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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-18
(54)【発明の名称】バイオマーカー
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20231011BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20231011BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231011BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20231011BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231011BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231011BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20231011BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20231011BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231011BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20231011BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20231011BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231011BHJP
A61P 3/06 20060101ALN20231011BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
A61P1/16
A61K45/00
A61K38/02
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 P
A61K31/7088
A61K31/713
A61K31/7105
A61K48/00
G01N33/50 P
G01N33/68
C12N15/12
A61P3/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518817
(86)(22)【出願日】2021-09-23
(85)【翻訳文提出日】2023-05-11
(86)【国際出願番号】 GB2021052469
(87)【国際公開番号】W WO2022064198
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】2015056.1
(32)【優先日】2020-09-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
(71)【出願人】
【識別番号】500341551
【氏名又は名称】ケンブリッジ エンタープライズ リミティッド
(71)【出願人】
【識別番号】512010753
【氏名又は名称】ゲノム・リサーチ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホーア マシュー
(72)【発明者】
【氏名】キャンベル ピーター
(72)【発明者】
【氏名】エヌジー スタンレー
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CB01
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA17
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ79
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4B063QS14
4B063QS39
4C084AA02
4C084AA13
4C084AA17
4C084BA03
4C084NA05
4C084ZA751
4C084ZC331
4C084ZC412
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB22
4C085EE01
4C086AA01
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZA75
4C086ZC33
(57)【要約】
本発明は、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又はアルコール関連脂肪性肝疾患（ＡＲＬＤ）を診断及び／又は予後判定する方法であって、対象の１つ以上の肝細胞に選択的利点を付与するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質における体細胞突然変異を検出することを含む、方法に関する。本発明はまた、治療剤による治療から利益を得る、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患している対象を同定するため、及び／又は疾患モニタリングの増加から利益を得る、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法を提供する。本発明はまた、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの治療に有用な治療剤を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又はアルコール関連脂肪性肝疾患（ＡＲＬＤ）を診断及び／又は予後判定するための方法であって、ａ）対象の１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料を提供することと、
ｂ）前記肝細胞に選択的利点を付与する前記ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質における体細胞突然変異を検出することであって、前記肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異の存在は、前記対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出することと、を含む、方法。
【請求項2】
ステップｂ）において検出される前記体細胞突然変異が、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップｂ）において検出される前記体細胞突然変異が、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ及びＣＩＤＥＢからなる群から選択される遺伝子内にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ステップｂ）で検出される前記体細胞突然変異が、前記ＦＯＸＯ１遺伝子内にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＦＯＸＯ１遺伝子内の前記体細胞突然変異が、前記１つ以上の肝細胞によって発現されるＦＯＸＯ１タンパク質のＮ末端１４－３－３タンパク質結合モチーフ内のミスセンス及び／又はナンセンス突然変異をもたらす、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＦＯＸＯ１遺伝子内の前記体細胞突然変異が、前記１つ以上の肝細胞によって発現されるＦＯＸＯ１タンパク質においてＳ２２Ｗ若しくはＲ２１Ｌアミノ酸置換又はＳ２２ナンセンス突然変異をもたらす、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＦＯＸＯ１遺伝子内の前記体細胞突然変異が、前記１つ以上の肝細胞によって発現されるＦＯＸＯ１タンパク質においてＳ２２Ｗアミノ酸置換をもたらす、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ステップｂ）で検出される前記体細胞突然変異が、前記ＧＰＡＭ遺伝子内にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＧＰＡＭ遺伝子内の前記体細胞突然変異が、前記１つ以上の肝細胞によって発現されるミトコンドリアグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）の機能を損なうか又は無効にする、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ステップｂ）で検出される前記体細胞突然変異が、前記ＣＩＤＥＢ遺伝子内にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＣＩＤＥＢ遺伝子内の前記体細胞突然変異が、前記１つ以上の肝細胞によって発現されるＣＩＤＥＢタンパクの機能を損なうか又は無効にする、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
ステップｂ）が、ＣＬＣＮ５遺伝子内の体細胞突然変異を検出するステップを更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記生物学的試料が、循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記生物学的試料が、肝生検試料に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記生物学的試料が、１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ステップｂ）は、前記対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、並びに／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変、がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ））及び肝不全からなる群から選択されるより重症型の肝疾患を発症するリスクがあるかどうかを決定することを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ステップｂ）は、前記対象が、消化管がん、肥満、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（例えば、高コレステロール血症）及び心血管疾患からなる群から選択される肝疾患に関連する疾患又は状態を発症するリスクがあるかどうかを決定することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記対象が、消化管がん、肥満、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（例えば、高コレステロール血症）及び／又は心血管疾患にも罹患している対象である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ステップａ）が、前記対象の２つ以上の肝細胞、例えば前記対象の約１０～約５０，０００個の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料を提供することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記方法が、ｉ）前記対象から得られた生物学的試料を提供することと、
ｉｉ）前記生物学的試料中の前記ＦＯＸＯ１及び／又はＧＰＡＭ遺伝子における１つ以上の体細胞突然変異を検出することであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、前記対象がＮＡＦＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出することと、を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
疾患モニタリングの増加から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法であって、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法ステップを含む、方法。
【請求項22】
肝臓におけるＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＧＰＡＭ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法であって、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法ステップを含む、方法。
【請求項23】
ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの治療に使用するための治療剤であって、前記使用が、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法を実行することと、
前記治療剤を前記対象に投与することと、を含み、前記治療剤が、ＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＧＰＡＭ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害又は調節するものである、治療剤。
【請求項24】
ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を治療する方法であって、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法を実行することと、ＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＧＰＡＭ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質活性を阻害又は調節する、ある用量の治療剤を前記対象に投与することと、を含む、方法。
【請求項25】
前記治療剤が、小分子、ペプチド（環状ペプチドを含む）、タンパク質（例えば、治療用抗体、抗体断片及び抗体模倣物）、核酸（例えば、アンチセンスヌクレオチド配列；三重らせん；ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ；及び生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチド）、合成又は天然無機分子、合成又は天然有機分子、及びＣＲＩＳＰＲからなる群から選択される、請求項２３に記載の使用又は請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法に従って、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの診断又は予後診断に使用するためのインビトロ診断キットであって、ＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ、ＧＰＡＭ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出し、任意選択的に前記ＣＬＣＮ５遺伝子若しくはＮＥＡＴ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出し、かつ／又はテロメア長を測定するための１つ以上の試薬を含む、インビトロ診断キット。
