ホーム > 特許ランキング > タネア メディカル アーベー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-13
(54)【発明の名称】連鎖球菌Ｍタンパク質に対する抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/12 20060101AFI20231005BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231005BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20231005BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231005BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231005BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20231005BHJP
【ＦＩ】
C07K16/12 ZNA
C07K16/46
A61P31/04
A61K39/395 R
A61K39/395 D
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023517681
(86)(22)【出願日】2021-09-20
(85)【翻訳文提出日】2023-05-11
(86)【国際出願番号】 EP2021075789
(87)【国際公開番号】W WO2022058584
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】20196885.6
(32)【優先日】2020-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
(71)【出願人】
【識別番号】523094579
【氏名又は名称】タネア メディカル アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ノルデンフェルト，ビル ポンタス
(72)【発明者】
【氏名】マルムストロム，アンデルス ヨハン
(72)【発明者】
【氏名】バフナン，ウェール ガブリエル
(72)【発明者】
【氏名】ハッポネン，ロッタ ヨハンナ オクサネン
(72)【発明者】
【氏名】カークザッド，ハメド
(72)【発明者】
【氏名】シャノン，ウーナ
(72)【発明者】
【氏名】ビョルク，ラルス ヘンリク
(72)【発明者】
【氏名】マルムストロム，ラルス グスタフ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB41
4C085CC21
4C085DD52
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA70
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、新規抗体および抗体組成物、そのような抗体を得るための方法、ならびに細菌感染症およびウイルス感染症を治療するためにならびに研究およびスクリーニング目的のためにそのような抗体および組成物を使用する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する抗体であって、配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡもしくはＶであり、Ａ３はＲもしくはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、もしくはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、もしくは不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、もしくは不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、もしくは不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、もしくはＴであり、Ａ９はＲもしくはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、もしくはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、もしくはＷであり、Ａ１２はＲもしくは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、もしくはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、もしくはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤもしくはＥであり、Ａ１７はＹもしくはＩであり、Ａ１８はＷであるか、または前記配列Ａ１～Ａ１８は、それに６つ以下の保存的置換を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹもしくはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、もしくはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、もしくはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、もしくはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、もしくはＰであり、Ｂ８はＩもしくは不在であり、Ｂ９はＦもしくは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、もしくはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶであるか、または前記配列Ｂ１～Ｂ１７は、それに６つ以下の保存的置換を含む、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む抗体。
【請求項2】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０との結合により決定して５０×１０－９Ｍ－１未満のＫＤで連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記ＣＤＲ Ｈ３ループは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４から選択され、前記ＣＤＲ Ｌ３ループは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項4】
－ 配列番号１７および配列番号２１の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、－ 配列番号１８および配列番号２２の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、
配列番号１９および配列番号２３の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、ならびに
配列番号２０および配列番号２４の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体
からなる群から選択される、請求項１～３のいずれかに記載の抗体。
【請求項5】
－ 重鎖としての配列番号１７および軽鎖としての配列番号２１を含む抗体、－ 重鎖としての配列番号１８および軽鎖としての配列番号２２を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１９および軽鎖としての配列番号２３を含む抗体、
－ 重鎖として配列番号２０および軽鎖として配列番号２４を含む抗体、ならびに
－ 前記抗体のいずれかのバリアントであり、前記バリアントは、好ましくは、前記重鎖および／または軽鎖の各々に多くとも１、２、５、または１０個のアミノ酸改変、より好ましくは配列に保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有する、抗体
からなる群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の抗体。
【請求項6】
細菌凝集を媒介する能力を有する、請求項１～５のいずれかに記載の抗体。
【請求項7】
ＮＦｋＢ活性化を媒介する能力を有する、請求項１～６のいずれかに記載の抗体。
【請求項8】
食作用を誘導する能力を有する、請求項１～７のいずれかに記載の抗体。
【請求項9】
二重Ｆａｂシス抗体結合により前記連鎖球菌Ｍタンパク質の２つの異なるエピトープに対して同時結合を呈する能力を有する、請求項１～８のいずれかに記載の抗体。
【請求項10】
請求項１～９のいずれかに規定の抗体および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項11】
Ａ群連鎖球菌などの連鎖球菌感染症を治療するための、請求項１～９のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項12】
ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、および免疫蛍光から選択される応用における、請求項１～９のいずれかに規定の抗体の使用。
【請求項13】
二重Ｆａｂシス抗体結合により分子の２つの異なるエピトープに対して結合を呈する抗体。
【請求項14】
二重Ｆａｂシス抗体結合により分子の２つの異なるエピトープに対して同時結合を呈する抗体を得るための方法であって、－ 免疫応答などが生じるように前記分子に曝露されたドナーから抗体を得る工程、
－ 前記抗体を酵素反応により前記抗体から単一Ｆａｂ断片に切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により前記抗体から切断する工程、
－ インタクト抗体の結合と、Ｆ（ａｂ’）２－断片および前記単一Ｆａｂ断片の結合とを測定および比較する工程、
－ 抗体結合と比較して、単一Ｆａｂ結合の有意な低減を確認する工程
を含み、
それにより前記抗体を特定および提供する、方法。
【請求項15】
分子に結合した抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を架橋するための方法であって、－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により前記抗体から切断する工程、
－ 前記抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を単離する工程、
－ 前記抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片および前記分子を溶液中で接触させる工程
－ 前記溶液にスベリン酸ジサクシンイミジルを添加し、反応の進行を可能にする工程、
－ 架橋反応をクエンチする工程
を含み
それにより、架橋抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を得る、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療科学、免疫学、および医薬製品の分野に関する。本発明は、免疫系に影響を及ぼし、連鎖球菌感染症などの病原性感染症を阻害することが可能な抗体および組成物を提供する。また、本発明は、そのような抗体を得るための方法、ならびにそのような抗体の使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
抗体は、病原性細菌などの外部侵入物質を認識および中和するために使用される免疫系の必須成分である。抗体は、Ｂ細胞受容体がリンパ組織の特定の抗原と反応した後、Ｂ細胞により産生される。Ｂ細胞成熟および抗体発生は、多種多様な標的の結合を可能にする並外れた多様性を可能にするように進化している。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え事象ならびに体細胞超変異は、抗体可変ドメインの膨大なレパートリーを生み出す。Ｂ細胞活性化、クローン拡大増殖、成熟、およびクラススイッチの結果は、感染因子に対する長期的防御を提供するＩｇＧ抗体の生成である。ＩｇＧ抗体は、２つの同一のＦａｂ断片および１つのＦｃドメインで構成されるＹ字型分子であり、独自の特異性は、Ｆａｂと抗原との相互作用により提供される。ＩｇＧは、典型的には、いずれかのＦａｂで結合し、抗原密度および構成に応じて、同じ抗原の２つのコピーとの結合力によってより高い強度で結合することができる（ＫｌｅｉｎおよびＢｊｏｒｋｍａｎ ２０１０年）。本発明は、この後者の形態の結合を二重Ｆａｂトランス結合と称する。標的に結合すると、ＩｇＧ分子は、免疫細胞上のＦｃ受容体のクラスター化を引き起こすことによりエフェクター機能を実施し、それにより、細胞シグナル伝達が誘導され、食作用、免疫認識、および活性化などの様々な下流効果がもたらされる。
【0003】
Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）は、一般的なヒト病原体であり、ヒト集団において著しい罹患率および死亡率を引き起こし、重度侵襲性感染症の重要な原因因子である。この細菌は、食作用に対する抵抗性および幾つかの免疫グロブリン標的機序（ＩｄｅＳ、ＥｎｄｏＳ、タンパク質Ｍ／Ｈ）を含む、ヒト免疫応答に対抗するための広範な一連の対策を進化させてきた。病原性決定因子である連鎖球菌Ｍタンパク質は、反復領域（Ａ、Ｂ、Ｓ、Ｃ、およびＤ）を有する長鎖コイルドコイル構造を有する。こうした領域は、典型的には、異なるタンパク質相互作用に関連付けられており、Ｃ４ＢＰおよびアルブミンなどの体液性免疫応答の多数の成分に結合し、フィブリノゲンと複合体を形成し、こうした複合体は血管漏出を誘導し、食作用抵抗性に寄与する。また、Ｍタンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃドメインを捕捉することによりＩｇＧの向きを反転させ、それにより食作用を低減させることができる。こうした病原性機序は、免疫系から重要な防御機能を奪い、ＧＡＳが宿主内におよび集団全体に広まることを可能にする。
【0004】
ＧＡＳ感染は体液性免疫応答を生成し、防御メモリーＢ細胞免疫の生成には、反復曝露が必要であると考えられる。抗細菌モノクローナル抗体療法の候補は一般に少数であり、ＧＡＳに使用可能なものは存在しない。ＧＡＳに対するワクチンの開発には多大な労力が費やされている（ＤａｌｅおよびＷａｌｋｅｒ ２０２０年）、主な免疫抗原は、Ｍタンパク質、特にＭタンパク質に基づくペプチドである（Ａｚｕａｒら ２０１９年）。しかしながら、ＧＡＳに対する効果的なワクチンは現在まで承認されていない。免疫の生成を非常に難しくするものが何かであるか不明であるが、抗体サブセットの形成可能性は、免疫優性領域または潜在エピトープにより抑制される（Ｏｚｂｅｒｋら ２０１８年）。重度の生命を脅かす侵襲性ＧＡＳ感染症では、それらの有効性に関する報告が矛盾した結果を示しているにも関わらず、ヒトプール血漿に由来する静脈内ＩｇＧ抗体（ＩＶＩＧ）が療法として使用されている。また、ヒト血漿に由来する医薬には安全性の問題が依然として存在する。したがって、こうした重篤疾病患者を治療するための新しい方法を見出すことが切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、病原性細菌およびウイルスなどの外部侵入物質に起因する疾患と闘うための効果的で安全な新しい抗体が必要とされている。１つのそのような病原性細菌は、Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）である。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、以前にＧＡＳ感染を経験したことがある健常ドナーに由来する抗Ｍタンパク質抗体は、こうした抗体がＧＡＳおよびＭタンパク質に曝露された際にそれらと結合し、細菌凝集、ＮＦｋＢ活性化、食作用、およびｉｎ ｖｉｖｏ防御を含む一連の防御免疫機能を含む種々の効果を発揮することを発見した。また、本発明者らは、モノクローナルＩｇＧ抗体の１つの２つの同一Ｆａｂが同じ分子上の２つの異なるエピトープに同時に結合するという新しいタイプの相互作用を特定した。この形態の結合を二重Ｆａｂシス結合と称する。
【0007】
第１の態様では、本発明は、連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する抗体であって、
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡもしくはＶであり、Ａ３はＲもしくはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、もしくはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、もしくは不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、もしくは不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、もしくは不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、もしくはＴであり、Ａ９はＲもしくはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、もしくはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、もしくはＷであり、Ａ１２はＲもしくは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、もしくはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、もしくはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤもしくはＥであり、Ａ１７はＹもしくはＩであり、Ａ１８はＷであるか、または配列Ａ１～Ａ１８は、それに６つ以下の保存的置換を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹもしくはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、もしくはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、もしくはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、もしくはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、もしくはＰであり、Ｂ８はＩもしくは不在であり、Ｂ９はＦもしくは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、もしくはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶであるか、または配列Ｂ１～Ｂ１７は、それに６つ以下の保存的置換を含む、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む抗体を提供する。
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡもしくはＶであり、Ａ３はＲもしくはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、もしくはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、もしくは不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、もしくは不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、もしくは不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、もしくはＴであり、Ａ９はＲもしくはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、もしくはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、もしくはＷであり、Ａ１２はＲもしくは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、もしくはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、もしくはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤもしくはＥであり、Ａ１７はＹもしくはＩであり、Ａ１８はＷであるか、または配列Ａ１～Ａ１８は、それに６つ以下の保存的置換を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹもしくはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、もしくはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、もしくはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、もしくはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、もしくはＰであり、Ｂ８はＩもしくは不在であり、Ｂ９はＦもしくは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、もしくはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶであるか、または配列Ｂ１～Ｂ１７は、それに６つ以下の保存的置換を含む、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む抗体を提供する。
【0008】
一実施形態では、抗体は、
－ 重鎖としての配列番号９および軽鎖としての配列番号１３を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１０および軽鎖としての配列番号１４を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１１および軽鎖としての配列番号１５を含む抗体、ならびに
－ 重鎖としての配列番号１２および軽鎖としての配列番号１６を含む抗体
からなる群から選択される。
－ 重鎖としての配列番号９および軽鎖としての配列番号１３を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１０および軽鎖としての配列番号１４を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１１および軽鎖としての配列番号１５を含む抗体、ならびに
－ 重鎖としての配列番号１２および軽鎖としての配列番号１６を含む抗体
からなる群から選択される。
【0009】
別の実施形態では、本発明の抗体は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０との結合により決定して５０×１０－９Ｍ－１未満のＫＤで連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する。
【0010】
本発明の抗体は、細菌凝集を媒介する能力を有することが見出された。さらなる実施形態では、本発明による抗体は、ＮＦｋＢ活性化を媒介することが見出された。本発明のまたさらなる実施形態では、本発明の抗体は、食作用を誘導する能力を有することが見出された。
