特表 2023-543129 マイクロチップキャピラリー電気泳動を使用するアデノ随伴ウイルスの特徴付けの方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-13

(54)【発明の名称】マイクロチップキャピラリー電気泳動を使用するアデノ随伴ウイルスの特徴付けの方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/70 20060101AFI20231005BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20231005BHJP

   G01N 27/447 20060101ALI20231005BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20231005BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/70

G01N33/68

G01N27/447 331E

G01N27/447 315K

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023513578

(86)(22)【出願日】2021-08-28

(85)【翻訳文提出日】2023-03-30

(86)【国際出願番号】 US2021048116

(87)【国際公開番号】W WO2022047269

(87)【国際公開日】2022-03-03

(31)【優先権主張番号】63/071,815

(32)【優先日】2020-08-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507302748

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ジャン ボーウェン

(72)【発明者】

【氏名】ツル フランコ

(72)【発明者】

【氏名】リュウ ディンジャン

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045DA36

2G045FA34

2G045FB12

4B063QA01

4B063QQ10

4B063QQ79

4B063QR41

4B063QR50

4B063QS16

4B063QX04

(57)【要約】

アデノ随伴ウイルスのカプシドウイルスタンパク質の比を決定することを含む、ウイルスベクターを含有する試料中のカプシドウイルスタンパク質を同定するための方法及びシステムが提供される。方法及びシステムは、試料中のカプシドウイルスタンパク質を変性させることと、変性したカプシドウイルスタンパク質をリジン結合色素で標識することと、マイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して、変性／標識されたカプシドウイルスタンパク質の分離プロファイルを生成することと、分離プロファイルに基づいてカプシドウイルスタンパク質のレベルを定量化することと、分離プロファイルに基づいてカプシドウイルスタンパク質の定量化比を決定することと、カプシドウイルスタンパク質のリジン含有量に基づいて定量化比を正規化することと、を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのウイルスベクターを含有する試料中の２つ以上のタンパク質間の定量化比を決定する方法であって、
（ａ）少なくとも約６０℃の温度の変性溶液中で前記試料中の前記２つ以上のタンパク質を変性させることと、
（ｂ）変性した前記２つ以上のタンパク質をリジン結合色素で標識することと、
（ｃ）マイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して、標識された前記２つ以上のタンパク質の分離プロファイルを生成することと、
（ｄ）前記分離プロファイルに基づいて前記２つ以上のタンパク質のレベルを定量化することと、
（ｅ）前記２つ以上のタンパク質の定量化された前記レベルを比較して、前記２つ以上のタンパク質間の定量化比を決定することと
を含む、方法。

【請求項2】

前記２つ以上のタンパク質のリジン含有量に基づいて前記定量化比を正規化することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記分離プロファイルの移動時間に基づいて前記定量化比を補正することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記リジン結合色素が、アミン反応性蛍光色素である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記リジン結合色素が、活性エステル、イソチオシアネート、又は塩化スルホニルを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記リジン結合色素が、活性エステルを含み、前記活性エステルが、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、又はスルホジクロロフェノールエステルを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記少なくとも１つのウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記少なくとも１つのウイルスベクターが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）、及びウイルスタンパク質３（ＶＰ３）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記変性溶液が、界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記変性溶液が、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

少なくとも１つのウイルスベクターを含有する試料中の２つ以上のタンパク質間の定量化比を決定するためのシステムであって、
以下：
少なくとも１つのウイルスベクターを含有する試料、
少なくとも約６０℃の温度で前記試料中の２つ以上のタンパク質を変性させることができる変性溶液、及び
前記２つ以上のタンパク質を標識することができるリジン結合色素
を受容するためのマイクロプレートと、
以下：
前記マイクロプレートを受容すること、
標識された前記２つ以上のタンパク質を分離して分離プロファイルを生成すること、
前記２つ以上のタンパク質のレベルを定量化すること、及び
前記２つ以上のタンパク質の定量化された前記レベルを比較して、前記２つ以上のタンパク質間の定量化比を決定すること
ができる、マイクロチップキャピラリー電気泳動デバイスと
を備える、システム。

【請求項12】

前記リジン結合色素が、アミン反応性蛍光色素である、請求項１１に記載のシステム。

【請求項13】

前記リジン結合色素が、活性エステル、イソチオシアネート、又は塩化スルホニルを含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項14】

前記リジン結合色素が、活性エステルを含み、前記活性エステルが、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、又はスルホジクロロフェノールエステルを含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項15】

前記少なくとも１つのウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスである、請求項１１に記載のシステム。

【請求項16】

前記少なくとも１つのウイルスベクターが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）、及びウイルスタンパク質３（ＶＰ３）を含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項17】

前記変性溶液が、界面活性剤を含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項18】

前記変性溶液が、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む、請求項１１に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０７１，８１５号の優先権及び恩典を主張するものであり、この仮特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

分野
本発明は、概して、蛍光色素と組み合わせたマイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して、アデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を特徴付け又は定量化するための方法及びシステムに関する。

【背景技術】

【0003】

背景
遺伝子治療生物製剤は、遺伝物質の宿主ゲノムへの組み込みなど、移入された遺伝物質の転写及び／又は翻訳によって治療効果を媒介する。遺伝子治療生物製剤には、核酸、プラスミド、ウイルス、ベクター、又は遺伝子操作された微生物が含まれる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療のための遺伝物質を送達するための遺伝子送達ベクターとして広く使用されている。ＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれないが、ＡＡＶは非分裂細胞において長期の遺伝子発現を提供することができる。