【請求項27】
対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを診断又は予後判定するための方法であって、ある用量の診断プローブを前記対象に投与するステップと、
前記対象における前記診断プローブを検出するステップであって、前記診断プローブが、前記対象のＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ、ＧＰＡＭ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の存在及び／又は非存在を示し、前記ＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ、ＧＰＡＭ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の存在は、前記対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は消化管がんなどの肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、ステップと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
序論
本発明は、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease、ＮＡＦＬＤ）又はアルコール関連脂肪性肝疾患（alcohol-related fatty liver disease、ＡＲＬＤ）を診断及び／又は予後判定する方法に関する。本発明はまた、治療剤による治療から利益を得る、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患している対象を同定するため、及び／又は疾患モニタリングの増加から利益を得る、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法にも関する。ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの治療に有用な治療剤も本明細書において提供される。
本発明は、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease、ＮＡＦＬＤ）又はアルコール関連脂肪性肝疾患（alcohol-related fatty liver disease、ＡＲＬＤ）を診断及び／又は予後判定する方法に関する。本発明はまた、治療剤による治療から利益を得る、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患している対象を同定するため、及び／又は疾患モニタリングの増加から利益を得る、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法にも関する。ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの治療に有用な治療剤も本明細書において提供される。
【背景技術】
【0002】
世界人口の四分の一が罹患していると推定される非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、非アルコール性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis、ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変、肝細胞がん（hepatocellular carcinoma、ＨＣＣ）、及び肝不全に進行し得る肝臓の炎症及び損傷の症候群である。ＮＡＦＬＤ患者の約１０％～３０％がＮＡＳＨを発症し、ＮＡＳＨ患者の約２５％～４０％が、不良な長期予後に関連する肝線維症及び肝硬変を発症し続けると推定されている（Ｄｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｌｉｎｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１４；５，２１１（２１８）。研究により、ＮＡＦＬＤを有する患者は、肝臓がん及び消化管型がんを発症するリスクも高いことが示されている（Ａｌｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１９；７１（６）：１２２９－１２３６）。
【0003】
ＮＡＦＬＤの初期段階は、肝臓脂肪症の形成を特徴とし、これは、疾患が進行し、最終的により深刻な肝臓損傷を引き起こすまで気付かれない可能性がある。したがって、ＮＡＦＬＤの初期段階は、通常の血液検査後の血液中の異常な肝酵素の偶発的な検出によってのみ検出されることが多い。ＮＡＦＬＤが疑われると、超音波などの画像化技術が、肝臓における肝臓脂肪症の存在を確認するための初期調査においてしばしば使用される。しかしながら、ＮＡＦＬＤを決定的に診断するためには、侵襲性肝生検を実施して、肝臓組織における肝臓脂肪症の存在を確認することがしばしば必要である。これは、患者の危害のリスクを伴い、したがって、特定の場合にのみ使用される。したがって、ほとんどの場合、患者がＮＡＦＬＤを有するかどうか、及びそれが進行性であるかどうかの評価は、画像化及び血液検査の使用を通じて間接的である。
【0004】
疾患特異的バイオマーカー、例えば遺伝子及び／又はタンパク質レベルでの疾患特異的突然変異の同定により、様々な疾患及び状態、特にがんを確実に診断及び予後診断するための見込みが示されている。これに関して、インスリン抵抗性又は脂質生合成に関連する遺伝子における遺伝的変異（すなわち、生殖系列多型）は、ＮＡＦＬＤなどの肝疾患を発症する遺伝的リスクに対して軽微な影響を有することが示唆されている（例えば、Ｖａｌｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００９，５０，Ｓ２６５及びＨａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０２１，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．３２０３８を参照されたい）。しかしながら、ＮＡＦＬＤ及びＡＲＬＤの発症は主に生活様式及び環境因子によって駆動されるので、遺伝的変異の検出は、患者の肝臓の状態への限られた洞察のみを提供する。肝硬変及び肝細胞がん（ＨＣＣ）などの重症型の肝疾患に罹患している患者の肝細胞における体細胞突然変異の存在も報告されている（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１９；１７７（３）：６０８－６２１，Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１９；５４（７）：６２８－６４０，Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５７４，５３８－５４２，Ｔｏｒｒｅｃｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１７；６７（６）：１２２２－１２３１，ａｎｄ Ｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１４；６０（６）：１９８３－９２を参照されたい）。
【0005】
かなりの割合のヒト集団の健康及び平均余命に対するＮＡＦＬＤの影響にもかかわらず、現在、ＮＡＦＬＤを有する患者並びに肝硬変及びＨＣＣなどのより重症型の肝疾患を発症する可能性が高い患者を同定する信頼できる診断又は予後診断検査はない。注目すべきことに、ＮＡＦＬＤの治療に利用可能な特定の治療もない。治療は、多くの場合、運動及び食事プログラムの使用、並びに／又は肥満、２型糖尿病、高血圧及び高コレステロールなどの関連危険因子を低減するための治療に限定される。
【0006】
アルコール関連脂肪性肝疾患（ＡＲＬＤ）の初期段階は、異なる病因を有するが、ＮＡＦＬＤと同様の病態生理を有する。ＮＡＦＬＤに関しては、初期段階のＡＲＬＤを有する患者を同定するための信頼できる診断又は予後診断検査もなく、ＡＲＬＤの治療に利用可能な特定の治療もない。
【0007】
したがって、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの早期診断及びより重症型の肝疾患を発症するリスクがある対象の同定を可能にする、より信頼性の高い診断方法及び予後診断方法が依然として必要とされている。また、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの治療及び／又は予防に有効な治療も必要とされている。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又はアルコール関連脂肪性肝疾患（ＡＲＬＤ）を診断及び／又は予後判定するための方法であって、
ａ）対象の１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料を提供することと、
ｂ）肝細胞に選択的利点を付与するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質における体細胞突然変異を検出することであって、肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出することと、を含む方法を提供する。
ａ）対象の１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料を提供することと、
ｂ）肝細胞に選択的利点を付与するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質における体細胞突然変異を検出することであって、肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出することと、を含む方法を提供する。
【0009】
本発明は、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を診断及び／又は予後判定するための方法であって、
ａ）対象から得られた生物学的試料を提供することと、
ｂ）生物学的試料中のＦＯＸＯ１及び／又はＧＰＡＭ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出することと、を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生物学的試料を提供することと、
ｂ）生物学的試料中のＦＯＸＯ１及び／又はＧＰＡＭ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出することと、を含む方法を提供する。
【0010】
本発明はまた、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ若しくはＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害若しくは調節する治療剤による治療から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法、及び／又は疾患モニタリングの増加から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法を提供する。また、本明細書に開示されるのは、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの治療に使用するための治療剤であって、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害又は調節するものである、治療剤、及びＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害又は調節する治療剤を対象に投与することによって、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを治療又は予防する方法である。
【0011】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、アルコール関連脂肪性肝疾患（ＡＲＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び正常対照（すなわち、健康な対象由来の肝臓試料）を含む３４個の肝臓試料にわたって１５９０個のゲノムからの体細胞突然変異を分析した。この分析から、本発明者らは、肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異（がんにおけるドライバー突然変異と同種であると考えることができる突然変異）の発生が、対象におけるＮＡＦＬＤ及びＡＲＬＤの発症の中心であることを発見した。本発明者らは、対象の肝細胞におけるそのような体細胞突然変異の（直接的若しくは間接的な）検出、定量及び／又はモニタリングが、ＮＡＦＬＤ及びＡＲＬＤの診断及び予後診断検査に特に有用であることを見出した。特に、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを有する患者において、本発明者らは、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子における様々な突然変異を同定した。注目すべきことに、本発明者らは、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子において同定された突然変異をＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤのマーカーとして使用することにより、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの初期診断及び予後診断を可能にすることができることを見出した。更に、本明細書に記載のＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂ突然変異はまた、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの治療及び／又は予防のための新規分子標的を提供する。
【0012】
本発明はまた、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの診断及び／又は予後診断に使用するためのインビトロ診断キットであって、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出し、任意選択的にＣＬＣＮ５遺伝子、ＮＥＡＴ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出し、かつ／又はテロメア長を測定するための１つ以上の試薬を含む、インビトロ診断キットを提供する。