【0011】
またさらなる実施形態では、本発明の抗体は、二重Ｆａｂシス抗体結合により連鎖球菌Ｍタンパク質の２つの異なるエピトープに対して同時結合を呈する能力を有する。
【0012】
第２の態様では、本発明は、上記で規定された抗体および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0013】
一実施形態では、医薬組成物は、２つまたはそれよりも多くの異なる抗体を含む。
【0014】
第３の態様では、本発明は、Ａ群連鎖球菌感染症などの連鎖球菌感染症を治療するための、第１の態様による抗体の使用を提供する。
【0015】
第４の態様では、本発明は、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、および免疫蛍光から選択される応用における、本発明の抗体の使用を提供する。
【0016】
第５の態様では、本発明は、二重Ｆａｂシス抗体結合によりタンパク質の２つの異なるエピトープに対して結合を呈する抗体を提供する。
【0017】
第６の態様では、本発明は、二重Ｆａｂシス抗体結合により分子の２つの異なるエピトープに対して同時結合を呈する抗体を得るための方法であって、
－ 免疫応答などが生じるように分子に曝露されたドナーから抗体を得る工程、
－ 抗体を酵素反応により抗体から単一Ｆａｂ断片に切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ インタクト抗体の結合と、Ｆ（ａｂ’）２－断片および単一Ｆａｂ断片の結合とを測定および比較する工程、
－ 抗体結合と比較して、単一Ｆａｂ結合の有意な低減を確認する工程
を含み、
それにより抗体を特定および提供する、方法を提供する。
－ 免疫応答などが生じるように分子に曝露されたドナーから抗体を得る工程、
－ 抗体を酵素反応により抗体から単一Ｆａｂ断片に切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ インタクト抗体の結合と、Ｆ（ａｂ’）２－断片および単一Ｆａｂ断片の結合とを測定および比較する工程、
－ 抗体結合と比較して、単一Ｆａｂ結合の有意な低減を確認する工程
を含み、
それにより抗体を特定および提供する、方法を提供する。
【0018】
二重Ｆａｂシス抗体結合を呈する抗体を得るための方法の一実施形態では、分子の２つの異なるエピトープは、連鎖球菌Ｍタンパク質などのタンパク質の２つの異なるエピトープである。
【0019】
第７の態様では、本発明は、分子に結合した抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を架橋するための方法であって、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を単離する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片および分子を溶液中で接触させる工程
－ 溶液にスベリン酸ジサクシンイミジルを添加し、反応の進行を可能にする工程、
－ 架橋反応をクエンチする工程
を含み、
それにより、架橋抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を得る、方法を提供する。
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を単離する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片および分子を溶液中で接触させる工程
－ 溶液にスベリン酸ジサクシンイミジルを添加し、反応の進行を可能にする工程、
－ 架橋反応をクエンチする工程
を含み、
それにより、架橋抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を得る、方法を提供する。
【0020】
加えて、本発明による抗体は、既知の抗体および抗体組成物と比較して、細菌凝集、ＮＦκＢ活性化、食作用、および／またはｉｎ ｖｉｖｏ防御を含む一連の防御免疫機能を効果的に呈するための特性の向上を示す。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】ヒト単一細胞由来Ｍ特異的抗体の発生を可能にする抗原ベイティング（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂａｉｔｉｎｇ）のための方法を示す図であり、Ｂ細胞は、Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ Ｂを使用して単離され、生存し（Ｓｙｔｏ９－ＦＩＴＣ陰性）、ＣＤ１９を発現し（ＰＥ）、ＣＤ３を欠如し（ＢＶ５１０）、ＩｇＧおよびＭタンパク質に対して二重陽性だった（それぞれＢＶ４１０およびＡＦ６４７）単一リンパ球にＦＡＣＳ選別された。
【図2】ＳＦ３７０（ＧＦＰ形質転換）細菌を表示の抗体で染色し、二次Ｆａｂ抗Ｆａｂ抗体（ＡＦ６４７にコンジュゲートされた）を使用して、フローサイトメトリー分析用のシグナルを生成させたことを示す図である。フローヒストグラムの右上隅の数字は、蛍光強度中央値を示す。
【図3】ＷＴ ＳＦ３７０およびΔＭ ＳＦ３７０の染色を比較することにより、成功した抗体の特異性を評価したことを示す図である。
【図4】ＩｇＧ抗体の模式図を示す図である。
【図5】総抗体濃度の関数としての、対数増殖中期ＳＦ３７０またはＭ突然変異体に対する特異的抗体の測定結合値（暗色エラーバー）を、最小二乗法を使用してフィッティングした結合曲線（暗色曲線）と共に示すプロットを示す図である。下段の３つのプロットは、左下の結合曲線のフィッティングに従って正規化した非特異的抗体による対照であり、それにより結合は３つの対照間で比較可能になった。フィッティングのＫＤ値は、ブートストラップ法を使用して計算された信頼区間と共に、各プロットに示されている。使用した抗体（抗体断片）は、各グラフの右上側に表示されている。
【図6】ＩｄｅＳ切断α－Ｍ抗体で染色され、Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８コンジュゲートＦａｂ α－Ｆａｂ断片でプローブされた細菌に対して、構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）超解像度画像化を実施したことを示す図である。ＡＦ６４７コンジュゲートＷＧＡを、細菌構造を強調するための対比染色として使用した。スケールバーは５μｍを表す。
【図7】抗体を、Ｍタンパク質に対する反応性についてＥＬＩＳＡアッセイで試験したことを示す図である。ＸｏｌａｉｒおよびＰＢＳを陰性対照として使用した。４５０ｎｍの吸光度を測定し、四重重複ウェルの平均としてプロットした。
【図8】言及されている抗体を２μｇ／ｍｌの濃度で用いてプローブしたことを示す図である。対数増殖させたＷＴおよびΔＭ ＳＦ３７０細菌のタンパク質ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥに流し、ブロッティングした後、抗体でプローブした。
【図9】細菌凝集に対する抗体混合物（上段グラフ）または個々の抗体（下段グラフ）の効果の経時分析を、ＯＤ６００測定により評価した図である。
【図10】ＴＨＰ－１－ｂｌｕｅ細胞を、抗Ｍ特異的抗体と共にまたは伴わずにＭ１タンパク質（２μｇ／ｍｌ）で処理したことを示す図である。表示されているデータは、３回行われた実験を表す三重重複試料からのものである。エラーバーはＳＥＭを表す。統計的有意性は、クラスカル－ワリス多重比較補正を行った一元配置ＡＮＯＶＡを使用して評価した。＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１、＊＊＊はｐ≦０．００１、および＊＊＊＊はｐ≦０．０００１を示す。
【図11】細菌に付随した細胞のパーセンテージをＭＯＰの関数として表す曲線を示す図である。挿入図には、各オプソニン化条件のＭＯＰ５０が表示されている。ＴＨＰ－１細胞を、漸増ＭＯＰの熱死滅ＳＦ３７０細菌と共にインキュベートした。細菌との付随および内部移行を３０分間可能にした後、ＴＨＰ－１細胞をフローサイトメトリー分析した。
【図12】ＦＩＴＣチャネルにおけるＴＨＰ１細胞のＭＦＩが、ＭＯＰ４００の細菌とＴＨＰ１細胞との付随に対する各抗体の効果を示すことを表す図である。
【図13】各ＭＯＰ毎にプロットした、内部移行細菌を含む細胞のパーセンテージを示す図である。
【図14】４００のＭＯＰにおける、１０μｇ／ｍｌの個々の抗体で予めオプソニン化された内部移行細菌を有するＴＨＰ１細胞のＭＦＩ（内部移行細菌チャネル）を示す図である。
【図15】一連の濃度（０．０１７～４０μｇ／ｍｌ）のＡｂ２５（グラフの上部の記号）またはＸｏｌａｉｒ（グラフの下部の記号）でオプソニン化された熱死滅ＳＦ３７０を、ＭＯＰ１５０でＴＨＰ１細胞とインキュベートしたことを示す図である。この図に示されているデータは、３つの独立実験をプールした結果からのものである。エラーバーはＳＥＭを表す。統計的有意性は、クラスカル－ワリス多重比較補正を行った一元配置ＡＮＯＶＡを使用して評価し、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１、＊＊＊はｐ≦０．００１、および＊＊＊＊はｐ≦０．０００１を示す。
【図16】脾臓、腎臓、および肝臓組織の細菌量をコロニー計数により測定したことを示す図である。
【図17】血漿中のサイトカインレベルを、サイトメトリービーズアレイを使用して評価したことを示す図である。データは、２つの独立実験（１セット当たり１条件当たり５匹のマウス）からプールされている。
【図18】抗体Ａｂ２５、Ａｂ２６、Ａｂ３２、およびＡｂ４９の、アミノ酸配列レベルでのＬ３－Ｈ３ループ差異を反映する複数の配列アラインメントを示す図である。
【図19】モデル化抗体Ａｂ２５、Ａｂ３２、およびＡｂ４９のＦａｂ断片を表す図である。各抗体には、ＣＤＲ Ｈ３およびＬ３ループが示されている（Ａｂ２５、黄色；Ａｂ３２、緑色；およびＡｂ４５、青緑色）。
【図20】Ａｂ２５（黄色 ＣＤＲループ）、Ａｂ３２（緑色 ループ）、およびＡｂ４９（青緑色 ループ）の構造アラインメントを示す図である。
【図21】Ａｂ２５のＭ１相互作用部位（赤）を示す図である。図間には、ｙ軸での６０°回転が適用されている。接触表面の長さは、上部結合部位（Ｂ２－Ｂ３ドメイン）では４５Å、下部（Ｃドメイン）では１８Åである。
【図22】Ａｂ４９のＭ１相互作用部位（青緑色）を表す図である。Ａｂ４９の接触の長さ（Ｂ２－Ｂ３ドメイン）はおよそ１６Åである。図２１および２２の挿入図は、ＴＸ－ＭＳ（Ｈａｕｒｉら ２０１９年）により生成された全長モデルを表し、Ａｂ２５またはＡｂ４９（重鎖は濃赤色、軽鎖は明色網掛け）とＭ１タンパク質（灰色）とのＦａｂ媒介姓相互作用を示す。架橋ペプチドは濃青色で、リジン（Ｋ）残基間の架橋は黒色破線で示されている。ＣＤＲ Ｈ３ループは、黄色（Ａｂ２５の場合）または赤色（Ａｂ４９の場合）で示されている。Ｍ１タンパク質にはＡｂ２５との相互作用部位が２つあり、Ｂ２－Ｂ３ドメインの上部部位（挿入図）は４つの架橋により支持されており、Ｃ１ドメインの下部部位（挿入図）は６つの架橋により支持されている。Ａｂ４９とＭ１との相互作用部位は１つだけ存在し、２つの架橋により支持されている。
【図23】ＦａｂエピトープならびにＭタンパク質上のＦｃ結合領域は、構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）画像を使用した蛍光局在化平均法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｖｅｒａｇｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｋｕｍｒａ Ａｈｎｌｉｄｅらの原稿 ２０２０年）により推定されることを示す図である。相対的結合部位は、多数の画像の累積シグナルを使用して、抗体チャネルと参照チャネルとの距離（ＷＧＡ）を解像することにより決定される。結果は、それぞれＮ＝９、１３、９、９の４つの独立実験からのものである。
【図24】表示の抗体試料（１０μｇ／ｍｌ）による前処理後のＡｌｅｘａ６４７コンジュゲートＸｏｌａｉｒ（１００μｇ／ｍｌ）とＳＦ３７０との結合のデータを示す図である。データは、一緒にプールした３つの独立実験からのものである。統計的有意性は、クラスカル－ワリス多重比較補正を行った一元配置ＡＮＯＶＡを使用して評価し、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１、＊＊＊はｐ≦０．００１、および＊＊＊＊はｐ≦０．０００１を示す。
【図25】Ｆｃ結合を介した細菌に対するＸｏｌａｉｒ結合の結果を示す図である。事前にＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎで染色した熱死滅細菌を、１０μｇ／ｍｌのＡｂ２５またはＩｇｄＥ消化（Ｓｐｏｅｒｒｙら ２０１６年）Ａｂ２５（Ｆａｂ）と共にインキュベートした。次いで、細菌を、蛍光標識Ｘｏｌａｉｒ（ＡＦ６４７）と共にインキュベートした後で、フローサイトメトリーで分析した。Ｆｃ結合を介してＸｏｌａｉｒに結合した細菌は、陽性として示されている。
【図26】実施した競合抗Ｍタンパク質ＥＬＩＳＡの結果を示す図であり、遊離Ｍ１断片を等モル比（１０μｇ／ｍｌ）のＡｂ２５と混合した。次いで、ウェルを洗浄し、プロテインＧ－ＨＲＰを使用してシグナルを発生させた。
【図27】抗体を、熱死滅Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ細菌と混合し、次いでそれを洗浄し、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲートＦａｂ抗Ｆａｂで染色し、フローサイトメトリーで分析することにより研究した、Ｘｏｌａｉｒ、ＩｄｅＳ切断またはＩｇｄＥ切断Ａｂ２５またはＡｂ４９の結合特性に関する実験の結果を示す図である。右側のパネルは、結合分析で使用した抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図28】実施例１（図１～５）に記載のように実施したＡｂ２５およびＡｂ４９のＩｇｄＥ処理により生成されたＦａｂに対する親和性を示す図である。新しいＦａｂデータは、図５のデータに重ねられている。データは、４つの独立実験からプールした結果を表す。統計的有意性は、クラスカル－ワリス多重比較補正を行った一元配置ＡＮＯＶＡを使用して評価し、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１、＊＊＊はｐ≦０．００１、および＊＊＊＊はｐ≦０．０００１を示す。
【図29】重鎖および軽鎖の可変領域のクローニングＲＴ－ＰＣＲからの１０個の抗体対を示す図である。
【図30】凝集の測定に使用したキュベットの画像を示す図である。ＳＦ３７０一晩培養物をＴＨＹで１：５に希釈し、抗体（１００μｇ／ｍｌ）と共にプラスチックキュベット内で３時間、３７℃にてインキュベートした後でＯＤ６００を測定した。抗体混合物（各々１００μｇ／ｍｌのＡｂ２５、３２、および４９）の凝集効果を、ＷＴ細菌およびΔＭ細菌で比較した。陽性対照としてドナー血漿を使用した。
【図31】三重抗体カクテルならびに個々の抗体の両方の用量依存性凝集を示す図である。
【図32】凝集細菌ならびに典型的なＧＡＳ凝集体は、抗Ｍ抗体または血漿の存在下で激しくボルテックスすることにより消散することを示す図である。
【図33A】プレイの多重度（ＭＯＰ）を漸増させた、ｐＨ感受性ＣｙｐＨｅｒ５染色細菌と貪食ＴＨＰ－１細胞とのインキュベーションを示す図である。本発明者らは、Ａｂ２５、３２、および４９を組み合わせて、ＴＨＰ－１細胞との細菌付随に対する累積効果を評価した。ＴＨＰ－１細胞を、ＦＳＣおよびＳＣＣに基づいてゲート制御した。ＦＳＣ面積および高さパラメーターに基づいて、単一細胞を選択した。非相互作用細胞は、ＦＩＴＣ（細菌）またはＣｙｐＨｅｒ５Ｅ（内部移行細菌）シグナルを示さない。細菌に付随した相互作用細胞は、左上象限（外側）へのシフトを示すが、細菌に内部移行されたＴＨＰ－１細胞は、ＡＰＣシグナルの取得により右上象限にシフトする。細菌を接種したＴＨＰ－１細胞を氷上で維持して食作用を低減させた。これは、右上象限の事象数の低減として視認可能である。
【図33B】プレイの多重度（ＭＯＰ）を漸増させた、ｐＨ感受性ＣｙｐＨｅｒ５染色細菌と貪食ＴＨＰ－１細胞とのインキュベーションを示す図である。本発明者らは、Ａｂ２５、３２、および４９を組み合わせて、ＴＨＰ－１細胞との細菌付随に対する累積効果を評価した。ＴＨＰ－１細胞を、ＦＳＣおよびＳＣＣに基づいてゲート制御した。ＦＳＣ面積および高さパラメーターに基づいて、単一細胞を選択した。非相互作用細胞は、ＦＩＴＣ（細菌）またはＣｙｐＨｅｒ５Ｅ（内部移行細菌）シグナルを示さない。細菌に付随した相互作用細胞は、左上象限（外側）へのシフトを示すが、細菌に内部移行されたＴＨＰ－１細胞は、ＡＰＣシグナルの取得により右上象限にシフトする。細菌を接種したＴＨＰ－１細胞を氷上で維持して食作用を低減させた。これは、右上象限の事象数の低減として視認可能である。
【図34】Ａｂ２５による食作用増強を示す図である。１０μｇ／ｍｌのＸｏｌａｉｒまたはＡｂ２５を使用して、様々なＭ血清型にわたる食作用増強を研究した。Ｍ１ ＳＦ３７０株に加えて、血清型Ｍ１（ＡＰ１）、Ｍ１２、Ｍ８９、およびＭ５を有するＧＡＳを比較した。内部移行率に対する抗体処理の効果を、フローサイトメトリーにより測定した。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。データは３つの独立実験からのものである。
【図35】抗体とＭ１タンパク質との間の架橋ペプチドを特定するためのＭ／Ｓデータを示す図である（パネルＡ～Ｆ）。
【図36】抗体とＭ１タンパク質との間の架橋ペプチドを特定するためのＭ／Ｓデータを示す図である（パネルＧ～Ｌ）。
【図37】Ｍタンパク質のＢ１Ｂ２Ｂ３領域ならびにＣ１Ｃ２Ｃ３領域にわたる断片に対するＡｂ２５（３０μｇ／ｍｌ）またはＩＶＩＧ（１ｍｇ／ｍｌ）のＥＬＩＳＡ反応性を示す図である。全長Ｍ１およびＧＦＰは、それぞれ陽性対照および陰性対照としての役目を果たす。３つの独立実験がＳＤと共に示されている。
【図38】使用したＭタンパク質断片の配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0022】
第１の態様では、本発明は、連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する抗体であって、
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡもしくはＶであり、Ａ３はＲもしくはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、もしくはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、もしくは不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、もしくは不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、もしくは不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、もしくはＴであり、Ａ９はＲもしくはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、もしくはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、もしくはＷであり、Ａ１２はＲもしくは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、もしくはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、もしくはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤもしくはＥであり、Ａ１７はＹもしくはＩであり、Ａ１８はＷであるか、または配列Ａ１～Ａ１８はそれに６つ以下の保存的置換を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹもしくはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、もしくはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、もしくはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、もしくはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、もしくはＰであり、Ｂ８はＩもしくは不在であり、Ｂ９はＦもしくは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、もしくはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶであるか、または配列Ｂ１～Ｂ１７は、それに６つ以下の保存的置換を含む、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む抗体を提供する。
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡもしくはＶであり、Ａ３はＲもしくはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、もしくはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、もしくは不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、もしくは不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、もしくは不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、もしくはＴであり、Ａ９はＲもしくはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、もしくはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、もしくはＷであり、Ａ１２はＲもしくは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、もしくはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、もしくはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤもしくはＥであり、Ａ１７はＹもしくはＩであり、Ａ１８はＷであるか、または配列Ａ１～Ａ１８はそれに６つ以下の保存的置換を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹもしくはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、もしくはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、もしくはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、もしくはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、もしくはＰであり、Ｂ８はＩもしくは不在であり、Ｂ９はＦもしくは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、もしくはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶであるか、または配列Ｂ１～Ｂ１７は、それに６つ以下の保存的置換を含む、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む抗体を提供する。
