特表 2023-543232 ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化のための強力な結合剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-13

(54)【発明の名称】ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化のための強力な結合剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/435 20060101AFI20231005BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231005BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231005BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231005BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231005BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231005BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231005BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20231005BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231005BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231005BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20231005BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231005BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20231005BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20231005BHJP

【ＦＩ】

C07K14/435 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/12

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/16

A61K48/00

A61P43/00 111

A61P1/02

A61P1/04

A61P13/08

A61P19/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023519101

(86)(22)【出願日】2021-09-27

(85)【翻訳文提出日】2023-05-23

(86)【国際出願番号】 US2021052192

(87)【国際公開番号】W WO2022067178

(87)【国際公開日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】63/083,544

(32)【優先日】2020-09-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515158308

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100114557

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 英仁

(74)【代理人】

【識別番号】100078868

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 登夫

(72)【発明者】

【氏名】ビーチー，フィリップ エー．

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，ユンシャオ

(72)【発明者】

【氏名】マングリック，アーシッシュ

(72)【発明者】

【氏名】ルー，ワン－ジン

(72)【発明者】

【氏名】ハン，シュオ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA02

4C084CA56

4C084NA14

4C084ZA67

4C084ZA68

4C084ZA81

4C084ZA96

4C084ZC02

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

(57)【要約】

ナノボディの形態で提供され得る、ヘッジホッグ受容体Ｐａｔｃｈｅｄ１に特異的なコンフォメーション特異的抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）が提供される。このナノボディは、Ｐａｔｃｈｅｄ１「スイッチヘリックス」の代替コンフォメーションを安定させることによって、インビトロ及びインビボでヘッジホッグ経路を強力に活性化する。このＡＢＤ又はナノボディは、水溶性であり、すなわち、その活性のための脂質修飾を必要とせず、ヘッジホッグ経路活性化及び治療的使用の機械的研究を容易にする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

優先的に特定のヒトＰＴＣＨ１コンフォメーションに結合し、特定のヒトＰＴＣＨ１コンフォメーションを安定させる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含んでおり、ヘッジホッグシグナル伝達経路を活性化するポリペプチド。

【請求項2】

前記ＡＢＤが、単一可変領域配列である、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記ＡＢＤが、ナノボディである、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記ＡＢＤが、配列番号１０のアミノ酸配列、又はそのバリアントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

配列番号２４のアミノ酸配列、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡ［Ｇ／Ａ／Ｓ／Ｔ／Ｄ］ＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮ［Ｔ／Ｎ］ＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰ［Ｙ／Ｉ］ＲＹ［Ｈ／Ｒ］［Ｇ／Ｒ］ＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳを含む、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項6】

配列番号２３のアミノ酸配列、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＴＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰＩＲＹＲＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳを含む、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項7】

ヒトＦｃ配列に連結された、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項8】

標的化部分に連結された、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記標的化部分が、リンカー配列を介して任意選択で連結されたコラーゲン結合配列を含む、請求項８に記載のポリペプチド。

【請求項10】

前記コラーゲン結合配列が、配列番号２６、ＬＲＥＬＨＬＮＮＮを含む、請求項９に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記標的化部分が、リンカー配列を介して任意選択で連結された繊毛局在化配列及び膜貫通ドメインを含む、請求項８に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記繊毛局在化配列が、配列番号２９、ＬＳＹＲＦＫＱＧＦＲＲＩＬＬＲＰＳＲＲＩＲＳＱＥＰＧＳＧＰＰＥＫＴＥＥＥＥＤＥＥＥＥＥＲＲＥＥＥＥＲＲＭＱＲＧ ＱＥ ＭＮＧＲＬＳＱＩＡＱＡＧＴＳＧＱＱＰＲＰＣＴＧＴＡＫＥＱＱＬＬＰＱＥＡＴＡＧＤＫＡＳＴＬＳＨＬを含む、請求項１１に記載のポリペプチド。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸。

【請求項14】

請求項１３に記載の核酸を含む、核酸ベクター。

【請求項15】

請求項１４に記載のベクター、又は請求項１３に記載の核酸を含む、細胞。

【請求項16】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１４に記載の核酸ベクター、又は請求項１３に記載の核酸を含む、医薬製剤。

【請求項17】

単位用量処方中の、請求項１６に記載の医薬製剤。

【請求項18】

ヘッジホッグシグナル伝達の欠損を治療する方法であって、
それを必要とする個体に、請求項１６又は１７に記載の医薬製剤の有効用量を投与することを含む、方法。

【請求項19】

治療が、舌の味覚受容体細胞の再生を提供する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

治療が、大腸炎の治療を提供する、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

治療が、前立腺肥大における組織の過剰増殖の低減を提供する、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

治療が、糖尿病における骨治癒の加速を提供する、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法で使用するための、キット。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

ヘッジホッグのシグナル伝達は、胚組織のパターン化及び組織の恒常性及び再生の胚後調節において機能する。ヘッジホッグ経路の胎児期後の再生活性は、経路活性化の潜在的な治療上の利点を明確に示唆している。

【0002】

しかしながら、臨床的に試験された経路調節の唯一のモダリティは阻害であり、その開始及び成長が、髄芽細胞腫及び基底細胞がんなどの腫瘍の原発細胞における経路活性化変異に依存する悪性腫瘍に罹患している患者にとって明らかな利益を有する。

【0003】

強力な小分子経路活性化剤の利用可能性にもかかわらず、経路活性化療法に対する臨床的関心の欠如は、そのような全身治療が、間葉の過剰増殖及び複数の臓器における線維症の潜在的な開始又は増悪を引き起こし得るという期待に起因し得る。

【0004】

これらの危険な副作用は、経路活性化を特定の細胞型に制限することによって回避することができる。

【0005】

標的化剤にコンジュゲートされた経路アゴニストは、この目的を果たすが、天然のヘッジホッグタンパク質は、細胞型特異性について操作することが困難である。成熟ヘッジホッグタンパク質は、そのカルボキシ末端上のコレステリル部分、及びそのアミノ末端上のパルミトイル付加物を含む２つの脂質修飾を含有し、これはシグナル伝達活性にとって特に重要である。

【0006】

シグナル伝達における脂質修飾の要件は、組織標的化の大規模な産生、貯蔵、及び更なる誘導体化に課題をもたらす。標的化剤に容易にコンジュゲートされ得る他の合成又は遺伝子コードされたペプチドは、現在欠如している。

【発明の概要】

【0007】

ヘッジホッグシグナル伝達経路を活性化する、優先的に特定のヒトＰＴＣＨ１コンフォメーションに結合し、ＰＴＣＨ１コンフォメーションを安定させる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）に関する組成物及び方法が提供される。ＡＢＤは、ＰＴＣＨ１に特異的に結合し、ＰＴＣＨ１を安定させる１つ以上の可変領域ポリペプチドから構成される。一実施形態では、ＡＢＤは、配列番号２４のポリペプチド、例えば、配列番号１８～配列番号２３を含むが、これらに限定されないナノボディとして提供される。配列番号２３のナノボディは、特別な目的の対象である。他の実施形態では、この配列は、配列番号１～１７のうちのいずれかに記載のポリペプチドを含む。

【0008】

ＡＢＤは、様々なエフェクターポリペプチドに連結、例えば、コンジュゲート又は融合されてもよく、これには、ナノボディ、抗体、並びにその断片及び誘導体が含まれるが、これらに限定されない。実施形態は、ＡＢＤをコードするポリヌクレオチド、ＡＢＤをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ＡＢＤを発現するように操作された細胞、及びＡＢＤを発現するように操作された細胞を含む医薬製剤を含む。ＡＢＤは、組織又は細胞型特異性を有する抗体又は他の薬剤への融合による標的化のために操作することができる。

【0009】

いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、任意のアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡなどのＦｃ配列、例えばヒト免疫グロブリン定常領域、又は単一可変領域ドメイン、例えばナノボディなどを含む、例えばｓｃＦｖとして、免疫グロブリンエフェクター配列に連結された、例えばコンジュゲート又は融合されたポリペプチドとして提供される。

【0010】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるナノボディは、例えば、標的化部分にコンジュゲート又は融合される。標的化部分は、リンカー配列、例えば、ポリペプチドリンカー配列を介してナノボディに連結され得る。この部分は、ナノボディを、特定の臓器、組織、組織コンパートメント、及び目的の細胞型に標的化する。

【0011】

いくつかの実施形態では、標的化部分は、コラーゲン結合ペプチドを含む。多くのコラーゲン結合配列が、当該技術分野において知られており、この目的のための使用を見出す。いくつかの実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩである。いくつかの実施形態では、標的化部分は、配列番号２５を含む。この配列は、ナノボディを間葉系組織に局在させることが示されている。

【0012】

いくつかの実施形態では、標的化部分は、ナノボディを一次繊毛の膜に固定する細胞質尾部を含み、標的化部分は、膜貫通ドメインに連結され得る。繊毛は、スムースンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）を抑制する際の局在化及びパッチド（Ｐａｔｃｈｅｄ）作用の主要な部位であるため、この標的化により、ナノボディはＨｈ経路の特に強力な活性化因子となる。膜繋ぎ止め（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）は更に、（一般的に拡散可能である代わりに）それが発現される細胞にその作用を制限する。これは、ナノボディの発現のために特異的に標的化され得る任意の細胞型、例えば、特定の細胞型への傾向を有するウイルス、又は細胞型特異的プロモーターの制御下での発現によって制限される経路活性化を可能にする。

【0013】

いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、提供される配列のＣＤＲのうちの１つ以上、すなわち配列番号１～２３のアミノ酸配列バリアントを含み、配列番号１０及びそのバリアント、すなわち配列番号１８～２３を含むが、これらに限定されない。バリアントは、ＣＤＲ残基の中又は隣接する１つ以上のアミノ酸挿入、及び／又はＣＤＲ残基の中又は隣接する欠失、及び／又はＣＤＲ残基の置換（置換は、そのようなバリアントを生成するための好ましいタイプのアミノ酸改変である）を含み得る。そのようなバリアントは、通常、結合親和性又はより高い親和性、並びに配列番号２３のエピトープ特異性を有する。特に、配列番号２４に記載されている変異についての残基は、ＡＢＤの親和性を増加させるために有用であることが示されている。

【0014】

いくつかの実施形態では、治療方法が提供される。経路活性化は、化学療法患者において失われるか又は減少することが多い舌の味覚受容体細胞の再生、大腸炎などの疾患の保護又は回復、前立腺肥大における組織の過剰増殖の低減、糖尿病における骨治癒の加速などにおいて治療上の利点を与える。方法は、本明細書に開示されるＡＢＤポリペプチド、例えば配列番号２３を含むナノボディを、必要とするレシピエントに導入することを含むことができる。

【0015】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＢＤを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターが提供され、例えば、配列番号２３を含むナノボディをコードし、コード配列は、所望の細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的又は誘導性であってもよい。様々なベクターは、当該技術分野において既知であり、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、標的細胞ゲノムに組み込まれることができるか、又はエピソーム的に維持されることができるミニサークルベクターなど、この目的のために使用することができる。ベクター及び／又はポリペプチドは、キットにて提供され得る。

【図面の簡単な説明】

【0016】

本発明は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読むと最もよく理解される。慣例に従って、図面の様々な特徴が縮尺通りでないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大又は縮小されている。図面には、以下の図が含まれる。

【0017】

【図1-1】コンフォメーション選択的ナノボディの選択を示す。（Ａ）異なるＲＮＤトランスポーターからの膜貫通４（上から下へ配列番号３１～３４）及び１０（上から下へ配列番号３５～３８）のアライメントである。荷電残基はアスタリスクで示されている。（Ｂ）ナノボディ選択のための工程のフローチャートである。酵母ライブラリを、最初に、ＰＴＣＨ１－ＮＮＱバリアントに結合するクローンについてのＭＡＣＳで濃縮し、次いで、ＮＮＱバリアントを好む集団を、異なる蛍光標識を有するＰＴＣＨ１－ＮＮＱ及びＰＴＣＨ１－ＷＴを使用して、ＦＡＣＳ中で選択した。（Ｃ）ＰＴＣＨ１－ＮＮＱ（ＦＩＴＣ標識）及びＰＴＣＨ１－ＷＴ（Ａｌｅｘａ ６４７標識）で染色された酵母細胞をＦＡＣＳプロットに示す。右下の象限は、ＷＴバリアントよりもＮＮＱバリアントを好む細胞である。ＦＩＴＣフルオロフォアよりもＡｌｅｘａ ６４７フルオロフォアへの非特異的な結合により、二重陽性集団は左上象限に向かってシフトする。（Ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉで発現し、精製したナノボディを、Ｇｌｉ依存性ルシフェラーゼレポーターを用いて、ヘッジホッグ応答性３Ｔ３細胞上で試験した。経路アンタゴニストであるＧＤＣ－０４４９は、ナノボディ１７、２０及び２３がこのアッセイにおいて弱い活性化を示すことを示す対照である。（Ｅ）クローン１７、２０及び２３の初期ナノボディ配列を変異誘発し、酵母ディスプレイにおいて選択して、より高い親和性クローン（親和性成熟）を得た。２ラウンドの親和性成熟後、ＴＩ２３と名付けられた新しいナノボディバリアントは、天然のヘッジホッグリガンドのそれに近い、３Ｔ３細胞中で８．６ｎＭのＥＣ５０を示す。

【図1-2】コンフォメーション選択的ナノボディの選択を示す。（Ｆ）２ラウンドの親和性成熟から得られたＴＩ２３クローンは、ＰＴＣＨ１－ＮＮＱバリアントへの結合の好みを示した。Ｎｂ２３、Ｔ２３又はＴＩ２３を発現する酵母細胞を、１：１のＰＴＣＨ１－ＷＴタグ付きタンパク質Ｃと１Ｄ４のＰＴＣＨ１－ＮＮＱタグ付きタンパク質との混合物とともにインキュベートし、次いで、タンパク質Ｃタグ又は１Ｄ４タグに対する抗体で染色した。これらのビーズは、カッパ鎖の定常領域に結合し、染色に使用される異なる抗体を区別しないため、ＯｎｅＣｏｍｐビーズを非選択的結合の対照として使用した。（Ｇ）ヒト間葉系細胞株ＨＥＰＭにおいて、ＴＩ２３は、ｑＰＣＲによってアッセイするように、ヘッジホッグ応答を活性化し、経路標的、ＧＬＩ１（ＥＣ_５０＝１６．０ｎＭ）及びＰＴＣＨ１（ＥＣ_５０＝１８．５ｎＭ）の転写を誘導した。（Ｈ）ＮＩＨ－３Ｔ３細胞において、ＳｈｈＮｐ及びＴＩ２３は、Ｇｌｉ－ルシフェラーゼアッセイで滴定される。ＳｈｈＮｐ及びＴＩ２３のＥＣ_５０は、それぞれ１．４ｎＭ及び６．９ｎＭであることが決定される。誤差バーは標準偏差を表し、全てのデータポイントは３重の平均値を表す。

