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特表2023-542953改変された脂肪酸エステル分布を有するポリソルベート混合物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-12
(54)【発明の名称】改変された脂肪酸エステル分布を有するポリソルベート混合物
(51)【国際特許分類】
A61K 47/26 20060101AFI20231004BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231004BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231004BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20231004BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20231004BHJP
【ＦＩ】
A61K47/26
A61K45/00
A61K39/395 M
A61K38/00
A61K38/43
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518393
(86)(22)【出願日】2021-09-23
(85)【翻訳文提出日】2023-05-09
(86)【国際出願番号】 US2021051681
(87)【国際公開番号】W WO2022066858
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】63/082,606
(32)【優先日】2020-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/082,611
(32)【優先日】2020-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/168,567
(32)【優先日】2021-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ヤーダブ， サンディープ
(72)【発明者】
【氏名】ドーシ， ニディ
(72)【発明者】
【氏名】ショバ， タマンナ
(72)【発明者】
【氏名】トムリンソン， アンソニー
(72)【発明者】
【氏名】スリバスタバ， アミット
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076DD09F
4C076EE23F
4C076FF16
4C076FF43
4C076FF61
4C084AA01
4C084AA17
4C084DC01
4C084MA05
4C084NA03
4C085AA13
4C085DD11
4C085EE05
(57)【要約】
本開示は、特定の脂肪酸エステル濃度を有するポリソルベート２０組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０組成物は、例えば、安定性を改善するために医薬製剤に使用され得る。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１．０％以下のカプロン酸エステル、２．６％以上６．６％以下のカプリル酸エステル、２．４％以上６．４％以下のカプリン酸エステル、５５．０％以上６０．０％以下のラウリン酸エステル、１４．１％以上１８．１％以下のミリスチン酸エステル、７．０％以上１０．９％以下のパルミチン酸エステル、および２．０％以下のステアリン酸エステルを含む脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物。
【請求項2】
３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．６％以上であって、６．６％以下のカプリル酸エステルを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
２．６％以上、または３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．４％以上であって、６．４％以下のカプリン酸エステルを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
５６％以上、５７％以上、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
１４．１％以上であって、１８％以下、または１７％以下、または１６％以下、または１５％以下のミリスチン酸エステルを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
７％以上であって、１０．９％未満、または１０％以下、または９％以下、または８％以下のパルミチン酸エステルを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
２％以下、または１．５％以下、または１％以下のステアリン酸エステルを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
検出可能なステアリン酸エステルを含まない、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．８％のカプリン酸エステル、約５７．０％のラウリン酸エステル、約１６．２％のミリスチン酸エステル、約９．４％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
１％以下のカプロン酸エステル、３．７％～５．２％のカプリル酸エステル、３．７％～５．２％のカプリン酸エステル、５６．３％～５７．２％のラウリン酸エステル、１５．９％～１６．９％のミリスチン酸エステル、８．８％～９．７％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
１％以下のカプロン酸エステル、３．５％～５．５％のカプリル酸エステル、３．５％～５．５％のカプリン酸エステル、５５％～５８％のラウリン酸エステル、１５％～１７．５％のミリスチン酸エステル、８．５％～１０％のパルミチン酸エステル、および約０．１％以下のステアリン酸エステルを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
５．８％以上９．８％以下のオレイン酸エステル、および２．０％以下のリノール酸エステルをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
薬物および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬製剤であって、前記薬学的に許容され得る賦形剤が、脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物であって、前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、１．０％以下のカプロン酸エステル、２．６％以上６．６％以下のカプリル酸エステル、２．４％以上６．４％以下のカプリン酸エステル、５５．０％以上６０．０％以下のラウリン酸エステル、１４．１％以上１８．１％以下のミリスチン酸エステル、７．０％以上１０．９％以下のパルミチン酸エステル、および２．０％以下のステアリン酸エステルを含む、脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物を含む、医薬製剤。
【請求項14】
前記ポリソルベート２０組成物が、前記製剤の０．０１％～０．１２％（ｗ／ｖ）である、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項15】
前記薬物が、タンパク質、抗体、抗体断片、酵素、またはペプチドである、請求項１３または１４に記載の医薬製剤。
【請求項16】
前記薬物がタンパク質である、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項17】
前記薬物が抗体である、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項18】
前記薬物の濃度が１％～３０％（ｗ／ｖ）である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項19】
前記薬物の濃度が５％～２０％（ｗ／ｖ）である、請求項１８に記載の医薬製剤。
【請求項20】
前記ポリソルベート２０組成物が、前記製剤の０．０１％～０．０８％、０．０３％～０．１％、０．０４％～０．０７％（ｗ／ｖ）である、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項21】
前記ポリソルベート２０組成物が、前記製剤の約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．１１％、または０．１２％（ｗ／ｖ）である、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項22】
前記ポリソルベート２０組成物が、前記製剤の約０．０６％（ｗ／ｖ）である、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項23】
ｐＨが４～８、または５～７．５、または６．５～７．５、または６．８～７．２である、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項24】
前記薬学的に許容され得る賦形剤が、水、アルコール、糖、緩衝剤、界面活性剤、安定剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項25】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．６％以上であって、６．６％以下のカプリル酸エステルを含む、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項26】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、２．６％以上、または３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．４％以上であって、６．４％以下のカプリン酸エステルを含む、請求項１３～２５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項27】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、５６％以上、５７％以上、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む、請求項１３～２６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項28】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、１４．１％以上であって、１８％以下、または１７％以下、または１６％以下、または１５％以下のミリスチン酸エステルを含む、請求項１３～２７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項29】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、７％以上であって、１０．９％未満、または１０％以下、または９％以下、または８％以下のパルミチン酸エステルを含む、請求項１３～２８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項30】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、２％以下、または１．５％以下、または１％以下のステアリン酸エステルを含む、請求項１３～２９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項31】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、請求項１３～３０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項32】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．８％のカプリン酸エステル、約５７．０％のラウリン酸エステル、約１６．２％のミリスチン酸エステル、約９．４％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、請求項１３～３１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項33】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、１％以下のカプロン酸エステル、３．７％～５．２％のカプリル酸エステル、３．７％～５．２％のカプリン酸エステル、５６．３％～５７．２％のラウリン酸エステル、１５．９％～１７．０％のミリスチン酸エステル、８．８％～９．８％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、請求項１３～３１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項34】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、１％以下のカプロン酸エステル、３．５％～５．５％のカプリル酸エステル、３．５％～５．５％のカプリン酸エステル、５５％～５８％のラウリン酸エステル、１５％～１７．５％のミリスチン酸エステル、８．５％～１０％のパルミチン酸エステル、および約０．１％以下のステアリン酸エステルを含む、請求項１３～３１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項35】
前記ポリソルベート２０組成物の前記脂肪酸エステルが、５．８％以上９．８％以下のオレイン酸エステル、および２．０％以下のリノール酸エステルをさらに含む、請求項１３～３４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項36】
同一貯蔵条件に供される標準ポリソルベート２０組成物を含む製剤と比較した場合、脂肪酸エステルの分解に起因する遊離脂肪酸粒子が少ない、請求項１３～３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項37】
高次エステル分解医薬品をさらに含み、遊離脂肪酸粒子の形成が観察される前に、他の点では同一の含有量を有し、同一条件下で貯蔵される標準ポリソルベート２０組成物を含むＨＯＥ分解医薬品におけるよりも最大１０％多くの脂肪酸エステルが遊離脂肪酸に分解され得る、請求項１３～３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項38】
遊離脂肪酸の金属核生成によって生成される遊離脂肪酸粒子の数が、他の点では含有量および貯蔵条件が同一である標準ポリソルベート２０組成物を含む製剤における遊離脂肪酸の金属核生成によって生成される遊離脂肪酸粒子の数よりも少ない、請求項１３～３７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項39】
遊離脂肪酸が、前記脂肪酸エステルの加水分解および／または酸化分解によって生成される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組成物または製剤。
【請求項40】
脂肪酸エステルの分解により、標準ポリソルベート２０組成物を含む組成物または製剤中の遊離脂肪酸粒子形成と比較して、遊離脂肪酸粒子形成が遅延する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組成物または製剤。
【請求項41】
前記遊離脂肪酸粒子が肉眼で見える、請求項４０に記載の組成物または製剤。
【請求項42】
前記遊離脂肪酸粒子が肉眼で見えない、請求項４０に記載の組成物または製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２４日に出願された米国仮出願第６３／０８２，６０６号；２０２０年９月２４日に出願された米国仮出願第６３／０８２，６１１号；および２０２１年３月３１日に出願された米国仮出願第６３／１６８，５６７号の優先権を主張し、これらの内容はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年９月２４日に出願された米国仮出願第６３／０８２，６０６号；２０２０年９月２４日に出願された米国仮出願第６３／０８２，６１１号；および２０２１年３月３１日に出願された米国仮出願第６３／１６８，５６７号の優先権を主張し、これらの内容はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
分野
本開示は、特定の脂肪酸エステル濃度を有するポリソルベート２０組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０組成物は、例えば、安定性を改善するために医薬製剤に使用され得る。
本開示は、特定の脂肪酸エステル濃度を有するポリソルベート２０組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０組成物は、例えば、安定性を改善するために医薬製剤に使用され得る。
【背景技術】
【0003】
背景
ポリソルベート２０（ＰＳ２０）は、例えばタンパク質製剤において界面応力を軽減するために使用される非イオン性界面活性剤である。ＰＳ２０は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）ソルビタンモノラウレートが主成分である不均一混合物である。構造は、４つの分枝ポリオキシエチレン鎖に結合した親水性ソルビタン環を含み、その１つは疎水性ラウリン酸エステル結合を有する。両親媒性特性により、ＰＳ２０が液体－空気界面および液体－固体界面と相互作用することが可能になり、輸送中または投与中に起こり得る撹拌誘導凝集からタンパク質治療薬が遮蔽される。ＰＳ２０の脂肪酸エステル領域は疎水性であり、ソルビタン環またはＰＯＥ鎖よりも水溶液に溶解しにくい。
ポリソルベート２０（ＰＳ２０）は、例えばタンパク質製剤において界面応力を軽減するために使用される非イオン性界面活性剤である。ＰＳ２０は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）ソルビタンモノラウレートが主成分である不均一混合物である。構造は、４つの分枝ポリオキシエチレン鎖に結合した親水性ソルビタン環を含み、その１つは疎水性ラウリン酸エステル結合を有する。両親媒性特性により、ＰＳ２０が液体－空気界面および液体－固体界面と相互作用することが可能になり、輸送中または投与中に起こり得る撹拌誘導凝集からタンパク質治療薬が遮蔽される。ＰＳ２０の脂肪酸エステル領域は疎水性であり、ソルビタン環またはＰＯＥ鎖よりも水溶液に溶解しにくい。
【0004】
ＰＳ２０組成物は、ＰＯＥ鎖長およびコア糖構造に基づいて異なる脂肪酸エステルの分布を有する。さらに、ＰＳ２０の４つのＰＯＥ鎖のそれぞれを脂肪酸でエステル化して、混合物中のＰＳ２０のモノエステルおよび高次エステル（ＨＯＥ）（ジ－、トリ－および最大テトラエステル）バージョンを得ることが可能である。ＰＳ２０の脂肪酸エステル規格は、下記表Ａに示すように、種々の薬局方により設定されている。
【表A】
【0005】
ＰＳ２０は、バイオ製剤中で加水分解し、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の出現を引き起こし得る。酵素（例えば、リパーゼ、エステラーゼなど。）は、エステル結合でＰＳ２０を切断して、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および遊離頭部基またはポリオールを形成すると考えられている。ＦＦＡは、水溶液に難溶性であり、製剤の製造および貯蔵において、より頻繁に、またはより早期に、肉眼で見える粒子または肉眼で見えない粒子の形成をもたらし得、長期のタンパク質安定性および製剤の貯蔵寿命に実質的に影響を及ぼし得る。
【発明の概要】
【0006】
概要
本開示は、特定の脂肪酸エステル分布を有するＰＳ２０製剤を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書のポリソルベート製剤は、遊離脂肪酸をもたらす分解による粒子形成の影響を受けにくい可能性がある。本開示はまた、ポリソルベートを含む製剤に関する。いくつかの実施形態では、これらは、医薬製剤の貯蔵寿命を延ばし、および／または分解された製剤および期限切れの製剤に起因する廃棄物を減らすのに役立ち得る。
本開示は、特定の脂肪酸エステル分布を有するＰＳ２０製剤を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書のポリソルベート製剤は、遊離脂肪酸をもたらす分解による粒子形成の影響を受けにくい可能性がある。本開示はまた、ポリソルベートを含む製剤に関する。いくつかの実施形態では、これらは、医薬製剤の貯蔵寿命を延ばし、および／または分解された製剤および期限切れの製剤に起因する廃棄物を減らすのに役立ち得る。
【0007】
追加の目的および利点は、以下の説明に部分的に記載され、説明から部分的に明らかになるか、または実践によって習得され得る。目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせによって実現および達成されるであろう。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、いずれも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【0008】
本発明は、特に遊離脂肪酸をもたらす分解による粒子形成の影響を受けにくいと思われる特定の脂肪酸エステル分布を有するＰＳ２０の組成物、およびこれらのＰＳ２０組成物を含有する医薬製剤を提供する 本明細書の開示は、例えば、以下のような実施形態を含む。
【0009】
実施形態１は、１％以下のカプロン酸エステル、２．３％超１０％以下のカプリル酸エステル、２．８％超１０％以下のカプリン酸エステル、５２．１％超６０％以下のラウリン酸エステル、１４％以上１８．３％未満のミリスチン酸エステル、７％以上１１．９％未満のパルミチン酸エステル、および６．４％未満のステアリン酸エステルを含む脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物である。
【0010】
