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特表2023-542960微生物細胞産物、前記微生物細胞産物を得るための方法、および前記微生物細胞産物の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-12
(54)【発明の名称】微生物細胞産物、前記微生物細胞産物を得るための方法、および前記微生物細胞産物の使用
(51)【国際特許分類】
A23L 31/15 20160101AFI20231004BHJP
A23L 31/00 20160101ALI20231004BHJP
A23C 11/00 20060101ALI20231004BHJP
A23C 20/00 20060101ALI20231004BHJP
A23G 9/36 20060101ALI20231004BHJP
A23L 13/00 20160101ALI20231004BHJP
A21D 2/08 20060101ALI20231004BHJP
A21D 13/80 20170101ALI20231004BHJP
A23K 10/16 20160101ALI20231004BHJP
C12N 1/16 20060101ALN20231004BHJP
【ＦＩ】
A23L31/15
A23L31/00
A23C11/00
A23C20/00
A23G9/36
A23L13/00 Z
A21D2/08
A21D13/80
A23K10/16
C12N1/16 G
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518458
(86)(22)【出願日】2021-09-13
(85)【翻訳文提出日】2023-04-25
(86)【国際出願番号】 EP2021075137
(87)【国際公開番号】W WO2022058287
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】2026504
(32)【優先日】2020-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523100814
【氏名又は名称】フミ イングリディエンツ ベーヴェー
【氏名又は名称原語表記】ＦＵＭＩ ＩＮＧＲＥＤＩＥＮＴＳ Ｂ．Ｖ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100225060
【弁理士】
【氏名又は名称】屋代 直樹
(72)【発明者】
【氏名】エドガー スアレス ガルシア
(72)【発明者】
【氏名】コリヤン ヴァンデンベルグ
【テーマコード（参考）】
2B150
4B001
4B014
4B018
4B032
4B042
4B065
【Ｆターム（参考）】
2B150AB20
2B150DD14
2B150DD20
2B150DD22
4B001AC32
4B001EC05
4B001EC99
4B014GB18
4B014GG18
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB07
4B018LB10
4B018MD80
4B018MD81
4B018MD94
4B018ME14
4B018MF01
4B018MF07
4B018MF14
4B032DB05
4B032DK53
4B032DK54
4B042AC04
4B042AD36
4B042AK16
4B065AA72X
4B065AC20
4B065BD01
4B065CA41
4B065CA43
4B065CA50
(57)【要約】
本発明は、微生物細胞産物を調製する方法に関し、方法は、微生物細胞を含む水性懸濁液を準備するステップと、前記懸濁液を１５～３５℃の範囲の温度、好ましくは９～１１の範囲のｐＨ値で機械的細胞破砕に供して、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液を得るステップと、懸濁液を分離して、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物を準備するステップと、並びに、各抽出物の少なくとも一部を組み合わせて、前記微生物細胞産物を準備するステップと、を含む。本発明はさらに、前記方法で得られた、または得ることができる微生物細胞産物に関する。本発明はさらに、例えば卵白の代用品としての、食品、動物性食品および／または化粧品製剤における前記産物の使用に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
微生物細胞産物を調製する方法であって、ｉ）微生物細胞を含む水性の懸濁液を準備するステップと、
ｉｉ）前記懸濁液を１５～３５℃の範囲の温度で、好ましくは７～１１の範囲のｐＨ値で機械的細胞破砕に供して、破砕した微生物細胞を含む水性の懸濁液を得るステップと、
ｉｉｉ）前記懸濁液を分離して、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物を準備するステップと、
ｖ）各抽出物の少なくとも一部を組み合わせて、前記微生物細胞産物を準備するステップと、
を含む、方法。
【請求項2】
請求項１に記載の方法において、ステップｉ）の後かつステップｉｉ）の前に、微生物細胞を含む前記水性懸濁液を前処理して、微生物細胞および副生成物を含む前処理された水性懸濁液を得るステップｉａ）をさらに含み、ここで、前記前処理は、好ましくは、デカント、遠心分離、膜濾過などの濾過、およびそれらの１つ以上の組み合わせから選択される、方法。
【請求項3】
請求項１または２に記載の方法において、ステップｉｉｉ）の前記分離は、沈降、堆積、凝集／凝固、沈殿、デカンテーション、（水）サイクロン分離、（空気）浮選、遠心分離、膜濾過などの濾過、およびそれらの１つ以上の組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法において、ステップｉｉ）の後またはステップｉｉｉ）の後にステップｉｖ）をさらに含み、ステップｉｖ）は、ステップｉｉ）またはステップｉｉｉ）で得られた微生物産物の少なくとも１つを、洗浄、膜濾過またはダイアフィルトレーションなどの濾過、吸着、クロマトグラフィー、結晶化、凝集／凝固、沈殿、二相抽出、亜臨界抽出、超臨界抽出、溶媒抽出蒸留、およびそれらの１つ以上の組み合わせからなる処理の群から独立して選択される精製処理に供して、少なくとも１つの精製微生物細胞産物を得るステップである、方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法において、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｉｖ）またはステップｖ）の後に、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｉｖ）またはステップｖ）で得られた微生物産物の少なくとも１つを、好ましくは、噴霧乾燥、凍結乾燥および流動床乾燥から選択される方法を用いて乾燥するステップｖｉ）を行って、乾燥微生物細胞産物を得ることをさらに含み、好ましくは、前記乾燥微生物細胞産物は、該乾燥微生物細胞産物の総重量に対して、１０重量％以下、より好ましくは５重量％以下の含水量を有する、方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法において、前記微生物細胞は、単細胞またはコロニーの原核生物および真核生物、ならびにそれらの１つ以上の組み合わせから選択され、好ましくは、該微生物細胞は、酵母、藻類、細菌、真菌、およびそれらの１つ以上の組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項7】
請求項６に記載の方法において、前記微生物細胞は酵母である、方法。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法において、ステップｉ）の前記懸濁液中の微生物細胞の質量濃度は、１～２５％、好ましくは５～１５％の範囲である、方法。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法において、ステップｉｉ）の前記機械的細胞破砕は、ビーズミリングを使用して実施される、方法。
【請求項10】
請求項９に記載の方法において、ビーズミリングは、前記懸濁液の所定の粒度分布を得るために実行される、方法。
【請求項11】
請求項１０に記載の方法において、前記微生物細胞は酵母であり、また、ステップｉｉ）の後の前記所定の粒度分布は、Ｄ１０＜０．５μｍ、Ｄ５０＜４．５μｍ、Ｄ９０＜７．５μｍ、およびＤ［３，２］＜２、Ｄ［４，３］＜４．５である、方法。
【請求項12】
請求項９または１０に記載の方法において、ビーズミリングは、粒子の凝集を誘発するのに十分な時間の間、ｐＨ＞９で実行され、また、分離前の乾燥重量含有量が少なくとも２．５％である、方法。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法において、ステップｉｉｉ）の前記分離処理は、相対遠心力（ｒｆｃ）４０００以下の遠心力で遠心分離することである、方法。
【請求項14】
請求項１３に記載の方法において、前記遠心分離は、２０分以下、好ましくは１５分未満の時間で行われる、方法。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法において、前記分離するステップｉｉｉ）の前に、破砕した細胞懸濁液の含水量を調整するステップをさらに含む、方法。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法において、混合するステップｖ）の前に、２５℃未満で少なくとも６０分間、前記小細胞断片が豊富な抽出物をインキュベートするステップをさらに含む、方法。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法によって直接的に得られるか、または得ることができる微生物細胞産物。
【請求項18】
請求項１７に記載の微生物細胞産物を含むか、または請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法によって生成された微生物細胞産物を含む、食品、動物用飼料製品、または化粧品。
【請求項19】
乳化剤、発泡剤、結合剤、膨張剤、増粘剤、保湿剤、接着剤、褐変剤、透明化剤、ゲル化剤、結晶化制御剤、保水剤、軟化剤、通気剤、構造改良剤、凝固剤、コーティング剤、着色剤、光沢剤、香料、凍結剤、断熱剤、食感改良剤、ｐＨ緩衝剤、貯蔵寿命延長剤、脂肪代替剤、肉増量剤、防腐剤、抗菌剤、食品腐敗防止剤、マロラクティック発酵防止剤、テクスチャー改善剤、卵代替品、またはそれらの任意の組み合わせとしての請求項１７に記載の微生物細胞産物の使用。
【請求項20】
卵を含まない食用エマルション、卵類似物、卵を含まないスクランブルエッグ、卵を含まないパティ、卵を含まないパウンドケーキ、卵を含まないエンジェルフードケーキ、卵白を含まない代用肉、卵を含まない代用肉、卵を含まないイエローケーキ、卵および乳製品を含まないクリームチーズ、卵を含まないパスタ生地、卵を含まないカスタード、卵を含まないアイスクリーム、または乳製品を含まない牛乳における請求項１７に記載の微生物細胞産物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物細胞産物を得る方法に関する。本発明はさらに、前記方法によって得られる、または得ることができる微生物細胞産物に関する。本発明はさらに、前記微生物細胞産物の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
卵は用途が広く、ほぼどこにでもある食品であり、食物の構成要素である。卵は多くの理由で高く評価されている。卵は栄養価が高いだけでなく、パン、ケーキ、クッキー、カスタード、スフレ、マフィン、スコーン、ビスケット、パスタ、ドレッシング、ソース、およびアイスクリームなど、これらに限定されない幅広い食品の必須成分でもある。
【0003】
卵白は、重量で鶏卵の約３分の２を占める。卵白は主に約９０％の水で構成されており、その中に約１０％のタンパク質（アルブミン、ムコタンパク質、およびグロブリンを含む）が溶解している。脂質（脂肪）が豊富な卵黄とは異なり、卵白は脂肪をほとんど含有しておらず、炭水化物含有量は１％未満である。卵白は、卵中のタンパク質の約５６％を含有している。卵白は、食品（メレンゲ、ムースなど）における用途および、その他の多くの（例えば、インフルエンザ用のワクチン調製などの）用途がある。
【0004】
卵の使用には多くの欠点がある。例えば、卵は高レベルのコレステロールおよび飽和脂肪を含み、心血管疾患や肥満のリスクを増加させる。栄養価が高く、卵含有製品を楽しむことで恩恵を受ける他の消費者は、食物アレルギーまたはその他の食事制限に起因してそうすることができなくなる可能性がある。例えば、幼児の１～２％が卵アレルギーであると推定されている。相当数の人口セグメントが、例えばビーガンといった自発的な食事制限に従っており、その他には、動物の搾取を避けるため、または宗教的理由、もしくはその他の理由で卵を食べない人もいる。さらに、卵の工業規模の生産は、鶏の工業的養殖に関連しており、これには、例えば、食品の健康性および農家に対する安全性の制限に関連するコスト、高額な輸送コスト、産卵鶏の給餌および収容のコストなど、高いコストがかかる。産業用の養鶏は環境に悪影響を及ぼし、多くの人道上の重要な問題を引き起こす。
【0005】
さらに、卵の貯蔵寿命は限られており、例えば、サルモネラ菌、大腸菌、および公衆衛生を危険にさらす可能性のある他の病原体などの感染性病原体が潜んでいるリスクがある。
