特表 2023-543398 トリプシン消化、クロマトグラフィーグラジエント、及びＢｏｘＣａｒ質量分析法を組み合わせることによって治療用抗体中の宿主細胞タンパク質を検出するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-16

(54)【発明の名称】トリプシン消化、クロマトグラフィーグラジエント、及びＢｏｘＣａｒ質量分析法を組み合わせることによって治療用抗体中の宿主細胞タンパク質を検出するための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20231006BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20231006BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20231006BHJP

   G01N 30/34 20060101ALI20231006BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20231006BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20231006BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20231006BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 J

G01N27/62 V

G01N27/62 X

G01N30/06 E

G01N30/34 E

G01N30/72 C

C12Q1/37

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023515255

(86)(22)【出願日】2021-09-08

(85)【翻訳文提出日】2023-04-11

(86)【国際出願番号】 US2021049398

(87)【国際公開番号】W WO2022055954

(87)【国際公開日】2022-03-17

(31)【優先権主張番号】63/075,617

(32)【優先日】2020-09-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507302748

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ニー ソン

(72)【発明者】

【氏名】グリア タイラー

(72)【発明者】

【氏名】オブライエン ジョンソン リード

(72)【発明者】

【氏名】チェン シャオジン

(72)【発明者】

【氏名】リ ニン

【テーマコード（参考）】

2G041

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA12

2G041GA03

2G041GA08

2G041HA01

2G041JA02

2G041LA08

4B063QA01

4B063QA20

4B063QQ79

4B063QR16

4B063QS17

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045EA20

4H045EA50

4H045GA21

(57)【要約】

本開示は、改善されたアッセイを用いて、治療用抗体調製物中の望ましくない宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の性質をプロファイリングするための改善された方法を提供する。当該アッセイは、超低トリプシン消化と、ロンググラジエント液体クロマトグラフィーと、質量分析（ＭＳ）、特にＢｏｘＣａｒ質量分析の使用とを含む、３つの例示的なステップを含む。本開示により、患者における使用に適するような治療用抗体の純度を決定することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療用タンパク質試料中の混入タンパク質の同一性または量を特定するための方法であって、以下：
前記タンパク質試料を消化する工程であって、より小さいポリペプチド配列が得られる、工程と、
前記消化物をクロマトグラフィーステップに曝露する工程と、
前記クロマトグラフィーステップの前記消化物を、質量分析（ＭＳ）に曝露する工程であって、前記混入タンパク質の同一性または存在量が特定される、工程と
を含む、方法。

【請求項2】

前記混入タンパク質の同一性が、サイズまたは配列によって特定される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記混入タンパク質の量が、１０未満、５未満、２未満、１未満、または０．１未満の百万分率（ｐｐｍ）レベルで決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記混入タンパク質が、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記治療用タンパク質が、抗体、抗体バリアント、または抗体融合物である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記消化物が、低濃度トリプシン消化物である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記クロマトグラフィーが、ロンググラジエント液体クロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記質量分析（ＭＳ）が、ＢｏｘＣａｒである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

治療用抗体試料中の混入タンパク質宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の同一性または量を決定するための方法であって、以下：
タンパク質消化物を生成するために、前記タンパク質試料を超低濃度トリプシンに曝露する工程と、
前記消化物をロンググラジエント液体クロマトグラフィーステップに曝露する工程と、
前記クロマトグラフィーステップの前記消化物を、質量分析（ＭＳ）ＢｏｘＣａｒに曝露する工程であって、前記混入ＨＣＰタンパク質の同一性または存在量が決定される、工程と
を含む、方法。

【請求項10】

前記ポリペプチドが、抗体、抗体バリアント、または抗体融合物である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記混入タンパク質が、ベータ－ヘキソサミニダーゼ、補体Ｃｌｒ－Ａサブ構成成分、ｈＰＬＢＤ２、カテプシンＺ、カテプシンＤ、シアル酸Ｏ－アセチルエステラーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤１、ペプチジル－プロリル シス－トランス イソメラーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、ｃ－ｘ－ｃモチーフケモカイン、トランスサイレチン、酸性セラミダーゼ、及びプロコラーゲンＣエンドペプチダーゼエンハンサー１からなる群より選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記トリプシン媒介性消化物が、１００００：１の比である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ロンググラジエント液体クロマトグラフィーのステップが、５０ｃｍカラム及び４時間のグラジエントを含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記抗体、抗体バリアント、または抗体融合物が、アフリベルセプト、リロナセプト、アリロクマブ、デュピルマブ、サリルマブ、セミプリマブ、及び抗エボラ抗体からなる群より選択される、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

請求項９の方法に従って、１０未満、５未満、２未満、１未満、または０．１未満の百万分の一（ｐｐｍ）レベルでの混入宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を有すると決定される、ポリペプチド。

【請求項16】

抗体、抗体バリアント、及び抗体融合物からなる群より選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。

【請求項17】

アフリベルセプト、リロナセプト、アリロクマブ、デュピルマブ、サリルマブ、セミプリマブ、及び抗エボラ抗体からなる群より選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。

【請求項18】

アフリベルセプトである、請求項１５に記載のポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月８日出願の米国仮出願第６３／０７５，６１７号の優先権を主張し、当該出願を参照によりその全体を本明細書に援用する。

【0002】

技術分野
本開示は、概して、改善されたアッセイを用いて、治療用抗体調製物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の性質をプロファイリングするための方法に関するものである。当該アッセイは、超低トリプシン消化と、ロンググラジエント液体クロマトグラフィーと、質量分析（ＭＳ）、特にＢｏｘＣａｒ質量分析とを含む、３つの例示的なステップを含む。

【背景技術】

【0003】

背景
治療用抗体は、医学に革命をもたらしており、最近開発された薬物のかなりの部分を構成している。多大な投資が開発に投じられた結果、７９種の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が米国食品医薬品局からの承認を受けており、世界のｍＡｂ市場が生み出す収益は、２０２５年までに３０００億ドルに達することが予測されている。

【0004】

多くの障害に対しｍＡｂ治療薬の採用が増加している主な理由は、特異性が高く、多くの薬物標的と親和性が高く、副作用が最小限であることによるものである。しかし、ｍＡｂの巨大なサイズ及び化学的不均一性、ならびに治療用タンパク質とともに細胞発現中に産生される宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入物の存在によって、これらの恩恵は薄められる。

【0005】

治療薬のＨＣＰ集団は、患者の安全性を脅かしたり薬物の有効性を低減したりするタンパク質を含み得るため、最大の懸念材料である。例えば、免疫原性ＨＣＰは、患者において意図しない有害な免疫応答を誘発する恐れがあり、酵素活性を有するＨＣＰは、治療用抗体自体を分解したり、製剤バッファー中の構成成分と反応して抗体の安定性を低下させ、視認可能な粒子の形成を増大させたりする恐れがある。

【0006】

実際に、免疫原性及び酵素活性の両方を潜在的に有するＨＣＰが報告されている事例すら存在する。このようなリスクから、ＨＣＰのレベルを、重要品質特性（ＣＱＡ）（モニターし許容されるレベルに制御しなければならない）として分類する必要があった。規制ガイドラインは、ＨＣＰの存在量の具体的な上限を示していないが、一般的には、精製薬品中１００ｐｐｍ以下を最大合計値とするリスクベースアプローチが用いられている。

