特表 2023-543041 分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物、それを含む組成物、及びそれを利用して標的産物を生産する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-12

(54)【発明の名称】分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物、それを含む組成物、及びそれを利用して標的産物を生産する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20231004BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231004BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231004BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231004BHJP

   C12P 1/00 20060101ALI20231004BHJP

   C12P 5/02 20060101ALI20231004BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20231004BHJP

【ＦＩ】

C12N1/19

C12N1/15 ZNA

C12N1/21

C12N5/10

C12P1/00 Z

C12P5/02

C12N15/62 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023519309

(86)(22)【出願日】2021-07-08

(85)【翻訳文提出日】2023-03-27

(86)【国際出願番号】 KR2021008714

(87)【国際公開番号】W WO2022065643

(87)【国際公開日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】10-2020-0125985

(32)【優先日】2020-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0037445

(32)【優先日】2021-03-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514266091

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティチュート オブ ケミカル テクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】イ、 ジュ ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ソン、 ソ ヒ

(72)【発明者】

【氏名】キム、 ジェ ウン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AB04

4B064CA06

4B064CA19

4B064DA16

4B064DA20

4B065AA80X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC03

4B065CA03

4B065CA52

4B065CA60

(57)【要約】

分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物、それを含む組成物、及びそれを利用して標的産物を生産する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む、組換え微生物。

【請求項2】

前記分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質分泌能を有するものである、請求項１に記載の組換え微生物。

【請求項3】

前記標的産物結合タンパク質は、脂質結合タンパク質である、請求項１に記載の組換え微生物。

【請求項4】

前記脂質結合タンパク質は、上清タンパク質因子（ＳＰＦ）、Ｓｅｃ１４、ＴＴＰ、α－トコフェロール転移タンパク質、細胞性レチナール結合タンパク質、イカレチナール結合タンパク質、または標的産物結合能を有するそれらの断片からなる群のうちから選択されるものである、請求項３に記載の組換え微生物。

【請求項5】

前記標的産物生産能が増大されたものである、請求項１に記載の組換え微生物。

【請求項6】

前記標的産物は、代謝産物である、請求項１に記載の組換え微生物。

【請求項7】

前記脂質は、テルペノイド化合物である、請求項６に記載の組換え微生物。

【請求項8】

前記標的産物は、２，３－オキシドスクアレン（2,3-oxidosqualene）、ミルセン(myrcene)、（ｚ）－オシメン（(z)-ocimene）、リナロール（linalool）、ゲラニオール（geraniol）、ネロール（nerol）、リモネン（limonene）、メントール（menthol）、α－ピネン（α－pinene）、ショウノウ（camphor）、カルバクロール（carvacrol）、カルボン（carvone）、β－ファルネセン（β－farnesene）、ネロリドール（nerolidol）、β－ビサボレン（β－bisabolene）、バレンセン（valencene）、アモルファジエン（amorphadiene）、カプシジオール（capsidiol）、α－セドラン（α－cedrane）、アルテミシニン（artemisinin）、フィタン（phytane）、フィトール（phytol）、カンホレン（camphorene）、レチノール（retinol）、ラブダン（labdane）、クレロドン（clerodone）、ピマラン（pimarane）、アビエタン（abietane）、チグリアン（tigliane）、カウラン（kaurane）、タキサン（taxane）、スクアレン（squalene）、ラノステロール（lanosterol）、α－アミリン（α－amyrin）、β－アミリン（β－amyrin）、ホパン（hopane）、オレアノール酸（oleanolic acid）、リコペン（lycopene）、ルビキサンチン（rubixanthin）、β－カロテン（β－carotene）、ルテイン（lutein）、ゼアキサンチン（zeaxanthin）及びアスタキサンチン（astaxanthin）からなる群のうちから選択される化合物である、請求項１に記載の組換え微生物。

【請求項9】

前記分泌シグナル配列は、Ｓｕｃ２，Ｐｈｏ５及びＭＦαからなる群のうちから選択された１以上である、請求項１に記載の組換え微生物。

【請求項10】

該標的産物をコーディングするポリヌクレオチドの発現を増大させる遺伝子改変、または該標的産物を生産する代謝経路を強化させる遺伝子改変を含むものである、請求項１に記載の組換え微生物。

【請求項11】

酵母細胞である、請求項１に記載の組換え微生物。

【請求項12】

サッカロミケス（Saccharomyces）属である、請求項１１に記載の組換え微生物。

【請求項13】

前記標的産物は、２，３－オキシドスクアレン（2,3-oxidosqualene）、ミルセン(myrcene)、（ｚ）－オシメン（(z)-ocimene）、リナロール（linalool）、ゲラニオール（geraniol）、ネロール（nerol）、リモネン（limonene）、メントール（menthol）、α－ピネン（α－pinene）、ショウノウ（camphor）、カルバクロール（carvacrol）、カルボン（carvone）、β－ファルネセン（β－farnesene）、ネロリドール（nerolidol）、β－ビサボレン（β－bisabolene）、バレンセン（valencene）、アモルファジエン（amorphadiene）、カプシジオール（capsidiol）、α－セドラン（α－cedrane）、アルテミシニン（artemisinin）、フィタン（phytane）、フィトール（phytol）、カンホレン（camphorene）、レチノール（retinol）、ラブダン（labdane）、クレロドン（clerodone）、ピマラン（pimarane）、アビエタン（abietane）、チグリアン（tigliane）、カウラン（kaurane）、タキサン（taxane）、スクアレン（squalene）、ラノステロール（lanosterol）、α－アミリン（α－amyrin）、β－アミリン（β－amyrin）、ホパン（hopane）、オレアノール酸（oleanolic acid）、リコペン（lycopene）、ルビキサンチン（rubixanthin）、β－カロテン（β－carotene）、ルテイン（lutein）、ゼアキサンチン（zeaxanthin）及びアスタキサンチン（astaxanthin）からなる群のうちから選択される化合物であり、
前記標的産物結合タンパク質は、上清タンパク質因子（ＳＰＦ）、Ｓｅｃ１４、ＴＴＰ、α－トコフェロール転移タンパク質、細胞性レチナール結合タンパク質、イカレチナール結合タンパク質、または標的産物結合能を有するそれらの断片からなる群のうちから選択されるものであり、
酵母細胞である、請求項１に記載の組換え微生物。

【請求項14】

分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物、及び担体を含む、標的産物を生産することに使用するための組成物。

【請求項15】

分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物を、培地内で培養する段階を含む、標的産物を生産する方法。

【請求項16】

前記培養する段階は、培地または水に対する標的産物の溶解度に比べ、標的産物の溶解度が高い化合物を含む培地中で培養する段階を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記標的産物を分離する段階を含み、前記標的産物を分離する段階は、培養物から上清を分離する段階を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記上清から、前記標的産物を分離する段階を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

培地または水に対する標的産物の溶解度に比べ、標的産物の溶解度が高い化合物層から標的産物を分離する段階を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