【0004】

生物医薬品の製造中、製品評価には、製造に使用される成分を評価すること、最終製品を試験／特徴付けること、及び製品の安全性及び品質を保証するために製造プロセスの管理を評価することが含まれる。最終生成物は、純度、同一性、及び効力について試験され、特徴付けられるべきである。したがって、ＡＡＶについての製品試験には、非感染性ベクターに対する感染性ベクターの比、空のカプシドの存在、又はウイルスタンパク質の化学量論比を試験することが含まれ得る。ＡＡＶカプシドタンパク質の特徴付けは、ＡＡＶのウイルスカプシドタンパク質の集合がＡＡＶの感染性、効力、及び安定性に対して著しい影響を有し得るので、ロット間のＡＡＶの産物の品質及び一貫性を確実にするために重要である。

【0005】

ＡＡＶのカプシドウイルスタンパク質を同定及び特徴付けるための方法及びシステムの必要性が存在することが理解される。ＡＡＶのカプシドウイルスタンパク質の特徴付けは、異なるカプシドウイルスタンパク質の比を決定することを含むべきであるが、これは、カプシドウイルスタンパク質の正確な比は、ＡＡＶの生物学的機能（具体的には、カプシド構造、及び組織向性を媒介するアミノ酸差異）に重要であり得るからである。これらの方法及びシステムは、ＡＡＶのカプシドウイルスタンパク質の、頑強で、迅速で、信頼性が高く、高感度で、ハイスループットな検出及び特徴付けを提供するものである。

【発明の概要】

【0006】

概要
本出願は、ウイルスベクターを含有する試料中のカプシドウイルスタンパク質を同定及び／又は特徴付けるための方法及びシステムを提供する。これらの方法及びシステムは、カプシドウイルスタンパク質を同定するための、迅速で、信頼性が高く、高感度で、ハイスループットなプロセスを提供し、ＡＡＶの異なるカプシドウイルスタンパク質の比を決定することを含む。

【0007】

本開示は、ウイルスベクターを含有する試料中の２つ以上のタンパク質間の定量化比を決定する方法を提供する。一部の例示的な実施形態では、本開示は、少なくとも約６０℃の温度の変性溶液中で試料中の２つ以上のタンパク質を変性させることと、変性した２つ以上のタンパク質をリジン結合色素で標識することと、マイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して、変性／標識された２つ以上のタンパク質の分離プロファイルを生成することと、分離プロファイルに基づいて２つ以上のタンパク質のレベルを定量化することと、２つ以上のタンパク質の定量化されたレベルを比較して、当該２つ以上のタンパク質間の定量化比を決定することと、を含む、方法を提供する。

【0008】

一態様では、本出願の方法は、２つ以上のタンパク質のリジン含有量に基づいて定量化比を正規化することを更に含む。一態様では、本出願の方法は、分離プロファイルの移動時間に基づいて定量化比を補正することを更に含む。一態様では、本出願の方法のリジン結合色素は、アミン反応性蛍光色素である。別の態様では、本出願の方法のリジン結合色素は、活性エステル、イソチオシアネート、又は塩化スルホニルを含む。更に別の態様では、本出願の方法のリジン結合色素は、活性エステルを含み、活性エステルは、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、又はスルホジクロロフェノールエステルを含む。

【0009】

一態様では、本出願の方法のウイルスベクターはＡＡＶである。一態様では、本出願の方法のウイルスベクターは、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）、及びウイルスタンパク質３（ＶＰ３）を含む。別の態様では、本出願の方法の変性溶液は、界面活性剤を含み、界面活性剤は、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。

【0010】

本開示は、少なくとも部分的に、少なくとも１つのウイルスベクターを含有する試料中の２つ以上のタンパク質間の定量化比を決定するためのシステムを提供する。一部の例示的な実施形態では、本開示は、マイクロプレートであって、少なくとも１つのウイルスベクターを含有する試料、少なくとも約６０℃の温度で当該試料中の２つ以上のタンパク質を変性させることができる変性溶液、及び２つ以上のタンパク質を標識することができるリジン結合色素、を受容するためのマイクロプレートと、マイクロチップキャピラリー電気泳動デバイスであって、当該マイクロプレートを受容し、変性／標識された２つ以上のタンパク質を分離して分離プロファイルを生成し、２つ以上のタンパク質のレベルを定量化し、かつ２つ以上のタンパク質の定量化されたレベルを比較して、２つ以上のタンパク質間の定量化比を決定することができる、マイクロチップキャピラリー電気泳動デバイスと、を備える、システムを提供する。

【0011】

一態様では、定量化比は、２つ以上のタンパク質のリジン含有量に基づいて正規化することができる。一態様では、定量化比は、分離プロファイルの移動時間に基づいて補正することができる。別の態様では、本出願のシステムのリジン結合色素は、アミン反応性蛍光色素である。一態様では、本出願のシステムのリジン結合色素は、活性エステル、イソチオシアネート、又は塩化スルホニルを含む。更に別の態様では、本出願のシステムのリジン結合色素は、活性エステルを含み、活性エステルは、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、又はスルホジクロロフェノールエステルを含む。

【0012】

一態様では、本出願のシステムのウイルスベクターはＡＡＶである。一態様では、本出願のシステムのウイルスベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含む。別の態様では、本出願のシステムの変性溶液は、界面活性剤を含み、界面活性剤は、ＬＤＳ又はＳＤＳである。

