特表2023-543344多能性幹細胞を中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞に分化する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-13
(54)【発明の名称】多能性幹細胞を中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞に分化する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0793 20100101AFI20231005BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20231005BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231005BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20231005BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20231005BHJP
C12N 5/0797 20100101ALN20231005BHJP
C12N 5/0735 20100101ALN20231005BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20231005BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0793
A61K35/30
A61P25/28
A61P25/16
A61P25/14
C12N5/0797
C12N5/0735
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023541855
(86)(22)【出願日】2021-09-14
(85)【翻訳文提出日】2023-05-16
(86)【国際出願番号】 CN2021118183
(87)【国際公開番号】W WO2022062960
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】202011002775.4
(32)【優先日】2020-09-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ
(71)【出願人】
【識別番号】523102519
【氏名又は名称】上海躍賽生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＸＥＬＬ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】陳 躍 軍
(72)【発明者】
【氏名】周 文 浩
(72)【発明者】
【氏名】熊 曼
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065BC50
4B065BD21
4B065BD39
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087CA04
4C087DA32
4C087MA67
4C087NA20
4C087ZA15
4C087ZA16
(57)【要約】
多能性幹細胞を中脳黒質ドーパミン作動性（Ａ９ ｍＤＡ）ニューロン細胞に特定に分化する方法を提供する。分化して成熟したＡ９ ｍＤＡニューロンが、脳黒質ドーパミン作動性ニューロンの表面分子マーカー（ＴＨ、ＦＯＸＡ２、ＥＮ１、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１、とＧＩＲＫ２を含む）を発現することができるが、腹側被蓋野ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるＣＢをほとんど発現しない。上記のＡ９ｍＤＡ神経細胞を黒質に移植すると、その軸索が、内因性黒質ドーパミン作動性ニューロンに支配される標的脳領域－背側線条体へ特異性に投射する；移植されたＡ９ ｍＤＡニューロン自体は、低周波の自発放電周波数、超分極電流刺激に誘起されるｓａｇを含む、内因性黒質ドーパミン作動性ニューロンの典型的な電気生理特性を表す；Ａ９ ｍＤＡ神経細胞を神経変性疾患個体の黒質または線条体に移植すると、運動機能障害を改善することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）幹細胞を神経誘導剤を含む培地に置き、複数の段階では、添加組分でそれぞれに誘導すること；及び（２）培養物から上記幹細胞から由来する中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞を得ること
を含む、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞を調製する方法。
【請求項2】
（１）には、複数の段階では、異なる添加組分で誘導する：第一段階：ＳＢ４３１５４２、ＤＭＨ－１、ＳＨＨとＣＨＩＲ９９０２１を添加する；
第二段階：ＳＡＧ、ＳＨＨとＣＨＩＲ９９０２１を添加する；
第三段階：ＳＨＨ、ＳＡＧとＦＧＦ８ｂを添加する；
第四段階：ＳＨＨとＦＧＦ８ｂを添加する；
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
複数の段階では、異なる添加組分で誘導する：第一段階：１～１５μＭのＤＭＨ－１、２００～１０００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨ、０．１～１μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加する；
第二段階：０．１～５μＭのＳＡＧ、５０～３００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．１～１μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加する；
第三段階：５～１００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．１～５μＭのＳＡＧ、５～２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂを添加する；
第四段階：５～１００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、５～８０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂを添加する；
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項4】
複数の段階では、異なる添加組分で誘導する：第一段階：１０±５μＭのＳＢ４３１５４２、２±１μＭのＤＭＨ－１を添加し、５００±２００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．４±０．２μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加する；
第二段階：２±１μＭのＳＡＧ、１００±５０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．４±０．２μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加する；
第三段階：２０±１０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨと０．５±０．２μＭのＳＡＧ、１００±５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂを添加する；
第四段階：２０±１０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、２０±１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂを添加する；
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項5】
各の段階では、第一段階：培養開始から培養６～８日間；好ましくは、７±０．５日間；
第二段階：培養６～８日間から培養１１～１３日間；好ましくは１２±０．５日間；
第三段階：培養１１～１３日間から培養１８～２０日間；好ましくは１９±０．５日間；
第四段階：培養１８～２０日間から培養３１～３３日間；好ましくは３２±０．５日間；
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
上記の幹細胞は、胚性幹細胞又は誘導性多能性幹細胞を含む；好ましくは、上記の幹細胞は、ヒト幹細胞であり、上記の胚性幹細胞又は誘導性多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導性多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一つの方法で調製して得る中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞。
【請求項8】
中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞が、分化５～１０日後、チロシンヒドロキシラーゼ、ＦＯＸＡ２、ＥＮ１、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１及び／又はＧＩＲＫ２を含む、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロンの表面分子マーカーを発現するが、腹側被蓋野ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるＣＡＬＢをほとんど発現しない中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞。
【請求項9】
上記の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞を、脳の黒質領域に移植したあと、移植して分化して得たＡ９中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロン軸索は、内因性の黒質ドーパミン作動性ニューロンに支配される標的脳領域－背側線条体に特異性に投射される；及び／又は移植して分化して得たＡ９中脳ドーパミン作動性ニューロン自体が、低周波の自発放電周波数、超分極電流刺激に誘起されるｓａｇを含む内因性の黒質ドーパミン作動性ニューロンとする典型的な電気生理特性を表す；及び／又は
移植して分化して得たＡ９中脳ドーパミン作動性ニューロンが、脳の黒質又は線条体に作用させると、運動機能障害を改善することができる；
ことを特徴とする請求項７又は８に記載の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞。
【請求項10】
上記の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞は、Ａ９中脳ドーパミン作動性細胞である；好ましくは、分化５～１０日後、その８０％超がＡ９ ｍＤＡニューロンマーカーであるＧＩＲＫ２を発現する；より好ましくは、その８５％超がＡ９ ｍＤＡニューロンマーカーであるＧＩＲＫ２を発現することを特徴とする請求項７又は８に記載の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞。
【請求項11】
分化５～１０日後、総細胞中の４０％以上又はＴＵＪ１＋ニューロン中の５０％以上の細胞が、当該特徴を有する；より好ましくは、総細胞中の５０％以上又はＴＵＪ１＋ニューロン中の６０％以上の細胞が、当該特徴を有することを特徴とする請求項７又は８に記載の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞。
【請求項12】
請求項７～１１のいずれか一つに記載の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞から分化して得る中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞；好ましくは、それが、ＴＨ、ＦＯＸＡ２、ＥＮ１、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１及び／又はＧＩＲＫ２を含む、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロンの表面分子マーカーを発現するが、腹側被蓋野ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるＣＡＬＢ（ＣＢ）をほとんど発現しない。
【請求項13】
神経変性疾患を治療する製剤の調製における請求項７～１１のいずれか一つに記載の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞の応用。
【請求項14】
請求項７～１１のいずれか一つに記載の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞；及び、薬学的に許容される担体を含む神経変性疾患を治療する製剤。
【請求項15】
上記の製剤は：大脳黒質領域又は線条体移植の移植物として；
運動機能障害の予防・治療に
使用されることを特徴とする請求項１４に記載の応用。
【請求項16】
上記の神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ルイ認知症、ハンチントン病、筋萎縮側索硬化症、神経損傷を含むことを特徴とする請求項１５に記載の応用。
【請求項17】
以下を含む神経変性疾患を改善する物質のスクリーニング方法：（１）候補物質でモデル系を処理し、当該モデル系は、大脳神経回路が損傷され又は神経機能が損傷され、且つ中脳ドーパミン作動性ニューロンを含むモデル系である；及び
（２）上記のモデル系を検測し、上記の候補物質は、ドーパミン作動性ニューロンが大脳中の損傷した神経回路を修復すること又はその再構築神経機能を再構築することを、統計学的に促進する場合、当該候補物質は、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【請求項18】
ステップ（１）に記載のモデル系は、動物モデル系、組織モデル系、器官モデル系、細胞モデル系であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
ステップ（２）が、以下を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法：中脳ドーパミン作動性ニューロンに対する上記の候補物質の影響を観測することを含み、中脳ドーパミン作動性ニューロンの黒質－線条体回路に対する修復を促進する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である；又は
中脳ドーパミン作動性ニューロンに対する上記の候補物質の影響を観測することを含み、中脳ドーパミン作動性ニューロンのシナプス前とシナプス後の統合を促進する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である；又は
中脳ドーパミン作動性ニューロンに対する上記の候補物質の影響を観測することを含み、中脳ドーパミン作動性ニューロンの軸索の背側への投射を促進する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である；又は
中脳ドーパミン作動性ニューロンに対する上記の候補物質の影響を観測することを含み、中脳ドーパミン作動性ニューロンから神経繊維を成長させ、内因性黒質－線条体神経接続経路に沿って特異的に成長し、その内因性標的領域－線条体まで延長し、線条体ニューロンと神経接続を形成し、線条体に投射することを促進する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【請求項20】
上記のモデル系は、動物系であり、当該動物が、運動機能障害という特点を有する；更に、動物の運動能力を観測することを含み、上記の候補物質が、その運動機能障害を更に改善する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、神経幹細胞科学分野に属し、より具体的に、本発明は、多能性幹細胞を中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞に分化する分化方法に関する。
本発明は、神経幹細胞科学分野に属し、より具体的に、本発明は、多能性幹細胞を中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞に分化する分化方法に関する。
【背景技術】
【0002】
背景技術
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）は、長期の中枢神経系変性疾患であり、平均発病年齢は６０歳、６５歳以上の老人の中で発病率は１．７％である。国際疫学調査によると、２００５年の中国ＰＤ患者は約２００万人で、世界の発症者の半分を占めている。２０３０年までに、中国では５００万人近くのＰＤ患者が発生すると予想されている。パーキンソン病の患者は、静止性振戦、筋張力上昇、運動遅延、姿勢不安定などの運動障害としてよく見られる。パーキンソン病の病理的基礎は、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロンの変性的変化と損失であり、線条体ドーパミン作動性レベルが著しく低下し、運動機能の障害を招いた。
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）は、長期の中枢神経系変性疾患であり、平均発病年齢は６０歳、６５歳以上の老人の中で発病率は１．７％である。国際疫学調査によると、２００５年の中国ＰＤ患者は約２００万人で、世界の発症者の半分を占めている。２０３０年までに、中国では５００万人近くのＰＤ患者が発生すると予想されている。パーキンソン病の患者は、静止性振戦、筋張力上昇、運動遅延、姿勢不安定などの運動障害としてよく見られる。パーキンソン病の病理的基礎は、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロンの変性的変化と損失であり、線条体ドーパミン作動性レベルが著しく低下し、運動機能の障害を招いた。
【0003】
ドーパミン作動性ニューロンは、カテコールアミン系神経伝達物質であるドーパミンを分泌できることから名づけられ、脳内に広く分布している。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、ＴＨ）をマーカーとし、ＴＨは、ドーパミン合成における律速酵素であり、チロシンのＬ－ドパ（Ｌ－ＤＯＰＡ）への転換を触媒する役割を担う。中脳では、ドーパミン作動性ニューロンは、主に３つの神経核に分布している：黒質緻密部（ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｐａｒｓ ｃｏｍｐａｃｔａ、ＳＮｃ）、腹側被蓋野（ｔｈｅ ｖｅｎｔｒａｌ ｔｅｇｍｅｎｔａｌ ａｒｅａ、ＶＴＡ）、および後赤核領域（ｔｈｅ ｒｅｔｒｏｌｂｒａｌ ｆｉｅｌｄ、ＲｒＦ）。ＳＮｃのドーパミン作動性ニューロンは、Ａ９ ｍＤＡニューロンとも呼ばれ、ＶＴＡのは、Ａ１０ ｍＤＡニューロン、ＲｒＦのは、Ａ８ ｍＤＡニューロンとも呼ばれ、Ａ８－１０の命名は、解剖学的な定位に基づいて区別されている。Ａ９ ｍＤＡニューロンとＡ１０ ｍＤＡニューロンは、中脳ドーパミン作動性ニューロン（ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ， ｍＤＡ）の２種類の重要なサブタイプであり、２種類のニューロンは、位置分布の違いを除いて、投射回路もそれぞれ異なっている。Ａ９ ｍＤＡニューロンは主に背外側の線条体に投射され、中脳黒質－線条体回路を構成し、主に運動機能を制御し、パーキンソン病で特異的に損失したドーパミン作動性ニューロンサブグループである。Ａ１０ ｍＤＡニューロンは、主に側坐核、皮質、嗅皮層、扁桃体などに投射され、中脳辺縁皮質回路を構成し、報酬、情緒などの機能の制御に関与する。
【0004】
Ａ９ ｍＤＡニューロンとＡ１０ ｍＤＡニューロンは、パーキンソン病には異なる易感性を示した。パーキンソン病患者の脳内では、ＳＮｃのＡ９ ｍＤＡニューロンが、優先的に退化し、ＳＮｃ腹側の細胞は背側よりも敏感であるが、隣接するＶＴＡのＡ１０ ｍＤＡニューロンは相対的に免れた。細胞内カルシウム結合蛋白質ｃａｌｂｉｎｄｉｎ（ＣＡＬＢ）は、Ａ１０ ｍＤＡニューロンのマーカーとして使用され、ｃａｌｂｉｎｄｉｎは、ＰＤ患者とＰＤモデル動物の脳内ドーパミン作動性ニューロンの中で拮抗能を持つニューロン（大部はＡ１０ ｍＤＡニューロン）を区別するために使用さる。もう一つのタンパク質であるＧ－タンパク質ゲート内向き整流性カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）は、Ｄ２またはＧＡＢＡ受容体を活性化することによって、緩やかな抑制性シナプス後電位を生成し、それによってドーパミン作動性ニューロンの活性を制御する。その中で、ＧＩＲＫ２は、特異的に、感作性ドーパミン作動性ニューロン（大部はＡ９ ｍＤＡニューロン）に発現される。
【0005】