【図2】マウスＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体構造の概要を示す。（Ａ）ＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体のクライオ（ｃｒｙｏ－）ＥＭマップは、タンパク質の明確な特徴を示す。ＰＴＣＨ１、バイオレット；ＴＩ２３、黄色である。（Ｂ）Ａと同様に着色したＰＴＣＨ１及びＴＩ２３を有する複合体のタンパク質モデルを示す。マップに見られる脂質様密度は、部位Ｉ～ＩＶにおいてモデル化された。（Ｃ）ＴＩ２３の二次構造要素及び相対位置及び脂質様密度を示すＰＴＣＨ１の概略図である。コンフォメーション変化に関与する主要なヘリックスは、「スイッチヘリックス」として強調表示されている。（Ｄ）ＰＴＣＨ１上のＴＩ２３の結合部位は、ＳＨＨ（ティール（ｔｅａｌ））の結合部位と重なり合う。バイオレットで強調表示されているスイッチヘリックスは、ＴＩ２３のＣＤＲ１及びＣＤＲ３によって挟まれている。（Ｅ、Ｆ）ＴＩ２３ ＣＤＲとＰＴＣＨ１との間の相互作用を詳細に示す。ＣＤＲ１はオレンジ色、ＣＤＲ３は緑色、スイッチヘリックスはバイオレットで着色されている。ＣＤＲ１からの疎水性相互作用は、ｅの膜の上から見られるが、ＣＤＲ３からの水素結合相互作用は、ＦのようにＰＴＣＨ１タンパク質のＥＣＤ２側から見られる。

【図3】ＴＩ２３によって誘導されるコンフォメーション変化を示す。（Ａ）マウスＰＴＣＨ１単独（ＰＤＢ ＩＤ：６ｍｇ８）又はＴＩ２３と複合体中の構造のオーバーレイは、細胞外ドメインにおける２つの主要な変化を示す。ＴＭ７とＴＭ８との間の細胞外ドメイン２は、膜貫通ドメインへのその接続で約５度回転する。細胞外ドメイン１の短いヘリックス（スイッチヘリックス）は、膜に向かって約３２度回転する。ＰＴＣＨ１単独及び複合体中のコンフォメーションは、それぞれポーズ１及び２と称される。（Ｂ）他の公表されたＰＴＣＨ１構造も、また、ポーズ１及び２カテゴリに分類される。他のＰＴＣＨ１構造のこのオーバーレイでは、ポーズ１様構造が赤の色合いで示され、ポーズ２様構造が青の色合いで示される。（Ｃ）スイッチヘリックスの回転は、細胞外ドメイン内の空洞の形状を変化させる。ＰＴＣＨ１構造では、点線（…）によって示されるように、導管は末端にキャップされるが、ＴＩ２３構造では、導管の末端は外側に対して広く開放され、下部は破線（－－－）によって示されるようにスロットルされる。（Ｄ）導管に沿った異なる点における半径がここにプロットされ、変更された部分が２つの垂直線でマークされる。ＴＩ２３結合は、導管の上端を開くが、脂質部位Ｉの下部を閉じる。（Ｅ）部位Ｉにおける脂質様密度の位置は、ＴＩ２３結合とともに変化する。スイッチヘリックスの回転は、結合基質を外側に押し出しながら、侵入経路を閉じている。（Ｆ）ＰＴＣＨ１でトランスフェクションしたＰｔｃｈ１^－／－ＭＥＦでは、精製ＴＩ２３、又はヘッジホッグリガンド（ＳｈｈＮ）を添加した直後に、形質膜内葉（ＩＰＭ）コレステロール活性が増加した。ヘッジホッグリガンドは、ＩＰＭコレステロール活性のわずかに速い増加を引き起こし、約６分後に停滞した。これは、ＴＩ２３が、Ｇｌｉ依存性ルシフェラーゼアッセイにおける飽和濃度で約７５％の最大経路活性を誘導するため、これら２つのリガンドの有効性の差を反映し得る。対照条件において、コレステロール活性は、アッセイの期間にわたって変化しなかった。終点（ｔ＝１０）では、ＴＩ２３又はＳｈｈＮ群におけるコレステロール活性は、緩衝液処置群よりも有意に高い（多重比較のための１－Ｚａ／ＡＮＯＶＡ ＺＬＷＫ ＤＸＱＱｅＷｓ補正、ｐ＜０．０００１）。誤差バーは標準偏差を表す。ＳｈｈＮ又はＴＩ２３の場合、ｎ＝１０であり、バッファ制御のみの場合、ｎ＝５である。

【図4-1】皮膚におけるＴＩ２３活性の検証を示す。（Ａ）マウスにＡＡＶ－ＤＪを注射するか、又は組織学的分析のために皮膚を採取する前に、小分子ＳＡＧ２１ｋで２週間処理した。（Ｈｐｒｔ１に対する）Ｇｌｉ１発現は、ＴＩ２３、ＳｈｈＮ又は小分子ＳＡＧ２１ｋを受けた動物の背側皮膚において活性化され、ＴＩ２３が皮膚内のヘッジホッグ経路を活性化したことを示唆した。平均値及び平均値の標準誤差をプロットした。（Ｂ）背側皮膚の組織学は、対照群の毛包が静止休止期にあることを示唆しているが、毛包は成長し、ＴＩ２３、ＳｈｈＮ、又はＳＡＧ２１ｋ処置で脂肪細胞層に侵入し、成長期の誘導を示す。（Ｃ）ウイルス注射の２週間後に観察される毛の再生は、対照群と比較してＴＩ２３又はＳｈｈＮ処置動物ではるかに加速され、これらの毛包が活性な成長期にあることを示唆している。

【図4-2】皮膚におけるＴＩ２３活性の検証を示す。（Ｄ）背面舌表面の概略図である。生理学的条件下での活動的なヘッジホッグ経路応答を有する細胞は、主に、ＲＮＡＳｃｏｐｅを用いたインサイツハイブリダイゼーションによって示されるように、茸状乳頭（Ｅ）ＴＩ２３誘導Ｇｌｉ１発現内の茸状及び糸状乳頭に位置する舌上皮細胞内に位置する。対照ナノボディ（Ｎｂ４）、ＴＩ２３又はＳｈｈＮをコードするＡＡＶ－ＤＪを受けた動物を、注射の２週間後に屠殺した。経路アゴニストＴＩ２３、ＳｈｈＮ、又は小分子ＳＡＧ２１ｋでは、挿入パネルに示すように、味覚受容体細胞（Ｃｋ８^＋、赤色）を含有する茸状乳頭及び糸状乳頭の両方で、Ｇｌｉ１の発現が増加した。各群について、ｎ＝４である。（Ｆ）Ｇｌｉ１の平均蛍光強度は、茸状及び糸状乳頭の領域間で比較される。Ｔｕｋｅｙの多重比較を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、ＴＩ２３、ＳｈｈＮ、又は小分子ＳＡＧ２１Ｋ、ＧＬＩ１の発現が、対照条件と比較してレベルを上昇させたことを示唆している。＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．００５、＊＊＊；ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊；ｐ＜０．０００１である。茸状領域については、それぞれＮｂ４、ＴＩ２３、ＳｈｈＮ、ＳＡＧ２１ｋについて、ｎ＝５、３、４、４である。糸状領域については、それぞれＮｂ４、ＴＩ２３、ＳｈｈＮ、ＳＡＧ２１ｋについて、ｎ＝５、４、３、５である。

【図5-1】ナノボディの選択を示す。（Ａ）最初のクローンを発現する酵母細胞を、ＦＡＣＳ中に使用した抗体で染色して、ナノボディがＰＴＣＨ１タンパク質に直接結合することを確実にした。（Ｂ）に要約されるように、クローン４、９、及び１５は、抗体への強い結合を示し、したがって、選択中に偽陽性クローンである。次いで、他の全てのクローンを精製し、細菌から発現又は精製することができなかったクローン１３を除いて、細胞上での活性について試験した。（Ｃ）親和性成熟の第１ラウンドのフローチャートである。クローン１７、２０、及び２３からのナノボディ配列を、エラーを起こしやすいＰＣＲで変異誘発し、酵母に形質転換した。ＭＡＣＳでＰＴＣＨ１結合クローンを濃縮した後、酵母細胞をＦＡＣＳ中で選択する。最終ＦＡＣＳ工程において、細胞をＰＴＣＨ１とともに最初にインキュベートして、ナノボディが結合することを可能にし、洗浄後、細胞を親ナノボディタンパク質とともにインキュベートして、細胞表面からＰＴＣＨ１と競合させた。競合追跡の前及び後のＦＡＣＳプロットを（Ｄ）に示す。ＰＴＣＨ１への結合を保持する細胞をＦＡＣＳによって選択した。

【図5-2】ナノボディの選択を示す。（Ｅ）親和性成熟の第２ラウンドのフローチャートである。この配列をワンポット変異誘発で変異誘発し、酵母に形質転換した。ナノボディを発現する酵母細胞を、同様の競合追跡を用いてＦＡＣＳ中で選択した。競合の前後のＦＡＣＳプロットを（Ｆ）に示した。（Ｇ）ラウンド２親和性成熟ライブラリのアミノ酸配列をＭｉＳｅｑで決定し、ここにプロットする。選択は、Ｔ７７Ｎ及びＹ１０２Ｉバリアントに対して濃縮された。（Ｈ）Ｎｂ２３、Ｔ２３、又はＴＩ２３を発現する酵母細胞は、ＰＴＣＨ１－ＮＮＱよりもＰＴＣＨ１－ＷＴに優先的に結合する。全ての抗体に等しくよく結合するＯｎｅＣｏｍｐビーズを対照として使用した。

【図6-1】クライオＥＭデータ検証を示す。（Ａ）タンパク質粒子は、生のクライオＥＭ顕微鏡写真ではっきりと見える。（Ｂ）コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）のパラメータは、このデータセットに対して適切に適合されている。（Ｃ）２Ｄ分類は、ＰＴＣＨ１－ＴＩ２３複合体の明確な見解を明らかにした。（Ｄ）クライオＥＭデータ処理は、こちらのフローチャートに示す。ｃｉｓＴＥＭで行った最後の局所的詳細化工程を除いて、全てのステップをｃｒｙｏＳＰＡＲＣで実施した。

【図6-2】クライオＥＭデータ検証を示す。（Ｅ）粒子の配向は、ここの球形ヒストグラムに示す。ほとんどの粒子は、タンパク質の赤道に沿って配向される。（Ｆ）最終的詳細化のＦＳＣ曲線をここにプロットした。最終マップの分解度は、０．１４３ゴールドスタンダードのＦＳＣによると３．４Åと推定されている。（Ｇ）最終的な再構成の局所解像度は、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣで推定され、ここで３Ｄモデルで示された。ナノボディの一部を除いて、ほとんどの領域は十分に解決された。

【図7】タンパク質モデルの特徴を示す。（Ａ）タンパク質モデルは、クライオＥＭによく適合する。高品質のマップは、アルファヘリカル構造だけでなく、細胞外ドメイン内のベータ鎖の確実なモデリングを可能にする。主要な膜貫通ヘリックス４及び１０における透明な側鎖密度の存在は、主要な荷電トライアド（ｔｒｉａｄ）の相互作用のモデリングを可能にする。（Ｂ）細胞外ドメインに存在する大きな密度は、ＧＤＮによく適合するため、結合したＧＤＮ分子である可能性が高い。（Ｃ）モデルは、モデルマップＦＳＣ曲線によって示されるように、クライオＥＭマップによく適合する。（Ｄ）ＴＭ４とＴＭ１０との間の相互作用は、ＴＩ２３結合マウスＰＴＣＨ１構造（左）と、ＳＨＨ結合ヒトＰＴＣＨ１構造（右、Ｈ１０９９、Ｅ１０９５、及びＤ５１３は、マウス残基Ｈ１０８５、Ｅ１０８１、及びＤ４９９に対応する）との間で異なる。

【図8】ＡｃｒＢとＰＴＣＨ１構造変化の比較を示す。（Ａ）２つの異なる部位（三角形で示され、１つの下部部位は膜面に近く、１つの上部部位は細胞外ドメインの上部出口に近い）は、ＡｃｒＢの３つの異なる構造で交互に開閉する（ＰＤＢ ＩＤ：２ｇｉｆ、Ａ鎖に示されるＬ状態、Ｂ鎖に示されるＴ状態、Ｃ鎖に示されるＯ状態）。（Ｂ）膜の遠位にある単一の部位は、既知のＰＴＣＨ１構造におけるコンフォメーションを変化させる。ＰＴＣＨ１：ＴＩ２３及びＰＴＣＨ１単独（６ｍｇ８）を例としてここに示す。

【図9】（Ａ）ＴＩ２３コラーゲン１（配列番号２６）の構築設計を示し、ＳＰ：シグナルペプチドであり、（Ｂ）上皮及び間葉区画が示された背舌の図表を示す。（Ｃ及びＤ）Ｈｐｒｔハウスキーピング遺伝子に正規化されたＧｌｉ１の相対発現のｑＰＣＲ結果を示す。ＡＡＶをＡＡＶ－ＤＪに包装し、７～８週齢のＦＶＢマウスに軌道後注射によって送達した。なお、コラーゲン１標的配列がないＴＩ２３は、Ｔｉ２３Ｃｏｌ１及びＮＢ４よりも１１．７倍及び１３．５倍高い力価で注射した。ウイルス力価は、マウス１匹当たり注射されたウイルスゲノム（ｖｇ）として示される。ＮＢ４コラーゲン１の場合は７．１ｅ＋０１０ｖｇ／マウス（陰性対照）、ＴＩ２３コラーゲン１の場合は８．２ｅ＋０１０ｖｇ／マウス、ＴＩ２３の場合は９．５７ｅ＋０１１ｖｇ／マウスである。

【図10】上部は、繊毛膜繋ぎ止めＴＩ２３ナノボディの設計を示す。シグナルペプチド（ＳＰ）は、分泌経路標的化のためにＴＩ２３ナノボディのＮ末端に融合され、ＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）の膜貫通ドメインは、ナノボディの細胞表面ディスプレイに使用される。繊毛標的化は、Ｓｓｔｒ３からの繊毛局在化配列をＣＤ８膜貫通ドメインのＣ末端に融合することによって達成される。下部は、繊毛膜繋ぎ止めＴＩ２３の局在化及び活性の検証を示す。繊毛膜繋ぎ止めＴＩ２３をコードするプラスミドは、経路が活性化されたときにＧｌｉプロモーター下でＨ２Ｂ－シトリンレポーターを発現するヘッジホッグ経路活性レポーター細胞株にトランスフェクトした。ｍＣｈｅｒｒｙシグナルは、ＴＩ２３の繊毛局在化を示し、これは、繊毛マーカーアセチル化チューブリンとの共局在化によって証明される。シトリンレポーターは、ＴＩ２３（矢印）を発現する細胞でのみ発現するが、隣接する非トランスフェクト細胞（矢印）では発現せず、繊毛膜繋ぎ止めＴＩ２３による経路活性化が細胞自律的であることを実証する。スケールバー、２０μｍである。