【0013】

本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮される場合、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態及び多数の具体的な詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。多くの置換、修正、追加、又は再配置が、本発明の範囲内で行われ得る。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ １ ＶＰ１－ Ｕｎｉｑｕｅ Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃａｐｓｉｄ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ，２０１３，ｖｏｌ．８７，ｎｏ．９，ｐａｇｅｓ ４９７４－４９８４による、ＡＡＶ１カプシドＶＰ３単量体の結晶構造及びＡＡＶ１カプシドの表面表示を含むＡＡＶ１の構造を示す。

【図2】Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐａｇｅｓ ２５５－２６７による、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び逆層液体クロマトグラフィーなどの従来の方法を使用したＡＡＶのカプシドウイルスタンパク質の分離を示す。

【図3】例示的な実施形態による、還元条件下でリジン結合色素を用いてタンパク質を標識するための試料調製のプロセスを示す。

【図4】例示的な実施形態による、非還元条件下でリジン結合色素を用いてタンパク質を標識するための試料調製のプロセスを示す。

【図5】例示的な実施形態による、１５．９ｋＤａ（ＬＡ１）、２０．４ｋＤａ（ＬＡ２）、２８．９ｋＤａ（ＬＡ３）、４８．４ｋＤａ（ＬＡ４）、６８．４ｋＤａ（ＬＡ５）又は１１９．２ｋＤａ（ＬＡ６）の分子量を有する６つのタンパク質標準物質を含有するＰｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓラダーを示す。

【図6A】例示的な実施形態による、疎水性色素染色と組み合わせたキャピラリー電気泳動を使用した、ＡＡＶ８のカプシドウイルスタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）の分離を示す。

【図6B】例示的な実施形態による、疎水性色素染色と組み合わせたキャピラリー電気泳動を使用した、ＡＡＶ８のカプシドウイルスタンパク質の比、例えば、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比の決定を示す。１２個の電気泳動図を重ね合わせて、アッセイの再現性を実証した。

【図7】例示的な実施形態による、リジン結合色素と組み合わせたキャピラリー電気泳動を使用した、ＡＡＶ８の標識カプシドウイルスタンパク質の分離を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

詳細な説明
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療のための核酸の送達など、遺伝物質を送達するための遺伝子送達ベクターとして広く使用されている。ＡＡＶは、非病原性及び低免疫原性の利点を提供する。ＡＡＶは、ディペンドウイルス属のパルボウイルス科の非病原性メンバーであり、感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーを必要とする（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ １ ＶＰ１－ Ｕｎｉｑｕｅ Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃａｐｓｉｄ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ，２０１３，ｖｏｌ．８７，ｎｏ．９，ｐａｇｅｓ ４９７４－４９８４）。ＡＡＶは、約４．８キロベース（ｋｂ）の一本鎖ＤＮＡゲノムを、タンパク質（例えば、カプシドウイルスタンパク質）の殻から作製される正二十面体カプシド中にカプセル化する。図１は、ＡＡＶ１カプシドＶＰ３単量体の結晶構造及びＡＡＶ１カプシドの放射状に着色された表面表示を含むＡＡＶ１の構造を示している（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．）。

【0016】

遺伝子送達ベクターとしてのＡＡＶの品質及び効率をモニタするために、純度、カプシド同一性、ベクター粒子力価、空／完全比、及びカプシドウイルスタンパク質比をモニタすることが重要である。カプシドウイルスタンパク質は自己集合して外側カプシド殻を形成し、これは細胞結合及び細胞侵入に能動的に関与する。カプシドウイルスタンパク質は、カプシド殻の構造に重要な特定の化学量論比で自己集合する。したがって、遺伝子送達系として使用されるＡＡＶのカプシドウイルスタンパク質の比を決定するための、迅速で、信頼性が高く、高感度で、ハイスループットな方法を開発することが非常に必要とされている。ＡＡＶカプシドタンパク質の特徴付けは、異なるカプシドタンパク質の比を含むべきである。カプシドウイルスタンパク質の正確な比は、ＡＡＶの生物学的機能に重要である。カプシドタンパク質の分解は、ＡＡＶの感染性に有害であり得る。カプシドは、好適な宿主細胞が出現し、細胞侵入が開始され、そしてＡＡＶゲノムが複製のために放出されるまで、ＡＡＶゲノムを保護し得るべきである。

【0017】

ＡＡＶカプシドタンパク質の特徴付けは、ＡＡＶの産物の品質及び一貫性を確実にするために重要であるが、これは、ＡＡＶのウイルスカプシドタンパク質の集合は、ウイルス感染力及びベクター効力に対して著しい影響を有し得るからである（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐａｇｅｓ ２５５－２６７）。ＡＡＶのカプシドウイルスタンパク質は、ｓｓＤＮＡが包まれた場合の第２鎖合成及びインプットゲノムの転写の両方の開始に関与し得る（Ｓａｌｇａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｍａｙ ｐｌａｙ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄ－ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４，Ｖｏｌ．８８，Ｎｏ．２，ｐａｇｅｓ １０７１－１０７９）。