臨床上、パーキンソン病を治癒する有効な治療案はまだなく、現在応用されている治療手段は症状を改善するしかなく、病状の進展を阻止することはできない。薬物治療は、パーキンソン病の最も主要な治療手段であり、ドーパミンを補充したり、ドーパミン受容体機能を増強したりすることによって治療の効果を達成して、Ｌ－ドパ（Ｌ－ＤＯＰＡ）製剤は依然として最も有効な薬物である；しかし、薬物はＰＤの初期段階でしか有効ではなく、ドーパミン作動性ニューロンの更なる損失につれて、薬物は徐々に失効し、明らかな副作用が現れる。脳深部の電気刺激術は、パーキンソン病患者の治療にも応用されている。しかし、薬物治療と同様に、手術治療は症状を改善するだけで、病気を根治することはできない。また、深部脳刺激の副作用により、この治療手段は一部の患者にしか適用されない。外部来源からドーパミン作動性ニューロンを移植し、さらに脳内で損失したドーパミン作動性ニューロンの機能に代わる方法（幹細胞治療）は、将来性のある治療法の１つである。臨床試験により、流産胎児の中脳腹側（中脳ドーパミン作動性神経前駆細胞が位置する脳領域）の細胞を患者の線条体に移植し、一部の患者の運動機能を長期的に回復させることができ、しかも薬物を必要としないか、少量しか使用しないことが分かった。移植した一部の神経前駆細胞は、ＤＡニューロンに分化し、ＤＡを放出することができる。これらの臨床研究は、ＰＤ治療における幹細胞治療の巨大な潜在能力を証明した。しかし、流産胎児の脳組織源はわずかであり、かつ倫理学的な問題もある。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）とヒト誘導性多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）を含むヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）は、全身のあらゆるタイプの細胞に分化する可能性があり、治療のために様々な機能細胞を得るための理想的な細胞源である。体内発育の原則に従い、ヒト多能性幹細胞は、中脳ドーパミン作動性ニューロンへの分化を誘導することができる。これらの細胞はＰＤモデルマウスの線条体内に移植され、生存することができ、パーキンソン病の行動表現を救うことができ、パーキンソン病の治療に新たな希望をもたらした。
【0006】
しかし、これらの研究では、移植細胞中の中脳ドーパミン作動性ニューロンのサブタイプ（Ａ９／Ａ１０）を明確に区別しなかった。上述のように内部来源の異なるサブタイプのドーパミン作動性ニューロンは、その電気生理特性、支配する脳領域と生理機能が全く異なる。そのため、中脳ドーパミン作動性ニューロンの異なるサブタイプに対する分化方法を開発する必要があり、特にパーキンソン病に対する細胞治療には、効率的な中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン富化の分化方法を開発する必要がある。また、分化して得られるドーパミン作動性ニューロンには、マーカー分子の発現、電気生理的特徴、軸索投射の特徴などを含む複数のレベルから、それらのサブタイプ特異性を検証する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
発明の内容
本発明の目的は、多能性幹細胞を、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞に分化する特定の方法、およびその方法により得られる細胞または細胞製剤を提供することである。
本発明の目的は、多能性幹細胞を、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞に分化する特定の方法、およびその方法により得られる細胞または細胞製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の第一は、（１）幹細胞を神経誘導剤を含む培地に置き、複数の段階では、添加組分でそれぞれに誘導すること；及び、（２）培養物から上記幹細胞から由来する中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞を得ること；を含む、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞を調製する方法を提供する。
【0009】
一つの好ましい例において、（１）には、複数の段階では、異なる添加組分で誘導する：第一段階：ＳＢ４３１５４２、ＤＭＨ－１、ＳＨＨとＣＨＩＲ９９０２１を添加する；第二段階：ＳＡＧ、ＳＨＨとＣＨＩＲ９９０２１を添加する；第三段階：ＳＨＨ、ＳＡＧとＦＧＦ８ｂを添加する；第四段階：ＳＨＨとＦＧＦ８ｂを添加する。
【0010】
もう一つの好ましい例において、第一段階には、１～１５μＭ（例えば２、５、８、１２、１４μＭ）のＳＢ４３１５４２、１～５μＭ（例えば０．４、０．６、１、３、５、１０、１５、１８μＭ）のＤＭＨ－１、２００～１０００ｎｇ／ｍＬ（例えば３００、４００、６００、７００、８００、９００ｎｇ／ｍＬ）のＳＨＨ、０．１～１μＭ（例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９μＭ）のＣＨＩＲ９９０２１を添加する。
【0011】
より好ましい例において、第一段階には、１０±５μＭのＳＢ４３１５４２、２±１μＭのＤＭＨ－１を添加し、５００±２００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．４±０．２μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加する。さらに好ましくは、１０±２μＭのＳＢ４３１５４２、２±０．５μＭのＤＭＨ－１を添加し、５００±１００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．４±０．１μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加する。
【0012】
もう一つの好ましい例において、第二段階には、０．１～５μＭ（例えば０．２、０．５、０．８、１、２、３、４μＭ）のＳＡＧ、５０～３００ｎｇ／ｍｌ（例えば８０、１００、１５０、２００、２５０ｎｇ／ｍｌ）のＳＨＨ、０．１～１μＭ（例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９μＭ）のＣＨＩＲ９９０２１を添加する。
【0013】
より好ましい例において、第二段階には、２±１μＭのＳＡＧ、１００±５０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．４±０．２μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加する。さらに好ましくは、２±０．５μＭのＳＡＧ、１００±２０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．４±０．１μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加する。
【0014】
もう一つの好ましい例において、第三段階には、５～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｎｇ／ｍｌ；好ましくは、５～５０ｎｇ／ｍｌ）のＳＨＨ、０．１～５μＭ（例えば０．２、０．５、０．８、１、２、３、４μＭ）のＳＡＧ、５～２００ｎｇ／ｍｌ（例えば１０、１５、２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ８ｂを添加する。
【0015】
より好ましい例において、第三段階には、２０±１０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨと０．５±０．２μＭのＳＡＧ、１００±５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂを添加する。さらに好ましくは、２０±５ｎｇ／ｍｌのＳＨＨと０．５±０．１μＭのＳＡＧ、１００±２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂを添加する。
【0016】
もう一つの好ましい例において、第四段階には、５～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｎｇ／ｍｌ）のＳＨＨ、５～８０ｎｇ／ｍｌ（例えば１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ８ｂを添加する。
【0017】
より好ましい例において、第四段階には、２０±１０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、２０±１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂを添加する。さらに好ましくは、２０±３ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、２０±３ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂを添加する。
【0018】
もう一つの好ましい例において、各段階において、第一段階：培養開始から培養６～８日；好ましくは、７±０．５日；第二段階：培養６～８日から培養１１～１３日；好ましくは１２±０．５日；第三段階：培養１１～１３日から培養１８～２０日；好ましくは１９±０．５日；第四段階：培養１８～２０日から培養３１～３３日；好ましくは３２±０．５日。
【0019】
もう一つの好ましい例において、上記の幹細胞は、胚性幹細胞又は誘導性多能性幹細胞を含む；好ましくは、上記の幹細胞は、ヒト幹細胞であり、上記の胚性幹細胞又は誘導性多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導性多能性幹細胞である。
【0020】
本発明のもう一つは、前記のいずれか一つの方法で調製された中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞を提供する。
【0021】
本発明のもう一つは、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞を提供し、上記の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞が、分化５～１０日（例えば６、７、８、９日）後、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＦＯＸＡ２、ＥＮ１、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１及び／又はＧＩＲＫ２を含む、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロンの表面分子マーカーを発現するが、腹側被蓋野ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるＣＡＬＢ（ＣＢ）をほとんど発現しない。
【0022】
もう一つの好ましい例において、上記の分化は、インビトロ分化であり、インビトロでの付着と成熟、成熟した中脳黒質ドーパミン作動性ニューロンへの分化を含む。
【0023】
もう一つの好ましい例において、上記の分化は、インビボ分化であり、インビボでの成熟を含む。
【0024】
もう一つの好ましい例において、腹側被蓋野ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるＣＡＬＢをほとんど発現しないことは、２０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１２％、１０％、８％未満のＣＡＬＢを発現すると指す。
【0025】
もう一つの好ましい例において、上記の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞を、脳の黒質領域に移植したあと、移植して分化して得たＡ９ 中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロン軸索は、内因性の黒質ドーパミン作動性ニューロンに支配される標的脳領域－背側線条体に特異性に投射される。
【0026】
もう一つの好ましい例において、移植して分化して得たＡ９中脳ドーパミン作動性ニューロン自体が、低周波の自発放電周波数、超分極電流刺激に誘起されるｓａｇを含む内因性の黒質ドーパミン作動性ニューロンとする典型的な電気生理特性を表す。
【0027】
もう一つの好ましい例において、移植して分化して得たＡ９中脳ドーパミン作動性ニューロンが、脳の黒質又は線条体に作用させると、運動機能障害を改善することができる。
【0028】
もう一つの好ましい例において、上記の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞は、Ａ９中脳ドーパミン作動性細胞である；好ましくは、分化５～１０日（例えば６、７、８、９日）後、その８０％超がＡ９ ｍＤＡニューロンマーカーであるＧＩＲＫ２を発現する；より好ましくは、その８５％超がＡ９ ｍＤＡニューロンマーカーであるＧＩＲＫ２を発現する。
【0029】
もう一つの好ましい例において、分化５～１０日後、総細胞中の４０％（例えば４５％、５０％、５５％、６０％、７０％）以上又はＴＵＪ１＋ニューロン中の５０％（例えば５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％）以上の細胞が、当該特徴を有する；より好ましくは、総細胞中の５０％（例えば５５％、６０％、６５％、７０％、７５％）以上又はＴＵＪ１＋ニューロン中の６０％（例えば６５％、７０％、７５％）以上の細胞が、当該特徴を有する。
【0030】
本発明のもう一つは、前記のいずれか一つの中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞から分化して得る中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞を提供し、好ましくは、それが、ＴＨ、ＦＯＸＡ２、ＥＮ１、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１及び／又はＧＩＲＫ２を含む、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロンの表面分子マーカーを発現するが、腹側被蓋野ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるＣＡＬＢ（ＣＢ）をほとんど発現しない。
【0031】
本発明のもう一つは、神経変性疾患を治療する製剤（細胞培養物又は分離物を含む）の調製における前記のいずれか一つの中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞の応用を提供する。
【0032】
本発明のもう一つは、前記のいずれか一つの中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞；及び、薬学的に許容される担体を含む神経変性疾患を治療する製剤を提供する。
【0033】
もう一つの好ましい例において、上記の製剤はさらに、大脳黒質領域又は線条体移植の移植物（薬物）として使用される。
【0034】
もう一つの好ましい例において、上記の製剤はさらに、運動機能障害の予防・治療に使用される。
【0035】
もう一つの好ましい例において、上記の神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ルイ認知症、ハンチントン病、筋萎縮側索硬化症、神経損傷を含むが、これらに限定されない。
【0036】
本発明のもう一つは、神経変性疾患を改善する物質（潜在物質を含む）をスクリーニングする方法を提供し、上記の方法は、以下を含む：（１）候補物質でモデル系を処理し、当該モデル系は、大脳神経回路が損傷され又は神経機能が損傷され、且つ中脳ドーパミン作動性ニューロン（細胞）を含むモデル系である；及び、（２）上記のモデル系を検測し、上記の候補物質は、ドーパミン作動性ニューロンが大脳中の損傷した神経回路を修復すること又はその神経機能を再構築することを、統計学的に促進（著しく促進、例えば１０％以上、２０％以上、５０％以上、８０％以上など促進）する場合、当該候補物質は、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【0037】
もう一つの好ましい例において、ステップ（１）に記載のモデル系は、動物モデル系、組織モデル系、器官モデル系、細胞（培養物）モデル系である。
【0038】
もう一つの好ましい例において、ステップ（２）において、中脳ドーパミン作動性ニューロンに対する上記の候補物質の影響を観測することを含み、中脳ドーパミン作動性ニューロンの黒質－線条体回路に対する修復を促進（著しく促進、例えば１０％以上、２０％以上、５０％以上、８０％以上など促進）する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【0039】
もう一つの好ましい例において、ステップ（２）において、中脳ドーパミン作動性ニューロンに対する上記の候補物質の影響を観測することを含み、中脳ドーパミン作動性ニューロンのシナプス前とシナプス後の統合を促進（著しく促進、例えば１０％以上、２０％以上、５０％以上、８０％以上など促進）する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【0040】
もう一つの好ましい例において、ステップ（２）において、中脳ドーパミン作動性ニューロンに対する上記の候補物質の影響を観測することを含み、中脳ドーパミン作動性ニューロンの軸索の背側（Ｃａｕｄａｔｅ ｐｕｔａｍｅｎ、ＣＰｕ）への投射を促進（著しく促進、例えば１０％以上、２０％以上、５０％以上、８０％以上など促進）する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【0041】
もう一つの好ましい例において、ステップ（２）において、中脳ドーパミン作動性ニューロンに対する上記の候補物質の影響を観測することを含み、中脳ドーパミン作動性ニューロンから神経繊維を成長させ、内因性黒質－線条体神経接続経路に沿って特異的に成長し、その内因性標的領域－線条体まで延長し、線条体ニューロンと神経接続を形成し、線条体に投射することを促進（著しく促進、例えば１０％以上、２０％以上、５０％以上、８０％以上など促進）する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【0042】
もう一つの好ましい例において、ステップ（２）において、以下を含む：上記のモデル系は、動物系であり、当該動物が、運動機能障害という特点を有する；更に、動物の運動能力を観測することを含み、上記の候補物質が、その運動機能障害を更に改善（著しく改善、例えば１０％以上、２０％以上、５０％以上、８０％以上など改善）する場合、それは、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【0043】
もう一つの好ましい例において、ステップ（２）において、以下を含む：ステップ（１）が、以下を含む：テストグループにおいて、候補物質でモデル系を処理する；及び／又は、ステップ（２）が、以下を含む：上記の系における、大脳中の損傷した神経回路又はその神経機能の再構築に対するドーパミン作動性ニューロンの作用を検測し、又は黒質－線条体回路の修復に対する中脳ドーパミン作動性ニューロンの作用を検測し、又は中脳ドーパミン作動性ニューロンのシナプス前とシナプス後の統合状況を検測し、又は動物の運動機能障害状況を観測すること；かつ、上記の候補物質を添加しない発現系であるコントロールグループと比較すること；上記の候補物質が、大脳中の損傷した神経回路又はその神経機能の再構築に対するドーパミン作動性ニューロンの作用や、黒質－線条体回路の修復に対する中脳ドーパミン作動性ニューロンの作用や、中脳ドーパミン作動性ニューロンのシナプス前とシナプス後の統合状況や、動物の運動機能障害の改善を、統計学的に促進する場合、当該候補物質は、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【0044】
もう一つの好ましい例において、上記のスクリーニング方法は、疾患の治療を直接目的とする方法を含まない。
【0045】
もう一つの好ましい方式において、上記の候補物質は、化合物、相互作用分子、生体高分子などを含むが、これらに限定されない。
【0046】
もう一つの好ましい例において、上記の方法はさらに、得られた物質又は潜在物質に対して、更なる細胞実験、動物（例えばネズミ、非ヒト霊長類）実験又はヒトに対する臨床試験を行うことで、候補物質から更に大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質を選択・確定することを含む。
【0047】
本文に開示された内容に基づき、当業者にとって、本発明の他の面は自明なものである。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】黒質に移植されたヒトニューロンの軸索投射。 （ＡとＢ）黒質移植マウスの脳切片矢状断面、ｍＤＡ（Ａ）とＧｌｕ（Ｂ）ニューロンのｈＮＣＡＭ免疫組織化学染色。スケールバー、２５０ｕｍ。黒枠領域は右上に拡大される。白い枠の領域は右下に拡大される。スケールバー、拡大される画像は、２５ｕｍである （Ｃ）解剖構造の３つの代表的な矢状断面概略図。 （Ｄ）対応する矢状面において、野生型マウス（左図）またはｍＤＡニューロン（中図）またはＧｌｕニューロン（右図）を移植したＰＤマウスのＴＨ免疫染色。 （Ｅ）異なる領域におけるｈＮＣＡＭ＋繊維の分布を定量化する。ｍＤＡグループｎ＝８，Ｇｌｕグループｎ＝６。 （Ｆ）ｍＤＡ移植マウスの背側（ＣＰｕ）と腹側線条体（Ａｃｂ）におけるｈＮＣＡＭ＋繊維の相対分布。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）の画像は、複数の高倍率拡大画像から自動的に結合されたものである。図８も参照。
【図2】黒質に移植されたニューロンの軸索投射経路。 （Ａ）ｍＤＡニューロンを移植したマウス脳の近似的な中外側平面およびそれと対応する連続矢状面ｈＮＣＡＭ免疫染色概略図。 （Ｂ）異なる矢状面にｈＮＣＡＭ＋軸索投射を描画する。ボックスの領域は（Ｃ）～（Ｆ）に拡大される。 （Ｃ～Ｆ）高倍率レンズで軸索の投射経路と領域を示す。スケールバー、２５０ｕｍ。（Ｃ）における赤色矢印は、ＭＦＢにおけるｈＮＣＡＭ＋軸索を表す。（Ｃ）における赤色矢印は、上りのｈＮＣＡＭ＋軸索を表す。（Ｆ）は外側線条体中のｈＮＣＡＭ＋繊維の分布を示す。（Ｄ）及び（Ｆ）における青色矢印は、皮質中のｈＮＣＡＭ＋繊維を表す。 （Ｇ）異なるホスト脳領域に移植されたｍＤＡ又はＧｌｕニューロン繊維中のｈＮＣＡＭ＋繊維の形態分布及びヒトＳＴＥＭ１２１及びＴＨとの共標識。スケールバー、５０ｍｍ（上）、２５ｍｍ（下）。 （Ｈ）ｍＤＡまたはＧｌｕニューロン移植マウスＣＰｕ中のＴＨと共標識されたヒトＳＴＥＭ１２１のピクセルの百分比を定量化する。データは平均値±ＳＥＭで表される。ｔ検定。＊＊＊ｐ＜０．００１。 （Ａ）と（Ｃ～Ｆ）の画像は、複数の高倍率拡大画像から自動的に結合されたものである。図９も参照。