【0007】

ＨＣＰの存在量をこのような低レベルに減らすには、かなりの幅のサイズ、実効電荷、疎水性、及び他の多くの物理化学的特性を備えた何千種ものタンパク質を実質的に除去可能な、多段階クロマトグラフィープロセスの実行が求められる。このようなプロセスは、典型的には、ほとんどのＨＣＰを除去するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーから開始して、続いてアニオン交換、サイズ排除、または疎水性相互作用クロマトグラフィーのような直交性の精製ステップを行って、残った混入物の集団及び存在量をさらに低減する。（Ｇｉｌｇｕｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅｓ，Ｊ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ２０１９，１５９５，２８－３８（非特許文献1）；Ｌｉｕ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１０，２，４８０－４９９（非特許文献2）；Ｚｈｕ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，ｐｐ １６３９－１６６９．（非特許文献3））

【0008】

抗体精製戦略が成功すれば、ＨＣＰの総レベルは１００ｐｐｍ未満に低減するため、これらの低存在量の分析物のモニタリングは困難であり、しばしば複数のアッセイを要する。ＨＣＰの検出及び定量化の戦略は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で開始されるのが一般的である。この方法は、特異性、正確性、及び精度が高いことに加え、使いやすさ及び自動化を備えていることから、このように主流となっている。（Ｚｈｕ－Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２０１４，１１１，２３６７－２３７９（非特許文献4）；Ｒｅｙ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ ２０１２，７０，５８０－５８６．（非特許文献5））

【0009】

しかし、ＥＬＩＳＡの利点は、その有用性を低減するいくつかの制約を伴う。特に重要なのは、ＥＬＩＳＡは、動物をヌル細胞株で免疫することによって産生されるポリクローナル抗体を必要とするが、このヌル細胞株が、産生細胞株由来の全てのＨＣＰを完全に網羅しないことから、より免疫原性の高いＨＣＰを検出する上で偏りが生じることである。（Ｚｈｕ－Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２０１４，１１１，２３６７－２３７９（非特許文献4）；Ｈｅｎｒｙ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１７，９，１０６５－１０７５．（非特許文献6））また、ＨＣＰレベルの過小評価は、タンパク質が治療用抗体と非共有結合的に結合している場合や、その濃度がポリクローナル抗体の能力よりも高い場合にもよく見られる。（Ａｎｉｃｅｔｔｉ，Ｖ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８６，９１，２１３－２２４．（非特許文献7））

【0010】

最後に、（ホスホリパーゼＢ様２のような）１つの重要なＨＣＰを検出するＥＬＩＳＡキットは存在し、問題を有する他の既知のタンパク質についても開発することはできるものの、従来のＥＬＩＳＡプラットフォームは、総タンパク質濃度のみを測定するにとどまり、特定のタンパク質を同定したり個々の濃度を定量化したりすることはできない。（Ｈｅｎｒｙ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１７，９，１０６５－１０７５．（非特許文献6））これらの制約により、ＨＣＰの特性評価において許容されないギャップが生じており、現在、規制当局は、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ２）のような直交性の方法でこのギャップを満たすことを期待している。

【0011】

このような理由から、分析物理化学を用いたロバストで精度の高いアッセイを有することは、タンパク質試料（例えば、治療用抗体）の、高速で正確なＨＣＰ品質管理（深いプロファイリング）を行う上で有益である。このようなアッセイは、臨床開発及び商業使用において抗体の製造を完璧にするための幅広い用途があり、公表され確立された方法に比べて高度に全体的ＨＣＰ制御を行い、約０．１ｐｐｍという感度のより高度な同一性カバレッジ及び忠実度を備え、他の方法に比べて高速で使いやすく（ステップ数が最小限）低コストであることが望ましい。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｇｉｌｇｕｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅｓ，Ｊ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ２０１９，１５９５，２８－３８

【非特許文献2】Ｌｉｕ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１０，２，４８０－４９９

【非特許文献3】Ｚｈｕ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，ｐｐ １６３９－１６６９．

【非特許文献4】Ｚｈｕ－Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２０１４，１１１，２３６７－２３７９

【非特許文献5】Ｒｅｙ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ ２０１２，７０，５８０－５８６．

【非特許文献6】Ｈｅｎｒｙ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１７，９，１０６５－１０７５．

【非特許文献7】Ａｎｉｃｅｔｔｉ，Ｖ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８６，９１，２１３－２２４．

【発明の概要】

【0013】

概要
１つの態様において、本開示は、速度及び正確性を改善して、ＨＣＰ特性評価における許容されないギャップを解決することに関するものである。詳細には、本開示は、治療用タンパク質試料中の混入タンパク質の同一性または量を決定するための高速アッセイを提供するものであり、当該アッセイは、典型的には、治療用タンパク質試料を、（１）超低トリプシン消化、（２）ロンググラジエント液体クロマトグラフィー、及び（３）質量分析（ＭＳ）、詳細にはＢｏｘＣａｒ質量分析に供することを含む、３つのステップを含む。上記の３つのステップ、すなわち、超低濃度トリプシン消化、ロンググラジエント液体クロマトグラフィー、及びＢｏｘＣａｒ質量分析を、本明細書では頭文字からＵＬＴＬＢと称する。

【0014】

１つの実施形態において、当該アッセイは、混入タンパク質、詳細には宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の、同一性及び存在量を同時に決定するのに適している。

【0015】

１つの実施形態において、当該アッセイは、タンパク質の同定に十分なアミノ酸配列または部分配列により、混入タンパク質の同一性を決定することができる。

【0016】

いくつかの実施形態において、当該アッセイは、混入タンパク質の存在量を百万分率（ｐｐｍ）単位の測定レベルで決定することができ、混入タンパク質の量は、百万分の一（ｐｐｍ）の感度で、約１０、５、２、１、０．１、またはそれ未満、すなわち１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、２ｐｐｍ未満、１ｐｐｍ未満、または０．１ｐｐｍ未満という低いレベル及びその間で決定される。

【0017】

諸実施形態において、当該アッセイは、原理上、任意の治療用タンパク質、詳細には抗体、抗体バリアント、または抗体融合物などの治療用タンパク質において、ＨＣＰ不純物の有無を調べるために使用することができる。

【0018】

したがって、当該アッセイは、本明細書で挙げている任意の数の治療用抗体、バリアント、及び融合物の精製ストリームに適用するために使用することができる（「当該アッセイの幅広い用途」という表題のサブセクションを参照）。

【図面の簡単な説明】

【0019】

本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示のいくつかの実施形態を例示するものであり、発明を実施するための形態とともに、本開示の原理を説明する役割を果たす。

【0020】

【図1】示されるような３つの主要なステップを有するアッセイの概略図である。ステップ１は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を有する治療用抗体試料が、超低濃度トリプシン消化プロセスに供されているのを示し、ステップ２は、得られた消化ポリペプチドが、ロンググラジエント液体クロマトグラフィーに供されているのを示し、ステップ３は、直前のステップ２のポリペプチドが、ＢｏｘＣａｒ質量分析取得プロセスに供され、（ベン図で重ねて示しているように）以前の方法に比べて顕著な改善が得られることを示している。上記の３つのステップ、すなわち、超低濃度トリプシン消化、ロンググラジエント液体クロマトグラフィー、及びＢｏｘＣａｒ質量分析は、本明細書では頭文字からＵＬＴＬＢと称する（図１に示す）。「ＢｏｘＣａｒ」という用語は、より高い忠実度を達成するための、例えば、１２個のアイソレーションウインドウ、すなわち「箱」で構成された選択的ＭＳスキャンを指す（図３も参照）。

