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特表2023-543541ビーズ連結トランスポソームを使用するＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリの調製
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-17
(54)【発明の名称】ビーズ連結トランスポソームを使用するＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリの調製
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20231010BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALI20231010BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 200
C12Q1/6874 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023505710
(86)(22)【出願日】2021-08-05
(85)【翻訳文提出日】2023-01-26
(86)【国際出願番号】 US2021044715
(87)【国際公開番号】W WO2022031955
(87)【国際公開日】2022-02-10
(31)【優先権主張番号】63/061,885
(32)【優先日】2020-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/165,830
(32)【優先日】2021-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/168,802
(32)【優先日】2021-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/219,014
(32)【優先日】2021-07-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500358711
【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】502279294
【氏名又は名称】イルミナ ケンブリッジ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107489
【弁理士】
【氏名又は名称】大塩 竹志
(72)【発明者】
【氏名】ゴームリー， ナイル アンソニー
(72)【発明者】
【氏名】ケネディ， アンドリュー ビー．
(72)【発明者】
【氏名】キュルステン， ロバート スコット
(72)【発明者】
【氏名】シュロス， ゲイリー
(72)【発明者】
【氏名】ランダイス－ヒンチリフ， カルロ
(72)【発明者】
【氏名】シュルツァバーガー， サラ
(72)【発明者】
【氏名】ケイパー， フィオナ
(72)【発明者】
【氏名】ウー， イル－シューアン
(72)【発明者】
【氏名】クラナ， タルン
(72)【発明者】
【氏名】マシャイェキ， フォード
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR06
4B063QR07
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS32
4B063QX02
(57)【要約】
本出願は、タグ付きＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法を記載する。単一試料からＤＮＡ及びＲＮＡ配列決定ライブラリを調製するいくつかの方法も本明細書に記載される。これらの方法は、単一細胞からのライブラリ調製を含み得る。３’固有分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）を組み込むＲＮＡライブラリを調製する方法、及びタグメンテーションを用いて鎖特異的ＲＮＡライブラリを調製する方法も本明細書に記載される。ＲＮＡ及びＤＮＡライブラリを調製する方法が本明細書に記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、前記タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含み、前記方法が、ａ．ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、前記第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、前記トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、
ｂ．前記ＤＮＡを固定化することと、
ｃ．前記第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、
ｄ．前記ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、
ｅ．ｃＤＮＡを固定化するために、前記試料を第２の固体支持体と組み合わせることであって、前記第２の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、前記トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＲＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、
ｆ．前記ｃＤＮＡを固定化し、前記第２の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、を含む、方法。
【請求項2】
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、前記タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含み、前記方法が、ａ．ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、前記第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、前記トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、
ｂ．前記ＤＮＡを固定化することと、
ｃ．前記第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、
ｄ．前記ＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生することと、
ｅ．ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を固定化するために、前記試料を第２の固体支持体と組み合わせることであって、前記第２の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、前記トランスポソーム複合体が、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対する活性を有するトランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＲＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、
ｆ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を固定化し、前記第２の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、を含む、方法。
【請求項3】
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、前記タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含み、前記方法が、ａ．ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、前記第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、前記トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、
ｂ．前記ＤＮＡを固定化することと、
ｃ．前記第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、
ｄ．前記ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、
ｅ．溶液中で前記二本鎖ＤＮＡに対してタグメンテーションを行って、前記二本鎖ｃＤＮＡのタグ付き断片を調製することであって、溶液中の前記トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列、ＲＮＡ特異的バーコード、及び捕捉プローブにハイブリダイズする配列を含むトランスポゾンと、を含み、前記タグ付き断片が、前記ＲＮＡ特異的バーコードと、前記捕捉プローブにハイブリダイズする配列と、を含む、調製することと、
ｆ．前記試料を、捕捉プローブを含む表面を有する第２の固体支持体と組み合わせることと、
ｇ．前記第２の固体支持体上に前記二本鎖ｃＤＮＡのタグ付き断片を固定化することと、を含む、方法。
【請求項4】
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、前記タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含み、前記方法が、ａ．ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、前記第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、前記トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、
ｂ．前記ＤＮＡを固定化することと、
ｃ．前記第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、
ｄ．前記ＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生することと、
ｅ．溶液中で前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行って、前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグ付き断片を調製することであって、溶液中の前記トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列、ＲＮＡ特異的バーコード、及び捕捉プローブにハイブリダイズする配列を含むトランスポゾンと、を含み、前記タグ付き断片が、前記ＲＮＡ特異的バーコード及び前記捕捉プローブにハイブリダイズする配列を含む、調製することと、
ｆ．前記試料を、捕捉プローブを含む表面を有する第２の固体支持体と組み合わせることと、
ｇ．前記第２の固体支持体上に前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグ付き断片を固定化することと、を含む、方法。
【請求項5】
前記第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後に、合成二本鎖ＤＮＡを前記第１の固体支持体に付加することを更に含み、任意選択で、前記合成二本鎖ＤＮＡが、ウラシルを含み、増幅が、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＤＮＡ特異的バーコード及び前記ＲＮＡ特異的バーコードが、異なるプライマー結合配列を含み、任意選択で、前記方法が、ａ．前記ＤＮＡ特異的バーコードに含まれる前記プライマー結合配列と結合するプライマーを使用して、前記ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を増幅すること、
ｂ．前記ＲＮＡ特異的バーコードに含まれる前記プライマー結合配列と結合するプライマーを使用して、前記ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を増幅すること、又は
ｃ．前記ＤＮＡ特異的バーコードに含まれる前記プライマー結合配列と結合するプライマーと、前記ＲＮＡ特異的バーコードに含まれる前記プライマー結合配列と結合するプライマーと、を含むプライマーミックスを使用して、前記ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片及び前記ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を増幅することを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡの鎖特異的ライブラリを調製する方法であって、ａ．ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を阻害する条件下で、逆転写酵素、プライマー、及びｄＴＴＰを含むヌクレオチドを使用して、試料中に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を調製することと、
ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、及びｄＵＴＰを含むヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡの前記第１の鎖からｃＤＮＡの第２の鎖を調製して、二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、
ｃ．前記二本鎖ｃＤＮＡを、トランスポソーム複合体が上に固定化された固体支持体に適用することであって、各トランスポソーム複合体が、
ｉ．トランスポザーゼと、
ｉｉ．トランスポゾン末端配列及び第１のリード配列決定アダプター配列を含む３’部分を含む第１のトランスポゾンであって、前記トランスポソーム複合体を前記固体支持体に固定化するための５’親和性エレメントを含む、第１のトランスポゾンと、
ｉｉｉ．前記トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾン配列と、を含む、適用することと、
ｄ．前記トランスポソーム複合体を用いて前記二本鎖ＤＮＡに対してタグメンテーションを行って、前記第１のリード配列決定アダプター配列を含むタグ付き二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、
ｅ．前記第２のトランスポゾンを除去し、ギャップ充填及び伸長を行うことと、
ｆ．前記二本鎖ＤＮＡ断片の前記鎖を分離することと、
ｇ．第２のリード配列決定アダプター配列を含むプライマーを、前記トランスポゾン末端配列又は前記トランスポゾン末端配列に対して完全に若しくは部分的に相補的である前記配列にハイブリダイズし、前記固体支持体に結合されておらず、かつ前記第１のリード配列決定アダプター及び前記第２のリード配列決定アダプターを含むＤＮＡ鎖を調製するために増幅することと、
ｈ．前記増幅によって生成される前記鎖を、前記固体支持体から放出することであって、前記放出が、前記第１のリード配列決定アダプター及び前記第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖ＤＮＡ断片を放出する、放出することと、を含む、方法。
【請求項8】
ａ．ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を阻害する前記条件が、アクチノマイシンＤを含む緩衝液の存在であり、ｂ．前記プライマーが、１つ以上のランダマープライマーであるか、若しくは前記プライマーが、ランダマープライマーとポリＴプライマーとの混合物であり、
ｃ．ｃＤＮＡの第２の鎖の前記調製のための前記プライマーが、ｃＤＮＡの第１の鎖の前記調製のための前記プライマーと同じであり、
ｄ．前記ＲＮＡが、長い非コードＲＮＡ又はアンチセンス転写物であり、
ｅ．前記増幅が、ウラシル不耐性ポリメラーゼを用いて行われ、かつ／又は
ｆ．前記親和性エレメントが、ビオチン、デスチオビオチン、若しくはデュアルビオチンであり、前記固体支持体が、その表面上にストレプトアビジン若しくはアビジンを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ａ．固有分子識別子（ＵＭＩ）が、第２のリード配列決定アダプター配列を含む前記プライマーに含まれ、任意選択で、前記ＵＭＩが、前記第２のリード配列決定アダプター配列と、前記トランスポゾン末端配列に結合することができる配列又は前記トランスポゾン末端配列に対して完全に若しくは部分的に相補的である配列との間に位置するか、あるいはｂ．ＵＭＩが前記第１のトランスポゾンに含まれ、任意選択で、前記ＵＭＩが、前記トランスポゾン末端配列と前記第１のリード配列決定アダプター配列との間に位置する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記放出の後に、前記第１のリード配列決定アダプター及び前記第２のリード配列決定アダプターを含む前記一本鎖ＤＮＡ断片を用いてインデックスプライマー増幅を行って、インデックス付き断片を調製することを更に含み、任意選択で、前記インデックスプライマー増幅が、前記固体支持体とは別個の反応容器内で行われ、かつ／又は前記インデックスプライマー増幅が、ウラシル不耐性ポリメラーゼを用いて行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを調製する方法であって、ａ．ＵＭＩ及び第１のリード配列決定アダプター配列を含むポリＴプライマーを使用して、試料中の完全長ＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を調製することと、
ｂ．ｃＤＮＡの第２の鎖を調製して、二本鎖ｃＤＮＡを生成することと、
ｃ．前記二本鎖ｃＤＮＡを、トランスポソーム複合体が上に固定化されたビーズに適用することであって、各トランスポソーム複合体が、
ｉ．トランスポザーゼと、
ｉｉ．３’トランスポゾン末端配列を含む第１のトランスポゾンと、
ｉｉｉ．前記トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列及びハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含み、
前記トランスポソーム複合体が、ビーズに固定化されたオリゴヌクレオチドへの前記ハイブリダイゼーション配列の結合によって固定化され、前記オリゴヌクレオチドが、５’親和性エレメント、第１のリード配列決定アダプター配列、ビーズコード、及び前記ハイブリダイゼーション配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む、適用することと、
ｄ．前記二本鎖ｃＤＮＡを固定化し、前記ビーズに対してタグメンテーションを行って、二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、
ｅ．前記第２のトランスポゾンを除去することと、
ｆ．第２のリード配列決定アダプター配列と、前記トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列と、を含むプライマーを、前記トランスポゾン末端配列にハイブリダイズすることと、
ｇ．ギャップ充填及び伸長を行って、前記第１のリード配列決定アダプター及び前記第２のリード配列決定アダプターを含む二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、を含む、方法。
【請求項12】
ＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを調製する方法であって、ａ．ＵＭＩ及び第１のリード配列決定アダプター配列を含むポリＴプライマーを使用して、試料中の完全長ＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を調製することと、
ｂ．ｃＤＮＡの第２の鎖を調製して、二本鎖ｃＤＮＡを生成することと、
ｃ．前記二本鎖ｃＤＮＡを、トランスポソーム複合体が上に固定化されたビーズに適用することであって、各トランスポソーム複合体が、
ｉ．トランスポザーゼと、
ｉｉ．３’トランスポゾン末端配列、ビーズコード、及び第２のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンであって、前記トランスポソーム複合体を前記固体支持体に固定化するための５’親和性エレメントを更に含む、第１のトランスポゾンと、
ｉｉｉ．前記トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、適用することと、
ｄ．前記二本鎖ｃＤＮＡを固定化し、前記ビーズに対してタグメンテーションを行って、二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、
ｅ．前記第２のトランスポゾンを除去することと、
ｆ．第２のリード配列決定アダプター配列と、前記トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列と、を含むプライマーを、前記トランスポゾン末端配列にハイブリダイズすることと、
ｇ．ギャップ充填及び伸長を行って、前記第１のリード配列決定アダプター及び前記第２のリード配列決定アダプターを含む二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、を含む、方法。
【請求項13】
前記トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である前記配列が、前記トランスポゾン末端配列より短く、任意選択で、前記トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である前記配列が、前記トランスポゾン末端配列より短い場合、より少ないアダプターダイマーが生成される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、標的ＲＮＡを含む試料を、トランスポソーム複合体及び捕捉オリゴヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、任意選択で、前記標的ＲＮＡが、前記捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の少なくとも一部分に対して相補的である配列を含み、かつ／又は前記捕捉オリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列を含み、前記トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、前記第１のポリヌクレオチドが、
ｉ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
ｉｉ．第１のタグと、を含み、
前記試料は、前記標的ＲＮＡの３’末端が前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、前記固体支持体に適用される、適用することと、
ｂ．ｃＤＮＡを合成し、前記捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ｃ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、前記トランスポソーム複合体を用いて前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、前記第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【請求項15】
前記トランスポソーム複合体が、タグメンテーションを行う前に可逆的に不活性化され、タグメンテーションを行うことが、前記トランスポソーム複合体を活性化することを含み、任意選択で、ａ．前記トランスポソーム複合体が、前記トランスポソーム複合体に結合したトランスポソーム不活性化剤によって可逆的に不活性化され、任意選択で、
ｉ．前記トランスポソーム不活性化剤が、前記トランスポソーム複合体のＴｎ５結合部位に結合されているか、又は
ｉｉ．前記トランスポソーム不活性化剤が、脱リン酸化ＭＥ’、余分な塩基、阻害剤二重鎖、及び／若しくは易熱性抗体を含み、かつ／又は
ｂ．前記トランスポソーム複合体が、前記トランスポソーム不活性化剤を除去することによって活性化される、請求項１～１４、１６～２３、又は２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ．標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、前記第１のポリヌクレオチドが、
ｉ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
ｉｉ．第１のタグと、を含み、
前記試料は、前記標的ＲＮＡの３’末端が前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、前記固体支持体に適用される、適用することと、
ｂ．トランスポザーゼを、前記トランスポザーゼが前記第１のポリヌクレオチドに結合してトランスポソーム複合体を形成する条件下で付加することと、
ｃ．ｃＤＮＡを合成し、前記捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ｄ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、前記トランスポソーム複合体を用いて前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、前記第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【請求項17】
標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ．標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、前記第１のポリヌクレオチドが、
ｉ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
ｉｉ．第１のタグと、を含み、
前記試料は、前記標的ＲＮＡの３’末端が前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、前記固体支持体に適用される、適用することと、
ｂ．ｃＤＮＡを合成し、前記捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ｃ．トランスポザーゼを、前記トランスポザーゼが前記第１のポリヌクレオチドに結合してトランスポソーム複合体を形成する条件下で付加することと、
ｄ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、前記トランスポソーム複合体を用いて前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、前記第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【請求項18】
標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に前記適用することが、液滴中で行われ、任意選択で、標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に前記適用することが、ａ．ビーズと一緒に液滴中の単一細胞を提供することと、
ｂ．前記液滴中の前記細胞を溶解することと、
ｃ．前記単一細胞から前記標的ＲＮＡを放出することと、
ｄ．前記標的ＲＮＡを前記ビーズ上に捕捉することと、を含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
配列決定のために、前記固体支持体上のＤＮＡ：ＲＮＡ断片の前記固定化ライブラリを、表面に送達することを更に含み、任意選択で、前記方法が、前記送達の後に、ａ．配列決定のために、前記表面上のＤＮＡ：ＲＮＡ断片の前記固定化ライブラリを用いて前記固体支持体を捕捉することと、
ｂ．前記固定化断片を前記固体支持体から放出することと、
ｃ．配列決定のために、前記表面上の前記断片を捕捉することと、を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に前記適用することが、前記固体支持体上のマイクロウェル中で行われ、かつ／又は標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に前記適用することが、細胞を溶解し、マイクロウェル中の前記単一細胞から標的ＲＮＡを放出することを含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の前記固定化ライブラリを放出し、同じマイクロウェル中で前記断片を配列決定することを更に含み、任意選択で、前記固体支持体が、マイクロウェルを含むフローセルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記トランスポソーム複合体全てが、同一であり、任意選択で、前記断片が、前記二本鎖断片の両方の鎖の前記５’末端において同じアダプター配列でタグ付けされており、任意選択で、前記方法がａ．前記トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を放出することと、
ｂ．アダプター配列、ＵＭＩ、及び第１の３’末端トランスポゾン配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズすることであって、前記ポリヌクレオチドに含まれる前記アダプター配列が、前記トランスポソーム複合体に含まれる前記アダプター配列とは異なる、ハイブリダイズすることと、
ｃ．任意選択で、前記二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長することと、
ｄ．任意選択で、前記ポリヌクレオチド又は伸長ポリヌクレオチドを前記二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、
ｅ．前記ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を産生することであって、前記ＵＭＩが、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する、産生することと、を更に含む、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ．標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、任意選択で、前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡであり、前記捕捉オリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列を含む、適用することと、
ｂ．ｃＤＮＡを合成し、前記捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ｃ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、溶液中の前記トランスポソーム複合体を用いて前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、前記第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【請求項24】
固体支持体であって、その上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドを含み、前記第１のポリヌクレオチドが、ａ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
ｂ．第１のタグと、を含む、固体支持体。
【請求項25】
捕捉オリゴヌクレオチド及び固定化オリゴヌクレオチドを含む固体支持体であって、前記固定化オリゴヌクレオチドが、トランスポソーム複合体に含まれる第２のトランスポゾンに含まれるハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするための配列を含む、固体支持体。
【請求項26】
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む前記試料を、
ｉ．ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、前記第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、前記第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、
ｉｉ．第１の捕捉オリゴヌクレオチドが上に固定化された第２の固体支持体と、に適用することであって、
前記試料は、前記ＤＮＡが前記第１の固体支持体上の前記第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、前記ＲＮＡが前記第２の固体支持体上の前記第１の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、前記第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、
ｂ．前記第２の固体支持体に結合した前記ＲＮＡを、第３の固体支持体に転移させることであって、前記第３の固体支持体が、その上に固定化された、前記転移されたＲＮＡに結合する第２の捕捉オリゴヌクレオチドと、第２のトランスポソーム複合体と、を有し、前記第２のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第２のポリヌクレオチドと、を含み、前記第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、含む、転移させることと、
ｃ．ｃＤＮＡを合成し、前記第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ｄ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、前記第２のトランスポソーム複合体を用いて前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、前記第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【請求項27】
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、
ｉ．ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、前記第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、前記第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、
ｉｉ．捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドが上に固定化された第２の固体支持体であって、前記第２のポリヌクレオチドが、
トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
第２のタグと、を含む、第２の固体支持体と、に適用することであって、
前記試料は、前記ＤＮＡが前記第１の固体支持体上の前記第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、前記ＲＮＡが前記第２の固体支持体上の前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、前記第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、
ｂ．トランスポザーゼを、前記トランスポザーゼが前記第２のポリヌクレオチドに結合して、前記第２の固体支持体上にトランスポソーム複合体を形成する条件下で、付加することと、
ｃ．ｃＤＮＡを合成し、前記第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ｄ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、前記第２のトランスポソーム複合体を用いて前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、前記第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【請求項28】
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、
ｉ．ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、前記第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、前記第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、
ｉｉ．可逆的に不活性化される捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のトランスポソーム複合体が上に固定化されたＲＮＡを固定化するための第２の固体支持体であって、前記トランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、前記第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む、第２の固体支持体と、に適用することであって、前記試料は、前記ＤＮＡが前記第１の固体支持体上の前記第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、前記ＲＮＡが前記第２の固体支持体上の前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、前記第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、
ｂ．ｃＤＮＡを合成し、前記捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ｃ．前記第２のトランスポソーム複合体を活性化することと、
ｄ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、前記活性化された第２のトランスポソーム複合体を用いて前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、前記第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【請求項29】
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体に適用することであって、前記第１の固体支持体が、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、前記第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、前記第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含み、前記試料は、前記ＤＮＡが前記第１の固体支持体上の前記第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択でタグ付けされる条件下で適用される、適用することと、
ｂ．前記結合したＤＮＡを有する前記第１の固体支持体を前記ＲＮＡから分離することと、
ｃ．捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のトランスポソーム複合体が上に固定化されたＲＮＡを固定化するための第２の固体支持体に前記ＲＮＡを適用することであって、前記第２のトランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、前記第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含み、前記ＲＮＡが、前記第２の固体支持体上の前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合する、適用することと、
ｄ．ｃＤＮＡを合成し、前記第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ｅ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、活性化された第２のトランスポソーム複合体を用いて前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、前記第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【請求項30】
標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ．ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するための条件下で、標的ＲＮＡを含む試料に逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ｂ．トランスポソーム複合体が上に固定化された固体支持体にＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を固定化することであって、
前記トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、前記第１のポリヌクレオチドが、
ｉ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
ｉｉ．第１のタグと、を含み、
前記試料は、前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が、捕捉オリゴヌクレオチド又はトランスポザーゼに直接結合する条件下で、前記固体支持体に適用される、固定化することと、
ｃ．前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、前記トランスポソーム複合体を用いて前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、前記第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【請求項31】
請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法を使用して調製された配列決定ライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年８月６日に出願された米国特許仮出願第６３／０６１，８８５号、２０２１年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／１６５，８３０号、２０２１年３月３１日に出願された米国特許仮出願第６３／１６８，８０２号、及び２０２１年７月７日に出願された米国特許仮出願第６３／２１９，０１４号の優先権の利益を主張し、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年８月６日に出願された米国特許仮出願第６３／０６１，８８５号、２０２１年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／１６５，８３０号、２０２１年３月３１日に出願された米国特許仮出願第６３／１６８，８０２号、及び２０２１年７月７日に出願された米国特許仮出願第６３／２１９，０１４号の優先権の利益を主張し、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（発明の分野）
本出願は、ビーズ連結トランスポソームを使用するＲＮＡ配列決定ライブラリの調製に関する。単一試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを調製する方法もまた記載される。
本出願は、ビーズ連結トランスポソームを使用するＲＮＡ配列決定ライブラリの調製に関する。単一試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを調製する方法もまた記載される。
【背景技術】
【0003】
ＲＮＡ配列決定はいくつかの用途にとって重要である。例えば、完全ＲＮＡ転写物の配列決定は、スプライシングにおける差異など、転写物における任意の変異を研究することを可能にする。また、ＲＮＡ配列決定は、転写物のカウントを行い、様々な遺伝子の転写物の数をカウントするために使用され得る。
【0004】
ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）は、次世代配列決定を使用してトランスクリプトームをプロファイリングする。一般的な技術は、一本鎖ＲＮＡを一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡ断片に変換することを含む。次いで、アダプターは、ライブラリ調製において各断片の末端に付加され、これは多くの配列決定プラットフォームに必要とされる。使用されるアプローチに依存して、ＲＮＡがどの鎖に由来するかに関する情報が保持され得る。これは、鎖特異的ＲＮＡ－ｓｅｑとして知られており、アンチセンス転写物を正確に特定し、非コードＲＮＡ（例えば、ＬｎｃＲＮＡ）の鎖を決定し、重複遺伝子の境界を画することによって、標準的なアプローチを改善する。更に、鎖特異的ＲＮＡ－ｓｅｑは、転写物発現のより正確な推定を提供するため、望ましいアプローチである。
【0005】
ＲＮＡ試料を配列決定するための多くの現在のプロトコルは、配列決定の前に試料中のＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡフォーマットに変換する試料調製方法を用いる。ＲＮＡ配列決定のために、ワークフロー及び使い易さを改善する方法、例えば、タグメンテーションを使用して鎖特異的ＲＮＡライブラリの調製を可能にする方法が必要とされる。
【0006】
更に、現在の単一細胞ＲＮＡ配列決定分析は、発現の定量的測定を確実にするために、固有分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）に基づく方法に依存する。このアプローチは、配列決定のための十分なインプットを得るために有意なレベルのｃＤＮＡ前増幅にしばしば依存する単一細胞ＲＮＡ配列決定に特に関連する。増幅バイアスは、マッチするＵＭＩ及びマッピング部位を有するリードを折りたたむことによって補正され得る。しかしながら、ＵＭＩに基づく方法は、ＣＥＬ－ｓｅｑ２（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１７：７７（２０１６））、Ｄｒｏｐ－ｓｅｑ（Ｍａｃｏｓｋｏ ＥＺ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６１：１２０２－１４（２０１５））、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２（Ｐｉｃｅｌｌｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ９：１７１－１８１（２０１４））などの最新のプロトコルでＵＭＩが結合されるか、又はＳＴＲＴ－ｓｅｑ（Ｉｓｌａｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３；１１：１６３－６）などで、５’末端でＵＭＩが結合され得る場合、転写物の３’にのみ由来するリードを提供する。したがって、代替的スプライシング研究は、ＲＮＡ配列決定の顕著な適用となっているが、単一細胞アイソフォーム発現分析を可能にし得る利用可能な技術が非常に少ないため、アイソフォーム発現の単一細胞レベル測定は、限定されたままである。したがって、ＲＮＡからのｃＤＮＡ産生を改善する方法は、広範な種々の異なる適用において使用され得る。
【0007】
表面（ビーズなど）に結合したトランスポソームは、二本鎖（double-stranded、ｄｓ）ＤＮＡの長い分子をタグ付けし、ビーズ又は他の表面上に鋳型ライブラリを産生することができる（米国特許第９６８３２３０号を参照されたい）。トランスポソームをビーズに固定することは、タグメンテーション中の挿入サイズ及び収量の制御を助けることができ、以前はＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ技術として知られているＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ（研究用途のみ、ｒｅｓｅａｒｃｈ ｕｓｅ ｏｎｌｙ、ＲＵＯ）技術の基礎である。これらの方法において、Ｔｎ５酵素は、タグメンテーションと称される「カットアンドペースト（cut-and-paste）」機構を介して、二本鎖ＤＮＡ又はｃＤＮＡの末端への配列決定に必要とされるアダプターの転位を触媒する。ライブラリ調製において、タグメンテーションは、ビーズ連結トランスポソーム（bead-linked transposome、ＢＬＴ）を使用して溶液中又は磁気ビーズ上のいずれかで行われる。タグメンテーションに基づく方法は、ライゲーションに基づく方法よりも少ない工程を必要とし、より高い変換効率をもたらし、より正確である。しかしながら、タグメンテーション法で利用可能な鎖特異的ＲＮＡ－ｓｅｑ法は存在しない。
【0008】
更に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅなどの非対称タグメンテーション法は、Ａ１４及びＢ１５トランスポソームの混合物を含むＢＬＴを用いたタグメンテーションを含み、Ａ１４及びＢ１５は、配列決定アダプター配列を含む。Ａ１４のみ又はＢ１５のみでタグメンテーションされている断片（すなわち、断片の両末端にＡ１４配列又は断片の両末端にＢ１５配列を有する断片）は、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＢＳ配列決定法が、断片の一方の末端にＡ１４及び他方の末端にＢ１５の存在を必要とするため、実行可能なライブラリ産物を作製しない。したがって、全てのタグメンテーションされた断片のおよそ半分が失われ、先行技術における非対称タグメンテーション法によるライブラリ調製効率の低下につながる。全てのトランスポソーム複合体が同一のトランスポソームを含む対称タグメンテーションプロトコルを組み込むことによってなど、タグメンテーション産物のそのような損失を回避する方法が、タグメンテーションを含む方法で収量を改善するために必要である。
【0009】
トランスポソームはまた、「見かけの」ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖をタグメンテーションすることができる。例えば、ポリＴ捕捉オリゴは、フローセル表面に結合され、その３’ポリＡテールを介してｍＲＮＡ転写物を捕捉し、続いて、逆転写酵素（reverse transcriptase、ＲＴ）酵素で処理して、元のＲＮＡ転写物に結合した「第１の鎖合成」ｃＤＮＡ鎖を含む二重鎖を生成することができる。次いで、溶液からのトランスポソームは、国際公開第２０１３／１３１９６２（Ａ１）号に記載されているように、クラスタ化可能かつ配列決定可能である鋳型を生成することができる。次に、トランスポソームを溶液に添加して、第２の鎖ｃＤＮＡ、及びしたがって二本鎖ｃＤＮＡを生成することなく、クラスタ化可能かつ配列決定可能である鋳型を生成することができた。これは、トランスポソームが「見かけの」ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をタグメンテーションすることができることを示唆した。この機構の仮説は、逆転写酵素が、ＲＮＡ鎖に生じるニックを介して第２の鎖合成を開始し、これらのｄｓＤＮＡ二重鎖がトランスポソームの基質であるということである。しかしながら、溶液からのトランスポソームを使用する結果として、リードは、転写物の３’末端からのみ生成される（図１Ｂ及び図１Ｃに示される）。本出願は、３’バイアスを回避するＲＮＡに対するタグメンテーションの方法を記載する。
更に、本出願は、同じ試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを調製する手段を記載する。多くの配列決定に基づくアッセイは、試料のＤＮＡ及びＲＮＡ含量の両方を「マルチオミクス」分析で特徴付けることができることから利益を得る。試料からの全核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む、ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＴＮＡ）を分析するための現在の試料調製／配列決定ワークフローは、これらのワークフローが煩雑である及び／若しくは試料の著しい損失を有する（例えば、ＴＮＡ試料を２つの生体分子特異的ライブラリ調製物に分割することを必要とする）か、又は生体分子の種類を区別しない（例えば、次世代配列決定（next-generation sequencing、ＮＧＳ）リードは、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のいずれかに由来し得る）かのいずれかであるため、マルチオミクスに限定される。本開示は、元の生体分子の種類（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を特定する方法を使用する、ＮＧＳのための効率的なＴＮＡ試料調製のための様々な方法論を記載する。したがって、これらの方法論は、二本鎖核酸のタグメンテーションによる単純化されマルチオミクスライブラリ調製を可能にすることができる。
３’固有分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）を組み込むＲＮＡライブラリを調製する方法、及びタグメンテーションを用いて鎖特異的ＲＮＡライブラリを調製する方法も本明細書に記載される。
更に、本出願は、同じ試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを調製する手段を記載する。多くの配列決定に基づくアッセイは、試料のＤＮＡ及びＲＮＡ含量の両方を「マルチオミクス」分析で特徴付けることができることから利益を得る。試料からの全核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む、ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＴＮＡ）を分析するための現在の試料調製／配列決定ワークフローは、これらのワークフローが煩雑である及び／若しくは試料の著しい損失を有する（例えば、ＴＮＡ試料を２つの生体分子特異的ライブラリ調製物に分割することを必要とする）か、又は生体分子の種類を区別しない（例えば、次世代配列決定（next-generation sequencing、ＮＧＳ）リードは、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のいずれかに由来し得る）かのいずれかであるため、マルチオミクスに限定される。本開示は、元の生体分子の種類（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を特定する方法を使用する、ＮＧＳのための効率的なＴＮＡ試料調製のための様々な方法論を記載する。したがって、これらの方法論は、二本鎖核酸のタグメンテーションによる単純化されマルチオミクスライブラリ調製を可能にすることができる。
３’固有分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）を組み込むＲＮＡライブラリを調製する方法、及びタグメンテーションを用いて鎖特異的ＲＮＡライブラリを調製する方法も本明細書に記載される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】米国特許第９６８３２３０号明細書
【特許文献2】国際公開第２０１３／１３１９６２（Ａ１）号
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１７：７７（２０１６）
【非特許文献2】Ｍａｃｏｓｋｏ ＥＺ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６１：１２０２－１４（２０１５）
【非特許文献3】Ｐｉｃｅｌｌｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ９：１７１－１８１（２０１４）
【非特許文献4】Ｉｓｌａｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３；１１：１６３－６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0012】
ＲＮＡ及びＤＮＡライブラリを調製する方法が本明細書に記載される。
【0013】
実施形態１．標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、（ａ）標的ＲＮＡを含む試料を、トランスポソーム複合体及び捕捉オリゴヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、標的ＲＮＡの３’末端が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、固体支持体に適用される、適用することと、（ｂ）ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、（ｃ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【0014】
実施形態２．トランスポソーム複合体が、タグメンテーションを行う前に可逆的に不活性化され、タグメンテーションを行うことが、トランスポソーム複合体を活性化することを含む、実施形態１に記載の方法。
【0015】
実施形態３．トランスポソーム複合体が、トランスポソーム複合体に結合したトランスポソーム不活性化剤によって可逆的に不活性化される、実施形態２に記載の方法。
【0016】
実施形態４．トランスポソーム不活性化剤が、トランスポソーム複合体のＴｎ５結合部位に結合される、実施形態３に記載の方法。
【0017】
実施形態５．トランスポソーム不活性化剤が、脱リン酸化ＭＥ’、余分な塩基、阻害剤二重鎖、及び／又は易熱性抗体を含む、実施形態３又は４に記載の方法。
【0018】
実施形態６．トランスポソーム複合体が、トランスポソーム不活性化剤を除去することによって工程（ｃ）において活性化される、実施形態２～５のいずれか１つに記載の方法。
【0019】
実施形態７．捕捉オリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0020】
実施形態８．標的ＲＮＡが、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
【0021】
実施形態９．トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
【0022】
実施形態１０．トランスポソーム複合体が、トランスポゾン末端配列に対して相補的である領域を含む第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
【0023】
実施形態１１．トランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態１０に記載の方法。
【0024】
実施形態１２．あらゆる未結合の標的ＲＮＡを除去するために、工程（ａ）の後に固体支持体を洗浄することを更に含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
【0025】
実施形態１３．トランスポソーム複合体が、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0026】
実施形態１４．トランスポザーゼが、Ｔｎ５トランスポザーゼを含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
【0027】
実施形態１５．Ｔｎ５トランスポザーゼが、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである、実施形態１４に記載の方法。
【0028】
実施形態１６．固定化ライブラリ中の二本鎖断片の長さが、固体支持体上のトランスポソーム複合体の密度を増加又は減少させることによって調整される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
【0029】
実施形態１７．第１のタグの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が、同じタグドメインを含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。
【0030】