前記標的産物は、２，３－オキシドスクアレン（2,3-oxidosqualene）、ミルセン(myrcene)、（ｚ）－オシメン（(z)-ocimene）、リナロール（linalool）、ゲラニオール（geraniol）、ネロール（nerol）、リモネン（limonene）、メントール（menthol）、α－ピネン（α－pinene）、ショウノウ（camphor）、カルバクロール（carvacrol）、カルボン（carvone）、β－ファルネセン（β－farnesene）、ネロリドール（nerolidol）、β－ビサボレン（β－bisabolene）、バレンセン（valencene）、アモルファジエン（amorphadiene）、カプシジオール（capsidiol）、α－セドラン（α－cedrane）、アルテミシニン（artemisinin）、フィタン（phytane）、フィトール（phytol）、カンホレン（camphorene）、レチノール（retinol）、ラブダン（labdane）、クレロドン（clerodone）、ピマラン（pimarane）、アビエタン（abietane）、チグリアン（tigliane）、カウラン（kaurane）、タキサン（taxane）、スクアレン（squalene）、ラノステロール（lanosterol）、α－アミリン（α－amyrin）、β－アミリン（β－amyrin）、ホパン（hopane）、オレアノール酸（oleanolic acid）、リコペン（lycopene）、ルビキサンチン（rubixanthin）、β－カロテン（β－carotene）、ルテイン（lutein）、ゼアキサンチン（zeaxanthin）及びアスタキサンチン（astaxanthin）によってなる群のうちから選択される化合物であり、
前記標的産物結合タンパク質は、上清タンパク質因子（ＳＰＦ）、Ｓｅｃ１４、ＴＴＰ、α－トコフェロール伝達タンパク質、細胞性レチナール結合タンパク質、イカレチナール結合タンパク質、または標的産物結合能を有するそれらの断片からなる群のうちから選択されるものであり、
前記組換え微生物である酵母細胞である、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物、それを含む組成物、及びそれを利用して標的産物を生産する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

組換え微生物を利用し、多くの産物が生産されている。例えば、組換え大腸菌または組換えサッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）を含む酵母細胞を使用し、さまざまな産物が生産されている。

【0003】

しかしながら、一部産物は、組換え微生物において生合成された後、細胞内に存在する。細胞内に存在する産物は、それを分離するために、細胞を破砕するさらなる段階を必要とする。

【0004】

従って、生合成された後、細胞内に存在する産物を、細胞外に分泌させることができる組換え微生物、及びそれを利用して産物を生産する方法を求める要求がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

一態様は、分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物を提供する。

【0006】

他の態様は、前述の分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物、及び担体を含む、標的産物を生産するのに使用するための組成物を提供する。

【0007】

他の態様は、分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物を、培地内で培養する段階を含む、標的産物を生産する方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

一態様は、分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物を提供する。

【0009】

前記ポリヌクレオチドは、前記組換え微生物のゲノムにまたはゲノム外に存在するものでありうる。前記ポリヌクレオチドは、調節配列に作動可能に連結されたものでもありうる。前記調節配列は、ポリヌクレオチドから、前記タンパク質を生合成または生産することにおいて必要な配列でありうる。前記調節配列は、転写調節配列、翻訳調節配列及び翻訳後修飾調節配列でありうる。前記調節配列は、プローモーター、オペレーター、ターミネーター、エンハンサ、リボソーム結合部位、またはそれらの組み合わせでありうる。前記調節配列は、前記組換え微生物が組み換えられる前、内在的に存在するもの、または外来調節配列でありうる。前記調節配列は、前記分泌シグナル配列が融合されていないネイキッド標的産物結合タンパク質をコーディングする遺伝子の調節配列、またはそれと異なるタンパク質をコーディングする遺伝子の調節配列でありうる。前記ポリヌクレオチドは、複数個のコピーで、前記細胞に含まれているものでもありうる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、２個コピー以上、５個コピー以上、１０個コピー以上、５０個コピー以上、１００個コピー以上、２ないし１，０００個コピー、２ないし５００個コピー、２ないし１００個コピー、２ないし５０個コピー、２ないし１０個コピー、２ないし５個コピー、５ないし１００個コピー、５ないし５０個コピー、５ないし１０個コピー、５ないし１００個コピー、５ないし１０個コピー、１０ないし１００個コピー、または１０ないし５０個コピーで、前記細胞に含まれているものでありうる。前記ポリヌクレオチドは、前記調節配列と、発現可能になるように連結されたものでありうる。前記ポリヌクレオチドは、内在的ポリヌクレオチド発現に比べ、上昇されたレベルに発現されるようにする調節配列に連結されたものでありうる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、内在的プローモーターに比べ、さらに強い転写開始能を有するプローモーターに連結されたものでありうる。

【0010】

前記ポリヌクレオチドはまた、細胞外に分泌された前記複合体、または解離された標的産物結合タンパク質を分離するのに使用するためのタグ（tag）配列をコーディングするヌクレオチド配列も含みうる。前記タグ配列は、オリゴペプチドでありうる。前記タグ配列は、２以上のアミノ酸、例えば、２ないし５０個アミノ酸配列、２ないし３０個アミノ酸配列、２ないし２０個アミノ酸配列、２ないし１５個アミノ酸配列、または２ないし１０個アミノ酸配列を含むものでありうる。前記タグ配列は、例えば、Ｈｉｓタグ配列でありうる。前記Ｈｉｓタグは、前記標的産物結合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結されたものでありうる。前記タグは、６ｘＨｉｓでありうる。

【0011】

前記ポリヌクレオチドは、標的産物結合タンパク質のＮ末端に、分泌シグナル配列が融合されたアミノ酸配列をコーディングするものでありうる。

【0012】

前記ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られた遺伝子改変（genetic modification）方法によって組み換えられる前の微生物細胞に導入されたものでありうる。前記遺伝子改変は、形質変換、形質導入、トランスフェクションまたは電気穿孔（electroporation）によるものでありうる。また、前記ポリヌクレオチドは、組み換えられる前の微生物細胞内の遺伝子を遺伝子編集（gene editing）して生成されるものでありうる。前記遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）遺伝子編集のような知られた方法によって行われうる。

【0013】

前記組換え微生物は、前記分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質分泌能を有するものでありうる。前記組換え微生物は、前記標的産物生成能を有するものでありうる。前記組換え微生物は、増大された標的産物生成能を有するものでありうる。前記組換え微生物は、標的産物と前記標的産物結合タンパク質とが結合された複合体の形態でもって、細胞外に分泌することができるものでありうる。前記複合体の形成は、細胞内でなされるものでありうる。前記複合体の形成は、外部からの操作なしに、細胞代謝過程において、細胞によって行われるものでありうる。前記複合体において、該標的産物と前記標的産物結合タンパク質との結合は非共有結合によるものでありうる。前記非共有結合は、疎水性結合、水素結合またはイオン結合を含むものでありうる。前記複合体は、液体媒質において、前記結合を解離させるのに適する条件下で解離され、解離された標的産物と前記標的産物結合タンパク質とをそれぞれ形成することができる。前記分泌シグナル配列に融合されていない標的産物結合タンパク質は、自然な宿主細胞内においては、細胞内、例えば、細胞質に存在しており、細胞外に分泌されないものでありうる。前記分泌シグナル配列に融合されていない標的産物結合タンパク質は、自然な宿主細胞内においては、分泌シグナル配列に連結されていないものでありうる。