【図3】遺伝的に標識されたヒトｍＤＡニューロンの軸索投射と電気生理特性。 （Ａ）ヒトのｍＤＡ及び非ｍＤＡニューロンの移植の可視化及び電気生理記録策略。 （Ｂ）ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ二重サイトノックインｈＥＳＣ細胞株（ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ ｈＥＳＣｓ）を構築する策略。 （Ｃ）上記のｈＥＳＣｓ細胞株を用いた分化４２日目の免疫染色は、ｔｄＴｏｍａｔｏとＥＹＦＰがＴＨ＋ニューロンで共発現している（白色矢印）が、ＴＨ－ニューロンにｔｄＴｏｍａｔｏ（白色矢印）がないことを示す。スケールバー、２０ｕｍ。 （Ｄ）免疫組織化学画像は、黒質移植のトランスジェニックヒトｍＤＡニューロンの移植ブロックに、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋／ＥＹＦＰ＋ｍＤＡニューロン（白色矢印）とｔｄＴｏｍａｔｏ－／ＥＹＦＰ＋非ｍＤＡニューロン細胞（白色矢印）を含むことを示す。 （Ｅ）黒質移植したＰＤマウス脳切片連続冠状切片免疫染色のｔｄＴｏｍａｔｏ。スケールバー、１ｍｍ。図に示するように、枠内領域が拡大される。スケールバー、０．１ｍｍ。点状赤色矢印は、腹側線条体からの上り軸索を示す。 （Ｆ）ヒトＳＴＥＭ１２１とｔｄＴｏｍａｔｏの共標識。スケールバー、５０ｕｍ。 （Ｇ～Ｉ）移植部位の冠状面切片、ＰＤマウス脳の線条体（ＧとＨ）または黒質（Ｉ）移植ブロックのｔｄＴｏｍａｔｏとＥＹＦＰ免疫染色。（Ｇ）における枠領域は下に拡大される。（Ｉ）における画像は、同じ移植ブロックの上部と下部の２つの個別の画像を合成したものである。スケールバー、１ｍｍ、上部（Ｇ）；１００ｍｍ、下部（Ｇ）；２５０ｕｍ、（Ｈ）と（Ｉ）。 （Ｊ）ｍＤＡニューロンレポーターマウス（ＤＡＴ－ｃｒｅ／Ａｉ９）の内因性ＳＮｃ ｍＤＡニューロンまたは線条体または黒質移植のヒトｍＤＡニューロン移植３ヶ月後、典型的な自発的動作電位（ｓＡＰｓ）が出現した。 （Ｋ～Ｍ）ｍＤＡニューロンレポーターマウスから由来の内因性中間ＶＴＡまたはＳＮｃ（Ｋ）または線条体移植のヒト非ｍＤＡニューロンまたはｍＤＡニューロン（Ｌ）は、移植後６ヶ月に典型的な電圧サグ特性を検出した。括弧内の数字は、記録された細胞にサグを示すニューロンの数を表す。サグの幅は（Ｍ）で表し、統計サンプル数は柱に表示される。データは平均値±ＳＥＭで表される。ｔ検定，＃＃ｐ＜０．０１，＃＃ｐ＜０．００１。 （Ｅ）、（Ｇ）と（Ｈ）の画像は、複数の高倍率拡大画像から自動的に結合されたものである。（Ｉ）における画像は、同一断面の上半分と下半分の２枚の個別の画像を結合してなるものである。図１０と１１も参照。
【図4】遺伝的に標識されたヒトｍＤＡニューロンの入力の、狂犬病に媒介される追跡。 （Ａ）ＰＤマウスのＳＮまたは線条体に入力された遺伝的に標識されたヒトｍＤＡニューロンの入力を追跡するための戦略。（Ｂ）ＴＨ－ｉＣｒｅ ｈＥＳＣ細胞株の構築の概略図。 （Ｃ）移植部位でＥＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏを発現するニューロン。スケールバー、１ｍｍ。（Ｄ）免疫組織化学画像が示すＳＮ移植部位ニューロンにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ、ＥＧＦＰ及びＴＨの発現。白色矢印は、ＥＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏがＴＨ＋ニューロンで共発現することを示す。スケールバー、１００ｍｍ。 （Ｅ）連続冠状切片は、追跡されたホストニューロン（ＥＧＦＰ＋／ｔｄＴｏｍａｔｏ－）における黒質または線条体に移植されたヒトｍＤＡニューロンの分布を示す。移植物と同じ側のみが表示される。スケールバー、１ｍｍ。 （Ｆ）定量化統計標識は、黒質または線条体に移植されたヒトｍＤＡニューロンの同側標識の入力であり、すべての同側入力のパーセントで表される。データは平均値±ＳＥＭとして表される。平均入力パーセントが１％を超える黒質または線条体移植物の大脳領域のみを示す。線条体移植の場合、ｎ＝３、黒質移植物の場合、ｎ＝５。ＮＤ，未検出。スチューデントのｔ検定、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１。 （Ｇ）標識されたニューロンを、異なるホスト脳領域に移植されたｍＤＡニューロンに入力させる拡大画像。スケールバー、２００ｍｍ。 （Ｈ）冠状断面で、Ａｃｂにおいて標識されたニューロンが移植されたｍＤＡニューロンに入力されたことを示す。ボックスの領域は、（Ｈ１）で拡大する。別の動物からの入力ニューロンの例示的な分布（Ｈ２）を示す。白色矢印は、標識された入力ニューロンが斑塊状に分布していることを示している。スケールバーは、１ｍｍ（上図）と０．５ｍｍ（下図）である。 （Ｃ～Ｅ）と（Ｈ）の画像は、複数の高倍率拡大画像から自動的に結合されたものである。（Ｇ）の画像はタイル画像から拡大される。図１２も参照。
【図5】ヒト由来ｍＤＡまたは非ｍＤＡニューロン入力の電気生理特性。 （ＡとＢ）移植後３ヶ月又は６ヶ月以内に線条体（Ａ）又は黒質（Ｂ）に移植されたヒトｍＤＡ又は非ｍＤＡニューロンには典型的なｓＥＰＳＣ及びｓＩＰＳＣがある。 （ＣとＤ）ｓＩＰＳＣ（Ｃ）とｓＥＰＳＣ（Ｄ）の周波数と振幅。データは平均値±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析を行い、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ事後検定を行った。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１；３ヶ月と６ヶ月移植されたｍＤＡまたは非ＤＡニューロンを比較した。＃＃ｐ＜０．０１，＃＃＃ｐ＜０．００１；ｍＤＡと非ｍＤＡニューロンの比較。 （Ｅ）野生型ＳＣＩＤマウスの内因性線条体またはＳＮｃニューロンと、移植後６ヶ月の線条体または黒質の非ｍＤＡまたはｍＤＡニューロンとのｓＩＰＳＣ／ｓＥＰＳＣ比。データは平均値±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析を行い、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ事後検定を行った。＃＃ｐ＜０．０１，＃＃＃ｐ＜０．００１。この列には統計用のサンプル番号が表示される。
【図6】移植動物の行動結果。 （Ａ）動物モデルの構築、移植、行動解析の実験過程。これらの動物に対して、アンフェタミンに誘導される回転、回転テストと円筒テストなどの行動学的テストを毎月行った。 （Ｂ）アンフェタミンに誘導される回転挙動は、移植後６ヶ月以内に変化した。 （Ｃ）回転テストは、移植前後の落下時間の変化を示した。 （Ｄ）円筒テストは、移植前後の同側選好変化を示した。 すべての３つの行動テストにおいて、黒質ｍＤＡグループｎ＝１１、黒質Ｇｌｕグループｎ＝８、黒ＡＣＳＦグループｎ＝８、線条体ｍＤＡグループｎ＝８であった。データは平均値±ＳＥＭとして表される。２段階分散分析を行い、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定を行った。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図7】移植を受けたＰＤマウスの双方向制御。 （Ａ）ＰＤマウスに移植されたヒトｍＤＡニューロンの双方向制御の概略図。 （Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙとＢｉ－ＤＲＡＤＤ ｈＥＳＣ系を生成する模式図。 （Ｃ）免疫染色により、Ｂｉ－ＤＲＡＤＤ ｈＥＳＣ分化の４２日目に、分化したｍＤＡニューロンにおいて、ＴＨ、ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びヘマトクリット（ＨＡ）標識のＫＯＲＤ共発現が示された。スケールバー、５０ｍｍ。 （Ｄ）免疫組織化学画像によると、Ｂｉ－ＤＲＡＤＤｈＥＳＣｓから分化したｍＤＡニューロンは移植後、ヒト核（ｈＮｓ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＴＨを共発現した。スケールバー、５０ｍｍ。 （Ｅ）動物モデルの実験過程、移植と行動解析。Ｓ回転、自発回転。 （ＦとＧ）アンフェタミンに誘導される回転と円筒テストは、回転行動（Ｆ）または同側優先触覚（Ｇ）の変化を示した。 （Ｈ）円筒テストにより、媒介体、ＣＮＯまたはＳＡＬＢで処理した後、ＰＤマウスの同側優先触覚（Ｇ）に変化が生じたことが明らかになった。 （ＩとＪ）自発回転テストは、ＣＮＯまたはＳＡＬＢに引かれた同側純回転（Ｉ）と同側優先回転（Ｊ）の変化を示した。
【図8】ｍＤＡ及びＧｌｕニューロンのインビトロ分化及びＴＨ繊維のインビボ分布。 （Ａ～Ｂ）ｈＥＳＣからの３２日目培養物の免疫染色でｍＤＡとして示された、標識された始原細胞（Ａ）と前脳グルタミン酸始原細胞（Ｂ）。Ｈｏ，Ｈｏｅｃｈｓｔ、スケールバー＝２５ｕｍ。（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）に提供された細胞分化の定量化。（Ｄ～Ｅ）ｈＥＳＣからの４２日目培養物の免疫染色でｍＤＡとして示された、標識されたニューロン（Ｄ）と前脳グルタミン酸ニューロン（Ｅ）。スケールバー＝２５ｕｍ。（Ｆ）（Ｄ）と（Ｅ）で紹介された細胞分化過程の定量化。（Ｇ）図１Ｄに示すように、野生型マウスＴＨ＋繊維の分布の領域別定量化。ｎ＝５。皮質中のＴＨ＋陽性細胞体も、計算に含まれる。
【図9】黒質移植のｍＤＡとＧｌｕニューロンの生存、軸索投射とシナプス形成。 （Ａ）ＰＤマウス脳からのｈＮＣＡＭの免疫組織化学画像。移植されたｍＤＡニューロンは、ＣＰｕ中のｈＮＣＡＭ＋繊維の分布と分岐化を示した。赤色矢印は、ｈＮＣＡＭ＋繊維のビーズ状構造を表す。スケールバー＝５０ｕｍ（Ｂ）ｎＤＡを移植したマウスの損傷した脳の免疫組織化学画像。ニューロンは異なる脳領域で、ｈＮＣＡＭ＋繊維の形態を示した。スケールバー＝１２５ｕｍ。 （Ｃ）ＰＤマウス脳からのｈＮＣＡＭの免疫組織化学画像。移植されたＧｌｕニューロンは、マウス皮質とＯＢ（嗅球）では、ｈＮＣＡＭ＋繊維の分布と分岐化を示した。スケールバー＝１２５ｕｍ。 （Ｄ）免疫組織化学画像は、黒質中に移植されたヒト由来細胞核（ｈＮ）とＧＩＲＫ２ ＴＨを共発現する陽性細胞を示した。ボックスの領域は、下で拡大する。大画像の場合、スケールバー＝１００ｕｍ、拡大画像の場合、スケールバー＝２５ｕｍ。矢印は二重陽性細胞を示す。 （Ｅ）免疫組織化学画像は、黒質中に移植されたヒト核（ｈＮ）陽性細胞が、ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａを共発現することを示した。スケールバー＝１００ｕｍ。 （Ｆ）（ＤとＥ）における細胞アイデンティティの定量化。 （Ｇ）ヒト由来の移植されたｍＤＡニューロンを有するマウス脳に対してヒト特異的染色して得られたシナプシンと、ホストＣＰｕ中のＴＨ（上図）またはＧＡＢＡ（下図）。ボックスの領域は、右で拡大する。白色矢印は、ヒト特異性的に、ＴＨ繊維に沿ってＴＨとシナプシンの共局在化が発生した。白色矢印は、ＧＡＢＡニューロン周囲のヒト特異的シナプシンとＧＡＢＡの細胞体の共局在性を示す。 （Ｈ）移植された神経を有するＧｌｕニューロンを有するマウスの脳染色と、ホストＣＰｕ中のヒト特異的シナプシンとＧＡＢＡ。ボックスの領域は、右で拡大する。白色矢印は、ヒト特異的シナプシンがＧＡＢＡニューロン細胞周囲に共局在化することを示す。
【図10】ｈＥＳＣ ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰの細胞株構築と特徴付け。 （Ａ）ｈＥＳＣ ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰの細胞系戦略の概略図。ＴＨサイト挿入またはホモ接合を示すＰＣＲプライマーは、それぞれ赤色矢印と黒色矢印で表される。ＡＡＶＳ１遺伝子座のＰＣＲプライマー挿入またはホモ接合は、緑色矢印と青色矢印によって示される。 （Ｂ）ｈＥＳＣ ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰのＰＣＲによる遺伝子型決定。正確にＴＨサイトまたはＡＡＶＳ１サイトを標的とする予想されるＰＣＲ産物は、それぞれ～１２００ｂｐ（赤色矢印）または～１０００ｂｐ（緑色矢印）である。ＴＨ遺伝子座またはＡＡＶＳ１遺伝子座のヘテロ接合性を同定するためにそれぞれ用いられるのは、～１０００ｂｐ（黒色矢印）または～６５０ｂｐ（青色矢印）のＰＣＲ産物である。～１０００ｂｐまたは～６５０ｂｐのＰＣＲ産物がないものは、ホモ接合されるものである。親細胞系Ｈ９ ＥＳＣｓをコントロールとした。ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ ｈＥＳＣ細胞株が、ＴＨ部位とＡＡＶＳ１部位の両方では、ホモ接合体である； （Ｃ）ＤＩＣ及び蛍光画像は、ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ ｈＥＳＣとＥＳＣ中の、ｍＤＡニューロン分化過程におけるｔｄＴｏｍａｔｏ及びＥＹＦＰの発現を示す。ｔｄＴｏｍａｔｏは、中間（Ｄ１５）および末期（Ｄ４８）段階で発現するが、ＥＳまたはｍＤＡニューロン分化の初期（Ｄ９）段階では発現しない。スケールバー＝１００ｕｍ； （Ｄ）上記ｈＥＳＣからの４２日目培養物の免疫染色は、ＴＨ＋ニューロンとｔｄＴｏｍａｔｏの共発現を示す。ボックスの領域は、下で拡大する。白色矢印は、ｔｄＴｏｍａｔｏとＴＨ高発現ニューロンを示す。白色矢印は、ｔｄＴｏｍａｔｏとＴＨ低発現ニューロンを示す。スケールバー＝２０ｕｍ； （Ｅ）免疫組織化学画像は、黒質ｍＤＡ移植物ＴＨ＋ニューロンにおけるｔｄＴｏｍａｔｏの発現を示す。ボックスの領域は拡大領域である。白色矢印状及び白色矢印は、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＴＨ高発現及び低発現ニューロンを表す。スケールバー＝２０ｕｍ； （Ｆ）免疫組織化学画像は、黒質ｍＤＡ移植物に、５－ＨＴ陽性のセロトニンニューロンを示す。ボックスには拡大領域が表示される。白色矢印は、ｔｄＴｏｍａｔｏ－と５－ＨＴ＋のニューロンを表す。スケールバー＝２０ｕｍ； （Ｇ）ｔｄＴｏｍａｔｏとＥＹＦＰ免疫染色の移植部位からの冠状断面。ＰＤマウスの大脳線条体に、ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ由来のｍＤＡニューロンを移植し、ｍＤＡニューロンの特定の投射を示した； ＣＰｕに到達するが、隣接する脳領域を含まない。スケールバー＝１ｍｍ。ボックスの領域は、下で拡大する。スケールバー＝１００ｕｍ。画像は、複数位置の高倍率拡大画像から自動的に結合されたものである。 （Ｈ）ＰＤマウス脳に、ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ由来のｍＤＡニューロンを移植した切片のＤＩＣと蛍光画像。白色矢印は、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ｍＤＡニューロン、白色矢印は、ＥＹＦＰ＋移植物中のｔｄＴｏｍａｔｏ－非ｍＤＡニューロンを表す。スケールバー＝５０ｕｍ。
【図11】ヒトｍＤＡニューロンまたは非ｍＤＡニューロンを黒質または線条体に移植し、機能成熟に関する電気生理検定を行った。 （Ａ～Ｄ）移植後３ヶ月に線条体（ＡとＣ）または黒質（ＢとＤ）に移植されたヒトｍＤＡまたは非ｍＤＡニューロンにおいて典型的な全細胞パッチクランプによって記録された青色光誘発動作電位（ＡとＢ）または電流誘発動作電位（ＣとＤ）。 （ＥとＦ）３ヶ月の線条体（Ｅ）または黒質（Ｆ）移植によるヒト非ｍＤＡニューロン移植後、典型的な全細胞パッチクランプによって記録された自発動作電位（ｓＡＰｓ）。破線は閾値電位を表す。 （ＧとＨ）ｍＤＡニューロンレポーターマウス（ＤＡＴ－Ｃｒｅ／Ａｉ９）の内因性ＳＮｃ ｍＤＡニューロンからの電位周波数自発動作電位周波数（ｓＡＰ）（Ｇ）と副閾値発振（Ｈ）、または３ヶ月に線条体または黒質に移植されたヒトｍＤＡニューロンの移植後のプロット。データは平均値±ＳＥＭとして表される。サンプル統計値は列に示される。一元配置分散分析、ｐ＞０．０５。 （ＩとＪ）６ヶ月後に移植されたヒトｍＤＡニューロンの移植後の線条体（Ｉ）または黒質（Ｊ）の典型的な全細胞パッチクランプによって記録された自発動作電位（ｓＡＰ）。破線は閾値電位を表す。 （ＫとＬ）移植後６ヶ月に移植されたヒト非ｍＤＡとｍＤＡニューロンの入力抵抗（Ｒｍ）、膜容量（Ｃｍ）、線条体（Ｋ）または黒質（Ｌ）のＴａｕのプロット。データは平均値±ＳＥＭとして表される。統計されたサンプル数は列に示される。スチューデントのｔ検定，＃ｐ＜０．０５。
【図12】ＴＨ－ｉｃｒｅ ｈＥＳＣ細胞系を構築し、狂犬病ウイルスで、遺伝的に標識されたヒト由来とマウス内因のｍＤＡニューロンをトレーシングした。 （Ａ）ＴＨ－ｉＣｒｅ ｈＥＳＣ細胞系遺伝子型の解析戦略概略図。ＴＨサイト挿入用またはホモ接合のＰＣＲプライマーは、それぞれ赤色矢印と黒色矢印で表される。緑色矢印は、ＰＧＫ－Ｐｕを除去するためのＰＣＲプライマーを示す。 （Ｂ）ＴＨ－ｉＣｒｅ ｈＥＳＣ系のＰＣＲ遺伝子型解析。正確にＴＨ部位を標的とするＰＣＲ産物は、１０００ｂｐ前後（赤色矢印）である。ホモ接合体クローンは、約１０００ｂｐ程度のＰＣＲ産物によって同定（黒い矢印）され、ＰＣＲ産物のないクローンはホモ接合体である。ＰＧＫ除去のためのＰＣＲ産物は、７５０ｂｐ前後（緑色矢印）である。親細胞系（Ｈ９ ＥＳＣｓ）をコントロールとした。ＰＧＫ－ｐｕ除去のＴＨサイトヘテロ接合クローン（赤色アスタリスク）を選択して実験を行った。 （Ｃ）レンチウイルスが、ユビキチンプロモーターによって駆動されるｃｒｅ依存性ｍＣｈｅｒｒｙ発現（Ｌｅｎｔｉ－Ｕｂｉ－ＤＩＯ－ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードする図。 （Ｄ）ＴＨ－ｉｃｒｅ分化により得られたｍＤＡニューロンは、レンチウイルスＬｅｎｔｉ－Ｕｂｉ－ＤＩＯ－ｍＣｈｅｒｒｙに感染することにより、ＴＨ＋ｍＤＡニューロン中でｍＣｈｅｒｒｙを発現する。ボックスの領域は右側に拡大される。白色矢印状は、ｍＤＡニューロンにおけるｍＣｈｅｒｒｙとＴＨの共発現を表す。白色矢状はＴＨ低発現のｍＣｈｅｒｒｙ発現ニューロンを表す。スケールバー＝２０ｕｍ。 （Ｅ）免疫組織化学画像によると、線条体に移植されたＴＨ－ｉｃｒｅ ｈＥＳＣ細胞の分化により得られたｍＤＡニューロンは、移植の６ヶ月後に、ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＴＶＡ－２Ａ－ＮＬＳ－ｔｄＴｏｍａｔｏウイルスに感染され、移植されたｍＤＡニューロン中で、ｔｄＴｏｍａｔｏとＴＨが共発現した。ボックスの領域は右側に拡大される。白色矢印状は共発現ニューロンを表す。スケールバー＝２０ｕｍ。 （Ｆ）免疫組織化学画像によると、皮質ＣＴＩＰ２＋またはＳＡＴＢ２＋ニューロン、ＣＰｕ領域ＧＡＢＡ＋またはＤＡＲＰＰ３２＋ニューロン、ＤＲ領域５－ＨＴ＋ニューロンは、すべて黒質に移植されたヒトｍＤＡニューロンに接続される。白色矢印状は共発現ニューロンを表す。スケールバー＝１００ｕｍ。 （Ｇ）狂犬病ウイルスに媒介された内因性ｍＤＡニューロンのトランスシナプストレーシング。共焦点画像では、ＤＡＴ－ＣｒｅマウスのＳＮｃにおけるＥＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏを発現するニューロンが示される。スケールバー＝０．５ｍｍ。 （Ｈ）一連の冠状面切片は、ｄａｔｅ－ｃｒｅマウス内因性ｍＤＡニューロンの追跡ニューロン（ＥＧＦＰ＋／ｔｄＴｏｍａｔｏ－）分布を示した。移植部位と同じ側のみが表示される。スケールバー＝１ｍｍ。 （Ｉ）枠内領域を拡大する。（Ｉ）拡大画像は、標識された内因性ｍＤＡニューロンに着信するニューロンは斑塊状分布を示す。スケールバー＝０．５ｍｍ。 （Ｊ）標識されたホストの異なる脳領域に着信する線条体に移植されたｍＤＡニューロンの高倍率拡大画像。スケールバー２００ｕｍ。 （Ｇ）と（Ｈ）の画像は、複数の高倍率拡大画像から自動的に結合されたものである。 （Ｉ）と（Ｊ）の画像は、タイル画像から拡大されるものである。
【図13】移植されたニューロンに対する内因性ニューロンの機能的な着信及び移植されたニューロンのｓＩＰＳＣｓ及びｓＥＰＳＣｓ動態。 （Ａ及びＢ）移植後３又は６ヶ月に、線条体（Ａ）又は黒質（Ｂ）の脳切片上の非ｍＤＡ又はｍＤＡニューロンの自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣｓ）と自発的抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣｓ）の典型的な図示。 （Ｃ～Ｆ）Ａ、ＢにおけるｓＥＰＳＣｓとｓＩＰＳＣｓの個別の定量分析。データは平均値±ＳＥＭで表される。統計データのサンプル番号が列に表示される。単一要因分散分析後にＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ事後検定を用いた。ｐ＞０．０５。（ＧとＨ）野生型ＳＣＩＤマウスの脳切片の内因性側ＳＮｃ ｍＤＡ（Ｇ）または線条体ニューロン（Ｈ）中の、典型のｓＥＰＳＣｓとｓＩＰＳＣｓの全細胞パッチクランプ記録。
【図14】ｍＣｈｅｒｒｙ－及びＢｉ－ＤＲＡＤＤを発現するｈＥＳＣ細胞株の構築及び特徴づけ。 （Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙまたはＢｉ－ＤＲＡＤＤを発現するｈＥＳＣクローンのＰＣＲ遺伝子型の同定。ＡＡＶＳ１遺伝子座を正確に標的とする予想されるＰＣＲ産物は、約２０００ｂｐ（赤色矢印）である。ホモ接合体クローンは、～６５０ｂｐのＰＣＲ産物のないクローン（黒色矢印）におけるホモ接合体であり、～６５０ｂｐのＰＣＲ産物のあるクローンは、ヘテロ接合体である。ホモ接合クローン（赤色アスタリスク）を選択して実験を行った。 （Ｂ）免疫染色が、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｈＭ３Ｄｑ－ｍｃｈｅｒｒｙまたはＨＡ標識のＫＯＲＤのｍＣｈｅｒｒｙまたはＢｉ－ＤＲＡＤＤ ｈＥＳＣ細胞株における発現を示す。スケールバー＝５０ｕｍ。 （Ｃ）１６日目の始原細胞の免疫染色。Ｈｏ，Ｈｏｅｃｈｓｔ。スケールバー＝５０ｕｍ。 （Ｄ）ｍＣｈｅｒｒｙまたはＢｉ－ＤＲＡＤＤ ｈＥＳＣ細胞系に分化したｍＤＡニューロンからの４２日目培養物の免疫染色。スケールバー＝５０ｕｍ。 （Ｅ）免疫染色分化の４２日目は、ＴＨとｍＣｈｅｒｒｙの共発現を示したが、ＨＡ標識のＫＯＲＤ細胞株にはなかった。スケールバー＝５０ｕｍ。 （ＦとＧ）ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ（Ｆ）又はＢｉ－ＤＲＡＤＤ ｈＥＳＣ（Ｇ）からの黒質移植ｍＤＡニューロンの免疫組織化学画像は、トランスジェニックｍＣｈｅｒｒｙ又はｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙとヒト由来ＳＴＥＭ１２１の共発現を示す。スケールバー＝２０ｕｍ。