実施形態２は、２．５％超、または３．５％超、または４％超、または４．６％以上であって、１０％以下のカプリル酸エステルを含む、実施形態１に記載の組成物である。
【0011】
実施形態３は、３％超、または３．５％超、または４％超、または４．４％以上であって、１０％以下のカプリン酸エステルを含む、実施形態１または２に記載の組成物である。
【0012】
実施形態４は、５３％超、５５％超、５７％超、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む、実施形態１～４のいずれか一つに記載の組成物である。
【0013】
実施形態５は、１４％以上１８％未満、または１７％未満、または１６．５％未満、または１６．１％以下のミリスチン酸エステルを含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の組成物である。
【0014】
実施形態６は、７％以上１１％未満、または１０％未満、または９．５％未満、または８．９％以下のパルミチン酸エステルを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の組成物である。
【0015】
実施形態７は、６％未満、または５％未満、または１％未満のステアリン酸エステルを含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の組成物である。
【0016】
実施形態８は、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態１～７のいずれか１つに記載の組成物である。
【0017】
実施形態９は、１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．４％のカプリン酸エステル、約５８％のラウリン酸エステル、約１６．１％のミリスチン酸エステル、約８．９％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物である。
【0018】
実施形態１０は、１％以下のカプロン酸エステル、４．２％～５．１％のカプリル酸エステル、４．０％～４．８％のカプリン酸エステル、５２％～６０％のラウリン酸エステル、１４．５％～１７．７％のミリスチン酸エステル、８．０％～９．８％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態１～９のいずれか１つに記載の組成物である。
【0019】
実施形態１１は、１％以下のカプロン酸エステル、４．４％～４．８％のカプリル酸エステル、４．２％～４．６％のカプリン酸エステル、５５％～６０％のラウリン酸エステル、１５．３％～１６．９％のミリスチン酸エステル、８．５％～９．３％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の組成物である。
【0020】
実施形態１２は、１％以下のカプロン酸エステル、４．５％～４．７％のカプリル酸エステル、４．３％～４．５％のカプリン酸エステル、５６．８％～５９．１％のラウリン酸エステル、１５．８％～１６．４％のミリスチン酸エステル、８．７％～９．１％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の組成物である。
【0021】
実施形態１３は、薬物および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬製剤であり、薬学的に許容される賦形剤が、
脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物であって、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１％以下のカプロン酸エステル、２．３％超１０％以下のカプリル酸エステル、２．８％超１０％以下のカプリン酸エステル、５２．１％超６０％以下のラウリン酸エステル、１４％以上１８．３％未満のミリスチン酸エステル、７％以上１１．９％未満のパルミチン酸エステル、および６．４％未満のステアリン酸エステルを含む、脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物を含む、医薬製剤である。
脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物であって、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１％以下のカプロン酸エステル、２．３％超１０％以下のカプリル酸エステル、２．８％超１０％以下のカプリン酸エステル、５２．１％超６０％以下のラウリン酸エステル、１４％以上１８．３％未満のミリスチン酸エステル、７％以上１１．９％未満のパルミチン酸エステル、および６．４％未満のステアリン酸エステルを含む、脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物を含む、医薬製剤である。
【0022】
実施形態１４は、ポリソルベート２０組成物が製剤の０．０１％～０．２％（ｗ／ｖ）である、実施形態１３に記載の医薬製剤である。
【0023】
実施形態１５は、薬物がタンパク質、抗体、抗体断片、酵素、またはペプチドである、実施形態１３または１４に記載の医薬製剤である。
【0024】
実施形態１６は、薬物がタンパク質である、実施形態１５に記載の医薬製剤である。
【0025】
実施形態１７は、薬物が抗体である実施形態１５に記載の医薬製剤である。
【0026】
実施形態１８は、薬物濃度が０．１％～３０％（ｗ／ｖ）である、実施形態１３～１７のいずれか一つに記載の医薬製剤である。
【0027】
実施形態１９は、薬物濃度が５％～２０％（ｗ／ｖ）である、実施形態１８に記載の医薬製剤である。
【0028】
実施形態２０は、ポリソルベート２０組成物が、製剤の０．０１％～０．１２％、０．０１％～０．０８％、０．０３％～０．１％、または０．０４％～０．０７％（ｗ／ｖ）である、実施形態１３～１９のいずれか一つに記載の医薬製剤である。
【0029】
実施形態２１は、ポリソルベート２０組成物が、製剤の約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．１１％、または０．１２％（ｗ／ｖ）である、実施形態１３～２０のいずれか一つに記載の医薬製剤である。
【0030】
実施形態２２は、ポリソルベート２０組成物が製剤の約０．０６％（ｗ／ｖ）である、実施形態１３～２１のいずれか一つに記載の医薬製剤である。
【0031】
実施形態２３は、ｐＨが４～８、または５～７．５、または６．５～７．５、または６．８～７．２である、実施形態１３～２２のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0032】
実施形態２４は、薬学的に許容され得る賦形剤が、水、アルコール、糖、緩衝剤、界面活性剤、安定剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、実施形態１３～２３のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0033】
実施形態２５は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、２．５％超、または３．５％超、または４％超、または４．６％超であって、１０％以下のカプリル酸エステルを含む、実施形態１３～２４のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0034】
実施形態２６は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、３％超、または３．５％超、または４％超、または４．４％以上であって、１０％以下のカプリン酸エステルを含む、実施形態１３～２５のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0035】
実施形態２７は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、５３％超、５５％超、５７％超、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む、実施形態１３～２６のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0036】
実施形態２８は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１４％以上であって、１８％未満、または１７％未満、または１６．５％未満、または１６．１％以下のミリスチン酸エステルを含む、実施形態１３～２７のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0037】
実施形態２９は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、７％以上であって、１１％未満、または１０％未満、または９．５％未満、または８．９％以下のパルミチン酸エステルを含む、実施形態１３～２８のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0038】
実施形態３０は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、６％未満、または５％未満、または１％未満のステアリン酸エステルを含む、実施形態１３～２９のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0039】
実施形態３１は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態１３～３０のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0040】
実施形態３２は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．４％のカプリン酸エステル、約５８％のラウリン酸エステル、約１６．１％のミリスチン酸エステル、約８．９％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸を含まない、実施形態１３～３１のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0041】
実施形態３３は、１．０％以下のカプロン酸エステル、２．６％以上６．６％以下のカプリル酸エステル、２．４％以上６．４％以下のカプリン酸エステル、５５．０％以上６０．０％以下のラウリン酸エステル、１４．１％以上１８．１％以下のミリスチン酸エステル、７．０％以上１０．９％以下のパルミチン酸エステル、および２．０％以下のステアリン酸エステルを含む脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物である。
【0042】
実施形態３４は、３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．６％以上であって、６．６％以下のカプリル酸エステルを含む、実施形態３３に記載の組成物である。
【0043】
実施形態３５は、２．６％以上、または３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．４％以上であって、６．４％以下のカプリン酸エステルを含む、実施形態３３または３４に記載の組成物である。
【0044】
実施形態３６は、５６％以上、５７％以上、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む、実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の組成物である。
【0045】
実施形態３７は、１４．１％以上であって、１８％以下、１７％以下、１６％以下、または１５％以下のミリスチン酸エステルを含む、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の組成物である。
【0046】
実施形態３８は、７％以上１０．９％未満、または１０％以下、または９％以下、または８％以下のパルミチン酸エステルを含む、実施形態３３～３７のいずれか１つに記載の組成物である。
【0047】
実施形態３９は、２％以下、または１．５％以下、または１％以下のステアリン酸エステルを含む、実施形態３３～３８のいずれか１つに記載の組成物である。
【0048】
実施形態４０は、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態３３～３９のいずれか１つに記載の組成物である。
【0049】
実施形態４１は、１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．８％のカプリン酸エステル、約５７．０％のラウリン酸エステル、約１６．２％のミリスチン酸エステル、約９．４％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態３３に記載の組成物である。
【0050】
実施形態４２は、１％以下のカプロン酸エステル、３．７％～５．２％のカプリル酸エステル、３．７％～５．２％のカプリン酸エステル、５６．３％～５７．２％のラウリン酸エステル、１５．９％～１６．９％のミリスチン酸エステル、８．８％～９．７％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態３３に記載の組成物である。
【0051】
実施形態４３は、１％以下のカプロン酸エステル、３．５％～５．５％のカプリル酸エステル、３．５％～５．５％のカプリン酸エステル、５５％～５８％のラウリン酸エステル、１５％～１７．５％のミリスチン酸エステル、８．５％～１０％のパルミチン酸エステル、および約０．１％以下のステアリン酸エステルを含む、実施形態３３に記載の組成物である。
【0052】
実施形態４４は、５．８％以上９．８％以下のオレイン酸、および２．０％以下のリノール酸エステルをさらに含む、実施形態３３～４３のいずれか１つに記載の組成物である。
【0053】
実施形態４５は、薬物および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬製剤であり、薬学的に許容される賦形剤が、
脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物であって、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１．０％以下のカプロン酸エステル、２．６％以上６．６％以下のカプリル酸エステル、２．４％以上６．４％以下のカプリン酸エステル、５５．０％以上６０．０％以下のラウリン酸エステル、１４．１％以上１８．１％以下のミリスチン酸エステル、７．０％以上１０．９％以下のパルミチン酸エステル、および２．０％以下のステアリン酸エステルを含む、脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物を含む、医薬製剤である。
脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物であって、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１．０％以下のカプロン酸エステル、２．６％以上６．６％以下のカプリル酸エステル、２．４％以上６．４％以下のカプリン酸エステル、５５．０％以上６０．０％以下のラウリン酸エステル、１４．１％以上１８．１％以下のミリスチン酸エステル、７．０％以上１０．９％以下のパルミチン酸エステル、および２．０％以下のステアリン酸エステルを含む、脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物を含む、医薬製剤である。
【0054】
実施形態４６は、ポリソルベート２０組成物が製剤の０．０１％～０．２％（ｗ／ｖ）である、実施形態４５に記載の医薬製剤である。
【0055】
実施形態４７は、薬物がタンパク質、抗体、抗体断片、酵素、またはペプチドである、実施形態４５または４６に記載の医薬製剤である。
【0056】
実施形態４８は、薬物がタンパク質である、実施形態４７に記載の医薬製剤である。
【0057】
実施形態４９は、薬物が抗体である実施形態４７に記載の医薬製剤である。
【0058】
実施形態５０は、薬物濃度が０．１％～３０％（ｗ／ｖ）である、実施形態４５～４９のいずれか一つに記載の医薬製剤である。
【0059】
実施形態５１は、薬物濃度が５％～２０％（ｗ／ｖ）である、実施形態５０に記載の医薬製剤である。
【0060】
実施形態５２は、ポリソルベート２０組成物が、製剤の０．０１％～０．１２％、０．０１％～０．０８％、０．０３％～０．１％、または０．０４％～０．０７％（ｗ／ｖ）である、実施形態４５～５１のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0061】
実施形態５３は、ポリソルベート２０組成物が、製剤の約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．１１％、または０．１２％（ｗ／ｖ）である、実施形態４５～５２のいずれか一つに記載の医薬製剤である。
【0062】
実施形態５４は、ポリソルベート２０組成物が製剤の約０．０６％（ｗ／ｖ）である、実施形態４５～５３のいずれか一つに記載の医薬製剤である。
【0063】
実施形態５５は、ｐＨが４～８、または５～７．５、または６．５～７．５、または６．８～７．２である、実施形態４５～５４のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0064】
実施形態５６は、薬学的に許容され得る賦形剤が、水、アルコール、糖、緩衝剤、界面活性剤、安定剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、実施形態４５～５５のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0065】
実施形態５７は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．６％以上であって、６．６％以下のカプリル酸を含む、実施形態４５～５６のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0066】
実施形態５８は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、２．６％以上、または３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．４％以上であって、６．４％以下のカプリン酸エステルを含む、実施形態４５～５７のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0067】
実施形態５９は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、５６％以上、５７％以上、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む、実施形態４５～５８のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0068】
実施形態６０は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１４．１％以上であって、１８％以下、または１７％以下、または１６％以下、または１５％以下のミリスチン酸エステルを含む、実施形態４５～５９のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0069】
実施形態６１は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、７％以上１０．９％未満、または１０％以下、または９％以下、または８％以下のパルミチン酸エステルを含む、実施形態４５～６０のいずれか１つに記載の組成物である。
【0070】
実施形態６２は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、２％以下、または１．５％以下、または１％以下のステアリン酸エステルを含む、実施形態４５～６１のいずれか１つに記載の組成物である。
【0071】
実施形態６３は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態４５～６２のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0072】
実施形態６４は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．８％のカプリン酸エステル、約５７．０％のラウリン酸エステル、約１６．２％のミリスチン酸エステル、約９．４％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸を含まない、実施形態４５～６３のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0073】
実施形態６５は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１％以下のカプロン酸エステル、３．７％～５．２％のカプリル酸エステル、３．７％～５．２％のカプリン酸エステル、５６．３％～５７．２％のラウリン酸エステル、１５．９％～１７．０％のミリスチン酸エステル、８．８％～９．８％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、実施形態４５～６３のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0074】
実施形態６６は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１％以下のカプロン酸エステル、３．５％～５．５％のカプリル酸エステル、３．５％～５．５％のカプリン酸エステル、５５％～５８％のラウリン酸エステル、１５％～１７．５％のミリスチン酸エステル、８．５％～１０％のパルミチン酸エステル、および約０．１％以下のステアリン酸を含む、実施形態４５～６３のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0075】
実施形態６７は、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、５．８％以上９．８％以下のオレイン酸、および２．０％以下のリノール酸塩をさらに含む、実施形態４５～６６のいずれか１つに記載の医薬製剤である。
【0076】
実施形態６８は、同一貯蔵条件に供される標準ポリソルベート２０組成物を含む製剤と比較した場合、脂肪酸エステルの分解に起因する遊離脂肪酸粒子が少ない、実施形態４５～６７のいずれか１つに記載の製剤である。