【0018】

一本鎖ＡＡＶゲノムは、ｒｅｐ（複製）、ｃａｐ（カプシド）、及びａａｐ（アセンブリ）を含む３つの遺伝子を含有する。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス増殖及びパッケージングに関連する。ｃａｐ遺伝子は、カプシドウイルスタンパク質をコードする。ｃａｐ遺伝子の発現は、共通のＣ末端を有する交互にスプライシングされたｍＲＮＡから作製される、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含むカプシドウイルスタンパク質を産生する。ＶＰ３は約６１ｋＤａであり、カプシドタンパク質含有量の約８５％を構成する。ＶＰ２は約７３ｋＤａである。ＶＰ１は約８７ｋＤａである。ＶＰ１は、ホスホリパーゼＡ２ドメイン及び核局在化シグナルを含むＶＰ１固有領域（ＶＰ１ｕ）を含む（Ｒａｙａｐｒｏｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３，ｖｏｌ．８７，Ｎｏ．２４，ｐ．１３１５０－１３１６０）。ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含む６０のウイルスタンパク質単量体からなる。ＶＰ３は主要なカプシドタンパク質であり、したがって、カプシド殻の安定性において主要な役割を果たす。ＡＡＶカプシドには約５０コピーのＶＰ３が存在する。ＡＡＶカプシド中には約５コピーのＶＰ１及び５コピーのＶＰ２が存在する。概して、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比は約１：１：１０であり、例えば、６０個のウイルスタンパク質単量体において、５コピーのＶＰ１、５コピーのＶＰ２、及び５０コピーのＶＰ３である（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．）。

【0019】

ＡＡＶカプシドウイルスタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を使用して、サイズの差に基づいて分離することができる。ＡＡＶカプシドタンパク質を特徴付けるための従来の分析方法としては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及び逆相液体クロマトグラフィー（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．による図２に示されるような）が挙げられる。しかしながら、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離は、低スループットであり、定量的な変動を伴う。ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３は、銀染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して可視化することができるが、これは労働集約的で時間のかかるプロセスであり、定量的データが不十分である。銀染色と組み合わせたＳＤＳ－ＰＡＧＥから得られる不十分な定量的データの問題には、試料の過負荷、ゲルの過熱、及び染色／脱染の不適切な標準化が含まれる。別のアプローチは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離をゲル内酵素消化及び液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせて、カプシドウイルスタンパク質を特徴付けることである。しかしながら、ゲルからの消化されたペプチドの回収が限られているため、この方法には限界がある。加えて、逆相液体クロマトグラフィーは、特定の血清型のカプシドタンパク質を分離するのに十分ではない。顕著なウイルスタンパク質の重複が生じ得、かつ分離されるウイルスタンパク質のベースライン分離が不十分であり得る。加えて、１試料当たりに必要とされる分離時間は、約４５～約６０分であり、これは、産業上の要求に対して低いスループットである。Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．は、正確な質量測定に基づいて一部のカプシドタンパク質のＮ末端配列及びＣ末端配列を同定することによって、種々のＡＡＶ血清型におけるカプシドタンパク質を特徴付けるための直接的なＬＣ／ＭＳインタクトタンパク質分析を提供している。

【0020】

マイクロチップキャピラリー電気泳動などのキャピラリー電気泳動は、カプシドウイルスタンパク質を分離するための代替技術であり、これは、自動化でより高いスループット（試料当たり約４２～６５秒）を有する。タンパク質検出のためのキャピラリー電気泳動は、通常、ＵＶ検出を伴う。しかしながら、ＵＶ検出は、特に、タンパク質濃度が典型的には１ｍｇ／ｍＬ未満であるＡＡＶ薬物製品の場合、より低い感度を有し、より大きい試料体積を必要とする。代替のタンパク質検出方法としては、複数の注入のカラムスタッキング又は蛍光検出が挙げられる。加えて、キャピラリー電気泳動を使用して分離された試料は、試料の疎水性パッチに結合する蛍光色素で染色され得る。しかしながら、タンパク質への疎水性色素の結合は、色素が結合するために利用可能な疎水性パッチの程度が血清型ごとに変動することに起因して、制御されない染色化学量となる。カプシドタンパク質中の疎水性パッチを定量化することも困難である。したがって、疎水性色素染色と組み合わせたキャピラリー電気泳動の方法を使用して、カプシドウイルスタンパク質の比を正確に推定することはできない。

【0021】

一部の例示的な実施形態では、本出願は、ウイルスベクターのカプシドウイルスタンパク質を同定及び／又は特徴付けるための方法及びシステムであって、リジン結合蛍光色素と組み合わせたマイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して、ウイルスベクターのカプシドウイルスタンパク質の比を定量化することを含む、方法及びシステムを提供する。一部の例示的な実施形態では、本出願は、ウイルスベクターのカプシドウイルスタンパク質を同定及び／又は定量化するための方法を提供し、この方法は、ウイルスベクターのカプシドウイルスタンパク質を、少なくとも約６０℃、最大約９５℃、又は典型的には約７５℃の温度の変性溶液中で約１０分間変性させることであって、変性溶液は、ＬＤＳを含有する、変性させることと、変性したカプシドウイルスタンパク質をリジン結合色素で標識することと、マイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して、変性／標識したカプシドウイルスタンパク質の分離プロファイルを生成することと、を含む。一部の態様では、ウイルスベクターのカプシドウイルスタンパク質は、リジン結合蛍光色素で標識される。一部の態様では、ウイルスベクターのカプシドウイルスタンパク質は、活性エステル、イソチオシアネート、又はスルホニルクロリドを含むアミン反応性蛍光色素で標識される。一部の態様では、活性エステルは、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、又はスルホジクロロフェノールエステルを含む。一態様では、本出願の方法のウイルスベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含むＡＡＶである。一態様では、ウイルスベクターのカプシドウイルスタンパク質は、還元又は非還元条件下で標識することができる。カプシドウイルスタンパク質が還元条件下で標識される場合、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を還元剤として使用することができる。カプシドウイルスタンパク質が非還元条件下で標識される場合、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）又はヨードアセトアミド（ＩＡＭ）などのアルキル化剤を使用することができる。

