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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-18
(54)【発明の名称】自閉症スペクトラム障害の診断及び治療方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20231011BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 D
G01N33/50 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518327
(86)(22)【出願日】2021-09-21
(85)【翻訳文提出日】2023-05-19
(86)【国際出願番号】 CA2021051309
(87)【国際公開番号】W WO2022056646
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】63/080,842
(32)【優先日】2020-09-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/115,221
(32)【優先日】2020-11-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522005103
【氏名又は名称】モレキュラー ユー コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】アンワー、モハマド アシュラフル
(72)【発明者】
【氏名】ワン、ヂォンナン
(72)【発明者】
【氏名】フレイザー、ロバート
(72)【発明者】
【氏名】ウィシャート、デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】マンダール、ルパスリ
【テーマコード（参考）】
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045DA61
2G045DA77
2G045FA25
2G045FA28
2G045FA40
2G045FB06
(57)【要約】
本開示は、ヒト対象における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の診断及び治療のための方法及びキットに関する。本開示はまた、ＡＳＤを診断及び治療するためのコンピュータで実行される方法に関する。ＡＳＤでは検査所見が一貫して異常であるため、現在の診断プロトコルは主に行動学的検査に限定されている。現在報告されているバイオマーカーはいずれも、これら臨床ツールが最も必要とされる出生から幼児期までの若年齢における小児科の現場において、早期発達スクリーニング又は早期診断若しくは予後予測ツールとしては期待できない。本開示により、ＡＳＤを有する対象におけるＡＳＤに関するメタボロミクスプロファイル、タンパク質プロファイル、及びそれらの組み合わせが同定される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断及び治療する方法であって、（ａ）前記対象から得られた生体サンプルを提供することと；
（ｂ）前記得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することと；
（ｃ）前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比較することと；
（ｄ）前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なる場合、前記対象がＡＳＤを有すると特定することと；
（ｅ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、
を含む方法。
【請求項2】
対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断及び治療する方法であって、（ａ）前記対象から得られた生体サンプルを提供することと；
（ｂ）前記得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを分光測定ユニットで測定するか又は測定しておくことと；
（ｃ）前記分光測定ユニットで求めたときの前記ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比較するか又は比較しておくことと；
（ｄ）前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なる場合、前記対象がＡＳＤを有すると特定することと；
（ｅ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、
を含む方法。
【請求項3】
前記ＡＳＤ治療レジメが、食事の調整、栄養の補充、行動訓練、ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因があると診断された対象における前記ＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記対象における前記ＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整が、前記対象における行動遂行の改善が観察されるまで行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整が、前記対象における腸内微生物叢の組成を調整することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記特定する工程が、前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連代謝物のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上異なると判定されたときに行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項7】
前記特定する工程（ｄ）が、前記得られたサンプルからのフマル酸及び／又はＬ－リンゴ酸の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照フマル酸及び／又は参照Ｌ－リンゴ酸の濃度レベルに比べて低下している、好ましくは、前記得られたサンプルからのフマル酸の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照フマル酸の濃度レベルに比べて約２倍以下低下している及び／又は前記得られたサンプルからのＬ－リンゴ酸の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照Ｌ－リンゴ酸の濃度レベルに比べて約２倍以下低下していると判定されたときに行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項8】
前記特定する工程（ｄ）が、前記得られたサンプルからの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項9】
前記得られたサンプルが、血液又は尿、好ましくは血清、血漿、又は尿である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項10】
前記ＡＳＤ関連代謝物が分光技術によって測定され、前記分光技術が、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー質量分析、ガスクロマトグラフィー質量分析、高速液体クロマトグラフィー質量分析、キャピラリー電気泳動質量分析、核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）、ラマン分光法、及び赤外分光法からなる群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項11】
前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルとの比較が、多変量統計解析を用いることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項12】
前記多変量統計解析が、主成分分析（ＰＣＡ）又は部分的最小二乗潜在構造投影判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＡＳＤ陰性サンプルが、１０歳以下、５歳以下、又は３歳以下の非自閉症児からのものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項14】
前記対象が、１０歳以下、好ましくは５歳以下、又は好ましくは３歳以下の小児である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項15】
対象における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の進行をモニタリングし、前記ＡＳＤを治療する方法であって、（ａ）第１の時点で対象から得られた第１の生体サンプルを提供することと；
（ｂ）前記第１の得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することによって、第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを評価することと；
（ｃ）前記第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルと比較することと；
（ｄ）前記第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルと前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルとの間に、ＡＳＤを示す第１の差があると判定することと；
（ｅ）前記第１の時点の後である第２の時点で前記対象から得られた第２の生体サンプルを提供することと；
（ｆ）前記第２の得られたサンプルから前記ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することによって、第２のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを評価することと；
（ｇ）前記第２のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルと比較することと；
（ｈ）前記第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルと前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルとの間に、ＡＳＤを示す第２の差があると判定することと；
（ｉ）前記第１の差及び第２の差に少なくとも部分的に基づいてＡＳＤの進行を判定することと；
（ｊ）特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、
を含む方法。
【請求項16】
前記第１の時点と前記第２の時点との間の期間が、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、又は少なくとも３ヶ月である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記第１のサンプル、前記第２のサンプル、又は両方が、血液又は尿であり、好ましくは、両方のサンプルが、同じ検体の種類であり、血清、血漿又は尿から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記アシルカルニチンが、Ｃ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣから選択される、請求項１、２、又は１５に記載の方法。
【請求項19】
前記特定する工程（ｄ）が、前記得られたサンプルからのＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣの濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照Ｃ１０：１、参照Ｃ１６：２、及び／又は参照Ｃ７－ＤＣの濃度レベルと比べて上昇している、好ましくは、前記得られたサンプルからの前記アシルカルニチンの濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照アシルカルニチンの濃度レベルに比べて約２倍以下、好ましくは約０．５倍～約２倍上昇していると判定されたときに行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記判定する工程（ｉ）が、前記第２の得られた生体サンプルからのＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣの濃度レベルが、前記第１の得られた生体サンプルからのＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣの濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記判定する工程（ｉ）が、前記第２の得られた生体サンプルからのフマル酸及び／又はＬ－リンゴ酸の濃度レベルが、前記第１の得られた生体サンプルからのフマル酸及び／又はＬ－リンゴ酸の濃度レベルに比べて低下していると判定されたときに行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項22】
前記判定する工程（ｉ）が、前記第２の得られたサンプルからの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルが、前記第１の得られた生体サンプルからの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項23】
前記リゾリン脂質が、リゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３である、請求項１、２、又は１５に記載の方法。
【請求項24】
前記特定する工程（ｄ）が、前記得られたサンプルからのリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照リゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又は参照リゾＰＣ ａ Ｃ２０：３の濃度レベルに比べて上昇している、好ましくは、前記得られたサンプルからの前記リゾリン脂質の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照リゾリン脂質の濃度レベルに比べて約１．１倍以上、好ましくは約１．２倍以上上昇していると判定されたときに行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記判定する工程（ｉ）が、前記第２の得られた生体サンプルからのリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３の濃度レベルが、前記第１の得られた生体サンプルからのリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記スフィンゴ脂質が、ＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２である、請求項１、２、又は１５に記載の方法。
【請求項27】
前記特定する工程（ｄ）が、前記得られたサンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又は前記ＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又は参照ＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２の濃度レベルに比べて上昇している、好ましくは、前記得られたサンプルからの前記スフィンゴ脂質の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照スフィンゴ脂質の濃度レベルに比べて約１．０５倍以上、好ましくは約１．１倍以上上昇していると判定されたときに行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記判定する工程（ｉ）が、前記第２の得られた生体サンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２、前記得られた生体サンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２、前記第２の得られた生体サンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２の濃度レベルと判定されたときに行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記グリセロリン脂質が、ＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２である、請求項１、２、又は１５に記載された方法。
【請求項30】
前記特定する工程（ｄ）が、前記得られたサンプルからのＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又は参照ＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルに比べて上昇している、好ましくは、前記得られたサンプルからの前記グリセロリン脂質の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照グリセロリン脂質の濃度レベルに比べて約１．０５倍以上、好ましくは約１．１倍以上上昇していると判定されたときに行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記判定する工程（ｉ）が、前記第２の得られた生体サンプルからのＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルが、前記第１の得られた生体サンプルからのＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項32】
前記特定する工程（ｄ）が、前記得られたサンプルからの４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は参照２－ヒドロキシイソ吉草酸の濃度レベルに比べて低下している、好ましくは、前記得られたサンプルからの４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は参照２－ヒドロキシイソ吉草酸の濃度レベルに比べて検出不可能であると判定されたときに行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項33】
前記判定する工程（ｉ）が、前記第２の得られた生体サンプルからの４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸の濃度レベルが、前記第１の得られた生体サンプルからの４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸の濃度レベルに比べて低下していると判定されたときに行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項34】
前記特定する工程（ｄ）が、前記得られたサンプルからのｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び／又は４－ヒドロキシ馬尿酸の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び／又は４－ヒドロキシ馬尿酸の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項35】
前記判定する工程（ｉ）が、前記第２の得られた生体サンプルからのｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び／又は４－ヒドロキシ馬尿酸の濃度レベルが、前記第１の得られた生体サンプルからのｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び／又は４－ヒドロキシ馬尿酸の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項36】
任意で使用説明書と共に、フマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択されるＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定するための試薬を含む、請求項１、２、又は１５のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。
【請求項37】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するためのキットであって、（ａ）得られた生体サンプルからのフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを検出するように構成されている検出器と；
（ｂ）ＡＳＤ陰性対象の対照群に対応する対照レベルのフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタゴン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースを含む組成物と；
（ｃ）前記ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと前記対照レベルとの差を分析するように構成されている多変量解析システムと；