【0014】

前記標的産物は、代謝産物（metabolite）でありうる。前記代謝産物は、内在的代謝産物、または遺伝子改変によって導入されたその合成経路によって合成される代謝産物でありうる。前記代謝産物は、脂質、多糖、タンパク質または小分子化合物でありうる。前記標的産物は、脂質でありうる。前記脂質は、テルペノイドでありうる。用語「テルペノイド」は、イソプレン（isoprene）を単位体にして合成される化合物でありうる。前記テルペノイドは、炭素を、５ないし１００個、１０ないし１００個、１５ないし１００個、３０ないし１００個、５ないし６０個、１０ないし６０個、１５ないし６０個、３０ないし６０個、５ないし４５個、１０ないし４５個、１５ないし４５個、３０ないし６０個、５ないし３０個、１０ないし３０個、１５ないし３０個、または５ないし４５個を有するものでありうる。前記テルペノイドは、酸素分子を含むものでありうる。また、前記テルペノイドは、酸素分子を含まない炭化水素（hydrocarbon）でありうる。前記テルペノイドは、モノテルペン、ジテルペン、セスキテルペン、トリテルペンまたはテトラテルペンでありうる。前記テルペノイドは、環状化合物または非環状化合物でありうる。前記テルペノイドは、下記４３個化合物、すなわち、２，３－オキシドスクアレン（2,3-oxidosqualene）、ミルセン(myrcene)、（ｚ）－オシメン（(z)-ocimene）、リナロール（linalool）、ゲラニオール（geraniol）、ネロール（nerol）、リモネン（limonene）、メントール（menthol）、α－ピネン（α－pinene）、ショウノウ（camphor）、カルバクロール（carvacrol）、カルボン（carvone）、β－ファルネセン（β－farnesene）、ネロリドール（nerolidol）、β－ビサボレン（β－bisabolene）、バレンセン（valencene）、アモルファジエン（amorphadiene）、カプシジオール（capsidiol）、α－セドラン（α－cedrane）、アルテミシニン（artemisinin）、フィタン（phytane）、フィトール（phytol）、カンホレン（camphorene）、レチノール（retinol）、ラブダン（labdane）、クレロドン（clerodone）、ピマラン（pimarane）、アビエタン（abietane）、チグリアン（tigliane）、カウラン（kaurane）、タキサン（taxane）、スクアレン（squalene）、ラノステロール（lanosterol）、α－アミリン（α－amyrin）、β－アミリン（β－amyrin）、ホパン（hopane）、オレアノール酸（oleanolic acid）、リコペン（lycopene）、ルビキサンチン（rubixanthin）、β－カロテン（β－carotene）、ルテイン（lutein）、ゼアキサンチン（zeaxanthin）及びアスタキサンチン（astaxanthin）によってなる群のうちから選択されるものでありうる。前記標的産物は、スクアレンまたはβ－カロチンでありうる。前記組換え微生物は、テルペノイド生合成経路が強化されたものでありうる。前記組換え微生物は、前記４３個化合物のうち１以上の化合物の生合成経路が強化されたものでありうる。

【0015】

前記標的産物結合タンパク質は、前記代謝産物に結合するものでありうる。前記標的産物結合タンパク質は、前記代謝産物に特異的に結合するものでありうる。前記標的産物結合タンパク質は、脂質結合タンパク質でありうる。前記標的産物結合タンパク質は、細胞質脂質結合タンパク質でありうる。前記脂質結合タンパク質は、上清タンパク質因子（ＳＰＦ：supernatant protein factor）、ホスファチジルイノシトール転移タンパク質（Ｓｅｃ１４：phosphatidylinositol transfer protein、）、α－トコフェロール転移タンパク質（ＴＴＰ：alpha-tocopherol transfer protein）、細胞性レチナール結合タンパク質（cellular retinal binding protein）、イカレチナール結合タンパク質（squid retinal binding protein）、または標的産物結合能を有するそれらの断片によってなる群のうちから選択されるものでありうる。前記脂質結合タンパク質は、任意の細胞由来のものでありうる。例えば、前記脂質結合タンパク質は、哺乳動物細胞由来のものでありうる。前記上清タンパク質因子（ＳＰＦ）及び前記α－トコフェロール転移タンパク質（ＴＴＰ）は、ヒト由来またはマウス由来のものでありうる。ヒト由来上清タンパク質因子（ＳＰＦ）は、４０３個アミノ酸配列を有するものであり、脂質結合能を有するＮ末端ドメインと、ゼリーロールモチーフ（jelly-roll motif）を有するＣ末端ドメイン、すなわち、ゴルジダイナミックスドメイン（ＧＯＬＤ：Golgi dynamics domain）と、を有するものでありうる。該上清タンパク質因子（ＳＰＦ）は、スクアレン結合能を有し、Ｃ末端ドメイン、すなわち、２７６番ないし４０３番のアミノ酸配列が切断されて除去された、切断されたＳＰＦ（ｔＳＰＦ）であってもよい。すなわち、該ｔＳＰＦは、該上清タンパク質因子（ＳＰＦ）の１番ないし２７５番のアミノ酸配列によってなるものでありうる。該ＳＰＦ及び該ｔＳＰＦは、それぞれ配列番号１及び２のアミノ酸配列を有するものでありうる。該ＳＰＦ及び該ｔＳＰＦをコーディングするヌクレオチドは、それぞれ配列番号３及び４のヌクレオチド配列を有するものでありうる。

【0016】

前記分泌シグナル配列は、細胞で発現されたタンパク質を、細胞外分泌させるアミノ酸配列を表す。前記分泌シグナル配列は、真核細胞由来または原核細胞由来の分泌シグナル配列でありうる。前記分泌シグナル配列は、前記組換え微生物において、標的産物結合タンパク質を、細胞外に分泌させる任意のアミノ酸配列でありうる。前記分泌シグナル配列は、組換え微生物細胞と、同一または異なる細胞に由来するものでありうる。前記分泌シグナル配列は、動物由来、植物由来、酵母由来またはバクテリア由来の分泌シグナル配列でありうる。前記分泌シグナル配列は、Ｓｕｃ２，Ｐｈｏ５，ＭＦα，Ｉｎｕ１及びＭｅｌ１分泌シグナル配列によってなる群のうちから選択された１以上のものでありうる。Ｓｕｃ２，Ｐｈｏ５及びＭＦα分泌シグナル配列は、配列番号５，６及び７のアミノ酸配列をそれぞれ有するものでありうる。Ｓｕｃ２，Ｐｈｏ５及びＭＦα分泌シグナル配列をコーディングするヌクレオチドは、配列番号８，９及び１０のヌクレオチド配列を有するものでありうる。

【0017】

前記組換え微生物は、真核細胞または原核細胞でありうる。前記真核細胞は、動物細胞、植物細胞または菌類細胞でありうる。前記菌類は、酵母でありうる。前記酵母細胞は、サッカロミケス（Saccharomyces）属でありうる。サッカロミケス（Saccharomyces）属細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）でありうる。前記原核細胞は、バクテリアでありうる。前記バクテリアは、エスケリキア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属またはバシラス（Bacillus）属に属するものでありうる。また、前記バクテリアは、乳酸菌、例えば、ラクトバチルス（Lactobacillus）属またはラクトコッカス（Lactococcus）属に属するものでありうる。前記バクテリアは、大腸菌（Escherichia coli）、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）または枯草菌（Bacillus subtilus）でありうる。

【0018】

前記組換え微生物は、標的産物をコーディングするポリヌクレオチドの発現を増大させる遺伝子改変、または標的産物を生産する代謝経路が強化されたものでありうる。前記組換え微生物は、改変される前の細胞に比べ、増大された標的産物生成能を有するものでありうる。前記遺伝子改変は、標的産物をコーディングするポリヌクレオチドのコピー数の増加でありうる。前記遺伝子改変は、標的産物をコーディングするポリヌクレオチドの発現を増大させる調節配列の改変でもありうる。また、前記組換え微生物は、標的産物を生産する代謝経路が強化されたものでもありうる。該標的産物を生産する代謝経路は、標的産物の生合成に関与するタンパク質または酵素のような因子をコーディングするポリヌクレオチドの発現を増大させる遺伝子改変によって強化されたものでありうる。前記遺伝子改変は、標的産物の生合成に関与するタンパク質または酵素のような因子をコーディングするポリヌクレオチドのコピー数の増加、またはその調節配列の改変でもありうる。