【0023】
一実施形態では、抗体は、１つ以下の保存的置換など、３つ以下の保存的置換を含む配列Ａ１～Ａ１８を有する。第２の実施形態では、抗体は、１つ以下の保存的置換など、３つ以下の保存的置換を含む配列Ｂ１～Ｂ１８を有する。
【0024】
保存的置換は、本明細書で使用される場合、表１～３の１つまたは複数の群の１つまたは複数に反映されているアミノ酸のクラス内の置換であると定義される。
【0025】
【表1】
【0026】
【表2】
【0027】
【表3】
【0028】
一実施形態では、抗体は、
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡまたはＶであり、Ａ３はＲまたはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、または不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、または不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、または不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、またはＴであり、Ａ９はＲまたはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、またはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、またはＷであり、Ａ１２はＲまたは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、またはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、またはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤまたはＥであり、Ａ１７はＹまたはＩであり、Ａ１８はＷである、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹまたはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、またはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、またはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、またはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、またはＰであり、Ｂ８はＩまたは不在であり、Ｂ９はＦまたは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、またはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶである、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む。
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡまたはＶであり、Ａ３はＲまたはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、または不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、または不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、または不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、またはＴであり、Ａ９はＲまたはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、またはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、またはＷであり、Ａ１２はＲまたは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、またはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、またはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤまたはＥであり、Ａ１７はＹまたはＩであり、Ａ１８はＷである、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹまたはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、またはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、またはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、またはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、またはＰであり、Ｂ８はＩまたは不在であり、Ｂ９はＦまたは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、またはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶである、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む。
【0029】
本発明のいずれかによる抗体は、好ましくは、ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０との結合により決定して５０×１０－９Ｍ－１未満のＫＤで連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、１５×１０－９Ｍ－１未満、５×１０－９Ｍ－１未満、または１×１０－９Ｍ－１未満のＫＤで連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する。
【0030】
さらなる実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４から選択されるＣＤＲ Ｈ３ループを有する。
配列番号１は、ＣＡＲＳＹＰＨＫＲＷＬＲＰＰＦＤＹＷである。
配列番号２は、ＣＡＫＮＳＲＳＧＷＹＦＦＦＤＹＷＧＱである。
配列番号３は、ＣＡＲＱＧＦＤＴＲＧＥＤＡＦＥＩＷＧである。
配列番号４は、ＣＶＲＤＳＲＦＷＧＩＦＤＹＷＧＱＧＴである。
配列番号１は、ＣＡＲＳＹＰＨＫＲＷＬＲＰＰＦＤＹＷである。
配列番号２は、ＣＡＫＮＳＲＳＧＷＹＦＦＦＤＹＷＧＱである。
配列番号３は、ＣＡＲＱＧＦＤＴＲＧＥＤＡＦＥＩＷＧである。
配列番号４は、ＣＶＲＤＳＲＦＷＧＩＦＤＹＷＧＱＧＴである。
【0031】
さらなる実施形態では、本発明による抗体は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２と比べて２０個未満の保存的アミノ酸置換を有する任意のバリアント配列から選択されるＨ３鎖を有する。
【0032】
Ａｂ２５のＨ３鎖は、以下の配列を有する配列番号９である：
ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＬＩＳＹＤＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＰＨＫＲＷＬＲＰＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＬＩＳＹＤＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＰＨＫＲＷＬＲＰＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0033】
Ａｂ２６のＨ３鎖は、以下の配列を有する配列番号１０である：
ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＶＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＳＲＳＧＷＹＦＦＦＤＹＷＧＱ
ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＶＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＳＲＳＧＷＹＦＦＦＤＹＷＧＱ
【0034】
Ａｂ３２のＨ３鎖は、以下の配列を有する配列番号１１である：
ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＭＦＮＥＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＦＩＳＮＡＧＴＹＴＮＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＥＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＦＤＴＲＧＥＤＡＦＥＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＭＦＮＥＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＦＩＳＮＡＧＴＹＴＮＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＥＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＦＤＴＲＧＥＤＡＦＥＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
【0035】
Ａｂ４９のＨ３鎖は、以下の配列を有する配列番号１２である：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＳＩＮＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＳＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＤＳＲＦＷＧＩＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＳＩＮＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＳＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＤＳＲＦＷＧＩＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0036】
一部の実施形態では、抗体は、１０個未満の保存的アミノ酸置換、５つ未満の保存的アミノ酸置換、または２つ未満の保存的アミノ酸置換を有するＨ３鎖のバリアント配列を含む。
【0037】
別の実施形態では、抗体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択されるＣＤＲ Ｌ３ループを含む。
配列番号５は、ＱＹＮＳＹＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶｄである。
配列番号６は、ＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶである。
配列番号７は、ＱＲＳＧＷＰＳＩＦＴＦＧＰＧＴＫＶである。
配列番号８は、ＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶである。
配列番号５は、ＱＹＮＳＹＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶｄである。
配列番号６は、ＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶである。
配列番号７は、ＱＲＳＧＷＰＳＩＦＴＦＧＰＧＴＫＶである。
配列番号８は、ＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶである。
【0038】
さらなる実施形態では、本発明による抗体は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６と比べて２０個未満の保存的アミノ酸置換を有する任意のバリアント配列から選択されるＬ３鎖を有する。
【0039】
Ａｂ２５のＬ３鎖は、以下の配列を有する配列番号１３である：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＳＹＣＣＱＱＹＮＳＹＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＳＹＣＣＱＱＹＮＳＹＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫ
【0040】
Ａｂ２６のＬ３鎖は、以下の配列を有する配列番号１４である：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【0041】
Ａｂ３２のＬ３鎖は、以下の配列を有する配列番号１５である：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＰＬＳＧＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＮＡＳＫＲＡＴＧＩＰＡＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＧＷＰＳＩＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＰＬＳＧＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＮＡＳＫＲＡＴＧＩＰＡＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＧＷＰＳＩＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
【0042】
Ａｂ４９のＬ３鎖は、以下の配列を有する配列番号１６である：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＲＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＲＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0043】
一部の実施形態では、抗体は、１０個未満の保存的アミノ酸置換、５つ未満の保存的アミノ酸置換、または２つ未満の保存的アミノ酸置換を有するＬ３鎖のバリアント配列を含む。
【0044】
さらなる実施形態では、抗体は、
－ 重鎖としての配列番号１７および軽鎖としての配列番号２１を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１８および軽鎖としての配列番号２２を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１９および軽鎖としての配列番号２３を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号２０および軽鎖として配列番号２４を含む抗体、ならびに
－ 上記抗体のいずれかのバリアントであり、バリアントは、好ましくは、重鎖および／または軽鎖の各々に多くとも１、２、５、または１０個のアミノ酸改変、より好ましくは、上記配列に保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有する、抗体
からなる群から選択される。
－ 重鎖としての配列番号１７および軽鎖としての配列番号２１を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１８および軽鎖としての配列番号２２を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１９および軽鎖としての配列番号２３を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号２０および軽鎖として配列番号２４を含む抗体、ならびに
－ 上記抗体のいずれかのバリアントであり、バリアントは、好ましくは、重鎖および／または軽鎖の各々に多くとも１、２、５、または１０個のアミノ酸改変、より好ましくは、上記配列に保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有する、抗体
からなる群から選択される。
【0045】
Ａｂ２５の重鎖は、以下の配列を有する配列番号１７である：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＬＩＳＹＤＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＰＨＫＲＷＬＲＰＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＬＩＳＹＤＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＰＨＫＲＷＬＲＰＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0046】
Ａｂ２６の重鎖は、以下の配列を有する配列番号１８である：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＶＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＳＲＳＧＷＹＦＦＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＶＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＳＲＳＧＷＹＦＦＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0047】
Ａｂ３２の重鎖は、以下の配列を有する配列番号１９である：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＭＦＮＥＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＦＩＳＮＡＧＴＹＴＮＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＥＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＦＤＴＲＧＥＤＡＦＥＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＭＦＮＥＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＦＩＳＮＡＧＴＹＴＮＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＥＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＦＤＴＲＧＥＤＡＦＥＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0048】
Ａｂ４９の重鎖は、以下の配列を有する配列番号２０である：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＳＩＮＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＳＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＤＳＲＦＷＧＩＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＳＩＮＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＳＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＤＳＲＦＷＧＩＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0049】
Ａｂ２５の軽鎖は、以下の配列を有する配列番号２１である：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＳＹＣＣＱＱＹＮＳＹＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＳＹＣＣＱＱＹＮＳＹＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0050】
Ａｂ２６の軽鎖は、以下の配列を有する配列番号２２である：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0051】
Ａｂ３２の軽鎖は、以下の配列を有する配列番号２３である：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＰＬＳＧＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＮＡＳＫＲＡＴＧＩＰＡＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＧＷＰＳＩＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＰＬＳＧＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＮＡＳＫＲＡＴＧＩＰＡＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＧＷＰＳＩＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0052】
Ａｂ４９の軽鎖は、以下の配列を有する配列番号２４である：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＲＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＲＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0053】
別の実施形態では、本発明の抗体は、
－ 重鎖としての配列番号１７および軽鎖としての配列番号２１を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１８および軽鎖としての配列番号２２を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１９および軽鎖として配列番号２３を含む抗体、ならびに
－ 重鎖としての配列番号２０および軽鎖としての配列番号２４を含む抗体
からなる群から選択される。
－ 重鎖としての配列番号１７および軽鎖としての配列番号２１を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１８および軽鎖としての配列番号２２を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１９および軽鎖として配列番号２３を含む抗体、ならびに
－ 重鎖としての配列番号２０および軽鎖としての配列番号２４を含む抗体
からなる群から選択される。
【0054】
別の実施形態では、本発明の抗体は、
－ 配列番号１７および配列番号２１の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、
－ 配列番号１８および配列番号２２の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、
配列番号１９および配列番号２３の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、ならびに