（ｄ）任意で、ＡＳＤ診断方法の説明書であって、前記方法が、前記得られた生体サンプルからのＡＳＤ関連代謝物のレベルを前記検出器を用いて測定し、前記得られたＡＳＤ関連代謝物のレベルをＡＳＤ陰性対象から得られたＡＳＤ関連代謝物の対照レベルと比較することを含む説明書と、
を含むキット。
【請求項38】
前記検出器が、フマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタゴン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースを含むＡＳＤ関連代謝物のレベルを測定するように構成されているマルチ代謝物検出器を含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項39】
対象の生体サンプルを処理し、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断し、ＡＳＤを治療するためのコンピュータで実行される方法であって、（ａ）対象から得られた生体サンプルを受信することと；
（ｂ）処理装置に直接又は無線で接続された分光測定ユニットで前記サンプルを処理することであって、前記処理装置が、前記分光測定ユニットからの測定データを保存するためのメモリを有することと；
（ｃ）前記分光測定ユニットで、フマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物のレベルを測定し、測定データをプロセッサに保存することと；
（ｄ）多変量統計解析を用いて、保存された測定データをＡＳＤ陰性サンプルを表すメモリ内の値と比較することと；
（ｅ）前記得られたサンプルからのフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物に対応する結果を前記処理装置に保存することであって、前記結果から、前記ＡＳＤ関連代謝物のレベルを表す測定データがＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なる場合、前記対象がＡＳＤを有すると特定されることと；
（ｆ）ＡＳＤを有するか又はＡＳＤを発症する素因を有すると特定された対象のために、前記プロセッサに直接又は無線で接続された電子ディスプレイにＡＳＤ治療レジメを表示することであって、表示される治療レジメが、前記ＡＳＤを有するか又はＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象に対する
（ｉ）食事の調整、
（ｉｉ）栄養の補充、
（ｉｉｉ）行動訓練、若しくはそれらの組み合わせ、又は
（ｉｖ）ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象において行動遂行の改善が観察されるまで、前記対象におけるＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整、のうちの１つ以上について説明するグラフィカルユーザインターフェースにおける電子テキストを含むことと、を含み、好ましくは、前記ＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整が、前記対象における腸内微生物叢の組成の調整を含む、コンピュータで実行される方法。
【請求項40】
対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断及び治療する方法であって、（ａ）前記対象から得られた生体サンプルを提供することと；
（ｂ）レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、セロトランスフェリン、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、アルファ２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク質２、及びテネイシンＣからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを測定することと；
（ｃ）前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比較することと；
（ｄ）前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比べて異なる場合、前記対象がＡＳＤを有すると特定することと；
（ｅ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、
を含む方法。
【請求項41】
対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断及び治療する方法であって、（ａ）前記対象から得られた生体サンプルを提供することと；
（ｂ）前記得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することと；
（ｃ）前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比較することと；
（ｄ）レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、セロトランスフェリン、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、アルファ２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク質２、及びテネイシンＣからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを測定することと；
（ｅ）前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比較することと；
（ｆ）前記得られたサンプルからのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なっており、かつ前記得られたサンプルからのＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比べて異なっている場合、前記対象がＡＳＤを有すると特定することと；
（ｇ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、を含む方法。
【請求項42】
前記特定する工程（ｆ）が、前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連タンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上異なると判定されたときに行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記特定する工程（ｆ）が、前記得られたサンプルからのアルファ－２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、及び／又はテネイシンＣの濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照アルファ－２－アンチプラスミン、参照凝固第Ｘ因子、参照凝固第ＸＩ因子、及び／又は参照テネイシンＣの濃度レベルに比べて上昇している、好ましくは、前記得られたサンプルからのアルファ－２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、及び凝固第ＸＩ因子の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照アルファ－２－アンチプラスミン、参照凝固第Ｘ因子、及び／又は参照凝固第ＸＩ因子の濃度レベルに比べて約０．５倍～約１．５倍、好ましくは約０．７５倍～約１．３倍上昇している、好ましくは、前記得られたサンプルからのテネイシンＣの濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照テネイシンＣの濃度レベルに比べて約０．３倍以上、好ましくは約０．４倍以上上昇していると判定されたときに行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
前記特定する工程（ｆ）が、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、及び／又はレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、参照トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、及び／又は参照レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）の濃度レベルに比べて低下している、好ましくは、前記得られたサンプルからの凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖の濃度レベルに比べて約１．２倍以下、又は好ましくは約１．３倍以下低下している、好ましくは、前記得られたサンプルからのトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）の濃度レベルに比べて約１．２倍以下、又は好ましくは約１．５倍以下低下している、好ましくは、前記得られたサンプルからのレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）の濃度レベルに比べて約１．５倍以下、好ましくは約１．８倍以下低下していると判定されたときに行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項45】
前記特定する工程が、前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連代謝物のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上異なると判定されたときに行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項46】
前記特定する工程（ｆ）が、前記得られたサンプルからの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はグリセロリン脂質の濃度レベルが、前記ＡＳＤ陰性サンプルからの参照３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、参照アシルカルニチン、参照リゾリン脂質、参照スフィンゴ脂質、及び／又は参照グリセロリン脂質の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項47】
前記アシルカルニチンが、Ｃ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記リゾリン脂質が、リゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３である、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
前記スフィンゴ脂質が、ＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２である、請求項４６に記載の方法。
【請求項50】
前記グリセロリン脂質が、ＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２である、請求項４６に記載の方法。
【請求項51】
前記得られたサンプルが、血液又は尿、好ましくは血清、血漿、又は尿である、請求項４１に記載の方法。
【請求項52】
前記ＡＳＤ関連代謝物が分光技術によって測定され、前記分光技術が、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー質量分析、ガスクロマトグラフィー質量分析、高速液体クロマトグラフィー質量分析、キャピラリー電気泳動質量分析、核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）、ラマン分光法、及び赤外分光法からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項53】
前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルとの比較が、多変量統計解析を用いることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項54】
前記得られたサンプルからの前記ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと前記ＡＳＤ陰性サンプルからの前記参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルとの比較が、多変量統計解析を用いることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項55】
前記ＡＳＤ陰性サンプルが、１０歳以下、５歳以下、又は３歳以下の非自閉症児からのものである、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一般に、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の診断及び管理／治療の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）（本明細書では自閉症とも称する）は、多数の症状を特徴とする深刻な精神神経及び神経発達障害である。典型的には、対象は、社会的行動／相互作用における障害、コミュニケーション（言語及び非言語）における障害、並びに年相応の活動及び関心に取り組むことの困難に苦しんでいる。例えば、対象は、様々な程度の社会的行動の障害、コミュニケーション及び言語の障害、並びに／又はいずれも個人に特有であり、繰り返し行われる関心及び活動の範囲の狭さを有する多種多様な症状を呈することが多い。これら症状は、幼児の発達過程において、すなわち生後５年の間に存在し、現れることがあり、その後、社会的、学習的、職業的、又は他の人生の重要な領域において、臨床的に顕著な障害を引き起こす可能性がある。
【0003】
世界保健機関によれば、世界中で小児１６０人に１人がＡＳＤを有する。しかし、その高い有症率にもかかわらず、適切及び／又は正確なＡＳＤスクリーニングツールが不足している。その結果、診断及び治療的介入が遅れることが多い。ＡＳＤの初期徴候はわずか２歳の小児でも観察できるにもかかわらず、ほとんどの小児は未だに診断が遅れている（例えば、４～５歳以降）。医師が早期診断及びエビデンスに基づく行動療法の紹介を通してＡＳＤの個体、特に小児の転帰を大きく改善できることが示されているため、この遅れは問題である。
【0004】
行動処置及び親の技能訓練プログラム等のエビデンスに基づく心理社会的介入は、コミュニケーション及び社会的行動における困難を軽減し、ＡＳＤ者及びその介護者の幸福及び生活の質に良い影響を与える。残念なことに、小児科医が通常認識するＡＳＤの最初の徴候は、生後１８ヶ月～２４ヶ月まで顕在化しないコミュニケーション及び言語における欠陥である。ＡＳＤは、あらゆる階層の集団に分布する世界的な公衆衛生上の現象であり、スティグマ形成及び差別に対する脆弱性、生殖力に関する制約、並びに監督、支援、及び保護を必要とするある程度の依存性から、犠牲の大きな生涯にわたる影響がある。自閉症児の早期発見及び早期介入は、世界保健機関（「ＷＨＯ」）によって、ＡＳＤ者の転帰を改善するための最も重要な要素のうちの２つであると認識されている。
【0005】
今日まで、ＡＳＤ者を適切に診断する能力は不十分であり、主に訓練を受けた専門家による定性的な観察に基づいている。ＡＳＤでは検査所見が一貫して異常であるため、現在の診断プロトコルは主に行動学的検査に限定されている。例えば、現行のこの年齢群におけるＡＳＤのスクリーニングツールとしては、乳幼児チェックリスト（Ｉｎｆａｎｔ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ、「ＩＴＣ」；コミュニケーション及び象徴行動尺度及び発達プロファイル（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｉｃ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ Ｓｃａｌｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｆｉｌｅ）としても知られている）及び乳幼児期自閉症チェックリスト修正版（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ ｆｏｒ Ａｕｔｉｓｍ ｉｎ Ｔｏｄｄｌｅｒｓ、「Ｍ－ＣＨＡＴ」）等が挙げられる。ＩＴＣは、生後９ヶ月～２４ヶ月の小児における発達障害を特定するために使用することができるが、基本的なコミュニケーションの遅れと明白なＡＳＤとの区別における有用性は限定的である。Ｍ－ＣＨＡＴは１６ヶ月～３０ヶ月で使用することができる。しかし、ポジティブスクリーニングのためにフォローアップアンケートが必要であり、これが小児の１０％で生じる。ＡＳＤ児の平均診断年齢は約３歳であり、そのうちの約半数は偽陽性である可能性がある。更に、これら標準的な行動実験プロトコル／ガイドラインを用いてそのような個人を診断するためには適切な有資格者が必要であり、従来の評価アプローチに主観が入る可能性もある。
【0006】
ＡＳＤは高度に不均一であり、その病因は不明である。遺伝子異常、免疫系の調節不全、炎症、及び環境要因等のこの疾患の幾つかの潜在的原因が、以前の研究で明らかになっている。近年、ＡＳＤにおける腸と脳との相互作用が、科学的及び医学的研究において大きな注目を集めている。最近の研究で自閉症者は腸内細菌の微生物叢が変化していることが判明したので、ＡＳＤは重要な腸内微生物叢の構成要素を有することが示されている。長い年月をかけて、選択された微生物叢が、免疫系、代謝、及び神経系と一体化しているヒトの消化管に常在するようになった。また、大腸の常在微生物叢も、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種等の潜在的な病原性微生物の増殖を阻害することによって、重要な宿主防御機能を提供する。便秘、腹痛、膨満感（ｇａｓｅｏｕｓｎｅｓｓ）、下痢、及び鼓腸を含む消化管の問題は、ＡＳＤに関連する一般的な症状である。場合によっては、抗生物質の投与及び微生物叢移植療法等の治療的介入によって腸内微生物叢をリモデリングすることで、ＡＳＤの症状が緩和されたことも報告されている。
【0007】
出生後いつでも実施可能である代謝物分析によるスクリーニングを含むバイオマーカースクリーニングは、ＡＳＤスクリーニングツールキットへの魅力的な追加物となる。糞便又は便のサンプル中の細菌代謝物濃度の測定は、腸内細菌種の存在量を示すのに有用であるが、糞便又は便の検体の収集及び処理が困難である場合がある。収集及び取り扱いが容易であり、かつ適時に検体を収集できるので、医療現場では、他の種類の生体サンプル（例えば、血液、尿）が診断試験に使用される頻度がはるかに高い。
【0008】
幾つかの生化学的代謝マーカーは、自閉症的の形質と関連している。例えば、ＡＳＤに関連する代謝異常の存在としては、フェニルケトン尿症（「ＰＫＵ」）、プリン代謝における障害、脳の発達における葉酸欠乏、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素欠損、スミス・レムリ・オピッツ症候群（「ＳＬＯＳ」）、有機酸尿（例えば、ピリドキシン依存、３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損、プロピオン酸血症）、及びミトコンドリア障害を挙げることができる。これら代謝異常は、一つには、病原性微生物が存在するＡＳＤ者の腸内微生物叢の変化に起因している可能性がある。これら単独知見から、ＡＳＤに関与している可能性のある生化学的経路に関して更なる洞察が得られたが、特に幼児のＡＳＤ診断及び治療において広範囲にわたる成功が示されたＡＳＤの存在又は易罹患性を判定するための信頼できる試験プロトコルは、これまで報告されていない。更に、未だ同定されていないＡＳＤの臨床転帰に関連する代謝物は、他に数百存在する。まとめると、現在報告されているバイオマーカーはいずれも、これら臨床ツールが最も必要とされる出生から幼児期までの若年齢における小児科の現場において、早期発達スクリーニング又は早期診断若しくは予後予測ツールとしては期待できない。
【0009】
従って、ＡＳＤの存在又は発症の素因に特徴的な行動形質の臨床診断を高い信頼度で確認し、それを治療することができる改良された方法が必要とされている。また、ＡＳＤには一貫した身体的特徴がなく、生後数年間のその特徴が顕在化する時期が不確実であるため、行動的特徴だけに依存することなくＡＳＤ者を客観的にスクリーニング及び治療することも必要とされている。また、対象、特に幼児（すなわち、３歳以下の小児）におけるＡＳＤの早期診断及びその早期治療を可能にする検査も必要とされている。
【発明の概要】
【0010】
本明細書において具現化され、説明される通り、一態様では、本開示は、対象における自閉症スペクトラム障害（「ＡＳＤ」）を診断及び治療する方法に関する。方法は、（ａ）対象から得られた生体サンプルを提供することと；（ｂ）該得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（「ＨＰＨＰＡ」）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することと；（ｃ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比較することと；（ｄ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なる場合、該対象がＡＳＤを有すると特定することと；（ｅ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、を含む。
【0011】