実施形態１８．タグが、クラスタ増幅のための領域を含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
【0031】
実施形態１９．タグが、配列決定反応をプライミングするための領域を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
【0032】
実施形態２０．固体支持体が、微小粒子、ビーズ、平面支持体、パターン化表面、又はウェルを含む、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
【0033】
実施形態２１．平面支持体が、チューブの内面又は外面である、実施形態２０に記載の方法。
【0034】
実施形態２２．タグメンテーションを行うことが、固体支持体上の２つの固定化トランスポソーム複合体に架橋された二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生し、任意選択で、ＤＮＡの第２の鎖が、タグメンテーションを行う前に二本鎖ＤＮＡを調製するために合成される、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
【0035】
実施形態２３．架橋された二重鎖の長さが、１００塩基対～１５００塩基対である、実施形態２２に記載の方法。
【0036】
実施形態２４．固体支持体に適用される試料が、血液である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
【0037】
実施形態２５．固体支持体に適用される試料が、細胞溶解物である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0038】
実施形態２６．細胞溶解物が、粗細胞溶解物である、実施形態２５に記載の方法。
【0039】
実施形態２７．固体支持体に適用される試料が、１．７以下である２６０／２８０吸光度比を有する、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。
【0040】
実施形態２８．試料を固体支持体に適用した後に、試料中の細胞を溶解することを更に含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
【0041】
実施形態２９．（ｄ）ＤＮＡ：ＲＮＡ断片が液相トランスポソーム複合体によって更に断片化される条件下で、液相トランスポソーム複合体を、固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ断片と接触させて、それによって、溶液中に１つの末端を有する固定化核酸断片を得ることを更に含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
【0042】
実施形態３０．液相トランスポソーム複合体が、第２のタグを含み、それによって、溶液中に第２のタグを有する固定化核酸断片を生成する、実施形態２９に記載の方法。
【0043】
実施形態３１．第１及び第２のタグが異なっている、実施形態３０に記載の方法。
【0044】
実施形態３２．液相トランスポソーム複合体の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が、第２のタグを含む、実施形態２９～３１のいずれか１つに記載の方法。
【0045】
実施形態３３．ポリメラーゼと、第１のポリヌクレオチドの部分に対応する増幅プライマーとを反応させることによって、固体支持体上の断片を増幅することを更に含む、実施形態２９～３２のいずれか１つに記載の方法。
【0046】
実施形態３４．実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法に従って調製された、タグ付きＲＮＡ断片のライブラリが上に固定化された固体支持体。
【0047】
実施形態３５．標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ）標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、標的ＲＮＡの３’末端が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、固体支持体に適用される、適用することと、（ｂ）トランスポザーゼを、トランスポザーゼが第１のポリヌクレオチドに結合してトランスポソーム複合体を形成する条件下で付加することと、（ｃ）ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上の固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、（ｄ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【0048】
実施形態３６．標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、ａ）標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、標的ＲＮＡの３’末端が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、固体支持体に適用される、適用することと、（ｂ）ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、（ｃ）トランスポザーゼが第１のポリヌクレオチドに結合してトランスポソーム複合体を形成する条件下で、トランスポザーゼを付加することと、（ｄ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【0049】
実施形態３７．標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に適用することが、液滴中で行われる、実施形態３５又は３６のいずれか１つに記載の方法。
【0050】
実施形態３８．標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に適用することが、（ａ）ビーズと一緒に液滴中の単一細胞を提供することと、（ｂ）液滴中の細胞を溶解することと、（ｃ）単一細胞から標的ＲＮＡを放出することと、（ｄ）ビーズ上に標的ＲＮＡを捕捉することと、を含む、実施形態３７に記載の方法。
【0051】
実施形態３９．液滴が、ｃＤＮＡを合成する前に除去される、実施形態３７又は３８に記載の方法。
【0052】
実施形態４０．配列決定のために、固体支持体上のＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを送達することを更に含む、実施形態３５～３９のいずれか１つに記載の方法。
【0053】
実施形態４１．送達の後に、（ａ）配列決定のために、表面上のＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを用いて固体支持体を捕捉することと、（ｂ）固体支持体から固定化断片を放出することと、（ｃ）配列決定のために、表面上に断片を捕捉することと、を更に含む、実施形態４０に記載の方法。
【0054】
実施形態４２．配列決定のために、表面上の断片を配列決定することを更に含む、実施形態４１に記載の方法。
【0055】
実施形態４３．配列決定のための表面が、フローセルである、実施形態４２に記載の方法。
【0056】
実施形態４４．標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に適用することが、固体支持体上のマイクロウェル中で行われる、実施形態３５～４３のいずれか１つに記載の方法。
【0057】
実施形態４５．標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に適用することが、細胞を溶解することと、マイクロウェル中の単一細胞から標的ＲＮＡを放出することと、を含む、実施形態４４に記載の方法。
【0058】
実施形態４６．ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを放出することと、同じマイクロウェル中の断片を配列決定することと、を更に含む、実施形態３５～４５のいずれか１つに記載の方法。
【0059】
実施形態４７．固体支持体が、マイクロウェルを含むフローセルである、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の方法。
【0060】
実施形態４８．配列決定データが、配列決定のための表面上の断片の空間的近接度に基づいて、同じ固体支持体上に固定化されていた断片の分解能を可能にする、実施形態４７に記載の方法。
【0061】
実施形態４９．トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行うことが、
２つの異なるトランスポソーム複合体を用いて行われ、異なるトランスポソーム複合体が、異なるアダプター配列を含む第１のトランスポゾンを含む、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の方法。
２つの異なるトランスポソーム複合体を用いて行われ、異なるトランスポソーム複合体が、異なるアダプター配列を含む第１のトランスポゾンを含む、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の方法。
【0062】
実施形態５０．少なくともいくつかの断片が、一方の鎖の５’末端において第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端において第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる、実施形態４９に記載の方法。
【0063】
実施形態５１．トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行うことが、同じアダプター配列を含む第１のトランスポゾンを含むトランスポソーム複合体を用いて行われる、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の方法。
【0064】
実施形態５２．全てのトランスポソーム複合体が、同一である、実施形態５１に記載の方法。
【0065】
実施形態５３．断片が、二本鎖断片の両方の鎖の５’末端において同じアダプター配列でタグ付けされる、実施形態５１又は５２に記載の方法。
【0066】
実施形態５４．（ａ）トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を放出することと、（ｂ）アダプター配列、ＵＭＩ、及び第１の３’末端トランスポゾン配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズすることであって、ポリヌクレオチドに含まれるアダプター配列が、トランスポソーム複合体に含まれるアダプター配列とは異なる、ハイブリダイズすることと、（ｃ）任意選択で、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長することと、（ｄ）任意選択で、ポリヌクレオチド又は伸長したポリヌクレオチドを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（ｅ）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を産生することであって、ＵＭＩが挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する、産生することと、を更に含む、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載の方法。
【0067】
実施形態５５．（ａ）トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を放出することと、（ｂ）ＵＭＩ及びアダプター配列を含む第１のポリヌクレオチドをハイブリダイズすることであって、第１のトランスポゾン内のアダプターが、第１のポリヌクレオチド内のアダプターとは異なる、ハイブリダイズすることと、（ｃ）任意選択で、第１のポリヌクレオチドに対して相補的である領域を含む第２のポリヌクレオチドを付加して、二本鎖アダプターを産生することと、（ｄ）任意選択で、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長することと、（ｅ）任意選択で、二本鎖アダプターを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、（ｆ）ＵＭＩを含む二本鎖標的核酸断片を産生することであって、ＵＭＩが二本鎖標的核酸断片と第１のポリヌクレオチドからのアダプター配列との間に位置する、産生することと、を更に含む、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載の方法。
【0068】
実施形態５６．断片が、一方の鎖の５’末端において第１のトランスポゾンからの第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端において第１のポリヌクレオチドからの第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる、実施形態５４又は５５に記載の方法。
【0069】
実施形態５７．標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、（ａ）標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することと、
（ｂ）ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上の固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
（ｃ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、溶液中でトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
（ｂ）ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上の固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
（ｃ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、溶液中でトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【0070】
実施形態５８．ＲＮＡが、ｍＲＮＡであり、捕捉オリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列を含む、実施形態５７に記載の方法。
【0071】
実施形態５９．断片のライブラリが、１つ以上のＲＮＡの３’末端から生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ断片を含む、実施形態５８に記載の方法。
【0072】
実施形態６０．捕捉オリゴヌクレオチドが、第１のリード配列決定アダプター配列、ビーズコード、及び／又は１つ以上の追加のアダプター配列を更に含む、実施形態５７～５９のいずれか１つに記載の方法。
【0073】
実施形態６１．溶液中のトランスポソーム複合体が、第２のリード配列アダプター配列及び／又は１つ以上の追加のアダプター配列を含む第１のトランスポソームを含む、実施形態５７～６０のいずれか１つに記載の方法。
【0074】
実施形態６２．ＤＮＡ：ＲＮＡ断片のライブラリが、配列決定前に断片を増幅することなく配列決定される、実施形態５７～６１のいずれか１つに記載の方法。
【0075】
実施形態６３．固体支持体であって、その上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含む、固体支持体。
【0076】
実施形態６４．固体支持体が、ビーズである、実施形態６３に記載の固体支持体。
【0077】
実施形態６５．第１のポリヌクレオチドが、ビーズコードを更に含む、実施形態６４に記載の固体支持体。
【0078】
実施形態６６．ビーズが、ビーズのプールに含まれ、各ビーズが、プール中の他のビーズに含まれるビーズコードと比較して、異なるビーズコードを含む固定化された第１のポリヌクレオチドを含む、実施形態６５に記載の固体支持体。
【0079】
実施形態６７．トランスポソーム複合体を形成するために、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを更に含む、実施形態６３～６６のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0080】
実施形態６８．トランスポソーム複合体が、可逆的に不活性化される、実施形態６７に記載の固体支持体。
【0081】
実施形態６９．トランスポソーム複合体が、トランスポソーム複合体に結合したトランスポソーム不活性化剤によって可逆的に不活性化される、実施形態６８に記載の固体支持体。
【0082】
実施形態７０．トランスポソーム不活性化剤が、トランスポソーム複合体のＴｎ５結合部位に結合される、実施形態６９に記載の固体支持体。
【0083】
実施形態７１．トランスポソーム不活性化剤が、脱リン酸化ＭＥ’、余分な塩基、阻害剤二重鎖、及び／又は易熱性抗体を含む、実施形態６９又は７０に記載の固体支持体。
【0084】
実施形態７２．捕捉オリゴヌクレオチド及び固定化オリゴヌクレオチドを含む固体支持体であって、固定化オリゴヌクレオチドが、トランスポソーム複合体に含まれる第２のトランスポゾンに含まれるハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするための配列を含む、固体支持体。
【0085】
実施形態７３．固体支持体が、ビーズである、実施形態７２に記載の固体支持体。
【0086】
実施形態７４．固定化オリゴヌクレオチドが、ビーズコード及び／又は１つ以上のアダプター配列を更に含む、実施形態７３に記載の固体支持体。
【0087】
実施形態７５．ビーズが、ビーズのプールに含まれ、各ビーズが、プール中の他のビーズに含まれる固定化オリゴヌクレオチドに含まれるビーズコードと比較して、異なるビーズコードを含む固定化オリゴヌクレオチドを含む、実施形態７４に記載の固体支持体。
【0088】
実施形態７６．捕捉オリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列を含む、実施形態６３～７５のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0089】
実施形態７７．捕捉オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの少なくとも部分に対して相補的である配列を含む、実施形態６３～７６のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0090】
実施形態７８．トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態６３～７７のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0091】
実施形態７９．トランスポソーム複合体が、トランスポゾン末端配列に対して相補的である領域を含む第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態６３～７８のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0092】
実施形態８０．トランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態７９に記載の方法。
【0093】
実施形態８１．トランスポソーム複合体が、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する、実施形態６３～８０のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0094】
実施形態８２．トランスポザーゼが、Ｔｎ５トランスポザーゼである、実施形態６３～８１のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0095】
実施形態８３．Ｔｎ５トランスポザーゼが、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである、実施形態８２に記載の方法。
【0096】
実施形態８４．第１のタグの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が、同じタグドメインを含む、実施形態６３～８３のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0097】
実施形態８５．タグが、クラスタ増幅のための領域を含む、実施形態６３～８４のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0098】
実施形態８６．タグが、配列決定反応をプライミングするための領域を含む、実施形態６３～８５のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0099】
実施形態８７．固体支持体が、微小粒子、ビーズ、平面支持体、パターン化された表面、又はウェルを含む、実施形態６３～８６のいずれか１つに記載の固体支持体。
【0100】
実施形態８８．平面支持体が、チューブの内面又は外面である、実施形態８７に記載の固体支持体。
【0101】
実施形態８９．実施形態６３～８８のいずれか１つに記載の固体支持体を含むキット。
【0102】
実施形態９０．トランスポザーゼを更に含む、実施形態８９に記載のキット。
【0103】
実施形態９１．逆転写酵素ポリメラーゼを更に含む、実施形態８９又は９０に記載のキット。
【0104】
実施形態９２．トランスポザーゼを含む第２のトランスポソーム複合体と、トランスポゾン末端配列を含む３’部分及び任意選択で第２のタグを含む第３のポリヌクレオチドと、を含む、ＤＮＡを固定化するための第２の固体支持体を更に含む、実施形態９０又は９１に記載のキット。
【0105】
実施形態９３．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、第１の捕捉オリゴヌクレオチドが上に固定化された第２の固体支持体と、に適用することであって、試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、タグメンテーションされ、任意選択でタグ付けされ、ＲＮＡが第２の固体支持体上の第１の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、（ｂ）第２の固体支持体に結合したＲＮＡを、第３の固体支持体に転移させることであって、第３の固体支持体が、その上に固定化された、転移されたＲＮＡに結合する第２の捕捉オリゴヌクレオチドと、第２のトランスポソーム複合体と、を有し、第２のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第２のポリヌクレオチドと、を含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、含む、転移させることと、（ｃ）ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上の固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、（ｄ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【0106】
実施形態９４．第１及び／又は第２の捕捉オリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列を含む、実施形態９３に記載の方法。
【0107】
実施形態９５．ＲＮＡが、第１及び／又は第２の捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む、実施形態９３又は９４に記載の方法。
【0108】
実施形態９６．第１及び／又は第２のトランスポソーム複合体が、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態９３～９５のいずれか１つに記載の方法。
【0109】
実施形態９７．あらゆる未結合のＤＮＡ又はＲＮＡを除去するために、工程（ａ）の後に固体支持体を洗浄することを更に含む、実施形態９３～９６のいずれか１つに記載の方法。
【0110】
実施形態９８．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドが上に固定化された第２の固体支持体であって、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む、第２の固体支持体と、に適用することであって、試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、ＲＮＡが第２の固体支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、（ｂ）トランスポザーゼを、トランスポザーゼが第２のポリヌクレオチドに結合して、第２の固体支持体上にトランスポソーム複合体を形成する条件下で、付加すること、ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、（ｃ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【0111】
実施形態９９．捕捉オリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列を含む、実施形態９８に記載の方法。
【0112】
実施形態１００．ＲＮＡが、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む、実施形態９８又は９９に記載の方法。
【0113】
実施形態１０１．第１及び／又は第２のトランスポソーム複合体が、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態９８～１００のいずれか１つに記載の方法。
【0114】
実施形態１０２．あらゆる未結合のＤＮＡ又はＲＮＡを除去するために、工程（ａ）の後に固体支持体を洗浄することを更に含む、実施形態９８～１０１のいずれか１つに記載の方法。
【0115】
実施形態１０３．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、可逆的に不活性化される捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のトランスポソーム複合体が上に固定化されたＲＮＡを固定化するための第２の固体支持体であって、第２のトランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む、第２の固体支持体と、に適用することであって、試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、ＲＮＡが第２の固体支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、（ｂ）ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、（ｃ）第２のトランスポソーム複合体を活性化することと、（ｄ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、活性化された第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【0116】
実施形態１０４．トランスポソーム複合体が、トランスポソーム複合体に結合したトランスポソーム不活性化剤によって可逆的に不活性化される、実施形態１０３に記載の方法。
【0117】
実施形態１０５．トランスポソーム不活性化剤が、トランスポソーム複合体のＴｎ５結合部位に結合される、実施形態１０４に記載の方法。
【0118】
実施形態１０６．トランスポソーム不活性化剤が、脱リン酸化ＭＥ’、余分な塩基、阻害剤二重鎖、及び／又は易熱性抗体を含む、実施形態１０４又は１０５に記載の方法。
【0119】
実施形態１０７．トランスポソーム複合体が、トランスポソーム不活性化剤の除去によって工程（ｃ）において活性化される、実施形態１０４～１０６のいずれか１つに記載の方法。
【0120】
実施形態１０８．捕捉オリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列を含む、実施形態１０３～１０６のいずれか１つに記載の方法。
【0121】
実施形態１０９．ＲＮＡが、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む、実施形態１０３～１０８のいずれか１つに記載の方法。
【0122】
実施形態１１０．第１及び／又は第２のトランスポソーム複合体が、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態１０３～１０９のいずれか１つに記載の方法。
【0123】
実施形態１１１．あらゆる未結合のＤＮＡ又はＲＮＡを除去するために、工程（ａ）の後に固体支持体を洗浄することを更に含む、実施形態１０３～１１０のいずれか１つに記載の方法。
【0124】
実施形態１１２．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体に適用することであって、第１の固体支持体が、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含み、試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択でタグ付けされる条件下で適用される、適用することと、（ｂ）結合したＤＮＡを有する第１の固体支持体をＲＮＡから分離することと、（ｃ）捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のトランスポソーム複合体が上に固定化されたＲＮＡを固定化するための第２の固体支持体にＲＮＡを適用することであって、第２のトランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含み、ＲＮＡが、第２の固体支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する、適用することと、（ｄ）ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、（ｅ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、活性化された第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【0125】
実施形態１１３．捕捉オリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列を含む、実施形態１１２に記載の方法。
【0126】
実施形態１１４．ＲＮＡが、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む、実施形態１１２又は１１３に記載の方法。
【0127】
実施形態１１５．第１及び／又は第２のトランスポソーム複合体が、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態１１２～１１４のいずれか１つに記載の方法。
【0128】
実施形態１１６．あらゆる未結合のＲＮＡを除去するために、工程（ｃ）の後に固体支持体を洗浄することを更に含む、実施形態１１２～１１５のいずれか１つに記載の方法。
【0129】
実施形態１１７．結合したＤＮＡを有する第１の固体支持体を、タグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを有する第２の固体支持体と再度組み合わせることを更に含む、実施形態１１２～１１６のいずれか１つに記載の方法。
【0130】
実施形態１１８．標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、（ａ）ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するための条件下で、標的ＲＮＡを含む試料に逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、（ｂ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を、トランスポソーム複合体が上に固定化された固体支持体に固定化することであって、トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が捕捉オリゴヌクレオチド又はトランスポザーゼに直接結合する条件下で、固体支持体に適用される、固定化することと、（ｂ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む、方法。
【0131】
実施形態１１９．トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態１１８に記載の方法。
【0132】
実施形態１２０．トランスポソーム複合体が、トランスポゾン末端配列に対して相補的である領域を含む第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態１１８又は１１９に記載の方法。
【0133】
実施形態１２１．トランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される、実施形態１２０に記載の方法。
【0134】
実施形態１２２．トランスポソーム複合体が、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する、実施形態１１８～１２１のいずれか１つに記載の方法。
【0135】
実施形態１２３．トランスポザーゼが、Ｔｎ５トランスポザーゼを含む、実施形態１１８～１２２のいずれか１つに記載の方法。
【0136】
実施形態１２４．Ｔｎ５トランスポザーゼが、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである、実施形態１２３に記載の方法。
【0137】
実施形態１２５．固定化ライブラリ中の二本鎖断片の長さが、固体支持体上のトランスポソーム複合体の密度を増加又は減少させることによって調整される、実施形態１１８～１２４のいずれか１つに記載の方法。
【0138】
実施形態１２６．第１のタグの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が、同じタグドメインを含む、実施形態１１８～１２５のいずれか１つに記載の方法。
【0139】
実施形態１２７．タグが、クラスタ増幅のための領域を含む、実施形態１１８～１２６のいずれか１つに記載の方法。
【0140】
実施形態１２８．タグが、配列決定反応をプライミングするための領域を含む、実施形態１１８～１２７のいずれか１つに記載の方法。
【0141】
実施形態１２９．固体支持体が、微小粒子、ビーズ、平面支持体、パターン化された表面、又はウェルを含む、実施形態１１８～１２８のいずれか１つに記載の方法。
【0142】
実施形態１３０．平面支持体が、チューブの内面又は外面である、実施形態１２９に記載の方法。
【0143】
実施形態１３１．タグメンテーションを行うことが、固体支持体上の２つの固定化トランスポソーム複合体に架橋された二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生する、実施形態１１８～１３０のいずれか１つに記載の方法。
【0144】
実施形態１３２．架橋された二重鎖の長さが、１００塩基対～１５００塩基対である、実施形態１３１に記載の方法。
【0145】
実施形態１３３．固体支持体に適用される試料が、血液である、実施形態１１８～１３２のいずれか１つに記載の方法。
【0146】
実施形態１３４．固体支持体に適用される試料が、細胞溶解物である、実施形態１１８～１３３のいずれか１つに記載の方法。
【0147】
実施形態１３５．細胞溶解物が、粗細胞溶解物である、実施形態１３４に記載の方法。
【0148】
実施形態１３６．固体支持体に適用される試料が、１．７以下である２６０／２８０吸光度比を有する、実施形態１１８～１３５のいずれか１つに記載の方法。
【0149】
実施形態１３７．試料を固体支持体に適用した後に、試料中の細胞を溶解することを更に含む、実施形態１１８～１３６のいずれか１つに記載の方法。
【0150】
実施形態１３８．（ｄ）ＤＮＡ：ＲＮＡ断片が液相トランスポソーム複合体によって更に断片化される条件下で、液相トランスポソーム複合体を、固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ断片と接触させて、それによって、溶液中に１つの末端を有する固定化核酸断片を得ることを更に含む、実施形態１１８～１３７のいずれか１つに記載の方法。
【0151】
実施形態１３９．液相トランスポソーム複合体が、第２のタグを含み、それによって、溶液中に第２のタグを有する固定化核酸断片を生成する、実施形態１３８に記載の方法。
【0152】
実施形態１４０．第１及び第２のタグが異なっている、実施形態１３９に記載の方法。
【0153】
実施形態１４１．液相トランスポソーム複合体の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が、第２のタグを含む、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の方法。
【0154】
実施形態１４２．ポリメラーゼと、第１のポリヌクレオチドの部分に対応する増幅プライマーとを反応させることによって、固体支持体上の断片を増幅することを更に含む、実施形態１３８～１４１のいずれか１つに記載の方法。
【0155】
実施形態１４３．一方の鎖の５’末端が、ＲＮＡ鎖の５’末端である、実施形態１～１４２のいずれか１つに記載の方法。
【0156】
実施形態１４４．一方の鎖の５’末端が、ＤＮＡ鎖の５’末端である、実施形態１～１４２のいずれか１つに記載の方法。
【0157】
実施形態１４５．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含み、方法が、（ａ）ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、（ｂ）ＤＮＡを固定化することと、（ｃ）第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、（ｄ）ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｅ）ｃＤＮＡを固定化するために、試料を第２の固体支持体と組み合わせることであって、第２の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＲＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、（ｆ）ｃＤＮＡを固定化し、第２の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することであって、任意選択で、トランスポソーム複合体が、タグメンテーションを行う前に可逆的に不活性化され、タグメンテーションを行うことが、トランスポソーム複合体を活性化することを含む、調製することと、を含む、方法。
【0158】
実施形態１４６．第２の固体支持体上でタグメンテーションを行った後に、第１及び第２の固体支持体を組み合わせることを更に含み、各固体支持体が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む固定化タグ付き断片を有する、実施形態１４５に記載の方法。
【0159】
実施形態１４７．第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後、及びＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製する前に、試料の残りからのＤＮＡ特異的バーコードを含む固定化タグ付き断片を有する第１の固体支持体を分割することを更に含む、実施形態１４５又は１４６に記載の方法。
【0160】
実施形態１４８．ＤＮＡを固定化した後、及び第１の固体支持体上でタグメンテーションを行う前に、固定化ＤＮＡを有する第１の固体支持体を試料の残りから分割して、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することを更に含む、実施形態１４５又は１４６に記載の方法。
【0161】
実施形態１４９．ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することが、鋳型スイッチングによって行われる、実施形態１４５～１４８のいずれか１つに記載の方法。
【0162】
実施形態１５０．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含み、方法が、（ａ）ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、（ｂ）ＤＮＡを固定化することと、（ｃ）第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、（ｄ）ＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生することと、（ｅ）ＤＮＡ：二重鎖を固定化するために、試料を第２の固体支持体と組み合わせることであって、第２の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対する活性を有するトランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＲＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、（ｆ）ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を固定化し、第２の固体支持体上でタグメンテーション行って、ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することであって、任意選択で、トランスポソーム複合体が、タグメンテーションを行う前に可逆的に不活性化され、タグメンテーションを行うことが、トランスポソーム複合体を活性化することを含む、調製することと、を含む、方法。
【0163】
実施形態１５１．第２の固体支持体上でタグメンテーションを行った後に、第１及び第２の固体支持体を組み合わせることを更に含み、各固体支持体が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む固定化タグ付き断片を有する、実施形態１５０に記載の方法。
【0164】
実施形態１５２．第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後、及びＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製する前に、試料の残りからのＤＮＡ特異的バーコードを含む固定化タグ付き断片を有する第１の固体支持体を分割して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生することを更に含む、実施形態１５０又は１５１に記載の方法。
【0165】
実施形態１５３．ＤＮＡを固定化した後、及び第１の固体支持体上でタグメンテーションを行う前に、固定化ＤＮＡを有する第１の固体支持体を試料の残りから分割して、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することを更に含む、実施形態１５０又は１５１に記載の方法。
【0166】
実施形態１５４．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含み、方法が、（ａ）ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、（ｂ）ＤＮＡを固定化することと、（ｃ）第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、（ｄ）ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｅ）溶液中で二本鎖ＤＮＡに対してタグメンテーションを行って、二本鎖ｃＤＮＡのタグ付き断片を調製することであって、溶液中のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列、ＲＮＡ特異的バーコード、及び捕捉プローブにハイブリダイズする配列を含むトランスポゾンと、を含み、任意選択で、トランスポソーム複合体が、タグメンテーションを行う前に可逆的に不活性化され、タグメンテーションを行うことが、トランスポソーム複合体を活性化することを含む、タグ付き断片が、ＲＮＡ特異的バーコードと、捕捉プローブにハイブリダイズする配列と、を含む、調製することと、（ｆ）試料を、捕捉プローブを含む表面を有する第２の固体支持体と組み合わせることと、（ｇ）第２の固体支持体上に二本鎖ｃＤＮＡのタグ付き断片を固定化することと、を含む、方法。
【0167】
実施形態１５５．第２の固体支持体上で二本鎖ｃＤＮＡのタグ付き断片を固定化した後に、第１及び第２の固体支持体を組み合わせることを更に含み、各固体支持体が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む固定化タグ付き断片を有する、実施形態１５４に記載の方法。
【0168】
実施形態１５６．第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後、及びＲＮＡからの二本鎖ｃＤＮＡの前に、試料の残りからのＤＮＡ特異的バーコードを含む固定化タグ付き断片を有する第１の固体支持体を分割することを更に含む、実施形態１５４又は１５５に記載の方法。
【0169】
実施形態１５７．ＤＮＡを固定化した後、及び第１の固体支持体上でタグメンテーションを行う前に、固定化ＤＮＡを有する第１の固体支持体を試料の残りから分割して、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することを更に含む、実施形態１５４又は１５５に記載の方法。
【0170】
実施形態１５８．ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含み、方法が、（ａ）ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、（ｂ）ＤＮＡを固定化することと、（ｃ）第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、（ｄ）ＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生することと、（ｅ）溶液中でＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行って、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグ付き断片を調製することであって、溶液中のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列、ＲＮＡ特異的バーコード、及び捕捉プローブにハイブリダイズする配列を含むトランスポゾンと、を含み、任意選択で、トランスポソーム複合体が、タグメンテーションを行う前に可逆的に不活性化され、タグメンテーションを行うことが、トランスポソーム複合体を活性化することを含み、タグ付き断片が、ＲＮＡ特異的バーコードと、捕捉プローブにハイブリダイズする配列と、を含む、調製することと、（ｆ）試料を、捕捉プローブを含む表面を有する第２の固体支持体と組み合わせることと、（ｇ）第２の固体支持体上にＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグ付き断片を固定化することと、を含む、方法。
【0171】
実施形態１５９．第２の固体支持体上にＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグ付き断片を固定化した後、第１及び第２の固体支持体を組み合わせることを更に含み、各固体支持体が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む固定化タグ付き断片を有する、実施形態１５８に記載の方法。
【0172】
実施形態１６０．第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後、及びＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製する前に、試料の残りからのＤＮＡ特異的バーコードを含む固定化タグ付き断片を有する第１の固体支持体を分割して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生することを更に含む、実施形態１５８又は１５９に記載の方法。
【0173】
実施形態１６１．ＤＮＡを固定化した後、及び第１の固体支持体上でタグメンテーションを行う前に、固定化ＤＮＡを有する第１の固体支持体を試料の残りから分割して、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することを更に含む、実施形態１５８又は１６０に記載の方法。
【0174】
実施形態１６２．捕捉プローブが、核酸を含む、実施形態１５４～１６１のいずれか１つに記載の方法。
【0175】
実施形態１６３．第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後に、合成二本鎖ＤＮＡを第１の固体支持体に付加することを更に含む、実施形態１４５～１６２のいずれか１つに記載の方法。
【0176】
実施形態１６４．合成二本鎖ＤＮＡが、ウラシルを含む、実施形態１６３に記載の方法。
【0177】
実施形態１６５．ＤＮＡ特異的バーコード及びＲＮＡ特異的バーコードが、異なるプライマー結合配列を含む、実施形態１４５～１６４のいずれか１つに記載の方法。
【0178】
実施形態１６６．ＤＮＡ特異的バーコードに含まれるプライマー結合配列と結合するプライマーを使用して、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を増幅することを更に含む、実施形態１６５に記載の方法。
【0179】
実施形態１６７．ＲＮＡ特異的バーコードに含まれるプライマー結合配列と結合するプライマーを使用して、ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を増幅することを更に含む、実施形態１６５に記載の方法。
【0180】
実施形態１６８．ＤＮＡ特異的バーコードに含まれるプライマー結合配列と結合するプライマーと、ＲＮＡ特異的バーコードに含まれるプライマー結合配列と結合するプライマーと、を含むプライマーミックスを使用して、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片及びＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を増幅することを更に含む、実施形態１６５に記載の方法。
【0181】
実施形態１６９．増幅が、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、実施形態１６６～１６８のいずれか１つに記載の方法。
【0182】
実施形態１７０．増幅が、ブリッジ増幅を含む、実施形態１６８又は１６９に記載の方法。
【0183】
実施形態１７１．タグ付き断片又は増幅されたタグ付き断片を配列決定することを更に含む、実施形態１４５～１７０のいずれか１つに記載の方法。
【0184】
実施形態１７２．方法が、単一の反応容器で行われる、実施形態１４５～１７１のいずれか１つに記載の方法。
【0185】
実施形態１７３．トランスポソーム複合体が、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する、実施形態１４５～１７２のいずれか１つに記載の方法。
【0186】
実施形態１７４．トランスポザーゼが、Ｔｎ５トランスポザーゼを含む、実施形態１４５～１７３のいずれか１つに記載の方法。
【0187】
実施形態１７５．Ｔｎ５トランスポザーゼが、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである、実施形態１７４に記載の方法。
【0188】
実施形態１７６．固定化断片の長さが、固体支持体上のトランスポソーム複合体の密度を増加又は減少させることによって調整される、実施形態１４５～１７５のいずれか１つに記載の方法。
【0189】
実施形態１７７．固体支持体が、微小粒子、ビーズ、平面支持体、パターン化表面、又はウェルを含む、実施形態１４５～１７６のいずれか１つに記載の方法。
【0190】
実施形態１７８．固体支持体が、ビーズである、実施形態１７７に記載の方法。
【0191】
実施形態１７９．実施形態１４５～１７８のいずれか１つに記載の方法に従って調製された、タグ付き断片のライブラリが上に固定化された固体支持体。
【0192】
実施形態１８０．固体支持体が、ビーズである、実施形態１７９に記載の固体支持体。
【0193】
実施形態１８１．ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡの鎖特異的ライブラリを調製する方法であって、（ａ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を阻害する条件下で、逆転写酵素、プライマー、及びｄＴＴＰを含むヌクレオチドを使用して、試料中に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を調製することと、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、及びｄＵＴＰを含むヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡの第１の鎖からｃＤＮＡの第２の鎖を調製して、二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｃ）二本鎖ｃＤＮＡを、トランスポソーム複合体が上に固定化された固体支持体に適用することであって、各トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及び第１のリード配列決定アダプター配列を含む３’部分を含む第１のトランスポゾンであって、トランスポソーム複合体を固体支持体に固定化するための５’親和性エレメントを含む、第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾン配列と、を含む、適用することと、（ｂ）トランスポソーム複合体を用いて二本鎖ＤＮＡに対してタグメンテーションを行い、第１のリード配列決定アダプター配列を含むタグ付き二本鎖ＤＮＡ断片を調製することであって、任意選択で、トランスポソーム複合体が、タグメンテーションを行う前に可逆的に不活性化され、タグメンテーションを行うことが、トランスポソーム複合体を活性化することを含む、調製することと、（ｃ）第２のトランスポゾンを除去し、ギャップ充填及び伸長を行うことと、（ｄ）二本鎖ＤＮＡ断片の鎖を分離することと、（ｅ）第２のリード配列決定アダプター配列を含むプライマーを、トランスポゾン末端配列又はトランスポゾン末端配列に対して完全若しくは部分的に相補的である配列にハイブリダイズし、増幅して、固体支持体に結合しておらず、かつ第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含むＤＮＡ鎖を調製することと、（ｆ）増幅によって生成される鎖を固体支持体から放出することであって、放出することが、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖ＤＮＡ断片を放出することと、を含む、方法。
【0194】
実施形態１８２．ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を阻害する条件が、アクチノマイシンＤを含む緩衝液の存在である、実施形態１８１に記載の方法。
【0195】
実施形態１８３．プライマーが、１つ以上のランダマープライマーである、実施形態１８１又は１８２に記載の方法。
【0196】
実施形態１８４．プライマーが、ランダマープライマーとポリＴプライマーとの混合物である、実施形態１８１～１８３のいずれか１つに記載の方法。
【0197】
実施形態１８５．ｃＤＮＡの第２の鎖を調製のためのプライマーが、ｃＤＮＡの第１の鎖の調製のためのプライマーと同じである、実施形態１８１～１８４のいずれか１つに記載の方法。
【0198】
実施形態１８６．ＲＮＡが、長い非コードＲＮＡ又はアンチセンス転写物である、実施形態１８１～１８５のいずれか１つに記載の方法。
【0199】
実施形態１８７．増幅が、ウラシル不耐性ポリメラーゼを用いて行われる、実施形態１８１～１８６のいずれか１つに記載の方法。
【0200】
実施形態１８８．増幅が、ウラシルを含むＤＮＡ鎖から増幅しない、実施形態１８７に記載の方法。
【0201】
実施形態１８９．固有分子識別子（ＵＭＩ）が、第２のリード配列決定アダプター配列を含むプライマーに含まれる、実施形態１８１～１８８のいずれか１つに記載の方法。
【0202】
実施形態１９０．ＵＭＩが、第２のリード配列決定アダプター配列と、トランスポゾン末端配列に結合することができる配列又はトランスポゾン末端配列に対して完全に若しくは部分的に相補的である配列との間に位置する、実施形態１８９に記載の方法。
【0203】
実施形態１９１．ＵＭＩが、第１のトランスポゾンに含まれる、実施形態１８１～１８８のいずれか１つに記載の方法。
【0204】
実施形態１９２．ＵＭＩが、トランスポゾン末端配列と、第１のリード配列決定アダプター配列との間に位置する、実施形態１９１に記載の方法。
【0205】
実施形態１９３．ＲＮＡが、異なるＲＮＡのプールを含み、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖断片が、異なる断片のプールを含み、各断片が、異なる断片のプールに含まれる他の断片とは異なるＵＭＩを含む、実施形態１８９～１９２のいずれか１つに記載の方法。
【0206】
実施形態１９４．親和性エレメントが、ビオチン又はデスチオビオチンであり、固体支持体が、その表面にストレプトアビジン又はアビジンを含む、実施形態１８１～１９３のいずれか１つに記載の方法。
【0207】
実施形態１９５．親和性エレメントが、二重ビオチンである、実施形態１９４に記載の方法。
【0208】
実施形態１９６．放出することが、熱又は水酸化ナトリウム処理で行われる、実施形態１８１～１９５のいずれか１つに記載の方法。
【0209】
実施形態１９７．第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖断片が、放出の後に固体支持体から分割される、実施形態１８１～１９６のいずれか１つに記載の方法。
【0210】
実施形態１９８．放出の後に、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖ＤＮＡ断片を用いてインデックスプライマー増幅を行って、インデックス付き断片を調製することを更に含む、実施形態１８１～１９７のいずれか１つに記載の方法。
【0211】
実施形態１９９．インデックスプライマー増幅が、固体支持体とは別個の反応容器内で行われる、実施形態１９８に記載の方法。
【0212】
実施形態２００．インデックスプライマー増幅が、ウラシル不耐性ポリメラーゼを用いて行われる、実施形態１９８又は１９９に記載の方法。
【0213】
実施形態２０１．第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖ＤＮＡ断片又はインデックス付き断片を配列決定することを更に含む、実施形態１８１～２００のいずれか１つに記載の方法。
【0214】
実施形態２０２．配列決定データが、ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡの第１の鎖から生成される、実施形態２０１に記載の方法。
【0215】
実施形態２０３．配列決定データが、ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡの第２の鎖から生成されない、実施形態２０１に記載の方法。
【0216】
実施形態２０４．方法が、ライゲーションを必要としない、実施形態１８１～２０３のいずれか１つに記載の方法。
【0217】
実施形態２０５．ＲＮＡ中の重複配列の境界を画する、実施形態１８１～２０６のいずれか１つに記載の方法。
【0218】
実施形態２０６．方法が、転写産物発現の推定を可能にする、実施形態１８１～２０７のいずれか１つに記載の方法。
【0219】
実施形態２０７．転写物発現の推定が、ＵＭＩの分析に基づく、実施形態２０８に記載の方法。
【0220】