【図11】ＮＩＨ３Ｔ３細胞における二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用した、繊毛膜繋ぎ止めＴＩ２３よる経路活性化の検証を示す。構築物１～４を、Ｇｌｉ－Ｆｉｒｅｆｌｙ／ＳＶ４０－Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ二重レポータープラスミドと別々に共トランスフェクトした。ホタル／Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの相対比は、ヘッジホッグ経路活性化を反映する。繊毛膜繋ぎ止めＴＩ２３（構築物２）は、陰性対照ＧＦＰナノボディ（構築物１）と比較して堅牢な活性化を示す。ＳＡＧ２１ｋは、小分子経路アゴニストである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本開示の実施形態について更に記載する前に、本開示は、記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって無論変動し得ることが理解されるものである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみについて記載することを目的とし、本開示の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことが理解されるものである。

【0019】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。また、本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本開示の類似の実践又は実施形態の試験に使用することができる。

【0020】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「化合物」への参照は、単一の化合物だけでなく、２つ以上の化合物の組み合わせも含み、「置換基」への参照は、単一の置換基並びに２つ以上の置換基などを含む。

【0021】

本発明の説明及び特許請求の範囲において、特定の用語は、以下に記載される定義に従って使用される。本明細書で提供される定義は、互いに排他的であることを意図するものではないことが理解される。したがって、いくつかの化学部分は、２つ以上の用語の定義内に含まれ得る。

【0022】

本明細書で使用される場合、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例えば（ｆｏｒ ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「など」、又は「含む」という語句は、より一般的な主題を更に明確にする例を導入することを意味する。これらの例は、本開示を理解するための補助としてのみ提供され、いかなる様式においても限定を意味するものではない。

【0023】

一般に、タンパク質合成、組換え細胞培養及びタンパク質単離、並びに当該技術分野内の組換えＤＮＡ技術の従来の方法が、本発明で採用される。このような技術は、文献で完全に説明されており、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００１）、Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）を参照されたい。

【0024】

「含む」とは、列挙された要素が組成物／方法／キットにおいて必要であるが、他の要素が、特許請求の範囲内で組成物／方法／キットなどを形成するために含まれ得ることを意味する。

【0025】

「から本質的になる」とは、主題の発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない特定の材料又は工程に記載される組成物又は方法の範囲の限定を意味する。

【0026】

「からなる」とは、特許請求の範囲に特定されていない任意の要素、工程、又は成分の組成物、方法、又はキットからの除外を意味する。

【0027】

本明細書で使用される場合、「ナノボディ」は、抗原に選択的に結合することができる単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である、ｓｄＡｂと称され得る単一ドメイン抗体を指す。ナノボディは、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含み得る。具体的には、本開示のナノボディは、重鎖可変ドメインを含む。ナノボディは、ラクダ科（Ｖ_ＨＨ断片）又は軟骨魚（Ｖ_ＮＡＲ断片）に由来し得る。代替的には、ナノボディは、ＩｇＧからモノマーに二量体可変ドメインを分割することに由来し得る。

【0028】

ナノボディは、主に抗原認識及び結合に関与する可変領域と、フレームワーク領域とを含む。「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれる「可変領域」は、抗原認識に基づいてサイズ及び配列が大きく異なるループを含む。ＣＤＲは、一般に、ナノボディの結合特異性に関与する。ＣＤＲとの違いは、フレームワーク領域である。フレームワーク領域は比較的保存されており、全体的なタンパク質構造を支援する。フレームワーク領域は、βシート及びループ構造からなる大きな溶媒曝露表面を含み得る。当該技術分野において既知であるように、シグナル配列を含むことができ、これは次いで、成熟ナノボディから切断される。

【0029】

本開示は、パッチドに結合し、ヘッジホッグシグナル伝達経路を活性化するナノボディを提供する。ナノボディは、単一可変領域抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む。本明細書で使用される場合、「ＡＢＤ」という用語は、所望の抗原に特異的に結合する可変領域ポリペプチドを指す。ＡＢＤは、本発明において、単一のポリペプチドとして、完全な抗原認識部位及び結合部位を含有する最小断片である。この構造においては、可変ドメインのＣＤＲは、ドメインの表面上の抗原結合部位を定義する。ナノボディの例としては、配列番号１０、及び配列番号１８～２３、特に配列番号２３を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載されるものが挙げられる。

【0030】

抗原に対する親和性の決定は、当該技術分野で既知の方法、例えば、ビアコア測定値などを使用して行うことができる。ナノボディファミリーのメンバーは、約１０^－７～約１０^－１０、約１０^－７～約１０^－９、約１０^－７～約１０^－８、約１０^－８～約１０^－１１、約１０^－８～約１０^－１０、約１０^－８～約１０^－９、約１０^－９～約１０^－１１、約１０^－９～約１０^－１０、又はこれらの範囲内の任意の値が含まれるが、これらに限定されない約１０^－７～約１０^－１１のＫｄを有する同族抗原に対する親和性を有し得る。親和性選択は、例えば、インビトロ又は前臨床モデルにおける活性の生物学的評価、及び潜在的な毒性の評価によって確認され得る。

【0031】

目的の抗原に「結合する」ナノボディ又はＡＢＤは、ナノボディ又は結合分子が、抗原を標的とする際の診断剤及び／又は治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応しないように、十分な親和性で抗原に結合するものである。このような実施形態では、ナノボディ又は他の結合分子の非標的化抗原への結合の程度は、通常、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析又は放射免疫沈降（ＲＩＡ）によって決定されるように、１０％以下である。

【0032】

「機能的」又は「生物学的に活性な」ナノボディ又は抗原結合分子は、構造的、調節的、生化学的又は生物物理的事象において、その天然活性のうちの１つ以上を発揮することができるものである。例えば、機能的ナノボディ又は他の結合分子は、抗原に特異的に結合する能力を有し得、結合は、次に、シグナル伝達又は酵素活性などの細胞又は分子事象を誘発又は変更し得る。

【0033】

「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分で、配列が大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の可変ドメインの結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、可変ドメイン全体に均等に分布しているわけではない。それは超可変領域に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。

【0034】

本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与するアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基、及び／又は「超可変ループ」からのそれらの残基を含み得る。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

【0035】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、それらが望ましい生物学的活性を示す限り、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノマー、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、重鎖のみの抗体、３つの鎖抗体、単鎖Ｆｖ、ナノボディなどを包含し、また、抗体断片を含む（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４－４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、又は他の種に由来し得る。抗体という用語は、全長の重鎖、全長の軽鎖、インタクトな免疫グロブリン分子、又はこれらのポリペプチドのいずれかの免疫学的に活性な部分、すなわち、目的の標的の抗原又はその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチドを指し得る。免疫グロブリンは、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、分類（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又は免疫グロブリン分子のサブ分類（低減又は増強されたエフェクター細胞活性を提供する、改変されたＦｃ部分を有する操作されたサブ分類を含む）であり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。一態様では、免疫グロブリンは、主にヒト由来である。

【0036】

特に反対に示されない限り、本明細書に記載され、特許請求される「コンジュゲート」という用語は、ポリマー分子、標識、細胞傷害性薬剤、標的部分などの１つ以上の追加の分子への１つ以上のナノボディ断片の共有結合によって形成される不均一分子として定義される。例えば、ポリマーは、水溶性であってもよく、すなわち、血液などの生理学的流体に可溶性であり、不均一分子は、任意の構造化凝集体を含まない。目的のコンジュゲートは、ＰＥＧである。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、ナノボディに直接的又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であり得る（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能である基質化合物又は組成物の化学変化を触媒し得る。

【0037】

リンカー。タンパク質のドメインは、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカー、又は非ペプチドリンカーなどによって分離され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、剛性リンカーであり、他の実施形態では、リンカーは、可撓性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２～１００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９個であるが、１００個以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、５～７５、５～５０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、又は５～９個のアミノ酸長である。例示的なリンカーとしては、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒなどの少なくとも２つのアミノ酸残基を有する直鎖ペプチドが挙げられる。好適な直鎖ペプチドとしては、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン、並びにアラニル及び／又はセリニル及び／又はプロリニル及び／又はグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ_９、Ｇｌｕ_９、Ｓｅｒ_９、Ｇｌｙ_５－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ_２－Ｃｙｓ、（Ｇｌｙ_４－Ｓｅｒ）_３、Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ、Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ、及びＧｌｙ９－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ、又は（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎは、１、２、３、４、５などであるが、多くのそのようなリンカーは、当該技術分野で知られ、使用され、この目的に役立ち得る。

【0038】

結合ドメインの連結に使用される化学基としては、当該技術分野で既知のように、カルバミン酸、アミド（アミン＋カルボン酸）、エステル（アルコール＋カルボン酸）、チオエーテル（ハロアルカン＋スルフヒドリル、マレイミド＋スルフヒドリル）、シフ塩基（アミン＋アルデヒド）、尿素（アミン＋イソシアネート）、チオ尿素（アミン＋イソチオシアネート）、スルホンアミド（アミン＋塩化スルホニル）、ジスルフィド、脂質などが挙げられる。

【0039】

膜貫通ドメイン。本開示のタンパク質は、表面ドメインを細胞内細胞質ドメインと結合する膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、真核細胞膜内で熱力学的に安定な任意のポリペプチド配列から構成される。膜貫通スパニングドメインは、天然に生じる膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインに由来し得るか、又は合成され得る。合成膜貫通ドメインの設計においては、アルファヘリカル構造に有利なアミノ酸が好ましい。膜貫通ドメインは、アルファヘリカル二次構造を有する形成に有利な約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２２、２３、２４、又はそれ以上のアミノ酸から構成され得る。アルファヘリカルコンフォメーションに有利なアミノ酸は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ７５：４２２－４２７を参照されたい。アルファヘリカルコンフォメーションで特に有利なアミノ酸としては、メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタメート、及びリジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、限定されないが、配列番号２８を含むＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８などのＩ型膜貫通タンパク質由来の膜貫通ドメインに由来し得る。

【0040】

本明細書で使用される「標的化部分」は、治療の意図された標的に結合することができる、すなわち、「の結合パートナー」に結合することができ、目的の細胞又は組織に局在することができる任意の部分などである。例えば、標的化部分は、標的が細胞受容体である場合には、受容体リガンドであり得る。いくつかの実施形態では、標的化部分は、抗原結合ドメインであり、他の実施形態では、より短いポリペプチド配列が好ましく、標的化部分の他の例は、当該技術分野において知られており、アプタマー、アビマー、受容体結合リガンド、核酸、ビオチン－アビジン結合対、結合ペプチド又はタンパク質などのように、使用され得る。いくつかの実施形態では、標的化部分は、リンカーペプチドを介して本明細書に開示されるナノボディに連結される。

【0041】

標的化部分は、コラーゲン結合ペプチド、ＲＧＤモチーフを有するインテグリン結合ペプチド、繊毛局在化配列（配列番号２９）などを含むがこれらに限定されない、目的の細胞表面分子に結合するペプチドであり得る。コラーゲン結合ペプチドとしては、例えば、（配列番号２６）、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ（配列番号３０）などのフィブロネクチンコラーゲン結合配列、又は当該技術分野で既知の他のものが挙げられ、例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｆａｒｎｄａｌｅ（２０１９）Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６３（３）：３３７－３４８を参照されたい。いくつかの実施形態では、標的化部分は、それ自体が、所望の細胞型又は細胞外区画に結合するナノボディ又は一本鎖抗体である。

【0042】

２つの配列間の「相同性」は、配列同一性によって決定される。互いに比較される２つの配列が長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチド残基と同一である、より短い配列のヌクレオチド残基のパーセンテージに関する。配列同一性は、従来、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）などのコンピュータプログラムを使用して決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２（１９８１），４８２－４８９の局所ホモロジーアルゴリズムを利用して、２つの配列間で最も高い配列同一性を有する断片を見つける。特定の配列が例えば本発明の参照配列と９５％の同一性を有するか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔ又は別の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータは、好ましくは、同一性のパーセンテージが参照配列の全長にわたって計算され、参照配列中のヌクレオチドの総数の最大５％の相同性ギャップが許可されるように調整される。Ｂｅｓｔｆｉｔを使用する場合、いわゆるオプションパラメータは、プリセット（「デフォルト」）値のままであることが好ましい。本発明の所与の配列と上記の配列との比較において現れる偏差は、例えば、付加、欠失、置換、挿入、又は組換えによって引き起こされ得る。このような配列比較は、好ましくは、プログラム「ｆａｓｔａ２０ｕ６６」（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ｕ６６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９８ ｂｙ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３，６３－９８、追加された実施例及びｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／も参照のこと）を用いて実施することもできる。この目的のために、「デフォルト」パラメータ設定が使用され得る。

【0043】

「バリアント」は、天然配列ポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常、アミノ酸配列バリアントは、少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の相同性を配列によって有し、例えば、参照アミノ酸配列内のある特定の位置で１、２、３、４、又はそれ以上のアミノ酸置換、付加、又は欠失を有する。

【0044】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図されている。１つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡ断片がライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡ断片は、ウイルスゲノム内にライゲーションされてもよい。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。更に、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術における有用性の発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、互換的に使用され得る。

【0045】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」（又は「組換え宿主細胞」）という用語は、組換えプラスミド又はベクターなどの外因性ポリヌクレオチドの導入によって遺伝的に改変された、又は遺伝的に改変され得る細胞を指すことが意図される。そのような用語は、本発明の特定の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されていることを理解されたい。ある特定の修飾は、変異又は環境の影響のいずれかのために後続の世代で発生し得るため、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではなくてもよいが、依然として、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。

【0046】

「結合親和性」は、概して、分子（例えば、ナノボディ又は他の結合分子）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原又は受容体）との間の非共有結合性相互作用の合計の強さを指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は、抗原（又は受容体）に弱く結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、抗原（又は受容体）により強く結合し、より長く結合したままである。

【0047】

一実施形態では、親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、ビアコアシステムによって使用されるものによって決定される。別の分子に対する１つの分子の親和性は、相互作用の結合動態を、例えば、２５℃で測定することによって決定される。

【0048】

「活性剤」、「アンタゴニスト」、「阻害剤」、「薬物」、及び「薬理学的に活性な薬剤」という用語は、生物（ヒト又は動物）に投与されると、局所及び／又は全身作用によって所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を誘導する化学物質又は化合物を指すために本明細書で互換的に使用される。

【0049】

本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」などの用語は、所望される薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に又は部分的に予防するという点では予防的であり得、かつ／あるいは疾患及び／若しくは疾患に起因する有害作用に対する部分的又は完全な治癒という点では治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用される場合、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療をカバーし、（ａ）疾患又は疾患の症状が疾患の素因であり得るが、それを有するとまだ診断されていない対象（例えば、原発性疾患に関連付けられ得るか又はそれによって引き起こされ得る疾患を含む）において発生することを防止することと、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発達を阻止することと、（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすこととを含む。

【0050】

「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、限定されないが、サル及びヒトを含むヒト及び非ヒト霊長類、ラット及びマウスを含むげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、鳥類などを含む動物を指す。「哺乳類」は、任意の哺乳類種の１つ又は複数のメンバーを意味し、例として、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、げっ歯類など、並びに霊長類、例えば非ヒト霊長類及びヒトを含む。非ヒト動物モデル、例えば、哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ネズミ科、ウサギ目などが、実験的調査に使用され得る。