【0077】
実施形態６９は、高次エステル分解医薬品をさらに含み、遊離脂肪酸粒子の形成が観察される前に、他の点では同一の含有量を有し、同一条件下で貯蔵される標準ポリソルベート２０組成物を含むＨＯＥ分解医薬品におけるよりも最大１０％多くの脂肪酸エステルが遊離脂肪酸に分解され得る、実施形態４５～６８のいずれか１つに記載の製剤である。
【0078】
実施形態７０は、遊離脂肪酸の金属核生成によって生成される遊離脂肪酸粒子の数が、他の点では含有量および貯蔵条件が同一である標準ポリソルベート２０組成物を含む製剤における遊離脂肪酸の金属核生成によって生成される遊離脂肪酸粒子の数よりも少ない、実施形態４５～６９のいずれか１つに記載の製剤である。
【0079】
実施形態７１は、遊離脂肪酸が、脂肪酸エステルの加水分解および／または酸化分解によって生成される、実施形態３３～７０のいずれか１つに記載の製剤である。
【0080】
実施形態７２は、脂肪酸エステルの分解により、標準ポリソルベート２０組成物を含む組成物または製剤中の遊離脂肪酸粒子形成と比較して、遊離脂肪酸粒子形成が遅延する、実施形態３３～７０のいずれか１つに記載の製剤である。
【0081】
実施形態７３は、遊離脂肪酸粒子が肉眼で見える、実施形態７２に記載の製剤である。
【0082】
実施形態７４は、遊離脂肪酸粒子が肉眼で見えない、実施形態７２に記載の製剤である。
【0083】
追加の目的および利点は、以下の説明に部分的に記載され、説明から部分的に明らかになるか、または実践によって習得され得る。目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせによって実現および達成されるであろう。
【0084】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、いずれも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、いくつかの例示的な実施形態を示し、説明と共に、本明細書に記載の特定の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【0085】
【0086】
【0087】
【0088】
【0089】
【図4】図４Ａ～図４Ｄは、非固定化酵素カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）のリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）およびシュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ）のリパーゼ（ＰＣＬ）によって分解された修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１および対照ロットＨＰ ＰＳ２０由来のＰＳ２０の逆相ＵＨＰＬＣによるエステル分布を示す。図４Ａは、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１に対するＣＡＬＢの効果を示す。図４Ｂは、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１に対するＰＣＬの効果を示す。図４Ｃは、ＨＰ ＰＳ２０対照に対するＣＡＬＢの効果を示す。図４Ｄは、ＨＰ ＰＳ２０対象に対するＰＣＬの効果を示す。モノエステルは５～１５分の間に早期に溶出し、高次（ジ－およびトリ－）エステルは１５～２０分の間に溶出する。ＣＡＬＢはモノエステルを優先的に分解し、ＰＣＬはＰＳ２０の高次エステルを主に標的とする。
【0090】
【0091】
【0092】
【図7】図７Ａ～図７Ｆは、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１および対照ロットＨＰ ＰＳ２０由来のＰＳ２０を分解するためのｍＡｂ－Ｂ、ＣおよびＤの高速分解ＤＰ製剤を使用したリアルタイム５℃安定性試験究の開始時（Ｔ０）および終了時（１２週間）のエステル分布の逆相ＵＨＰＬＣによる測定を示す。図７Ａは、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１に対するｍＡｂ－Ｂの効果を示す；図７Ｂは、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１に対するｍＡｂ－Ｃの効果を示す；図７Ｃは、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１に対するｍＡｂ－Ｄの効果を示す；図７Ｄは、対照ロットＨＰ ＰＳ２０に対するｍＡｂ－Ｂの効果を示す；図７Ｅは、対照ロットＨＰ ＰＳ２０に対するｍＡｂ－Ｃの効果を示す；図７Ｆは、対象ロットＨＰ ＰＳ２０に対するｍＡｂ－Ｄの効果を示す。モノエステルは１２～２２分の間に早期に溶出し、高次エステル（ジエステルおよびトリエステル）は２２～３０分の間に溶出する。
【0093】
【0094】
【発明を実施するための形態】
【0095】
Ａ．定義
特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【0096】
本出願では、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。多数項従属請求項の文脈では、「または」の使用は、１つよりも多くの先行する独立請求項または従属請求項のいずれかのみを指す。また、「要素」または「構成成分」などの用語は、特に明記しない限り、１つの単位を含む要素および構成成分と、１つよりも多くのサブユニットを含む要素および構成成分の両方を包含する。
【0097】
本明細書に記載の場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率の範囲、または整数範囲は、別段示されない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数、および適切な場合、それらの分数（整数の１０分の１および１００分の１など）の値を含むと理解されるべきである。
【0098】
単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（ＳＩ）で受け入れられている形式で示されている。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。測定値は、有効数字および測定に関連する誤差を考慮して、近似値であると理解される。
【0099】
本明細書で使用される場合、製剤中のＰＳ２０のパーセンテージ（「％」）は、特に明記しない限り、重量対体積（「ｗ／ｖ」）パーセンテージである。また、ＰＳ２０組成物中の個々の脂肪酸のパーセンテージ（「％」）は、特に明記しない限り、ＰＳ２０組成物中の脂肪酸の組成を測定するためのＵＳＰ／ＥＰ法を使用して測定されるガスクロマトグラムにおけるピーク面積パーセンテージである。
【0100】
本明細書で使用される場合、「ポリソルベート２０」または「ＰＳ２０」は、ラウリン酸の添加前にソルビタンのエトキシル化によって形成されるポリソルベート型非イオン性界面活性剤を指す。ポリソルベート２０（ＰＳ２０）は、例えば、医薬製剤または他の種類の製剤中における生物製剤の凝集を防ぐために使用し得る。ＰＳ２０は、種々の脂肪酸エステルの構造的に可変な混合物または分布であり、各脂肪酸エステルはモノエステルまたは高次エステル、ＨＯＥであり得る。「標準ＰＳ２０組成物」は、薬局方の規格（例えば、上記の表Ａを参照されたい）を満たすが、例えば本明細書の図１に示されるような本明細書に開示される仕様を満たさないポリソルベート２０のロットである。ＨＰ ＰＳ２０は、標準ＰＳ２０の一例である。
【0101】
本明細書で使用される場合、「脂肪酸エステル」は、脂肪酸とアルコールとの組み合わせから生じるエステルのタイプを指し、脂肪酸は、飽和または不飽和のいずれかである長脂肪族鎖を有するカルボン酸である。脂肪酸は、偶数個、例えば４～２８個の炭素原子の非分枝鎖を有し得る。
【0102】
本明細書で使用される場合、「遊離脂肪酸」または「ＦＦＡ」は、脂肪酸エステルの長脂肪族鎖部分を指す。ＦＦＡは、例えば、脂肪酸エステルの分解によって生成される。遊離脂肪酸は可溶化されたままであってもよく、または凝集して凝集体または粒子を形成してもよい。
【0103】
本明細書で使用される場合、ヘキサン酸としても知られている「カプロン酸」は、化学式ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯＯＨを有するヘキサンから誘導されるカルボン酸を指す。この酸は炭素鎖の長さが６である（Ｃ６）。デカン酸の塩およびエステルは「カプロン酸エステル」と呼ばれる。
【0104】
本明細書で使用される場合、オクタン酸としても知られている「カプリル酸」は、構造式ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨを有する飽和脂肪酸およびカルボン酸を指す。この酸は炭素鎖の長さが８である（Ｃ８）。デカン酸の塩およびエステルは「カプリル酸エステル」と呼ばれる。
【0105】
本明細書で使用される場合、デカン酸またはデシル酸としても知られている「カプリン酸」は、式ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＯＯＨを有する飽和脂肪酸を指す。この酸は炭素鎖の長さが１０である（Ｃ１０）。デカン酸の塩およびエステルは、「デカン酸エステル」または「カプリン酸エステル」と呼ばれる。
【0106】
本明細書で使用される場合、ドデカン酸としても知られている「ラウリン酸」は、式ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＯＯＨを有する飽和脂肪酸を指す。この酸は炭素数の長さが１２である（Ｃ１２）。ラウリン酸の塩およびエステルは「ラウリン酸エステル」として知られている。
【0107】
本明細書で使用される場合、「ミリスチン酸」は、分子式ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯＯＨを有する飽和脂肪酸を指す。この酸は炭素鎖の長さが１４である（Ｃ１４）。その塩およびエステルは、一般に「ミリスチン酸エステル」または「テトラデカン酸エステル」と呼ばれる。
【0108】
本明細書で使用される場合、ヘキサデカン酸としても知られている「パルミチン酸」は、化学式ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯＯＨを有する飽和脂肪酸を指す。この酸は炭素鎖の長さが１６である（Ｃ１６）。デカン酸の塩およびエステルは「パルミチン酸エステル」と呼ばれる。
【0109】
本明細書で使用される場合、オクタデカン酸としても知られている「ステアリン酸」は、化学式ＣＨ３（ＣＨ２）１６ＣＯＯＨを有する飽和脂肪酸を指す。この酸は炭素鎖の長さが１８である（Ｃ１８）。ステアリン酸の塩およびエステルは「ステアリン酸エステル」と呼ばれる。
【0110】
本明細書で使用される場合、「オレイン酸」は、化学式ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨを有する脂肪酸を指す。この酸の炭素長は１８であり、不飽和度は１点である（Ｃ１８：１）。ステアリン酸の塩およびエステルは「オレイン酸エステル」と呼ばれる。
【0111】
本明細書で使用される場合、「リノール酸」は、化学式ＣＯＯＨ（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３を有する飽和脂肪酸を指す。この酸の炭素長は１８であり、不飽和点は２点である（Ｃ１８：２）。ステアリン酸の塩およびエステルは「リノール酸塩」と呼ばれる。
【0112】
本明細書で使用される場合、「高次エステル」は、ポリソルベート２０のポリオキシエチレン鎖のジ－、トリ－および最大テトラ－エステル型を指し、これは「モノエステル」型を有するものとは対照的である。ポリソルベート２０の４つのポリオキシエチレン鎖の各々を脂肪酸でエステル化することで、混合物中にモノエステルおよび高次エステルをもたらし得る。高次エステル（ＨＯＥ）ポリソルベート２０の種は、脂肪酸エステルの任意の組み合わせを有し得、分子当たり１種類のみの脂肪酸エステルに限定されない。各ソルビタン環は、約２０モル当量でエトキシル化され得る。さらに、ポリソルベート２０頭部基は、ソルビタン環またはイソソルビド環のいずれかであってもよく、後者は、脂肪酸でエステル化され得る２つのポリオキシエチレン鎖のみを生ずる。ＰＳ２０組成物のＨＯＥ含有量は、ポリソルベートエステル分布アッセイを使用して定量し得る。（例えば、図２を参照されたい。）
【0113】
本明細書で使用される場合、「高次エステル分解医薬品」または「ＨＯＥ分解医薬品」は、ポリソルベートエステル分布アッセイを使用して特定されるように、超高速逆相液体クロマトグラフィーアッセイにおいてＰＳ２０のＨＯＥピーク面積をモノエステルピーク面積に対して経時的に減少させる任意の医薬品を指す（例えば、図２および図７Ａ～図７Ｆを参照されたい。）。
【0114】
本明細書で使用される場合、「凝集体」および「凝集」は、一緒になること、または例えば遊離脂肪酸鎖の凝集のように塊または全体として集まることを意味する。凝集した遊離脂肪酸鎖は、本明細書では粒子またはＦＦＡ粒子とも呼ばれ得る。凝集体は、自己凝集性であり得、または他の因子、例えば、凝集剤、沈殿剤、撹拌、または遊離脂肪酸鎖を一緒にする他の手段および方法の存在に起因して凝集し得る。「凝集しやすい」化合物は、特に撹拌によって他の分子と凝集することが観察されている化合物である。凝集は、溶液中の以前は透明であった製剤が濁った場合または沈殿物を含む場合など、または分子をサイズによって分離するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などの方法によって視覚的に観察され得る。凝集は、肉眼で見えないＦＦＡ粒子をもたらし得、これは、光遮蔽またはフローイメージング顕微鏡を使用して定量化され得る。
【0115】
本明細書で使用される場合、「薬物」は、医薬製剤に使用される任意の種類の活性成分を指す。薬物は、例えば、抗体、抗体断片、酵素、またはペプチドなどのタンパク質を含み得る。
【0116】
「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線状または分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、また非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作または改変、例えば、標識成分とのコンジュゲートにより改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含むタンパク質、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義に含まれる。
【0117】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、および一本鎖分子、ならびに抗体結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む。「抗体」という用語は、「抗体断片」および「抗原結合断片」を含む。「抗体断片」または「抗原結合断片」は、インタクトな抗体の抗原結合部分および／または可変領域を含み、抗原に特異的に結合するインタクトな抗体の部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ：直鎖状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７～１０６２［１９９５］）：一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【0118】
本明細書で使用される場合、「酵素」は、化学反応を触媒する任意のタンパク質を指す。酵素の触媒機能は、その活性または酵素活性を構成する。酵素は、通常、それが行う触媒機能の種類、例えばペプチド結合の加水分解に従って分類される。
【0119】
「製剤」は、他の成分の中でもＰＳ２０を含み得る成分、例えばタンパク質、緩衝液、安定剤などの混合物を指す。場合によっては、製剤は水溶液などの液体溶液であるが、他の場合では凍結乾燥されていてもよい。「医薬製剤」または「治療用製剤」または「治療用調製物」などの用語は、少なくとも１つの活性成分および少なくとも１つの追加の成分または賦形剤を含み、活性成分の生物学的活性が哺乳動物対象において有効であることを可能にするような形態であり、「治療用途に適している」または「医薬用途に適している」調製物または組成物を指し、製剤全体が哺乳動物対象に対して許容できないほど毒性ではなく、製剤が投与される哺乳動物対象に対して許容できないほど毒性であるか、またはそれらを対象に対して許容できないほど毒性にする濃度である成分を含まないことを意味する。
【0120】
本明細書で使用される場合、「安定な」製剤は、貯蔵時にその物理的および／または化学的安定性を保持する製剤である。安定性は、選択された温度にて選択された期間測定し得る。貯蔵中の粒子形成の程度、例えば肉眼で見える粒子製剤／または肉眼で見えない粒子製剤、または凝集の程度、または分解生成物の形成の程度、またはこれらの要因の任意の組み合わせを、例えば安定性の指標として使用し得る。
【0121】
薬物含有製剤の「安定性」を高めることは、（未改変の薬物含有製剤と比較して）その製剤中の凝集体の形成を減少させること、または防止することを含み得、またはその製剤中の肉眼で見える粒子および／または肉眼で見えない粒子の形成を低減または防止し；他の成分が薬物の安定性を維持するように作用し続け得るように、製剤の成分の分解生成物を低減または防止することを含む。
【0122】
「安定剤」という用語は、タンパク質および抗体などの大きく帯電した生体分子を安定化する薬剤を指す。場合によっては、界面活性剤または等張化剤が安定剤として作用し得る。
【0123】
本明細書で使用される場合、「界面活性剤」とは、表面活性剤、好ましくは、非イオン性界面活性剤を指す。本明細書における界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグルコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、またはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；メチルココイルタウリン酸ナトリウムまたはメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、およびエチレングリコール－プロピレングリコールコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８等）等が挙げられる。
【0124】
「等張化剤」という用語は、溶液の相対濃度を調整または維持するために使用される薬剤を指す。等張化剤の例としては、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの三価以上の糖アルコールなどの多価糖アルコールが挙げられる。
【0125】
本明細書で使用される場合、「緩衝剤」は、その酸－塩基コンジュゲート成分の作用によるｐＨの変化に抵抗する溶液を指す。
【0126】
「無菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生存微生物およびそれらの胞子を含まないか、またはそれらを本質的に含まない。
【0127】
Ｂ．ＰＳ２０組成物
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ＰＳ２０中のより高濃度のミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、およびステアリン酸（Ｃ１８：０）のより長鎖の脂肪酸エステルを含むＰＳ２０組成物は、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の形成をより受けやすくなる可能性がある。脂肪酸エステルの分解は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の形成をもたらす。したがって、より長鎖の脂肪酸エステルを含むＰＳ２０組成物は、肉眼で見えるＦＦＡ粒子、および肉眼で見えないＦＦＡ粒子の形成の影響を受けにくい可能性がある。
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ＰＳ２０中のより高濃度のミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、およびステアリン酸（Ｃ１８：０）のより長鎖の脂肪酸エステルを含むＰＳ２０組成物は、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の形成をより受けやすくなる可能性がある。脂肪酸エステルの分解は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の形成をもたらす。したがって、より長鎖の脂肪酸エステルを含むＰＳ２０組成物は、肉眼で見えるＦＦＡ粒子、および肉眼で見えないＦＦＡ粒子の形成の影響を受けにくい可能性がある。
【0128】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＳ２０組成物は、ＵＳＰ／ＥＰ／ＪＰ仕様内に留まりながら、より低濃度のステアリン酸エステル、パルミチン酸エステル、およびミリスチン酸エステルを含む。いくつかの実施形態では、ステアリン酸エステルレベルは、市販の製剤中の約５～６％から約０％に低下する可能性がある。いくつかの実施形態では、短鎖脂肪酸エステル（すなわち、炭素鎖長Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０およびＣ１２の脂肪酸エステル）の濃度を濃縮する一方で、長鎖脂肪酸エステル（すなわち、炭素鎖長Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８の脂肪酸エステル）を最小化させ、または希釈する。
【0129】
本明細書では、１％以下のカプロン酸エステル、２．３％超１０％以下のカプリル酸エステル、２．８％超１０％以下のカプリン酸エステル、５２．１％超６０％以下のラウリン酸エステル、１４％以上１８．３％未満のミリスチン酸エステル、７％以上１１．９％未満のパルミチン酸エステル、および６．４％未満のステアリン酸エステルを含むポリソルベート２０組成物が提供される。
【0130】
いくつかの実施形態では、組成物は、２．５％超、または３．５％超、または４％超、または４．６％以上であって、１０％以下のカプリル酸エステルを含む。
【0131】
いくつかの実施形態では、組成物は、３％超、または３．５％超、または４％超、または４．４％以上であって、１０％以下のカプリン酸エステルを含む。
【0132】