【0013】
誤解を避けるために、本明細書で使用される場合、「アルコール関連肝疾患」及び「ＡＲＬＤ」という用語は、過剰なアルコール消費によって引き起こされる、対象における肝臓損傷を指す。ＮＡＦＬＤに関して、ＡＲＬＤの初期段階は、典型的には、肝臓脂肪症の形成を特徴とする。過剰なアルコール消費によって引き起こされる肝臓脂肪症の形成は、アルコール性脂肪性肝疾患（alcoholic fatty liver disease、ＡＦＬＤ）と呼ばれることもある。ＡＲＬＤはまた、アルコール性肝炎及び肝硬変に関連している可能性がある。したがって、ＡＦＬＤは、ＡＲＬＤの亜属と考えられ得る。
【0014】
また、誤解を避けるために、本出願全体を通して、ＡＲＬＤという用語は、ＡＦＬＤという用語を組み込むものと考えるべきである。したがって、本発明はまた、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＦＬＤを診断及び／又は予後判定する方法、治療剤による治療から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＦＬＤに罹患している対象を同定するための方法、疾患モニタリングの増加から利益を得るＮＡＦＬＤ又はＡＦＬＤに罹患している対象を同定するための方法、及びＮＡＦＬＤ又はＡＦＬＤの治療に有用な治療剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】慢性肝疾患において獲得された収束性ＦＯＸＯ１突然変異を調査するために使用される階層的実験設計の概要を示す。正常対照、ＡＲＬＤ及びＮＡＦＬＤについて３４個の肝臓をサンプリングした（３２個の肝臓については１個の試料／肝臓、２個の肝臓については８個の試料／肝臓）。これらの試料をレーザーキャプチャーマイクロダイセクションに供して、２１～５２個のマイクロダイセクション／試料を生成し、そのそれぞれを個別に全ゲノム配列決定した（全体で１５９０個の全ゲノム）。
【図2A】罹患患者からのマイクロダイセクションによって分類されたＦＯＸＯ１における体細胞突然変異の分布を示す。円グラフは、各マイクロダイセクションにおける突然変異体対立遺伝子を報告する配列決定リードの割合を示す。ホットスポットＳ２２残基は、１４－３－３核外輸送タンパク質による結合並びにＡＫＴ１及びＡＭＰＫによるリン酸化のための標準的な、高度に保存されたモチーフ内にある。
【図2B】ＰＤ３７２３９におけるＦＯＸＯ１突然変異に関する。ＰＤ３７２３９及びＰＤ３７９１８はいずれもＮＡＦＬＤ患者である。図２Ｂ及び図２Ｃの左パネルは系統樹を示し、より濃い線の枝は、独立して獲得された突然変異を示している。実線は、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。破線は、肝細胞が細胞の１００％未満であることを表すと仮定して、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。右パネルは、患者の肝生検のヘマトキシリン及びエオシン（haematoxylin and eosin、Ｈ＆Ｅ）染色光学顕微鏡写真上にマッピングされた系統樹からのクローンを示し、ＦＯＸＯ１突然変異体クローンは、系統樹上に示されたより濃い線の枝に一致するように網掛けした。
【図2C】ＰＤ３７９１８におけるＦＯＸＯ１突然変異に関する。ＰＤ３７２３９及びＰＤ３７９１８はいずれもＮＡＦＬＤ患者である。図２Ｂ及び図２Ｃの左パネルは系統樹を示し、より濃い線の枝は、独立して獲得された突然変異を示している。実線は、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。破線は、肝細胞が細胞の１００％未満であることを表すと仮定して、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。右パネルは、患者の肝生検のヘマトキシリン及びエオシン（haematoxylin and eosin、Ｈ＆Ｅ）染色光学顕微鏡写真上にマッピングされた系統樹からのクローンを示し、ＦＯＸＯ１突然変異体クローンは、系統樹上に示されたより濃い線の枝に一致するように網掛けした。
【図2D】ＮＡＦＬＤ患者であるＰＤ３７９０７からのマイクロダイセクションのうちの１つにおける第１３染色体に影響を及ぼす染色体異常事象を示す。黒点は、染色体に沿った補正リード深度を表す。線及び弧は、構造バリアントを表す。ＦＯＸＯ１を切断する構造バリアントが強調されており（図では、「ＦＯＸＯ１を再配置する」と示されている）、第１のイントロン内の遺伝子を切断し、第１のコードエクソンを保存するが、残りのコードエクソンを欠失させると予測される。
【図2E】ＰＤ３７２３９のＨ＆Ｅ染色切片上に置かれた図２Ｂのクローンマップを示す。図２Ｅの左側には、ＦＯＸＯ１突然変異を有する及び有しない代表的な試料からの生の配列決定データが示されており、Ｈ＆Ｅ切片上のそれらの物理的位置が矢印によって示されている。Ｓ２２Ｗ及びＲ２１Ｌ突然変異の位置を矢印で示す。Ｈ＆Ｅ切片の周りに配置された散布図は、試料対における突然変異のバリアント対立遺伝子画分プロットを表す。ｘ軸及びｙ軸タイトルのグレースケールシェードは、Ｈ＆Ｅ切片のクローンマップのグレースケールシェードと一致する。クローン的に関連する試料対において、突然変異のほとんどは、両方の試料によって共有され、ゼロではないバリアント対立遺伝子画分を有する突然変異のクラウドとして明らかである。クローン的に関連のない試料において、突然変異はｘ軸及びｙ軸に沿っており、１つの例外はＦＯＸＯ１突然変異であり、それが２つのクローンにおいて独立して獲得されることを示す。
【図3A】ＰＤ３７２３４についての系統樹及びクローンマップを示す。図の左パネルは系統樹を示し、より濃い線の枝は、独立して獲得された突然変異を示している。実線は、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。破線は、肝細胞が細胞の１００％未満であることを表すと仮定して、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。右パネルは、肝臓のＨ＆Ｅ染色顕微鏡写真上にマッピングされた系統樹からのクローンを示し、ＦＯＸＯ１－突然変異体クローンは、系統樹上に示されたより濃い線の枝に一致するように網掛けした。
【図3B】ＰＤ３７１０５についての系統樹及びクローンマップを示す。図の左パネルは系統樹を示し、より濃い線の枝は、独立して獲得された突然変異を示している。実線は、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。破線は、肝細胞が細胞の１００％未満であることを表すと仮定して、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。右パネルは、肝臓のＨ＆Ｅ染色顕微鏡写真上にマッピングされた系統樹からのクローンを示し、ＦＯＸＯ１－突然変異体クローンは、系統樹上に示されたより濃い線の枝に一致するように網掛けした。
【図3C】ＰＤ３７２４５についての系統樹及びクローンマップを示す。図の左パネルは系統樹を示し、より濃い線の枝は、独立して獲得された突然変異を示している。実線は、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。破線は、肝細胞が細胞の１００％未満であることを表すと仮定して、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。右パネルは、肝臓のＨ＆Ｅ染色顕微鏡写真上にマッピングされた系統樹からのクローンを示し、ＦＯＸＯ１－突然変異体クローンは、系統樹上に示されたより濃い線の枝に一致するように網掛けした。
【図4A】慢性肝疾患におけるＣＩＤＥＢ内の体細胞突然変異の分布を示す。アミノ酸残基は、野生型タンパク質配列の上に示される慢性肝疾患において観察された突然変異とともに、タイプごとに着色されている。
【図4B】ＮＡＦＬＤの患者であるＰＤ４８６３７から分析されたクイノー（Couinaud）セグメントのうちの１つにおけるＣＩＤＥＢ突然変異を示す。左パネルは系統樹を示し、より濃い線の枝は、独立して獲得された突然変異を示している。実線は、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。破線は、肝細胞が細胞の１００％未満であることを表すと仮定して、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。右パネルは、肝臓のＨ＆Ｅ染色顕微鏡写真上にマッピングされた系統樹からのクローンを示し、ＣＩＤＥＢ－突然変異体クローンは、系統樹上に示されたより濃い線の枝に一致するように網掛けした。１つのクローンは、ＣＩＤＥＢにおいて、異なる対立遺伝子上に２つの独立した点突然変異を有した（複合ヘテロ接合性）。
【図4C】慢性肝疾患患者におけるＣＩＤＥＢ突然変異の更なる例を示す。ＣＩＤＥＢ突然変異を有するＰＤ４８３６７のクイノーセグメントのうちの１つについて、系統樹及びクローンマップを示す。
【図5A】ゲノム位置に従うＧＰＡＭにおける体細胞突然変異の分布を示す。円グラフは、各マイクロダイセクションにおける突然変異体対立遺伝子を報告する配列決定リードの割合を示す。代表的な種について、各突然変異残基±３アミノ酸の進化的保存を示す複数の配列アラインメントを示す。
【図5B】ＡＲＬＤ患者であるＰＤ３７１１０からのマイクロダイセクションにおけるＧＰＡＭの上流の縦列重複を示す。ＧＰＡＭは無傷のままであるが、縦列重複は遺伝子の２０ｋｂ上流から始まる。
【図5C】ＡＲＬＤ患者であるＰＤ３７２３１におけるＧＰＡＭ突然変異を示す。左パネルは系統樹を示し、より濃い線の枝は、独立して獲得された突然変異を示している。実線は、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。破線は、肝細胞が細胞の１００％未満であることを表すと仮定して、ネスティングが鳩の巣原理に従うことを示す。右パネルは、肝臓のＨ＆Ｅ染色顕微鏡写真上にマッピングされた系統樹からのクローンを示し、ＧＰＡＭ－突然変異体クローンは、系統樹上に示されたより濃い線の分岐に一致するように網掛けした。
【図5D】ＡＲＬＤ患者におけるＧＰＡＭ突然変異の更なる例を示す。系統樹及びクローンマップは、ＰＤ３７１１１のクイノーセグメントのうちの１つ（図５Ｄ）及びＰＤ３７２３２のクイノーセグメントのうちの１つ（図５Ｅ）について示される。
【図5E】ＡＲＬＤ患者におけるＧＰＡＭ突然変異の更なる例を示す。系統樹及びクローンマップは、ＰＤ３７１１１のクイノーセグメントのうちの１つ（図５Ｄ）及びＰＤ３７２３２のクイノーセグメントのうちの１つ（図５Ｅ）について示される。
【図6A】ゲノム位置に従うＡＣＶＲ２Ａにおける体細胞突然変異の分布を示す。円グラフは、各マイクロダイセクションにおける突然変異体対立遺伝子を報告する配列決定リードの割合を示す。
【図6B】ＡＣＶＲ２Ａのコピー喪失を生じる構造バリアントを示す異なる患者における２つのマイクロダイセクションを示す。黒点は、染色体に沿った補正リード深度を表す。線及び弧は、構造バリアントを表す。
【図7】ゲノム位置に従うＣＬＣＮ５における体細胞突然変異の分布を示す。円グラフは、各マイクロダイセクションにおける突然変異体対立遺伝子を報告する配列決定リードの割合を示す。
【図8】ゲノム位置に従う、長鎖非コードＲＮＡＮＥＡＴ１における体細胞突然変異の分布を示す。円グラフは、各マイクロダイセクションにおける突然変異体対立遺伝子を報告する配列決定リードの割合を示す。
【図9】ゲノム位置に従うＴＮＲＣ６Ｂにおける体細胞突然変異の分布を示す。円グラフは、各マイクロダイセクションにおける突然変異体対立遺伝子を報告する配列決定リードの割合を示す。
【図10A】Ｃ末端ｅＧＦＰと融合したＦＯＸＯ１の示された野生型又は突然変異体構築物でトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の生細胞画像化を示す。細胞を、核（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）及び細胞質（ＳＰＹ－５５５－アクチン）マーカーで対比染色した。生細胞画像化を、一晩の血清飢餓、次いで１００ｎＭインスリンでの刺激後に行った。
【図10B】生細胞画像化（野生型細胞、ｎ＞６１８６及びＦＯＸＯ１Ｓ２２Ｗ細胞、ｎ±７１７２／時点）中のｌｏｇ核－細胞質蛍光比（平均±ＳＥＭ）として表されるｅＧＦＰ局在化の定量を示す。
【図10C】４つの条件（野生型ＦＯＸＯ１構築物（インスリンあり又はなし）；Ｓ２２Ｗ ＦＯＸＯ１構築物（インスリンあり又はなし））にわたってそれぞれ５回反復して（横列）測定されたＨｅｐＧ２細胞において測定された代謝産物（縦列）の濃度のヒートマップを示す。図に示されているのは、突然変異体構築物と野生型構築物との間で多重仮説検定（ｑ＜０．０１）の補正後に有意に異なった４３個の代謝産物であり、ペントースリン酸経路及び解糖／糖新生経路からの中間体が太字で強調されている（すなわち、ヘキソース－リン酸、ジヒドロキシアセトン－リン酸、ペントース－リン酸、セドヘプツロース７－リン酸、グリセロール－３－リン酸及びグリセルアルデヒド－３－リン酸）。
【図10D】Ｃ末端ＧＦＰと融合したＦＯＸＯ１の示された野生型構築物又は突然変異体構築物によるトランスフェクション後のＨｅｐＧ２細胞を示す。細胞をＤＡＰＩで対比染色して核を強調し、一晩の血清飢餓条件後（左）及び１００ｎＭインスリンへの１５分間の曝露後（右）に画像化した。
【図10E】ＦＯＸＯ１－ＧＦＰの核－細胞質比によるスケールで擬似着色されたＨｅｐＧ２細胞のカバースリップ全体の広視野図を示す。血清飢餓（左）、インスリン１００ｎＭに１５分間曝露した後（中）、又は５％ウシ胎児血清（foetal calf serum、ＦＣＳ）に１５分間曝露した後（右）、の条件下で細胞を画像化した。
【図10F】ＨＣＣ細胞株における野生型及び突然変異体ＦＯＸＯ１－ＧＦＰ構築物についての核－細胞質比を示す。ＦＯＸＯ１－ＧＦＰの核－細胞質比によるスケールで擬似着色されたＨｅｐ３Ｂ（図１１Ａ）及びＰＬＣ／ＰＲＦ５（図１１Ｂ）細胞の広視野図を示す。血清飢餓（左）、１５分間ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（右）の１５分間インスリン１００ｎＭに曝露した後（中）、の条件下で細胞を画像化した。
【図10G】ＨＣＣ細胞株における野生型及び突然変異体ＦＯＸＯ１－ＧＦＰ構築物についての核－細胞質比を示す。ＦＯＸＯ１－ＧＦＰの核－細胞質比によるスケールで擬似着色されたＨｅｐ３Ｂ（図１１Ａ）及びＰＬＣ／ＰＲＦ５（図１１Ｂ）細胞の広視野図を示す。血清飢餓（左）、１５分間ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（右）の１５分間インスリン１００ｎＭに曝露した後（中）、の条件下で細胞を画像化した。
【図10H】示されるような異所性ｅＧＦＰタグ付き野生型又は突然変異体ＦＯＸＯ１構築物を発現し、ビヒクル又はインスリン（１００ｎＭ）で１５分間処理されたＨｅｐＧ２細胞の免疫ブロットを示す。細胞を、イムノブロッティングによって示されたタンパク質について分析した。分子量マーカー（ｋＤａ）を示す。