【0051】

本明細書で使用される場合、「決定する」、「測定する」、「評価する」、及び「アッセイする」という用語は、互換的に使用され、定量的及び定性的決定の両方を含む。

【0052】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、コードされた及びコードされていないアミノ酸、化学的若しくは生化学的に修飾された、又は誘導されたアミノ酸、並びに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語は、異種のアミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する、又は有さない、異種及び天然のリーダー配列を有する融合、免疫学的にタグ付けされたタンパク質、検出可能な融合パートナー、例えば、蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む、融合パートナーを有する融合タンパク質などを含むが、これらに限定されない、融合タンパク質を含む。

【0053】

「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はそのアナログのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知又は未知の任意の機能を実行し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転写ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。核酸分子は、直鎖状であっても環状であってもよい。

【0054】

「治療有効量」又は「有効量」は、疾患、状態、又は障害を治療するために哺乳類又は他の対象に投与されると、疾患、状態、又は障害に対するそのような治療に効果を与えるために十分である化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重などに応じて変動する。

【0055】

本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒト及び動物対象のための単位投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルと関連して所望の効果を生じるために十分な量で計算された所定の量の化合物を含有する。単位剤形の仕様は、使用される特定の化合物及び達成される効果、並びに宿主内の各化合物に関連する薬力学に依存する。

【0056】

「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容される担体」、及び「薬学的に許容されるアジュバント」は、薬学的組成物の調製において有用であり、一般に安全であり、非毒性であり、生物学的にもその他においても望ましい、賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントを意味し、獣医学的使用並びにヒト薬学的使用において許容される賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントを含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用される「薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバント」は、１つの、及び２つ以上のそのような賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントの両方を含む。

【0057】

本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」は、哺乳類、特にヒトなどの対象への投与に好適な組成物を包含することを意味する。概して、「薬学的組成物」は、無菌であり、好ましくは、対象内で望ましくない応答を誘発することが可能な汚染物質を含まない（例えば、薬学的組成物中の化合物は、医薬グレードである）。薬学的組成物は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内、筋肉内、皮下などを含むいくつかの異なる投与経路を介して、治療を必要とする対象又は患者への投与のために設計され得る。

【0058】

使用方法
ナノボディは、予防的及び治療的目的の両方に有用である。したがって、本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、疾患の予防、及び既存の状態の治療の両方を指すために使用される。特定の例では、予防は、疾患又は状態を発症するリスクがあると特定された患者における、疾患又は状態の発症の阻害又は遅延を示す。患者の臨床症状を安定化させるか又は改善するための、進行中の疾患の治療は、本発明によって提供される特に重要な利益である。そのような治療は、罹患組織における機能喪失の前に行われることが望ましく、その結果、本発明によって提供される予防的治療的利益もまた重要である。治療効果の証拠は、疾患の重症度の任意の減少であり得る。治療効果は、臨床成績の観点から測定することができるか、又は免疫学的又は生化学的試験によって決定することができる。治療のための患者は、哺乳動物、例えば、ヒトを含む霊長類であってもよく、実験動物、例えば、ウサギ、ラット、マウスなどであってもよく、特に、治療法、ウマ、イヌ、ネコ、農場動物などの評価のためであってもよい。

【0059】

治療製剤、例えば、薬学的組成物の投薬量は、状態の性質、投与頻度、投与方法、宿主からの薬剤のクリアランスなどに応じて大きく異なる。特定の実施形態では、初回用量は、より多い維持用量、続いて、より少ない維持用量であってもよい。ある特定の実施形態では、用量は、有効な用量レベルを維持するために必要に応じて、毎週又は隔週、又はより頻繁により少ない用量に分画して投与し、毎日、半週、又は他の方法で投与することができる。

【0060】

本発明のいくつかの実施形態では、ナノボディを含む組成物又は製剤の投与は、局所投与によって行われる。本明細書で使用される場合、局所投与は、局所投与を指し得るが、治療部位での体内への注射又は他の導入も指す。このような投与の例としては、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射などが挙げられる。他の実施形態では、ナノボディを含む組成物又は製剤は、全身的に、例えば、経口的に又は静脈内に投与される。一実施形態では、ナノボディを含む製剤の組成物は、注入、例えば、一定期間、例えば、１０分、２０分、３分、１時間、２時間、３時間、４時間以上にわたる連続注入によって投与される。味覚受容体細胞の再生のために、更に、舌への局所適用、例えば、マウスウォッシュ、舌上に配置されるフィルムへの組み込みなどがあり得る。大腸炎の治療には、例えば、坐剤法があり得る。前立腺の過成長のために、例えば、経尿道送達、前立腺組織への注射などがあり得る。

【0061】

本発明のいくつかの実施形態では、組成物又は製剤は、活性の急速で有意な増加を得るために、短期間、例えば、１回の投与、又は一連の投与、例えば、１、２、３日以上、最大１又は２週間にわたって実施される。投与される用量の大きさは、医師によって決定されなければならず、疾患の性質及び重症度、患者の年齢及び健康状態、並びに薬物自体に対する患者の耐性などのいくつかの要因に依存する。

【0062】

本発明のある特定の方法において、ナノボディを含む組成物の有効量は、例えば、所望の効果を達成するために、細胞をその組成物の有効量と接触させることによって、細胞に提供される。特定の実施形態では、接触は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで生じる。特定の実施形態では、細胞は、増加したヘッジホッグシグナル伝達を必要とする対象に由来するか、又はそれに存在する。

【0063】

他の実施形態では、本明細書に開示されるナノボディをコードする核酸組成物は、所望の細胞内でポリヌクレオチドを発現するために、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ＣＲＩＳＰＲ標的化などを使用して、細胞に提供される。

【0064】

本発明のいくつかの方法では、細胞内のヘッジホッグシグナル伝達を増強するために、有効量の本発明の組成物が提供される。生化学的に言えば、ナノボディの有効量又は有効用量は、ナノボディの非存在下でのシグナル伝達と比較して、細胞内のヘッジホッグシグナル伝達を、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％増加させる量である。細胞の活性の調節の量は、当業者に既知のいくつかの方法によって決定され得る。

【0065】

臨床的意味では、ナノボディ組成物の有効用量は、対象に好適な期間、例えば、少なくとも約１週間、場合によっては約２週間、又はそれ以上、最大約４週間、８週間、又はそれ以上の期間投与されると、シグナル伝達の欠如に関連する症状の変化を証拠とする用量である。いくつかの実施形態では、有効用量は、疾患状態の進行を遅らせる又は停止させるだけでなく、状態の逆転を誘発し得る。当業者は、初回用量がそのような期間にわたって投与されてもよく、続いて維持用量が投与されてもよく、維持用量は、場合によっては、減少した用量で投与されることを理解する。

【0066】

投与されるナノボディ組成物の有効量又は有効用量の計算は、当業者の技術範囲内であり、当業者には日常的である。言うまでもなく、投与される最終量は、投与経路及び治療される障害又は状態の性質に依存する。

【0067】

主題の方法で使用するために好適な細胞は、１つ以上のＦｚｄ受容体を含む細胞である。接触させる細胞は、インビトロ、すなわち、培養中であってもよく、又はインビボ、すなわち、対象中であってもよい。細胞は、任意の生物に由来してもよく、好ましくは、ヒト、家畜及び農場動物、並びにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、フルーツフライ、ワームなどの動物園の動物、実験室の動物、又はペット動物を含む哺乳類に由来する。好ましくは、哺乳類は、ヒトである。細胞は、任意の組織由来であり得る。細胞は、凍結され得るか、又はそれらは、新鮮であり得る。それらは、初代細胞であり得るか、又は細胞株であり得る。多くの場合、細胞は、レシピエントに導入する前に、インビボで使用されるか、又はエクスビボで処理される初代細胞である。

【0068】

インビトロでの細胞は、当該技術分野でいくつかの周知の方法のうちのいずれかによって、ナノボディを含む組成物と接触させてもよい。例えば、組成物は、本発明の細胞が培養されている培地中の細胞に提供され得る。ナノボディをコードする核酸は、それらの取り込み、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、及びリポフェクションを促進するための当該技術分野において周知の条件下で、主題細胞又はベクター上で主題細胞と共培養された細胞に提供され得る。代替的には、ナノボディをコードする核酸は、本発明の細胞に、又はウイルスを介して本発明の細胞と共培養された細胞に提供され得る、すなわち、細胞は、ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルス粒子と接触される。レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、非分裂細胞をトランスフェクトするために使用することができるため、本発明の方法に特に好適である（例えば、Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９５（２０）：１１９３９－４４を参照されたい）。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠陥」であり、すなわち、生産的な感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株における成長を必要とする。

【0069】

治療用量は、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重、及び約１０ｍｇ／ｋｇ体重以下であり得る。当業者は、このようなガイドラインが、活性剤の分子量、例えば、タンパク質コンジュゲート、例えば、ペグ化タンパク質の使用に合わせて調整されることを理解する。投薬量は、局所投与、例えば、鼻腔内、吸入など、又は全身投与、例えば、ｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．などによっても変化し得る。

【0070】

同様に、細胞は、対象へのペプチド、低分子、又は核酸の投与のための当該技術分野におけるいくつかの周知の方法のうちのいずれかによって、本発明のナノボディ組成物とインビボで接触させてもよい。ナノボディ組成物は、天然のヘッジホッグタンパク質の製剤化に必要とされるように、いくつかの実施形態では、洗剤、リポソームなどの非存在下で製剤化される様々な製剤又は薬学的組成物に組み込むことができる。

【0071】

いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、病気の若しくは損傷した組織の治療に使用するために、組織再生に使用するために、かつ細胞成長及び増殖に使用するために、かつ／又は組織工学に使用するために投与される。特に、本発明は、組織の再生若しくは修復、又は他の病理学的状態で使用するための、本発明によるポリヌクレオチドをコードするナノボディ又はナノボディを提供する。

【0072】

本発明の組成物による治療のための目的の条件としては、再生細胞成長が所望されるいくつかの条件が挙げられるが、これらに限定されない。そのような状態には、例えば、骨の成長又は再生、例えば、骨の再生、骨移植片、骨折の治癒など、味覚受容体の再生、大腸炎又は粘膜炎の治療などが含まれ得る。

【0073】

強化された骨の成長が所望される条件としては、骨折、移植片、人工装具周辺の内向性増殖などが挙げられ得るが、これらに限定されない。ナノボディは、骨の治癒の増強において用途を見出す。多くの臨床状況では、骨修復状態は、骨形成細胞の活性の低下、例えば、高齢者、外傷後、骨形成不完全性などのために理想的ではない。様々な骨及び軟骨障害が高齢者に影響を及ぼす。このような組織は、通常、間葉系幹細胞によって再生される。このような状態には、変形性関節症が含まれる。骨修復を加速する方法において、本発明の薬学的組成物は、骨への損傷、例えば、外傷に続く損傷に罹患している患者に投与される。製剤は、好ましくは、骨再生を必要とする損傷の後、外傷部位又はその付近で投与される。代替的方法では、骨への損傷に罹患している患者に、骨髄細胞、例えば、間葉系幹細胞、骨髄細胞に分化することができる骨髄細胞などを含む組成物を提供する。骨髄細胞は、再生を増強するために十分な用量で、薬学的組成物又はタンパク質でエクスビボで処理されてもよい。

【0074】

他の実施形態では、本発明の組成物は、味覚受容体組織の再生に使用される。本発明の組成物は、例えば、注入、マトリックス又は他のデポシステム、又は再生の増強のための舌への他の局所適用において使用することができる。

【0075】

様々な表皮症状は、例えば、胃腸管を覆う急速に分裂した上皮細胞の破壊があり、組織を潰瘍化及び感染にさらされ、例えば、大腸炎、粘膜炎などにつながる場合など、本発明の化合物による治療が有益である。粘膜又は粘膜（ｍｕｃｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）としても知られる粘膜組織は、呼吸器及び消化管などの空気と通信する全ての身体通路を並べ、粘液を分泌する細胞及び関連腺を有する。口腔粘膜と呼ばれる、口を覆うこのライニングの部分は、体の最も敏感な部分のうちの１つであり、特に化学療法及び放射線に対して脆弱である。

【0076】

いくつかの実施形態では、毛髪再生を促進するための経路活性化を伴う、脱毛の治療方法が提供され（例えば、Ｐａｌａｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２５：６３８－６４６，２００５を参照されたい）、そのような実施形態では、送達は、例えば、経皮パッチ又はマイクロニードル送達によって達成され得る。

【0077】

非侵襲性高リスク膀胱がんの治療では、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ，ｂｏｖｉｎｅ ＴＢ）の膀胱への注入方法が知られている。いくつかの実施形態では、本発明のＡＢＤのコード配列は、発現及び分泌のために、これらの細菌に導入される。Ｈｈ経路活性化は、非侵襲的形態から致死的侵襲的形態への膀胱がんの進行を抑制する（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １４、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １７を参照されたい）。

【0078】

患者は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳類）であり得る。典型的には、患者は、ヒトである。本発明の代替物又は本発明の代替物を含む化合物若しくは組成物の治療方法及び医療用途は、組織再生を促進する。

【0079】

いくつかの実施形態では、本発明は、前述のように、２つ以上のナノボディが動物又は患者に同時に、連続して、又は別々に投与される、治療方法及び医療用途を提供する。

【0080】

いくつかの実施形態では、本発明は、前述のような治療方法及び医療用途を提供し、本発明の１つ以上のナノボディは、１つ以上の更なる化合物又は薬物と組み合わせて動物又は患者に投与され、該ナノボディ及び該更なる化合物若しくは薬物は、同時に、連続して、又は別々に投与される。

【0081】

本発明のナノボディは、また、非治療的方法、例えば、インビトロ研究方法において広範な用途を有する。

【0082】

発現の構築物。本発明の方法では、ナノボディは、組換え方法によって産生され得る。アミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡコード配列に適切なヌクレオチド変化を導入することによって調製される。シグナル配列は、ナノボディの分泌のために含まれ得る。このようなバリアントは、アミノ酸配列の一方又は両方の末端内の、又はその末端で、残基の挿入、置換、及び／又は指定された欠失を表す。挿入、置換、及び／又は指定された欠失を任意に組み合わせて、最終構築物に到達するが、最終構築物は、本明細書に定義される所望の生物学的活性を有することを条件とする。アミノ酸の変化は、また、グリコシル化部位の数又は位置の変化、膜固定特性の変化、及び／又はポリペプチドのリーダー配列の挿入、欠失、又はそれ以外の方法での影響を受けることによって、ポリペプチドの翻訳後プロセスを変更し得る。

【0083】

発現のために、ナノボディをコードする核酸を複製可能なベクターに挿入することができる。多くのそのようなベクターが利用可能である。ベクター成分としては、一般に、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。

【0084】

発現ベクターは、宿主生物によって認識され、ナノボディコード配列に作動可能に連結されるプロモーターを含有する。プロモーターは、それらが作動可能に連結される特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列である（一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）。そのようなプロモーターは、典型的には、誘導性及び構成性の２つの分類に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件のいくらかの変化、例えば、栄養素の有無又は温度の変化に応答して、それらの制御下のＤＮＡから増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。

