉｇｏ）を使用した。マウスを、ｔｅｒｔ－アミルアルコール（Ａｖｅｒｔｉｎ）中２５０ｕＬの２，２，２－トリブロモエタノールの腹腔内注射によって麻酔し、５０ｕＬのＰＢＳ又は１０４、１０５、１０６のＰＦＵ ＣＶＸＧＡ１を鼻腔内接種した。免疫から２８日後に、マウスを安楽死させ、心臓胸部採血により血清を採取し、脾臓を摘出した。マウスは、ＨＥＰＡフィルター付きアイソレータにおいて強化バイオセーフティレベル２実験室に収容され、免疫処置を受けた。実験は全て、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコルに従って実施した。
免疫処置。この試験では、６～８週齢の雌マウス（Ｅｎｖｉｇｏ）を使用した。マウスを、ｔｅｒｔ－アミルアルコール（Ａｖｅｒｔｉｎ）中２５０ｕＬの２，２，２－トリブロモエタノールの腹腔内注射によって麻酔し、５０ｕＬのＰＢＳ又は１０４、１０５、１０６のＰＦＵ ＣＶＸＧＡ１を鼻腔内接種した。免疫から２８日後に、マウスを安楽死させ、心臓胸部採血により血清を採取し、脾臓を摘出した。マウスは、ＨＥＰＡフィルター付きアイソレータにおいて強化バイオセーフティレベル２実験室に収容され、免疫処置を受けた。実験は全て、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコルに従って実施した。
【0136】
１０６個のＰＦＵ紫外線不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、アルムアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号７７１６１）と２００μｌの容量で１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合し、マウスに筋肉内に送達した。Ａｄ５－ＡＣＥ２によるマウスの感作。Ａｄ５－ｈＡＣＥ２ベクターについては、以前記載されている（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７９：１４６１４－１４６２１，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７９．２３．１４６１４－１４６２１．２００５；及びＳｕｎ ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０６．０１０）。ウイルスベクター構築は、ＲＡＰＡＤ（商標）システムＶＶＣを用いて実施する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ；７：１０３４－１０３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０１１９７）。マウスをケタミン／キシラジン（８７．５ｍｇ／ｋｇケタミン／１２．５ｍｇ／ｋｇキシラジン）で麻酔し、７５μｌのＤＭＥＭ中２．５×１０８ＰＦＵのＡｄ５－ｈＡＣＥ２で鼻腔内に形質導入した。
【0137】
マウスの感染。マウスをケタミン／キシラジンで軽度に麻酔してから、総量５０μｌのＤＭＥＭ中表示量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内接種した。動物の体重と健康状態を毎日モニターした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用した実験は全て、バイオセーフティレベル３（ＢＳＬ３）実験室で実施した。形質導入の５日後、ケタミン／キシラジン（８７．５ｍｇ／ｋｇのケタミン／１２．５ｍｇ／ｋｇのキシラジン）でマウスを麻酔し、５０μｌのＤＭＥＭ中１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（分離株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ ＢＥＩ＃ＮＲ－５２２８１）で鼻腔内感染させた。マウスを毎日モニターし、計量した。
【0138】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２によるフェレットの免疫処置及び感染
生後８～９か月の雄及び雌（７００～２０００ｇ）フェレット１２匹をＴｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍから受け取り、ＵＧＡ動物実験室において順応させた。到着前に、フェレットは殺菌及び体臭腺の除去を受けた。少なくとも７日間の順応期間の後、肩甲骨の間に熱トランスポンダーを皮下配置するためにフェレットを麻酔した。埋込型のプログラム可能な温度トランスポンダー（Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を移植部位の組織にしっかりと固定し、華氏９０～１１０度の範囲の温度の読取りを可能にする。同時に、ベースライン血清検査のために全血を採取し、ウイルス排出の分析のために糞便スワブを実施した。
生後８～９か月の雄及び雌（７００～２０００ｇ）フェレット１２匹をＴｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍから受け取り、ＵＧＡ動物実験室において順応させた。到着前に、フェレットは殺菌及び体臭腺の除去を受けた。少なくとも７日間の順応期間の後、肩甲骨の間に熱トランスポンダーを皮下配置するためにフェレットを麻酔した。埋込型のプログラム可能な温度トランスポンダー（Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を移植部位の組織にしっかりと固定し、華氏９０～１１０度の範囲の温度の読取りを可能にする。同時に、ベースライン血清検査のために全血を採取し、ウイルス排出の分析のために糞便スワブを実施した。
【0139】
全ての実験手順は、ジョージア大学バイオサイエンス動物実験室（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で実施した。動物はペアで飼育し、自由給餌及び給水とした。実験は全て、ジョージア大学獣医学部（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＩＡＣＵＣにより承認された。鼻洗浄及び採血を含む全ての手順は、短時間イソフルランガス麻酔下で行われた。
【0140】
感染性Ｓａｒｓ－ＣｏＶ－２チャレンジのために、動物をジョージア大学動物衛生リサーチセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）動物バイオセーフティレベル－３（ＡＢＳＬ３）実験室に移した。実験は全て、ジョージア大学獣医学部（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＩＡＣＵＣにより承認された。
【0141】
６匹ずつのフェレットの群に、鼻孔当たり５００ｕＬとして分配される１．０ｍＬ滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５×１０６ＰＦＵのＣＶＸＧＡ１を鼻腔内（ＩＮ）ワクチン接種した。ワクチン接種後、鼻汁、くしゃみ、下痢、無気力、呼吸数及び労力（うっ血）の増加、チアノーゼ、神経学的変化、及び外部刺激に対する反応などの臨床徴候について、動物を毎日モニターした。体温は、埋め込まれた温度プローブを使用して追跡した。免疫処置から３、７、１４、２１、及び２８日後（ｄｐｉ）に鼻洗浄液及び糞便スワブを収集して、ワクチン排出を評価した。免疫処置後毎週全血を採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、後の分析のために凍結保存した。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２による感染チャレンジのために、４×１０５ＰＦＵをＩＮ経路で送達した。ここでも、身体観察、計量、検温を毎日実施した。チャレンジ後４日目に、６匹ずつのサブセットを人道的に安楽死させて剖検し、残りの動物（ｎ＝６）はチャレンジ後７日目に人道的に安楽死させた。剖検は全て、委員会認定の獣医学病理学者の指導の下で実施した。病理及びウイルス負荷について組織サンプル（気管及び肺）を収集した。血清及びＰＢＭＣ単離のためにターミナル採血を行った。
【0142】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２によるネコの免疫処置及び感染
１２匹の亜成体（生後７～９か月）、インタクトなペット用雄ショートヘア（ＤＳＨ）ネコをＭＢＲ Ｗａｖｅｒｙ ＬＬＣから受け取った。順応期間の後、委員会認定獣医によって雄ネコを外科的に去勢した。滅菌済の雄は全て、委員会認定の実験動物獣医によって決定される完全な外科的回復を待つ間、単独で収容された。免疫処置の前に、肩甲骨の間に埋込型のプログラム可能な温度トランスポンダー、ＩＰＴＴ ３００（Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を皮下配置するために、注射麻酔薬を用いてネコを麻酔した。同時に、全血及び糞便サンプルを収集した。個々の血清をＥＬＩＳＡによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質反応性ＩｇＧ抗体の存在についてスクリーニングした。ネコ腸内コロナウイルスの存在についてｑＲＴ－ＰＣＲにより糞便スワブを評価した。
１２匹の亜成体（生後７～９か月）、インタクトなペット用雄ショートヘア（ＤＳＨ）ネコをＭＢＲ Ｗａｖｅｒｙ ＬＬＣから受け取った。順応期間の後、委員会認定獣医によって雄ネコを外科的に去勢した。滅菌済の雄は全て、委員会認定の実験動物獣医によって決定される完全な外科的回復を待つ間、単独で収容された。免疫処置の前に、肩甲骨の間に埋込型のプログラム可能な温度トランスポンダー、ＩＰＴＴ ３００（Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を皮下配置するために、注射麻酔薬を用いてネコを麻酔した。同時に、全血及び糞便サンプルを収集した。個々の血清をＥＬＩＳＡによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質反応性ＩｇＧ抗体の存在についてスクリーニングした。ネコ腸内コロナウイルスの存在についてｑＲＴ－ＰＣＲにより糞便スワブを評価した。
【0143】
感染チャレンジの前に行われたネコの手順は全て、ジョージア大学ライフサイエンス動物実験室（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で実施した。性別及び気質に基づいてネコを群又はペア別に収容した。ネコには市販のドライフードを給餌し、自由給水とした。
【0144】
ネコの群（ｎ＝４／群）は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させた１×１０６ＰＦＵのＣＶＸＧＡ１を鼻腔内（ＩＮ）又は皮下（ＳＱ）のいずれかでワクチン接種した。鼻腔内ワクチン接種は、鼻孔当たり２５０ｕＬとして配分される０．５ｍＬの量で完了した。皮下送達は、総量１．０ｍＬを用いて実施した。皮下ワクチン接種した動物は、一次注射の２１日後にブースター接種した。ワクチン接種後、動物は、鼻汁、くしゃみ、下痢、無気力、呼吸数及び労力（うっ血）の増加、チアノーゼ、神経学的変化、及び外部刺激に対する反応などの臨床徴候について毎日モニターした。埋め込まれた温度プローブを用いて、体温を追跡した。ワクチン接種から１、３、７、１４、２１、及び２８日後（ｄｐｖ）に鼻洗浄液及び糞便スワブを収集して、ワクチン排出を評価した。免疫処置後毎週全血を採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、後の分析のために凍結保存した。感染チャレンジのために、１．０ｍＬ容量中４×１０５ＰＦＵの用量でＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２を、ＩＮ経路で送達した。全ての動物（ｎ＝１２）を、チャレンジの１４日後に人道的に安楽死させた。委員会認定獣医病理学者の指導の下、剖検を実施した。組織に加えて、血清及びＰＢＭＣ単離のためにターミナル採血を実施した。
【0145】
組織学及び免疫組織化学
動物を麻酔し、ＰＢＳで経心的に灌流した。肺組織を採取し、固定（１０％中性緩衝ホルマリン）し、一連のアルコール及びキシレン浴により脱水し、パラフィン包埋し、切片化（約４μｍ）し、ヘマトキシリン及びエオジン（ＨＥ）染色で染色した。組織は、盲検的に、且つ再現可能な組織スコアの原則（Ｍｅｙｅｒｈｏｌｚ ａｎｄ Ｂｅｃｋ、２０１８、Ｉｎｖｅｓｔ；９８：８４４－８５５、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１３７４－０１８－００５７－０）に従い、委員会認定病理学者によって検査された。血管周囲好酸球浸潤を以前記載されている通りに評価した（Ｆｕｅｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８９：８１９３－８２０５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００１３３－１５）。簡単に説明すると、細胞浸潤のある血管周囲領域を、盲検的に病理学者がランダムに選択し（ｎ＝２０／肺）、好酸球の数を記録し、各肺の最終スコアについて平均した。単核浸潤について肺をスコアリングし、スコア０は正常パラメータ内の値を表し、１は気管支周囲及び血管周囲領域の小さな凝集体を表し、２は血管周囲空間を満たす血管周囲及び気道凝集体を表し、３は、スコア２に加えて、肺の領域の中隔及び硬化病変への浸潤葉の拡大を表す。肺を顆粒球浸潤についてスコアリングするが、スコアは以下の通りである：０、正常なパラメータ内；１、中隔内に隔離された散在するＰＭＮ；２、１のスコアに加えて、気室中に漏出した孤立性ＰＭＮ；３、スコア２に加えて、血管及び気室各々における微小な凝集体。