【図11A】遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ、ＧＯ；ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｏｎｔｏｔａｇｙ．ｏｒｇ（Ｇ０：００６１６２１））からの「標準的解糖」遺伝子セットにおける遺伝子についての遺伝子発現レベルのヒートマップを示す。ｘ軸上の遺伝子の順序は、有意性のレベル（及び変化の方向）によって決定され、ｙ軸上の試料の順序は、状態（ＦＯＸＯ１状態及びインスリン状態）による。
【図11B】リアクトーム（Ｒｅａｃｔｏｍｅ（Ｒ－ＨＳＡ－６９２７８；－ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ／）からの「細胞周期、有糸分裂」遺伝子セットにおける遺伝子についての遺伝子発現レベルのヒートマップを示す。ｘ軸上の遺伝子の順序は、有意性のレベル（及び変化の方向）によって決定され、ｙ軸上の試料の順序は、状態（ＦＯＸＯ１状態及びインスリン状態）による。
【図11C】リアクトーム（９６１５０１７－ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ／））の「酸化ストレス、代謝及びニューロン遺伝子のＦＯＸＯ媒介転写」遺伝子セット（図１１Ｃ）；ＧＯ（００１６０４２）の「脂質異化プロセス」遺伝子セット（図１１Ｄ）；及びＧＯ（０００６９１５）の「アポトーシス」遺伝子セット（図１１Ｅ）についての濃縮プロットを示す。それぞれにおいて、上のパネルは、遺伝子セットがＦＯＸＯ１突然変異体構築物の存在下で最も上方制御されたものから最も下方制御されたものへとトラバースされるときの累積濃縮スコアを反映する。それぞれの下のパネルは、測定された全ての遺伝子にわたる遺伝子セットにおける各遺伝子の順位を示す。
【図11D】リアクトーム（９６１５０１７－ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ／））の「酸化ストレス、代謝及びニューロン遺伝子のＦＯＸＯ媒介転写」遺伝子セット（図１１Ｃ）；ＧＯ（００１６０４２）の「脂質異化プロセス」遺伝子セット（図１１Ｄ）；及びＧＯ（０００６９１５）の「アポトーシス」遺伝子セット（図１１Ｅ）についての濃縮プロットを示す。それぞれにおいて、上のパネルは、遺伝子セットがＦＯＸＯ１突然変異体構築物の存在下で最も上方制御されたものから最も下方制御されたものへとトラバースされるときの累積濃縮スコアを反映する。それぞれの下のパネルは、測定された全ての遺伝子にわたる遺伝子セットにおける各遺伝子の順位を示す。
【図11E】リアクトーム（９６１５０１７－ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ／））の「酸化ストレス、代謝及びニューロン遺伝子のＦＯＸＯ媒介転写」遺伝子セット（図１１Ｃ）；ＧＯ（００１６０４２）の「脂質異化プロセス」遺伝子セット（図１１Ｄ）；及びＧＯ（０００６９１５）の「アポトーシス」遺伝子セット（図１１Ｅ）についての濃縮プロットを示す。それぞれにおいて、上のパネルは、遺伝子セットがＦＯＸＯ１突然変異体構築物の存在下で最も上方制御されたものから最も下方制御されたものへとトラバースされるときの累積濃縮スコアを反映する。それぞれの下のパネルは、測定された全ての遺伝子にわたる遺伝子セットにおける各遺伝子の順位を示す。
【図12A】各患者において分析された試料から外挿された、ドライバー突然変異を保有する推定累積肝臓質量を示す積み重ね棒グラフを示す。計算は、各患者について１５００ｇの総肝臓質量を仮定する。バーは、同定された６つの反復的に突然変異した遺伝子の各々について斜線で示され、ｘ軸上の患者コードは疾患状態について着色されている。
【図12B】野生型クローンと比較した、４つの最も頻繁に突然変異した遺伝子（ＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ、ＧＰＡＭ及びＡＣＶＲ２Ａ）についての推定クローンサイズを示す。点は箱ひげ図上に重ねられ、ここで、中央値は太い黒線で示され、四分位数範囲は細い黒い箱で示される。ひげは、データの全範囲又は２５／７５パーセンタイル＋１．５×四分位数間範囲（いずれか小さい方）を示す。
【図12C】特定の遺伝子内に突然変異を有するクローンを保有したか否かによる、コホートにおける患者の年齢の分布の散布図を示す。
【図12D】２型糖尿病を有する患者又は有しない患者の割合の積み重ね棒グラフを、それらが各遺伝子においてドライバー突然変異を保有するかどうかによって示す。
【図12E】ＮＡＦＬＤ活動性スコア（NAFLD Activity Score、ＮＡＳ）が各遺伝子にドライバー突然変異を保有したか否かによるＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）の分布の積み重ね棒グラフを示し、低いスコアは、低い程度の組織学的異常を示す。
【図13A】患者（ｘ軸）ごとのテロメア長（ｙ軸）の分布の散布図を示す。各点は、その患者内の各クローンにおける最も高い中央値のバリアント対立遺伝子画分（variant allele fraction、ＶＡＦ）を有する構成マイクロダイセクションについてのゲノム配列決定データから推定された平均テロメア長を表す。図１３Ａでは、患者がｘ軸上に並べられ、疾患状態ごとに示されている（ブロック＝正常／健常、空白＝ＡＲＬＤ、線＝ＮＡＦＬＤ）。各疾患実体内で、患者は年齢の昇順で並べられている。図１３Ｂでは、点は箱ひげ図上に重ねられ、ここで、中央値は太い黒線で示され、四分位数範囲は細い黒い箱で示される。ひげは、データの全範囲又は２５／７５パーセンタイル＋１．５×四分位数間範囲（いずれか小さい方）の印を示す。
【図13B】患者（ｘ軸）ごとのテロメア長（ｙ軸）の分布の散布図を示す。各点は、その患者内の各クローンにおける最も高い中央値のバリアント対立遺伝子画分（variant allele fraction、ＶＡＦ）を有する構成マイクロダイセクションについてのゲノム配列決定データから推定された平均テロメア長を表す。図１３Ａでは、患者がｘ軸上に並べられ、疾患状態ごとに示されている（ブロック＝正常／健常、空白＝ＡＲＬＤ、線＝ＮＡＦＬＤ）。各疾患実体内で、患者は年齢の昇順で並べられている。図１３Ｂでは、点は箱ひげ図上に重ねられ、ここで、中央値は太い黒線で示され、四分位数範囲は細い黒い箱で示される。ひげは、データの全範囲又は２５／７５パーセンタイル＋１．５×四分位数間範囲（いずれか小さい方）の印を示す。
【図14A】それぞれ、ＡＲＬＤ（図１４Ａ）及びＮＡＦＬＤ（図１４Ｂ）からの２つの代表的な系統樹上に階層化されたテロメア長を示す。枝は、マイクロダイセクションのテロメア長に従ってグレースケールで網掛けされており、最も高い中央値のバリアント対立遺伝子画分がその枝に割り当てられている。内部ノードは最大尤度を用いて推定され、スケールは各枝に沿って補間された。
【図14B】それぞれ、ＡＲＬＤ（図１４Ａ）及びＮＡＦＬＤ（図１４Ｂ）からの２つの代表的な系統樹上に階層化されたテロメア長を示す。枝は、マイクロダイセクションのテロメア長に従ってグレースケールで網掛けされており、最も高い中央値のバリアント対立遺伝子画分がその枝に割り当てられている。内部ノードは最大尤度を用いて推定され、スケールは各枝に沿って補間された。
【図14C】テロメア長ごとに網掛けされた系統樹の更なる例を示す。テロメア長は、正常肝臓（上）、ＡＲＬＤ（中）及びＮＡＦＬＤ（下）からの２つの代表的な系統樹上に階層化されている。枝は、試料のテロメア長に従ってグレースケールで網掛けされており、最も高いバリアント対立遺伝子画分がその枝に割り当てられている。内部ノードは最大尤度を用いて推定され、スケールは各枝に沿って補間された。
【図15】テロメア長に対するクローンサイズ（ｌｏｇ１０当たり（μｍ２））、年齢（１０歳当たり）及び疾患状態（ＮＡＦＬＤ及びＡＲＬＤ対正常）の効果サイズの事後分布を示す。ＭＣＭＣ（Ｍａｒｋｏｖ Ｃｈａｉｎ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ）サンプラーからの密度プロットを十進法で網掛けして示す。
【図16A】本発明者らによって注目された新しい突然変異シグネチャーの詳細を示す。
【図16B】同じ肝臓試料内の近くのクローン間の活動の変動性が示されている。
【図16C】５年の期間にわたる１人の患者からの３つの肝臓切除試料を示す。
【図16D】５年の期間にわたる１人の患者からの３つの肝臓切除試料を示す。
【図16E】５年の期間にわたる１人の患者からの３つの肝臓切除試料を示す。
【図16F】５年の期間にわたる１人の患者からの３つの肝臓切除試料を示す。
【図16G】正常肝細胞、ＡＲＬＤ罹患細胞、ＮＡＦＬＤ罹患細胞の試料における、及び８個全ての解剖学的セグメントがサンプリングされた２人のＮＡＦＬＤ患者におけるシグネチャーの分布が示されている。
【図16H】正常肝細胞、ＡＲＬＤ罹患細胞、ＮＡＦＬＤ罹患細胞の試料における、及び８個全ての解剖学的セグメントがサンプリングされた２人のＮＡＦＬＤ患者におけるシグネチャーの分布が示されている。
【図16I】正常肝細胞、ＡＲＬＤ罹患細胞、ＮＡＦＬＤ罹患細胞の試料における、及び８個全ての解剖学的セグメントがサンプリングされた２人のＮＡＦＬＤ患者におけるシグネチャーの分布が示されている。
【図17】シグネチャー抽出のために使用される濃度パラメータ設定を含む全体的なＨＤＰノード構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又はアルコール関連脂肪性肝疾患（ＡＲＬＤ）を診断及び／又は予後判定するための方法であって、対象における１つ以上の肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異の発生を検出することを含む、方法を開発した。したがって、本発明は、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＦＬＤを診断又は予後判定するための方法であって、
ａ）対象の１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料を提供するステップと、
ｂ）肝細胞に選択的利点を付与するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質における体細胞突然変異を検出するステップであって、体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出するステップと、を含む方法を提供する。特定の実施形態では、肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異の検出は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＲＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変、がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ））、若しくは肝不全を発症するリスクがあることを示す。例示的な実施形態では、本明細書に記載のＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの診断又は予後判定方法は、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤのインビトロ診断又は予後判定方法である。
ａ）対象の１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料を提供するステップと、
ｂ）肝細胞に選択的利点を付与するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質における体細胞突然変異を検出するステップであって、体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出するステップと、を含む方法を提供する。特定の実施形態では、肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異の検出は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＲＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変、がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ））、若しくは肝不全を発症するリスクがあることを示す。例示的な実施形態では、本明細書に記載のＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの診断又は予後判定方法は、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤのインビトロ診断又は予後判定方法である。
【0017】
誤解を避けるために、本明細書で使用される場合、「予後判定」という用語は、対象におけるＮＡＦＤＬ若しくはＡＲＬＤの可能性のある経過及び転帰、並びに／又は対象がＮＡＦＤＬ若しくはＡＲＬＤから回復する可能性を推定／予測するプロセスを指す。例えば、本発明の方法を使用することによって決定されるように、肝疾患が特定の治療に応答して退行していない対象は、予後不良であると見なされ得る。
【0018】
ａ）対象の１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料を提供すること：
典型的には、１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料は、対象から得られた血液試料、尿試料又は組織試料から得られる。血液試料は、対象から得られた血清、血漿又は全血試料であってもよい。組織試料は、生検試料、特に対象から得られた肝生検試料であってもよい。肝生検試料は、肝細胞（hepatocyte、ＨＣ）、肝星細胞（hepatic stellate cell、ＨＳＣ）、クッパー細胞（Kupffer cell、ＫＣ）又は肝類洞壁内皮細胞（liver sinusoidal endothelial cell、ＬＳＥＣ）などの肝細胞を含む。好ましくは、対象から得られた肝生検試料は、肝細胞を含む。
典型的には、１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料は、対象から得られた血液試料、尿試料又は組織試料から得られる。血液試料は、対象から得られた血清、血漿又は全血試料であってもよい。組織試料は、生検試料、特に対象から得られた肝生検試料であってもよい。肝生検試料は、肝細胞（hepatocyte、ＨＣ）、肝星細胞（hepatic stellate cell、ＨＳＣ）、クッパー細胞（Kupffer cell、ＫＣ）又は肝類洞壁内皮細胞（liver sinusoidal endothelial cell、ＬＳＥＣ）などの肝細胞を含む。好ましくは、対象から得られた肝生検試料は、肝細胞を含む。
【0019】