【図2】図２Ａは、左から右に通常、ネイティブ、及び超低の順に強度を下げた様々なトリプシン消化条件に供した場合の、抗体標準物質（ＮＩＳＴｍＡｂ）を含む抗体試料を示している。各試料に対し二重反復で実行した。左パネルは、超低条件を使用することにより、通常及びネイティブ消化条件に比べて、最も多くのＨＣＰが同定されることを示している。右パネルは、超低条件を使用することにより、通常及びネイティブ消化条件に比べて、最も多くのユニークペプチドが同定されることを示している。図２Ｂは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の様々なカラム長（２５ｃｍまたは５０ｃｍ）及びグラジエント長（２時間または４時間）（左→右）に供したときの、上記の消化条件の、抗体標準（ＮＩＳＴｍＡｂ）を含む抗体試料を示している。各試料に対し二重反復で実行した。左のパネルは、長いカラム長（５０ｃｍ）及び長いグラジエント（４時間）を使用することにより、短いカラム長（２５ｃｍ）及び短いグラジエント（２時間）の場合に比べて最も多くのＨＣＰが同定されることを示している。右のパネルは、長いカラム長（５０ｃｍ）及び長いグラジエント（４時間）を使用することにより、短いカラム長（２５ｃｍ）及び短いグラジエント（２時間）の場合に比べて、同定されたユニークペプチドの量が最も多いことを示している。

【図3A】図３Ａ～３Ｃは、低存在量のペプチドのＭＳシグナルをブーストすることによってＨＣＰ同定を改善したＢｏｘＣａｒ取得プロファイルを示している。図３Ａは、標準的なフルスキャンの代表例を示している。図３Ｂは、１２個の狭いアイソレーションウインドウ（「ボックス」）で構成された隣接するＢｏｘＣａｒスキャンを示している。図３Ａ及び図３Ｂでは、フルスキャンと比較したＢｏｘＣａｒスキャンで観察可能なペプチドシグナルの増加を、影の挿入で強調している。シグナル：雑音比（Ｓ／Ｎ）を比較のために示している。図３Ｃは、ＢｏｘＣａｒ取得試料により、従来のデータ依存的取得（ＤＤＡ）に比べてＨＣＰ同定率の顕著な改善が得られた（約５１％）ことを示している。

【図3B】図３Ａの説明を参照。

【図3C】図３Ａの説明を参照。

【図4】図４のパネルＡでは、試料調製、ＬＣ分離、及びＭＳ取得の最適化から、ＵＬＴＬＢ法を用いたＨＣＰ同定の全体的改善に寄与していることを示している。図の凡例は以下の通り。ネイティブ：ネイティブ消化、２５ｃｍ及び５０ｃｍ：カラム長、２時間及び４時間：グラジエント時間。パネルＢでは、ＵＬＴＬＢ法によって同定した総ＨＣＰを、ネイティブ消化法及びＭＷＣＯ濃縮法の場合との比較でベン図で重ねて示している。ＵＬＴＬＢを含む諸方法により、合計４５３種のＨＣＰを同定した。

【図5】図５のパネルＡでは、二重反復の実行（反復１及び反復２で示す通り）で同定された、極めて一貫性のあるＨＣＰの重複（９２％）を、ベン図で重ねて示している。パネルＢでは、二重反復の実行（反復１及び反復２で示す通り）で同定されたタンパク質存在量の一致性が高いことを、ピアソン相関で示している。

【図6】図６のパネルＡでは、例示的な治療用抗体ＲＥＧＮ ｍＡｂ１に対する２つの以前のＨＣＰ検出方法（プロテインＡ及びネイティブ消化）を、本明細書に記載の例示的な実施形態に従う例示的な方法（ＵＬＴＬＢを用いた方法）と比較して、ベン図で重ねて示している。この情報は表形式でも提示している。パネルＢでは、第二の例示的な治療用抗体ＲＥＧＮ ｍＡｂ２に対する２つの以前のＨＣＰ検出方法（プロテインＡ及びネイティブ消化）を、本明細書に記載の例示的な実施形態に従う例示的な方法（ＵＬＴＬＢを用いた方法）を比較して、ベン図で重ねて示している。この情報は表形式でも提示している。

【発明を実施するための形態】

【0021】

詳細な説明
１．定義
「分析技法または分析化学」という用語は、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、またはこれらの組合せを用いた例示的な方法を行うためのポリペプチド分子の定量的な分析を指す。

【0022】

「抗体」という用語は、疾患または障害（例えば、免疫または腫瘍学的障害）の調節のために対象に導入するのに適している治療用免疫結合体、例えば、モノクローナル抗体、二重または多重特異性抗体を指す。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多特異性を有する抗体組成物、ならびに抗体フラグメントまたはサブユニット（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆｃ／２、及びＬＣ）、抗体誘導体、融合体、バリアント、及びアナログを表すものとして広く解釈するものとする。

【0023】

「ＢｏｘＣａｒ」という用語は、ＭＳ技法として知られている、ポリペプチドを特性評価するための分析技法を指し、選択的に解析される１つ以上のウインドウまたは「ボックス」が存在する。

【0024】

「ＤＤＡ」という用語は、質量分析ステップの実施に関連するデータ依存的取得（Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）として知られている、ポリペプチドを特性評価するための分析技法を指す。

【0025】

「深いプロファイリング」という用語は、分析技法（例えば、ＭＳ）を用いて、試料から高出力のタンパク質定量化を達成する能力を指す。

【0026】

「ＨＣＰ（単数または複数）」という用語は、タンパク質調製物を宿主細胞、典型的には真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内で製造する（すなわち、遺伝子発現させる）際に、タンパク質調製物中に認められる望ましくない不純物である単数または複数の宿主細胞タンパク質を指す。

【0027】

「ＨＲＡＭ」という用語は、高分解能精密質量分析として知られている、ポリペプチドを特性評価するための分析技法を指す。

【0028】

「ＬＣ」という用語は、液体クロマトグラフィーとして知られている、ポリペプチドを特性評価するための分析技法を指す。

【0029】

「ＬＣ－ＭＳ」という用語は、液体クロマトグラフィー及び質量分析として知られている、ポリペプチドを特性評価するための分析技法を指す。

【0030】

「ＬＣＭＳ２」という用語は、液体クロマトグラフィー及びタンデム質量分析として知られている、ポリペプチドを特性評価するための分析技法を指す。

【0031】

「ロンググラジエントＬＣ」という用語は、液体クロマトグラフィーとして知られている、ポリペプチドを特性評価するための分析技法を指し、ロンググラジエントとは、例えばカラムサイズが５０ｃｍで滞留時間が４時間であるものを指す。

【0032】

「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を指す。

【0033】

「ＭＳ」という用語は、質量分析として知られている、ポリペプチドを特性評価するための分析技法を指す。

【0034】

「ｍ／ｚ」という用語は、例えばＭＳを用いて、ポリペプチドの局面を特性評価するための分析パラメーターを指し、「ｍ」は質量、「ｚ」は観測されるイオンの電荷数を表す。

【0035】

「ＮＩＳＴｍＡｂ」という用語は、「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＧ１_κ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＮＩＳＴｍＡｂ）」として知られているモノクローナル抗体標準物質を指す。

【0036】

「Ｏｒｂｉｔｒａｐ」及び「Ｅｘｐｌｏｒｉｓ」という用語は、分析化学の分野で周知されている市販の質量分析計を指し、ポリペプチドの特性評価に用いられている。

【0037】

「トリプシン消化物（ｄｉｇｅｓｔ）または消化物（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）」という用語は、トリプシン酵素媒介性の切断ステップに曝露されたタンパク質を指す。消化物は、所望の結果を達成するために、トリプシン濃度及びインキュベート時間により高度に改変することができる。諸実施形態において、トリプシン消化物は、例えば１０，０００：１の比での「超低消化物」であり得る。

【0038】

「ポリペプチド消化物またはペプチド消化物」という用語は、ＵＬＴＬＢを含む例示的な方法を用いて適切なサイズのポリペプチドまたはペプチドを調べられるように、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、抗体）を、大きなタンパク質またはポリペプチドの配列を消化可能な１つ以上の酵素（例えば、トリプシン）とインキュベートした場合に、曝露の結果得られるポリペプチドまたはペプチドの混合物を指す。