【0022】

一部の例示的な実施形態では、本出願は、ウイルスベクターを含有する試料中のカプシドウイルスタンパク質を同定するための方法を提供し、本方法は、少なくとも約６０℃の温度の変性溶液中でカプシドウイルスタンパク質を変性させることと、変性したカプシドウイルスタンパク質をリジン結合色素で標識することと、マイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して、変性／標識されたカプシドウイルスタンパク質の分離プロファイルを生成することと、分離プロファイルに基づいてカプシドウイルスタンパク質のレベルを定量化することと、分離プロファイルに基づいてカプシドウイルスタンパク質の定量化比を決定することと、を含む。一態様では、本出願の方法は、カプシドウイルスタンパク質のリジン含有量に基づいて定量化比を正規化することと、分離プロファイルの移動時間に基づいて定量化比を補正することと、を更に含む。一態様では、本出願の方法のウイルスベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含むＡＡＶである。

【0023】

一部の例示的な実施形態では、本出願は、ウイルスベクターを含有する試料中のタンパク質、例えばカプシドウイルスタンパク質間の定量化比を同定及び／又は決定するためのシステムを提供する。一部の態様では、本出願は、マイクロプレートであって、ウイルスベクターを含有する試料、少なくとも６０℃の温度で当該試料中の２つ以上のタンパク質、例えばカプシドウイルスタンパク質を変性させることができる変性溶液であって、ＬＤＳを含有する、変性溶液、及び２つ以上のタンパク質を標識することができるリジン結合色素、を受容するためのマイクロプレートと、マイクロチップキャピラリー電気泳動デバイスであって、マイクロプレートを受容し、変性／標識された２つ以上のタンパク質を分離して分離プロファイルを生成し、２つ以上のタンパク質のレベルを定量化し、２つ以上のタンパク質の定量化されたレベルを比較して２つ以上のタンパク質の定量化比を決定することができるマイクロチップキャピラリー電気泳動デバイスと、を含む、システムを提供する。一態様では、定量化比は、２つ以上のカプシドウイルスタンパク質のリジン含有量に基づいて正規化することができる。一態様では、定量化比は、分離プロファイルの移動時間に基づいて正規化することができる。

【0024】

ＡＡＶを含有する生物製剤製品の製品品質、一貫性、有効性、及び安全性を改善する要求は、ＡＡＶのカプシドウイルスタンパク質を同定及び／又は特徴付けるための要求の増加をもたらした。本出願は、ウイルスベクターを含有する試料中のカプシドウイルスタンパク質を同定及び／又は特徴付けるための方法及びシステムを提供する。本出願の方法及びシステムの利点は、前述の要求を満たすために、カプシドウイルスタンパク質の比を決定することを含む、ＡＡＶのカプシドウイルスタンパク質を同定及び／又は特徴付けるための、迅速で、信頼性が高く、高感度で、ハイスループットである方法及びシステムを提供することを含む。本明細書に開示される例示的な実施形態は、長年にわたる必要性を満たすために、ＡＡＶのカプシドウイルスタンパク質を同定及び／又は特徴付けるための方法及びシステムを提供することによって、前述の要求を満たす。

【0025】

「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。

【0026】

一部の例示的な実施形態では、本出願は、ウイルス粒子を含有する試料中の２つ以上のタンパク質を同定し、それらの間の定量化比を決定するための方法であって、試料中の２つ以上のタンパク質を少なくとも６０℃の温度の変性溶液中で変性させることと、変性した２つ以上のタンパク質をリジン結合色素で標識することと、マイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して、変性／標識された２つ以上のタンパク質の分離プロファイルを生成することと、分離プロファイルに基づいて２つ以上のタンパク質のレベルを定量化することと、分離プロファイルに基づいて２つ以上のタンパク質の定量化比を決定することと、を含む、方法を提供する。

【0027】

本明細書中で使用される場合、用語「マイクロチップキャピラリー電気泳動」とは、開放管状電気泳動（例えば、微小流体形式のガラスキャピラリー）を使用する電気浸透流の存在下での生体分子の高速分離のためのアプローチをいう。電気浸透流は、電圧がキャピラリーを横切って確立される場合に、穏やかなイオン溶液で満たされたキャピラリー中で生じるバルク溶液流動現象である。キャピラリー電気泳動分離の間の所定の分析物種の速度は、分析物の移動度及び電気浸透流によって決定される。分析物分子の電気泳動移動度は、分離のための重要な因子であり、これは、分析物の質量及び正味の電荷によって影響され得る（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓ．Ｈｅｎｒｙ，Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３３９：１－１０）。マイクロチップキャピラリー電気泳動では、１ｋＶのオーダーの電圧が使用され、サブミリメートルからセンチメートルのチャネル長では、これは１００Ｖ／ｃｍから１０ｋＶ／ｃｍに変換される。

【0028】

本明細書中で使用される用語「ベクター」は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるべき核酸を含む組換えプラスミド又はウイルスをいう。ＡＡＶ由来のベクターは、（ｉ）それらが、筋線維及びニューロンを含む多種多様な非分裂及び分裂細胞型に感染（形質導入）することができ、（ｉｉ）それらはウイルス構造遺伝子を欠き、それによってウイルス感染に対する天然の宿主細胞応答、例えば、インターフェロン媒介性応答を排除し、（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病理とも関連付けられておらず、（ｉｖ）宿主細胞ゲノムに組み込むことができる野生型ＡＡＶとは対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは一般にエピソームとして存続し、したがって、挿入変異誘発又はがん遺伝子の活性化のリスクを制限し、（ｖ）他のベクター系とは対照的に、ＡＡＶベクターは、著しい免疫応答を誘発せず（ｉｉを参照されたい）、したがって、治療用導入遺伝子の長期発現を可能にする（ただし、それらの遺伝子産物が拒絶されない場合）ため、遺伝物質の送達のために特に魅力的である。