典型的には、生物学的試料は、少なくとも１０個、少なくとも１００個、又は少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、又は少なくとも１０６個の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む。例えば、約１０～約１０個６個の肝細胞、約１００～約１０５個、約５００～約１０４個、約１０～約５０，０００個、又は約１０００～約５０，０００個（例えば、約１０００～約１０，０００個、約１０００～約２０，０００個、約１０００～約３０，０００個、若しくは約１０００～約４０，０００個の肝細胞）である。例示的な実施形態では、生物学的試料は、対象の約１０～約５０，０００個の肝細胞（例えば、約１０～約５０，０００個の肝細胞）に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む。
【0020】
試料が１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む特定の実施形態では、試料は、ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ、ｇＤＮＡ）及び／又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を含む。例えば、試料は、対象から得られた血液試料又は生検試料中に存在する細胞から抽出されたＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。
【0021】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料は、対象からの肝生検試料に由来する。対象から肝生検を得るための方法は、当技術分野において既知であり、臨床従事者の日常的な能力の範囲内である。肝生検試料は、例えば、経皮的、経頚静脈的又は腹腔鏡下肝生検法によって対象から得てもよい。
【0022】
例示的な実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料は、対象から得られた肝生検試料のマイクロダイセクションに由来する。例えば、肝生検試料を対象から得て、その後、約１～約１００（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００）の別個のマイクロダイセクション試料に切断してもよい。典型的には、肝生検試料は、約１０～約６０個のマイクロダイセクション試料に切断される。肝生検試料から得られた各別個のマイクロダイセクション試料は、約１０～約５０，０００個の肝細胞（１０～約５０，０００個の肝細胞）を含み得る。典型的には、各別個のマイクロダイセクション試料は、約１００～約５００個の肝細胞を含む。
【0023】
肝細胞などの細胞からＤＮＡ及び／又はＲＮＡを抽出するための方法は、当技術分野において既知である。例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡは、細胞を溶解するための試薬を使用して細胞又は組織試料から単離することができ、その後、カラムベースの手法及び／又はビーズベースの手法を行って、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを精製することができる。細胞又は組織試料からＤＮＡ又はＲＮＡを単離するために使用され得る市販キットの例としては、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｋｉｔ、ＥＺ１（登録商標）ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ、及びＡｒｃｔｕｒｕｓ（登録商標）ＰｉｃｏＰｕｒｅ（登録商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔが挙げられるが、これらに限定されない。
【0024】
単離されたＤＮＡ又はＲＮＡは、分析前に増幅され得る。増幅の前に、単離されたＲＮＡは、逆転写酵素を使用する逆転写によってＤＮＡに変換され得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、当該分野で既知の技術を使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）ベースの方法又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription polymerase chain reaction、ＲＴ－ＰＣＲ）ベースの方法を使用することによって増幅され得る。単離されたＤＮＡ又はＲＮＡはまた、使用される配列決定技術に好適なＤＮＡライブラリー又はＲＮＡライブラリーを構築するために使用され得る。例えば、トランスポザーゼベースの方法を用いてＤＮＡライブラリーを構築してもよい。
【0025】
試料から単離されたＤＮＡ又はｍＲＮＡは、定量的ＰＣＲ（Quantitative PCR、ｑＰＣＲ）及び定量的逆転写ＰＣＲ（Quantitative reverse transcription PCR、ＲＴ－ｑＰＣＲ）などの当技術分野で既知の方法を使用して定量してもよい。したがって、ある特定の実施形態では、本方法は、対象から得られた生物学的試料から得られたＤＮＡ又はＲＮＡの量を増幅及び／又は定量するステップを更に含み得る。
【0026】
生物学的試料がＤＮＡを含む実施形態では、ＤＮＡは循環遊離ＤＮＡ（circulating free DNA、ｃｆＤＮＡ）であり得る。すなわち、本発明の方法のステップａ）において提供される生物学的試料は、対象の１つ以上の肝細胞に由来するｃｆＤＮＡを含み得る。本明細書で使用される場合、「循環遊離ＤＮＡ」（ｃｆＤＮＡ）という用語は、血漿中に放出されており、血流中又は尿中を自由に循環していることが見出されるＤＮＡ断片を指す。ｃｆＤＮＡは、一般に、小さな断片（７０～２００ｂｐ）からなる二本鎖ＤＮＡである。したがって、生物学的試料は、ｃｆＤＮＡを検出及び／又は単離することができる、当技術分野で既知の任意の好適な試料であってもよい。例えば、試料は、好適には、ｃｆＤＮＡを含む血液試料、血漿試料、又は尿試料であり得る。生物学的試料中の肝臓由来ｃｆＤＮＡを同定するための方法は当技術分野で既知であり、そのような方法の例は、例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１９，７１（２），４０９－４２１，Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１８，９，５０６８，及びＰｕｎｉａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０２１，２１，１４９－１５９に記載されている。
【0027】
生物学的試料がｃｆＤＮＡを含む実施形態では、本方法は、試料からｃｆＤＮＡを単離することを更に含み得る。ｃｆＤＮＡは、当技術分野で既知の様々な技法を使用して試料から単離することができる。例えば、ｃｆＤＮＡは、カラムベースの手法及び／又はビーズベースの手法によって単離することができる。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは、例えば、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）循環核酸キットなどの市販のキットを使用して、カラムベースの手法によって単離される。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは、ビーズベースの手法、例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｃｃｆＤＮＡ Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの市販のキットを使用する自動ｃｆＤＮＡ抽出システムによって単離される。
【0028】
単離されたｃｆＤＮＡは、分析前に増幅され得る。したがって、本方法は、単離されたｃｆＤＮＡの増幅を更に含み得る。ｃｆＤＮＡを増幅するのに好適な技術は当技術分野で既知であり、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特異的対立遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction of specific alleles、ＰＡＳＡ）、ポリメラーゼ鎖ライゲーション、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0029】
生物学的試料がタンパク質を含む実施形態では、突然変異タンパク質のレベルは、当技術分野で既知の任意の好適な技術を使用して測定することができる。本方法は、試料からタンパク質を単離することと、次いで、存在する突然変異タンパク質の量を評価することと、を含み得る。使用される方法及び必要とされる精度のレベルに依存して、精製ステップが実施され得る。いくつかの状況において、試料中の細胞の単純な溶解が十分であり得る。存在する突然変異タンパク質のレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析及び質量分析から選択される１つ以上の技術を使用して評価され得る。
【0030】
本明細書で使用される場合、「対象」とは、ヒトなどの哺乳動物を含む動物を指す。好ましくは、患者はヒト対象である。実施形態では、対象は、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを有することが知られているか若しくはその疑いがあるか、及び／又はＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクを有することが知られているか若しくはその疑いがある。ある特定の実施形態では、対象は、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクを増加させること、より重症型の肝疾患を発症するリスクを増加させること、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクを増加させることが知られている疾患又は状態を有する対象である。例えば、対象は、消化管がん、肥満、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（例えば、高コレステロール血症）及び／又は心血管疾患に罹患していることが知られているか、又はその疑いがある対象であってもよい。
【0031】
ｂ）肝細胞クローンに選択的利点を付与するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質における体細胞突然変異を検出すること：
体細胞突然変異は、個体の生涯の間に獲得される遺伝子のＤＮＡ配列の永久的な変化である。すなわち、体細胞突然変異は個体の生殖系列ＤＮＡには存在せず、したがって生殖系列多型のように親から遺伝されない。体細胞突然変異は、ヌクレオチドの置換、欠失又は細胞のＤＮＡへの挿入を作り出す各細胞分裂で起こるＤＮＡ複製の非忠実度に起因して自発的に起こり得る。体細胞突然変異は、紫外線放射、化学物質曝露又はウイルス感染などの環境因子によっても引き起こされ得る。
体細胞突然変異は、個体の生涯の間に獲得される遺伝子のＤＮＡ配列の永久的な変化である。すなわち、体細胞突然変異は個体の生殖系列ＤＮＡには存在せず、したがって生殖系列多型のように親から遺伝されない。体細胞突然変異は、ヌクレオチドの置換、欠失又は細胞のＤＮＡへの挿入を作り出す各細胞分裂で起こるＤＮＡ複製の非忠実度に起因して自発的に起こり得る。体細胞突然変異は、紫外線放射、化学物質曝露又はウイルス感染などの環境因子によっても引き起こされ得る。
【0032】
遺伝子における体細胞突然変異は、突然変異タンパク質を産生するために細胞によって発現され得、遺伝子における１つ以上のヌクレオチド置換（すなわち、「単一ヌクレオチドバリアント（single-nucleotide variant）」又は「ＳＮＶ」である各ヌクレオチド置換）は、体細胞非突然変異核酸配列によってコードされるアミノ酸と比較して、コードされる異なるアミノ酸をもたらし、したがって、正常な非罹患細胞（例えば、健康な肝細胞）におけるタンパク質／ペプチドと比較して、タンパク質／ペプチドにおいて異なるアミノ酸をもたらす可能性がある。ヌクレオチドの挿入及び／又は欠失は、リーディングフレームエラー（すなわち、「インデル突然変異」又は「フレームシフト突然変異」）をもたらし、その結果として、タンパク質レベルで新しいアミノ酸配列をもたらす（すなわち、ヌクレオチドの挿入又は欠失がＤＮＡのリーディングフレームを変化させ、その結果、突然変異後に、正常細胞（例えば、健康な肝細胞）と比較して、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸の大部分又は全てを変化させる）可能性がある。追加的又は代替的に、挿入及び／又は欠失は、終止コドンの導入をもたらし、その結果として、タンパク質レベルで短縮型タンパク質をもたらす（ナンセンス突然変異）可能性がある。ヌクレオチド置換は、コドンを個々に変更し、タンパク質レベルでアミノ酸の置換及び／又は終止コドンの導入をもたらし、その結果として、タンパク質レベルで短縮型タンパク質をもたらす可能性がある。
【0033】
本発明の方法のステップｂ）において検出される体細胞突然変異は、対象の肝細胞に選択的利点を付与するものである。本明細書で使用される場合、「選択的利点」という用語は、同じ１つ以上の突然変異を有しない細胞よりも良好に細胞が生存及び／又は再生することを可能にする１つ以上の突然変異（例えば、体細胞突然変異は、対象の肝細胞に増殖利点を付与するものである）を介して所与の細胞に付与される利点を指す。例えば、肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異は、細胞内の脂質の蓄積によって引き起こされる毒性条件下で肝細胞が生存することを可能にするものであり得る。肝細胞に選択的利点を付与する突然変異は、肝臓の所与の微小環境における肝細胞の正の選択をもたらし、同じ１つ以上の突然変異を有しない肝細胞よりも良好に生存及び／又は再生することができる肝細胞を含む優性肝細胞クローンをもたらす可能性がある。したがって、例えば、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）において検出される体細胞突然変異は、肝臓における脂質蓄積に関連する毒性条件下で肝細胞が生存することを可能にすることによって、肝細胞に選択的利点を付与するものである。更に、又はあるいは、肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異は、肝臓における脂質蓄積に関連するもの、例えば、肝臓における脂質蓄積の増加及び／又は肝臓における脂質代謝の減少に関連するものであり得る。
【0034】
誤解を避けるために、本明細書で使用される場合、「ドライバー突然変異」という用語はまた、対象の細胞（例えば、肝細胞）に選択的利点を付与する変異を指す。
【0035】