【発明を実施するための形態】
【0049】
具体的な実施形態
本発明者らは、鋭意研究した結果、多能性幹細胞を、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞に分化する特定の方法を解明した。分化成熟したＡ９ ｍＤＡニューロンが、脳黒質ドーパミン作動性ニューロンの表面分子マーカー（ＴＨ、ＦＯＸＡ２、ＥＮ１、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１、とＧＩＲＫ２を含む）を発現することができるが、腹側被蓋野ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるＣＡＬＢをほとんど発現しない。上記のＡ９ｍＤＡ神経細胞を黒質に移植すると、その軸索が、内因性黒質ドーパミン作動性ニューロンに支配される標的脳領域－背側線条体へ特異性に投射する；黒質移植のＡ９ ｍＤＡニューロンはより多くの抑制性入力を受けて興奮性入力は少なく、この制御モードは内因性黒質ドーパミン作動性ニューロンと類似している；移植したＡ９ ｍＤＡニューロン自体は、低周波の自発放電周波数、超分極電流刺激に誘起されるｓａｇを含む、内因性黒質ドーパミン作動性ニューロンの典型的な電気生理特性を表す；Ａ９ ｍＤＡ神経細胞を神経変性疾患個体の黒質または線条体に移植すると、運動機能障害を改善することができる。
本発明者らは、鋭意研究した結果、多能性幹細胞を、中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞に分化する特定の方法を解明した。分化成熟したＡ９ ｍＤＡニューロンが、脳黒質ドーパミン作動性ニューロンの表面分子マーカー（ＴＨ、ＦＯＸＡ２、ＥＮ１、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１、とＧＩＲＫ２を含む）を発現することができるが、腹側被蓋野ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるＣＡＬＢをほとんど発現しない。上記のＡ９ｍＤＡ神経細胞を黒質に移植すると、その軸索が、内因性黒質ドーパミン作動性ニューロンに支配される標的脳領域－背側線条体へ特異性に投射する；黒質移植のＡ９ ｍＤＡニューロンはより多くの抑制性入力を受けて興奮性入力は少なく、この制御モードは内因性黒質ドーパミン作動性ニューロンと類似している；移植したＡ９ ｍＤＡニューロン自体は、低周波の自発放電周波数、超分極電流刺激に誘起されるｓａｇを含む、内因性黒質ドーパミン作動性ニューロンの典型的な電気生理特性を表す；Ａ９ ｍＤＡ神経細胞を神経変性疾患個体の黒質または線条体に移植すると、運動機能障害を改善することができる。
【0050】
用語
本発明で用いられるように、「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔまたはｔｒｅａｔ）という用語は、ここでは、哺乳動物（特にヒト）に対する予防的（例えば、予防的薬物（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））、治療的（ｃｕｒａｔｉｖｅ）または緩和的（ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ）治療を含む；かつ、以下を含む：（１）個体が罹患する疾患（例えば癌）の予防、治療、または緩和、ただし、当該個体は、当該疾患に罹患する高リスク群であるか、すでに罹患していて確定診断されていない；、（２）疾患を抑制する（例えば、その発生を抑制する）、または（３）疾患を軽減する（例えば、疾患に関連する徴状を軽減する）。
本発明で用いられるように、「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔまたはｔｒｅａｔ）という用語は、ここでは、哺乳動物（特にヒト）に対する予防的（例えば、予防的薬物（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））、治療的（ｃｕｒａｔｉｖｅ）または緩和的（ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ）治療を含む；かつ、以下を含む：（１）個体が罹患する疾患（例えば癌）の予防、治療、または緩和、ただし、当該個体は、当該疾患に罹患する高リスク群であるか、すでに罹患していて確定診断されていない；、（２）疾患を抑制する（例えば、その発生を抑制する）、または（３）疾患を軽減する（例えば、疾患に関連する徴状を軽減する）。
【0051】
本発明で使用されるように、「中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞」、「幹細胞由来の中脳ドーパミン作動性ニューロン細胞」と「Ａ９ ｍＤＡ神経細胞」は互換的に使用される／参照される。
【0052】
本発明で使用されるように、「細胞」は「細胞群」に含まれ、「細胞培養物」にも含まれる。
【0053】
本発明で使用されるように、「個体」、「生体」、「被験対象」または「被験者」（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、本発明の細胞（中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞）または細胞製剤の治療を受けることができるげっ歯類、霊長類などのヒトを含む動物を指す。
【0054】
本発明で使用されるように、「予防・治療」は、「予防」、「緩和」、「治療」を含む。
【0055】
本発明で使用されるように、「神経回路」は、脳内の異なる性質と機能のニューロンが、様々な形で接続されるものである；本発明では、特に黒質－線条体神経回路に注目する。
【0056】
本発明において、「薬学的に許容される」成分は、ヒト及び／又は哺乳動物に適用され、過度の不良な副反応（例えば毒性）がないもので、すなわち合理な利益／リスク比がある物質である。用語「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投薬に用いられる担体を指し、各種な賦形剤と希釈剤を含む。当該用語が、それ自体が必須の有効成分ではないが、投与後に過度に毒性がないいくつかの医薬品担体を指す。
【0057】
本発明で使用されるように、「有効量（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ａｍｏｕｎｔ）」とは、必要な治療効果反応を生成するのに十分な量の薬剤（本発明では細胞または細胞製剤）を意味する。有効量は、前記薬剤の治療上の利益効果が、その毒性または有害影響を超える場合も含む。薬剤の有効量は、必ずしも疾患や症状を治癒することはできないが、疾患や症状の発生を遅らせたり、阻害したり、防止したり、疾患や症状に関連する徴候を遅らせたりすることができる。治療上の有効量は、指定された期間内に適切な剤形で１回、２回、またはそれ以上投与される１つ、２つ、またはそれ以上の剤に分けることができる。
【0058】
幹細胞由来のニューロン及びその調製
本発明は、主にＡ９中脳ドーパミン作動性ニューロン細胞である中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞（又は細胞群）を提供する。
本発明は、主にＡ９中脳ドーパミン作動性ニューロン細胞である中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞（又は細胞群）を提供する。
【0059】
本発明の好ましい形態として、本発明で得られる幹細胞由来のニューロンにおいて、その８０％超がＡ９ ｍＤＡニューロンマーカーＧＩＲＫ２を発現する；より好ましくは、その８５％超がＡ９ ｍＤＡニューロンマーカーＧＩＲＫ２を発現する。
【0060】
本発明の好ましい形態として、上記の中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞が、マーカーとしてＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、とＥＮ１を発現する。更に約一週間分化した場合、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及びＥＮ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１ＡとＮＵＲＲ１をさらに発現する（好ましくは、総細胞中の４０％以上又はＴＵＪ１＋ニューロン中の５０％以上の細胞が、当該特徴を有する；より好ましくは、総細胞中の５０％以上又はＴＵＪ１＋ニューロン中の６０％以上の細胞が、当該特徴を有する。
【0061】
本発明は、更に、インビトロで中脳黒質ドーパミン作動性細胞を調製する方法を提供し、（１）幹細胞を、神経誘導剤を含む培地に置くこと；及び、（２）培養物から上記の中脳黒質ドーパミン作動性細胞を得ること；を含む。
【0062】
本発明の好ましい形態として、（１）には、神経誘導剤を培地に添加する；複数の段階では、異なる添加組分で誘導する：第一段階：ＳＢ４３１５４２、ＤＭＨ－１、ＳＨＨとＣＨＩＲ９９０２１を添加する；第二段階：ＳＡＧ、ＳＨＨとＣＨＩＲ９９０２１を添加する；第三段階：ＳＨＨとＣＨＩＲ９９０２１を添加する；第四段階：ＳＨＨとＦＧＦ８ｂを添加する。
【0063】
本発明のより好ましい形態として、本発明者らは、更に各添加組分の添加時期を最適化する。好ましくは、各段階において、第一段階：培養開始から培養６～８日間；好ましくは、７±０．５日間；第二段階：培養６～８日間から培養１１～１３日間；好ましくは１２±０．５天；第三段階：培養１１～１３日間から培養１８～２０日間；好ましくは１９±０．５日間；第四段階：培養１８～２０日間から培養３１～３３日間；好ましくは３２±０．５日間。
【0064】
本発明のより好ましい形態として、本発明者らは、更に各添加組分の添加量を最適化する。添加量の最適化は、本発明の特定の中脳黒質ドーパミン作動性細胞の獲得／富化に有利である。
【0065】
本発明の最適化された方法で得られる中脳黒質ドーパミン作動性ニューロン細胞は、良好な作用を有し、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築を含む；更に具体的に、以下を含む：黒質脳領域で神経繊維の形成によって、線条体へ投射し、修復を行うこと；又は、脳中の標的細胞の間にシナプス接続の形成によって、修復を行うこと；又は、軸索を背側（Ｃａｕｄａｔｅ ｐｕｔａｍｅｎ、ＣＰｕ）への投射によって、修復を行うこと；又は、神経繊維を成長させ、内因性黒質－線条体神経接続経路に沿って特異的に成長し、その内因性標的領域－線条体まで延長し、線条体ニューロンと神経接続を形成し、線条体に投射することによって、修復を行うこと。
【0066】
幹細胞由来の神経細胞の修復作用
ニューロンは脳の基本機能ユニットであり、個体の脳内には、千種類以上の異なるタイプのニューロンがあり、ニューロンの間に、複雑で正確なネットワーク接続（神経回路）が形成され、個体が世界を感知し、思考と行為の基礎となる。脳卒中、脳外傷、神経変性疾患（パーキンソン病やアルツハイマー病など）を含む多くの神経系疾患は、脳内ニューロンの喪失や神経接続の破壊、さらに片麻痺、運動遅延、筋肉硬直、学習記憶能力の損傷などの深刻な神経機能障害を引き起こす。しかし、ヒトを含む成人哺乳類の脳神経の再生能力は非常に限られ、これらのニューロンの喪失により、神経接続破壊や神経機能障害を引き起こす疾患には、臨床的に有効な治療措置が不足している。神経系疾患の幹細胞治療のキーは、損傷した神経回路の修復と機能再構築であるが、個体の脳内ニューロンの間の正確なネットワーク接続は、発育過程で徐々に形成され、その中には、複雑な神経繊維成長ガイドのメカニズムが関与している。成人疾患の脳環境では、移植された神経細胞に神経線維が生えるかどうか、「失連」の上流と下流の脳領域をブリッジし、さらに損傷した神経回路を修復するかどうかは不明である。さらに重要なのは、こんな修復作用が、移植細胞のランダム統合の結果なのか、それとも特異的な修復なのか、その裏のメカニズムと原則は何ですかというものは、すべて神経系疾患の幹細胞治療分野で急に解決すべき重要な問題である。
ニューロンは脳の基本機能ユニットであり、個体の脳内には、千種類以上の異なるタイプのニューロンがあり、ニューロンの間に、複雑で正確なネットワーク接続（神経回路）が形成され、個体が世界を感知し、思考と行為の基礎となる。脳卒中、脳外傷、神経変性疾患（パーキンソン病やアルツハイマー病など）を含む多くの神経系疾患は、脳内ニューロンの喪失や神経接続の破壊、さらに片麻痺、運動遅延、筋肉硬直、学習記憶能力の損傷などの深刻な神経機能障害を引き起こす。しかし、ヒトを含む成人哺乳類の脳神経の再生能力は非常に限られ、これらのニューロンの喪失により、神経接続破壊や神経機能障害を引き起こす疾患には、臨床的に有効な治療措置が不足している。神経系疾患の幹細胞治療のキーは、損傷した神経回路の修復と機能再構築であるが、個体の脳内ニューロンの間の正確なネットワーク接続は、発育過程で徐々に形成され、その中には、複雑な神経繊維成長ガイドのメカニズムが関与している。成人疾患の脳環境では、移植された神経細胞に神経線維が生えるかどうか、「失連」の上流と下流の脳領域をブリッジし、さらに損傷した神経回路を修復するかどうかは不明である。さらに重要なのは、こんな修復作用が、移植細胞のランダム統合の結果なのか、それとも特異的な修復なのか、その裏のメカニズムと原則は何ですかというものは、すべて神経系疾患の幹細胞治療分野で急に解決すべき重要な問題である。
【0067】
以上の問題に対して、本発明者らは、パーキンソン病を疾病モデルとし、成人脳内の移植された幹細胞由来の神経細胞で損傷した神経回路の修復に対する実行可能性とメカニズムを研究した。パーキンソン病は、静止性振戦、筋硬直、運動遅延などを主な表現とする世界第２位の神経変性疾患であり、その主な原因は、大脳黒質脳領域のドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失であり、黒質脳領域から線条体脳領域の神経結合の破壊を招き、さらに線条体内のドーパミン分泌不足をもたらし、最終的に患者の運動機能の障害を招く。本発明者らは、異なるタイプのニューロンに対するヒト由来幹細胞神経分化技術の開発に取り組み、これに基づいて、高効率なヒト幹細胞から中脳黒質ドーパミン作動性ニューロンを分化する方法を構築した。さらに、遺伝子編集技術により、ヒト幹細胞を遺伝学的に標識し、そして、幹細胞由来のヒトドーパミン作動性ニューロン及びその神経繊維を、特異的に追跡することができる。本発明者らは、遺伝学的に標識されたヒトドーパミン作動性ニューロンを、パーキンソン病モデルマウスが損傷した黒質脳領域に移植し、その結果は、黒質脳領域に移植されたヒトドーパミン作動性ニューロンは、大量の神経繊維を成長させ、内因性黒質－線条体神経接続経路に沿って、特異的に成長し、その内因性標的領域－線条体まで延長し、線条体ニューロンと神経接続を形成し、大部の神経繊維が、線条体に投射されたことが分かった。本発明者らは、さらに遺伝学技術と狂犬病ウイルスに媒介されるトレーシング技術を通じて、黒質移植のヒトドーパミン作動性ニューロンが受ける上流の神経支配を追跡し、移植されたヒトドーパミン作動性ニューロンが、内因性黒質ドーパミン作動性ニューロンに似た神経支配を受けることを発見した。ニューロンの電気生理機能の研究により、移植されたヒトドーパミン作動性ニューロンは、内因性動物黒質ドーパミン作動性ニューロンと似た電気生理特性を示し、似た神経伝達物質の制御を受けていることが分かった。これらの結果は、パーキンソン病モデル動物の脳内に移植されたヒトドーパミン作動性ニューロンが、損傷した黒質－線条体神経結合を特異性に修復・再構築し、その構造と機能は、内因性神経結合と高度に一致していることを示している。最後に、本発明者らは、行動学的検測により、細胞移植グループの動物運動機能障害は、移植時間の延長に伴い、徐々に改善されたが、化学遺伝学技術により移植された神経細胞の活性を抑制すると、動物運動機能の改善は消え、これは、移植された細胞に再構築された神経機能接続が、モデル動物行動学の回復を媒介することを示唆した。興味深いことは、本発明者らが、パーキンソン病モデル動物の黒質に別のタイプの神経細胞－ヒト皮質グルタミン酸作動性ニューロンを移植した場合、その神経繊維は、主に皮質と嗅球脳領域に投射され、ほとんど線条体に投射されず、損傷した黒質－線条体神経回路を修復することができず、モデル動物の運動機能障害も改善されなく、これは、特定のタイプの細胞だけが特定の神経機能回路を修復できることを示す。
【0068】
本発明は、成年脳内の損傷した神経結合は、幹細胞由来の神経細胞を移植することにより、構造と機能上の修復を実現し、神経機能を再構築することができることを示唆する。同時に、本発明はまた、異なるタイプの神経細胞の回路に対する修復作用が異なることを発見し、異なるタイプのニューロン損失による神経系疾患に対して、特定の神経細胞を対象的に移植して回路修復と治療を行う必要があることを示唆した。これらの発見は、脳損傷と神経変性疾患の治療に新しい考え方と理論的基礎を提供した。現在、ヒトの脳内の主要な神経細胞タイプは、すでに幹細胞神経分化技術で体外で効率的に獲得することができ、幹細胞技術の発展は多くの神経系疾患の治療に新たな希望をもたらす。
【0069】
したがって、本発明者の新たな知見に基づいて、本発明の技術方案は以下の特徴を有する：（１）幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）由来のドーパミン作動性ニューロンは、黒質中脳ドーパミン作動性ニューロンの特徴を有する；（２）機能的入力は、移植の位置ではなく、移植される神経細胞のタイプに依存する；（３）中脳ドーパミン作動性ニューロンは、正確に黒質－線条体回路を修復することができる；（４）機能的に修復された黒質－線条体回路は、パーキンソン病などの神経変性疾患モデル動物の運動機能を回復する。
【0070】
薬物のスクリーニング
本発明者らは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の中脳ドーパミン（ｍＤＡ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ）皮質の神経細胞を動物ＰＤモデルの黒質又は線条体に移植し、移植された細胞がホストの回路と広く統合することを発見した。背側線条体への軸索経路は、移植されるニューロンのタイプによって決定され、シナプス前の入力は、移植部位に大きく依存し、抑制性と興奮性の入力は、移植されるニューロンのタイプによって決定される。ｈＥＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、Ａ９ニューロンの特徴を示し、かつ運動機能の改善を調整するために再構築された黒質線条体回路の機能を回復する。これらの結果は、移植によって再構築された回路と内因性ニューラルネットワークの間で、シナプス前とシナプス後の統合の類似性は特定の細胞型に依存し、ｈＰＳＣ由来のニューロン亜型が、成人脳において特定回路修復と機能回復を行う能力を明らかにした。
本発明者らは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の中脳ドーパミン（ｍＤＡ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ）皮質の神経細胞を動物ＰＤモデルの黒質又は線条体に移植し、移植された細胞がホストの回路と広く統合することを発見した。背側線条体への軸索経路は、移植されるニューロンのタイプによって決定され、シナプス前の入力は、移植部位に大きく依存し、抑制性と興奮性の入力は、移植されるニューロンのタイプによって決定される。ｈＥＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、Ａ９ニューロンの特徴を示し、かつ運動機能の改善を調整するために再構築された黒質線条体回路の機能を回復する。これらの結果は、移植によって再構築された回路と内因性ニューラルネットワークの間で、シナプス前とシナプス後の統合の類似性は特定の細胞型に依存し、ｈＰＳＣ由来のニューロン亜型が、成人脳において特定回路修復と機能回復を行う能力を明らかにした。
【0071】
本発明者らの新たな発見に基づいて、脳中の損傷した神経回路を修復したり、神経機能を再構築したりする物質を選別することができる。脳損傷、神経変性疾患などに有用な薬物は、上記の物質から見つけることができる。
【0072】
したがって、本発明は、脳内の損傷した神経回路を修復するまたは神経機能を再構築する物質（潜在物質を含む）をスクリーニングする方法を提供し、前記方法は、以下を含む：（１）候補物質でモデル系を処理し、当該モデル系は、大脳神経回路が損傷され又は神経機能が損傷され、且つ中脳ドーパミン作動性ニューロン（細胞）を含むモデル系である；及び、（２）上記のモデル系を検測し、上記の候補物質は、ドーパミン作動性ニューロンが大脳中の損傷した神経回路を修復すること又はその神経機能を再構築することを、統計学的に促進する場合、当該候補物質は、大脳中の損傷した神経回路の修復又は神経機能の再構築に有用な物質である。
【0073】
本発明の研究結果を結合して、候補物質の作用後の、中脳ドーパミン作動性ニューロンによる黒質－線条体回路の修復状況、中脳ドーパミン作動性ニューロンのシナプス前とシナプス後の統合状況、中脳ドーパミン作動性ニューロンの軸索が背側及び／又は動物モデルに投射する運用能力を分析することにより、前記潜在物質（候補物質または候補薬物）の有効性を決定することができる。
【0074】
本発明の研究結果を結合して、候補物質の作用を系統的に分析した後、中脳ドーパミン作動性ニューロンから神経繊維を成長させ、内因性黒質－線条体神経接続経路に沿って特異的に成長し、その内因性標的領域－線条体まで延長し、線条体ニューロンと神経接続を形成し、線条体に投射する能力の変化によって、前記潜在物質（候補物質または候補薬物）の有効性を決定することができる。
【0075】
本発明の好ましい態様では、スクリーニングを行う際に、候補物質の処理前後の変化を、より容易に観察するために、空白対照またはプラセボ対照などの候補物質を添加しないモデル系であるコントロールグループ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を設けることもできる。