【0085】

原核宿主との使用に好適なプロモーターとしては、β－ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、並びにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも好適である。そのようなヌクレオチド配列が公開されており、それによって、当業者がそれらをＤＮＡコード配列に作動可能にライゲーションすることを可能にする。細菌系で使用するためのプロモーターは、また、コード配列に作動可能に連結されたシャインダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。

【0086】

プロモーター配列は、真核生物について知られている。酵母宿主とともに使用するための好適な促進配列の例としては、３－ホスホグリセラートキナーゼ、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセラート変異酵素、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼなどの他の糖酵素のプロモーターが挙げられる。増殖条件によって制御される転写の更なる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、アイソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現で使用するための好適なベクター及びプロモーターは、ＥＰ７３，６５７に更に記載されている。酵母エンハンサーは、また、酵母プロモーターと有利に使用される。

【0087】

哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鳥痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス（マウス幹細胞ウイルスなど）、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーターによって、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）又は免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから制御され得るが、このようなプロモーターは宿主細胞系と互換性がある。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる。

【0088】

高等真核生物による転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。エンハンサーは、通常約１０～３００ｂｐのＤＮＡのシス作用エレメントであり、プロモーターに作用して、その転写を増加させる。エンハンサーは、イントロン内、並びにコード配列自体内で、転写単位に対して５’及び３’であることが見出されているため、相対的に配向及び位置に依存しない。現在、多くのエンハンサー配列が、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリン）から知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例えば、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列に５’又は３’の位置で発現ベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。

【0089】

真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の核細胞）で使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有し得る。このような配列は、真核生物又はウイルスＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの５’及び場合によっては３’の非翻訳領域から一般的に入手可能である。

【0090】

上記の構成要素のうちの１つ以上を含有する好適なベクターの構築は、標準的な技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を、所望の形態で切断、調整、及び再ライゲーションして、必要なプラスミドを生成することができる。構築されたプラスミドにおける正しい配列を確認するための分析のために、ライゲーション混合物を使用して宿主細胞、必要に応じてアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって選択される成功した形質転換体を形質転換する。形質転換体からのプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析し、及び／又は配列決定する。

【0091】

本明細書のベクターにおけるＤＮＡのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的のための好適な原核生物としては、例えば、Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ又はＧｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｓｍｓなどのｅｕｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、並びにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの例は、限定ではなく例示である。

【0092】

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、好適な発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は一般的なパン酵母は、下部真核生物宿主微生物の間で最も一般的に使用される。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎ、及びＡ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓホストなどの糸状菌などの多数の他の属、種、及び株が、本明細書で一般的に入手可能であり、有用である。

【0093】

綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、ある種の細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとのインキュベーションによってトランスフェクトされる。そのような植物細胞培養物のインキュベーション中に、ＤＮＡコード配列は、それがトランスフェクトされるように植物細胞宿主に移され、適切な条件下でＤＮＡを発現する。加えて、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列などの植物細胞に適合した調節配列及びシグナル配列が利用可能である。

【0094】

有用な哺乳類宿主細胞株の例は、マウスＬ細胞（Ｌ－Ｍ［ＴＫ－］、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－２６４８）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚性腎臓株（浮遊培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファロー肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）である。

【0095】

宿主細胞は、ナノボディ産生のための上記の発現ベクターでトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修飾された従来の栄養培地中で培養される。哺乳類宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコの改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に好適である。これらの培地のうちのいずれかに、必要に応じて、ホルモン及び／若しくは他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質、微量元素、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充してもよい。任意の他の必要な補充物も、また、当業者に既知の適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかである。

【0096】

本発明は、完全に説明されているが、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができることは、当業者には明らかである。

【0097】

実験
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が行われる全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に対する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別様に示されない限り、部とは重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。

【0098】

本明細書で引用される全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0099】

本発明は、本発明の実施のための好ましいモードを含むように、本発明者によって見出されるか、又は提供される特定の実施形態に関して説明されている。当業者は、本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態で多数の修正及び変更を行うことができることを理解されたい。例えば、コドン冗長性のために、タンパク質配列に影響を与えることなく、基礎を成すＤＮＡ配列に変更を行うことができる。生物学的機能等価性の考慮によって、種類又は量で生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造に変更を行うことができる。このような修正は全て、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

【0100】

実施例１
パッチドステロール導管のナノボディ媒介コンフォメーション遮断によるヘッジホッグ経路活性化
ヘッジホッグ経路の活性化は、改善された骨治癒、味覚受容体細胞再生、及び大腸炎又は他の状態の緩和のための治療的価値を有する。しかしながら、全身経路活性化は有害であり得、治療的適用のための組織標的化に適した薬剤が欠如している。我々は、ヘッジホッグ受容体Ｐａｔｃｈｅｄ１に対するコンフォメーション特異的ナノボディである新規アゴニストを開発した。このナノボディは、我々のクライオＥＭ構造で明らかになったように、Ｐａｔｃｈｅｄ１「スイッチヘリックス」の代替コンフォメーションを安定させることによって、インビトロ及びインビボでヘッジホッグ経路を強力に活性化する。ナノボディ結合は、その輸送サイクルの一段階でＰａｔｃｈｅｄを捕捉しやすいため、Ｐａｔｃｈｅｄ１ステロール導管を通る基質の移動を防止する。天然のヘッジホッグリガンドとは異なり、このナノボディは、その活性のために脂質修飾を必要とせず、ヘッジホッグ経路活性化の機械的研究及び治療的使用のための経路活性化剤の操作を容易にする。我々のコンフォメーション選択的ナノボディアプローチは、一般に、他のＰＴＣＨ１相同体の研究に適用可能である。

【0101】

ヘッジホッグの主な受容体は、Ｐａｔｃｈｅｄ１（ＰＴＣＨ１）であり、下流のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）様タンパク質であるスムースンド（ＳＭＯ）を抑制することによって経路静止を維持する。ヘッジホッグに結合すると、ＰＴＣＨ１は不活性化され、ＳＭＯが活性化し、下流のシグナル伝達事象を作動することを可能にする。機械的には、ＳＭＯの活性化にはステロールの結合が必要であり、おそらく、形質膜内葉から７ＴＭバンドルに入る。ＰＴＣＨ１は、形質膜内葉からステロールを輸送することによってＳＭＯ活性化を防止し、それによってＳＭＯの活性化ステロールへのアクセスを制限することが提案されている。この輸送活性には、ＰＴＣＨ１細胞外ドメインを通る疎水性導管が必要であり、ヘッジホッグはこの導管を遮断し、その必須アミノ末端パルミトイル付加物を挿入することによってＰＴＣＨ１を不活性化する。トランスポーターは、典型的には、コンフォメーション変化の繰り返しのサイクルを通過することによって作用する。ＰＴＣＨ１輸送機能がそのような立体構造サイクルを用いる場合、優先的に特定のＰＴＣＨ１コンフォメーションに結合し、ＰＴＣＨ１コンフォメーションを安定させる薬剤は、その立体構造サイクル及び輸送活性を破壊することが期待され、したがって、ＳＭＯの活性化を可能にする。したがって、このような薬剤は、脂質修飾を省略可能にし、ＰＴＣＨ１作業サイクル中に生じるコンフォメーション変化に光を当てることができる経路調節物質として機能し得る。

【0102】

結果
経路を活性化するコンフォメーション特異的ナノボディの開発。ナノボディは、特定のＧＰＣＲタンパク質コンフォメーションを安定させるために使用されている一本鎖抗体断片であり、遺伝子工学に適している。我々は、ＰＴＣＨ１に対するコンフォメーション特異的ナノボディを選択するための合成酵母ディスプレイライブラリを出発点として選択した。コンフォメーション特異的ナノボディを選択するために、我々はまず、その膜貫通ドメイン内に埋め込まれた３つの酸性残基（Ｄ４９９Ｎ、Ｄ５００Ｎ、Ｅ１０８１Ｑ、ＰＴＣＨ１－ＮＮＱと称される）を改変することによって、ＰＴＣＨ１にコンフォメーションバイアスを導入した。これらの酸性残基は、ＲＮＤトランスポーターファミリー内で保存され、ステロール輸送及びＳＭＯ調節におけるＰＴＣＨ１活性に必要であり、カチオン流入に応答してＲＮＤトランスポーターのコンフォメーション変化を駆動することがより一般的に提案されている（図１Ａ）。したがって、我々は、ＰＴＣＨ１中のこれらの残基の変化が、その立体配座状態の相対的表現に影響を与える可能性があると推論した。

【0103】

酵母ディスプレイライブラリからのナノボディクローンの選択のために精製されたＰＴＣＨ１－ＮＮＱ変異型タンパク質を使用した。ＰＴＣＨ１－ＮＮＱ結合酵母クローンの数ラウンドの濃縮の後、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）、並びに異なる蛍光団に結合した抗体で標識された野生型及びＮＮＱ ＰＴＣＨ１タンパク質を使用して、優先的にＰＴＣＨ１－ＮＮＱに結合するナノボディを選択した（図１Ｂ）。優先的に結合したナノボディを発現する酵母細胞は、ＦＡＣＳプロットの対角線外に集団を形成する（図１Ｃ）。ＮＮＱを好む集団においてナノボディ発現酵母細胞を選択した後、１５個の独自のクローンをシークエンシングによって同定し、そのうちの３個は、選択中に使用される抗体に直接結合するために廃棄された（図５Ａ、Ｂ）。ＰＴＣＨ１及びＰＴＣＨ１－ＮＮＱは、膜貫通ドメイン内の酸性残基においてのみ異なるため、ナノボディ結合の差異は、ＰＴＣＨ１とＰＴＣＨ１－ＮＮＱとの間のコンフォメーション状態の差異に起因する可能性が最も高い。

【0104】

特定のＰＴＣＨ１コンフォメーションの安定化は、その輸送活性を不活性化し、ヘッジホッグ経路における下流応答を可能にすると予測される。したがって、我々は、Ｇｌｉ依存性ルシフェラーゼアッセイを使用して、３Ｔ３－Ｌｉｇｈｔ２細胞上で精製されたナノボディタンパク質の活性を試験した。クローン１７、２０、及び２３は、弱い活性化効果を示した（図１Ｄ）。我々は、最初に、エラーが起こりやすいＰＣＲライブラリ（図５Ｃ、Ｄ）から選択し、次いで、ワンポット変異誘発（図５Ｅ、Ｆ）を使用して、相補性決定領域（ＣＤＲ）を標的とするライブラリから選択することによって、２ラウンドの親和性成熟を通じてシグナル伝達力を増強した。親和性成熟の第１ラウンドでは、クローン２３（配列番号１０）（「ＮＢ２３」）に由来する一連のナノボディクローンが得られ、ＣＤＲ３中のＨ１０５Ｒ、Ｇ１０６Ｒ置換、及びＣＤＲ２中のＧ５０でのいくつかのバリアント残基が得られた。これらのバリアントのうち、Ｇ５０Ｔ置換（Ｔ２３と名付けられた）のみが、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製のために発現され得る。Ｔ２３は、そのＮｂ２３親よりもＧｌｉ依存性ルシフェラーゼアッセイにおいて優れた効力を示し（図１Ｅ）、全てのＣＤＲ残基がワンポット変異誘発において系統的にランダム化された、親和性成熟の第２ラウンドの開始配列として使用された。ＰＴＣＨ１結合に基づく選択後、ＣＤＲ３中のＹ１０２Ｉを濃縮し、意図しない置換であるＴ７７Ｎを濃縮した（図５Ｇ）。「ＴＩ２３」（配列番号２３）と名付けられたこのバリアントは、更なる特性評価のために精製され、Ｔ２３親よりも経路活性化に大きな効力を示した（図１Ｅ）。これらのバリアントを発現する酵母細胞の２色染色によって明らかにされるように、ナノボディバリアントの全ては、ＰＴＣＨ１－ＮＮＱに対する優先的な結合を示した（図１Ｆ、図５Ｈ）。ＴＩ２３は、また、ヒト胚性口蓋間葉系（ＨＥＰＭ）に由来する細胞株で試験したときに、低ナノモル濃度でＧＬＩ１及びＰＴＣＨ１を標的とするヒトヘッジホッグ経路を強く活性化した（図１Ｇ）。ＳｈｈＮｐと比較して、ＴＩ２３は、同様の効力を示したが、一貫して、より低い有効性を示した。ＴＩ２３によって誘導される最大応答は、ＳｈｈＮｐ由来の最大応答の約７５％であり、それが部分アゴニストであることを示唆する（図１Ｈ）。

【0105】

ＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体の構造。ＰＴＣＨ１へのＴＩ２３結合のコンフォメーション効果を決定するために、我々は、クライオＥＭによる構造決定のためにＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体を調製した。複合体を、適切にフィットした造影剤移動関数パラメータ（ＣＴＦ、図６Ｂ）及び２Ｄ分類平均（図６Ｃ）を用いて、クライオＥＭ顕微鏡写真（図６Ａ）で明確に可視化した。クライオＥＭデータセットの３Ｄ再構築は、３．４Åの分解度で高品質のマップ（図２Ａ、図６Ｄの手順）をもたらした（図６Ｆ）。１２個の膜貫通（ＴＭ）ヘリックス及び２つの主要な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を全て分解し（図２Ａ）、ＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体の原子モデルを、このマップ及び以前に決定されたマウスＰＴＣＨ１構造に基づいて構築した（２４）。細胞内配列の大部分は、ＴＭ１及びＴＭ７の前の２つの横ヘリックスを除いて、未分解であり、モデル化されていなかった（図２Ｂ）。

【0106】

ステロール様密度は、複数の部位で同定され、１つは、ＥＣＤ１の遠位先端（膜から最も遠い、密度Ｉ）のポケット内にあり、１つは、輸送導管（ＩＩ）の一部として提案された空洞内にあり、２つは、膜貫通ドメイン（ＩＩＩ及びＩＶ）の周辺にある（図２Ｂ）。部位ＩＩにおける密度は特によく分解されており、その異常な「Ｙ」形状は、ステロール様密度もＧＤＮである可能性が最も高いが、ＧＤＮのステロイド部分、ジジトゲニンのみが分解され、モデル化されたことを強く示唆している。

【0107】

概略図（図２Ｃ）に示すように、ナノボディは、ＰＴＣＨ１のＥＣＤ１とのみ相互作用する。ＴＩ２３の結合部位は、ＳＨＨの結合部位と重なり合うが、ＳＨＨは、ＥＣＤ１及びＥＣＤ２の両方と相互作用する（図２Ｄ）。ＴＩ２３ナノボディのＣＤＲ１及びＣＤＲ３ループは、異なる角度からＰＴＣＨ１ ＥＣＤ１内の短いヘリックス（図２Ｃで強調されている「スイッチヘリックス」）に接触する。ＣＤＲ１は、疎水性残基Ｉ２８及びＦ２９を脂質部位Ｉ（図２Ｅ）の疎水性ポケットに挿入することによってＰＴＣＨ１と相互作用するが、ＣＤＲ３は、ＰＴＣＨ１の表面上の他の残基と主に水素結合ネットワークを形成する（図２Ｆ）。