【0019】

前記組換え微生物はまた、標的産物生産を阻害する代謝経路が弱化されたものでもありうる。前記代謝経路は、例えば、標的産物を分解する経路またはフィードバック阻害経路でありうる。

【0020】

一具体例において、前記標的産物結合タンパク質は、上清タンパク質因子（ＳＰＦ）またはそのリガンド結合断片でありうる。前記標的産物結合タンパク質は、配列番号１の上清タンパク質因子（ＳＰＦ）のアミノ酸配列において、Ｌ８４，Ｉ１０３，Ｌ１０６，Ａ１０８，Ｌ１１１，Ｌ１１２，Ｌ１２０，Ｌ１２１，Ｋ１２４，Ｉ１５１，Ｙ１５３，Ｃ１５５，Ｌ１５８，Ｈ１６２，Ａ１６７，Ｖ１６８，Ａ１７０，Ｙ１７１，Ｆ１７４，Ｌ１７５，Ｌ１８６，Ｌ１８９，Ｆ１９８，Ａ２０１，Ｙ２０２，Ｉ２０５，Ｌ２０９，Ｔ２１３及びＩ２１７アミノ酸を含むポリペプチドでありうる。前記組換え微生物は、サッカロミケス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）でありうる。前記組換え微生物は、メバロン酸生合成経路またはβ－カロチン生合成経路が強化されたものでありうる。前記組換え微生物は、ＨＭＧ－ＣｏＡ及びＥＲＧ２０のうち１以上の活性を増大させる遺伝子改変を含むものでありうる。前記組換え微生物は、ＨＭＧ－ＣｏＡまたはＥＲＧ２０をコーディングする遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変を含むものでありうる。前記遺伝子改変は、前記遺伝子のコピー数増加でありうる。前記組換え微生物は、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、ｈｉｓ３及びｙｐ１０６２ｗのうち１以上が不活性化されたものでありうる。前記不活性化される遺伝子の発現を完全に除去するものだけではなく、低減させるものも含む。前記不活性化は、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、ｈｉｓ３及びｙｐ１０６２ｗのうち１以上の遺伝子の欠失でありうる。ＨＭＧ－ＣｏＡ、ＥＲＧ２０、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、ｈｉｓ３及びｙｐ１０６２ｗは、配列番号１１，１２，１３，１４，１５及び１６のアミノ酸配列をそれぞれ有するものでありうる。ＨＭＧ－ＣｏＡ，ＥＲＧ２０，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ｈｉｓ３及びｙｐ１０６２ｗ遺伝子は、配列番号１７，１８，１９，２０，２１及び２２のヌクレオチド配列を有するものでありうる。

【0021】

図１は、Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む酵母細胞において、スクアレンを分泌する過程を図式的に示した図面である。前記過程は、まず、細胞内において、前記ポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡの翻訳がなされる間、Ｎ末端に位置したシグナル（信号）ペプチドは、シグナル認識粒子（signal recognition particle）に結合され、部分的に翻訳された前記融合タンパク質、及びリボゾームの複合体が小胞体膜に伝達される。小胞体において、融合タンパク質の初期ポリペプチド（nascent polypeptide）が合成され、シグナルペプチドが小胞体内腔において、シグナルペブチダーゼによって切断されれば、ｔＳＰＦ、すなわち、標的産物結合タンパク質のポリペプチドだけが残る（段階Ａ）。前記結合タンパク質のポリペプチドは、小胞体のシャペロンタンパク質により、さらなる変形が進められ、その後、成熟したタンパク質を形成する（段階Ｂ）。成熟したスクアレン特異的結合タンパク質は、細胞内に蓄積されていたスクアレンと特異的結合を行い、複合体を形成する。該過程が、標的代謝産物を捕獲する過程である（段階Ｃ）。該スクアレンが該結合タンパク質と複合体を形成すれば、輸送小胞（transport vesicle）によってカプセル化された複合体は、ゴルジ体に輸送されうる（段階Ｄ）。該ゴルジ体から、分泌小胞により、該スクアレン及び該結合タンパク質の複合体は、細胞外空間にも放出される（段階Ｅ）。

【0022】

他の態様は、前述の分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物、及び担体を含む、標的産物を生産するのに使用するための組成物を提供する。

【0023】

分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物については、前述の通りである。前記担体は、前記微生物を培養するのに使用される培地、バッファまたは保存溶液でありうる。

【0024】

他の態様は、分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物を、培地内で培養する段階を含む、標的産物を生産する方法を提供する。

【0025】

分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物については、前述の通りである。

【0026】

前記培養は、前記組換え微生物及び培地を含む混合物を、組換え微生物が成長し前記分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質を生産するのに適する条件でインキュベーションすることを含む。

【0027】

前記培養は、炭素源、例えば、グルコースを含む培地において行われうる。微生物培養に使用される培地は、適切な補充物を含む最小培地、または複合培地のような、選択された組換え細胞の成長に適する任意の一般的な培地でありうる。適する培地は、商業的な販売者から入手可能であるか、あるいは公知の製法によって製造されるものでありうる。

【0028】

前記培地は、選択される標的産物に応じて、特定微生物の要求条件を満足させることができる培地でありうる。前記培地は、炭素源、窒素源、塩、微量元素、及びそれらの組み合わせによってなる群のうちから選択される成分を含むものでありうる。

【0029】

前記培養の条件は、選択される標的産物、例えば、スクアレンのようなテルペノイドの生産に適するように、適切に調節されうる。前記培養は、細胞増殖のために、好気性条件においてなされうる。前記培養は、撹拌なしに、あるいは撹拌と共に行われうる。前記培養は、バッチ（batch）、フェッドバッチまたは連続式によって培養されるものでありうる。該連続式培養は、培養物のうちから、微生物または上清の一部を除去しながら、培地を補充しつつ、連続して培養するものでありうる。前記組換え微生物は、標的産物を、標的産物結合タンパク質との複合体の形態でもって、細胞外に分泌し、該培養物から細胞を除去した上清からそれを分離することができる。

【0030】

前記培養は、標的産物に対する溶解度が高い化合物を含む培地において培養するものでありうる。前記溶解度は、培地または水に比べ、高いものでありうる。前記溶解度は、培地または水に比べ、１．２倍以上、１．５倍以上、２．０倍以上、３．０倍以上、５．０倍以上、７．５倍以上または１０倍以上、あるいは１．２ないし１０倍、１．５ないし１０倍、２．０ないし１０倍、３．０ないし１０倍、５．０ないし１０倍、または７．５ないし１０倍の溶解度を有するものでありうる。前記標的産物は、脂質、例えば、テルペノイドであり、標的産物に対する溶解度の高い化合物は、脂質、例えば、テルペノイドに対する溶解度が高いオイル性化合物でありうる。前記標的産物は、培養中において、標的産物・標的産物結合タンパク質の複合体の形態でもって細胞外に分泌され、細胞外培地において、前記複合体は、該標的産物と標的産物結合タンパク質とに解離された状態、及び複合体が動的平衡状態で存在するものでありうる。それにより、前記動的平衡状態において解離された標的産物の一部は、前記標的産物に対する溶解度が高い化合物層に分配されるものでありうる。例えば、該標的産物は、脂質、例えば、テルペノイドであり、前記培養は、オイル性化合物を含む培地においてなされる場合、前記標的産物が細胞外に分泌された後、培地中のオイル性化合物層に分配されるものでありうる。前記オイル性化合物は、アルカン溶媒、例えば、Ｃ_１－Ｃ_６０，Ｃ_６－Ｃ_６０またはＣ_３－Ｃ_３０アルカンでありうる。前記溶媒は、ヘキサン、ヘプタン、デカン、ドデカンまたはヘキサデカンでありうる。また、前記オイル性化合物は、植物油でありうる。前記植物油は、オリーブ油、カノラオイルまたは精油でありうる。前記オイル性化合物は、前記標的産物と沸点差が大きく、互いに分離されやすい化合物でありうる。