【0039】

「ＵＬＴＬＢ」という用語は、超低濃度トリプシン消化、ロンググラジエント液体クロマトグラフィー、及びＢｏｘＣａｒ質量分析と称される３ステップアッセイの頭文字をつないだ語である。

【0040】

「超低濃度トリプシン消化」という用語は、望ましいペプチドプロファイルを達成するための低いトリプシン比率を指す。

【0041】

別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての用語及び表現は、逆のことが明らかに示されるか、逆のことが当該用語または表現が使用されている文脈から明らかに明白でない限り、その用語及び表現が当技術分野で得た意味を含む。

【0042】

２．治療用抗体調製物中のＨＣＰの性質及び存在量を特性評価するための改善されたアッセイ
本開示は、典型的には３つのステップを含むアッセイを提供する。

【0043】

ステップ１は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を有する治療用抗体試料を、超低濃度トリプシン消化プロセスに供することを含む。

【0044】

ステップ２は、得られた消化ポリペプチドを、ロンググラジエント液体クロマトグラフィープロセスに供することを含む。

【0045】

ステップ３は、直前のステップ２のポリペプチドを、ＢｏｘＣａｒ質量分析取得プロセスに供することを含み、その結果、同定されるポリペプチドの数が種類及び存在量の両面で大幅に改善される。

【0046】

例示的な方法及び各ステップについては、以下の複数の実施例で説明する。重要なことは、例示的なアッセイをいくつかの治療用抗体に適用して、既知の技法に比べて優れた結果を得られることである。

【0047】

上記の３つのステップ、すなわち、超低濃度トリプシン消化、ロンググラジエント液体クロマトグラフィー、及びＢｏｘＣａｒ質量分析を、本明細書では頭文字からＵＬＴＬＢと称し、図１に概略図の形で提示している。

【0048】

本明細書に記載の例示的なアッセイは、速度及び使いやすさを伴って高忠実度を達成するパラメーターを利用する。さらに、例示的なアッセイは、患者を保護する目的で、抗体治療薬に対しＨＣＰ不純物のスクリーニングを行うこともできる。

【0049】

３．幅広い用途
本開示が、治療用抗体調製物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の同一性及び存在量を、高い忠実度（約０．１ｐｐｍ以内）で、迅速かつ正確に決定できるようにするものであることを理解されたい。また、例示的なアッセイを２つの例示的な治療用抗体（ＲＥＧＮ ｍＡｂ１及びＲＥＧＮ ｍＡｂ２）にも適用し、優れた結果が得られた（それぞれ、図６の上パネル及び下パネルを参照）。したがって、本開示の方法は、商業的に生産される任意の治療用抗体のＣＭＣ（化学、製造、及び管理）を補完し改善するものである。

【0050】

例えば、１つの態様において、例示的なアッセイは、複数の抗体治療薬の製造ならびに均質性及び純度の保護の完璧化を可能にする。

【0051】

このような抗体治療薬としては、アブシキシマブ、アダリムマブ、アダリムマブ－ａｄｂｍ、アダリムマブ－ａｔｔｏ、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベバシズマブ－ａｗｗｂ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、ブロスマブ－ｔｗｚａ、カナキヌマブ、カプロマブペンデチド、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、ダクリズマブ（Ｚｉｎｂｒｙｔａ（登録商標））、ダラツムマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ－ｋｘｗｈ、エレヌマブ－ａｏｏｅ、エボロクマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、グセルクマブ、イバリズマブ－ｕｉｙｋ、イブリツモマブチウキセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ－ａｂｄａ、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ、インフリキシマブ－ｑｂｔｘ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、チルドラキズマブ－ａｓｍｎ、トシリズマブ、トラツズマブ、トラツズマブ－ｄｋｓｔ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、及びリツキシマブならびにヒアルロニダーゼが挙げられる。

【0052】

例示的なアッセイに供する様々な適応における関心対象となる他の治療用抗体としては、アフリベルセプト（眼障害の治療）、リロナセプト（失明及び転移性大腸癌の治療）、アリロクマブ（家族性高コレステロール血症または臨床アテローム性動脈硬化性心疾患（ＡＳＣＶＤ）の治療）、デュピルマブ（アトピー性皮膚炎の治療）、サリルマブ（関節リウマチ及びＣＯＶＩＤ－１９の治療）、セミプリマブ（ＰＤ－１関連疾患の治療）、ならびにエボラ治療用の抗体が挙げられる。

【実施例】

【0053】

以下の実施例は、例示目的で提供するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の内容を限定するものと解釈するべきではない。本出願内に記載する全ての参考文献及び特許を、参照により本明細書に含める。

【0054】

材料及び方法
参考文献
本開示の方法は、当業者が実施する際、ペプチド及びタンパク質の分析のために物理化学分野の従来の技法を利用することができ、本開示内に示されているだけでなく以下の文献及び現在の電子バージョンにも示されている（例えば、“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”（Ｐｒａｄｉｐ Ｋｕｍａｒ Ｇｈｏｓｈ，２０１５）；“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”（Ｊｅｎｎｉｅ Ｒ．Ｌｉｌｉ ａｎｄ Ｗｅｎｄｙ Ｓａｎｄｏｖａｌ，２０１７）；“Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）”（Ｍａｒｙ Ｓ．Ｌｉｐｔｏｎ ａｎｄ Ｌｊｉｌｊａｎａ Ｐａｓａ－Ｔｏｌｉｃ，２００８）；“Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”（Ａｌｉｓａ Ｇ．Ｗｏｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｓｔｅｌ Ｃ．Ｄａｒｉｅ，２０１９）；及び“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｒｏｍ Ｌａｂ ｔｏ Ｐａｔｉｅｎｔ”（Ｍｉｋｅ Ｓ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｑｉｎ Ｃ．Ｊｉ，２０１７））。

【0055】

材料
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ギ酸（ＦＡ）、及びアセトニトリルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。尿素、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、及びヒト化ＩｇＧ１_κモノクローナル抗体標準物質ＲＭ８６７１をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。

【0056】

シークエンシンググレード修飾トリプシン（再懸濁バッファーあり）をＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。Ｃ１８ ＳＰＥカラムをＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。精製モノクローナル抗体及びスパイクインＣＨＯタンパク質は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）で内製した。

【0057】

通常消化
２００μｇの原薬試料を、９Ｍの尿素／１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを用いて５ｍｇ／ｍｌに希釈した。ジスルフィド結合を１０ｍＭのＤＴＴで還元し、５０℃で３０分間インキュベートした。試料を室温に冷却し、暗中で３０分間、１５ｍＭのＩＡＭでアルキル化した。

【0058】

還元しアルキル化した試料を、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌでおよそ８倍に希釈した。トリプシン（１：２０のトリプシン：基質比）を用いて、タンパク質分解消化を、３７℃で一晩実施した。酸性化して０．２％ＦＡとすることにより、消化をクエンチした。試料をＣ１８ ＳＰＥカラムによって脱塩してからｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。

【0059】

ネイティブ消化
ネイティブ消化についての詳細な説明は、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１７，８９ ５４３５－５４４４）に示されている。簡潔に説明すると、試料を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を用いて約５ｍｇ／ｍｌに希釈した。次いでタンパク質を、３７℃のトリプシン（１：４００ｗ／ｗの酵素：基質比）で一晩消化し、最終ｐＨを約７．４とした。