配列番号２０および配列番号２４の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体
からなる群から選択される。
－ 配列番号１７および配列番号２１の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、
－ 配列番号１８および配列番号２２の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、
配列番号１９および配列番号２３の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、ならびに
配列番号２０および配列番号２４の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体
からなる群から選択される。
【0055】
一実施形態では、本発明による抗体は、細菌凝集を媒介する能力を有する。
【0056】
別の実施形態では、本発明による抗体は、ＮＦｋＢ活性化を媒介する能力を有する。
【0057】
さらに別の実施形態では、本発明による抗体は、食作用を誘導する能力を有する。
【0058】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、二重Ｆａｂシス抗体結合により、連鎖球菌Ｍタンパク質の２つの異なるエピトープに対して同時結合を呈する能力を有する。一実施形態では、抗体は、ａ）ＢリピートおよびＣリピート、ｂ）線状配列、またはｃ）３次元構造である、連鎖球菌Ｍタンパク質の２つの異なるエピトープを有する。
【0059】
「二重Ｆａｂシス抗体結合」という用語は、本明細書で使用される場合、１つの結合部位のみが標的分子の２つの個別の結合部位に結合する抗体による結合を意味することが意図されている。したがって、二重Ｆａｂシス抗体結合は、各々が標的分子の２つの部位の１つに結合する２つの独立した可変部位を含む既知の二重特異性抗体による結合とは異なる。Ａｂ２５は、分子内シス結合様式で２つの個別の非同一エピトープに二重Ｆａｂシス結合することが可能である。
【0060】
Ａｂ２５が呈する別々のエピトープに対する二重Ｆａｂシス結合の要件は、抗体に見出されるすでに驚くべき多様性に加えて、予想外の機能的抗体相互作用の様式である（Ｋａｎｙａｖｕｚら、２０１９年）。二重Ｆａｂシス結合に関連する現象は、抗ＨＩＶ ２Ｇ１２抗体の場合であり（Ｔｒｋｏｌａら、１９９６年）、この抗体は、Ｆａｂ二量体化をもたらす突然変異をそのヒンジ領域に有する（Ｇａｃｈら、２０１０年）。２Ｇ１２の２つのＦａｂは高マンノース糖に結合するが、それらの非正統的な二量体化という事実のため、本質的に１つの大きなＦａｂとして挙動する（Ｃａｌａｒｅｓｅら、２００５年）。実際、複数の抗ＨＩＶグリカン抗体間の通常の単一Ｆａｂに基づく相互作用は、２Ｇ１２と同様の生物学的結果をもたらした（総説は、Ｋｏｎｇら、２０１４年を参照）。これは、２Ｇ１２が非正統的な構造を有する一方で、その機能は、特定のエピトープと相関しており、個別様式の相互作用によるものではないことを示す。非正統的抗体の状況では、機能を向上させるために、二重特異性抗体（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＢｒｉｎｋｍａｎｎ、２０１５年）または抗原クラスピング抗体（ａｎｔｉｇｅｎ ｃｌａｓｐｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｈａｔｔｏｒｉら、２０１６年）が遺伝子操作されており、本発明は、進化が同様の結果をもたらしたことを示す。本発明は、機能的抗体をスクリーニングする際に、ＦａｂではなくＦ（ａｂ’）２断片を使用することに関するこれまで知られていない付加価値を明らかにする。
【0061】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0062】
一実施形態では、医薬組成物は、本発明により規定される２つまたはそれよりも多くの異なる抗体を含む。
【0063】
本明細書に開示される本発明の抗体および抗体組成物は、個体の細菌感染症またはウイルス感染症と闘うために使用することができる。特に、抗体は、Ａ群連鎖球菌による感染症を治療するために使用することができる。
【0064】
静脈内投与または皮下投与などの非経口投与のための医薬組成物は、投与のためには、液体製剤であってもよくまたは固体製剤であってもよい。再構成用の固形製剤は、注射または輸注により送達することができる。そのような製剤は、典型的には無菌製品である。
【0065】
治療方法は、単回投与または一定期間にわたる複数回投与で構成されていてもよい。
【0066】
特定の治療および治療しようとする個体ならびに投与経路に応じて、組成物は、様々な用量および／または頻度で投与することができる。
【0067】
医薬組成物は、製造および保管条件下で安定でなければならない。したがって、必要に応じて、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保存されるべきである。溶液などの液体製剤の場合、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、緩衝剤、等張化剤、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒であってもよい。
【0068】
本発明の治療方法で使用するための組成物は、担体、溶媒、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定剤、界面活性剤、可溶化剤、保存剤などの少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む。
【0069】
特に上記で言及した成分に加えて、本発明の製剤は、懸案の製剤のタイプに関して当技術分野で慣用されている他の作用剤を含んでいてもよいことが理解されるべきである。当業者であれば、好適な製剤をどのように選択し、それをどのように調製するかを知っているだろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１８版またはそれ以降を参照）。また、当業者であれば、好適な投与経路および投薬量を選択する方法を知っているだろう。
【0070】
さらなる態様では、本発明は、Ａ群連鎖球菌などの連鎖球菌感染症を治療するための本発明の抗体の使用を提供する。
【0071】
一実施形態では、本発明による抗体の使用は、敗血症の治療のためである。
【0072】
さらなる実施形態では、抗体の使用は、静脈内、皮下、または筋肉内などの非経口投与を含む。
【0073】
一実施形態では、この使用は、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）との組合せである。別の実施形態では、本発明の医薬組成物の使用は、敗血症の治療のためである。さらなる実施形態では、抗体のこの使用は、静脈内、皮下、または筋肉内投与を含む。
【0074】
さらなる態様では、本発明は、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、および免疫蛍光から選択される応用における、本発明の抗体の使用を提供する。
【0075】
さらなる態様では、本発明は、二重Ｆａｂシス抗体結合により分子の２つの異なるエピトープに対して結合を呈する抗体を提供する。一実施形態では、分子の２つの異なるエピトープは、タンパク質または炭水化物の２つの異なるエピトープである。一実施形態では、分子はタンパク質である。別の実施形態では、タンパク質の２つの異なるエピトープは、連鎖球菌Ｍタンパク質の２つの異なるエピトープである。
【0076】
さらなる態様では、本発明は、二重Ｆａｂシス抗体結合により分子の２つの異なるエピトープに対して同時結合を呈する抗体を得るための方法であって、
－ 免疫応答などが生じるように分子に曝露されたドナーから抗体を得る工程、
－ 抗体を酵素反応により抗体から単一Ｆａｂ断片に切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ インタクト抗体の結合と、Ｆ（ａｂ’）２－断片および単一Ｆａｂ断片の結合とを測定および比較する工程、
－ 抗体結合と比較して、単一Ｆａｂ結合の有意な低減を確認する工程
を含み、
それにより抗体を特定および提供する方法を提供する。
－ 免疫応答などが生じるように分子に曝露されたドナーから抗体を得る工程、
－ 抗体を酵素反応により抗体から単一Ｆａｂ断片に切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ インタクト抗体の結合と、Ｆ（ａｂ’）２－断片および単一Ｆａｂ断片の結合とを測定および比較する工程、
－ 抗体結合と比較して、単一Ｆａｂ結合の有意な低減を確認する工程
を含み、
それにより抗体を特定および提供する方法を提供する。
【0077】
この方法の一実施形態では、タンパク質の２つの異なるエピトープは、連鎖球菌Ｍタンパク質の２つの異なるエピトープである。
【0078】
さらなる態様では、本発明は、分子に結合した抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を架橋するための方法であって、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を単離する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片および分子を溶液中で接触させる工程
－ 溶液にスベリン酸ジサクシンイミジルを添加し、反応の進行を可能にする工程、
－ 架橋反応をクエンチする工程
を含み、
それにより、架橋抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を得る、方法を提供する。
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を単離する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片および分子を溶液中で接触させる工程
－ 溶液にスベリン酸ジサクシンイミジルを添加し、反応の進行を可能にする工程、
－ 架橋反応をクエンチする工程
を含み、
それにより、架橋抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を得る、方法を提供する。
【0079】
この方法の一実施形態では、分子は、連鎖球菌Ｍタンパク質などのタンパク質である。
【0080】
非限定的な実施形態の以下のリストは、本発明をさらに説明する。
１． 連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する抗体であって、
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡもしくはＶであり、Ａ３はＲもしくはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、もしくはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、もしくは不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、もしくは不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、もしくは不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、もしくはＴであり、Ａ９はＲもしくはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、もしくはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、もしくはＷであり、Ａ１２はＲもしくは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、もしくはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、もしくはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤもしくはＥであり、Ａ１７はＹもしくはＩであり、Ａ１８はＷであるか、または配列Ａ１～Ａ１８はそれに６つ以下の保存的置換を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹもしくはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、もしくはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、もしくはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、もしくはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、もしくはＰであり、Ｂ８はＩもしくは不在であり、Ｂ９はＦもしくは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、もしくはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶであるか、または配列Ｂ１～Ｂ１７は、それに６つ以下の保存的置換を含む、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む抗体。
１． 連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する抗体であって、
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡもしくはＶであり、Ａ３はＲもしくはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、もしくはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、もしくは不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、もしくは不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、もしくは不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、もしくはＴであり、Ａ９はＲもしくはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、もしくはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、もしくはＷであり、Ａ１２はＲもしくは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、もしくはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、もしくはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤもしくはＥであり、Ａ１７はＹもしくはＩであり、Ａ１８はＷであるか、または配列Ａ１～Ａ１８はそれに６つ以下の保存的置換を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹもしくはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、もしくはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、もしくはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、もしくはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、もしくはＰであり、Ｂ８はＩもしくは不在であり、Ｂ９はＦもしくは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、もしくはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶであるか、または配列Ｂ１～Ｂ１７は、それに６つ以下の保存的置換を含む、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む抗体。
【0081】
２． 配列Ａ１～Ａ１８は、３つ以下の保存的置換を含む、実施形態１に記載の抗体。
【0082】
３． 配列Ｂ１～Ｂ１８は、３つ以下の保存的置換を含む、実施形態１に記載の抗体。
【0083】
４． 配列Ａ１～Ａ１８は、１つ以下の保存的置換を含む、実施形態１に記載の抗体。
【0084】
５． 配列Ｂ１～Ｂ１８は、１つ以下の保存的置換を含む、実施形態１に記載の抗体。
【0085】
６．
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡまたはＶであり、Ａ３はＲまたはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、または不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、または不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、または不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、またはＴであり、Ａ９はＲまたはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、またはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、またはＷであり、Ａ１２はＲまたは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、またはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、またはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤまたはＥであり、Ａ１７はＹまたはＩであり、Ａ１８はＷである、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹまたはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、またはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、またはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、またはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、またはＰであり、Ｂ８はＩまたは不在であり、Ｂ９はＦまたは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、またはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶである、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
配列Ａ１～Ａ１８を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループであり、
Ａ１はＣであり、Ａ２はＡまたはＶであり、Ａ３はＲまたはＫであり、Ａ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＤであり、Ａ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、または不在であり、Ａ６は、Ｐ、Ｆ、または不在であり、Ａ７は、Ｈ、Ｒ、Ｄ、または不在であり、Ａ８は、Ｋ、Ｓ、またはＴであり、Ａ９はＲまたはＧであり、Ａ１０は、Ｗ、Ｇ、またはＦであり、Ａ１１は、Ｌ、Ｙ、Ｅ、またはＷであり、Ａ１２はＲまたは不在であり、Ａ１３は、Ｐ、Ｆ、Ｄ、またはＧであり、Ａ１４は、Ｐ、Ｆ、Ａ、またはＩであり、Ａ１５はＦであり、Ａ１６はＤまたはＥであり、Ａ１７はＹまたはＩであり、Ａ１８はＷである、相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３ループ、および
配列Ｂ１～Ｂ１７を含むＣＤＲ Ｌ３ループであり、
Ｂ１はＱであり、Ｂ２はＹまたはＲであり、Ｂ３は、Ｎ、Ｄ、またはＳであり、Ｂ４は、Ｓ、Ｎ、またはＧであり、Ｂ５は、Ｙ、Ｌ、またはＷであり、Ｂ６はＰであり、Ｂ７は、Ｖ、Ｌ、Ｓ、またはＰであり、Ｂ８はＩまたは不在であり、Ｂ９はＦまたは不在であり、Ｂ１０はＴであり、Ｂ１１はＦであり、Ｂ１２はＧであり、Ｂ１３は、Ｑ、Ｇ、またはＰであり、Ｂ１４はＧであり、Ｂ１５はＴであり、Ｂ１６はＫであり、Ｂ１７はＶである、ＣＤＲ Ｌ３ループ
を含む、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0086】
７． ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０との結合により決定して５０×１０－９Ｍ－１未満のＫＤで連鎖球菌Ｍタンパク質に結合する、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0087】
８． ＫＤは１５×１０－９Ｍ－１未満である、実施形態７に記載の抗体。
【0088】
９． ＫＤは５×１０－９Ｍ－１未満である、実施形態７に記載の抗体。
【0089】
１０． ＫＤは１×１０－９Ｍ－１未満である、実施形態７に記載の抗体。
【0090】
１１． ＣＤＲ Ｈ３ループは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0091】
１２． ＣＤＲ Ｌ３ループは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0092】
１３． Ｈ３鎖は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２と比べて２０個未満の保存的アミノ酸置換を有する任意のバリアント配列から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0093】
１４． Ｌ３鎖は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６と比べて２０個未満の保存的アミノ酸置換を有する任意のバリアント配列から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0094】
１５． バリアント配列は、１０個未満の保存的アミノ酸置換を有する、実施形態１３または１４に記載の抗体。
【0095】
１６． バリアント配列は、５つ未満の保存的アミノ酸置換を有する、実施形態１３または１４に記載の抗体。
【0096】
１７． バリアント配列は、２つ未満の保存的アミノ酸置換を有する、実施形態１３または１４に記載の抗体。
【0097】
１８． Ｈ３鎖は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0098】
１９． Ｌ３鎖は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0099】
２０．
－ 重鎖としての配列番号１７および軽鎖としての配列番号２１を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１８および軽鎖としての配列番号２２を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１９および軽鎖としての配列番号２３を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号２０および軽鎖としての配列番号２４を含む抗体、ならびに