本明細書において具現化され、説明される通り、別の態様では、本開示はまた、対象におけるＡＳＤを診断及び治療する方法に関する。方法は、（ａ）対象から得られた生体サンプルを提供することと；（ｂ）該得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸ＨＰＨＰＡ、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを分光測定ユニットで測定するか又は測定しておくことと；（ｃ）該分光測定ユニットで求めたときの該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比較するか又は比較しておくことと；（ｄ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、該ＡＳＤ陰性サンプルから該参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なる場合、該対象がＡＳＤを有すると特定することと；（ｅ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、を含む。
【0012】
本明細書において具現化され、説明される通り、更に別の態様では、本開示はまた、ＡＳＤの進行をモニタリングし、対象におけるＡＳＤを治療する方法に関する。方法は、（ａ）第１の時点で対象から得られた第１の生体サンプルを提供することと；（ｂ）該第１の得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することによって、第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを評価することと；（ｃ）該第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルと比較することと；（ｄ）該第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルと該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルとの間に、ＡＳＤを示す第１の差があると判定することと；（ｅ）該第１の時点の後である第２の時点で該対象から得られた第２の生体サンプルを提供することと；（ｆ）該第２の得られたサンプルから該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することによって、第２のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを評価することと；（ｇ）該第２のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを、該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルと比較することと；（ｈ）該第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルと該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルとの間に、ＡＳＤを示す第２の差があると判定することと；（ｉ）該第１の差及び第２の差に少なくとも部分的に基づいてＡＳＤの進行を判定することと；（ｊ）特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、を含む。
【0013】
本明細書において具現化され、説明される通り、更に別の態様では、本開示はまた、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つで使用するためのキットであって、任意で使用説明書と共に、フマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択されるＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定するための試薬を含むキットに関する。
【0014】
本明細書において具現化され、説明される通り、更に別の態様では、本開示はまた、自閉症スペクトラム障害（「ＡＳＤ」）のメタボロミクスプロファイルに関する。幾つかの態様では、ＡＳＤの代謝プロファイルは、
（ａ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照フマル酸及び／又は参照Ｌ－リンゴ酸よりも低い濃度レベルのフマル酸及び／又はＬ－リンゴ酸；
（ｂ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）よりも高い濃度レベルの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）；
（ｃ）ＡＳＤ陰性サンプルからの好ましくはＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣから選択される参照アシルカルニチンよりも高い濃度レベルの好ましくはＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣから選択されるアシルカルニチン；
（ｄ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照リゾリン脂質、好ましくはリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３よりも高い濃度レベルのリゾリン脂質、好ましくはリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３；
（ｅ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照スフィンゴ脂質、好ましくはＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２よりも高い濃度レベルのスフィンゴ脂質、好ましくはＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２；
（ｆ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照グリセロリン脂質、好ましくはＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０よりも高い濃度レベルのグリセロリン脂質、好ましくはＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０；並びに
（ｇ）ＡＳＤ陰性サンプルから参照４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は参照２－ヒドロキシイソ吉草酸よりも低い濃度レベルの４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸
のうちの１つ以上、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを含む。
（ａ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照フマル酸及び／又は参照Ｌ－リンゴ酸よりも低い濃度レベルのフマル酸及び／又はＬ－リンゴ酸；
（ｂ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）よりも高い濃度レベルの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）；
（ｃ）ＡＳＤ陰性サンプルからの好ましくはＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣから選択される参照アシルカルニチンよりも高い濃度レベルの好ましくはＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣから選択されるアシルカルニチン；
（ｄ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照リゾリン脂質、好ましくはリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３よりも高い濃度レベルのリゾリン脂質、好ましくはリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３；
（ｅ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照スフィンゴ脂質、好ましくはＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２よりも高い濃度レベルのスフィンゴ脂質、好ましくはＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２；
（ｆ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照グリセロリン脂質、好ましくはＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０よりも高い濃度レベルのグリセロリン脂質、好ましくはＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０；並びに
（ｇ）ＡＳＤ陰性サンプルから参照４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は参照２－ヒドロキシイソ吉草酸よりも低い濃度レベルの４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸
のうちの１つ以上、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを含む。
【0015】
他の態様では、メタボロミクスプロファイルは、（ａ）非ＡＳＤ対象からの参照フマル酸の濃度レベルの中央値よりも少なくとも約２倍以下低い濃度レベルのフマル酸；及び（ｂ）非ＡＳＤ対象からの参照Ｌ－リンゴ酸の濃度レベルの中央値よりも少なくとも約２倍以下低い濃度レベルのＬ－リンゴ酸を含む。好ましくは、前述のメタボロミクスプロファイルは、更に、（ｃ）非ＡＳＤ対象からの参照ＨＰＨＰＡの濃度レベルの中央値よりも少なくとも約１０倍以上高い濃度レベルのＨＰＨＰＡを含む。
【0016】
本明細書において具現化され、説明される通り、更に別の態様では、本開示はまた、自閉症スペクトラム障害（「ＡＳＤ」）のプロテオミクスプロファイルに関する。幾つかの態様では、ＡＳＤのプロテオミクスプロファイルは、
（ａ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照アルファ－２－アンチプラスミン、参照凝固第Ｘ因子、参照凝固第ＸＩ因子、及び／又は参照テネイシンＣよりも高い濃度レベルのアルファ－２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、及び／又はテネイシンＣ；並びに
（ｂ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、及び／又はレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）よりも低い濃度レベルの凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、及び／又はレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）
のうちの１つ以上、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを含む。
（ａ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照アルファ－２－アンチプラスミン、参照凝固第Ｘ因子、参照凝固第ＸＩ因子、及び／又は参照テネイシンＣよりも高い濃度レベルのアルファ－２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、及び／又はテネイシンＣ；並びに
（ｂ）ＡＳＤ陰性サンプルからの参照凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、及び／又はレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）よりも低い濃度レベルの凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、及び／又はレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）
のうちの１つ以上、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを含む。
【0017】
本明細書において具現化され、説明される通り、更に別の態様では、本開示はまた、ＡＳＤを診断するためのキットに関する。キットは、（ａ）得られた生体サンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを検出するように構成されている検出器と；（ｂ）ＡＳＤ陰性者の対照群に対応する対照レベルのフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタゴン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースを含む組成物と；（ｃ）該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと該対照レベルとの差を分析するように構成されている多変量解析システムと；（ｄ）任意で、ＡＳＤ診断方法の説明書であって、該方法が、該得られた生体サンプルからＡＳＤ関連代謝物のレベルを該検出器を用いて測定し、得られたＡＳＤ関連代謝物のレベルをＡＳＤ関連代謝物の対照レベルと比較することを含む説明書と、を含む。
【0018】
本明細書において具現化され、説明される通り、更に別の態様では、本開示はまた、対象の生体サンプルを処理し、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断し、ＡＳＤを治療するためのコンピュータで実行される方法に関する。コンピュータで実行される方法は、（ａ）対象から得られた生体サンプルを受信することと；（ｂ）処理装置に直接又は無線で接続された分光測定ユニットでサンプルを処理することであって、該処理装置が、該分光測定ユニットからの測定データを保存するためのメモリを有することと；（ｃ）該分光測定ユニットで、フマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物のレベルを測定し、測定データをプロセッサに保存することと；（ｄ）多変量統計解析を用いて、保存された測定データをＡＳＤ陰性サンプルを表すメモリ内の値と比較することと；（ｅ）該得られたサンプルからのフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物に対応する結果を処理装置に保存することであって、該結果から、ＡＳＤ関連代謝物のレベルを表す測定データがＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なる場合、該対象がＡＳＤを有すると特定されることと；（ｆ）ＡＳＤを有するか又はＡＳＤを発症する素因を有すると特定された対象のために、プロセッサに直接又は無線で接続された電子ディスプレイにＡＳＤ治療レジメを表示することであって、表示される治療レジメが、ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象に対する（ｉ）食事の調整、（ｉｉ）栄養の補充、（ｉｉｉ）行動訓練、若しくはそれらの組み合わせ、及び／又は（ｉｖ）ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象において行動遂行の改善が観察されるまで、該対象におけるＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整、のうちの１つ以上について説明するグラフィカルユーザインターフェースにおける電子テキストを含むことと、を含む。
【0019】
本明細書において具現化され、広く説明される通り、更に別の態様では、本開示はまた、対象における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断及び治療する方法に関する。方法は、（ａ）対象から得られた生体サンプルを提供することと；（ｂ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比較することと；（ｃ）レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、セロトランスフェリン、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、アルファ２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク質２、及びテネイシンＣからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを測定することと；（ｄ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルが、該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比べて異なる場合、該対象がＡＳＤを有すると特定することと；（ｅ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、を含む。
【0020】
本明細書において具現化され、広く説明される通り、更に別の態様では、本開示はまた、対象における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断及び治療する方法に関する。方法は、（ａ）対象から得られた生体サンプルを提供することと；（ｂ）該得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することと；（ｃ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比較することと；（ｄ）レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、セロトランスフェリン、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、アルファ２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク質２、及びテネイシンＣからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを測定することと；（ｅ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比較することと；（ｆ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なっており、かつ該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルが、該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比べて異なっている場合、該対象がＡＳＤを有すると特定することと；（ｇ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、を含む。
【0021】
本明細書において具現化され、広く説明される通り、更に別の態様では、本開示はまた、本明細書に記載の方法のいずれか１つで用いるためのキットであって、任意で使用説明書と共に、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、セロトランスフェリン、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、アルファ－２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク質２、及びテネイシンＣからなる群から選択されるＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを測定するための試薬を含むキットに関する。
【0022】
本明細書において具現化され、説明される通り、更に更なる態様では、本開示はまた、対象がＡＳＤを有するか若しくはそれを発症する素因があると診断する又はＡＳＤの進行／退行を評価するためのコンピュータで実行される方法であって、データセットを受信し、コンピュータのメモリに入力することであって、該データセットが、対象に関連する代謝及びプロテオミクスのプロファイルを含むことと；該代謝及びプロテオミクスのプロファイルが、ＡＳＤ、ＡＳＤ発症の素因、又はその進行若しくは退行を示すかどうかを、以前のコンピュータで実行されたモデリング解析からのＡＳＤモデリングデータに基づいて特定することと；該対象のために、コンピュータのプロセッサに直接又は無線で接続された電子ディスプレイにＡＳＤ治療レジメを表示することであって、表示される治療レジメが、ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象に対する（ｉ）１つ以上の食事の調整、（ｉｉ）１つ以上の栄養の補充、（ｉｉｉ）行動訓練、若しくはそれらの組み合わせ、及び／又は（ｉｖ）ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象において行動遂行の改善が観察されるまで、該対象におけるＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整、のうちの少なくとも１つを表示するグラフィカルユーザインターフェースにおける電子テキストを含むことと、を含む方法に関する。
【0023】
代謝及びプロテオミクスのプロファイルにおけるバイオマーカーの例としては、上記及び本明細書において更に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、１～５０個、２～４０個、又は５～３０個のバイオマーカーを、ＡＳＤモデリングデータに基づいて評価する。