いくつかの実施形態では、組成物は、５３％超、５５％超、５７％超、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、組成物は、１４％以上であって、１８％未満、または１７％未満、または１６．５％未満、または１６．１％以下のミリスチン酸エステルを含む。
【0134】
いくつかの実施形態では、組成物は、７％以上１１％未満、または１０％未満、または９．５％未満、または８．９％以下のパルミチン酸エステルを含む。
【0135】
いくつかの実施形態では、組成物は、６％未満、または５％未満、または１％未満のステアリン酸エステルを含む。
【0136】
いくつかの実施形態では、組成物は、検出可能なステアリン酸エステルを含まない。
【0137】
いくつかの実施形態では、本明細書では、１．０％以下のカプロン酸エステル、２．６％以上６．６％以下のカプリル酸エステル、２．４％以上６．４％以下のカプリン酸エステル、５５．０％以上６０．０％以下のラウリン酸エステル、１４．１％以上１８．１％以下のミリスチン酸エステル、７．０％以上１０．９％以下のパルミチン酸エステル、および２．０％以下のステアリン酸エステルを含む脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物が提供される。
【0138】
いくつかの実施形態では、組成物は、３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．６％以上であって、６．６％以下のカプリル酸エステルを含む。
【0139】
いくつかの実施形態では、組成物は、２．６％以上、または３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．４％以上であって、６．４％以下のカプリン酸エステルを含む。
【0140】
いくつかの実施形態では、組成物は、５６％以上、５７％以上、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む。
【0141】
いくつかの実施形態では、組成物は、１４．１％以上であって、１８％以下、または１７％以下、または１６％以下、または１５％以下のミリスチン酸エステルを含む。
【0142】
いくつかの実施形態では、組成物は、７％以上であって、１０．９％未満、または１０％以下、または９％以下、または８％以下のパルミチン酸エステルを含む。
【0143】
いくつかの実施形態では、組成物は、２％以下、または１．５％以下、または１％以下のステアリン酸エステルを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、検出可能なステアリン酸エステルを含まない。１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．８％のカプリン酸エステル、約５７．０％のラウリン酸エステル、約１６．２％のミリスチン酸エステル、約９．４％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない、請求項１に記載の組成物。
【0144】
いくつかの実施形態では、組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、３．７％～５．２％のカプリル酸エステル、３．７％～５．２％のカプリン酸エステル、５６．３％～５７．２％のラウリン酸エステル、１５．９％～１７．０％のミリスチン酸エステル、８．８％～９．８％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない。
【0145】
いくつかの実施形態では、組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、３．５％～５．５％のカプリル酸エステル、３．５％～５．５％のカプリン酸エステル、５５％～５８％のラウリン酸エステル、１５％～１７．５％のミリスチン酸エステル、８．５％～１０％のパルミチン酸エステル、および約０．１％以下のステアリン酸エステルを含む。
【0146】
いくつかの実施形態では、組成物は、５．８％以上９．８％以下のオレイン酸、および２．０％以下のリノール酸エステルをさらに含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．４％のカプリン酸エステル、約５８％のラウリン酸エステル、約１６．１％のミリスチン酸エステル、約８．９％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない。
【0148】
いくつかの実施形態では、組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、４．２％～５．１％のカプリル酸エステル、４．０％～４．８％のカプリン酸エステル、５２％～６０％のラウリン酸エステル、１４．５％～１７．７％のミリスチン酸エステル、８．０％～９．８％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステル塩を含まない。
【0149】
いくつかの実施形態では、組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、４．４％～４．８％のカプリル酸エステル、４．２％～４．６％のカプリン酸エステル、５５％～６０％のラウリン酸エステル、１５．３％～１６．９％のミリスチン酸エステル、８．５％～９．３％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステル塩を含まない。
【0150】
いくつかの実施形態では、組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、４．５％～４．７％のカプリル酸エステル、４．３％～４．５％のカプリン酸エステル、５６．８％～５９．１％のラウリン酸エステル、１５．８％～１６．４％のミリスチン酸エステル、８．７％～９．１％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステル塩を含まない。
【0151】
Ｃ．製剤
少なくとも一種の薬物と少なくとも一種の薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤も本明細書で提供され、薬学的に許容され得る賦形剤は、上記の脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物を含む。したがって、いくつかの製剤では、製剤は、脂肪酸エステルエステルがポリソルベート２０組成物の１％以下のカプロン酸エステル、２．３％超１０％以下のカプリル酸エステル、２．８％超１０％以下のカプリン酸エステル、５２．１％超６０％以下のラウリン酸エステル、１４％以上１８．３％未満のミリスチン酸エステル、７％以上１１．９％未満のパルミチン酸エステルおよび６．４％未満のステアリン酸エステルを含むポリソルベート２０組成物を含む。別の製剤では、製剤は、脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物であって、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１．０％以下のカプロン酸エステル、２．６％以上６．６％以下のカプリル酸エステル、２．４％以上６．４％以下のカプリン酸エステル、５５．０％以上６０．０％以下のラウリン酸エステル、１４．１％以上１８．１％以下のミリスチン酸エステル、７．０％以上１０．９％以下のパルミチン酸エステル、および２．０％以下のステアリン酸エステルを含む脂肪酸エステルを含む、製剤である。
少なくとも一種の薬物と少なくとも一種の薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤も本明細書で提供され、薬学的に許容され得る賦形剤は、上記の脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物を含む。したがって、いくつかの製剤では、製剤は、脂肪酸エステルエステルがポリソルベート２０組成物の１％以下のカプロン酸エステル、２．３％超１０％以下のカプリル酸エステル、２．８％超１０％以下のカプリン酸エステル、５２．１％超６０％以下のラウリン酸エステル、１４％以上１８．３％未満のミリスチン酸エステル、７％以上１１．９％未満のパルミチン酸エステルおよび６．４％未満のステアリン酸エステルを含むポリソルベート２０組成物を含む。別の製剤では、製剤は、脂肪酸エステルを含むポリソルベート２０組成物であって、ポリソルベート２０組成物の脂肪酸エステルが、１．０％以下のカプロン酸エステル、２．６％以上６．６％以下のカプリル酸エステル、２．４％以上６．４％以下のカプリン酸エステル、５５．０％以上６０．０％以下のラウリン酸エステル、１４．１％以上１８．１％以下のミリスチン酸エステル、７．０％以上１０．９％以下のパルミチン酸エステル、および２．０％以下のステアリン酸エステルを含む脂肪酸エステルを含む、製剤である。
【0152】
いくつかの実施形態では、１種以上のさらなる薬学的に許容され得る賦形剤が含まれる。他の実施形態では、製剤は、少なくとも一つの薬物およびポリソルベート２０組成物から本質的になる。
【0153】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの薬物は、抗体、抗体断片、酵素、またはペプチドなどのタンパク質を含む。
【0154】
医薬製剤のいくつかの実施形態では、薬物の濃度は、製剤の０．１％～３０％（ｗ／ｖ）、例えば１％～３０％、５％～３０％、５％～２５％、５％～２０％、５％～１０％、１０％～３０％、１０％～２５％、１０％～２０％、または１５％～２５％である。
【0155】
本明細書の医薬製剤では、総界面活性剤濃度は、０．００１％～１％、０．００１％～０．５％、０．００５％～０．２％、０．０１％～０．１％、または０．０２％～０．０６％、または０．０３％～０．０５％であり得る。いくつかの実施形態では、総界面活性剤濃度は、製剤の０．０１％～１％（ｗ／ｖ）、例えば０．０１％～０．５％、０．０１％～０．２５％、０．０１％～０．１２％、または０．０１％～０．２％である。本明細書の医薬製剤では、ポリソルベート２０濃度は、０．００１％～１％、０．００５％～０．２％、０．０１％～０．１％、または０．０２％～０．０６％、または０．０３％～０．０５％であり得る。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０組成物は、製剤の０．０１％～１％（ｗ／ｖ）、例えば０．０１％～０．５％、０．０１％～０．２５％、０．０１％～０．１２％、または０．０１％～０．２％である。
【0156】
医薬製剤のいくつかの実施形態では、ポリソルベート２０組成物は、製剤の０．０１％～０．２％、０．０１％～０．１２％、０．０１％～０．０８％、０．０３％～０．１％、または０．０４％～０．０７％（ｗ／ｖ）を含む。
【0157】
医薬製剤のいくつかの実施形態では、ポリソルベート２０組成物は、製剤の約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．１１％、または０．１２％（ｗ／ｖ）を含む。
【0158】
医薬製剤のいくつかの実施形態では、ポリソルベート２０組成物は、製剤の約０．０６％（ｗ／ｖ）である。
【0159】
医薬製剤のいくつかの実施形態では、ｐＨは４～８、または５～７．５、または６．５～７．５、または６．８～７．２である。
【0160】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、２．５％超、または３．５％超、または４％超、または４．６％以上であって、１０％以下のカプリル酸エステルを含む。
【0161】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．６％以上であって、６．６％以下のカプリル酸エステルを含む。
【0162】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、３％超、または３．５％超、または４％超、または４．４％以上であって、１０％以下のカプリン酸エステルを含む。
【0163】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、２．６％以上、または３％以上、または３．５％以上、または４％以上、または４．４％以上であって、６．４％以下のカプリン酸エステルを含む。
【0164】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、５３％超、５５％超、５７％超、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む。
【0165】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、５６％以上、５７％以上、５８％以上であって、６０％以下のラウリン酸エステルを含む。
【0166】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、１４％以上であって、１８％未満、または１７％未満、または１６．５％未満、または１６．１％以下のミリスチン酸エステルを含む。
【0167】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、１４．１％以上であって、１８％以下、または１７％以下、または１６％以下、または１５％以下のミリスチン酸エステルを含む。
【0168】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、７％以上であって、１１％未満、または１０％未満、または９．５％未満、または８．９％以下のパルミチン酸エステルを含む。
【0169】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、７％以上であって、１０．９％未満、または１０％以下、または９％以下、または８％以下のパルミチン酸エステルを含む。
【0170】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、６％未満、または５％未満、または１％未満のステアリン酸エステルを含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、２％以下、または１．５％以下、または１％以下のステアリン酸エステルを含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、検出可能なステアリン酸エステルを含まない。
【0171】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．４％のカプリン酸エステル、約５８％のラウリン酸エステル、約１６．１％のミリスチン酸エステル、約８．９％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない。
【0172】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、約４．６％のカプリル酸エステル、約４．８％のカプリン酸エステル、約５７．０％のラウリン酸エステル、約１６．２％のミリスチン酸エステル、約９．４％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルエステルを含まない。
【0173】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、３．７％～５．２％のカプリル酸エステル、３．７％～５．２％のカプリン酸エステル、５６．３％～５７．２％のラウリン酸エステル、１５．９％～１７．０％のミリスチン酸エステル、８．８％～９．８％のパルミチン酸エステルを含み、検出可能なステアリン酸エステルを含まない。
【0174】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、１％以下のカプロン酸エステル、３．５％～５．５％のカプリル酸エステル、３．５％～５．５％のカプリン酸エステル、５５％～５８％のラウリン酸エステル、１５％～１７．５％のミリスチン酸エステル、８．５％～１０％のパルミチン酸エステル、および約０．１％以下のステアリン酸エステルを含む。
【0175】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート２０組成物は、５．８％以上９．８％以下のオレイン酸エステル、および２．０％以下のリノール酸エステルをさらに含む。
【0176】
医薬製剤のいくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る賦形剤は、水、アルコール、糖、緩衝剤、界面活性剤、安定剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＳ２０組成物を含む水性製剤は、安定剤、緩衝剤、界面活性剤、および等張化剤から選択される１種以上の賦形剤をさらに含み得る。本発明の水性製剤は、ｐＨ緩衝溶液中で調製し得る。本明細書に開示される製剤に有用な緩衝液は、約ｐＨ４．５～約９．０の範囲のｐＨを有し得る。特定の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ４．５～約７．０の範囲、約ｐＨ４．５～約６．５の範囲、約ｐＨ４．５～約６．０の範囲、約ｐＨ４．５～約５．５の範囲、約ｐＨ４．５～約５．０の範囲、約ｐＨ５．０～約７．０の範囲、約ｐＨ５．５～約７．０の範囲、約ｐＨ５．７～約６．８の範囲、約ｐＨ５．８～約６．５の範囲、約ｐＨ５．９～約６．５の範囲、約ｐＨ６．０～約６．５の範囲、または約ｐＨ６．２～約６．５の範囲である。特定の実施形態では、液体製剤は、約４．７～約５．２の範囲、約５．０～６．０の範囲、または約５．２～約５．８の範囲のｐＨを有する。
【0177】
ｐＨをこの範囲内に制御し得る緩衝剤の例としては、有機酸および無機酸ならびにそれらの塩が挙げられる。例えば、酢酸塩（例えば、酢酸ヒスチジン、酢酸アルギニン、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ヒスチジン、コハク酸アルギニン、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、リン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、およびそれらの組み合わせ。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ～約６００ｍＭであり得る。
【0178】
場合により、追加の界面活性剤を医薬製剤に添加し得る。例示的な追加の界面活性剤としては、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８など）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の総量は、例えば、製剤化された薬物の凝集を減少させ得、および／または製剤中の微粒子の形成を最小化し、および／または吸着を減少させるように添加し得る。
【0179】
等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１重量％～２５重量％、または１重量％～５重量％の任意の量で存在し得る。例示的な等張化剤としては、多価糖アルコール、例えば３価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが挙げられる。
【0180】
いくつかの実施形態では、製剤は、インビボ投与のための医薬製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、無菌である。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、製剤は、液体、溶液形態で保存される。いくつかの実施形態では、製剤を濃縮形態で保存し、使用前に希釈する。製剤は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって無菌にし得る。本明細書の治療製剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルなどの滅菌容器に入れることが可能である。
【0181】
Ｄ．ＰＳ２０組成物およびＰＳ２０含有製剤の作製および試験方法
市販のＰＳ２０の特定の組成物は、貯蔵期間の初期（例えば、Ｔ＜４００日）に分解することが見出されており、場合によっては、ＰＳ２０を含む製剤中に望ましくない肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子をもたらす。
市販のＰＳ２０の特定の組成物は、貯蔵期間の初期（例えば、Ｔ＜４００日）に分解することが見出されており、場合によっては、ＰＳ２０を含む製剤中に望ましくない肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子をもたらす。
【0182】
本明細書に記載され、ＵＳＰ／ＥＰ／ＪＰ仕様内にある濃度のステアリン酸エステル、パルミチン酸エステルおよびミリスチン酸エステルを含むポリソルベート２０組成物は、当技術分野で公知のプロセスを使用して製造し得る。
【0183】
脂肪酸エステルの分布を決定する方法は、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ １０．０ ｒｅｖ ０１／２０１７：０４２６：Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０，第３５８９－３５９０頁に見出され得る。その文献には、例えば、ＰＳ２０（２．４．２２、方法Ｃ）中の脂肪酸の組成を決定する方法が記載されている。方法は、Ｆａｔｓ ａｎｄ Ｆｉｘｅｄ Ｏｉｌｓ（４０１），Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎを参照して、ＵＳＰ（２０１４年９月１日付け）Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０のＩｎｔｅｒｉｍ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔの章にも見出され得る。
【0184】
遊離脂肪酸濃度を測定するための方法は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ａら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０１５；１２（１１）：３８０５－１５）に見出され得る。
【0185】
ＰＳ２０含有組成物の安定性は、例えば、市販の粒子計数器を用いる、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の可視化および／または画像化を含む既知の方法を用いて測定し得る。例えば、凝集は、サイズ排除クロマトグラフィーによって評価され得る。また、数時間にわたる撹拌などの試験を行い、続いてサイズ排除クロマトグラフィーまたは目視検査を行い得る。例えば、いくつかの実施形態では、１００ｒｐｍで数時間、例えば２４時間の撹拌を使用して、製剤中の凝集体または微粒子の程度を決定し得る。