【0006】
卵の望ましくない特徴を最小限に抑えながら、自然の卵の望ましい特徴を再現する卵代用品（全卵代用品または卵白代用品のいずれか）を作るために、多くの試みがなされてきた。卵代用品は、卵または卵白と同様の結合特性、保湿特性、乳化特性および／または膨張特性を達成することを目的としている。
【0007】
多くの家庭料理ベースの代用品があり、例えば、マッシュバナナ、アップルソース、アクアファバ（ひよこ豆の調理液）、アマニの種を卵の代わりに使用し、膨張を付与するためのベーキングパウダー／重曹混合物、並びに、結合および膨張を付与するための小麦粉／水混合物としている。
【0008】
さらに、工業的に生産された植物ベースの卵代用品は、例えば、特許文献１（国際公開第２０１３／０６７４５３号：WO2013067453A1）で知られており、出発材料として豆またはエンドウ豆を開示している。特許文献２（国際公開第２０１７／１０２５３５号：WO2017102535A1）は、１０ｐｐｍ未満のグリアジンを含むグルテンフリーの天然ナタネタンパク質の単離物（isolate）を得るためのプロセスを開示しており、卵白の代わりとなる発泡剤として、任意のヒト栄養食品用途に使用され得る。卵を含まない（egg-free）卵白タンパク質の別の製造方法は、特許文献３（国際公開第２０１６／０７７４５７号：WO2016077457A1）に開示されており、該方法は、２つ以上の卵白タンパク質の組換え発現、および２つ以上の卵白タンパク質を混合するステップを含む。特許文献４（国際公開第２０１０／０４５３６８号：WO2010045368A2）は、１つ以上の他の食用成分との組み合わせで、微細藻類バイオマス、全微細藻類細胞、および／または微細藻類油を含む食品組成物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】国際公開第２０１３／０６７４５３号パンフレット
【特許文献2】国際公開第２０１７／１０２５３５号パンフレット
【特許文献3】国際公開第２０１６／０７７４５７号パンフレット
【特許文献4】国際公開第２０１０／０４５３６８号パンフレット
【0010】
上述の全卵代用品および卵白代用品は、（食品）製品における組成物の多目的使用を可能にする卵白の特性の所望の組み合わせを部分的にしか有していない。
【0011】
したがって、改良された卵白の代用品が必要とされている。結合剤、保湿剤、乳化剤および／または、油／水保持剤として使用できる卵を含まない組成物がさらに必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の目的は、結合剤、ゲル化剤、増粘剤、発泡剤、保湿剤、乳化剤および／または、油／水保持剤として使用できる卵を含まない組成物を提供することである。本発明の実施形態のさらなる目的は、例えば卵白の代用品として食品において、例えば、ペレット状、乾燥／粉末、半湿潤または湿潤飼料配合物といった動物性食品において、および／または例えば、溶液、クリーム、ローション、懸濁液、軟膏／ペースト、粉末およびゲルのような化粧品製剤において使用するための改良された組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、第１の態様において、微生物細胞産物を調製する方法に関する。本発明の方法は、ｉ）微生物細胞を含む水性懸濁液を準備するステップと、ｉｉ）前記懸濁液を機械的細胞破砕に供して、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液を得るステップと、ｉｉｉ）懸濁液を分離して、小細胞断片が豊富な抽出物（extract enriched in small cell fragments）および大細胞断片が豊富な抽出物（extract enriched in large cell fragments）を準備するステップと、およびｖ）各抽出物の少なくとも一部を組み合わせて、微生物細胞産物を準備するステップと、を含む。
【0014】
本発明者らは、懸濁液を２つの別個の抽出物に分離し、各抽出物を再結合することにより、単純な懸濁液に対して異なる特性を有する微生物細胞産物を製造できることを見出した。さらに、破砕ステップおよび再結合抽出物の比率のいずれかまたは両方を変更することによって、微生物細胞産物の最終特性を変更できると考えられる。これにより産物を微調整して、特定の用途にある程度適したものにすることができる。追加の「微調整」ステップとは、方法の特定のステップ間の時間、例えば抽出物を再結合する前に、組成物をインキュベートするステップを含めることができる。
【0015】
この微調整および方法の他のステップのさらなる詳細は、本明細書でより詳細に説明される。
【0016】
本発明はまた、この方法で生成することができる微生物細胞産物、およびそのような微生物細胞産物を含む食品にも関する。本発明の他の特徴および態様は、詳細な説明から明らかになるであろう。
【0017】
本発明は、別の態様において、微生物細胞産物を調製するための方法に関する。本発明の方法は、ｉ）微生物細胞を含む水性懸濁液を準備するステップと、ii）前記懸濁液を機械的細胞破砕に供して、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液を前記微生物細胞産物として得るステップと、を含む。本方法に係る機械的細胞破砕は、１～４５℃の範囲の温度で起こる。
【0018】
さらなる態様において、本発明は、本発明に係る方法によって直接的に得られるか、または得ることができる微生物細胞産物に関する。
【0019】
さらなる態様において、本発明は、本発明に係る方法によって得ることができる、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物に関する。
【0020】
さらなる態様において、本発明は、乳化剤、発泡剤、結合剤、膨張剤、増粘剤、保湿剤（moisturizing agent）、接着剤、褐変剤（browning agent）、透明化剤（clarification agent）、ゲル化剤、結晶化制御剤、保水剤（humectant agent）、軟化剤、通気剤、構造改良剤、凝固剤、コーティング剤、着色剤、光沢剤、香料、凍結剤、断熱剤（insulation agent）、食感改良剤（mouthfeel improvement agent）、ｐＨ緩衝剤、貯蔵寿命延長剤、脂肪代替剤、肉増量剤、防腐剤、抗菌剤、食品腐敗防止剤、マロラクティック発酵防止剤、テクスチャー改善剤、卵代替品、またはそれらの任意の組み合わせとしての本発明に係る微生物細胞産物の使用に関する。
【0021】
さらなる態様において、本発明は、卵を含まない食用エマルション、卵類似物（egg analog）、卵を含まないスクランブルエッグ、卵を含まないパティ、卵を含まないパウンドケーキ、卵を含まないエンジェルフードケーキ、卵白を含まない（egg-white free）代用肉、卵を含まない代用肉、卵を含まないイエローケーキ、卵および乳製品を含まないクリームチーズ、卵を含まないパスタ生地、卵を含まないカスタード、卵を含まないアイスクリーム、または乳製品を含まない牛乳における本発明に係る微生物細胞産物の使用に関する。
【0022】
この方法に対して開示された対応する実施形態は、本発明に係る微生物細胞産物、本発明に係る小細胞断片が豊富な抽出物、本発明に係る大細胞断片が豊富な抽出物、および本発明に係る微生物細胞産物の使用にも適用可能である。
【0023】
［定義のリスト］
以下の定義は、記載された主題を定義するために、本明細書および特許請求の範囲において使用される。以下に引用されていないその他の用語は、この分野で一般的に受け入れられている意味を有することを意味する。
以下の定義は、記載された主題を定義するために、本明細書および特許請求の範囲において使用される。以下に引用されていないその他の用語は、この分野で一般的に受け入れられている意味を有することを意味する。
【0024】
本明細書において使用される「乾燥（Drying）」とは、含水量を減少させることを意味する。乾燥という用語は、水分が、減少した量において乾燥後に残り得る部分的な乾燥を含み、これは濃縮とも見なすことができる。
【0025】
本明細書で使用される「乾燥重量（Dry weight）（ＤＷ）」および「乾燥細胞重量（dry cell weight）」は、水の相対的な不在下で測定される重量を意味する。例えば、乾燥重量で特定の成分の特定のパーセンテージを含む微生物バイオマスへの言及は、実質的にすべての水が除去された後のバイオマスの重量に基づいてパーセンテージが計算されることを意味する。
【0026】
微生物細胞の文脈で本明細書において使用される「破壊（Disruption）」は、「溶解（lysing）」とも呼ばれ、細胞を開いて細胞質化合物（「溶解物（lysate）」とも呼ばれる）を放出することを意味する。
【0027】
本明細書で使用される「破砕（Disintegration）」は、微生物細胞の破砕の文脈において、細胞の断片化を意味する。これは、結果として得られる細胞断片の平均サイズが、最初の微生物細胞の平均細胞サイズよりも小さくならなければならないことを意味する。破砕は、細胞が開かれるだけでなく、細胞が断片化もされる、特定の種類の破壊と見なすことができる。
【0028】
本発明で使用される「細胞質物質（Cytoplasmic material）」または「細胞質化合物（Cytoplasmic compounds）」は、細胞核（存在する場合）以外の、細胞膜によって取り囲まれた細胞内に通常含まれるすべての物質を意味する。細胞が破砕または破壊されると、細胞質物質が細胞から放出される。
【0029】
本明細書で使用される「微生物細胞（Microbial cells）」は、微生物を意味する。これは、真核生物および原核生物の単細胞生物およびそれらのコロニーであり得る。原核生物は、エンベロープで囲まれた核を持たない細胞生物である。分子分析に基づく３ドメインシステムでは、原核生物は２つのドメイン、細菌（以前の真正細菌）および古細菌（以前の原始細菌）に分けられる。核を有する生物は、真核生物という第３のドメインに配置される。本発明による微生物細胞は、酵母（yeast）などの藻類（algae）および真菌（fungi）も包含する。
【0030】
本明細書で使用される「微生物（Microorganism）、（microbe）」は、任意の微視的なコロニーまたは単細胞生物を意味する。
【0031】
本明細書において使用される「微生物細胞産物（Microbial cell product）」とは、微生物細胞を特定の方法で処理することによって得ることができる微生物細胞由来の産物を意味する。
【0032】
本発明で使用される「小細胞断片が豊富な抽出物（Extract enriched in small cell fragments）（ＥＥＳＦ）」は、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液の分離によって得られる微生物細胞産物を意味する。この分離中に、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液から抽出物が分離され、小細胞断片が部分的に枯渇した破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液が残る。換言すれば、分離処理により、小細胞断片が豊富な抽出物（主産物として）および、小細胞断片が枯渇した水性懸濁液が生成され、後者は、大細胞断片が豊富な抽出物と呼ばれることもあるし、そう呼ばれるだろう。本明細書で使用される「小細胞断片（Small cell fragments）」は、ｄ５０≦５００ナノメートル（ｎｍ）以下のサイズを有する微生物細胞の破砕から得られる細胞断片を意味する。
【0033】
本発明で使用される「大細胞断片が豊富な抽出物（Extract enriched in large cell fragments）（ＥＥＬＦ）」または「小細胞断片が枯渇した水性懸濁液（aqueous suspension depleted in small cell fragments）」は、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液の分離によって得られる微生物細胞産物を意味する。この分離中に、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液から抽出物が分離され、小細胞断片が部分的に枯渇した破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液が残る。換言すれば、分離処理により、小細胞断片が豊富な抽出物（主産物として）および、小細胞断片が枯渇した水性懸濁液（副生成物として）が生成され、後者は、大細胞断片が豊富な抽出物と呼ばれることもあるし、そう呼ばれるだろう。本明細書で使用される「大細胞断片（Large cell fragments）」は、ｄ５０≧５００ナノメートル（ｎｍ）を超えるサイズを有する微生物細胞の破砕から得られる細胞断片を意味する。
【0034】
本明細書で使用される「微生物バイオマス（Microbial biomass）」および「バイオマス（biomass）」は、微生物細胞の成長および／もしくは増殖によって生成される、または発酵プロセスの副生成物として生成される物質を意味する。バイオマスは、細胞および／または細胞内内容物ならびに細胞外物質を含有し得る。細胞外物質は、細胞によって分泌される化合物を含むが、これに限定されない。
【0035】
本明細書で使用される「ビーズミリング（Bead milling）」は、小さな研磨粒子（ビーズ）による懸濁液中における微生物細胞の撹拌を意味する。せん断力、ビーズ間の粉砕、およびビーズとの／間の衝突により、細胞が壊れる。ビーズによって生み出されるせん断力が、細胞を破壊し、細胞化合物の同時的な放出を伴う破砕を引き起こす。