【0076】
別の態様では、本発明は、また、前記スクリーニング方法を用いて得られる潜在物質を提供する。これらの予備的にスクリーニングされた物質は、スクリーニングライブラリーを構成することができ、最終的には、脳の損傷した神経回路の修復や神経機能の再構築に有用な物質をスクリーニングすることができるようにする。
【0077】
薬物製剤
本発明は、更に薬物組成物（製剤）を提供し、有効量（例えば０．０００００１－５０ｗｔ％；好ましくは０．００００１－２０ｗｔ％；より好ましくは０．０００１－１０ｗｔ％）の本発明の方法で調製される中脳黒質ドーパミン作動性細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する。
本発明は、更に薬物組成物（製剤）を提供し、有効量（例えば０．０００００１－５０ｗｔ％；好ましくは０．００００１－２０ｗｔ％；より好ましくは０．０００１－１０ｗｔ％）の本発明の方法で調製される中脳黒質ドーパミン作動性細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する。
【0078】
上記の「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投薬に用いられる担体を指し、各種な賦形剤と希釈剤を含む。当該用語が、それ自体が必須の有効成分ではないが、投与後に過度に毒性がないいくつかの医薬品担体を指す。適当な担体は、当業者に熟知される。組成物には、薬学的に許容される担体が、液体、例えば水、塩水、バッファを含んでも良い。さらに、これらの担体はまた、補助物質、例えば充填剤、潤滑剤、流動促進剤、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを含んでも良い。上記の担体には、さらに細胞トランスフェクション剤を含んでも良い。
【0079】
本発明に記載の中脳黒質ドーパミン作動性細胞の有効量は、投薬方式と治療しようとする疾病の重篤度に応じて変更してもよい。好ましい有効量の選択は、当業者が様々な要因に基づいて決定することができる（例えば、臨床試験による）。かかる要因としては、薬物動態学的パラメータ、例えばバイオアベイラビリティ、代謝、半減期など；患者の治療しようとする疾患の重症度、患者の体重、患者の免疫状況、投与経路などがある。
【0080】
具体的な治療有効量は、治療しようとする特定の状況、個体の生理的条件（例えば、体重、年齢、性別）、治療を受ける個体のタイプ、治療継続時間、並列治療（例えば、ある）の本質、および使用される特定の配合物および化合物またはその誘導体の構造などの様々な要因に依存する。例えば、治療有効量は、活性成分の総重量、例えばグラム、ミリグラムまたはマイクログラムで表され、あるいは、体重に対する活性成分の重量の割合を示し、例えば体重１ｋｇ当たり何ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）で表される。あるいは、有効量は、活性成分（例えば本発明の細胞または細胞製剤）の濃度、例えばモル濃度、重量濃度、体積濃度、重量モル濃度、モル分率、重量分率および混合比として表すことができる。当業者は、動物モデルの用量に基づいて、薬剤（例えば本発明の細胞または細胞製剤など）の人体等価用量（ｈｕｍａｎ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓｅ、ＨＥＤ）を計算することができる。例を挙げると、当業者は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が公告した「初期臨床治療における成人健康ボランティアの最大安全開始用量の推定」（Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）に基づいて、人体使用の最高安全用量を推定することができる。
【0081】
本発明の具体的な実施例では、マウスなどの動物に対するいくつかの投与スキームを提供する。マウスなどの動物の投与量からヒトに適した投与量に換算することは、当業者にとって容易に行うことができ、例えば、Ｍｅｅｈ－Ｒｕｂｎｅｒ公式に基づいて計算することができる：Ａ＝ｋ×（Ｗ２／３）／１０，０００。式中、Ａは体表面積であり、ｍ２で計算する；Ｗは体重であり、ｇで計算する；Ｋは定数であり、動物の種類によって異なるが、一般的には、マウスとラット９．１、モルモット９．８、ウサギ１０．１、猫９．９、犬１１．２、猿１１．８、人１０．６である。薬物および臨床状況によっては、経験的な薬剤師の評価によって、投与量の換算が変化することが理解されるべきである。
【0082】
本発明はまた、前記医薬組成物を含有する、または前記中脳黒質ドーパミン作動性細胞を直接含有するキットを提供する。さらに、前記キットには、キット内の薬物の使用方法を説明する説明書を含んでもよい。
【0083】
以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ、２００２に記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。
【0084】
材料と方法
細胞の培養
照射されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を敷設した幹細胞培養液中で、Ｈ９ヒト胚幹細胞株とＨ９ヒト胚幹細胞レポーター株を培養した。培養液は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＫＯＳＲ、１ｘＮＥＡＡ、０．５ｘＧｌｕｔａｍａｘ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノールと４ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－２からなる。新鮮な培地を１日１回交換し、毎週Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩで継代した。
細胞の培養
照射されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を敷設した幹細胞培養液中で、Ｈ９ヒト胚幹細胞株とＨ９ヒト胚幹細胞レポーター株を培養した。培養液は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＫＯＳＲ、１ｘＮＥＡＡ、０．５ｘＧｌｕｔａｍａｘ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノールと４ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－２からなる。新鮮な培地を１日１回交換し、毎週Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩで継代した。
【0085】
中脳ドーパミン作動性ニューロンと前脳グルタミン酸作動性ニューロンの産生
中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロン前駆細胞の誘導方法は、ＭＥＦ飼育層またはｖｅｔｒｏｎｅｃｔｉｏｎ上のヒト胚性幹細胞（継代後１日）を、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）とＤＭＨ－１（２μＭ）を添加した神経誘導培地（ＮＩＭ）（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、１ｘＮＥＡＡ、１ｘＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）で培養することを含む。分化された細胞を、中脳底板前駆細胞に形成させるために、１日目から７日目まで、培養物にＳＨＨ（Ｃ２５ＩＩ、５００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（０．４μＭ）を添加した。７日目に、神経上皮細胞コロニーをピペットで軽く吹き下ろし、マウス胚線維芽細胞飼育層に貼り直し、ＳＡＧ（２μＭ）、ＳＨＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（０．４μＭ）を添加したＮＩＭで６日間再培養した（Ｄ７－１２）。１２日目にＣＨＩＲ９９０２１を撤去し、ＳＨＨ濃度を２０ｎｇ／ｍｌに下げ、ＳＡＧ（０．５μＭ）とＦＧＦ８ｂ（１００ｎｇ／ｍｌ）を培養液に添加して前駆細胞を懸濁液中で１９日目まで増幅した。３２日目、移植まで２０ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨと２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８ｂを含む神経誘導培地で培養した。インビトロ分化のために、３２日目に、３７℃で３～５分間Ａｃｃｕｔａｓｅでインキュベートして神経球を解離させた。次にＭａｔｒｉｇｅｌを塗布したガラスカバーガラス上に敷き、脳由来神経営養因子（ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）、膠質細胞系由来神経営養因子（ＧＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（ＡＡ，２００μＭ）、ｃＡＭＰ（１μＭ）、形質転換成長因子β３（ＴＧＦβ３，１ｎｇ／ｍｌ）、化合物Ｅ（ＣｏｍｐｏｕｎｄＥ，０．１μＭ）を添加した神経分化培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、１ｘＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１ｘＢ２７）（ＮＤＭ）で培養を続けた。
中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロン前駆細胞の誘導方法は、ＭＥＦ飼育層またはｖｅｔｒｏｎｅｃｔｉｏｎ上のヒト胚性幹細胞（継代後１日）を、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）とＤＭＨ－１（２μＭ）を添加した神経誘導培地（ＮＩＭ）（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、１ｘＮＥＡＡ、１ｘＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）で培養することを含む。分化された細胞を、中脳底板前駆細胞に形成させるために、１日目から７日目まで、培養物にＳＨＨ（Ｃ２５ＩＩ、５００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（０．４μＭ）を添加した。７日目に、神経上皮細胞コロニーをピペットで軽く吹き下ろし、マウス胚線維芽細胞飼育層に貼り直し、ＳＡＧ（２μＭ）、ＳＨＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（０．４μＭ）を添加したＮＩＭで６日間再培養した（Ｄ７－１２）。１２日目にＣＨＩＲ９９０２１を撤去し、ＳＨＨ濃度を２０ｎｇ／ｍｌに下げ、ＳＡＧ（０．５μＭ）とＦＧＦ８ｂ（１００ｎｇ／ｍｌ）を培養液に添加して前駆細胞を懸濁液中で１９日目まで増幅した。３２日目、移植まで２０ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨと２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８ｂを含む神経誘導培地で培養した。インビトロ分化のために、３２日目に、３７℃で３～５分間Ａｃｃｕｔａｓｅでインキュベートして神経球を解離させた。次にＭａｔｒｉｇｅｌを塗布したガラスカバーガラス上に敷き、脳由来神経営養因子（ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）、膠質細胞系由来神経営養因子（ＧＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（ＡＡ，２００μＭ）、ｃＡＭＰ（１μＭ）、形質転換成長因子β３（ＴＧＦβ３，１ｎｇ／ｍｌ）、化合物Ｅ（ＣｏｍｐｏｕｎｄＥ，０．１μＭ）を添加した神経分化培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、１ｘＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１ｘＢ２７）（ＮＤＭ）で培養を続けた。
【0086】
ヒト胚性幹細胞から前脳グルタミン酸（Ｇｌｕ）ニューロンを誘導する方法：Ｈ９ヒト胚性幹細胞を１週間クローン培養し、培地を毎日交換した。その後、ｈＥＳＣクローンを飼育層から分離し、ＥＳ培地中で４日間増殖させて細胞凝集体の形成を支援した。神経誘導を行うために、細胞凝集体を２μＭ ＳＢ４３１５４２と２μＭ ＤＭＨ－１が添加されたＮＩＭの培養ボトルで３日間培養した。次いで、ＥＳＣ凝集体を、１６日目頃に、神経管様のバラ状構造が形成されるまで、ビトロネクチンで被覆された６ウェルプレートに接着し、ＮＩＭ中で培養した。バラ状構造を１ｍＬピペットで軽く吹き落とし、同じ培地に懸濁して１０日間再培養した。２６日目、前駆細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで４分間消化し、ペレットに消化した。ＮＩＭを入れた培養瓶で１日間再培養した後、ペレットを集めて動物モデルに移植するか、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＡＡ（２００μＭ）、ｃＡＭＰ（１μＭ）、ＩＧＦ１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＮＤＭで１週間培養し、免疫蛍光染色のために貼付、成熟させた。
【0087】
ＰＤモデルと細胞の移植
ＳＣＩＤマウスにおけるＰＤモデル構築のための手術手順は、以下のことを含む：成人ＳＣＩＤマウス（８～１２週間）を１～２％のイソフルオロランと酸素で混合麻酔した。１μＬの６－ＯＨＤＡ（３ｍｇ／ｍｌ、１％のアスコルビン酸を含む塩水に溶解）を左側大脳黒質に直接注入した（前後［ＡＰ］＝－２．９ｍｍ、側面［Ｌ］＝－１．１ｍｍ、垂直［Ｖ］＝４．５ｍｍ、垂直深さは頭骨から計算する）。６－ＯＨＤＡ損傷手術後の４週間において、アンフェタミン誘導後でも１．５時間以内に６回／分以上回転できた動物を選択し、細胞移植を行った。動物をランダムにグループに分け、グルタミン作動性ニューロン前駆細胞、ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞または人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）（コントロール）を移植した。５００００個の細胞をＲｏｃｋ阻害剤（０．５μＭ）、Ｂ２７、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦを含む１μＬのＡＣＳＦに再懸濁し、左側黒質（前後［ＡＰ］＝－２．９ｍｍ、側面［Ｌ］＝１．１ｍｍ、垂直［Ｖ］＝４．４ｍｍ、垂直深さは頭骨から計算する）または左線条体（ＡＰ＝＋０．６ｍｍ、Ｌ＝１．８ｍｍ、Ｖ＝３．２ｍｍ、垂直深さは硬膜から計算する）に注入した。
ＳＣＩＤマウスにおけるＰＤモデル構築のための手術手順は、以下のことを含む：成人ＳＣＩＤマウス（８～１２週間）を１～２％のイソフルオロランと酸素で混合麻酔した。１μＬの６－ＯＨＤＡ（３ｍｇ／ｍｌ、１％のアスコルビン酸を含む塩水に溶解）を左側大脳黒質に直接注入した（前後［ＡＰ］＝－２．９ｍｍ、側面［Ｌ］＝－１．１ｍｍ、垂直［Ｖ］＝４．５ｍｍ、垂直深さは頭骨から計算する）。６－ＯＨＤＡ損傷手術後の４週間において、アンフェタミン誘導後でも１．５時間以内に６回／分以上回転できた動物を選択し、細胞移植を行った。動物をランダムにグループに分け、グルタミン作動性ニューロン前駆細胞、ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞または人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）（コントロール）を移植した。５００００個の細胞をＲｏｃｋ阻害剤（０．５μＭ）、Ｂ２７、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦを含む１μＬのＡＣＳＦに再懸濁し、左側黒質（前後［ＡＰ］＝－２．９ｍｍ、側面［Ｌ］＝１．１ｍｍ、垂直［Ｖ］＝４．４ｍｍ、垂直深さは頭骨から計算する）または左線条体（ＡＰ＝＋０．６ｍｍ、Ｌ＝１．８ｍｍ、Ｖ＝３．２ｍｍ、垂直深さは硬膜から計算する）に注入した。
【0088】
ドナープラスミドの構築
ＡｄｄｇｅｎｅからＴＡＬＥＮツール、ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌野生型Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－２Ａ－ＧＦＰ）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－２Ａ－ＧＦＰ）とｐＣＡＧ－Ｆｌｐｏ（プラスミド＃５２３４２、プラスミド＃５２３４１、プラスミド＃４４７１９、プラスミド＃４４７２０、プラスミド＃６０６６２）を取得した。ＰＬ５５２中のｌｏｘＰ配列（＃６８４０７）を、ＦＲＴ配列に置換することにより、両側にＦＲＴを有するＰＧＫ－Ｐｕｒｏ発現カセットを含むＰＬ６５２ドナープラスミドベクターを構築した。
ＡｄｄｇｅｎｅからＴＡＬＥＮツール、ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌野生型Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－２Ａ－ＧＦＰ）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－２Ａ－ＧＦＰ）とｐＣＡＧ－Ｆｌｐｏ（プラスミド＃５２３４２、プラスミド＃５２３４１、プラスミド＃４４７１９、プラスミド＃４４７２０、プラスミド＃６０６６２）を取得した。ＰＬ５５２中のｌｏｘＰ配列（＃６８４０７）を、ＦＲＴ配列に置換することにより、両側にＦＲＴを有するＰＧＫ－Ｐｕｒｏ発現カセットを含むＰＬ６５２ドナープラスミドベクターを構築した。
【0089】
ＴＨ－ｉＣｒｅドナープラスミドを産生するために、ゲノムＤＮＡ中のＴＨ遺伝子に隣接するＳＴＯＰコドンの上流または下流の配列から、それぞれ左相同アームと右相同アームを有するＤＮＡ断片を増幅した。Ｐ２Ａ配列を有するプライマーを用いて、Ｐ２Ａ配列を融合したｉＣｒｅ遺伝子のＤＮＡ断片を、ｐＤＩＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８０９４５）から増幅した。その後、３つの断片をプラスミドＰＬ６５２のマルチクローニング部位にクローニングした。
【0090】
ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏドナープラスミドを産生するために、Ｐ２Ａ配列を有するプライマーを用いて、Ｐ２Ａ配列を融合したｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子のＤＮＡ断片を、ｐＡＡＶ－ＦＬＥＸ－ＡｒｃｈＴ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２８３０５）から増幅した。ｈＧＨポリＡ信号配列を有するＤＮＡ断片を、ＡＡＶＳ１－ｐｕ－ＣＡＧ－ＥＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８０９４５）から増幅した。次いで、ＴＨ－ｉＣｒｅドナープラスミド中の左右相同アームのＤＮＡ断片、Ｐ２Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ配列を含むＤＮＡ断片、およびｈＧＨポリＡシグナル配列を含むＤＮＡ断片を、プラスミドＰＬ５５２のマルチクローニング部位にクローニングした。
【0091】
ＡＡＶＳ１－ｎｅｏ－ＣＡＧ－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰドナープラスミドを構築するために、本発明者らは、ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）－ＥＹＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２６９７３）からＣｈＲ２－ＥＹＦＰ遺伝子を増幅し、ＡＡＶＳ１－Ｎｅｏ－ＣＡＧ－ＦＬｐｅ－ＥＲＴ２プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６８４６０）中のＦｌｐｅＥＲＴ２遺伝子を置換した。
【0092】
ＡＡＶＳ１－ｐｕｒ－ＣＡＧ－Ｂｉ－ＤＲＥＡＤＤドナープラスミド（ＡＡＶＳ１－ｐｕｒ－ＣＡＧ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍｃｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＨＡ－ＫＯＲＤ）とＡＡＶＳ１－ｐｕｒ－ＣＡＧ－ｍＣｈｅｒｒｙドナープラスミドを構築するために、本発明者らはＡＡＶＳ１－ｐｕｒ－ＣＡＧ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８０９４８）から、それぞれｍＣｈｅｒｒｙまたはｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを増幅し、ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ｄＦ－ＨＡ－ＫＯＲＤ－ＩＲＥＳ－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃３＄６５４１７）から、ＨＡ－ＫＯＲＤを増幅した。２つの遺伝子が同じ細胞で同時に発現することを確保するために、２つのＤＲＥＡＤＤ遺伝子（ｈＭ３Ｄｑ－ｍｃｈｅｒｒｙとＨＡ－ＫＯＲＤ）を、Ｐ２Ａによって連結（ｈＭ３Ｄｑ－ｍｃｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＨＡ－ＫＯＲＤ）し、最後にＡＡＶＳ１－ｐｕ－ＣＡＧ－ＥＧＦＰ中のＥＧＦＰを、ｈＭ３Ｄｑ－ｍｃｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＨＡ－ＫＯＲＤまたはｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子で置換した。ＳＡ－Ｎｅｏは、スプライシング受容体配列の後に、Ｔ２Ａ自己分解ペプチド配列とネオマイシン耐性遺伝子を順番に連結した。ＣＡＧは、人工合成されたアクチンエンハンサーと巨細胞ウイルス早期プロモーターを有するＣＡＧＧＳプロモーターである。