【0060】

続いて、ジスルフィド結合を５ｍＭのＴＣＥＰで還元し、９０℃で１０分間インキュベートした。得られたペプチド混合物を酸性化して約０．２％ＦＡとし、１５０００ｇで２分間遠心分離した。上清を１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）遠心フィルターに移して粒子を除去してからｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。

【0061】

低濃度トリプシン消化
１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ ＭＷＣＯ遠心フィルターを用いて、試料を脱塩し、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）にバッファー交換した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定し、約５ｍｇ／ｍｌに希釈した。次いで、再懸濁バッファーで希釈したトリプシン（５０μｇ／μｌ）を、１００００：１ｗ／ｗのタンパク質：トリプシン比で試料に加え、３７℃で一晩消化した。続いて、ジスルフィド結合を５ｍＭのＴＣＥＰで還元し、９０℃で１０分間インキュベートした。試料を酸性化して約０．２％ＦＡとし、１５０００ｇで２分間遠心分離した。上清を１０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターに移し、粒子を除去してからｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。

【0062】

ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
全てのＨＣＰ試料は、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ ４８０質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連動させたものを用いて分析した。ＲＳＬＣｎａｎｏシステムは、２５ｃｍまたは５０ｃｍのＣ１８カラム（ＣｏＡｎｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、外径３６０μｍ、内径７５μｍ、先端内径１０μｍ）を備えていた。

【0063】

移動相Ａには水中０．１％ＦＡが含まれ、移動相Ｂは８０％アセトニトリル／２０％水中０．１％ＦＡが含まれた。試料を、Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００、７５μｍ×２ｃｍプレカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に流量５μｌ／分で５分間充填した。２時間のグラジエントについては、以下のようにリニアＬＣグラジエントを設定した：０分時５％Ｂ、８分時８％Ｂ、９５分時３６％Ｂ、及び１１５～１２０分時９５％Ｂ。

【0064】

４時間のグラジエントについては、以下のようにリニアＬＣグラジエントを設定した：０分時５％Ｂ、１０分時８％Ｂ、２２０分時３６％Ｂ、及び２３５～２４０分時９５％Ｂ。流量は、２５ｃｍカラムに対し０．２５μｌ／分、５０ｃｍカラムに対し０．２μｌ／分とした。

【0065】

質量スペクトルのデータ取得は、Ｘｃａｌｉｂｕｒ ｖ４．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ）を用いて実施した。ナノＥＳＩスプレー電圧を２２００Ｖに設定し、従来のデータ依存的取得モード（ＤＤＡ）において、Ｏｒｂｉｔｒａｐでサーベイスキャンを３秒のサイクルタイムで実施した。３００％の標準自動化ゲイン制御（ＡＧＣ）及び２０ｍｓの最大注入時間において６０Ｋの分解能（ｍ／ｚ２００）にて、ｍ／ｚ３８０～１５００でＭＳフルスキャンを取得した。

【0066】

ＨＣＤを用いて、１５Ｋの分解能（ｍ／ｚ２００）、７５％の標準ＡＧＣ、５０ｍｓの最大注入時間において、３０％の正規化衝突エネルギーによりＭＳ／ＭＳフラグメンテーションを実施した。ダイナミック排除期間を４５秒、リピートカウント１に設定し、電荷状態が＋２～＋６のプリカーサーのみを選択した。

【0067】

Ｅｘｐｌｏｒｉｓ４８０によるＢｏｘＣａｒスキャン
ＢｏｘＣａｒスキャンの設定は、Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１８，１５，４４０－４４８により公表された設定に従い、一部修正を加えた。全体の取得サイクルは、標準的フルスキャンに続いて、ｍ／ｚ４００～１２００の範囲を網羅する２回のＢｏｘＣａｒスキャン（１．５秒のサイクル時間）を含むものであった。従来のＤＤＡ実験と同じ基準及び設定を適用して、先行のフルスキャンから好適なプリカーサーイオンを選択した。

【0068】

各ＢｏｘＣａｒは、異なるｍ／ｚウインドウを有する１２個の異なるボックスを有する。各ＢｏｘＣａｒスキャンについて、総ＡＧＣ目標値を標準ＡＧＣの３００％に調整し、全てのボックスにわたり均等に分配した。各ボックスについて、最大合計イオン注入時間は２０ｍｓとした。他の全てのパラメーターは、前述の標準的ＤＤＡと同一とした。

【0069】

データ分析
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に組み込まれたＳＥＱＵＥＳＴとＭａｓｃｏｔを、一般的な混入物を含むＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ｍｏｕｓｅ ｔａｒｇｅｔ－ｄｅｃｏｙタンパク質データベースに対し用いて、ＨＣＰタンパク質同定のデータベース検索を実施した。プリカーサーイオンの質量許容差を２０ｐｐｍ、フラグメントイオンの質量許容差を０．０２Ｄａに設定した。

【0070】

データベース検索時にトリプシンを消化酵素として指定し、１回の切断ミスを許容した。通常（アルキル化）消化物に対し、メチオニン酸化（＋１６Ｄａ）を可変修飾として選択し、システインカルバミドメチル化を固定修飾として選択した。

【0071】

偽発見率（ＦＤＲ）は、ペプチド同定については１％、タンパク質同定については５％に設定し、タンパク質あたり最低２個のユニークペプチドが検出された。

【0072】

実施例１
治療用抗体調製物の純度を調べるためのＨＣＰアッセイの設計態様及び改善
この実施例では、治療用抗体調製物中のＨＣＰを検出するための例示的なアッセイを構築する上で検討した多くの課題及び設計態様の解決について説明する。

【0073】

高分解能のＬＣ分離及び高感度高分解能精密質量（ＨＲＡＭ）質量分析計を連結することにより、免疫原性に依存しない個々のＨＣＰの同定及び定量化が可能になる。このような分析における主な障壁は、豊富な治療用抗体と個々の低存在量のＨＣＰとの間の非常に大きな濃度差（治療用抗体ｍｇ当たり１～１００ｎｇ未満のＨＣＰ）から生じる。

【0074】

治療用抗体に対する精製戦略が進歩するに伴い、治療用タンパク質と混入タンパク質との間のダイナミックレンジは増加する一方であり、免疫原性または酵素活性を依然有し得るほとんどの低存在量のＨＣＰは、直接的なＬＣ－ＭＳ２法のみで検出することはできない。

【0075】

この課題に対応して、（１）免疫親和性、プロテインＡ、または分子量カットオフを通じてＨＣＰと治療用タンパク質との間の濃度差を小さくする、（２）多次元クロマトグラフィーを用いてＨＣＰ及び治療用ペプチドのピーク間の重複を低減する、そして（３）下限値から外れる種のデータ依存的分析を妨害するスキャン内ダイナミックレンジ制約を回避する、多数の試料調製及び装置の技法が開発されてきた。（Ｈｅｎｒｙ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１７，９，１０６５－１０７５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２０１４，２８，８５５－８６０；Ｍａｄｓｅｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１５，７，１１２８－１１３７；Ｃｈｅｎ，Ｉ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０２０，９２，３７５１－３７５７；Ｄｏｎｅａｎｕ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１２，４，２４－４４；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１５，８７，９１８６－９１９３；Ｋｕｆｅｒ，Ｒ．；Ｈａｉｎｄｌ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１９，９１，９７１６－９７２３；Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１７，９，６５４－６６３；Ｄｏｎｅａｎｕ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１５，８７，１０２８３－１０２９１；Ｋｒｅｉｍｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１７，８９，５２９４－５３０２；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０２０；Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０２０．）

【0076】

これらの方法の中には、タンパク質混入物をサブｐｐｍレベルまで検出できる方法もあるが、多くは、ある特定のＨＣＰに優先的に選択的であったり、スループットが著しく低下したり、新規タンパク質の同定をさらに困難にしたりする方法である。そのため、顕著なバイアスや他の注意点を導入することなくＨＣＰカバレッジの深さを大幅に拡大する比較的シンプルなＬＣ－ＭＳ２法が、バイオ医薬品業界及び規制当局から強く求められている。