【0024】
本明細書において具現化され、説明される通り、更に更なる態様では、本開示はまた、対象のプロテオミクス及び／又は代謝のプロファイル、好ましくは両方のプロファイルの分析に基づいて、対象がＡＳＤを有するか若しくはそれを発症する素因があると診断する又はＡＳＤの進行／退行を評価するコンピュータで実行される方法に関する。そのような方法は、データセットを受信し、コンピュータのメモリに入力することを含み、該データセットは、対象からの生体サンプルから得られた複数のＡＳＤプロテオミクス及び／又は代謝のバイオマーカーの測定値を含む。一実施形態では、データセットは、対象に関連する代謝及びプロテオミクスのプロファイルのうちの少なくとも１つを含む、並びに／又はＡＳＤの診断及び／若しくはＡＳＤの進行を示すものとして代謝及び／又はプロテオミクスのＡＳＤコンピュータモデリングから予め決定された少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、８個、９個、又は１０個のバイオマーカーを含む。一実施形態は、幾つかの実施形態ではＡＤＳ及び対照の対象から得られた少なくとも１つの代謝及び／又はプロテオミクスのプロファイル、好ましくは両方のプロファイル内の所与のバイオマーカー又はマーカーのセットに重みを割り当てる、以前に得られたコンピュータで実行された計算に基づいて、試験群及び対照群からのコンピュータモデリングデータをコンピュータ可読フォーマットで予め得ることを含む。方法は、コンピュータを用いて、入力されたデータセットに対するデータ計算を行うことであって、該計算が、以前のコンピュータモデリングデータから得られたバイオマーカーのデータと該入力されたデータセットとの比較に基づくことと、上記のコンピュータで実行された比較からの結果に基づいて、対象がＡＳＤを有する、ＡＳＤ発症の素因を有すると特定する、又はＡＳＤの進行／退行を評価することと、を更に含んでいてもよい。
【0025】
幾つかの実施形態では、方法は、比較に基づいて、対象のために、コンピュータのプロセッサに直接又は無線で接続された電子ディスプレイにＡＳＤ治療レジメを表示することであって、表示される治療レジメが、ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象に対する（ｉ）１つ以上の食事の調整、（ｉｉ）１つ以上の栄養の補充、（ｉｉｉ）行動訓練、若しくはそれらの組み合わせ、及び／又は（ｉｖ）ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象において行動遂行の改善が観察されるまで、該対象におけるＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整、のうちの少なくとも１つを表示するグラフィカルユーザインターフェースにおける電子テキストを含むことを更に含んでいてもよい。
【0026】
本開示の前述の態様のいずれか１つの一実施形態では、データセットは、分光測定ユニットから得られる分光測定データである。別の実施形態では、データセットは、ハイスループット測定ユニットから得られる。
【0027】
前述のように、一実施形態では、以前のモデリングデータは、ＡＳＤを有する及びＡＳＤを有しない対象のプロテオミクス及び／又は代謝のプロファイルから複数のバイオマーカーを同定する。
【0028】
一実施形態では、モデリングデータは、ＡＳＤ試験群及び対照群のデータから得られ、各群のデータは、コンピュータで生成された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析、主成分分析（ＰＣＡ）プロット、及び潜在構造判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）モデル、及び／又は変数重要度の投影（ＶＩＰ）プロットのうちの少なくとも１つを含むコンピュータで実行される計算に供され、それによって、測定された他のバイオマーカーと比べてＡＳＤの診断、発症、又は退行に寄与すると同定された少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のバイオマーカーのセットが得られる。
【0029】
幾つかの非限定的な例では、少なくとも２個、３個、４個、又は５個の代謝及び／又はプロテオミクスのバイオマーカーが測定される。更なる実施形態では、最大１００個、９５個、９０個、８５個、８０個、７５個、７０個、６５個、６０個、５５個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、又は２０個の代謝及び／又はプロテオミクスバイオマーカーが、コンピュータモデリングに基づいて同定される。好ましくは、バイオマーカーは、コンピュータモデリングから得られるプロテオミクス及び代謝の両プロファイルから選択される。
【0030】
幾つかの実施形態では、バイオマーカーは、プロテオミクス及び代謝のプロファイルから選択されるバイオマーカーに重みを割り当てることに基づくコンピュータモデリングから選択され、該重みは、ＡＳＤを診断するか又はＡＳＤの進行を評価するマーカーの能力に基づく。
【0031】
一実施形態では、バイオマーカーは、対象から得られたサンプルからのフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースのうちの少なくとも１つから選択される。
【0032】
本開示に記載される例示的な実施形態の全ての特徴は、相互に排他的ではなく、互いに組み合わせることができる。更に言及することなく、ある実施形態の要素を他の実施形態で利用することができる。本開示の他の態様及び特徴は、添付の図面と組み合わせて特定の実施形態に関する以下の説明を精査すれば、当業者に明らかになるであろう。
【0033】
本明細書は、本開示を具体的に指摘し、明確に主張する特許請求の範囲で締めくくられるが、本開示は、以下の添付図面の説明からより深く理解されると考えられる：
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1-1】試験した尿の有機酸の表を含む。
【図1-2】試験した尿の有機酸の表（続き）を含む。
【図2】ＧＣ－／ＬＣ－ＭＳ及び分析プロセスのフローチャートである。
【図3】尿サンプル（実施例１）から試験した代謝物のＰＣＡ及びＰＬＳ－ＤＡのプロットを可視化したものである。
【図4】実施例１から試験した代謝物のＲＯＣ曲線のグラフである。
【図5】実施例１から試験した代謝物の変数重要度の投影（ＶＩＰ）プロットである。
【図6】血清サンプル（実施例２）から試験した代謝物のＰＣＡ及びＰＬＳ－ＤＡのプロットを可視化したものである。
【図7】実施例２から試験した代謝物の変数重要度の投影（ＶＩＰ）プロットである。
【図8】血漿サンプル（実施例２）から試験したプロテオミクスのＰＣＡ及びＰＬＳ－ＤＡのプロットを可視化したものである。
【図9】実施例２から試験した代謝物の変数重要度の投影（ＶＩＰ）プロットである。
【発明を実施するための形態】
【0035】
図面では、一例として例示的な実施形態が示されている。明細書及び図面は、特定の実施形態を例示する目的のためだけのものであり、理解を支援するものであることが明確に理解される。これらは、いかなる方法であっても、本発明を限定すると解釈されることを意図するものではない。
【0036】
本発明の原理を説明する添付図面と共に、本発明の１つ以上の実施形態の詳細な説明が以下に提供される。本発明は、このような実施形態に関連して説明されるが、本発明は、本明細書に記載される任意の特定の実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲及びその等価物によってのみ限定される。本発明を十分に理解させるために、以下の説明では多数の具体的な詳細について記載する。これら詳細は、非限定的な例を提供する目的で提供され、本発明は、これらの特定の詳細の一部又は全部がなくても、特許請求の範囲に従って実施することができる。明確にするために、本発明に関連する技術分野において公知の特定の技術資料は詳細には記載されていないので、そのような記述によって本発明が不必要に不明瞭になることはない。
【0037】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用するとき、特に記載がない限り又は文脈上特に必要がない限り、以下の各用語は下記の定義を有するものとする。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用するとき、特に記載がない限り又は文脈上特に必要がない限り、以下の各用語は下記の定義を有するものとする。
【0038】
特許請求の範囲において使用されるとき、「ａ」及び「ａｎ」等の冠詞は、請求又は記載されているもののうちの１つ以上を意味すると理解される。
【0039】
「自閉症」及び「自閉症スペクトラム障害」（「ＡＳＤ」）という用語は、一般的に、乳幼児チェックリスト（「ＩＴＣ」、コミュニケーション及び象徴行動尺度及び発達プロファイルとしても知られている）及び乳幼児期自閉症チェックリスト修正版（「Ｍ－ＣＨＡＴ」）に記載されている標準行動実験プロトコル／ガイドラインを用いて有資格者によって特定されたＡＳＤを表すために互換的に使用される。また、「ＡＳＤ」という用語は、不安、脆弱Ｘ、レット症候群、結節性硬化症、強迫性障害、注意欠陥障害、統合失調症、自閉性障害（古典的自閉症）、アスペルガー障害（アスペルガー症候群）、特定不能の広汎性発達障害（「ＰＤＤ－ＮＯＳ」）、又は小児崩壊性障害（「ＣＤＤ」）を含むがこれらに限定されないＡＳＤの症状のうちの１つ以上を有する病的状態を指す場合もある。
【0040】
「ＡＳＤ陰性」という用語は、一般的に、ＡＳＤに罹患しておらず、ＡＳＤを発症してもいない個人からの生体サンプルを指す。
【0041】
「ＡＳＤ治療レジメ」という用語は、一般的に、ＡＳＤに罹患している対象に対応して行われる介入を指す。レジメの目的は、症状の緩和又は予防、ＡＳＤの進行又は悪化の減速又は停止、及びＡＳＤの寛解のうちの１つ以上を挙げることができるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、「ＡＳＤ治療レジメ」とは、治療的処置（例えば、ＡＳＤ関連代謝物レベルの変更）、食事の調整、栄養の補充、及び／又は行動訓練を指す。
【0042】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、非限定的であることを意味する、すなわち、結果の結末に影響を与えない他の工程及び他のセクションを追加することができる。上記の用語は、「からなる」及び「から本質的になる」という用語を包含する。
【0043】
「行動遂行の改善」という用語は、一般的に、その程度を問わず、ＡＳＤに罹患している個体が示す行動の障害、症状、及び／若しくは異常のうちの１つ以上、又はＡＳＤの症状のうちの１つ以上を有する病的状態の予防又は重症度若しくは頻度の低下を指す。行動症状の非限定的な例としては、反復行動、プレパルス抑制（「ＰＰＩ」）の減少、及び不安の増大が挙げられる。改善は、治療を行う個人又は別の人物（例えば、医療関係者又はその他）によって観察され得る。
【0044】
「代謝物」という用語は、一般的に、代謝に関与する任意の分子を指す。代謝物は、代謝過程における生成物、基質、又は中間体であってよい。代謝物としては、限定されるものではないが、アミノ酸、ペプチド、アシルカルニチン、単糖類、脂質及びリン脂質、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、グルコース、プロスタグランジン、ヒドロキシエイコサテトラエン酸、ヒドロキシオクタデカジエン酸、ステロイド、胆汁酸、並びに糖脂質及びリン脂質を挙げることができる。
【0045】
「ＡＳＤ関連代謝物」又は「メタボロミクスプロファイル」という用語は、一般的に、フマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（「ＨＰＨＰＡ」）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコース、又はそれらの組み合わせから選択される１つ又は２つ以上の代謝物を含む、ＡＳＤに関連する代謝物のプロファイルを指す。
【0046】
用語「好ましい」、「好ましくは」、及び変形は、一般的に、特定の状況下で特定の利点を与える本開示の実施形態を指す。しかし、同じ又は他の状況下で他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、他の実施形態を本開示の範囲から除外することを意図するものでもない。
【0047】
「予防する」及び「予防」という用語は互換的に使用され、一般的に、対象におけるＡＳＤ発症リスクの低減につながる任意の活動を指す。
【0048】
「ＡＳＤ関連タンパク質」又は「プロテオミクスプロファイル」という用語は、一般的に、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、セロトランスフェリン、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、アルファ－２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、α－１－アンチトリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク２、及びテネイシンＣ、又はそれらの組み合わせから選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のタンパク質を含むＡＳＤに関連するタンパク質のプロファイルを指す。
【0049】
「対象」という用語は、一般的に、哺乳類等の脊椎動物を指す。「哺乳類」という用語は、哺乳綱に属する個体として定義され、ヒト、ドメスティックアニマル及び家畜、並びに動物園の動物、スポーツ動物、又はペット動物、例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、又はウシが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【0050】
「治療する」又は「治療」という用語は、一般的に、対象が示すＡＳＤ又は関連する症状に対応して行われる介入を指す。治療の目的は、ＡＳＤの緩和又は予防、ＡＳＤの進行又は悪化の減速又は停止、及びＡＳＤの寛解のうちの１つ以上を挙げることができるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、「治療」とは、処置療法、食事療法、栄養補助療法、及び／又は行動療法を指す。
【0051】
本開示の全ての実施形態では、全ての百分率、濃度、部、及び比は、特に指定されない限り、本開示の組成物の総重量に基づく。列挙されている成分に関するそのような重量は全て活性レベルに基づくので、特に指定しない限り、市販の材料に含まれる可能性のある溶剤も副産物も含まない。
【0052】
特に具体的に記載のない限り、全ての比は重量比である。特に具体的に記載のない限り、全ての温度は摂氏温度（℃）である。本明細書に開示される全ての寸法及び値（例えば、量、百分率、部、及び比率）は、列挙された正確な数値に厳密に限定されると理解されるべきではない。その代わり、特に指定がない限り、そのような各寸法又は値は、列挙された値とその値の前後の機能的に等価な範囲の両方を意味することが意図される。例えば、「４０ｍｍ」と開示されている寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することが意図される。
【0053】
ＡＳＤを診断及び治療する方法
広範な一態様では、本開示は、対象におけるＡＳＤ及び任意の関連する症状を（早期）診断及び治療する方法に関する。本開示は、少なくとも部分的には、ＡＳＤに関連する病因情報を提供する新規代謝物及び／又は新規タンパク質の同定を前提としており、より有効な療法につながる可能性のある、対象のＡＳＤを客観的に代謝物ベース及び／又はタンパク質ベースで診断する機会を提供する。遺伝と環境との間の相互作用の複雑さに鑑みて、代謝及び／又はプロテオミクスのプロファイリングは、ＡＳＤのより深い理解及び個別化治療法の決定に役立つ診断検査の開発に向けて重要なアプローチを提供することができる。代謝及び／又はプロテオミクスに基づく解析は、個人の遺伝性の遺伝子に由来するバイオマーカープロファイルを同定することに加えて、ＡＳＤ対象の固有の代謝プロファイル及び／又はタンパク質プロファイルに寄与する個人の現在のライフスタイル行動（例えば、喫煙、アルコール消費、睡眠行動、身体活動等）、腸内微生物叢、食事、及び環境要因の相互作用を捉えるという利点を有する。早期診断とＡＳＤ治療レジメとを組み合わせることは、対象の人生のより早い段階で好ましい治療成績が増加するという更なる利点もある。ＡＳＤ対象の診断及び治療に役立つ該対象に共通する新規の代謝プロファイル及び／又はプロテオミクスプロファイルの同定を提供する方法が、本明細書に記載される。従って、本開示は、当技術分野における進歩を提供する。
広範な一態様では、本開示は、対象におけるＡＳＤ及び任意の関連する症状を（早期）診断及び治療する方法に関する。本開示は、少なくとも部分的には、ＡＳＤに関連する病因情報を提供する新規代謝物及び／又は新規タンパク質の同定を前提としており、より有効な療法につながる可能性のある、対象のＡＳＤを客観的に代謝物ベース及び／又はタンパク質ベースで診断する機会を提供する。遺伝と環境との間の相互作用の複雑さに鑑みて、代謝及び／又はプロテオミクスのプロファイリングは、ＡＳＤのより深い理解及び個別化治療法の決定に役立つ診断検査の開発に向けて重要なアプローチを提供することができる。代謝及び／又はプロテオミクスに基づく解析は、個人の遺伝性の遺伝子に由来するバイオマーカープロファイルを同定することに加えて、ＡＳＤ対象の固有の代謝プロファイル及び／又はタンパク質プロファイルに寄与する個人の現在のライフスタイル行動（例えば、喫煙、アルコール消費、睡眠行動、身体活動等）、腸内微生物叢、食事、及び環境要因の相互作用を捉えるという利点を有する。早期診断とＡＳＤ治療レジメとを組み合わせることは、対象の人生のより早い段階で好ましい治療成績が増加するという更なる利点もある。ＡＳＤ対象の診断及び治療に役立つ該対象に共通する新規の代謝プロファイル及び／又はプロテオミクスプロファイルの同定を提供する方法が、本明細書に記載される。従って、本開示は、当技術分野における進歩を提供する。
【0054】
本開示により、ＡＳＤを有する対象において、ＡＳＤに関する新規メタボロミクスプロファイルが同定される。ＡＳＤに関するメタボロミクスプロファイルは、フマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物を含む。好ましくは、ＡＳＤに関連するメタボロミクスプロファイルは、フマル酸、Ｌ－リンゴ酸、及び３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）を含む。
【0055】
代謝物である３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（「ＨＰＨＰＡ」）は、ＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性者における参照ＨＰＨＰＡのレベルの中央値と比較して約１０倍以上のレベルに上昇することが観察されている。幾つかの態様では、約１００μｍｏｌ／ｍｍｏｌ（クレアチニン）以上の上昇したＨＰＨＰＡレベルによって、対象がＡＳＤを有すると特定される。そのような対象は、ＡＳＤと臨床的に診断されている場合もある及び／又はＡＳＤの治療を受けている。ＨＰＨＰＡは、ヒトの尿で検出される豊富な有機酸であり、栄養源に由来すると考えられる。しかし、最近、尿中のＨＰＨＰＡは、消化管内で細菌（すなわち、クロストリジウム属の種）がポリフェノールを代謝することによって生じる異常なフェニルアラニン代謝物から生じる可能性があることが報告されている。
【0056】
代謝物であるフマル酸もＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性者における参照フマル酸のレベルの中央値と比較して約２倍以下のレベルに低下することが観察されている。幾つかの態様では、約０．４μｍｏｌ／ｍｍｏｌ（クレアチニン）以上の低下したフマル酸レベルによって、対象がＡＳＤを有すると特定される。そのような対象は、ＡＳＤと臨床的に診断されている場合もある及び／又はＡＳＤの治療を受けている。フマル酸は、クレブストリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルにおける代謝を通して生成され、該回路において、フマル酸はＬ－リンゴ酸の前駆体である。尿中に排出される場合もあり、フマル酸のレベルが低いとミトコンドリア機能不全を示すことがある。
【0057】
代謝物であるＬ－リンゴ酸もＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性者における参照Ｌ－リンゴ酸のレベルの中央値と比較して約２倍以下のレベルに低下することが観察されている。幾つかの態様では、約７μｍｏｌ／ｍｍｏｌ（クレアチニン）以上の低下したフマル酸レベルによって、対象がＡＳＤを有すると特定される。そのような対象は、ＡＳＤと臨床的に診断されている場合もある及び／又はＡＳＤの治療を受けている。Ｌ－リンゴ酸は、フマル酸と同様に、クレブスＴＣＡサイクルにおける中間体であり、クエン酸の代謝を通して生成される。Ｌ－リンゴ酸は、オキサロ酢酸の前駆体である。尿中に排出される場合もあり、Ｌ－リンゴ酸のレベルが低いとミトコンドリア機能不全を示すことがある。
【0058】