【0093】
電気穿孔とヒト胚性幹細胞レポーター細胞系の構築
Ｈ９ ｈＥＳＣｓをＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤で６～８時間（０．５ｍＭ）前処理した。その後、ＴｒｙｐＬＥ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅを用いて単細胞に消化した。そして、５００ｍＬの電気穿孔緩衝液（５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０２．９４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４と４７．０６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２）に、適切な配合比のプラスミドを加え、０．４ｃｍ電気転写カップ（Ｐｈｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）において、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて２５０Ｖ、５００ｍＦの条件で電気穿孔を行い、その後、細胞を６ウェルプレートのＭＥＦ飼育層に播種し、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養した。ＭＥＦで滋養したＥＳＣ培地（ＣＭ）を毎日に液交換する。７２時間後、プリンマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）又はＧ４１８（５０－１００μｇ／ｍｌ）をＣＭに添加し、２週間スクリーニングした。スクリーニング後、細胞をＲＯＣＫ阻害剤で６～８時間前処理し、単一クローンを採取した。外因性遺伝子が組み込まれているかどうかを、ゲノムＰＣＲにより同定した。
Ｈ９ ｈＥＳＣｓをＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤で６～８時間（０．５ｍＭ）前処理した。その後、ＴｒｙｐＬＥ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅを用いて単細胞に消化した。そして、５００ｍＬの電気穿孔緩衝液（５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０２．９４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４と４７．０６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２）に、適切な配合比のプラスミドを加え、０．４ｃｍ電気転写カップ（Ｐｈｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）において、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて２５０Ｖ、５００ｍＦの条件で電気穿孔を行い、その後、細胞を６ウェルプレートのＭＥＦ飼育層に播種し、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養した。ＭＥＦで滋養したＥＳＣ培地（ＣＭ）を毎日に液交換する。７２時間後、プリンマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）又はＧ４１８（５０－１００μｇ／ｍｌ）をＣＭに添加し、２週間スクリーニングした。スクリーニング後、細胞をＲＯＣＫ阻害剤で６～８時間前処理し、単一クローンを採取した。外因性遺伝子が組み込まれているかどうかを、ゲノムＰＣＲにより同定した。
【0094】
ＴＨ－ｉＣｒｅノックインｈＥＳＣ系を構築するために、ＣＲＩＳＰＲを用いてＨ９ ＥＳＣｓの内因性ＴＨ遺伝子のＳＴＯＰコドンのすぐ上流に、Ｐ２Ａ結合を含むコドン最適化Ｃｒｅ組換え酵素（ｉＣｒｅ）遺伝子とＳＴＯＰコドンをノックインし、次いで両側にＦＲＴを有するＰＧＫ－Ｐｕｒｏ配列（ＰＧＫプロモーター駆動Ｐｕｒｏ）をノックインした。次いで、両側にＦＲＴを有するＰＧＫ－Ｐｕｒｏを、瞬時発現Ｆｌｐｏにより除去した。
【0095】
ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ ｈＥＳＣ系を構築するために、ＣＲＩＳＰＲを用いてＨ９ ＥＳＣｓの内因性ＴＨ遺伝子のＳＴＯＰコドンのすぐ上流に、Ｐ２Ａ結合を含むコドン最適化されたｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子とＳＴＯＰコドンをノックインし、続いてｐｏｌｙＡ配列とＰＧＫ－Ｐｕ配列をノックインし、そしてＴＡＬＥＮを通じてＣｈＲ２発現カセットをＡＡＶＳ１遺伝子座にノックインした。Ｂｉ－ＤＲＡＤＤまたはｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ細胞株を構築するために、Ｈ９ ｈＥＳＣのＡＡＶＳ１遺伝子部位にｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＨＡ－ＫＯＲＤまたはｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットをＴＡＬＥＮにより挿入した。
【0096】
全細胞パッチクランプと脳切片記録
移植後３ヶ月と６ヶ月に、Ｌｅｉｃａ ＶＴ １２００ Ｓ振動切片機を用いて予冷した切片液中で、前脳または中脳の水平の３５０μｍ厚の冠状脳切片を製造した（切片液の組成：１００ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２－６Ｈ２０、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－６Ｈ２０及び０．７ｍＭ ＣａＣｌ２）。その後、脳切片を、飽和９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を含む人工脳脊髄液ＡＣＳＦ（ＡＣＳＦの組成は、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、４．４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４と１０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）に移し、インキュベートし、１ｈ回復させた後に記録し、電流信号はＡｘｏｎ ７００ Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ）によって記録した。脳切片記録外液と脳切片培養液は、いずれもＡＣＳＦであり、記録電極（３－５ＭΩ）は、電極内液（内液の組成は：１１２ｍＭ Ｃｓ－Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ、５ｍＭ ＴＥＡ－Ｃｌ、３．７ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰと５ｍＭ ＱＸ－３１４であり、ＣｓＯＨでｐＨ ７．２まで調節した）を含み、自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）と自発的抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）記録に用いられた。ｓＥＰＳＣまたはｓＩＰＳＣ記録のために、細胞をそれぞれ６０ｍＶと０ｍＶにクランプした。全実験にわたって、膜抵抗Ｒｍは１５～３０ＭΩに維持された。記録中にＲｍ変化が１５％を超える細胞は、廃棄された。データ収集のフィルタリングは１ｋＨｚ、サンプリング周波数は１０ｋＨｚとした。電流クランプ状態で、青色光刺激（４７３ｎｍ、周波数５Ｈｚ、光強度１０ｍＭ／ｍｍ２）または脱分極電流（０－１００ｐＡ、ステップ１０ｐＡ、持続時間２ｓ）により誘起された動作電位（ＡＰｓ）を記録した。移植または内因性ｍＤＡニューロンにそれぞれ９０ｐＡまたは１２０ｐＡ電流を注入する電流クランプモードで、Ｓａｇ検出を行った。ｍＤＡニューロンと非ｍＤＡニューロンは、ＥＹＦＰ陽性の移植細胞中のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光信号によって区別された。
移植後３ヶ月と６ヶ月に、Ｌｅｉｃａ ＶＴ １２００ Ｓ振動切片機を用いて予冷した切片液中で、前脳または中脳の水平の３５０μｍ厚の冠状脳切片を製造した（切片液の組成：１００ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２－６Ｈ２０、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－６Ｈ２０及び０．７ｍＭ ＣａＣｌ２）。その後、脳切片を、飽和９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を含む人工脳脊髄液ＡＣＳＦ（ＡＣＳＦの組成は、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、４．４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４と１０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）に移し、インキュベートし、１ｈ回復させた後に記録し、電流信号はＡｘｏｎ ７００ Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ）によって記録した。脳切片記録外液と脳切片培養液は、いずれもＡＣＳＦであり、記録電極（３－５ＭΩ）は、電極内液（内液の組成は：１１２ｍＭ Ｃｓ－Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ、５ｍＭ ＴＥＡ－Ｃｌ、３．７ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰと５ｍＭ ＱＸ－３１４であり、ＣｓＯＨでｐＨ ７．２まで調節した）を含み、自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）と自発的抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）記録に用いられた。ｓＥＰＳＣまたはｓＩＰＳＣ記録のために、細胞をそれぞれ６０ｍＶと０ｍＶにクランプした。全実験にわたって、膜抵抗Ｒｍは１５～３０ＭΩに維持された。記録中にＲｍ変化が１５％を超える細胞は、廃棄された。データ収集のフィルタリングは１ｋＨｚ、サンプリング周波数は１０ｋＨｚとした。電流クランプ状態で、青色光刺激（４７３ｎｍ、周波数５Ｈｚ、光強度１０ｍＭ／ｍｍ２）または脱分極電流（０－１００ｐＡ、ステップ１０ｐＡ、持続時間２ｓ）により誘起された動作電位（ＡＰｓ）を記録した。移植または内因性ｍＤＡニューロンにそれぞれ９０ｐＡまたは１２０ｐＡ電流を注入する電流クランプモードで、Ｓａｇ検出を行った。ｍＤＡニューロンと非ｍＤＡニューロンは、ＥＹＦＰ陽性の移植細胞中のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光信号によって区別された。
【0097】
ウイルス注射と狂犬病ウイルス追跡実験
狂犬病ウイルス追跡実験では、Ｃｒｅによって誘導されるＴＶＡとｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＡＡＶウイルス（ＡＡＶ２／９－Ｅｆ１ａ－ＤＩＯ－ＴＶＡ－２Ａ－ＮＬＳ－ｔｄＴｏｍａｔｏ、力価１．２９＊１０１２遺伝子コピー（ｇｃ）／ｍｌ）２００ｎＬ、またはＣｒｅによって誘導される狂犬病糖タンパク質を発現するＡＡＶ（ＡＡＶ２／９－Ｅｆ１ａ－ＤＩＯ－Ｇ、力価１．２９＊１０１２ｇｃ／ｍｌ）２００ｎＬを、移植した後５ヶ月のＰＤマウスの移植部位に共注入した（黒質：ＡＰ＝２．９ｍｍ、Ｌ＝１．１ｍｍ、Ｖ＝４．４ｍｍ、垂直深さは頭骨から計算する；線条体：ＡＰ＝＋０．６ｍｍ、Ｌ＝１．８ｍｍ、Ｖ＝３．２ｍｍ、垂直深さは硬膜から計算する）。３週間後、ＥｎＶＡ偽型、狂犬病タンパク質Ｇが欠損し、ＥＧＦＰを発現する狂犬病ウイルス（ＲＶｄＧ－ＥＧＦＰ，４００ｎｌ、力価２＊１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を同じ部位に注射し、アンチシナプス標識を行った。１週間後、マウスを致死させて組織学的分析を行った。内因性ｍＤＡニューロンに対して、ＤＡＴ－Ｃｒｅ／Ａｉ９マウスのＳＮｃ（ＡＰ＝２．９ｍｍ、Ｌ＝１．１ｍｍ、Ｖ＝４．５ｍｍ、頭骨から垂直深さを計算する）にウイルスを注射した。固定後、冷凍スライサーでスライス（３０ｍｍ厚）した。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０）を用いて、２０倍対物レンズを用いて、すべての未染色冠状切片（１：４ ｓｅｒｉｅｓ）をイメージングした。ＶＳ－ＡＳＷ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ソフトウェアを使用し、タイル画像を１０％の重畳率で自動的に結合した。ＰａｘｉｎｏｓとＦｒａｎｋｌｉｎ（２００７）によると、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用し、標識されたニューロンの位置と脳領域の輪郭を手動でマークアップした。一部は、細胞のアイデンティティを明らかにするために、免疫染色を行った。
狂犬病ウイルス追跡実験では、Ｃｒｅによって誘導されるＴＶＡとｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＡＡＶウイルス（ＡＡＶ２／９－Ｅｆ１ａ－ＤＩＯ－ＴＶＡ－２Ａ－ＮＬＳ－ｔｄＴｏｍａｔｏ、力価１．２９＊１０１２遺伝子コピー（ｇｃ）／ｍｌ）２００ｎＬ、またはＣｒｅによって誘導される狂犬病糖タンパク質を発現するＡＡＶ（ＡＡＶ２／９－Ｅｆ１ａ－ＤＩＯ－Ｇ、力価１．２９＊１０１２ｇｃ／ｍｌ）２００ｎＬを、移植した後５ヶ月のＰＤマウスの移植部位に共注入した（黒質：ＡＰ＝２．９ｍｍ、Ｌ＝１．１ｍｍ、Ｖ＝４．４ｍｍ、垂直深さは頭骨から計算する；線条体：ＡＰ＝＋０．６ｍｍ、Ｌ＝１．８ｍｍ、Ｖ＝３．２ｍｍ、垂直深さは硬膜から計算する）。３週間後、ＥｎＶＡ偽型、狂犬病タンパク質Ｇが欠損し、ＥＧＦＰを発現する狂犬病ウイルス（ＲＶｄＧ－ＥＧＦＰ，４００ｎｌ、力価２＊１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を同じ部位に注射し、アンチシナプス標識を行った。１週間後、マウスを致死させて組織学的分析を行った。内因性ｍＤＡニューロンに対して、ＤＡＴ－Ｃｒｅ／Ａｉ９マウスのＳＮｃ（ＡＰ＝２．９ｍｍ、Ｌ＝１．１ｍｍ、Ｖ＝４．５ｍｍ、頭骨から垂直深さを計算する）にウイルスを注射した。固定後、冷凍スライサーでスライス（３０ｍｍ厚）した。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０）を用いて、２０倍対物レンズを用いて、すべての未染色冠状切片（１：４ ｓｅｒｉｅｓ）をイメージングした。ＶＳ－ＡＳＷ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ソフトウェアを使用し、タイル画像を１０％の重畳率で自動的に結合した。ＰａｘｉｎｏｓとＦｒａｎｋｌｉｎ（２００７）によると、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用し、標識されたニューロンの位置と脳領域の輪郭を手動でマークアップした。一部は、細胞のアイデンティティを明らかにするために、免疫染色を行った。
【0098】
組織の用意と免疫組織化学
動物を、過剰のペントバルビタール（２５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で致死させ、かつまず塩水で灌流し、さらに４％の冷たいリン酸塩で緩衝されたポリホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した。脳を取り出し、２０％と３０％のショ糖に順次浸漬して沈んた。冷凍スライサー（Ｌｅｉｃａ ＳＭ２０１０Ｒ）上で、連続矢状（内側から外側へ０．１２～３．１２ｍｍ）または冠状（Ｂｒｅｇｍａ １．４２～０．１０ｍｍ）で切片を３０ｍｍの厚さで切り取り、２０℃で冷凍保護剤溶液に保存した。浮遊した脳切片を一次抗体と共に４℃で１～２晩インキュベートし、その後、未結合の一次抗体を除去した。ＤＡＢ染色については、切片は、対応するビオチン化二次抗体と１ｈインキュベートし、次いで室温で、アビジン－ビオチンペルオキシダーゼと１ｈインキュベートした。ＤＡＢ染色キットを用いて、免疫反応性を観察した。次に切片をエタノールで脱水し、キシレン中で透過化し、中性樹脂に固定した。蛍光免疫標識を行うために、切片は、対応する蛍光二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。その後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇによって封止された。
動物を、過剰のペントバルビタール（２５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で致死させ、かつまず塩水で灌流し、さらに４％の冷たいリン酸塩で緩衝されたポリホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した。脳を取り出し、２０％と３０％のショ糖に順次浸漬して沈んた。冷凍スライサー（Ｌｅｉｃａ ＳＭ２０１０Ｒ）上で、連続矢状（内側から外側へ０．１２～３．１２ｍｍ）または冠状（Ｂｒｅｇｍａ １．４２～０．１０ｍｍ）で切片を３０ｍｍの厚さで切り取り、２０℃で冷凍保護剤溶液に保存した。浮遊した脳切片を一次抗体と共に４℃で１～２晩インキュベートし、その後、未結合の一次抗体を除去した。ＤＡＢ染色については、切片は、対応するビオチン化二次抗体と１ｈインキュベートし、次いで室温で、アビジン－ビオチンペルオキシダーゼと１ｈインキュベートした。ＤＡＢ染色キットを用いて、免疫反応性を観察した。次に切片をエタノールで脱水し、キシレン中で透過化し、中性樹脂に固定した。蛍光免疫標識を行うために、切片は、対応する蛍光二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。その後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇによって封止された。
【0099】
レンチウイルスのパッケージング
パッケージングプラスミドと骨格プラスミドを、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈法でのトランスフェクションすることにより、２９３Ｔ細胞中にレンチウイルスを産生した。２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）中で培養した。７２時間トランスフェクション後、ウイルス粒子を含む上清を集め、４℃で２７０００ｒｐｍで２時間超遠心して濃縮した。次いで、ウイルス粒子をＤＰＢＳに再懸濁した。
パッケージングプラスミドと骨格プラスミドを、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈法でのトランスフェクションすることにより、２９３Ｔ細胞中にレンチウイルスを産生した。２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）中で培養した。７２時間トランスフェクション後、ウイルス粒子を含む上清を集め、４℃で２７０００ｒｐｍで２時間超遠心して濃縮した。次いで、ウイルス粒子をＤＰＢＳに再懸濁した。
【0100】
イメージングと細胞の定量化
ＴＨ細胞中で、ＥＮ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１、ＧＩＲＫ２、ＴＵＪ－１を発現する細胞の数、またはＴＨ細胞の割合を定量化するために、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、カバーガラスからランダムに選択された少なくとも５枚の画像をカウントした。データは３回繰り返され、平均±ＳＥＭとして表される。脳切片中のヒト由来繊維密度を測定するために、Ｎｉｋｏｎ ＴＥ６００またはＯｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０顕微鏡を用いてタイル画像を捕捉した。マウスの脳の異なる領域におけるヒト脳の光密度を、画像処理および分析システム（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ５．１ソフトウェア）により測定した。データは、異なる領域の光密度として表示される。ＴＨ、ＧＩＲＫ２、ＬＭＸ１Ａ、ヒト細胞核（ｈＮ）およびＦＯＸＡ２の染色について、ニコンＡ１Ｒ－Ｓｉレーザ走査共焦点顕微鏡（ニコン）または蛍光顕微鏡（オリンパスＶＳ１２０）を用いて、６０倍対物レンズでグラフトを描画し、移植物を捕獲した。ＩｍａｇｅＪを用いて、単染色細胞または二重染色細胞を手動でカウントした。データはＴＨ－、ＬＭＸ１Ａ－、ＦＯＸＡ２－と総ｈＮの割合、またはＧＩＲＫ２／ＴＨ／ｈＮとＴＨ／ｈＮ細胞の割合で表される。すべてのデータは平均値±ＳＥＭとして表される。
ＴＨ細胞中で、ＥＮ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１、ＧＩＲＫ２、ＴＵＪ－１を発現する細胞の数、またはＴＨ細胞の割合を定量化するために、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、カバーガラスからランダムに選択された少なくとも５枚の画像をカウントした。データは３回繰り返され、平均±ＳＥＭとして表される。脳切片中のヒト由来繊維密度を測定するために、Ｎｉｋｏｎ ＴＥ６００またはＯｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０顕微鏡を用いてタイル画像を捕捉した。マウスの脳の異なる領域におけるヒト脳の光密度を、画像処理および分析システム（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ５．１ソフトウェア）により測定した。データは、異なる領域の光密度として表示される。ＴＨ、ＧＩＲＫ２、ＬＭＸ１Ａ、ヒト細胞核（ｈＮ）およびＦＯＸＡ２の染色について、ニコンＡ１Ｒ－Ｓｉレーザ走査共焦点顕微鏡（ニコン）または蛍光顕微鏡（オリンパスＶＳ１２０）を用いて、６０倍対物レンズでグラフトを描画し、移植物を捕獲した。ＩｍａｇｅＪを用いて、単染色細胞または二重染色細胞を手動でカウントした。データはＴＨ－、ＬＭＸ１Ａ－、ＦＯＸＡ２－と総ｈＮの割合、またはＧＩＲＫ２／ＴＨ／ｈＮとＴＨ／ｈＮ細胞の割合で表される。すべてのデータは平均値±ＳＥＭとして表される。