【0031】

用語「培養条件」は、微生物を培養するための条件を意味する。そのような培養条件は、例えば、微生物が利用する炭素源、窒素源または酸素の条件でありうる。酵母が利用することができる炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類を含むものでありうる。前記炭素源は、資化可能な糖であり、グルコース、フルクトース、マンノースまたはガラクトースを含むものでありうる。前記窒素源は、有機窒素化合物または無機窒素化合物でありうる。前記窒素源は、アミノ酸、アミド、アミン、硝酸塩またはアンモニウム塩でありうる。微生物を培養する酸素条件には、正常酸素分圧の好気性条件、大気中に、０．１％ないし１０％の酸素を含む低酸素条件、または酸素がない嫌気性条件がある。

【0032】

前記方法は、前記標的産物を分離する段階を含むものでありうる。前記標的産物を分離する段階は、細胞を破砕する段階を含まないものでありうる。前記標的産物を分離する段階は、培養物から上清を分離する段階を含むものでありうる。前記分離する段階は、前記上清から、前記標的産物を分離する段階を含むものでありうる。前記標的産物を分離する段階は、標的産物と前記標的産物結合タンパク質との複合体から、該標的産物を分離する段階を含むものでありうる。該標的産物と前記標的産物結合タンパク質との複合体から、該標的産物を分離する段階は、前記複合体を含む培養物または上清を、前記複合体を該標的産物と該標的産物結合タンパク質とに解離するのに適する条件下において、液体媒質内においてインキュベーションすることを含みうる。前記条件は、選択される標的産物と標的産物結合タンパク質とに応じて適切に選択されうる。例えば、前記標的産物は、スクアレンまたはβ－カロチンのようなテルペノイド化合物であり、前記分離する段階は、前記複合体を、疎水性溶媒、例えば、オイル性化合物において、インキュベーションすることを含むものでありうる。前記溶媒は、アルカン、例えば、Ｃ_１－Ｃ_６０，Ｃ_６－Ｃ_６０またはＣ_３－Ｃ_３０アルカンでありうる。前記溶媒は、ヘキサン、ヘプタン、デカン、ドデカンまたはヘキサデカンでありうる。前記分離する段階は、前記培養と同時に行われるものであってもよい。

【0033】

一具体例において、前記標的産物は、２，３－オキシドスクアレン（2,3-oxidosqualene）、ミルセン(myrcene)、（ｚ）－オシメン（(z)-ocimene）、リナロール（linalool）、ゲラニオール（geraniol）、ネロール（nerol）、リモネン（limonene）、メントール（menthol）、α－ピネン（α－pinene）、ショウノウ（camphor）、カルバクロール（carvacrol）、カルボン（carvone）、β－ファルネセン（β－farnesene）、ネロリドール（nerolidol）、β－ビサボレン（β－bisabolene）、バレンセン（valencene）、アモルファジエン（amorphadiene）、カプシジオール（capsidiol）、α－セドラン（α－cedrane）、アルテミシニン（artemisinin）、フィタン（phytane）、フィトール（phytol）、カンホレン（camphorene）、レチノール（retinol）、ラブダン（labdane）、クレロドン（clerodone）、ピマラン（pimarane）、アビエタン（abietane）、チグリアン（tigliane）、カウラン（kaurane）、タキサン（taxane）、スクアレン（squalene）、ラノステロール（lanosterol）、α－アミリン（α－amyrin）、β－アミリン（β－amyrin）、ホパン（hopane）、オレアノール酸（oleanolic acid）、リコペン（lycopene）、ルビキサンチン（rubixanthin）、β－カロテン（β－carotene）、ルテイン（lutein）、ゼアキサンチン（zeaxanthin）及びアスタキサンチン（astaxanthin）によってなる群のうちから選択される化合物でありうる。前記標的産物結合タンパク質は、上清タンパク質因子（ＳＰＦ）、Ｓｅｃ１４、ＴＴＰ、α－トコフェロール転移タンパク質、細胞性レチナール結合タンパク質、イカレチナール結合タンパク質、または標的産物結合能を有するそれらの断片によってなる群のうちから選択されるものでありうる。前記組換え微生物は、酵母細胞、例えば、サッカロミケス（Saccharomyces）属でありうる。該サッカロミケス（Saccharomyces）属微生物は、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）でありうる。

【発明の効果】

【0034】

一態様による組換え微生物は、標的産物を効率的に生産することに使用されうる。
一態様による標的産物を生産するのに使用するための組成物は、標的産物を効率的に生産することに使用されうる。
一態様による標的産物を生産する方法によれば、標的産物を効率的に生産することができる。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む酵母細胞において、スクアレンを分泌する過程を図式的に示した図である。

【図2A】分泌シグナル（信号）配列に融合されたｔＳＰＦをコーディングするポリヌクレオチドを含む酵母細胞によって生産された細胞外スクアレン濃度を示した図である。

【図2B】分泌シグナル（信号）配列に融合されたｔＳＰＦをコーディングするポリヌクレオチドを含む酵母細胞によって生産された細胞内スクアレン濃度を示した図である。

【図3】Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ，Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びＭＦα－ｔＳＰＦ融合タンパク質遺伝子でそれぞれ形質転換されたＳＱ菌株によって細胞外分泌されたスクアレンを、ＨＰＬＣ分析した結果を示した図である。

【図4】Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ，Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びＭＦα－ｔＳＰＦ融合タンパク質遺伝子でそれぞれ形質転換されたＳＱ菌株を培養し、細胞破砕物及び培養上清（上澄み液）に対してウェスタンブロット分析した結果を示した図である。

【図5】ｐ４１５－ＢＣベクターと、ｐＳＥＣ－ｔＳＰＦまたはｐＳＥＣ－Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦとで共同形質転換されたＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｄ酵母細胞を培養し、生産されたβ－カロチンの量を示した図である。

【図6】Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ融合タンパク質遺伝子で形質転換された酵母細胞によって生産されて細胞外に分泌されたβ－カロチンを、ＨＰＬＣ分析した結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0036】

以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0037】

［実施例１．スクアレン分泌能が増大された酵母細胞、及びそれを利用したスクアレン生産］
本実施例においては、酵母細胞に、分泌シグナル配列に融合された標的産物結合タンパク質を導入し、組換え酵母細胞を作り、製造された組換え酵母細胞を利用して標的産物を生産し、その分泌能を確認した。該酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を使用し、該分泌シグナル配列は、Ｓｕｃ２，Ｐｈｏ５及びＭＦα分泌シグナル配列をそれぞれ使用した。また、該標的産物は、スクアレンを使用し、標的産物結合タンパク質は、上清タンパク質因子（ＳＰＦ）の切断された断片であるｔＳＰＦを使用した。該ｔＳＰＦは、上清タンパク質因子（ＳＰＦ）の脂質結合能を有するＮ末端ドメインに該当するスクアレン結合タンパク質である。該ｔＳＰＦは、配列番号１のアミノ酸配列を有する上清タンパク質因子（ＳＰＦ）において、１番ないし２７５番のアミノ酸配列に該当する。