【0036】
本明細書で使用される「遠心分離（Centrifugation）」は、数あるパラメータの中でも特に、サイズ、形状、密度、媒体の粘度、およびローター速度に従って溶液から粒子を分離するために遠心力を適用することを意味する。遠心分離の速度は、通常は１分あたりの回転数（ＲＰＭ）で表される角速度、またはｇで表される加速度によって特定される。ＲＰＭとｇとの間の変換係数は、遠心分離機のローターの半径に依存する。遠心分離機の毎分回転数（ＲＰＭ）を計算するための一般式は以下のとおりであり、
式中、ｇは遠心分離機の各々の力を表し、ｒはローターの中心からサンプル内の点までの半径を表す。ただし、使用する遠心分離機のモデルによっては、ローターのそれぞれの角度および半径が異なる場合があるため、式が修正される。相対遠心力の計算に使用される最も一般的な式は以下のとおりであり、
式中、ｒは半径（ｍｍ）である。
【数1】
【数2】
【図面の簡単な説明】
【0037】
本発明は、本発明の実施形態が示された添付の図面を参照して以下に説明され、同様の参照番号は同一または同様の要素を示す。
【図1】本発明に係る方法のさまざまな（任意の）ステップ、および得られた（中間）生成物の概要を示す図である。この概要は、本発明に係る微生物細胞産物を得るための多くのさまざまな経路を示している。
【図2】図２Ａは、さまざまなｐＨ値で得られた小細胞断片が豊富な抽出物について、天然の立体構造（native conformation）にあるタンパク質のプロファイルを示しており、図２Ｂは、さまざまなｐＨ値での小細胞断片が豊富な抽出物中のタンパク質の溶解度を示す。
【図3】ビーズミリング試行の過程で、小細胞断片が豊富な抽出物中のタンパク質および炭水化物の可溶化を示す図である。
【図4】ビーズミリング後、またはビーズミリング後かつ遠心分離後の細胞画分の粒度分布を示す図である。
【図5】精製処理後の最大ゲル強度［Ｐａ］に対する遠心力の影響を示す図である。
【図6】ゲル強度Ｇ’ｍａｘ［Ｐａ］で測定した、小細胞断片が豊富な精製抽出物のゲル化挙動に対する膜カットオフの影響を示す図である。
【図7】空気‐水（左）および油‐水（右）界面で得られた副生成物（Ｐ、左図）および小細胞断片が豊富な精製抽出物（Ｒ、右図）の平衡表面張力を、卵白プロテイン単離物およびホエイプロテイン単離物の表面張力と比較した図である。
【図8】本発明の一実施形態に係る微生物細胞産物を調製するための単純化されたプロセスフロー図を示す。
【図9】さまざまな破壊条件での酵母の粒度分布を示す図である。
【図11】低、中、および高分離強度での微生物細胞産物のゲル硬度を示す図である。
【図12】異なる分離強度下での酵母調製物のさまざまな画分の粒度分布を示す図である。
【図13】異なる分離強度下での酵母調製物のさまざまな画分の比表面積および濃度を示す図である。
【図14】異なる希釈条件で分離した酵母調製物のＥＥＳＦおよびＥＥＬＦのゲル硬度を示す図である。
【図15】異なる希釈条件で分離した酵母調製物のＥＥＬＦの水保持力および油保持力を示す図である。
【図16】異なる希釈条件で分離した酵母調製物のＥＥＳＦの粒度分布を示す図である。
【図17】異なる希釈条件で分離した酵母調製物のさまざまな画分の比表面積および濃度を示す図である。
【図18】異なる希釈条件で分離した酵母調製物の粒度分布を示す図である。
【図19】異なる希釈条件で分離した後の、さまざまな微生物からの微生物調製物の油保持能力を示す図である。
【図20】さまざまなｐＨレベルでの破壊後の酵母調製物のゲル硬度、並びに油分および水分の保持能力を示す図である。
【図21A】さまざまなｐＨレベルで破壊された酵母の経時的な粒度分布（ｄ５０）を示す図である。
【図21B】さまざまなｐＨレベルで破壊された酵母の経時的な粒度分布（Ｄ［３，２］）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
上述のように、本発明は、第１の態様において、微生物細胞産物を調製するための方法に関し、該方法は、ｉ）微生物細胞を含む水性懸濁液を準備するステップと、ｉｉ）前記懸濁液を機械的細胞破砕に供し、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液を得るステップと、ｉｉｉ）懸濁液を分離して、小細胞断片が豊富な抽出物および、大細胞断片が豊富な抽出物を準備するステップと、並びに、ｖ）各抽出物の少なくとも一部を組み合わせて、微生物細胞産物を準備するステップと、を含む。機械的細胞破砕は、１～４５℃の範囲（すなわち、１℃から４５℃までおよび４５℃を含む範囲）、好ましくは１５～３５℃、より好ましくは約２５℃の温度で実行して、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液を得ることができる。
【0039】
図１において、前記水性懸濁液を準備するステップ（ステップｉ）は、左側に灰色で示されている。ステップｉｉ）は、中央からやや左側に灰色で開示されている。ステップｉ）の後、水性懸濁液をステップｉｉ）に直接供するか、または第１の前処理（ステップｉａ））を実行することができる。異なる経路（図１に開示され、以下に開示される）のそれぞれについて、この任意の前処理ステップが存在し得る。ステップｉｉ）由来の生成物は、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液である。次いで、その画分が懸濁している可溶性化合物に加えて、小断片が豊富な抽出物（ＥＥＳＦ）および大細胞断片が豊富な抽出物（ＥＥＬＦ）を準備するために、水性懸濁液が分離される（ｉｉｉ）。次いで、豊富な抽出物の一部を組み合わせて（ｖ）、微生物細胞産物を準備する。これは、場合によっては、本明細書では混合抽出物と呼ばれる場合がある。該プロセスは、図８に追加で示されている。
【0040】
この方法は、必要に応じて、ｉａ）前処理、ｉｖ）精製処理、ｖｉ）乾燥およびｖｉｉ）混合のステップのいずれかを含む。例えば、この方法は、ステップｉ）およびｉｉ）またはステップｉ)、ｉａ)およびｉｉ)、またはステップｉ)、ｉａ)、ｉｉ)およびｉｉｉ)、またはステップｉ）、ｉａ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）およびｉｖ)、またはステップｉ）、ｉａ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖ)、またはステップｉ）、ｉａ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）およびｉｖ)、またはステップｉ）、ｉａ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ)を含み得る。
【0041】
本発明に係る方法で得ることができる微生物細胞産物は、混合抽出物、混合精製抽出物、乾燥混合抽出物、乾燥混合精製抽出物、混合乾燥抽出物、および混合乾燥精製抽出物を含む。
【0042】
微生物細胞産物とは、さらに、精製微生物細胞産物および乾燥微生物細胞産物をも意味する。
【0043】
本発明に係る方法で得ることができる精製微生物細胞産物は、混合精製抽出物、乾燥混合精製抽出物、および混合乾燥精製抽出物を含む。
【0044】
本発明に係る方法で得ることができる乾燥微生物細胞産物は、乾燥混合抽出物、乾燥混合精製抽出物、混合乾燥抽出物、および混合乾燥精製抽出物を含む。
【0045】
本明細書に記載の方法の特定のステップを実行して、本発明の方法から得られる混合抽出物とは別個の、代替の産物を得ることができる。例えば、図１のステップを参照すると、破砕した微生物細胞の精製された懸濁液は、以下の後続のステップ、すなわち、ステップｉ）、ステップｉｉ）、およびステップｉｖ）；または、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、およびステップｉｖ）を実施した後に得られる。
【0046】
乾燥精製破砕微生物細胞は、以下の後続のステップ、すなわち、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｖ）およびステップｖｉ）；またはステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｖ）およびステップｖｉ）を実施した後に得られる。
【0047】
乾燥破砕微生物細胞は、以下の後続のステップ、すなわち、ステップｉ）、ステップｉｉ）およびステップｖｉ）；またはステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）およびステップｖｉ）を実施した後に得られる。
【0048】
小細胞断片が豊富な抽出物は、以下の後続のステップ、すなわち、ステップｉ）、ステップｉｉ）およびステップｉｉｉ）；またはステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）およびステップｉｉｉ）を実施した後に得られる。
【0049】
大細胞断片が豊富な抽出物は、以下の後続のステップ、すなわち、ステップｉ）、ステップｉｉ）およびステップｉｉｉ）；またはステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）およびステップｉｉｉ）を実施した後に得られる。
【0050】
小細胞断片が豊富な乾燥抽出物は、以下の後続のステップ、すなわち、小細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｖｉ）；または小細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｖｉ）を実施した後に得られる。
【0051】
大細胞断片が豊富な乾燥抽出物は、以下の後続のステップ、すなわち、大細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｖｉ）；または大細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｖｉ）を実施した後に得られる。
【0052】
小細胞断片が豊富な精製抽出物は、以下の後続のステップ、すなわち、小細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｉｖ）；または小細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｉｖ）を実施した後に得られる。
【0053】
大細胞断片が豊富な精製抽出物は、以下の後続のステップ、すなわち、大細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｉｖ）；または大細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｉｖ）を実施した後に得られる。
【0054】
小細胞断片が豊富な乾燥精製抽出物は、以下の後続のステップ、すなわち、小細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、およびステップｖｉ）、ならびにステップｖｉ）；または小細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｖｉ）ならびにステップｖｉ）を実施した後に得られる。
【0055】
大細胞断片が豊富な乾燥精製抽出物は、以下の後続のステップ、すなわち、大細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、およびステップｖｉ）、ならびにステップｖｉ）；または大細胞断片が豊富な抽出物に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）およびステップｖｉ）ならびにステップｖｉ）を実施した後に得られる。
【0056】
混合抽出物（本発明に係る微生物細胞産物）は、以下の後続のステップ、すなわち、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、および小細胞断片が豊富な抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）；またはステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）および小細胞断片が豊富な抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）を実施した後に得られる。
【0057】
乾燥混合抽出物（本発明に係る微生物細胞産物）は、以下の後続のステップ、すなわち、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、小細胞断片が豊富な抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）ならびにステップｖｉ）；またはステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、小細胞断片が豊富な抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）ならびにステップｖｉ）を実施した後に得られる。
【0058】