【0186】
場合によっては、本明細書で提供される組成物は、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の存在についてアッセイをし得る。一実施形態では、サンプルをガラスバイアルに入れ、チンダル光の存在下でサンプルを回転させることによって、可視粒子を観察し得る。一実施形態では、肉眼で見えない粒子は、高精度（ＨＩＡＣ）粒子カウンタを使用して分析される。いくつかの実施形態では、ＨＩＡＣ装置は、１０ｍＬ／分の流量、０．１ｍＬの風袋容量、および０．４ｍＬのサンプル容量に設定され得る。特定の実施形態では、サンプルのキャリーオーバーによる測定誤差を防ぐために、各サンプルの最初のランを破棄し、０．４ｍＬの一部の４回のランをしようしてサンプルを分析し得る。２、５、１０、１５、および２５ミクロンのフィルタサイズを分析に使用し得る。
【0187】
いくつかの実施形態では、ＰＳ２０組成物は、例えば、脂肪酸エステル分布、酸価、ヒドロキシル価、けん化価、含水量割合を測定することによって分析し得る。次いで、これらの値を、関連する米国薬局方および／または欧州薬局方および／または日本薬局方の仕様と比較し得る。シャローグラジエントアッセイを行って、モノ－、ジ－およびトリ－エステル含有量を測定し得る。ＰＳ２０組成物中の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルは、脂肪酸質量分析法によって測定される。金属イオン含有量は、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によって試験し得る。アルミニウムおよびカルシウムなどの金属イオンは、遊離脂肪酸核形成を引き起こし、ＰＳ２０の酸化電位を上昇させる可能性がある。
【0188】
ＰＳ２０ロットについて、以下の機能的および安定性の試験を行ってもよい。
【0189】
バイアル撹拌試験は、バイアル内で撹拌ストレスにさらされたときにＰＳ２０がタンパク質を保護する能力を示し得る。１つの方法では、緩衝液中の試験タンパク質は、空気－水界面で凝集しやすい撹拌感受性分子として使用される。ＰＳ２０組成物は、濃度を０．０２％～０．０８％などに上昇させて添加される。サンプルをアームシェーカー上で室温にて７０ｒｐｍで２４時間撹拌する。この時間に、器具の横に静的制御装置を配置する。サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＨＰＬＣ）によって各サンプルを分析して、撹拌サンプルおよび対照サンプルにおけるタンパク質凝集および粒子の形成を調べる。
【0190】
小規模のＩＶバッグ撹拌試験も実施し得る。この試験の目的は、製剤をバイアルから取り出し、注入前にＩＶバッグで希釈した後に製品を保護するために必要なＰＳ２０の濃度をモデル化することである。この試験では、試験タンパク質を様々な濃度のＰＳ２０を含む生理食塩水で希釈し、例えば、１８０ＲＰＭで５℃で２時間、静的対照を５℃で２時間、オービタルシェーカーで攪拌する。バイアル撹拌試験と同じ指標（肉眼で見えない／肉眼で見える形成および凝集）を、生理食塩水中で撹拌した後に分析する。それ未満で凝集および／または粒子が観察されるＰＳ２０の濃度を決定して、ＩＶバッグの界面保護性能の比較または改善を確立し得る。例えば、凝集は、ＳＥ－ＵＨＰＬＣを使用して上記のように評価し得る。
【0191】
ＰＳ２０材料の酸化傾向についても試験し得る。０．２％ｗ／ｖのＰＳ２０を配合したヒスチジンアセテートプラセボを、例えば４０℃で１ヶ月間試験し得る。この試験におけるＰＳ２０の分解の主な機構は酸化的であると予想される。過酸化物をクエンチするタンパク質が存在しないので、４０℃のストレス温度でプラセボ製剤ではＰＳ２０の酸化分解が加速される。ＰＳ２０の酸化分解がプラットフォーム安定剤によって緩和されることを確実にするために、１０ｍＭのメチオニンアームを試験に追加し得る。混合モード蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）で測定されたＰＳ２０の損失は、酸化分解の尺度として使用される。
【0192】
ＰＳ２０を分解することが知られている薬剤の存在下で、例えば、５℃、で３ヶ月間の安定性試験を使用し、ＰＳ２０含有製剤のＰＳ２０分解、ＦＦＡ生成および粒子形成傾向を推測することも可能である。ＰＳ２０を分解することが示されており、５℃で３ヶ月以内にＦＦＡ粒子を形成させることが予想される分子を添加してもよい。ＦＦＡ濃度ならびに凝集および粒子形成を、上記の技術によって、１２週間にわたって毎週など、試験中に評価し得る。酵素ベースのＰＳ２０分解試験を行って、ＦＦＡおよび関連粒子を形成するＰＳ２０組成物の傾向を評価し得る。例えば、カンジダ・アンタルクティカのリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）はモノエステルを特異的に分解するが、シュードモナス・セパシアのリパーゼ（ＰＣＬ）は高次エステルを特異的に分解する。
【0193】
これらの各酵素をＰＳ２０組成物に別々に添加し、ＰＳ２０濃度、および肉眼で見えない粒子の形成を経時的に分析することによって、ＦＦＡ粒子の形成をモニターし得る。
【0194】
ＣＡＬＢおよびＰＣＬの酵素作業溶液は、例えば、遊離酵素を２０ｍＭ酢酸ヒスチジン緩衝液にそれぞれ約０．０１Ｕ／ｍＬおよび１２．５Ｕ／ｍＬで溶解して、粒子の形成が約３時間以内に確実に起こるように調製し得る。次いで、１０％ ＰＳ２０をこれらの酵素溶液に添加して、最終濃度を０．１％ｗ／ｖにする。溶液を、１０ｍＬの充填体積を有する複数の１５ｃｃバイアルに分割する。混合モードＥＬＳＤによるＰＳ２０濃度およびＨＩＡＣによる肉眼で見える粒子を、時間０およびその後３０分ごとに合計１８０分間測定する。
【0195】
上記の分析のいずれにおいても、本明細書の開示によるＰＳ２０組成物は、例えば、より広範な薬局方の基準（例えば、上記の表Ａを参照されたい）を満たすが、本明細書に開示される仕様（「基準ＰＳ２０」）を満たさないＰＳ２０組成物と比較され得る。修飾ＨＰ ＰＳ２０は、本開示によるＰＳ２０組成物の一例である。ＨＰ ＰＳ２０は、標準ＰＳ２０の一例である。
【0196】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＳ２０組成物またはＰＳ２０組成物を含有する製剤において、脂肪酸エステルの分解は、他の点では含有量および保存条件が同一であるが標準ポリソルベート２０組成物を含む組成物または製剤中の遊離脂肪酸粒子形成と比較して、遊離脂肪酸粒子の形成が遅延する。
【0197】
いくつかの実施形態では、ＰＳ２０を含む製剤が提供され、この製剤は、標準ポリソルベート２０組成物を含むが他の点では含有量が同一であり、同じ貯蔵条件に供される製剤と比較した場合、脂肪酸エステルの分解に起因する遊離脂肪酸粒子がより少ない。
【0198】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される製剤は、高次エステル（ＨＯＥ）分解医薬品をさらに含む。ＨＯＥ分解医薬品を含むいくつかの実施形態では、特許請求の範囲に記載のＰＳ２０組成物を使用する場合、遊離脂肪酸粒子の形成が観察される前に、他の点では同一の含有量を有し、同じ貯蔵条件下である標準ポリソルベート２０組成物を含むＨＯＥ分解医薬品におけるよりも最大１０％多くのエステル化脂肪酸が遊離脂肪酸に分解され得る。ＨＯＥ分解医薬品は、ポリソルベートエステル分布アッセイを使用して同定されるように、ＰＳ２０のＨＯＥピーク面積を経時的に減少させる製剤である。
【0199】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＳ２０組成物またはＰＳ２０組成物を含有する製剤において、遊離脂肪酸の金属核生成によって生成される粒子の数は、標準ポリソルベート２０の組成物または他の点では含有量および貯蔵条件が同一である標準ポリソルベート２０組成物を含む製剤における遊離脂肪酸の金属核生成によって生成される粒子の数よりも少ない。
【0200】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＳ２０組成物またはＰＳ２０組成物を含有する製剤は、標準ポリソルベート２０の組成物または他の点では含有量および貯蔵条件が同一である標準ポリソルベート２０組成物を含む製剤における遊離脂肪酸の金属核生成によって生成される粒子の数よりも、遊離脂肪酸の金属核生成によって生成される粒子が少ない。
Ｅ．キット
本発明の別の実施形態では、ポリソルベート分解を低減するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＳ２０組成物のいずれかを含むキットが提供される。一実施形態では、そのようなキットは、本明細書で提供される少なくとも１つのＰＳ２０組成物、薬物、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤、ならびに本明細書で提供される薬学的に許容される製剤を調製するための説明書を含む。
Ｅ．キット
本発明の別の実施形態では、ポリソルベート分解を低減するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＳ２０組成物のいずれかを含むキットが提供される。一実施形態では、そのようなキットは、本明細書で提供される少なくとも１つのＰＳ２０組成物、薬物、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤、ならびに本明細書で提供される薬学的に許容される製剤を調製するための説明書を含む。
【0201】
Ｆ．モデル
ＰＳ２０の４つのＰＯＥ鎖の各々を脂肪酸でエステル化して、混合物中のＰＳ２０のモノエステルおよび高次エステル（ＨＯＥ）（ジ－、トリ－および最大テトラエステル）バージョンを得ることが可能である。高次エステル（ＨＯＥ）ＰＳ２０種は、脂肪酸エステルの任意の組み合わせを有し得る。１分子当たり１種類の脂肪酸エステルに限定されない。各ソルビタン環は、約２０モル当量でエトキシル化される。さらに、ＰＳ２０頭部基はソルビタン環またはイソソルビド環のいずれかであってもよく、後者は脂肪酸１４、３０、３１でエステル化され得る２本のＰＯＥ鎖のみをもたらす。
ＰＳ２０の４つのＰＯＥ鎖の各々を脂肪酸でエステル化して、混合物中のＰＳ２０のモノエステルおよび高次エステル（ＨＯＥ）（ジ－、トリ－および最大テトラエステル）バージョンを得ることが可能である。高次エステル（ＨＯＥ）ＰＳ２０種は、脂肪酸エステルの任意の組み合わせを有し得る。１分子当たり１種類の脂肪酸エステルに限定されない。各ソルビタン環は、約２０モル当量でエトキシル化される。さらに、ＰＳ２０頭部基はソルビタン環またはイソソルビド環のいずれかであってもよく、後者は脂肪酸１４、３０、３１でエステル化され得る２本のＰＯＥ鎖のみをもたらす。
【0202】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、より低濃度の高次エステルを含むＰＳ２０組成物は、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の形成に対して感受性が高い可能性がある。脂肪酸エステルの分解は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の形成をもたらす。より高次のエステルは、ＰＳ２０を含む製剤中のＦＦＡの溶解を促進し得る。
【0203】
一態様では、本開示はまた、例えば、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）を含む組成物中の遊離脂肪酸粒子の形成を予測するために使用し得る方法を提供する。そのような方法は、例えば、
ａ．組成物のｐＨを測定し；
ｂ．組成物中のＰＳ２０濃度を測定し；
ｃ．ＰＳ２０の全ピーク面積分率に対する高次エステルを測定し；
ｄ．以下の式を使用して組成物中の遊離脂肪酸エステルの溶解度を計算することを含む。
（式中、β１は非イオン化脂肪酸の溶解度であり、β２は実験的に決定されたｐＫａであり、［ＰＳ２０］は組成物中のＰＳ２０濃度であり、ＨＯＥはＰＳ２０の総ピーク面積に対する高次エステル分率である。
ａ．組成物のｐＨを測定し；
ｂ．組成物中のＰＳ２０濃度を測定し；
ｃ．ＰＳ２０の全ピーク面積分率に対する高次エステルを測定し；
ｄ．以下の式を使用して組成物中の遊離脂肪酸エステルの溶解度を計算することを含む。
【0204】
本発明は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。本明細書に記載の実施例および実施態様が例示のみを目的とするものであり、それを考慮に入れた様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることは理解されよう。
【実施例】
【0205】
実施例１．ＰＳ２０組成物の特徴付けおよび試験
以下の実験により、遊離脂肪酸の形成に対する、以下の２種類のＰＳ２０組成物の感受性を比較した：標準薬局方仕様を満たす標準ＰＳ２０である１ロットのＨＰ ＰＳ２０；、本明細書に記載のより狭い仕様セットを満たすＰＳ２０組成物である３ロットの修飾ＨＰ ＰＳ２０。以下の表１および図１を参照されたい。実験には、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および関連ＦＦＡ粒子の形成のためのＰＳ２０組成物を含む試験配合物が含まれていた。
以下の実験により、遊離脂肪酸の形成に対する、以下の２種類のＰＳ２０組成物の感受性を比較した：標準薬局方仕様を満たす標準ＰＳ２０である１ロットのＨＰ ＰＳ２０；、本明細書に記載のより狭い仕様セットを満たすＰＳ２０組成物である３ロットの修飾ＨＰ ＰＳ２０。以下の表１および図１を参照されたい。実験には、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および関連ＦＦＡ粒子の形成のためのＰＳ２０組成物を含む試験配合物が含まれていた。
【0206】
Ａ．材料および方法
試薬および材料
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈＩｎｃ．（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）から入手したＣＨＯ由来モノクローナル抗体である。ＭＡｂ－ＢおよびＣはＩｇＧ１サブクラスのものであり、一方、ｍＡｂ－ＤはＩｇＧ４サブクラスのものである。ｍＡｂを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含む一連のクロマトグラフィー工程によって精製した。ＭＡｂ－ＡおよびＢは、低イオン強度ヒスチジン塩酸塩緩衝液中で３０ｍｇ／ｍＬで製剤化され、一方、ｍＡｂ－ＣおよびＤは、特に明記しない限り、界面活性剤または他の賦形剤を含まない高イオン強度アルギニンコハク酸緩衝液中でそれぞれ１５０および１８０ｍｇ／ｍＬで製剤化された。ｍＡｂ製剤のｐＨは５．５～６．０の範囲であった。Ｔｗｅｅｎ（商標）２０高純度（ＨＰ ＰＳ２０）およびＴｗｅｅｎ（商標）２０修飾高純度（修飾ＨＰ ＰＳ２０）は、Ｃｒｏｄａ（エジソン、ニュージャージー州）から購入した。Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－アルギニンおよびヒスチジン塩酸塩はＡｊｉｎｏｍｏｔｏ（ローリー、ノースカロライナ州）から入手した。酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび氷酢酸はＪＴ Ｂａｋｅｒ（フィリップスバーグ、ニュージャージー州）から購入した。ダンシル－Ｌ－メチオニンシクロヘキシルアンモニウム塩は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダラス、テキサス州）から購入した。酵素ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（ＭＭＬ）、カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（ＣＡＬ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（ＰＣＬ）およびカンジダ・アンタルクティカリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）、ならびにＬ－メチオニン、塩化アルミニウム六水和物およびグルタルアルデヒドは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＨＡ４０３／Ｍビーズは、ＲｅｓｉｎｄｉｏｎＳ．ｒ．ｌ．（ビナスコ、イタリア）から入手した。Ｅｌｇａ ＰＵＲＥＬＡＢ（登録商標）（ウッドリッジ、イリノイ州）システムからの超純水を水溶液の調製に使用した。安定性試験で使用した種々のサイズのホウケイ酸ガラスバイアルは、Ｓｃｈｏｔｔ ＡＧ（マインツ、ドイツ）から、Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）からの対応するサイズのＤａｉｋｙｏ Ｄ７７７－１ストッパーと共に購入した。種々のサイズのポリエチレンテレフタレートコポリエステル（ＰＥＴＧ）スクリュートップバイアルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム、マサチューセッツ州）から購入した。
試薬および材料
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈＩｎｃ．（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）から入手したＣＨＯ由来モノクローナル抗体である。ＭＡｂ－ＢおよびＣはＩｇＧ１サブクラスのものであり、一方、ｍＡｂ－ＤはＩｇＧ４サブクラスのものである。ｍＡｂを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含む一連のクロマトグラフィー工程によって精製した。ＭＡｂ－ＡおよびＢは、低イオン強度ヒスチジン塩酸塩緩衝液中で３０ｍｇ／ｍＬで製剤化され、一方、ｍＡｂ－ＣおよびＤは、特に明記しない限り、界面活性剤または他の賦形剤を含まない高イオン強度アルギニンコハク酸緩衝液中でそれぞれ１５０および１８０ｍｇ／ｍＬで製剤化された。ｍＡｂ製剤のｐＨは５．５～６．０の範囲であった。Ｔｗｅｅｎ（商標）２０高純度（ＨＰ ＰＳ２０）およびＴｗｅｅｎ（商標）２０修飾高純度（修飾ＨＰ ＰＳ２０）は、Ｃｒｏｄａ（エジソン、ニュージャージー州）から購入した。Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－アルギニンおよびヒスチジン塩酸塩はＡｊｉｎｏｍｏｔｏ（ローリー、ノースカロライナ州）から入手した。酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび氷酢酸はＪＴ Ｂａｋｅｒ（フィリップスバーグ、ニュージャージー州）から購入した。ダンシル－Ｌ－メチオニンシクロヘキシルアンモニウム塩は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダラス、テキサス州）から購入した。酵素ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（ＭＭＬ）、カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（ＣＡＬ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（ＰＣＬ）およびカンジダ・アンタルクティカリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）、ならびにＬ－メチオニン、塩化アルミニウム六水和物およびグルタルアルデヒドは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＨＡ４０３／Ｍビーズは、ＲｅｓｉｎｄｉｏｎＳ．ｒ．ｌ．（ビナスコ、イタリア）から入手した。Ｅｌｇａ ＰＵＲＥＬＡＢ（登録商標）（ウッドリッジ、イリノイ州）システムからの超純水を水溶液の調製に使用した。安定性試験で使用した種々のサイズのホウケイ酸ガラスバイアルは、Ｓｃｈｏｔｔ ＡＧ（マインツ、ドイツ）から、Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）からの対応するサイズのＤａｉｋｙｏ Ｄ７７７－１ストッパーと共に購入した。種々のサイズのポリエチレンテレフタレートコポリエステル（ＰＥＴＧ）スクリュートップバイアルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム、マサチューセッツ州）から購入した。
【0207】
Ｂ．アッセイ
ポリソルベート２０濃度
ＰＳ２０は、Ｈｅｗｉｔｔら（１）に記載の方法から適合させた蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えた混合モード高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量した。使用した装置パラメータ、カラム、勾配および移動相は、本発明者らの以前の試験（２）に記載されたものと同一であった。
ポリソルベート２０濃度
ＰＳ２０は、Ｈｅｗｉｔｔら（１）に記載の方法から適合させた蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えた混合モード高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量した。使用した装置パラメータ、カラム、勾配および移動相は、本発明者らの以前の試験（２）に記載されたものと同一であった。
【0208】
ポリソルベート２０のエステル分布
タンパク質を含有するサンプル中のＰＳ２０エステル分布を、Ｌｉら（３）によって使用されたものと同様の二次元液体クロマトグラフィー（２ＤＬＣ）システム設定を使用して評価した。Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ２ＤＬＣシステムを、３５ｐｓｉの窒素圧力で作動するＣｏｒｏｎａＵｌｔｒａ帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）と連結した。混合モード法（一次元目）を使用して逆相法（二次元目）と組み合わせてタンパク質を除去し、ＰＳ２０エステルの組成を試験した。混合モードカラムから溶出したＰＳ２０エステルを５００μＬのステンレス鋼ループに捕捉し、次いでエステル亜種のさらなる分離のために二次元に送った。一次元はＯａｓｉｓ ＭＡＸカラム（２０ｍｍ×２．１ｍｍ、３０μｍ）を使用し、二次元はＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ）を使用した。一次元に使用した移動相ＡおよびＢは、それぞれ２％酢酸水溶液およびアセトニトリル中２％酢酸であった。一次元の勾配は以下の通りであった：０～１分、２％Ｂ；１～１．１分、２～２０％Ｂ；１．１～５分、２０％Ｂ；５～５．１分、２０～９０％Ｂ；５．１～９分、９０％Ｂ；９－９．１分、９０～２％Ｂ；９．１～１３分、２％Ｂ。二次元に使用した移動相ＡおよびＢは、それぞれ水および８０／２０（ｖ／ｖ）アセトニトリル／イソプロパノールであった。二次元の勾配は以下の通りであった：０～２．４分、５．０％Ｂ；２．４～２．５分、５～４５％Ｂ；２．５～２０分、４５～１００％Ｂ；２０～２５分、１００％Ｂ；２５～２５．１分、１００～５％Ｂ；２５．１～３０分、５％Ｂ。