【0029】

本明細書中で使用される場合、「タンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、概して「ペプチド」又は「ポリペプチド」として当技術分野で公知の１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。タンパク質は、１つ以上のポリペプチドを含有し、単一の機能性生体分子を形成し得る。

【0030】

例示的な実施形態
本明細書に開示される実施形態は、ウイルスベクターを含有する試料中のカプシドウイルスタンパク質を同定及び／又は特徴付けるための方法及びシステムを提供する。

【0031】

一部の例示的な実施形態では、本出願は、ウイルスベクターを含有する試料中の２つ以上のカプシドウイルスタンパク質間の定量化比を決定するための方法を提供し、本方法は、少なくとも約６０℃の温度の変性溶液中で試料中のカプシドウイルスタンパク質を変性させることと、変性したカプシドウイルスタンパク質をリジン結合色素で標識することと、マイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して、変性／標識されたカプシドウイルスタンパク質の分離プロファイルを生成することと、分離プロファイルに基づいてカプシドウイルスタンパク質のレベルを定量化することと、カプシドウイルスタンパク質間の定量化比を決定するためにカプシドウイルスタンパク質の定量化されたレベルを比較することと、カプシドウイルスタンパク質のリジン含有量に基づいてカプシドウイルスタンパク質の定量化比を正規化することと、を含む。

【0032】

一態様では、試料中のカプシドウイルスタンパク質は、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、少なくとも約８０℃、少なくとも約８５℃、少なくとも約９０℃、少なくとも約９５℃、約６０℃～９５℃、約７０℃～９５℃、約７５℃～９５℃、約８０℃～９５℃、又は約８５℃～９５℃の温度の変性溶液中で、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、又は約１０分間変性される。別の態様では、試料中のカプシドウイルスタンパク質は、約６０℃～９５℃、約７０℃～９５℃、約７５℃～９５℃、約８０℃～９５℃、又は約８５℃～９５℃で、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、又は約１０分間、段階的に加熱することによって変性溶液中で変性され得る。

【0033】

一態様では、本出願の方法のリジン結合色素は、活性エステル、イソチオシアネート、又は塩化スルホニルを含有するアミン反応性蛍光色素である。一態様では、本出願の方法のリジン結合色素は、活性エステルを含み、活性エステルは、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、又はスルホジクロロフェノールエステルを含む。

【0034】

システムは、前述のＡＡＶ、マイクロチップキャピラリー電気泳動デバイス、カプシドウイルスタンパク質、リジン結合色素、又はアミン反応性蛍光色素のいずれにも限定されないことが理解される。上記のように、本発明の方法及びシステムの利点の１つは、疎水性色素の使用のような従来の方法とは異なり、リジン結合色素の使用が、アミノ酸配列中のリジンの数が既知である限り、任意のタンパク質の正確な同定及び定量化を可能にすることである。したがって、例えば、特定のウイルスが例示され得るが、本発明の方法及びシステムは、他のＡＡＶ血清型及び他のウイルスに適用され得ることが理解される。

【0035】

本明細書で提供される方法ステップの数字及び／又は文字による連続的な標識は、方法又はその任意の実施形態を特定の指示された順序に限定することを意味しない。特許、特許出願、公開された特許出願、アクセッション番号、技術論文及び学術論文を含む種々の刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらの引用された参考文献の各々は、その全体が全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示は、本開示をより詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。それらは、例示することを意図しており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0036】

試薬及び方法
１．リジン結合色素を用いた試料調製、標識及び分析：カプシドウイルスタンパク質を、リジン結合色素又はアミン反応性蛍光色素、例えばＰｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ標識色素（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、蛍光色素で標識した。アミン反応性蛍光色素は、リジン残基及びＮ末端アミンを標識することによって、一級アミンと反応することができる。標識反応をクエンチした後、取り込まれた蛍光色素の程度及び位置をモニタした。タンパク質は、標識に利用可能な可変含有量のリジン残基を有する。色素量及びタンパク質濃度を滴定し、標識反応のために最適化する。

【0037】

Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ試薬キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、製造業者によって提供されたユーザガイド（Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）に従って、ｐＨ６～９の緩衝液中０．１～１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲を有するタンパク質試料を標識した。試料の標識には、リジン結合蛍光色素を含有する標識緩衝液を用いた。試料調製のためのＰｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ試薬キットの１×標識緩衝液の組成は、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、０．１４％ＬＤＳ、ｐＨ８である。試料緩衝液はまた、ＬＤＳを含有する。タンパク質試料は、還元又は非還元条件下で標識することができる。還元条件下でタンパク質試料を標識するために、図３に示すように、製造業者の指示に従ってＤＴＴを還元剤として使用した。図３は、一例としてＩｇＧを使用することによる還元条件下での試料調製のプロセスを示している。図４は、製造業者の指示に従って例としてＩｇＧを使用することによって、非還元条件下でリジン結合色素を用いてタンパク質を標識するための試料調製のためのプロセスを示している。アルキル化剤（例えば、ＮＥＭ又はヨードアセトアミド）は、非還元条件のために使用され得る。