【0038】

（１．１）スクアレン生合成経路が強化された酵母細胞の作製
酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であり、野生型菌株であるＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｄ［（ＭＡＴα ｕｒａ３－５２；ｔｒｐ１－２８９；ｌｅｕ２－３、１１２；ｈｉｓ３△１；ＭＡＬ２－８；ＳＵＣ２）（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦアクセス番号：３００００Ｂ）を使用した。前記菌株は、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐ１（phosphoribosylanthranilate isomerase））、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕ２（3-isopropylmalate dehydrogenase））及びイミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ（ｈｉｓ３（imidazoleglycerol-phosphate dehydratase））をコーディングする遺伝子が不活性化されている。ｔｒｐ１、ｌｅｕ２及びｈｉｓ３は、配列番号１３，１４及び１５のアミノ酸配列をそれぞれ有するものでもある。ｔｒｐ１，ｌｅｕ２及びｈｉｓ３遺伝子は、配列番号１９，２０及び２１のヌクレオチド配列をそれぞれ有するものでもある。スクアレンは、テルペノイドであり、酵母細胞においては、メバロン酸生合成経路を介して合成される。スクアレン生成能を増大させるために、下記遺伝子改変を導入した。

【0039】

まず、前記菌株の欠失されたｔｒｐ１，ｌｅｕ２及びｈｉｓ３遺伝子位置に、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（β-Hydroxy β-methylglutaryl-CoA reductase）をコーディングするｔＨＭＧ１遺伝子、及びサッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来ファルネシルピロリン酸シンテターゼ（ＥＲＧ２０（farnesyl pyrophosphate synthetase））をコーディングする遺伝子を導入した。該ｔＨＭＧ１及び該ＥＲＧ２０は、配列番号１１及び１２のアミノ酸配列をそれぞれ有するものでもある。該ｔＨＭＧ１遺伝子及び該ＥＲＧ２０遺伝子は、配列番号１７及び１８のヌクレオチド配列をそれぞれ有するものでもある。該ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロネートに転換する反応を触媒する酵素である。該ＥＲＧ２０は、ＧＰＰをＦＰＰに転換する反応を触媒する酵素である。該ＨＭＧ－ＣｏＡと該ＦＰＰは、いずれもスクアレン合成の前駆体である。

【0040】

また、前記菌株のゲノムにおいて、ｙｐｌ０６２ｗをコーディングする遺伝子を欠損させると共に、ｙｐｌ０６２ｗサイトに、前記ｔＨＭＧ１遺伝子を導入した。ｙｐｌ０６２ｗ遺伝子欠損により、メバロン酸生合成経路の初期基質であるアセチル－ＣｏＡレベルが上昇されうる。ｙｐｌ０６２ｗは、配列番号１６のアミノ酸配列を有するものでもある。ｙｐｌ０６２ｗ遺伝子は、配列番号２２のヌクレオチド配列を有するものでもある。

【0041】

その結果、組換えサッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）菌株ＳＱを得た。ＳＱ菌株を作製するさらに詳細な過程は、韓国登録特許公報第１０－２１７６５５５号に開示されており、その内容は、援用によって本明細書に含まれる。

【0042】

（１．２）分泌シグナル配列に融合されたスクアレン結合タンパク質をコーディングする遺伝子が導入された酵母細胞の作製
分泌シグナル配列は、３種の異なるシグナルペプチドを使用し、スクアレン結合タンパク質は、ｔＳＰＦを使用した。具体的には、３種の異なるシグナルペプチド、すなわち、Ｓｕｃ２，Ｐｈｏ５及びＭＦαシグナルペプチドを、それぞれｔＳＰＦのＮ末端に融合させた融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを得た。前記融合タンパク質は、Ｃ末端において、６ｘＨｉｓタグ配列を含む。

【0043】

Ｓｕｃ２，Ｐｈｏ５及びＭＦαシグナルペプチドは、配列番号５，６及び７のアミノ酸配列をそれぞれ有するものでもある。Ｓｕｃ２，Ｐｈｏ５及びＭＦαシグナルペプチドをコーディングするヌクレオチドは、配列番号８，９及び１０のヌクレオチド配列を有するものでもある。Ｓｕｃ２，Ｐｈｏ５及びＭＦαシグナルペプチドは、それぞれスクロース輸送タンパク質（Ｓｕｃ２）、酸ホスファターゼ（Ｐｈｏ５（acid phosphatase））及び酵母α－メイティング因子（ＭＦα：α-mating factor）を細胞外に分泌するＮ末端シグナルペプチド機能を有するアミノ酸配列である。ｔＳＰＦは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。該ｔＳＰＦは、配列番号４のヌクレオチド配列を有する。その結果、得られたＳｕｃ２－ｔＳＰＦ，Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びＭＦα－ｔＳＰＦ融合タンパク質は、配列番号２３，２４及び２５のアミノ酸配列をそれぞれ有するものでもある。Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ，Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びＭＦα－ｔＳＰＦ融合タンパク質をコーディングするヌクレオチドは、配列番号２６，２７及び２８のヌクレオチド配列を有するものでもある。

【0044】

次に、前記ポリヌクレオチドを、ｐ４２６－ＴＥＦ１（配列番号２９）ベクターのＳｐｅＩ／ＸｈｏＩ制限酵素部位に導入し、発現ベクターｐＳＥＣ－Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ、ｐＳＥＣ－Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びｐＳＥＣ－ＭＦα－ｔＳＰＦを得た。対照群として、分泌シグナル配列がないｔＳＰＦ遺伝子がｐ４２６－ＴＥＦ１に導入されたｐＳＥＣ－ｔＳＰＦベクター、及び空のｐ４２６－ＴＥＦ１ベクターを使用した。ｐ４２６－ＴＥＦ１は、ＴＥＦ１プローモーターが含まれた高コピー数プラスミド（high copy number plasmid）である。前記融合タンパク質は、ＴＥＦ１プローモーターによって作動自在に連結されており、それにより、転写開始されうる。

【0045】

前記発現ベクターを、前記ＳＱ菌株に、熱衝撃（heat shock）形質転換方法によって導入し、３種融合タンパク質遺伝子でそれぞれ形質転換されたＳＱ菌株を得た。前記発現ベクターは、ＳＱ菌株のゲノムと独立して、その外に存在する。

【0046】

（１．３）組換え酵母細胞によるスクアレン生産及び分泌能の確認
ｐＳＥＣ－Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ、ｐＳＥＣ－Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びｐＳＥＣ－ＭＦα－ｔＳＰＦで形質転換されたＳＱ菌株を、２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１０％（ｖ／ｖ）ドデカンが補充された最小培地（YSC medium（０．６７％（ｗ／ｖ） yeast nitrogen base without amino acids（BD Difco・米国）、０．１９％（ｗ／ｖ） yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil（Sigma－Aldrich・米国）））５０ｍＬを含む２５０Ｌフラスコ内において、２５０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で培養した。

【0047】

培養７２時間及び１４４時間後、培養物を４，０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞、培養上清及びドデカン層に分離した。分離された細胞内及びドデカン層内のスクアレン濃度を測定した。細胞内スクアレン濃度測定のために、前記細胞を、メタノールとアセトンとの１：１混合液６００μＬに再懸濁し、lysing matrix Ｃ（ガラスビーズ（MP Biomedicals・米国））が含まれたチューブに移し入れ、ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４ ５Ｇホモジェナイザー（MP Biomedicals・米国）を利用して細胞を破砕し、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、破砕された細胞と、破砕された細胞から溶解されて出たスクアレンとを含む細胞内代謝産物を分離した。

【0048】

次に、細胞破砕物について、スクアレン濃度を測定した。細胞破砕物内スクアレン濃度測定のために、０．２μｍシリンジフィルタ（syringe filter）で濾過した後、Agilent ＨＰＬＣシステムを利用し、濃度を測定した。