－ 上記抗体のいずれかのバリアントであり、バリアントは、好ましくは、重鎖および／または軽鎖の各々に多くとも１、２、５、または１０個のアミノ酸改変、より好ましくは、上記配列に保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有する、抗体
からなる群から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
－ 重鎖としての配列番号１７および軽鎖としての配列番号２１を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１８および軽鎖としての配列番号２２を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１９および軽鎖としての配列番号２３を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号２０および軽鎖としての配列番号２４を含む抗体、ならびに
－ 上記抗体のいずれかのバリアントであり、バリアントは、好ましくは、重鎖および／または軽鎖の各々に多くとも１、２、５、または１０個のアミノ酸改変、より好ましくは、上記配列に保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有する、抗体
からなる群から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0100】
２１．
－ 重鎖としての配列番号１７および軽鎖としての配列番号２１を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１８および軽鎖としての配列番号２２を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１９および軽鎖としての配列番号２３を含む抗体、ならびに
－ 重鎖としての配列番号２０および軽鎖としての配列番号２４を含む抗体
からなる群から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
－ 重鎖としての配列番号１７および軽鎖としての配列番号２１を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１８および軽鎖としての配列番号２２を含む抗体、
－ 重鎖としての配列番号１９および軽鎖としての配列番号２３を含む抗体、ならびに
－ 重鎖としての配列番号２０および軽鎖としての配列番号２４を含む抗体
からなる群から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0101】
２２．
－ 配列番号１７および配列番号２１の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、
－ 配列番号１８および配列番号２２の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、
配列番号１９および配列番号２３の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、ならびに
配列番号２０および配列番号２４の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体
からなる群から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
－ 配列番号１７および配列番号２１の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、
－ 配列番号１８および配列番号２２の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、
配列番号１９および配列番号２３の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体、ならびに
配列番号２０および配列番号２４の６つのＣＤＲのすべてを含む抗体
からなる群から選択される、上記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0102】
２３． 細菌凝集を媒介する能力を有する、前記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0103】
２４． ＮＦｋＢ活性化を媒介する能力を有する、前記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0104】
２５． 食作用を誘導する能力を有する、前記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0105】
２６． 二重Ｆａｂシス抗体結合により連鎖球菌Ｍタンパク質の２つの異なるエピトープに対して同時結合を呈する能力を有する、前記実施形態のいずれかに記載の抗体。
【0106】
２７． 連鎖球菌Ｍタンパク質の２つの異なるエピトープは、ａ）ＢリピートおよびＣリピート、ｂ）線状配列、またはｃ）３次元構造である、実施形態２６に記載の抗体。
【0107】
２８． 実施形態１～２７のいずれかに規定の抗体および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【0108】
２９． 実施形態１～２６のいずれかに規定の２つまたはそれよりも多くの異なる抗体を含む、実施形態２８に記載の医薬組成物。
【0109】
３０． Ａ群連鎖球菌などの連鎖球菌感染症を治療するための、実施形態１～２７のいずれかに記載の抗体の使用。
【0110】
３１． 敗血症を治療するための、実施形態１～２７のいずれかに記載の抗体の使用。
【0111】
３２． 抗体は、静脈内、皮下、または筋肉内など、非経口投与される、実施形態３０または３１に記載の使用。
【0112】
３３． 静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）との組合せである、実施形態３０～３２のいずれかに記載の使用。
【0113】
３４． 敗血症を治療するための、実施形態２８または２９に規定の医薬組成物の使用。
【0114】
３５． 抗体は、静脈内、皮下、または筋肉内など、非経口投与される、実施形態３０～３４のいずれかに記載の使用。
【0115】
３６． ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、および免疫蛍光から選択される応用における、実施形態１～２７のいずれかに記載の抗体の使用。
【0116】
３７． 二重Ｆａｂシス抗体結合により分子の２つの異なるエピトープに対して結合を呈する抗体。
【0117】
３８． 分子の２つの異なるエピトープは、連鎖球菌Ｍタンパク質などのタンパク質の２つの異なるエピトープである、実施形態３７に記載の抗体。
【0118】
３９． 二重Ｆａｂシス抗体結合により分子の２つの異なるエピトープに対して同時結合を呈する抗体を得るための方法であって、
－ 免疫応答などが生じるように分子に曝露されたドナーから抗体を得る工程、
－ 抗体を酵素反応により抗体から単一Ｆａｂ断片に切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ インタクト抗体の結合と、Ｆ（ａｂ’）２－断片および単一Ｆａｂ断片の結合とを測定および比較する工程、
－ 抗体結合と比較して、単一Ｆａｂ結合の有意な低減を確認する工程
を含み、
それにより抗体を特定および提供する、方法。
－ 免疫応答などが生じるように分子に曝露されたドナーから抗体を得る工程、
－ 抗体を酵素反応により抗体から単一Ｆａｂ断片に切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ インタクト抗体の結合と、Ｆ（ａｂ’）２－断片および単一Ｆａｂ断片の結合とを測定および比較する工程、
－ 抗体結合と比較して、単一Ｆａｂ結合の有意な低減を確認する工程
を含み、
それにより抗体を特定および提供する、方法。
【0119】
４０． 分子の２つの異なるエピトープは、連鎖球菌Ｍタンパク質などのタンパク質の２つの異なるエピトープである、実施形態３９に記載の方法。
【0120】
４１． 分子に結合した抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を架橋するための方法であって
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を単離する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片および分子を溶液中で接触させる工程
－ 溶液にスベリン酸ジサクシンイミジルを添加し、反応の進行を可能にする工程、
－ 架橋反応をクエンチする工程
を含み、
それにより、架橋抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を得る、方法。
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を酵素反応により抗体から切断する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を単離する工程、
－ 抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片および分子を溶液中で接触させる工程
－ 溶液にスベリン酸ジサクシンイミジルを添加し、反応の進行を可能にする工程、
－ 架橋反応をクエンチする工程
を含み、
それにより、架橋抗体Ｆ（ａｂ’）２－断片を得る、方法。
【0121】
４２． 分子は、連鎖球菌Ｍタンパク質などのタンパク質である、実施形態４１に記載の方法。
【0122】
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【実施例】
【0123】
基本方法／物質
ＳＴＡＲ法
ＳＴＡＲ法
【0124】
【表4-1】
【0125】
【表4-2】
【0126】
単一Ｂ細胞の精製、ベイティング（ｂａｉｔｉｎｇ）、および分離
Ｂ細胞単離を、幾つかの変更を加えて以前に記載のように（Ｓｍｉｔｈら ２００９年）実施した。簡単に説明すると、Ａ群連鎖球菌感染症から最近回復し、感染後（自己免疫性）後遺症のない若年女性から３５ｍｌの血液を採取した（クエン酸塩採血管に）。血液を、２．５μｌ／ｍｌのＲｏｓｅｔｔｅｓｅｐ Ｂ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２０分間室温にて処理した。次いで、血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ勾配上に層状に配置した。遠心分離後（８００×ｇで３０分間）、血漿を収集および凍結し、Ｂ細胞層（約７ｍｌ）を除去し、４３ｍｌのＰＢＳで希釈し、再び遠心分離した。この洗浄工程を２回繰り返した。Ｂ細胞を計数し、染色のために室温で維持した（典型的な収量は、血液３０～４０ｍｌ当たり２～５百万個の細胞である）。
Ｂ細胞単離を、幾つかの変更を加えて以前に記載のように（Ｓｍｉｔｈら ２００９年）実施した。簡単に説明すると、Ａ群連鎖球菌感染症から最近回復し、感染後（自己免疫性）後遺症のない若年女性から３５ｍｌの血液を採取した（クエン酸塩採血管に）。血液を、２．５μｌ／ｍｌのＲｏｓｅｔｔｅｓｅｐ Ｂ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２０分間室温にて処理した。次いで、血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ勾配上に層状に配置した。遠心分離後（８００×ｇで３０分間）、血漿を収集および凍結し、Ｂ細胞層（約７ｍｌ）を除去し、４３ｍｌのＰＢＳで希釈し、再び遠心分離した。この洗浄工程を２回繰り返した。Ｂ細胞を計数し、染色のために室温で維持した（典型的な収量は、血液３０～４０ｍｌ当たり２～５百万個の細胞である）。
【0127】
Ｂ細胞染色、ベイティング、および選別
Ｂ細胞をＰＢＳで最終容量５００μｌに濃縮した。次いで、細胞を５％ＢＳＡで２０分間ブロッキングした後、ＣＤ１９－ＰＥ（ＢＤ－５５５４１３）、ＣＤ３－ＢＶ５１０（ＢＤ－５６４７１３）、およびＩｇＧ－ＢＶ４２１（ＢＤ－５６２５８１）に対する抗体で染色した。また、Ｂ細胞を、Ｓｙｔｏｘ－ＦＩＴＣ生／死染色（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ－Ｓ３４８６０）で標識した。ＭＣ２５ Ａ群連鎖球菌Ｍ１株から単離された可溶性Ｍ１タンパク質を使用して、Ｂ細胞のベイティングを行った。Ｍ１タンパク質単離手順は、以前に他所に記載されていた（ＣｏｌｌｉｎおよびＯｌｓｅｎ ２０００年）。マイクロスケール標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｍ１タンパク質をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７に直接コンジュゲートした。抗体および生／死染色剤に加えて、０．１μｇ／ｍｌのＡＦ６９４－Ｍ１を細胞に添加し、混合物を３２℃で２０分間インキュベートした（Ｍ１は、４℃で立体構造変化を起こし、それにより重要なエピトープが不明確になる可能性がある（Ｃｅｄｅｒｖａｌｌら １９９５年））。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、さらなる分析まで氷上で維持した。ＦＡＣＳＡｒｉａＦｕｓｉｏｎ選別装置での選別のためのゲート制御は、未染色細胞およびＦＭＯ－１試料を使用して設定した。合計１００個の細胞を、２５０万個のＢ細胞から９６ウェルプレート内のＲＮａｓｅ阻害剤を含む１０μｌの水へと直接的に選別し、直ちに－８０℃冷凍庫に移した。この時点で細胞は浸透圧により溶解し、ＲＮＡは溶液中で安定化される。
Ｂ細胞をＰＢＳで最終容量５００μｌに濃縮した。次いで、細胞を５％ＢＳＡで２０分間ブロッキングした後、ＣＤ１９－ＰＥ（ＢＤ－５５５４１３）、ＣＤ３－ＢＶ５１０（ＢＤ－５６４７１３）、およびＩｇＧ－ＢＶ４２１（ＢＤ－５６２５８１）に対する抗体で染色した。また、Ｂ細胞を、Ｓｙｔｏｘ－ＦＩＴＣ生／死染色（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ－Ｓ３４８６０）で標識した。ＭＣ２５ Ａ群連鎖球菌Ｍ１株から単離された可溶性Ｍ１タンパク質を使用して、Ｂ細胞のベイティングを行った。Ｍ１タンパク質単離手順は、以前に他所に記載されていた（ＣｏｌｌｉｎおよびＯｌｓｅｎ ２０００年）。マイクロスケール標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｍ１タンパク質をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７に直接コンジュゲートした。抗体および生／死染色剤に加えて、０．１μｇ／ｍｌのＡＦ６９４－Ｍ１を細胞に添加し、混合物を３２℃で２０分間インキュベートした（Ｍ１は、４℃で立体構造変化を起こし、それにより重要なエピトープが不明確になる可能性がある（Ｃｅｄｅｒｖａｌｌら １９９５年））。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、さらなる分析まで氷上で維持した。ＦＡＣＳＡｒｉａＦｕｓｉｏｎ選別装置での選別のためのゲート制御は、未染色細胞およびＦＭＯ－１試料を使用して設定した。合計１００個の細胞を、２５０万個のＢ細胞から９６ウェルプレート内のＲＮａｓｅ阻害剤を含む１０μｌの水へと直接的に選別し、直ちに－８０℃冷凍庫に移した。この時点で細胞は浸透圧により溶解し、ＲＮＡは溶液中で安定化される。
【0128】
逆転写、ファミリー特定、およびクローニング
以前に凍結したプレートの細胞を氷上で解凍し、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコールを変更せずに使用して、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ工程で使用したプライマー配列は、Ｓｍｉｔｈら（２００９年）の論文のものを変更なしで直接採用した。ＲＴ－ＰＣＲ後、ネステッドＰＣＲを実施し、重鎖および軽鎖の可変領域に対応するバンドを配列決定して、抗体ファミリーを特定した。ファミリー特異的クローニングプライマーを使用して、重鎖および軽鎖の定常領域を含むプラスミドに可変鎖をクローニングした。発現プラスミドは、Ｐａｔｒｉｃｋ Ｗｉｌｓｏｎ博士グループの厚意により寄贈されたものである。
以前に凍結したプレートの細胞を氷上で解凍し、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコールを変更せずに使用して、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ工程で使用したプライマー配列は、Ｓｍｉｔｈら（２００９年）の論文のものを変更なしで直接採用した。ＲＴ－ＰＣＲ後、ネステッドＰＣＲを実施し、重鎖および軽鎖の可変領域に対応するバンドを配列決定して、抗体ファミリーを特定した。ファミリー特異的クローニングプライマーを使用して、重鎖および軽鎖の定常領域を含むプラスミドに可変鎖をクローニングした。発現プラスミドは、Ｐａｔｒｉｃｋ Ｗｉｌｓｏｎ博士グループの厚意により寄贈されたものである。
【0129】
基本的細胞培養およびトランスフェクション
ＴＨＰ１細胞（白血病性単球）を、Ｌ－グルタミンおよび１０％ＦＢＳで補完されたＲＰＭＩ培地中で維持した。細胞を、１ｍｌ当たり５～１０×１０５細胞の細胞密度に維持した。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ細胞を、通常のＴＨＰ１細胞と同様に維持した。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌ－グルタミンおよび１０％ＦＢＳで補完されたＤＭＥＭ培地中で維持した。細胞を、１００％コンフルエントになるまで増殖させることは決してなかった。トランスフェクションの前日に、８×１０６細胞を円形１５０ｍｍ皿に播種した。このトランスフェクション形式は、最も効率的な抗体回収を可能にした。
ＴＨＰ１細胞（白血病性単球）を、Ｌ－グルタミンおよび１０％ＦＢＳで補完されたＲＰＭＩ培地中で維持した。細胞を、１ｍｌ当たり５～１０×１０５細胞の細胞密度に維持した。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ細胞を、通常のＴＨＰ１細胞と同様に維持した。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌ－グルタミンおよび１０％ＦＢＳで補完されたＤＭＥＭ培地中で維持した。細胞を、１００％コンフルエントになるまで増殖させることは決してなかった。トランスフェクションの前日に、８×１０６細胞を円形１５０ｍｍ皿に播種した。このトランスフェクション形式は、最も効率的な抗体回収を可能にした。
【0130】
トランスフェクション、発現、および精製
合計で、１００個の開始細胞から１０個の抗体構築物対を生成することに成功した。抗体対を、Ｍｉｘ’ｎ’ｇｏ大腸菌に形質転換した。形質転換体コロニーを配列決定により検証し、プラスミドをさらに増殖させ、Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｍｉｄｉｐｒｅｐキットを使用してＤＮＡを抽出した。完全成熟抗体をコードするプラスミド対を、ＰＥＩトランスフェクション法（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／）を使用してＨＥＫ２９３細胞に共トランフェクトした。簡単に説明すると、細胞を２５μＭクロロキンで５時間処理した。その後、２０μｇの重鎖および軽鎖発現プラスミドＤＮＡを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で１：３比に希釈した（５０μｇのＤＮＡの場合、１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩストックを１１４μｌ使用した）。細胞を３７℃で１８時間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地をＯｐｔｉＭＥＭと交換した。細胞をさらに７２時間インキュベートしてから、上清を収集した。カラム設定のプロテインＧビーズを使用して、上清中の抗体を精製した。次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの抗体の濃度を既知濃度のＸｏｌａｉｒ（商業的に購入されたオマリズマブ、１５０ｍｇ／ｍｌで保管）の系列希釈物と比較することにより、抗体を滴定した。
合計で、１００個の開始細胞から１０個の抗体構築物対を生成することに成功した。抗体対を、Ｍｉｘ’ｎ’ｇｏ大腸菌に形質転換した。形質転換体コロニーを配列決定により検証し、プラスミドをさらに増殖させ、Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｍｉｄｉｐｒｅｐキットを使用してＤＮＡを抽出した。完全成熟抗体をコードするプラスミド対を、ＰＥＩトランスフェクション法（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／）を使用してＨＥＫ２９３細胞に共トランフェクトした。簡単に説明すると、細胞を２５μＭクロロキンで５時間処理した。その後、２０μｇの重鎖および軽鎖発現プラスミドＤＮＡを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で１：３比に希釈した（５０μｇのＤＮＡの場合、１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩストックを１１４μｌ使用した）。細胞を３７℃で１８時間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地をＯｐｔｉＭＥＭと交換した。細胞をさらに７２時間インキュベートしてから、上清を収集した。カラム設定のプロテインＧビーズを使用して、上清中の抗体を精製した。次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの抗体の濃度を既知濃度のＸｏｌａｉｒ（商業的に購入されたオマリズマブ、１５０ｍｇ／ｍｌで保管）の系列希釈物と比較することにより、抗体を滴定した。
【0131】
細菌株、増殖、および形質転換
ストレプトコッカス・ピオゲネス株ＳＦ３７０（ｅｍｍ１血清型）およびＡＰ１（ｅｍｍ１血清型）を、Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ酵母培地（ＴＨＹ）中で３７℃にて増殖させた。細菌を寒天プレートで３週間維持してから廃棄した。本発明者らは、本発明者らのすべての実験でＳＦ３７０を使用することを選択した。その理由は、ＳＦ３７０が、複雑化要因である（その強力なＦｃ結合能力およびＭタンパク質との広範な相同性のため（Åｋｅｓｓｏｎら １９９０年））タンパク質Ｈを欠如するＭ１血清型株であるためである。実験では、一晩培養物をＴＨＹで調製し、実験当日に１：２０に希釈した。希釈後、３７℃で３時間の増殖により、細菌が対数増殖中期であることを保証した。ＧＦＰ発現株の生成のために、ＳＦ３７０およびそのΔＭ同質遺伝子対応物を、対数中期まで増殖させた後、氷冷水で洗浄した。エレクトロコンピテント細菌を、２０μｇのｐＧＦＰ１プラスミドでエレクトロポレーションし、エリスロマイシン補完ＴＨＹプレートに播種した。成功した形質転換体は、紫外光下で調査したところ蛍光性だった。細菌の熱死滅は、培養物を対数中期まで増殖させ、ＰＢＳで１回洗浄し、氷上で５分間インキュベートすることにより行った。次いで８０℃で５分間の熱ショックを細菌に与えた後、氷上で１５分間静置した。食作用アッセイでは、熱死滅細菌を、８０００×ｇで３分間遠心分離し、Ｎａ培地（５．６ｍＭグルコース、１２７ｍＭ ＮａＣｌ、１０．８ｍＭ ＫＣｌ、２．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．６ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２；ＮａＯＨでｐＨを７．３に調整）に再懸濁した。熱死滅細菌を、穏やかに３７℃にて回転させながら５μＭのＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８－Ｘサクシニミジルエステル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）で染色し、３０分間遮光した。次いで、細菌を遠心分離し、ｐＨ感受性色素ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による追加の染色工程のために炭酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．０）に再懸濁した。再懸濁では、１．５ｍｌの容量中７μｇ／ｍｌの濃度を使用し、遮光して穏やかに室温で２時間回転させた。試料をＮａ培地で１回洗浄して過剰な色素を除去し、後の使用のために４℃で保管した。