混合精製抽出物（本発明に係る微生物細胞産物）は、以下の後続のステップ、すなわち、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物の両方に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｖｉ）、ならびに小細胞断片が豊富な精製抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な精製抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）；または細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物の両方に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｖｉ）、ならびに小細胞断片が豊富な精製抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な精製抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）を実施した後に得られる。
【0059】
乾燥混合精製抽出物（本発明に係る微生物細胞産物）は、以下の後続のステップ、すなわち、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物の両方に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｖｉ）、小細胞断片が豊富な精製抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な精製抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）、ならびにステップｖｉ）；または細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物の両方に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｖｉ）、小細胞断片が豊富な精製抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な精製抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）、ならびにステップｖｉ）を実施した後に得られる。
【0060】
混合乾燥抽出物（本発明に係る微生物細胞産物）は、以下の後続のステップ、すなわち、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物の両方に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｖｉ）、ならびに小細胞断片が豊富な乾燥抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な乾燥抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）；または細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物の両方に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｖｉ）、ならびに小細胞断片が豊富な乾燥抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な乾燥抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）を実施した後に得られる。
【0061】
混合乾燥精製抽出物（本発明に係る微生物細胞産物）は、以下の後続のステップ、すなわち、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物の両方に対して、ステップｉ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｖｉ）、小細胞断片が豊富な精製抽出物および大細胞断片が豊富な精製抽出物の両方に対して、ステップｖｉ）、ならびに小細胞断片が豊富な乾燥精製抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な乾燥精製抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）；または細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物の両方に対して、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｖｉ）、小細胞断片が豊富な精製抽出物および大細胞断片が豊富な精製抽出物の両方に対して、ステップｖｉ）、ならびに小細胞断片が豊富な乾燥精製抽出物（の一部）と大細胞断片が豊富な乾燥精製抽出物（の一部）とを混合するステップｖ）を実施した後に得られる。
【0062】
図１に示すように、さまざまな副生成物が得られる可能性がある。この第１および／または第２の副生成物は、例えば、さらに乾燥または濃縮処理をして、乾燥または濃縮副生成物を得ることができる。
【0063】
微生物細胞を含む微生物バイオマスは、産業上の関心のある幅広い製品を生産するために伝統的に使用されてきた、または多くの用途で直接使用されてきた。ほとんどの産業または商業用途では、細菌、酵母、真菌、藻類のドメインから選択された微生物バイオマス株の群を利用している。全体として、微生物バイオマスから得られる産物は、細胞内または細胞外のいずれかである。細胞外産物は、細胞によってバルク培地、通常は水相に分泌される。反対に、細胞内産物は細胞内にとどまる。細胞内産物を得るためには、これらの産物を細胞から放出し（細胞膜または細胞壁を壊すことにより）、目的の化合物を残りのバイオマスおよびその他の不純物からさらに分離するために、追加の処理が必要となる。
【0064】
食品用途の特定の分野では、微生物バイオマスは、タンパク質（単一細胞タンパク質 ‐ ＳＣＰ）の供給源として、栄養補助食品として、またはさまざまな成分および添加物を製造するために使用されてきた。
【0065】
微生物バイオマスはしばしば抽出物の形態で使用され、そのために前記バイオマスを形成する微生物細胞を破壊／破砕する必要がある。真菌抽出物、藻類抽出物、および酵母抽出物など、いくつかの異なる出発物質から調製された抽出物が知られている。これら抽出物の中で最も一般的に使用されているのは、酵母由来のもの、いわゆる酵母抽出物（以下、「ＹＥ」という）である。ＹＥは、実験室で細胞を培養するための増殖培地から、食品産業用の栄養補助食品および風味増強剤に至るまで、幅広い製品に適用されている（適用され得る）。ＹＥの生成プロセスはよく知られている。一般に、主にSaccharomyces属由来の酵母細胞は、熱誘導または化学誘導自己消化（または原形質溶解）によって破壊（＝破砕）され、その後、タンパク質および核酸などの大きな細胞内産物をペプチド、アミノ酸およびヌクレオチドなどの小さな成分に分解（＝消化）する内因性酵素を活性化するために、高温（＞５０℃）でのインキュベーションのステップへと続く。得られた消化スラリーは、最終用途に応じてさらに精製および補充され、ＹＥとして商品化可能な抽出物が提供される。
【0066】
一般に、細胞破砕方法は、非機械的または機械的のいずれかに分類できる。非機械的破砕方法は、さらに次の３つのカテゴリに分類でき、物理的破砕（例えば、減圧、浸透圧ショック、熱分解、超音波、または凍結融解による）、化学的破砕（例えば、溶媒、界面活性剤、カオトロープ、酸および塩基、またはキレートの使用による）並びに酵素的破砕（例えば、自己消化、ファージ溶解、または溶解酵素）がある。本発明は、機械的破砕方法のみに関する。機械的破砕方法の例は、ビーズミルを含むボールミル、およびホモジナイザーである。
【0067】
ホモジナイザーは高圧下で動作し、実際には細胞懸濁液をバルブに通してから衝撃リングに高速で流れを衝突させる容積式ポンプである。多くの場合、高圧で数回通過する必要があり、それにより温度が上昇して不安定な分子が局所的に変性し得る。
【0068】
ボールミル（ビーズミルを含む）は、垂直型および水平型のいずれかであり、粉砕チャンバーに存在する粉砕媒体を使用する。モーターがローターを駆動し、細胞懸濁液を高速で回転させる。細胞懸濁液および粉砕材料（ビーズなど）は、細胞を壊すせん断力を発生させる。これにより、細胞内物質が水性懸濁液に放出され、細胞の断片化（すなわち、破砕）をも引き起こす。ローター速度の増加に伴い、せん断力が増し、細胞の破壊が増加する。粉砕材料のサイズが小さくなると、通常、細胞の破壊が増加する。他のパラメータは、破砕プロセスの性能に影響を及ぼす。当業者は、本発明に従って正しいパラメータおよび変数を選択することができる。
【0069】
先行文献による細胞破砕方法の例は以下の通りである。米国特許第３,８８８,８３９号（US3888839A）は、酵母細胞からタンパク質単離物を得るためのプロセスを開示し、ここで、酵母細胞は、高圧ホモジナイゼーション（機械的破砕）およびその後のインキュベーションによって破裂する。欧州特許公開第１１９９３５３号（EP1199353A1）は、酵母懸濁液または酵母ペーストを処理し、不溶性成分を分離することによって酵母抽出物を製造するプロセスを開示し、そこで、酵母懸濁液または酵母ペーストは高電圧の電気パルスに供される（物理的破砕）。欧州特許公開第２７７４９９３号（EP2774993A1A）は、プロテアーゼを含有しない細胞壁分解酵素（酵素分解）を使用し、次いで生成物を７０～８０℃で１０～２０分間熱処理することを開示している。
【0070】
微生物バイオマス懸濁液に存在する微生物細胞は、主にタンパク質、炭水化物、脂質、およびミネラルを含有する。タンパク質およびその他の不安定な分子は、高温、長いインキュベーション時間、極度のｐＨ値、溶媒、塩、およびその他の過酷な化学物質にさらされると、アンフォールディング、変性、および分解が生じる。タンパク質およびその他の機能分子が変性すると（三次構造および四次構造が失われる）、それらの機能活性（の一部）が失われる。変性（アンフォールディング）の際、タンパク質は親水性および疎水性表面と相互作用する能力を失い、また熱冷却処理時に再編成してネットワーク様構造を形成する能力にも影響を受ける。（タンパク質）機能性は、多くの商業的用途、特に卵白と同様のゲル化特性が必要な用途において非常に重要なものとなる。本発明者らは、本明細書に記載の条件（例えば、記載の温度およびｐＨ範囲）での機械的破砕の使用が、タンパク質および他の不安定な分子のアンフォールディング、変性および／または分解を防ぐのに十分穏やかであり、したがって、機能特性、特にゲル化挙動を保護するために必要であることを観察した。
【0071】
一実施形態では、ステップｉ）の前記懸濁液中の微生物細胞の質量濃度は、１～２５％、好ましくは５～１５％の範囲である。質量濃度は乾燥重量のパーセンテージであり、１０％乾燥重量は１００ｇ／Ｌと同じである。
【0072】
微生物細胞を含む水性懸濁液は、増殖または発酵中に産生される細胞質物質または他の細胞外物質をさらに含み得る。
【0073】
本発明に係る方法の一実施形態では、微生物細胞は、単細胞またはコロニーの原核生物および真核生物、ならびにそれらの１つ以上の組み合わせから選択される。好ましい実施形態では、微生物細胞は、酵母、藻類、細菌、真菌、およびそれらの１つ以上の組み合わせよりなる群から選択される。特定の実施形態では、微生物細胞は酵母である。
【0074】
一実施形態では、方法は、ステップｉ）の後かつステップｉｉ）の前に、微生物細胞を含む水性懸濁液を前処理して、微生物細胞および副生成物を含む前処理された水性懸濁液を得るステップｉａ）をさらに含む。特定の実施形態では、前記前処理は、デカント、遠心分離、膜濾過などの濾過、およびそれらの１つ以上の組み合わせから選択される。前記前処理の前に、微生物細胞を含む水性懸濁液を洗浄してもよい。洗浄およびその後の前処理の組み合わせは、二重の前処理と見なすことができる。洗浄は、例えば、水、酸もしくは塩基、またはエタノールなどの溶媒で行うことができる。この実施形態では、ステップの順序は以下の通りであり、ステップｉ）、ステップｉａ）、ステップｉｉ）となり、前記懸濁液を機械的細胞破砕に供するステップｉｉ）において、ステップｉａ）で得られた前処理された懸濁液が使用される。
【0075】
一実施形態では、ステップｉｉ）の前記機械的細胞破砕は、ビーズミリングを使用して実施される。一実施形態では、ビーズミリングは、１分～３時間の範囲の時間にわたり使用される。ミリング時間は、水性懸濁液に放出される細胞質化合物ならびにタンパク質および炭水化物などの他の細胞由来化合物の量を調整するためにも用いられる。細胞破砕プロセスは、代謝活性を低下させ、タンパク質の機能を維持し、および冷却コストを削減するために、１５～３５℃（好ましくは約２５℃）で実行され得る。破砕プロセスは、好ましくはｐＨ７～１１、好ましくはｐＨ９付近で実施される。あるいは、細胞破砕は、Ｔ＜２５℃で、＞３時間、ｐＨ１１で行われる。
【0076】
破砕条件は、好ましくは、所望の粒度分布を提供するように選択される。本明細書でさらに議論されるように、粒度分布を変更することにより、例えば特定の意図された用途に適合するように、混合製品の最終特性を変更することが可能となり得る。破砕プロセスは、二峰性の粒度分布（ｐｓｄ）が得られ、無傷の細胞のピークおよび細胞断片のピークが表示されるように実行される。酵母の場合、無傷の細胞のピークが６μｍまで、細胞断片のピークが０．８μｍまで得られる（図４および図９を参照）。
【0077】