【0101】
行動テスト：回転テスト
移植前および移植後の毎月～６ヶ月にわたって、アンフェタミンに誘導される回転をテストした。アンフェタミンを腹膜で注射（２ｍｇ／ｍｌ生理食塩水中、５ｍｇ／ｋｇ）５～１０分後、ビデオカメラで１．５時間記録した。データは、９０分間以内の１分間当たりの平均純回転数で表される。
移植前および移植後の毎月～６ヶ月にわたって、アンフェタミンに誘導される回転をテストした。アンフェタミンを腹膜で注射（２ｍｇ／ｍｌ生理食塩水中、５ｍｇ／ｋｇ）５～１０分後、ビデオカメラで１．５時間記録した。データは、９０分間以内の１分間当たりの平均純回転数で表される。
【0102】
自発回転テストでは、ＣＮＯ（１．２ｍｇ／ｋｇ）注射２０分間、ＳＡＬＢ（５ｍｇ／ｋｇ）注射５分間または塩水注射２０分間後に、動物を６０分間記録した。
【0103】
行動テスト：円筒テスト
個体動物をガラスの円筒に入れ、カメラで３分間記録した。マウスの脳損傷と同じ側と反対側の爪が、円筒の壁に接触する回数を計算した。データは、全接触回数に占める同側接触の割合として表される。薬物治療のために、円筒テストの前に、動物にＣＮＯ（１．２ｍｇ／ｋｇ）処理を２０分間、ＳＡＬＢ（５ｍｇ／ｋｇ）処理を５分間、または塩水処理を２０分間行った。
個体動物をガラスの円筒に入れ、カメラで３分間記録した。マウスの脳損傷と同じ側と反対側の爪が、円筒の壁に接触する回数を計算した。データは、全接触回数に占める同側接触の割合として表される。薬物治療のために、円筒テストの前に、動物にＣＮＯ（１．２ｍｇ／ｋｇ）処理を２０分間、ＳＡＬＢ（５ｍｇ／ｋｇ）処理を５分間、または塩水処理を２０分間行った。
【0104】
行動テスト：ロータロッドテスト
ロータロッド（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して運動協調性をテストした。すべての動物は、２日間の予備訓練を行い、安定した表現を達成した。１日目に、マウスをロータロッド上で訓練し、このロータロッドは、３００ｓの時間内に毎分２（ｒｐｍ）から２０ｒｐｍに加速し、３回行った。２日目に、マウスを３００ｓの時間内に３ｒｐｍから３０ｒｐｍに２回加速し、４ｒｐｍから４０ｒｐｍに１回加速するロータロッド訓練を行った。３日目からロータロッドでテストを行い、このロータロッドは、３００ｓの時間内に４ｒｐｍから４０ｒｐｍに加速した。マウスが、ロータロッドに留まる時間を監視した。各動物の３回の繰り返し試験の平均継続時間を、データ解析に用いた。
ロータロッド（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して運動協調性をテストした。すべての動物は、２日間の予備訓練を行い、安定した表現を達成した。１日目に、マウスをロータロッド上で訓練し、このロータロッドは、３００ｓの時間内に毎分２（ｒｐｍ）から２０ｒｐｍに加速し、３回行った。２日目に、マウスを３００ｓの時間内に３ｒｐｍから３０ｒｐｍに２回加速し、４ｒｐｍから４０ｒｐｍに１回加速するロータロッド訓練を行った。３日目からロータロッドでテストを行い、このロータロッドは、３００ｓの時間内に４ｒｐｍから４０ｒｐｍに加速した。マウスが、ロータロッドに留まる時間を監視した。各動物の３回の繰り返し試験の平均継続時間を、データ解析に用いた。
【0105】
定量化と統計解析
ＳＰＳＳソフトウェアを用いて統計解析を行った。すべての研究では、Ｓｔｕｄｅｎｔ－Ｔ検定、ペアｔ検定、二要因分散分析、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＲＭ ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定またはＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡとＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定により、データ分析を行った。統計学的有意性はｐ＜０．０５と決定された。
ＳＰＳＳソフトウェアを用いて統計解析を行った。すべての研究では、Ｓｔｕｄｅｎｔ－Ｔ検定、ペアｔ検定、二要因分散分析、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＲＭ ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定またはＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡとＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定により、データ分析を行った。統計学的有意性はｐ＜０．０５と決定された。
【0106】
本発明の各略語の英語注釈は表１に示す。
【0107】
【表1】
【実施例】
【0108】
実施例１、移植したヒトドーパミン作動性ニューロンとグルタミン酸作動性ニューロンが、異なる脳領域に投射した
発育過程において、軸索の配向投射は、通常に、細胞の内在特性に依存する。成人脳内で細胞の内在特性が依然として細胞の投射標的を決定できるかどうかを知るために、本発明者らは、ｈＥＳＣから分化して得られたｍＤＡまたは前脳グルタミン酸作動性ニューロン前駆細胞を、ＰＤモデルマウスの中脳に移植した。本発明者らの方法は、ｈＥＳＣをｍＤＡまたはＧｌｕの神経前駆細胞に分化することができる。ｍＤＡニューロン分化の３２日目（移植当日）に、ほとんどの前駆細胞は、底板と中脳マーカーＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１を発現した（図８Ａと８Ｃ）。４２日目までに、総細胞中の６９％またはＴＵＪ１＋ニューロン中の８４％の細胞は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）およびＥＮ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１ＡおよびＮＵＲＲ１（図８Ｄおよび８Ｆ）を発現し、ｍＤＡニューロン特性を示した。また、ほとんどのＴＨ＋ニューロンは、Ａ９ ｍＤＡ神経マーカーＧＩＲＫ２（＞８５％）を共発現したが、Ａ１０ ｍＤＡ神経マーカーＣａｌｂｉｎｄｉｎ（ＣＡＬＢ）（１５％）はあまり発現していない（図８Ｄと８Ｆ）。したがって、ほとんどのＴＨ＋ニューロンはＡ９ ｍＤＡニューロン特徴を有する。Ｇｌｕニューロン分化の３２日目に、ほとんどの細胞は、背側前脳マーカーとするＰＡＸ６と前脳マーカーとするＦＯＸＧ１を発現し、それらが、背側前脳神経前駆細胞であることを示した（図８Ｂと８Ｃ）。４２日目までに、８２％の細胞が、ｖＧＬＵＴ１陽性であり、これらのニューロンの多くは、ＣＴＩＰ２（＞８０％）またはＴＢＲ１（＞８５％）を発現し、分化によって得られたのは、前脳皮質の５／６層のＧｌｕニューロンであることを示した（図８Ｅと８Ｆ）。
発育過程において、軸索の配向投射は、通常に、細胞の内在特性に依存する。成人脳内で細胞の内在特性が依然として細胞の投射標的を決定できるかどうかを知るために、本発明者らは、ｈＥＳＣから分化して得られたｍＤＡまたは前脳グルタミン酸作動性ニューロン前駆細胞を、ＰＤモデルマウスの中脳に移植した。本発明者らの方法は、ｈＥＳＣをｍＤＡまたはＧｌｕの神経前駆細胞に分化することができる。ｍＤＡニューロン分化の３２日目（移植当日）に、ほとんどの前駆細胞は、底板と中脳マーカーＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１を発現した（図８Ａと８Ｃ）。４２日目までに、総細胞中の６９％またはＴＵＪ１＋ニューロン中の８４％の細胞は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）およびＥＮ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１ＡおよびＮＵＲＲ１（図８Ｄおよび８Ｆ）を発現し、ｍＤＡニューロン特性を示した。また、ほとんどのＴＨ＋ニューロンは、Ａ９ ｍＤＡ神経マーカーＧＩＲＫ２（＞８５％）を共発現したが、Ａ１０ ｍＤＡ神経マーカーＣａｌｂｉｎｄｉｎ（ＣＡＬＢ）（１５％）はあまり発現していない（図８Ｄと８Ｆ）。したがって、ほとんどのＴＨ＋ニューロンはＡ９ ｍＤＡニューロン特徴を有する。Ｇｌｕニューロン分化の３２日目に、ほとんどの細胞は、背側前脳マーカーとするＰＡＸ６と前脳マーカーとするＦＯＸＧ１を発現し、それらが、背側前脳神経前駆細胞であることを示した（図８Ｂと８Ｃ）。４２日目までに、８２％の細胞が、ｖＧＬＵＴ１陽性であり、これらのニューロンの多くは、ＣＴＩＰ２（＞８０％）またはＴＢＲ１（＞８５％）を発現し、分化によって得られたのは、前脳皮質の５／６層のＧｌｕニューロンであることを示した（図８Ｅと８Ｆ）。
【0109】
その後、本発明者は、ｍＤＡ（図１Ａ）またはＧｌｕ前駆細胞（図１Ｂ）を、ＰＤマウスのＳＮ脳領域に移植した。移植後６ヶ月、すべての移植動物に移植細胞が存在した。ｍＤＡニューロンを移植した脳の連続矢状断面によると、ｈＮＣＡＭ＋神経繊維の大部分は、尾状殻（ＣＰｕ）中に分布し（図１Ａと１Ｄ）、当該領域は、主にＡ９ ｍＤＡニューロンによって支配される（ＢｊｏｒｋｌｕｎｄとＤｕｎｎｅｔｔ、２００７）。３つの代表的な矢状平面から、ｈＮＣＡＭ＋繊維密度を定量分析すると（図１Ｃ）、ＣＰｕ脳領域では、ｈＮＣＡＭ＋繊維総量が、平面Ｌ ２．１６の７２％、平面Ｌ １．４４の６２％、平面Ｌ ０．７２の４５％（図１Ｅ）を占めることを示した。嗅結節Ｔｕ（１７％～２０％）と側坐核（Ａｃｂ；９％～１６％）では、少ないｈＮＣＡＭ＋繊維が検出され、これらの脳領域は、主にＡ１０ ｍＤＡニューロン投射を受けた。残りの領域は、扁桃体と皮質を含み、全繊維の１５％未満を占める（図１Ｅ）。線条体内では、平面Ｌ ０．７２及びＬ １．４４上のそれぞれ７２％と８７％のヒト由来繊維が、背側線条体（ＣＰｕ）に投射される（図１Ｆ）。ｈＮＣＡＭ＋繊維の分布パターン、特にＣＰｕでは、正常動物における内因性ＴＨ＋繊維の分布パターンと類似している（図１Ｄと８Ｇ）。
【0110】
逆に、Ｇｌｕニューロンの軸索の成長は局所的であり、中脳全体に投射される（図１Ｂ）。軸索も遠方に投射するが、主に扁桃体到達し、嗅球（ＯＢ）、無症状性物質（ＳＩ）、大脳皮質までいたるが、ＣＰｕでは、ｈＮＣＡＭ＋繊維（２％から８％）の極一部しか検出されなかった（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ）。
【0111】
以上より、これらの結果は、移植されたヒト神経前駆細胞が、各ニューロンタイプに分化し、軸索が異なる脳領域に投射されることを示している。
【0112】
実施例２、移植されたヒトｍＤＡニューロンの投射は、相同経路を経ている
連続矢状断面（図２Ａ）から、移植されたｍＤＡニューロンは、明確の境界を有するように、内側前脳束（ＭＦＢ）に沿って、延髄部の軸索を延長した（図２Ｂ、Ｌ １．０８及図２Ｃにおけるび赤色矢印）ことがわかった。側面から見ると、それらは、ＳＩ（図２Ｂ、Ｌ １．４４）と扁桃体（図２Ｂ、Ｌ ２．０４）を通って延びている。吻側から見ると、ｈＮＣＡＭ＋繊維は、Ａｃｂ（図２Ｂ～２Ｅ）を通過し、その大部のｈＮＣＡＭ＋繊維は、皮質と線条体との境界に沿って、ＣＰｕ（図２Ａ及び図２Ｄ中の赤色矢印）に入る。皮質中に、少量のｈＮＣＡＭ＋繊維が検出された（図２Ｄと２Ｆの青色矢印）。これらの結果は、移植されたｍＤＡニューロンの軸索投射のほとんどが、内因性黒質－線条体経路に従うことを示す。
連続矢状断面（図２Ａ）から、移植されたｍＤＡニューロンは、明確の境界を有するように、内側前脳束（ＭＦＢ）に沿って、延髄部の軸索を延長した（図２Ｂ、Ｌ １．０８及図２Ｃにおけるび赤色矢印）ことがわかった。側面から見ると、それらは、ＳＩ（図２Ｂ、Ｌ １．４４）と扁桃体（図２Ｂ、Ｌ ２．０４）を通って延びている。吻側から見ると、ｈＮＣＡＭ＋繊維は、Ａｃｂ（図２Ｂ～２Ｅ）を通過し、その大部のｈＮＣＡＭ＋繊維は、皮質と線条体との境界に沿って、ＣＰｕ（図２Ａ及び図２Ｄ中の赤色矢印）に入る。皮質中に、少量のｈＮＣＡＭ＋繊維が検出された（図２Ｄと２Ｆの青色矢印）。これらの結果は、移植されたｍＤＡニューロンの軸索投射のほとんどが、内因性黒質－線条体経路に従うことを示す。
【0113】
背側／外側線条体では、密集したｈＮＣＡＭ＋繊維が、分枝状を呈し、密集した分枝状ネットワークを形成した（図２Ｄ－２Ｆと図９Ａ）。Ｔｕ（図２Ｃと２Ｄ）にも、軸索の分枝は観察されたが、Ａｃｂ、扁桃体、ＭＦＢ（図９Ｂ）には、軸索の分枝は観察されず、これは、軸索分枝が特異的に投射したことを示している。ＳＴＥＭ１２１で染色したほとんどのヒト繊維は、ＴＨ陽性であり（図２Ｇと２Ｈ）、これらの神経繊維は、ドーパミン作動性を有することを示している。移植されたＧｌｕニューロンｈＮＣＡＭ＋繊維からの分枝は、ＯＢと皮質に観察された（図９Ｃ）。
【0114】
ｍＤＡ移植物の免疫組織化学分析によると、６８％の移植細胞が、ＴＨとヒト細胞核（ｈＮｓ）を共発現し、かつほとんどのＴＨ＋細胞も、ＧＩＲＫ２とＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａを発現し（図９Ｄ～図９Ｆ）、これはＡ９ ｍＤＡ特性を示唆した。ヒト特異的なシナプシン（ｈＳｙｎ）の点は、ＣＰｕ中のＴＨ＋の繊維に沿って分布し、そのうちの一部は、ＧＡＢＡ＋細胞体上に位置した（図９Ｇ）。これに対して、前脳ニューロン移植グループでは、ｈＳｙｎ＋シナプスは、ほとんど観察されず、かつＧＡＢＡ＋細胞体に局在することはほとんど見られなかった（図９Ｈ）。これらの結果は、シナプス接続は、移植されたヒトｍＤＡニューロンとホストの脳中の標的細胞との間に形成できることを示している。
【0115】
実施例３、遺伝的な標識により、ヒトｍＤＡニューロンの特定軸索神経分布を示す
移植されたｍＤＡニューロンによる特定の軸索神経分布を解明するために、本発明者らは、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を有するＴＨレポーター遺伝子ｈＥＳＣ系を構築し、内因性ＴＨ遺伝子の発現（方法詳細）を概括した。本発明者らは、さらに、特定の標識及び移植されたヒト細胞の操作を可能にするために、ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ融合タンパク質発現カセットを、ＡＡＶＳ１遺伝子部位にノックインした（図３Ａ、３Ｂ、１０Ａ及び１０Ｂ）。最終的なｈＥＳＣは、ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ ｈＥＳＣと呼ばれ、ｍＤＡニューロン分化の全過程で、ＣｈＲ２－ＥＹＦＰを構造的に発現するが、ｔｄＴｏｍａｔｏは、ｍＤＡニューロン分化の後期にのみ発現し（図１０Ｃ）、かつＴＨ＋ｍＤＡニューロンにのみ発現し（図３Ｃと１０Ｄ）、これは、ＴＨ＋細胞の特異的な発現を強調した。
移植されたｍＤＡニューロンによる特定の軸索神経分布を解明するために、本発明者らは、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を有するＴＨレポーター遺伝子ｈＥＳＣ系を構築し、内因性ＴＨ遺伝子の発現（方法詳細）を概括した。本発明者らは、さらに、特定の標識及び移植されたヒト細胞の操作を可能にするために、ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ融合タンパク質発現カセットを、ＡＡＶＳ１遺伝子部位にノックインした（図３Ａ、３Ｂ、１０Ａ及び１０Ｂ）。最終的なｈＥＳＣは、ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ ｈＥＳＣと呼ばれ、ｍＤＡニューロン分化の全過程で、ＣｈＲ２－ＥＹＦＰを構造的に発現するが、ｔｄＴｏｍａｔｏは、ｍＤＡニューロン分化の後期にのみ発現し（図１０Ｃ）、かつＴＨ＋ｍＤＡニューロンにのみ発現し（図３Ｃと１０Ｄ）、これは、ＴＨ＋細胞の特異的な発現を強調した。
【0116】
次に、本発明者らは、ＴＨ－ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＡＶＳ１－ＣｈＲ２－ＥＹＦＰ ｈＥＳＣ由来のｍＤＡ前駆細胞をＰＤモデルマウスのＳＮまたは線条体に移植した（図３Ａ）。移植から６ヶ月後、すべての移植動物にＥＹＦＰ＋移植細胞が出現した（図３Ｄ）が、ｔｄＴｏｍａｔｏは、ＴＨ＋ｍＤＡニューロンで発現したが、５－ＨＴ＋ニューロンなどの非ｍＤＡニューロンで発現しなかった（図１０Ｅと１０Ｆ）。ＳＮ細胞を移植した脳の連続冠状切片は、ほとんどのヒトｍＤＡニューロンの投射は、ＣＰｕ中に分布し、そこで、繊維が密集して分枝するネットワークを形成したことを示す（図３Ｅ、ｂ、ｃ）。Ａｃｂは、ｍＤＡニューロン投射のほんの一部しか存在しない（図３Ｅ、切片１～３）。これらの冠状切片（図３Ｅ、切片１と２、ａとｂ、赤色点線矢印）において、ｍＤＡニューロン軸索の延髄投射経路を決定した。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋投影が、ＳＴＥＭ１２１が陽性を示し（図３Ｆ）、ヒト細胞由来であることが確認された。これらの結果は、ｈＮＣＡＭ染色によって示された移植ヒトｍＤＡニューロンからの特異的な軸索経路探索と標的化作用（図１と２）を検証した。線条体の移植では、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ｍＤＡニューロン繊維がＣＰｕ全体を占め、かつほとんどの繊維が、ＣＰｕに限定されている（図３Ｇ、３Ｈ、１０Ｇ）。黒質の移植において、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋繊維は、周囲の移植物に限られた大量の樹状突起成長を示し（図３Ｉ）、ヒトｍＤＡ樹状突起と軸索の細胞と標的特異的分枝を示した。また、ｈＥＳＣ由来のドーパミン（ＤＡ）ニューロンは、線条体と黒質移植物の周囲に分布している（図３Ｈと３Ｉ）が、ＰＤ患者のヒト胎児脳移植と極めて類似している。
【0117】
細胞の特徴（図８Ｄ、９Ｄ及び９Ｆ）及び特定の投射（図１、２及び３）は、本発明者らのｍＤＡニューロンは、ＳＮ ｐａｒｓ ｃｏｍｐａｃｔａ（ＳＮｃ）中のニューロンと類似することを示す。遺伝的レポーター遺伝子を用いて、本発明者らは、ｍＤＡニューロン（ＥＹＦＰ＋／ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）と非ｍＤＡニューロン（ＥＹＦＰ＋／ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）に全細胞パッチクランプ記録を行った（図１０Ｈ）。本発明者らは、線条体又は黒質移植物中のヒトｍＤＡニューロンと非ｍＤＡニューロンが、移植後３ヶ月以内に、電流又は青色光誘導の動作電位（ＡＰ）と自発ＡＰ（ｓＡＰ）（図３Ｊ及び１１Ａ～１１Ｆ）を示し、移植ヒトニューロンの機能成熟を示唆することを発見した。重要なことに、線条体と黒質に移植されたヒトｍＤＡニューロンのｓＡＰは、規則的な放電を示し、放電周波数が低い（線条体グループ０．８７±０．２０Ｈｚ、黒質グループ０．８３±０．１５Ｈｚ）と副閾値発振電位が遅い（０．２９）線条体グループは±０．０６Ｈｚ、黒質グループは０．２６±０．１３Ｈｚ（図３Ｊ、１１Ｇ、１１Ｈ）である。移植６ヶ月後、ヒトｍＤＡニューロンのｓＡＰに、明らかな超分極（ＡＨＰ）が観察された（図１１Ｉと１１Ｊ）。これらの生理的特徴は、内因性ＳＮｃ（Ａ９）ｍＤＡニューロンの特徴と一致する（図３Ｊ；Ｇｕｚｍａｎら、２００９、Ｌａｍｍｅｌら、２００８、Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄら、１９９３）。また、非ｍＤＡニューロンと比較すると、移植されたｍＤＡニューロンは、移植後６ヶ月の線条体または黒質移植物では、より高い膜容量（Ｃｍ）と、より低いニューロン入力抵抗（Ｒｍ）傾向とを示した（図１１Ｋと１１Ｌ）。また、内因性ＳＮｃ ｍＤＡニューロンは、超分極電流注入に応答する際のサグ幅の値（Ｅｖａｎｓら，２０１７；Ｌａｍｍｅｌら，２００８；Ｎｅｕｈｏｆｆら，２００２）に特徴がある。ｍＤＡニューロンレポーター遺伝子マウス（ＤＡＴ－Ｃｒｅ／Ａｉ９）を用いて、本発明者らは、記録されたすべてのＳＮｃニューロンが閾値以下の範囲（３７．２±３．８ｍＶ、ｎ＝１５／１５）に典型的なサグ幅の値（図３Ｋと３Ｍ）を示すことを発見した。しかし、１１個の内因性ＶＴＡ ｍＤＡニューロンのうち、電圧サグを示すのは５個だけで、その幅はずっと小さい（２３．０±１．６ｍＶ、ｎ＝５／１１）（図３Ｋと３Ｍ）。興味深いことに、線条体に移植されたヒトｍＤＡニューロンは、明らかな電圧サグ（３２．５±３．３ｍＶ、ｎ＝１３／１６）を示した。これに対して、２９個の移植された非ｍＤＡニューロンのうち、１１個だけが電圧サグを示し、その幅は、ずっと小さい（１４．９±２．９ｍＶ、ｎ＝１１／２９）（図３Ｌと３Ｍ）。
【0118】
これらの結果は、移植されたヒトｍＤＡニューロンは、Ａ９ ｍＤＡニューロンの機能的な特徴を有することを示す。
【0119】
実施例４、構造学的にヒトニューロンのシナプス入力は移植部位に関与する