実施形態２０８．ＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを調製する方法であって、（ａ）ＵＭＩ及び第１のリード配列決定アダプター配列を含むポリＴプライマーを使用して、試料中の完全長ＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を調製することと、（ｂ）ｃＤＮＡの第２の鎖を調製して、二本鎖ｃＤＮＡを生成することと、（ｃ）二本鎖ｃＤＮＡを、トランスポソーム複合体が上に固定化されたビーズに適用することであって、各トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、３’トランスポゾン末端配列を含む第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列及びハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含み、トランスポソーム複合体が、ビーズに固定化されたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション配列の結合によって固定化され、オリゴヌクレオチドが、５’親和性エレメント、第１のリード配列決定アダプター配列、ビーズコード、及びハイブリダイゼーション配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む、適用することと、（ｂ）二本鎖ｃＤＮＡを固定化し、ビーズ上でタグメンテーションを行って、二本鎖ＤＮＡ断片を調製することであって、任意選択で、トランスポソーム複合体が、タグメンテーションを行う前に可逆的に不活性化され、タグメンテーションを行うことが、トランスポソーム複合体を活性化することを含む、調製することと、（ｃ）第２のトランスポゾンを除去することと、（ｄ）第２のリード配列決定アダプター配列と、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列と、を含むプライマーを、トランスポゾン末端配列にハイブリダイズすることと、（ｅ）ギャップ充填及び伸長を行って、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、を含む、方法。
【0221】
実施形態２０９．ＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを調製する方法であって、（ａ）ＵＭＩ及び第１のリード配列決定アダプター配列を含むポリＴプライマーを使用して、試料中の完全長ＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を調製することと、（ｂ）ｃＤＮＡの第２の鎖を調製して、二本鎖ｃＤＮＡを生成することと、（ｃ）二本鎖ｃＤＮＡを、トランスポソーム複合体が上に固定化されたビーズに適用することであって、各トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、３’トランスポゾン末端配列、ビーズコード、及び第２のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンであって、トランスポソーム複合体を固体支持体に固定化するための５’親和性エレメントを更に含む、第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、適用することと、（ｂ）二本鎖ｃＤＮＡを固定化し、ビーズ上でタグメンテーションを行って、二本鎖ＤＮＡ断片を調製することであって、任意選択で、トランスポソーム複合体が、タグメンテーションを行う前に可逆的に不活性化され、タグメンテーションを行うことが、トランスポソーム複合体を活性化することを含む、調製することと、（ｃ）第２のトランスポゾンを除去することと、（ｄ）第２のリード配列決定アダプター配列と、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列と、を含むプライマーを、トランスポゾン末端配列にハイブリダイズすることと、（ｅ）ギャップ充填及び伸長を行って、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、を含む、方法。
【0222】
実施形態２１０．トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列が、トランスポゾン末端配列よりも短い、実施形態２０８又は２０９に記載の方法。
【0223】
実施形態２１１．トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列が、トランスポゾン末端配列よりも短い場合、より少ないアダプターダイマーが生成される、実施形態２１０に記載の方法。
【0224】
実施形態２１２．プライマーが、第２のリード配列アダプターを含む５’部分と、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む３’部分と、を含む、実施形態２０８～２１１のいずれか１つに記載の方法。
【0225】
実施形態２１３．トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を除去するときに、断片が、一方又は両方の末端でトランスポソームに結合したままである、実施形態２１０～２１２のいずれか１つに記載の方法。
【0226】
実施形態２１４．完全長ＲＮＡが、異なる完全長ＲＮＡのプールを含み、ポリＴプライマーが、異なるＵＭＩを含む異なるポリＴプライマーのプールを含む、実施形態２１０～２１３のいずれか１つに記載の方法。
【0227】
実施形態２１５．異なるポリＴプライマーのプールに含まれる各ポリＴプライマーが、異なるＵＭＩを含む、実施形態２１４に記載の方法。
【0228】
実施形態２１６．完全長ＲＮＡが、異なる完全長ＲＮＡのプールを含み、単一完全長ＲＮＡから調製された３’二本鎖ＤＮＡ断片が、プール中の他の完全長ＲＮＡから調製された３’二本鎖ＤＮＡ断片とは異なるＵＭＩを含む、実施形態２１０～２１５に記載の方法。
【0229】
実施形態２１７．完全長ＲＮＡが、異なる完全長ＲＮＡのプールを含み、ビーズが、ビーズのプールを含む、実施形態２１６に記載の方法。
【0230】
実施形態２１８．各ビーズが、プール中の他のビーズ上に固定化されたトランスポソーム複合体に含まれるビーズコードと比較して、異なるビーズコードを含むトランスポソーム複合体を固定化している、実施形態２１７に記載の方法。
【0231】
実施形態２１９．単一完全長ＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡから調製された全ての断片が、同じビーズ上でタグメンテーションされる、実施形態２１０～２１８のいずれか１つに記載の方法。
【0232】
実施形態２２０．二本鎖ｃＤＮＡから調製された第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む全ての二本鎖断片が、ギャップ充填及び伸長を行った後に同じ固体支持体上にある、実施形態２１０～２１９のいずれか１つに記載の方法。
【0233】
実施形態２２１．完全長ＲＮＡが、異なる完全長ＲＮＡのプールを含み、プール中の単一完全長ＲＮＡから調製された第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む全ての二本鎖断片が、ギャップ充填及び伸長を行った後に同じ固体支持体上にある、実施形態２１０～２２０のいずれか１つに記載の方法。
【0234】
実施形態２２２．第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む二本鎖断片を増幅して、増幅された断片を調製することを更に含む、実施形態２１０～２２１のいずれか１つに記載の方法。
【0235】
実施形態２２３．第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む増幅された断片又は二本鎖断片を配列決定することを更に含む、実施形態２１０～２２２のいずれか１つに記載の方法。
【0236】
実施形態２２４．配列決定が、完全長ＲＮＡアイソフォーム検出を可能にする、実施形態２２３に記載の方法。
【0237】
実施形態２２５．二本鎖ｃＤＮＡの調製が、ストランド法によるものである、実施形態２１０～２２４のいずれか１つに記載の方法。
【0238】
実施形態２２６．第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプター又は増幅された断片を含む二本鎖断片から得られた配列中のビーズコードの存在は、断片が生成されたビーズを同定する、実施形態２２３～２２５のいずれか１つに記載の方法。
【0239】
実施形態２２７．試料が、単一細胞を含む、実施形態２１０～２２６のいずれか１つに記載の方法。
【0240】
実施形態２２８．ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製すること、及びｃＤＮＡを固定化するために試料を第２の固体支持体と組み合わせることが、実施形態１４５のいずれか１つの方法を含む、実施形態２１０～２２７のいずれか１つの方法。
【0241】
追加の目的及び利点は、以下の説明において部分的に記載され、一部は説明から明白であるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
【0242】
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的のみであり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【0243】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、１つの（いくつかの）実施形態を図解し、明細書とともに本明細書に記載される原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【0244】
【図1A】固定化トランスポソームによるＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の断片化（Ａ）対捕捉及びタグメンテーションによる溶液中のトランスポソームによるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片化（Ｃａｐ－Ｔａｇ、Ｂ及びＣ）の現在の方法を比較する。図１Ａ及び図１Ｂの両方において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するポリＴ捕捉オリゴヌクレオチドによって固定化される。図１Ｂ及び図１Ｃにおいて、逆転写酵素が、ＲＮＡ鎖に生じるニックを介して第２の鎖合成を開始すること、及びこれらのｄｓＤＮＡ二重鎖がトランスポソームの基質であることが提案される。しかしながら、溶液からのトランスポソームを使用する結果として、リードは、転写物の３’末端からのみ生成される。対照的に、固定化トランスポソームを用いる本方法（図１Ａ）は、標的ＲＮＡの完全長に対応するライブラリ生成を可能にする。
【図1B】固定化トランスポソームによるＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の断片化（Ａ）対捕捉及びタグメンテーションによる溶液中のトランスポソームによるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片化（Ｃａｐ－Ｔａｇ、Ｂ及びＣ）の現在の方法を比較する。図１Ａ及び図１Ｂの両方において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するポリＴ捕捉オリゴヌクレオチドによって固定化される。図１Ｂ及び図１Ｃにおいて、逆転写酵素が、ＲＮＡ鎖に生じるニックを介して第２の鎖合成を開始すること、及びこれらのｄｓＤＮＡ二重鎖がトランスポソームの基質であることが提案される。しかしながら、溶液からのトランスポソームを使用する結果として、リードは、転写物の３’末端からのみ生成される。対照的に、固定化トランスポソームを用いる本方法（図１Ａ）は、標的ＲＮＡの完全長に対応するライブラリ生成を可能にする。
【図1C】固定化トランスポソームによるＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の断片化（Ａ）対捕捉及びタグメンテーションによる溶液中のトランスポソームによるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片化（Ｃａｐ－Ｔａｇ、Ｂ及びＣ）の現在の方法を比較する。図１Ａ及び図１Ｂの両方において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するポリＴ捕捉オリゴヌクレオチドによって固定化される。図１Ｂ及び図１Ｃにおいて、逆転写酵素が、ＲＮＡ鎖に生じるニックを介して第２の鎖合成を開始すること、及びこれらのｄｓＤＮＡ二重鎖がトランスポソームの基質であることが提案される。しかしながら、溶液からのトランスポソームを使用する結果として、リードは、転写物の３’末端からのみ生成される。対照的に、固定化トランスポソームを用いる本方法（図１Ａ）は、標的ＲＮＡの完全長に対応するライブラリ生成を可能にする。
【図2】どのように溶液中のＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が、表面上に固定化されたトランスポソームによってタグメンテーションされ得るかを示す。標的ＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成のために使用され、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成し、続いて、固定化トランスポソーム複合体を介してＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖をタグメンテーションする。タグメンテーションは、固体支持体上の２つの固定化トランスポソーム複合体に架橋した二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生する。次いで、トランスポソーム複合体（本明細書に示されるＴｎ５など）のトランスポザーゼの活性は、停止されるか、又はトランスポザーゼは除去される。鎖交換が行われ、続いて、ギャップ充填ライゲーションが行われる。断片のライブラリは、チューブ又はフローセルのいずれかにおいて放出され得る。
【図3A】ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するために、ユニバーサルヒト参照ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を使用して生成されたＲＮＡ配列決定ライブラリからの代表的な配列決定の結果を示す。これらのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴなどの固定化トランスポソーム複合体（図２に示される）によってタグメンテーションされた。ＢＬＴ上の固定化トランスポソーム複合体によるタグメンテーションの後、ギャップ充填ライゲーションが行われた。ライブラリは、チューブに放出され、フローセルに直接播種された。ライブラリは配列決定可能であった（Ａ）。結果の分布は、コード、非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）、イントロン、及び遺伝子間配列（Ｂ）の配列決定を示し、したがって、ＲＮＡの異なる領域は、本方法を使用して配列決定されることができたことを示す。転写物の長さに沿った正規化されたカバレッジも示され（Ｃ）、これは、配列決定の結果における３’バイアスの相対的欠如を支持する。
【図3B】ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するために、ユニバーサルヒト参照ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を使用して生成されたＲＮＡ配列決定ライブラリからの代表的な配列決定の結果を示す。これらのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴなどの固定化トランスポソーム複合体（図２に示される）によってタグメンテーションされた。ＢＬＴ上の固定化トランスポソーム複合体によるタグメンテーションの後、ギャップ充填ライゲーションが行われた。ライブラリは、チューブに放出され、フローセルに直接播種された。ライブラリは配列決定可能であった（Ａ）。結果の分布は、コード、非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）、イントロン、及び遺伝子間配列（Ｂ）の配列決定を示し、したがって、ＲＮＡの異なる領域は、本方法を使用して配列決定されることができたことを示す。転写物の長さに沿った正規化されたカバレッジも示され（Ｃ）、これは、配列決定の結果における３’バイアスの相対的欠如を支持する。
【図3C】ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するために、ユニバーサルヒト参照ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を使用して生成されたＲＮＡ配列決定ライブラリからの代表的な配列決定の結果を示す。これらのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴなどの固定化トランスポソーム複合体（図２に示される）によってタグメンテーションされた。ＢＬＴ上の固定化トランスポソーム複合体によるタグメンテーションの後、ギャップ充填ライゲーションが行われた。ライブラリは、チューブに放出され、フローセルに直接播種された。ライブラリは配列決定可能であった（Ａ）。結果の分布は、コード、非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）、イントロン、及び遺伝子間配列（Ｂ）の配列決定を示し、したがって、ＲＮＡの異なる領域は、本方法を使用して配列決定されることができたことを示す。転写物の長さに沿った正規化されたカバレッジも示され（Ｃ）、これは、配列決定の結果における３’バイアスの相対的欠如を支持する。
【図4】液滴中の細胞及び捕捉ビーズの同時カプセル封入、それに続く細胞溶解、ｃＤＮＡ合成、及びライブラリ調製を示す。断片の固定化ライブラリを有するビーズは、ライブラリ断片が放出される前に、配列決定のために固体表面（例えば、フローセル）に送達され得る。代替的に、固定化された標的核酸を有するビーズは、配列決定のために固体表面に送達され得、続いて、ビーズ上で断片を調製し、配列決定のために固体表面上に断片を放出する。フローセル上への断片の放出は、同じ細胞に由来する可能性が高い断片を同定するためのオンフローセル空間リードを可能にすることができる。
【図5】捕捉オリゴヌクレオチドを含むビーズを示す。この代表的な例において、捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリＴ配列、バーコード（ビーズコードとして使用され得る）、及びＰ５アダプター配列を含む。ポリＴ配列は、ｍＲＮＡを捕捉するために使用することができ、Ｐ５及びバーコードは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の調製中に組み込むことができる。他のアダプター（ここではＢ’－Ｐ７’として示す）を、タグメンテーション中又はその後に組み込むことができる。タグメンテーション後、鎖交換及びライゲーションを行って、配列決定のためのライブラリ断片を調製することができる。
【図6】捕捉オリゴヌクレオチドを有するビーズ（ここでは、ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列）と、トランスポソーム複合体に含まれる第２のトランスポゾンに含まれるハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするための配列（「短Ａ」）を含む固定化オリゴヌクレオチドとを有するビーズを示す。このようにして、固定化オリゴヌクレオチドは、トランスポソーム複合体を組み立てるために使用することができる。固定化オリゴヌクレオチドは、Ｐ５アダプター配列及びビーズコードを更に含み得る。
【図7】液滴中のｍＲＮＡ捕捉、バルクでのｃＤＮＡ合成、トランスポソームの固定化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション（hybridization、Ｈｙｂ）、及びタグメンテーションの工程を含む、トランスポソームを組み立てるための固定化オリゴヌクレオチドを有する活性化可能ＢＬＴを使用して完全長ＲＮＡからライブラリを産生するためのワークフローを示す。ＢＬＴは、タグメンテーションの前又は後にフローセル上で捕捉され得る。
【図8】液滴中で使用するか、又はフローセルのマイクロウェル中で捕捉する、ライブラリの単一細胞分解能のための方法を示す。
【図9】ｃＤＮＡ合成、続いてＢＬＴ上でのタグメンテーション及びライブラリ調製、並びに次いで、フローセル又はチューブ中での断片の放出の方法を示す。この方法は、ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するポリＴプライマーを使用して、完全長ｍＲＮＡライブラリを調製する。
【図10】ｃＤＮＡ合成、続いてＢＬＴ上でのタグメンテーション及びライブラリ調製、次いで、フローセル又はチューブ中での断片の放出の方法を示す。この方法は、全てのＲＮＡに結合するランダムプライマーを使用して、全ＲＮＡライブラリを調製する。
【図11A】ＲＮＡからライブラリを調製するための本方法に使用され得る様々な異なるビーズを示す。（Ａ）捕捉オリゴヌクレオチド（ここでは、ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列）と、トランスポソーム複合体を組み立てるために使用され得る、トランスポソーム複合体に含まれる第２のトランスポゾンに含まれるハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするための配列（例えば、「短Ａ」）を含む固定化オリゴヌクレオチドとを有する、完全長ｍＲＮＡライブラリ調製のためのビーズ。（Ｂ）短Ａ配列へのトランスポソームのハイブリダイゼーション。（Ｃ）ビーズ上での完全長ｍＲＮＡの複数の断片の調製。
【図11B】ＲＮＡからライブラリを調製するための本方法に使用され得る様々な異なるビーズを示す。（Ａ）捕捉オリゴヌクレオチド（ここでは、ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列）と、トランスポソーム複合体を組み立てるために使用され得る、トランスポソーム複合体に含まれる第２のトランスポゾンに含まれるハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするための配列（例えば、「短Ａ」）を含む固定化オリゴヌクレオチドとを有する、完全長ｍＲＮＡライブラリ調製のためのビーズ。（Ｂ）短Ａ配列へのトランスポソームのハイブリダイゼーション。（Ｃ）ビーズ上での完全長ｍＲＮＡの複数の断片の調製。
【図11C】ＲＮＡからライブラリを調製するための本方法に使用され得る様々な異なるビーズを示す。（Ａ）捕捉オリゴヌクレオチド（ここでは、ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列）と、トランスポソーム複合体を組み立てるために使用され得る、トランスポソーム複合体に含まれる第２のトランスポゾンに含まれるハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするための配列（例えば、「短Ａ」）を含む固定化オリゴヌクレオチドとを有する、完全長ｍＲＮＡライブラリ調製のためのビーズ。（Ｂ）短Ａ配列へのトランスポソームのハイブリダイゼーション。（Ｃ）ビーズ上での完全長ｍＲＮＡの複数の断片の調製。
【図12】完全長ｍＲＮＡライブラリ調製のための代表的なビーズを示す。ビーズは、複数の捕捉オリゴヌクレオチド（ここでは、ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列）と、第２のトランスポゾンに含まれるハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするための配列を含む複数の固定化オリゴヌクレオチドとを有する。ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の調製の前及び後、固定化オリゴヌクレオチドは、トランスポソーム複合体をビーズ上にハイブリダイズ及び固定化するために使用することができた。
【図13】ＢＬＴ上の複数のトランスポソームがどのようにしてｍＲＮＡから生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の完全長から断片を調製するかの代表的な例を示す。
【図14】ｃＤＮＡの合成中に３’ＵＭＩを組み込んだ後のＢＬＴに対する対称タグメンテーション事象を示す。
【図15】３’ＵＭＩを有する二本鎖ｃＤＮＡの調製後のタグメンテーションを示す。この例では、各ビーズは、ビーズコードを有する固定化された第１のトランスポゾンを含み、ｍＲＮＡ転写物全体にわたるＵＭＩ計数アッセイを可能にする。
【図16】３’ＵＭＩを有する二本鎖ｃＤＮＡの調製後のビーズを用いたタグメンテーションを示し、方法は、第１の鎖ｃＤＮＡ合成、鋳型スイッチング、及びタグメンテーション前のＰＣＲ増幅を含む。
【図17】鎖特異的ｃＤＮＡ合成を伴うプライマー伸長鎖特異的ＢＬＴ（primer extension strand-specific BLT、ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ）ワークフローを示す。
【図18】ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴワークフローの概要を示し、第１のトランスポゾンは、二重ビオチンを使用してビーズに固定化される。
【図19】二重ビオチン及び短縮されたＭＥ’配列がワークフローの収量をどのように改善し得るかを要約する。例えば、短縮されたＭＥ’配列は、図１４に示されるような方法、又は非転移ＭＥ’鎖が異なるオリゴヌクレオチドと交換される他の方法において有用であり得る。
【図20】ＲＮＡ配列決定ライブラリを調製するための例示的なワークフローの図を示す。ポリＴ捕捉オリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ ＢＬＴを使用して、全ＲＮＡ試料からｍＲＮＡを捕捉し、試料は洗浄され、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを生成してＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を形成し、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡ ＢＬＴ上に固定化されたトランスポソーム複合体を介して断片化される。図２０～図２８に示される実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡもまた調製され得（ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の代わりに）、ＲＮＡ ＢＬＴ上に固定化されたトランスポソーム複合体を介して断片化される。
【図21】混合試料（すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む）中のＤＮＡ及びＲＮＡが、ＲＮＡ ＢＬＴ及びＤＮＡ ＢＬＴにどのように結合し得るかの概要を示す。ＲＮＡは、トランスポソーム複合体に対する親和性を有さないため、ＲＮＡは、ポリＴ捕捉オリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ ＢＬＴにのみ結合する。しかしながら、ＤＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡ ＢＬＴの両方における固定化トランスポソーム複合体に含まれるトランスポゾン末端配列に対するＤＮＡの親和性に基づいて、ＤＮＡ ＢＬＴ又はＲＮＡ ＢＬＴのいずれかに結合することができた。したがって、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料とともに使用するための方法は、ＤＮＡをＤＮＡ ＢＬＴに選択的に分離しなければならない。ＤＮＡ及びＲＮＡを含む混合物試料とともに使用するための方法は、ｉＤＮＡがＤＮＡ ＢＬＴを同定するインデックスであり、ｉＲＮＡがＲＮＡ ＢＬＴを同定するためのインデックスであるように、タグメンテーション反応中に異なるタグを使用することができる。このようにして、ＤＮＡに由来する断片は、ＲＮＡに由来する断片から区別され得る。
【図22】試料を適用する前に可逆的に不活性化されたＲＮＡ ＢＬＴによって、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定試料を調製する方法を概説する。このようにして、試料中のＤＮＡは、ＤＮＡ ＢＬＴに結合し、ＲＮＡのみが（ポリＴ捕捉オリゴヌクレオチドを介して）ＲＮＡ ＢＬＴに結合する。ＤＮＡ ＢＬＴに結合したＤＮＡは、タグメンテーションされ、ビーズは洗浄される。次いで、ＲＮＡ ＢＬＴのトランスポソーム複合体は、活性化される（すなわち、不活性化が逆転される）。逆転写を行って、ＲＮＡ ＢＬＴに固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成し、続いて、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片化を行う。
【図23】「裸の」ＲＮＡ ＢＬＴを使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定試料を調製する方法を概説する。これらの「裸の」ＲＮＡ－ＢＬＴは、トランスポザーゼを含まない。最初に、ＤＮＡは、ＤＮＡ－ＢＬＴを用いてタグメンテーションされ、ＲＮＡは、ポリＴ捕捉オリゴヌクレオチド上で捕捉され、ｃＤＮＡ合成を行うことができ、試料は洗浄され、次いで、トランスポザーゼを付加して、以前に「裸」であったＲＮＡ－ＢＬＴ上で機能的トランスポソームを組み立てる。逆転写酵素ポリメラーゼは付加され、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションは、ＲＮＡ ＢＬＴを用いて行われる。トランスポソームは、ＲＮＡ－ＢＬＴに固定化されたオリゴヌクレオチドへのトランスポソーム複合体のハイブリダイゼーションによって、ｃＤＮＡ合成後にビーズ上で組み立てることができる。
【図24】３ビーズアプローチを使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定試料を調製する方法を概説する。３ビーズアプローチにおいて、方法は、ＤＮＡ－ＢＬＴ及びポリＴビーズ（トランスポソームを欠く）で開始する。ＤＮＡは、ＤＮＡ ＢＬＴによってタグメンテーションされ、ＲＮＡは、ポリＴビーズによって捕捉される。ビーズは洗浄される。次いで、ＲＮＡ－ＢＬＴは、捕捉されたＲＮＡをポリＴビーズからＲＮＡ－ＢＬＴ上に置換する試薬と一緒に付加される。逆転写酵素ポリメラーゼは付加され、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションは、ＲＮＡ ＢＬＴを用いて行われる。
【図25】ＤＮＡ捕捉を使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定試料を調製し、続いて、ＤＮＡ結合ＤＮＡ ＢＬＴをＲＮＡ ＢＬＴから物理的に分離する方法を概説する。過剰なＤＮＡ ＢＬＴを使用して、試料中の全ての二本鎖（double-stranded、ｄｓ）ＤＮＡを結合させ、ＤＮＡに対してタグメンテーションを行うことができる。次いで、ＲＮＡは、タグメンテーションされたＤＮＡ ＢＬＴから分割され、ＲＮＡ ＢＬＴに結合され得る。逆転写酵素ポリメラーゼを介してＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成した後、ＲＮＡのタグメンテーションが行われる。次いで、ＲＮＡ ＢＬＴ及びＤＮＡ ＢＬＴは、組み合わされ得る。
【図26】ＤＮＡ特異的タグメンテーション及びｃＤＮＡ特異的タグメンテーション並びに分割を使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡ（ｃＤＮＡに変換された）から調製されたタグ付き断片のライブラリを調製する方法を記載する。全核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む、ＴＮＡ）を有する試料をＤＮＡ ＢＬＴと組み合わせ、ＤＮＡ特異タグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを断片に組み込んだ後、ＤＮＡ ＢＬＴは分割され得るが、一方でＤＮＡ断片はＢＬＴと会合される。次いで、二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ－ｃＤＮＡ）は、ＲＮＡから生成され、ＲＮＡ（ｃＤＮＡ）特異的タグメンテーションを介してタグメンテーションされ、ＲＮＡ特異的バーコードを断片に組み込むことができる。このようにして、下流の配列決定及びバイオインフォマティクスは、バーコードを使用してＲＮＡに由来する試料をＤＮＡに由来する試料から区別するために使用され得るように、断片はタグ付けされる。
【図27】ＤＮＡ特異的タグメンテーション及びＲＮＡ（ｃＤＮＡ）特異的タグメンテーションを使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡ（ｃＤＮＡに変換された）から調製されたタグ付き断片のライブラリを調製する方法を記載する。この方法は、単一の反応容器中で行われ得る（すなわち、ワンポット反応）。ＤＮＡ特異的タグメンテーションを行って、ＤＮＡ ＢＬＴを使用してＤＮＡ特異的バーコードを組み込んだ後、「自殺」合成ＤＮＡは、これらのＤＮＡ ＢＬＴに付加され得る。このような合成ＤＮＡは、ウラシルを含む二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）であり得、これは、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼが増幅のために使用される場合、増幅され得ない。このようにして、全てのＤＮＡ ＢＬＴは、試料由来のｄｓＤＮＡ又は合成ｄｓＤＮＡのいずれかで飽和され、ＤＮＡ ＢＬＴ（ＤＮＡ特異的バーコードを有するトランスポソーム複合体を含む）は、更なるタグメンテーションに利用可能とはならない。次いで、ｄｓ－ｃＤＮＡは、試料中のＲＮＡから調製することができ、ｃＤＮＡ特異的タグメンテーションは、ＲＮＡ特異的バーコードを有するトランスポソーム複合体を含むＲＮＡ ＢＬＴを使用してＲＮＡバーコードを組み込むために使用され得る。クリーンアップ及び増幅の後、タグ付き断片は、配列決定され得、バーコードは、ＤＮＡに由来する試料対ＲＮＡに由来する試料を決定するために使用される。
【図28】ＤＮＡ特異的タグメンテーション及びＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖特異的タグメンテーションを使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に変換された）から調製されたタグ付き断片のライブラリの調製のための方法を記載する。ＤＮＡ特異的タグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを有するトランスポソーム複合体を含むＤＮＡ ＢＬＴを使用してＤＮＡバーコードを組み込んだ後、「自殺」合成ＤＮＡは、これらのＤＮＡ ＢＬＴに付加され得る。次いで、試料中のＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成することができ、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションを使用して、ＲＮＡ特異的バーコードを有するトランスポソーム複合体を含むＲＮＡ ＢＬＴを使用してＲＮＡバーコードを組み込むことができる。例示的なＲＮＡ ＢＬＴとしては、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖をタグメンテーションすることにおいて改善された有効性を有するｘＧＥＮ ＵＳＡからのｔｅｄＲＮＡビーズが挙げられる。クリーンアップ及び増幅後、タグ付き断片は、配列決定され得、バーコードは、ＤＮＡに由来する試料対ＲＮＡに由来する試料を決定するために使用される。
【発明を実施するための形態】
【0245】
Ｉ．捕捉オリゴヌクレオチドを含むビーズ連結トランスポソームを使用してＲＮＡ配列決定ライブラリを調製する方法
ＲＮＡ試料を配列決定するための多くのプロトコルは、配列決定の前に試料中のＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡフォーマットに変換する試料調製を用いる。ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を使用し、ｍＲＮＡをタグメンテーションするときに３’バイアスを回避するＲＮＡ試料を配列決定するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、得られたライブラリ産物中の標的ＲＮＡの５’から３’への均一なカバレッジを可能にする（図１Ａに示される）。
ＲＮＡ試料を配列決定するための多くのプロトコルは、配列決定の前に試料中のＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡフォーマットに変換する試料調製を用いる。ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を使用し、ｍＲＮＡをタグメンテーションするときに３’バイアスを回避するＲＮＡ試料を配列決定するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、得られたライブラリ産物中の標的ＲＮＡの５’から３’への均一なカバレッジを可能にする（図１Ａに示される）。
【0246】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ：ＲＮＡ」二重鎖とは、ＲＮＡ及びＤＮＡの二重鎖を指す。ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、それと会合したいくらかの量のＤＮＡを有するＲＮＡを包含する。ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のＤＮＡは、断片化を可能にし、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＤＮＡは、トランスポザーゼがＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化するのに十分である。
【0247】
全ての実施形態について、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖はまた、断片化（すなわち、タグメンテーションを行うこと）の前に二本鎖ＤＮＡに変換され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの第２の鎖の全て又は一部は、断片化の前に生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、溶液中で又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖がＢＬＴに結合された後に、二本鎖ＤＮＡに変換され得る。二本鎖ＤＮＡに変換されるとは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡの一部又は全てがＤＮＡに変換されることを意味する。このような実施形態では、断片化は、二本鎖ＤＮＡの領域で生じ得る。
【0248】
いくつかの実施形態では、１つ以上の種のＲＮＡを含む試料は、表面に付加され、そこで、ｍＲＮＡ転写物は、ビーズの表面上のそれらの３’ポリＡテールによって捕捉されるなど、捕捉オリゴヌクレオチドを介して捕捉される。次いで、逆転写酵素（ＲＴ）ポリメラーゼは、第１の鎖ｃＤＮＡを生成するために付加される。したがって、この方法において、ｃＤＮＡ合成は、ＲＮＡが捕捉オリゴヌクレオチドに結合された後に行われ得る。ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、表面結合トランスポソームによってタグメンテーションされ、したがって、ｍＲＮＡ転写物の完全長からライブラリ鋳型を生成する。
【0249】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、
標的ＲＮＡを含む試料を、トランスポソーム複合体及び捕捉オリゴヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、
トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
第１のタグと、を含み、
試料は、標的ＲＮＡの３’末端が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、固体支持体に適用される、適用することと、
ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対して断片化を行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
標的ＲＮＡを含む試料を、トランスポソーム複合体及び捕捉オリゴヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、
トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
第１のタグと、を含み、
試料は、標的ＲＮＡの３’末端が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、固体支持体に適用される、適用することと、
ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対して断片化を行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
【0250】
いくつかの実施形態では、活性化可能なＢＬＴが使用され得、トランスポザーゼは、方法の間に第１のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、逆転写酵素を付加する前又は後に第１のポリヌクレオチドに結合される。言い換えれば、トランスポザーゼは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が生成された後、又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が生成される前に付加され得る。
【0251】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、
標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、標的ＲＮＡの３’末端が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、固体支持体に適用される、適用することと、
トランスポザーゼを、トランスポザーゼが第１のポリヌクレオチドに結合してトランスポソーム複合体を形成する条件下で付加することと、
ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対して断片化を行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。
標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、標的ＲＮＡの３’末端が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、固体支持体に適用される、適用することと、
トランスポザーゼを、トランスポザーゼが第１のポリヌクレオチドに結合してトランスポソーム複合体を形成する条件下で付加することと、
ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対して断片化を行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。
【0252】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡからタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、
標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、標的ＲＮＡの３’末端が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、固体支持体に適用される、適用することと、
ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
トランスポザーゼを、トランスポザーゼが第１のポリヌクレオチドに結合してトランスポソーム複合体を形成する条件下で付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対して断片化を行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。
標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することであって、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、標的ＲＮＡの３’末端が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、固体支持体に適用される、適用することと、
ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
トランスポザーゼを、トランスポザーゼが第１のポリヌクレオチドに結合してトランスポソーム複合体を形成する条件下で付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対して断片化を行い、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。
【0253】
いくつかの実施形態では、方法は、試料を固体支持体に適用した後に、固体支持体を洗浄してあらゆる未結合の標的ＲＮＡを除去することを更に含む。
【0254】
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が固体支持体に付加された場合、トランスポソーム複合体は、二重鎖をタグメンテーションし、したがって、両方の末端で表面に結合した断片を生成する。いくつかの実施形態では、架橋断片の長さは、表面上のトランスポソーム複合体の密度を変えることによって変化させることができる。ある特定の実施形態では、得られた架橋断片の長さは、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ、３０００ｂｐ、３１００ｂｐ、３２００ｂｐ、３３００ｂｐ、３４００ｂｐ、３５００ｂｐ、３６００ｂｐ、３７００ｂｐ、３８００ｂｐ、３９００ｂｐ、４０００ｂｐ、４１００ｂｐ、４２００ｂｐ、４３００ｂｐ、４４００ｂｐ、４５００ｂｐ、４６００ｂｐ、４７００ｂｐ、４８００ｂｐ、４９００ｂｐ、５０００ｂｐ、１００００ｂｐ、３００００ｂｐ、又は１００，０００ｂｐ以下である。そのような実施形態では、次に、架橋断片は、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、標準的なクラスタ化学を使用して、クラスタ内に増幅され得、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0255】
いくつかの実施形態では、断片化は、固体支持体上の２つの固定化トランスポソーム複合体に架橋した二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生する。いくつかの実施形態では、架橋二重鎖の長さは、１００塩基対～１５００塩基対である。
【0256】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの３’末端から生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、一方の末端で捕捉オリゴヌクレオチドに結合され、他方の末端で固定化トランスポソーム複合体に結合される。いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、１つ以上のトランスポゾン末端に含まれる配列と類似又は同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、第１のタグを含み得る。
【0257】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片は、
標的ＲＮＡのコード、非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、及び／又は遺伝子間配列を生成するために使用することができる。
標的ＲＮＡのコード、非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、及び／又は遺伝子間配列を生成するために使用することができる。
【0258】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖をタグ付けし、固定化されたタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するためのインビトロ転位反応は、トランスポザーゼ、トランスポゾン配列組成物、及び好適な反応条件を含む。
【0259】
本明細書で記載されるように、プロトコルに対する特定の修飾は、収量を改善し得る。しかしながら、これらの特定の方法は、特許請求の範囲の範囲を限定することを意味するものではないが、それらの特定の試料に対して方法を最適化することを望む当業者に指針を提供することを意味する。例えば、単一細胞を含む試料で作業する使用者は、単一細胞が限られた量のＲＮＡ及びＤＮＡを有するため、ライブラリ収量を改善するために本明細書に記載される方法を使用することを望み得る。
【0260】
Ａ．試料及び標的ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、試料は、標的ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、コード、非翻訳領域（ＵＴＲ）配列、イントロン配列、及び／又は遺伝子間配列を含む。
いくつかの実施形態では、試料は、標的ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、コード、非翻訳領域（ＵＴＲ）配列、イントロン配列、及び／又は遺伝子間配列を含む。
【0261】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを含む試料又はＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を適用する工程は、生体試料を当該固体支持体に付加することを含む。生体試料は、ＲＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡを含み、かつタグメンテーションのために固体表面上に堆積させることができる任意の種類であり得る。例えば、試料は、精製されたＲＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡを含む、様々な精製状態のＲＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡを含み得る。しかしながら、試料は、完全に精製される必要はなく、例えば、タンパク質、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又は任意の他の混入物が混入しているＲＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、生体試料は、ＲＮＡ若しくはＲＮＡ及びＤＮＡ、タンパク質、他の核酸種、他の細胞成分、並びに／又はインビボで見られるものとほぼ同じ割合で存在する任意の他の混入物の混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、成分は、無傷細胞に見られるものと同じ割合で見出される。いくつかの実施形態では、生体試料は、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、又は０．６０以下の２６０／２８０吸光度比を有する。いくつかの実施形態では、生体試料は、少なくとも２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、又は０．６０の２６０／２８０吸光度比を有する。本明細書で提供される方法により、ＲＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡ
を固形支持体に結合させることが可能になるため、他の混入物は、表面結合タグメンテーションが生じた後に固形支持体を洗浄するだけで除去することができる。生体試料は、例えば、粗細胞溶解物又は全細胞を含み得る。例えば、本明細書に記載の方法において固体支持体に適用される粗細胞溶解物は、他の細胞成分から核酸を単離するために従来から使用している分離工程のうちの１つ以上が行われる必要はない。例示的な分離工程は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９、及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌに記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
を固形支持体に結合させることが可能になるため、他の混入物は、表面結合タグメンテーションが生じた後に固形支持体を洗浄するだけで除去することができる。生体試料は、例えば、粗細胞溶解物又は全細胞を含み得る。例えば、本明細書に記載の方法において固体支持体に適用される粗細胞溶解物は、他の細胞成分から核酸を単離するために従来から使用している分離工程のうちの１つ以上が行われる必要はない。例示的な分離工程は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９、及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌに記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【0262】
いくつかの実施形態では、固体支持体に適用される試料は、１．７以下である２６０／２８０吸光度比を有する。
【0263】
したがって、いくつかの実施形態では、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引物、糞便、及びこれらの浸軟組織、若しくはこれらの溶解物、又はＲＮＡ若しくはＲＮＡ及びＤＮＡを含む任意の他の生体標本を含み得る。
【0264】
いくつかの実施形態では、固体支持体に適用される試料は、血液である。いくつかの実施形態では、固体支持体に適用される試料は、細胞溶解物である。
【0265】
いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、粗細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、方法は、試料を固体支持体に適用した後に試料中の細胞を溶解して、細胞溶解物を生成することを更に含む。
【0266】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、溶液中で調製され、次いで、ＢＬＴに固定化される（図２を参照されたい）。
【0267】
本明細書に提示される方法及び組成物の１つの利点は、フローセルに生体試料を添加することができ、その後の溶解工程及び精製工程は、フローセルに必要な試薬を流すだけで、更なる移動又は取り扱い工程なしにフローセル内で全て生じ得ることである。
【0268】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む。
【0269】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、メッセンジャＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（transfer RNA、ｔＲＮＡ）、又はリボソームＲＮＡ（ribosomal RNA、ｒＲＮＡ）である。適切な捕捉オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの種類に基づいて設計され得る。
【0270】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの３’末端は、捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。
【0271】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ポリアデニル化される（すなわち、アデニン塩基のみを含むＲＮＡのストレッチを含む）。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリＡテールを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの３’末端は、ポリＡテールを含む。
【0272】
いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡは、ポリＡ配列を含み、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。
【0273】
試料中に含まれるＤＮＡ及びＲＮＡは、「全核酸」と称され得る。本明細書に記載される方法は、全核酸を含む試料からＤＮＡ及びＲＮＡライブラリを調製することにおいて有用であり得、ＤＮＡライブラリに含まれる断片は、各々、ＤＮＡ特異的バーコードを含み、ＲＮＡライブラリに含まれる断片は、各々、ＲＮＡ特異的バーコードを含む。このような方法は、単一の試料からＤＮＡ及びＲＮＡライブラリを調製する前に、ＤＮＡ及びＲＮＡを分離する必要性を回避し得る。
【0274】
Ｂ．トランスポソーム複合体
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、１つ以上のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、１つ以上のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含む。
【0275】
「トランスポソーム複合体」は、少なくとも１つのトランスポザーゼ（又は本明細書に記載の他の酵素）及びトランスポゾン認識配列から構成される。いくつかのそのようなシステムでは、トランスポザーゼは、転移反応を触媒することができる機能的複合体を形成するために、トランスポゾン認識配列に結合する。いくつかの側面では、トランスポゾン認識配列は、二本鎖トランスポゾン末端配列である。トランスポザーゼは、標的核酸内のトランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポゾン認識配列を標的核酸に挿入する。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポゾン認識配列（又は末端配列）の１つの鎖が標的核酸に転写され、開裂事象が生じる。例示的な転位手順及びシステムは、トランスポザーゼでの使用に容易に適合され得る。
【0276】
「トランスポザーゼ」は、トランスポゾン末端含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）を有する機能的複合体を形成し、かつ二本鎖標的核酸へのトランスポゾン末端含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる酵素を意味する。本明細書に提示されるトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含み得る。
【0277】
トランスポゾンベースの技術は、ＤＮＡを断片化するために利用することができ、ゲノムＤＮＡなどの標的核酸は、標的を同時に断片化及びタグ付けする（「タグメンテーション」）トランスポソーム複合体で処理され、それによって、断片の末端に固有のアダプター配列でタグ付けされた断片化核酸分子の集団を生成する。タグメンテーションは、トランスポゾン末端配列（本明細書でトランスポゾンと称される）を含む１つ以上のタグ（アダプター配列など）で複合体化されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を含む。タグメンテーションは、ＤＮＡの断片化及び二重鎖断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションを同時にもたらし得る。
【0278】