代謝物であるアシルカルニチンもＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性対象における参照アシルカルニチンのレベルの中央値と比較して約０．５～約２．０倍、好ましくは約０．７５～約１．７５倍、又は好ましくは約０．８５～約１．５倍、又はそれ以上のレベルに上昇することが観察されている。好ましくは、アシルカルニチンは、Ｃ１０：１（デセノイルカルニチン）、Ｃ１６：２（９，１２－ヘキサデカジエノイルカルニチン）、及び／又はＣ７－ＤＣ（ピメリル－Ｌ－カルニチン）から選択される。そのような対象は、ＡＳＤと臨床的に診断されている場合もある及び／又はＡＳＤの治療を受けている。生化学的、遺伝学的、及び病理組織学的な所見に基づいて、ミトコンドリア機能不全は、ＡＳＤの原因として以前から推測されていた。更に、ＡＳＤ児の小集団の症状は、集団ベースの調査におけるミトコンドリア呼吸鎖障害の基準と密接に重なっていた（Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｄｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．４７，１８５－１８９（２００５））。ミトコンドリアは、機能するためのエネルギーを細胞に供給するのに関与する中心的なオルガネラであるため、その機能に欠陥があると、疲労、脱力、代謝性脳卒中、発達又は認知の障害、消化管又は腎臓の機能障害を含む広範囲にわたる健康上の懸念が生じる場合があり、そのうちの一部はＡＳＤ症状として観察されるものである。血漿中のミトコンドリア機能の評価及びアシルカルニチンの濃度上昇は、ミトコンドリア機能不全を示している場合がある。カルニチンは、脂肪酸（ＦＡ）代謝に関与し、長鎖ＦＡのミトコンドリア酸化及び細胞内のアシル－ＣｏＡ－ＣｏＡ比の緩衝において絶対的な役割を果たす。そのため、アシルカルニチンプロファイルは、β酸化の直接的又は間接的な破壊を通じたミトコンドリア機能不全を示唆する。ＡＳＤの状況では、アシルカルニチンが調節不全となることが判明している。理論に束縛されるものではないが、血漿アシルカルニチンは、アシルカルニチンの取り込みが広範囲にわたって阻害されるか、又は恐らくミトコンドリア内部の脂肪アシル－ＣｏＡ形成を維持するためにＣｏＡのミトコンドリア内基質利用可能性が低下することにより増加し得る。
【0059】
代謝物であるリゾリン脂質もＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性対象における参照リゾリン脂質のレベルの中央値と比較して約１．１倍以上、又は好ましくは約１．２倍以上のレベルに上昇することが観察されている。好ましくは、リゾリン脂質は、リゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３である。ＡＳＤ対象の血清では、リゾリン脂質のレベルの上昇がみられる。そのような対象は、ＡＳＤと臨床的に診断されている場合もある及び／又はＡＳＤの治療を受けている。理論に束縛されるものではないが、血清リゾリン脂質のレベル上昇は、脂肪酸代謝の障害を示す。
【0060】
代謝物であるスフィンゴ脂質もＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性者における参照スフィンゴ脂質のレベルの中央値と比較して約１．０５倍、又は好ましくは約１．１倍以上のレベルに上昇することが観察されている。好ましくは、スフィンゴ脂質は、ＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１（Ｃ２４：１ヒドロキシスフィンゴミエリン）及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２（Ｃ２２：２ヒドロキシスフィンゴミエリン）である。ＡＳＤ対象の血清では、スフィンゴ脂質のレベルの上昇がみられる。そのような対象は、ＡＳＤと臨床的に診断されている場合もある及び／又はＡＳＤの治療を受けている。理論に束縛されるものではないが、血清スフィンゴ脂質のレベル上昇は、脂肪酸代謝の障害を示す。
【0061】
代謝物であるグリセロリン脂質もＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性者における参照グリセロリン脂質のレベルの中央値と比較して約１．０５倍、又は好ましくは約１．１倍以上のレベルに上昇することが観察されている。好ましくは、グリセロリン脂質は、ＰＣ ａｅ Ｃ３６：０（アシル－アルキル残基の合計がＣ３６：０であるホスファチジルコリン）及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２（ジアシル残基の合計がＣ４０：２であるホスファチジルコリン）である。ＡＳＤ対象の血清では、グリセロリン脂質のレベルの上昇がみられる。そのような対象は、ＡＳＤと臨床的に診断されている場合もある及び／又はＡＳＤの治療を受けている。理論に束縛されるものではないが、血清グリセロリン脂質のレベル上昇は、脂肪酸代謝の障害を示す。
【0062】
代謝物であるグルコースもＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性者における参照グルコースのレベルの中央値と比較して約１．２倍、又は好ましくは約１．２倍以上のレベルに上昇することが観察されている。ＡＳＤ対象の血清では、グルコースのレベルの上昇がみられる。そのような対象は、ＡＳＤと臨床的に診断されている場合もある及び／又はＡＳＤの治療を受けている。脂肪酸の酸化に加えて、解糖もエネルギー生産の別の主要なプロセスである。最近の研究で、新生児期の異常なグルコースレベルとミトコンドリア機能不全との間の繋がりが解明された（Ｈｏｉｒｉｓｃｈ－Ｃｌａｐａｕｃｈ，Ｓ．＆Ｎａｒｄｉ，Ａ．Ｅ．Ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｌｅｔ’ｓ ｔａｌｋ ａｂｏｕｔ ｇｌｕｃｏｓｅ？ Ｔｒａｎｓｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ９，５１－５１（２０１９））。グルコース代謝、ミトコンドリア機能不全、及びＡＳＤの神経症状の間には関連性があると考えられる。更に、ＡＳＤ群でみられるような低レベルのインスリン様成長因子が、小児の神経疾患で観察されている。
【0063】
代謝物である４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸もＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性者における参照４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸のレベルの中央値と比較したとき、ＡＳＤサンプルには存在しない（又は定量可能レベルよりも低い（すなわち、検出不可能である））ことが観察されている。ＡＳＤ対象の尿中では、４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸のレベルが低下しているか又は検出されないことが見出された。そのような対象は、ＡＳＤと臨床的に診断されている場合もある及び／又はＡＳＤの治療を受けている。これら有機酸は、非ＡＳＤ対象と比較してＡＳＤ対象からのサンプルでは定量可能なレベルよりも低い。
【0064】
本開示により、ＡＳＤを有する対象において、ＡＳＤに関する新規プロテオミクスプロファイルが同定される。ＡＳＤのプロテオミクスプロファイルは、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、セロトランスフェリン、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、アルファ２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク質２、及びテネイシンＣからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連タンパク質を含む。
【0065】
本発明者らは、ＡＳＤ対象では血液凝固に関与するタンパク質のレベルが上昇していることを明らかにした。具体的には、タンパク質アルファ－２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、及び凝固第ＸＩ因子がＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性対象における参照アルファ－２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、及び凝固第ＸＩのレベルの中央値と比べて、約０．５～約１．５倍、好ましくは約０．７５～約１．３倍、又は好ましくは約０．８５～約１．２倍、又はそれ以上のレベルに上昇することが観察されている。これらタンパク質は、血液凝固のプロセスを支援し、活性化されるとフィブリンを溶解する。
【0066】
タンパク質である凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖もＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性対象における参照凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖のレベルの中央値と比較して約１．２倍以下、又は好ましくは約１．３倍以下のレベルに低下することが観察されている。これらタンパク質も、血液凝固のプロセスを支援し、活性化されるとフィブリンを溶解する。凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖のレベルの低下は、ＡＳＤ対象で起こる血液凝固プロセスの調節不全を示す。理論に束縛されるものではないが、フィブリンは、凝固カスケードの最終段階に関与しており、これにはフィブリンのネットワークを安定化させるために凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖が必要となる。凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖のレベルの低下により、正常な血液凝固プロセスが妨害される。
【0067】
タンパク質であるトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）もＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性対象における参照トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）のレベルの中央値と比較して、約１．２倍以下、好ましくは約１．４倍以下、又は好ましくは約１．５倍以下のレベルに低下することが観察されている。トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）は、血小板の活性化中の凝固第ＸＩＩＩ因子の基質であり、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）のレベルの低下も正常な血液凝固プロセスを妨害する。
【0068】
タンパク質であるテネイシンＣもＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性対象における参照テネイシンＣのレベルの中央値と比較して約０．３倍以上、好ましくは約０．３５倍以上、又は好ましくは０．４倍以上のレベルに上昇することが観察されている。テネイシンＣは、自然免疫及び免疫制御のトリガーとして機能する。テネイシンＣレベルの上昇は、傷害又は感染中にみられる炎症促進性サイトカインの増加、炎症の進行及び創傷治癒中の一過性の増加、並びに炎症性疾患、自己免疫疾患、及び線維性疾患に伴う持続的な発現をもたらす。
【0069】
タンパク質であるレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）もＡＳＤのバイオマーカーとして同定され、ＡＳＤ陰性対象における参照レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）のレベルの中央値と比較して、約１．５倍以下、好ましくは約１．７倍以下、又は好ましくは約１．８倍以下のレベルになることが観察されている。ＲＢＰ４レベルは、ビタミンＡの代謝物であるレチノールに結合し、輸送する機能を有することから、レチノールの状態の代用マーカーとなる。血漿ＲＢＰ４と自閉症との関連についての開示は知られていない。ＲＢＰ４のレベルの低下は、急性期応答（炎症状態）及び栄養失調に起因する可能性がある。理論に束縛されるものではないが、まとめると、急性期応答、凝固における機能低下、並びに内皮細胞及び血管周囲細胞の調節不全が、ＡＳＤの表現型、特に発達遅延及び免疫系の変化の基礎を形成する可能性がある。
【0070】
驚くべきことに、ＡＳＤに罹患している対象では、非自閉症者及び／又はＡＳＤ陰性者と比較してメタボロミクスプロファイル及び／又はプロテオミクスプロファイルが変化することが見出された。特に、ＡＳＤを有する対象の循環では、非自閉症者と比較してＡＳＤ関連代謝物及び／又はＡＳＤ関連タンパク質のレベルが変化する。特定の実施形態では、ＡＳＤを有する対象の血液（例えば、血清、血漿）、体液（例えば、脳脊髄液、胸水、羊水、精液、又は唾液）、尿、及び／又は糞便において、ＡＳＤ関連代謝物及び／又はＡＳＤ関連タンパク質のレベルが変化する。理論に束縛されるものではないが、ＡＳＤ関連代謝物及び／又はＡＳＤ関連タンパク質は、ＡＳＤを有する対象におけるＡＳＤ関連行動の発現の原因となる役割を果たすと考えられる。あるいは、ＡＳＤ関連代謝物及び／又はＡＳＤ関連タンパク質のレベルの変化は、ＡＳＤによって引き起こされる。
【0071】
具体的には、一態様では、本開示は、対象における自閉症スペクトラム障害（「ＡＳＤ」）を診断及び治療する方法を提供する。方法は、工程（ａ）対象、好ましくはヒトから得られた生体サンプルを提供することを含む。生体サンプルは、成人対象からのものであっても、１０代の対象からのものであってもよい。生体サンプルは、小児、例えば、約１０歳未満、約５歳未満、約３歳未満、約２歳未満、又は約１８ヶ月未満の小児から得ることもできる。本明細書に開示される方法に従って、血液（血清又は血漿を含むがこれらに限定されない）、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）、胸水、尿、便、汗、涙、呼気凝縮液、唾液硝子体液、組織サンプル、羊水、絨毛膜絨毛採取、脳組織；腫瘍、隣接する正常筋、平滑筋、及び骨格筋、脂肪組織、肝臓、皮膚、毛髪、脳、腎臓、膵臓、肺等を含む任意の固形組織の生検材料を含むがこれらに限定されない、対象の身体のいずれかを起源とする任意の種類の生体サンプルを試験することができる。好ましくは、生存対象から得られる生体サンプルは、尿である。ＡＳＤ関連代謝物は、定量分析化学において一般的に使用される任意の数の抽出／精製手順を使用して、その生物学的起源から抽出することができる。
【0072】
方法は、更に、工程（ｂ）得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することを含む。特定の実施形態では、方法は、得られたサンプルから少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、又は１５個のＡＳＤ関連代謝物を測定することを含む。
【0073】
特定の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルは、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）ＧＣ及び液体クロマトグラフィー質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＲＭ、ＬＣ－ＳＩＭ、及びＬＣ－ＳＲＭ）を含むがこれらに限定されない質量分析を通じて測定してよい。好ましくは、ＡＳＤ関連代謝物は、分光技術によって測定され、該分光技術は、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー質量分析、ガスクロマトグラフィー質量分析、高速液体クロマトグラフィー質量分析、キャピラリー電気泳動質量分析、核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）、ラマン分光法、及び赤外分光法からなる群から選択される。また、例えば、比色法、酵素法、免疫学的方法、並びに例えば、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＴ、ノーザン分析、及びインサイチュハイブリダイゼーションを含む遺伝子発現解析等の他の方法論の下で測定を実施してもよい。
【0074】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかでは、方法は、本明細書に記載のもののいずれかを含むがこれらに限定されない、１つ以上の追加のＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することを更に含んでいてもよく、測定することも可能である。本開示の新規アプローチは、診断分類の小集団（すなわち、この場合ＡＳＤ）に関して高い予測値を有するバイオマーカーを同定する。追加のＡＳＤ関連代謝物を含めることの利点は、追加の代謝物のサブタイプを明らかにする機会が得られ、方法の全体的な感度が高まることである。追加のＡＳＤ関連代謝物の非限定的な例を表１に提供する。ここでは、生体サンプルから得られた１つ以上の追加のＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが参照ＡＳＤ陰性サンプルにおける濃度レベルと異なる場合、対象はＡＳＤを有すると特定される。
【0075】
【表1】
【0076】
追加のＡＳＤ関連代謝物の他の好適な例としては、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４５３９７号の表６に列挙されている代謝物が挙げられ、関連する内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0077】
本明細書に記載の方法は、更に、工程（ｃ）得られたサンプルからのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比較することを含む。当業者であれば、比較のために、ＡＳＤに罹患していない非自閉症集団におけるＡＳＤ関連代謝物のレベルを代表する値として参照を確立できることを理解するであろう。参照集団における特定の対象の包含及び／又は除外を決定するために、対象の年齢（例えば、参照対象は、治療を必要とする対象と同じ年齢群内であってよい）及び対象の性別（例えば、参照対象は、治療を必要とする対象と同じ性別であってよい）を含む様々な基準を使用することができる。特定の実施形態では、参照は、約１０歳以下、約５歳以下、約３歳以下、又は約１８ヶ月以下の非自閉症児から得られたＡＳＤ陰性サンプルからのものである。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法では、対象は、約１０歳以下、約５歳以下、約３歳以下、又は約１８ヶ月以下の小児である。
【0078】
本明細書に記載の方法は、更に、工程（ｄ）得られたサンプルからのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なる場合、対象がＡＳＤを有すると特定することを含む。特定の実施形態では、特定する工程（ｄ）は、得られたサンプルからの少なくとも１つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの少なくとも１つの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上異なると判定されたときに行われる。特定の実施形態では、特定する工程（ｄ）は、得られたサンプルからの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上異なると判定されたときに行われる。
【0079】
特定の実施形態では、特定する工程（ｄ）は、得られたサンプルからのフマル酸及び／又はＬ－リンゴ酸の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照フマル酸及び／又は参照Ｌ－リンゴ酸の濃度レベルに比べて低下していると判定されたときに行われる。幾つかの態様では、得られたサンプルからのフマル酸の濃度レベルは、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照フマル酸の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上低い。幾つかの態様では、得られたサンプルからのＬ－リンゴ酸の濃度レベルは、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照フマル酸の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上低い。
【0080】
特定の実施形態では、特定する工程（ｄ）は、得られたサンプルからの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。幾つかの態様では、得られたサンプルからの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルは、ＡＳＤ－陰性サンプルからの参照３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上上昇する。幾つかの態様では、約１００μｍｏｌ／ｍｍｏｌ（クレアチニン）以上の上昇したレベルの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）によって、対象がＡＳＤを有すると特定される。幾つかの態様では、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）レベルが約１００μｍｏｌ／ｍｍｏｌ（クレアチニン）未満であると、ＡＳＤを有すると特定することから対象が除外される。
【0081】
本明細書に記載の方法は、更に、工程（ｅ）そのようにＡＳＤを有すると特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することを含む。