【0049】

また、遠心分離を介して層分離されたドデカン層も、同様に濾過した後、ＨＰＬＣシステムを利用し、スクアレン濃度を測定した。表１は、分泌シグナル配列に融合されたｔＳＰＦをコーディングするポリヌクレオチドを含む酵母細胞によって生産された細胞内及び細胞外のスクアレン濃度を示す。図２Ａ及び図２Ｂは、分泌シグナル配列に融合されたｔＳＰＦをコーディングするポリヌクレオチドを含む酵母細胞によって生産された細胞外及び細胞内のスクアレン濃度をそれぞれ示す。

【0050】

【表1】

【0051】

表１、並びに図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ，Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びＭＦα－ｔＳＰＦ融合タンパク質遺伝子でそれぞれ形質転換されたＳＱ菌株は、細胞外スクアレンの量、または細胞外分泌比が、対照群細胞に比べ、顕著に増大している。図３は、Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ，Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びＭＦα－ｔＳＰＦ融合タンパク質遺伝子でそれぞれ形質転換されたＳＱ菌株によって生産され、細胞外に分泌されたスクアレンを、ＨＰＬＣ分析した結果を示した図面である。図３の結果は、表１において、細胞外分泌されたスクアレンデータに該当する。図３に示されているように、スクアレン標準を示すピークと同一滞留時間（retention time）でもって、Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ，Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びＭＦα－ｔＳＰＦ融合タンパク質によって細胞外に分泌されたスクアレンだけの明らかなピークを観察することができた。それは、それら細胞から、スクアレン特異的に細胞外に分泌されるということを示す。図３において、「ドデカン」及び「ドデカン＋１００ｐｐｍスクアレン」は、対照群であり、ドデカン単独、並びにドデカン及び１００ｐｐｍスクアレン標準を混合して得られた試料を、ＨＰＬＣ分析したものである。

【0052】

図４は、Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ，Ｐｈｏ５－ｔＳＰＦ及びＭＦα－ｔＳＰＦ融合タンパク質遺伝子でそれぞれ形質転換されたＳＱ菌株を培養して得られた細胞破砕物、及び培養上清に対してウェスタンブロット分析した結果を示した図面である。ｔＳＰＦ融合タンパク質の細胞外分泌を確認するために、酵母細胞を、２日間、２％（ｗ／ｖ）グルコースが含まれた５０ｍｌ最小培地（YSC medium（０．６７％（ｗ／ｖ） yeast nitrogen base without amino acids（BD Difco・米国）、０．１９％（ｗ／ｖ） yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil（Sigma－Aldrich・米国）））を含む２５０ｍＬフラスコ内において、３０℃で撹拌しながら培養した。このとき、前記最小培地は、ドデカン層を含んでいない。ＯＤ６００値が１００に該当する量の培養された酵母細胞から細胞内タンパク質を抽出するために、タンパク質分解酵素抑制剤（(1x protease inhibitor cocktail（Roche Diagnostics（Mannheim・ドイツ））が含まれた１ｍｌの細胞破砕バッファ（1mL RIPA buffer（Thermo Scientific（ＭＡ・米国））に再浮遊させた。懸濁液を、超音波粉砕機を利用し、２０％振幅、３秒間隔で、６分間均質化させた。培養液の上清にある細胞外タンパク質は、５０ｍｌ上清に卜リクロロ酢酸溶液が２５％になるように添加し、３０分間インキュベーションし、タンパク質を沈澱させた後、４℃で４０分間遠心分離した。沈澱されたタンパク質を、冷たいアセトン１ｍｌで３回洗浄し、５０μｌの滅菌水に再懸濁した。再懸濁されたタンパク質は、３０ｋＤａアミコン超遠心フィルタ（amicon ultra centrifugal filters）を使用してさらに濃縮された。

【0053】

準備されたタンパク質サンプル、すなわち、細胞破砕物は、５ｘＳＤＳサンプルバッファと混合し、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した後、４％脱脂乳（skim milk）含有ＴＢＳＴにおいて、一日インキュベーションしてブロッキングした。ＰＶＤＦ膜を、一次抗体が含まれた溶液において、室温で１時間反応させた後、ＴＢＳＴ溶液で３回洗浄した。一次抗体は、抗アクチン抗体または抗Ｈｉｓタグ抗体を使用した。前記融合タンパク質は、Ｃ末端に、６ｘＨｉｓタグ配列を含む。洗浄されたＰＶＤＦ膜を、さらにペルオキシダーゼ（peroxidase）が結合された抗ＩｇＧ抗体が含まれた溶液において、室温で１時間反応させた。抗体が結合されたタンパク質が存在するＰＶＤＦ膜を、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステムを利用して視覚化させた。

【0054】

ウェスタンブロット結果は、図５に示されている。図５に示されているように、細胞破砕物の場合、Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ及びＰｈｏ５－ｔＳＰＦのバンドは、ほとんど示されていないと見られ、分泌シグナル配列に融合されたｔＳＰＦは、細胞内に留まらず、細胞外部に移動した。また、該分泌シグナル配列に融合されていないｔＳＰＦは、細胞破砕物において、鮮明なバンドが示されているところを見るとき、該分泌シグナル配列が融合されていない場合、細胞外部に移動されていない。培養上清の場合、分泌シグナル配列に融合されていないｔＳＰＦは、バンドが示されていない。それは、該分泌シグナル配列に融合されていないｔＳＰＦは、細胞外部に移動しないということを示す。

【0055】

［実施例２．β－カロチン分泌能が増大された酵母細胞、及びそれを利用したβ－カロチン生産］
（２．１）β－カロチン生合成経路が強化された酵母細胞の作製
実施例１の１．１節に記載されたＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｄ酵母菌株に、β－カロチン生合成遺伝子を含むベクターを導入し、β－カロチン生産能が増大された酵母細胞を作製した。

【0056】

具体的には、β－カロチン生合成経路のｃｒｔＥ、ｃｒｔＹＢ、ｃｒｔＩ及びｔＨＭＧ１の発現カセットを含むｐＭＭ４９４ベクター（Plasmid #100539（Ａｄｄｇｅｎｅ社製））から、ｃｒｔＥ，ｃｒｔＹＢ，ｃｒｔＩ及びｔＨＭＧ１遺伝子を増幅し、それを、ｐ４１５－ＧＰＤベクター（配列番号３０）の制限酵素ＢａｍＨＩサイト及び制限酵素ＳａｌＩサイトに導入し、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹＢ、ｃｒｔＩ及びｔＨＭＧ１に係わる発現カセットを含むｐ４１５－ＢＣベクターを作製した。ｐ４１５－ＧＰＤベクター（ＡＴＣＣ ８７３５８）は、ＧＰＤ１プローモーターを含む低コピー数発現ベクターである。ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹＢ及びｃｒｔは、配列番号３１、３２及び３３のアミノ酸配列をそれぞれ有する。ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹＢ及びｃｒｔをコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号３４、３５及び３６のヌクレオチド配列をそれぞれ有する。ｃｒｔＥ，ｃｒｔＹＢ及びｃｒｔＩタンパク質は、キサントフィロマイセス・デンドロフス(Xanthophyllomyces dendrohous)由来のタンパク質であり、次の活性を有する。ｃｒｔＥは、ファルネシス二リン酸をゲラニルゲラニル二リン酸に転換する反応を触媒するゲラニルゲラニル二リン酸をコーディングする遺伝子である。ｃｒｔＹＢは、ゲラニルゲラニル二リン酸をフィトエン（phytoene）に転換する反応を触媒するフィトエンシンダーゼをコーディングするｃｒｔＢと、リコペンをβ－カロチンに転換する反応を触媒するリコペンβ－シクラーゼをコーディングする遺伝子ｃｒｔＹと、を含む。ｃｒｔＩは、フィトエンをリコペンに転換するフィトエンデサチュラーゼ（phytoene desaturase）をコーディングする遺伝子である。