転位反応は、１つ以上のトランスポゾンがランダムな部位又はほぼランダムな部位で標的核酸に挿入される反応である。転位反応の構成要素としては、トランスポザーゼ（又は本明細書に記載される核酸を断片化及びタグ付けすることができる他の酵素、例えば、インテグラーゼ）、及び酵素に結合する二本鎖トランスポゾン末端配列を含むトランスポゾン要素、及び２つのトランスポゾン末端配列のうちの１つに結合されたアダプター配列が含まれ得る。二本鎖トランスポゾン末端配列のうちの一本鎖は、標的核酸の一本鎖に転移され、相補的なトランスポゾン末端配列鎖は、転移されない（すなわち、非転移トランスポゾン配列）。アダプター配列は、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列（例えば、プライマー配列）を含み得る。
【0279】
本明細書に提供されるある特定の実施形態で使用され得る例示的なトランスポザーゼとしては、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼ、ビブリオハーベイ（Vibrio harveyi）、Ｒ１及びＲ２末端配列を含むＭｕＡトランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼ認識部位、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｔｎ５５２、Ｔｙ１、Ｔｎ７トランスポザーゼ、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０、Ｍａｒｉｎｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ、Ｔｃ１、Ｐ Ｅｌｅｍｅｎｔ、Ｔｎ３、細菌挿入配列、レトロウイルス、及び酵母のレトロトランスポゾンが挙げられる（又はそれによってコードされる）。より多くの例としては、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、及びトランスポザーゼファミリー酵素の設計されたバージョンが挙げられる。本明細書に記載される方法はまた、トランスポザーゼの組み合わせを含み、単一のトランスポザーゼのみを含むのではない。
【0280】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５、Ｔｎ７、ＭｕＡ、若しくはビブリオハーベイトランスポザーゼ、又はこれらの活性変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその活性変異体である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ、又はその活性変異体である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第２０１５／１６０８９５号に記載されているＴｎ５トランスポザーゼである。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する５４、５６、３７２、２１２、２１４、２５１、及び３３８位での突然変異を有する、高活性Ｔｎ５である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼ：Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６Ａ、Ｌ３７２Ｐ、Ｋ２１２Ｒ、Ｐ２１４Ｒ、Ｇ２５１Ｒ、及びＡ３３８Ｖに対する以下の突然変異を有する高活性Ｔｎ５である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼ融合タンパク質は、融合伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）タグを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型配列に対するアミノ酸５４、５６、及び３７２における突然変異を含む高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼは融合タンパク質であり、任意選択で、融合タンパク質は伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）である。いくつかの実施形態では、認識部位は、Ｔｎ５型トランスポザーゼ認識部位である（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７，１９９８）。一実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼと複合体を形成するトランスポザーゼ認識部位が使用される（例えば、ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである。
【0281】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼの２つの分子のダイマーを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、トランスポザーゼの２つの分子は各々、同じ型の第１及び第２のトランスポゾンに結合している（例えば、各モノマーに結合した２つのトランスポゾンの配列は同じであり、「ホモダイマー」を形成する）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、トランスポソーム複合体の２つの集団を採用する。いくつかの実施形態では、各集団におけるトランスポゾンは同じである。いくつかの実施形態では、各集団におけるトランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、第１の集団は、各モノマーにおいて第１のアダプター配列を有し、第２の集団は、各モノマー中に異なるアダプター配列を有する。
【0282】
「トランスポゾン末端」という用語は、インビトロ転位反応で機能するトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素との複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す二本鎖核酸ＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端は、転位反応においてトランスポザーゼと機能複合体を形成することができる。非限定的な例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号の開示に記載されるように、トランスポゾン末端は、１９－ｂｐの外側末端（「outer end、ＯＥ」）トランスポゾン末端、内側末端（「inner end、ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は野生型若しくは変異体Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識される「モザイク末端」（「mosaic end、ＭＥ」）トランスポゾン末端、又はＲ１及びＲ２トランスポゾン末端を含み得る。トランスポゾン末端は、インビトロ転位反応においてトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素と機能複合体を形成するのに好適な任意の核酸又は核酸類似体を含み得る。例えば、トランスポゾン末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾塩基、非天然塩基、修飾骨格を含むことができ、一方又は両方の鎖にニックを含むことができる。「ＤＮＡ」という用語は、トランスポゾン末端組成物に関連して本開示全体を通して使用されるが、任意の好適な核酸又は核酸類似体がトランスポゾン末端において利用され得ることを理解すべきである。
【0283】
同様に、「転移鎖」という用語は、両方のトランスポゾン末端の転移部分を指す。同様に、「非転移鎖」という用語は、両方の「トランスポゾン末端」の非転移部分を指す。転移鎖の３’末端は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移される。転移されたトランスポゾン末端配列に相補的なトランスポゾン末端配列を示す非転移鎖は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移されない。
【0284】
いくつかの実施形態では、転移鎖及び非転移鎖は、共有結合している。例えば、いくつかの実施形態では、転移及び非転移鎖配列は、単一のオリゴヌクレオチド上に、例えば、ヘアピン構成で提供される。したがって、非転移鎖の遊離末端は、転位反応によって標的ＤＮＡに直接的には結合されないが、非転移鎖は、ヘアピン構造のループによって転移鎖に連結されているため、非転移鎖は、ＤＮＡ断片に間接的に付着することになる。トランスポソーム構造並びにトランスポソームを調製及び使用する方法の更なる例は、米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号の開示に見出すことができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0285】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグとを含む。
【0286】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン末端配列に対して相補的である領域を含む第２のポリヌクレオチドを含む。
【0287】
１．トランスポザーゼ
全体を通して使用されるように、トランスポザーゼという用語は、トランスポゾン含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン組成物）を有する機能的複合体を形成し、かつインビトロ転位反応で、それがインキュベートされる二本鎖標的核酸へのトランスポゾン含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる酵素を指す。提供される方法のトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含む。提供される方法において使用され得る例示的なトランスポザーゼとしては、野生型又は変異体形態のＴｎ５トランスポザーゼ及びＭｕＡトランスポザーゼが挙げられる。
全体を通して使用されるように、トランスポザーゼという用語は、トランスポゾン含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン組成物）を有する機能的複合体を形成し、かつインビトロ転位反応で、それがインキュベートされる二本鎖標的核酸へのトランスポゾン含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる酵素を指す。提供される方法のトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含む。提供される方法において使用され得る例示的なトランスポザーゼとしては、野生型又は変異体形態のＴｎ５トランスポザーゼ及びＭｕＡトランスポザーゼが挙げられる。
【0288】
「転位反応」は、１つ以上のトランスポゾンがランダムな部位又はほぼランダムな部位で標的核酸に挿入される反応である。転位反応の必須成分は、転移トランスポゾン配列及びその相補体（すなわち、非転移トランスポゾン末端配列）、並びに機能的転位又はトランスポソーム複合体を形成するために必要な他の構成要素を含む、トランスポゾンのヌクレオチド配列を示すトランスポザーゼ及びＤＮＡオリゴヌクレオチドである。本開示の方法は、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ及びＴｎ５型トランスポゾン末端によって、又はＭｕＡ若しくはＨＹＰＥＲＭｕトランスポザーゼ並びにＲ１及びＲ２末端配列を含むＭｕトランスポゾン末端によって形成される転位複合体を用いることによって例示される（例えば、Ｇｏｒｙｓｈｉｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｗ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７，１９９８、及びＭｉｚｕｕｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，３５：７８５，１９８３；Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４８９３，１９９５を参照されたく、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。しかしながら、意図された目的のために標的核酸にタグ付けするのに十分な効率で、ランダム又はほぼランダムな様式でトランスポゾン末端を挿入することができる任意の転位システムが提供される方法で使用され得る。提供される方法で使用され得る既知の転位システムの他の例としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｔｎ５５２、Ｔｙｌ、トランスポゾンＴｎ７、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０、マリナートランスポザーゼ、Ｔｅｌ、Ｐエレメント、Ｔｎ３、細菌挿入配列、レトロウイルス、並びに酵母のレトロトランスポゾン（例えば、Ｃｏｌｅｇｉｏ Ｏ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：２３８４－８，２００１；Ｋｉｒｂｙ Ｃ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１７３－８６，２００２、Ｄｅｖｉｎｅ Ｓ Ｅ，ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ Ｊ Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２，１９９４、国際特許出願第９５／２３８７５号、Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１：１５１２，１９９６、Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ：Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２７－４８，１９９６、Ｋｌｅｃｋｎｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：４９－８２，１９９６、Ｌａｍｐｅ Ｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：５４７０－９，１９９６、Ｐｌａｓｔｅｒｋ Ｒ Ｈ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０４：１２５－４３，１９９６、Ｇｌｏｏｒ，Ｇ Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２６０：９７－１ １４，２００４、Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｈ，ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｂｏ Ｅ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８８２９－３２，１９９０、Ｏｈｔｓｕｂｏ，Ｆ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，Ｙ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１－２６，１９９６、Ｂｒｏｗｎ Ｐ Ｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：２５２５－９，１９８９、Ｂｏｅｋｅ Ｊ Ｄ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ Ｖ Ｇ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３－３４，１９８９を参照されたく、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、それらに限定されない。
【0289】
トランスポゾンを標的配列に挿入するための方法は、好適なインビトロ転位システムが利用可能であるか、又は当該技術分野の知識に基づいて開発され得る任意の好適なトランスポゾンシステムを使用してインビトロで実施され得る。一般に、本開示の方法で使用するための好適なインビトロ転位システムは、少なくとも、十分な純度、十分な濃度、及び十分なインビトロ転位活性のトランスポザーゼ酵素、並びにトランスポザーゼが、転位反応を触媒し得るそれぞれのトランスポザーゼと機能的複合体を形成するトランスポゾンを必要とする。使用され得る好適なトランスポザーゼトランスポゾン末端配列は、トランスポザーゼの野生型、誘導体又は変異体から選択されるトランスポザーゼと複合体を形成する野生型、誘導体又は変異体トランスポゾン末端配列を含むが、それらに限定されない。
【0290】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５と比較して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対して増加された活性を有する。
【0291】
２．不活性化トランスポソーム
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、方法の間に可逆的に不活性化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、標的ＲＮＡを含む試料がトランスポソーム複合体及び捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持体に適用されるときに可逆的に不活性化され、ＤＮＡ：ＲＮＡ複合体を断片化する前又はそのときに活性化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム不活性化剤を除去することによって、断片化の前又はそのときに活性化される。可逆的不活性化の方法のうちのいずれかは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖又は二本鎖ＤＮＡのいずれかの断片化を含む、本明細書に記載される方法とともに使用され得る。言い換えれば、本明細書に記載される任意のトランスポソーム複合体は、可逆的に不活性化され得る。いくつかの実施形態では、タグメンテーションを行うことは、以前に可逆的に不活性化された状態にあったトランスポソーム複合体を活性化することを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、方法の間に可逆的に不活性化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、標的ＲＮＡを含む試料がトランスポソーム複合体及び捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持体に適用されるときに可逆的に不活性化され、ＤＮＡ：ＲＮＡ複合体を断片化する前又はそのときに活性化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム不活性化剤を除去することによって、断片化の前又はそのときに活性化される。可逆的不活性化の方法のうちのいずれかは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖又は二本鎖ＤＮＡのいずれかの断片化を含む、本明細書に記載される方法とともに使用され得る。言い換えれば、本明細書に記載される任意のトランスポソーム複合体は、可逆的に不活性化され得る。いくつかの実施形態では、タグメンテーションを行うことは、以前に可逆的に不活性化された状態にあったトランスポソーム複合体を活性化することを含む。
【0292】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム複合体に結合したトランスポソーム不活性化剤によって可逆的に不活性化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム不活性化剤は、トランスポソーム複合体のＴｎ５結合部位に結合される。
【0293】
広範囲の手段がトランスポソームを不活性化することができた。いくつかの実施形態では、トランスポソーム不活性化剤は、脱リン酸化ＭＥ’、余分な塩基、阻害剤二重鎖、及び／又は易熱性抗体を含む。
【0294】
いくつかの実施形態では、脱リン酸化ＭＥ’配列は、リン酸化されて、リン酸化ＭＥ’配列を生成し、トランスポソームを活性化することができる。
【0295】
いくつかの実施形態では、余分な塩基（すなわち、ヌクレオチド）は、トランスポゾン末端配列に隣接して、トランスポザーゼとの会合を遮断する。いくつかの実施形態では、余分な塩基は、切断可能なリンカーによってトランスポゾン末端配列から分離される。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーを切断するための薬剤による処理は、活性トランスポソーム複合体を生成する。
【0296】
いくつかの実施形態では、阻害剤二重鎖は、トランスポソーム複合体のトランスポザーゼに結合される。
【0297】
いくつかの実施形態では、易熱性抗体は、トランスポソーム複合体のトランスポザーゼのＤＮＡ結合部位に対する複合体である。いくつかの実施形態では、易熱性抗体を含む不活性化トランスポソームを含む反応溶液は、易熱性抗体が不活性化されるように加熱される。易熱性抗体が不活性化されると、トランスポソームは、活性化され得る。
【0298】
３．液相トランスポソーム複合体
本明細書に提示される方法は、溶液中にトランスポソーム複合体を提供し、ＤＮＡ：ＲＮＡがトランスポソーム複合体溶液によって断片化される条件下で、溶液相トランスポソーム複合体を固定化断片と接触させ、それによって、溶液中に１つの末端を有する固定化核酸断片を得る工程を更に含み得る。いくつかの実施形態では、溶液中のトランスポソーム複合体は、第２のタグを含むことができ、その結果、方法は、第２のタグを有する固定化核酸断片を生成し、第２のタグは溶液中にある。第１及び第２のタグは、異なるか又は同じであり得る。
本明細書に提示される方法は、溶液中にトランスポソーム複合体を提供し、ＤＮＡ：ＲＮＡがトランスポソーム複合体溶液によって断片化される条件下で、溶液相トランスポソーム複合体を固定化断片と接触させ、それによって、溶液中に１つの末端を有する固定化核酸断片を得る工程を更に含み得る。いくつかの実施形態では、溶液中のトランスポソーム複合体は、第２のタグを含むことができ、その結果、方法は、第２のタグを有する固定化核酸断片を生成し、第２のタグは溶液中にある。第１及び第２のタグは、異なるか又は同じであり得る。
【0299】
いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片が液相トランスポソーム複合体によって更に断片化される条件下で、液相トランスポソーム複合体を固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ断片と接触させ、それによって、溶液中に１つの末端を有する固定化核酸断片を得ることを更に含み得る。
【0300】
いくつかの実施形態では、液相トランスポソーム複合体は、第２のタグを含み、それによって、溶液中に第２のタグを有する固定化核酸断片を生成する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のタグは異なる。いくつかの実施形態では、液相トランスポソーム複合体の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、第２のタグを含む。
【0301】
いくつかの実施形態では、表面結合トランスポソームの１つの形態は、固体支持体上に主に存在する。例えば、いくつかの実施形態では、当該固体支持体上に存在するタグの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、同じタグドメインを含む。そのような実施形態では、表面結合トランスポソームとの最初のタグメンテーション反応後、ブリッジ構造の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、ブリッジの各末端に同じタグドメインを含む。第２のタグメンテーション反応は、ブリッジを更に断片化する溶液からのトランスポソームを付加することによって行われ得る。いくつかの実施形態では、液相トランスポソームのほとんど又は全ては、第１のタグメンテーション反応において生成されたブリッジ構造上に存在するタグドメインとは異なるタグドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、液相トランスポソーム中に存在するタグの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、第１のタグメンテーション反応において生成されたブリッジ構造上に存在するタグドメインとは異なるタグドメインを含む。
【0302】
いくつかの実施形態では、鋳型の長さは、標準的なクラスタ化学を使用して好適に増幅され得るものよりも長い。例えば、いくつかの実施形態では、鋳型の長さは、少なくとも１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ、３０００ｂｐ、３１００ｂｐ、３２００ｂｐ、３３００ｂｐ、３４００ｂｐ、３５００ｂｐ、３６００ｂｐ、３７００ｂｐ、３８００ｂｐ、３９００ｂｐ、４０００ｂｐ、４１００ｂｐ、４２００ｂｐ、４３００ｂｐ、４４００ｂｐ、４５００ｂｐ、４６００ｂｐ、４７００ｂｐ、４８００ｂｐ、４９００ｂｐ、５０００ｂｐ、１００００ｂｐ、３００００ｂｐ、又は１００，０００ｂｐである。そのような実施形態では、第２のタグメンテーション反応は、次いで、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９６８３２３０号に記載されるように、ブリッジを更に断片化する溶液からのトランスポソームを付加することによって行われ得る。したがって、第２のタグメンテーション反応は、ブリッジの内部スパンを除去することができ、更なる配列決定工程の準備ができているクラスタに変換することができる表面に固定された短い切り端を残す。特定の実施形態では、鋳型の長さは、上で例示したものから選択される上限及び下限によって規定される範囲内であり得る。
【0303】
いくつかの実施形態では、溶液中での転位（すなわち、液相トランスポソーム複合体を用いる）を使用して、捕捉プローブにハイブリダイズすることができる配列を組み込むことができる。このようにして、タグメンテーションを使用して、その表面上に捕捉プローブを含む固体支持体に特異的に結合することができる断片を生成することができる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ又はＲＮＡから生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、溶液中でタグメンテーションされ、捕捉プローブにハイブリダイズすることができる配列を含むタグを組み込む。このタグメンテーション後、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から生成された断片は、捕捉プローブを含む固体支持体に結合され得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、Ｐ５又はＰ７配列（又はそれらの相補体）を含む。
【0304】
Ｃ．捕捉オリゴヌクレオチドを含むビーズ
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に固定化される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの３’末端は、捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に標的ＲＮＡを固定化するように機能し得る。ｍＲＮＡを捕捉するための捕捉オリゴヌクレオチドを含むビーズを使用する例示的なワークフローを図２０に示す。
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に固定化される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの３’末端は、捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に標的ＲＮＡを固定化するように機能し得る。ｍＲＮＡを捕捉するための捕捉オリゴヌクレオチドを含むビーズを使用する例示的なワークフローを図２０に示す。
【0305】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ポリＴ配列を含む。
【0306】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡは、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。
【0307】
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリＴ配列を含まない。
【0308】
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、Ｐ５又はＰ７配列を介してビーズに固定化される。
【0309】
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ビーズコード又は他の種類のバーコードを更に含む。本明細書で使用される場合、「ビーズコード」は、ビーズ上に存在し、かつビーズのプール中の全て又はほとんどの他のビーズとは異なる核酸配列である。いくつかの実施形態では、ビーズコードを使用して、同じビーズ上に生成される断片を同定することができる。
【0310】
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドに含まれる配列は、合成中にｃＤＮＡに組み込まれる。
【0311】
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、固定化トランスポソームの第１のポリヌクレオチドに含まれる第１のタグにも存在するタグを含む。
【0312】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、標的核酸を固定化するための捕捉オリゴヌクレオチドを含まない。例えば、二本鎖ＤＮＡ及びＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、固定化トランスポソーム複合体への結合を介して固体支持体上に固定化され得る。
【0313】
Ｄ．ポリヌクレオチド及び固定化トランスポソーム複合体
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体組成物は、トランスポゾン配列に加えて、１つ以上の他のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのトランスポゾンを含むか、又はそれからなる。このようなヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドと称され得る。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体組成物は、トランスポゾン配列に加えて、１つ以上の他のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのトランスポゾンを含むか、又はそれからなる。このようなヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドと称され得る。
【0314】
本明細書に提示される方法及び組成物では、トランスポソーム複合体は、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチドなどの１つ以上のポリヌクレオチドを介して支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼ酵素を固体支持体に結合するリンカーを介して固定化され得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素及びポリヌクレオチドの両方が、固体支持体に固定化される。固体支持体への分子（例えば、核酸）の固定化に言及する場合、「固定化された」及び「結合された」という用語は、本明細書では互換的に使用され、両方の用語は、明示的に又は文脈によってのいずれかで別段指示されない限り、直接的又は間接的、共有結合、又は非共有結合を包含することが意図される。いくつかの実施形態では、共有結合が使用され得るが、一般的に、必要とされるのは、例えば、核酸増幅及び／又は核酸配列決定を必要とする用途において、支持体を使用することが意図される条件下で、分子（例えば、核酸）が、支持体に固定化されたままである又は結合したままであるということである。
【0315】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のタグは、ＤＮＡ特異的バーコードである。
【0316】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む。いくつかの実施形態では、第２のタグは、ＲＮＡ特異的バーコードを含む。
【0317】
したがって、いくつかの実施形態では、トランスポゾン組成物は、転移トランスポゾン配列の１つ以上の他のヌクレオチド配列５’、例えば、タグ配列を有する転移鎖を含む。転移トランスポゾン配列に加えて、タグは、１つ以上の他のタグ部分又はタグドメインを有し得る。
【0318】
「タグメンテーション」は、断片及びタグ核酸に対するトランスポザーゼの使用を指す。タグメンテーションは、トランスポゾン末端配列（本明細書でトランスポゾンと称される）を含む１つ以上のタグ（アダプター配列など）で複合体化されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を含む。タグメンテーションは、ＤＮＡの断片化及び二重鎖断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションを同時にもたらし得る。
【0319】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。
【0320】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン末端配列に対して相補的である領域を含む第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。
【0321】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する。
【0322】
いくつかの実施形態では、固定化ライブラリ中の二本鎖断片の長さは、固体支持体上のトランスポソーム複合体の密度を増加又は減少させることによって調整される。
【0323】
その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９６８３２３０号に記載されているように、いくつかの異なる種類の固定化トランスポソームをこれらの方法で使用することができる。
【0324】
Ｅ．ビーズ上の核酸の空間的に分離された捕捉
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドを含む固体支持体は、核酸を捕捉するために使用される。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを捕捉するために使用される。
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドを含む固体支持体は、核酸を捕捉するために使用される。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを捕捉するために使用される。
【0325】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、捕捉ビーズ上に捕捉される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＲＮＡ－ＢＬＴ上に捕捉される。
【0326】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、液滴内の固体支持体上に捕捉される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に適用することは、液滴中で行われる。
【0327】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、液滴内の固体支持体上に捕捉される。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡを含む試料を固体支持体に適用することは、液滴中で行われる。
【0328】
１．液滴
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に適用することは、ビーズと一緒に液滴中の単一細胞を提供することと、液滴中の細胞を溶解することと、単一細胞から標的ＲＮＡを放出することと、ビーズ上に標的ＲＮＡを捕捉することと、を含む。いくつかの実施形態では、液滴は、ｃＤＮＡを合成する前に除去される。国際公開第２０１５／１６８１６１号及び同第２０１７／０４０３０６号など、液滴を使用する様々な方法が当該技術分野で既知であり、その各々はその全体が本明細書に組み込まれる。試料からの標的ＤＮＡは、同様にビーズ（ＢＬＴなど）上に捕捉され得、次いで、液滴が除去される。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に適用することは、ビーズと一緒に液滴中の単一細胞を提供することと、液滴中の細胞を溶解することと、単一細胞から標的ＲＮＡを放出することと、ビーズ上に標的ＲＮＡを捕捉することと、を含む。いくつかの実施形態では、液滴は、ｃＤＮＡを合成する前に除去される。国際公開第２０１５／１６８１６１号及び同第２０１７／０４０３０６号など、液滴を使用する様々な方法が当該技術分野で既知であり、その各々はその全体が本明細書に組み込まれる。試料からの標的ＤＮＡは、同様にビーズ（ＢＬＴなど）上に捕捉され得、次いで、液滴が除去される。
【0329】
いくつかの実施形態では、液滴中のＲＮＡの捕捉後、ｃＤＮＡ合成は、ビーズ上で、バルクで行われ、ｃＤＮＡの第１の鎖を生成する（すなわち、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する）。本明細書で使用される場合、「バルクで」は、工程がビーズ上で行われるが、これらのビーズは溶液中にあり、液滴によって分離されないことを示すために使用される。したがって、方法の工程がビーズへの核酸の捕捉後にバルクで行われる場合、これらの固定化された核酸は、溶液中に存在しないが、ビーズ上に固定化されたままである。一般に、本明細書に記載される全ての方法は、液滴中のＲＮＡ又はＤＮＡの捕捉を可能にするが、後の工程は、液滴中で行われるか、又はバルクで行われるかのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、タグメンテーションは、バルクで行われる。
【0330】
例えば、図５は、ビーズコード（すなわち、バーコード）が、液滴中でＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を調製するためのｃＤＮＡの第１の鎖の合成中に組み込まれる、代表的な例を示す。ビーズコードは、ポリＴ配列（ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するため）及び固体表面上に断片を固定化するために使用され得るＰ５アダプター配列も含む捕捉オリゴヌクレオチドに含まれる。固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、バルクでタグメンテーションすることができ、続いて鎖交換及びライゲーションを行うことができる。アダプター（Ｂ’及びＰ７’など）は、溶液中でのタグメンテーション又はＰＣＲなどを用いて、断片の遊離末端（ビーズに結合していない）に付加され得る。
【0331】
２．液滴中のバーコード化
いくつかの実施形態では、バーコード化は、個々の細胞を液滴に分離し、ビーズコードを組み込むことによって行われ得る。いくつかの実施形態では、液滴中のビーズに含まれるビーズコードに基づいて、ビーズコードをライブラリ断片に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、液滴は、試料を空間的に分離するために使用される。
いくつかの実施形態では、バーコード化は、個々の細胞を液滴に分離し、ビーズコードを組み込むことによって行われ得る。いくつかの実施形態では、液滴中のビーズに含まれるビーズコードに基づいて、ビーズコードをライブラリ断片に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、液滴は、試料を空間的に分離するために使用される。
【0332】
いくつかの実施形態では、ＢＬＴは、ビーズコードを含む固定化オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、ビーズコードを含む第１のトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、ビーズコード及び第２のトランスポゾンに結合するためのハイブリダイゼーション配列を含む。
【0333】
いくつかの実施形態では、ビーズコードは、試料由来のＲＮＡから生成されたｃＤＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、タグメンテーション中にビーズコードをライブラリ断片に組み込むことができる。
【0334】
いくつかの実施形態では、液滴は、エマルジョン中で互いに分離される。いくつかの実施形態では、液滴は、液滴アクチュエータを使用して形成及び／又は操作される。いくつかの実施形態では、１つ以上の液滴は、バーコード含有の第１の鎖合成プライマーの異なるセットを含む。いくつかの実施形態では、各液滴は、多数の第１の鎖合成プライマーを含み、これらのプライマーの各々は、同一バーコードを含む同一配列を有し、１つの液滴からのバーコードは、別の液滴とは異なるが、第１の鎖合成プライマーの残りの部分は、液滴間で同じままである。したがって、これらの実施形態では、バーコードは、液滴並びに液滴によって包含される単一細胞の識別子として機能する。
【0335】
いくつかの実施形態では、１つ以上の液滴は、ＵＭＩ含有の第１の鎖合成プライマーの異なるセットを含む。したがって、各液滴中で溶解される各個々の細胞は、各液滴中のバーコードによって識別可能である。いくつかの実施形態では、液滴ベースのバーコード化は、単一細胞を含む液滴を、バーコードの固有のセットを含む他の液滴とマージすることによって行われ得る。このフォーマットは、多重壁フォーマットで利用可能なものを超える追加の多重化を可能にする。第１の鎖合成及び鋳型スイッチングは、各個々の液滴内で行われる。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、液滴は、タグメンテーションの前にマージされ得る。追加的に又は代替的に、いくつかの実施形態では、液滴は、ＰＣＲの後及びタグメンテーションの前にマージされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、第１の鎖合成が個々の液滴中で行われた後、タグ付きｃＤＮＡをマージすることができ、したがってｃＤＮＡをプールすることができる。
【0336】
いくつかの実施形態では、試料及びＵＭＩバーコード化は、第１の鎖合成のためのＵＭＩ及び／又はバーコードタグ付きプライマーを有するビーズを用いて個々の細胞を分離することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、ビーズは、エマルジョン中で液滴に分離される。いくつかの実施形態では、ビーズは、液滴アクチュエータを使用して分離及び操作される。いくつかの実施形態では、ビーズベースのバーコード化は、ビーズのセットを作製することによって行うことができ、各ビーズは、バーコードの固有のセットを有する。
【0337】
３．液滴中のＢＬＴ上での核酸捕捉を使用する空間的分離
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、液滴中のＢＬＴ上で捕捉され、次いで、ｃＤＮＡ調製及び断片化が行われた後、断片がＢＬＴから放出される。細胞及び捕捉ビーズは、液滴中に同時カプセル封入され得、続いて、液滴中で溶解及びｍＲＮＡ捕捉される。次いで、ｃＤＮＡ合成、タグメンテーション、及びライゲーションもバルクで行うことができ、得られたライブラリ断片はビーズ上に保持される。代表的な方法は図７に示され、ＢＬＴは、活性化可能なＢＬＴであり、トランスポソームは、バルクでｃＤＮＡ合成後に組み立てられる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、液滴中のＢＬＴ上で捕捉され、次いで、ｃＤＮＡ調製及び断片化が行われた後、断片がＢＬＴから放出される。細胞及び捕捉ビーズは、液滴中に同時カプセル封入され得、続いて、液滴中で溶解及びｍＲＮＡ捕捉される。次いで、ｃＤＮＡ合成、タグメンテーション、及びライゲーションもバルクで行うことができ、得られたライブラリ断片はビーズ上に保持される。代表的な方法は図７に示され、ＢＬＴは、活性化可能なＢＬＴであり、トランスポソームは、バルクでｃＤＮＡ合成後に組み立てられる。
【0338】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、液滴中のＢＬＴ上で捕捉され、断片化は、断片がＢＬＴから放出される前に行われる。
【0339】
いくつかの実施形態では、ライブラリ断片は、断片とのトランスポザーゼ（ＢＬＴ上の固定化トランスポソーム複合体に含まれる）の会合に起因して、ビーズ上に保持される。いくつかの実施形態では、断片は、プロテアーゼ又はＳＤＳが付加されてトランスポザーゼから断片を放出するまで、ビーズ上に固定化されたままである。いくつかの実施形態では、固定化ライブラリ断片を有するビーズは、配列決定のために固体支持体（フローセルなど）に送達され、ライブラリは、ビーズから放出される。フローセル上に捕捉されたビーズからのそのような放出は、図４に示されるように、「オンフローセル空間リード」を可能にし、単一のビーズからの断片は、互いに近接して放出される。このようにして、フローセル上で空間的に近接している断片は、同じ細胞からの核酸に由来する可能性が高いと決定され得る。
【0340】
いくつかの実施形態では、液滴中の核酸の捕捉と、それに続くＢＬＴ上でのライブラリ調製は、バーコード化の不在下であっても、異なる細胞からの断片の分離を可能にする。
【0341】
４．区画化された固体支持体を使用する空間的分離
いくつかの実施形態では、区画化は、配列決定のためのライブラリ断片の空間的分離を可能にする。いくつかの実施形態では、区画化は、元の試料中のＤＮＡ又はＲＮＡからの断片が、ライブラリ調製後に近接することを可能にする。いくつかの実施形態では、配列決定データ及び近接度データを一緒に使用して、試料中の出発ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に含まれていた断片を決定することができる。
いくつかの実施形態では、区画化は、配列決定のためのライブラリ断片の空間的分離を可能にする。いくつかの実施形態では、区画化は、元の試料中のＤＮＡ又はＲＮＡからの断片が、ライブラリ調製後に近接することを可能にする。いくつかの実施形態では、配列決定データ及び近接度データを一緒に使用して、試料中の出発ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に含まれていた断片を決定することができる。
【0342】
いくつかの実施形態では、区画化は、マイクロウェルを含む固体支持体を使用して行われる。いくつかの実施形態では、単一細胞は、マイクロウェル内で区画化される。いくつかの実施形態では、細胞密度及び体積の計算を使用して、ほとんどの細胞が別の細胞を含まないマイクロウェル内に区画化されるように試料を希釈することができる。
【0343】
図８は、ポリＴ ＲＮＡ捕捉が、マイクロウェル当たりの単一細胞の捕捉を可能にするマイクロウェルを含むフローセル上で行われ得る、代表的な例を示す。
【0344】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に適用することは、固体支持体上のマイクロウェルにおいて行われる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを含む試料を固体支持体に適用することは、細胞を溶解することと、マイクロウェル中の単一細胞から標的ＲＮＡを放出することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを放出することと、同じマイクロウェル中の断片を配列決定することと、を更に含む。このようにして、所与のマイクロウェルに局在化される断片は、単一細胞に由来するものとして特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、配列決定データは、配列決定のための表面上の断片の空間的近接度に基づいて、同じ固体支持体上に固定化されていた断片の分解能を可能にする。
【0345】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、マイクロウェルを含むフローセルである。
【0346】
いくつかの実施形態では、マイクロウェルを含むフローセルは、ポリマーコーティングを含む。いくつかの実施形態では、フローセルは、共有結合したポリマーでコーティングされる。いくつかの実施形態では、共有結合したポリマーは、ＰＡＺＡＭである。いくつかの実施形態では、ポリマーコーティングは、オリゴヌクレオチドと反応するための反応部位を含む。そのような共有結合したポリマーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１８４７９６号に記載されている。いくつかの実施形態では、ＰＡＺＡＭなどのポリマーは、紫外線を使用して架橋される。
【0347】
マイクロウェルを含むフローセルを用いる方法はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０２０／０３６９９１号に記載されるように、特殊なハイブリダイゼーション緩衝液及びアダプターブロッカーを使用してもよい。
【0348】
Ｆ．固体支持体
本明細書に提示される方法及び組成物では、トランスポソーム複合体は、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体及び／又は捕捉オリゴヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチドなどの１つ以上のポリヌクレオチドを介して支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼ酵素を固体支持体に結合するリンカーを介して固定化され得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素及びポリヌクレオチドの両方が、固体支持体に固定化される。固体支持体への分子（例えば、核酸）の固定化に言及する場合、「固定化された」及び「結合された」という用語は、本明細書では互換的に使用され、両方の用語は、明示的に又は文脈によってのいずれかで別段指示されない限り、直接的又は間接的、共有結合、又は非共有結合を包含することが意図される。いくつかの実施形態では、共有結合が使用され得るが、一般的に、必要とされるのは、例えば、核酸増幅及び／又は核酸配列決定を必要とする用途において、支持体を使用することが意図される条件下で、分子（例えば、核酸）が、支持体に固定化されたままである又は結合したままであるということである。
本明細書に提示される方法及び組成物では、トランスポソーム複合体は、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体及び／又は捕捉オリゴヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチドなどの１つ以上のポリヌクレオチドを介して支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼ酵素を固体支持体に結合するリンカーを介して固定化され得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素及びポリヌクレオチドの両方が、固体支持体に固定化される。固体支持体への分子（例えば、核酸）の固定化に言及する場合、「固定化された」及び「結合された」という用語は、本明細書では互換的に使用され、両方の用語は、明示的に又は文脈によってのいずれかで別段指示されない限り、直接的又は間接的、共有結合、又は非共有結合を包含することが意図される。いくつかの実施形態では、共有結合が使用され得るが、一般的に、必要とされるのは、例えば、核酸増幅及び／又は核酸配列決定を必要とする用途において、支持体を使用することが意図される条件下で、分子（例えば、核酸）が、支持体に固定化されたままである又は結合したままであるということである。
【0349】
ある特定の実施形態は、ポリヌクレオチドなどの生体分子への共有結合を可能にする反応基を含む中間材料の層又はコーティングの適用によって機能化された不活性基質又はマトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズなど）から構成される固体支持体を利用することができる。このような支持体の例としては、ガラスなどの不活性基質上に支持されるポリアクリルアミドヒドロゲル、特に国際公開第２００５／０６５８１４号及び米国特許出願公開第２００８／０２８０７７３号に記載されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されず、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。そのような実施形態では、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、中間材料（例えば、ヒドロゲル）に直接共有付着してもよいが、中間材料は、それ自体が基質又はマトリックス（例えば、ガラス基質）に非共有結合してもよい。用語「固体支持体への共有結合」は、この種類の配列を包含するように適宜解釈されるべきである。
【0350】
「固体表面」、「固体支持体」という用語、及び本明細書の他の文法的等価物は、トランスポソーム複合体の結合に適切であるか、又は適切であるように修飾され得る任意の材料を指す。当業者によって理解されるように、可能な基質の数は非常に多い。可能な基質としては、ガラス及び変性又は機能化ガラス、プラスチック（例えば、アクリル、ポリスチレン、並びにスチレン及び他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）など）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、セラミックス、樹脂、シリカ、又はシリコン及び変性シリコンを含むシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバ束、並びに様々な他のポリマーを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、特に有用な固体支持体及び固体表面は、フローセル装置内に配置される。例示的なフローセルは、以下に更に詳細に示される。
【0351】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、規則的なパターンでのトランスポソーム複合体の固定に好適なパターン化された表面を含む。「パターン化された表面」は、固体支持体の露出層内又はその上における、異なる領域の配置を指す。例えば、領域のうちの１つ以上は、１つ以上のトランスポソーム複合体が存在する特徴であり得る。この特徴は、トランスポソーム複合体が存在しない間質領域によって分離され得る。いくつかの実施形態では、パターンは、行及び列にある特徴のｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの実施形態では、パターンは、特徴及び／又は間質領域の反復配置であり得る。いくつかの実施態様では、パターンは、特徴及び／又は間質領域のランダム配置であり得る。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、固体支持体上にランダムに分布している。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、パターン化された表面上に分布している。本明細書に示される方法及び組成物において使用され得る例示的なパターン化された表面は、米国出願第１３／６６１５２４号又は米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0352】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面にウェル又は窪みのアレイを含む。これは、フォトリソグラフィ、スタンピング技術、成形技術、及びマイクロエッチング技術を含むがこれらに限定されない様々な技術を使用して、当該技術分野において一般的に既知であるように加工することができる。当該技術分野において理解されるように、使用される技術は、アレイ基質の組成物及び形状に依存する。
【0353】
固体支持体の組成及び幾何学的形状は、その使用によって異なり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ及び／又はアレイなどの平面構造である。したがって、基質の表面は、平面層の形態であり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセルの１つ以上の表面を含む。本明細書で使用するとき、用語「フローセル」は、１つ以上の流体試薬を流通させることができる固体表面を含むチャンバを指す。本開示の方法において容易に使用することができるフローセル及び関連する流体システム及び検出プラットフォームの例は、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、同第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0354】
いくつかの実施形態では、固体支持体又はその表面は、チューブ又は容器の内面又は外面などの非平面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ミクロスフェア又はビーズを含む。本明細書における「ミクロスフェア」又は「ビーズ」又は「粒子」又は文法的均等物は、小さな離散粒子を意味する。好適なビーズ組成物としては、プラスチック、セラミックス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル（thoria sol）、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、又はセファロースなどの架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、及びテフロン（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されず、並びに固体支持体について本明細書に概説される任意の他の材料を全て使用することができる。Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄ．の「Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ」は、有用なガイドである。ある特定の実施形態では、ミクロスフェアは、磁気ミクロスフェア又はビーズである。
【0355】
ビーズは球状である必要はない。不規則な粒子を使用してもよい。代替的に又は追加的に、ビーズは多孔質であってもよい。ビーズサイズは、ナノメートル、すなわち、１００ｎｍから、ミリメートル、すなわち、１ｍｍまでの範囲であり、ビーズは約０．２ミクロン～約２００ミクロン、又は約０．５～約５マイクロメートルであるが、いくつかの実施形態では、より小さな又はより大きなビーズが使用されてもよい。
【0356】
これらの表面結合トランスポソームの密度は、第１のポリヌクレオチドの密度を変化させることによって、又は固体支持体に付加されるトランスポザーゼの量によって、調節することができる。例えば、いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する。
【0357】
支持体への核酸の結合は、剛性又は半剛性にかかわらず、共有結合又は非共有結合を介して起こり得る。例示的な連結は、米国特許第６，７３７，２３６号、同第７，２５９，２５８号、同第７，３７５，２３４号、及び同第７，４２７，６７８号、並びに米国特許公開第２０１１／００５９８６５号に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸又は他の反応成分は、ゲル又は他の半固体支持体に結合され得、これは次に、固相支持体に結合又は接着される。このような実施形態では、核酸又は他の反応成分は、固相であると理解される。
【0358】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、微小粒子、ビーズ、平面支持体、パターン化された表面、又はウェルを含む。いくつかの実施形態では、平面支持体は、チューブの内面又は外面である。