【0108】

ＴＩ２３は、ＥＣＤ１とのみ相互作用するが、我々は、膜貫通ドメイン内の側鎖の分解能における有意な改善に留意した。特に興味深いことに、ＴＩ２３の選択のために変更されたＴＭ４及びＴＭ１０内の荷電残基トライアドは、他の公開されたＰＴＣＨ１構造のほとんどにおいてよりも良好に分解される。したがって、ＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体中のＴＭ４及びＴＭ１０は、Ｈ１０８５とＤ４９９との間の塩架橋を介して互いに会合するが、ＳＨＨ結合ＰＴＣＨ１構造では、この相互作用が中断されることに留意されたい（図７Ｄ）。膜貫通ドメイン側鎖相互作用におけるこのナノボディ関連変化は、ＥＣＤと膜貫通ドメインとの間の潜在的なアロステリーを示唆する。

【0109】

ＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体の全体的な構造は、非結合マウスのＰＴＣＨ１構造に類似しており、９１０個の残基上のＣａ炭素原子の根平均平方偏差は０．９５５Ａである。ＥＣＤ１及びＥＣＤ２の両方は、複合体内でいくつかの立体構造の差異を示す。１つのわずかな違いは、ＰＴＣＨ１単独と比較して、ＥＣＤ１の方向への約５度のＴＭドメインへの接続の周りのＥＣＤ２の回転である（図３Ａ）。より顕著な違いは、反転スイッチを示唆する方法で、ＥＣＤ１内の「スイッチヘリックス」の遠位端を膜に向かって約３２度回転させることである（図３Ａ、挿入図）。ＰＴＣＨ１単独及びＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体におけるスイッチヘリックスのコンフォメーションをそれぞれポーズ１及び２として参照する（図３Ａ、挿入図）。スイッチヘリックスのこれら２つの代替ポーズは存在するが、様々な条件下で決定されたＰＴＣＨ１の他の構造ではほとんど目立たなくなっている。例えば、２つのヒトＰＴＣＨ１分子（２３）に結合した単一の天然Ｓｈｈリガンドの三元複合体では、Ａ鎖のＰＴＣＨ１、すなわち、ＳＨＨリガンドのＮ末端パルミトイル部分との相互作用によってステロール導管が閉塞されている分子は、ポーズ２を採用し、一方、Ｂ鎖のＰＴＣＨ１は、ポーズ１を採用する。実際、ＰＴＣＨ１の全ての公開された構造において、スイッチヘリックスは、これら２つのポーズの一方又は他方を採用し、それらが、ＰＴＣＨ１活性サイクル内に優先的に充填される個別の代替構造を表すことを示唆する（図３Ｂ）。最も分解度が高いＳＨＨ－ＰＴＣＨ１構造では、細胞外ドメイン内のスイッチヘリックスがポーズ１を採用し、膜貫通ドメイン内のＨ１０８５とＤ４９９との間の塩架橋が破損していることは注目に値する。対照的に、ＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体は、これらの両方の部位において代替コンフォメーションを採用する（図７）。これらの変化は、膜貫通ドメイン内の荷電残基と細胞外ドメイン内のスイッチヘリックスとの間のアロステリーと一致する。他のＰＴＣＨ１構造のいずれも、ＴＭ４及びＴＭ１０中の荷電残基の側鎖を明確に分解しておらず、更なる比較を排除している。

【0110】

ステロール導管へのスイッチヘリックスの影響。これらの構造再構成は、Ｃａｖｅｒプログラムによって評価されるように、輸送導管の形状を変化させる（図３Ｃ）。したがって、マウスＰＴＣＨ１のステロールＩを包含する導管の領域は、ＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体の導管内で劇的に収縮していると見られ、ＰＴＣＨ１：：ＴＩ２３複合体の導管は、外部への遠位開口部も取得する（図３Ｄ）。この導管形状の変化と並行して、結合したステロール様密度は、より近位側の密閉空洞から、外部への開口部を有するより遠位側の位置にシフトする（図３Ｅ）。この協調した近位側の収縮及び遠位側の膨張は、主にスイッチヘリックスの回転に起因する。ＰＴＣＨ１活性が、他のＲＮＤファミリーメンバーと同様に、化学浸透勾配によって駆動される場合、本明細書で同定されるコンフォメーション変化は、基質導管に影響を与える輸送導管コンフォメーション遷移内の基質の方向性移動をもたらす定義された配列の一部を形成し得、原理的には、ＰＴＣＨ１のものとは詳細には異なるが、同様である。Ｃａｖｅｒプログラムを用いた分析により、ＡｃｒＢの下部及び上部部位は、代替的に、基質の方向性移動を実施するために開閉する（図８Ａ）（３４）が、一方、ＰＴＣＨ１構造からは、単一の上部部位のみが同定されている（図８Ｂ）。

【0111】

ＴＩ２３ナノボディは、ＰＴＣＨ１スイッチヘリックスのポーズ２を安定させるように見える。内葉から離れたステロールのＰＴＣＨ１媒介輸送が、スイッチヘリックス移動に関連する導管の形状の動的変化に実際に依存する場合、ＴＩ２３結合は、ＰＴＣＨ１をステロール移動と互換性がない状態にロックし得る。このアイデアを試験するために、我々は、細胞にマイクロインジェクションされたソルバトクロミック蛍光ステロールセンサを利用して、膜の内葉内のセンサ結合に利用可能なステロールの比率測定を可能にした（３５）。このセンサは以前、利用可能なステロールがＰＴＣＨ１活性とともに急激に減少し、ＳｈｈリガンドによるＰＴＣＨ１不活性化が正常なステロール利用可能性に戻ることを明らかにした（２４）。Ｓｈｈリガンド添加の効果と同様に、ＴＩ２３添加は、ＰＴＣＨ１媒介性コレステロール活性の低減を逆転させることに注目した（図３Ｆ）。

【0112】

ヘッジホッグ経路のインビボ活性化。ナノボディ（約１２ｋＤａ）などの小さなタンパク質は、優れた組織浸透度を示し、ほとんどの組織の細胞に容易にアクセス可能であることが期待され得る。我々は、それを発現するように操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をマウスに静脈内注射することによって、ＴＩ２３の活性を試験した。この実験は、ＡＡＶ感染が数週間にわたって維持されるため、持続的なナノボディ曝露によって引き起こされる生物学的効果の観察を可能にするはずである。舌上皮及び皮膚を監視した。これらの組織は、ヘッジホッグ経路活性化に対する十分に特徴付けられた応答を示す。

【0113】

ＴＩ２３ナノボディは、Ｇｌｉ１ ＲＮＡレベルの６倍の増加によって示されるように、背側皮膚におけるヘッジホッグ経路活性を増強した（図４Ａ）。ＴＩ２３からの効果は、ＳｈｈＮ又はＳＡＧ２１ｋよりも弱く、ＴＩ２３がインビトロで部分アゴニストとして機能するという観察と一致する。また、ＴＩ２３又はＳｈｈＮをコードするＡＡＶに感染したが、対照ナノボディ（Ｎｂ４）ではないマウスにおける背側皮膚の組織学的検査時に皮膚脂肪層への毛包の拡張を指摘し、毛包が毛周期の成長期への侵入を示す（図４Ｂ）。成長期への加速された侵入と一致して、我々は、剃った後の背側皮膚のより速い毛の再成長を観察した（図４Ｃ）。

【0114】

また、舌上皮における経路活性化の指標として、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるＧｌｉ１ ｍＲＮＡを調べた。ヘッジホッグ経路活性は、未処理動物におけるＣＫ８^＋味覚受容体細胞を取り囲む細胞に限定される（図４Ｄ）。ＳｈｈＮ又はＴＩ２３ウイルス注射マウスにおいて、Ｇｌｉ１発現によって示されるように、ヘッジホッグ経路活性の範囲は、対照ウイルスを受けた動物と比較して劇的に拡大した（図４Ｅ、Ｆ）。ＳＡＧ２１ｋ（図４Ｅ、Ｆ）、ＳＭＯを活性化する小分子ヘッジホッグアゴニストを投与したマウスにおいても、Ｇｌｉ１発現の同様の拡張が観察された。

【0115】

ヘッジホッグ経路調節の治療的適用は、主に経路アンタゴニストに焦点を当てており、ヘッジホッグ経路の阻害は、腫瘍の原発細胞における過剰なヘッジホッグ経路活性によって直接駆動されるがんの治療において有効であることが証明されている。しかしながら、腫瘍増殖を促進することとは対照的に、最近、経路活性は、それが原発細胞ではなく間質細胞、特に膀胱がん、並びに結腸及び膵臓腺がんなどの内胚葉臓器のがんにおいて生じるとき、がんの成長及び進行を抑制することが見出されている。経路活性化は、また、化学療法患者において失われるか又は減少することが多い舌の味覚受容体細胞の再生、大腸炎などの疾患の保護又は回復、前立腺肥大における組織の過剰増殖の低減、又は糖尿病における骨治癒の加速における治療上の利点を付与し得る。

【0116】

これらの潜在的な利点にもかかわらず、臨床環境における経路活性化は、特定の組織を標的とする手段の欠如によって妨げられている。利用可能なヘッジホッグ経路アゴニストは、ＳＡＧファミリーの小分子メンバー、特定のオキシステロール、及びＰＴＣＨ１を標的とする脂質修飾ヘッジホッグタンパク質又はその誘導体を含む、本質的に全て疎水性である。コンフォメーション選択的ＰＴＣＨ１指向性ナノボディＴＩ２３（配列番号２３）は、天然のヘッジホッグタンパク質とは異なり、活性のための疎水性修飾を必要としない、強力でより親水性が高いアゴニストの新しい分類を表す。更に、ＴＩ２３は、組織又は細胞型特異性を有する抗体又は他の薬剤への融合による標的化のために操作される可能性を有する。これらの操作されたバリアントは、全身経路活性化からの多面的効果を回避し、臨床応用により適している可能性がある。

【0117】

ＴＩ２３は、更なる医薬品開発に有用であり、ＰＴＣＨ１輸送機構への洞察も提供する。トランスポータータンパク質を通る基質の方向移動は、コンフォメーション変化を意味するが、トランスポーターのためのそのようなコンフォメーション遷移の同定は、非自明の課題である。私たちのコンフォメーション特異的ナノボディアプローチにより、ＰＴＣＨ１スイッチヘリックスのポーズ１及び２に関連する２つの異なるコンフォメーションを同定することができた。これらのポーズに関連する輸送導管の形状の変化は、蠕動運動を、指向性基質移動のための潜在的なメカニズムとして示唆する。ＰＴＣＨ１は、好ましい基質及び細胞外ドメイン構造の両方において、十分に特徴付けられたＲＮＤトランスポーターＡｃｒＢとは異なるため、これらのタンパク質の立体構造遷移が異なることは驚くことではない。実際、これらの違いを考えると、両方のタンパク質における基質導管の蠕動運動の明らかな類似性は非常に顕著に思われる。

【0118】

ＰＴＣＨ１へのＴＩ２３結合は、ＰＴＣＨ１－ＮＮＱと同様のコンフォメーション変化を誘導すると予測される。ＮＮＱ中の改変された残基が膜貫通ドメインに埋め込まれていることに対し、ＴＩ２３は細胞外ドメインに結合するので、最も軽微な説明は、２つのドメイン間のアロステリーである。細菌輸送体では、ＴＭ４及びＴＭ１０の荷電トライアドが膜を横切ってプロトンを導き、化学浸透勾配からエネルギーを抽出する。ＰＴＣＨ１では、この荷電残基のトライアドの２つの異なる状態が現在観察されている。ＳＨＨ結合構造では、Ｄ５１３及びＥ１０９５は互いに近接しており、それらの負電荷は結合カチオンによって安定化され得るが、ＴＩ２３結合構造では、これらの２つの残基は遠く離れており、いかなるカチオンとも相互作用しない可能性が高い。この差は、ＰＴＣＨ１－ＮＮＱにおける電荷中和の欠如がカチオン相互作用を著しく弱めると予想されるため、カチオン結合に対するＮＮＱ改変の潜在的効果と一致する。

【0119】

ＴＩ２３ナノボディの興味深い側面は、それが部分的なアゴニストとして機能することに対し、ＰＴＣＨ１－ＮＮＱバリアントは、細胞においてほとんど活性を示さないことである。この違いの１つの説明は、ナノボディが少量のコンフォメーション柔軟性を許容し、したがって、低レベルのＰＴＣＨ１輸送活性を可能にすることであり得る。実際、局所分解度マップでは、ナノボディ領域の分解度は、タンパク質の残りの部分よりもはるかに悪く、実質的な構造的不均一性を示唆している。

【0120】

ナノボディの構造安定性を改善するための更なるインビトロ進化は、経路を活性化するためのその有効性を増強し得る。我々のコンフォメーション選択的ナノボディアプローチは、他のトランスポーター、特にＲＮＤファミリーの他のメンバーの研究に一般化可能である。哺乳類では、このファミリーには、ＮＰＣ１コレステロール輸送タンパク質、及びＰＴＣＨＤ１などの他のＰＴＣＨ様タンパク質が含まれ、その破壊は自閉症と強く関連している。他のトランスポーターについては、機能を破壊する変異は、任意の１つのコンフォメーションを一意に安定させることなく、通常のコンフォメーションランドスケープをバイアスすることによってそうすることができる。そのような変異体に優先的に結合するナノボディの選択は、まばらに集積されているが重要なコンフォメーションの捕捉を可能にし、構造的及び機能的研究のための実験的にアクセス可能な状態のレパートリーを拡大し、特定の細胞型又は組織コンパートメントを標的にする可能性を有する薬理学的薬剤を提供し得る。

【0121】

材料及び方法
細胞培養。Ｓｆ９及び２９３Ｔ細胞を、以前に公開された条件に従って培養中に維持した。２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を、１％ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補充したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、振盪プラットフォームを装備した８％ＣＯ_２インキュベーター内で浮遊培養中に維持した。Ｓｆ９細胞におけるバキュロウイルス産生及び組換えバキュロウイルスによる懸濁液２９３培養物の感染（ＢａｃＭａｍ発現）を、前述のように実施した。

【0122】

分子クローニング。全ての構築物をＧｉｂｓｏｎアセンブリでクローニングした。ＢａｃＭａｍ発現に関して、ＰＴＣＨ１バリアントをｐＶＬＡＤ６ベクターにクローニングした。酵母選択のために、Ｐｔｃｈ１－Ｃ及びＰｔｃｈ１－Ｃ－ＮＮＱバリアントを使用した。Ｐｔｃｈ１－Ｃは、アミノ酸１１７３で切断され、６１９－７１１で欠失し、Ｃ１１６７Ｙで改変されたマウスＰＴＣＨ１である。選択のためのＰｔｃｈ１－Ｃの使用は、細胞内配列の広範な欠失に起因して、ＰＴＣＨ１細胞内ドメインに結合するナノボディを得る可能性を最小限に抑えた。構造決定及び細胞生物学実験には、先に報告されたＰｔｃｈ１－Ｂを使用した。ルシフェラーゼアッセイ及び細胞表面結合実験のために、ＰＴＣＨ１バリアントをｐｃＤＮＡ－ｈ（ネオマイシン耐性カセットを除去したｐｃＤＮＡ３ベクター）にクローニングした。