【0077】

液体クロマトグラフィーと質量分析との組合せ（ＬＣ－ＭＳ）は、その感度、選択性、及び適応性ゆえに、抗体薬物プロセス開発時の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の分析における強力なツールである。しかし、治療用抗体と付随するＨＣＰとの間の非常に大きなダイナミックレンジのために、ＬＣ－ＭＳベースでこれらの低存在量の不純物を検出するのは著しく困難である。

【0078】

この課題に対処するため、典型的には、免疫親和性、プロテインＡ、２Ｄ－ＬＣ、または他の戦略によるＨＣＰの濃縮が実施されている。しかし、これらの濃縮は時間がかかり、場合によっては大量の試料を要する。

【0079】

本明細書では、非変性条件下の消化時における超低濃度トリプシンと、長いクロマトグラフィーグラジエントと、四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を用いたＢｏｘＣａｒ取得とを組み合わせること（ＵＬＴＬＢ）により、煩雑な濃縮を伴わずに治療用抗体試料中のＨＣＰを分析するためのシンプルで高感度な戦略を開示する。

【0080】

この戦略をＮＩＳＴモノクローナル抗体標準物質（ＮＩＳＴｍＡｂ）に適用した結果、４５３種のマウスＨＣＰが同定され、濃縮を伴わない同定されたＨＣＰの数が以前の報告に比べて顕著に増加した。既知量のＨＣＰを精製した抗体原薬にスパイクしたところ、当該方法が０．１ｐｐｍと高感度であることが示されている。このように、ＵＬＴＬＢ法は、抗体中のＨＣＰを深くプロファイリングするための高感度でシンプルなプラットフォームに相当するものである。

【0081】

進歩した試料調製、ＬＣ分離、及びＭＳデータ収集の組合せは、通常の障害を伴うことなく深いＨＣＰプロファイリングが可能な方法を開発する鍵を握っていると思われる。このような開発の１つは、非変性条件を利用することによって抗体よりもＨＣＰを優先的に消化するというものである。（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１７，８９，５４３６－５４４４）。別のプロテオミクス研究では、ＨＣＰには適用されていないが、消化時に極めて低いトリプシン濃度（１：２５０００ｗ／ｗの酵素：基質比）を適用することにより、低存在量のタンパク質の検出が増強されることが観察された（Ｆｏｎｓｌｏｗ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３，１０，５４－５６）。

【0082】

ＬＣカラム及びグラジエントの長さに関するプロテオミクス研究では、カラムとグラジエントを長くすると、追加的な試料調製及び負担となる多次元ＬＣの時間要件を伴わずに、高感度で深いプロテオームカバレッジが得られることが示されている（Ｔｈａｋｕｒ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１１，１０，Ｍ１１０ ００３６９９；Ｈｉｎｚｋｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１９，１０，２３８）。

【0083】

最後に、「ＢｏｘＣａｒ」法と名付けられたＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計における新規の取得方法は、狭いｍ／ｚウインドウからのイオンでＣトラップを満たし、これらのパケットをＯｒｂｉｔｒａｐに順次送信して、１回のスキャンで分析することにより、ＤＤＡ中のフルスキャンＭＳＩ取得の障害となるスキャン内ダイナミックレンジの問題を低減する（Ｍｅｉｅｒ，Ｆ. ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１８，１５，４４０－４４８）。ＢｏｘＣａｒ技法は、低存在量イオンの取得時間を多くすることができ、またトラップ内で高存在量イオンが消費するスペースを制限することにより、シグナル対ノイズを１桁増加させることができる。

【0084】

この試験では、複数のカラム及びグラジエントの長さを検討することで、いずれについても長い方がＨＣＰの同定を最大化することが明らかになり、またＢｏｘＣａｒ取得は従来のＤＤＡよりも多くのＨＣＰを同定することが分かった。さらに、非変性条件下の消化時における超低濃度トリプシンと、長いクロマトグラフィーグラジエントと、四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計におけるＢｏｘＣａｒ質量分析取得とを組み合わせることにより、深いＨＣＰプロファイリングのためのシンプルで新規のプラットフォームが確立された。本明細書で言及される「ＵＬＴＬＢ」法と称される、このシンプルでロバストで迅速なプロトコルは、他の方法に比べてより深いＨＣＰのプロファイリングを可能にする。これは、ＵＬＴＬＢ法が、不要で時間のかかる追加的な試料濃縮ステップを回避するためである。

【0085】

本明細書で開示しているように、複数のカラム及びグラジエントの長さを検討することで、いずれについても長い方がＨＣＰの同定を最大化することが明らかになり、またＢｏｘＣａｒ取得は従来のＤＤＡよりも多くのＨＣＰを同定することが分かった。さらに、非変性条件下の消化時における超低濃度トリプシンと、長いクロマトグラフィーグラジエントと、四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計におけるＢｏｘＣａｒ質量分析取得とを組み合わせることにより、深いＨＣＰプロファイリングのためのシンプルで新規のプラットフォームが必要とされることが確立された。

【0086】

「ＵＬＴＬＢ」法と称される、このシンプルでロバストで迅速なプロトコルは、他の方法に比べてより深いＨＣＰのプロファイリングを可能にし、不要で時間のかかる追加的な試料濃縮ステップを回避する（図１、実施例６、及び表２参照）。図１で示しているように、本開示のアッセイにより、２９６種のポリペプチドが同定された。Ｃｈｅｎらが同定したのは、わずか１０４種のポリペプチドである。Ｈｕａｎｇらが同定したのは、わずか４３種のポリペプチドである。

【0087】

したがって、この実施例では、以下にさらに詳細に説明するように、ＨＣＰ検出の課題を設定し、ＨＣＰ検出を顕著に改善する本明細書に記載の例示的アッセイ（ＵＬＴＬＢを用いた方法）の様々なパラメーターを示している。

【0088】

実施例２
３ステップアッセイのステップ１に関するアッセイ設計及び結果：
トリプシン消化ステップ
この実施例では、治療用抗体調製物中のＨＣＰを検出するための例示的なアッセイの設計態様について、アッセイにおける３つのステップのうち第一のステップ：トリプシン消化ステップから説明する。

【0089】

新規の消化戦略を用いて、濃縮ステップを伴わないシンプルで高感度な試料調製法を開発した。この消化ステップは、非変性条件における超低濃度のトリプシンの使用を伴い、その結果、ｍＡｂ自体よりもＨＣＰが優先的に消化された。

【0090】

ｍＡｂは、典型的にはほとんどのＨＣＰよりもはるかに大きく、合計１６個のジスルフィド結合によって安定化されているため、ＨＣＰよりもトリプシンへのアクセス性が低く、還元条件下または比較的高いプロテアーゼレベルで容易に消化される。最適な消化条件を得るため、非変性条件下でＮＩＳＴｍＡｂを消化することにより、２５０００：１～１０００：１の異なるタンパク質：トリプシン比を試験した。

【0091】

全ての試料を２５ｃｍカラム及び２時間グラジエントで分析した。図２は、タンパク質：トリプシン比が１００００：１及び２５００：１の消化物が、タンパク質：トリプシン比が２５０００：１及び１０００：１の消化物に比べて、より多くのＨＣＰ及びユニークペプチドが同定されたことを示している。さらなる分析から、トリプシン濃度の上昇に伴い、同定されたｍＡｂペプチドのスペクトル数が数倍増加した（約１０００ 対 約４２００）。