【0359】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、その上に固定化されて調製されたタグ付きＲＮＡ断片のライブラリを有する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、その上に固定化されて調製されたタグ付きＤＮＡ断片のライブラリを有する。いくつかの実施形態では、２つ以上の固体支持体は、１つの固体支持体上にタグ付きＲＮＡ断片のライブラリを生成し、別の固体支持体上にタグ付きＤＮＡ断片のライブラリを生成するために使用される。
【0360】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、その上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチド及び第１のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のタグは、ＤＮＡ特異的バーコードである。いくつかの実施形態では、この固体支持体は、ＤＮＡをタグメンテーションするためのものであり、ＤＮＡビーズ連結トランスポソーム（DNA bead-linked transposome、ＤＮＡ ＢＬＴ）と称される。
【0361】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、トランスポソーム複合体を形成するために第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを更に含む。
【0362】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、その上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む。いくつかの実施形態では、第２のタグは、ＲＮＡ特異的バーコードを含む。いくつかの実施形態では、この固体支持体は、ＲＮＡ（ｄｓ－ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のいずれか）から生成された核酸をタグメンテーションするためのものであり、ＲＮＡビーズ連結トランスポソーム（RNA bead-linked transposome、ＲＮＡ ＢＬＴ）と称される。
【0363】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、トランスポソーム複合体を形成するために第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを更に含む。
【0364】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従って調製された、その上に固定化されたタグ付き断片のライブラリを含む。
【0365】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、トランスポザーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、逆転写酵素ポリメラーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、トランスポザーゼを含む第２のトランスポソーム複合体と、トランスポゾン末端配列を含む３’部分及び任意選択で第２のタグを含む第３のポリヌクレオチドと、を含む、ＤＮＡを固定化するための第２の固体支持体を更に含む。
【0366】
Ｇ．ＤＮＡ ＢＬＴ及びＲＮＡ ＢＬＴ
いくつかの実施形態では、これらの方法は、ＢＬＴ（ビーズ連結トランスポソーム）を使用する。表面に結合したトランスポソーム（例えば、ＢＬＴ）は、二本鎖ＤＮＡの長い分子をタグメンテーションし、ビーズ又は他の表面上で鋳型ライブラリを作製することができる（米国特許第９６８３２３０号）。トランスポソームをビーズに固定することにより、制御可能な挿入サイズ及び収量などの新規の特性が得られる。これは、以前はＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ技術として知られていたＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ技術の基礎である。二本鎖ＤＮＡをタグメンテーションすることができるＢＬＴは、ＤＮＡ－ＢＬＴと称され得る。
いくつかの実施形態では、これらの方法は、ＢＬＴ（ビーズ連結トランスポソーム）を使用する。表面に結合したトランスポソーム（例えば、ＢＬＴ）は、二本鎖ＤＮＡの長い分子をタグメンテーションし、ビーズ又は他の表面上で鋳型ライブラリを作製することができる（米国特許第９６８３２３０号）。トランスポソームをビーズに固定することにより、制御可能な挿入サイズ及び収量などの新規の特性が得られる。これは、以前はＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ技術として知られていたＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ技術の基礎である。二本鎖ＤＮＡをタグメンテーションすることができるＢＬＴは、ＤＮＡ－ＢＬＴと称され得る。
【0367】
トランスポゾン末端はＤＮＡに対する親和性を有するため、ＤＮＡ ＢＬＴは、ビーズ上への固定化のための捕捉オリゴヌクレオチドを必要とせず、その代わりに、ＤＮＡは、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチドを使用して固定化され得る。代替的に、捕捉オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子を捕捉するために使用され得る。
【0368】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡを固定化するための固体支持体は、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含む。いくつかの実施形態では、第１のトランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１のタグを更に含む。いくつかの実施形態では、第１のタグは、ＤＮＡ特異的バーコードである。
【0369】
いくつかの実施形態では、これらの方法は、ＲＮＡ ＢＬＴを使用する。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ ＢＬＴ」とは、試料中のＲＮＡに由来するタグ付き断片を調製するために使用されるＢＬＴを指す。したがって、ＲＮＡ ＢＬＴは、ＲＮＡから生成される核酸から断片を生成し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ ＢＬＴは、（ｃＤＮＡの２つの鎖の合成後に）ＲＮＡから生成されたｄｓ－ｃＤＮＡから断片を生成する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ ＢＬＴは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から断片を生成する（ｃＤＮＡの一本鎖のみが産生される）。いくつかの実施形態では、図２６～図２８に示されるように、ＲＮＡ ＢＬＴは、ＲＮＡ特異的バーコードを組み込むように機能し、一方で、ＤＮＡ ＢＬＴは、ＤＮＡ特異的バーコードを組み込むように機能する。
【0370】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｄｓ－ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖）から生成された核酸を固定化するための固体支持体は、その上に固定化された第２のトランスポソーム複合体を含む。いくつかの実施形態では、第２のトランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分を含む。いくつかの実施形態では、このトランスポザーゼは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から断片を生成するための増加された活性を有する。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のタグを更に含む。いくつかの実施形態では、第２のタグは、ＲＮＡ特異的バーコードを含む。
【0371】
１．活性化可能なＢＬＴ
いくつかの実施形態では、ビーズを使用して、使用者が選択時に活性トランスポソームを生成することを可能にすることができる。例えば、使用者の選択時に溶液からトランスポソームを捕捉することを可能にするビーズは、「活性化可能なＢＬＴ」と称され得る。活性化可能なＢＬＴの一般的な態様は、それらが核酸（例えば、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖又は二本鎖ｃＤＮＡなど）を断片化することができない状態で試料に適用され得ることであるが、使用者は、選択時にＢＬＴを活性化することができる。このようにして、使用者は、複数工程方法でタグメンテーションのタイミングを制御する。ある範囲の異なる種類の活性化可能なトランスポソームは、本明細書に記載されており、異なる方法で使用され得る。図１１Ａ～図１１Ｃは、捕捉オリゴヌクレオチドと、短Ａ配列を介して溶液からのトランスポソームに結合することができるオリゴヌクレオチドと、を含むビーズを示す。図１２は、第１及び第２のトランスポゾンが短Ａ配列を介してビーズに結合されている実施形態を示す。
いくつかの実施形態では、ビーズを使用して、使用者が選択時に活性トランスポソームを生成することを可能にすることができる。例えば、使用者の選択時に溶液からトランスポソームを捕捉することを可能にするビーズは、「活性化可能なＢＬＴ」と称され得る。活性化可能なＢＬＴの一般的な態様は、それらが核酸（例えば、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖又は二本鎖ｃＤＮＡなど）を断片化することができない状態で試料に適用され得ることであるが、使用者は、選択時にＢＬＴを活性化することができる。このようにして、使用者は、複数工程方法でタグメンテーションのタイミングを制御する。ある範囲の異なる種類の活性化可能なトランスポソームは、本明細書に記載されており、異なる方法で使用され得る。図１１Ａ～図１１Ｃは、捕捉オリゴヌクレオチドと、短Ａ配列を介して溶液からのトランスポソームに結合することができるオリゴヌクレオチドと、を含むビーズを示す。図１２は、第１及び第２のトランスポゾンが短Ａ配列を介してビーズに結合されている実施形態を示す。
【0372】
いくつかの実施形態では、活性化可能なＢＬＴは、望ましくないタグメンテーションを回避する。例えば、活性化可能なＢＬＴの使用は、使用者が、トランスポソームによるタグメンテーションの前に、ｃＤＮＡ合成が完了したこと（例えば、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の生成など）を確実にすることを可能にすることができる。このようにして、使用者は「部分的」ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖（すなわち、ｃＤＮＡがＲＮＡの一部分からのみ生成されている、不完全ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーション）の断片化を回避することができる。
【0373】
活性化可能なＢＬＴは、使用者が複数工程方法においてタグメンテーションのタイミングを制御することを可能にするなど、いくつかの利点を有する。いくつかの実施形態では、活性化可能なＢＬＴは、試料由来のＤＮＡ対試料由来のＲＮＡから生成されたｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションの工程を順序付けることができる。このような順序付けは、ＤＮＡに由来する断片対ＲＮＡに由来する断片のタグ付けを可能にし得る。
【0374】
活性化可能なＢＬＴは、固体支持体（例えば、ビーズ）上に固定化されたトランスポソームとともに、本明細書に記載される任意の方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、活性化可能なＢＬＴは、ＤＮＡ－ＢＬＴ又はＲＮＡ－ＢＬＴである。
【0375】
いくつかの実施形態では、活性化可能なＲＮＡ ＢＬＴは、ＲＮＡを捕捉し、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を調製し、次いで、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖をタグメンテーションするためのものである。いくつかの実施形態では、活性化可能なＢＬＴは、ｍＲＮＡを捕捉するための固定化ポリＴ配列を含む。
【0376】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、捕捉オリゴヌクレオチド及び固定化オリゴヌクレオチドを含み、固定化オリゴヌクレオチドは、トランスポソーム複合体に含まれる第２のトランスポゾンに含まれるハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするための配列を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、ビーズコード及び／又は１つ以上のアダプター配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ビーズは、ビーズのプールに含まれ、各ビーズは、プール中の他のビーズに含まれる固定化オリゴヌクレオチドに含まれるビーズコードと比較して、異なるビーズコードを含む固定化オリゴヌクレオチドを含む。
【0377】
いくつかの実施形態では、活性化可能なＢＬＴは、溶液からトランスポソームを捕捉することができる固定化オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能なＢＬＴは、トランスポソーム複合体に含まれるトランスポゾンに結合することができるハイブリダイゼーション配列を含む固定化オリゴヌクレオチドを含む。
【0378】
いくつかの実施形態では、溶液からトランスポソームを捕捉することができる固定化オリゴヌクレオチドは、アダプター配列（Ｐ５若しくはＰ７、又はそれらの相補体など）、ビーズバーコード、及びトランスポソーム複合体の第２のトランスポゾンに含まれる配列にハイブリダイズするための配列を含む。図６～図７の代表例に示されるように、固定化オリゴヌクレオチドは、Ｐ５、ビーズバーコード（bead barcode、ＢＣ）、及び第２のトランスポゾンに含まれる配列（Ａ’）にハイブリダイズするための配列（短Ａ）を含み得る（第２のトランスポゾンはＡ’－ＭＥ’を含む）。固定化オリゴヌクレオチドはまた、配列決定アダプター配列（例えば、Ａ１４若しくはＢ１５、又はそれらの相補体など）を含み得る。このようにして、使用者はｍＲＮＡを捕捉し、ビーズ上にＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を調製し、次いで、トランスポソームをビーズにハイブリダイズして、同じビーズ上にｃＤＮＡ断片を調製することができる。活性化可能なＢＬＴの使用は、使用者が、ＤＮＡ断片調製する前に、完全長ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を調製することができることを意味する。このようにして、部分ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片化は、使用者がＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の条件を最適化することができ、ｃＤＮＡの第１の鎖の合成が完了する前に始まる断片化についての懸念を有さないため、回避され得る。
【0379】
いくつかの実施形態では、活性化可能なＲＮＡ－ＢＬＴは、ｍＲＮＡを捕捉するための固定化ポリＴ配列と、溶液からトランスポソームを捕捉するための固定化オリゴヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、そのような活性化可能なＢＬＴは、ｍＲＮＡを捕捉し、ビーズ上のＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の調製を可能にすることができ、その後、トランスポソームは、固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得、タグメンテーションを可能にすることができる。いくつかの実施形態では、１つの種類のトランスポソームのみが固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、したがって、ＢＬＴ上での対称タグメンテーションを可能にする。
【0380】
２．対称タグメンテーションのためのＢＬＴ
いくつかの実施形態では、全てのトランスポソーム複合体は、同じ配列決定アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、全てのトランスポソーム複合体に含まれる第１のトランスポゾンは同一である。いくつかの実施形態では、ビーズ上（ＤＮＡ－ＢＬＴ又はＲＮＡ－ＢＬＴ上など）に固定化された全てのトランスポソーム複合体は、同じ第１及び第２のトランスポゾンを含む。同じアダプター配列を断片の両方の末端に付加され得るこのようなトランスポソーム複合体の使用は、これらのトランスポソーム複合体が、タグメンテーションによって生成される二本鎖断片の両方の鎖の５’末端に付加されている同じアダプターをもたらすため、「対称タグメンテーション」と称され得る。
いくつかの実施形態では、全てのトランスポソーム複合体は、同じ配列決定アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、全てのトランスポソーム複合体に含まれる第１のトランスポゾンは同一である。いくつかの実施形態では、ビーズ上（ＤＮＡ－ＢＬＴ又はＲＮＡ－ＢＬＴ上など）に固定化された全てのトランスポソーム複合体は、同じ第１及び第２のトランスポゾンを含む。同じアダプター配列を断片の両方の末端に付加され得るこのようなトランスポソーム複合体の使用は、これらのトランスポソーム複合体が、タグメンテーションによって生成される二本鎖断片の両方の鎖の５’末端に付加されている同じアダプターをもたらすため、「対称タグメンテーション」と称され得る。
【0381】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化することは、同じアダプター配列を含む第１のトランスポゾンを含むトランスポソーム複合体を用いて行われる。いくつかの実施形態では、全てのトランスポソーム複合体は同一である。
【0382】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列決定ライブラリを調製するためのＢＬＴは、同じ１つ以上のアダプター配列を含むトランスポソーム複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＢＬＴのプールに含まれる全てのトランスポソーム複合体中のトランスポゾンは同一である。いくつかの実施形態では、同じ１つ以上のアダプター配列を含むＢＬＴは、二本鎖ｃＤＮＡ断片の両方の末端が同じアダプター配列でタグ付けされていることを意味する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の二本鎖ｃＤＮＡ断片の両方の５’末端は、同じ１つ以上のアダプターを組み込む。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡの両方の末端は、同じ５’タグを含む。
【0383】
いくつかの実施形態では、対称タグメンテーション工程を使用する方法は、２つ以上の種類のトランスポソーム複合体がタグメンテーションに使用される標準的な非対称タグメンテーション工程と比較して、配列決定可能な断片（すなわち、断片の各末端に異なる配列決定アダプター配列を有する各断片）の収量を増加させる。対照及び非対照タグ付き産物（Ａ－Ａ、Ｂ－Ｂ、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ａ）が産生されるが、Ａ－Ｂ及びＢ－Ａのみがその後の増幅及び配列決定に好適であるため、異なるタグ（第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターなど、Ａ及びＢ）を有する２つの種類のトランスポソームを使用する非対照タグメンテーションは、増幅されたタグメンテーション産物からのほぼ半分のリードの損失を引き起こす。対照的に、対称タグメンテーションのためのＢＬＴを用いる現在のものは、得られた断片が第１のリード及び第２のリード配列決定アダプターの両方を含む確率を増加させることができる。
【0384】
いくつかの実施形態では、対称タグメンテーションを使用する方法は、他のライブラリ調製方法と比較して、ライブラリの収量を増加させ得る。
【0385】
タグメンテーション後に第２のアダプターを付加するためのいくつかの異なる方法が本明細書に記載される。例えば、第１の配列決定アダプターは、タグメンテーション中に二本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に組み込まれ得、第２のリード配列決定アダプターは後の工程で組み込まれる（ライゲーションなどによって）。例示的な方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本方法は、対称タグメンテーションにより１つの配列決定アダプター配列を組み込み、第２の配列決定アダプター配列を含むプライマー又はオリゴヌクレオチドの使用を介して別の配列決定アダプター配列を組み込むことによって、（非対称タグメンテーションを使用する方法と比較して）ライブラリ収量を改善することができる。
【0386】
３．非対称タグメンテーションのためのＢＬＴ
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化することは、２つの異なるトランスポソーム複合体を用いて行われ、異なるトランスポソーム複合体は、異なるアダプター配列を含む第１のトランスポゾンを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化することは、２つの異なるトランスポソーム複合体を用いて行われ、異なるトランスポソーム複合体は、異なるアダプター配列を含む第１のトランスポゾンを含む。
【0387】
異なるトランスポソーム複合体が異なるアダプター配列を含む第１のトランスポゾンを含む２つの異なるトランスポソーム複合体の使用は、これらのトランスポソーム複合体が、タグメンテーションによって生成される二本鎖断片の２つの鎖の５’末端に付加されている異なるアダプターをもたらし得るため、「非対称タグメンテーション」と称され得る。いくつかの実施形態では、非対称タグメンテーションは、タグメンテーション工程中に２つの異なるアダプターを組み込むことによって、より速い又はより容易なワークフローを可能にすることができる。
【0388】
いくつかの実施形態では、少なくともいくつかの断片は、非対照タグメンテーションを使用して、一方の鎖の５’末端において第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端において第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる。
【0389】
４．捕捉オリゴヌクレオチドを含むＢＬＴ
いくつかの実施形態では、固体支持体は、トランスポソーム及び捕捉オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは、捕捉オリゴヌクレオチドと、トランスポソームに含まれ得る第１のポリヌクレオチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、トランスポソーム及び捕捉オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは、捕捉オリゴヌクレオチドと、トランスポソームに含まれ得る第１のポリヌクレオチドと、を含む。
【0390】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ビーズコードを更に含む。いくつかの実施形態では、ビーズは、ビーズのプールに含まれ、各ビーズは、プール中の他のビーズに含まれるビーズコードと比較して、異なるビーズコードを含む固定化された第１のポリヌクレオチドを含む。
【0391】
いくつかの実施形態では、ＢＬＴは、捕捉オリゴヌクレオチドを更に含み、そのようなビーズは、ＲＮＡを捕捉し、続いて、ｃＤＮＡの第１の鎖を調製して、固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖及びビーズを生成し、最終的にＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から固定化された断片を調製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列であり、ビーズは、ｍＲＮＡを捕捉するために使用される同じビーズ上でのライブラリの調製を可能にする。これらの実施形態のいずれかにおいて、ｃＤＮＡの第２の鎖はまた、二本鎖ｃＤＮＡを調製するためにｍＲＮＡの捕捉後に調製され得る。
【0392】
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドを含むＢＬＴは、トランスポソーム複合体にハイブリダイズするために使用され得るハイブリダイゼーション配列を含む固定化オリゴヌクレオチドを含む活性化可能なＢＬＴである。
【0393】
図１１Ａ～図１１Ｃは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の調製（図１１Ａ）、トランスポソーム複合体の生成のためのハイブリダイゼーション配列を含む固定化オリゴヌクレオチドへのトランスポゾンのハイブリダイゼーション（図１１Ｂ）、及びトランスポソーム複合体によって媒介される複数のタグメンテーション反応（図１１Ｃ）を示す。タグメンテーションによる複数の断片の調製後、本明細書に記載される方法（対称タグメンテーション後のプライマー伸長など）を使用して、追加のアダプターを組み込み、配列決定可能な断片を調製することができる。
【0394】
図１２は、複数の捕捉オリゴヌクレオチド及びトランスポソームを固定化する複数の固定化オリゴヌクレオチドを有する完全長ｍＲＮＡ調製物のためのビーズを示す。図１３は、どのようにして複数のトランスポソームがｍＲＮＡから生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の完全長ＤＮＡからの断片の調製を可能にすることができるかを示す。
【0395】
Ｈ．ＢＬＴによる配列決定のための表面へのライブラリ断片の送達
いくつかの実施形態では、固定化ライブラリ断片を有する固体支持体は、配列決定のために、ライブラリ断片を表面に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、配列決定のための表面は、フローセルである。図９及び図１０は、タグメンテーション及びライブラリ調製がＢＬＴ上でどのように行われ得、その後、フローセル又はチューブ中で断片が放出され得るかを要約する。図９は、完全長ｍＲＮＡからライブラリを調製するためにポリＴプライマーを使用し、一方で、図１０は、ライブラリ完全長全ＲＮＡを調製するためにランダムプライマーを使用する。
いくつかの実施形態では、固定化ライブラリ断片を有する固体支持体は、配列決定のために、ライブラリ断片を表面に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、配列決定のための表面は、フローセルである。図９及び図１０は、タグメンテーション及びライブラリ調製がＢＬＴ上でどのように行われ得、その後、フローセル又はチューブ中で断片が放出され得るかを要約する。図９は、完全長ｍＲＮＡからライブラリを調製するためにポリＴプライマーを使用し、一方で、図１０は、ライブラリ完全長全ＲＮＡを調製するためにランダムプライマーを使用する。
【0396】
いくつかの実施形態では、固体支持体上の断片のライブラリは、配列決定のために表面に送達され、一方で、断片は、固体支持体上に固定され、次いで、断片は、配列決定のために表面に放出及び捕捉される。いくつかの実施形態では、固定化された核酸を有する固体支持体は、配列決定のために表面に送達され、固定化された断片のライブラリは、タグメンテーションによって固体支持体上に生成され、次いで、断片は、配列決定のために表面上に放出及び捕捉される。
【0397】
いくつかの実施形態では、方法は、送達の後に、配列決定のために表面上のＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを用いて固体支持体を捕捉することと、固体支持体から固定化断片を放出することと、配列決定のために、表面上に断片を捕捉することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、配列決定のために表面上の断片を配列決定することを更に含む。
【0398】
いくつかの実施形態では、ＢＬＴは、固相担体として使用され得る。固相担体としてのＢＬＴの例示的な使用は、国際公開第２０１５／０９５２２６号に記載されており、これはその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＢＬＴから放出された断片は、配列決定のためにビーズが表面上に捕捉された部位に近接する表面の領域上に再捕捉され得る。このようにして、所定のビーズからの全ての断片は、配列決定のために表面に近接して捕捉される。
【0399】
いくつかの実施形態では、固定化ライブラリ断片を有するＢＬＴは、配列決定のために表面に送達され得る。いくつかの実施形態では、ＢＬＴの表面上のＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴが配列決定のために表面に送達される前に既にタグメンテーションされていてもよい。例えば、ＢＬＴに対するタグメンテーションは、反応容器内で起こり得、次に、ＢＬＴはフローセルに送達され、次いで、断片はフローセル上で放出及び捕捉される。
【0400】
いくつかの実施形態では、固定化された核酸を有するＢＬＴは、配列決定のために表面に送達され得る。この送達の後、ライブラリ断片が生成され得る。例えば、二本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴの表面に固定化され得、タグメンテーションは、ＢＬＴが配列決定のために表面に送達された後に生じる。例えば、ＢＬＴに対するタグメンテーションは、フローセルを用いて生じ得、その後、断片はフローセル上で放出及び捕捉される。
【0401】
ＢＬＴからの断片の放出は、いくつかの方法によって生じ得る。例えば、断片は、プロテアーゼ又はＳＤＳ処理によって放出され得る。代替的に、断片は、ＢＬＴから断片を放出するビーズの破壊によって産生され得る。断片を放出するためのこれらの機構のうちのいずれかにおいて、所与のビーズからの断片は、元のＤＮＡ又はＲＮＡ分子の配列の物理的マップを調製するのを助けるために、近接した配列決定のための表面（フローセルなど）上に放出及び捕捉され得る。
【0402】
いくつかの実施形態では、ＢＬＴは、ヒドロゲルビーズを含み得る。いくつかの実施形態では、それらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０２８０４７号及び同第２０１９／０２８１６６号に開示されている方法など、ヒドロゲルビーズを融解又は溶解して、ビーズに結合した断片を放出することができる。
【0403】
いくつかの実施形態では、ＢＬＴは、分解性ポリエステルビーズを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、その全体が本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０４０６１２号に開示されている方法など、ビーズに結合した断片を放出するために分解することができる。例えば、各トランスポソーム複合体は、ポリヌクレオチドの別の薬剤への結合を可能にするポリヌクレオチド結合部分を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、ビーズ結合部分を含むビーズにポリヌクレオチドを結合するように機能する。いくつかの実施形態では、各ビーズ結合部分は、リンカーを介してポリエステルビーズに共有結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を含む。
【0404】
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、５０℃超、６０℃超、７０℃超、又は８０℃超の温度で分解される。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、６０℃の温度で分解される。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、水性塩基によって分解される。いくつかの実施形態では、水性塩基は、ＮａＯＨである。いくつかの実施形態では、ＮａＯＨは、１Ｍ～５Ｍ ＮａＯＨである。いくつかの実施形態では、ＮａＯＨは、３Ｍ ＮａＯＨである（Ｙｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ｂ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒ８７（２）：５６２－９（２００８）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、５０℃～９０℃の温度でＮａＯＨ水溶液によって分解される。
【0405】
いくつかの実施形態では、固定化された核酸又はその断片を有するＢＬＴは、重力沈降によって、配列決定のために表面と接触させることができる。いくつかの実施形態では、固定化された核酸又はその断片を有するＢＬＴは、レセプター及びリガンドを使用して、配列決定のために表面に結合され得る。
【0406】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡから生成されたＤＮＡ又はｃＤＮＡからの全ての断片が同じビーズ上で生成されるため、近接度データは、断片に関する配列決定データと一緒に使用されて、試料中に含まれていた所与のＤＮＡ又はＲＮＡに関する情報を生成することができる。固定化ポリヌクレオチドの物理的マップを調製するための近接度データの使用は、本明細書に記載される方法を使用して行われ得る。
【0407】
Ｉ．ＢＬＴに対する対称タグメンテーション後のプライマー伸長
いくつかの実施形態では、ＢＬＴに対する対称タグメンテーションは、同じ１つ以上のアダプター配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片の両方の末端をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＢＬＴに対する対称タグメンテーションは、同じ１つ以上のアダプター配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片の両方の末端をもたらす。
【0408】
いくつかの実施形態では、（第２のトランスポゾンからの）非転移ＭＥ’配列は、タグメンテーション後にＰＣＲ伸長によって融解され、ギャップ充填される。いくつかの実施形態では、ＭＥ’配列は、反応の温度を上昇させることによって除去される。
【0409】
いくつかの実施形態では、ギャップ充填は、非転移ＭＥ’配列が除去された後に行われる。いくつかの実施形態では、プライマーは、ギャップ充填されたＭＥ’配列にアニーリングされる。いくつかの実施形態では、このプライマーは、伸長のために使用され、伸長プライマーと称され得る。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、ＭＥ配列を含む。いくつかの実施形態では、伸長プライマーに含まれるＭＥ配列は、ギャップ充填されたＭＥ’配列にハイブリダイズする。
【0410】
いくつかの実施形態では、伸長プライマーはまた、配列決定アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、伸長プライマーに含まれる配列アダプター配列は、トランスポソーム複合体に含まれなかった。いくつかの実施形態では、伸長プライマーによる伸長は、二本鎖断片の各末端に異なる配列決定アダプター配列を含む断片を生成する。
【0411】
いくつかの実施形態では、ウラシル不耐性ＤＮＡは、プライマー伸長に使用される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの第２の鎖は、上に記載される鎖特異的ｃＤＮＡ調製物に基づいて、それがウラシルを含むため伸長されない。
【0412】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体がＡ１４配列（又はその相補体）を含む場合、伸長プライマーは、Ｂ１５（又はその相補体）を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体がＢ１５配列（又はその相補体）を含む場合、伸長プライマーは、Ａ１４（又はその相補体）を含む。これらの代表的な例では、Ａ１４及び１５は、例示的な配列決定アダプター配列を表すのみであり、本方法は、このようなアダプター配列に限定されない。目的の対になったアダプター配列の任意のセットは、トランスポソーム複合体及び伸長プライマーにおいて使用され得、当業者は、配列決定が異なるプラットフォーム上でどのように行われるか、及びそのようなプラットフォームが経時的に進化し得ることを十分に承知している。
【0413】
１．合成ＤＮＡによるＤＮＡ ＢＬＴの飽和
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ特異的バーコードを含む断片を生成するためにタグメンテーションを行うためにＤＮＡ ＢＬＴ（いくつかの方法において第１の固体支持体として使用され得るものなど）が使用された後、ＤＮＡ ＢＬＴは、合成二本鎖ＤＮＡと結合される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ ＢＬＴは、合成二本鎖ＤＮＡで飽和される。いくつかの実施形態では、方法は、第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後に、合成二本鎖ＤＮＡを第１の固体支持体に付加することを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ特異的バーコードを含む断片を生成するためにタグメンテーションを行うためにＤＮＡ ＢＬＴ（いくつかの方法において第１の固体支持体として使用され得るものなど）が使用された後、ＤＮＡ ＢＬＴは、合成二本鎖ＤＮＡと結合される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ ＢＬＴは、合成二本鎖ＤＮＡで飽和される。いくつかの実施形態では、方法は、第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後に、合成二本鎖ＤＮＡを第１の固体支持体に付加することを含む。
【0414】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ ＢＬＴは、この飽和後に核酸に結合（及びタグメンテーション）することができない。ＤＮＡ ＢＬＴのこのような飽和は、第２の固体支持体上でタグメンテーションを行うために、ＲＮＡからのｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のいずれかを次に生成する段階的方法を可能にし得る。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、飽和ＤＮＡ ＢＬＴによってタグメンテーションされ得ない。代わりに、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、第２の固体支持体（すなわち、ＲＮＡ ＢＬＴ）上でタグメンテーションされ得、ＲＮＡ特異的バーコードでタグ付けされるｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から断片が生成されることを可能にする。いくつかの実施形態では、合成二本鎖ＤＮＡは、ウラシルを含み、それは、ある特定のハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼによるタグ付き断片の増幅を遮断する。
【0415】
いくつかの実施形態では、合成二本鎖ＤＮＡによるＤＮＡ ＢＬＴの飽和は、単一の反応容器中で完了され得る方法を可能にし得る。いくつかの実施形態では、合成二本鎖ＤＮＡによるＤＮＡ ＢＬＴの飽和は、試料からＤＮＡをタグメンテーションした後にＤＮＡ ＢＬＴを分割する必要性をなくす。
【0416】
Ｊ．タグ並びにＤＮＡ特異的バーコード及びＲＮＡ特異的バーコード
本明細書で使用する場合、用語「タグ」及び「タグドメイン」は、所望の意図された目的又は用途のための配列を示すポリヌクレオチドの部分又はドメインを指す。本明細書に提示されるいくつかの実施形態は、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、タグドメインを含むタグとを有するポリヌクレオチドを含むトランスポソーム複合体を含む。タグドメインは、任意の所望の目的のために提供される任意の配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、タグドメインは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、クラスタ増幅反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、配列決定反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。任意の他の好適な特徴がタグドメインに組み込まれ得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５ｂｐ～２００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、１０ｂｐ～１００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、２０ｂｐ～５０ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ｂｐの長さを有する配列を含む。
本明細書で使用する場合、用語「タグ」及び「タグドメイン」は、所望の意図された目的又は用途のための配列を示すポリヌクレオチドの部分又はドメインを指す。本明細書に提示されるいくつかの実施形態は、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、タグドメインを含むタグとを有するポリヌクレオチドを含むトランスポソーム複合体を含む。タグドメインは、任意の所望の目的のために提供される任意の配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、タグドメインは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、クラスタ増幅反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、配列決定反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。任意の他の好適な特徴がタグドメインに組み込まれ得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５ｂｐ～２００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、１０ｂｐ～１００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、２０ｂｐ～５０ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ｂｐの長さを有する配列を含む。
【0417】
タグは、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列又は構成要素（例えば、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサ領域、又はインデックスタグ配列）を含み得る。
【0418】
いくつかの実施形態では、第１のタグの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、同じタグドメインを含む。いくつかの実施形態では、タグは、クラスタ増幅のための領域を含む。いくつかの実施形態では、タグは、配列決定反応をプライミングするための領域を含む。
【0419】
いくつかの実施形態では、方法は、ポリメラーゼと、第１のポリヌクレオチドの部分に対応する増幅プライマーとを反応させることによって、固体支持体上の断片を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドの部分は、増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドの第１のタグは、増幅プライマーを含む。
【0420】
いくつかの実施形態では、個々のビーズ上のトランスポソームは、固有のインデックスを保持し、多数のそのようなインデックス付きビーズが用いられる場合、位相化された転写物が生じる。ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料とともに使用するためのいくつかの実施形態では、ＲＮＡ ＢＬＴは、ＲＮＡ ＢＬＴ（「ｉＲＮＡ」）を同定するためのインデックスであるタグを含む。ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料とともに使用するためのいくつかの実施形態では、ＤＮＡ ＢＬＴは、ＤＮＡ ＢＬＴ（「ｉＤＮＡ」）を同定するためのインデックスであるタグを含む。ＲＮＡ ＢＬＴを同定するためのインデックスは、「ＲＮＡ特異的バーコード」と称され得、ＤＮＡ ＢＬＴを同定するための指標は、「ＤＮＡ特異的バーコード」と称され得る。ＤＮＡ ＢＬＴ及びＲＮＡ ＢＬＴを使用する例示的な方法を図２１～図２５に示す。
【0421】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１のタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２のタグを含む。
【0422】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のタグは、Ａ１４プライマー配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のタグは、Ｂ１５プライマー配列を含む。
【0423】
いくつかの実施形態では、タグメンテーション中に組み込まれるタグは、アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、タグメンテーション中に、第１鎖ｃＤＮＡ合成中に、又はタグメンテーション後にプライマーを介して付加されてもよい。
【0424】
いくつかの実施形態では、アダプター配列は、プライマー配列、インデックスタグ配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、若しくは配列決定関連配列、又はそれらの組み合わせを含む。本明細書で使用される場合、配列決定関連配列は、後の配列決定工程に関連する任意の配列であり得る。配列決定関連配列は、下流の配列決定工程を単純化するように作用し得る。例えば、配列決定関連配列は、他の点でアダプターを核酸断片にライゲーションする工程を介して組み込まれる配列であり得る。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、ある特定の配列決定方法においてフローセルへの結合を容易にするために、Ｐ５又はＰ７配列（又はそれらの相補体）を含む。本開示は、使用することができるアダプター配列の種類に限定されず、当業者であれば、ライブラリ調製及び次世代配列決定に使用することができる追加の配列を認識するであろう。
【0425】
いくつかの実施形態では、第１のリード配列決定アダプター配列は、タグメンテーション中に組み込まれ、第２のリード配列決定アダプター配列は、タグメンテーション後にプライマーを介して組み込まれる。異なる配列決定プロトコルは、異なる「第１のリード配列決定アダプター」及び「第２のリード配列決定アダプター」を使用し、これらのアダプターは、製造業者及び機器によって異なる。言い換えれば、配列決定リードの順序及び同一性は、所与の配列決定方法に対して任意である。したがって、本明細書で使用される「第１のリード」及び「第２のリード」配列決定アダプターは、単に２つのリード配列決定アダプターの存在を必要とし、それらは、配列決定ライブラリの調製後の任意の下流配列決定方法において、第１の配列決定リード対第２の配列決定リードに対して特定のアダプターが使用されなければならないことを必要としない。当業者は、「第２のリード」配列決定アダプターを用いて下流配列決定反応を最初に実行することを選択することができ、次いで、そのように選択する場合、「第１のリード」配列決定アダプターを選択し得る。
【0426】
いくつかの実施形態では、第１のリード及び／又は第２のリード配列決定アダプター配列は、異なるプライマー結合部位を含む。
【0427】
Ｋ．逆転写酵素ポリメラーゼ及びｃＤＮＡ合成反応
いくつかの実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼは、ｃＤＮＡ合成のために使用される。本明細書で使用される場合、「逆転写酵素ポリメラーゼ」は、テンプレートとしてＲＮＡを使用してＤＮＡ合成を触媒し得る任意のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを指す。逆転写酵素ポリメラーゼを使用して、ＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の第１の鎖を合成することができる。いくつかの実施形態では、固定化ＲＮＡ分子は、逆転写酵素ポリメラーゼを介してＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に変換される。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼは、ｃＤＮＡ合成のために使用される。本明細書で使用される場合、「逆転写酵素ポリメラーゼ」は、テンプレートとしてＲＮＡを使用してＤＮＡ合成を触媒し得る任意のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを指す。逆転写酵素ポリメラーゼを使用して、ＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の第１の鎖を合成することができる。いくつかの実施形態では、固定化ＲＮＡ分子は、逆転写酵素ポリメラーゼを介してＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に変換される。
【0428】
いくつかの実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼは、ｃＤＮＡの一本鎖のみを生成する。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの一本鎖は、標的ＲＮＡに結合され、すなわち、標的ＲＮＡからのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するために使用される。
【0429】
いくつかの実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼは、ｃＤＮＡの２つの鎖を生成し、すなわち、逆転写酵素は、二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡを生成する。
【0430】
いくつかの実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼは、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素である。
【0431】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ合成のための試薬は、逆転写酵素、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、及び／又はＲｎａｓｅ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ランダムプライマー及びオリゴｄＴプライマーの両方は、ｃＤＮＡ合成反応において使用される。
【0432】
いくつかの実施形態では、逆転写は、ＲＮＡがビーズ上に固定化された（すなわち、捕捉された）後に行われる。いくつかの実施形態では、逆転写は、溶液中で行われる。
【0433】
１．鋳型スイッチングを使用するｃＤＮＡの調製
いくつかの実施形態では（図１６など）、ＲＮＡからの二本鎖ｃＤＮＡの調製は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０４０３０６号、同第２０１５／１６８１６１号、及び同第２０１０／１１７６２０号に記載されるように、鋳型スイッチングによって行われる。要するに、オリゴ（ｄＴ）及び／又はランダマープライマーは、第１の鎖ｃＤＮＡ合成反応をプライミングする。逆転写酵素（ＳＭＡＲＴＳＣＲＩＢＥ（商標）など）がｍＲＮＡの５’末端に到達すると、この酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡの３’末端にいくつかの更なる非鋳型ヌクレオチドを付加する。この非鋳型ヌクレオチドストレッチと塩基対を形成するように設計された鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（template-switch oligonucleotide、ＴＳＯ）は、アニーリングし、伸長鋳型を作製して、逆転写酵素がオリゴヌクレオチドの末端まで複製し続けることを可能にする。
いくつかの実施形態では（図１６など）、ＲＮＡからの二本鎖ｃＤＮＡの調製は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０４０３０６号、同第２０１５／１６８１６１号、及び同第２０１０／１１７６２０号に記載されるように、鋳型スイッチングによって行われる。要するに、オリゴ（ｄＴ）及び／又はランダマープライマーは、第１の鎖ｃＤＮＡ合成反応をプライミングする。逆転写酵素（ＳＭＡＲＴＳＣＲＩＢＥ（商標）など）がｍＲＮＡの５’末端に到達すると、この酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡの３’末端にいくつかの更なる非鋳型ヌクレオチドを付加する。この非鋳型ヌクレオチドストレッチと塩基対を形成するように設計された鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（template-switch oligonucleotide、ＴＳＯ）は、アニーリングし、伸長鋳型を作製して、逆転写酵素がオリゴヌクレオチドの末端まで複製し続けることを可能にする。
【0434】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの第２の鎖は、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドプライマー（ＴＳＯプライマー）を使用して合成される。いくつかの実施形態では、ＴＳＯプライマーは、第２の増幅プライマー結合部位を更に含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーは、ｍＲＮＡ鋳型を越えて伸長され、ＴＳＯプライマー鎖を更にコピーする。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの第２の鎖は、ＴＳＯプライマーを使用して合成される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの第２の鎖は、相補的ＴＳＯ鎖を包含するようにｍＲＮＡ鋳型を越えて伸長されるｃＤＮＡの第１の鎖に対して相補的である第２の増幅プライマーを使用して合成される。
【0435】
鋳型スイッチオリゴヌクレオチド及び適合性逆転写酵素を使用する例示的なシステムは、ＳＭＲＴ－ｓｅｑ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）である。
【0436】
２．鎖ｃＤＮＡの調製
配列決定データがライブラリ断片の起源であったｍＲＮＡ鎖を同定することを可能にする様々な方法が、当該技術分野で既知である。そのような「鎖」法の使用は、使用者が、ｃＤＮＡの第１の鎖の配列を使用して（ｃＤＮＡの第２の鎖からのデータを混乱させることなく）元のｍＲＮＡ鎖の配列を決定することを可能にし得る。
配列決定データがライブラリ断片の起源であったｍＲＮＡ鎖を同定することを可能にする様々な方法が、当該技術分野で既知である。そのような「鎖」法の使用は、使用者が、ｃＤＮＡの第１の鎖の配列を使用して（ｃＤＮＡの第２の鎖からのデータを混乱させることなく）元のｍＲＮＡ鎖の配列を決定することを可能にし得る。
【0437】
鎖ｃＤＮＡ調製の例示的な方法は、「ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ，」Ｉｌｌｕｍｉｎａ，２０１７に概説されている。ｍＲＮＡは、ＲＮＡ依存性合成を可能にし、かつ望ましくないＤＮＡ依存性合成を防止する第１の鎖合成アクチノマイシンミックスにおいて逆転写酵素を使用してｃＤＮＡの第１の鎖にコピーされる。第１の鎖合成アクチノマイシンミックスは、ｃＤＮＡの第１の鎖を生成するときに鎖特異性を改善することができる。第２の鎖ｃＤＮＡ合成は、第２の鎖マーキングミックス中でＤＮＡポリメラーゼＩ及びＲＮａｓｅ Ｈを使用して行われ、ｄＴＴＰは、ｄＵＴＰによって置き換えられている。ｃＤＮＡの第２の鎖へのｄＵＴＰの組み込みは、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼが使用される場合、この鎖の増幅をクエンチし得る（以下の増幅の説明において記載される）。
【0438】
いくつかの実施形態では、第１の鎖ｃＤＮＡ合成のための組成物中に含まれるヌクレオシド三リン酸は、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰを含む。
【0439】
いくつかの実施形態では、ｄＴＴＰは、鎖特異性のために第２の鎖ｃＤＮＡ合成反応においてｄＵＴＰで置き換えられる。いくつかの実施形態では、第２の鎖ｃＤＮＡ合成のための組成物は、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの第２の鎖におけるｄＵＴＰの組み込みは、ライブラリ調製の間のインデックスＰＣＲ反応におけるｃＤＮＡの第２の鎖の増幅を抑制する。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの第２の鎖の増幅の抑制は、鎖特異的方法を可能にする。
【0440】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ調製は、ｍＲＮＡからの鎖情報を保持する非ストランド法によるものである。
【0441】
Ｌ．鎖交換及びギャップ充填ライゲーション
固定化トランスポソームによるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片化後、鎖置換ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔポリメラーゼ）を使用して、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片のＲＮＡ鎖を置換し、第２のｃＤＮＡ鎖を生成することができる。いくつかの実施形態では、鎖交換は、二本鎖ＤＮＡ断片を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、鎖交換工程は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から断片のＲＮＡ鎖を除去し、ＲＮＡをＤＮＡの第２の鎖で置き換える。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼを介した鎖交換は、二本鎖ＤＮＡ断片中のＤＮＡ：ＲＮＡを含む断片を変換する。
固定化トランスポソームによるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片化後、鎖置換ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔポリメラーゼ）を使用して、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片のＲＮＡ鎖を置換し、第２のｃＤＮＡ鎖を生成することができる。いくつかの実施形態では、鎖交換は、二本鎖ＤＮＡ断片を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、鎖交換工程は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から断片のＲＮＡ鎖を除去し、ＲＮＡをＤＮＡの第２の鎖で置き換える。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼを介した鎖交換は、二本鎖ＤＮＡ断片中のＤＮＡ：ＲＮＡを含む断片を変換する。