動物を麻酔し、ＰＢＳで経心的に灌流した。肺組織を採取し、固定（１０％中性緩衝ホルマリン）し、一連のアルコール及びキシレン浴により脱水し、パラフィン包埋し、切片化（約４μｍ）し、ヘマトキシリン及びエオジン（ＨＥ）染色で染色した。組織は、盲検的に、且つ再現可能な組織スコアの原則（Ｍｅｙｅｒｈｏｌｚ ａｎｄ Ｂｅｃｋ、２０１８、Ｉｎｖｅｓｔ；９８：８４４－８５５、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１３７４－０１８－００５７－０）に従い、委員会認定病理学者によって検査された。血管周囲好酸球浸潤を以前記載されている通りに評価した（Ｆｕｅｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８９：８１９３－８２０５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００１３３－１５）。簡単に説明すると、細胞浸潤のある血管周囲領域を、盲検的に病理学者がランダムに選択し（ｎ＝２０／肺）、好酸球の数を記録し、各肺の最終スコアについて平均した。単核浸潤について肺をスコアリングし、スコア０は正常パラメータ内の値を表し、１は気管支周囲及び血管周囲領域の小さな凝集体を表し、２は血管周囲空間を満たす血管周囲及び気道凝集体を表し、３は、スコア２に加えて、肺の領域の中隔及び硬化病変への浸潤葉の拡大を表す。肺を顆粒球浸潤についてスコアリングするが、スコアは以下の通りである：０、正常なパラメータ内；１、中隔内に隔離された散在するＰＭＮ；２、１のスコアに加えて、気室中に漏出した孤立性ＰＭＮ；３、スコア２に加えて、血管及び気室各々における微小な凝集体。
【0146】
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２－Ｓ中和
以前記載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ＶＳＶ－Ｓ）で偽型化されたＶＳＶ（Ｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ；９：６８０－６８６，ｏｉ：１０．１０８０／２２２２１７５１．２０２０．１７４３７６７）を中和アッセイに使用した。ＶＳＶ－Ｓ粒子をＶｅｒｏ細胞の９６ウェルプレート中のＴＣＩＤ５０により滴定して、中和に最適な粒子数を決定した。それらを、２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地中１％Ｐ／Ｓで希釈した。力価は、Ｐｒｏｍｅｇａによるホタルルシフェラーゼ検出Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて決定した。１：１比の希釈粒子及び滅菌ＰＢＳ（血清なし）から成る各プレートに粒子対照を使用した。バックグラウンドを構成するために、滅菌ＰＢＳと２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地中１％Ｐ／Ｓから成る各プレートに陰性対照も使用した。
以前記載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ＶＳＶ－Ｓ）で偽型化されたＶＳＶ（Ｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ；９：６８０－６８６，ｏｉ：１０．１０８０／２２２２１７５１．２０２０．１７４３７６７）を中和アッセイに使用した。ＶＳＶ－Ｓ粒子をＶｅｒｏ細胞の９６ウェルプレート中のＴＣＩＤ５０により滴定して、中和に最適な粒子数を決定した。それらを、２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地中１％Ｐ／Ｓで希釈した。力価は、Ｐｒｏｍｅｇａによるホタルルシフェラーゼ検出Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて決定した。１：１比の希釈粒子及び滅菌ＰＢＳ（血清なし）から成る各プレートに粒子対照を使用した。バックグラウンドを構成するために、滅菌ＰＢＳと２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地中１％Ｐ／Ｓから成る各プレートに陰性対照も使用した。
【0147】
中和アッセイの前に５６℃で４５分間血清を熱不活性化した。次いでこれを、細胞非含有の９６ウェル未処理プレートにおいて１：５０（ネコ）又は１：１００（フェレット）から出発する１：２希釈を用いて、滅菌ＰＢＳで段階希釈した。回収したヒト血清サンプル（＋ＲＨＳ）を各アッセイの陽性対照として使用し、１：１００から出発して１：２に段階希釈した。サンプル及び対照は４回反復で実施した。
【0148】
５０ｕｌの希釈ＶＳＶ－Ｓ粒子を、５０ｕｌの希釈血清を含む９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、９０～１００％コンフルエントでＶｅｒｏ細胞を含む白色９６ウェルプレートから培地を吸引し、粒子－血清混合物（１００ｕｌ）を細胞に添加した。５％ＣＯ２、３７℃で１８～２４時間プレートをインキュベートした。翌日、室温で１０～２０分間サンプルを平衡させ、５０ｕｌのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加した。プレートは、ＰｒｏｍｅｇａによるＧｌｏＭａｘルミノメーター上でＢｉｏ－Ｇｌｏプロトコルを用いて直ちに読み取った。
【0149】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による中和のために、血清サンプルを中和アッセイの前に５６℃で３０分間熱不活性化した。次に、それらを滅菌ＤＭＥＭで段階希釈し、約２０ ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有する等量のＤＭＥＭと混合した。３７℃で１時間インキュベートした後、アリコートを１２ウェルプレートのＶｅｒｏ Ｅ６細胞に添加し、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。接種材料の除去後、４％ＦＢＳを含む１．２％アガロースでプレートを覆った。５％ＣＯ２、３７℃で２日間さらにインキュベートした後、オーバーレイを除去し、０．１％クリスタルバイオレットでの染色によりプラークを可視化した。
【0150】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２鼻腔排出ｑＰＣＲ
標準曲線の作成。標準曲線に使用したウイルスを増殖させるために、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ－ＷＡ０１／２０２０（ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、ｃａｔ＃ＮＲ５２２８１）継代１に約０．００１のＭＯＩで感染させ、３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートした。感染から４８時間後にウイルスを収集し、１．２％Ａｖｉｃｅｌ＋０．５×ＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳ＋０．５×抗生物質／抗真菌剤のアビセルオーバーレイを有するＶｅｒｏ Ｅ６細胞に対するプラークアッセイにより滴定した。遺伝物質を不活化して保存するために、フェレット及びネコのサンプルについてそれぞれ１．１×１０６ＰＦＵ／ｍＬ又は１．４４×１０７ＰＦＵ／ｍＬの濃度のウイルスを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１：１で混合した。クイックＲＮＡウイルスキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＲＮＡを６００ｕＬから抽出し、５０ｕＬのＴＲＩｚｏｌに溶出した。ＲＮＡを１：１０に段階希釈した。１０ｕＬの各ウイルス希釈液を、１０ｕＬのＴａｑＰａｔｈ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥＵＡ ＣＤＣ ＳＡＲＳ－２キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からの３ｕＬのｎＣｏｖ Ｎ１プライマー／プローブを用いた４０ｕＬのｑＰＣＲ反応に使用した。ｑＰＣＲ反応物は全て、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３０００Ｐを用いて分析した。
標準曲線の作成。標準曲線に使用したウイルスを増殖させるために、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ－ＷＡ０１／２０２０（ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、ｃａｔ＃ＮＲ５２２８１）継代１に約０．００１のＭＯＩで感染させ、３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートした。感染から４８時間後にウイルスを収集し、１．２％Ａｖｉｃｅｌ＋０．５×ＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳ＋０．５×抗生物質／抗真菌剤のアビセルオーバーレイを有するＶｅｒｏ Ｅ６細胞に対するプラークアッセイにより滴定した。遺伝物質を不活化して保存するために、フェレット及びネコのサンプルについてそれぞれ１．１×１０６ＰＦＵ／ｍＬ又は１．４４×１０７ＰＦＵ／ｍＬの濃度のウイルスを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１：１で混合した。クイックＲＮＡウイルスキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＲＮＡを６００ｕＬから抽出し、５０ｕＬのＴＲＩｚｏｌに溶出した。ＲＮＡを１：１０に段階希釈した。１０ｕＬの各ウイルス希釈液を、１０ｕＬのＴａｑＰａｔｈ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥＵＡ ＣＤＣ ＳＡＲＳ－２キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からの３ｕＬのｎＣｏｖ Ｎ１プライマー／プローブを用いた４０ｕＬのｑＰＣＲ反応に使用した。ｑＰＣＲ反応物は全て、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３０００Ｐを用いて分析した。
【0151】
フェレット鼻洗浄液ｑＰＣＲ。５００ｕＬの回収された鼻洗浄サンプルをＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１で混合した。クイックＲＮＡウイルスキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、６００ｕＬからＲＮＡを抽出し、１５ｕＬのＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄに溶出した。２ｎｇの各鼻洗浄液サンプルを、１０ｕＬのＴａｑＰａｔｈ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥＵＡ ＣＤＣ ＳＡＲＳ－２キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からの３ｕＬのｎＣｏｖ Ｎ１プライマー／プローブを用いた４０ｕＬのｑＰＣＲ反応に使用した。ｑＰＣＲ反応当たりのゲノムコピーは、標準曲線を用いて計算した。ｑＰＣＲ反応に用いたＲＮＡの比は、２ｎｇをサンプル当たりの総ＲＮＡ ｎｇ数で割ることによって計算した。各サンプルのゲノムコピーを計算するために、ｑＰＣＲ反応当たりのゲノムコピーに、反応に使用したＲＮＡの比を掛け、記載される希釈量と抽出量を用いて、ｍＬ当たりのゲノムコピーを逆算した。ＣＴ値が３７を超えるサンプルは、ＰＣＲ陰性とみなした。各ｑＰＣＲ実験について、標準曲線を用いて１ＦＦＵ／反応（ｒｘｎ）ＣＴ値カットオフを設定し、ＣＴ値が３７未満であるが、１ＦＦＵ／ｒｘｎカットオフを超えるサンプルには、グラフ作成の目的で０．５のゲノムコピー／ｍＬ値を割り当てた。１ＦＦＵ／ｍＬ及びＰＣＲ陽性のカットオフラインは、それぞれｙ＝１及びｙ＝０．１にプロットした。
【0152】
ネコ鼻洗浄液ｑＰＣＲ
５００ｕＬの回収鼻洗浄液サンプルをＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１で混合した。クイックＲＮＡウイルスキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、６００ｕＬからＲＮＡを抽出し、１５ｕＬのＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄに溶出した。１ｕＬの各鼻洗浄サンプルを、１０ｕＬのＴａｑＰａｔｈ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥＵＡ ＣＤＣ ＳＡＲＳ－２キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からの３ｕＬのｎＣｏｖ Ｎ１プライマー／プローブを用いた４０ｕＬのｑＰＣＲ反応に使用した。