【0038】

カプシドウイルスタンパク質を含有する標識されたタンパク質試料を、蛍光検出を使用するＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ又はＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴを使用して分析されるマイクロ流体チップ上にロードした。適切なアッセイ型を、機器によって提供されるアッセイリストから選択した。Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ １００を、１４～１００ｋＤａの範囲でタンパク質をサイズ分類するために選択した。Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２００を、１４～２００ｋＤａの範囲でタンパク質をサイズ分類するために選択した。機器のアッセイ機能は、タンパク質標準物質とのアラインメント及びスケーリングに基づいてタンパク質濃度を決定することができる。アラインメント後、各タンパク質ピークのサイズを、既知のサイズ及び測定された移動時間の一次ラダーピークに対するｌｏｇ（サイズ）対１／時間の適合を使用して、アラインメントピーク時間から計算する。試料ピーク濃度を決定するために、ピーク面積を最初に補正して蛍光強度を補償する。蛍光強度は一定の時間間隔でサンプリングされるので、より遅く移動するタンパク質は、速く移動するタンパク質よりも検出器の下でより多くの時間が費やされる。次いで、ピーク濃度は、ラダーピーク面積及びアッセイ分析ウィンドウにおいて供給されるラダーについての濃度を使用して計算され得る。濃度は、試料及びラダーの希釈係数に合わせて調整する（Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）。

【0039】

２．タンパク質分子量標準物質：Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓラダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ＡＡＶカプシドウイルスタンパク質の分子量を較正又は推定した。タンパク質ラダーを、１：２倍希釈を使用して、７．８ｎｇ／μＬ～２５０ｎｇ／μＬの範囲の連続希釈で調製した。１５．９ｋＤａ（ＬＡ１）、２０．４ｋＤａ（ＬＡ２）、２８．９ｋＤａ（ＬＡ３）、４８．４ｋＤａ（ＬＡ４）、６８．４ｋＤａ（ＬＡ５）又は１１９．２ｋＤａ（ＬＡ６）の分子量を有する６つのタンパク質標準物質を使用した。図５に示すように、タンパク質標準物質のピークは、移動時間が増大する順に現れ、これはタンパク質のサイズ増大に対応した。下部マーカー（ＬＭ）は、低移動時間で最初に現れた。

【0040】

機器
マイクロチップキャピラリー電気泳動を、ＰｒｏｔｅｉｎＥＸａｃｔ（商標）アッセイ又はＰｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙを使用して、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ又はＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）で実施した。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍは、電気泳動分離及び分析の自動化を含む、タンパク質分離のための単一シッパーマイクロ流体チップを使用する。分析のために試料を２４、９６、又は３８４ウェルマイクロプレート（又は「プレート」）にロードした。システムの光学系は、レーザ誘起蛍光信号を検出することができる。システムのアッセイ機能は、データを自動的に分析して、ラダー及びマーカー較正標準を使用して、相対的なタンパク質濃度、分子サイズ、及びパーセント純度を提供する。システムは、１４～２００ｋＤａの範囲の分解能でサイズに基づいてタンパク質を分離することができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｃｏ Ａｓｓａｙの感度は銀染色と同等である。試料は、Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓについては４２秒で、ＰｒｏｔｅｉｎＥＸａｃｔ（商標）については６５秒で分析することができる。スループットは、チップ調製物当たり、Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓについては最大３８４試料、又はＰｒｏｔｅｉｎＥＸａｃｔ（商標）については９６試料である。

【0041】

実施例１．疎水性色素と組み合わせたマイクロチップキャピラリー電気泳動を使用するカプシドウイルスタンパク質の特徴付け
カプシドウイルスタンパク質を、疎水性色素と組み合わせたマイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して分析した。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をＰｒｏｔｅｉｎＥＸａｃｔ（商標）アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と組み合わせて使用して、カプシドウイルスタンパク質を分析し、特徴付けた。ＰｒｏｔｅｉｎＥＸａｃｔ（商標）アッセイは、製造業者の指示に従って行った（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ、ＰｒｏｔｅｉｎＥＸａｃｔ（商標）ＨＲ Ａｓｓａｙ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ）。反応キット中のＰｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲ色素を、タンパク質検出のためにＰｒｏｔｅｉｎＥＸａｃｔ（商標）ゲルマトリックスに添加した。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍは、染色、脱染、電気泳動分離、及び分析の自動化を含むタンパク質分離のための単一シッパーマイクロ流体チップを使用する。それはまた、再現性及び感度を可能にするために、オンシステム較正ステップを利用する。

【0042】

ＰｒｏｔｅｉｎＥＸａｃｔ（商標）アッセイと組み合わせたＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴシステムは、ＳＤＳ、例えばＭＣＥ－ＳＤＳが存在する状態でマイクロ流体キャピラリー電気泳動を使用したタンパク質の分析及び特徴付けのためのハイスループットシステムである。ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）は、ＨＥＫ－２９３細胞において生成され、Ｄ－ＰＢＳ中に少なくとも５×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬを含有した。ＡＡＶ８を含有する試料を、分析を行う前に、例えば試料を約７５℃で加熱することによって変性させた。タンパク質試料を調製し、非還元条件下で変性させた場合、タンパク質試料をヨードアセトアミドで処理した。タンパク質試料を調製し、還元条件下で変性させた場合、タンパク質試料をＤＴＴで処理した。

【0043】

アッセイビューアー上で実行されたＰｒｏｔｅｉｎＥＸａｃｔ（商標）アッセイの出力は、サイズ、蛍光、濃度、及び試料中の総タンパク質に対する個々のタンパク質の寄与パーセントの定量化分析を伴う相対的電気泳動図である。電気泳動図において分離されたピークは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及び不純物を含む。濃度に対応する各タンパク質の補正曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、これを使用して試料中のカプシドウイルスタンパク質の比を決定した。ＡＡＶ８のカプシドウイルスタンパク質を、図６Ａに示されるように、タンパク質検出のためのＰｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲ色素染色と組み合わせたキャピラリー電気泳動を使用して分離した。図６ＡのＸ軸は、ｋＤａでのサイズとして表される。Ｙ軸は、濃度に対応する蛍光を表す。１２個の電気泳動図を重ね合わせて、図６Ｂに示すように、アッセイの再現性を実証した。図６Ｂは、ＶＰ１に対して正規化された各ピークの平均濃度に基づいて計算されたＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比を示している。図６Ｂに示されるように、ＡＡＶ８のカプシドウイルスタンパク質の比、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３は、１．０：１．７：１１．３と計算された。このＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比１．０：１．７：１１．３は、１：１：１０の理論比から有意に逸脱している。