【0442】
いくつかの実施形態では、転位事象後に残ったＤＮＡ配列中のギャップはまた、鎖置換伸長反応を使用することにおいて充填され得、そのようなものはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰ混合物を含む。いくつかの実施形態では、ギャップ充填ライゲーションは、伸長－ライゲーション混合緩衝液を使用して行われる。
【0443】
次いで、二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリは、任意選択で増幅され得（クラスタ増幅を用いてなど）、配列決定プライマーを用いて配列決定され得る。
【0444】
Ｍ．増幅
本開示は更に、本明細書に提供される方法に従って産生される固定化ＤＮＡ断片の増幅に関する。表面結合トランスポソームによって産生される固定化ＤＮＡ断片は、当該技術分野で既知の任意の好適な増幅方法論に従って増幅され得る。いくつかの実施形態では、固定化されたＤＮＡ断片は、固体支持体上で増幅される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面結合タグメンテーションが起こる同じ固体支持体である。このような実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、試料調製物が、最初の試料導入工程から、増幅まで、及び任意選択的に配列決定工程まで、同じ固体支持体上で進行することを可能にする。
本開示は更に、本明細書に提供される方法に従って産生される固定化ＤＮＡ断片の増幅に関する。表面結合トランスポソームによって産生される固定化ＤＮＡ断片は、当該技術分野で既知の任意の好適な増幅方法論に従って増幅され得る。いくつかの実施形態では、固定化されたＤＮＡ断片は、固体支持体上で増幅される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面結合タグメンテーションが起こる同じ固体支持体である。このような実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、試料調製物が、最初の試料導入工程から、増幅まで、及び任意選択的に配列決定工程まで、同じ固体支持体上で進行することを可能にする。
【0445】
例えば、いくつかの実施形態では、固定化ＤＮＡ断片は、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、クラスタ増幅方法論を使用して増幅され、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている材料は、固定化された核酸分子のクラスタ又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体上に固定化することを可能にする固相核酸増幅の方法を記載する。そのようなアレイ上の各クラスタ又はコロニーは、複数の同一の固定化されたポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化された相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスタ化アレイ」と称される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に記載されているような固相増幅反応の産物は、固定化されたポリポリヌクレオチド鎖と固定化された相補鎖の対をアニーリングすることによって形成されるいわゆる「ブリッジ（bridged）」構造体であり、両方の鎖は、いくつかの実施形態では、共有結合を介して、５’末端で固体支持体上に固定化されている。クラスタ増幅方法論は、固定化された核酸鋳型を使用して固定化されたアンプリコンを産生する方法の例である。他の好適な方法論を使用して、本明細書で提供される方法に従って産生された固定化されたＤＮＡ断片から固定化されたアンプリコンを産生することもできる。例えば、１つ以上のクラスタ又はコロニーは、増幅プライマーの各対の一方又は両方のプライマーが固定化されているかどうかにかかわらず、固相ＰＣＲによって形成することができる。
【0446】
他の実施形態では、固定化ＤＮＡ断片は、溶液中で増幅される。例えば、いくつかの実施形態では、固定化ＤＮＡ断片は、切断されるか、又はそうでなければ固体支持体から遊離され、次いで、増幅プライマーは、溶液中で遊離分子にハイブリダイズされる。他の実施形態では、増幅プライマーを、１つ以上の初期の増幅工程のために固定化されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、その後溶液中での後続の増幅工程を行う。したがって、いくつかの実施形態では、固定化された核酸鋳型を使用して、液相アンプリコンを産生することができる。
【0447】
本明細書に記載されるか、又は当該技術分野において一般に既知である増幅方法論のいずれも、固定化ＤＮＡ断片を増幅するために、ユニバーサル又は標的特異的プライマーとともに利用され得ることを理解されたい。増幅のための好適な方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，００３，３５４号に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。上記の増幅方法を使用して、関心対象の１つ以上の核酸を増幅することができる。例えば、多重ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して、固定化ＤＮＡ断片を増幅することができる。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマーは、増幅反応に含まれる。
【0448】
ポリヌクレオチドの増幅に好適な他の方法としては、オリゴヌクレオチド伸長及びライゲーション、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８）、参照により本明細書に組み込まれる。）、及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（一般に米国特許第７，５８２，４２０号、同第５，１８５，２４３号、同第５，６７９，５２４号、及び同第５，５７３，９０７号、欧州特許第０３２０３０８（Ｂ１）号、同第０３３６７３１（Ｂ１）号、同第０４３９１８２（Ｂ１）号、国際公開第９０／０１０６９号、同第８９／１２６９６号、及び同第８９／０９８３５号、その全てが参照により組み込まれる）技術、を挙げることができる。これらの増幅方法論は、固定化ＤＮＡ断片を増幅するように設計され得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、増幅方法は、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマーを含むライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅法は、関心対象の核酸に特異的に指向されるプライマーを含有するプライマー伸長ライゲーション反応を含んでもよい。関心対象の核酸を増幅するように特別に設計することができるプライマー伸長及びライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５８２，４２０号及び同第７，６１１，８６９号に例示されるようなＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に使用されるプライマーを含み得る。
【0449】
本開示の方法で使用され得る例示的な等温増幅法としては、例えばＤｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１－６６（２００２）により例示される多置換増幅（Multiple Displacement Amplification、ＭＤＡ）、又は例えば米国特許第６，２１４，５８７号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により例示される等温鎖置換核酸増幅が挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用され得る他の非ＰＣＲ系方法としては、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５、米国特許第５，４５５，１６６号、及び同第５，１３０，２３８号、並びにＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１－９６（１９９２）に記載されている鎖置換増幅（strand displacement amplification、ＳＤＡ）又は例えば、Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２９４－３０７（２００３）に記載されている超分枝鎖置換増幅が挙げられ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。等温増幅法は、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅のために、鎖置換Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大型断片、５’→３’エキソ－とともに使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高い加工性及び鎖置換活性を利用する。高い加工性により、ポリメラーゼは、１０～２０ｋｂの長さの断片を産生することが可能になる。上記のように、クレノウポリメラーゼなどの低いプロセッシビティと鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、等温条件下でより小さな断片を産生することができる。増幅反応、条件、及び成分の更なる説明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６７０，８１０号の開示に詳細に記載されている。
【0450】
本開示において有用な別の核酸増幅法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｏｔｈｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１３２１－２（１９９３）に記載されるように、定常５’領域の後にランダム３’領域が続く２ドメインプライマーの集団を使用するタグ付きＰＣＲである。増幅の第１のラウンドは、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて、熱変性ＤＮＡ上で多数の開始を可能にするために実施される。３’領域の性質により、開始部位は、ゲノム全体にランダムであると考えられる。その後、結合していないプライマーを除去し、定常５’領域に対して相補的であるプライマーを使用して、更なる複製を行うことができる。
【0451】
１．ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼによる増幅
いくつかの実施形態では、第１の固体支持体（ＤＮＡビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）など）上のＤＮＡに対してタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードをＤＮＡ断片に組み込んだ後、合成二本鎖ＤＮＡは、第１の固体支持体に付加される。いくつかの実施形態では、合成二本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ断片によってまだ結合されていない第１の固体支持体上の任意のトランスポソーム複合体に結合する。いくつかの実施形態では、合成二本鎖ＤＮＡは、後に増幅することができない「自殺ＤＮＡ」である。いくつかの実施形態では、合成二本鎖ＤＮＡは、ウラシルを含み、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼは、後の工程における増幅に使用される（例えば、図２７及び図２８に概説される方法を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、第１の固体支持体（ＤＮＡビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）など）上のＤＮＡに対してタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードをＤＮＡ断片に組み込んだ後、合成二本鎖ＤＮＡは、第１の固体支持体に付加される。いくつかの実施形態では、合成二本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ断片によってまだ結合されていない第１の固体支持体上の任意のトランスポソーム複合体に結合する。いくつかの実施形態では、合成二本鎖ＤＮＡは、後に増幅することができない「自殺ＤＮＡ」である。いくつかの実施形態では、合成二本鎖ＤＮＡは、ウラシルを含み、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼは、後の工程における増幅に使用される（例えば、図２７及び図２８に概説される方法を参照されたい）。
【0452】
いくつかの実施形態では、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼは、ハイフィデリティ又はプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼである。当業者は、多くのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼが、鋳型鎖中のウラシル残基を検出し、かつ更なるＤＮＡ合成を失速させる「ウラシル結合ポケット」に起因して、ウラシル含有鋳型を増幅することができないことを承知している（「Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，」Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ２０１５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼは、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ（Ｒｏｃｈｅ）又はＰｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）である。ウラシル不耐性ポリメラーゼの使用はまた、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０３６５９９号及びＭｕｌｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｎｄｅｘｉｎｇ，ｂｉｏＲｘｉｖ ｐｒｅｐｒｉｎｔ（２０２１年１月１２日に掲載されたｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０１．１１．４２５９９５で利用可能）に記載されており、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、モザイク末端配列の直後にウラシル塩基を含み、ウラシル不耐性ポリメラーゼの使用は、Ｍｕｌｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．に記載されるように、モザイク末端を越える伸長を防止する。
【0453】
同様に、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼは、ｃＤＮＡ調製のストランド法において使用され得る。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡから調製されたｃＤＮＡの第２の鎖におけるウラシルの存在は、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼが使用される場合、この第２の鎖の増幅をクエンチし得る。このようにして、増幅されたｃＤＮＡは、ｃＤＮＡの第１の鎖から生成されたものに限定され、試料中に含まれていたｍＲＮＡ鎖の同定を可能にする。
【0454】
２．選択的増幅
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ特異的バーコード及びＲＮＡ特異的バーコードは、選択的増幅を可能にする。「選択的増幅」は、試料中のＤＮＡに由来する断片（すなわち、ＤＮＡ特異的バーコードでタグ付けされた断片）の増幅、又は試料中のＲＮＡに由来する断片（すなわち、ＲＮＡ特異的バーコードでタグ付けされた断片）の増幅を指す。選択的増幅は、使用者が、ＤＮＡに由来する断片又はＲＮＡに由来する断片のみを増幅（及び潜在的に配列決定）することを可能にする。代替的に、使用者は、ＤＮＡ及びＲＮＡに由来する両方の断片を増幅することを選択し得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ特異的バーコード及びＲＮＡ特異的バーコードは、選択的増幅を可能にする。「選択的増幅」は、試料中のＤＮＡに由来する断片（すなわち、ＤＮＡ特異的バーコードでタグ付けされた断片）の増幅、又は試料中のＲＮＡに由来する断片（すなわち、ＲＮＡ特異的バーコードでタグ付けされた断片）の増幅を指す。選択的増幅は、使用者が、ＤＮＡに由来する断片又はＲＮＡに由来する断片のみを増幅（及び潜在的に配列決定）することを可能にする。代替的に、使用者は、ＤＮＡ及びＲＮＡに由来する両方の断片を増幅することを選択し得る。
【0455】
実験に対する使用者の目標に応じて、所定の試料に由来するＤＮＡ又はＲＮＡのみが目的のものであり得る。代替的に、使用者は、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を評価するために、試料のマルチオミクス分析を望む場合がある。
【0456】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ特異的バーコード及びＲＮＡ特異的バーコードは、異なるプライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ特異的バーコードに含まれるプライマー結合配列に結合するプライマーを使用して、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡ特異的バーコードに含まれるプライマー結合配列に結合するプライマーを使用して、ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ特異的バーコードに含まれるプライマー結合配列と結合するプライマーと、ＲＮＡ特異的バーコードに含まれるプライマー結合配列と結合するプライマーと、を含むプライマーミックスを使用して、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片及びＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を増幅することを更に含む。
【0457】
Ｎ．配列決定
本開示は更に、本明細書に提供される方法に従って産生される固定化ＤＮＡ断片の配列決定に関する。いくつかの実施形態では、方法は、タグ付き断片又は増幅されたタグ付き断片を配列決定することを含む。固定化ＤＮＡ断片は、試料中に含まれるｄｓＤＮＡから生成されるもの、試料中に含まれるＲＮＡから生成されるｄｓ－ｃＤＮＡ、又は試料中に含まれるＲＮＡから生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーション後の鎖交換から生成されたｄｓ－ＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、固定化ＤＮＡ断片は、配列決定後のバイオインフォマティック分解能が、試料のＤＮＡに由来する断片対試料のＲＮＡに由来する断片を区別することができるように、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードを含み得る。
本開示は更に、本明細書に提供される方法に従って産生される固定化ＤＮＡ断片の配列決定に関する。いくつかの実施形態では、方法は、タグ付き断片又は増幅されたタグ付き断片を配列決定することを含む。固定化ＤＮＡ断片は、試料中に含まれるｄｓＤＮＡから生成されるもの、試料中に含まれるＲＮＡから生成されるｄｓ－ｃＤＮＡ、又は試料中に含まれるＲＮＡから生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーション後の鎖交換から生成されたｄｓ－ＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、固定化ＤＮＡ断片は、配列決定後のバイオインフォマティック分解能が、試料のＤＮＡに由来する断片対試料のＲＮＡに由来する断片を区別することができるように、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードを含み得る。
【0458】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の断片は、鎖交換なしで直接配列決定される。
【0459】
表面結合トランスポソーム媒介タグメンテーションによって産生された固定化ＤＮＡ断片は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポア配列決定などを含む、直接配列決定などの任意の好適な配列決定方法論に従って配列決定することができる。いくつかの実施形態では、固定化ＤＮＡ断片は、固体支持体上で配列決定される。いくつかの実施形態では、配列決定のための固体支持体は、表面結合タグメンテーションが起こるものと同じ固体支持体である。いくつかの実施形態では、配列決定のための固体支持体は、増幅が起こるのと同じ固体支持体である。
【0460】
１つの例示的な配列決定方法論は、合成による配列決定（sequencing-by-synthesis、ＳＢＳ）である。ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば標的核酸又はそのアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長を監視して、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定する。基礎となる化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリマーベースのＳＢＳの実施態様では、プライマーに付加されるヌクレオチドの順序及び種類の検出を使用して鋳型の配列を決定することができるように、蛍光標識ヌクレオチドを鋳型依存的にプライマーに付加する（それによってプライマーを伸長させる）。
【0461】
フローセルは、本開示の方法によって産生された、増幅されたＤＮＡ断片を収容するための便利な固体支持体を提供する。そのようなフォーマットの１つ以上の増幅されたＤＮＡ断片は、サイクル中に試薬を繰り返し送達することを含むＳＢＳ又は他の検出技術に供することができる。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つ以上の標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、１つ以上の増幅された核酸分子を収容するフローセルに流入／通過させることができる。プライマー伸長によって標識ヌクレオチドを組み込む部位は、検出することができる。任意選択的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加されると、更なるプライマー伸長を終結する可逆的終結特性を更に含むことができる。例えば、デブロッキング作用因子が送達されてその部分を除去するまで、その後の伸長が起こらないように、可逆的ターミネータ部分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに付加することができる。したがって、可逆的終結を使用する実施形態の場合、デブロッキング試薬をフローセルに送達することができる（検出が行われる前又は後に）。洗浄は、様々な送達工程の間に実施することができる。次に、サイクルをｎ回繰り返してプライマーをｎ個のヌクレオチドで伸長し、それによって長さｎの配列を検出することができる。本開示の方法によって産生されるアンプリコンとともに使用するために容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体系及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、同第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0462】
パイロシーケンシングなどの、サイクル反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に組み込まれるときに無機ピロリン酸（inorganic pyrophosphate、ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１），８４－９（１９９６）、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１），３－１１（２００１）、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５），３６３（１９９８）、米国特許第６，２１０，８９１号、同第６，２５８，５６８号、及び同第６，２７４，３２０号、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシーケンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate、ＡＴＰ）に即座に変換されることで検出することができ、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ産生光子を介して検出することができる。したがって、配列決定反応は、発光検出システムを介して監視することができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、パイロシーケンシング手順には必要ない。本開示により産生されたアンプリコンへのパイロシーケンシングの適用に適合させることができる有用な流体システム、検出器、及び手順は、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８（Ａ１）号、米国特許第７，５９５，８８３号、及び同第７，２４４，５５９号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0463】
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer、ＦＲＥＴ）相互作用を介して、又はゼロモード導波路（zeromode waveguide、ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースの配列決定のための技術及び試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２－６８６（２００３）、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）、Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５，１１７６－１１８１（２００８）に記載され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0464】
いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器及び関連技術、又は、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２（Ａ１）号、同第２００９／０１２７５８９（Ａ１）号、同第２０１０／０１３７１４３（Ａ１）号、若しくは同第２０１０／０２８２６１７（Ａ１）号に記載されている配列決定方法及びシステムを使用することができ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。動力学的除外を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用し、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を産生することができる。
【0465】
別の有用な配列決定技術は、ナノポア配列決定である（例えば、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１４７－１５１（２０００）、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３５：８１７－８２５（２００２）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２：６１１－６１５（２００３）を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかのナノポアの実施形態では、標的核酸又は標的核酸から除去された個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸又はヌクレオチドがナノポアを通過するとき、各ヌクレオチドの種類は、ポアの電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別され得る。（米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１（２００７）、Ｈｅａｌｙ，Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９－４８１（２００７）、Ｃｏｃｋｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８－８２０（２００８）、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【0466】
本開示による検出に適用することができるアレイに基づく発現及び遺伝子型解析のための例示的な方法は、米国特許第７，５８２，４２０号、同第６，８９０，７４１号、同第６，９１３，８８４号、若しくは同第６，３５５，４３１号、又は米国特許公開第２００５／００５３９８０（Ａ１）号、同第２００９／０１８６３４９（Ａ１）号、若しくは同第２００５／０１８１４４０（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【0467】
本明細書に記載の方法の利点は、複数の標的核酸の迅速かつ効率的な検出を並行して提供することである。したがって、本開示は、上記で例示されるものなどの当該技術分野において既知の技術を使用して核酸を調製及び検出することができる統合システムを提供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬及び／又は配列決定試薬を１つ以上の固定化されたＤＮＡ断片に送達することができる流体成分を含むことができ、システムは、ポンプ、弁、リザーバ、流体ラインなどの構成要素を含む。フローセルは、標的核酸を検出するための統合システムで構成及び／又は使用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８（Ａ１）号及び米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。フローセルについて例示されるように、統合システムの流体構成要素の１つ以上を増幅方法及び検出方法に使用することができる。核酸配列決定の実施形態を一例として取ると、統合システムの流体構成要素の１つ以上を、本明細書に記載の増幅方法、及び上記に例示したような配列決定方法における配列決定試薬の送達に使用することができる。代替的に、統合システムは、増幅方法を実施し、検出方法を実施するための別々の流体システムを含み得る。増幅された核酸を作成し、また核酸の配列を決定することができる統合配列決定システムの例としては、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及び参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。
【0468】
Ｏ．固定化されたポリヌクレオチド分子の物理的マップ
また、本明細書では、固定化ポリヌクレオチドの物理的マップを生成する方法も提示される。方法は、有利には、連結された配列（すなわち、同じ標的ポリヌクレオチド分子からの第１及び第２の部分）を含む可能性が高いクラスタを同定するために利用することができる。したがって、固定化されたポリヌクレオチドから得られる任意の２つのクラスタの相対的近接度は、２つのクラスタから得られる配列情報のアラインメントに有用な情報を提供する。具体的には、固体表面上の任意の２つの所与のクラスタ間の距離は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２５２５０号により詳細に記載されるように、２つのクラスタが同じ標的ポリヌクレオチド分子に由来する確率と正に相関する。
また、本明細書では、固定化ポリヌクレオチドの物理的マップを生成する方法も提示される。方法は、有利には、連結された配列（すなわち、同じ標的ポリヌクレオチド分子からの第１及び第２の部分）を含む可能性が高いクラスタを同定するために利用することができる。したがって、固定化されたポリヌクレオチドから得られる任意の２つのクラスタの相対的近接度は、２つのクラスタから得られる配列情報のアラインメントに有用な情報を提供する。具体的には、固体表面上の任意の２つの所与のクラスタ間の距離は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２５２５０号により詳細に記載されるように、２つのクラスタが同じ標的ポリヌクレオチド分子に由来する確率と正に相関する。
【0469】
例として、いくつかの実施形態では、フローセルの表面上に広がる長いＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖分子は、その場でタグメンテーションされ、フローセルの表面を横切る接続されたＤＮＡ：ＲＮＡブリッジのラインをもたらす。更に、固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡの物理的マップは、次いで、鎖交換が固定化ＤＮＡを生成する前又は後に生成され得る。したがって、物理的マップは、固定化ＤＮＡが増幅された後のクラスタの物理的関係を相関させる。具体的には、物理的マップは、国際公開第２０１２／０２５２５０号の組み込まれた材料に記載されているように、任意の２つのクラスタから得られた配列データが連結される確率を計算する。
【0470】
いくつかの実施形態では、物理的マップは、固体表面を横切る固定化ＤＮＡ分子の位置を確立するためにＤＮＡを画像化することによって生成される。いくつかの実施形態では、固定化ＤＮＡは、イメージング剤を固体支持体に添加し、イメージング剤からシグナルを検出することによって画像化される。いくつかの実施形態では、イメージング剤は、検出可能な標識であってもよい。好適な検出可能な標識としては、プロトン、ハプテン、放射性核種、酵素、蛍光標識、化学発光標識、及び／又は発色剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、イメージング剤は、挿入色素又は非挿入ＤＮＡ結合剤である。当該技術分野において既知の任意の好適な挿入色素又は非挿入ＤＮＡ結合剤を使用することができ、これには、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２８２６１７号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0471】
いくつかの実施形態では、固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、鎖交換及びクラスタ生成の前に、更に断片化されて遊離末端を遊離させる。ブリッジ構造の切断は、国際公開第２０１２／０２５２５０号の組み込まれた材料によって例示されるように、当該技術分野において既知の任意の好適な方法論を使用して実行することができる。例えば、切断は、国際公開第２０１２／０２５２５０号に記載されているようなウラシルなどの修飾ヌクレオチドの組み込みによって、制限エンドヌクレアーゼ部位の組み込みによって又は本明細書の他の場所で説明されているように、液相トランスポソーム複合体をブリッジＤＮＡ構造に適用することによって、起こり得る。
【0472】
ある特定の実施形態では、複数のＲＮＡが、複数のナノチャネルを備えるフローセル上に流され、ナノチャネルは、それに固定化された複数のトランスポソーム複合体を有する。本明細書で使用される場合、ナノチャネルという用語は、長い線状核酸分子が流入する狭いチャネルを指す。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０ ７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００個以下、又は１０００個以下の個々の長鎖の標的ＲＮＡが、各ナノチャネルに流入する。いくつかの実施形態では、個々のナノチャネルは、標的ＲＮＡの個々の長鎖が複数のナノチャネルと相互作用することを防止する物理的バリアによって分離される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、少なくとも１０、５０、１００、２００、５００、１０００、３０００、５０００、１００００、３００００、５００００、８００００、又は１０００００個のナノチャネルを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルの表面に結合したトランスポソームは、ＲＮＡをタグメンテーションする。次いで、連続マッピングは、例えば、これらのチャネルのうちの１つの長さに沿ってクラスタを追跡することによって実行することができる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの長鎖は、少なくとも０．１ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、５００ｋｂ、５５０ｋｂ、６００ｋｂ、６５０ｋｂ、７００ｋｂ、７５０ｋｂ、８００ｋｂ、８５０ｋｂ、９００ｋｂ、９５０ｋｂ、１０００ｋｂ、５０００ｋｂ、１００００ｋｂ、２００００ｋｂ、３００００ｋｂの長さ、又は５００００ｋｂの長さであり得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの長鎖は、０．１ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、５００ｋｂ、５５０ｋｂ、６００ｋｂ、６５０ｋｂ、７００ｋｂ、７５０ｋｂ、８００ｋｂ、８５０ｋｂ、９００ｋｂ、９５０ｋｂ以下、又は１０００ｋｂ以下の長さである。一例として、ナノチャネル内にマッピングされた固定化タグメンテーション産物を含む１０００以上のナノチャネルを有するフローセルを使用して、短い「ポジショニングされた」リードで生物のゲノムを配列決定することができる。いくつかの実施形態では、ナノチャネル内にマッピングされた固定化タグメンテーション産物を使用して、ハプロタイプを解析することができる。いくつかの実施形態では、ナノチャネル内にマッピングされた固定化タグメンテーション産物を使用して、フェージング課題を解析することができる。
【0473】
ＩＩ．溶液中でのビーズ連結トランスポソーム及びｃＤＮＡ合成を使用してＲＮＡ配列決定ライブラリを調製する方法
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、ライブラリ調製の第１の工程として、ＲＮＡを含む試料から溶液中で合成される。言い換えれば、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴによるタグメンテーションの前に溶液中で生成され得る（図２に示されるように）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、次いで、捕捉オリゴヌクレオチドによってＢＬＴ上に捕捉される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、トランスポソーム複合体に含まれるトランスポザーゼに対する親和性に基づいてＢＬＴに直接結合する。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、ライブラリ調製の第１の工程として、ＲＮＡを含む試料から溶液中で合成される。言い換えれば、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴによるタグメンテーションの前に溶液中で生成され得る（図２に示されるように）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、次いで、捕捉オリゴヌクレオチドによってＢＬＴ上に捕捉される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、トランスポソーム複合体に含まれるトランスポザーゼに対する親和性に基づいてＢＬＴに直接結合する。
【0474】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素によって行われる。いくつかの実施形態では、このｃＤＮＡ合成により、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が得られ、ＲＮＡの鎖にハイブリダイズすることができるＤＮＡの鎖が生成される。いくつかの実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼは、ｃＤＮＡを合成する条件下で、ＲＮＡを含む試料に付加される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡを合成するための条件は、ＲＮＡに結合することができるヌクレオチド及び／又はプライマー（ポリＴプライマー及び／又はランダマープライマーなど）の存在を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を調製するための反応混合物は、オリゴｄＴプライマー、逆転写酵素、及びヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、４２℃の反応温度でｃＤＮＡの第１の鎖を合成する。
【0475】
いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮＡからＤＮＡを調製するだけである（二本鎖ＤＮＡを得るためにＤＮＡの更なるコピーを生成することなく）。
【0476】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ調製は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するため又は二本鎖ｃＤＮＡを生成するために溶液中で行われる。
【0477】
いくつかの実施形態では、溶液中で生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、次いで、ＢＬＴに結合され、タグメンテーションされ得る。トランスポザーゼを停止又は除去した後、鎖交換を行い、続いて、ギャップ充填及びライゲーションを行うことができ、次いで、ライブラリは放出され得る。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡが溶液中で調製され、次いで、タグメンテーションされる場合、鎖交換は必要とされない。いくつかの実施形態では、これらの方法は、チューブ内又はフローセル内で行われ得る。
【0478】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡからのタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、標的ＲＮＡを含む試料に逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を、トランスポソーム複合体が上に固定化された固体支持体に固定化することであって、トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含み、試料は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が捕捉オリゴヌクレオチド又はトランスポザーゼに直接結合する条件下で、固体支持体に適用される、固定化することと、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端にタグ付けされる条件下で、トランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化し、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
【0479】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡからのタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、標的ＲＮＡを含む試料を、捕捉オリゴヌクレオチドが上に固定化された固体支持体に適用することと、ｃＤＮＡを合成し、捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端にタグ付けされる条件下で、溶液中でトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化し、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡであり、捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリＴ配列を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリは、１つ以上のＲＮＡの３’末端から生成されたＤＮＡ：ＲＮＡ断片を含む。いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、第１のリード配列決定アダプター配列、ビーズコード、及び／又は１つ以上の追加のアダプター配列を更に含む。いくつかの実施形態では、溶液中のトランスポソーム複合体は、第２のリード配列アダプター配列及び／又は１つ以上の追加のアダプター配列を含む第１のトランスポソームを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のライブラリは、配列決定前に断片を増幅することなく配列決定される。
【0480】
ＩＩＩ．３’ＵＭＩを用いたＲＮＡ配列決定ライブラリの調製方法
ＵＭＩ配列決定の現在の方法は単独で、転写物の断片のみの定量的配列決定を可能にし、これは高分解能アイソフォーム同定を妨げる。いくつかの実施形態では、連結長リード技術を本明細書に記載される３’ＵＭＩ結合と組み合わせることにより、ＲＮＡライブラリの定量的配列決定、並びに元の転写物の全ての断片を３’ＵＭＩと一緒に連結することによるアイソフォーム同定が可能になる。いくつかの実施形態では、共通のビーズコード識別子を有するビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）は、完全長ＲＮＡについての連結長リードを生成することができる。ＵＭＩを用いた本方法は多くの用途を有し得るが、それらは、異なるＲＮＡ分子に由来する配列の同定が重要である選択的スプライシング研究に特に有用であり得る。
ＵＭＩ配列決定の現在の方法は単独で、転写物の断片のみの定量的配列決定を可能にし、これは高分解能アイソフォーム同定を妨げる。いくつかの実施形態では、連結長リード技術を本明細書に記載される３’ＵＭＩ結合と組み合わせることにより、ＲＮＡライブラリの定量的配列決定、並びに元の転写物の全ての断片を３’ＵＭＩと一緒に連結することによるアイソフォーム同定が可能になる。いくつかの実施形態では、共通のビーズコード識別子を有するビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）は、完全長ＲＮＡについての連結長リードを生成することができる。ＵＭＩを用いた本方法は多くの用途を有し得るが、それらは、異なるＲＮＡ分子に由来する配列の同定が重要である選択的スプライシング研究に特に有用であり得る。
【0481】
いくつかの実施形態では、方法は、図１５及び図１６によって例示されるように、正確な定量化のための３’ＵＭＩタグ付けと、連結長リードビーズコードとを組み合わせる。いくつかの実施形態では、３’ＵＭＩタグ付けは、増幅前に行われる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの３’ＵＭＩ前増幅の組み込み及びタグメンテーションの前は、方法を単一細胞及び超低ＲＮＡインプットに適合させる。いくつかの実施形態では、方法は、単一細胞についての完全長ＲＮＡ計数アッセイを可能にする。いくつかの実施形態では、方法は、鋳型スイッチングを含む。
【0482】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを調製する方法は、ＵＭＩ及び第１のリード配列決定アダプター配列を含むポリＴプライマーを使用して、試料中の完全長ＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を調製することと、ｃＤＮＡの第２の鎖を調製して、二本鎖ｃＤＮＡを生成することと、二本鎖ｃＤＮＡを、トランスポソーム複合体が上に固定化されたビーズに適用することであって、各トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、３’トランスポゾン末端配列を含む第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列及びハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含み、トランスポソーム複合体が、ビーズに固定化されたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション配列の結合によって固定化され、オリゴヌクレオチドが、５’親和性エレメント、第１のリード配列決定アダプター配列、ビーズコード、及びハイブリダイゼーション配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む、適用することと、二本鎖ｃＤＮＡを固定化し、ビーズに対してタグメンテーションを行って、二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、第２のトランスポゾンを除去することと、第２のリード配列決定アダプター配列と、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列と、を含むプライマーを、トランスポゾン末端配列にハイブリダイズすることと、ギャップ充填及び伸長を行って、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、を含む。
【0483】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを調製する方法は、ＵＭＩ及び第１のリード配列決定アダプター配列を含むポリＴプライマーを使用して、試料中の完全長ＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を調製することと、ｃＤＮＡの第２の鎖を調製して、二本鎖ｃＤＮＡを生成することと、二本鎖ｃＤＮＡを、トランスポソーム複合体が上に固定化されたビーズに適用することであって、各トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、３’トランスポゾン末端配列、ビーズコード、及び第２のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンであって、トランスポソーム複合体を固体支持体に固定化するための５’親和性エレメントを更に含む、第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、適用することと、二本鎖ｃＤＮＡを固定化し、ビーズに対してタグメンテーションを行って、二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、第２のトランスポゾンを除去することと、第２のリード配列決定アダプター配列と、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列と、を含むプライマーを、トランスポゾン末端配列にハイブリダイズすることと、ギャップ充填及び伸長を行って、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、を含む。
【0484】
いくつかの実施形態では、プライマーは、第２のリード配列アダプターを含む５’部分と、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む３’部分と、を含む。
【0485】
いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を除去するときに、断片は、一方又は両方の末端でトランスポソームに結合したままである。
【0486】
いくつかの実施形態では、各プライマーは、異なるＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、完全長ＲＮＡは、異なる完全長ＲＮＡのプールを含み、ポリＴプライマーは、異なるＵＭＩを含む異なるポリＴプライマーのプールを含む。いくつかの実施形態では、異なるポリＴプライマーのプールに含まれる各ポリＴプライマーは、異なるＵＭＩを含む。
【0487】
いくつかの実施形態では、各断片は、固有のＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、完全長ＲＮＡは、異なる完全長ＲＮＡのプールを含み、単一完全長ＲＮＡから調製された３’二本鎖ＤＮＡ断片は、プール中の他の完全長ＲＮＡから調製された３’二本鎖ＤＮＡ断片とは異なるＵＭＩを含む。
【0488】
いくつかの実施形態では、各ビーズは、固有のビーズコードを含む。いくつかの実施形態でが、完全長ＲＮＡは、異なる完全長ＲＮＡのプールを含み、ビーズは、ビーズのプールを含む。いくつかの実施形態では、各ビーズは、プール中の他のビーズ上に固定化されたトランスポソーム複合体に含まれるビーズコードと比較して、異なるビーズコードを含むトランスポソーム複合体を固定化している。
【0489】
いくつかの実施形態では、単一の完全長ＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡから調製された全ての断片は、同じビーズ上でタグメンテーションされる。
【0490】
いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡから調製された第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む全ての二本鎖断片は、ギャップ充填及び伸長を行った後に同じ固体支持体上にある。
【0491】
いくつかの実施形態では、完全長ＲＮＡは、異なる完全長ＲＮＡのプールを含み、プール中の単一完全長ＲＮＡから調製された第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む全ての二本鎖断片は、ギャップ充填及び伸長を行った後に同じ固体支持体上にある。
【0492】
いくつかの実施形態では、方法は、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む二本鎖断片を増幅して、増幅された断片を調製することを更に含む。
【0493】
いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡ調製物は、ストランド法によるものである。いくつかの実施形態では、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプター又は増幅された断片を含む二本鎖断片から得られた配列におけるビーズコードの存在は、断片が生成されたビーズを同定する。
【0494】
いくつかの実施形態では、試料は、単一細胞である。
【0495】
いくつかの実施形態では、方法は、鎖ＲＮＡライブラリ調製を含む。
【0496】
いくつかの実施形態では、１つの配列決定アダプター配列は、タグメンテーション工程中に断片に組み込まれ、異なる配列決定アダプター配列は、タグメンテーション後の伸長のために使用されるプライマーを介して断片に組み込まれる。いくつかの実施形態では、配列決定アダプター配列を組み込むプライマーは、配列決定アダプター配列を含むタグ付きプライマーである。
【0497】
いくつかの実施形態では、本方法は、対称タグメンテーション工程を含み、全てのトランスポソーム複合体は、同じアダプター配列を含む。
【0498】
いくつかの実施形態では、本方法は、３’ＵＭＩタグ付け、前増幅、及び／又は完全長ＲＮＡアイソフォーム検出と適合性である。
【0499】
いくつかの実施形態では、方法は、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む増幅された断片又は二本鎖断片を配列決定することを更に含む。
【0500】
いくつかの実施形態では、配列決定は、完全長ＲＮＡアイソフォームの検出を可能にする。
【0501】
いくつかの実施形態では、３’ＵＭＩ（タグメンテーション中に生成された３’断片に含まれる）を配列決定結果の分析中に使用して、他のｃＤＮＡとは異なるｃＤＮＡを同定することができる（他のＵＭＩを有する他のｃＤＮＡに基づく）。図１４は、第１の鎖合成中に３’断片がどのようにＵＭＩを組み込み（第１の鎖合成プライマーに含まれるＵＭＩに基づく）、その後、ｃＤＮＡの３’末端の捕捉後に単一のタグメンテーション事象が続くかを概説する。所定のｃＤＮＡからの全ての断片は、同じＤＮＡ ＢＬＴ上で断片化されるため、全ての断片は同じビーズコードを組み込む。図１５は、実施形態のこの態様を要約しており、全ての断片は、このコードを含むビーズ上でのタグメンテーションによって生成されたため、「ＵＭＩ１」は、ｃＤＮＡ合成中にアイソフォーム＃１からのｃＤＮＡに組み込まれ、このアイソフォームの全ての断片は、「ビーズコードＡ」を組み込む。対照的に、全ての断片は、このコードを含むビーズ上でのタグメンテーションによって生成されたため、「ＵＭＩ２」は、ｃＤＮＡ合成中にアイソフォーム＃２からのｃＤＮＡに組み込まれ、このアイソフォームの全ての断片は、「ビーズコードＢ」を組み込む。鋳型スイッチ及びＰＣＲ増幅を使用する方法は図１６に示されており、鋳型スイッチプライマーを使用して、アダプター（Ｐ５など）を組み込むことができる。
【0502】
これらの方法を使用して、所定のｍＲＮＡアイソフォームからのｃＤＮＡから生成された全ての断片は、配列決定結果の分析の間に分類され得る。この分析は、配列決定結果内の異なるｍＲＮＡアイソフォームの区別を可能にする。
【0503】
Ａ．連結長リード配列決定
標準的な短リード配列決定は、短距離情報を提供するために正確な塩基レベルの配列を提供するが、短リード配列決定は、長距離ゲノム情報を提供しない場合がある。更に、ハプロタイプ情報は、配列決定されたゲノム又は短リードデータを有する参照について保持されないため、長距離ハプロタイプの再構築は、標準的な方法では困難である。したがって、標準的な配列決定及び分析アプローチは、一般に、単一ヌクレオチドバリアント（single nucleotide variant、ＳＮＶ）をコールすることができるが、これらの方法は、個々のゲノムにおいてみられる構造変異の全スペクトルを同定しない場合がある。ゲノムの「構造変異」は、本明細書で使用される場合、５０塩基対以上の事象を含む、ＳＮＶより大きな事象を指す。代表的な構造バリアントには、コピー数変異、逆位、欠失、及び重複が含まれる。
標準的な短リード配列決定は、短距離情報を提供するために正確な塩基レベルの配列を提供するが、短リード配列決定は、長距離ゲノム情報を提供しない場合がある。更に、ハプロタイプ情報は、配列決定されたゲノム又は短リードデータを有する参照について保持されないため、長距離ハプロタイプの再構築は、標準的な方法では困難である。したがって、標準的な配列決定及び分析アプローチは、一般に、単一ヌクレオチドバリアント（single nucleotide variant、ＳＮＶ）をコールすることができるが、これらの方法は、個々のゲノムにおいてみられる構造変異の全スペクトルを同定しない場合がある。ゲノムの「構造変異」は、本明細書で使用される場合、５０塩基対以上の事象を含む、ＳＮＶより大きな事象を指す。代表的な構造バリアントには、コピー数変異、逆位、欠失、及び重複が含まれる。
【0504】
「連結長リード配列決定」又は「連結リード配列決定」は、ゲノム配列に関する長距離情報を提供する配列決定方法を指す。
【0505】
いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、ハプロタイプ再構築のために使用され得る。いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、構造バリアントのコーリングを改善する。いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、アクセス可能性が制限されたゲノムの領域へのアクセスを改善する。いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、デノボ二倍体アセンブリのために使用される。いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、デノボアセンブリを必要とする高度に多型の配列（ヒト白血球抗原遺伝子など）の配列決定を改善する。
【0506】
いくつかの実施形態では、連結長リード配列決定は、ＢＬＴからの断片の放出前の空間的分離に基づいて、又はビーズバーコーディングに基づいて行われ得る。
【0507】
１．空間的分離に基づく連結長リード配列決定
いくつかの実施形態では、完全長核酸は、ＢＬＴなどの単一ビーズ上に「ラップ」され、これは、完全長核酸が単一ビーズ上の複数のトランスポソーム複合体と会合することができることを意味する。本明細書で使用される場合、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖であり得る。
いくつかの実施形態では、完全長核酸は、ＢＬＴなどの単一ビーズ上に「ラップ」され、これは、完全長核酸が単一ビーズ上の複数のトランスポソーム複合体と会合することができることを意味する。本明細書で使用される場合、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖であり得る。
【0508】
いくつかの実施形態では、ビーズは、ビーズに結合した完全長核酸を用いて配列決定のために表面に送達される。例えば、核酸は、活性化可能なＢＬＴに結合させ、フローセルに送達することができる。ＢＬＴは、断片の調製を可能にするためにフローセルに結合させた後に活性化され得る。次いで、所定の完全長核酸（同じビーズ上で調製される）から生成された断片が、他のビーズ上で調製された断片と比較して、非常に近接して放出されるように、断片が放出され得る。
【0509】
いくつかの実施形態では、ＢＬＴは、ＢＬＴに結合した断片とともに配列決定のために表面に送達される。
【0510】
いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、分子バーコードを使用して、同じ長いＤＮＡ断片に由来するリードをタグ付けする。固有のバーコードが、個々のＤＮＡ分子から生成された全ての短リードに付加される場合、短リードは、そのＤＮＡ分子を一緒に連結することができる。言い換えれば、バーコードを共有するリードは、単一の長いインプット分子に由来するものとして分類することができ、長距離情報を短リードからアセンブリすることを可能にする。
【0511】
Ｂ．第１の鎖合成プライマー
いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーは、試料中に含まれるＲＮＡから生成されたｃＤＮＡの第１の鎖に１つ以上のタグを組み込むことができる。いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーは、ポリＴ配列を含む。いくつかの実施形態では、このポリＴ配列は、ＲＮＡの３’末端上のポリＡテールにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリＴ配列を含むプライマーの使用は、３’ＵＭＩによるｃＤＮＡの第１の鎖のタグ付けを可能にする。
いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーは、試料中に含まれるＲＮＡから生成されたｃＤＮＡの第１の鎖に１つ以上のタグを組み込むことができる。いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーは、ポリＴ配列を含む。いくつかの実施形態では、このポリＴ配列は、ＲＮＡの３’末端上のポリＡテールにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリＴ配列を含むプライマーの使用は、３’ＵＭＩによるｃＤＮＡの第１の鎖のタグ付けを可能にする。
【0512】
いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーは、ＵＭＩ、インデックス配列（若しくはその相補体）、第１のリード配列決定アダプター配列（若しくはその相補体）、及び／又は１つ以上の追加のアダプター配列を更に含む。
【0513】
いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーは、第１の鎖合成プライマーのプールに含まれる。いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーのプール中の第１の鎖合成プライマーは、ミックス中の全て又はほとんどの他のプライマーとは異なる固有のＵＭＩを含む。
【0514】
いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーは、オリゴｄＴ配列、ＵＭＩ、インデックス配列、及びアダプター配列を含む。このようなプライマーを用いて生成されたｃＤＮＡの代表的な第１の鎖が図１４に示され、ｃＤＮＡの第１の鎖は、オリゴｄＴ配列、ＵＭＩ、ｉ７配列（インデックス配列）、及びＰ７配列（すなわち、プライマーランディング部位として使用されるアダプター配列）を含む。いくつかの実施形態では、フローセルなどの配列決定のための表面は、プライマーランディング部位のローンでコーティングされる。いくつかの実施形態では、プライマーランディング部位は、Ｐ５又はＰ７である。いくつかの実施形態では、プライマーランディング部位（Ｐ５又はＰ７など）は、フローセルへの断片の結合を促進する。
【0515】
いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ配列及び第１のリード配列決定アダプター配列は、プライマーの混合物中の各第１の鎖合成プライマーについて同一である。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、各第１の鎖合成プライマーについて固有である。このようにして、下流の配列決定事象は、異なるＲＮＡを含む試料に含まれる異なるＲＮＡ分子から生成された断片を区別することができる。
【0516】
いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーに含まれるインデックス配列は、ｉ７又はｉ５配列などのインデックス配列の既知のプールの１つである（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃１００００００００２６９４ ｖ１０，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．２０１９を参照されたい）。
【0517】
いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーは、１つ以上のアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、プライマー配列、インデックスタグ配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、若しくは配列決定関連配列、又はそれらの組み合わせを含む。
【0518】
Ｃ．固有分子識別子（ＵＭＩ）
固有分子識別子（ＵＭＩ）は、個々の核酸分子を互いに区別するために使用され得る核酸分子に適用されるか、又は同定されるヌクレオチドの配列である。ＵＭＩは、リード配列が１つのソース核酸分子又は別のものであるかどうかを決定するために、それらが関連する核酸分子とともに配列決定され得る。「ＵＭＩ」という用語は、ポリヌクレオチドの配列情報及び物理的ポリヌクレオチド自体の両方を指すために本明細書で使用され得る。ＵＭＩは、１つの試料のリードを他の試料のリードから区別するために一般的に使用されるバーコードに類似しているが、ＵＭＩは、代わりに、個々の試料からの多くの断片が一緒に配列決定される場合、核酸鋳型断片を別の断片から区別するために使用される。ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１０８９７２号及び同第２０１８／１３６２４８号に記載されるように、多くの方式で定義することができる。
固有分子識別子（ＵＭＩ）は、個々の核酸分子を互いに区別するために使用され得る核酸分子に適用されるか、又は同定されるヌクレオチドの配列である。ＵＭＩは、リード配列が１つのソース核酸分子又は別のものであるかどうかを決定するために、それらが関連する核酸分子とともに配列決定され得る。「ＵＭＩ」という用語は、ポリヌクレオチドの配列情報及び物理的ポリヌクレオチド自体の両方を指すために本明細書で使用され得る。ＵＭＩは、１つの試料のリードを他の試料のリードから区別するために一般的に使用されるバーコードに類似しているが、ＵＭＩは、代わりに、個々の試料からの多くの断片が一緒に配列決定される場合、核酸鋳型断片を別の断片から区別するために使用される。ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１０８９７２号及び同第２０１８／１３６２４８号に記載されるように、多くの方式で定義することができる。
【0519】
固有分子識別子（ＵＭＩ）は、個々の核酸分子を互いに区別するために使用され得る核酸分子に適用されるか、又は同定されるヌクレオチドの配列である。ＵＭＩは、リード配列が１つのソース核酸分子又は別のものであるかどうかを決定するために、それらが関連する核酸分子とともに配列決定され得る。「ＵＭＩ」という用語は、ポリヌクレオチドの配列情報及び物理的ポリヌクレオチド自体の両方を指すために本明細書で使用され得る。ＵＭＩは、１つの試料のリードを他の試料のリードから区別するために一般的に使用されるバーコードに類似しているが、ＵＭＩは、代わりに、個々の試料からの多くの断片が一緒に配列決定される場合、核酸鋳型断片を別の断片から区別するために使用される。ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１０８９７２号及び同第２０１８／１３６２４８号に記載されるように、多くの方式で定義することができる。
【0520】
いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリは、非ランダム配列を含む。いくつかの実施形態では、非ランダムＵＭＩ（nonrandom UMI、ｎｒＵＭＩ）は、特定の実験又は適用のために事前定義される。ある特定の実施形態では、規則を使用して、セットの配列を生成するか、又はセットから試料を選択してｎｒＵＭＩを得る。例えば、セットの配列は、配列が特定のパターンを有するように生成され得る。いくつかの実施形態では、各配列は、特定の数（例えば、２、３、又は４）のヌクレオチドだけ、セット中の他の全ての配列と異なる。すなわち、ｎｒＵＭＩ配列は、特定の数より少ないヌクレオチドを置き換えることによって、任意の他の利用可能なｎｒＵＭＩ配列に変換され得ない。いくつかの実装形態では、配列決定プロセスで使用されるＵＭＩのセットは、特定の配列長を与えられた全ての可能なＵＭＩよりも少ないＵＭＩを含む。例えば、６個のヌクレオチドを有するｎｒＵＭＩｓのセットは、合計４Ａ６＝４０９６個の可能な異なる配列の代わりに、合計９６個の異なる配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリは、１２０個の非ランダム配列を含む。
【0521】
ｎｒＵＭＩが全ての可能な異なる配列よりも少ない配列を有するセットから選択されるいくつかの実施において、ｎｒＵＭＩの数は、ソースＤＮＡ分子の数よりも少なく、場合によっては著しく少ない。このような実施では、ｎｒＵＭＩ情報を、仮想ＵＭＩ、参照配列上のリード位置、及び／又はリードの配列情報などの他の情報と組み合わせて、同じソースＤＮＡ分子に由来する配列リードを同定することができる。
【0522】
いくつかの実施形態では、ｒＵＭＩｓのライブラリは、１つ以上の配列長を与えられた全ての可能な異なるオリゴヌクレオチド配列からなるＵＭＩのセットから、置き換えあり又はなしで、ランダム試料として選択されるランダムＵＭＩ（random UMI、ｒＵＭＩ）を含み得る。例えば、ＵＭＩのセット中の各ＵＭＩがｎ個のヌクレオチドを有する場合、セットは、互いに異なる配列を有する４Ａｎ個のＵＭＩを含む。４Ａｎ個のＵＭＩから選択されたランダム試料は、ｒＵＭＩを構成する。
【0523】
いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリは、擬似ランダム又は部分的にランダムであり、ｎｒＵＭＩとｒＵＭＩとの混合物を含み得る。
【0524】
いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列は、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在してもよい。
【0525】
いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列は、各ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在してもよい。
【0526】
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプター配列を表す核酸の配列は、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に位置してもよい。
【0527】
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、合成されたｃＤＮＡの第１の鎖上にある。いくつかの実施形態では、ＵＭＩの第１のコピーは、合成されたｃＤＮＡの第１の鎖上にあり、ＵＭＩの第２のコピー（すなわち、その相補体）は、合成されたｃＤＮＡの第２の鎖上にある。
【0528】
Ｄ．タグメンテーション後に１つ以上のアダプターを組み込むためのプライマー
いくつかの実施形態では、プライマーは、１つ以上のアダプター配列を組み込むために、ＢＬＴに対するタグメンテーション後にハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、このプライマーは、配列決定アダプター配列と、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列と、を含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、第１の鎖合成プライマーに含まれる配列決定アダプターとは異なる配列決定アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーの配列は、タグメンテーション後に使用されるプライマーの配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、プライマーは、１つ以上のアダプター配列を組み込むために、ＢＬＴに対するタグメンテーション後にハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、このプライマーは、配列決定アダプター配列と、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列と、を含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、第１の鎖合成プライマーに含まれる配列決定アダプターとは異なる配列決定アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖合成プライマーの配列は、タグメンテーション後に使用されるプライマーの配列とは異なる。
【0529】
いくつかの実施形態では、タグメンテーション後にハイブリダイズしたプライマーは、第１のトランスポゾン中の配列に対して完全に相補的ではない。言い換えれば、ＢＬＴに固定化された断片へのプライマーのハイブリダイゼーションは、「Ｙ型アダプター」又は「フォーク型アダプター」様構造を生成する。
【0530】
いくつかの実施形態では、タグメンテーション後にハイブリダイズしたプライマーは、第１のトランスポゾンに含まれる配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、タグメンテーション後にハイブリダイズしたプライマーは、第１のトランスポゾンに含まれるモザイク末端（mosaic end、ＭＥ）配列（又はその相補体）に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、タグメンテーション後にハイブリダイズしたプライマーは、第１のトランスポゾンに含まれない配列を含む。
【0531】
いくつかの実施形態では、非転移鎖中のＭＥ’配列は、第１のトランスポゾン中に含まれる配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含むプライマーをハイブリダイズする前に、断片から解離される。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列は、トランスポゾン末端配列よりも短い。そのような実施形態は、図１９に短縮されたＭＥ’として示されている。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列がトランスポゾン末端配列よりも短い（すなわち、短縮されたＭＥ’配列が使用される）場合、より少ないアダプターダイマーが生成される。
【0532】
いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンは、タグメンテーション後のＭＥ配列からのＭＥ’配列の解離を容易にするために、より短いＭＥ’を含む。いくつかの実施形態では、短縮されたＭＥ’配列は、非転移ＭＥ’配列を異なるオリゴヌクレオチド（プライマーなど）と交換するのに有用である。いくつかの実施形態では、短縮されたＭＥ’配列はまた、平滑末端ライゲーションの発生を低減し得る。
【0533】
Ｅ．ハイブリダイゼーション配列
いくつかの実施形態では、ビーズは、溶液中でトランスポソームに結合するために使用され得るオリゴヌクレオチドを含む。このようにして、ビーズは、「活性化可能なＢＬＴ」であり得、使用者はＢＬＴの生成のタイミングを制御する。
いくつかの実施形態では、ビーズは、溶液中でトランスポソームに結合するために使用され得るオリゴヌクレオチドを含む。このようにして、ビーズは、「活性化可能なＢＬＴ」であり得、使用者はＢＬＴの生成のタイミングを制御する。
【0534】
いくつかの実施形態では、ビーズは、ハイブリダイゼーション配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、トランスポソーム複合体に含まれる配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列に結合する。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、トランスポソームに含まれる第２のトランスポゾンに結合し、溶液からのトランスポソームは、第２のトランスポゾンに含まれる配列に対して完全に又は部分的に相補的であるハイブリダイゼーション配列を介して結合され得る（ＢＬＴを形成するため）。
【0535】
Ｆ．ビーズコード
所与のｃＤＮＡの３’断片は、（上に記載されるように）ＵＭＩ配列を組み込むことができる。このようにして、所与のｃＤＮＡから生成された３’断片中のＵＭＩ配列を使用して、このｃＤＮＡを生成される他のものと区別することができる。所与のｃＤＮＡから生成されたこの３’断片（図１５に示される）又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖はまた、タグメンテーションの間に組み込まれたビーズコードを含む。このようにして、３’断片（ＵＭＩを含む）からの配列決定データを、同じビーズ上で生成された他の断片からの配列決定データと一緒に選別して、試料から出発ＲＮＡの完全配列を生成することができる。言い換えれば、完全長ＲＮＡ転写物から生成されたｃＤＮＡは、単一のビーズによってタグメンテーションされ、これは、同一のビーズコード配列を有する元の完全長ＲＮＡ由来のｃＤＮＡの全てのセグメントをタグメンテーションする。いくつかの実施形態では、所与のビーズ上の単一のｃＤＮＡを断片化することにより、全ての断片を元の転写物並びに逆転写中に導入されたＵＭＩに戻して連結することが可能になる。したがって、この方法は、固有のＲＮＡ分子に関するデータを提供することができる。
所与のｃＤＮＡの３’断片は、（上に記載されるように）ＵＭＩ配列を組み込むことができる。このようにして、所与のｃＤＮＡから生成された３’断片中のＵＭＩ配列を使用して、このｃＤＮＡを生成される他のものと区別することができる。所与のｃＤＮＡから生成されたこの３’断片（図１５に示される）又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖はまた、タグメンテーションの間に組み込まれたビーズコードを含む。このようにして、３’断片（ＵＭＩを含む）からの配列決定データを、同じビーズ上で生成された他の断片からの配列決定データと一緒に選別して、試料から出発ＲＮＡの完全配列を生成することができる。言い換えれば、完全長ＲＮＡ転写物から生成されたｃＤＮＡは、単一のビーズによってタグメンテーションされ、これは、同一のビーズコード配列を有する元の完全長ＲＮＡ由来のｃＤＮＡの全てのセグメントをタグメンテーションする。いくつかの実施形態では、所与のビーズ上の単一のｃＤＮＡを断片化することにより、全ての断片を元の転写物並びに逆転写中に導入されたＵＭＩに戻して連結することが可能になる。したがって、この方法は、固有のＲＮＡ分子に関するデータを提供することができる。
【0536】
所定のｃＤＮＡの全ての断片は、一般に、同じＢＬＴ上で生成されるが、このＢＬＴはまた、それに結合する他のｃＤＮＡから断片を生成し得る。言い換えれば、元の試料中の異なるＲＮＡに由来する断片は、同じビーズコードを有し得る。しかしながら、配列アラインメントを使用して、所与のビーズ上のどの断片が所与の配列に由来するかを同定することができる。
【0537】
ＩＶ．対称タグメンテーション後にＲＮＡ又はＤＮＡライブラリを調製する追加の方法
配列決定可能な断片を生成するためのいくつかの異なる方式が、ＢＬＴに対する対称タグメンテーションの後に使用され得る。これらの方法は、本明細書に記載されるプロトコルのうちのいずれかと組み合わされ得る。いくつかの例示的な方法が、その全体が本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６３／１６８，８０２号に開示されている。
配列決定可能な断片を生成するためのいくつかの異なる方式が、ＢＬＴに対する対称タグメンテーションの後に使用され得る。これらの方法は、本明細書に記載されるプロトコルのうちのいずれかと組み合わされ得る。いくつかの例示的な方法が、その全体が本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６３／１６８，８０２号に開示されている。
【0538】
いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションの後に、トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を放出することと、アダプター配列、及び第１の３’末端トランスポゾン配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含むポリヌクレオチドをハイブリダイズすることであって、ポリヌクレオチドに含まれるアダプター配列が、トランスポソーム複合体に含まれるアダプター配列とは異なる、ハイブリダイズすることと、任意選択で、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長することと、任意選択で、ポリヌクレオチド又は伸長したポリヌクレオチドを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、二本鎖標的核酸断片を産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＵＭＩを更に含む。いくつかの実施形態では、断片は、ＵＭＩを含み、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に直接隣接して位置する。
【0539】
いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションの後に、トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を放出することと、第１のポリヌクレオチドアダプター配列をハイブリダイズすることであって、第１のトランスポゾン内のアダプターが、第１のポリヌクレオチド内のアダプターとは異なる、ハイブリダイズすることと、任意選択で、第１のポリヌクレオチドに対して相補的である領域を含む第２のポリヌクレオチドを付加して、二本鎖アダプターを産生することと、任意選択で、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長することと、任意選択で、二本鎖アダプターを二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、二本鎖標的核酸断片を産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＵＭＩを更に含む。いくつかの実施形態では、断片は、ＵＭＩを含み、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片と第１のポリヌクレオチド由来のアダプター配列との間に位置する。
【0540】
いくつかの実施形態では、断片は、一方の鎖の５’末端において第１のトランスポゾンからの第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端において第１のポリヌクレオチドからの第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる。
【0541】
Ｖ．ライブラリ調製のためのタグメンテーションによる鎖特異的ｃＤＮＡ調製の調製方法（ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ）
いくつかの実施形態では、鎖特異的ｃＤＮＡ調製の方法は、ライブラリを調製するためにタグメンテーションと組み合わされる。プライマー伸長鎖特異的ＢＬＴアプローチ（ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ）は、図１７及び図１８に示されるように、ｃＤＮＡ合成、ＢＬＴ形成、及びライブラリ調製を含む鎖特異的方法を記載するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、鎖特異的ｃＤＮＡ調製の方法は、ライブラリを調製するためにタグメンテーションと組み合わされる。プライマー伸長鎖特異的ＢＬＴアプローチ（ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ）は、図１７及び図１８に示されるように、ｃＤＮＡ合成、ＢＬＴ形成、及びライブラリ調製を含む鎖特異的方法を記載するために使用され得る。
【0542】
いくつかの実施形態では、ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴを介してＲＮＡから一本鎖ＤＮＡの鎖特異的ライブラリを調製する方法は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を阻害する条件下で、逆転写酵素、プライマー、及びｄＴＴＰを含むヌクレオチドを使用して、試料中に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を調製することと、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、及びｄＵＴＰを含むヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡの第１の鎖からｃＤＮＡの第２の鎖を調製して、二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、二本鎖ｃＤＮＡを、トランスポソーム複合体が上に固定化された固体支持体に適用することであって、各トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及び第１のリード配列決定アダプター配列を含む３’部分を含む第１のトランスポゾンであって、トランスポソーム複合体を固体支持体に固定化するための５’親和性エレメントを含む、第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾン配列と、を含む、適用することと、トランスポソーム複合体を用いて二本鎖ＤＮＡを断片化して、第１のリード配列決定アダプター配列を含むタグ付き二本鎖ＤＮＡ断片を調製することと、第２のトランスポゾンを除去し、ギャップ充填及び伸長を行うことと、二本鎖ＤＮＡ断片の鎖を分離することと、第２リード配列決定アダプター配列を含むプライマーを、トランスポゾン末端配列又はトランスポゾン末端配列に対して完全若しくは部分的に相補的である配列にハイブリダイズし、増幅して、固体支持体に結合しておらず、かつ第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含むＤＮＡ鎖を調製することと、増幅によって生成される鎖を固体支持体から放出することであって、放出することが、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖ＤＮＡ断片を放出することと、を含む、方法。
【0543】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を阻害する条件は、アクチノマイシンＤを含む緩衝液の存在である。いくつかの実施形態では、プライマーは、１つ以上のランダマープライマーである。いくつかの実施形態では、プライマーは、ランダマープライマーとポリＴプライマーとの混合物である。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの第２の鎖を調製するためのプライマーは、ｃＤＮＡの第１の鎖を調製するためのプライマーと同じである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、長い非コードＲＮＡ又はアンチセンス転写物である。
【0544】
いくつかの実施形態では、増幅は、ウラシル不耐性ポリメラーゼを用いて行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、ウラシルを含むＤＮＡ鎖から増幅しない。
【0545】
いくつかの実施形態では、固有分子識別子（ＵＭＩ）は、第２のリード配列決定アダプター配列を含むプライマーに含まれる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、第２のリード配列決定アダプター配列と、トランスポゾン末端配列に結合することができる配列又はトランスポゾン末端配列に対して完全に若しくは部分的に相補的である配列との間に位置する。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、第１のトランスポゾンに含まれる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、トランスポゾン末端配列と第１のリード配列決定アダプター配列との間に位置する。
【0546】
いくつかの実施形態では、得られたライブラリ中の異なる断片は、異なるＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、異なるＲＮＡのプールを含み、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖断片は、異なる断片のプールを含み、各断片は、異なる断片のプールに含まれる他の断片とは異なるＵＭＩを含む。
【0547】
ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ法では、ある範囲の異なる親和性エレメントを使用することができる。いくつかの実施形態では、親和性エレメントは、ビオチン又はデスチオビオチンであり、固体支持体は、その表面上にストレプトアビジン又はアビジンを含む。いくつかの実施形態では、親和性エレメントは、図１９に記載されるように、二重ビオチンである。
【0548】
増幅によって生成される鎖を固体支持体から放出することは、いくつかの方式で行うことができる。いくつかの実施形態では、放出は、熱又は水酸化ナトリウム処理を用いて行われる。いくつかの実施形態では、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖断片は、放出の後に固体支持体から分割される。
【0549】
いくつかの実施形態では、方法は、放出の後に、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖ＤＮＡ断片を用いてインデックスプライマー増幅を行って、インデックス付き断片を調製することを更に含む。このようなインデックスプライマー増幅は、配列決定データのインデックス付けのために当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー増幅は、固体支持体とは別の反応容器中で行われる。
【0550】
いくつかの実施形態では、インデックスプライマー増幅は、ウラシル不耐性ポリメラーゼを用いて行われる。このようにして、ｃＤＮＡの第２の鎖は、それらがウラシルを含む場合、増幅されない。
【0551】
いくつかの実施形態では、方法は、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプターを含む一本鎖ＤＮＡ断片又はインデックス付き断片を配列決定することを更に含む。いくつかの実施形態では、配列決定データは、ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡの第１の鎖から生成される。いくつかの実施形態では、配列決定データは、ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡの第２の鎖から生成されない。いくつかの実施形態では、方法は、ライゲーションを必要としない。
【0552】
ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴは、ｍＲＮＡ分析にいくつかの利点を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡ中の重複配列の境界を画する。いくつかの実施形態では、方法は、転写物発現の推定を可能にする。いくつかの実施形態では、転写物発現の推定は、ＵＭＩの分析に基づく。ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴの一般的な概要は、それが、鎖特異的ｃＤＮＡ合成、ＢＬＴによる対称タグメンテーション、及びライブラリ断片を調製するためのプライマー伸長の工程を含むことである。
【0553】
Ａ．ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴにおける鎖特異的ｃＤＮＡ合成
いくつかの実施形態は、全ＲＮＡは、逆転写酵素、ランダムプライマー、ヌクレオシド三リン酸、及びアクチノマイシンＤを含むＦＳＡ緩衝液を使用して、第１の鎖ｃＤＮＡにコピーされる。いくつかの実施形態では、アクチノマイシンＤは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を特異的に阻害し、鎖特異性を改善する。鎖特異的ｃＤＮＡ合成の代表的な方法を図１７に示す。
いくつかの実施形態は、全ＲＮＡは、逆転写酵素、ランダムプライマー、ヌクレオシド三リン酸、及びアクチノマイシンＤを含むＦＳＡ緩衝液を使用して、第１の鎖ｃＤＮＡにコピーされる。いくつかの実施形態では、アクチノマイシンＤは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を特異的に阻害し、鎖特異性を改善する。鎖特異的ｃＤＮＡ合成の代表的な方法を図１７に示す。
【0554】
このような鎖特異的ｃＤＮＡ合成は、ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ法内で使用され得るが、またライブラリ調製の他の方法とともに使用され得る。
【0555】
Ｂ．ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴにおける使用のためのＢＬＴ
いくつかの実施形態では、鎖特異的プロトコルを使用して調製された二本鎖ｃＤＮＡは、次いで、タグ付き二本鎖ＤＮＡ断片を生成するためにタグメンテーションされる。
いくつかの実施形態では、鎖特異的プロトコルを使用して調製された二本鎖ｃＤＮＡは、次いで、タグ付き二本鎖ＤＮＡ断片を生成するためにタグメンテーションされる。
【0556】
いくつかの実施形態では、ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ法におけるタグメンテーションは、対称タグメンテーションであり、全てのトランスポソーム複合体は、同じアダプター配列を含む第１のトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、対称タグメンテーションを使用する方法は、２つ以上の種類のトランスポソーム複合体がタグメンテーションに使用される非対称タグメンテーション工程と比較して、配列決定可能な断片（すなわち、断片の各末端に異なる配列決定アダプター配列を有する各断片）の収量を増加させる。
【0557】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、断片が両方の鎖の５’末端に同じタグを組み込むようにタグメンテーションされる。いくつかの実施形態では、タグメンテーションによって生成されたタグ付き二本鎖ｃＤＮＡ断片は、断片の両方の末端に同じタグを有する。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、単一の配列決定アダプター配列を含むタグでタグメンテーションされる。いくつかの実施形態では、配列決定アダプター配列は、Ａ１４又はＢ１５である。
【0558】
Ｃ．ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴにおけるプライマー伸長
いくつかの実施形態では、（第２のトランスポゾンからの）非転移ＭＥ’配列は、タグメンテーション後にＰＣＲ伸長によって融解され、ギャップ充填される。いくつかの実施形態では、ＭＥ’配列は、反応の温度を上昇させることによって除去される。方法のこれらの工程を図１８に概説する。
いくつかの実施形態では、（第２のトランスポゾンからの）非転移ＭＥ’配列は、タグメンテーション後にＰＣＲ伸長によって融解され、ギャップ充填される。いくつかの実施形態では、ＭＥ’配列は、反応の温度を上昇させることによって除去される。方法のこれらの工程を図１８に概説する。
【0559】
いくつかの実施形態では、ギャップ充填は、非転移ＭＥ’配列が除去された後に行われる。いくつかの実施形態では、プライマーは、ギャップ充填されたＭＥ’配列にアニーリングされる。いくつかの実施形態では、このプライマーは、伸長のために使用され、伸長プライマーと称され得る。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、ＭＥ配列を含む。いくつかの実施形態では、伸長プライマーに含まれるＭＥ配列は、ギャップ充填されたＭＥ’配列にハイブリダイズする。
【0560】
いくつかの実施形態では、伸長プライマーはまた、配列決定アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、伸長プライマーに含まれる配列アダプター配列は、トランスポソーム複合体に含まれなかった。いくつかの実施形態では、伸長プライマーによる伸長は、二本鎖断片の各末端に異なる配列決定アダプター配列を含む断片を生成する。
【0561】
いくつかの実施形態では、ウラシル不耐性ＤＮＡは、プライマー伸長に使用される。いくつかの実施形態では、プライマー伸長は、ｃＤＮＡの第１の鎖からのみ生じる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの第２の鎖は、上に記載される鎖特異的ｃＤＮＡ調製物に基づいて、それがウラシルを含むため伸長されない。
【0562】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体がＡ１４配列（又はその相補体）を含む場合、伸長プライマーは、Ｂ１５（又はその相補体）を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体がＢ１５配列（又はその相補体）を含む場合、伸長は、Ａ１４（又はその相補体）を含む。これらの代表的な例では、Ａ１４及び１５は、例示的な配列決定アダプター配列を表すのみであり、本方法は、このようなアダプター配列に限定されない。目的の対になったアダプター配列の任意のセットは、トランスポソーム複合体及び伸長プライマーにおいて使用され得、当業者は、配列決定が異なるプラットフォーム上でどのように行われるか、及びそのようなプラットフォームが経時的に進化し得ることを十分に承知している。
【0563】
いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、ＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、ＰＣＲ増幅によって産生されるコピーに対して固有のｍＲＮＡ転写物をマークする。言い換えれば、任意の下流増幅工程からの同じｃＤＮＡ（例えば、単一のｍＲＮＡ転写物に由来する）からのアンプリコンコピーは、同じＵＭＩを含む。このようにして、配列決定結果の分析は、同じｍＲＮＡから生成された断片の複数のコピーを同定し得る。
【0564】
図１９に示されるように、ある特定の修飾トランスポゾンは、ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴの結果を改善し得る。これらの修飾はまた、本明細書に記載される他の方法において有用であり得る。いくつかの実施形態では、二重ビオチンは、トランスポゾン配列をビーズに固定化して、ＢＬＴを生成するために使用される。いくつかの実施形態では、二重ビオチンは、ビオチンと比較して、ストレプトアビジンに対してより強い親和性を有し、これは、ＢＬＴからのトランスポソームの結合及び放出を改善する。そのような修飾は、本明細書に記載される任意の他の方法とともに、ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ方法において使用され得る。
【0565】
ＶＩ．ビーズ連結トランスポソームを使用するＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリの調製方法
いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を適用することを含む。これらの方法は、ＲＮＡ配列決定ライブラリを使用するために列挙された方法と類似の構成要素を用いて行われ得る。図２～図１８に示され、本明細書に記載されるＲＮＡ配列決定のための方法のうちのいずれかは、同じ試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを調製する場合に使用され得る。図２２～図２８はまた、ＲＮＡが、方法の間に、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖又は二本鎖ＤＮＡに変換され得る例示的な方法を示す。
いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を適用することを含む。これらの方法は、ＲＮＡ配列決定ライブラリを使用するために列挙された方法と類似の構成要素を用いて行われ得る。図２～図１８に示され、本明細書に記載されるＲＮＡ配列決定のための方法のうちのいずれかは、同じ試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを調製する場合に使用され得る。図２２～図２８はまた、ＲＮＡが、方法の間に、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖又は二本鎖ＤＮＡに変換され得る例示的な方法を示す。
【0566】
いくつかの実施形態では、本方法は、タグメンテーションに基づくライブラリ調製により、全核酸（total nucleic acid、ＴＮＡ）試料のＲＮＡに由来する試料及びＤＮＡに由来する試料の配列決定を解決することができる。いくつかの実施形態では、方法は、単一の反応容器がＲＮＡ及びＤＮＡライブラリを生成することを可能にする。
【0567】
いくつかの実施形態では、方法は、配列決定された断片の起源であった核酸の鎖を区別することができる「指向性」ライブラリ調製を可能にする。
【0568】
いくつかの実施形態では、異なる方法の態様を組み合わせて、「鎖」ＲＮＡ及びＤＮＡタグメンテーションベースの配列決定ライブラリを生成することができる。
【0569】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列決定ライブラリは、単一の試料反応から生成され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列決定ライブラリは、単一の反応容器中で生成され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ゲノム及びトランスクリプトーム又は他の情報を１つの反応で捕捉することができ、これは、マルチオミクスアッセイと称され得る。
【0570】
様々な方法が、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を用いて使用され得、同じ試料からのＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリの調製を可能にする。いくつかの実施形態では、これらの方法は、ＲＮＡ－ＢＬＴによるＤＮＡのタグメンテーションを回避する。代わりに、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中のＲＮＡは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖断片化のために設計されたＢＬＴ（ＲＮＡ ＢＬＴ）によってタグメンテーションされ、試料中のＤＮＡは、ＤＮＡ断片化のために設計されたＢＬＴ（ＤＮＡ ＢＬＴ）によってタグメンテーションされる。
【0571】
図２１は、これらの方法における課題、すなわち、ＤＮＡ自体が、ＲＮＡ ＢＬＴ上に存在するであろうトランスポソームに結合することができることを提示する。本出願は、ＲＮＡ ＢＬＴによるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションを特定するためのいくつかの方法を記載する。これらの方法は、ＲＮＡ ＢＬＴによるＤＮＡのタグメンテーションを回避する。図２２～図２８は、ＤＮＡ ＢＬＴによるＤＮＡのタグメンテーション（ＤＮＡ特異的バーコードを組み込むためなど）及びＲＮＡ ＢＬＴによってＲＮＡから調製されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖又は二本鎖ＤＮＡのタグメンテーション（ＲＮＡ特異的バーコードを組み込むためなど）を可能にする例示的なワークフローを提供する。
【0572】
いくつかの実施形態では、第１のタグ及び第２のタグは異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のタグは、ＲＮＡ配列決定ライブラリの断片をＤＮＡ配列決定ライブラリの断片から区別することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ ＢＬＴによる断片化を同定するためのインデックスは、「ｉＤＮＡ」又はＤＮＡ ＢＬＴを識別するインデックスと称される（図２１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ ＢＬＴによる断片化を同定するためのインデックスは、「ｉＲＮＡ」又はＲＮＡ ＢＬＴを同定するインデックスと称される（図２１を参照されたい）。
【0573】
そのようなワークフローの課題は、二本鎖ＤＮＡ基質をＲＮＡ ＢＬＴではなくＤＮＡ ＢＬＴのみに導くことである。図２１は、ＤＮＡ分子が、トランスポソーム複合体に直接結合する能力により、ＲＮＡ ＢＬＴに対する親和性を有することを要約する。本方法は、試料がＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む場合に、ＲＮＡ断片化をＲＮＡ ＢＬＴに、及びＤＮＡ断片化をＤＮＡ ＢＬＴに効率的に導くための様々な方式を記載する。
【0574】
Ａ．３つのビーズを使用する方法
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、３つのビーズを使用する。３つのビーズを用いた例示的な方法を図２４に示す。いくつかの実施形態では、これらの３つのビーズは、ＲＮＡ ＢＬＴ、ＤＮＡ ＢＬＴ、及び「ＲＮＡ捕捉ビーズ」であり得る。ＲＮＡ捕捉ビーズは、ＲＮＡタグメンテーションをもたらすことなく（すなわち、ＲＮＡ捕捉ビーズは活性トランスポソーム複合体を欠く）、ＲＮＡを捕捉するためのポリＴ捕捉オリゴヌクレオチド又は別の薬剤を含み得る。ＤＮＡタグメンテーション及びＲＮＡ捕捉ビーズによるＲＮＡの捕捉の後、ＲＮＡは、ＲＮＡ捕捉ビーズからＲＮＡ ＢＬＴに転移される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、３つのビーズを使用する。３つのビーズを用いた例示的な方法を図２４に示す。いくつかの実施形態では、これらの３つのビーズは、ＲＮＡ ＢＬＴ、ＤＮＡ ＢＬＴ、及び「ＲＮＡ捕捉ビーズ」であり得る。ＲＮＡ捕捉ビーズは、ＲＮＡタグメンテーションをもたらすことなく（すなわち、ＲＮＡ捕捉ビーズは活性トランスポソーム複合体を欠く）、ＲＮＡを捕捉するためのポリＴ捕捉オリゴヌクレオチド又は別の薬剤を含み得る。ＤＮＡタグメンテーション及びＲＮＡ捕捉ビーズによるＲＮＡの捕捉の後、ＲＮＡは、ＲＮＡ捕捉ビーズからＲＮＡ ＢＬＴに転移される。
【0575】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、
その上に固定化された第１の捕捉オリゴヌクレオチドを有する第２の固体支持体と、に適用することであって、
試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、ＲＮＡが第２の固体支持体上の第１の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、
第２の固体支持体に結合したＲＮＡを、第３の固体支持体に転移させることであって、第３の固体支持体が、その上に固定化された、転移されたＲＮＡに結合する第２の捕捉オリゴヌクレオチドと、第２のトランスポソーム複合体とを有し、第２のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第２のポリヌクレオチドと、を含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、含む、転移させることと、
ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化して、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、
その上に固定化された第１の捕捉オリゴヌクレオチドを有する第２の固体支持体と、に適用することであって、
試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、ＲＮＡが第２の固体支持体上の第１の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、
第２の固体支持体に結合したＲＮＡを、第３の固体支持体に転移させることであって、第３の固体支持体が、その上に固定化された、転移されたＲＮＡに結合する第２の捕捉オリゴヌクレオチドと、第２のトランスポソーム複合体とを有し、第２のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第２のポリヌクレオチドと、を含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、含む、転移させることと、
ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化して、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
【0576】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリＴ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、第１及び／又は第２の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のトランスポソーム複合体は、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、方法は、試料を固体支持体に適用した後に固体支持体を洗浄して、あらゆる未結合のＤＮＡ又はＲＮＡを除去することを更に含む。
【0577】
Ｂ．２つのビーズ：機能的トランスポソームを欠くＤＮＡ ＢＬＴ及びＲＮＡビーズを使用する方法
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、２つのビーズは、ＤＮＡ ＢＬＴ及び「裸の」ＲＮＡビーズである。本明細書で使用される場合、「裸の」ＢＬＴは、トランスポソーム複合体を連結することができるが、連結された活性トランスポソーム複合体を有さないビーズを指す。例えば、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム複合体の活性に必要なトランスポザーゼ又は別の必須構成要素を欠いていてもよい。したがって、「裸の」ＢＬＴは、断片化を可能にするために、更なる構成要素が後の工程中に付加されることを可能にする。「裸の」ＲＮＡ ＢＬＴの使用は、ＲＮＡ断片化のタイミングの制御を可能にする。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、２つのビーズは、ＤＮＡ ＢＬＴ及び「裸の」ＲＮＡビーズである。本明細書で使用される場合、「裸の」ＢＬＴは、トランスポソーム複合体を連結することができるが、連結された活性トランスポソーム複合体を有さないビーズを指す。例えば、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム複合体の活性に必要なトランスポザーゼ又は別の必須構成要素を欠いていてもよい。したがって、「裸の」ＢＬＴは、断片化を可能にするために、更なる構成要素が後の工程中に付加されることを可能にする。「裸の」ＲＮＡ ＢＬＴの使用は、ＲＮＡ断片化のタイミングの制御を可能にする。
【0578】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体は、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分を含む。いくつかの実施形態では、第１の固体支持体は、第１のタグを更に含む。
【0579】
いくつかの実施形態では、第２の固体支持体は、その上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを有し、第２のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む。いくつかの実施形態では、第２のタグは、ＲＮＡ特異的バーコードを含む。
【0580】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、
捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドが上に固定化された第２の固体支持体であって、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む、第２の固体支持体と、に適用することであって、試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、ＲＮＡが第２の固体支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、
トランスポザーゼを、トランスポザーゼが第２のポリヌクレオチドに結合して、第２の固体支持体上にトランスポソーム複合体を形成する条件下で、付加することと、
ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化して、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、
捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドが上に固定化された第２の固体支持体であって、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む、第２の固体支持体と、に適用することであって、試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、ＲＮＡが第２の固体支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、
トランスポザーゼを、トランスポザーゼが第２のポリヌクレオチドに結合して、第２の固体支持体上にトランスポソーム複合体を形成する条件下で、付加することと、
ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化して、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
【0581】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリＴ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、第１及び／又は第２の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のトランスポソーム複合体は、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、方法は、試料を固体支持体に適用した後に固体支持体を洗浄して、あらゆる未結合のＤＮＡ又はＲＮＡを除去することを更に含む。
【0582】
Ｃ．２つのビーズ：ＤＮＡ ＢＬＴ及び不活性化ＲＮＡ ＢＬＴを使用する方法
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、２つのビーズは、ＤＮＡ ＢＬＴ及び「不活性化」ＲＮＡ ＢＬＴである。本明細書で使用される場合、「不活性化」ＲＮＡ ＢＬＴは、可逆的に不活性化されたＲＮＡ ＢＬＴを指す。したがって、「不活性化」ＲＮＡ ＢＬＴは、断片化を可能にするための後の工程中の活性化を可能にする。したがって、「不活性化」ＲＮＡビーズの使用は、ＲＮＡ断片化のタイミングの制御を可能にする。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、２つのビーズは、ＤＮＡ ＢＬＴ及び「不活性化」ＲＮＡ ＢＬＴである。本明細書で使用される場合、「不活性化」ＲＮＡ ＢＬＴは、可逆的に不活性化されたＲＮＡ ＢＬＴを指す。したがって、「不活性化」ＲＮＡ ＢＬＴは、断片化を可能にするための後の工程中の活性化を可能にする。したがって、「不活性化」ＲＮＡビーズの使用は、ＲＮＡ断片化のタイミングの制御を可能にする。
【0583】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、可逆的に不活性化される捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のトランスポソーム複合体が上に固定化されたＲＮＡを固定化するための第２の固体支持体であって、トランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む、第２の固体支持体と、に適用することであって、試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、ＲＮＡが第２の固体支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、
ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