【0092】

超低濃度トリプシン消化試料（２５０００：１、１００００：１）では、比較的少ないｍＡｂスペクトルが同定された。これは、これらの試料中で最小限の量のｍＡｂが消化されたことを示している。同定されたＨＣＰの数を、見出されたｍＡｂペプチドスペクトル数に対してこ入れすることにより、最も多くのＨＣＰが検出され、最も少ない量のｍＡｂが消化された１００００：１のタンパク質：トリプシン比を、最適なタンパク質：トリプシン比として選択した。

【0093】

この方法を通常消化及びネイティブ消化と比較するため、同じＬＣ－ＭＳ条件を用いて、各条件で調製した試料を分析した。図２で示しているように、超低濃度トリプシン消化法は、ネイティブ消化法に比べて、ＨＣＰの同定を顕著に改善している（タンパク質レベルが６８％、ペプチドレベルが６０％）。いずれの方法も、わずかなＨＣＰ及びペプチドを検出するにとどまった通常消化条件よりも、大幅に優れた性能を示した。

【0094】

ＨＣＰ検出が低減した主な理由は、通常消化試料中ではＬＣクロマトグラムを支配した消化抗体ペプチドの存在量が高く、またネイティブ消化試料でも依然として存在量が高いためである。しかし、超低濃度トリプシン消化試料ではｍＡｂ消化ペプチドの数が少なく、そのためＨＣＰペプチドの干渉が少ない。

【0095】

この結果は、本開示の超低濃度トリプシン消化が、いかなる追加の冗長な濃縮手順を伴わずに、試料調製中にｍＡｂをインタクトに保つことにより、低存在量のＨＣＰペプチドを選択的に消化するシンプルな方法であることを示している。図２Ａ及び２Ｂを参照。

【0096】

したがって、この実施例では、ＨＣＰ検出の課題を設定し、アッセイの３つのステップのうち第一のステップ：トリプシン消化ステップを顕著に改善する本明細書に記載の例示的アッセイ（ＵＬＴＬＢを用いたアッセイ）の様々なパラメーターを示している。

【0097】

実施例３
３ステップアッセイのステップ２に関するアッセイ設計及び結果：
ロンググラジエント液体クロマトグラフィーステップ
この実施例では、治療用抗体調製物中のＨＣＰを検出するための例示的なアッセイの設計態様について、アッセイにおける３つのステップのうち第二のステップ：ロンググラジエント液体クロマトグラフィーステップから説明する。

【0098】

ＬＣ分離を最適化しＨＣＰ同定を改善するため、ＮＩＳＴｍＡｂ ＨＣＰ試料を用いて、複数のメーカー製の長さ及び寸法が異なる一連のカラムを試験して最良の分離を得た（データは示さず）。続いて、最も高性能のカラム（ＣｏＡｎｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬＬＣ，１．７μｍ、Ｃ１８カラム）を、ＮＩＳＴｍＡｂネイティブ消化試料を用いたさらなるカラム長及びグラジエントの最適化に使用した。カラム長最適化実験のデータから、２時間のグラジエントを使用する場合、５０ｃｍカラムを使用した結果、２５ｃｍカラムに比べてＨＣＰが４４．２％、ユニークペプチドが３６．０％多く同定された（図２）。

【0099】

５０ｃｍカラム長の優位が示されたのは、分離がより大きくピーク幅がより狭いためである。５０ｃｍカラムでグラジエントの長さをさらに最適化した。その結果、ＨＣＰ同定は、４時間グラジエントを使用すると、２時間グラジエントに比べてタンパク質レベルで１４．７％、ペプチドレベルで１３．５％さらに改善できることが分かった。しかし、さらに長いグラジエント（６時間及び８時間）を同じカラムで試験したところ、さらなる改善は観察されなかった。プロテオミクス研究では、複雑な組織または細胞の試料において、８時間グラジエントが４時間または６時間グラジエントに比べて最良の性能を示した（３５、３６）が、ＨＣＰ試料を分析する場合、複雑性が低く、単一タンパク質（ｍＡｂ）が異常に高濃度であり、これが低存在量のＨＣＰペプチド分析を妨害することから、同様の長さのグラジエントを使用する利点が少なくなるように思われる。

【0100】

さらに、６時間または８時間のような長いグラジエントでは、ピーク幅が広がるため、低存在量のＨＣＰペプチドのＭＳシグナルが著しく低下する可能性がある。これらの知見により、５０ｃｍカラムによる４時間グラジエントを最適なＬＣ分離条件として選択するに至った。より短時間の２５ｃｍカラムにおける２時間の分離の代わりに、４時間グラジエント及び５０ｃｍカラムを使用した場合、ＮＩＳＴｍＡｂネイティブ消化試料中で約６５．５％多いＨＣＰ（１８７対１１３）及び５４．４％多いユニークペプチド（７７２対５００）が同定された（図２）。この最適なＬＣ分離及び発明者らの超低濃度トリプシン消化を組み合わせた結果、標準的ＬＣ条件を用いたネイティブ消化に比べて、３倍以上の数のＨＣＰが同定された（３６６対１１３）。図２Ａ及び２Ｂを参照。

【0101】

したがって、この実施例では、ＨＣＰ検出の課題を設定し、アッセイの３つのステップのうち第二のステップ：ロンググラジエント液体クロマトグラフィーステップを顕著に改善する本明細書に記載の例示的アッセイ（ＵＬＴＬＢを用いたアッセイ）の様々なパラメーターを示している。

【0102】

実施例４
３ステップアッセイのステップ３に関するアッセイ設計及び結果：
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）ＢｏｘＣａｒステップ
この実施例では、治療用抗体調製物中のＨＣＰを検出するための例示的なアッセイの設計態様について、アッセイにおける３つのステップのうち第三のステップ：液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）ＢｏｘＣａｒステップから説明する。

【0103】

ＬＣ－ＭＳベースの方法における大きな課題は、試料消化物中のＨＣＰと治療用抗体との間の濃度差が６桁を上回り得ることである。さらに、トラップ型質量分析計の重要な制約は、イオントラップの電荷容量が限られているため、多くの低存在量イオンがＭＳ１レベルの分析から除外されることである。ＨＣＰ分析を妨害するワイドダイナミックレンジの問題を軽減するため、ＢｏｘＣａｒ取得法をＨＣＰ試料分析に適合させて、検出ダイナミックレンジを増大させた。

【0104】

図３Ａ及び図３Ｂで示しているように、ＢｏｘＣａｒスキャンのイオン注入時間の合計（１６４．６ｍｓ）は、標準的なフルスキャンのイオン注入時間（１．３ｍｓ）よりもはるかに長く、個々のボックスの平均イオン注入時間は、標準のフルスキャンの１０倍を上回った。最終的な結果として、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が不十分な低存在量種のフルスキャン信号が４０倍超増加した。

【0105】

１回のＬＣ－ＭＳ実験内で、ＢｏｘＣａｒスキャンの回数及びＢｏｘＣａｒスキャン当たりのボックス数は固定されていた。全体的な取得サイクルは、標準的なフルスキャン及びｍ／ｚ４００～１２００の範囲を網羅する２回以上のＢｏｘＣａｒスキャンから構成されていた。ＢｏｘＣａｒのスキャン回数を増やし、１回のスキャンでより多くのボックスをスキャンすることで検出ダイナミックレンジを増大させることはできるものの、より長いサイクルタイムが必要となる。

【0106】

全体のサイクルタイム及びＢｏｘＣａｒのスキャン回数のバランスをとるため、複数のＢｏｘＣａｒ設定を検討した。フルスキャン１回＋ＢｏｘＣａｒスキャン２回を使用したときに最も多くのＨＣＰが得られた。２つのＢｏｘＣａｒスキャンにおける各ボックスの詳細なｍ／ｚウインドウを表１に示す。