細胞破砕プロセスの過程で、ｐｓｄは変化し、無傷の細胞のピークが減少し、また結果として細胞断片のピークが増加することが示される。破砕プロセスは、特定のｐｓｄが得られるまで実行される。酵母の例では、比表面積は時間の経過とともに増加するが、Ｄ［３，２］、Ｄ［４，３］、Ｄ１０、Ｄ５０、Ｄ９０は時間の経過とともに減少する（図１０Ａ、図１０Ｂを参照）。酵母の場合、望ましい目的のｐｓｄはＤ１０＜０．５μｍ、Ｄ５０＜４．５μｍ、Ｄ９０＜７．５μｍ、およびＤ［３，２］＜２、Ｄ［４，３］＜４．５である。当業者は、特定の破砕方法／装置のパラメータを調整して、所望のｐｓｄに到達することができる。これは、例えば、ビーズミル、ホモジナイザー、またはその他の機器および特定の設定を用いることで実施でき、これについては、専門の文献に詳しく記載されている。
【0078】
考えられるビーズのサイズは、０．１～５ｍｍの範囲、好ましくは０．５～１ｍｍの範囲である。適切なビーズ材料は、ジルコニウムおよびガラスを含むが、これらに限定されない。
【0079】
適切と考えられるビーズ充填率（ビーズで満たされたビーズミルチャンバーのパーセンテージ）は、ビーズミルチャンバーの利用可能な総体積に対して、４０～９０％の範囲、好ましくは６５～８０％の範囲である。
【0080】
適切と考えられる回転速度は、１～２０ｍ／ｓの範囲である。各ビーズミルの構成およびジオメトリーに応じて、当業者は、対応するローター速度をｒｐｍで見積もることができる。ｒｐｍでの適切な回転速度は、例えば５００～５０００ｒｐｍ、好ましくは１０００～３０００ｒｐｍである。
【0081】
適切と考えられる微生物細胞の濃度は、乾燥重量で２～２５％の範囲である。
【0082】
１つの特定の実施形態では、微生物細胞は、Ｄｙｎｏ－ｍｉｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ（ＣＢ Ｍｉｌｌｓ）ビーズミルを使用して破砕される。細胞はまた、ブレンディング（例として高速ブレンダーまたはワーリングブレンダーなど）、フレンチプレス、または細胞壁が弱い場合には遠心分離を使用して、細胞を破砕させるといったようなせん断力によって破壊することもできる。
【0083】
一実施形態では、化学物質および／または溶媒を添加することなく細胞破砕が起こる。
【0084】
一実施形態では、ステップｉｉ）中のｐＨ値は４～１１の範囲である。好ましい実施形態では、ステップｉｉ）中のｐＨ値は７．５～９の範囲である。
【0085】
一実施形態では、ステップｉｉ）中の温度は、４５℃未満、好ましくは３５℃未満、または１５～２５℃など、３５℃以下である。
【0086】
一実施形態では、破砕ステップは、粒子の少なくとも１０％が０．５μｍ以下のサイズを有し、得られた細胞断片の少なくとも５０％が４．５μｍ以下のサイズを有するように実行される。
【0087】
方法はさらに、ステップｉｉ）の後にステップｉｉｉ）を含み、ステップｉｉｉ）は、ステップｉｉ）で得られた破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液を分離処理に供し、抽出物が懸濁している可溶性化合物に加えて、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物を微生物細胞産物として得る。換言すれば、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液は、２つの抽出物に分離される。これらは、本明細書において、ＥＥＳＦ（小断片が豊富な抽出物）およびＥＥＬＦ（大断片が豊富な抽出物）と呼ばれ得る。分離処理は、固‐液分離であってもよい。分離処理は、当業者に知られている任意の適切な方法を使用して行い得る。好ましい実施形態では、分離処理は、デカント、遠心分離、膜濾過などの濾過、およびそれらの１つ以上の組み合わせからなる群から選択される。分離のための適切な方法には、沈降（settling）、堆積（sedimentation）、凝集（flocculation）／凝固（coagulation）、沈殿（precipitation）、デカンテーション、（水）サイクロン分離および（空気）浮選をさらに含む。本明細書で説明するように、特定の好ましい特性を有する濃縮（豊富な）抽出物を得るために、特定の分離条件を微調整してもよい。
【0088】
小細胞断片が豊富な抽出物は、ほとんどが可溶性の細胞質物質と小細胞断片とを含み得、大細胞断片が豊富な抽出物は、ほとんどが大細胞断片といくらかの可溶性細胞質物質とを含み得る。
【0089】
ＥＥＳＦは、低強度および中強度の遠心分離によって優先的に得られる。低強度および中強度とは、短時間または低ｇ力、またはその組み合わせを意味する。低強度の例は、ベンチトップ遠心機での４０００ｒｃｆ未満での２分間未満の分離である。中強度の例は、ベンチトップ遠心機での４０００ｒｃｆ未満での１５分間未満の分離である。高強度の遠心分離の例は、＞２００００ｒｃｆでの＞２０分である。
【0090】
ＥＥＳＦの収率を高めるためには、低および中の分離強度が好ましい。さらに、低強度および中強度の分離により、ＥＥＳＦの優れた機能が得られる。
【0091】
一実施形態では、ステップｉｉｉ）の前記分離処理は、相対遠心力（ｒｆｃ）４０００以下の遠心力で遠心分離することである。
【0092】
一実施形態では、前記遠心分離は、２０分以下の時間で行う。特定の実施形態では、前記遠心分離は、１５分以下の時間で行う。
【0093】
一実施形態では、前記小細胞断片が豊富な抽出物は、微生物細胞断片および可溶性細胞質化合物を含み、少なくともｄ５０≦５００ｎｍである。
【0094】
一実施形態では、小細胞断片が豊富な抽出物は、同時に得られた小細胞断片が枯渇した水性懸濁液（すなわち、大細胞断片が豊富な抽出物）よりも、少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも５０％多くの小細胞断片を含む。
【0095】
分離パラメータを調整して、好ましい粒度分布の優先的な回収をすることができる。例えば、酵母の場合、ＥＥＳＦについて０．１～３μｍの範囲（少なくともｄ５０≦５００ｎｍ）の粒子、ＥＥＬＦについて３～１０μｍの範囲の粒子の優先的な回収を目標とすることができる。
【0096】
ＥＥＳＦの粒度分布は、遠心分離機での分離強度の結果で変化する。
【0097】
特定の実施形態では、破砕した細胞調製物の含水量は、分離ステップの前に調整してもよい。希釈レベルを変更することで、ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦの機能特性を修正できる。
【0098】
一実施形態では、方法は、混合ステップｖ）の前にＥＥＳＦをインキュベートするステップをさらに含む。細胞破砕の過程で、ｐＨが低下することがわかっている（例えば、約９から約６．５へ)。これらの条件下では、かなりの量のＣＯ２が放出され得る。これにより、いくつかの食品用途に使用できる膨張効果が得られる。しかし、これは常に望ましいとは限らないため、ＥＥＳＦをインキュベーションステップにかけ、余剰のＣＯ２を枯渇させることができる。例えば、ＥＥＳＦは、２５℃未満で少なくとも６０分間、穏やかに、すなわち攪拌せずに好気条件下でインキュベートしてもよい。一実施形態では、ＥＥＳＦは、＞５％のＤＷを含有する液体懸濁液として、＞６０分間、およびＴ＜２５℃で撹拌下に放置される。インキュベーションプロセス中に、ＥＥＳＦの機能特性を損なうことなく、余剰のガスが放出される。インキュベーションプロセスの後、膨張効果は大幅に減少する。さらに、本発明者らが驚いたことに、例えば破砕後のｐＨ＜６．５からｐＨ＞６．９、例えばｐＨ６．９またはｐＨ７．０までｐＨをわずかに上昇させると、膨張効果は実質的に減少し得る。
【0099】
一実施形態では、方法は、ステップｉｉ）またはステップｉｉｉ）で得られた微生物産物の少なくとも１つを精製処理に供して、少なくとも１つの精製微生物細胞産物を得るステップｉｖ）をさらに含む。精製処理は、当業者に知られている任意の適切な方法を使用して行ってよい。精製方法の例は、吸着、クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーションまたは膜濾過などの濾過、結晶化、凝集／凝固、沈殿、二相抽出（two-phase extraction）、亜臨界（sub-critical）および超臨界（supercritical）抽出、並びに溶媒抽出である。好ましい実施形態では、精製処理は、洗浄、膜濾過またはダイアフィルトレーションなどの濾過、吸着、クロマトグラフィー、結晶化、凝集／凝固、沈殿、二相抽出、亜臨界および超臨界抽出、溶媒抽出、ならびにそれらの１つ以上の組み合わせからなる群からのものである。ステップｉｉ）およびステップｉｉｉ）で得られた両方の微生物産物が精製処理にかけられる場合、これらの精製処理は独立して選択される。
【0100】
一実施形態では、ステップｉｖ）の前記精製処理は膜濾過であり、使用される膜のカットオフ値は１ｋＤａ～２００００ｋＤａの範囲、好ましくは１０ｋＤａ～１０００ｋＤａの範囲である。一実施形態では、使用される膜のカットオフ値は、０．１～２μｍの範囲である。
【0101】
方法は、ステップｉｉｉ）で得られた小細胞断片が豊富な抽出物の少なくとも一部と、ステップｉｉｉ）で得られた大細胞断片が豊富な抽出物の少なくとも一部とを混合するステップｖ）を行って、微生物細胞産物として混合抽出物を得ることか、または、ステップｉｖ）で得られた小細胞断片が豊富な精製抽出物の少なくとも一部と、ステップｉｖ）で得られた大細胞断片が豊富な精製抽出物の少なくとも一部とを混合するステップｖ）を行って、微生物細胞産物として混合精製抽出物を得ること、を含む。この混合するステップは、産物をさらに調整するために使用できる。例えば、意図した目的に対して分離が「完全」すぎると思われる場合、つまり抽出物の濃縮が高すぎる（豊富過ぎる）時に、混合が適用される場合がある。例えば、小細胞断片が豊富な抽出物中の小細胞断片の量が特定の目的に対して最適な量よりも多い場合、大細胞断片が豊富な抽出物の一部を小細胞断片が豊富な抽出物と混合して、混合抽出物を得る。
【0102】
これにより、ＥＥＳＦまたはＥＥＬＦとは異なる特性を備えた混合産物が得られ、さらに、分離ステップ中に少なくとも一部の可溶性成分が除去されるため、破砕した細胞調製物とは異なる特性を備えた混合産物が得られることに言及することが重要である。本明細書で提供される詳細から明らかなように、特定のＥＥＳＦおよびＥＥＬＦ抽出物は、わずかに異なる条件下においてわずかに異なる方法によって生成され、所望の特性が得られる。次いで、混合産物の所望の特性が得られるように、組み合わせの割合も変更してよい。
【0103】
一実施形態では、方法は、ステップｉｉ）、ステップｉｉｉ）、ステップｉｖ）またはステップｖ）で得られた微生物産物の少なくとも１つを乾燥するステップｖｉ）を行って、乾燥微生物細胞産物を得ることをさらに含む。好ましい実施形態では、乾燥ステップは、噴霧乾燥、凍結乾燥および流動床乾燥（fluidized bed drying）から選択される方法による。乾燥は濃縮でもあり得る。好ましくは、乾燥微生物細胞産物は、乾燥微生物細胞産物の総重量に対して、１０重量％以下、より好ましくは５重量％以下の含水量を有する。１５０℃を超え、かつ２００℃未満で行う噴霧乾燥および流動床乾燥により、無色、無臭および無味の製品が得られる。これは、乾燥中に揮発性化合物が除去されるためである。フリーズドライは、昇華時に保存されるため、香り、色、および味を保存するための好ましい技術である。
【0104】
ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦの機能特性をさらに維持するためには、濃縮が好ましい。濃縮は、好ましくは、生成物が＞５０℃または＜０℃の温度に曝されない当該技術分野で既知の方法で実行される。そのような方法の例は膜濃縮である。ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦは、ＤＷ含有量が２０％を超えるように優先的に濃縮される。
【0105】
一実施形態では、方法は、ステップｖｉ）で得られた小細胞断片が豊富な乾燥抽出物の少なくとも一部と、ステップｖｉ）で得られた大細胞断片が豊富な乾燥抽出物の少なくとも一部とを混合するステップｖｉｉ）を行って、微生物細胞産物として混合乾燥抽出物を得ることか、または、ステップｖｉ）で得られた小細胞断片が豊富な乾燥精製抽出物の少なくとも一部と、ステップｖｉ）で得られた大細胞断片が豊富な乾燥精製抽出物の少なくとも一部とを混合するステップｖｉｉ）を行って、微生物細胞産物として混合乾燥精製抽出物を得ることをさらに含む。乾燥抽出物の１つを精製し、また乾燥抽出物の１つを混合前に精製しないことも可能である。簡潔性のため、このオプションは図１には示されていない。
【0106】
【0107】
一態様では、本発明は、上記の少なくともステップｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）を含む方法によって得られる小細胞断片が豊富な抽出物に関し、ここで、該抽出物は、天然の立体構造で分子量が１０ｋＤａを超え、好ましくは５０ｋＤａを超え、より好ましくは６０ｋＤａを超える可溶性タンパク質を含む。一実施形態では、前記抽出物中のすべての可溶性タンパク質の少なくとも９５％が、それらの天然の立体構造で、１０ｋＤａを超える、好ましくは５０ｋＤａを超える、より好ましくは６０ｋＤａを超える分子量を有する。
【0108】
この態様の一実施形態では、前記小細胞断片が豊富な抽出物は、微生物細胞断片および可溶性細胞質化合物を含み、ここで、前記細胞断片の少なくとも８０％がｄ５０≦５００ｎｍである。
【0109】
この態様の一実施形態では、小細胞断片が豊富な抽出物は、同時に得られた小細胞断片が枯渇した水性懸濁液（すなわち、大細胞断片が豊富な抽出物）よりも、少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、さらには少なくとも３０％、または少なくとも５０％多くの小細胞断片を含む。