【0123】

酵母ディスプレイ選択。合成ナノボディライブラリを、ＳＤＣＡＡ培地中で３０℃で、約１×１０^８／ｍｌの細胞密度まで成長させた。初期多様性（５×１０^８多様性、５×１０^９細胞）の約１０倍をカバーする細胞を、２０℃でＳＧＣＡＡ培地に移して、細胞表面上のナノボディの発現を誘導した。選択のために、７．５×１０^９個の細胞を遠心分離によってペレット化し、選択緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１％のＤＤＭ、０．０２％のＣＨＳ）中に再懸濁した。次いで、細胞を１００ｎＭの１Ｄ４タグ付きＰｔｃｈ１－Ｃ ＮＮＱとともにインキュベートし、スピンダウンして選択緩衝液で洗浄し、次いでＦＩＴＣ標識された１Ｄ４抗体、次いで１００μＬの抗ＦＩＴＣ ＭＡＣＳビーズで洗浄した。ビーズ結合細胞を磁気マニホールドにロードし、選択緩衝液で広範囲に洗浄した後、結合細胞を溶出し、ＳＤＣＡＡ培地中で培養し、ＳＧＣＡＡ培地中でナノボディ発現のために誘導した。次いで、これらの細胞上で第２ラウンドの選択を行い、まず、抗体結合細胞を反射選択するために、Ａｌｅｘａ６４７標識された１ｄ４抗体のみを用いて、次いで、１００ｎＭの１Ｄ４タグ付けされたＰｔｃｈ１－Ｃ ＮＮＱを用いて実施した。選択した細胞をＳＤＣＡＡで増殖させ、再びＳＧＣＡＡで誘導し、次いで１００ｎＭのＭｙｃタグ付きＰｔｃｈ１－Ｃ及び１００ｎＭの１Ｄ４タグ付きＰｔｃｈ１－Ｃ－ＮＮＱとともにインキュベートし、抗Ｍｙｃ Ａｌｅｘａ ６４７及び抗１Ｄ４ ＦＩＴＣで染色し、ＦＡＣＳ上により強いＦＩＴＣシグナルを示す細胞を選択した。同じＦＡＣＳ選択を繰り返し、選択した細胞を増殖させ、希釈プレートした。プラスミドを単一コロニーから調製し、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）後に配列決定した。２４個のコロニーから１５個のユニークな配列を回収した。次いで、これらのナノボディ配列を有する酵母細胞を、抗１Ｄ４抗体及びＰｔｃｈ１－Ｃ－ＮＮＱへの結合について試験した。１５個のうち３つ、クローン＃４、＃９、及び＃１５は、１Ｄ４抗体に直接結合する。クローン４を、活性特性決定における対照ナノボディとして使用した。残りの配列を、 Ｅ．ｃｏｌｉからの発現及び精製のためにｐＥＴ２６ｂベクターにクローニングした。

【0124】

ナノボディ精製。ナノボディ配列を含有するｐＥＴ２６ｂベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。細菌を、３７℃～０．８のＯＤ６００までのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス培地中で増殖させ、次いで０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、２０℃に移した。一晩発現した後、細胞を８，０００ｇで遠心分離することによって採取した。細胞ペレットを、５ｍｌの緩衝液／１ｇのペレットの比で、ＳＥＴ緩衝液（５００ｍＭのスクロース、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。室温で３０分間撹拌した後、２体積の水を添加した。追加で４５分間撹拌した後、ＭｇＣｌ_２を２ｍＭ及びベンゾナーゼに１：１００，０００で添加した。５分間のインキュベーション後、ＮａＣｌを１５０ｍＭに添加し、イミダゾールを２０ｍＭに添加し、混合物全体を２０，０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。次に、上清をＮｉ－ＮＴＡカラムにロードし、氷冷緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）で洗浄し、次いで、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾールで溶出した。次いで、溶出したタンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で４℃で一晩透析した。クローン１３を除く全ての最初のヒットを発現させ、精製することができる。次いで、クローン１３を分析から除外した。

【0125】

親和性成熟。第１ラウンド親和性成熟ライブラリは、エラーが起こりやすいＰＣＲを用いて作製した。この選択の出発点として、ナノボディクローン１７、２０、及び２３を選択した。ナノボディ配列を含有する１０ｎｇのプラスミドを鋳型（ナノボディ配列の約１ｎｇのＤＮＡに相当する）として使用し、ＰＣＲをＭｕｔａｚｙｍｅキットで増幅した。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、次いで、次のＰＣＲラウンドの鋳型として１０ｎｇを使用した。合計４ラウンドのＰＣＲを実施した。次いで、最終生成物をフュージョンポリメラーゼで増幅して、酵母形質転換のための十分な量を得た。合計約１００μｇのＤＮＡを、約２μｇのエラーが起こりやすいＰＣＲ生成物を使用して、各親配列について精製した。次いで、ＤＮＡ断片を、ｐＹＤＳ２．０プラスミド骨格とともに酵母に形質転換した。３つの異なる親配列からのＤＮＡ、及び３つの混合物を酵母細胞に別々にエレクトロポレーションしたが、エレクトロポレーション後の回収のために細胞をＹＰＤ中にプールした。連続希釈及びめっきにより、このライブラリについて１×１０^９独立形質転換体の推定値が得られた。次いで、形質転換酵母細胞を、１００μｇ／ｍｌの硫酸ノルセオトリシンを用いたＹＰＤ培地中で増殖させ、次いで、同じ抗生物質を用いてＹＰＧ培地中で誘導した。１００ｎＭ、５ｎＭ、０．８ｎＭの１Ｄ４タグ付きＰｔｃｈ１－Ｃ ＮＮＱの濃度を使用して、ＭＡＣＳ選択によるＰＴＣＨ１結合について酵母細胞を濃縮した。次いで、ナノボディを発現する細胞をＰｔｃｈ１－Ｃ ＮＮＱとともに０．６ｎＭでインキュベートした。選択緩衝液中で洗浄した後、細胞を、１μＭの親１７、２０、２３ナノボディタンパク質とともに各々、室温で１７０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＩＴＣ標識されたＨＡ抗体で染色してナノボディ発現レベルをマークし、Ａｌｅｘａ ６４７標識された抗１Ｄ４抗体で染色してＰＴＣＨ１結合をマークした。高いＰＴＣＨ１結合を維持する細胞をＦＡＣＳから選択した。６４個のクローンを配列決定して、繰り返す変化を同定した。

【0126】

親和性成熟の第２ラウンドは、ワンポット変異誘発法を使用して相補性決定領域（ＣＤＲ）を標的とするライブラリを用いて実施した。ＣＤＲ領域内の各コドンを置換するＮＮＫを有するＤＮＡオリゴのプールを、ＣＤＲのワンポット変異誘発のために使用したので、理論的には、各位置の全ての２０個のアミノ酸がこのライブラリに表された。次いで、ワンポット変異誘発由来のＤＮＡ生成物をＱ５ポリメラーゼで増幅し、ゲル抽出で精製した。最終生成物約５μｇのＤＮＡを酵母形質転換のために使用した。形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌの硫酸ノルセオトリシンを含有するＹＰＤ培地中で成長させ、同じ抗生物質を含有するＹＰＧ培地中で誘導した。次いで、１０ｎＭのタンパク質Ｃタグ付きＰｔｃｈ１－Ｃとともにインキュベートし、選択緩衝液中で洗浄し、次いで１μＭの２３Ｔ（第１ラウンドの親和性成熟からのコンセンサス配列を有する精製ナノボディタンパク質）とともに１日間インキュベートした。次いで、ＦＩＴＣ標識されたＨＡ及びＡｌｅｘａ ６４７標識された抗タンパク質Ｃ抗体で細胞を染色し、ＰＴＣＨ１－高細胞をＦＡＣＳ中で選択した。細胞をＹＰＤ中で増殖させ、再び誘導した。集団を更に精製するために、同じＦＡＣＳ選択手順を繰り返した。次いで、最初の酵母ライブラリ及び最終選択ライブラリから調製したプラスミドからのナノボディ配列をＱ５ポリメラーゼで増幅し、ＭＧＨ配列決定コアでアンプリコン配列決定のために送った。

【0127】

ＰＴＣＨ１精製。ＰＴＣＨ１の精製を、前述のように、わずかな変化を伴って実施した。懸濁液２９３細胞を１．２～１．６×１０^６／ｍｌの密度まで増殖させ、１０ｍＭの酪酸ナトリウムを補充し、高力価のＰｔｃｈ１－ＳＢＰバキュロウイルスに４０～４８時間感染させた。細胞ペレットを－８０℃で保管した。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤及びベンゾナーゼを補充した低張性緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＫＣｌ、０．２５Ｍのスクロース）中に解凍した。粗膜を、遠心分離（１００，０００×ｇ、３０分、４℃）でペレット化した。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤で溶解緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミド、１％ＤＤＭ／０．２％ＣＨＳ）中に再懸濁し、穏やかな回転で４℃で１時間可溶化した。遠心分離（１００，０００×ｇ、３０分、４℃）後、上清を、穏やかに回転させながら、４℃で２～３時間、バッチモードでストレプトアビジン－アガロース親和性樹脂とともにインキュベートした。樹脂を使い捨てカラムに充填し、２０～３０カラム体積の緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のＤＤＭ／０．００６％のＣＨＳ）で洗浄した。タンパク質を、２．５ｍＭのビオチンを補充した同じ緩衝液中で溶出した。

【0128】

クライオＥＭデータの取得。溶出したＰｔｃｈ１－Ｂタンパク質を、ＴＩ２３と１：１．１の比で混合し、次いで、ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％ＧＤＮ）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上にロードした。ピーク画分を収集し、１００ｋＤａ～Ａ２８０～４．５の分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎフィルターで濃縮した。２．５μＬの試料を、ｖｉｔｒｏｂｏｔ上の発光放電量子箔グリッドに適用した。試料チャンバを１００％相対湿度で維持した。グリッドを１０秒間ブロットし、液体窒素によって冷却された液体エタン浴中に沈めた。３００ｋＶで動作するＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ ２電子顕微鏡で、クライオグリッドを撮像した。ＧＩＦ前のＫ２カメラ上で、１．０５９Å（１超分解画素当たり０．５２９５Å）のピクセルサイズに対応する２２．５ｋの公称倍率で、用量分画モードで画像を撮影した。線量率は約８ｅ／ピクセル／秒であり、総露光時間は、０．２ｓ／フレームのフレームレートで１２ｓであった。デフォーカス範囲は－１μｍ～－３μｍで、ＳｅｒｉａｌＥＭを用いて全自動データ収集を実施した。ゲイン参照は、データ収集の開始時に取得され、後でデータ処理に適用された。

【0129】

画像処理。合計７，０４６本のムービースタックが収集された。ムービースタックは、ゲイン参照によって補正され、２回ビニングされ、ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２を使用してビーム誘導運動について補正された。ＣＴＦは、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ２で提供されるラッパーを使用して、用量重み付けを行わずに、動き補正された合計からＣＴＦＦＩＮＤ４で決定された。以下の全ての処理工程に用量加重合計を使用した。粒子は、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ２を自動ピックした。タンパク質分子に対応する粒子を２Ｄ分類から選択した。次いで、これらの粒子は最初から再構成され、次いで、最初のモデルとして最後の工程から生成されたマップの２つのコピーと１つのジャンクマップとを使用して、３つの分類に不均一な詳細化で分類された。最良の分類は、均質な詳細化のために選択され、次いで、不均一詳細化のために、４．１Åのマップを得るために選択された。次いで、粒子を３Ｄ変動解析ツールで分析し、第１の固有ベクトルの２つの極端を更なる３Ｄ分類の基礎として使用した。最終的な３Ｄ分類は、３．７Åの分解能まで不均一詳細化で洗練された。次いで、ｐｙＥＭ中のスクリプトを使用して、粒子スタックをｃｉｓＴＥＭにエクスポートした。洗剤ミセルを除いたマスクを用いて局所的詳細化を１回繰り返した後、３．４Åのマップを報告した。鋭利化後の最終マップをモデル構築に使用した。

【0130】

タンパク質モデル構築。鋳型構造として４ｍｑｔＢ及び５ｍ３０Ｆを使用して、ｒｏｓｅｔｔａＣＭでナノボディＴＩ２３構造を生成した。生成された構造及び以前に決定されたＰＴＣＨ１構造（６ｍｇ８）を、クライオＥＭマップにドッキングし、モーフィングによりｐｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅで洗練した。次に、洗練されたモデルをクート（ｃｏｏｔ）で手動で編集して、現在新しい構造及び低分子で分解されている残基中に添加した。小分子の制約は、ＰＲＯＤＲＧサーバ上で生成された。次いで、構造全体がｐｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅで洗練された。

【0131】

ＦＡＣＳベースのＳｈｈＮ結合アッセイ。２９３細胞を、ＧＦＰタグ付きＰｔｃｈ１構築物で一過的にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を、１０ｍＭのＥＤＴＡを使用して解離させ、ＨＰＢＳ０．５ｍＭのＣａ^２＋で洗浄し、遠心分離によってペレット化した。次いで、細胞を結合緩衝液（ＨＰＢＳ、０．５ｍＭのＣａ^２＋、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中に再懸濁し、精製したＳｈｈＮ－ビオチン（１：４００希釈）とともに４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を結合緩衝液中で遠心分離によって３回洗浄し、その後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに４℃で１５分間インキュベートした。次いで、洗浄緩衝液（結合緩衝液＋１ｍＭビオチン）中での遠心分離によって細胞を３回洗浄し、ＳｈｈＮによって結合した細胞のパーセンテージを、ＰＴＣＨ１－ＧＦＰ発現のゲーティング後のフローサイトメトリーによって定量した（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＦＡＣＳ Ｃｏｒｅ）。

【0132】

Ｇｌｉ依存性ルシフェラーゼアッセイ。ルシフェラーゼアッセイを、前述のように、Ｐｔｃｈ１^－／－ＭＥＦで実施した。Ｐｔｃｈ１^－／－ＭＥＦを２４ウェルプレートに播種し、次いで、８ｘＧｌｉホタルルシフェラーゼ及びＳＶ４０－レニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼプラスミドを含有する混合物とともに、様々なプラスミドでトランスフェクトした。各ウェルについて、Ｐｔｃｈ１－Ｂバリアントをコードする２ｎｇ（０．４％）のプラスミド、又は全長ＰＴＣＨ１をコードする５ｎｇ（１％）のプラスミドを使用した。細胞をコンフルエントさせたとき、それらを、ＳｈｈＮ調節培地又は対照培地を含有する０．５％の血清を含むＤＭＥＭに移し、４８時間インキュベートした。次いで、ルシフェラーゼ活性を、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｃｅｎｔｒｏ ＸＳ３光度計を使用して測定した。ＳｈｈＮ条件化培地は、Ｓｈｈのアミノシグナル伝達ドメインを発現するプラスミドでトランスフェクションした２９３細胞から調製した。要するに、２９３細胞を、リポフェクタミン２０００でＳｈｈＮ発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後、培養培地を２％ＦＢＳ低血清培地に置き換えた。次いで、培地変化の４８時間後に条件化培地を回収し、１：１０でルシフェラーゼアッセイに使用した。