ストレプトコッカス・ピオゲネス株ＳＦ３７０（ｅｍｍ１血清型）およびＡＰ１（ｅｍｍ１血清型）を、Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ酵母培地（ＴＨＹ）中で３７℃にて増殖させた。細菌を寒天プレートで３週間維持してから廃棄した。本発明者らは、本発明者らのすべての実験でＳＦ３７０を使用することを選択した。その理由は、ＳＦ３７０が、複雑化要因である（その強力なＦｃ結合能力およびＭタンパク質との広範な相同性のため（Åｋｅｓｓｏｎら １９９０年））タンパク質Ｈを欠如するＭ１血清型株であるためである。実験では、一晩培養物をＴＨＹで調製し、実験当日に１：２０に希釈した。希釈後、３７℃で３時間の増殖により、細菌が対数増殖中期であることを保証した。ＧＦＰ発現株の生成のために、ＳＦ３７０およびそのΔＭ同質遺伝子対応物を、対数中期まで増殖させた後、氷冷水で洗浄した。エレクトロコンピテント細菌を、２０μｇのｐＧＦＰ１プラスミドでエレクトロポレーションし、エリスロマイシン補完ＴＨＹプレートに播種した。成功した形質転換体は、紫外光下で調査したところ蛍光性だった。細菌の熱死滅は、培養物を対数中期まで増殖させ、ＰＢＳで１回洗浄し、氷上で５分間インキュベートすることにより行った。次いで８０℃で５分間の熱ショックを細菌に与えた後、氷上で１５分間静置した。食作用アッセイでは、熱死滅細菌を、８０００×ｇで３分間遠心分離し、Ｎａ培地（５．６ｍＭグルコース、１２７ｍＭ ＮａＣｌ、１０．８ｍＭ ＫＣｌ、２．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．６ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２；ＮａＯＨでｐＨを７．３に調整）に再懸濁した。熱死滅細菌を、穏やかに３７℃にて回転させながら５μＭのＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８－Ｘサクシニミジルエステル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）で染色し、３０分間遮光した。次いで、細菌を遠心分離し、ｐＨ感受性色素ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による追加の染色工程のために炭酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．０）に再懸濁した。再懸濁では、１．５ｍｌの容量中７μｇ／ｍｌの濃度を使用し、遮光して穏やかに室温で２時間回転させた。試料をＮａ培地で１回洗浄して過剰な色素を除去し、後の使用のために４℃で保管した。
【0132】
抗体スクリーニングおよびフローサイトメトリー
ＥＬＩＳＡの場合、ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトフィブリノゲン（１００μｌのＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ）で一晩４℃にてコーティングした。翌日、コーティング緩衝液をＰＢＳＴで洗い流し、プレートを、ＭＣ２５培養上清から精製した１０μｇ／ｍｌのＭ１でコーティングした（ＣｏｌｌｉｎおよびＯｌｓｅｎ ２０００年）。３７℃で１時間インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、３００μｌのＰＢＳＴ中２％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした。ブロッキング後、３００μｌの抗体含有上清をウェルに添加したか、または希釈ドナー血漿を対照として添加した。試料を３７℃で１時間インキュベートし、洗浄し、プロテインＧ－ＨＲＰの溶液（１：３０００希釈）をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、試料を洗浄し、１００μｌの展開試薬（２０ｍｌの基質緩衝液クエン酸Ｎａ ｐＨ４．５＋１ｍｌのＡＢＴＳ過酸化物基質＋０．４ｍｌのＨ２Ｏ２）で展開した。室温で５～３０分間発色させた後、ＯＤ４５０の吸光度を読み取った。
ＥＬＩＳＡの場合、ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトフィブリノゲン（１００μｌのＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ）で一晩４℃にてコーティングした。翌日、コーティング緩衝液をＰＢＳＴで洗い流し、プレートを、ＭＣ２５培養上清から精製した１０μｇ／ｍｌのＭ１でコーティングした（ＣｏｌｌｉｎおよびＯｌｓｅｎ ２０００年）。３７℃で１時間インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、３００μｌのＰＢＳＴ中２％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした。ブロッキング後、３００μｌの抗体含有上清をウェルに添加したか、または希釈ドナー血漿を対照として添加した。試料を３７℃で１時間インキュベートし、洗浄し、プロテインＧ－ＨＲＰの溶液（１：３０００希釈）をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、試料を洗浄し、１００μｌの展開試薬（２０ｍｌの基質緩衝液クエン酸Ｎａ ｐＨ４．５＋１ｍｌのＡＢＴＳ過酸化物基質＋０．４ｍｌのＨ２Ｏ２）で展開した。室温で５～３０分間発色させた後、ＯＤ４５０の吸光度を読み取った。
【0133】
より短いＭ１ Ｂ１Ｂ２Ｂ３およびＣ１Ｃ２Ｃ３構築物を使用したＥＬＩＳＡの場合、Ｍ１タンパク質のＢ１Ｂ２Ｂ３リピート（ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ：Ｑ９９ＸＶ０、ｅｍｍ１；アミノ酸１３２～１９４）およびＣ１Ｃ２Ｃ３リピート（アミノ酸２２９～３４８）をコードするオープンリーディングフレームを、ルンドタンパク質産生プラットフォーム（Ｌｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ）（ＬＰ３）（ルンド、スウェーデン）にクローニングした。コード配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州、米国）に合成構築物として注文し、タンデム親和性精製タグ（ヒスチジン－ヘマグルチニン－ＳｔｒｅｐＩＩ－タバコエッチウイルスプロテアーゼ認識部位）を構築物のＣ末端に組み込んだｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４ベースベクターにクローニングした。構築物は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで補完されたＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉブロス（Ｄｉｆｃｏ）中の大腸菌ＴＵＮＥＲ（ＤＥ３）細胞で２５℃にて発現させた。タンパク質発現のため、温度を１８℃に低下させ、０．６のＯＤ６００時に０．１ｍＭ ＩＰＴＧで発現を誘導した。発現細胞を回収し、無ＥＤＴＡ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ錠剤（Ｒｏｃｈｅ）で補完されたリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に再懸濁した。フレンチプレスセルを使用して１８，０００ｐｓｉで細胞を溶解した。ライセートを超遠心分離（Ｔｉ５０．２ローター、２４４，０００×ｇ、６０分、４℃）で清澄化し、その後０．４５μｍフィルターに通してから、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。カラムを２０カラム容量（ＣＶ）のリン酸緩衝液で洗浄し、リン酸緩衝液中０～５００ｍＭイミダゾールの勾配を使用して、結合タンパク質を溶出した。所望のタンパク質を含む画分をプールし、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸緩衝液、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）ｐＨ７．３に対して透析し、－８０℃で保管した。その後、こうした構築物を、ＥＬＩＳＡウェルのコーティングまたはＭ抗体の競合として使用した。
【0134】
フローサイトメトリースクリーニングの場合、ＳＦ３７０－ＧＦＰ細菌またはそのΔＭ対応物の一晩培養物をＴＨＹで１：２０希釈し、対数中期まで増殖させた。１００μｌの細菌を、９６ウェルプレートのウェルに分配した。細胞培養上清から精製した抗体を５μｇ／ｍｌに希釈し、１μｇ／ｍｌのＩｄｅＳで３時間、３７℃にて消化した。消化した抗体を、細菌懸濁物でさらに１：１０希釈した。０．５μｇ／ｍｌの最終濃度に到達させた。細菌を３７℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＡＦ６４７コンジュゲートＦａｂ α－Ｆａｂ抗体断片を二次抗体として使用して、一次α－Ｍ抗体の結合を検出した。Ｆａｂ α－Ｆａｂ断片と３０分間インキュベーションした後、細菌を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。ＧＦＰ発現細菌のゲート制御は、ＳＦ３７０親株（ＧＦＰプラスミドを発現しない）を使用して設定した。ＧＦＰ発現ゲート内のＧＦＰ発現細菌を、抗体染色について評価した（ＡＰＣチャネル）。抗体染色は、表面結合一次－二次抗体複合体の存在を反映し、抗Ｍ抗体の結合を示す。
【0135】
ウェスタンブロッティングの場合、ウェスタンブロッティングを使用してＳＦ３７０およびそのΔＭ突然変異体のライセートをプローブすることにより、線状エピトープに対する抗体反応性を評価した。簡単に説明すると、対数増殖細菌のペレットを、ライセートが透明性になるまで、ホスホリパーゼＣと共に３０分間ＰＢＳ中でインキュベートした。ライセートを超音波処理し、遠心分離（１５，０００×ｇで３分間）により清澄化した。本発明者らは、ＳＦ３７０対ΔＭ突然変異タンパク質の５つの複製セットを４０μｇで勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～２０％）に負荷した。ゲル電気泳動を６０分間流して、タンパク質分離を達成した。タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜へと移し、それをＰＢＳＴ中５％スキムミルクで４５分間ブロッキングした。次いで、膜の複製レーンを切断し、２または１０μｇ／ｍｌのＸｏｌａｉｒ、Ａｂ２５、３２、４９、またはＩＶＩｇＧで一晩４℃にてプローブした。膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、二次ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）抗体で１時間室温にてプローブした。後に二次抗体を洗浄し、化学発光試薬（ＷｅｓｔＦｅｍｔｏ基質、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して膜を発色させた。
【0136】
凝集アッセイ
凝集アッセイの場合
ＳＦ３７０およびそのΔＭ株の一晩培養物を、ＲＰＭＩで１：５希釈し、１００μｇ／ｍｌの抗Ｍ抗体または５％ドナー血漿で処理した。この一連の実験では、細菌をキュベットでインキュベートし、培養中は振盪もボルテックスもしないことが重要である。表示の時点で細菌のＯＤ６００を測定し、３．５時間の標記時点でキュベットの写真を撮影した。
凝集アッセイの場合
ＳＦ３７０およびそのΔＭ株の一晩培養物を、ＲＰＭＩで１：５希釈し、１００μｇ／ｍｌの抗Ｍ抗体または５％ドナー血漿で処理した。この一連の実験では、細菌をキュベットでインキュベートし、培養中は振盪もボルテックスもしないことが重要である。表示の時点で細菌のＯＤ６００を測定し、３．５時間の標記時点でキュベットの写真を撮影した。
【0137】
凝集体溶解実験の場合
ＳＦ３７０細菌を一晩増殖させ、ＴＨＹで１：２０希釈し、静置して２時間増殖させた。次いで、細菌を、１００μｇ／ｍｌの適切な抗体で補完した。接種の２時間後、細菌をボルテックスし、画像化し（無作為に）、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して凝集面積を分析した。
ＳＦ３７０細菌を一晩増殖させ、ＴＨＹで１：２０希釈し、静置して２時間増殖させた。次いで、細菌を、１００μｇ／ｍｌの適切な抗体で補完した。接種の２時間後、細菌をボルテックスし、画像化し（無作為に）、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して凝集面積を分析した。
【0138】
ＳＩＭ画像化
対数期細菌を０．５分間超音波処理して（ＶｉａｌＴｗｅｅｔｅｒ；Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）一切の凝集体を分離し、４％パラホルムアルデヒドで固定して氷上で５分間インキュベートした。その後、細菌をＰＢＳで２回洗浄した（１０，０００×ｇで３分間）。ＳＦ３７０を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲート小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）で染色した。細菌を、ＩｄｅＳで切断したＸｏｌａｉｒ、Ａｂ２５、Ａｂ３２、およびＡｂ４９と共にインキュベートし、蛍光標識ＩｇＧＦａｂまたはＩｇＧＦｃ特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（ＤｙＬｉｇｈｔ４８８コンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃまたはＩｇＧＦａｂ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で染色した。Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔを使用して１．５番のカバーガラスで、試料をガラススライドにマウントした。ＬＵ－ＮＶレーザーユニット、ＣＦＩ ＳＲ ＨＰアポクロマートＴＩＲＦ １００×オイル対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．４９）および追加の１．５×倍率を有するＮ－ＳＩＭ顕微鏡を使用して、単一細菌の画像を取得した。使用したカメラは、ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ ｓＣＭＯＳカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．）だった。画像は、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｒ（ＮＩＳ－Ａ ６ＤおよびＮ－ＳＩＭ分析）のＮｉｋｏｎ社製ＳＩＭソフトウェアで再構築した。細菌の画像は、４８８および６４０ｎｍレーザーで取得した。部位局在化のために、単一細菌を手動で特定し、５０フレームで時系列的に画像化した。部位局在化の分析パイプラインは、Ｊｕｌｉａに実装されていた。それは、ＧｉｔＨｕｂで利用可能である（Ｋｕｍｒａ Ａｈｎｌｉｄｅらの原稿 ２０２０年）。初期信号対雑音比（ＳＮＲ）のカットオフを０．３に設定し、含まれる時間フレームは、初期ＳＮＲの少なくとも７０％を有するものだった。
対数期細菌を０．５分間超音波処理して（ＶｉａｌＴｗｅｅｔｅｒ；Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）一切の凝集体を分離し、４％パラホルムアルデヒドで固定して氷上で５分間インキュベートした。その後、細菌をＰＢＳで２回洗浄した（１０，０００×ｇで３分間）。ＳＦ３７０を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲート小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）で染色した。細菌を、ＩｄｅＳで切断したＸｏｌａｉｒ、Ａｂ２５、Ａｂ３２、およびＡｂ４９と共にインキュベートし、蛍光標識ＩｇＧＦａｂまたはＩｇＧＦｃ特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（ＤｙＬｉｇｈｔ４８８コンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃまたはＩｇＧＦａｂ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で染色した。Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔを使用して１．５番のカバーガラスで、試料をガラススライドにマウントした。ＬＵ－ＮＶレーザーユニット、ＣＦＩ ＳＲ ＨＰアポクロマートＴＩＲＦ １００×オイル対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．４９）および追加の１．５×倍率を有するＮ－ＳＩＭ顕微鏡を使用して、単一細菌の画像を取得した。使用したカメラは、ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ ｓＣＭＯＳカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．）だった。画像は、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｒ（ＮＩＳ－Ａ ６ＤおよびＮ－ＳＩＭ分析）のＮｉｋｏｎ社製ＳＩＭソフトウェアで再構築した。細菌の画像は、４８８および６４０ｎｍレーザーで取得した。部位局在化のために、単一細菌を手動で特定し、５０フレームで時系列的に画像化した。部位局在化の分析パイプラインは、Ｊｕｌｉａに実装されていた。それは、ＧｉｔＨｕｂで利用可能である（Ｋｕｍｒａ Ａｈｎｌｉｄｅらの原稿 ２０２０年）。初期信号対雑音比（ＳＮＲ）のカットオフを０．３に設定し、含まれる時間フレームは、初期ＳＮＲの少なくとも７０％を有するものだった。
【0139】
結合曲線
ＳＦ３７０細菌を対数中期まで増殖させ、洗浄し、１０ｍｌの培養物を１０００μｌのＰＢＳに濃縮した。細菌を、抗Ｍ抗体の半減系列希釈物で染色した。ＩｄｅＳ処理抗体１００μｌ毎に３０μｌの細菌を使用した。４℃で３０分間（振盪しながら）染色を実施した後、細菌を洗浄し、３０μｌの容量の過剰ＡＦ６４７コンジュゲートＦａｂ抗Ｆａｂ断片で３０分間４℃にて振盪しながら染色した。次いで、細菌をＰＢＳで２５０μｌに希釈し、フローサイトメトリーで分析した。解離定数を未知変数とした理想的結合曲線は、ＭＡＴＬＡＢでｆｍｉｎｓｅａｒｃｈを使用して理論的フィッティングを行った。
ＳＦ３７０細菌を対数中期まで増殖させ、洗浄し、１０ｍｌの培養物を１０００μｌのＰＢＳに濃縮した。細菌を、抗Ｍ抗体の半減系列希釈物で染色した。ＩｄｅＳ処理抗体１００μｌ毎に３０μｌの細菌を使用した。４℃で３０分間（振盪しながら）染色を実施した後、細菌を洗浄し、３０μｌの容量の過剰ＡＦ６４７コンジュゲートＦａｂ抗Ｆａｂ断片で３０分間４℃にて振盪しながら染色した。次いで、細菌をＰＢＳで２５０μｌに希釈し、フローサイトメトリーで分析した。解離定数を未知変数とした理想的結合曲線は、ＭＡＴＬＡＢでｆｍｉｎｓｅａｒｃｈを使用して理論的フィッティングを行った。
【0140】
抗体Ｆ（ａｂ’）２断片とＭ１タンパク質との架橋
Ａｂ２５、Ａｂ３２、およびＡｂ４９Ｆ（ａｂ’）２断片をＭ１タンパク質に架橋するために、本発明者らは、Ｍ１タンパク質の２つの異なる調製物を使用した。１つは、上記のＢ１Ｂ２Ｂ３構築物およびＣ１Ｃ２Ｃ３構築物について記載のように組換え体として大腸菌で発現および精製し、もう１つは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＭＣ２５株の培養上清から精製した（ＣｏｌｌｉｎおよびＯｌｓｅｎ ２０００年）。ＦｒａｇＩＴキットを製造元の説明書に従って使用しＦｃ捕捉カラム（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を用いて、発現されたインタクト抗体から抗体Ｆ（ａｂ’）２断片を切断および精製した。架橋のために、２５μｇの組換えＭ１タンパク質または８μｇのＭＣ２５ Ｍ１タンパク質を、１×ＰＢＳ ｐＨ７．４中で、５μｇの対応するＦ（ａｂ’）２断片と共に、３７℃、８００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に再懸濁した重／軽スベリン酸ジサクシンイミジル（ＤＳＳ；ＤＳＳ－Ｈ１２／Ｄ１２、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｉｎｃ．）を最終濃度が２５０および５００μＭになるように添加し、３７℃、８００ｒｐｍでさらに６０分間インキュベートした。架橋反応は、最終濃度が５０ｍＭの重炭酸アンモニウムを用いて１５分間３７℃にて８００ｒｐｍでクエンチした。
Ａｂ２５、Ａｂ３２、およびＡｂ４９Ｆ（ａｂ’）２断片をＭ１タンパク質に架橋するために、本発明者らは、Ｍ１タンパク質の２つの異なる調製物を使用した。１つは、上記のＢ１Ｂ２Ｂ３構築物およびＣ１Ｃ２Ｃ３構築物について記載のように組換え体として大腸菌で発現および精製し、もう１つは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＭＣ２５株の培養上清から精製した（ＣｏｌｌｉｎおよびＯｌｓｅｎ ２０００年）。ＦｒａｇＩＴキットを製造元の説明書に従って使用しＦｃ捕捉カラム（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を用いて、発現されたインタクト抗体から抗体Ｆ（ａｂ’）２断片を切断および精製した。架橋のために、２５μｇの組換えＭ１タンパク質または８μｇのＭＣ２５ Ｍ１タンパク質を、１×ＰＢＳ ｐＨ７．４中で、５μｇの対応するＦ（ａｂ’）２断片と共に、３７℃、８００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に再懸濁した重／軽スベリン酸ジサクシンイミジル（ＤＳＳ；ＤＳＳ－Ｈ１２／Ｄ１２、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｉｎｃ．）を最終濃度が２５０および５００μＭになるように添加し、３７℃、８００ｒｐｍでさらに６０分間インキュベートした。架橋反応は、最終濃度が５０ｍＭの重炭酸アンモニウムを用いて１５分間３７℃にて８００ｒｐｍでクエンチした。
【0141】
ＭＳのための試料調製