狂犬病ウイルスに媒介される追跡は、ＰＤモデルにおける移植された細胞の解剖学的入力を追跡するために、使用されてきた。移植されたヒトｍＤＡニューロンのシナプス前のシグナル入力を、明らかにするために、本発明者らは、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ遺伝子発現システムと、狂犬病ウイルスに媒介されるシナプス追跡とを結合した（図４Ａ）。本発明者らは、内因性ＴＨの発現を損なうことなく、ＴＨを発現する細胞中でＣｒｅ組換え酵素を直接発現させるＴＨ－ｉＣｒｅ ｈＥＳＣ系を構築した（図４Ｂ、１２Ａ及び１２Ｂ）。Ｃｒｅ依存性ｍＣｈｅｒｒｙを発現するレンチウイルスで、ＴＨ－ｉＣｒｅ ｈＥＳＣ由来ニューロン培養物を感染した後、ＴＨ＋ｍＤＡニューロンの中で唯一発現したのはｍＣｈｅｒｒｙであり、このシステムの特異性を証明した（図１２Ｃと１２Ｄ）。ＴＨ－ｉＣｒｅ ｍＤＡ前駆細胞を、ＰＤマウスの黒質または線条体に移植した５ヶ月後、ＡＡＶを発現するＣｒｅ依存性ＴＶＡとＮＬＳ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＴＶＡ－２Ａ－ＮＬＳ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及びＣｒｅを発現するＡＡＶ依存性狂犬病糖タンパク質（Ｇ）（ＡＡＶ－ＤＩＯ－Ｇ）を移植部位に共注入した（図４Ａ）。１ヶ月後、ＥＧＦＰ（ＲＶｄＧ－ＥＧＦＰ）を発現するＥｎｖＡ偽型と、Ｇ欠損の狂犬病ウイルスを、移植部位に注入した（図４Ａ）。移植されたヒトｍＤＡニューロンのみがＣｒｅ組換え酵素を発現するため、ＴＶＡ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｇの発現は、ヒトｍＤＡニューロンに限られ、ｍＤＡニューロンではない。実際、ｔｄＴｏｍａｔｏは、ＴＨ＋ヒトｍＤＡニューロンのみで発現した（図１２Ｅ）。ＲＶｄＧ－ＥＧＦＰは、ＴＶＡを発現する（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）ヒトｍＤＡニューロンにのみ感染するため、移植の開始ヒトｍＤＡニューロンは、ＥＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏを共発現した。移植されたヒトｍＤＡニューロンにおけるＧの共発現は、ＲＶｄＧ－ＥＧＦＰをそれらのシナプス前パートナー（Ｗｉｃｋｅｒｓｈｍら，２００７）にシナプス伝播させ、したがって、ホストのシナプス前ニューロンは、ＥＧＦＰのみを発現した（図４Ａ）。
狂犬病ウイルスに媒介される追跡は、ＰＤモデルにおける移植された細胞の解剖学的入力を追跡するために、使用されてきた。移植されたヒトｍＤＡニューロンのシナプス前のシグナル入力を、明らかにするために、本発明者らは、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ遺伝子発現システムと、狂犬病ウイルスに媒介されるシナプス追跡とを結合した（図４Ａ）。本発明者らは、内因性ＴＨの発現を損なうことなく、ＴＨを発現する細胞中でＣｒｅ組換え酵素を直接発現させるＴＨ－ｉＣｒｅ ｈＥＳＣ系を構築した（図４Ｂ、１２Ａ及び１２Ｂ）。Ｃｒｅ依存性ｍＣｈｅｒｒｙを発現するレンチウイルスで、ＴＨ－ｉＣｒｅ ｈＥＳＣ由来ニューロン培養物を感染した後、ＴＨ＋ｍＤＡニューロンの中で唯一発現したのはｍＣｈｅｒｒｙであり、このシステムの特異性を証明した（図１２Ｃと１２Ｄ）。ＴＨ－ｉＣｒｅ ｍＤＡ前駆細胞を、ＰＤマウスの黒質または線条体に移植した５ヶ月後、ＡＡＶを発現するＣｒｅ依存性ＴＶＡとＮＬＳ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＴＶＡ－２Ａ－ＮＬＳ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及びＣｒｅを発現するＡＡＶ依存性狂犬病糖タンパク質（Ｇ）（ＡＡＶ－ＤＩＯ－Ｇ）を移植部位に共注入した（図４Ａ）。１ヶ月後、ＥＧＦＰ（ＲＶｄＧ－ＥＧＦＰ）を発現するＥｎｖＡ偽型と、Ｇ欠損の狂犬病ウイルスを、移植部位に注入した（図４Ａ）。移植されたヒトｍＤＡニューロンのみがＣｒｅ組換え酵素を発現するため、ＴＶＡ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｇの発現は、ヒトｍＤＡニューロンに限られ、ｍＤＡニューロンではない。実際、ｔｄＴｏｍａｔｏは、ＴＨ＋ヒトｍＤＡニューロンのみで発現した（図１２Ｅ）。ＲＶｄＧ－ＥＧＦＰは、ＴＶＡを発現する（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）ヒトｍＤＡニューロンにのみ感染するため、移植の開始ヒトｍＤＡニューロンは、ＥＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏを共発現した。移植されたヒトｍＤＡニューロンにおけるＧの共発現は、ＲＶｄＧ－ＥＧＦＰをそれらのシナプス前パートナー（Ｗｉｃｋｅｒｓｈｍら，２００７）にシナプス伝播させ、したがって、ホストのシナプス前ニューロンは、ＥＧＦＰのみを発現した（図４Ａ）。
【0120】
開始ニューロン（ＥＧＦＰ＋／ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）は、ヒト移植細胞でのみ発見され、かつＴＨ＋（図４Ｃと４Ｄ）である。シナプス標識されたホストニューロン（ＥＧＦＰ＋／ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）は、移植から離れた脳領域で容易に検出された（図４Ｅ）。移植された脳では、線条体の中で、最も豊富な標識を持つホストニューロン（ＣＰｕとＡｃｂを含む）が発見された（図４Ｅ～４Ｇ）。ＣＰｕ中の標識されたホストニューロンは、ＧＡＢＡとＤＡＲＰＰ３２を発現し、線条体中の有棘細胞であることを示唆した（図１２Ｆ）。Ａｃｂでは、標識されたホストニューロンが、プラークを形成し、異なるサンプルでこんな現象を観察した（図４Ｈ）。皮質領域では、ＣＴＩＰ２＋とＳＡＴＢ２＋皮質ニューロンが、ヒト黒質ｍＤＡニューロン（図４Ｅ～４Ｇと１２Ｆ）に投射されたことが分かった。視床下部領域では、視床下部外側（ＰＬＨ）の花柄部分と視床下部脳室傍核（Ｐａ）が、ＳＮのヒトｍＤＡニューロンに強く投射した。末端線条体（ＳＴ）と扁桃体中央（Ｃｅ）の床核にも、標識が密集したホストニューロンを発見したが、他の扁桃体領域にはなかった（図４Ｅ～４Ｇ）。また、淡蒼球（ＧＰ）、腹側淡蒼球（ＶＰ）、及び拡張扁桃体（ＥＡ）に、分散ニューロンは観察された。より多くの尾部領域では、背側縫線核（ＤＲ）、水道周囲灰白質（ＰＡＧ）である。橋網様核（Ｐｎ）は、大量の標識されたニューロンを含む（図４Ｅ～４Ｇ）。本発明者らは、ＤＲ中に、ＳＮ中のヒトｍＤＡニューロンに投射された５－ＨＴ＋ニューロンを発見した（図１２Ｆ）。移植されたヒトｍＤＡニューロンのシナプス前入力分布は、ＤＡＴ－Ｃｒｅマウスにおける内因性ＳＮｃ ｍＤＡニューロン上の分布と驚くほど類似し、後者は、ＤＡニューロン中でＣｒｅ（図１２Ｇと１２Ｈ）を発現し、かつＡｃｂ中にも、シート状分布入力を呈する内因性ｍＤＡニューロンが観察された。
【0121】
線条体移植の脳では、ＣＰｕに密集したシナプス前入力が見出したが、Ａｃｂには認められなかった。黒質移植したヒトｍＤＡニューロンに比べて、ＧＰと皮質領域で、より多くの入力が観察された。視床束傍核（ＰＦ）と背内側核（ＭＤ）が、線条体のヒトＤＡニューロンに投射することに傾向する。線条体移植の脳において、ＣｅとＳＮ網様部（ＳＮＲ）にも、標識されたホストニューロンを発見した。ＰＡＧ、ＤＲ、傍小脳脚核（ＰＢ）、Ｐｎなどの尾部髄質の多い領域では、標識されたニューロンは、ほとんど存在しない（図４Ｅ、４Ｆ、１２Ｊ）。
【0122】
そのため、線条体と黒質に移植されたヒトｍＤＡニューロンが受け取った入力は、異なる脳領域から来い、位置依存性シナプス前入力を示している。内因性ｍＤＡニューロンと同様に、黒質に移植されたヒトｍＤＡニューロンも、同様の脳領域から大量の入力を受けている。
【0123】
実施例５、移植されたニューロンのタイプは、その機能的入力特性を決定した
電気生理記録によると、移植後３ヶ月、線条体または黒質移植ブロックにおけるヒトｍＤＡと非ｍＤＡニューロンには、ｓＥＰＳＣとｓＩＰＳＣ（それぞれ自発的興奮性および抑制的シナプス後電流）をほとんど検出しなかった（図５Ａ～５Ｄ）。驚くべきことに、移植後６ヶ月で、線条体または黒質移植ブロックにおけるｍＤＡと非ｍＤＡニューロンには、ｓＩＰＳＣｓとｓＥＰＳＣｓの平均周波数（振幅ではなく）は、有意に増加した（図５Ａ～５Ｄ）。移植された非ｍＤＡニューロンとｍＤＡニューロンの間のｓＥＰＳＣまたはｓＩＰＳＣ上昇時間または減衰時間には、差がない（図１３Ａ～１３Ｆ）。これらの結果は、機能的入力は、移植位置やニューロンタイプの影響を受けず、３～６ヶ月以内に確立されたことを示す。
電気生理記録によると、移植後３ヶ月、線条体または黒質移植ブロックにおけるヒトｍＤＡと非ｍＤＡニューロンには、ｓＥＰＳＣとｓＩＰＳＣ（それぞれ自発的興奮性および抑制的シナプス後電流）をほとんど検出しなかった（図５Ａ～５Ｄ）。驚くべきことに、移植後６ヶ月で、線条体または黒質移植ブロックにおけるｍＤＡと非ｍＤＡニューロンには、ｓＩＰＳＣｓとｓＥＰＳＣｓの平均周波数（振幅ではなく）は、有意に増加した（図５Ａ～５Ｄ）。移植された非ｍＤＡニューロンとｍＤＡニューロンの間のｓＥＰＳＣまたはｓＩＰＳＣ上昇時間または減衰時間には、差がない（図１３Ａ～１３Ｆ）。これらの結果は、機能的入力は、移植位置やニューロンタイプの影響を受けず、３～６ヶ月以内に確立されたことを示す。
【0124】
興味深いことに、黒質移植ブロックでは、ｍＤＡニューロン中のｓＩＰＳＣ周波数は、非ｍＤＡニューロン中のｓＩＰＳＣ周波数よりも高かった（図５Ｃ）。これに対して、線条体と黒質移植ブロックでは、ｍＤＡニューロン中のｓＥＰＳＣ周波数は、非ｍＤＡニューロン中のｓＥＰＳＣ周波数より有意に低かった（図５Ｄ）。ｓＩＰＳＣ／ｓＥＰＳＣ比を計算することにより、本発明者らは、移植されたヒトｍＤＡニューロンが受け取る抑制性入力がより多く、そのｓＩＰＳＣ／ｓＥＰＳＣ比は３．２８であり、内因性ｍＤＡニューロンのパターンに似ているが、ヒトの非ｍＤＡニューロンが受ける抑制／興奮性入力では、ｓＩＰＳＣ／ｓＥＰＳＣ比は、０．９５であることを発見した（図５Ｅと１３Ｇ）。非ｍＤＡニューロンと比較すると、ヒトｍＤＡニューロンのｓＩＰＳＣ／ｓＥＰＳＣ比がより高い（２．６１）傾向は、線条体移植ブロックにも観察されたが（図５Ｅ）、内因性線条体ニューロンは、より多くの興奮性入力を受け、ｓＩＰＳＣ／ｓＥＰＳＣ比は０．８６（図５Ｅと１３Ｈ）であった。
【0125】
これらの結果は、移植部位ではなく移植ニューロンのタイプが、移植ニューロンの抑制性と興奮性入力特徴を決定することを示している。
【0126】
実施例６、ＧｌｕニューロンではなくｍＤＡニューロンの移植は、ＰＤマウスの運動障害を是正できる
移植前と移植後の４週間ごとに、アンフェタミンに誘導される回転、回転テストと円筒テストにより、黒質移植細胞の機能効果を評価した（図６Ａ）。線条体移植細胞のＰＤマウスのアンフェタミンに誘導される回転は、３ヶ月から回復を開始し、かつ移植後４ヶ月で回復した。時間の経過につれて、マウスは、反対側に回転することによって、徐々に過剰補償を示した（図６Ｂ）。４～５ヶ月後、黒質移植ｍＤＡのＰＤマウスにおいても機能回復が観察された；しかし、６ヶ月で、過剰補償は消失した（ｐ＜０．００１；図６Ｂ）。逆に、アンフェタミンに誘導される回転では、黒質にグルタミン酸ニューロンまたは人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ；対照）を受けたマウスは、回復の兆候を示さなかった（ｐ＞０．０５、図６Ｂ）。
移植前と移植後の４週間ごとに、アンフェタミンに誘導される回転、回転テストと円筒テストにより、黒質移植細胞の機能効果を評価した（図６Ａ）。線条体移植細胞のＰＤマウスのアンフェタミンに誘導される回転は、３ヶ月から回復を開始し、かつ移植後４ヶ月で回復した。時間の経過につれて、マウスは、反対側に回転することによって、徐々に過剰補償を示した（図６Ｂ）。４～５ヶ月後、黒質移植ｍＤＡのＰＤマウスにおいても機能回復が観察された；しかし、６ヶ月で、過剰補償は消失した（ｐ＜０．００１；図６Ｂ）。逆に、アンフェタミンに誘導される回転では、黒質にグルタミン酸ニューロンまたは人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ；対照）を受けたマウスは、回復の兆候を示さなかった（ｐ＞０．０５、図６Ｂ）。
【0127】
運動協調と平衡を評価し、かつドーパミンエネルギー系の薬理刺激に依存しない回転テストでは、ヒトｍＤＡニューロンの黒質または線条体移植を受けたＰＤマウスでは、時間の経過とともに、落下の時間が顕著に増加した（ｐ＜０．００１）が、黒質ＧｌｕニューロンまたはＡＣＳＦを受けたマウスでは増加しなかった（ｐ＞０．０５、図６Ｃ）。
【0128】
前肢の運動能力を測定する方法である円筒テストでは、すべてのグループは、６－ＯＨＤＡ損傷後に優先的な同側肢接触を示した。ヒトｍＤＡの黒質または線条体移植後４ヶ月、マウスの同側接触選好は、著しく低下した（５０％に近い）（ｐ＜０．００１）が、ＧｌｕニューロンまたはＡＣＳＦの黒質移植マウスは変化しなかった（ｐ＞０．０５、図６Ｄ）。
【0129】
実施例７、運動回復は黒質－線条体の神経回路機能の再構築に依存する
ＰＤモデル動物の挙動回復が、再構築された黒質－線条体回路に依存するかどうかを確定するために、本発明者らは、移植されたｈＥＳＣ由来のｍＤＡニューロンに、「双方向スイッチ」を設置した（図７Ａ）。本発明者らは、Ｂｉ－ＤＲＥＡＤＤ－ＨＥＳＣｓと呼ばれるｈＥＳＣ細胞株を構築し、ＡＡＶＳ１遺伝子座に、ＣＮＯによって活性化された興奮性ｈＭ３Ｄｑ受容体（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００９）とＳａｌｖｉｎｏｒｉｎ Ｂ（ＳＡＬＢ）によって活性化されたＫＯＲＤ抑制性受容体（Ｖａｒｄｙら、２０１５、図７Ｂ、１４Ａ、１４Ｂ）である２つのＤＲＥＡＤＤ（薬物によって専門的に活性化された受容体）を挿入した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現をＡＡＶＳ１遺伝子座にノックインしたｈＥＳＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ－ｈＥＳＣｓ）を、コントロールとした（図７Ｂ、１４Ａと１４Ｂ）。培養中または移植後に、Ｂｉ－ＤＲＡＤＤ－ＨＥＳＣまたはｍＣｈｅｒｒｙ－ｈＥＳＣから誘導されたニューロンに、遺伝子組み換えの発現が容易に検出された（図７Ｃ、７Ｄおよび１４Ｃ～１４Ｇ）。移植後の６ヶ月後、Ｂｉ－ＤＲＡＤＤグループとｍＣｈｅｒｒｙ（コントロールグループ）グループでは、運動回復が観察され、これは、アンフェタミンに誘導された回転の減少と同側接触選好の低下によって確認された（ｐ＜０．０５；図７Ｅ～７Ｇ）。
ＰＤモデル動物の挙動回復が、再構築された黒質－線条体回路に依存するかどうかを確定するために、本発明者らは、移植されたｈＥＳＣ由来のｍＤＡニューロンに、「双方向スイッチ」を設置した（図７Ａ）。本発明者らは、Ｂｉ－ＤＲＥＡＤＤ－ＨＥＳＣｓと呼ばれるｈＥＳＣ細胞株を構築し、ＡＡＶＳ１遺伝子座に、ＣＮＯによって活性化された興奮性ｈＭ３Ｄｑ受容体（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００９）とＳａｌｖｉｎｏｒｉｎ Ｂ（ＳＡＬＢ）によって活性化されたＫＯＲＤ抑制性受容体（Ｖａｒｄｙら、２０１５、図７Ｂ、１４Ａ、１４Ｂ）である２つのＤＲＥＡＤＤ（薬物によって専門的に活性化された受容体）を挿入した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現をＡＡＶＳ１遺伝子座にノックインしたｈＥＳＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ－ｈＥＳＣｓ）を、コントロールとした（図７Ｂ、１４Ａと１４Ｂ）。培養中または移植後に、Ｂｉ－ＤＲＡＤＤ－ＨＥＳＣまたはｍＣｈｅｒｒｙ－ｈＥＳＣから誘導されたニューロンに、遺伝子組み換えの発現が容易に検出された（図７Ｃ、７Ｄおよび１４Ｃ～１４Ｇ）。移植後の６ヶ月後、Ｂｉ－ＤＲＡＤＤグループとｍＣｈｅｒｒｙ（コントロールグループ）グループでは、運動回復が観察され、これは、アンフェタミンに誘導された回転の減少と同側接触選好の低下によって確認された（ｐ＜０．０５；図７Ｅ～７Ｇ）。
【0130】
アンフェタミン刺激によりＤＡ放出を必要としない円筒テストと自発回転テストを用いて、本発明者は、ＣＮＯ（１ｍｇ／ｋｇ）処理が、同側の優先接触をさらに低減できることを発見したが（ｐ＜０．０５；図７Ｈ）、ＳＡＬＢ（５ｍｇ／ｋｇ）処理は、Ｂｉ－ＤＲＡＤＤ移植による同じ動物の同側触覚を増加させた（ｐ＜０．０１；図７Ｈ）。ＣＮＯまたはＳＡＬＢ処理は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現を受けたマウスの同側接触に影響を与えなかった（ｐ＞０．０５、図７Ｈ）。自発回転テストにおいて、コントロールマウスは、明らかな運動平衡変化を示さなかった。しかし、Ｂｉ－ＤＲＡＤＤ細胞を移植したマウスでは、ＣＮＯ処理が、同側回転よりも多くの対側回転を著しく誘導し（ｐ＜０．０１）（図７Ｉ）、同側回転比は、４８．４９±８．１０から３４．８３±６．２３（ｐ＜０．０５、図７Ｊ）に低下した。逆に、ＳＡＬＢは、同側純回転（ｐ＜０．０５）を著しく増加し、同側回転比は、４８．４９±８．１０から５８．４２±９．９１（ｐ＜０．０１、図７Ｊ）に増加した。ＣＮＯまたはＳＡＬＢ処理の有無にかかわらず、ｍＣｈｅｒｒｙマウスは、明らかな変化を示さなかった（ｐ＞０．０５、図７Ｉと７Ｊ）。
【0131】
これらの結果は、前肢の運動障害の回復と非対称回転が、移植細胞の活性に依存することを示している。
【0132】
検討
本発明では、ＰＤマウスモデルにおける移植されたヒト由来ｍＤＡニューロンからの投射及びシナプス入力を正確に描画するための遺伝的標識戦略を開発した。本発明者らは、黒質に移植されたヒト由来ｍＤＡニューロンが、背側線条体に特異的に投射されることを発見した。狂犬病ウイルスに媒介される追跡により、移植されたｍＤＡニューロンは、内因性ｍＤＡニューロンと極めて類似した方法で、シナプス入力を受けていることが明らかになった。電気生理記録によると、主に、移植されたｍＤＡニューロンへの抑制性入力は、移植部位によらず、細胞のタイプに依存しているよう。シナプス前とシナプス後の統合により、同所移植したヒト由来ｍＤＡニューロンは、移植細胞の活性に応じて、ＰＤマウスの運動機能障害を挽回することができる。これらの発見は、移植されたニューロンと細胞型に関連する機能性回路との統合を解明し、幹細胞を使用する特定のニューロンタイプが、神経系疾患を治療するために神経回路を修復する見通しを際立たせた。
本発明では、ＰＤマウスモデルにおける移植されたヒト由来ｍＤＡニューロンからの投射及びシナプス入力を正確に描画するための遺伝的標識戦略を開発した。本発明者らは、黒質に移植されたヒト由来ｍＤＡニューロンが、背側線条体に特異的に投射されることを発見した。狂犬病ウイルスに媒介される追跡により、移植されたｍＤＡニューロンは、内因性ｍＤＡニューロンと極めて類似した方法で、シナプス入力を受けていることが明らかになった。電気生理記録によると、主に、移植されたｍＤＡニューロンへの抑制性入力は、移植部位によらず、細胞のタイプに依存しているよう。シナプス前とシナプス後の統合により、同所移植したヒト由来ｍＤＡニューロンは、移植細胞の活性に応じて、ＰＤマウスの運動機能障害を挽回することができる。これらの発見は、移植されたニューロンと細胞型に関連する機能性回路との統合を解明し、幹細胞を使用する特定のニューロンタイプが、神経系疾患を治療するために神経回路を修復する見通しを際立たせた。
【0133】
成熟した脳に移植されたニューロンの標的投射を決定するものは、まだ未知である。二つのタイプの投射ニューロンｍＤＡとＧｌｕニューロンを、ＰＤマウスの黒質に移植することにより、本発明者らは、二つのニューロンタイプとも長い経路を介して軸索を投射することができるが、異なる経路を介して、軸索を異なる標的に投射することを発見し、ただｈし、ほとんどの移植されたｍＤＡニューロン軸索は、ＣＰｕに投射された。ＴＨレポーター細胞系を用いて、これをさら確認し、このレポーター細胞は、腹側線条体（Ａｃｂ）ではなく背側線条体（ＣＰｕ）に、ほぼ排他的に投射することを示した。ＣＰｕは、ＳＮｃ（Ａ９）ｍＤＡニューロンの主要標的（ＢｊｏｒｋｌｕｎｄとＤｕｎｎｅｔｔ、２００７；ＪｏｅｌとＷｅｉｎｅｒ、２０００）であるため、本発明者らの発見は、ヒト由来ｍＤＡニューロンの多くが、Ａ９ ｍＤＡニューロンであることを示した。確かに、本発明の細胞の特徴、特に電気生理記録は、ヒト由来ｍＤＡニューロンのＡ９型を確認した。この説明は、以前の研究で見られた他の脳領域への軸索投射の多くは、非ｍＤＡニューロンから由来する可能性があることを示す。つまり、これらの結果は、投射経路と投射標的脳領域が、移植されたニューロンのタイプに大きく依存することを強く示唆した。
【0134】
シナプスを、移植されたニューロンに正しく入力することは、損失した機能を回復するためにも重要である。本発明において、ＴＨ－ｉＣｒｅシステムは、ヒト由来ｍＤＡニューロンに移植された単シナプス入力を、特異的に識別することができ、そして興味深いパターンを明らかにした。移植物を全体的に見ると、Ａｄｌｅｒらの観察に似て、黒質と線条体に移植されたｍＤＡニューロンが、重畳領域（例えば背側線条体）から入力を受けても、解剖的なシナプス入力は、移植位置と関与するようである。しかし、移植されたヒト由来ｍＤＡニューロンと内因性ｍＤＡニューロンの入力の驚くべき類似性は、細胞のタイプが、シナプス入力を決定する上で役割を果たしたことを示す。これは機能レベルでより明確に表示される。非ｍＤＡニューロンに比べて、細胞を線条体または黒質に移植するかは関係なく、移植されたｍＤＡニューロンは、より多くの抑制性入力を受けたが、より少ない興奮性入力を受け、これは、移植されたニューロンのタイプが、機能性シナプス入力を決定したを示す。
【0135】
移植されたｍＤＡニューロンのシナプス前とシナプス統合により、再構築された黒質－線条体回路が、ＰＤマウスの運動回復に役立つと自然に考えることができる。線条体に移植されたヒトｍＤＡニューロンは、機能的に線条体ニューロンに接続され、かつ光遺伝学的と化学的遺伝学的ツールを用いて動物行動の回復を促進することが、既に実証された。現在の研究では、Ｂｉ－ＤＲＡＤＤ戦略を用いて、同じ移植細胞上で活性化と抑制を行うことができ、これは、ＰＤマウスの行動回復の基礎となる再構築された黒質－線条体回路が機能していることを明確に証明した。
【0136】
精確な遺伝的標識と機能検測とを結合し、本発明者らは、成熟した脳における移植された細胞の神経回路の回復（経路探索、標的特異性、機能入力確立を含む）が、移植された神経の内在特性に大きく依存することを発見した。そのため、極めて重要なのは、高度に富化し、運命が決定した神経前駆細胞を移植することであり、そして治療効果を達成するために特定の回路を再構築した。したがって、細胞に基づく療法による神経系疾患の治療が、現実的である。
【0137】
本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきのは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図10H】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図14F】
【図14G】
【国際調査報告】