タンパク質を含有するサンプル中のＰＳ２０エステル分布を、Ｌｉら（３）によって使用されたものと同様の二次元液体クロマトグラフィー（２ＤＬＣ）システム設定を使用して評価した。Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ２ＤＬＣシステムを、３５ｐｓｉの窒素圧力で作動するＣｏｒｏｎａＵｌｔｒａ帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）と連結した。混合モード法（一次元目）を使用して逆相法（二次元目）と組み合わせてタンパク質を除去し、ＰＳ２０エステルの組成を試験した。混合モードカラムから溶出したＰＳ２０エステルを５００μＬのステンレス鋼ループに捕捉し、次いでエステル亜種のさらなる分離のために二次元に送った。一次元はＯａｓｉｓ ＭＡＸカラム（２０ｍｍ×２．１ｍｍ、３０μｍ）を使用し、二次元はＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ）を使用した。一次元に使用した移動相ＡおよびＢは、それぞれ２％酢酸水溶液およびアセトニトリル中２％酢酸であった。一次元の勾配は以下の通りであった：０～１分、２％Ｂ；１～１．１分、２～２０％Ｂ；１．１～５分、２０％Ｂ；５～５．１分、２０～９０％Ｂ；５．１～９分、９０％Ｂ；９－９．１分、９０～２％Ｂ；９．１～１３分、２％Ｂ。二次元に使用した移動相ＡおよびＢは、それぞれ水および８０／２０（ｖ／ｖ）アセトニトリル／イソプロパノールであった。二次元の勾配は以下の通りであった：０～２．４分、５．０％Ｂ；２．４～２．５分、５～４５％Ｂ；２．５～２０分、４５～１００％Ｂ；２０～２５分、１００％Ｂ；２５～２５．１分、１００～５％Ｂ；２５．１～３０分、５％Ｂ。
【0209】
タンパク質を含まないサンプル中のＰＳ２０エステル分布を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｏｒｏｎａ Ｕｌｔｒａ ＣＡＤを備えた一次元Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）Ｈ－クラスシステムを用いた逆相クロマトグラフィーによって評価した。カラム、勾配および移動相は、上記の２ＤＬＣ ＣＡＤ法の二次元に使用したものと同一であった。
遊離脂肪酸の定量
総（可溶性＋不溶性画分）遊離脂肪酸
遊離脂肪酸の定量
総（可溶性＋不溶性画分）遊離脂肪酸
【0210】
Ｈｏｎｅｍａｎｎら（５）に記載されているように、質量検出器に連結された逆相クロマトグラフィー法を使用して、ＤＰおよびＰＳ２０原料中の総ＦＦＡを検出した。簡潔に説明すると、８０：２０アセトン：メタノールに溶解した１μｇ／ｍＬの標識ＦＦＡ内部標準を含む２００μＬの沈殿溶液を５０μＬのサンプルに添加した。サンプルを室温で１時間インキュベートし、続いて１５，０００×ｇで１５分間、２５℃で２回遠心分離した。１００μＬの上清を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）バイアルに分注した。タンパク質の有無にかかわらず、サンプル中のＦＦＡレベルを分析する場合にも同様の手順を使用した。分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ｑｄａ（商標）質量分析計に連結されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＨＰＬＣで行った。カラム、移動相、勾配およびＭＳ装置の設定は、Ｈｏｎｅｍａｎｎら（５）によって記載されたものに基づいた。各ＦＦＡのモノアイソトピックピークおよびアイソトピックピークの両方を合計し、定量のためにそれぞれの内部標準と比較した。ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸を定量した。
【0211】
不溶性画分中の遊離脂肪酸
ＤＰで観察された粒子のＦＦＡ分布を分析するために、粒子を濾過によって単離し、再懸濁し、逆相質量分析によって分析した。内径（ＩＤ）１０ｍｍのガラス漏斗を利用して、孔径０．８μｍの金コーティングポリカーボネートフィルターで濾過を行った。２．０ｍＬの氷冷サンプルを漏斗に添加し、４００トルの穏やかな真空圧力を加えた。均質性を確保するためにサンプリング前にサンプルを旋回させた。各フィルター上に単離した粒子を、分析のために直ちに５００μＬのメタノールに再懸濁した。製剤緩衝液対照も各ＤＰに含めた。各サンプルおよび対照を二重濾過で試験した。次いで、「総ＦＦＡ」定量化セクションに記載されたものと同じ勾配およびＬＣ－ＭＳ条件を使用してサンプルを適切に分析したが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸の外部標準曲線に対して定量した。緩衝液対照のＦＦＡレベルを、対応するＤＰサンプルのＦＦＡレベルから差し引いた。
ＤＰで観察された粒子のＦＦＡ分布を分析するために、粒子を濾過によって単離し、再懸濁し、逆相質量分析によって分析した。内径（ＩＤ）１０ｍｍのガラス漏斗を利用して、孔径０．８μｍの金コーティングポリカーボネートフィルターで濾過を行った。２．０ｍＬの氷冷サンプルを漏斗に添加し、４００トルの穏やかな真空圧力を加えた。均質性を確保するためにサンプリング前にサンプルを旋回させた。各フィルター上に単離した粒子を、分析のために直ちに５００μＬのメタノールに再懸濁した。製剤緩衝液対照も各ＤＰに含めた。各サンプルおよび対照を二重濾過で試験した。次いで、「総ＦＦＡ」定量化セクションに記載されたものと同じ勾配およびＬＣ－ＭＳ条件を使用してサンプルを適切に分析したが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸の外部標準曲線に対して定量した。緩衝液対照のＦＦＡレベルを、対応するＤＰサンプルのＦＦＡレベルから差し引いた。
【0212】
目視検査
目視検査は、ＵＳＰ＜７９０＞（８）およびＰｈ．Ｅｕｒに従って、検査点で２０００ルクス～３７５０ルクスの白色蛍光を使用して、黒色背景および白色背景に対して行った。２．９．２０（９）。バイアルを穏やかに旋回させ、各バックグラウンドに対して約５秒間検査した。２人の無関係の分析者が肉眼で見える粒子を観察したとき、陽性結果が記録された。
目視検査は、ＵＳＰ＜７９０＞（８）およびＰｈ．Ｅｕｒに従って、検査点で２０００ルクス～３７５０ルクスの白色蛍光を使用して、黒色背景および白色背景に対して行った。２．９．２０（９）。バイアルを穏やかに旋回させ、各バックグラウンドに対して約５秒間検査した。２人の無関係の分析者が肉眼で見える粒子を観察したとき、陽性結果が記録された。
【0213】
強化された目視検査
Ｂｏｓｃｈ（登録商標）卓上型ＡＰＫ－５１型を用いて、光強度および拡大率を高めて目視検査を行った。バイアルを回転させた後、１０倍の高解像度カメラおよび底部ＬＥＤライトを使用して目視検査を行った。２人の無関係の分析者が粒子を観察したとき、陽性結果が記録された。
Ｂｏｓｃｈ（登録商標）卓上型ＡＰＫ－５１型を用いて、光強度および拡大率を高めて目視検査を行った。バイアルを回転させた後、１０倍の高解像度カメラおよび底部ＬＥＤライトを使用して目視検査を行った。２人の無関係の分析者が粒子を観察したとき、陽性結果が記録された。
【0214】
光遮蔽による肉眼で見えない粒子
Ｈａｃｈから入手した３０００ＡサンプラーおよびＨＲＬＤ－１５０センサを備えたＨＩＡＣ９７０３＋液体粒子計数システムを使用した光遮蔽によって、累積的な肉眼で見えない粒子を計数した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した５μｍポリスチレンＣｏｕｎｔ－ＣＡＬビーズ標準を使用して、装置の性能を検証した。実験サンプル中の、２μｍ以上、５μｍ以上、１０μｍ以上、および２５μｍ以上の累積的な肉眼で見えない粒子数を測定した。４つの１ ｍＬアリコートを各測定のためにサンプリングし、最後の３つのアリコートの結果を最初の１つを廃棄した後に平均した。
Ｈａｃｈから入手した３０００ＡサンプラーおよびＨＲＬＤ－１５０センサを備えたＨＩＡＣ９７０３＋液体粒子計数システムを使用した光遮蔽によって、累積的な肉眼で見えない粒子を計数した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した５μｍポリスチレンＣｏｕｎｔ－ＣＡＬビーズ標準を使用して、装置の性能を検証した。実験サンプル中の、２μｍ以上、５μｍ以上、１０μｍ以上、および２５μｍ以上の累積的な肉眼で見えない粒子数を測定した。４つの１ ｍＬアリコートを各測定のためにサンプリングし、最後の３つのアリコートの結果を最初の１つを廃棄した後に平均した。
【0215】
フローイメージング顕微鏡法による、肉眼で見えない粒子
フローイメージング顕微鏡法によって、累積的な肉眼で見えない粒子数および形態を測定した。測定は、Ｆｌｕｉｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した１０倍対物レンズ、８０×７００μｍフローセル、および１ｍＬシリンジポンプを備えたＦｌｏｗＣａｍ（登録商標）８１００システムを使用して実施した。各測定のために、７００ｕＬのサンプルを２００ｕＬ／分の流量でフローセルを通してポンプ輸送した。捕捉された画像は、粒子分類のためのガイドとしてＳｉｓｋａら（６）およびＷｅｒｋら（７）による以前の試験を使用して、サイズおよび形態に基づいて粒子タイプ（ＦＦＡ、シリコーン油、タンパク質性、気泡、または種々雑多）によって分類された。気泡として分類された全ての画像を分析から除外した。
フローイメージング顕微鏡法によって、累積的な肉眼で見えない粒子数および形態を測定した。測定は、Ｆｌｕｉｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した１０倍対物レンズ、８０×７００μｍフローセル、および１ｍＬシリンジポンプを備えたＦｌｏｗＣａｍ（登録商標）８１００システムを使用して実施した。各測定のために、７００ｕＬのサンプルを２００ｕＬ／分の流量でフローセルを通してポンプ輸送した。捕捉された画像は、粒子分類のためのガイドとしてＳｉｓｋａら（６）およびＷｅｒｋら（７）による以前の試験を使用して、サイズおよび形態に基づいて粒子タイプ（ＦＦＡ、シリコーン油、タンパク質性、気泡、または種々雑多）によって分類された。気泡として分類された全ての画像を分析から除外した。
【0216】
可溶性モノクローナル抗体の凝集
可溶性ｍＡｂ凝集を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＨＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＢｉｏシステムでＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ ３０００カラム、２μｍ、４．６ｍｍ×３００ｍｍを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、全ての高分子量形態（ＨＭＷＦ）の総和％として定量した。サンプルを室温で０．２Ｍリン酸カリウム、０．２５Ｍ塩化カリウム、およびｐＨ ６．２で０．３ｍＬ／分の定組成流量で溶出した。溶出ピークを紫外線（ＵＶ）ダイオードアレイ検出器によって２８０ｎｍでモニターした。
可溶性ｍＡｂ凝集を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＨＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＢｉｏシステムでＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ ３０００カラム、２μｍ、４．６ｍｍ×３００ｍｍを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、全ての高分子量形態（ＨＭＷＦ）の総和％として定量した。サンプルを室温で０．２Ｍリン酸カリウム、０．２５Ｍ塩化カリウム、およびｐＨ ６．２で０．３ｍＬ／分の定組成流量で溶出した。溶出ピークを紫外線（ＵＶ）ダイオードアレイ検出器によって２８０ｎｍでモニターした。
【0217】
ＩＣＰ－ＭＳによる金属分析
誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によってＰＳ２０原料中の微量金属を定量した。ＨＰ ＰＳ２０および修飾ＨＰ ＰＳ２０を、ＰＳ２０の酸性加水分解を回避するために分析の直前に５％硝酸で１０％（ｗ／ｖ）に希釈した。測定は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＸシリーズＩＩ ＩＣＰ－ＭＳ装置を用いて行った。少量の各サンプルをアルゴンプラズマトーチを使用してその元素成分に解離させ、これによりサンプルをイオン化元素成分に解離させ、続いて従来の質量分析を使用して質量によって同定する。使用されるＩＣＰ－ＭＳ法の検出範囲は、１～１００ｐｐｂにサンプル希釈係数を乗じたものである。
誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によってＰＳ２０原料中の微量金属を定量した。ＨＰ ＰＳ２０および修飾ＨＰ ＰＳ２０を、ＰＳ２０の酸性加水分解を回避するために分析の直前に５％硝酸で１０％（ｗ／ｖ）に希釈した。測定は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＸシリーズＩＩ ＩＣＰ－ＭＳ装置を用いて行った。少量の各サンプルをアルゴンプラズマトーチを使用してその元素成分に解離させ、これによりサンプルをイオン化元素成分に解離させ、続いて従来の質量分析を使用して質量によって同定する。使用されるＩＣＰ－ＭＳ法の検出範囲は、１～１００ｐｐｂにサンプル希釈係数を乗じたものである。
【0218】
粒子の同定
ＤＰの穏やかな濾過によって粒子を単離した。孔径０．８μｍの金コーティングポリカーボネートフィルターを用いて、内径４ｍｍの濾過漏斗を組み立てた。０．５ｍｌのサンプルを軽度の真空（６００トール）下でフィルタにかけることによって、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子スラリーを単離した。捕捉された粒子を０．１ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水ですすぎ、ＮｉｃｏｌｅｔｉＮ１０－ＭＸ赤外線顕微鏡を使用してＦＴ－ＩＲ顕微鏡によって分析した。単離された粒子／スラリーを含有する濾過領域全体を約５ｍｍ×５ｍｍの視野モザイクで捕捉した。長さが１００μｍを超える、肉眼で見える粒子、および１５０μｍ×１５０μｍの開口部を有する、肉眼で見えない粒子スラリー領域を識別のために選択した。特注のデータベースとの６０％スペクトル一致を使用して、粒子を同定した。
ＤＰの穏やかな濾過によって粒子を単離した。孔径０．８μｍの金コーティングポリカーボネートフィルターを用いて、内径４ｍｍの濾過漏斗を組み立てた。０．５ｍｌのサンプルを軽度の真空（６００トール）下でフィルタにかけることによって、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子スラリーを単離した。捕捉された粒子を０．１ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水ですすぎ、ＮｉｃｏｌｅｔｉＮ１０－ＭＸ赤外線顕微鏡を使用してＦＴ－ＩＲ顕微鏡によって分析した。単離された粒子／スラリーを含有する濾過領域全体を約５ｍｍ×５ｍｍの視野モザイクで捕捉した。長さが１００μｍを超える、肉眼で見える粒子、および１５０μｍ×１５０μｍの開口部を有する、肉眼で見えない粒子スラリー領域を識別のために選択した。特注のデータベースとの６０％スペクトル一致を使用して、粒子を同定した。
【0219】
Ｃ．試験設計
非固定化酵素を用いたＰＳ２０分解
修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１、２および３ならびにＨＰ ＰＳ２０対照ロットをそれぞれ水中に、１０％ｗ／ｖに希釈した。酵素作業溶液は、ｐＨ５．５の低イオン強度酢酸ヒスチジン緩衝液に、非固定化ＣＡＬＢおよびＰＣＬをそれぞれ０．０１Ｕ／ｍＬおよび１２．５Ｕ／ｍＬの濃度で溶解することによって調製した。ＰＳ２０加水分解反応を開始するために、１０％ｗ／ｖのＰＳ２０ストック溶液を０．１％ｗ／ｖの最終濃度まで酵素作業溶液中に、別個に添加した。次いで、５℃でサンプルを５０ｃｃガラスバイアルに入れた。混合モードＨＰＬＣ ＥＬＳＤによるＰＳ２０濃度、および光遮蔽による肉眼で見えない粒子を、選択した５℃の時点で測定した。試験時間が短く室温平衡化できなかったため、氷冷したサンプルで肉眼で見えない粒子を測定した。ＨＰ ＰＳ２０対照ロットを分解し、それぞれの修飾ＨＰ ＰＳ２０ロットと共に分析して、日ごとの変動性を説明した。
非固定化酵素を用いたＰＳ２０分解
修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１、２および３ならびにＨＰ ＰＳ２０対照ロットをそれぞれ水中に、１０％ｗ／ｖに希釈した。酵素作業溶液は、ｐＨ５．５の低イオン強度酢酸ヒスチジン緩衝液に、非固定化ＣＡＬＢおよびＰＣＬをそれぞれ０．０１Ｕ／ｍＬおよび１２．５Ｕ／ｍＬの濃度で溶解することによって調製した。ＰＳ２０加水分解反応を開始するために、１０％ｗ／ｖのＰＳ２０ストック溶液を０．１％ｗ／ｖの最終濃度まで酵素作業溶液中に、別個に添加した。次いで、５℃でサンプルを５０ｃｃガラスバイアルに入れた。混合モードＨＰＬＣ ＥＬＳＤによるＰＳ２０濃度、および光遮蔽による肉眼で見えない粒子を、選択した５℃の時点で測定した。試験時間が短く室温平衡化できなかったため、氷冷したサンプルで肉眼で見えない粒子を測定した。ＨＰ ＰＳ２０対照ロットを分解し、それぞれの修飾ＨＰ ＰＳ２０ロットと共に分析して、日ごとの変動性を説明した。
【0220】
製剤中のＰＳ２０分解
低イオン強度ｍＡｂ－Ｂ製剤を、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１、２および３ならびにＨＰ ＰＳ２０対照ロットで別個にスパイクして、０．０２％ｗ／ｖの最終濃度にした。高イオン強度ｍＡｂ－ＣおよびｍＡｂ－Ｄ製剤を、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１およびＨＰ ＰＳ２０対照ロットのみでスパイクして、０．０２％ｗ／ｖの最終濃度にした。ＰＳ２０の酸化分解を最小限に抑えるために、メチオニンを抗酸化剤として全ての製剤に１０ｍＭで添加した。５ｍＬ容量の各製剤を６ｃｃのガラスバイアルに充填し、５℃で１２週間安定させた。各製剤の５つの専用バイアルを、黒色および白色の背景の下での目視検査および増大した光強度および１０倍の倍率の下での増強された目視検査によって、肉眼で見える粒子の存在について毎週繰り返しモニターした。肉眼で見えない粒子についても、フローイメージング顕微鏡法によって毎週モニターした。サンプルを、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の測定の前に室温に平衡化した。ＬＣ－ＭＳによる不溶性画分のＦＴ－ＩＲおよびＦＦＡ濃度測定による粒子同定を、５℃で１４週間後に各製剤について行った。各製剤の材料を追加で毎週抜き取り、－７０℃で凍結させた。凍結アリコートを解凍し、全ての条件および時点について、混合モードＨＰＬＣ ＥＬＳＤによるＰＳ２０濃度、逆相ＵＨＰＬＣ ＣＡＤによるＰＳ２０エステル分布およびＬＣ－ＭＳによる総（不溶性および可溶性画分）ＦＦＡ濃度測定について試験した。
低イオン強度ｍＡｂ－Ｂ製剤を、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１、２および３ならびにＨＰ ＰＳ２０対照ロットで別個にスパイクして、０．０２％ｗ／ｖの最終濃度にした。高イオン強度ｍＡｂ－ＣおよびｍＡｂ－Ｄ製剤を、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１およびＨＰ ＰＳ２０対照ロットのみでスパイクして、０．０２％ｗ／ｖの最終濃度にした。ＰＳ２０の酸化分解を最小限に抑えるために、メチオニンを抗酸化剤として全ての製剤に１０ｍＭで添加した。５ｍＬ容量の各製剤を６ｃｃのガラスバイアルに充填し、５℃で１２週間安定させた。各製剤の５つの専用バイアルを、黒色および白色の背景の下での目視検査および増大した光強度および１０倍の倍率の下での増強された目視検査によって、肉眼で見える粒子の存在について毎週繰り返しモニターした。肉眼で見えない粒子についても、フローイメージング顕微鏡法によって毎週モニターした。サンプルを、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の測定の前に室温に平衡化した。ＬＣ－ＭＳによる不溶性画分のＦＴ－ＩＲおよびＦＦＡ濃度測定による粒子同定を、５℃で１４週間後に各製剤について行った。各製剤の材料を追加で毎週抜き取り、－７０℃で凍結させた。凍結アリコートを解凍し、全ての条件および時点について、混合モードＨＰＬＣ ＥＬＳＤによるＰＳ２０濃度、逆相ＵＨＰＬＣ ＣＡＤによるＰＳ２０エステル分布およびＬＣ－ＭＳによる総（不溶性および可溶性画分）ＦＦＡ濃度測定について試験した。
【0221】
遊離脂肪酸の金属核生成
酵素ムコール・ミエヘイのリパーゼ（ＭＭＬ）およびカンジダ・アンタルクティカのリパーゼ（ＣＡＬ）を、Ｇｒａｆら（１０）に記載の手順に基づいてＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＨＡ４０３／Ｍビーズに固定化した。修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１～３およびＨＰ ＰＳ２０対照ロットのストック溶液（水中５％ｗ／ｖ）は、各酵素を使用して部分的に１０％が分解した（混合モードＥＬＳＤによって確認）。部分的に分解したＰＳ２０ストック溶液を、０～２５０ｐｐｂのアルミニウム（Ａｌ）を含むｐＨ５．５の低イオン強度酢酸ヒスチジン緩衝液に、公称０．０４％ｗ／ｖのＰＳ２０濃度（０．０３６％ｗ／ｖの非分解ＰＳ２０および０．００４％ｗ／ｖの分解ＰＳ２０）まで別々にスパイクした。バイアルを５℃で保存し、最大２１日間の光遮蔽を使用して、白黒の背景および肉眼で見えない粒子の下での目視検査によって、肉眼で見える粒子の形成について評価した。目視検査の前に、バイアルを室温に少なくとも４時間平衡化させた。肉眼で見えない粒子については、粒子数の初期変化を捕捉するために冷却サンプル溶液を使用して測定を行った。非分解ＰＳ２０を含有するサンプルを対照として含めた。