【0107】

ＢｏｘＣａｒ設定を最適化した後、同一のＬＣ条件（２５ｃｍカラムで２時間グラジエント）で分離したＮＩＳＴｍＡｂネイティブ消化試料を用いて、ＢｏｘＣａｒ取得をＤＤＡと比較した。ＢｏｘＣａｒ取得を用いて１７１種のＨＣＰが同定された。これは従来のＤＤＡに対し約５１％の改善に相当し、一方ユニークペプチド同定数は約５５％増加した（図３Ｃ）。

【0108】

したがって、この実施例では、ＨＣＰ検出の課題を設定し、アッセイの３つのステップのうち第二のステップ：液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）ＢｏｘＣａｒステップを顕著に改善する例示的なアッセイの様々なパラメーターを示している。

【0109】

実施例５
アッセイ設計及び３ステップアッセイの組合せの結果
ＵＬＴＬＢ法
この実施例では、アッセイの３つ全てのステップを組み合わせることによる、治療用抗体調製物中のＨＣＰを検出するための例示的なアッセイの設計態様について説明する。

【0110】

したがって、上記の例示的なアッセイの全てのステップ、すなわち、非変性条件下での超低濃度トリプシン消化と、最適なロングＬＣグラジエントと、ＢｏｘＣａｒ取得とを組み合わせて「ＵＬＴＬＢ法」と称する新たな方法とし、これを標準抗体（ＮＩＳＴｍＡｂ）に適用して、他の報告と直接比較できるようにした。ＵＬＴＬＢ法により、合計４５３種のマウスタンパク質が同定された（同定されたＨＣＰの全リストについては表１参照）。

【0111】

図４Ａで示しているように、ＵＬＴＬＢ法では、２５ｃｍカラムにおける２時間グラジエントを用いて分析した標準的ネイティブ消化よりもＨＣＰ同定が４倍以上増加した。またこの結果は、試料調製、ＬＣ分離、及びＭＳ取得を含む各最適化がＨＣＰ同定の改善にどれだけ貢献したかも明らかにしており、より長いカラム（５０ｃｍ）、より長いグラジエント（４時間）、及びＢｏｘＣａｒ取得により、ＨＣＰ同定がそれぞれ４４％、１４％、３８％改善した。超低濃度トリプシン消化を最適化されたＬＣ－ＭＳ条件と組み合わせることにより、ＨＣＰ同定はさらに７５％超増加した。

【0112】

これは、超低濃度トリプシン消化により、ＵＬＴＬＢ法においてＨＣＰの同定が顕著に改善されたことを示すものである。最近、Ｃｈｅｎら（ＡｎａｌＣｈｅｍ ２０２０，９２，３７５１－３７５７）及びＨｕａｎｇら（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１７，８９，５４３６－５４４４）の両者がＨＣＰ同定戦略を開発し、ＮＩＳＴｍＡｂを用いてその有効性を試験し、それぞれ１６４種のＨＣＰ及び６０種のＨＣＰを同定した。加えて、ネイティブ消化法（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）によって検出された６０種中５７種のＨＣＰがＵＬＴＬＢ法によって同定され、ＭＷＣＯ法によって同定された１６４種中１４７種のＨＣＰがＵＬＴＬＢ法によって同様に網羅された。合計でＮＩＳＴｍＡｂ中の２９６種のマウスＨＣＰがＵＬＴＬＢ法によって同定されたが、これらは以前の２つの研究では報告されていないものであった（図４Ｂ）。

【0113】

（表１）抗体試料にスパイクするタンパク質の濃度を変えることによって試験した検出限界

【0114】

当該方法の検出限界を評価するため、０．１～２００ｐｐｍにわたる濃度の１３種の精製ＣＨＯタンパク質を、非常に低いレベルの内在性ＨＣＰを含む精製市販グレードモノクローナル抗体ｍＡｂ１にスパイクした（表１）。リストには、ＰＬＢＤ２、カテプシンＤ、メタロプロテイナーゼ阻害剤１などの重要な低存在量ＨＣＰ標的が含まれた。２つのモノクローナル抗体について得られた比較結果については、図６を参照。

【0115】

ＵＬＴＬＢ法を用いてスパイクイン試料を処理し、三重反復で分析した。表１は、１３種全てのスパイクインタンパク質が高信頼度で同定され、最低濃度のタンパク質（０．１ｐｐｍ）でも８つのスペクトルで同定されたことを示している。結果からは、ＵＬＴＬＢ法の感度が高く、０．１ｐｐｍまでＨＣＰを検出できることが示される。

【0116】

ＵＬＴＬＢ法の再現性を、ＮＩＳＴｍＡｂを用いた２回の個別実行でも評価し、合計５８３種のタンパク質（全タンパク質の９２％に相当）が実行間で共有されていた（図５Ａ）。この再現性の高い結果は、ＨＣＰ分析に不可欠なタンパク質同定における信頼度の高さを示すものである。タンパク質存在量についてもラベルフリー定量化によって定量し、両実行で比較した。この方法のピアソン相関は０．９５超であり、ＵＬＴＬＢ法の再現性が高いことが示された（図５Ｂ）。

【0117】

したがって、この実施例では、ＨＣＰ検出の課題を設定し、３ステップＵＬＴＬＢ法の様々なパラメーター及びデータ結果を示している。

【0118】

実施例６
５つの異なるＨＣＰ分析技法の比較分析
この実施例では、表２にまとめた５つの異なるＨＣＰ分析技法の比較分析を提示する。

【0119】

本開示は、非変性条件下の消化時における超低濃度トリプシンと、長いクロマトグラジエントと、四重極オービトラップ質量分析計でのＢｏｘＣａｒ質量分析取得とを組み合わせることにより、ＵＬＴＬＢ法と称する深いＨＣＰプロファイリングのためのシンプルかつ新規のプラットフォームを確立する。

【0120】

この戦略を使用すれば、ｍＡｂ試料中の低存在量のＨＣＰは、非変性条件下で超低濃度のトリプシンを用いて優先的に消化され、ｍＡｂは比較的インタクトに保たれ、変性またはＭＷＣＯフィルターで取り出すことが可能になる。ロンググラジエント分離及びＢｏｘＣａｒ取得を最適化することにより、ＨＣＰ検出ダイナミックレンジはさらに１～２桁改善した。

【0121】

スパイクイン実験は、ＵＬＴＬＢ法が高感度であり、検出限界を０．１ｐｐｍまで達成することを示している。また、ＵＬＴＬＢ法は、ＮＩＳＴｍＡｂ中の４５０種超のＨＣＰを高い再現性で検出した。これらには、他の方法によって過去に報告されたほぼ全ての同定ＨＣＰが含まれている。

【0122】

したがって、ＵＬＴＬＢ法はシンプルでロバストであり、他の方法に比べてより深いＨＣＰプロファイリングを可能にし、追加的な時間のかかる試料の濃縮ステップを回避する。

【0123】

（表２）治療用抗体の純度を特性評価するためのＨＣＰアッセイの比較

【0124】

したがって、この実施例では、ＨＣＰ検出のための既存の４つのアッセイと、例示的なアッセイ（ＵＬＴＬＢ使用）との比較を設定し、ＵＬＴＬＢが優れていることを示している。

【0125】

その他の実施形態
以上の明細書において、ある特定の実施形態及び実施例を説明し、多くの詳細を例示目的で示してきたが、本明細書で説明されている例示的なアッセイが追加の実施形態の影響を受けやすく、本明細書に記載のある特定の詳細が本明細書に記載の基本原理から逸脱することなく変化し得ることは、当業者には明らかであろう。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】