【0133】

細胞コレステロールの測定。Ｐｅｒｆｒｉｎｇｏｌｙｓｉｎ Ｏ Ｄ４ドメイン（ａ．ａ．３９１－５００）及び変異体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＲＩＬコドンプラス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞においてＨｉｓ_６タグ付きタンパク質として発現し、Ｈｉｓ_６親和性樹脂（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して精製した。これらのタンパク質を、単一のＣｙｓ部位（Ｃ４５９）で、ソルバトクロミックフルオロフォアによって標識して、比率センサを生成した。Ｐｔｃｈ１^－／－ＭＥＦを５０ｍｍの円形ガラス底プレート（ＭａｔＴｅｋ）に播種し、１０％（ｖ／ｖ）の致死性ウシ血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｈｓ）を補充した、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の９５％の空気及び５％のＣＯ_２の加湿雰囲気中で、３７℃で増殖させた。培養容器に結合した後（約２４時間）、製造業者のプロトコルに従って、ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓトランスフェクション）を使用して、Ｐｔｃｈ１－Ｂバリアントをコードするプラスミドで細胞を一過的にトランスフェクトした。各トランスフェクションに１μｇのプラスミドを使用した。いくつかの修正を加えて、前述のようにコレステロールセンサを使用して、形質膜の内（ＩＰＭ）葉中のコレステロールを定量化した。具体的には、（２Ｚ，３Ｅ）－３－（（アクリロイルオキシ）イミノ）－２－（（７－（ジエチルアミノ）－９，９－ジメチル－９Ｈ－フルオレン－２－イル）メチレン）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－１－オン（ＷＣＲ）で標識されたＤ４ドメインのＹ４１５Ａ／Ｄ４３４Ｗ／Ａ４６３Ｗ（ＹＤＡ）変異体を、ＩＰＭコレステロール（［Ｃｈｏｌ］_ｉ）の定量のためにマイクロインジェクションにより細胞内に送達した。全てのセンサ較正、顕微鏡測定、及び比率測定画像データ分析を、記載の通りに実施した。

【0134】

マウス。全ての手順を、スタンフォード大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）承認プロトコルに従って実施した。野生型ＦＶＢ／ＮＣｒｌ（２０７）マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入した。７週齢の雄マウスを、所定の試料サイズの群にランダムに割り付けた。直接比較を伴う全ての実験を並行して実施し、変動を最小限に抑えた。ヘッジホッグアゴニストＳＡＧ２１ｋを、２ｍｇ／ｋｇ／日の用量で２週間にわたって浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ）によって送達した。

【0135】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生。全てのＡＡＶプラスミドの骨格は、ｂＧＨに置き換えられたポリ（Ａ）シグナルを有するｐＡＡＶ－ＥＦ１ａ－Ｃｒｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ、５５６３６）に基づいた。感染細胞で発現するために、ナノボディ配列をベクターにクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＡＡＶを生成し、説明されるように、イオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ、Ｄ１５５６）工程勾配によって精製した。ウイルス力価は、ＤＮａｓｅ Ｉ耐性ウイルスゲノムを、直鎖化ウイルスゲノムプラスミドを標準として使用してｑＰＣＲで定量化することによって測定した。精製したウイルスを、マウス１匹当たり１×１０^１１μｇ又は他の具体的に示された力価で、眼窩後洞を介して麻酔したマウスに静脈内注射した。

【0136】

組織学。動物を安楽死させ、背部皮膚をＲＮＡ抽出のために切除した。次いで、マウスにＰＢＳ及び４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）をＰＢＳ中に灌流し、舌及び背側皮膚を４％ＰＦＡ中に２４時間固定した。マウスＧｌｉ１プローブ（３１１００１）を使用して、ＲＮＡＳｃｏｐｅ多重蛍光キット（ＡＣＤシステム）に従って、舌をインサイツハイブリダイゼーションのために処理し、続いて記載されるように免疫染色を行った。免疫蛍光イメージングを、レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８００）で実施した。皮膚は、スタンフォード大学の動物組織学サービスによって標準的なＨ＆Ｅ染色のために処理された。

【0137】

ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲ。皮膚試料を均質化し、ＴＲＩｚｏｌを使用してＲＮＡ用に抽出し、続いてＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）及びＤＮａｓｅセット（ＱＩＡＧＥＮ）を抽出した。Ｇｌｉ１及びＨｐｒｔ１レベルは、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ｇｌｉ１、Ｍｍ００４９４６５４＿ｍ１、Ｈｐｒｔ、Ｍｍ００４４６９６８＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ白金ワンステップシステムを使用して、ＡＢＩ７９００ＨＴ器具上の１ステップ定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって決定した。対照群との相対的な正規化発現レベルを、通常の一元配置分散分析ＡＮＯＶＡ検定とダネットの多重比較補正とを使用して比較した。

【0138】

【表1】

【0139】

参考文献：
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【0140】

実施例２
ヘッジホッグ経路の全身経路活性化は、望ましくない効果を有し得、治療的適用は、組織標的化に適した経路活性化剤の欠如のために困難であった。単一ドメインタンパク質として、本明細書に開示されるナノボディは、工学に適しており、ヘッジホッグ経路活性の正確な制御のために、特定の組織区画を標的にすることができる。

【0141】

最近の研究は、増殖性及び分化性の手がかりの同時産生を通じた上皮臓器の維持及び再生のための間葉系の鋳型としての間葉系のニッチの役割に新たな光をもたらした。間葉区画における優先的なヘッジホッグ経路活性化を達成するために、コラーゲンＩ型結合ペプチド（配列番号２６、ＬＲＥＬＨＬＮＮＮ）をＴＩ２３配列に付加し、このバリアントＴＩ２３^{コラーゲンＩ}、又はＴＩ２３^Ｃｏｌ１と名付けた（図９Ａ）。成熟タンパク質は、配列番号２５に示される。Ｉ型コラーゲンは、間葉区画では広く発現するが、上皮では発現しないため、我々は、ＴＩ２３^Ｃｏｌ１が、間葉におけるヘッジホッグ経路に集中し、効率的に活性化することを期待した。舌上皮は、ディスパーゼ処理後に間葉から容易に分離することができ、組織標的化を実証するために舌を使用した（図９Ｂ）。ＴＩ２３^Ｃｏｌ１ウイルスを受けた動物において、間葉系Ｇｌｉ１の発現は、ＴＩ２３ウイルスを受けた動物と同様のレベルで約１１．７倍高い力価で観察された（図９Ｃ）。したがって、類似のレベルの間葉系発現のために、ＴＩ２３^Ｃｏｌ１ウイルスの力価の約８．５％のみがＴＩ２３ウイルスと比較して必要とされる。対照的に、上皮におけるＧｌｉ１発現は、対照動物におけるレベルと同様に、ＴＩ２３^Ｃｏｌ１を受けた動物において最小であり（図９Ｄ）、ＴＩ２３^Ｃｏｌ１が間葉におけるヘッジホッグ経路を優先的に活性化することを示すことに留意されたい。

【0142】

ペプチド又はナノボディ又は他の標的化配列を融合する類似の戦略を使用して、ヘッジホッグ経路の活性化を他の特定の区画に制限することができる。

【0143】

実施例３
完全に遺伝的にコード可能なヘッジホッグタンパク質模倣物であるＴＩ２３は、また、前例がない特性を有する多様な経路アゴニストの組のタンパク質工学を可能にする。例えば、現在、天然又は合成分子は、細胞自律型又は細胞型特異的な方法で、Ｐａｔｃｈｅｄ１を阻害し、Ｈｈ経路活性を刺激することができない。これは、配列番号２７に示す、ナノボディを発現する細胞内で特異的に繊毛膜上のＰａｔｃｈｅｄ１を不活性化する、繊毛膜繋ぎ止めＴＩ２３（図Ａ及びＢ）を操作することによって達成することができる。

【0144】

そのような操作されたＴＩ２３の有用性は、数倍である。１．細胞又は組織型特異的プロモーターと組み合わせる場合、そのような構築物は、遺伝的に定義された細胞サブ集団においてＨｈ経路を活性化する有望なモダリティを提供する。２．この繊毛膜繋ぎ止めＴＩ２３の発現は、また、制御された経路活性化のために、特定の化学的又は物理的（光学的、磁気的、音響的、温度など）刺激に応答する誘導性プロモーターの制御下にあることができる。３．加えて、ＴＩ２３の発現レベル及びナノボディとＰａｔｃｈｅｄ１との間の親和性の両方が微調整され得るので、Ｈｈ経路活性化の程度は、そのようなアプローチを使用して正確に調節され得る。

【0145】

配列
＞１０（配列番号１）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＴＩＦＬＳＨＹＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＡＩＮＦＧＴＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＦＴＰＩＦＨＨＬＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１２（配列番号２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＬＰＹＹＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＳＩＤＱＧＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＡＹＴＰＥＶＹＨＩＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１３（配列番号３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＳＤＴＧＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＳＩＧＧＧＴＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＬＲＮＹＧＩＦＹＶＳＫＹＳＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１５（配列番号４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＤＤＧＮＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＡＹＧＳＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＹＦＰＤＮＰＰＹＹＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１７（配列番号５）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＤＧＮＬＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＧＧＡＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＷＬＹＴＰＶＦＹＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１９（配列番号６）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＩＦＷＹＶＮＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＧＩＤＨＧＴＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＧＹＲＹＧＦＱＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１（配列番号７）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＴＩＦＹＬＹＹＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＩＧＥＧＧＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＶＩＮＶＬＧＨＨＧＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞２０（配列番号８）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＬＷＥＳＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩＮＴＧＳＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＲＶＩＳＷＹＮＦＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞２２（配列番号９）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＴＩＦＱＡＧＧＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＧＨＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＷＷＤＬＲＨＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞２３（配列番号１０）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＧＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰＹＲＹＨＧＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞２（配列番号１１）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＴＩＳＴＡＴＱＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＡＹＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＬＰＤＹＹＨＹＨＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞３（配列番号１２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＳＴＩＱＱＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＧＦＧＴＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＱＷＴＩＷＤＡＨＴＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞６（配列番号１３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＩＦＡＤＱＧＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＴＩＤＶＧＡＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＧＩＴＩＮＧＶＩＹＶＰＨＧＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１０（配列番号１４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＴＩＦＬＳＨＹＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＡＩＮＦＧＴＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＦＴＰＩＦＨＨＬＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１２（配列番号１５）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＬＰＹＹＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＳＩＤＱＧＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＡＹＴＰＥＶＹＨＩＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１３（配列番号１６）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＳＤＴＧＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＳＩＧＧＧＴＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＬＲＮＹＧＩＦＹＶＳＫＹＳＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１７（配列番号１７）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＤＧＮＬＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＧＧＡＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＷＬＹＴＰＶＦＹＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号１０の既知の配列変異
配列番号１０のバリエーションは、活性において配列番号１０を維持するか、又はそれを上回ることが観察されている。活性に影響を与える配列のいくつかの重要な位置を以下に示す。
（配列番号２４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡ［Ｇ／Ａ／Ｓ／Ｔ／Ｄ］ＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮ［Ｔ／Ｎ］ＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰ［Ｙ／Ｉ］ＲＹ［Ｈ／Ｒ］［Ｇ／Ｒ］ＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ナノボディ配列としては、以下が挙げられる。
＞１０－１（配列番号１８）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＧＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡ
ＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰＹＲＹＨＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１０－２（配列番号１９）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＳＩＤＩＧＧＳＴＮＹＡ
ＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＨＣＶＶＱＡＶＰＹＲＹＲＧＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１０－３（配列番号２０）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＡＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡ
ＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＧＡＶＱＡＶＰＹＲＹＨＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１０－４（配列番号２１）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＤＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡ
ＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＮＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰＹＲＹＨＧＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１０－５（配列番号２２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＮＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＴＩＤＩＧＳＮＴＮＹＡ
ＤＳＶＫＧＲＦＮＩＳＲＤＮＡＫＮＩＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰＹＲＹＲＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞１０－６（配列番号２３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＴＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡ
ＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰＩＲＹＲＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２５、リンカーを介して末端に融合されたＣＯＬ１結合配列（配列番号２５）を含むＴＩ２３^Ｃｏｌ１タンパク質。
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＴＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰＩＲＹＲＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＳＧＬＲＥＬＨＬＮＮＮ
配列番号２６
ＬＲＥＬＨＬＮＮＮ
配列番号２７、成熟ＴＩ２３ナノボディを、ＣＤ８（配列番号２７）の膜貫通ドメイン及び繊毛局在化配列（配列番号２８）に融合させる。
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＩＦＡＹＹＩＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＴＩＤＩＧＧＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶＱＡＶＰＩＲＹＲＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＬＳＹＲＦＫＱＧＦＲＲＩＬＬＲＰＳＲＲＩＲＳＱＥＰＧＳＧＰＰＥＫＴＥＥＥＥＤＥＥＥＥＥＲＲＥＥＥＥＲＲＭＱＲＧＱＥＭＮＧＲＬＳＱＩＡＱＡＧＴＳＧＱＱＰＲＰＣＴＧＴＡＫＥＱＱＬＬＰＱＥＡＴＡＧＤＫＡＳＴＬＳＨＬ
配列番号２８ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン
ＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
配列番号２９繊毛局在化配列、Ｓｓｔｒ３ ＣＬＳ（元のタンパク質由来のａａ ３２５－４２８）
ＬＳＹＲＦＫＱＧＦＲＲＩＬＬＲＰＳＲＲＩＲＳＱＥＰＧＳＧＰＰＥＫＴＥＥＥＥＤＥＥＥＥＥＲＲＥＥＥＥＲＲＭＱＲＧＱＥＭＮＧＲＬＳＱＩＡＱＡＧＴＳＧＱＱＰＲＰＣＴＧＴＡＫＥＱＱＬＬＰＱＥＡＴＡＧＤＫＡＳＴＬＳＨＬ

【0146】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／０８３，５４４号の利益及び優先権を主張し、その開示全体が本明細書に記載されている。

【0147】

連邦政府による資金提供の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された契約ＧＭ１０２４９８下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0148】

テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０２１年９月２７日に作成され、４５０００バイトのサイズを有するテキストファイル（ＳＴＡＮ－１６８８ＷＯ＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）で本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

2023543232000001.app

【国際調査報告】