５００ｕＬの回収鼻洗浄液サンプルをＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１で混合した。クイックＲＮＡウイルスキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、６００ｕＬからＲＮＡを抽出し、１５ｕＬのＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄに溶出した。１ｕＬの各鼻洗浄サンプルを、１０ｕＬのＴａｑＰａｔｈ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥＵＡ ＣＤＣ ＳＡＲＳ－２キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からの３ｕＬのｎＣｏｖ Ｎ１プライマー／プローブを用いた４０ｕＬのｑＰＣＲ反応に使用した。
【0153】
ｑＰＣＲ反応当たりのゲノムコピーは、標準曲線を用いて計算した。記載される希釈量と抽出量を用いて、ｍＬ当たりのゲノムコピーを逆算した。ＣＴ値が３７を超えるサンプルは、ＰＣＲ陰性とみなした。各ｑＰＣＲ実験について、標準曲線を用いて１ＦＦＵ／反応（ｒｘｎ）ＣＴ値カットオフを設定し、ＣＴ値が３７未満であるが、１ＦＦＵ／ｒｘｎカットオフを超えるサンプルには、グラフ作成の目的で０．５のゲノムコピー／ｍＬ値を割り当てた。１ＦＦＵ／ｍＬ及びＰＣＲ陽性のカットオフラインは、それぞれｙ＝１及びｙ＝０．１にプロットした。
【0154】
フォーカス形成ユニットアッセイ
感染性ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２の定量化は、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上のフォーカス形成単位（ＦＦＵ）により実施し完了した。簡単に説明すると、９６ウェル細胞培養プレートを３．２×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。コンフルエント単層は、２％ＦＢＳ及び１×抗生物質／抗真菌剤培地を含むＤＭＥＭの培地中で、接種材料の１０倍段階希釈物と一緒にインキュベートした。培養プレートからの増殖培地、５０ｕＬ接種材料を、３７℃、加湿５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。オーバーレイ培地、即ち、培地中０．８％メチルセルロースを１５０ｕＬ／ウェルで適用し、プレートを３７℃、加湿５％ＣＯ２に２０～２４時間かけて戻した。フォーカス形成ユニット（ＦＦＵ）の比色分析展開のために、メチルセルロースオーバーレイをデカントし、プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄した。固定液（８０％メタノール、２０％アセトン）を１００ｕＬ添加し、室温で少なくとも１０分間インキュベートした後、固定液に浸し、ＢＳＬ３実験室から取り出した。一次抗体（ＨＲＰ共役１ＣＯ２、１．４μｇ／ｍｌ）を、７５ｕＬ／ウェルのブロッキングバッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、５％ＮＦＤＭ、５％ＢＳＡ）で１：１０００に希釈し、室温で４５分間インキュベートした。次に、一次溶液をデカントし、プレートを０．１％ＰＢＳ－Ｔで２回洗浄した。追加の洗浄ステップをｄＨ２０、７５ｕＬ／ウェルＴＭＢ現像溶液で完了し、室温で１時間インキュベートした。最終ｄＨ２０洗浄ステップを完了し、プレートを風乾して、手動ＦＦＵ定量用のＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ７ ｍａｃｈｉｎｅで画像を取得した。
感染性ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２の定量化は、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上のフォーカス形成単位（ＦＦＵ）により実施し完了した。簡単に説明すると、９６ウェル細胞培養プレートを３．２×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。コンフルエント単層は、２％ＦＢＳ及び１×抗生物質／抗真菌剤培地を含むＤＭＥＭの培地中で、接種材料の１０倍段階希釈物と一緒にインキュベートした。培養プレートからの増殖培地、５０ｕＬ接種材料を、３７℃、加湿５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。オーバーレイ培地、即ち、培地中０．８％メチルセルロースを１５０ｕＬ／ウェルで適用し、プレートを３７℃、加湿５％ＣＯ２に２０～２４時間かけて戻した。フォーカス形成ユニット（ＦＦＵ）の比色分析展開のために、メチルセルロースオーバーレイをデカントし、プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄した。固定液（８０％メタノール、２０％アセトン）を１００ｕＬ添加し、室温で少なくとも１０分間インキュベートした後、固定液に浸し、ＢＳＬ３実験室から取り出した。一次抗体（ＨＲＰ共役１ＣＯ２、１．４μｇ／ｍｌ）を、７５ｕＬ／ウェルのブロッキングバッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、５％ＮＦＤＭ、５％ＢＳＡ）で１：１０００に希釈し、室温で４５分間インキュベートした。次に、一次溶液をデカントし、プレートを０．１％ＰＢＳ－Ｔで２回洗浄した。追加の洗浄ステップをｄＨ２０、７５ｕＬ／ウェルＴＭＢ現像溶液で完了し、室温で１時間インキュベートした。最終ｄＨ２０洗浄ステップを完了し、プレートを風乾して、手動ＦＦＵ定量用のＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ７ ｍａｃｈｉｎｅで画像を取得した。
【0155】
実施例３
パラインフルエンザウイルス５ベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンによる単回用量粘膜免疫処置によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対するＫ１８－ｈＡＣＥ２マウス及びフェレットの防御
本実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全長スパイク（その細胞質尾部がＰＩＶ５ Ｆタンパク質の細胞質尾部で置換されている）を含む組換えＰＩＶ５（ＣＶＸＧＡ１）を作製し、マウス及びフェレットのワクチンとしての有効性を検証した。
パラインフルエンザウイルス５ベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンによる単回用量粘膜免疫処置によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対するＫ１８－ｈＡＣＥ２マウス及びフェレットの防御
本実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全長スパイク（その細胞質尾部がＰＩＶ５ Ｆタンパク質の細胞質尾部で置換されている）を含む組換えＰＩＶ５（ＣＶＸＧＡ１）を作製し、マウス及びフェレットのワクチンとしての有効性を検証した。
【0156】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質を発現するＰＩＶ５（ＣＶＸＧＡ１）の作製及び解析
ＰＩＶ５ベースのＭＥＲＳ－ＣｏＶワクチン開発で使用されたのと同様の戦略を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質を発現するＰＩＶ５（ＣＶＸＧＡ１と称する）を作製した（図１８Ａ）。ＲＴ－ＰＣＲシークエンシングによるウイルスゲノム配列でも、免疫蛍光法及びウエスタンブロットを用いたＣＶＸＧＡ１感染細胞におけるＳ糖タンパク質の発現が確認された（図１８Ｂ）。完全長Ｓの他に、切断産物であるＳ１も、ＣＶＸＧＡ１感染細胞に検出され、Ｓがプロセシングされたことを示している（図１８Ｂ）。Ｓタンパク質は、細胞同士の融合及びウイルスと細胞の融合を媒介して、ウイルスの侵入を促進し、Ｓによる免疫が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御免疫を生成する（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，（２０２０））。Ｓの天然（融合前を含む）立体配座は、最適な防御のための望ましい免疫を誘導すると考えられている（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，（２０２０））。ＰＩＶ５ベクターにより発現するＳタンパク質が機能性であるかどうかを調べるために、ＡＣＥ２受容体を発現するＶｅｒｏ細胞に、ＣＶＸＧＡ１を感染させた。合胞体形成（細胞同士の融合）は、ＣＶＸＧＡ１感染細胞にしか観察されず、Ｓタンパク質の機能性発現を示している（図１８Ｃ）。
ＰＩＶ５ベースのＭＥＲＳ－ＣｏＶワクチン開発で使用されたのと同様の戦略を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質を発現するＰＩＶ５（ＣＶＸＧＡ１と称する）を作製した（図１８Ａ）。ＲＴ－ＰＣＲシークエンシングによるウイルスゲノム配列でも、免疫蛍光法及びウエスタンブロットを用いたＣＶＸＧＡ１感染細胞におけるＳ糖タンパク質の発現が確認された（図１８Ｂ）。完全長Ｓの他に、切断産物であるＳ１も、ＣＶＸＧＡ１感染細胞に検出され、Ｓがプロセシングされたことを示している（図１８Ｂ）。Ｓタンパク質は、細胞同士の融合及びウイルスと細胞の融合を媒介して、ウイルスの侵入を促進し、Ｓによる免疫が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御免疫を生成する（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，（２０２０））。Ｓの天然（融合前を含む）立体配座は、最適な防御のための望ましい免疫を誘導すると考えられている（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，（２０２０））。ＰＩＶ５ベクターにより発現するＳタンパク質が機能性であるかどうかを調べるために、ＡＣＥ２受容体を発現するＶｅｒｏ細胞に、ＣＶＸＧＡ１を感染させた。合胞体形成（細胞同士の融合）は、ＣＶＸＧＡ１感染細胞にしか観察されず、Ｓタンパク質の機能性発現を示している（図１８Ｃ）。
【0157】
ＣＶＸＧＡ１は、マウスにおいて体液性及び細胞性免疫応答を生成した
ＣＶＸＧＡ１抗原性を検証するために、マウスを、様々なＣＶＸＧＡ１接種材料で鼻腔内免疫した。抗Ｓ抗体の用量依存的な増加が、単回鼻腔内投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスに検出された（図１８Ｄ）。同様に、Ｓの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を認識する抗体が、ＣＶＸＧＡ１で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて用量依存的に検出された（図１８Ｅ）。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体が、用量依存的に免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスに検出された（図２７）。ＣＶＸＧＡ１の６×１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）という低い用量での単回鼻腔内（ＩＮ）免疫後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、有意な抗体生成及び細胞応答が観察された（図３３）。これらの結果は、ＣＶＸＧＡ１による単回鼻腔内用量免疫処置が、マウスにおいて頑健な免疫応答を生み出したことを示している。
ＣＶＸＧＡ１抗原性を検証するために、マウスを、様々なＣＶＸＧＡ１接種材料で鼻腔内免疫した。抗Ｓ抗体の用量依存的な増加が、単回鼻腔内投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスに検出された（図１８Ｄ）。同様に、Ｓの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を認識する抗体が、ＣＶＸＧＡ１で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて用量依存的に検出された（図１８Ｅ）。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体が、用量依存的に免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスに検出された（図２７）。ＣＶＸＧＡ１の６×１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）という低い用量での単回鼻腔内（ＩＮ）免疫後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、有意な抗体生成及び細胞応答が観察された（図３３）。これらの結果は、ＣＶＸＧＡ１による単回鼻腔内用量免疫処置が、マウスにおいて頑健な免疫応答を生み出したことを示している。
【0158】