【0057】

（２．２）分泌シグナル配列に融合されたスクアレン結合タンパク質をコーディングする遺伝子が導入された酵母細胞の作製
実施例１の（１．２）節に記載されたところと同一過程を経て、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）野生菌株ＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｄに、該（１．２）節で作製されたｐ４１５－ＢＣベクターと、ｐＳＥＣ－ｔＳＰＦまたはｐＳＥＣ－Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦとを共同形質転換（cotransformation）し、シグナルペプチドに融合されたｔＳＰＦを発現するベクターで形質転換酵母細胞を作製した。

【0058】

（２．３）組換え酵母細胞によるβ－カロチン生産及び分泌能の確認
（２．２）節で得られたｐ４１５－ＢＣベクターと、ｐＳＥＣ－ｔＳＰＦまたはｐＳＥＣ－Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦとで共同形質転換され、β－カロチンを過生産することができるＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｄ酵母細胞を、実施例１の（１．３）節に記載されたところと同一条件で１４４時間培養し、生産された細胞内及び細胞外のβ－カロチン量を測定した。該β－カロチン量は、前記スクアレン濃度測定のために使用された細胞破砕方法及びドデカン層分離方法と同一方法で測定した。表２及び図６は、ｐ４１５－ＢＣベクターと、ｐＳＥＣ－ｔＳＰＦまたはｐＳＥＣ－Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦとで共同形質転換されたＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｄ酵母細胞を培養して生産されたβ－カロチンの量を示したものである。

【0059】

【表2】

【0060】

表２及び図６に示されているように、Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ融合タンパク質遺伝子で形質転換された酵母細胞は、細胞外β－カロチンの量、または細胞外分泌比が対照群細胞に比べ、顕著に増大した。具体的には、β－カロチン細胞外分泌は、空ベクターを含む対照群に比べ、約２３倍増大した。図６は、Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ融合タンパク質遺伝子で形質転換された酵母細胞によって生産されて細胞外に分泌されたβ－カロチンを、ＨＰＬＣ分析した結果を示した図面である。図６の結果は、表２において、細胞外分泌されたβ－カロチン、すなわち、ドデカン層に分泌されたβ－カロチンデータに該当する。図６に示されているように、β－カロチン標準と同一滞留時間でもって、Ｓｕｃ２－ｔＳＰＦ融合タンパク質によって細胞外に分泌されたβ－カロチンのピークを観察することができた。それは、それら細胞から、β－カロチンが特異的に細胞外に分泌されるということを示す。図６において、「ドデカン＋１ｐｐｍ β－カロチン」及び「ドデカン＋１ｐｐｍリコペン」は、対照群であり、ドデカンに、１ｐｐｍ β－カロチンを含む標準混合物、及びドデカンに１ｐｐｍリコペンを含む標準混合物をそれぞれ示す。

【0061】

［実施例３．多様なテルペノイド系物質への拡大可能性予測の評価］
ｔＳＰＦのリガンド結合部位を確認するために、ｔＳＰＦ（ＰＤＢＩＤ：４ＯＭＫ）の三次元結晶学構造を、ＲＣＳＢタンパク質データバンクから獲得した。分子のドッキング分析には、結晶構造において結合されたスクアレンと水分子とがシミュレーション前に除去された４ＯＮＫのＡチェーンが使用された。結晶学構造において、丈夫なタンパク質構造を構成するために、各アミノ酸につき、１つの可能な構造を意図的に選択し、Ａ鎖のスクアレン結合活性部位は、ＣＡＳＴｐ（Computer Atlas of Surface Topology of protein）を使用して決定した。スクアレン結合に必要な確認された残基は、配列番号１のアミノ酸配列を基準に、Ｌ８４、Ｉ１０３、Ｌ１０６、Ａ１０８、Ｌ１１１、Ｌ１１２、Ｌ１２０、Ｌ１２１、Ｋ１２４、Ｉ１５１、Ｙ１５３、Ｃ１５５、Ｌ１５８、Ｈ１６２、Ａ１６７、Ｖ１６８、Ａ１７０、Ｙ１７１、Ｆ１７４、Ｌ１７５、Ｌ１８６、Ｌ１８９、Ｆ１９８、Ａ２０１、Ｙ２０２、Ｉ２０５、Ｌ２０９、Ｔ２１３及びＩ２１７である。従って、スクアレン結合部位を前記残基が含むものと見られる。

【0062】

リガンド選択のために、ＰｕｂＣｈｅｍ化合物データベースから、ｓｄｆ形式により、以下のような４３個のテルペノイドを選択した。２，３－オキシドスクアレン（2,3-oxidosqualene）、ミルセン(myrcene)、（ｚ）－オシメン（(z)-ocimene）、リナロール（linalool）、ゲラニオール（geraniol）、ネロール（nerol）、リモネン（limonene）、メントール（menthol）、α－ピネン（α－pinene）、ショウノウ（camphor）、カルバクロール（carvacrol）、カルボン（carvone）、β－ファルネセン（β－farnesene）、ネロリドール（nerolidol）、β－ビサボレン（β－bisabolene）、バレンセン（valencene）、アモルファジエン（amorphadiene）、カプシジオール（capsidiol）、α－セドラン（α－cedrane）、アルテミシニン（artemisinin）、フィタン（phytane）、フィトール（phytol）、カンホレン（camphorene）、レチノール（retinol）、ラブダン（labdane）、クレロドン（clerodone）、ピマラン（pimarane）、アビエタン（abietane）、チグリアン（tigliane）、カウラン（kaurane）、タキサン（taxane）、スクアレン（squalene）、ラノステロール（lanosterol）、α－アミリン（α－amyrin）、β－アミリン（β－amyrin）、ホパン（hopane）、オレアノール酸（oleanolic acid）、リコペン（lycopene）、ルビキサンチン（rubixanthin）、β－カロテン（β－carotene）、ルテイン（lutein）、ゼアキサンチン（zeaxanthin）及びアスタキサンチン（astaxanthin）。

【0063】

また、対照群分子として、グルタメート（glutamate）とピルベート（pyruvate）とを選択した。ダウンロードされたｓｄｆファイルは、ＰｙＲｘ仮想ツールのＯｐｅｎＢａｂｅｌツールボックスにより、ｐｄｂｑｔ形式に変換された。前述のような情報を利用し、ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａで分子ドッキングし、ｔＳＰＦと、多様なテルペノイド系物質のとの結合エネルギーを分析した。その結果は、表３、表４、表５及び表６に示されている。

【0064】

【表3】

【0065】

【表4】

【0066】

【表5】

【0067】

【表6】

【0068】

表３、表４、表５及び表６に示されているように、ｔＳＰＦと４３個テルペノイド系化合物との各結合エネルギー差は、－１０．７ｋｃａｌ／ｍｏｌないし－６．１ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり、スクアレンとβ－カロチンとの結合エネルギーである－１０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び－７．７ｋｃａｌ／ｍｏｌとそれぞれ比較しても、大差がなかった。それは、前述の分泌シグナル配列に融合されたｔＳＰＦをコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え微生物が、多様なテルペノイド系化合物に拡大適用されうるということを示す。

【図1】

【図2A】

【図】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】