【0044】

実施例２．リジン結合色素と組み合わせたマイクロチップキャピラリー電気泳動を使用するカプシドウイルスタンパク質の特徴付け
ＡＡＶカプシドウイルスタンパク質を、リジン結合蛍光色素と組み合わせたマイクロチップキャピラリー電気泳動を使用して定量化し、特徴付けた。ＡＡＶカプシドウイルスタンパク質を、Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙと組み合わせてＬＤＳの存在下でＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴシステムを使用して分析し、特徴付けた。タンパク質標識を含むＰｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙを、表１に示されるような更なる最適化を用いて、製造業者の指示に従って行った。試薬キット中のＰｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ標識色素を使用して、カプシドウイルスタンパク質のリジン残基などの遊離アミンに結合することによって、カプシドウイルスタンパク質を標識した。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍは、電気泳動分離及び分析の自動化を含むタンパク質分離のための単一シッパーマイクロ流体チップを使用した。それはまた、再現性及び感度を可能にするためにオンシステム較正ステップを利用した。

【0045】

（表１）Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓアッセイ最適化パラメータ

【0046】

ＡＡＶをＨＥＫ－２９３細胞中で作製し、Ｄ－ＰＢＳ中に少なくとも５×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬを含有することが報告された。異なるペイロード、ペイロードＡ、Ｂ、又はＣを含有するＡＡＶ８試料を分析に使用した。ＡＡＶ８試料を、図３及び図４に示されるように、製造業者の指示に従って、還元条件下又は非還元条件下で、表１に詳述したＰｉｃｏ１．０最適化を伴って、Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ標識色素で標識した。タンパク質試料を調製し、非還元条件下で変性させた場合、タンパク質試料をヨードアセトアミドで処理した。タンパク質試料を調製し、還元条件下で変性させた場合、タンパク質試料をＤＴＴで処理した。ＡＡＶ８試料を、還元剤を含むか、又は含まないＬＤＳを含有する標識緩衝液と混合した。続いて、ＡＡＶ８を含有する試料を、７５℃で１０分間試料を加熱することによって変性させた。Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ標識色素を変性ＡＡＶ８試料に添加し、１分間混合した後、３５℃で３０分間、暗所でインキュベートした。停止液を試料に添加して、色素結合反応を終了させた。変性し、標識したＡＡＶ８試料を、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍにおいてＰｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙを使用する分析に供した。

【0047】

アッセイビューアー上で実行されるＰｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙの出力は、試料中の総タンパク質に対する各個々のタンパク質のサイズ、蛍光、及び寄与パーセントの定量化分析を伴う相対的電気泳動図である。電気泳動図において分離されたピークは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及び不純物を含む。ＡＡＶ８の標識されたカプシドウイルスタンパク質を、図７に示されるようにキャピラリー電気泳動を使用して分離した。図７のＸ軸は、移動時間として表される。Ｙ軸は、濃度に対応する蛍光（ＲＦＵ）を表す。濃度に対応する各タンパク質の補正曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、これを使用して試料中のカプシドウイルスタンパク質の比を決定した。

【0048】

表２は、Ｐｉｃｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ Ｐｉｃｏ１．０を使用した３つのＡＡＶ８試料についてのカプシドウイルスタンパク質の計算された比、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３を示している。表２はまた、各カプシドウイルスタンパク質についての対応するリジン数及び移動時間を列挙する。表３は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の、対応する決定された分子量を示している。各カプシドウイルスタンパク質は、異なるリジン含有量を有するため、比は、リジン残基の含有量を使用して正規化され、表４に示されるように、マイクロチップチャネル内の移動時間で補正された。比をＶＰ１に対して正規化した。

【0049】

（表２）Ｐｉｃｏ１．０を用いたカプシドウイルスタンパク質比

【0050】

（表３）決定された、カプシドウイルスタンパク質の分子量

【0051】

（表４）Ｐｉｃｏ１．０を使用して正規化及び補正したタンパク質比

【0052】

加えて、表１に詳述されるような更に最適化されたＰｉｃｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ Ｐｉｃｏ２．０を使用して、カプシドウイルスタンパク質の比を評価した。表５は、Ｐｉｃｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ Ｐｉｃｏ２．０を使用した３つのＡＡＶ８試料についてのカプシドウイルスタンパク質の計算された比、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３を示している。表５はまた、各ウイルスタンパク質について対応するリジン番号を列挙する。各カプシドウイルスタンパク質は異なるリジン含有量を有するので、表６に示すように、リジン残基の含有量を使用してタンパク質比を正規化し、マイクロチップチャネルにおける移動時間で補正した。

【0053】

（表５）Ｐｉｃｏ２．０を用いたカプシドウイルスタンパク質比

【0054】

（表６）Ｐｉｃｏ２．０についての正規化及び補正したタンパク質比

【0055】

これらのタンパク質比をＶＰ１に対して正規化した。Ｐｉｃｏ２．０を用いた最適化は、シグナル強度及びデータ再現性の改善を提供し、より低い濃度を有する試料に好適である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【国際調査報告】