ＣＶＸＧＡ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２致死的チャレンジに対してヒトＡＣＥ２受容体を有するマウスを防御した
ＣＶＸＧＡ１の有効性を判断するために、次の２つの相補的な動物モデルを使用した：トランスジェニックマウスを用いる重篤な疾患モデルと、フェレットを用いる上気道感染症モデル。マウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の機能性ＡＣＥ２受容体を欠失しているため、感染に対して抵抗性である。非常にストリンジェントなモデルであるヒトＡＣＥ２（ｈＡＣＥ２）におけるワクチン有効性を調べるために、トランスジェニックマウスを使用した。本来、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染を研究するために開発されたサイトケラチン１８プロモーター（Ｋ１８）の制御下でｈＡＣＥ２を発現するマウス（ＭｃＣｒａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１、８１３－８２１（２００７））は、近年、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答して重度の肺疾患を発症することが実証された（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８２、５０－５８ ｅ５８（２０２０）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，（２０２０））。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスに１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種すると、１００％の死亡率、びまん性肺胞損傷の兆候を伴う肺疾患、及びＣＮＳへの多様な拡散が起こる。致死量、５０％（ＬＤ５０）は、１０４ＰＦＵであると推定される（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８２，５０－５８ ｅ５８（２０２０）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，（２０２０））。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスを、単回用量のＣＶＸＧＡ１（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内免疫し、その４週間後に４×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジした。別の群のＫ１８－ＡＣＥ２マウスを、Ｖ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で筋肉内免疫処置し、その２週間後に追加免疫した。ワクチン未接種マウスは、筋肉内ＤＭＥＭを受けた。第２の対照群は、単回用量のＰＩＶ５ベクター（１０６ＰＦＵ）を鼻腔内に免疫した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに応答して、ＤＭＥＭ対照群は、チャレンジから７日後（ｄｐｃ）までに体重が減少し、感染で衰弱した（図２８Ａ、２８Ｂ）。ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＰＩＶ５で免疫処置されたマウスは、ＤＭＥＭ群と同じくらい体重が減少した。全てのＰＩＶ５免疫マウスは７ｄｐｃまでに衰弱し、６匹のＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫マウスのうち４匹が死亡した（図２８Ａ、２８Ｂ）。ＣＶＸＧＡ１免疫マウスは、体重の減少がなく、全て生存した（図２８Ａ、２８Ｂ）。
ＣＶＸＧＡ１の有効性を判断するために、次の２つの相補的な動物モデルを使用した：トランスジェニックマウスを用いる重篤な疾患モデルと、フェレットを用いる上気道感染症モデル。マウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の機能性ＡＣＥ２受容体を欠失しているため、感染に対して抵抗性である。非常にストリンジェントなモデルであるヒトＡＣＥ２（ｈＡＣＥ２）におけるワクチン有効性を調べるために、トランスジェニックマウスを使用した。本来、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染を研究するために開発されたサイトケラチン１８プロモーター（Ｋ１８）の制御下でｈＡＣＥ２を発現するマウス（ＭｃＣｒａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１、８１３－８２１（２００７））は、近年、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答して重度の肺疾患を発症することが実証された（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８２、５０－５８ ｅ５８（２０２０）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，（２０２０））。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスに１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種すると、１００％の死亡率、びまん性肺胞損傷の兆候を伴う肺疾患、及びＣＮＳへの多様な拡散が起こる。致死量、５０％（ＬＤ５０）は、１０４ＰＦＵであると推定される（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８２，５０－５８ ｅ５８（２０２０）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，（２０２０））。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスを、単回用量のＣＶＸＧＡ１（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内免疫し、その４週間後に４×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジした。別の群のＫ１８－ＡＣＥ２マウスを、Ｖ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で筋肉内免疫処置し、その２週間後に追加免疫した。ワクチン未接種マウスは、筋肉内ＤＭＥＭを受けた。第２の対照群は、単回用量のＰＩＶ５ベクター（１０６ＰＦＵ）を鼻腔内に免疫した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに応答して、ＤＭＥＭ対照群は、チャレンジから７日後（ｄｐｃ）までに体重が減少し、感染で衰弱した（図２８Ａ、２８Ｂ）。ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＰＩＶ５で免疫処置されたマウスは、ＤＭＥＭ群と同じくらい体重が減少した。全てのＰＩＶ５免疫マウスは７ｄｐｃまでに衰弱し、６匹のＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫マウスのうち４匹が死亡した（図２８Ａ、２８Ｂ）。ＣＶＸＧＡ１免疫マウスは、体重の減少がなく、全て生存した（図２８Ａ、２８Ｂ）。
【0159】
５ｄｐｃでは、ＤＭＥＭ、ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＰＩＶ５で免疫処置されたマウスの肺組織におけるウイルス力価は類似しており（図２８Ｃ）、３つの群全てが脳感染のエビデンスを示した（図２８Ｄ）。対照的に、ＣＶＸＧＡ１免疫マウスは、肺組織中に検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がなく、ウイルス力価の約５対数減少を示した（図２８Ｃ）。注目すべきことに、ＣＶＸＧＡ１免疫マウス４匹のうち４匹が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後に脳組織中にウイルスが検出されなかった（図２８Ｄ）。
【0160】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの５日後、肺組織中のウイルス抗原（Ｎタンパク質）が局在化した。対照ＤＭＥＭ処置動物は、気道及び肺実質上皮細胞全体に散在する抗原染色を有した（図２９Ａ）。対照的に、ＣＶＸＧＡ１免疫マウスは、Ｎタンパク質陽性細胞の稀有な小さい病巣のみを示し、進行しなかった初期感染部位を示すと推定される（図２９Ａ）。ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＰＩＶ５処置群からの肺組織はいずれも、散在性抗原陽性細胞を示した（図２９Ａ）。
【0161】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した動物の肺組織切片を調べ、血管周囲好酸球浸潤の存在についてスコアリングした。感染後５日目に、好酸球の流入が、ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で免疫処置したマウスで明瞭であり、他の群には存在しなかった（図２９Ｂ、挿入矢印）。血管周囲炎症性細胞浸潤の存在についても、肺組織をスコアリングした。血管周囲肺浸潤は、大部分がリンパ系細胞から成る場合、事前の抗原曝露及び有効なワクチン接種の好ましい兆候となり得る。図２９Ｂに示すように、ＤＭＥＭ対照群と比較して、ＣＶＸＧＡ１免疫マウスは、血管周囲リンパ系細胞浸潤の有意な増加を有していた。
【0162】
間質性疾患の存在は、多くの場合、重症ウイルス性肺炎の特徴である。肺組織を検査し、肺胞中隔浸潤の存在、気室への拡大、及び関連する肺拡張不全及び浮腫によって定義される間質性疾患（Ｈスコア）の存在についてスコアリングした。他の処置群と比較して、ＣＶＸＧＡ１免疫マウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後５日目に間質性疾患のエビデンスが最も少なかった（図２９Ｃ）。好酸球浸潤物、血管周囲浸潤物、及び間質性肺疾患の重症度についての組織学的スコアを図２９Ｄに示す。さらに、高チャレンジ用量（マウス当たり１０６ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対するＣＶＸＧＡ１免疫の有効性を検査し、及びＣＶＸＧＡ１免疫がこの致死的チャレンジからマウスを１００％防御したことを見出した（図３４）。
【0163】
ＣＶＸＧＡ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２感染からフェレットを防御した
フェレットは、広く使用されているヒト呼吸器感染症のモデルであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して感受性が高く、直接接触及びエアロゾルを介してウイルスを他の動物に伝播し得る（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，（２０２０）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０２０）；Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，３４９６（２０２０））。フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１有効性を検証するために、動物をＰＢＳ又はＣＶＸＧＡ１で鼻腔内免疫した（図３０Ａ）。免疫後３日目及び７日目にフェレットの鼻腔内でＣＶＸＧＡ１が複製し、鼻洗浄液中に１０４ＰＦＵ／ｍｌを超えるピーク力価を示し、ＣＶＸＧＡ１は、免疫から１４日後までに排除された（図３５Ａ）。ＣＶＸＧＡ１免疫は、高力価の抗Ｓ ＩｇＧ（図３５Ｂ）、抗ＲＢＤ ＩｇＧ（図３０Ｂ）、及び図３０Ｃの中和抗体によって明らかなように、頑健な抗体応答を生成した。低レベルの抗Ｓ ＩｇＡが鼻洗浄液中に検出された（図３５Ｃ）。鼻腔内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にチャレンジした場合、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットからの鼻洗浄液中にウイルスゲノムＲＮＡは検出されなかった（図３１Ａ）。対照的に、全ての模擬免疫フェレットに、ウイルスＲＮＡが経時的に検出された（図３１Ａ）。ウイルスＲＮＡはまた、模擬免疫フェレットの気管及び肺にも検出されたが、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットの気管及び肺では検出されなかった（図３１Ｂ、Ｃ）。フェレットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を評価するために、実験終了時（７ｄｐｃ）に抗Ｓ抗体レベルを定量化した。ＣＶＸＧＡ１免疫群における抗Ｓ ＩｇＧレベルは、チャレンジ後に増加し（図３５Ｄ）、Ｓ抗原に対する記憶応答及び曝露を示す。これらの結果は、ＣＶＸＧＡ１免疫が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の発症に極めて重要な部位である上気道におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を顕著に低減したことを示している。