肝細胞などの細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異を同定するための方法は、当技術分野で既知である。Ｍａｒｔｉｎｃｏｒｅｎａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１７，１７１，１０２９－１０４１．ｅ２１によって記載されたｄＮ／ＤＳｃｖ法及びＲｈｅｉｎｂａｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０２０，５７８，１０２－１１１によって記載されたＮＢＲアルゴリズムの使用を含む例示的な方法が本明細書に記載されている。
【0036】
本発明者らは、対象の肝臓に由来する試料中の複数の肝細胞において選択的利点を付与する独立して獲得された体細胞突然変異の検出が、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを診断及び／又は予後診断するための特に信頼できる方法を提供することを見出した。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップａ）は、少なくとも１０個、少なくとも１００個、又は少なくとも１０００個、少なくとも１０５個、又は少なくとも１０６個の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料を提供することを含む。例えば、ステップｂ）は、少なくとも１００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個の肝細胞を含む生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含み得る。そのような実施形態では、ステップｂ）は、少なくとも１０個、少なくとも１００個、又は少なくとも１０００個、少なくとも１０５個、又は少なくとも１０６個の肝細胞に由来する当該生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含み、１つ以上の肝細胞に選択的利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ及び／若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す。
【0037】
本発明者らは、約１０００～約５０，０００個の肝細胞（例えば、肝細胞）に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料の分析が、対象の肝臓の遺伝的ランドスケープ、並びに／又は肝臓におけるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤの進行及び／若しくは重症度の特に信頼できるスナップショットを提供することを見出した。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップａ）は、対象の約１０００～約５０，０００個の肝細胞（例えば、約１０００～約５０，０００個の肝細胞）に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む生物学的試料を提供することを含む。
【0038】
更に、又はあるいは、本発明の方法のステップｂ）は、対象から得られた１つ以上の異なる生物学的試料を使用して繰り返され得る。例えば、１つ以上の肝生検試料又はそのマイクロダイセクション試料、１つ以上の血液試料及び／又は１つ以上の尿試料である。例えば、ステップｂ）は、対象の肝臓における異なる位置からの肝生検から得られた対象の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む１つ以上の異なる生物学的試料（例えば、肝臓の異なる葉から得られた肝生検試料）を用いて繰り返されてもよい。
【0039】
更に、又はあるいは、本発明の方法のステップｂ）は、対象由来の１つの肝生検試料から得られた１つ以上の異なる生物学的試料を使用して繰り返されてもよい。例えば、ステップｂ）は、対象由来の肝生検試料を２つ以上の別個のマイクロダイセクション試料にマイクロダイセクションすることによって得られた１つ以上の生物学的試料を用いて繰り返されてもよい。
【0040】
１つ以上の異なる肝生検、その１つ以上の異なるマイクロダイセクション試料、１つ以上の異なる血液試料、及び／又は１つ以上の異なる尿試料などの１つ以上の異なる生物学的試料の分析は、対象の肝臓の遺伝的ランドスケープ、並びに／又は肝臓全体にわたるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤの進行及び／若しくは重症度へのより広い洞察を提供する。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、対象の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む１つ以上の異なる生物学的試料を提供することと、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ及び／若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあるかを決定するために、１つ以上の異なる生物学的試料を用いてステップｂ）を繰り返すことと、を含む。
【0041】
ある特定の実施形態では、ステップｂ）において検出される、対象の肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異は、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣｌＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内にある。
【0042】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象の肝細胞に選択的利点を付与するＦＯＸＯ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含む。ＦＯＸＯ１は、インスリンシグナル伝達の下流の主要な転写因子をコードする。絶食状態では、インスリンなしで、ＦＯＸＯ１タンパク質は肝細胞の核において活性であり、糖新生、解糖及び脂肪分解経路における遺伝子の発現を上方制御する。インスリンがその受容体に結合すると、ＡＫＴはＰＩ３Ｋを介して活性化される。続いて、ＡＫＴは核内のＦＯＸＯ１タンパク質をリン酸化し、ＦＯＸＯ１タンパク質の２４位のスレオニンは３つの既知のＡＫＴリン酸化標的のうちの１つである。
【0043】
ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象において、本発明者らは、ＦＯＸＯ１タンパク質のインスリン媒介核外輸送を損なうＦＯＸＯ１遺伝子内の体細胞突然変異を同定した。ＦＯＸＯ１機能の障害は、肝内脂肪が増加した対象において非常に優勢であるインスリン感受性の低下に寄与する。ＦＯＸＯ１遺伝子におけるこれらの突然変異のうちの１つ以上の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患していること、又は対象のＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクが増加しているか、より重症型の肝疾患を発症するリスクが増加しているか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクが増加していることを示し得る。したがって、ある特定の実施形態では、本方法は、ＦＯＸＯ１タンパク質のインスリン媒介核外輸送を損なうＦＯＸＯ１タンパク質のアミノ酸突然変異をもたらすＦＯＸＯ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の検出を含む。
【0044】
典型的には、ＦＯＸＯ１遺伝子において検出される体細胞突然変異のうちの少なくとも１つは、ＦＯＸＯ１タンパク質のＮ末端１４－３－３タンパク質結合モチーフをコードするＦＯＸＯ１遺伝子の領域（すなわち、ＦＯＸＯ１タンパク質のアミノ酸２０～２８）中にある。本発明者らは、ＦＯＸＯ１タンパク質のＮ末端１４－３－３タンパク質結合モチーフ内の体細胞突然変異が、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを特に示すことを見出した。したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、ＦＯＸＯ１タンパク質のＮ末端１４－３－３タンパク質結合モチーフ内のアミノ酸突然変異をもたらすＦＯＸＯ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含む。
【0045】
好ましい実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、ＦＯＸＯ１タンパク質においてＳ２２Ｗアミノ酸置換、Ｒ２１Ｌアミノ酸置換及び／又はＳ２２ナンセンス突然変異（本明細書ではＳ２２＊と呼ぶ）をもたらす１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含む。本発明者らは、ＦＯＸＯ１タンパク質におけるＳ２２Ｗアミノ酸置換、Ｒ２１Ｌアミノ酸置換又はＳ２２ナンセンス突然変異をもたらすＦＯＸＯ１遺伝子における体細胞突然変異が、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを特に示すことを見出した。したがって、特に好ましい実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、ＦＯＸＯ１タンパク質においてＳ２２Ｗアミノ酸置換をもたらすＦＯＸＯ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の検出を含む。
【0046】
本発明者らはまた、ＧＰＡＭ遺伝子内の体細胞突然変異は、対象におけるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤの指標、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクの増加の更なる指標、及び／又は対象がより重症型の肝疾患若しくは関連疾患若しくは状態を発症するリスクの増加の指標として使用され得ることを見出した。ＧＰＡＭ遺伝子は、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ１、ミトコンドリアタンパク質（本明細書ではＧＰＡＭタンパク質又はＧＰＡＴタンパク質と呼ぶ）をコードする。ＧＰＡＭタンパク質は、グリセロール－３－リン酸による長鎖アシル－ＣｏＡのエステル化を触媒する酵素である。典型的には、ＧＰＡＭ遺伝子において検出される１つ以上の体細胞突然変異は、ＧＰＡＭタンパク質の機能障害又は機能無効、特にグリセロール－３－リン酸による長鎖アシル－ＣｏＡのエステル化を触媒するＧＰＡＭタンパク質の能力の障害又は無効をもたらす。本発明者らは、ＧＰＡＭタンパク質の機能障害又は機能無効につながるＧＰＡＭ遺伝子における体細胞突然変異が、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの診断及び／又は予後のための特に有用なマーカーであることを見出した。
【0047】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象の肝細胞に選択的利点を付与するＧＰＡＭ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＧＰＡＭ遺伝子において検出される１つ以上の体細胞突然変異は、ＧＰＡＭタンパク質の機能を損なうか又は無効にする。本発明の方法のステップｂ）において検出され得るＧＰＡＭ遺伝子内の体細胞突然変異の例としては、ＧＰＡＭタンパク質のＧ７９０Ｗ、Ｅ７３０Ｋ、Ａ６１９Ｐ、Ｒ５１９Ｇ、Ｈ４８６Ｒ、Ｌ３３２Ｓ、Ｆ３１３Ｌ、Ｙ２９２Ｃ、Ｇ２７３Ｖ、Ｌ２２５Ｍ及び／又はＱ２１０Ｒ置換、ＧＰＡＭタンパク質のＬ３２２フレームシフト突然変異又はＲ１１８（すなわち、Ｒ１１８＊）ナンセンス突然変異をもたらす突然変異が挙げられる。
【0048】
本発明者らはまた、ＣＩＤＥＢ遺伝子内の体細胞突然変異が、対象におけるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤの指標、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクの増加の指標、及び／又は対象がより重症型の肝疾患若しくは関連する疾患若しくは状態を発症するリスクの増加の更なる指標として使用され得ることを見出した。ＣＩＤＥＢは、肝細胞において活性なＣＩＤＥファミリーの主要なメンバーであり、ノックアウトマウスモデルは、食事性脂肪性肝炎に対する抵抗性及びインスリン感受性の増加を示す（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００７，５６，２５２３－２５３２）。ＣＩＤＥタンパク質は、異なる液滴上のＣＩＤＥタンパク質間のホモ二量体の形成によって媒介される細胞内脂質液滴の融合を調節する（Ｂａｒｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｉｆｅ，２０１５，４，１－２４、及びＳｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３，４，１５９４９）。ＣＩＤＥタンパク質のホモ二量体化は、一方の脂肪液滴からのＣＩＤＥタンパク質上の正に荷電した残基と他方の負に荷電した残基との間の静電接触を介して起こる。
【0049】
本発明者らは、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している患者のＣＩＤＥＢ遺伝子におけるナンセンス、終止欠失突然変異及びミスセンス突然変異を同定した。特に、本発明者らは、ミスセンス突然変異がＣＩＤＥタンパク質のホモ二量体化に関与する２つのドメインに主に位置し、それらの多くが荷電残基を中性残基に切り替える（Ｒ４５Ｗ、Ｒ４５Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｒ１４４Ｐ）か、又は電荷を逆転させる（Ｄ４２Ｈ、Ｋ６２Ｅ、Ｅ７８Ｋ）かのいずれかであることを見出した。以前のインビトロ突然変異誘発研究は、荷電残基での置換又はＣＩＤＥＢタンパクの短縮を引き起こす突然変異が、肝細胞における脂肪液滴の増殖を妨害することを示している（Ｂａｒｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｉｆｅ，２０１５，４，１－２４、及びＳｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３，４，１５９４）。ＣＩＤＥＢノックアウトマウスはまた、高脂肪食によって引き起こされる脂肪性肝炎に対して抵抗性であることが見出されており（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００７，５６，２５２３－２５３２）、したがって、ＣＩＤＥＢ突然変異を不活性化させることが、代謝肝疾患において肝細胞に選択的利点をどのように付与し得るかについてのインビボでの証拠を提供する。