【0082】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、得られたサンプルからの少なくとも１つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルとＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルとの比較は、多変量統計分析を用いることを含む。好ましくは、多変量統計解析は、主成分分析（「ＰＣＡ」）、又は部分的最小二乗潜在構造投影判別分析（「ＰＬＳ－ＤＡ」）から選択される。特定の実施形態では、統計解析のためにコンピュータが使用される。統計解析のためのデータは、当技術分野で公知の統計方法のためのソフトウェアを使用して、クロマトグラム（すなわち、質量シグナルのスペクトル）から抽出することができる。
【0083】
幾つかの態様では、本開示は、ＡＳＤの進行をモニタリングし、対象におけるＡＳＤを治療する方法に関する。本質的に、方法は、対象におけるＡＳＤ進行（例えば、ＡＳＤ進行の低下率又は改善率）をモニタリングするために、治療開始後の１つ以上の時点においてＡＳＤ関連代謝物を定量することを含む。従って、方法は、（ａ）第１の時点で対象から得られた第１の生体サンプルを提供することと；（ｂ）該第１の得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することによって、第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを評価することと；（ｃ）該第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルと比較することと；（ｄ）該第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルと該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルとの間に、ＡＳＤを示す第１の差があると判定することと；（ｅ）該第１の時点の後である第２の時点で該対象から得られた第２の生体サンプルを提供することと；（ｆ）該第２の得られたサンプルから該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することによって、第２のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを評価することと；（ｇ）該第２のＡＳＤ関連代謝物プロファイルを、該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルと比較することと；（ｈ）該第１のＡＳＤ関連代謝物プロファイルと該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連代謝物プロファイルとの間に、ＡＳＤを示す第２の差があると判定することと；（ｉ）該第１の差及び第２の差に少なくとも部分的に基づいてＡＳＤの進行を判定することと；（ｊ）特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、を含む。
【0084】
上記方法の特定の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間の期間は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、又は少なくとも１２ヶ月、好ましくは少なくとも３ヶ月である。幾つかの実施形態では、最初の２つの生体サンプルが得られる前に、対象には既に治療が施されている。他の実施形態では、生体サンプルの採取間の間隔（複数可）において、対象には既に治療が施されている。特定の実施形態では、第１の生体サンプル、第２の生体サンプル、又はその両方は、血液又は尿、好ましくは血清、血漿、又は尿である。
【0085】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の生体サンプルからの好ましくはＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣから選択されるアシルカルニチンの濃度レベルが、第１の得られた生体サンプルからのＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣの濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0086】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の得られた生体サンプルからのフマル酸及び／又はＬ－リンゴ酸の濃度レベルが、第１の得られた生体サンプルからのフマル酸及び／又はＬ－リンゴ酸の濃度レベルに比べて低下していると判定されたときに行われる。
【0087】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の得られたサンプルからの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルが、第１の得られた生体サンプルからの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0088】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の得られた生体サンプルからのリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３の濃度レベルが、第１の得られた生体サンプルからのリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0089】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の得られた生体サンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２、得られたサンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２、第２の得られた生体サンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２の濃度レベルと判定されたときに行われる。
【0090】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の得られた生体サンプルからのＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルが、第１の得られた生体サンプルからのＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0091】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の得られた生体サンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２、得られたサンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２、第２の得られた生体サンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２の濃度レベルと判定されたときに行われる。
【0092】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の得られた生体サンプルからのＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルが、第１の得られた生体サンプルからのＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0093】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の得られた生体サンプルからの４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸の濃度レベルが、第１の得られた生体サンプルからの４－ヒドロキシマンデル酸及び／又は２－ヒドロキシイソ吉草酸の濃度レベルに比べて低下していると判定されたときに行われる。
【0094】
上記方法の特定の実施形態では、判定する工程（ｉ）は、第２の得られた生体サンプルからのｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び／又は４－ヒドロキシ馬尿酸の濃度レベルが、第１の得られた生体サンプルからのｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び／又は４－ヒドロキシ馬尿酸の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0095】
本開示はまた、対象における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断及び治療する方法を提供する。方法は、（ａ）対象から得られた生体サンプルを提供することと；（ｂ）レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、セロトランスフェリン、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、アルファ２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク質２、及びテネイシンＣからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを測定することと；（ｃ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比較することと；（ｄ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルが、該ＡＳＤ陰性サンプルから該参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比べて異なる場合、該対象がＡＳＤを有すると特定することと；（ｅ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、を含む。
【0096】
本開示はまた、対象における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断及び治療する方法を提供する。方法は、（ａ）対象から得られた生体サンプルを提供することと；（ｂ）該得られたサンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを測定することと；（ｃ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比較することと；（ｄ）レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、セロトランスフェリン、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、アルファ２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリン様成長因子結合タンパク質２、及びテネイシンＣからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを測定することと；（ｅ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比較することと；（ｆ）該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルが、該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なっており、かつ該得られたサンプルからの該ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルが、該ＡＳＤ陰性サンプルからの該参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルと比べて異なっている場合、該対象がＡＳＤを有すると特定することと；（ｇ）そのように特定された対象をＡＳＤ治療レジメで治療することと、を含む。
【0097】
上記方法の特定の実施形態では、特定する工程（ｆ）は、得られたサンプルからのＡＳＤ関連タンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連タンパク質の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上異なると判定されたときに行われる。
【0098】
上記方法の特定の実施形態では、特定する工程（ｆ）は、得られたサンプルからのアルファ－２－アンチプラスミン、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、及び／又はテネイシンＣの濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照アルファ－２－アンチプラスミン、参照凝固第Ｘ因子、参照凝固第ＸＩ因子、及び／又は参照テネイシンＣの濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0099】
上記方法の特定の実施形態では、特定する工程（ｆ）は、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、及び／又はレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、参照トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、及び／又は参照レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）の濃度レベルに比べて低下していると判定されたときに行われる。
【0100】
上記方法の特定の実施形態では、特定する工程は、得られたサンプルからのＡＳＤ関連代謝物のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルに比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、又は約７０％以上異なると判定されたときに行われる。
【0101】
上記方法の特定の実施形態では、特定する工程（ｆ）は、得られたサンプルからの３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はグリセロリン脂質の濃度レベルが、該ＡＳＤ陰性サンプルからの参照３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、参照アシルカルニチン、参照リゾリン脂質、参照スフィンゴ脂質、及び／又は参照グリセロリン脂質の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0102】
上記方法のいずれかの特定の実施形態では、アシルカルニチンは、Ｃ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣから選択される。好ましくは、方法の特定する工程は、得られたサンプルからのＣ１０：１、Ｃ１６：２、及び／又はＣ７－ＤＣの濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照Ｃ１０：１、参照Ｃ１６：２、及び／又は参照Ｃ７－ＤＣの濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0103】
上記方法のいずれかの特定の実施形態では、リゾリン脂質は、リゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３である。好ましくは、方法の特定する工程は、得られたサンプルからのリゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又はリゾＰＣ ａ Ｃ２０：３の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照リゾＰＣ ａ Ｃ１７：０及び／又は参照リゾＰＣ ａ Ｃ２０：３の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0104】
上記方法のいずれかの特定の実施形態では、スフィンゴ脂質は、ＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２である。好ましくは、方法の特定する工程は、得られたサンプルからのＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又はＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＳＭ（ＯＨ）Ｃ２４：１及び／又は参照ＳＭ（ＯＨ）Ｃ２２：２の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0105】
上記方法のいずれかの特定の実施形態では、グリセロリン脂質は、ＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２である。好ましくは、方法の特定する工程は、得られたサンプルからのＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又はＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＰＣ ａｅ Ｃ３６：０及び／又は参照ＰＣ ａａ Ｃ４０：２の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0106】
上記方法の特定の実施形態では、特定する工程は、得られたサンプルからのｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び／又は４－ヒドロキシ馬尿酸の濃度レベルが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び／又は４－ヒドロキシ馬尿酸の濃度レベルに比べて上昇していると判定されたときに行われる。
【0107】
ＡＳＤ治療レジメは、ＡＳＤを有するか又はＡＳＤを発症する素因があると診断された対象に対する食事の調整、栄養の補充、行動訓練、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、ＡＳＤ治療レジメは、ＡＳＤを有するか又はＡＳＤを発症する素因があると診断された対象におけるＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の濃度レベルを、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の対応するレベルに向けて調整する効果を有する。
【0108】
対象の食事を調整するために、様々な方法を用いることができる。非限定的な例として、１つ以上の腸内細菌種を低減するために、低炭水化物食を対象に提供してよい。理論に束縛されるものではないが、低炭水化物食は、発酵に利用可能な材料を制限し、対象における腸内微生物叢の組成を減少させることができると考えられる。例えば、ＡＳＤを治療するために、対象におけるクロストリジウム属の細菌（ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）等）のレベルを低下させることが望ましい場合がある。更に、ケトン誘発食による脂肪酸酸化増加及び血糖レベル低下の誘導は、ＡＳＤを有する対象、特に小児における症状を改善する可能性がある。
【0109】
栄養の補充は、非限定的な例として、対象に健康上の利益を提供する栄養強化食品又はサプリメントによって調整することができる。本明細書で使用するとき、用語「プロバイオティクス」とは、一般的に、適切な量で投与されたときに健康上の利益を提供し、対象におけるＡＳＤの治療に役立ち得る、生存している微生物を指す。プロバイオティクスは、栄養強化食品及び栄養補助食品（例えば、カプセル、錠剤、及び粉末）で利用可能であり得る。プロバイオティクスを含む栄養強化食品の非限定的な例としては、ヨーグルト等の乳製品、発酵及び未発酵乳、スムージー、バター、クリーム、フムス、昆布茶、サラダドレッシング、味噌、テンペ、栄養バー、並びに一部のジュース及び大豆飲料が挙げられる。
【0110】
行動訓練とは、ＡＳＤに関連する行動症状が現れているか又は後に発症する人の負担を軽減する任意の活動を指す。行動訓練には、当技術分野で一般的に知られているような標準的な行動修正治療が含まれ得る。
【0111】
対象におけるＡＳＤ関連代謝物の濃度レベル、例えば血中レベル（例えば、血清レベル）を調整するために、様々な方法を用いることができる。好ましくは、対象における１つ以上のＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルの調整は、該対象において行動遂行の改善が観察されるまで行われる。
【0112】
特定の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝物、ＡＳＤ関連代謝物のインビボ合成のための中間体、又はＡＳＤ関連代謝物のインビボ合成のための基質に特異的に結合する抗体を、対象に投与してよい。例えば、ＨＰＨＰＡ並びに／又はインビボＨＰＨＰＡ合成における基質及び中間体のうちの１つ以上に特異的に結合する抗体を用いて、対象におけるＨＰＨＰＡのレベルを低下させることができる。
【0113】
特定の実施形態では、１つ以上のＡＳＤ関連代謝物の濃度レベル、例えば血中レベル（例えば、血清レベル）は、対象における腸内微生物叢の組成を調整することによって調整される。特定の実施形態では、対象における腸内微生物叢の組成を調整することは、対象における１つ以上の細菌種のレベルを上昇させることを含む。非限定的な例として、対象における腸内微生物叢の組成を調整するために、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、エリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、及び／又はアルカリゲネス科（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）の細菌のレベルを上昇させてよい。特定の実施形態では、対象における腸内微生物叢の組成を調整することは、対象における１つ以上の細菌種のレベルを低下させることを含む。非限定的な例として、対象における腸内微生物叢の組成を調整するために、クロストリジウム属の細菌のレベルを低下させてよい。