【0110】
一実施形態では、微生物細胞産物は、卵と同様の結合特性、保湿特性、水油保持特性、および／または乳化特性を提供する。場合によっては、微生物細胞産物は結合剤として使用される。場合によっては、微生物細胞産物は保湿剤として使用される。場合によっては、微生物細胞産物は乳化剤として使用される。場合によっては、微生物細胞産物は発泡剤として使用される。場合によっては、微生物細胞産物は水保持剤または油保持剤として使用される。場合によっては、微生物細胞産物はゲル化剤として使用される。
【0111】
いくつかの実施形態では、微生物細胞産物は、等量または不等量の卵を使用して調製される同等の製品の調製において、卵黄、卵白、または全卵の代用品として使用することができる。好ましい実施形態では、微生物細胞産物は、卵白の代用品として使用される。
【0112】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の混合微生物細胞産物を含む食品を提供する。
【0113】
一実施形態では、ステップｉｉｉ）および／またはステップｉｖ）の間のｐＨ値は、方法のステップｉｉ）の終了時に相当する。一実施形態ではステップｉｉｉ）および／またはステップｉｖ）中の温度は、方法のステップｉｉ）中の温度と同じである。
【0114】
主に酵母細胞から得られる調製物を参照して本明細書に記載されているが、本発明はこれに限定されない。他の様々な微生物を使用することができる。実施形態では、微生物は、酵母（好ましくはサッカロミセス種（Saccharomyces sp）、より好ましくはビール酵母またはパン酵母）を含む真菌；植物、特に微細藻類（テトラセルミス属（Tetraselmis sp）またはクロレラ種（Chlorella sp）、例えばＣ．ブルガリス（C. vulgaris）を含む）;およびシアノバクテリア（アルスロスピラ属（Arthrospira sp）、好ましくはＡ.プラテンシス（A. platensis）を含む）から選択され得る。微生物は、細菌、例えば乳酸菌からも選択してもよい。
【0115】
開示された実施形態に対する他の変形（物）は、図面、開示、および添付の特許請求の範囲の研究から、請求された発明を実施する当業者によって理解され、また実行され得る。特許請求の範囲において、「含む（comprising）」という言葉は他の要素またはステップを除外するものではなく、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は複数を除外するものではない。特定の手段が相互で異なっている従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用できないことを示すものではない。
【0116】
本発明の範囲は、特許請求の範囲によって定義される。本発明の目的の１つ以上は、添付の特許請求の範囲によって達成される。
【0117】
［方法］
［微生物細胞を含む水性懸濁液の準備］
水性懸濁液を準備する例では、１００ｇ／Ｌの濃度（１０％乾燥重量）に到達するように、一定温度で穏やかに撹拌しながら、既知の体積の水にパン酵母(乾燥懸濁液または湿潤懸濁液として)を加えることにより、水性懸濁液を調製する。均質な懸濁液が得られるまで撹拌を行う。
［微生物細胞を含む水性懸濁液の準備］
水性懸濁液を準備する例では、１００ｇ／Ｌの濃度（１０％乾燥重量）に到達するように、一定温度で穏やかに撹拌しながら、既知の体積の水にパン酵母(乾燥懸濁液または湿潤懸濁液として)を加えることにより、水性懸濁液を調製する。均質な懸濁液が得られるまで撹拌を行う。
【0118】
［ｐＨの調整］
ｐＨの調整は、一例として、微生物細胞を含む水性懸濁液に、５Ｍ ＮａＯＨ溶液を、一定の穏やかな攪拌および一定の温度の下で、所望のｐＨとなるまでゆっくりと加えることによって行われる。ＮａＯＨの他の溶液、および他のタイプの塩基（例えば、ＣａＯＨ２）を使用して、微生物懸濁液のｐＨを調整することができる。同様に、適切な酸の溶液を使用して、微生物懸濁液のｐＨを下げることができる。
ｐＨの調整は、一例として、微生物細胞を含む水性懸濁液に、５Ｍ ＮａＯＨ溶液を、一定の穏やかな攪拌および一定の温度の下で、所望のｐＨとなるまでゆっくりと加えることによって行われる。ＮａＯＨの他の溶液、および他のタイプの塩基（例えば、ＣａＯＨ２）を使用して、微生物懸濁液のｐＨを調整することができる。同様に、適切な酸の溶液を使用して、微生物懸濁液のｐＨを下げることができる。
【0119】
［前処理］
一例では、微生物バイオマスの前処理は、以下の４つのステップを含む洗浄によって実施することができ：
（１）均一な酵母懸濁液（１００ｇ／Ｌ）を３０００ｒｃｆで５分間、温度１５℃で遠心分離する。
（２）得られた上澄みを除去し、等量の水に置き換える。
（３）得られた懸濁液を、均質な懸濁液が得られるまで穏やかに混合する。
（４）ステップ（１）～（３）を２～３回繰り返す。除去された上澄みは、別々に収集するか、または混合して副生成物（本発明における副生成物１）を得ることができる。
（５）ステップ１～４は、当技術分野で知られているプロセス構成を用いて、当業者によって実施され得る。そのような構成の一例は、向流（counter-current）または並流（co-current）洗浄である。
一例では、微生物バイオマスの前処理は、以下の４つのステップを含む洗浄によって実施することができ：
（１）均一な酵母懸濁液（１００ｇ／Ｌ）を３０００ｒｃｆで５分間、温度１５℃で遠心分離する。
（２）得られた上澄みを除去し、等量の水に置き換える。
（３）得られた懸濁液を、均質な懸濁液が得られるまで穏やかに混合する。
（４）ステップ（１）～（３）を２～３回繰り返す。除去された上澄みは、別々に収集するか、または混合して副生成物（本発明における副生成物１）を得ることができる。
（５）ステップ１～４は、当技術分野で知られているプロセス構成を用いて、当業者によって実施され得る。そのような構成の一例は、向流（counter-current）または並流（co-current）洗浄である。
【0120】
［細胞破砕］
酵母の細胞破砕の例では、ビーズミリングの使用により細胞破砕を実施する。このビーズミリングは、Ｄｙｎｏ Ｍｉｌｌ研究所（Ｗｉｌｌｙ Ａ. Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ）で行われる。ｐＨ８．９で１００ｇ／Ｌ（１０％ＤＷ）のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を含有する２００ｍｌの溶液を、バッチ再循環モードで１５分間処理する。２０３９ｒｐｍの一定速度を用いて、温度を２４～２６℃の範囲で制御する。ミルは、６５％の充填率で０．５ｍｍの球状ジルコニウムビーズを含有する。したがって、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液が得られる。
酵母の細胞破砕の例では、ビーズミリングの使用により細胞破砕を実施する。このビーズミリングは、Ｄｙｎｏ Ｍｉｌｌ研究所（Ｗｉｌｌｙ Ａ. Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ）で行われる。ｐＨ８．９で１００ｇ／Ｌ（１０％ＤＷ）のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を含有する２００ｍｌの溶液を、バッチ再循環モードで１５分間処理する。２０３９ｒｐｍの一定速度を用いて、温度を２４～２６℃の範囲で制御する。ミルは、６５％の充填率で０．５ｍｍの球状ジルコニウムビーズを含有する。したがって、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液が得られる。
【0121】
［分離処理］
分離の一例では、分離は、スイングバケットを備えたベンチトップ遠心分離機アレグラＸ－２２Ｒで実施される遠心分離によって行われる。小細胞断片が豊富な抽出物が得られるとともに、大細胞断片が豊富な抽出物とも呼ばれる、小細胞断片が部分的に枯渇した水性懸濁液である残留物も得られる。
分離の一例では、分離は、スイングバケットを備えたベンチトップ遠心分離機アレグラＸ－２２Ｒで実施される遠心分離によって行われる。小細胞断片が豊富な抽出物が得られるとともに、大細胞断片が豊富な抽出物とも呼ばれる、小細胞断片が部分的に枯渇した水性懸濁液である残留物も得られる。
【0122】
［精製処理］
精製の一例では、精製は、ラボスケールのＴＴＦシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて実施される濾過によって行われる。濾過は、＜１ｂａｒの一定の膜貫通圧および再循環モードで行われ、３～６倍の濃縮係数が達成される。試行ごとに、各濾過循環の前に、水で１倍に希釈する。したがって、精製もダイアフィルトレーションプロセスとして行われる。
精製の一例では、精製は、ラボスケールのＴＴＦシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて実施される濾過によって行われる。濾過は、＜１ｂａｒの一定の膜貫通圧および再循環モードで行われ、３～６倍の濃縮係数が達成される。試行ごとに、各濾過循環の前に、水で１倍に希釈する。したがって、精製もダイアフィルトレーションプロセスとして行われる。
【0123】
精製は、限外濾過または精密濾過によって行われ、すなわち、上記の方法で限外フィルターまたはマイクロフィルターのいずれかを使用する。限外濾過は、１０ｋＤａ～１０００ｋＤａの範囲の親水性の膜カセット（membrane cassettes）（Ｂｉｏｍａｘ）を使用して行われる。０．２μｍの中空糸膜ユニット（ＧＥ）によって精密濾過を行う。
【0124】
［乾燥］
乾燥の一例では、噴霧乾燥機（Ｏｌｌｉｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて１８０℃で乾燥を行い、最終水分含有量が＜５重量％になるようにする。乾燥は、凍結乾燥機 (Ｚｉｒｂｕｓｓ Ｇｍｂｈ ２ｘ３ｘ３)を使用して、‐２０℃および＜１ｍｂａｒで４８時間行うこともできる。
乾燥の一例では、噴霧乾燥機（Ｏｌｌｉｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて１８０℃で乾燥を行い、最終水分含有量が＜５重量％になるようにする。乾燥は、凍結乾燥機 (Ｚｉｒｂｕｓｓ Ｇｍｂｈ ２ｘ３ｘ３)を使用して、‐２０℃および＜１ｍｂａｒで４８時間行うこともできる。
【実施例】
【0125】
以下の実施例に基づいて本発明をさらに説明するが、これらの実施例は単なる例示であり、本発明を限定するものとは見なされない。
【0126】
［実施例１］
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ７に調整する。
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ７に調整する。
【0127】
上述のように細胞破砕を適用し、破砕した微生物細胞を含む水性懸濁液を得る。
【0128】
［実施例２］
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ７に調整する。
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ７に調整する。
【0129】
上述の細胞破砕およびその後の分離を適用し、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物を得る。
【0130】
［実施例３］
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ９に調整する。
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ９に調整する。
【0131】
小細胞断片が豊富な抽出物について、上記のような、細胞破砕、その後の分離、およびその後の限外濾過による精製を適用し、小細胞断片が豊富な精製抽出物を得る。
【0132】
［実施例４］
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ９に調整する。
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ９に調整する。
【0133】
小細胞断片が豊富な抽出物について、上記のような、細胞破砕、その後の分離、およびその後の精密濾過による精製を適用し、小細胞断片が豊富な精製抽出物を得る。
【0134】
［実施例５］
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ９に調整する。
パン酵母由来の微生物細胞を含む水性懸濁液は、上記のように調製する。細胞破砕の前に、水性懸濁液のｐＨをｐＨ９に調整する。
【0135】
小細胞断片が豊富な抽出物について、上記のような、細胞破砕、その後の分離、およびその後の限外濾過による精製、ならびにその後の乾燥を適用し、小細胞断片が豊富な乾燥精製抽出物を得る。
【0136】
［異なるステップでの温度およびｐＨの変化の例］
表１は、本方法に係る異なるプロセスステップ全体を通したｐＨおよび温度の例を示す。
表１は、本方法に係る異なるプロセスステップ全体を通したｐＨおよび温度の例を示す。
【表1】
【0137】
［ビーズミリング時の処理温度の影響］
ビーズミリング中の温度は、得られた微生物細胞産物のゲル化挙動に影響を及ぼす。
ビーズミリング中の温度は、得られた微生物細胞産物のゲル化挙動に影響を及ぼす。
【0138】