【0050】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象の肝細胞に選択的利点を付与するＣＩＤＥＢ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＣＩＤＥＢ遺伝子において検出される１つ以上の体細胞突然変異は、対象の肝細胞によって発現されるＣＩＤＥＢタンパクの機能を損なうか又は無効にする。例えば、ＣＩＤＥＢ遺伝子内に存在する体細胞突然変異は、例えば、ＣＩＤＥＢタンパク質中の荷電した残基の中性残基による置換、ＣＩＤＥＢタンパク質中の中性残基の荷電した残基による置換、ＣＩＤＥＢタンパク質中の負に荷電した残基の正に荷電した残基による置換、及び／又はＣＩＤＥＢタンパク質中の正に荷電した残基の負に荷電した残基による置換によって、ＣＩＤＥＢタンパク質の電荷の変化をもたらすものであってもよい。例示的な実施形態では、ＣＩＤＥＢ遺伝子における１つ以上の体細胞突然変異は、ＣＩＤＥＢタンパクのホモ二量体化を損なうか又は無効にし、したがって、肝細胞内の脂肪液滴の融合及び増殖を防止する。本発明の方法のステップｂ）において検出され得るＣＩＤＥＢ遺伝子における体細胞突然変異の例としては、ＣＩＤＥＢタンパクのＬ４Ｈ、Ｌ７Ｑ、Ｆ２３Ｓ、Ｗ２８Ｒ、Ｄ４２Ｈ、Ｒ４５Ｑ、Ｒ４５Ｗ、Ｋ６２Ｅ、Ｅ７２Ｋ、Ｒ１２２Ｑ、１１３１Ｖ、Ａ１２３Ｐ、Ｋ１４０Ｎ、Ｒ１４４Ｐ、Ｌ１５０Ｑ、Ｎ１５１Ｄ、Ｄ１６５Ｅ及び／若しくはＱ１６７Ｅ置換、又はＣＩＤＥＢタンパクのＷ２８（すなわちＷ２８＊）、Ｗ１８１（すなわちＷ１８１＊）及び／若しくは２２０Ｙ（すなわち＊２２０Ｙ）ナンセンス突然変異をもたらす突然変異が挙げられる。
【0051】
本発明者らはまた、ＡＣＶＲ２Ａ遺伝子内の体細胞突然変異の検出が、対象におけるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤの指標、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクの増加の指標、及び／又は対象がより重症型の肝疾患若しくは関連する疾患若しくは状態を発症するリスクの増加の指標として使用され得ることを見出した。ＡＣＶＲ２Ａ遺伝子は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーにおけるアクチビン－Ａの受容体をコードする。本発明者らは、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している患者において、ＡＣＶＲ２Ａにおける１３個のミスセンス突然変異、２個のナンセンス及び１個のスプライス部位インデル（ｑ＝７×１０－９）、並びに構造変異による４個の大規模欠失を同定した。
【0052】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象の肝細胞に選択的利点を付与するＡＣＶＲ２Ａ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含む。
【0053】
本発明の方法のステップｂ）において検出され得るＡＣＶＲ２Ａ遺伝子における体細胞突然変異の例としては、ＡＣＶＲ２Ａタンパク質のＣ３０Ｒ、Ｌ３１Ｐ、Ｃ８５Ｙ、Ｃ１０５Ｓ、Ｙ２３６Ｃ、Ｍ２４１Ｖ、Ｖ２８３Ｇ、Ｔ２９５Ａ、Ｈ３２０Ｙ、１３７５Ｖ、Ｓ４２４Ｙ及びＱ４８１Ｐ置換、並びにＡＣＶＲ２Ａタンパク質のＲ４１（すなわち、Ｒ４１＊）又はＥ２３４（すなわち、Ｅ２３４＊）ナンセンス突然変異をもたらす突然変異が挙げられる。
【0054】
本発明者らはまた、ＡＬＢ遺伝子内の体細胞突然変異の検出が、対象におけるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤの指標、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクの増加の指標、及び／又は対象がより重症型の肝疾患若しくは関連する疾患若しくは状態を発症するリスクの増加の指標として使用され得ることを見出した。ＡＬＢ遺伝子は、プレプロアルブミンとして肝臓で合成される血清アルブミンをコードする。新生形態のプレプロアルブミンはプロセシングされ、血清アルブミンとして循環中に放出される。
【0055】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象の肝細胞に選択的利点を付与するＡＬＢ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＢ遺伝子内の体細胞突然変異は、例えば、対象から得られた血液試料中に存在する血清アルブミンを特徴付けることによって、タンパク質レベルで検出してもよい。例えば、血液試料中の突然変異血清アルブミンの存在及び／又はレベルは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析及び質量分析によって決定され得る。
【0056】
本発明者らはまた、ＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子内の体細胞突然変異が、対象におけるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤの更なる指標、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクの増加の更なる指標、及び／又は対象がより重症型の肝疾患若しくは関連する疾患若しくは状態を発症するリスクの増加の更なる指標として使用され得ることを見出した。ＴＮＲＣ６Ｂは、マイクロＲＮＡプロセシングに関与するタンパクをコードする（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２００５，６；１５（２３）：２１４９－５５）。本発明者らは、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している患者におけるＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子内の体細胞突然変異を同定した。特に、本発明者らは、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している患者のＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子において、３つのナンセンス、２つの必須スプライス部位及び１つの大きなインフレーム欠失、並びに３つのミスセンス突然変異を見出した。
【0057】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象の肝細胞に選択的利点を付与するＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異は、ＴＮＲＣ６Ｂタンパク質の機能を損なうか又は無効にする。
【0058】
本発明の方法のステップｂ）において検出され得るＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子における体細胞突然変異の例としては、ＴＮＲＣ６Ｂタンパク質のＧ１３７４Ｃ、Ｔ１５３５Ｓ及び／若しくはＭ１８１４Ｖ置換、ＴＮＲＣ６Ｂタンパク質のＧ５３６（すなわちＧ５３６＊）、Ｗ１３９９（すなわちＷ１３９９＊）若しくはＱ１７００（すなわちＱ１７００＊）ナンセンス突然変異、並びに／又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質の残基１６３～１８０のインフレーム欠失をもたらす突然変異が挙げられる。
【0059】
ある特定の例示的な実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ及び／又はＣＩＤＥＢ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含む。すなわち、少なくとも１つの体細胞突然変異がＦＯＸＯ１遺伝子において検出され、少なくとも１つの体細胞突然変異がＧＰＡＭ遺伝子において検出され、かつ／又は少なくとも１つの体細胞突然変異がＣＩＤＥＢ遺伝子において検出される。例えば、本方法は、ＦＯＸＯ１タンパク質の１４－３－３タンパク質結合モチーフをコードするＦＯＸＯ１遺伝子のＤＮＡの領域におけるＦＯＸＯ１遺伝子中の１つ以上の体細胞突然変異の検出、機能障害又は機能無効を示すＧＰＡＭタンパク質をコードするＧＰＡＭ遺伝子中の１つ以上の突然変異の検出、及び／又は機能障害又は機能無効を示すＣＩＤＥＢタンパク質をコードするＣＩＤＥＢ遺伝子中の１つ以上の突然変異の検出を含み得る。
【0060】
対象の１つ以上の肝細胞に選択的利点を付与する体細胞突然変異を検出するステップ（例えば、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子における１つ以上の体細胞突然変異の検出）は、本明細書に記載されるように、対象から得られた生物学的試料から得られたＤＮＡを配列決定することによって達成され得る。更に、又はあるいは、１つ以上の体細胞突然変異は、１つ以上の体細胞突然変異を含む遺伝子から転写される生物学的試料中のｍＲＮＡを配列決定及び／又は定量することによって検出され得る。例えば、１つ以上の体細胞突然変異は、１つ以上の体細胞突然変異を含むＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子から転写された生物学的試料中のｍＲＮＡを配列決定及び／又は定量することによって検出され得る。
【0061】
種々のＤＮＡ及びＲＮＡ配列決定手順が当該分野で既知であり、そして本明細書中に開示される方法を実施するために使用され得る。例えば、Ｓａｎｇｅｒ配列決定、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、４５４パイロシーケンシング、コンビナトリアルプローブアンカー合成、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子配列決定、単一分子リアルタイム（Single molecule real time、ＳＭＲＴ）配列決定、Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＤＮＡ配列決定、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓａｎｇｅｒ配列決定及びＩｌｌｕｍｉｎａ色素配列決定である。
【0062】
更に、又はあるいは、１つ以上の体細胞突然変異は、１つ以上の体細胞突然変異を含む遺伝子によってコードされる突然変異アミノ酸を含むタンパク（例えば、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク）を検出することによって検出及び／又は定量され得る。試料中の変異タンパク質の存在及び／又はレベルは、当該分野で既知の任意の好適な技術を使用して測定され得る。本方法は、試料からタンパク質を単離することと、次いで、存在する突然変異タンパク質の量を評価することと、を含み得る。使用される方法及び必要とされる精度のレベルに依存して、精製ステップが実施され得る。いくつかの状況において、試料中の細胞の単純な溶解が十分であり得る。存在する突然変異タンパク質のレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析及び質量分析から選択される１つ以上の技術を使用して評価され得る。
【0063】
誤解を避けるために、本明細書で使用される場合、「重症型の肝疾患」という用語は、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの結果としての進行性肝線維症又は肝臓関連機能不全、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変、肝臓がん、及び肝不全を指す。具体的なタイプの肝臓がんとしては、肝細胞がん（ＨＣＣ）、肝内胆管がん、脈管肉腫及び血管肉腫が挙げられる。
【0064】
誤解を避けるために、本明細書で使用される場合、「関連疾患又は状態」という用語は、肝疾患に関連する疾患及び状態を指す。このような疾患及び状態としては、食道、胃、胆管、胆嚢及び関連構造、膵臓、小腸、大腸、直腸及び肛門の消化管がんが挙げられる。肝疾患に関連する疾患及び状態の他の例としては、肥満、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（例えば、高コレステロール血症）及び心血管疾患が挙げられる。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変、がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ））及び肝不全からなる群から選択されるより重症型の肝疾患を発症するリスクがあるかどうかを決定することを含む。特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象が、消化管がん、肥満、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（例えば、高コレステロール血症）及び心血管疾患からなる群から選択される肝疾患に関連する疾患又は状態を発症するリスクがあるかどうかを決定することを含む。
【0065】
ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、ステップａ）において提供される生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異のレベルを定量することを含む。１つ以上の体細胞突然変異のレベルを定量するのに適した技術は、当技術分野で既知であり、例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＤＮＡ／ＲＮＡマイクロアレイの使用、及びＤＮＡ配列決定データ、特に次世代配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ色素配列決定及びＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体配列決定）データの分析が挙げられる。
【0066】
本明細書で使用される場合、「１つ以上の体細胞突然変異のレベル」及び「体細胞突然変異のレベル」という用語は、所与の生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異のコピー数、所与の生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異を含むＤＮＡ分子の濃度、所与の生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異を含むｍＲＮＡ分子の濃度、又は所与の生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異によってコードされる１つ以上の突然変異アミノ酸を含むタンパク質の濃度を指す。
【0067】