フェレットは、広く使用されているヒト呼吸器感染症のモデルであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して感受性が高く、直接接触及びエアロゾルを介してウイルスを他の動物に伝播し得る（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，（２０２０）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０２０）；Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，３４９６（２０２０））。フェレットにおけるＣＶＸＧＡ１有効性を検証するために、動物をＰＢＳ又はＣＶＸＧＡ１で鼻腔内免疫した（図３０Ａ）。免疫後３日目及び７日目にフェレットの鼻腔内でＣＶＸＧＡ１が複製し、鼻洗浄液中に１０４ＰＦＵ／ｍｌを超えるピーク力価を示し、ＣＶＸＧＡ１は、免疫から１４日後までに排除された（図３５Ａ）。ＣＶＸＧＡ１免疫は、高力価の抗Ｓ ＩｇＧ（図３５Ｂ）、抗ＲＢＤ ＩｇＧ（図３０Ｂ）、及び図３０Ｃの中和抗体によって明らかなように、頑健な抗体応答を生成した。低レベルの抗Ｓ ＩｇＡが鼻洗浄液中に検出された（図３５Ｃ）。鼻腔内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にチャレンジした場合、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットからの鼻洗浄液中にウイルスゲノムＲＮＡは検出されなかった（図３１Ａ）。対照的に、全ての模擬免疫フェレットに、ウイルスＲＮＡが経時的に検出された（図３１Ａ）。ウイルスＲＮＡはまた、模擬免疫フェレットの気管及び肺にも検出されたが、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットの気管及び肺では検出されなかった（図３１Ｂ、Ｃ）。フェレットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を評価するために、実験終了時（７ｄｐｃ）に抗Ｓ抗体レベルを定量化した。ＣＶＸＧＡ１免疫群における抗Ｓ ＩｇＧレベルは、チャレンジ後に増加し（図３５Ｄ）、Ｓ抗原に対する記憶応答及び曝露を示す。これらの結果は、ＣＶＸＧＡ１免疫が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の発症に極めて重要な部位である上気道におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を顕著に低減したことを示している。
【0164】
ＣＶＸＧＡ１免疫が感染を阻止できるかどうかを判断するために、以前と同様に単回用量のＣＶＸＧＡ１でフェレットを免疫処置した。対照動物は、ＰＢＳ又は空のＰＩＶ５ウイルスベクターで免疫処置した（図３２Ａ）。ＩＮ免疫の４２日後、フェレットをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジし、１、３、５、７、９、及び１１ｄｐｃに鼻洗浄液を収集した（図３２Ａ）。ナイーブフェレットを、チャレンジフェレットと１ナイーブ：１感染の比で、２ｄｐｃから共収容した（ケージ当たり２匹のフェレット）。動物福祉法により、全てのフェレットをＢＳＬ３実験室内のオープンケージに収容した（図３６）。ＰＢＳ及び空のＰＩＶ５ベクター群における全てのフェレットは、鼻汁中の生存ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出により示される通り、感染し、３ｄｐｃにピークに達した（図３２Ｂ）。感染ＰＢＳ文及び空ＰＩＶ５ベクター群と一緒に共収容されたナイーブフェレットは全て、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染し、共収容から約５日後にピーク力価が検出された。曝露されたナイーブ動物における力価は、直接感染した動物と同様のレベルに達し、１００％伝播と一致した（図３２Ｂ）。前（図３２Ｂ）と同様に、チャレンジ後のＣＶＸＧＡ１免疫フェレットの鼻腔内にウイルスは検出されなかった。ＣＶＸＧＡ１免疫及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジフェレットと共収容されたナイーブフェレットでは、共収容後の最初の５日間はウイルスが検出されず（図３２Ｂ）、ＣＶＸＧＡ１免疫及びチャレンジフェレットとの直接接触は、ナイーブフェレットへのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播を引き起こさなかったことを示唆している。混合の７日後から、ＣＶＸＧＡ１免疫動物と混合されたフェレットは、恐らく隣接するケージ内の感染フェレットを含む環境から感染を獲得した（図３６）。
【0165】
今回の研究は、ＰＩＶ５ベースの粘膜ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが、マウスモデルで致死性疾患を予防し、また、フェレットでは、上気道ウイルスの複製を顕著に低減して、感染を阻害できることを実証した。動物モデルが、ヒトにおける重症ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の全ての特徴を完全に再現するわけではないが、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスは、頑健なウイルス複製を裏付け、用量依存的な重症疾患を発生するが、現在まで、このモデルにおいて伝播は研究されていない（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８２、５０－５８ ｅ５８（２０２０）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，（２０２０））。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおいて、致死量、即ち、５０％（ＬＤ５０）は、１０４ＰＦＵであると推定される（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，（２０２０）；Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１，１３２７－１３３５（２０２０））。ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスのプライムブーストは、致死的チャレンジからマウスの１００％を防御することができなかった。注目すべきは、推定１００ ＬＤ５０を使用した場合、不活化ウイルスで免疫したチャレンジ（１０６ＰＦＵ）マウスが、ＰＢＳ対照群よりも体重を減少したことである（図３４）。ＵＶ不活化ＭＥＲＳ－ＣｏＶワクチンによる以前の観察と同様に、ＵＶ不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による免疫と、それに続く１０６ＰＦＵ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジは、過敏症型反応と一致する好酸球の流入を引き起こした（図３４Ｅ）。致死量以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２接種を受けたＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスは、その後の致死量のチャレンジに耐えて生存したが、５ｄｐｃに、生存マウスの肺組織中にウイルスが検出された（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８２，０－５８ ｅ５８（２０２０））。単回用量のＣＶＸＧＡ１で免疫されたマウスは全て、脳内に検出可能なウイルスがなく、推定１００ ＬＤ５０チャレンジ（１０６ＰＦＵ）に耐えて生存したが、最も重要なことには、マウスの７５％が５ｄｐｃの肺組織にウイルスが検出されず、これは、ＣＶＸＧＡ１の強力な防御効果を実証するものである。
【0166】
ウイルス糖タンパク質の天然の立体配置を抗原として生成することは、防御免疫応答を最大化するために望ましいが、困難となり得る。ウイルスの不活化は、往々にして、抗原立体構造に望ましくない変化を引き起こす。精製されたウイルス糖タンパク質の最適な構造を得るために、変異が導入されることが多い（Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７，１２６０－１２６３（２０２０））。これまでに、ＰＩＶ５は、ＲＳＶ Ｆタンパク質を展示する優れたベクターであることが実証された。Ｆを含む組換えＰＩＶ５への感染後に、Ｆを発現する細胞は、ＲＳＶ感染細胞における天然Ｆタンパク質と同じ立体構造を保持し（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９１，（２０１７））、ＰＩＶ５生存ウイルスベクターが天然ウイルス糖タンパク質を適切に発現できることを実証している。ＣＶＸＧＡ１感染細胞における全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の発現は、合胞体形成を起こし（図１８Ｃ）、天然の融合コンピテントＳタンパク質の展示と一致した。ＰＩＶ５は、Ｆ及びＨＮ媒介性膜融合を介して宿主細胞に侵入する：ＨＮは、細胞表面タンパク質上のシアル酸残基に結合し、Ｆは膜融合を促進する。シアル酸残基は遍在性であるため、ＰＩＶ５は、ほぼ全ての哺乳類細胞に感染することがわかっている。従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の機能性Ｓを発現しても、ＣＶＸＧＡ１は、Ｆ及びＨＮと同様にＳを発現するので、ＣＶＸＧＡ１の細胞指向性は拡大しない（図１８Ａ）。さらに、ＣＶＸＧＡ１によって促進される合胞体形成の加速（ＰＩＶ５は、速度は遅いが、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でも合胞体を生じさせる）は、単層培養で増殖させた細胞に合胞体がより一般的に観察され、典型的に高分化及び分極した初代上皮細胞ではめったに発生しないため、損傷を引き起こす可能性は低い。
【0167】
フェレットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して感受性が高く、直接接触及びエアロゾルを介してウイルスを容易に伝播する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，（２０２０）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０２０）；Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，３４９６（２０２０））。直接接触は、間接（エアロゾル）経路よりも効率的な伝播手段である。公開された研究では、直接接触伝播を試験するために、１匹の感染したフェレットが１匹又は２匹のナイーブ動物と共収容された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，（２０２０）；Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，３４９６（２０２０））。頑健な伝播モデルでワクチンを試験するために、１匹のナイーブフェレットを１匹の感染フェレットと共収容した（図３２Ａ及び図３６）。単回用量のＣＶＸＧＡ１免疫は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から完全に防御した：免疫動物の鼻腔にウイルスＲＮＡは検出されなかった（図３１Ａ）。重要なことに、単回用量ＣＶＸＧＡ１の免疫処置は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の直接伝播を阻害した（図３２）。フェレットはオープンケージに収容されていたため、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットと共収容された動物は、おそらく他のケージからの環境感染により、混合から７日と９日後に感染した。ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットと共収容したナイーブフェレットの遅発性感染は、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレット及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジフェレットによる伝播の結果であり、従って、ＣＶＸＧＡ１はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播をただ遅らせた可能性もある。
【0168】