これは、温度を２０～５５℃の範囲で変化させたことを除いて、実施例１を繰り返すことによって調査した。追加の実験を行い（*）、温度制御なしで１時間の長時間にわたって破砕を実行した。最高温度は６０℃を記録した。結果を表２に示す。
【0139】
ビーズミリングの前に、温度を所望の値に調整した。細胞破砕への温度の対応する影響は、フローサイトメーター（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６）を使用して推定した。測定前に、サンプルを水で８０倍に希釈し、フローサイトメーターで分析した。細胞破砕を、前方散乱データから決定した。破壊された細胞の割合は、参照としてＴ＝２０℃でのバイオマス懸濁液を使用して推定した。
【0140】
すべてのサンプルについて、得られた小細胞断片が豊富な抽出物を収集、乾燥、および分析して、ゲル化性能を決定した。
【0141】
ゲル化を以下のように決定した。水に２００ｇ／Ｌ（２０％ＤＷ）を含有する溶液を調製した。１５０ｇ／Ｌ（１５％ＤＷ）および１００ｇ／Ｌ（１０％ＤＷ）に達するように、水でさらに希釈した。ブロックヒーターの使用により懸濁液を９５℃で１０分間加熱し、次いで水浴中で周囲温度まで冷却した（Ｔ＝２５℃）。得られた材料は、以下のランキング（スコア）に従ってゲル化特性を分析し、０はゲル化が観察されなかったことを意味し、１はペーストが観察されたことを意味し、２は粘度が高いペーストが観察されたことを意味し、３は非常に柔らかいゲルが観察されたことを意味し、４は柔らかいゲルが観察されたことを意味し、５は硬いゲルが観察されたことを意味する。
【0142】
【表2】
【0143】
［異なるｐＨ値でのタンパク質立体構造およびタンパク質溶解度に対するｐＨの影響］
実施例２を繰り返したが、懸濁液のｐＨは、ビーズミリングの前の懸濁液のｐＨと異なる値に調整した。小細胞断片が豊富な抽出物を採取し、次のように分析した。ネイティブゲル電気泳動について、サンプルは、ランニングバッファーとして１０ｘトリス‐グリシンバッファーを使用して、４～１２％のクロスリンクを備えたプレキャストゲルに装填した。サンプルを１２５Ｖで７０分間稼働し、天然のタンパク質マーカーと比較した。タンパク質バンドはクーマシーブルーで染色した。
実施例２を繰り返したが、懸濁液のｐＨは、ビーズミリングの前の懸濁液のｐＨと異なる値に調整した。小細胞断片が豊富な抽出物を採取し、次のように分析した。ネイティブゲル電気泳動について、サンプルは、ランニングバッファーとして１０ｘトリス‐グリシンバッファーを使用して、４～１２％のクロスリンクを備えたプレキャストゲルに装填した。サンプルを１２５Ｖで７０分間稼働し、天然のタンパク質マーカーと比較した。タンパク質バンドはクーマシーブルーで染色した。
【0144】
タンパク質溶解度について、タンパク質含有量の指標として、小細胞断片が豊富な抽出物中のタンパク質濃度を分光光度計において２８０ｎｍで測定した。解釈を容易にするために、データを正規化した。
【0145】
図２Ｂから、小細胞断片が豊富な抽出物に存在するタンパク質の溶解度は、アルカリ性のｐＨ値で高いことが明らかである。図２Ａから、特に４～１１（好ましくは７～９）の範囲のアルカリ性ｐＨ値において増加したこの溶解度は、タンパク質および他の分子複合体の天然の立体構造に影響を与えないことが見て取れる。図２Ａは、タンパク質が天然の立体構造で存在する場合のバンドを示す天然ゲル電気泳動である。タンパク質が変性すると、対応するバンドが完全に消失するか、または異なる分子量で新しいバンドが生じることとなる。
【0146】
［ビーズミルでの滞留時間の影響］
実施例２を繰り返し、さらなる分析のためにビーズミリング中の異なる時点でサンプルを採取した。さらなる分析のために小細胞断片が豊富な抽出物を収集した。
実施例２を繰り返し、さらなる分析のためにビーズミリング中の異なる時点でサンプルを採取した。さらなる分析のために小細胞断片が豊富な抽出物を収集した。
【0147】
タンパク質は、ローリーの方法［刊行物 Lowry, O.H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. L.; Randall, R. J. (1951). 「Protein measurement with the Folin phenol reagent」. Journal of Biological Chemistry. 193 (1): 265-75］に従って、標準タンパク質としてＢＳＡを使用して測定した。炭水化物は、デュボアの方法［刊行物 MICHEL DUBOIS, K. A. GILLES, J. K. HAMILTON, P. A. REBERS, and FRED SMITH. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. ANALYTICAL CHEMISTRY. VOLUME 28, NO. 3, MARCH 1956］に従って、標準糖としてブドウ糖を使用して測定した。
【0148】
図３は、ビーズミル内の滞留時間（横軸）の関数として、タンパク質（左の縦軸）および炭水化物（右の縦軸）の可溶化量をプロットしたものを示す。図３は、ビーズミリングの滞留時間がタンパク質および炭水化物の可溶化にどのように影響するかを示している。個々の分子の可溶化速度が異なるため、ビーズミル内のせん断力および滞留時間を調整して、さまざまな組成の抽出物、ひいてはさまざまな機能活性を得ることができる。
【0149】
これは、破砕ステップ中の滞留時間を調整することにより、タンパク質および炭水化物の可溶化のレベルを考慮した制御が可能であることを示している。図３は、２つの異なる滞留時間を選択することにより、組成の大きく異なる２つの抽出物が得られる例を示している。滞留時間が５分（Ｐ１の矢印を参照）の場合、得られた抽出物は、滞留時間が２０分（Ｐ２の矢印を参照）と比較して含有される可溶性炭水化物が３０％少ないことが判明した。さらに、粒度分布は、滞留時間の関数として調整することもできる。最終産物の機能特性は粒度分布に依存するため、これは本発明において特に重要なものである。
【0150】
［ビーズミリング後の細胞画分の粒度分布］
実施例２を繰り返したが、ミリング時間（ビーズミル内の滞留時間）については異なる値を使用した。得られた破砕微生物細胞を含む水性懸濁液（スラリーとも呼ばれる）を分析のために収集した。その後の分離後に得られた小細胞断片が豊富な抽出物も、さらなる分析のために収集した。
実施例２を繰り返したが、ミリング時間（ビーズミル内の滞留時間）については異なる値を使用した。得られた破砕微生物細胞を含む水性懸濁液（スラリーとも呼ばれる）を分析のために収集した。その後の分離後に得られた小細胞断片が豊富な抽出物も、さらなる分析のために収集した。
【0151】
粒度分布は、使い捨ての折り畳まれた毛細管セルを備えたＺｅｔａ－Ｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して測定した。サンプルを、濃度が＜１０ｇ／Ｌ（１％ ＤＷ）になるように水中で調製する。サンプルを、気泡が形成されていないことを確認しながら測定セルに添加する。サンプルを、２５℃、１．３３の屈折率で、３０秒の待機時間で３回測定した。
【0152】
Ｄ９９、Ｄ７０、およびＤ５０の値を、粒度分布データから計算した。Ｄ９９の粒度は、粒子の９９％がこの値よりも大きいことを示している。Ｄ７０の粒度は、粒子の７０％がこの値よりも大きいことを示しており、Ｄ７０（７０％）およびＤ５０（５０％）については必要な変更を加える。各サイズカテゴリの粒子の割合は、粒子の総数から決定し、間隔ごとの対応するサイズを推定した。破砕後および分離処理後の粒子範囲を表３に示す。
【0153】
【表3】
【0154】
図４は、１５分間（「１５分スラリー」 - 黒の実線）および ３時間（「３時間スラリー」 - 灰色の実線) のビーズミリング後の破砕した細胞を含む水性懸濁液中の細胞画分の粒度分布を示している。横軸はナノメートル単位の細胞断片の直径を示し、縦軸はシグナルの強度を示す。これらの実線は、２００～４００ｎｍの範囲のピーク（小細胞断片）並びに、５００～１５００ｎｍおよび５５００ｎｍ付近の領域のピークを示している。さらに、小細胞断片が豊富な抽出物を分離（４０００ｒｃｆで遠心分離）した後、粒度分布を決定した(１５分ＳＮ、３時間ＳＮ、ここで、ＳＮ＝上澄み)。図４に示されるように、前記分離処理の結果は、平均サイズが２００～４００ｎｍの範囲の細胞断片の集団が、遠心分離法を使用して選択的に維持されており、換言すれば、これら小細胞断片は抽出物に移行するが、大細胞断片は最初に破壊された懸濁液（または、小細胞断片が枯渇した水性懸濁液もしくは大細胞断片が豊富な抽出物）内に留まる。これは、本発明の分離ステップの効果を明確に示している。発明者らが驚いたことには、そのような小細胞断片（すなわち、小細胞断片が豊富な抽出物）は、タンパク質単離物などの高純度成分に文献で割り当てられたものに匹敵する機能特性を示す。
【0155】
本発明は、しばしば小断片が豊富な抽出物について５００ｎｍの粒度に言及する。明確かつ簡潔にするために、この値はｄ５０を指す。
【0156】
本発明の１つの重要な要素は、小断片が豊富な抽出物および大断片が豊富な抽出物が多峰性分布を示すという事実である。したがって、マスターサイザー２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して、分散剤（水）の屈折率を１．３３、また酵母の場合は粒子の屈折率を１．３４として、上記の抽出物および産物のさらなる特徴付けを行った。すべての分析は、ミー散乱モデルを使用して行った。
【0157】
［遠心力の影響］
実施例２を繰り返したが、分離ステップ中の遠心力にさまざまな値を用いた。得られた小細胞断片が豊富な抽出物を、さらなる分析のために収集した。
実施例２を繰り返したが、分離ステップ中の遠心力にさまざまな値を用いた。得られた小細胞断片が豊富な抽出物を、さらなる分析のために収集した。
【0158】
最大ゲル化強度（Ｇ’［Ｐａ］）を、レオメーター（Ａｎｔｈｏｎ Ｐａｒｒ）で測定した。サンプルを加熱冷却処理（順次、２５℃、９０℃、２５℃）に供した。Ｇ’ｍａｘ（貯蔵弾性率（storage modulus）とも呼ばれる）の値を、冷却ステップ（約２８℃の温度）の最後に得た。
【0159】
図５は、いくつかの遠心力（ＲＦＣ）および、最大ゲル強度に対するその影響についてのバーを示している。図５に示すように、本発明者らは、遠心力を調整することが、分離処理の結果として得られる抽出物の機能特性に直接影響を与えることを発明的に発見した。低遠心力を用いることで、小細胞断片が豊富な抽出物(上澄み)のゲル化特性が向上する。当業者は、本明細書に開示された発明に基づいて、細胞断片の集団を２００～４００ｎｍの範囲に維持しながら、所望の固‐液分離を達成するための、遠心力の特定の値および必要な時間を調整することができる。図５に示す例では、遠心力＜４０００ｒｆｃ、時間＜１５分が好ましい。
【0160】
［小細胞断片が豊富な抽出物のゲル化挙動に対する膜カットオフの影響］
実施例３を繰り返したが、精製中に使用したフィルターの膜カットオフ値については異なる値を使用した。
実施例３を繰り返したが、精製中に使用したフィルターの膜カットオフ値については異なる値を使用した。
【0161】
得られた小断片が豊富な精製抽出物を、さらなる分析のために収集した。
【0162】
最大ゲル化強度（Ｇ’［Ｐａ］）を、レオメーター（Ａｎｔｈｏｎ Ｐａｒｒ）で測定した。サンプルを加熱冷却処理（順次、２５℃、９０℃、２５℃）に供した。Ｇ’ｍａｘ［Ｐａ］の値は、冷却ステップの終了時（約２８℃の温度）で得られた。
【0163】
図６は、ゲル強度によって測定された、卵白タンパク質単離物、ホエイタンパク質単離物およびエンドウタンパク質単離物などの他のタンパク質が豊富な供給源と比較した、本発明に係る小細胞断片が豊富な精製抽出物のバーを示している。図６は、膜ベースの濾過を精製処理として適用して、小細胞断片が豊富な抽出物のゲル化特性を大幅に向上できることを示している。０．２、１００、および１０という数字は、膜のカットオフ値、つまり２μｍ、１００ｋＤａ、および１０ｋＤａを表す。特に、膜ベースの濾過を使用して、小細胞断片が豊富な抽出物を、濃縮水（retentate）相（小細胞断片が豊富な精製抽出物）および透過相（副生成物）に精製できる。図６はまた、比較として、ｐＨ７（豊富な画分ｐＨ７）またはｐＨ９（豊富な画分ｐＨ９）で破砕した小細胞断片が豊富な抽出物を示す。図６に示すように、小細胞断片が豊富な精製抽出物（濃縮水画分）は、良好なゲル化特性を示す。さらに、小細胞断片が豊富な抽出物は、特にｐＨ９でのゲル化特性も示す。
【0164】
［表面張力］
実施例３を繰り返したが、精製中に使用したフィルターの膜カットオフ値については異なる値を使用した。得られた副生成物および小断片が豊富な精製抽出物を、次のようにさらなる分析のために収集した。
実施例３を繰り返したが、精製中に使用したフィルターの膜カットオフ値については異なる値を使用した。得られた副生成物および小断片が豊富な精製抽出物を、次のようにさらなる分析のために収集した。
【0165】
表面張力は、自動落下張力計（ＡＤＴ、Ｔｅｃｌｉｓ Ｔｒａｃｋｅｒ）を使用して測定した。参照サンプルとして、空気‐水および、ヘキサデカン－水（油－水）を使用した。
【0166】