酵素ムコール・ミエヘイのリパーゼ（ＭＭＬ）およびカンジダ・アンタルクティカのリパーゼ（ＣＡＬ）を、Ｇｒａｆら（１０）に記載の手順に基づいてＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＨＡ４０３／Ｍビーズに固定化した。修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１～３およびＨＰ ＰＳ２０対照ロットのストック溶液（水中５％ｗ／ｖ）は、各酵素を使用して部分的に１０％が分解した（混合モードＥＬＳＤによって確認）。部分的に分解したＰＳ２０ストック溶液を、０～２５０ｐｐｂのアルミニウム（Ａｌ）を含むｐＨ５．５の低イオン強度酢酸ヒスチジン緩衝液に、公称０．０４％ｗ／ｖのＰＳ２０濃度（０．０３６％ｗ／ｖの非分解ＰＳ２０および０．００４％ｗ／ｖの分解ＰＳ２０）まで別々にスパイクした。バイアルを５℃で保存し、最大２１日間の光遮蔽を使用して、白黒の背景および肉眼で見えない粒子の下での目視検査によって、肉眼で見える粒子の形成について評価した。目視検査の前に、バイアルを室温に少なくとも４時間平衡化させた。肉眼で見えない粒子については、粒子数の初期変化を捕捉するために冷却サンプル溶液を使用して測定を行った。非分解ＰＳ２０を含有するサンプルを対照として含めた。
【0222】
Ｄ．結果および考察
分析的および機能的比較可能性を評価するために、３ロットの修飾ＨＰ ＰＳ２０および１ロットのＨＰ ＰＳ２０（対照）を並列試験で評価した。外部金属核生成因子の存在下および非存在下でＰＳ２０加水分解試験および金属核生成試験を行うことによって、ポリソルベートについて、ＦＦＡ粒子レベルを互いに対して比較した。
分析的および機能的比較可能性を評価するために、３ロットの修飾ＨＰ ＰＳ２０および１ロットのＨＰ ＰＳ２０（対照）を並列試験で評価した。外部金属核生成因子の存在下および非存在下でＰＳ２０加水分解試験および金属核生成試験を行うことによって、ポリソルベートについて、ＦＦＡ粒子レベルを互いに対して比較した。
【0223】
表１に示すように、３ロットの修飾ＨＰ ＰＳ２０は、ＨＰ ＰＳ２０と比較して、ステアリン酸エステル、パルミチン酸エステルおよびミリスチン酸エステルのレベルは低かった。例えば、ＨＰ ＰＳ２０対照ロットは、３ロットの修飾ＨＰ ＰＳ２０の０～０．１、８．８～９．７、および１５．９～１６．９と比較して、それぞれ６、１２、および１８％で比較的高レベルのステアリン酸エステル、パルミチン酸エステル、およびミリスチン酸エステルを含んでいた。
【表1】
【0224】
高次エステル画分
高次エステル（ＨＯＥ）画分は、酵素分解速度、ＦＦＡ可溶化能および表面活性に影響を及ぼし得るＰＳ２０の属性である。ＤＰ製剤中に存在するヒドロラーゼは、ＰＳ２０のモノエステルおよびＨＯＥに対して様々な特異性を有し得る。Ｚｈａｎｇら（４）によって使用されたＤＰのようにモノエステルを優先的に分解するものもあれば、Ｌｉら（３）によって使用されたＤＰのようにＨＯＥを標的とするものもある。ＨＯＥ画分の変化は、観察された分解の特異性に応じて、ＤＰのＰＳ２０分解速度に影響を及ぼし得る。例えば、ＨＯＥ画分の増加は、加水分解酵素によって切断される基質の開始レベルが高いため、ＨＯＥ分解ＤＰにおけるＰＳ２０分解速度を増加させ得る。分解速度に加えて、ＨＯＥ分率はＰＳ２０（２）のＦＦＡ可溶化能に直接影響する。ＰＳ２０のＨＯＥは、同量のモノエステルよりもＦＦＡを良好に可溶化する。修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１、２および３のＨＯＥピーク面積分率は、ＨＰ ＰＳ２０の４％以内であった。例えば、Ｄｏｓｈｉら（１１）で使用されたＨＰ ＰＳ２０ロットは、ＨＯＥピーク面積分率が４２％であったのに対して、Ｆｉｓｈら（１２）で使用されたロットは３６％であった。以前に公開されたＦＦＡ溶解度モデルは、５％未満のＨＯＥピーク面積分率の差が、ＦＦＡ溶解度において、ごくわずかの変化（３％未満）をもたらすと予測している（２）。その後の実験で、ＨＯＥピーク面積割合のわずかな違いが材料特性に大きな影響を与えないことを確認した。
高次エステル（ＨＯＥ）画分は、酵素分解速度、ＦＦＡ可溶化能および表面活性に影響を及ぼし得るＰＳ２０の属性である。ＤＰ製剤中に存在するヒドロラーゼは、ＰＳ２０のモノエステルおよびＨＯＥに対して様々な特異性を有し得る。Ｚｈａｎｇら（４）によって使用されたＤＰのようにモノエステルを優先的に分解するものもあれば、Ｌｉら（３）によって使用されたＤＰのようにＨＯＥを標的とするものもある。ＨＯＥ画分の変化は、観察された分解の特異性に応じて、ＤＰのＰＳ２０分解速度に影響を及ぼし得る。例えば、ＨＯＥ画分の増加は、加水分解酵素によって切断される基質の開始レベルが高いため、ＨＯＥ分解ＤＰにおけるＰＳ２０分解速度を増加させ得る。分解速度に加えて、ＨＯＥ分率はＰＳ２０（２）のＦＦＡ可溶化能に直接影響する。ＰＳ２０のＨＯＥは、同量のモノエステルよりもＦＦＡを良好に可溶化する。修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１、２および３のＨＯＥピーク面積分率は、ＨＰ ＰＳ２０の４％以内であった。例えば、Ｄｏｓｈｉら（１１）で使用されたＨＰ ＰＳ２０ロットは、ＨＯＥピーク面積分率が４２％であったのに対して、Ｆｉｓｈら（１２）で使用されたロットは３６％であった。以前に公開されたＦＦＡ溶解度モデルは、５％未満のＨＯＥピーク面積分率の差が、ＦＦＡ溶解度において、ごくわずかの変化（３％未満）をもたらすと予測している（２）。その後の実験で、ＨＯＥピーク面積割合のわずかな違いが材料特性に大きな影響を与えないことを確認した。
【0225】
ＰＳ２０原材料中の遊離脂肪酸レベル
ＨＰ ＰＳ２０原料は、ＰＳ２０合成中にポリオキシエチレン（ＰＯＥ）鎖へのエステル化反応を受けなかった低レベルの未結合ＦＦＡを含有することが知られている。修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間の残留ＦＦＡレベルを比較することは、それらが各グレードの全体的なＦＦＡ粒子感受性に寄与し得るので重要である。ステアリン酸、ミリスチン酸およびパルミチン酸のレベルは、１％ｗ／ｖのＨＰ ＰＳ２０と比較して、１％ｗ／ｖの修飾ＨＰ ＰＳ２０では低く、ラウリン酸はそれに対応して高かった（図３Ａ）。修飾ＨＰ ＰＳ２０の合成に使用されるＦＦＡブレンドはまた、ＨＰ ＰＳ２０と比較して、長鎖ＦＦＡのレベルが低く、短鎖ＦＦＡのレベルが高かった。修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の両方について、原料からの全体的なＦＦＡの寄与は、各ＦＦＡの水溶解限界に対して低い。例えば、以前に公開されたＦＦＡ溶解度モデルは、ｐＨ５．５で０．０２％ｗ／ｖのＰＳ２０製剤中でパルミチン酸溶解度は約１ｕｇ／ｍＬであると予測されている（２）。これらの結果に基づいて、ＰＳ２０原料は、両方のポリソルベートについて同じ製剤中で約パルミチン酸に０．１ｕｇ／ｍＬ寄与している。
ＨＰ ＰＳ２０原料は、ＰＳ２０合成中にポリオキシエチレン（ＰＯＥ）鎖へのエステル化反応を受けなかった低レベルの未結合ＦＦＡを含有することが知られている。修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間の残留ＦＦＡレベルを比較することは、それらが各グレードの全体的なＦＦＡ粒子感受性に寄与し得るので重要である。ステアリン酸、ミリスチン酸およびパルミチン酸のレベルは、１％ｗ／ｖのＨＰ ＰＳ２０と比較して、１％ｗ／ｖの修飾ＨＰ ＰＳ２０では低く、ラウリン酸はそれに対応して高かった（図３Ａ）。修飾ＨＰ ＰＳ２０の合成に使用されるＦＦＡブレンドはまた、ＨＰ ＰＳ２０と比較して、長鎖ＦＦＡのレベルが低く、短鎖ＦＦＡのレベルが高かった。修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の両方について、原料からの全体的なＦＦＡの寄与は、各ＦＦＡの水溶解限界に対して低い。例えば、以前に公開されたＦＦＡ溶解度モデルは、ｐＨ５．５で０．０２％ｗ／ｖのＰＳ２０製剤中でパルミチン酸溶解度は約１ｕｇ／ｍＬであると予測されている（２）。これらの結果に基づいて、ＰＳ２０原料は、両方のポリソルベートについて同じ製剤中で約パルミチン酸に０．１ｕｇ／ｍＬ寄与している。
【0226】
ＰＳ２０原料の微量金属含有量
アルミニウム（Ａｌ３＋）のような微量金属イオンは、ＦＦＡと相互作用してＦＦＡ金属錯体を形成する可能性があり、これは錯体を形成していないＦＦＡの溶解限界未満で水性配合物から析出し得る（１３）。Ａｌ含有量は、両ポリソルベートについて１０％ｗ／ｖのＰＳ２０で６０ｐｐｂ未満であり（図３Ｂ）、これは、０．０２～０．０６％ｗ／ｖのＰＳ２０濃度を有する典型的なＤＰ配合物で０．４ｐｐｂ未満のＡｌに変換される。ＦＦＡの金属誘起核生成は、１０ｐｐｂを超えるレベルのＡｌ３＋で起こることが以前に示されている（１３）。したがって、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０原料の両方で観察された微量のＡｌは無視できると考えられ、いずれかのＰＳ２０グレードのＦＦＡ金属核生成傾向に影響を及ぼす可能性は低い。鉄（Ｆｅ３＋）、銅（Ｃｕ２＋）、クロム（Ｃｒ３＋）およびニッケル（Ｎｉ２＋）のような微量の遷移金属イオンが、ポリソルベートの自己酸化を触媒することが知られている（１４，１５，１６，１７）。１０％ｗ／ｖの修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間で、明確な傾向はなく、Ｆｅ、Ｎｉ、およびＣｒのいくらかの差が観察された（図３Ｂ）。例えば、Ｆｅレベルは、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット３で最も高く、続いてＨＰ ＰＳ２０対照ロット、次いで修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１および２であった。これらの差の有意性を理解するために、４０℃プラセボ安定性試験およびメチオニン代用（ダンシル－メチオニン）酸化試験において、修飾ＨＰ ＰＳ２０の酸化傾向をＨＰ ＰＳ２０と比較した（データは示さず）。酸化試験の結果は、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０が酸化分解に対して同様の感受性を有することを実証しており、これは、微量のＦｅ、ＮｉおよびＣｒレベルで観察された差が酸化に対する感受性に影響を及ぼすようには見えないことを示している。
アルミニウム（Ａｌ３＋）のような微量金属イオンは、ＦＦＡと相互作用してＦＦＡ金属錯体を形成する可能性があり、これは錯体を形成していないＦＦＡの溶解限界未満で水性配合物から析出し得る（１３）。Ａｌ含有量は、両ポリソルベートについて１０％ｗ／ｖのＰＳ２０で６０ｐｐｂ未満であり（図３Ｂ）、これは、０．０２～０．０６％ｗ／ｖのＰＳ２０濃度を有する典型的なＤＰ配合物で０．４ｐｐｂ未満のＡｌに変換される。ＦＦＡの金属誘起核生成は、１０ｐｐｂを超えるレベルのＡｌ３＋で起こることが以前に示されている（１３）。したがって、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０原料の両方で観察された微量のＡｌは無視できると考えられ、いずれかのＰＳ２０グレードのＦＦＡ金属核生成傾向に影響を及ぼす可能性は低い。鉄（Ｆｅ３＋）、銅（Ｃｕ２＋）、クロム（Ｃｒ３＋）およびニッケル（Ｎｉ２＋）のような微量の遷移金属イオンが、ポリソルベートの自己酸化を触媒することが知られている（１４，１５，１６，１７）。１０％ｗ／ｖの修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間で、明確な傾向はなく、Ｆｅ、Ｎｉ、およびＣｒのいくらかの差が観察された（図３Ｂ）。例えば、Ｆｅレベルは、修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット３で最も高く、続いてＨＰ ＰＳ２０対照ロット、次いで修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１および２であった。これらの差の有意性を理解するために、４０℃プラセボ安定性試験およびメチオニン代用（ダンシル－メチオニン）酸化試験において、修飾ＨＰ ＰＳ２０の酸化傾向をＨＰ ＰＳ２０と比較した（データは示さず）。酸化試験の結果は、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０が酸化分解に対して同様の感受性を有することを実証しており、これは、微量のＦｅ、ＮｉおよびＣｒレベルで観察された差が酸化に対する感受性に影響を及ぼすようには見えないことを示している。
【0227】
酵素的ＰＳ２０分解およびＦＦＡ粒子形成
外部核形成因子の非存在下で溶液中でＦＦＡ粒子を形成するリスクに関して、修飾ＨＰ ＰＳ２０がＨＰ ＰＳ２０とどのように比較するかを評価するために、ＰＳ２０を非固定化酵素によって加水分解するか、または迅速なＰＳ２０分解を伴う製剤（ＤＰ）製剤中で加水分解する２組の実験を行った。さらに、金属核生成因子の存在下でのＦＦＡ粒子リスクを評価する実験も、事前に分解させたＰＳ２０を用いて行った；本試験では、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の両方が固定化酵素によって分解された。
外部核形成因子の非存在下で溶液中でＦＦＡ粒子を形成するリスクに関して、修飾ＨＰ ＰＳ２０がＨＰ ＰＳ２０とどのように比較するかを評価するために、ＰＳ２０を非固定化酵素によって加水分解するか、または迅速なＰＳ２０分解を伴う製剤（ＤＰ）製剤中で加水分解する２組の実験を行った。さらに、金属核生成因子の存在下でのＦＦＡ粒子リスクを評価する実験も、事前に分解させたＰＳ２０を用いて行った；本試験では、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の両方が固定化酵素によって分解された。
【0228】
非固定化酵素を用いたＰＳ２０分解
市販の非固定化カルボン酸エステルヒドロラーゼカンジダ・アンタルクティカのリパーゼ（ＣＡＬＢ）およびポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）を使用して、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０を人工的に加水分解した。次いで、加水分解されたサンプルにおいてＰＳ２０分解、および肉眼で見えない粒子をモニターした。肉眼で見える粒子は、ＨＰ ＰＳ２０を使用した同様の試験設定（１８，１１）において、同時にまたは肉眼で見えない粒子の発生と同時または後に発生することが以前に示されているので、この試験ではモニターしなかった。ＣＡＬＢおよびＰＣＬは、ＰＳ２０分解に対して特異性が異なり、これにより、ＣＡＬＢおよびＰＣＬを、異なるポリソルベート間のＦＦＡ粒子形成を比較するための効率的なモデル系として使用することが可能になる。ＣＡＬＢはモノエステルを優先的に分解するのに対して、ＰＣＬは修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の両方において高次エステル（ＨＯＥ）を標的とする（図４）（１１，１９）。
市販の非固定化カルボン酸エステルヒドロラーゼカンジダ・アンタルクティカのリパーゼ（ＣＡＬＢ）およびポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）を使用して、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０を人工的に加水分解した。次いで、加水分解されたサンプルにおいてＰＳ２０分解、および肉眼で見えない粒子をモニターした。肉眼で見える粒子は、ＨＰ ＰＳ２０を使用した同様の試験設定（１８，１１）において、同時にまたは肉眼で見えない粒子の発生と同時または後に発生することが以前に示されているので、この試験ではモニターしなかった。ＣＡＬＢおよびＰＣＬは、ＰＳ２０分解に対して特異性が異なり、これにより、ＣＡＬＢおよびＰＣＬを、異なるポリソルベート間のＦＦＡ粒子形成を比較するための効率的なモデル系として使用することが可能になる。ＣＡＬＢはモノエステルを優先的に分解するのに対して、ＰＣＬは修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の両方において高次エステル（ＨＯＥ）を標的とする（図４）（１１，１９）。
【0229】
ＣＡＬＢは、修飾ＨＰ ＰＳ２０の３つのロット、およびＨＰ ＰＳ２０対照ロットを同様の速度で分解した（図５Ａ）。ＣＡＬＢによって分解されると、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０サンプルは、約４０％が分解された後に、肉眼で見えない（２μｍ以上）粒子が１０００粒子超／ｍＬの急激な増加を示した。ＰＣＬ試験では、修飾ＨＰ ＰＳ２０の３つのロット全てがＨＰ ＰＳ２０よりもわずかに速く分解した（図５Ｂ）。特定のＦＡＥ鎖長に対する酵素特異性が異なることに起因して、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間では分解速度の小さな差が予想されることに留意することが重要である（２１，２１）。修飾ＨＰ ＰＳ２０のＦＡＥ仕様は、ＨＰ ＰＳ２０に適用されるＵＳＰ／ＥＰ／ＣｈＰ仕様のサブセットであるため、ＨＰ ＰＳ２０の異なるバッチ間に分解速度の同様の変動が既に存在する（表１および図１）。
【0230】
ＨＰ ＰＳ２０と比較して修飾ＨＰ ＰＳ２０は、わずかに分解が速いにもかかわらず、肉眼で見えない（２μｍ以上）粒子の発生は遅延していた。ＨＰ ＰＳ２０の３つのロット全てにおいて、ＨＰ ＰＳ２０が３０％分解した後、より早い段階で肉眼で見えない粒子（２μｍ以上）が増加したのとは異なり、４０％が分解した後に肉眼で見えない粒子（２μｍ以上）が１０００粒子以上／ｍＬと急激に増加した。ＣＡＬＢおよびＰＣＬ試験についての５、１０および２５μｍ以上の肉眼で見えない粒子についても、２μｍ以上の粒径の場合と同じ傾向が観察された（データは示さず）。
【0231】
ＰＣＬ試験において、ＨＰ ＰＳ２０と比較して、ＣＡＬＢ試験でＨＰ ＰＳ２０の肉眼で見えない粒子の発生の遅延は、モノエステルと比較し、ＨＯＥのステアリン酸エステル含有量が高い可能性を示している。修飾ＨＰ ＰＳ２０は、ステアリン酸エステル含有量が６％であるＨＰ ＰＳ２０対照ロットと比較して、０％に近く、ステアリン酸エステル含有量は非常に低い（表１）。したがって、ステアリン酸は、ＨＯＥが標的化される場合の修飾ＨＰ ＰＳ２０と比較して、ＨＰ ＰＳ２０におけるＦＦＡ粒子の早期発生の根本原因である可能性がある。しかし、モノエステルが標的化される場合、パルミチン酸は、両方のポリソルベートの粒子発生の根本原因である可能性がある。修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間のパルミチン酸エステルの差は３％未満である
【0232】
以前に実証されたように、ＨＯＥ分解ＤＰは、ＨＯＥと比較してモノエステルのＦＦＡ可溶化能力が低下しているため、モノエステル分解ＤＰよりもＦＦＡ粒子形成のリスクが実質的に高い（２）。ＰＣＬ試験の結果により、ＨＰ ＰＳ２０を修正ＨＰ ＰＳ２０で置き換えることで、ＦＦＡ粒子発生前に少なくとも１０％のさらなる分解を可能となって、ＨＯＥ分解ＤＰにおいて実質的な利益を有すると予想されることが示されている。修飾ＨＰ ＰＳ２０によって得られる利点は、本発明者らの試験で使用されたものよりも、ＨＰ ＰＳ２０の粒子が発生しやすいロット（例えば、おけるステアリン酸エステル、パルミチン酸エステルおよびミリスチン酸エステルの濃度が薬局方で許容される仕様の上限であるロット）と比較して大きい可能性がある。
【0233】
製剤中のＰＳ２０分解
ＰＳ２０が５℃で急速に分解するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）製剤（ＤＰ）製剤バッチ（ｍＡｂ－Ａ、ｍＡｂ－Ｂ、ｍＡｂ－ＣおよびｍＡｂ－Ｄ）を使用して、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間でＦＦＡ粒子形成を比較した。試験したｍＡｂについて、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間で分解速度は同様であった。５℃で１２週間後、両方のポリソルベートは、ｍＡｂ－Ｂ製剤で約６０％、ｍＡｂ－Ｃ製剤で５０％、ｍＡｂ－Ｄ製剤で３０％分解した（図６）。分解パターンは、ｍＡｂおよび２つのポリソルベートにわたって同様であり、モノエステルおよびＨＯＥの両方を標的とした（図７）。ステアリン酸、パルミチン酸およびミリスチン酸は、３つ全てのｍＡｂ製剤における修飾ＨＰ ＰＳ２０と比較して、ＨＰ ＰＳ２０においてより速い速度で生成された。ｍＡｂ－Ａ製剤では、両方のポリソルベートについて、肉眼で見える粒子（目視検査および増強された目視検査の両方による）および肉眼で見えない（２μｍ以上）粒子の発生が４週間の時点で起こった。修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット２および３のｍＡｂ－Ｂ試験では、ロット１と同じ傾向が観察された（データは示さず）。ｍＡｂｓ－ＣおよびＤでは、それぞれのＨＰ ＰＳ２０製剤の２週間後に、修飾ＨＰ ＰＳ２０製剤で強化目視検査によって粒子が観察された（図６）。目視検査により、両方のポリソルベートについて同じ時点；ｍＡｂ－Ｃについては１１週間およびｍＡｂ－Ｄについては１２週間で肉眼で見える粒子が発生した。肉眼で見えない（２μｍ以上）粒子も同様に発生したが、ｍＡｂ－Ｃ製剤およびＤ製剤の両方において、修飾ＨＰ ＰＳ２０と比較してＨＰ ＰＳ２０のカウントが高かった。５μｍ以上、１０μｍ以上および２５μｍ以上の肉眼で見えない粒子について、全ての配合物における２μｍ以上の粒径について同じ傾向が観察された（データは示さず）。さらに、肉眼で見えない粒子形態は、３つのｍＡｂおよび２つのポリソルベートにおいて類似しており、先に記載されたような特徴的なＦＦＡフレーク状および針状粒子が観察された（２０）。ｍＡｂ－Ｂ、ＣおよびＤ製剤中の粒子を０．８μｍの金ポリカーボネートフィルターで１４週間フィルタにかけた。粒子を単離しようとした結果、少数の別個の粒子を含むスラリーが得られ、その全てがＦＴ－ＩＲ分光法によってＦＦＡと同定された（図８Ａ～Ｃ）。