しかし、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットの鼻洗浄液又は肺にウイルスは検出されず（図３７）、これは、共収容されたフェレットのウイルス源が、隣接するオープンケージに収容された感染フェレット由来のものである可能性が高いことを示唆している。チャレンジ後のＣＶＸＧＡ１免疫フェレットにウイルスＲＮＡがないことは、ＣＶＸＧＡ１免疫フェレットと共収容されたフェレットの遅発性感染が、他の感染フェレットに由来することを裏付けている（図３７）。ＣＶＸＧＡ１免疫／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジフェレットと共収容されたナイーブフェレットが、遅い時点で感染する２つ経路が考えられた。１つは、フェレットがオープンケージに収容されていたため、隣接するケージ内の感染フェレットからのエアロゾル伝播を介して感染を獲得したというものである（図３６）。もう１つの可能性は、飼育及び設備からの汚染であった：ＩＡＣＵＣにより義務付けられた手順は、７日毎に動物のケージ交換が必要である。これらのケージ交換中に、共収容されたフェレットが汚染された設備との直接接触を通じて感染を獲得した可能性がある。ＰＢＳ群におけるウイルスＲＮＡレベルと生存ウイルスとの間の切断が観察された（図３２Ｂ及び図３７）：生存ウイルス力価は、３日目にピークに達し、７日目には検出できなかったが、ウイルスＲＮＡは３日目に最初にピークに達し、７日目に高レベルであった。ウイルスＲＮＡのこうしたクリアランスの遅延は、ｑＲＴ－ＰＣＲが残留ウイルスＲＮＡを検出できる方法の違いを反映している可能性がある。鼻腔内ＣＶＸＧＡ１免疫は、マウス及びフェレットにおいて頑健な血清抗体応答を生成した。重要なことに、ＩＮ ＣＶＸＧＡ１免疫はフェレットの呼吸器粘膜ＩｇＡを誘導したが、これは、ＰＩＶ５がインフルエンザウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含む呼吸器感染症のワクチン開発のための強力なベクターであるという以前の報告と一致している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９１，（２０１７）；Ｍｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９１，（２０１７））。粘膜ＩｇＡは、ＲＳＶ Ｆを発現するＰＩＶ５で鼻腔内免疫したサルにおいても検出された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９１，（２０１７））。生存ウイルスベクターとして、ＣＶＸＧＡ１が頑健な細胞性免疫応答を生成すると仮定され、図３３に観察されるように、細胞性免疫応答がマウスに検出された。ケンネルコフワクチンは何十年にもわたって安価且つ安全に製造されており、ＰＩＶ５の製造能力及びワクチン送達システムは十分に確立されている。ＰＩＶ５ベクターベースのワクチンのさらなる開発は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻止し、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックを制御する上で役立ち得る。
【0169】
材料及び方法
ウイルス及び細胞調製物、イムノブロッティング法、Ｓ及びＳのＲＢＤの精製、ＥＬＩＳＡプロトコル並びにフォーカス形成単位アッセイプロトコルは、実施例２と同様である。
ウイルス及び細胞調製物、イムノブロッティング法、Ｓ及びＳのＲＢＤの精製、ＥＬＩＳＡプロトコル並びにフォーカス形成単位アッセイプロトコルは、実施例２と同様である。
【0170】
免疫蛍光
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓタンパク質発現の免疫蛍光局在は、１のＭＯＩでＣＶＸＧＡ１又はＰＩＶ５を感染させた２４ウェルプレートのＭＤＢＫ細胞で実施した。感染後２日目に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次に２％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を０．１％ＰＢＳ－サポニン溶液中で透過処理し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号４０１５０－Ｒ００７）及び抗ＰＩＶ５－Ｖ／Ｐと一緒に１：２００希釈で１時間インキュベートした後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ウサギ（ＫＰＬ、カタログ番号０２－１５－１６）及びＣｙ３標識ヤギ抗マウス（ＫＰＬ、カタログ番号０７２－０１－１８－０６）二次抗体を２滴／ｍｌの４’６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）と共に細胞に添加した。細胞を３０分間インキュベートし、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ共焦点蛍光顕微鏡を用いて検査し、撮影した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓタンパク質発現の免疫蛍光局在は、１のＭＯＩでＣＶＸＧＡ１又はＰＩＶ５を感染させた２４ウェルプレートのＭＤＢＫ細胞で実施した。感染後２日目に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次に２％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を０．１％ＰＢＳ－サポニン溶液中で透過処理し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号４０１５０－Ｒ００７）及び抗ＰＩＶ５－Ｖ／Ｐと一緒に１：２００希釈で１時間インキュベートした後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ウサギ（ＫＰＬ、カタログ番号０２－１５－１６）及びＣｙ３標識ヤギ抗マウス（ＫＰＬ、カタログ番号０７２－０１－１８－０６）二次抗体を２滴／ｍｌの４’６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）と共に細胞に添加した。細胞を３０分間インキュベートし、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ共焦点蛍光顕微鏡を用いて検査し、撮影した。
【0171】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２によるマウスの免疫処置及び感染
これらの試験では、６～８週齢の雌マウス（Ｅｎｖｉｇｏ）又はＫ１８－ｈＡＣＥ２マウス（Ｂ６．Ｃｇ．Ｔｇ（Ｋ１８－ｈＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用した。マウスを、ｔｅｒｔ－アミルアルコール（Ａｖｅｒｔｉｎ）中２５０μｌの２，２，２－トリブロモエタノールの腹腔内注射によって麻酔し、５０μｌのＰＢＳ（又はＤＭＥＭ）又は１０４、１０５、１０６ＰＦＵ ＣＶＸＧＡ１若しくは１０６ＰＦＵ ＰＩＶ５ベクターを鼻腔内接種した。免疫処置から２８日後に、マウスを安楽死させ、心臓胸部採血により血清を採取し、脾臓を摘出した。マウスは、ＨＥＰＡフィルター付きアイソレータにおける強化バイオセーフティレベル２実験室に収容され、免疫処置を受けた。実験は全て、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ）及びアイオワ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコルに従って実施した。
これらの試験では、６～８週齢の雌マウス（Ｅｎｖｉｇｏ）又はＫ１８－ｈＡＣＥ２マウス（Ｂ６．Ｃｇ．Ｔｇ（Ｋ１８－ｈＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用した。マウスを、ｔｅｒｔ－アミルアルコール（Ａｖｅｒｔｉｎ）中２５０μｌの２，２，２－トリブロモエタノールの腹腔内注射によって麻酔し、５０μｌのＰＢＳ（又はＤＭＥＭ）又は１０４、１０５、１０６ＰＦＵ ＣＶＸＧＡ１若しくは１０６ＰＦＵ ＰＩＶ５ベクターを鼻腔内接種した。免疫処置から２８日後に、マウスを安楽死させ、心臓胸部採血により血清を採取し、脾臓を摘出した。マウスは、ＨＥＰＡフィルター付きアイソレータにおける強化バイオセーフティレベル２実験室に収容され、免疫処置を受けた。実験は全て、ジョージア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ）及びアイオワ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコルに従って実施した。
【0172】
１０６個のＰＦＵ紫外線不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、アルムアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号７７１６１）と２００μｌの容量で１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合し、マウスに筋肉内に送達した。
【0173】
マウスの感染。マウスをケタミン／キシラジンで軽度に麻酔し、表示量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を５０μｌ総容量のＤＭＥＭで鼻腔内接種した。動物の体重と健康状態を毎日モニターした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用した実験は全て、バイオセーフティレベル３（ＢＳＬ３）実験室で実施した。
【0174】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるフェレットの免疫処置及び感染
生後８～９か月の雄及び雌（７００～２０００ｇ）フェレット１２匹をＴｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍから受け取り、ＵＧＡ動物施設において順応させた。到着前に、フェレットは殺菌及び体臭腺の除去を受けた。少なくとも７日間の順応期間の後、肩甲骨の間に熱トランスポンダーを皮下配置するためにフェレットを麻酔した。埋込型のプログラム可能な温度トランスポンダー（Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を移植部位の組織にしっかりと固定し、華氏９０～１１０度の範囲の温度の読取りを可能にする。同時に、ベースライン血清検査のために全血を採取し、ウイルス排出の分析のために糞便スワブを実施した。
生後８～９か月の雄及び雌（７００～２０００ｇ）フェレット１２匹をＴｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍから受け取り、ＵＧＡ動物施設において順応させた。到着前に、フェレットは殺菌及び体臭腺の除去を受けた。少なくとも７日間の順応期間の後、肩甲骨の間に熱トランスポンダーを皮下配置するためにフェレットを麻酔した。埋込型のプログラム可能な温度トランスポンダー（Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を移植部位の組織にしっかりと固定し、華氏９０～１１０度の範囲の温度の読取りを可能にする。同時に、ベースライン血清検査のために全血を採取し、ウイルス排出の分析のために糞便スワブを実施した。
【0175】
前チャレンジ処置は、ジョージア大学バイオサイエンス動物施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で実施した。動物はペアで収容し、自由給餌及び給水とした。ワクチン接種の後、鼻腔洗浄及び採血を含む手順は、ＩＭ送達されるケタミン／キシラジン（１５～２０ｍｇ／ｋｇ／１～２ｍｇ／ｋｇキシラジン）を用いて麻酔した動物に対して実施した。臨床徴候についてフェレットを毎日モニターした。少なくとも鎮静状態での各処置の間に、体重及び体温を記録した。
【0176】
フェレットのウイルスチャレンジ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジのために、動物をジョージア大学動物衛生リサーチセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）動物バイオセーフティレベル－３（ＡＢＳＬ３）実験室に移した。ウイルスチャレンジ後に行われた処置は、短期間のイソフルランガス麻酔下で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジのために、動物をジョージア大学動物衛生リサーチセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）動物バイオセーフティレベル－３（ＡＢＳＬ３）実験室に移した。ウイルスチャレンジ後に行われた処置は、短期間のイソフルランガス麻酔下で実施した。
【0177】
６匹ずつのフェレットの群に、鼻孔当たり５００μＬとして分配される１．０ｍｌ滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１×１０６ＰＦＵ ＣＶＸＧＡ１を鼻腔内（ＩＮ）ワクチン接種した。ワクチン接種後、鼻汁、くしゃみ、下痢、無気力、呼吸数及び労力（うっ血）の増加、チアノーゼ、神経学的変化、及び外部刺激に対する反応の変化などの臨床徴候について、動物を毎日モニターした。体温は、埋め込まれた温度プローブを使用して追跡した。免疫処置から３、７、１４、２１、及び２８日後（ｄｐｉ）に鼻洗浄液及び糞便スワブを収集して、ワクチン排出を評価した。免疫処置後毎週全血を採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、後の分析のために凍結保存した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染チャレンジのために、１×１０６ＰＦＵをＩＮ経路で送達した。ここでも、身体観察、計量、及び検温を毎日実施した。チャレンジ後４日目に、６匹ずつのサブセットを人道的に安楽死させて剖検し、残りの動物（ｎ＝６）はチャレンジ後７日目に人道的に安楽死させた。全ての剖検は、委員会認定の獣医学病理学者の指導の下で実施した。病理及びウイルス負荷のために組織サンプル（気管及び肺）を収集した。血清及びＰＢＭＣ単離のためにターミナル採血を行った。伝播試験のために、チャレンジから２日後（ｄｐｃ）に、２匹のチャレンジフェレットを１匹のナイーブフェレットと混合した。