図７は、空気‐水界面の副生成物（Ｐ）の平衡表面張力（左）、および油‐水界面の小細胞断片が豊富な精製抽出物（Ｒ）の平衡表面張力（右）を示すバーを示している。卵白タンパク質単離物およびホエイタンパク質単離物の値を比較として用いている。平衡表面張力は、表面安定性の程度を反映しており、より低い値は、より優れた活性を有するサンプルから得られる。０．２、１０００、１００および１０、という数字は、精製ステップ中の濾過で使用される膜のカットオフ値、つまり２μｍ、１０００ｋＤａ、１００ｋＤａ、および１０ｋＤａを表す。本発明のいくつかの実施形態による精製処理は、小細胞断片が豊富な抽出物を、小細胞断片が豊富な精製抽出物および副生成物に選択的に分画する方法を提供する。これらの抽出物は両方とも、ゲル化挙動に加えて、図７に示すように優れた表面活性を示す。本発明者らは、そのような表面活性はまた、本発明に係る抽出物の発泡活性および乳化活性にも反映され、典型的なタンパク質単離物に匹敵するか、またはより優れていることを発見した。
【0167】
［抽出物の組成例］
実施例３を実施し、得られた抽出物をさらに分析した。
実施例３を実施し、得られた抽出物をさらに分析した。
【0168】
分離処理後に得られる小細胞断片および大細胞断片が豊富な抽出物は、タンパク質および炭水化物が豊富であり得る。表４は、小細胞断片が豊富な抽出物および大細胞断片が豊富な抽出物の組成例を示している。表中の「灰分（ash）」は鉱物などの無機物を指す。
【0169】
【表4】
【0170】
［さらなる調査］
微生物調製物の特性に対するさまざまな処理および調製方法の影響に関して、さらなる調査を行った。図９に見られるように、破砕プロセスが長時間にわたって実行されると、粒度分布が変化する。酵母の場合、破壊時間が長くなるにつれて無傷の細胞のピークが減少し、細胞断片のピークが増加して、無傷の細胞のピークが約６μｍ、および細胞断片のピークが約０．８μｍになる。したがって、破砕プロセスは、所望の粒度分布が得られるまで実行することができる。酵母の場合、所望するターゲットｐｓｄは、Ｄ１０＜０．５μｍ、Ｄ５０＜４．５μｍ、Ｄ９０＜７．５μｍ、およびＤ［３，２］＜２、Ｄ［４，３］＜４．５である。
微生物調製物の特性に対するさまざまな処理および調製方法の影響に関して、さらなる調査を行った。図９に見られるように、破砕プロセスが長時間にわたって実行されると、粒度分布が変化する。酵母の場合、破壊時間が長くなるにつれて無傷の細胞のピークが減少し、細胞断片のピークが増加して、無傷の細胞のピークが約６μｍ、および細胞断片のピークが約０．８μｍになる。したがって、破砕プロセスは、所望の粒度分布が得られるまで実行することができる。酵母の場合、所望するターゲットｐｓｄは、Ｄ１０＜０．５μｍ、Ｄ５０＜４．５μｍ、Ｄ９０＜７．５μｍ、およびＤ［３，２］＜２、Ｄ［４，３］＜４．５である。
【0171】
さまざまな分離条件の効果を図１１～図１３に示す。これらの例では、破壊された酵母調製物を、低強度、中強度、および高強度の遠心分離によって分離した。低強度および中強度は、ＥＥＳＦの収率を向上させることができる。例として、ＥＥＳＦの１０％を超える収率（ＤＷ）は、低および中の遠心強度と高遠心強度とを使用して得られる。
【0172】
さらに、高強度では、ＥＥＳＦのゲル形成特性が低下するが、低強度および中強度ではゲル形成特性が改善される（図１１）。高強度の分離を用いると、ＥＥＳＦの機能が低下する。中程度の分離強度が、ＥＥＳＦで優れた機能性を確保するのに好ましい。この文脈における「機能性（functionality）」とは、ゲル化硬度を意味し、例として、低強度分離では０．０８～０．１Ｎのゲル硬度が得られ、高強度分離では０．０５～０．０７Ｎのゲル硬度が得られる。
【0173】
異なる分離強度が、ＥＥＳＦまたはＥＥＬＦの粒子含有量を変更すると考えられる（図１２および図１３を参照）。分離強度を上げると比表面積は増加するが、粒子数は大幅に減少する。０．１～３μｍの範囲の粒子を有するＥＥＳＦを濃縮するために、低い分離強度を使用することが好ましい。高強度分離条件では、主に可溶性化合物が液相に残り、０．１～０．３μｍの範囲の少量の粒子が残る（図１２を参照）。分離強度を上げると比表面積は増加するが、粒子数は大幅に減少する（図１３を参照）。これらの粒子は、ＥＥＳＦの全体的な収率および機能特性を向上させるために不可欠であり、ゆえに、低分離強度と高分離強度との間のバランスを見つけなければならない。
【0174】
ＥＥＬＦは、優先的に２～１０μｍの範囲の断片を含有する。油保持能力を損なうことなく水保持能力を高めるには、２～１０μｍの範囲の細胞断片が好ましい。以下の表を見ると、ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦの水および油の保持能力、それに加えて好ましい粒度分布が示されている。
【表5】
【0175】
ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦのｐｓｄには、特に１～４μｍの範囲で重複があることに注意されたい。これは、低強度の分離を使用した場合により顕著になる（図１２を参照）。したがって、中間強度の分離を使用することが好ましい。
【0176】
画分の機能特性を修正するために、異なる希釈で分離を行うこともできる（図１４～図１８を参照）。例えば、分離は、２０％～２．５％まで変化する乾燥重量（ＤＷ）含量で実施することができる。分離前にＤＷ含有量を減らすことにより（希釈程度を増加することに相当)、ゲル化特性およびＥＥＬＦの水保持能力が向上する。その結果、ＥＥＳＦの機能特性が低下する（図１４を参照）。逆に、低いＤＷ含有量で分離が行われる場合、ＥＥＬＦにおける水保持能力および油保持能力はとりわけ改善される（図１５を参照）。
【0177】
ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦのｐｓｄの範囲は、異なる希釈レベルが実装されている場合、実際的に影響を受けない。多峰性分布の主要なピークの相対的な寄与のみが変化する。～０．２μｍにピークを有する粒子と～１．５‐２μｍに広いピークを有する粒子の寄与は、希釈レベルが高くなるほど増加する（図１６を参照）。同様に、希釈レベルが高いほどトータルの比表面積（ＳＳＡ）が高くなり（図１７を参照）、Ｄ［３，２］およびＤ［４，３］は希釈レベルの増加とともに減少する（図１８を参照）。
【0178】
［他の微生物］
これまでの例では出発微生物として酵母を使用してきたが、機能活性を有する細胞断片を生成するために、記載されたプロセスを他の微生物にも適用することができる。以下の表は、本発明に係る分離条件下で、２つの微細藻類種および１つのシアノバクテリア種のＥＥＳＦから得られたゲルの硬度を示す。
これまでの例では出発微生物として酵母を使用してきたが、機能活性を有する細胞断片を生成するために、記載されたプロセスを他の微生物にも適用することができる。以下の表は、本発明に係る分離条件下で、２つの微細藻類種および１つのシアノバクテリア種のＥＥＳＦから得られたゲルの硬度を示す。
【0179】
【表6】
【0180】
さらに、Ｓ／Ｌ（小／大）分離の前に高希釈を行うと、ゲル化硬度などのＥＥＬＦの機能特性が向上するという有利性がある。
【表7】
【0181】
さらに、Ｓ／Ｌ分離ステップの前に希釈レベルを調整することで、他の機能特性、例えば油保持容量（ＯＨＣ）を調整することを有利に行える（図１９を参照）。
【0182】
［延長された細胞破砕］
ＥＥＬＦの機能特性を強化するために、細胞破砕ステップをさらに延長することができる。例として、優れたゲル硬度、水保持容量ＷＨＣ、および油保持容量ＯＨＣを備えたＥＥＬＦを生成するために、ｐｓｄを２４０分間にわたって修正できる。
ＥＥＬＦの機能特性を強化するために、細胞破砕ステップをさらに延長することができる。例として、優れたゲル硬度、水保持容量ＷＨＣ、および油保持容量ＯＨＣを備えたＥＥＬＦを生成するために、ｐｓｄを２４０分間にわたって修正できる。
【0183】
【表8】
【0184】
アルカリ性条件、優先的にｐＨ＞９で細胞破砕を実施し、低ＤＷ含有量（＜ ５％）でＳ／Ｌ分離を実行することにより、ＥＥＬＦの機能特性が大幅に強化される（図２０を参照）。しかし、アルカリ性ｐＨでは、延長された細胞破砕が続く過程でｐｓｄが独特の傾向を示す。微粉化プロセスで予想される、粒度の着実な減少の代わりに、粒子は凝集する傾向がある。この効果は、ｐＨ１１で特に顕著である（図２１を参照）。
【0185】
ｐＨ１１で行われる延長された細胞破砕プロセスに続いて、高希釈レベル（ＤＷ＜５％）でのＳ／Ｌにより、酵母バイオマスに適用される従来のＢ－グルカン抽出プロセスと比較して、優れた機能を備えたＥＥＬＦが生成される。参考までに、細胞の自己消化、細胞の均質化、アルカリ抽出、酸抽出、水抽出（Aut+Hom+Extr）を含むプロセスを、現在提案されている方法（ｐＨ１１での延長された破砕および高希釈）と比較した。
【表9】
【0186】
参照プロセスは、［Samoani Tammakiti、Manopi Suphantarika、Tanaporn Fayesuan、Cornell Verduyna Preparation of spent brewer's yeast β-glucans for potential applications in the food industry. Food Science and Technology. Volume 39, Issue1, January 2004, Pages 21-29.］によって報告されている。
【0187】
[濃縮と乾燥]
ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦの機能特性は、蒸発や乾燥だけでなく凍結などの熱プロセスの結果として劣化する。したがって、両方の画分（ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦ）を湿式成分として適用し、熱変性を誘発する可能性のあるプロセスを避けることが好ましい。優先的に、両方の画分は４５℃を超えるまたは０℃未満の温度で処理すべきではない。
ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦの機能特性は、蒸発や乾燥だけでなく凍結などの熱プロセスの結果として劣化する。したがって、両方の画分（ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦ）を湿式成分として適用し、熱変性を誘発する可能性のあるプロセスを避けることが好ましい。優先的に、両方の画分は４５℃を超えるまたは０℃未満の温度で処理すべきではない。
【0188】
［成分のブレンド］
一旦調製したＥＥＬＦおよびＥＥＳＦを混合して、本発明に係る微生物細胞調製物を得ることができる。乾式または湿式成分(ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦ)を組み合わせ／ブレンドすることで、特に食品用途でテクスチャーを生み出すための個別に調整された機能性を付与できる。これらの比率は、破壊されたスラリーの比率と等しくないことに注意することが重要であり、換言すれば、ストリームを分離させ（上記で説明した遠心分離を使用して）、特定の比率でブレンドし直す必要がある。この例としては以下が挙げられ、代替肉バーガーのテクスチャライザーとして、成分の総濃度を同じに保ちながら、ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦの比率を変えると、硬さ、弾力性、ジューシーさおよび乾燥感が変化する。これにより、食品を調合する者は、求めているテクスチャーを実現するための幅広い選択肢を得ることができる。例えば、それぞれを１００：０から０：１００の範囲の比率で混合すると、７０ ＥＥＳＦ：３０ ＥＥＬＦの混合では固く弾力があり、乾燥していないハンバーガーとなり、一方４０ ＥＥＳＦ：６０ ＥＥＬＦの混合ではより柔らかく、よりジューシーで「脂っぽい」ハンバーガーとなる。したがって、当該比率は特定の市場向けに最適化され得る。
一旦調製したＥＥＬＦおよびＥＥＳＦを混合して、本発明に係る微生物細胞調製物を得ることができる。乾式または湿式成分(ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦ)を組み合わせ／ブレンドすることで、特に食品用途でテクスチャーを生み出すための個別に調整された機能性を付与できる。これらの比率は、破壊されたスラリーの比率と等しくないことに注意することが重要であり、換言すれば、ストリームを分離させ（上記で説明した遠心分離を使用して）、特定の比率でブレンドし直す必要がある。この例としては以下が挙げられ、代替肉バーガーのテクスチャライザーとして、成分の総濃度を同じに保ちながら、ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦの比率を変えると、硬さ、弾力性、ジューシーさおよび乾燥感が変化する。これにより、食品を調合する者は、求めているテクスチャーを実現するための幅広い選択肢を得ることができる。例えば、それぞれを１００：０から０：１００の範囲の比率で混合すると、７０ ＥＥＳＦ：３０ ＥＥＬＦの混合では固く弾力があり、乾燥していないハンバーガーとなり、一方４０ ＥＥＳＦ：６０ ＥＥＬＦの混合ではより柔らかく、よりジューシーで「脂っぽい」ハンバーガーとなる。したがって、当該比率は特定の市場向けに最適化され得る。
【0189】
ベーカリーでの卵の代替品として、ベーカリーにおける成分の期待される用途は、ＥＥＳＦを使用して、ベーカリー用途における卵白または全卵と置き換えることであろう。これは実にうまく機能することが証明されているが、驚いたことに、ＥＥＳＦおよびＥＥＬＦを５０：５０でブレンドして使用すると、全卵に代わってより良いテクスチャーおよびパフォーマンスを得る。ここで必要とされる主な機能はヒートセットゲル化であるため、これは直観に反しており、ＥＥＳＦの方がゲル化特性に優れていることから、期待される結果は、組み合わせよりもＥＥＳＦがうまく機能することである。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【国際調査報告】