ＰＳ２０が５℃で急速に分解するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）製剤（ＤＰ）製剤バッチ（ｍＡｂ－Ａ、ｍＡｂ－Ｂ、ｍＡｂ－ＣおよびｍＡｂ－Ｄ）を使用して、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間でＦＦＡ粒子形成を比較した。試験したｍＡｂについて、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の間で分解速度は同様であった。５℃で１２週間後、両方のポリソルベートは、ｍＡｂ－Ｂ製剤で約６０％、ｍＡｂ－Ｃ製剤で５０％、ｍＡｂ－Ｄ製剤で３０％分解した（図６）。分解パターンは、ｍＡｂおよび２つのポリソルベートにわたって同様であり、モノエステルおよびＨＯＥの両方を標的とした（図７）。ステアリン酸、パルミチン酸およびミリスチン酸は、３つ全てのｍＡｂ製剤における修飾ＨＰ ＰＳ２０と比較して、ＨＰ ＰＳ２０においてより速い速度で生成された。ｍＡｂ－Ａ製剤では、両方のポリソルベートについて、肉眼で見える粒子（目視検査および増強された目視検査の両方による）および肉眼で見えない（２μｍ以上）粒子の発生が４週間の時点で起こった。修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット２および３のｍＡｂ－Ｂ試験では、ロット１と同じ傾向が観察された（データは示さず）。ｍＡｂｓ－ＣおよびＤでは、それぞれのＨＰ ＰＳ２０製剤の２週間後に、修飾ＨＰ ＰＳ２０製剤で強化目視検査によって粒子が観察された（図６）。目視検査により、両方のポリソルベートについて同じ時点；ｍＡｂ－Ｃについては１１週間およびｍＡｂ－Ｄについては１２週間で肉眼で見える粒子が発生した。肉眼で見えない（２μｍ以上）粒子も同様に発生したが、ｍＡｂ－Ｃ製剤およびＤ製剤の両方において、修飾ＨＰ ＰＳ２０と比較してＨＰ ＰＳ２０のカウントが高かった。５μｍ以上、１０μｍ以上および２５μｍ以上の肉眼で見えない粒子について、全ての配合物における２μｍ以上の粒径について同じ傾向が観察された（データは示さず）。さらに、肉眼で見えない粒子形態は、３つのｍＡｂおよび２つのポリソルベートにおいて類似しており、先に記載されたような特徴的なＦＦＡフレーク状および針状粒子が観察された（２０）。ｍＡｂ－Ｂ、ＣおよびＤ製剤中の粒子を０．８μｍの金ポリカーボネートフィルターで１４週間フィルタにかけた。粒子を単離しようとした結果、少数の別個の粒子を含むスラリーが得られ、その全てがＦＴ－ＩＲ分光法によってＦＦＡと同定された（図８Ａ～Ｃ）。
【0234】
全体として、５℃のＤＰ安定性試験の結果により、ＨＰ ＰＳ２０グレードと比較して、修正ＨＰ ＰＳ２０グレードのＦＦＡ粒子のわずかな遅延が実証されている。３つ全てのｍＡｂ製剤の分解パターンは、モノエステルおよびＨＯＥの両方を標的とした。この試験では、ＣＡＬＢ試験と同様に、パルミチン酸が両方のポリソルベートの粒子発生の根本原因であると仮定された。この仮説は、１４週目に３つのｍＡｂ製剤の粒子中のＦＦＡ含有量を測定することによって確認された。３つの製剤のうち、ｍＡｂ－Ｄは、ＦＦＡ粒子の発生の開始が最も遅かった。したがって、１４週目において、ｍＡｂ－Ｄ製剤中の粒子のＦＦＡ分布は、ｍＡｂ－ＢおよびＣ製剤とは異なり、粒子発生時の初期ＦＦＡ分布の最も代表的なものである。ｍＡｂ－Ｄ製剤中の粒子は、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０において、ステアリン酸、ミリスチン酸またはラウリン酸に対して最も高い割合のパルミチン酸を含有し（図９）、パルミチン酸が最初に沈殿したことが示された。ｍＡｂ－ＢおよびＣ製剤中の粒子（不溶性画分）は、両方のポリソルベートについて、他の長鎖ＦＦＡに対して最も高い割合のミリスチン酸を含有していた。ＰＳ２０は分解し続けるが、初期発生粒子では分解しないが、劣化したＦＦＡ粒子（２０）では高いミリスチン酸レベルが以前に観察されている。したがって、ｍＡｂ－ＢおよびＣ製剤の粒子中の高いミリスチン酸含有量は、それらが劣化しており、早期発生粒子を代表するものではないことをさらに示す。興味深いことに、ステアリン酸は、ＨＰ ＰＳ２０製剤よりも低いレベルではあるが、修飾ＨＰ ＰＳ２０ ｍＡｂ－Ｂ製剤の粒子中に存在していた。これは、ＣｏＡがステアリン酸エステル含有量が０％を示すが、修飾ＨＰ ＰＳ２０には依然としていくらかのステアリン酸エステルが存在し得ることを示している。しかし、ステアリン酸は、ｍＡｂ－Ｄ製剤中の粒子のＦＦＡ分布によって実証されるように、修飾ＨＰ ＰＳ２０中の粒子のトリガー因子である可能性は低い。
【0235】
加水分解時にＦＦＡ粒子を形成する傾向は、標準ＰＳ２０と比較して、修飾ＨＰ ＰＳ２０ではより低かった。ＰＳ２０の分解パターンがＨＯＥを特異的に標的とした場合、効果はより顕著であった。ＨＯＥ分解ＤＰにおいてＨＰ ＰＳ２０を修飾ＨＰ ＰＳ２０で置き換えることにより、ＦＦＡ粒子の発生前に少なくとも１０％のさらなる分解が可能になり得る。さらに、修飾ＨＰ ＰＳ２０は、標準ＰＳ２０と比較して、分解時に核生成してＦＦＡ金属塩を形成する傾向が低いことが示された。修飾ＨＰ ＰＳ２０によって得られる利点は、本発明者らの試験で使用されたものよりも粒子が発生しやすいロットのＨＰ ＰＳ２０（ステアリン酸エステル、パルミチン酸エステルおよびミリスチン酸エステルの上端で製造される）と比較して、さらに大きくなる可能性がある。全体として、データは、ＰＳ２０中に長鎖ＦＡＥが存在すると、分解時にＦＦＡ粒子を形成しやすくなることを示している。ＰＳ２０原料中のＦＡＥレベルに対するより厳しい制御することにより、ＦＦＡ粒子形成の発生が低減し、一貫性を改善することによって、ＰＳ２０劣化に対する他の緩和努力を強化し得る。
【0236】
遊離脂肪酸の金属核生成
ＤＰガラスバイアルから浸出するＮａＡｌＯ２およびＣａＣｌ２などの外部核生成因子の存在下では、ＦＦＡの溶解度が低下する（１３）。負に荷電したＦＦＡは、Ａｌ３＋などの多価陽イオンと相互作用して不溶性ＦＦＡ錯体を形成し得、これは錯体を形成していないＦＦＡの水溶解限界をはるかに下回る濃度で水溶液中に沈殿する（１３）。ＦＦＡ鎖長が長くなることにより、肉眼で見えるＦＦＡ金属塩の開始を加速すると予想され、これは、修飾ＨＰ ＰＳ２０がＨＰ ＰＳ２０と比較してＦＦＡ金属核生成のリスクが低い可能性があることを示唆している（１３）。修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０が金属ＦＦＡ錯体を形成する傾向を、１０％分解ＰＳ２０中で０～２５０ｐｐｂのＡｌ３＋を含有する緩衝水溶液にスパイクすることによって比較した。修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の両方を、ＨＯＥおよびＣＡＬを標的とし、モノエステルおよびＨＯＥの両方を分解する固定化酵素ＭＭＬを使用して分解した（１０）。添加溶液中の公称ＰＳ２０濃度は０．０４％ｗ／ｖであった。その後、サンプルを５℃に置き、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の形成についてモニターした。
ＤＰガラスバイアルから浸出するＮａＡｌＯ２およびＣａＣｌ２などの外部核生成因子の存在下では、ＦＦＡの溶解度が低下する（１３）。負に荷電したＦＦＡは、Ａｌ３＋などの多価陽イオンと相互作用して不溶性ＦＦＡ錯体を形成し得、これは錯体を形成していないＦＦＡの水溶解限界をはるかに下回る濃度で水溶液中に沈殿する（１３）。ＦＦＡ鎖長が長くなることにより、肉眼で見えるＦＦＡ金属塩の開始を加速すると予想され、これは、修飾ＨＰ ＰＳ２０がＨＰ ＰＳ２０と比較してＦＦＡ金属核生成のリスクが低い可能性があることを示唆している（１３）。修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０が金属ＦＦＡ錯体を形成する傾向を、１０％分解ＰＳ２０中で０～２５０ｐｐｂのＡｌ３＋を含有する緩衝水溶液にスパイクすることによって比較した。修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の両方を、ＨＯＥおよびＣＡＬを標的とし、モノエステルおよびＨＯＥの両方を分解する固定化酵素ＭＭＬを使用して分解した（１０）。添加溶液中の公称ＰＳ２０濃度は０．０４％ｗ／ｖであった。その後、サンプルを５℃に置き、肉眼で見える粒子および肉眼で見えない粒子の形成についてモニターした。
【0237】
ＣＡＬ試験では、Ａｌ３＋レベルがＨＰ ＰＳ２０で増加したため、肉眼で見える粒子の発生が早くなることが観察された（表２）。３ロットの修飾ＨＰ ＰＳ２０は、全てのＡｌ３＋レベルにおいて、ＨＰ ＰＳ２０と比較して、肉眼で見える粒子の発生が遅く、容器あたりの粒子が少なかった。さらに、修飾ＨＰ ＰＳ２０では、１００ｐｐｂのＡｌ３＋を含むサンプルでのみ肉眼で見える粒子が観察されたが、５０または２５０ｐｐｂのＡｌ３＋サンプルでは観察されなかった。これらの結果は、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸などの長鎖ＦＦＡが、ＨＰ ＰＳ２０で観察されるＦＦＡの早期核形成に役割を果たすことを示している。修飾ＨＰ ＰＳ２０は、ＨＰ ＰＳ２０と比較して１０％酵素分解後に長鎖ＦＦＡのレベルが低くなると予想される。その結果、５０ｐｐｂのＡｌ３＋は、修飾ＨＰ ＰＳ２０で凝集して肉眼で見えるサイズまで粒子の成長を誘発するのに十分な完全錯体かＦＦＡを生成するには不十分であり得る。対照的に、２５０ｐｐｂのＡｌ３＋サンプルは、あまりにも多くの核形成部位を有する可能性があり、したがって、完全に錯体化した３：１ＦＦＡ：Ａｌ塩よりも可視粒子に合体する可能性が低い比較的多数の部分的に錯体化した（ＦＦＡ：Ａｌ比１：１または２：１）ＦＦＡを有する可能性がある。
【表2】
【0238】
ＭＭＬ試験では、ＣＡＬ試験と同様に、ＨＰ ＰＳ２０のＡｌ３＋レベルの上昇と共に肉眼で見える粒子がより早く発生することが観察された（表３）。修飾ＨＰ ＰＳ２０のロット１および２は、５０ｐｐｂおよび１００ｐｐｂのＡｌ３＋含有サンプルのＨＰ ＰＳ２０と同様に粒子が発生した。修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット１および２の２５０ｐｐｂのＡｌ３＋群には、おそらく核形成部位が多すぎ、部分的に錯化しているため、肉眼で見える粒子は観察されなかった。修飾ＨＰ ＰＳ２０ロット３は、Ａｌを含まない対照中に肉眼で見える粒子が含まれており、ＦＴ－ＩＲによるタンパク質の汚染として同定された。したがって、このサンプルサブセットは試験から除外した。
【表3】
【0239】
ＭＭＬ試験においてＨＰ ＰＳ２０および修飾ＨＰ ＰＳ２０で、５０および１００ｐｐｂ Ａｌ３＋で同様の肉眼で見える粒子の発生が確認されたのは、ＣＡＬと比較してＭＭＬによる１０％分解ＰＳ２０溶液中のＦＦＡ濃度が高いことに起因し得る。ＭＭＬは、モノエステルおよびＨＯＥの両方を分解するＣＡＬとは異なり、ＨＯＥ（ジエステルおよびトリエステル）を主に分解する。したがって、ＭＭＬは、劣化したＰＳ２０ １マイクログラム当たり、化学量論的により多量のＦＦＡを生成する可能性がある。ＨＰ ＰＳ２０および修飾ＨＰ ＰＳ２０の両方のＭＭＬサンプル中のＦＦＡ濃度は、５０および１００ｐｐｂのＡｌ３＋でのそれらの核生成傾向の間の差を解決するには高すぎる可能性がある。
【0240】
５℃で２１日間の光遮蔽による累積的な肉眼で見えない（２μｍ以上）粒子数は、両酵素の修飾ＨＰ ＰＳ２０と比較して、２５０ｐｐｂのＡｌ３＋含有ＨＰ ＰＳ２０サンプルで高かった（表２および３）。５０ｐｐｂおよび１００ｐｐｂのＡｌ３＋サンプルでは、２つのポリソルベート間で肉眼で見えない粒子数は同程度であった。これらの結果は、ＨＰ ＰＳ２０と比較して修飾ＨＰ ＰＳ２０におけるＦＦＡ金属塩粒子の発生が遅延することを裏付ける証拠を提供する。しかし、全てのサンプルについて肉眼で見えない（２μｍ以上）粒子数が１０００粒子／ｍＬ未満であったことを考慮すると、ポリソルベート間で観察された差は有意ではないと考えられる。全体として、結果は、ＰＳ２０分解時のＦＦＡの金属核生成およびその後の可視粒子の形成のリスクが、ＨＰ ＰＳ２０と比較して改良ＨＰ ＰＳ２０では低減されることを示唆している。
【0241】
機能的特徴づけ
修飾ＨＰ ＰＳ２０グレードは、上記の例に示すように、劣化時のＦＦＡ粒子形成を減少させる。さらに、修飾ＨＰ ＰＳ２０グレードは、ＨＰ ＰＳ２０と比較して材料の機能損失を示さなかった。例えば、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の酸化傾向は、ＰＳ２０酸化分解およびメチオニン酸化の両方に関して同等であった。１０ｍＭ濃度のメチオニンにより、両方のＰＳ２０グレードの酸化分解が緩和し得た。さらに、バイアルおよびｉ．ｖ．バッグによる撹拌試験では、より低いレベルおよび長鎖ＦＡＥのより良好な制御を含む改変ＨＰ ＰＳ２０グレードが、ｍＡｂを気液界面応力から保護する点でＨＰ ＰＳ２０と比較して同等の機能性を実証したことが示された。
修飾ＨＰ ＰＳ２０グレードは、上記の例に示すように、劣化時のＦＦＡ粒子形成を減少させる。さらに、修飾ＨＰ ＰＳ２０グレードは、ＨＰ ＰＳ２０と比較して材料の機能損失を示さなかった。例えば、修飾ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ２０の酸化傾向は、ＰＳ２０酸化分解およびメチオニン酸化の両方に関して同等であった。１０ｍＭ濃度のメチオニンにより、両方のＰＳ２０グレードの酸化分解が緩和し得た。さらに、バイアルおよびｉ．ｖ．バッグによる撹拌試験では、より低いレベルおよび長鎖ＦＡＥのより良好な制御を含む改変ＨＰ ＰＳ２０グレードが、ｍＡｂを気液界面応力から保護する点でＨＰ ＰＳ２０と比較して同等の機能性を実証したことが示された。
【0242】
結論
修飾ＨＰ ＰＳ２０は、ＨＰ ＰＳ２０と比較してＦＦＡ粒子を形成する傾向が低いが、これは、おそらくＦＦＡがより可溶性の高い組成のためである。ＰＳ２０の分解パターンがＨＯＥを特異的に標的とした場合、効果はより顕著であった。ＨＯＥ分解医薬品を含む製剤では、修飾ＨＰ ＰＳ２０は、ＦＦＡ粒子発生前のＨＰ ＰＳ２０と比較して少なくとも１０％のさらなる分解を可能にし、ＦＦＡ粒子の形成を遅延し得る。さらに、修飾ＨＰ ＰＳ２０は、ＨＰ ＰＳ２０と比較して、加水分解によるＦＦＡ金属塩の発生開始が遅延することを示した。データは全体的に、改変ＨＰ ＰＳ２０が、全体的な製剤安定性を維持しながらＦＦＡ粒子形成リスクを低減することによって、バイオ医薬品のためのＨＰ ＰＳ２０と比較して、目的の界面活性剤により適していることを示唆している。
参考文献
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修飾ＨＰ ＰＳ２０は、ＨＰ ＰＳ２０と比較してＦＦＡ粒子を形成する傾向が低いが、これは、おそらくＦＦＡがより可溶性の高い組成のためである。ＰＳ２０の分解パターンがＨＯＥを特異的に標的とした場合、効果はより顕著であった。ＨＯＥ分解医薬品を含む製剤では、修飾ＨＰ ＰＳ２０は、ＦＦＡ粒子発生前のＨＰ ＰＳ２０と比較して少なくとも１０％のさらなる分解を可能にし、ＦＦＡ粒子の形成を遅延し得る。さらに、修飾ＨＰ ＰＳ２０は、ＨＰ ＰＳ２０と比較して、加水分解によるＦＦＡ金属塩の発生開始が遅延することを示した。データは全体的に、改変ＨＰ ＰＳ２０が、全体的な製剤安定性を維持しながらＦＦＡ粒子形成リスクを低減することによって、バイオ医薬品のためのＨＰ ＰＳ２０と比較して、目的の界面活性剤により適していることを示唆している。
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【0243】
実施例２．バイオ医薬品における遊離脂肪酸粒子形成の予測の改善：ポリソルベート２０分解中のエステル分布の組み込み
ＰＳ２０中の脂肪酸エステルは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を形成する可能性があり、これはＰＳ２０含有製剤中に肉眼で見える粒子または肉眼で見えない粒子の形成をもたらし得る。より高次のエステルは、ＰＳ２０を含む製剤中のＦＦＡの溶解を促進し得る。ＰＳ２０の分解生成物は、ＨＯＥの分解から生じるモノエステルを含み得；例えば、脂肪酸エステルの１つが切断された場合、ジエステルの分解はモノエステルをもたらし得る。したがって、ＰＳ２０の分解により、出発原料と比較して、分解後に溶液中に残存するＰＳ２０のエステル分布が変化する可能性がある。
ＰＳ２０中の脂肪酸エステルは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を形成する可能性があり、これはＰＳ２０含有製剤中に肉眼で見える粒子または肉眼で見えない粒子の形成をもたらし得る。より高次のエステルは、ＰＳ２０を含む製剤中のＦＦＡの溶解を促進し得る。ＰＳ２０の分解生成物は、ＨＯＥの分解から生じるモノエステルを含み得；例えば、脂肪酸エステルの１つが切断された場合、ジエステルの分解はモノエステルをもたらし得る。したがって、ＰＳ２０の分解により、出発原料と比較して、分解後に溶液中に残存するＰＳ２０のエステル分布が変化する可能性がある。
【0244】
本開示はまた、例えば、ＰＳ２０を含む製剤のためのモデルであって、ｐＨおよびＰＳ２０濃度、ならびにＰＳ２０エステル分布およびＦＦＡ溶解度に対するそれらの影響を考慮に入れたモデルを提供する。このモデルは、製剤のｐＨを特定のＦＦＡのｐＫａより高くすると、ＦＦＡのイオン化形態が非イオン化形態よりも著しく可溶性であるため、指数関数的にその溶解度が増加すると予測する。また、このモデルにより、ＦＦＡの溶解度がＰＳ２０濃度の増加と共に増加することが予測される。このモデルはまた、精度を改善するための追加の要因として、酵素分解による変化するエステル分布の寄与を組み込んでいる。
【0245】
モデルを作成するために、最初に、一定のＰＳ２０濃度で種々の製剤ｐＨでＦＦＡ溶解度を測定した。この関係をＨｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式を変形したものに当てはめて、ラウリン酸、ミリスチン酸およびパルミチン酸のそれぞれのｐＫａおよび非イオン化ＦＦＡの溶解度を実験的に決定した。ＦＦＡの溶解度は、それぞれのＦＦＡのｐＫａに近づき、それを超えるにつれて、ｐＨの増加と共に増加する。ｐＨ依存性は、ｐＨがより高い溶液中ではイオン化ＦＦＡ（非イオン化画分よりも著しく可溶性）の割合が高いことに起因するものであった。第二に、一定のｐＨで種々のＰＳ２０濃度でＦＦＡの溶解度を測定した。このデータを経験的に導出された関数に当てはめた。最後に、ｐＨおよびＰＳ２０濃度の関数としてＦＦＡ溶解度を記述する個々の式を、式１に要約された１つの半経験的関係に組み合わせた。
式中、β１は非イオン化脂肪酸の溶解度であり、β２は実験的に決定されたｐＫａである。ラウリン酸、ミリスチン酸およびパルミチン酸についてのβ１およびβ２の値を表４に列挙する。
【表4】
【0246】
モデルをさらに更新するために、ＰＳ２０をモノエステルおよびＨＯＥに分画し、それらを異なる質量比で混合することによって、「模擬劣化」したＰＳ２０（ＭＤＰＳ２０）を生成した。ＭＤ ＰＳ２０ｓは、加水分解されたＰＳ２０の潜在的なエステル分布を模倣するために、％ＨＯＥ質量分率の範囲に及ぶ。ＦＦＡ溶解度およびその後の粒子リスクのより正確なモデルを生成するために、種々の濃度のＭＤ ＰＳ２０溶液でＦＦＡ溶解度を測定した。第二に、溶解度モデルの更新において、式１の「ＰＳ２０項」を、ＦＦＡ溶解度に影響を与える第三の変数として、全ＰＳ２０含有量に加えてＰＳ２０エステル分布を含むように修正した。ＰＳ２０濃度が低下するにつれて、ＦＦＡ溶解度も低下することがわかった。式１からのｐＨ項を式２と組み合わせることにより、ｐＨ、ＰＳ２０濃度およびＨＯＥピーク面積分率の任意の組み合わせでのＦＦＡ溶解度の推定が可能になる。式２は以下の通りである。
【0247】
【0248】
式１および式２を橋渡しするために、まず、式２を用いて係数Ｒを算出した。Ｒは、所望のＰＳ２０濃度およびＨＯＥピーク面積分率（分子）でのＦＦＡ溶解度対０．０４％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０およびＨＯＥピーク面積分率０．４１（分母）でのＦＦＡ溶解度の比として式３ａによって定義される。式３ａおよび式３ｂは以下の通りである。
これは以下のように単純化される。
ＲはｐＨに依存しないと予想され、式１のｐＨ項と掛け合わせて、式４で表わされる精密化モデルのＦＦＡ溶解度の最終式が得られる。式４は以下の通りである。
式中、β１は非イオン化脂肪酸の溶解度であり、β２は実験的に決定されたｐＫａであり、ＨＯＥはＰＳ２０の総ピーク面積に対する高次エステルである。
【0249】
式４に示されるこの半経験的関係を利用して、そのｐＨ、ＰＳ２０濃度およびＨＯＥピーク面積分率に基づいて、５℃における所与の製剤緩衝液中のラウリン酸、ミリスチン酸およびパルミチン酸の溶解度を予測し得る。このモデルの１つの仮定は、ミリスチン酸およびパルミチン酸の溶解度がＰＳ２０濃度およびＨＯＥピーク面積分率の関数としてラウリン酸の溶解度と同様に変化するというものである。本発明者らは、種々のｐＨおよびＰＳ２０濃度で測定および予測されたＦＦＡ溶解度を比較することによってこの仮定を以前に検証しており、新しいモデル３６でも当てはまると予想される。
【0250】
最終モデルは、ｐＨおよびＰＳ２０分解速度が同様の製剤が、ＰＳ２０のモノまたはＨＯＥのいずれかに対する分解の特異性に応じて、粒子形成に対して非常に異なる傾向を有し得る理由を説明するのに役立つ。また、ＨＯＥを分解する製剤、特に低ｐＨで製剤化された製剤は、加水分解ＰＳ２０分解によるＦＦＡ粒子形成のリスクが最も高いことも示唆される。
【0251】
このモデルを貯蔵寿命にわたるバイオ医薬品中の粒子予測のためのツールとして利用するために、５℃の安定時点で以下の測定を推奨する。１）製剤ｐＨ２）総ＰＳ２０濃度（混合モードＨＰＬＣＥＬＳＤを使用）および３）ＨＯＥピーク面積分率（浅い勾配ＵＨＰＬＣＣＡＤを使用）。これらの測定により、モデルを使用して、各安定時期でのラウリン酸、ミリスチン酸およびパルミチン酸の溶解度限界を予測することが可能になる。ＦＦＡ溶解度限界値を経時的に測定されたＦＦＡ量の測定値と比較し、交点を見つけるために外挿することは、ＦＦＡがいつ沈殿して肉眼で見える粒子または肉眼で見えない粒子を形成すると予想されるかを予測するのに役立ち得る。
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追加の参考文献
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４０．Ｂｒｉｔｏ ＲＭ，Ｖａｚ ＷＬ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｉｃｅｌｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ Ｎ－ｐｈｅｎｙｌ－１－ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８６；１５２（２）：２５０－５．
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【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】