【0178】
フェレットの共収容
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの２日後、ナイーブフェレットと１匹のチャレンジフェレットをペアにした。２回目のチャレンジを受けたフェレットは、チャレンジの４日後の剖検まで隔離ケージに移した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの２日後、ナイーブフェレットと１匹のチャレンジフェレットをペアにした。２回目のチャレンジを受けたフェレットは、チャレンジの４日後の剖検まで隔離ケージに移した。
【0179】
全ての実験は、ジョージア大学獣医学部（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＩＡＣＵＣによって承認された。
【0180】
組織学及び免疫組織化学
マウスを麻酔し、ＰＢＳで経心的に灌流した。肺組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、一連のアルコール浴及びキシレン浴で脱水し、パラフィン包埋し、約４μｍに切断し、ヘマトキシリン及びエオジン（ＨＥ）染色で染色した。組織は、盲検的に、且つ再現可能な組織スコアの原則（Ｍｅｙｅｒｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ９８，８４４－８５５（２０１８））に従い、委員会認定病理学者によって検査された。血管周囲好酸球浸潤を以前記載されている通りに評価した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ｍＢｉｏ １１，（２０２０））。簡単に説明すると、細胞浸潤のある血管周囲領域を、盲検的にランダムに選択し（ｎ＝２０／肺）、好酸球の数を記録し、各肺の最終スコアについて平均した。血管周囲リンパ系凝集体を順位スコアリングした：０－なし、１－わずかな孤立細胞、２－軽度から中度の凝集体、又は３－隣接する実質の圧迫を伴う周辺血管周囲浸潤を形成する頑健な凝集体。間質性疾患は、修正されたＨスコアを用いて、順位スコアリングした：０－なし、１－中隔にわずかに散在する細胞、２－中度の中隔内の浸潤及び内腔に広がる浸潤、又は３－中隔及び内腔内に中度から重度の浸潤があり、関連する硬変／無気肺及び／又は浮腫を伴う。これら階層の各々について、罹患した肺の％を記録した。各肺の最終的な修正Ｈスコアは、罹患％×各階層スコアを合計し、１００で割って０～３のスコアを取得することにより算出した。
マウスを麻酔し、ＰＢＳで経心的に灌流した。肺組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、一連のアルコール浴及びキシレン浴で脱水し、パラフィン包埋し、約４μｍに切断し、ヘマトキシリン及びエオジン（ＨＥ）染色で染色した。組織は、盲検的に、且つ再現可能な組織スコアの原則（Ｍｅｙｅｒｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ９８，８４４－８５５（２０１８））に従い、委員会認定病理学者によって検査された。血管周囲好酸球浸潤を以前記載されている通りに評価した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ｍＢｉｏ １１，（２０２０））。簡単に説明すると、細胞浸潤のある血管周囲領域を、盲検的にランダムに選択し（ｎ＝２０／肺）、好酸球の数を記録し、各肺の最終スコアについて平均した。血管周囲リンパ系凝集体を順位スコアリングした：０－なし、１－わずかな孤立細胞、２－軽度から中度の凝集体、又は３－隣接する実質の圧迫を伴う周辺血管周囲浸潤を形成する頑健な凝集体。間質性疾患は、修正されたＨスコアを用いて、順位スコアリングした：０－なし、１－中隔にわずかに散在する細胞、２－中度の中隔内の浸潤及び内腔に広がる浸潤、又は３－中隔及び内腔内に中度から重度の浸潤があり、関連する硬変／無気肺及び／又は浮腫を伴う。これら階層の各々について、罹患した肺の％を記録した。各肺の最終的な修正Ｈスコアは、罹患％×各階層スコアを合計し、１００で割って０～３のスコアを取得することにより算出した。
【0181】
免疫組織化学を、以前記載されているように実施した（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５８９，６０３－６０７（２０２１））。簡単に説明すると、一次抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗体（１：２０，０００希釈×６０分、４０１４３－Ｒ０１９，ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、その後、色原体としてのＲａｂｂｉｔ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｄａｋｏ）及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｄａｋｏ）と、対比染色としてのヘマトキシリンが続いた。免疫染色の順位スコアリングは、分布に基づく方式で実施した：０－なし、１－０～２５％、２－２６～５０％、３－５１～７５％及び４－＞７５％の肺野（組織切片中）。
【0182】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ中和
以前記載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＶＳＶ－Ｓ）で偽型化されたＶＳＶを中和アッセイに使用した（Ｈａｖｒａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｕｓｅｓ １２，（２０２０））。ＶＳＶ－Ｓ粒子をＶｅｒｏ細胞の９６ウェルプレート中のＴＣＩＤ５０により滴定して、中和に最適な粒子数を決定した。それらを、２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地中１％Ｐ／Ｓで希釈した。力価は、Ｐｒｏｍｅｇａによるホタルルシフェラーゼ検出Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて決定した。１：１比の希釈粒子及び滅菌ＰＢＳ（血清なし）から成る各プレート上で粒子対照を使用した。バックグラウンドを構成するために、滅菌ＰＢＳと２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地中１％Ｐ／Ｓから成る各プレート上に陰性対照も使用した。
以前記載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＶＳＶ－Ｓ）で偽型化されたＶＳＶを中和アッセイに使用した（Ｈａｖｒａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｕｓｅｓ １２，（２０２０））。ＶＳＶ－Ｓ粒子をＶｅｒｏ細胞の９６ウェルプレート中のＴＣＩＤ５０により滴定して、中和に最適な粒子数を決定した。それらを、２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地中１％Ｐ／Ｓで希釈した。力価は、Ｐｒｏｍｅｇａによるホタルルシフェラーゼ検出Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて決定した。１：１比の希釈粒子及び滅菌ＰＢＳ（血清なし）から成る各プレート上で粒子対照を使用した。バックグラウンドを構成するために、滅菌ＰＢＳと２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地中１％Ｐ／Ｓから成る各プレート上に陰性対照も使用した。
【0183】
中和アッセイの前に５６℃で４５分間血清を熱不活性化した。次に、細胞を含まない９６ウェル未処理プレートにおいて１：１００（フェレット）から出発する１：２希釈を用いて、滅菌ＰＢＳで段階希釈した。回収したヒト血清サンプル（＋ＲＨＳ）を各アッセイの陽性対照として使用し、１：１００から出発して１：２に段階希釈した。サンプル及び対照は４回反復で実施した。
【0184】
５０μｌの希釈ＶＳＶ－Ｓ粒子を、５０μｌの希釈血清を含む９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、９０～１００％コンフルエントでＶｅｒｏ細胞を含む白色９６ウェルプレートから培地を吸引し、粒子－血清混合物（１００μｌ）を細胞に添加した。５％ＣＯ２、３７℃で１８～２４時間プレートをインキュベートした。翌日、培地を吸引してから、５０ｕｌのＮａｎｏ－Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加した。プレートを攪拌した後、ＰｒｏｍｅｇａによるＧｌｏＭａｘルミノメーター上でＲｅｎｉｌｌａ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅプロトコルを使用して直ちに読み取った。
【0185】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による中和のために、血清サンプルを中和アッセイの前に５６℃で３０分間熱不活性化した。次に、それらを滅菌ＤＭＥＭで段階希釈し、約２０ ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有する等量のＤＭＥＭと混合した。３７℃で１時間インキュベートした後、アリコートを１２ウェルプレートのＶｅｒｏ Ｅ６細胞に添加し、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。接種材料の除去後、４％ＦＢＳを含む１．２％アガロースでプレートを覆った。５％ＣＯ２、３７℃で２日間さらにインキュベートした後、オーバーレイを除去し、０．１％クリスタルバイオレットでの染色によりプラークを可視化した。
【0186】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２鼻腔排出ｑＰＣＲ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡゲノム標準曲線のために、フェレット及びネコ標準についてそれぞれ１．１×１０６ＰＦＵ／ｍｌ又は１．４４×１０７ＰＦＵ／ｍｌを、不活化プロトコルに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈することによって不活化した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて６００μｌの希釈ウイルスからＲＮＡを抽出し、プロトコルに従って５０μｌのＤＮＡ／ＲＮＡ非含有水中に溶出した。ＤｅＮｏｖｉｘ ＤＳ－１１ ＦＸ＋分光光度計／蛍光光度計（ＤｅＮｏｖｉｘ）を用いて、ＲＮＡ純度（Ａ２６０／Ａ２８０）及び濃度を評価した。ＲＮＡを－８０℃で保存した。標準曲線のために、ＲＮＡを１０倍希釈した後、１０μｌの各ＲＮＡ希釈液を、１０μＬのＴａｑＰａｔｈ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥＵＡ ＣＤＣ ＳＡＲＳ－２キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からの３μｌのｎＣｏｖ Ｎ１プライマー／プローブを用いた４０μｌｑＰＣＲ反応に使用した。鼻洗浄サンプルの場合、５００μｌの回収した鼻洗浄液又は直腸スワブサンプルを２×ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた希釈１：１により不活化し、抽出まで－２０℃で保存した。クイックＲＮＡウイルスキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、６００μｌの希釈サンプルからＲＮＡを抽出し、プロトコルに従って１５μｌのＤＮＡ／ＲＮＡ非含有水中に溶出した。ＤｅＮｏｖｉｘ ＤＳ－１１ ＦＸ＋分光光度計／蛍光光度計（ＤｅＮｏｖｉｘ）を用いて、ＲＮＡ純度（Ａ２６０／Ａ２８０）及び濃度を評価した。ＲＮＡを－８０℃で保存した。ｑＰＣＲ反応は全て、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３０００Ｐを用いて分析した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡゲノム標準曲線のために、フェレット及びネコ標準についてそれぞれ１．１×１０６ＰＦＵ／ｍｌ又は１．４４×１０７ＰＦＵ／ｍｌを、不活化プロトコルに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈することによって不活化した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて６００μｌの希釈ウイルスからＲＮＡを抽出し、プロトコルに従って５０μｌのＤＮＡ／ＲＮＡ非含有水中に溶出した。ＤｅＮｏｖｉｘ ＤＳ－１１ ＦＸ＋分光光度計／蛍光光度計（ＤｅＮｏｖｉｘ）を用いて、ＲＮＡ純度（Ａ２６０／Ａ２８０）及び濃度を評価した。ＲＮＡを－８０℃で保存した。標準曲線のために、ＲＮＡを１０倍希釈した後、１０μｌの各ＲＮＡ希釈液を、１０μＬのＴａｑＰａｔｈ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥＵＡ ＣＤＣ ＳＡＲＳ－２キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からの３μｌのｎＣｏｖ Ｎ１プライマー／プローブを用いた４０μｌｑＰＣＲ反応に使用した。鼻洗浄サンプルの場合、５００μｌの回収した鼻洗浄液又は直腸スワブサンプルを２×ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた希釈１：１により不活化し、抽出まで－２０℃で保存した。クイックＲＮＡウイルスキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、６００μｌの希釈サンプルからＲＮＡを抽出し、プロトコルに従って１５μｌのＤＮＡ／ＲＮＡ非含有水中に溶出した。ＤｅＮｏｖｉｘ ＤＳ－１１ ＦＸ＋分光光度計／蛍光光度計（ＤｅＮｏｖｉｘ）を用いて、ＲＮＡ純度（Ａ２６０／Ａ２８０）及び濃度を評価した。ＲＮＡを－８０℃で保存した。ｑＰＣＲ反応は全て、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３０００Ｐを用いて分析した。