【0114】
特定の実施形態では、対象における腸内微生物叢の組成は、糞便移植（糞便微生物叢移植（「ＦＭＴ」）、糞便細菌療法、又は便移植として知られている）によって調整される。糞便移植は、健常ドナー（すなわち、ＡＳＤ陰性者）からレシピエント（例えば、ＡＳＤに罹患している対象）へ糞便細菌を単回又は複数回移植するプロセスを含み得る。
【0115】
特定の実施形態では、対象における腸内微生物叢の組成は、細菌を含む組成物、例えば、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の細菌（例えば、バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ））を含む組成物を対象に投与することによって調整される。細菌組成物は、経口投与、直腸投与、経皮投与、鼻腔内投与、又は吸入を介して対象に投与することができる。経口投与では、細菌組成物は、プロバイオティクス組成物、栄養補給組成物、医薬組成物、又はそれらの混合物であってよい。ヒト及び動物の対象への投与量は、好ましくは、所望の効果をもたらすのに十分な量の計算された所定量の細菌を含有する。
【0116】
キット
本明細書に記載のメタボロミクスプロファイルは、継続的な評価、モニタリング、易罹患性評価、保因者検査、及び出生前診断を含む、ＡＳＤの診断、予測、調節、又はモニタリングのための検査、アッセイ、方法、キットに利用することができる。本開示は、ＡＳＤに関連する少なくとも１つ以上のＡＳＤ関連代謝物を測定及び同定することによりＡＳＤを診断するためのキットを含む。好ましくは、キットは、ＡＳＤと判定された際に開始される適切なＡＳＤ治療レジメを含み得る。従って、キットは、（ａ）得られた生体サンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを検出するように構成されている検出器と；（ｂ）ＡＳＤ陰性対象の対照群に対応する対照レベルのフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタゴン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースを含む組成物と、（ｃ）該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと該対照レベルとの差を分析するように構成されている多変量解析システムと；（ｄ）任意で、ＡＳＤ診断方法の説明書であって、該方法が、該得られた生体サンプルからのＡＳＤ関連代謝物のレベルを該検出器を用いて測定し、得られたＡＳＤ関連代謝物のレベルをＡＳＤ陰性対象から得られたＡＳＤ関連代謝物の対照レベルと比較することを含む説明書と、を含む。好ましくは、ＡＳＤ診断方法は、ＡＳＤ関連代謝物のレベルを測定するように構成されているマルチ代謝物検出器を含む。
本明細書に記載のメタボロミクスプロファイルは、継続的な評価、モニタリング、易罹患性評価、保因者検査、及び出生前診断を含む、ＡＳＤの診断、予測、調節、又はモニタリングのための検査、アッセイ、方法、キットに利用することができる。本開示は、ＡＳＤに関連する少なくとも１つ以上のＡＳＤ関連代謝物を測定及び同定することによりＡＳＤを診断するためのキットを含む。好ましくは、キットは、ＡＳＤと判定された際に開始される適切なＡＳＤ治療レジメを含み得る。従って、キットは、（ａ）得られた生体サンプルからフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルを検出するように構成されている検出器と；（ｂ）ＡＳＤ陰性対象の対照群に対応する対照レベルのフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタゴン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースを含む組成物と、（ｃ）該ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと該対照レベルとの差を分析するように構成されている多変量解析システムと；（ｄ）任意で、ＡＳＤ診断方法の説明書であって、該方法が、該得られた生体サンプルからのＡＳＤ関連代謝物のレベルを該検出器を用いて測定し、得られたＡＳＤ関連代謝物のレベルをＡＳＤ陰性対象から得られたＡＳＤ関連代謝物の対照レベルと比較することを含む説明書と、を含む。好ましくは、ＡＳＤ診断方法は、ＡＳＤ関連代謝物のレベルを測定するように構成されているマルチ代謝物検出器を含む。
【0117】
幾つかの態様では、キットは、（本明細書で上述したような）物理的分離技術によってＡＳＤ関連代謝物を測定するためのものであってよい。幾つかの態様では、キットは、物理的分離法以外の方法、例えば非限定的な例として、比色法、酵素法、及び免疫学的方法によってＡＳＤ関連代謝物を測定するためのものであってもよい。また、キットは、１つ以上の適切な陰性及び／又は陽性の対照を含んでいてもよい。本開示のキットは、試験を行うために必要なバッファ及び溶液等の他の試薬を含んでいてもよい。
【0118】
コンピュータで実行される方法
本開示はまた、対象の生体サンプルを処理し、ＡＳＤを診断し、ＡＳＤを治療するためのコンピュータで実行される方法に関する。コンピュータで実行される方法は、更に、より有効な治療レジメを支援するために複数の時点にわたってＡＳＤの進行をモニタリングすることを可能にし得る。
本開示はまた、対象の生体サンプルを処理し、ＡＳＤを診断し、ＡＳＤを治療するためのコンピュータで実行される方法に関する。コンピュータで実行される方法は、更に、より有効な治療レジメを支援するために複数の時点にわたってＡＳＤの進行をモニタリングすることを可能にし得る。
【0119】
コンピュータで実行される方法は、対象からの生体サンプルを受信することと；処理装置に直接又は無線で接続されるか又は任意の好適な通信技術を利用してもよい分光測定ユニットでサンプルを処理することであって、該処理装置が、該分光測定ユニットからの測定データを保存するためのメモリを有することと；該分光測定ユニットで、フマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル－３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物のレベルを測定し、測定データをプロセッサに保存することと、を含む。処理装置は、方法に関連するデータを保存するように構成又は適合され得る１つ以上のデータ保存装置を備える。例えば、データ保存装置は、分光測定ユニットからの測定データを保存するように構成又は適合され得る。また、データ保存装置は、そこに保存されたコンピュータプログラムコードを含んでいてもよい。この実施形態のプログラムコードは、その実行時に方法の態様の工程を少なくとも実行するためのプログラムコードを含み得る。
【0120】
コンピュータで実行される方法は、更に、多変量統計解析を用いて、保存された測定データをＡＳＤ陰性サンプルを表すメモリ内の値と比較することと；得られたサンプルからのフマル酸、Ｌ－リンゴ酸、４－ヒドロキシマンデル酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）－３－ヒドロキシプロパン酸（ＨＰＨＰＡ）、ｐ－ヒドロキシフェニル酢酸、２－エチル３－ヒドロキシプロピオン酸、３－メチルグルタコン酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルグルタル酸、及び４－ヒドロキシ馬尿酸、アシルカルニチン、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＡＳＤ関連代謝物に対応する結果を処理装置に保存することであって、該結果から、ＡＳＤ関連代謝物のレベルを表す測定データが、ＡＳＤ陰性サンプルからの参照ＡＳＤ関連代謝物の濃度レベルと比べて異なる場合、対象がＡＳＤを有すると特定されることと；ＡＳＤを有するか又はＡＳＤを発症する素因を有すると特定された対象のために、プロセッサに直接又は無線で接続された電子ディスプレイにＡＳＤ治療レジメを表示することと、を含む。表示される治療レジメは、ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象に対する食事の調整、栄養の補充、行動訓練、若しくはそれらの組み合わせ、又は対象において行動遂行の改善が観察されるまで、ＡＳＤを有するか若しくはＡＳＤを発症する素因を有すると診断された対象におけるＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整、のうちの１つ以上を説明するグラフィカルユーザインターフェースにおける電子テキストを、任意でグラフィカルアイコンと共に含み、好ましくは、該ＡＳＤ関連代謝物のうちの１つ以上の血中レベルの調整は、対象における腸内微生物叢の組成の調整を含む。
【実施例】
【0121】
以下の実施例は、本明細書に記載される特定の方法を実施する幾つかの例示的な様式について説明する。実施例は、例示目的のためだけのものであり、本明細書に記載のシステム及び方法の範囲を限定することを意味するものではないことが理解されるべきである。
【0122】
実施例１
２歳～１８歳のＡＳＤ対象及びＡＳＤ陰性対照対象からの尿サンプルをこの試験に含める。対象からシングルスポットの尿サンプルを取得し、最大８５種の尿有機酸を定量的に検出するＧＣ－ＭＳで分析する（図１を参照）。尿サンプルは、分析のために解凍するまで－２０℃で保存する。収集と分析との間の間隔は、２週間～２ヶ月の範囲である。
２歳～１８歳のＡＳＤ対象及びＡＳＤ陰性対照対象からの尿サンプルをこの試験に含める。対象からシングルスポットの尿サンプルを取得し、最大８５種の尿有機酸を定量的に検出するＧＣ－ＭＳで分析する（図１を参照）。尿サンプルは、分析のために解凍するまで－２０℃で保存する。収集と分析との間の間隔は、２週間～２ヶ月の範囲である。
【0123】
ＧＣ－ＭＳ分析用サンプルの調製
サンプルを調製するために、ＨＰＬＣ水２００μＬ、内部標準物質（ＩＳＴＤ）（内部標準物質としての２．８２ｍＭトロパ酸）１０μＬ、及びメトキシアミンＨＣｌ４０μＬを、２ｍＬガラスバイアル内で合わせ、十分に混合する。サンプルを、６０℃で３０分インキュベートする。サンプルを、ベンチで１０分間かけて室温まで冷却し、その後、溶液が酸性（ｐＨ＝１）になるまで６Ｎ塩酸１０μＬをサンプルに添加する。２１０μＬの体積のブランク／ＱＣ／尿サンプルをバイアルから２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに移す。酢酸エチルをチューブに添加し（６００μＬ）、得られた溶液を１分間十分にボルテックスする。サンプルを、１０，０００ｒｐｍで３分間スピンする。５００μＬの体積の上清を新たな２ｍＬガラスバイアルに移す。その後、別の６００μＬの酢酸エチルをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに添加し、１分間十分ボルテックスする。サンプルを１０，０００ｒｐｍで３分間スピンする。５００μＬの体積の上清を抜き取り、前回の上清の入った２ｍＬガラスバイアルに添加する（すなわち、２回の抽出から得られた上清を合わせる）。窒素下で加熱（３５℃）しながら１．５時間かけてサンプルを蒸発乾固する。１６０μＬの体積のヘキサンと４０μＬの新鮮Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＦＴＡ）（１％のＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＴＭＣＳ）を含む）をサンプルに添加し、得られた混合物をボルテックスして十分に混合する。サンプルを、８０℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、サンプルをベンチで１５分間かけて室温まで冷却する。１９０μＬの体積のサンプルをブランク、ＱＣ、及び尿サンプル用の２５０μＬのインサートに移す。アルカン標準混合物を新たに調製した、すなわち、２ｍＬガラスバイアルに２５μＬのアルカン標準溶液Ｃ８～Ｃ２０及び７５μＬのアルカン標準溶液Ｃ２１～Ｃ４０を添加し、ボルテックスして十分混合し、２５０μＬのインサートに移した。サンプルは、ＧＣ－ＭＳ分析の準備が整ったか、又は分析の準備が整うまで冷蔵する。ＧＣ－ＭＳ及び分析プロセスのフローチャートについては図２を参照。
サンプルを調製するために、ＨＰＬＣ水２００μＬ、内部標準物質（ＩＳＴＤ）（内部標準物質としての２．８２ｍＭトロパ酸）１０μＬ、及びメトキシアミンＨＣｌ４０μＬを、２ｍＬガラスバイアル内で合わせ、十分に混合する。サンプルを、６０℃で３０分インキュベートする。サンプルを、ベンチで１０分間かけて室温まで冷却し、その後、溶液が酸性（ｐＨ＝１）になるまで６Ｎ塩酸１０μＬをサンプルに添加する。２１０μＬの体積のブランク／ＱＣ／尿サンプルをバイアルから２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに移す。酢酸エチルをチューブに添加し（６００μＬ）、得られた溶液を１分間十分にボルテックスする。サンプルを、１０，０００ｒｐｍで３分間スピンする。５００μＬの体積の上清を新たな２ｍＬガラスバイアルに移す。その後、別の６００μＬの酢酸エチルをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに添加し、１分間十分ボルテックスする。サンプルを１０，０００ｒｐｍで３分間スピンする。５００μＬの体積の上清を抜き取り、前回の上清の入った２ｍＬガラスバイアルに添加する（すなわち、２回の抽出から得られた上清を合わせる）。窒素下で加熱（３５℃）しながら１．５時間かけてサンプルを蒸発乾固する。１６０μＬの体積のヘキサンと４０μＬの新鮮Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＦＴＡ）（１％のＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＴＭＣＳ）を含む）をサンプルに添加し、得られた混合物をボルテックスして十分に混合する。サンプルを、８０℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、サンプルをベンチで１５分間かけて室温まで冷却する。１９０μＬの体積のサンプルをブランク、ＱＣ、及び尿サンプル用の２５０μＬのインサートに移す。アルカン標準混合物を新たに調製した、すなわち、２ｍＬガラスバイアルに２５μＬのアルカン標準溶液Ｃ８～Ｃ２０及び７５μＬのアルカン標準溶液Ｃ２１～Ｃ４０を添加し、ボルテックスして十分混合し、２５０μＬのインサートに移した。サンプルは、ＧＣ－ＭＳ分析の準備が整ったか、又は分析の準備が整うまで冷蔵する。ＧＣ－ＭＳ及び分析プロセスのフローチャートについては図２を参照。
【0124】
ＧＣ－ＭＳデータ解析
約８５種の有機酸の完全に定量された代謝物濃度データを含むＧＣ－ＭＳデータを、定量された代謝物データセットの統計解析、機能解析、及び統合解析を行うことができる総合ウェブサーバであるＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）Ｖ３．０（２０１６）を介して解析する。ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）ツールは、健常対照サンプルに対してＡＳＤを分類するために使用される代謝物を同定するための特定のデータ計算及び可視化を行うために使用される。
約８５種の有機酸の完全に定量された代謝物濃度データを含むＧＣ－ＭＳデータを、定量された代謝物データセットの統計解析、機能解析、及び統合解析を行うことができる総合ウェブサーバであるＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）Ｖ３．０（２０１６）を介して解析する。ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）ツールは、健常対照サンプルに対してＡＳＤを分類するために使用される代謝物を同定するための特定のデータ計算及び可視化を行うために使用される。
【0125】
ＡＳＤ群及び対照群について、主成分分析（「ＰＣＡ」）及び部分的最小二乗判別分析（「ＰＬＳ－ＤＡ」）を実施し、結果を比較する。ＰＣＡは、サンプル集団における差を可視化し、データセットにおける強いクラスター又はパターンを明らかにするために使用される多変量クラスタリング技術である。出願人は、データの解析及び可視化をより容易にするために多変量手法を使用した。ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）を使用してＰＣＡプロットを作成し、ＡＳＤサンプル及び健常対照サンプルのクラスターの可視化を開始させる（図３参照）。ＰＬＳ－ＤＡは、クラス間の分離が最大になるようにＰＣＡ成分を回転させることによって２群の所見間の分離を強化するために実行することができる別の分類モデルである。ＰＬＳ－ＤＡは、どの変数が最も重要なクラス分離情報を担っているかを理解し、順位付けするためにも使用することができる。ＰＬＳ－ＤＡによって、健常対照集団に対するＡＳＤの分離及び分類を強化することができる（図３参照）。
【0126】
ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）を使用して、受信者動作特性曲線又はＲＯＣ曲線を作成する（図４参照）。ＲＯＣ曲線とは、二値分類子システムの識別閾値を変化させたときのその診断能力を示すグラフィカルプロットである。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって、健常対照サンプルに対してＡＳＤを識別するモデルの診断能力は０．９８６であると求めることができる。これは、９８．６％の診断精度のレベルに相当する。
【0127】
図５を参照すると、上位の変数の方が下位の変数よりもＰＬＳ－ＤＡモデルへの寄与が大きい降順で最も重要な変数（すなわち、代謝物）を同定するために、変数重要度の投影（「ＶＩＰ」）プロットを作成する。また、ＶＩＰプロットの上位のものは、ＡＳＤの尿サンプルと健常対照の尿サンプルとの分類において高い予測力を発揮する。
【0128】
実施例２
ＡＳＤ対象（すなわち、試験群）から静脈穿刺により空腹時血液サンプルを回収する。試験群は、３歳～３２歳の４４名の参加者を含み、そのうち７６％が男性である。比較分析のために、４０名の非ＡＳＤ対象（すなわち、対照群）を、出願人が作成したデータベース（本明細書では「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｙｏｕデータベース」）から無作為に選択する。対照群は年齢及び性別が一致しており、対照群はほとんど９歳前後であり、約５０％が男性である。試験群及び対照群の人口統計データを表２に提供する。
ＡＳＤ対象（すなわち、試験群）から静脈穿刺により空腹時血液サンプルを回収する。試験群は、３歳～３２歳の４４名の参加者を含み、そのうち７６％が男性である。比較分析のために、４０名の非ＡＳＤ対象（すなわち、対照群）を、出願人が作成したデータベース（本明細書では「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｙｏｕデータベース」）から無作為に選択する。対照群は年齢及び性別が一致しており、対照群はほとんど９歳前後であり、約５０％が男性である。試験群及び対照群の人口統計データを表２に提供する。
【0129】
【表2】
【0130】
血清を生成するために、血液サンプルを６ｍＬの血清バキュテナーチューブに回収し、遮光し、採血後に（ｐｏｓｔ－ｄｒａｗ）室温で１時間インキュベートして凝固させる。インキュベーション後、血液サンプルを１，３００×ｇで１０分間遠心分離して、血清を単離する。血清をクライオバイアルに移し、直ちに、分析のために解凍するまで－２０℃で保存する。回収と分析との間の間隔は、２週間～２ヶ月の範囲である。
【0131】
血漿を生成するために、血液サンプルを６ｍＬのＥＤＴＡバキュテナーチューブに回収し、採血後直ちに氷浴に入れる。氷浴後、血液サンプルを１，３００×ｇで１０分間遠心分離して、血漿を単離する。血漿をクライオバイアルに移し、直ちに、分析のために解凍するまで－２０℃で保存する。回収と分析との間の間隔は、２週間～２ヶ月の範囲である。
【0132】
（Ａ）プロテオミクス解析
安定同位体標識標準（ＳＩＳ）ペプチドのための１３Ｃ／１５Ｎ標識アミノ酸を用いたフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化学を用いてペプチドを合成し、逆相ＨＰＬＣで精製し、その後ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによって評価し、アミノ酸分析（ＡＡＡ）及びキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を介して特性評価する。使用した他の化学物質及び試薬は全て、商業的供給元から入手される入手可能な最高級の分析及びＬＣ－ＭＳグレードのものである。
安定同位体標識標準（ＳＩＳ）ペプチドのための１３Ｃ／１５Ｎ標識アミノ酸を用いたフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化学を用いてペプチドを合成し、逆相ＨＰＬＣで精製し、その後ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによって評価し、アミノ酸分析（ＡＡＡ）及びキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を介して特性評価する。使用した他の化学物質及び試薬は全て、商業的供給元から入手される入手可能な最高級の分析及びＬＣ－ＭＳグレードのものである。
【0133】