架橋された試料を８Ｍ尿素および１００ｍＭ重炭酸アンモニウムと混合し、システイン結合を５ｍＭ ＴＣＥＰで還元し（３７℃で２時間、８００ｒｐｍ）、１０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した（２２℃で３０分間、暗所にて）。タンパク質を、まず１μｇの配列決定等級リシルエンドペプチダーゼ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で消化した（３７℃、８００ｒｐｍ、２時間）。試料を、１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで希釈して、最終尿素濃度を１．５Ｍにし、１μｇの配列決定等級トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加してタンパク質をさらに消化した（３７℃、８００ｒｐｍ、１８時間）。試料を１０％ギ酸で酸性化し（最終ｐＨ３．０まで）、ペプチドを、製造元の説明書に従ってＣ１８逆相スピンカラムで精製した（Ｍａｃｒｏｓｐｉｎカラム、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）。ペプチドを、ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥し、２％アセトニトリル、０．２％ギ酸に再構成してから、質量分光分析を行った。
架橋された試料を８Ｍ尿素および１００ｍＭ重炭酸アンモニウムと混合し、システイン結合を５ｍＭ ＴＣＥＰで還元し（３７℃で２時間、８００ｒｐｍ）、１０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した（２２℃で３０分間、暗所にて）。タンパク質を、まず１μｇの配列決定等級リシルエンドペプチダーゼ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で消化した（３７℃、８００ｒｐｍ、２時間）。試料を、１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで希釈して、最終尿素濃度を１．５Ｍにし、１μｇの配列決定等級トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加してタンパク質をさらに消化した（３７℃、８００ｒｐｍ、１８時間）。試料を１０％ギ酸で酸性化し（最終ｐＨ３．０まで）、ペプチドを、製造元の説明書に従ってＣ１８逆相スピンカラムで精製した（Ｍａｃｒｏｓｐｉｎカラム、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）。ペプチドを、ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥し、２％アセトニトリル、０．２％ギ酸に再構成してから、質量分光分析を行った。
【0142】
液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）
すべてのペプチド分析は、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １２００超高速液体クロマトグラフィーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続されたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。ペプチドを、Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００（７５μｍ×２ｃｍ）Ｃ１８（３μｍ、１００Å）プレカラムに負荷し、８００ｂａｒの一定圧力で稼動させたＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＩＤ７５μｍ×５０ｃｍ、カラム温度４５℃）で分離した。０．１％ギ酸水溶液中の８０％アセトニトリルの４～４５％の直線勾配を、流速３５０ｎｌ分－１で６５分間流した。１回の完全なＭＳスキャン（分解能６００００＠２００ｍ／ｚ；質量範囲３９０～１２１０ｍ／ｚ）に続いて、１５個の最も豊富なイオンシグナルのＭＳ／ＭＳスキャン（分解能１５０００＠２００ｍ／ｚ）を行った。前駆体イオンを２ｍ／ｚ単離幅で単離し、ＨＣＤを使用して正規化衝突エネルギー３０で断片化した。電荷状態スクリーニングを有効化し、電荷状態が不明である前駆体および電荷状態が１の前駆体を拒絶した。動的排除窓を１０秒に設定した。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳの自動ゲイン制御を３ｅ６および１ｅ５に設定し、イオン蓄積時間はそれぞれ１１０ｍｓおよび６０ｍｓだった。前駆体イオン選択の強度閾値を１．７ｅ４に設定した。
すべてのペプチド分析は、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １２００超高速液体クロマトグラフィーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続されたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。ペプチドを、Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００（７５μｍ×２ｃｍ）Ｃ１８（３μｍ、１００Å）プレカラムに負荷し、８００ｂａｒの一定圧力で稼動させたＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＩＤ７５μｍ×５０ｃｍ、カラム温度４５℃）で分離した。０．１％ギ酸水溶液中の８０％アセトニトリルの４～４５％の直線勾配を、流速３５０ｎｌ分－１で６５分間流した。１回の完全なＭＳスキャン（分解能６００００＠２００ｍ／ｚ；質量範囲３９０～１２１０ｍ／ｚ）に続いて、１５個の最も豊富なイオンシグナルのＭＳ／ＭＳスキャン（分解能１５０００＠２００ｍ／ｚ）を行った。前駆体イオンを２ｍ／ｚ単離幅で単離し、ＨＣＤを使用して正規化衝突エネルギー３０で断片化した。電荷状態スクリーニングを有効化し、電荷状態が不明である前駆体および電荷状態が１の前駆体を拒絶した。動的排除窓を１０秒に設定した。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳの自動ゲイン制御を３ｅ６および１ｅ５に設定し、イオン蓄積時間はそれぞれ１１０ｍｓおよび６０ｍｓだった。前駆体イオン選択の強度閾値を１．７ｅ４に設定した。
【0143】
計算モデル化
この研究の高分子モデル化には、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアスイート（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｕｉｔ）（Ｋｏｅｈｌｅｒ Ｌｅｍａｎら ２０１９年）の幾つかのプロトコールを使用した。全長抗体をモデル化するために、まずＲｏｓｅｔｔａ抗体プロトコール（Ｗｅｉｔｚｎｅｒら ２０１７年）を使用して抗原結合性ドメインを特徴付けた。次いで、ＲｏｓｅｔｔａＣＭプロトコール（Ｓｏｎｇら ２０１３年）を使用して、重鎖および軽鎖の両方の比較モデルを生成し、抗原結合性ドメインに対してアラインして抗体の初期構造を表した。ＨＳＹＭＤＯＣＫ（Ｙａｎら ２０１８年）ＷｅｂサーバーおよびＤａＲｅＵＳ＿ｌｏｏｐ（Ｋａｒａｍｉら ２０１９）Ｗｅｂサーバーを、それぞれＦｃドメインの対称ドッキングおよびヒンジ領域のモデル化に使用した。最後に、最終精密化として各抗体の４Ｋモデルを作成し、ｒｏｓｅｔｔａエネルギースコアと組み合わせて質量分析から導出されたＸＬに基づき、上位得点モデルを選択した。さらに、Ｍ１抗体相互作用を特徴付けるために、ＴＸ－ＭＳプロトコール（Ｈａｕｒｉら ２０１９年）を使用し、それにより２Ｋドッキングモデルを生成し、ＤＤＡデータの距離制約を使用してフィルタリングした。ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋプロトコール（Ｇｒａｙ ２００６年）を使用して、上位モデルに対して最終ラウンドの高解像度モデル化を実施して、側鎖を再パッキングした。
この研究の高分子モデル化には、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアスイート（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｕｉｔ）（Ｋｏｅｈｌｅｒ Ｌｅｍａｎら ２０１９年）の幾つかのプロトコールを使用した。全長抗体をモデル化するために、まずＲｏｓｅｔｔａ抗体プロトコール（Ｗｅｉｔｚｎｅｒら ２０１７年）を使用して抗原結合性ドメインを特徴付けた。次いで、ＲｏｓｅｔｔａＣＭプロトコール（Ｓｏｎｇら ２０１３年）を使用して、重鎖および軽鎖の両方の比較モデルを生成し、抗原結合性ドメインに対してアラインして抗体の初期構造を表した。ＨＳＹＭＤＯＣＫ（Ｙａｎら ２０１８年）ＷｅｂサーバーおよびＤａＲｅＵＳ＿ｌｏｏｐ（Ｋａｒａｍｉら ２０１９）Ｗｅｂサーバーを、それぞれＦｃドメインの対称ドッキングおよびヒンジ領域のモデル化に使用した。最後に、最終精密化として各抗体の４Ｋモデルを作成し、ｒｏｓｅｔｔａエネルギースコアと組み合わせて質量分析から導出されたＸＬに基づき、上位得点モデルを選択した。さらに、Ｍ１抗体相互作用を特徴付けるために、ＴＸ－ＭＳプロトコール（Ｈａｕｒｉら ２０１９年）を使用し、それにより２Ｋドッキングモデルを生成し、ＤＤＡデータの距離制約を使用してフィルタリングした。ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋプロトコール（Ｇｒａｙ ２００６年）を使用して、上位モデルに対して最終ラウンドの高解像度モデル化を実施して、側鎖を再パッキングした。
【0144】
蛍光Ｘｏｌａｉｒ競合実験
対数増殖ＳＦ３７０細菌を熱死滅させ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎで標識した（以前に記載の通りに）。細菌を抗体または血漿／ＩＶＩＧと混合し、振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、蛍光コンジュゲートＸｏｌａｉｒ（タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の説明書に従って使用してＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７にコンジュゲートした）を、１００μｇ／ｍｌの濃度で細菌にさらに３０分間添加した後で、フローサイトメトリーで直接分析した。Ｆａｂを使用した実験では、Ｆａｂａｌａｃｔｉｃａ消化キット（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を製造元の説明書に従って使用して、Ｆａｂを生成した。
対数増殖ＳＦ３７０細菌を熱死滅させ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎで標識した（以前に記載の通りに）。細菌を抗体または血漿／ＩＶＩＧと混合し、振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、蛍光コンジュゲートＸｏｌａｉｒ（タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の説明書に従って使用してＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７にコンジュゲートした）を、１００μｇ／ｍｌの濃度で細菌にさらに３０分間添加した後で、フローサイトメトリーで直接分析した。Ｆａｂを使用した実験では、Ｆａｂａｌａｃｔｉｃａ消化キット（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を製造元の説明書に従って使用して、Ｆａｂを生成した。
【0145】
食作用アッセイ
食作用実験は持続的付随正規化（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を使用して実施した（ｄｅ Ｎｅｅｒｇａａｒｄら ２０１９）。オプソニン化の前に、ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ染色およびＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ染色ＳＦ３７０細菌を最大５分間超音波処理して（ＶｉａｌＴｗｅｅｔｅｒ；Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）、細菌のあらゆる大きな凝集体を分散させた。顕微鏡で塊分散が確認された場合、超音波処理は十分であるとみなした。染色ならびに細菌計数（ＦＩＴＣ＋ｖｅゲート制御での事象／μｌ）を、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で評価した。ＣｙｐＨｅｒ５ＥのｐＨ応答性を、１μｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ５．０）を１００μｌの細菌懸濁物に添加する前後のＡＰＣチャネルにおける細菌蛍光染色を測定することにより試験した。酸誘導性蛍光シフトの存在は、染色の成功を示した。実験の当日に、各実験に合わせて適切な数の細菌をオプソニン化した。本発明者らのＭ特異的抗体、Ｘｏｌａｉｒ、またはＩＶＩＧによるオプソニン化を３７℃で３０分間実施した。様々なＭＯＰを用いた実験では、オプソニン化細菌の系列希釈物を製作し、ＴＨＰ－１細胞とのインキュベーションに使用した。白血球集団（付録図３ａ）、特に単一細胞（付録図３ｂ）をゲート制御することにより、本発明者らは、細胞を、細菌と付随したもの（ＦＩＴＣ陽性）および細菌に内部移行されたもの（ＦＩＴＣおよびＡＰＣ陽性）にグループ分けすることができた（付録図３ｃ～３ｅ）。付録図３ｃに示されているパネルは非相互作用細胞を示し、付録図３ｄおよび３ｅは、それぞれ３７℃および４℃での食作用の結果を示す。抗体濃度が変数である実験では、抗体の系列希釈物をＮａ培地で９６ウェルプレートに製作し、オプソニン化のために細菌を抗体に直接添加した。実験の当日に、ＴＨＰ１細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｎａ培地に再懸濁した。食作用の前に、ＴＨＰ－１細胞の濃度をフローサイトメトリーで測定し、２０００細胞／μｌ（１ウェル当たり１０００００細胞）に調整した。次いで、細胞を、様々な濃度の事前にオプソニン化された細菌（ＭＯＰ）でまたは様々な抗体濃度で以前に準備した９６ウェルプレートに添加した。最後に、氷上で５０μｌのＴＨＰ－１細胞を添加し、最終的な食作用容積を１５０μｌにした。氷上で５分間インキュベーションした後、プレートを、光から保護しながら３７℃に設定した振盪加熱ブロックに直接移したか、または内部移行の対照として氷上で維持した。食作用は、データ取得前に少なくとも１５分間氷上に試料を置くことにより停止させた。３回の実験を実施して結合曲線を評価し、４回の実験をＭＯＰ４００で実施して異なる抗体を比較した。
食作用実験は持続的付随正規化（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を使用して実施した（ｄｅ Ｎｅｅｒｇａａｒｄら ２０１９）。オプソニン化の前に、ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ染色およびＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ染色ＳＦ３７０細菌を最大５分間超音波処理して（ＶｉａｌＴｗｅｅｔｅｒ；Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）、細菌のあらゆる大きな凝集体を分散させた。顕微鏡で塊分散が確認された場合、超音波処理は十分であるとみなした。染色ならびに細菌計数（ＦＩＴＣ＋ｖｅゲート制御での事象／μｌ）を、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で評価した。ＣｙｐＨｅｒ５ＥのｐＨ応答性を、１μｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ５．０）を１００μｌの細菌懸濁物に添加する前後のＡＰＣチャネルにおける細菌蛍光染色を測定することにより試験した。酸誘導性蛍光シフトの存在は、染色の成功を示した。実験の当日に、各実験に合わせて適切な数の細菌をオプソニン化した。本発明者らのＭ特異的抗体、Ｘｏｌａｉｒ、またはＩＶＩＧによるオプソニン化を３７℃で３０分間実施した。様々なＭＯＰを用いた実験では、オプソニン化細菌の系列希釈物を製作し、ＴＨＰ－１細胞とのインキュベーションに使用した。白血球集団（付録図３ａ）、特に単一細胞（付録図３ｂ）をゲート制御することにより、本発明者らは、細胞を、細菌と付随したもの（ＦＩＴＣ陽性）および細菌に内部移行されたもの（ＦＩＴＣおよびＡＰＣ陽性）にグループ分けすることができた（付録図３ｃ～３ｅ）。付録図３ｃに示されているパネルは非相互作用細胞を示し、付録図３ｄおよび３ｅは、それぞれ３７℃および４℃での食作用の結果を示す。抗体濃度が変数である実験では、抗体の系列希釈物をＮａ培地で９６ウェルプレートに製作し、オプソニン化のために細菌を抗体に直接添加した。実験の当日に、ＴＨＰ１細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｎａ培地に再懸濁した。食作用の前に、ＴＨＰ－１細胞の濃度をフローサイトメトリーで測定し、２０００細胞／μｌ（１ウェル当たり１０００００細胞）に調整した。次いで、細胞を、様々な濃度の事前にオプソニン化された細菌（ＭＯＰ）でまたは様々な抗体濃度で以前に準備した９６ウェルプレートに添加した。最後に、氷上で５０μｌのＴＨＰ－１細胞を添加し、最終的な食作用容積を１５０μｌにした。氷上で５分間インキュベーションした後、プレートを、光から保護しながら３７℃に設定した振盪加熱ブロックに直接移したか、または内部移行の対照として氷上で維持した。食作用は、データ取得前に少なくとも１５分間氷上に試料を置くことにより停止させた。３回の実験を実施して結合曲線を評価し、４回の実験をＭＯＰ４００で実施して異なる抗体を比較した。
【0146】
フローサイトメトリー取得は、４８８ｎｍおよび６３８ｎｍレーザーならびにフィルター５２５／４０ＦＩＴＣおよび６６０／１０ＡＰＣを有するＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して実施した。閾値を、食作用の場合はＦＳＣ－Ｈ ７０，０００に、細菌の場合はＦＳＣ－Ｈ ２０００およびＳＳＣ－Ｈ ２０００に設定した。ゲインを、ＦＩＴＣの場合は３に、ＡＰＣの場合は２６５に設定した。取得は、すべての試料を評価するのにおよそ３０分かかる３０μｌ／分の速度で、標的集団の少なくとも５，０００事象を捕捉するように設定した。データ取得中は、９６ウェルプレートを氷冷インサート上で維持して、さらなる食作用を阻害した。
【0147】
ＮＦ－κＢ活性ルシフェラーゼアッセイ
ＴＨＰ－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）細胞を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００，０００細胞の密度で播種した。細胞を、Ｍ１タンパク質（２μｇ／ｍｌ）と共にまたは伴わずに、適切な抗体（０．５μｇ／ｍｌ）で１８時間、３７℃にて処理した。インキュベーション後、２０μｌの細胞上清を吸引し、アッセイの説明書に記載のように展開試薬（ＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ溶液、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合した。発色が適切になるまで試料を３７℃でインキュベートし、マルチウェル分光光度計を使用して試料のＯＤ６５０測定を行った。
ＴＨＰ－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）細胞を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００，０００細胞の密度で播種した。細胞を、Ｍ１タンパク質（２μｇ／ｍｌ）と共にまたは伴わずに、適切な抗体（０．５μｇ／ｍｌ）で１８時間、３７℃にて処理した。インキュベーション後、２０μｌの細胞上清を吸引し、アッセイの説明書に記載のように展開試薬（ＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ溶液、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合した。発色が適切になるまで試料を３７℃でインキュベートし、マルチウェル分光光度計を使用して試料のＯＤ６５０測定を行った。
【0148】
動物モデル
すべての動物使用および手順は、マルメ／ルンド地方実験動物委員会、倫理許可番号０３６８１－２０１９により承認されていた。９週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｓｃａｎｂｕｒ／Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。モノクローナル抗体Ａｂ２５（０．４ｍｇ／マウス）または静注用免疫グロブリン（１０ｍｇ／マウス）を、感染の６時間前に腹腔内投与した。Ｓ．ピオゲネスＡＰ１を、Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔブロス（３７℃、５％ＣＯ２）で対数期まで増殖させた。細菌を洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁した。１０６ＣＦＵの細菌を首筋に皮下注射し、２４時間以内に全身性感染を引き起こした。感染２４時間後にマウスを犠牲にし、器官（血液、肝臓、脾臓、および腎臓）を回収して、細菌播種の度合いを測定した。血球数を、フローサイトメトリーで分析した。サイトメトリービーズアッセイ（ＣＢＡマウス炎症キット、ＢＤ）を製造元の説明書に従って使用してサイトカインを定量化した。
すべての動物使用および手順は、マルメ／ルンド地方実験動物委員会、倫理許可番号０３６８１－２０１９により承認されていた。９週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｓｃａｎｂｕｒ／Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。モノクローナル抗体Ａｂ２５（０．４ｍｇ／マウス）または静注用免疫グロブリン（１０ｍｇ／マウス）を、感染の６時間前に腹腔内投与した。Ｓ．ピオゲネスＡＰ１を、Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔブロス（３７℃、５％ＣＯ２）で対数期まで増殖させた。細菌を洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁した。１０６ＣＦＵの細菌を首筋に皮下注射し、２４時間以内に全身性感染を引き起こした。感染２４時間後にマウスを犠牲にし、器官（血液、肝臓、脾臓、および腎臓）を回収して、細菌播種の度合いを測定した。血球数を、フローサイトメトリーで分析した。サイトメトリービーズアッセイ（ＣＢＡマウス炎症キット、ＢＤ）を製造元の説明書に従って使用してサイトカインを定量化した。
【0149】
実施例１
ヒト単一細胞由来Ｍ特異的抗体を発生させるための抗原ベイティング