【0187】
フェレット鼻洗浄液ｑＰＣＲ。ｑＰＣＲは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３０００Ｐ ｑＰＣＲシステム上でＴａｑＰａｔｈ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。各鼻洗浄反応は、１０μｌのＴａｑＰａｔｈ、３μｌのプライマー／プローブミックス、１７μｌの水、及び１０μｌの２ｎｇに希釈されたサンプルで構成され、最終反応量は１ウェル当たり４０μｌであった。ｎＣｏＶ Ｎ遺伝子特異的プライマーは、以下：
フォワード、５’－ＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴ－３’（配列番号１４）；
リバース、５’－ＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＡＡＴＣＴＧ－３’（配列番号１５）及び
プローブ（５’－（ＦＡＭ）ＡＣＣＣＣＧＣＡＴＴＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＡＣＣ（ＢＨＱ１）－３’（配列番号１６）であり、ＲＵＯ ＣＤＣ ＳＡＲＳ－２キットの一部としてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。温度プロファイルは、２５℃で２分の１サイクル、５０℃で１５分の１サイクル、９５℃で２分の１サイクル、及び９５℃で３秒の５０サイクル、続いて５５℃で３０秒から構成された。各プレートのｑＰＣＲランは、以下：ＲＮＡ標準物質（１０倍希釈、反応当たり１０μｌ、２回反復）、テンプレートなし対照、ポリメラーゼなし対照、及び陽性対照のためのウイルスＲＮＡをスパイクしたサンプルを含んだ。各サンプルのＰＦＵ／ｍｌ濃度は、ＲＮＡ標準曲線に用いたウイルスストックの初期ＰＦＵ／ｍｌ濃度を用いて決定した。ｑＰＣＲ反応に用いたＲＮＡの比は、サンプル当たりの総ＲＮＡ濃度で２ｎｇを割ることにより算出した。標準曲線からのＰＦＵ／ｍｌアウトプットに、反応に用いたＲＮＡの比を掛けた後、記載される希釈量と抽出量を用いて逆算することにより、サンプルの総ＰＦＵ／ｍｌ含量を決定した。ＣＴ値が３７を超えるサンプルは、ＰＣＲ陰性とみなした。各ｑＰＣＲプレートについて、標準曲線から１ＰＦＵ／ＰＣＲ反応（ｒｘｎ）Ｃｔ値を確立し、ｙ＝０として設定し、検出限界を、３７のＣｔ値の標準曲線濃度に設定し、チャレンジ用量を参照のために含めた。１ＰＦＵ／ｒｘｎから検出限界までのサンプルは、非感染性のゲノム物質を有するものを除き全てＰＣＲ陽性と見なされる。
フォワード、５’－ＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴ－３’（配列番号１４）；
リバース、５’－ＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＡＡＴＣＴＧ－３’（配列番号１５）及び
プローブ（５’－（ＦＡＭ）ＡＣＣＣＣＧＣＡＴＴＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＡＣＣ（ＢＨＱ１）－３’（配列番号１６）であり、ＲＵＯ ＣＤＣ ＳＡＲＳ－２キットの一部としてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。温度プロファイルは、２５℃で２分の１サイクル、５０℃で１５分の１サイクル、９５℃で２分の１サイクル、及び９５℃で３秒の５０サイクル、続いて５５℃で３０秒から構成された。各プレートのｑＰＣＲランは、以下：ＲＮＡ標準物質（１０倍希釈、反応当たり１０μｌ、２回反復）、テンプレートなし対照、ポリメラーゼなし対照、及び陽性対照のためのウイルスＲＮＡをスパイクしたサンプルを含んだ。各サンプルのＰＦＵ／ｍｌ濃度は、ＲＮＡ標準曲線に用いたウイルスストックの初期ＰＦＵ／ｍｌ濃度を用いて決定した。ｑＰＣＲ反応に用いたＲＮＡの比は、サンプル当たりの総ＲＮＡ濃度で２ｎｇを割ることにより算出した。標準曲線からのＰＦＵ／ｍｌアウトプットに、反応に用いたＲＮＡの比を掛けた後、記載される希釈量と抽出量を用いて逆算することにより、サンプルの総ＰＦＵ／ｍｌ含量を決定した。ＣＴ値が３７を超えるサンプルは、ＰＣＲ陰性とみなした。各ｑＰＣＲプレートについて、標準曲線から１ＰＦＵ／ＰＣＲ反応（ｒｘｎ）Ｃｔ値を確立し、ｙ＝０として設定し、検出限界を、３７のＣｔ値の標準曲線濃度に設定し、チャレンジ用量を参照のために含めた。１ＰＦＵ／ｒｘｎから検出限界までのサンプルは、非感染性のゲノム物質を有するものを除き全てＰＣＲ陽性と見なされる。
【0188】
フェレット組織ｑＰＣＲ
組織サンプルは、１００ｍｇの組織当たり１ｍｌのＳｈｉｅｌｄ比の１×ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄで不活性化した。振動数３０で１．５分間組織をビーズホモジナイズし（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ、Ｑｉａｇｅｎ）、ホモジネートを抽出まで－２０℃で保存した。抽出工程は、鼻洗浄の場合と同じであった。フェレット組織は、下記の例外と共に、前述したプロトコルを用いてアッセイした。各反応は、ウェル当たり３０μｌの最終反応容量につき、６．６６μｌのＴａｑＰａｔｈ、２μｌのプライマー／プローブミックス、２０．３４μｌの水、及び１μｌのサンプルで構成された。ウイルスＲＮＡの非存在下で、組織ＲＮＡの存在を確実にするためのハウスキーピング遺伝子として、ＨＰＲＴを使用した。
組織サンプルは、１００ｍｇの組織当たり１ｍｌのＳｈｉｅｌｄ比の１×ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄで不活性化した。振動数３０で１．５分間組織をビーズホモジナイズし（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ、Ｑｉａｇｅｎ）、ホモジネートを抽出まで－２０℃で保存した。抽出工程は、鼻洗浄の場合と同じであった。フェレット組織は、下記の例外と共に、前述したプロトコルを用いてアッセイした。各反応は、ウェル当たり３０μｌの最終反応容量につき、６．６６μｌのＴａｑＰａｔｈ、２μｌのプライマー／プローブミックス、２０．３４μｌの水、及び１μｌのサンプルで構成された。ウイルスＲＮＡの非存在下で、組織ＲＮＡの存在を確実にするためのハウスキーピング遺伝子として、ＨＰＲＴを使用した。
【0189】
ＨＰＲＴ遺伝子特異的プライマー（フォワード、５’－ＣＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡ－３’（配列番号１７）；及びリバース、５’－ＡＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴＴＡＴＡＧＣＣＡＡＣＡ－３’（配列番号１８））は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成された。遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ５’－ＮＥＤ－ＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡｇＡＧＧＡＣＣＣＣＴＣＧ－ＭＧＢＮＦＱ－３’（配列番号１９）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより合成された。ＨＥＸ吸収及び発光スペクトルを用いて、ＨＰＲＴ蛍光を読み取った。各サンプルのＰＦＵ／ｍｌ濃度は、ＲＮＡ標準曲線に用いたウイルスストックの初期ＰＦＵ／ｍｌ濃度を用いて決定した。サンプルの総ＰＦＵ／ｍｌ含有量は、記載される希釈及び抽出量を用いたホモジネートのＰＦＵ／ｍｌへの逆算によって決定した。Ｃｔ値が３７を超えるサンプルはＰＣＲ陰性とみなした。各ｑＰＣＲプレートについて、標準曲線から１ＰＦＵ／ｍｌ Ｃｔ値を確立し、ｙ＝０として設定し、検出限界を、３７のＣｔ値の標準曲線濃度に設定した。１ＰＦＵ／ｍｌから検出限界までのサンプルは、非感染性のゲノム物質を有するものを除き全てＰＣＲ陽性と見なされる。グラフ作成の目的で、３７未満であるが、１ＰＦＵ／ｒｘｎカットオフを超えるＣＴ値に、０．５のゲノムコピー／ｍＬ値を割り当てた。
【0190】
実施例４
アミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８の変異
先の実施例で詳述した手順に従って、コロナウイルスＳタンパク質がアミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８に変異をさらに含む構築物を作製した。この構築物の概略図を図３８に示す。例えば、アミノ酸残基Ｗ８８６におけるアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換であってよく、及び／又はアミノ酸残基Ｗ８８８におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のアルギニン（Ｒ）への置換であってよい。
アミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８の変異
先の実施例で詳述した手順に従って、コロナウイルスＳタンパク質がアミノ酸残基Ｗ８８６及び／又はＦ８８８に変異をさらに含む構築物を作製した。この構築物の概略図を図３８に示す。例えば、アミノ酸残基Ｗ８８６におけるアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換であってよく、及び／又はアミノ酸残基Ｗ８８８におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のアルギニン（Ｒ）への置換であってよい。
【0191】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に入手可能な物質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるアノテーション付きコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本出願の開示内容と参照により本明細書に組み込まれるあらゆる文献の開示内容との間に矛盾が存在する場合、本出願の開示が優先されるものとする。上文の詳細な説明及び実施例は、あくまで理解を明確にする目的で付与されている。そこから不必要な制限は理解すべきではない。本発明は、明示及び記載された正確な詳細に限定されるわけではなく、当業者に自明な変形例については、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれることになる。
【0192】
配列表フリーテキスト
配列番号１ ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミドの配列
配列番号２～１９ 人工オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１ ｐＤＡ２７（ＣＶＸ－ＵＧＡ１）プラスミドの配列
配列番号２～１９ 人工オリゴヌクレオチドプライマー
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図9-5】
【図9-6】
【図9-7】
【図9-8】
【図9-9】
【図9-10】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C-18D】
【図18E-18F】
【図19A-19C】
【図19D】
【図20A】
【図20B-20C】
【図20D-20F】
【図21A】
【図21B-21D】
【図21E】
【図22A-22C】
【図23A-23C】
【図24A-24B】
【図25A-25C】
【図25D-25E】
【図26A-26B】
【図26C-26D】
【図27】
【図28】
【図29A-29D】
【図30A-30C】
【図31A-31C】
【図32A-32B】
【図33A-33C】
【図34A-34E】
【図35A-35B】
【図35C-35D】
【図36A-36C】
【図37A】
【図37B】
【図38】
【配列表】
【国際調査報告】