第２のトランスポソーム複合体を活性化することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、活性化された第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化して、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体であって、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含む、第１の固体支持体と、可逆的に不活性化される捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のトランスポソーム複合体が上に固定化されたＲＮＡを固定化するための第２の固体支持体であって、トランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む、第２の固体支持体と、に適用することであって、試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択で、タグ付けされ、ＲＮＡが第２の固体支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、第１及び第２の固体支持体の混合物に適用される、適用することと、
ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
第２のトランスポソーム複合体を活性化することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、活性化された第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化して、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
【0584】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム複合体に結合したトランスポソーム不活性化剤によって可逆的に不活性化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム不活性化剤は、トランスポソーム複合体のＴｎ５結合部位に結合される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム不活性化剤は、脱リン酸化ＭＥ’、余分な塩基、阻害剤二重鎖、及び／又は易熱性抗体を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム不活性化剤の除去によって活性化される。
【0585】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ポリＴ配列を含む。いくつかの実施形態ではＲＮＡは、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のトランスポソーム複合体は、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、方法は、試料を適用した後に固体支持体を洗浄して、あらゆる未結合のＤＮＡ又はＲＮＡを除去することを更に含む。
【0586】
Ｄ．ＤＮＡ及びＲＮＡの連続固定化を伴う２つのビーズを使用する方法
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、試料中のＤＮＡ及びＲＮＡは、別個の固体支持体上に連続的に固定化される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、試料中のＤＮＡ及びＲＮＡは、別個の固体支持体上に連続的に固定化される。
【0587】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡを固定化するための第１の固体支持体に適用することであって、第１の固体支持体が、その上に固定化された第１のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、第１のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、任意選択で第１のタグと、を含み、試料は、ＤＮＡが第１の固体支持体上の第１のトランスポソーム複合体に結合し、断片化され、任意選択でタグ付けされる条件下で適用される、適用することと、
結合したＤＮＡを有する第１の固体支持体をＲＮＡから分離することと、
捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のトランスポソーム複合体が上に固定化されたＲＮＡを固定化するための第２の固体支持体にＲＮＡを適用することであって、第２のトランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含み、ＲＮＡが、第２の固体支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する、適用することと、
ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、活性化された第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化して、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
結合したＤＮＡを有する第１の固体支持体をＲＮＡから分離することと、
捕捉オリゴヌクレオチド及び第２のトランスポソーム複合体が上に固定化されたＲＮＡを固定化するための第２の固体支持体にＲＮＡを適用することであって、第２のトランスポソーム複合体が、第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含み、ＲＮＡが、第２の固体支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合する、適用することと、
ｃＤＮＡを合成し、第２の捕捉オリゴヌクレオチド上に固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する条件下で、逆転写酵素ポリメラーゼを付加することと、
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖が一方の鎖の５’末端上にタグ付けされる条件下で、活性化された第２のトランスポソーム複合体を用いてＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化して、それによって、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを産生することであって、少なくとも１つの鎖が、第１のタグで５’タグ付けされている、産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＲＮＡ鎖の５’末端である。いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端は、ＤＮＡ鎖の５’末端である。
【0588】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ポリＴ配列を含む。いくつかの実施形態ではＲＮＡは、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上の少なくとも部分に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のトランスポソーム複合体は、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡを適用する工程の後に固体支持体を洗浄して、あらゆる未結合のＲＮＡを除去することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、結合したＤＮＡを有する第１の固体支持体を、タグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリと再度組み合わせることを更に含む。
【0589】
Ｅ．ＤＮＡ及びＲＮＡの連続固定化並びに二本鎖ｃＤＮＡの調製を伴う２つのビーズを使用する方法
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡから生成されたＤＮＡ及び二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ－ｃＤＮＡ）は、別個の固体支持体上に連続的に固定化される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡから生成されたＤＮＡ及び二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ－ｃＤＮＡ）は、別個の固体支持体上に連続的に固定化される。
【0590】
いくつかの実施形態では、タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法は、ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、ＤＮＡを固定化することと、第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、ｃＤＮＡを固定化するために、試料を第２の固体支持体と組み合わせることであって、第２の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＲＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、ｃＤＮＡを固定化し、第２の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、を含む。
【0591】
いくつかの実施形態では、ｄｓ－ｃＤＮＡは、溶液中で生成される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の固体支持体は、第２の固体支持体上でタグメンテーションを行った後に組み合わされ、各固体支持体は、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む固定化タグ付き断片を有する。
【0592】
いくつかの実施形態では、方法は、第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後、及びＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製する前に、試料の残りからのＤＮＡ特異的バーコードを含む固定化タグ付き断片を有する第１の固体支持体を分割することを含む。
【0593】
いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡを固定化した後、及び第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製する前に、固定化ＤＮＡを有する第１の固体支持体を試料の残りから分割することを含む。
【0594】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することは、鋳型スイッチングによって行われる。
【0595】
Ｆ．ＤＮＡ及びＲＮＡの連続固定化並びにＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の調製を伴う２つのビーズを使用する方法
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡから生成されたＤＮＡ及びＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、別個の固体支持体上に連続的に固定化される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付きＤＮＡ：ＲＮＡ断片の固定化ライブラリを調製する方法は、２つの固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡから生成されたＤＮＡ及びＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、別個の固体支持体上に連続的に固定化される。
【0596】
いくつかの実施形態では、タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法は、ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、ＤＮＡを固定化することと、第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、ＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生することと、ＤＮＡ：二重鎖を固定化するために、試料を第２の固体支持体と組み合わせることであって、第２の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対する活性を有するトランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＲＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を固定化し、第２の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＲＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、を含む。
【0597】
いくつかの実施形態では、方法は、第２の固体支持体上でタグメンテーションを行った後に、第１及び第２の固体支持体を組み合わせることを更に含み、各固体支持体は、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む固定化タグ付き断片を有する。
【0598】
いくつかの実施形態では、方法は、第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後、及びＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生する前に、試料の残りからのＤＮＡ特異的バーコードを含む固定化タグ付き断片を有する第１の固体支持体を分割することを更に含む。
【0599】
いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡを固定化した後、及び第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製する前に、固定化ＤＮＡを有する第１の固体支持体を試料の残りから分割することを更に含む。
【0600】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、溶液中で生成される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の固体支持体は、第２の固体支持体上でタグメンテーションを行った後に組み合わされ、各固体支持体は、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む固定化タグ付き断片を有する。
【0601】
Ｇ．２つのビーズを使用する方法：ＤＮＡ ＢＬＴ及び液相ｃＤＮＡを用いるＤＮＡタグメンテーション又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖タグメンテーション
いくつかの実施形態では、試料中のＤＮＡは、ＤＮＡ ＢＬＴを使用してタグメンテーションされ得、次いで、ＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、溶液中でタグメンテーションされる。言い換えれば、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、タグ付きＤＮＡ断片を調製した後に液相トランスポソーム複合体と反応し得る。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションは、捕捉プローブにハイブリダイズすることができる配列を組み込む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から生成されたタグ付き断片は、その表面上に捕捉プローブを含む固体支持体によって結合され得る。
いくつかの実施形態では、試料中のＤＮＡは、ＤＮＡ ＢＬＴを使用してタグメンテーションされ得、次いで、ＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、溶液中でタグメンテーションされる。言い換えれば、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、タグ付きＤＮＡ断片を調製した後に液相トランスポソーム複合体と反応し得る。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションは、捕捉プローブにハイブリダイズすることができる配列を組み込む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から生成されたタグ付き断片は、その表面上に捕捉プローブを含む固体支持体によって結合され得る。
【0602】
いくつかの実施形態では、タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法は、ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、ＤＮＡを固定化することと、第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、溶液中で二本鎖ＤＮＡに対してタグメンテーションを行って、二本鎖ｃＤＮＡのタグ付き断片を調製することであって、溶液中のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列、ＲＮＡ特異的バーコード、及び捕捉プローブにハイブリダイズする配列を含むトランスポゾンと、を含み、タグ付き断片が、ＲＮＡ特異的バーコードと、捕捉プローブにハイブリダイズする配列と、を含む、調製することと、試料を、捕捉プローブを含む表面を有する第２の固体支持体と組み合わせることと、第２の固体支持体上に二本鎖ｃＤＮＡのタグ付き断片を固定化することと、を含む。
【0603】
いくつかの実施形態では、方法は、第２の固体支持体上で二本鎖ｃＤＮＡのタグ付き断片を固定化した後に、第１及び第２の固体支持体を組み合わせることを更に含み、各固体支持体は、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む固定化タグ付き断片を有する。
【0604】
いくつかの実施形態では、方法は、第１の固体支持体上でタグメンテーションを行った後、及びＲＮＡからの二本鎖ｃＤＮＡの前に、試料の残りからのＤＮＡ特異的バーコードを含む固定化タグ付き断片を有する第１の固体支持体を分割することを更に含む。
【0605】
いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡを固定化した後、及び第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製する前に、固定化ＤＮＡを有する第１の固体支持体を試料の残りから分割することを更に含む。
【0606】
いくつかの実施形態では、タグ付き断片が、ＤＮＡ特異的バーコード又はＲＮＡ特異的バーコードのいずれかを含む、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からタグ付き断片の固定化ライブラリを調製する方法は、ＤＮＡを固定化するために、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料を、第１の固体支持体と組み合わせることであって、第１の固体支持体が、その上に固定化されたトランスポソーム複合体を含み、トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列及びＤＮＡ特異的バーコードを含むトランスポゾンと、を含む、組み合わせることと、ＤＮＡを固定化することと、第１の固体支持体上でタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを含むタグ付き断片を調製することと、ＲＮＡからｃＤＮＡの一本鎖を調製して、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生することと、溶液中でＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対してタグメンテーションを行って、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグ付き断片を調製することであって、溶液中のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列、ＲＮＡ特異的バーコード、及び捕捉プローブにハイブリダイズする配列を含むトランスポゾンと、を含み、タグ付き断片が、ＲＮＡ特異的バーコード及び捕捉プローブにハイブリダイズする配列を含む、調製することと、試料を、捕捉プローブを含む表面を有する第２の固体支持体と組み合わせることと、第２の固体支持体上にＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグ付き断片を固定化することと、を含む。
【0607】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、核酸を含む。
【実施例】
【0608】
実施例
実施例１．捕捉オリゴヌクレオチドを含むＢＬＴを使用するＲＮＡ配列決定ライブラリの調製
ＲＮＡ配列決定ライブラリは、本明細書に記載される方法を使用して、ＲＮＡを含む試料由来の完全長全ＲＮＡから調製され得る。
実施例１．捕捉オリゴヌクレオチドを含むＢＬＴを使用するＲＮＡ配列決定ライブラリの調製
ＲＮＡ配列決定ライブラリは、本明細書に記載される方法を使用して、ＲＮＡを含む試料由来の完全長全ＲＮＡから調製され得る。
【0609】
試料由来のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡテールをビーズ上のポリＴ捕捉オリゴヌクレオチドに結合させることによって、ＲＮＡビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）に固定化することができる。
【0610】
次いで、逆転写酵素をｃＤＮＡ合成のために使用する。逆転写酵素ポリメラーゼを使用して、ビーズに結合した標的ＲＮＡからのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する。ｃＤＮＡ合成のための例示的な試薬としては、逆転写酵素、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、及び／又はＲｎａｓｅ阻害剤が挙げられる。ランダムプライマー及びオリゴｄＴプライマーの両方が、ｃＤＮＡ合成反応において使用され得る。
【0611】
ｃＤＮＡ合成反応は、４２℃で９０分間、及び次いで８５℃で５分間実行され得る。ｃＤＮＡ合成後に試料を洗浄する必要はない。
【0612】
ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションは、次いで、ＲＮＡ ＢＬＴを用いて行われ得る。ＲＮＡ ＢＬＴを生成するために使用され得る様々なＢＬＴが記載されている。ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のタグメンテーションは、トランスポソームによってビーズに固定化されるＤＮＡ：ＲＮＡ断片を生成するように機能する。
【0613】
ＢＬＴのトランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み得、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含む。このようにして、第１のタグは、ＤＮＡ：ＲＮＡ断片の生成中に組み込まれる。
【0614】
断片化後、鎖交換及びギャップ充填ライゲーションを行う。いくつかの実施形態では、第２のタグメンテーション反応を行って、一方の末端が溶液中にある二本鎖ＤＮＡ断片を生成する。第２のタグメンテーション反応は、第２のタグを組み込み得る。
【0615】
次いで、ライブラリは、チューブ内又はフローセル内で行われ得る更なる方法のために放出され得る。この方法は、ｍＲＮＡの完全長の配列を提供する方法を可能にする。
【0616】
そのような方法は、溶液中でトランスポソームに結合することができる固定化オリゴヌクレオチドを含む活性化可能なＢＬＴとともに使用することもできる。そのようなビーズは図１３に示されており、第２のトランスポゾン中のＡ’配列は、トランスポソームに結合するために使用される固定化ポリヌクレオチド中の短Ａ配列に結合することができる。固定化オリゴヌクレオチドはまた、図１３に示されるように、アダプター（Ｐ５配列など）及びビーズコード（ＢＣ）を含み得る。
【0617】
実施例２．３つのビーズを使用するマルチオミクス配列決定ライブラリの調製
図２４に示されるように、３つのビーズを使用するアプローチを使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを生成することができる。この方法は、ＲＮＡに結合することができるがトランスポソームを有さないＲＮＡ捕捉ビーズを利用する。
図２４に示されるように、３つのビーズを使用するアプローチを使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを生成することができる。この方法は、ＲＮＡに結合することができるがトランスポソームを有さないＲＮＡ捕捉ビーズを利用する。
【0618】
この方法では、ＲＮＡがＲＮＡ捕捉ビーズによって捕捉されている間に、ＤＮＡ ＢＬＴをＤＮＡタグメンテーションに使用することができる。洗浄後、ＲＮＡをＲＮＡ捕捉ビーズからＲＮＡ ＢＬＴに転移させる。逆転写後、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化し、活性ＲＮＡ ＢＬＴによってタグ付けすることができる。鎖交換及びギャップ充填ライゲーションの後、次いで、ＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリをそれぞれのＢＬＴから放出することができる。
【0619】
実施例３．活性トランスポソーム複合体を欠くＤＮＡ ＢＬＴ及びＲＮＡビーズを使用するマルチオミクス配列決定ライブラリの調製
図２３に示されるように、トランスポザーゼを欠くＤＮＡ ＢＬＴ及びＲＮＡ ＢＬＴ、続いてＲＮＡ ＢＬＴを生成するためのトランスポザーゼの付加を使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを生成することができる。ＲＮＡと結合するが、トランスポザーゼを欠くＢＬＴは、「裸の」ＲＮＡ ＢＬＴと称され得る。
図２３に示されるように、トランスポザーゼを欠くＤＮＡ ＢＬＴ及びＲＮＡ ＢＬＴ、続いてＲＮＡ ＢＬＴを生成するためのトランスポザーゼの付加を使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを生成することができる。ＲＮＡと結合するが、トランスポザーゼを欠くＢＬＴは、「裸の」ＲＮＡ ＢＬＴと称され得る。
【0620】
この方法では、ＲＮＡが裸のＲＮＡ ＢＬＴによって捕捉されている間に、ＤＮＡ ＢＬＴを使用してＤＮＡをタグメンテーションすることができる。洗浄後、ＲＮＡ ＢＬＴを活性化するためにトランスポザーゼを付加する。逆転写後、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、活性ＲＮＡ ＢＬＴによってタグメンテーションされ得る。鎖交換及びギャップ充填ライゲーションの後、次いで、ＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリをそれぞれのＢＬＴから放出することができる。
【0621】
実施例４．ＤＮＡ ＢＬＴ及び不活性化ＲＮＡ ＢＬＴを使用するマルチオミクス配列決定ライブラリの調製
ＤＮＡ ＢＬＴ及び可逆的に「不活性化された」ＲＮＡ ＢＬＴを使用して、図２２に示されるように、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを生成することができる。
ＤＮＡ ＢＬＴ及び可逆的に「不活性化された」ＲＮＡ ＢＬＴを使用して、図２２に示されるように、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを生成することができる。
【0622】
この方法では、ＤＮＡ ＢＬＴは、ＤＮＡをタグメンテーションするために使用され得るが、一方で、ＲＮＡは、不活性化ＲＮＡ ＢＬＴによって捕捉される。洗浄後、ＲＮＡ ＢＬＴの不活性化は逆転される（すなわち、ＲＮＡ ＢＬＴのトランスポソーム複合体が活性化される）。活性化後、逆転写を行い、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を断片化し、活性ＲＮＡ ＢＬＴによってタグ付けすることができる。鎖交換及びギャップ充填ライゲーションの後、次いで、ＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリをそれぞれのＢＬＴから放出することができる。
【0623】
脱リン酸化ＭＥ’、トランスポゾン末端上の余分な切断可能塩基、トランスポソームに結合することができる阻害剤二重鎖、及びトランスポザーゼのＤＮＡ結合部位に複合体を形成することができる易熱性抗体など、様々な可逆的トランスポソーム不活性化剤が既知である。
【0624】
実施例５：ＤＮＡ及びＲＮＡの連続固定化を伴う２つのビーズを使用するマルチオミクス配列決定ライブラリの調製
図２５に示されるように、連続工程を使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを生成することができる。ＤＮＡはＤＮＡ ＢＬＴによって捕捉することができ、ＤＮＡはタグメンテーションされる。この工程は、二本鎖ＤＮＡの全てがＤＮＡ ＢＬＴに結合するように、過剰のビーズを用いて行われる。次いで、ＲＮＡは、タグメンテーションされたＤＮＡ ＢＬＴから分割される（すなわち、物理的に分離（separated）又は分離（segregated）される）。次いで、ポリＴ捕捉オリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ ＢＬＴによってＲＮＡを捕捉し、逆転写酵素ポリメラーゼによってＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖を生成する。ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡ ＢＬＴのトランスポソーム複合体によってタグメンテーションすることができる。鎖交換及びギャップ充填ライゲーションの後、次いで、ＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリをそれぞれのＢＬＴから放出することができる。
図２５に示されるように、連続工程を使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料からＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリを生成することができる。ＤＮＡはＤＮＡ ＢＬＴによって捕捉することができ、ＤＮＡはタグメンテーションされる。この工程は、二本鎖ＤＮＡの全てがＤＮＡ ＢＬＴに結合するように、過剰のビーズを用いて行われる。次いで、ＲＮＡは、タグメンテーションされたＤＮＡ ＢＬＴから分割される（すなわち、物理的に分離（separated）又は分離（segregated）される）。次いで、ポリＴ捕捉オリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ ＢＬＴによってＲＮＡを捕捉し、逆転写酵素ポリメラーゼによってＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖を生成する。ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡ ＢＬＴのトランスポソーム複合体によってタグメンテーションすることができる。鎖交換及びギャップ充填ライゲーションの後、次いで、ＲＮＡ及びＤＮＡ配列決定ライブラリをそれぞれのＢＬＴから放出することができる。
【0625】
実施例６：溶液中でのｃＤＮＡ合成によるＲＮＡ配列決定ライブラリの調製
いくつかの方法では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴに結合する前に溶液中で生成される。この方法では、ＢＬＴは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に結合する捕捉オリゴヌクレオチドを含み得る。代替的に、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、トランスポソーム複合体のトランスポザーゼによって結合され得る。
いくつかの方法では、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＢＬＴに結合する前に溶液中で生成される。この方法では、ＢＬＴは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に結合する捕捉オリゴヌクレオチドを含み得る。代替的に、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、トランスポソーム複合体のトランスポザーゼによって結合され得る。
【0626】
標的ＲＮＡを含む試料は、溶液中でｃＤＮＡを生成するために使用され得る。完全長ｃＤＮＡを生成するための例示的な溶液は、逆転写酵素、プライマー、ｄＮＴＰ、及び／又はＲｎａｓｅ阻害剤を含み得る。オリゴｄＴプライマーを使用して、ｍＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを調製することができる。オリゴｄＴプライマー及びランダムプライマーを使用して、完全長全ＲＮＡを調製することができる。ｃＤＮＡ合成は、４２℃で９０分間、続いて８５℃で５分間、洗浄せずに行うことができる。このようにして、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、溶液中で生成される（図２に示されるように）。
【0627】
これらのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、タグメンテーションのためにＢＬＴに結合され得る。このタグメンテーションは、以前はＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ技術として知られていた、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ（研究用途のみ、ＲＵＯ）技術を用いて行うことができ、これは、２つの異なるトランスポソーム複合体を使用して、断片の反対の末端に異なるアダプター配列を組み込む。代替的に、対称タグメンテーションのためにＢＬＴを使用し、続いて別のアダプターを導入するためにプライマー伸長を使用する方法が使用され得る。
【0628】
固定化されたＤＮＡ：ＲＮＡ断片を生成した後、トランスポザーゼは、停止又は除去され得る（例えば、ＳＤＳによって）。鎖交換は、二本鎖ＤＮＡを生成することができ、続いてギャップ充填及びライゲーションが行われる。その後、調製されたライブラリが放出され得る。方法は、チューブ内又はフローセル内で行われ得る。図３Ａ～図３Ｃは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成し、続いて固定化トランスポソーム複合体を含むビーズによる断片化を行うために、ユニバーサルヒト参照ＲＮＡからの溶液中のｃＤＮＡ合成を使用して生成されたＲＮＡ配列決定ライブラリからの代表的な配列決定の結果を示す。ライブラリを転写物から首尾よく生成し、エキソン配列とアラインメントさせた。これらのデータは、配列リードが元の転写物分子の全長を表すため、溶液中のＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の生成を含む方法を使用した場合の配列決定結果における３’バイアスの相対的欠如を支持する。この方法を使用する自動化されたワークフローは、最小限の使用者のインプットで全ＲＮＡから配列決定可能なライブラリを生成することができる。
【0629】
図９は、ポリＴプライマー並びにＢＬＴに対するタグメンテーション及びライブラリ調製を用いる溶液中でのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の調製をどのように使用して、完全長ｍＲＮＡからライブラリを調製することができるかを示す。図１０は、ランダマープライマー並びにＢＬＴに対するタグメンテーション及びライブラリ調製を用いる溶液中でのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の調製をどのように使用して、全ＲＮＡからライブラリを調製することができるかを示す。両方の方法について、ライブラリは、ＢＬＴ上で調製され得、フローセル又はチューブ内に放出され得る。フローセル内でのこのような放出は、空間的に局在化された様式での放出を可能にすることができ、その結果、同じ完全長ＲＮＡ又はｍＲＮＡ由来の断片は、これらの断片が同じビーズ上で調製されたため、フローセル上で非常に近接して放出される。
【0630】
実施例７．二重ＲＮＡ／ＤＮＡバーコーディング及び分割を使用するマルチオミクス配列決定ライブラリの調製
方法は、ＮＧＳリードにおいて同定可能である異なるオリゴヌクレオチドインデックス配列を有するビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）を生成することができる（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３５：８５２－８５７（２０１７）を参照されたい）。異なるオリゴヌクレオチドインデックスを有するＢＬＴをライブラリ調製ワークフローの間に適用して、ＲＮＡ及びＤＮＡ由来ＮＧＳリードを同定するために使用される差次的分子タグを組み込む。
方法は、ＮＧＳリードにおいて同定可能である異なるオリゴヌクレオチドインデックス配列を有するビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）を生成することができる（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３５：８５２－８５７（２０１７）を参照されたい）。異なるオリゴヌクレオチドインデックスを有するＢＬＴをライブラリ調製ワークフローの間に適用して、ＲＮＡ及びＤＮＡ由来ＮＧＳリードを同定するために使用される差次的分子タグを組み込む。
【0631】
代表的な方法を図２６に示す。まず、ＤＮＡ標的物質を同定するオリゴヌクレオチドインデックス（「ＤＮＡ特異的バーコード」）をロードしたＢＬＴを、全核酸（ＴＮＡ）試料に適用する。試料中の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を、ＤＮＡバーコードＢＬＴ（ＤＮＡ ＢＬＴ）によって特異的にタグメンテーションする。磁気スタンド分離を適用して、ＤＮＡ ＢＬＴ上のタグメンテーションされたＤＮＡ断片を、溶液中のＲＮＡ分子から分割することができる。次いで、分離されたＲＮＡ分子を、「鎖」及び「非鎖」合成法を含む、当業者に既知の逆転写及び第２の鎖合成法によって、ｄｓ相補的ＤＮＡ（ｄｓ－ｃＤＮＡ）に完全に変換する。次いで、ＲＮＡ同定バーコード（ＲＮＡ ＢＬＴ上の「ＲＮＡ特異的バーコード」）を有するＢＬＴを適用して、ｄｓ－ｃＤＮＡ試料をタグメンテーションする。
【0632】
次いで、２つのタグメンテーションライブラリを組み合わせて、一緒に又は別々に増幅することができる。後者は、ＲＮＡ及びＤＮＡ由来ライブラリ分子の異なる増幅レベルを特定するのに有利であり得る。代替的に、ＲＮＡ特異的バーコード及びＤＮＡ特異的バーコードはまた、異なるプライマー結合配列を含んでもよく、これは、異なるＰＣＲ条件（例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ増幅プライマーセットに対する異なる増幅サイクル数）を通じて差次的なＲＮＡ及びＤＮＡライブラリ増幅を可能にし得る。ＲＮＡ及びＤＮＡライブラリが別々に増幅される場合、インデックス付きトランスポソームの代わりにＰＣＲ試料インデックスを使用して、ＮＳＧリードをＲＮＡ又はＤＮＡ分子起源を有するものとして同定することができる。
【0633】
増幅後、ＲＮＡ及びＤＮＡライブラリは、直接配列決定され得るか、又は配列決定の前に標的化領域について富化され得る。ＲＮＡ特異的バーコード又はＤＮＡ特異的バーコードのいずれかが全てのライブラリ断片で配列決定されるため、これらのバーコードは、二次バイオインフォマティクス分析の間に、ＤＮＡに由来する試料をＲＮＡに由来する試料から選別するために使用することができる。
【0634】
実施例８．単一の反応容器中でのＢＬＴタグメンテーション及び二重ＲＮＡ／バーコーディングを用いたマルチオミクス配列決定ライブラリの調製
マルチオミクス配列決定ライブラリの調製はまた、分割することなく、単一の反応容器（すなわち、単一ポットスキーム）において行われ得る。
マルチオミクス配列決定ライブラリの調製はまた、分割することなく、単一の反応容器（すなわち、単一ポットスキーム）において行われ得る。
【0635】
ＤＮＡ特異的バーコードＢＬＴ（ＤＮＡ ＢＬＴ）タグメンテーションを、実施例７のようにＴＮＡ試料に対して行う。ＤＮＡタグメンテーション反応が完了した後、合成ｄｓＤＮＡを含む「自殺ｄｓＤＮＡ」基質を付加することができる。合成ｄｓＤＮＡの目的は、ＤＮＡバーコードＢＬＴ（ＤＮＡ ＢＬＴ）を飽和し、任意の残りの未反応のＤＮＡ ＢＬＴを占有する（及びそれによってタグメンテーションされる）ことである。これは、未反応のＤＮＡ ＢＬＴが下流工程においてＲＮＡ由来基質と交差反応することを防止する。例示的な自殺は、ウラシル含有ｄｓＤＮＡであり、これはタグメンテーションのための基質であるが、ウラシル不耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ反応において増幅されない。
【0636】
同じ反応チューブにおいて、ｄｓＤＮＡタグメンテーションの後、溶液中のＲＮＡ分子からｄｓ－ｃＤＮＡが生成される。このｃＤＮＡ合成は、「鎖ライブラリ」を生成するための２工程（例えば、「自殺ｄｓＤＮＡ」と同様の効果を有する、ウラシル塩基による第２の鎖合成を使用する）、又は鋳型スイッチオリゴヌクレオチド及び適合性逆転写酵素（例えば、ＳＭＲＴ－ｓｅｑ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用する１工程で達成され得る。ｄｓ－ｃＤＮＡが生成されると、ＲＮＡ特異的バーコードＢＬＴ（ＲＮＡ ＢＬＴ）を適用して、これらの基質分子を特異的にタグメンテーションする。２つのタグメンテーション産物をきれいにし、一緒に溶出する（同じチューブ内で）。ＤＮＡ ＢＬＴ対ＲＮＡ ＢＬＴに対するタグメンテーションの間に組み込まれた差次的プライマー結合配列はまた、差次的ＲＮＡ及びＤＮＡライブラリ増幅レベルを可能にし得る。ＲＮＡ及びＤＮＡ由来分子の任意の富化、配列決定、及びバイオインフォマティクスデコンボリューションは、実施例７のように実施することができる。
【0637】
実施例９．ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対する活性を有するトランスポザーゼを使用する二重ＲＮＡ／ＤＮＡバーコーディングによるＢＬＴタグメンテーション
実施例８に記載される方法は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖とともに使用するために修飾され得る。この方法は、ｃＤＮＡの第２の鎖の合成（及び関連するクリーンアップ）工程の必要性を取り除く。ＤＮＡ ＢＬＴを使用してＤＮＡのタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを組み込んだ後、逆転写を行って、第１の鎖ｃＤＮＡを生成し、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を得る。これらのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対する活性を有するＲＮＡ特異的バーコードＢＬＴ（ＲＮＡ ＢＬＴ）を使用してタグメンテーションすることができる。ＸＧＥＮは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対する活性を有するｔｅｄ－トランスポゾンを開発した。この方法は、ｄｓ－ｃＤＮＡを生成する必要性を取り除く。
実施例８に記載される方法は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖とともに使用するために修飾され得る。この方法は、ｃＤＮＡの第２の鎖の合成（及び関連するクリーンアップ）工程の必要性を取り除く。ＤＮＡ ＢＬＴを使用してＤＮＡのタグメンテーションを行って、ＤＮＡ特異的バーコードを組み込んだ後、逆転写を行って、第１の鎖ｃＤＮＡを生成し、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を得る。これらのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対する活性を有するＲＮＡ特異的バーコードＢＬＴ（ＲＮＡ ＢＬＴ）を使用してタグメンテーションすることができる。ＸＧＥＮは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に対する活性を有するｔｅｄ－トランスポゾンを開発した。この方法は、ｄｓ－ｃＤＮＡを生成する必要性を取り除く。
【0638】
実施例１０．単一細胞分解能を用いたＲＮＡ配列決定ライブラリの調製
ＢＬＴは、マイクロウェルを有する液滴又はフローセルなどの方法を使用して、単一細胞フォーマットで転写物からライブラリを調製することができる。
ＢＬＴは、マイクロウェルを有する液滴又はフローセルなどの方法を使用して、単一細胞フォーマットで転写物からライブラリを調製することができる。
【0639】
液滴を使用する方法（図４及び図５）において、細胞は、最初に、Ｐ５で装飾された少なくとも１つのビーズ、ビーズコード（バーコード）、及びオリゴｄＴ配列を含む液滴に単離される。空間的バーコーディングは、バーコーディングのために別の３桁を提供するため、約１０００個の異なる種類のバーコードビーズを使用することができる。ビーズにハイブリダイズしたｍＲＮＡを含むビーズを液滴から除去し、逆転写酵素及びヌクレオチドをバルクで使用してｃＤＮＡ合成を行う。
【0640】
「バルクで」という用語は、溶液中にあるビーズ上で起こるｃＤＮＡ合成を指し、したがってビーズは液滴中にはないが、ｍＲＮＡはビーズにハイブリダイズしたままであり、溶液自体中にはない。したがって、バルクでのｃＤＮＡの調製は、ビーズ外でのより単純なワークフローを可能にするが、この調製は、異なるビーズ上の異なるｍＲＮＡの空間的分離を維持する。ライブラリは、Ｐ７－ＭＥ配列を含むトランスポゾンを用いた片側タグメンテーションにより生成され、ライゲーションを使用して完成された。
【0641】
ビーズは、断片を放出することなくフローセルに送達され、単一細胞ＲＮＡライブラリは、空間的バーコーディングを達成するために空間的に局在化された様式でフローセル上に放出される。このようにして、単一細胞に由来する転写物は、同じ細胞からの転写物がより近接しているため、他の細胞からの転写物から分解され得る。図５に示されるように、これは、元のｍＲＮＡ分子の３’末端に偏ったライブラリをもたらす。
【0642】
完全長ｍＲＮＡからライブラリを調製するためのワークフロー（図７）について、ビーズは、２つの異なる種類のオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡをハイブリダイズするためのポリＴ捕捉オリゴヌクレオチド、及びトランスポゾンをアセンブリするための固定化Ｐ５－バーコード－短Ａオリゴヌクレオチドからなる。この短Ａ配列は、トランスポゾン中の配列にハイブリダイズすることができる。言い換えれば、これらの方法は、トランスポゾンをアセンブリするために使用され得る本明細書に記載される「活性化可能なトランスポゾン」を使用することができる。
【0643】
ビーズ上でのｃＤＮＡ合成の後、第２のトランスポゾンのＭＥ’配列に結合するＡ５’ハンドルを使用して、ビーズ上でトランスポゾンアセンブリする。長い転写物はビーズの周りにループし、複数の部位でタグメンテーションされる。この工程の後、ＭＥ’－Ａ５’（すなわち、第２のトランスポゾン）は脱ハイブリダイズされ、ＭＥ’－Ａ５’－Ｐ７オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされ、続いてギャップ充填ライゲーション反応が行われる。これは、ビーズの周りにラップされた連結リードに変換されたｍＲＮＡ分子から生成された完全長転写物をもたらす。更に、ライブラリ断片は、タグメンテーションの間に組み込まれた１つ以上のアダプター及びオリゴヌクレオチドのライゲーションの間に組み込まれた１つ以上のアダプターを含む。次いで、ライブラリ断片は、空間的に局在化された様式でフローセル上に放出される。
【0644】
液滴を必要とせずにフローセル上で直接単一細胞ワークフローを行うために、マイクロウェルが組み込まれたフローセルを使用することができる（図８）。マイクロウェルからの区画化に起因してバーコードがはるかに少ないか、全くないことを除いて、液滴について上述したビーズを使用することができる。言い換えれば、マイクロウェルを使用することによって与えられる空間的分解能は、ビーズコードの使用の必要性を取り除くことができる。細胞は、マイクロウェル内に捕捉される（一般に、マイクロウェル当たり１個の細胞）。溶解した細胞からのｍＲＮＡは、マイクロウェル内のビーズ上に捕捉され、次いで、液滴の実施形態について上述したアプローチを使用してライブラリに変換される。マイクロウェルによって空間分解能が与えられ、その結果、ライブラリは、一般に、所与のマイクロウェル内の単一細胞から生成される。
【0645】
図１１Ａ～図１１Ｃは、そのような方法に使用され得るビーズのいくつかの特徴を示す。図１１Ａは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を調製するためのｃＤＮＡの第１の鎖の生成後のビーズを示し、図１１Ｂは、複数のトランスポソームがどのようにＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を複数の位置で断片化することができるかを示し、図１１Ｃは、複数の捕捉オリゴヌクレオチド及びアセンブリされたトランスポソームを有するビーズを示す。
【0646】
実施例１０．３’ＵＭＩを用いたＲＮＡ配列決定ライブラリの調製
方法は、正確な定量化のための３’ＵＭＩタグ付けと、連結長リードビーズコードとを組み合わせて、単一細胞についての完全長計数アッセイを可能にすることができる。
方法は、正確な定量化のための３’ＵＭＩタグ付けと、連結長リードビーズコードとを組み合わせて、単一細胞についての完全長計数アッセイを可能にすることができる。
【0647】
この方法のために、ＵＭＩ配列及びプライマーランディング部位を、第１の鎖ｃＤＮＡ合成に使用されるポリＴプライマーに組み込む（図１４）。このプライマーランディング部位は、フローセル上の得られたライブラリ断片の捕捉を可能にするＰ５又はＰ７（又はそれらの相補体）であり得る。ポリＴプライマーはまた、第１のリード又は第２のリード配列決定アダプター配列などの他の配列を含んでもよい。
【0648】
ｃＤＮＡの第２の鎖は、ＣｌｏｎｅｔｅｃｈからのＳｍａｒｔ－Ｓｅｑなどで調製され得、これは、タグメンテーションの前にｃＤＮＡの前増幅を可能にし、このアプローチを単一細胞及び超低ＲＮＡインプットと適合性にする（図１６）。
【0649】
次に、３’ＵＭＩを有する完全長二本鎖ｃＤＮＡを、各ビーズが固有のコードを有するように、共通のビーズコードを有するビーズ連結トランスポソームを用いてタグメンテーションする。これは、二本鎖ｃＤＮＡの３’末端断片を捕捉するための単一タグメンテーションをもたらし、一方で、他の断片は、断片の両方の末端に同じアダプター配列を組み込むための対称タグメンテーションを受ける（図１４）。次に、第２のトランスポゾンを脱ハイブリダイズして、ポリヌクレオチドを第１のトランスポソームのＭＥ配列にアニーリングする。ポリヌクレオチドは、標準的なプラットフォームのための配列決定可能な断片の調製を可能にするために、タグメンテーション中に導入されたものとは異なるアダプター配列を含み得る。タグメンテーション後にポリヌクレオチドをビーズ連結トランスポソーム上でハイブリダイズする「ｙ型アダプタースタイル」は、それを鎖ＲＮＡライブラリ調製物と適合性にする。このワークフローは、非産生タグメンテーション事象（末端断片が断片の両方の末端に同じアダプターを有し、標準的なプラットフォーム上で配列決定することができない）をもたらし得る標準的な非対称タグメンテーションワークフローよりも感度が高い場合がある。
【0650】
タグメンテーションは、活性化可能なＢＬＴを用いて行うことができ、ビーズの表面上の固定化オリゴヌクレオチド内の配列は、第２のトランスポゾンにハイブリダイズして（Ｈｙｂ’－ＭＥ’）、活性トランスポソームをアセンブリすることができ（図１４）、又はＢＬＴを用いて行うことができ、トランスポソームの第１のトランスポゾン（すなわち、第１のポリヌクレオチド）は、ビーズに固定化される（図１５及び図１６）。
【0651】
一般に、この方法を使用して、完全長転写物は、単一のビーズによってタグメンテーションされ、これは、同一のビーズコード配列を有する元の完全長ＲＮＡの全てのセグメントをタグメンテーションする。これにより、全ての断片が元の転写物並びに逆転写中に導入されたＵＭＩに連結して戻ることが可能になる（図１５）。このようにして、配列決定結果に基づく同じビーズコードを有する断片は、（複製物又は配列決定アーチファクトとは対照的に）固有の転写物をマークするＵＭＩと一緒に得られる。この方法は、完全長ＲＮＡを定量的に評価し、３’ＵＭＩタグ付け、前増幅、及び完全長ＲＮＡアイソフォーム検出と適合性である。
【0652】
実施例１１．ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴを介するＲＮＡ配列決定ライブラリの調製
タグメンテーション反応は、プライマー伸長鎖特異的ＢＬＴ（ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ）法を使用するｃＤＮＡ調製のストランド法の後に行うことができる。このワークフローは、ＢＬＴアプローチを使用して鎖特異的ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを作製することができる。
タグメンテーション反応は、プライマー伸長鎖特異的ＢＬＴ（ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴ）法を使用するｃＤＮＡ調製のストランド法の後に行うことができる。このワークフローは、ＢＬＴアプローチを使用して鎖特異的ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを作製することができる。
【0653】
ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴの最初の工程は、ｃＤＮＡ合成である。他の鎖特異的ＲＮＡ配列決定アプローチ（ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（登録商標）、Ｉｌｌｕｍｉｎａなど）と同様に、逆転写酵素、ランダムプライマー、及びアクチノマイシンＤを含む第１の鎖合成緩衝液（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａからのＦＳＡ緩衝液）を使用して、全ＲＮＡをｃＤＮＡの第１の鎖にコピーする。アクチノマイシンＤは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成を特異的に阻害し、鎖特異性を改善する。
【0654】
二本鎖ｃＤＮＡはタグメンテーション及び鎖特異性に必要であるため、第２の鎖合成反応においてｄＴＴＰをｄＵＴＰで置き換える。第２の鎖におけるｄＵＴＰの組み込みは、ライブラリ調製の間のインデックスＰＣＲにおけるその増幅を抑制する。したがって、第２の鎖におけるｄＵＴＰのこの組み込みは、鎖特異的ＢＬＴアプローチを可能にする。
【0655】
次に、ＢＬＴ形成を調製する。トランスポソームは、Ｔｎ５－Ｖ３酵素を、１９ｂｐモザイク末端（ＭＥ）配列を含むアニーリングされた二本鎖配列とともにインキュベートすることによってアセンブリされる。上部の鎖（すなわち、第１のトランスポゾン）は、タグメンテーションされたＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’末端に共有結合しているため、転移鎖と称される。下部の鎖（すなわち、第２のトランスポゾン）は、非転移鎖と称される。タグメンテーション後、ＭＥ’と称される逆相補体ＭＥ配列の非転移鎖とタグメンテーションされたＤＮＡの３’末端との間に９ｂｐのギャップが存在する。プライマー伸長ワークフローでは、転移鎖の５’末端に、Ａ１４と称される１４ｂｐ配列が存在する。Ａ１４は、インデックスプライマーを使用するライブラリ増幅に必要なランディング部位の１つである。最後に、デスチオビオチン修飾がＡ１４配列の５’末端に結合している。デスチオビオチンはストレプトアビジンに強固に結合し、トランスポソームを磁気ビーズに結合させてＢＬＴを形成するために使用される。デスチオビオチンは、ビオチンと比較して、ストレプトアビジンに対してより高い結合親和性を有するため、ビオチンの代わりに使用される。デスチオビオチンの使用は、ライブラリ調製後濃縮ワークフローに影響を及ぼし得る、ライブラリ産物中のビオチン化ＤＮＡのキャリースルーを低減するため、重要である。ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴとともに使用するための代表的なトランスポソーム複合体を図１７に示す。
【0656】
最後に、プライマー伸長によって鎖特異的ライブラリ調製を行う。当該技術分野における標準的な非対称タグメンテーション法を用いて、ｃＤＮＡを、Ａ１４及びＢ１５トランスポソームの混合物を含むＢＬＴを用いてタグメンテーションする。Ａ１４のみ又はＢ１５のみでタグメンテーションされた断片は、実行可能なライブラリ産物を作製しない。これは、全てのタグメンテーションされた断片のおよそ半分が失われ、ライブラリ調製効率の低下につながることを意味する。
【0657】
プライマー伸長ワークフローを伴うＰＲＥＳＳ－ＢＬＴは、この問題を有さない。ｃＤＮＡは、Ａ１４トランスポソームでのみタグメンテーションされる（図１７）。次いで、非転移ＭＥ’を融解し、ＰＣＲ伸長によってギャップ充填する。次いで、Ｂ１５－ＭＥプライマーをギャップ充填されたＭＥ’配列にアニーリングし、伸長させて、挿入物の一方の末端にＢ１５及び他方の末端にＡ１４を含むコピーを作製する。ＵＭＩは、Ｂ１５とＭＥとの間のプライマーに挿入され得るか、又はＡ１４配列とＭＥ配列との間のＢＬＴ上に作製され得る。ＵＭＩは、それらが固有のｍＲＮＡ転写物をマークし、かつＰＣＲ増幅によって産生されたコピーからそれらを区別するため重要である。プライマー伸長に続いて、Ｂ１５－挿入－Ａ１４コピーを熱又は水酸化ナトリウム処理によってビーズから融解し（図１８）、インデックスプライマー増幅のために新しいチューブに移す。
【0658】
図１９に示されるように、ＰＲＥＳＳ－ＢＬＴワークフローはまた、トランスポソームを固定化するために二重ビオチンを使用してもよく、これはトランスポソームの結合及び放出を改善することができるためである。
【0659】
均等物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想到される最良の様式を説明する。しかしながら、前述の内容が本文にどれほど詳細にあらわれていても、実施形態は多くの方式で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
前述の明細書は、当業者が実施形態を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想到される最良の様式を説明する。しかしながら、前述の内容が本文にどれほど詳細にあらわれていても、実施形態は多くの方式で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【0660】
本明細書で使用するとき、約という用語は、明示的に示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、割合、及び百分率を含む数値を指す。用語は、一般に、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能又は結果を有する）と同等であると考えられる数値の範囲（例えば、列挙された範囲の±５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリスト内に提供される値又は範囲の全てを変更する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含んでもよい。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【国際調査報告】