ＧＡＳ感染に対する防御抗体を構成するものを理解するために、本発明者らは、機能的ヒト抗体を生成し、毒性に対する抗体の効果を分析したいと考えた。本発明者らは、Ｍタンパク質を標的抗原として選択し、Ｍタンパク質特異的抗体の供給源として、連鎖球菌感染の除去に成功したドナーを用いた。連鎖球菌Ｍタンパク質に対する特異性を有するヒト抗体を特定するために、本発明者らは、ドナーＢ細胞を蛍光標識Ｍタンパク質でベイティングすることによりＭ反応性Ｂ細胞を単離した。本発明者らは、生存単一ＣＤ１９＋ＣＤ３－ＩｇＧ＋Ｍ＋Ｂ細胞を選別した（図１）。重鎖および軽鎖の可変領域のＲＴ－ＰＣＲのクローニングは、１０個の抗体対を産出した（付録図１）。ＨＥＫ２９３細胞での発現後の抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、正しい遊走パターンを示し、インタクト抗体が適正に発現されたことが示された（図２９）。４つの抗体が、ＧＡＳ単離株の中で最も一般的なＭタンパク質であるＧＡＳ（ＳＦ３７０株）の表面結合Ｍ１タンパク質に対して明らかな反応性を示した（図２）。Ｍ１タンパク質を欠如するΔＭ ＳＦ３７０突然変異株を使用した３つの選択された抗体によるさらなる実験は、Ａｂ２５、３２、および４９とＭ１との相互作用の特異性を実証した（図３）。本発明者らは、ＳＦ３７０の表面への抗体結合親和性を、インタクト抗体またはＦ（ａｂ’）２断片のいずれかで測定した（図４）。後者は、Ｍ１とＩｇＧＦｃとの結合の寄与を回避するためである（Åｋｅｓｓｏｎら １９９４年）。インタクトＸｏｌａｉｒ（オマリズマブ、抗ＩｇＥ）は、３．２×１０－６Ｍ－１のＫＤを示し、これは、結合親和性が低いことを意味し、以前に報告された精製Ｍ１タンパク質に対するＩｇＧＦｃ親和性（３．４×１０－６Ｍ－１）（Åｋｅｓｓｏｎら １９９４年）と一致した。Ａｂ２５、３２、および４９のＦ（ａｂ’）２断片は、Ｍ１に対して有意により高い親和性を示した；それぞれ２．３×１０－９、９．１×１０－９、および１２．３×１０－９Ｍ－１（図５）。
ヒト単一細胞由来Ｍ特異的抗体を発生させるための抗原ベイティング
ＧＡＳ感染に対する防御抗体を構成するものを理解するために、本発明者らは、機能的ヒト抗体を生成し、毒性に対する抗体の効果を分析したいと考えた。本発明者らは、Ｍタンパク質を標的抗原として選択し、Ｍタンパク質特異的抗体の供給源として、連鎖球菌感染の除去に成功したドナーを用いた。連鎖球菌Ｍタンパク質に対する特異性を有するヒト抗体を特定するために、本発明者らは、ドナーＢ細胞を蛍光標識Ｍタンパク質でベイティングすることによりＭ反応性Ｂ細胞を単離した。本発明者らは、生存単一ＣＤ１９＋ＣＤ３－ＩｇＧ＋Ｍ＋Ｂ細胞を選別した（図１）。重鎖および軽鎖の可変領域のＲＴ－ＰＣＲのクローニングは、１０個の抗体対を産出した（付録図１）。ＨＥＫ２９３細胞での発現後の抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、正しい遊走パターンを示し、インタクト抗体が適正に発現されたことが示された（図２９）。４つの抗体が、ＧＡＳ単離株の中で最も一般的なＭタンパク質であるＧＡＳ（ＳＦ３７０株）の表面結合Ｍ１タンパク質に対して明らかな反応性を示した（図２）。Ｍ１タンパク質を欠如するΔＭ ＳＦ３７０突然変異株を使用した３つの選択された抗体によるさらなる実験は、Ａｂ２５、３２、および４９とＭ１との相互作用の特異性を実証した（図３）。本発明者らは、ＳＦ３７０の表面への抗体結合親和性を、インタクト抗体またはＦ（ａｂ’）２断片のいずれかで測定した（図４）。後者は、Ｍ１とＩｇＧＦｃとの結合の寄与を回避するためである（Åｋｅｓｓｏｎら １９９４年）。インタクトＸｏｌａｉｒ（オマリズマブ、抗ＩｇＥ）は、３．２×１０－６Ｍ－１のＫＤを示し、これは、結合親和性が低いことを意味し、以前に報告された精製Ｍ１タンパク質に対するＩｇＧＦｃ親和性（３．４×１０－６Ｍ－１）（Åｋｅｓｓｏｎら １９９４年）と一致した。Ａｂ２５、３２、および４９のＦ（ａｂ’）２断片は、Ｍ１に対して有意により高い親和性を示した；それぞれ２．３×１０－９、９．１×１０－９、および１２．３×１０－９Ｍ－１（図５）。
【0150】
実施例２
抗Ｍ抗体の特徴付け
特定された抗Ｍ１抗体を特徴付けるために、本発明者らは、一群の生化学的および免疫学的アッセイを実施した。本発明者らは、構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）免疫蛍光法（ＩＦ）を使用して、ＳＦ３７０の表面の抗Ｍ結合パターンを可視化した。興味深いことに、Ｍタンパク質は、Ｆｃ媒介性Ｘｏｌａｉｒ結合を含むすべてのモノクローナル抗体と、生物の表面に沿って同様の点状分布を示す（図６）。何千人ものドナーからのプールしたＩｇＧを含むＩＶＩＧは、むしろ細菌の表面全体を染色し、予想通りの多特異的網羅範囲を示した（図６）。抗Ｍ ＥＬＩＳＡを使用した場合、Ａｂ２５のみがＭタンパク質との反応性を示したが（図７）、ウエスタンブロット（ＷＢ）実験では、Ａｂ３２がＭタンパク質に対する最も良好な結合を示した（図８）。まとめると、ＩＦ、ＥＬＩＳＡ、およびＷＢからのデータは、３つのモノクローナルが、Ｍタンパク質の異なるエピトープに結合することを示している。
抗Ｍ抗体の特徴付け
特定された抗Ｍ１抗体を特徴付けるために、本発明者らは、一群の生化学的および免疫学的アッセイを実施した。本発明者らは、構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）免疫蛍光法（ＩＦ）を使用して、ＳＦ３７０の表面の抗Ｍ結合パターンを可視化した。興味深いことに、Ｍタンパク質は、Ｆｃ媒介性Ｘｏｌａｉｒ結合を含むすべてのモノクローナル抗体と、生物の表面に沿って同様の点状分布を示す（図６）。何千人ものドナーからのプールしたＩｇＧを含むＩＶＩＧは、むしろ細菌の表面全体を染色し、予想通りの多特異的網羅範囲を示した（図６）。抗Ｍ ＥＬＩＳＡを使用した場合、Ａｂ２５のみがＭタンパク質との反応性を示したが（図７）、ウエスタンブロット（ＷＢ）実験では、Ａｂ３２がＭタンパク質に対する最も良好な結合を示した（図８）。まとめると、ＩＦ、ＥＬＩＳＡ、およびＷＢからのデータは、３つのモノクローナルが、Ｍタンパク質の異なるエピトープに結合することを示している。
【0151】
抗体媒介性細菌凝集は、十分に記録されている抗体機能であり、効果的な免疫クリアランスのために細菌を連鎖させるなど、重要な生物学的意義を有する（Ｍｏｏｒら ２０１７年；Ｍｉｔｓｉら ２０１７年）。別の周知の細菌間ＧＡＳ特異的現象は、増殖チューブの底部でのＭ依存性細菌凝集体の形成である（Ｆｒｉｃｋら ２０００年）。自己凝集を一切させずにＧＡＳを増殖させることは不可能であるが、抗体は、細菌凝集を大幅に増強した。三重抗体カクテルならびに個々の抗体は両方とも、Ｍ反応性Ｂ細胞が得られた患者に由来するドナー血清の場合と同様に、用量依存的な凝集をもたらした（図９、図３１）。この増強は、ΔＭ株では観察されなかった。これにより、抗体依存性凝集がＭ特異的な現象であることがさらに検証された。凝集細菌ならびに典型的なＧＡＳ凝集体は、抗Ｍ抗体または血漿の存在下で激しくボルテックスすることにより消散させることができた（図３２）。ＧＡＳ凝集および凝集体溶解は、Ａｂ２５、４９で最も顕著であり、Ａｂ３２では程度がより低かったが、Ｘｏｌａｉｒ（ＩｇＧＦｃ結合のみ）では効果がなかった。
【0152】
また、抗体は、抗原とライゲートし、抗原取込みを媒介することにより、マクロファージを活性化し、炎症性サイトカイン産生をもたらす（Ｂｏｕｒｎａｚｏｓら ２０１７年）。本発明者らは、ＮＦ－κＢ活性化の定量的指標としてＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリホスファターゼ）を分泌するＴＨＰ－１ Ｘ－Ｂｌｕｅレポーター細胞を使用して、抗体依存性Ｍタンパク質誘導性免疫活性化に取り組んだ。本発明者らは、Ｍタンパク質単独ではＮＦ－κＢシグナル伝達を誘導することができないことを見出した。しかしながら、Ｍタンパク質とＡｂ２５との組合せは、Ｍタンパク質とＸｏｌａｉｒとの組合せと比較して、ＮＦ－κＢ活性化を２．８倍と著しく増加させた（図１０）。Ｍタンパク質とＡｂ４９との組合せは、ＮＦ－κＢ活性化に対してある程度の効果を示したが（１．６倍、ｎｓ）、Ａｂ３２との組合せは効果を示さなかった（１．２倍）。３つの抗体すべてを組み合わせると、おそらくはＡｂ２５および４９の量が組み合わされるため、ＮＦ－κＢ活性化は累積で３．９倍と著しく増加した。興味深いことに、本発明者らは、ＩＶＩＧ処理Ｍタンパク質に対するＴＨＰ－１曝露時に、ＩＶＩＧが同じ抗体媒介性ＮＦ－κＢ活性化を誘発しないことも見出した（１．４倍）。モノクローナルの生化学的特徴および免疫学的特徴の組合せは、すべてがＭタンパク質に特異的であり、異なるエピトープに結合し、免疫学的効果を誘導することができ、Ａｂ２５が、全体的に最も強力な効果を有することを示している。
【0153】
実施例３
抗Ｍ抗体は効率的な食作用を促進する
食作用は、プレイがファゴソームに内部移行され、続いて酸性で過酷な区画へとそれらが成熟する受容体媒介性プロセスである。食作用を引き起こす抗体の能力を調査するために、本発明者らは、持続的付随に基づく正規化（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）（ｄｅ Ｎｅｅｒｇａａｒｄら ２０１９年）を使用して、食細胞との付随ならびに内部移行を増加させる抗体の能力を両方とも研究した。本発明者らは、プレイの多重度（ＭＯＰ）を漸増させて、貪食ＴＨＰ－１細胞をｐＨ感受性ＣｙｐＨｅｒ５染色細菌と共にインキュベートした（図３３～３４）。本発明者らは、Ａｂ２５、３２、および４９を組み合わせて、ＴＨＰ－１細胞との細菌付随に対する累積効果を評価した。Ｘｏｌａｉｒと比較して、抗体混合物および程度はより低いがＩＶＩＧは、細菌とＴＨＰ－１細胞との付随をある程度増加させた（図１１）。これは、曲線の左シフトとして確認することができ、最大付随を達成するために必要な細菌がより少数であることを意味する。個々に試験した場合、Ａｂ２５は単独でも付随の増強を示した。これは、抗体混合物媒介性の付随増加がＡｂ２５のみによるものであることを示す（図１２）。抗体混合物は、Ｘｏｌａｉｒと比較して内部移行を増加させ、２つの処理間の相離は、ＭＯＰの関数として増加した（図１３）。個々の抗体をより詳細に調査すると、Ａｂ２５のみが内部移行の増加を示した（図１４）。用量応答分析では、Ａｂ２５は、内部移行の媒介がＸｏｌａｉｒよりも有意に効果的であることが示された（ＴＨＰ－１細胞の５０％が細菌を内部移行させる濃度；ＥＣ５０ ０．８対４０．２μｇ／ｍｌ）（図１５）。食作用データは、すべてのモノクローナルによる強力なＦａｂ媒介性結合および他の免疫学的効果の誘導にも関わらず、１つの抗体Ａｂ２５のみが、Ａ群連鎖球菌の食作用を促進させることができることを示した。
抗Ｍ抗体は効率的な食作用を促進する
食作用は、プレイがファゴソームに内部移行され、続いて酸性で過酷な区画へとそれらが成熟する受容体媒介性プロセスである。食作用を引き起こす抗体の能力を調査するために、本発明者らは、持続的付随に基づく正規化（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）（ｄｅ Ｎｅｅｒｇａａｒｄら ２０１９年）を使用して、食細胞との付随ならびに内部移行を増加させる抗体の能力を両方とも研究した。本発明者らは、プレイの多重度（ＭＯＰ）を漸増させて、貪食ＴＨＰ－１細胞をｐＨ感受性ＣｙｐＨｅｒ５染色細菌と共にインキュベートした（図３３～３４）。本発明者らは、Ａｂ２５、３２、および４９を組み合わせて、ＴＨＰ－１細胞との細菌付随に対する累積効果を評価した。Ｘｏｌａｉｒと比較して、抗体混合物および程度はより低いがＩＶＩＧは、細菌とＴＨＰ－１細胞との付随をある程度増加させた（図１１）。これは、曲線の左シフトとして確認することができ、最大付随を達成するために必要な細菌がより少数であることを意味する。個々に試験した場合、Ａｂ２５は単独でも付随の増強を示した。これは、抗体混合物媒介性の付随増加がＡｂ２５のみによるものであることを示す（図１２）。抗体混合物は、Ｘｏｌａｉｒと比較して内部移行を増加させ、２つの処理間の相離は、ＭＯＰの関数として増加した（図１３）。個々の抗体をより詳細に調査すると、Ａｂ２５のみが内部移行の増加を示した（図１４）。用量応答分析では、Ａｂ２５は、内部移行の媒介がＸｏｌａｉｒよりも有意に効果的であることが示された（ＴＨＰ－１細胞の５０％が細菌を内部移行させる濃度；ＥＣ５０ ０．８対４０．２μｇ／ｍｌ）（図１５）。食作用データは、すべてのモノクローナルによる強力なＦａｂ媒介性結合および他の免疫学的効果の誘導にも関わらず、１つの抗体Ａｂ２５のみが、Ａ群連鎖球菌の食作用を促進させることができることを示した。
【0154】
実施例４
抗Ｍ抗体はＧＡＳ感染からマウスを防御する
Ａｂ２５で見られる食作用およびＮＦ－κＢの誘導は、免疫機能の重要な指標である。ｉｎ ｖｉｖｏでのＡｂ２５の潜在的な防御効果を試験するため、本発明者らは、ＧＡＳによる皮下感染のマウスモデルを使用した。マウスを、Ａｂ２５またはＩＶＩＧの腹腔内注射で前処置した。高用量ＩＶＩＧは、重度ＧＡＳ感染症のマウスモデルで使用されており（Ｓｒｉｓｋａｎｄａｎら ２００６年）、陽性対照としての役割を果たした。ＩＶＩＧまたはＡｂ２５による処置は、未処置の対照と比較して、脾臓、腎臓、および肝臓における細菌量を低減させ、Ａｂ２５は、ＩＶＩＧよりも良好な防御を呈した（図１６）。Ａｂ２５またはＩＶＩＧ処置は、血漿中のＴＮＦα、ＭＣＰ－１、およびＩＬ－６レベルの低減からわかるように、サイトカイン動員にも影響を及ぼした（図１７）。ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１２ｐ７０のレベルは、本発明者らの実験条件下では検出レベルを下回った。まとめると、凝集、ＮＦ－ｋＢ、食作用、および動物実験は、Ａｂ２５が免疫調節効果を示し、動物をＧＡＳ感染から防御することを示している。
抗Ｍ抗体はＧＡＳ感染からマウスを防御する
Ａｂ２５で見られる食作用およびＮＦ－κＢの誘導は、免疫機能の重要な指標である。ｉｎ ｖｉｖｏでのＡｂ２５の潜在的な防御効果を試験するため、本発明者らは、ＧＡＳによる皮下感染のマウスモデルを使用した。マウスを、Ａｂ２５またはＩＶＩＧの腹腔内注射で前処置した。高用量ＩＶＩＧは、重度ＧＡＳ感染症のマウスモデルで使用されており（Ｓｒｉｓｋａｎｄａｎら ２００６年）、陽性対照としての役割を果たした。ＩＶＩＧまたはＡｂ２５による処置は、未処置の対照と比較して、脾臓、腎臓、および肝臓における細菌量を低減させ、Ａｂ２５は、ＩＶＩＧよりも良好な防御を呈した（図１６）。Ａｂ２５またはＩＶＩＧ処置は、血漿中のＴＮＦα、ＭＣＰ－１、およびＩＬ－６レベルの低減からわかるように、サイトカイン動員にも影響を及ぼした（図１７）。ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１２ｐ７０のレベルは、本発明者らの実験条件下では検出レベルを下回った。まとめると、凝集、ＮＦ－ｋＢ、食作用、および動物実験は、Ａｂ２５が免疫調節効果を示し、動物をＧＡＳ感染から防御することを示している。
【0155】
実施例５
抗体は、単一Ｆａｂまたは二重Ｆａｂ結合を介してＭタンパク質の類似領域を標的とする
Ｆａｂを介して高親和性で結合する抗体は、典型的には、免疫応答を促進することが予想される。しかしながら、試験した抗Ｍ抗体のうち、Ａｂ２５のみが、すべての試験した免疫エフェクター機能を促進することができた。抗体間の構造上の違いを評価するために、本発明者らは、Ａｂ２５、Ａｂ３２、およびＡｂ４９のＦａｂ断片のＲｏｓｅｔｔａ生成分子モデルを提示する。このモデルでは、本発明者らは相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを強調する（図１８）。ＣＤＲ Ｈ３およびＬ３ループ領域の立体構造を比較するために、本発明者らは、３つの抗体すべてのＦａｂ断片を分析した（図１９）。ＣＤＲ Ｈ３ループに関するＡｂ２５とＡｂ４９との類似性は明らかであるが（ＲＭＳＤ １．０Å）、Ａｂ３２ ＣＤＲ Ｈ３の立体構造は異なる（図２０）。Ａｂ２５およびＡｂ４９の一次アミノ酸配列レベルでの保存はそれほど明確ではない。
抗体は、単一Ｆａｂまたは二重Ｆａｂ結合を介してＭタンパク質の類似領域を標的とする
Ｆａｂを介して高親和性で結合する抗体は、典型的には、免疫応答を促進することが予想される。しかしながら、試験した抗Ｍ抗体のうち、Ａｂ２５のみが、すべての試験した免疫エフェクター機能を促進することができた。抗体間の構造上の違いを評価するために、本発明者らは、Ａｂ２５、Ａｂ３２、およびＡｂ４９のＦａｂ断片のＲｏｓｅｔｔａ生成分子モデルを提示する。このモデルでは、本発明者らは相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを強調する（図１８）。ＣＤＲ Ｈ３およびＬ３ループ領域の立体構造を比較するために、本発明者らは、３つの抗体すべてのＦａｂ断片を分析した（図１９）。ＣＤＲ Ｈ３ループに関するＡｂ２５とＡｂ４９との類似性は明らかであるが（ＲＭＳＤ １．０Å）、Ａｂ３２ ＣＤＲ Ｈ３の立体構造は異なる（図２０）。Ａｂ２５およびＡｂ４９の一次アミノ酸配列レベルでの保存はそれほど明確ではない。
【0156】
それぞれのＦ（ａｂ’）２断片により認識される、Ｍ１タンパク質のエピトープを決定するために、本発明者らは、質量分析とカップリングされた標的化溶液中架橋（ＴＸ－ＭＳ）を実施した（Ｈａｕｒｉら ２０１９年）。ＴＸ－ＭＳは、大型タンパク質複合体の正確な四次立体構造をモデル化し、多数の高精度架橋ペプチド断片に基づいて幾つかの独立した架橋を特定することにより、それらの立体構造を裏付けることができる。分析した３つの抗体のうち、本発明者らは、Ａｂ２５とＭ１タンパク質との間に１０個の架橋ペプチドを特定した。こうした架橋は、Ｆ（ａｂ’）２とＭタンパク質の２つの異なる領域との間に見出され、Ａｂ２５が、Ｂ－Ｓ－Ｃドメイン領域に２つの異なる結合部位を有することを示している（図２１、図３５）。ＴＸ－ＭＳプロトコールの一部として、数多くのタンパク質間ドッキングモデルが作出される。架橋された距離的制約をこうしたドッキングモデルに重ね合わせることにより、Ａｂ２５ Ｆ（ａｂ’）は、ヒンジ領域に大きな立体構造変化を誘導することなく、２つの架橋されたエピトープと同時に結合することができることが示されている。これは、Ａｂ２５が、分子内シス結合様式で二重Ｆａｂ結合が可能であることを示唆する。抗体シス結合は、抗原が近近傍にある場合に結合力を誘導することができる伝統的な分子間トランス結合相互作用とは異なる（ＫｌｅｉｎおよびＢｊｏｒｋｍａｎ ２０１０年）。Ｍ１タンパク質Ｂ－Ｓドメイン領域での類似結合部位は、Ａｂ４９でも特定され、本発明者らは、Ｍ１タンパク質との２つの架橋ペプチドを特定した（図２２、図３５）。興味深いことに、Ｍ１タンパク質Ｓ領域は、以前はＦｃ媒介性結合にのみ関連付けられていた（Ｎｏｒｄｅｎｆｅｌｔら ２０１２年；Åｋｅｓｓｏｎら １９９４年）。
【0157】
観察された結合部位を直交性手法で検証するために、本発明者らは、部位局在化顕微鏡法を使用した。この方法では、蛍光標識された細胞壁と抗体結合部位との間の相対距離が、複数の個々の細菌の反復測定により決定される（図２３）。高さ分析は、すべてのモノクローナルＦ（ａｂ’）２断片が、Ｍ１タンパク質のＦｃ結合ドメイン（Ｓ）付近に結合することを示した（Ｘｏｌａｉｒ Ｆｃ結合と比較して）。これはＴＸ－ＭＳの結果を裏付けている。抗体は、Ｆｃ結合ドメイン付近にエピトープを有すると考えられるため（図２１～２２からわかるように）、本発明者らは、抗体のいずれかがＦｃ結合を妨害することができるか否かをさらに調査した。観察されたＡｂ２５の二重Ｆａｂシス結合が有効である場合、Ａｂ２５は、Ｓドメインを覆って（図５Ｄ）、Ｆｃ結合を遮断することができることになるが、単一のＦａｂ相互作用は、Ｆｃ結合に対する妨害がより小さいかまたはないだろう。本発明者らは、蛍光Ｘｏｌａｉｒと、抗体試料と共にプレインキュベートしたＳＦ３７０との結合を測定した。Ａｂ２５は、Ｆｃ結合を有意に遮ったが、Ａｂ３２およびＡｂ４９は遮らなかった。Ａｂ４９およびＡｂ２５は、Ｓ領域の上に位置する１つの類似エピトープを共有するため、そこに結合するだけではＦｃ相互作用を破壊するには不十分であり、これがＡｂ２５の二重Ｆａｂシス結合能力によるものであることを強く示唆している。
【0158】
実施例６
機能的抗体結合には二重Ｆａｂ様式の相互作用が必要である
単一タンパク質の２つの異なるエピトープに対する２つの同一Ｆａｂのシス様式での二重Ｆａｂ抗体結合は、これまで観察されていなかった新規の抗体相互作用様式である。これは、二重Ｆａｂシス結合が免疫学的防御機能の明白な獲得と関連するという事実と相まって、本発明者らが、この知見を検証し、Ａｂ２５の二重Ｆａｂ結合能力の特定の性質を解明する契機となった。第一に、本発明者らは、Ｆｃ結合を遮る単一Ａｂ２５ Ｆａｂの能力を調査した。いずれかの結合部位がＦｃ結合の立体障害を維持することができる場合、低減が見られるはずである。しかしながら、Ｆｃ結合は、単一Ｆａｂでは影響を受けなかった（図２５）。第二に、Ａｂ２５はＥＬＩＳＡで良好に機能するため（図７）、本発明者らは、いずれかの結合部位を欠如するＭ１ベース断片とのＡｂ２５結合を阻害することができるか否かを確認したいと考えた（図３８）。Ａｂ２５は、単独で単一エピトープに結合することができれば、断片との結合を低減させることが可能なはずである。しかしながら、Ｍ１結合は断片による影響を受けず（図２６）、本発明者らは、別のアッセイでも断片との結合を確認することができなかった（図３８）。第三に、本発明者らは、様々な形態の抗体がどの程度良好に細菌に結合することができるかを確認したいと考えた。本発明者らは、ＩｇＧ全体、Ｆ（ａｂ’）２、および単一ＦａｂとＳＦ３７０との結合を比較した。驚くべきことに、Ａｂ２５単一Ｆａｂは細菌に結合することができなかったが、Ａｂ４９ Ｆａｂは、それらの結合を増加させた（図２７）。後者は、単一Ｆａｂの方が接近し易いため、予想された結果であるが、こうした結果は、Ａｂ２５とＭタンパク質との相互作用の支配的な様式が二重Ｆａｂシス結合であることを明らかにしている。単一Ｆａｂを介した結合がどれほどより弱いかを評価するために、本発明者らは、単一Ｆａｂの親和性測定を実施した。これらは、Ａｂ２５ Ｆａｂ結合が、Ｆ（ａｂ）’２結合（２．３ｎＭ－１、図２８）と比較して、２０００分の１のより低い親和性（４．４ｍＭ－１）を有することを示した。こうした結果は、Ａｂ２５が効果的に結合し、防御機能を発揮するには、二重Ｆａｂシス様式の相互作用が必要であることを示している。
機能的抗体結合には二重Ｆａｂ様式の相互作用が必要である
単一タンパク質の２つの異なるエピトープに対する２つの同一Ｆａｂのシス様式での二重Ｆａｂ抗体結合は、これまで観察されていなかった新規の抗体相互作用様式である。これは、二重Ｆａｂシス結合が免疫学的防御機能の明白な獲得と関連するという事実と相まって、本発明者らが、この知見を検証し、Ａｂ２５の二重Ｆａｂ結合能力の特定の性質を解明する契機となった。第一に、本発明者らは、Ｆｃ結合を遮る単一Ａｂ２５ Ｆａｂの能力を調査した。いずれかの結合部位がＦｃ結合の立体障害を維持することができる場合、低減が見られるはずである。しかしながら、Ｆｃ結合は、単一Ｆａｂでは影響を受けなかった（図２５）。第二に、Ａｂ２５はＥＬＩＳＡで良好に機能するため（図７）、本発明者らは、いずれかの結合部位を欠如するＭ１ベース断片とのＡｂ２５結合を阻害することができるか否かを確認したいと考えた（図３８）。Ａｂ２５は、単独で単一エピトープに結合することができれば、断片との結合を低減させることが可能なはずである。しかしながら、Ｍ１結合は断片による影響を受けず（図２６）、本発明者らは、別のアッセイでも断片との結合を確認することができなかった（図３８）。第三に、本発明者らは、様々な形態の抗体がどの程度良好に細菌に結合することができるかを確認したいと考えた。本発明者らは、ＩｇＧ全体、Ｆ（ａｂ’）２、および単一ＦａｂとＳＦ３７０との結合を比較した。驚くべきことに、Ａｂ２５単一Ｆａｂは細菌に結合することができなかったが、Ａｂ４９ Ｆａｂは、それらの結合を増加させた（図２７）。後者は、単一Ｆａｂの方が接近し易いため、予想された結果であるが、こうした結果は、Ａｂ２５とＭタンパク質との相互作用の支配的な様式が二重Ｆａｂシス結合であることを明らかにしている。単一Ｆａｂを介した結合がどれほどより弱いかを評価するために、本発明者らは、単一Ｆａｂの親和性測定を実施した。これらは、Ａｂ２５ Ｆａｂ結合が、Ｆ（ａｂ）’２結合（２．３ｎＭ－１、図２８）と比較して、２０００分の１のより低い親和性（４．４ｍＭ－１）を有することを示した。こうした結果は、Ａｂ２５が効果的に結合し、防御機能を発揮するには、二重Ｆａｂシス様式の相互作用が必要であることを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33A】
【図33B】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【配列表】
【国際調査報告】