１４０種のタンパク質のパネルを、ＭＣ－ＭＲＭ質量分析を用いたペプチドベースの分析による標的定量に使用する。これらペプチドは、米国国立がん研究所のアッセイ開発のための臨床プロテオミクス腫瘍解析コンソーシアム（ＣＰＴＡＣ）ガイドライン（ｈｔｔｐｓ：／／ａｓａｙｓ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）に従って、ＬＣ－ＭＲＭ実験での使用について事前に検証されている。
【0134】
プロテオミクス分析用サンプルの調製
凍結させた血漿を室温で解凍する。１０μＬの体積の血漿を、９Ｍ尿素、２０ｍＭジチオスレイトール、及び０．５Ｍヨードアセトアミドに逐次供する。全ての工程は、ｐＨ８．０のＴｒｉｓバッファ中で行われる。変性及び還元を３７℃で３０分間同時に行い、その後暗所において室温で３０分間アルキル化を行う。ＴＰＣＫ処理したトリプシン（１ｍｇ／ｍＬで７０μＬ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を１０：１の基質：酵素比で添加することによって、タンパク質分解を開始させる。３７℃で一晩インキュベートした後、最終濃度１．０％のギ酸（ＦＡ）でタンパク質分解をクエンチする。
凍結させた血漿を室温で解凍する。１０μＬの体積の血漿を、９Ｍ尿素、２０ｍＭジチオスレイトール、及び０．５Ｍヨードアセトアミドに逐次供する。全ての工程は、ｐＨ８．０のＴｒｉｓバッファ中で行われる。変性及び還元を３７℃で３０分間同時に行い、その後暗所において室温で３０分間アルキル化を行う。ＴＰＣＫ処理したトリプシン（１ｍｇ／ｍＬで７０μＬ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を１０：１の基質：酵素比で添加することによって、タンパク質分解を開始させる。３７℃で一晩インキュベートした後、最終濃度１．０％のギ酸（ＦＡ）でタンパク質分解をクエンチする。
【0135】
次いで、ＳＩＳペプチド混合物（上記の通り）を血漿に添加する。次いで、全ての血漿を固相抽出（ＷａｔｅｒのＯａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ（３０マイクロメートル吸着粒子）２ｍｇ）によって濃縮する。固相抽出後、スピード真空濃縮機を用いて濃縮溶出液を蒸発させ、ＬＣ－ＭＲＭ／ＭＳのために０．１％ＦＡで最終濃度１μｇ（ペプチド）／μＬ（消化物）になるように再水和する。上述の血漿サンプルと同じ方法を用いてＰＢＳバッファ中１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡの消化物から、標準サンプル及びＱＣサンプルと共に使用するための代用マトリックスを調製する。
【0136】
各アナライトのための天然同位体存在量（ＮＡＴ）ペプチドを使用して、標準曲線を作成する。８回の希釈で定量下限（ＬＬＯＱ）の１０００倍の高濃度からアッセイのＬＬＯＱでもある曲線の最低点まで、代用マトリックスでＮＡＴペプチドの希釈系列を調製する。同じＮＡＴミックスからＱＣサンプルを調製し、各ペプチドごとにＢＳＡ消化物でＬＬＯＱの４倍、５０倍、及び５００倍に希釈する。
【0137】
血漿トリプシン消化物１０μＬを注入し、１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ（商標））内に含まれるＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ ＲＰ－ＵＨＰＬＣ（商標）カラム（２．１×１５０ｍｍ、粒径１．８μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ）で分離する。多段階ＬＣ勾配（２→８０％移動相Ｂ；移動相組成：ＡはＨ２Ｏ中０．１％ＦＡであり、一方Ｂはアセトニトリル中０．１％ＦＡであった）を介して、０．４ｍＬ／分で６０分かけてペプチドを分離する。カラムは５０℃で維持する。各サンプル分析後に４分間の勾配後カラム再平衡化を使用する。ＬＣシステムは、ポジティブイオンモードで動作する標準フローＡＪＳ ＥＳＩ源を介して三連四重極質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）６４９５Ｂ）にインターフェースされる。
【0138】
定量分析
Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェア（バージョン４．２．０．１９０７２、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いてＭＲＭデータを可視化し、検討する。これは、ＳＩＳペプチド及びＮＡＴペプチドの正確な選択、統合、及び均一性（ピーク形状及び保持時間の観点で）を確保するためのピーク検査を含む。少数の基準（すなわち、１／×２回帰の重み付け、ＱＣのレベルの精度における２０％未満の偏差等）を定義した後、標準曲線を用いて、線形回帰によりサンプル中のペプチド濃度をｆｍｏｌ／μＬ（血漿）で算出する。
Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェア（バージョン４．２．０．１９０７２、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いてＭＲＭデータを可視化し、検討する。これは、ＳＩＳペプチド及びＮＡＴペプチドの正確な選択、統合、及び均一性（ピーク形状及び保持時間の観点で）を確保するためのピーク検査を含む。少数の基準（すなわち、１／×２回帰の重み付け、ＱＣのレベルの精度における２０％未満の偏差等）を定義した後、標準曲線を用いて、線形回帰によりサンプル中のペプチド濃度をｆｍｏｌ／μＬ（血漿）で算出する。
【0139】
バッチの受け入れには、以下の基準を適用する：
１． ８つの標準のうち５つで、逆算された濃度が理論濃度の±２０％以内である。
２． ＱＣサンプルの少なくとも６６％が理論濃度の±２０％以内である。
３． ペプチド較正曲線の９５％が許容可能である。
４． プールされたヒト血漿サンプルのＱＣでは、全ペプチドの２／３が分析中に求められる平均濃度の３０％以内でなければならない。
５． クロマトグラフィーのピークを、保持時間の一貫性、ピークの形状、及び干渉がないことについて手動で調べる。
１． ８つの標準のうち５つで、逆算された濃度が理論濃度の±２０％以内である。
２． ＱＣサンプルの少なくとも６６％が理論濃度の±２０％以内である。
３． ペプチド較正曲線の９５％が許容可能である。
４． プールされたヒト血漿サンプルのＱＣでは、全ペプチドの２／３が分析中に求められる平均濃度の３０％以内でなければならない。
５． クロマトグラフィーのピークを、保持時間の一貫性、ピークの形状、及び干渉がないことについて手動で調べる。
【0140】
（Ｂ）メタボロミクス解析
この方法は、９６ウェルフォーマットで血清中の代謝物を検出及び定量するための、ポジティブスケジュール型多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モード及び直接注入（ＤＩ）ＭＳ／ＭＳモードのＬＣ－ＭＳ／ＭＳに基づいている。このアッセイは、異なるクラスの代謝物ごとに２つの異なる誘導体化方法（例えば、フェニルイソチオシアネートを用いたプレカラムアミン誘導体化工程）及び３つの異なるラン（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ及びＤＩ ＭＳ／ＭＳ）を有する。代謝物のクラスは、以下を含む：
１． アミノ酸及び生体アミン
２． 有機酸
３． アシルカルニチン
４． 脂質
５． グルコース
６． その他
この方法は、９６ウェルフォーマットで血清中の代謝物を検出及び定量するための、ポジティブスケジュール型多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モード及び直接注入（ＤＩ）ＭＳ／ＭＳモードのＬＣ－ＭＳ／ＭＳに基づいている。このアッセイは、異なるクラスの代謝物ごとに２つの異なる誘導体化方法（例えば、フェニルイソチオシアネートを用いたプレカラムアミン誘導体化工程）及び３つの異なるラン（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ及びＤＩ ＭＳ／ＭＳ）を有する。代謝物のクラスは、以下を含む：
１． アミノ酸及び生体アミン
２． 有機酸
３． アシルカルニチン
４． 脂質
５． グルコース
６． その他
【0141】
ＭＳデータ解析を行い、Ａｎａｌｙｓｔ １．６．２．（ＳＣＩＥＸ）を用いて濃度を計算する。
【0142】
バッチの受け入れには、以下の基準を適用する：
１． Ｒ２＞０．９９の較正曲線。
２． 全てのＱＣ標準サンプルが、理論濃度の０％以内である（アシルカルニチン及びリン脂質には適用せず）。
３． ＮＩＳＴヒト血清ＱＣサンプルから、計算された濃度は、既知の濃度又は分析中に求められる平均濃度の１５％以内でなければならない。
１． Ｒ２＞０．９９の較正曲線。
２． 全てのＱＣ標準サンプルが、理論濃度の０％以内である（アシルカルニチン及びリン脂質には適用せず）。
３． ＮＩＳＴヒト血清ＱＣサンプルから、計算された濃度は、既知の濃度又は分析中に求められる平均濃度の１５％以内でなければならない。
【0143】
（Ｃ）エクスポソミクス解析
この方法は、血清中の代謝物を検出及び定量するための、ポジティブスケジュール型多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ及び誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）－ＭＳに基づいている。このアッセイは、異なるクラスの代謝物ごとに２つの異なる誘導体化方法（例えば、フェニルイソチオシアネートを用いたプレカラムアミン誘導体化工程）、３つのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、及び１つのＩＣＰ－ＭＳランを有する。
この方法は、血清中の代謝物を検出及び定量するための、ポジティブスケジュール型多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ及び誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）－ＭＳに基づいている。このアッセイは、異なるクラスの代謝物ごとに２つの異なる誘導体化方法（例えば、フェニルイソチオシアネートを用いたプレカラムアミン誘導体化工程）、３つのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、及び１つのＩＣＰ－ＭＳランを有する。
【0144】
バッチの受け入れには、以下の基準を適用する：
１． Ｒ２＞０．９９の較正曲線（ＩＣＰ－ＭＳにも同様に適用）。
２． 全てのＱＣ標準サンプルが、理論濃度の２０％以内である（アシルカルニチン及びリン脂質には適用せず）。
３． ＮＩＳＴヒト血清ＱＣサンプルから、計算された濃度は、既知の濃度又は分析中に求められた平均濃度の１５％以内でなければならない。
１． Ｒ２＞０．９９の較正曲線（ＩＣＰ－ＭＳにも同様に適用）。
２． 全てのＱＣ標準サンプルが、理論濃度の２０％以内である（アシルカルニチン及びリン脂質には適用せず）。
３． ＮＩＳＴヒト血清ＱＣサンプルから、計算された濃度は、既知の濃度又は分析中に求められた平均濃度の１５％以内でなければならない。
【0145】
（Ｄ）データ解析
データのラングリング及び解析は、Ｒ（３．５．１）及びＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃａ／）で行う。
データのラングリング及び解析は、Ｒ（３．５．１）及びＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃａ／）で行う。
【0146】
全ての代謝物関連解析には絶対定量後の濃度を使用するが、タンパク質濃度はペプチド値から換算する。更に、分析機器の検出限界（ＬＯＤ）又は定量限界（ＬＬＯＱ）を下回る濃度を有する任意のアナライトについては、分析ＬＯＤの半分を濃度として割り当てる。各群（試験群及び対照群）におけるアナライトごとに、ＬＯＤ又はＬＬＯＱを下回るサンプルの割合を算出する。ＬＯＤ／ＬＬＯＱの割合間で３０％を超える差があるアナライトは、比較分析における誤表示又は平均値の一変量比較についての偽の重要な知見を避けるために分析から除外する。このプロセスの後、８０種の代謝物及び１３１種のタンパク質がデータ中に残る。
【0147】
一般化対数変換を用いてデータを正規化し、スケーリングする（平均値を中心にし、各変数の標準偏差で除する）。
【0148】
参照範囲を用いて、参照範囲内、参照範囲の境界の１０％以内（参照範囲のカットオフ値の両側で±５％）、及び参照範囲外（参照範囲のカットオフ値の＞５％）に該当するかどうかに基づいてアナライトをグループ化する。データ中の検出不可能なアナライトは「ＮＤ」に分類する。対応する年齢又は性別特異的な参照範囲値がＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｙｏｕデータベースにおいて利用可能でない場合、そのデータ点を「ＮＡ」に分類する。
【0149】
（Ｅ）結果
ウィルコクソン順位和検定を用いて、試験群と対照群との間でアナライト濃度を比較する。結果は、多重比較の偽陽性率（ホルム法）について調整した後、８０種の代謝物の濃度のうち４１種が試験群と対照群との間で有意に異なることを示す。試験群と対照群との間で絶対効果が最も大きい１０種の代謝物を表３に示す。
ウィルコクソン順位和検定を用いて、試験群と対照群との間でアナライト濃度を比較する。結果は、多重比較の偽陽性率（ホルム法）について調整した後、８０種の代謝物の濃度のうち４１種が試験群と対照群との間で有意に異なることを示す。試験群と対照群との間で絶対効果が最も大きい１０種の代謝物を表３に示す。
【0150】
【表3】
【0151】
タンパク質については、１１６種のタンパク質のうち３８種の濃度が、試験群と対照群との間で有意に異なっている。試験群と対照群との間で絶対効果が最も大きい１０種のタンパク質を表４に示す。
【0152】
【表4】
【0153】
試験群及び対照群で実施したＰＣＡ及びＰＬＳ－ＤＡを用いて、アナライトの寄与の重要度を判定し、結果を比較する。今回の血清メタボロミクスデータによれば、主成分（ＰＣ）１が変動の１９．３％を説明し、ＰＣ２が変動の１２．７％を説明し、ＰＣ３が更に８．５％を説明した。合わせると、最初の３つのＰＣによってメタボロミクスデータにおける変動の４０．５％が説明された。全分散（すなわち、１００％）を説明するために必要なＰＣの数は、入力変数の数によって影響を受ける。従って、入力データに多数の変数が含まれている場合、最初の３つのＰＣで表されるのは全分散の８０％未満になることが一般的であり、質量分析ベースのメタボロミクスでは通常そうである。
【0154】
ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）を使用してＰＣＡプロットを作成し、ＡＳＤサンプル及び健常対照サンプルのクラスタリングを開始する（図６参照）。図６は、試験群と対照群との間で分析された代謝物のスコアプロットを示す。引き続き図６を参照すると、試験群と対照群との間に分離があることに留意すべきであり、これはＰＬＳ－ＤＡ分析でも再現されている。血清代謝物のＰＬＳ－ＤＡ解析では、成分１が変動の１６．９％を説明し、成分２が変動の９．４％を説明し、成分３が更に変動の９．１％を説明する。
【0155】
試験群及び対照群の説明された分散からＰＬＳ－ＤＡプロットを作成する。Ｒ２及びＱ２の１０倍交差検証値は、それぞれ０．５７及び０．４７であり、図６にも含まれている。並べ替え検定により、ＰＬＳ－ＤＡでみられた分離が統計的に有意であることが確認された（ｐ＜０．０５）。図６に示すように、ＰＣＡの結果と比較して、ＰＬＳ－ＤＡ分析を用いると試験群と対照群とがより明確に識別される。理論に束縛されるものではないが、ＰＬＳ－ＤＡがデータ（ｘ変数）と群（ｙ変数）との間の共分散を最大化したと考えられる。
【0156】
図７を参照すると、上位の変数の方が下位の変数よりもＰＬＳ－ＤＡモデルへの寄与が大きい降順で上位２０種の寄与している血清代謝物を同定するために、ＶＩＰプロットを作成する。試験群及び対照群における絶対回帰係数の重み付き和を用いて各代謝物の重要度を算出し、ＶＩＰスコアを割り当てる。
【0157】
今回の血漿プロテオミクスデータによれば、主成分（ＰＣ）１が変動の１８．９％を説明し、ＰＣ２が変動の９．５％を説明し、ＰＣ３が３５．１％を説明する。ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（商標）を使用してＰＣＡプロットを作成し、ＡＳＤサンプル及び健常対照サンプルのクラスタリングを開始する（図８参照）。図８は、試験群及び対照群の間で分析されたプロテオミクスデータのスコアプロットを示す。血清メタボロミクスデータに比べて、血漿プロテオミクス解析では対照群と試験群との差異がより大きい。
【0158】
血漿タンパク質のＰＬＳ－ＤＡ解析では、成分１が変動の９．６％を説明し、成分２が変動の１４．８％を説明し、成分３が更に変動の８．３％を説明する。試験群及び対照群の説明された分散からＰＬＳ－ＤＡプロットを作成する。合計１１７種のタンパク質が解析に含まれている。１０倍交差検証の値は、Ｒ２＝０．７２及びＱ２＝０．６９である。並べ替え検定の結果、観察された分離距離（Ｂ／Ｗ）はｐ＜０．０５であることが判明し、ＰＬＳ－ＣＡモデルが検証された。図８に示すように、ＰＣＡの結果と比較して、ＰＬＳ－ＤＡ分析を用いると試験群と対照群とがより明確に識別される。
【0159】
図９を参照すると、上位の変数の方が下位の変数よりもＰＬＳ－ＤＡモデルへの寄与が大きい降順で上位２０種の寄与している血漿タンパク質を同定するために、ＶＩＰプロットを作成する。試験群及び対照群における絶対回帰係数の重み付き和を用いて各代謝物の重要度を算出し、ＶＩＰスコアを割り当てる。
【0160】
平衡サブサンプリングを用いたモンテカルロ交差検証（ＭＣＣＶ）によって、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した（図１０Ａ及び図１０Ｂ参照）。各ＭＣＣＶでは、サンプルの３分の２を使用して特徴の重要度を評価する。次いで、上位５つの重要な特徴を用いて分類モデルを構築し、除外されたサンプルの１／３に対して検証を行う。下記のＲＯＣ曲線の生成に用いた分類方法は、上位５種の血清代謝物（Ｃ１０：１、Ｃ１０：１、リゾホスファチジルコリンアシルＣ１７：０、Ｃ１６：２、グルコース、及びホスファチジルコリンジアシルＣ４０：２）及び上位５種の血漿タンパク質（レチノール結合タンパク質４、トロンボスポンジン、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖、テネイシンＣ、及びＸａａ－Ｐｒｏジペプチドーゼ）を用いたＰＬＳ－ＤＡからの結果に基づいている。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって、健常対照サンプルに対してＡＳＤを識別する代謝物モデルの診断能力は０．８９であると求めることができる。これは、８９％の診断精度のレベルに相当する。同様に、タンパク質モデルのＲＯＣ曲線下面積は、９５％の診断精度のレベルに相当する０．９５であると求められる。
【0161】
全体として、ＡＳＤ対象及びＡＳＤ陰性対象からの血清及び血漿のサンプル間で、有意に異なる濃度レベルのＡＳＤ関連代謝物及びＡＳＤ関連タンパク質が同定される。留意すべきことに、ＡＳＤ対象とＡＳＤ陰性対象との間には、ＡＳＤの診断に有用な特徴的な代謝及びプロテオミクスのプロファイルが存在する。
【0162】
実施の他の例は本明細書の教示を考慮して読者に明らかになるので、本明細書では更には説明しない。
【0163】
なお、本開示全体を通して、読者の便宜のために表題及び副題を使用することがあるが、決してこれらが本発明の範囲を限定すべきではない。更に、本明細書において特定の理論が提案され、開示されることがあるが、本発明がいかなる特定の理論にも作用様式にも関係なく本開示に従って実施される限り、それが正しいか誤りであるかにかかわらず、いかなる場合も本発明の範囲を限定すべきではない。
【0164】
実施例に関連して説明された本開示の方法及び／又はシステムの要素は、本開示の他の態様に準用される。従って、本開示の方法及び／又はシステムは、本明細書で言及した各工程又は構成要素が独立して本明細書で定義した通り存在している任意の実施形態において、そのような工程及び／又は構成要素のいずれかを含む任意の方法及び／又はシステムを包含することは言うまでもない。本明細書に具体的に規定されているものよりも多くのそのような方法及び／又はシステムが包含される場合もある。
【0165】
本明細書に開示された寸法及び値は、言及された正確な数値に厳密に限定されると理解されるべきではない。その代わり、特に指定がない限り、そのような各寸法は、言及された値とその値の前後の機能的に等価な範囲の両方を意味することが意図される。例えば、「４０ｍｍ」と開示されている寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することが意図される。
【0166】
任意の相互参照又は関連する特許又は出願、及び本出願が優先権又はその利益を主張する任意の特許出願又は特許を含む本明細書に引用された全ての文書は、明示的に除外されず、その他の限定もされない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いかなる文書の引用も、それが本明細書に開示若しくは請求される任意の開示に関する先行技術であること、又はそれが単独でも任意の他の参照文献（複数可）とのいかなる組み合わせにおいても、任意のそのような開示を教示、示唆、又は開示することを認めるものではない。また、本書における用語の任意の意味又は定義が、参照により組み込まれる文書中の同じ用語の任意の意味又は定義と矛盾する場合に限り、本書でその用語に割り当てられた意味又は定義が適用されるものとする。
【0167】
本開示の具体的な実施形態について図示及び説明してきたが、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な他の変更及び改変を行うことができることは、当業者にとって明らかであろう。従って、本開示の範囲内にある全てのそのような変更及び改変を添付の特許請求の範囲で網羅することが意図される。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】