典型的には、所与の生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異のレベル（すなわち、突然変異のコピー数、突然変異を有するＤＮＡの濃度、突然変異を有するｍＲＮＡの濃度及び／又は突然変異を有するタンパク質の濃度によって評価される）は、健康な対象から得られた参照生物学的試料（すなわち、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを有しない対象から得られた肝臓試料）、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを有することが知られている対象から得られた参照生物学的試料、及び／又は同じ対象から得られた参照生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異のレベルと比較される。
【0068】
参照生物学的試料が健康な対象由来である実施形態では、対象由来の所与の生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異のレベルが参照生物学的試料中のレベルよりも高い場合、これは、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを有するか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクが増加しているか、より重症型の肝疾患を発症するリスクが増加しているか、及び／又は関連疾患若しくは状態を発症するリスクが増加していることを示す。対象由来の所与の生物学的試料中の各１つ以上の体細胞突然変異のレベルが、健康な対象から得られた参照生物学的試料中のレベルと同等であるか、又はそれより低い場合、これは、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを有していないか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクが増加していないか、より重症型の肝疾患を発症するリスクが増加していないか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクが増加していないことを示す。
【0069】
参照生物学的試料がＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを有することが知られている対象由来である実施形態では、対象由来の所与の生物学的試料中の１つ以上の体細胞突然変異のレベルが参照生物学的試料中のレベルと同等であるか、又はそれより高い場合、これは、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを有するか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクが増加しているか、より重症型の肝疾患を発症するリスクが増加しているか、及び／又は関連疾患若しくは状態を発症するリスクが増加していることを示す。対象由来の所与の生物学的試料中の各１つ以上の体細胞突然変異のレベルが、参照生物学的試料中のレベルよりも低い場合、これは、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを有しないか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクが増加していないか、より重症型の肝疾患を発症するリスクが増加していないか、及び／又は関連する疾患若しくは状態を発症するリスクが増加していないことを示し得る。
【0070】
ある特定の実施形態では、参照生物学的試料は、所与の生物学的試料と同じ対象に由来する。典型的には、同じ対象由来の参照生物学的試料は、対象の身体若しくは肝臓の異なる領域から得られるか、及び／又は所与の生物学的試料とは異なる時点で対象から得られる。例えば、参照生物学的試料は、対象から得られた所与の生物学的試料よりも１～６ヶ月前、６～１２ヶ月前、１～２年前又は２～３年前に対象から得ることができる。
【0071】
参照生物学的試料が同じ対象から得られるが、所与の生物学的試料よりも早い時点で得られる実施形態では、所与の生物学的試料における１つ以上の体細胞突然変異のレベルが参照生物学的試料におけるレベルよりも高い場合、これは、参照生物学的試料が対象から得られたより早い時点と比較して、対象のＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクが増加しているか、より重症型の肝疾患を発症するリスクが増加しているか、及び／又は関連する疾患若しくは状態を発症するリスクが増加していることを示し得る。あるいは、所与の生物学的試料における１つ以上の体細胞突然変異のレベルが参照生物学的試料におけるレベルよりも高い場合、これは、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症しているか、より重症型の肝疾患を発症しているか、及び／又は関連する疾患若しくは状態を発症していることを示し得る。
【0072】
対象由来の所与の生物学的試料中の各１つ以上の体細胞突然変異のレベルが参照生物学的試料中のレベルと同等である場合、これは、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症していないか、より重症型のＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症していないか、より重症型の肝疾患を発症していないか、及び／又は関連する疾患若しくは状態を発症していないことを示し得る。対象由来の所与の生物学的試料中の各１つ以上の体細胞突然変異のレベルが参照生物学的試料中のレベルよりも低い場合、これは、参照生物学的試料が対象から得られた初期の時点と比較して、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクが低下しているか、より重症型の肝疾患を発症するリスクが低下しているか、及び／又は関連疾患若しくは状態を発症するリスクが低下していることを示し得る。又は、対象由来の所与の生物学的試料中の各１つ以上の体細胞突然変異のレベルが参照生物学的試料中のレベルよりも低い場合、これは、対象が寛解期にあるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを有するか、寛解期にあるより重症型の肝疾患を有するか、及び／又は寛解期にある関連疾患若しくは状態を有することを示し得る。
【0073】
ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象から得られた所与の生物学的試料中に含有される異なる肝細胞クローンに由来する１つ以上の体細胞突然変異を検出及び／又は定量することを含み得る。本明細書で使用される場合、「肝細胞クローン」という用語は、共通の祖先を共有する同一肝細胞の群を指す。ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）における１つ以上の体細胞突然変異（例えば、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異）の検出は、対象から得られた異なる生物学的試料に含まれる異なる肝細胞クローンに由来する１つ以上の体細胞突然変異を検出及び／又は定量することを含み得る。例えば、異なる肝細胞クローンは、肝臓の異なる領域から得られた異なる生物学的試料及び／又は異なる時点で対象から得られた異なる生物学的試料中に含まれ得る。それぞれの肝細胞クローンの肝細胞に選択的利点を付与する１つ以上（例えば、２、３、４、５、６つ以上）の異なる肝細胞クローンにおける１つ以上の同じ体細胞突然変異の検出は、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの存在の特に強力な指標である。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、対象から得られた生物学的試料に含まれる異なる肝細胞クローンに由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質における１つ以上の体細胞突然変異を検出及び／又は定量することを含み、２つ以上の肝細胞クローンにおける当該肝細胞クローンの肝細胞に選択的利点を与える同じ体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す。
【0074】
したがって、対象から得られた肝細胞及び／又は肝細胞クローンに選択的利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異のレベルの検出及び／又は定量は、好適な疾患モニタリングプログラム、好適な治療を決定する際に臨床医を導くために、又は対象が寛解していることを臨床医に知らせるために使用することができる。
【0075】
生物学的試料が肝生検試料由来のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む実施形態では、肝細胞に選択的利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異を有する肝細胞を含む肝生検試料又はそのマイクロダイセクションのサイズ及び／又は割合を測定し得る。肝細胞に選択的利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異を有する肝細胞を含む肝生検試料又はそのマイクロダイセクションのサイズ及び／又は割合は、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの重症度及び／又は進行への更なる洞察を提供する。例えば、肝細胞に選択的利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異を有する肝細胞を≧０．５ｃｍ３（すなわち、肝生検試料の５０％以上の割合）を含む１ｃｍ３のサイズを有する肝生検試料は、対象が、その肝臓の有意な割合においてＮＡＦＬＤ又はＡＦＬＤを有する（例えば、対象は、その肝臓の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれ以上において脂肪症を有し得る）ことを示すと考えられ得る。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、肝細胞に選択的利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異を有する肝細胞を含む肝生検試料又はそのマイクロダイセクションのサイズ及び／又は割合を測定するステップを更に含む。したがって、肝細胞に選択的利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異を有する肝細胞を含む肝生検試料又はそのマイクロダイセクション試料のサイズ及び／又は割合を使用して、好適な疾患モニタリングプログラム、好適な治療を決定する際に臨床医を導くか、又は対象が寛解していることを臨床医に知らせることができる。
【0076】
誤解を避けるために、本発明の方法のステップｂ）は、以下のうちのいずれか１つ以上における体細胞突然変異の検出及び／又は定量を含み得る：
遺伝子を含むＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）分子、
遺伝子の一部分を含むＤＮＡ（例えばｃｆＤＮＡ）分子、
遺伝子の一部分に対応する配列を含むＲＮＡ分子、
遺伝子に対応する配列によってコードされるタンパク質、及び／又は
遺伝子の一部分に対応する配列によってコードされるタンパク質。
遺伝子を含むＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）分子、
遺伝子の一部分を含むＤＮＡ（例えばｃｆＤＮＡ）分子、
遺伝子の一部分に対応する配列を含むＲＮＡ分子、
遺伝子に対応する配列によってコードされるタンパク質、及び／又は
遺伝子の一部分に対応する配列によってコードされるタンパク質。
【0077】
本発明の方法は、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの診断又は予後診断の信頼性を改善するための、１つ以上の追加のマーカーの検出及び／又は定量を更に含んでもよい。例えば、本明細書に記載されるように、本発明者らは、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを有する対象の肝細胞における新しい突然変異シグネチャーに注目した。特に、本発明者らは、肝疾患が進行するにつれて新しい突然変異シグネチャーの強度が増加することに注目した（図１６Ｄ～図１６Ｆを参照されたい）。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、対象の１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質における突然変異シグネチャーの同定、及び任意選択的なモニタリングを更に含み得る。
【0078】
誤解を避けるために、本明細書で使用される場合、「突然変異シグネチャー」という用語は、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを有することが既知であるか又はその疑いがある対象において観察される体細胞突然変異のセットを意味する。肝細胞などの細胞における突然変異シグネチャーを同定するための方法は、当技術分野において既知である。ＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒＭａｔｒｉｘＧｅｎｅｒａｔｏｒソフトウェアの使用を含む例示的な方法が本明細書に記載される（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｅ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０，１－１２（２０１９））。ある特定の実施形態では、本発明の方法はまた、対象から得られた生物学的試料中のＣＬＣＮ５遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するステップを含んでもよい。本発明者らは、ＣＬＣＮ５遺伝子における体細胞突然変異が、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している患者において起こることを見出した。ＣＬＣＮ５遺伝子はクロライドチャネルをコードし、これはＸ連鎖腎石灰化症を引き起こすが、生殖系列において突然変異した場合に既知の肝臓表現型を引き起こさない。ＣＬＣＮ５遺伝子内の体細胞突然変異は、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの更なる指標、対象がＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを発症するリスクの増加の更なる指標、及び／又は対象がより重症型の肝疾患又は関連疾患若しくは状態を発症するリスクの増加の更なる指標であり得る。特定の例示的な実施形態では、ＣＬＣＮ５遺伝子において検出される１つ以上の体細胞突然変異は、変異を含有する肝細胞に選択的利点を付与するものである。
【0079】
本発明の方法において検出され得るＣＬＣＮ５遺伝子における体細胞突然変異の例としては、ＣＬＣＮ５タンパク質のＧ３３０Ｄ、Ｓ３７１Ｇ及び／若しくはＧ５７０Ｒ置換をもたらす突然変異、又はＣＬＣＮ５タンパク質のＣ１７１（すなわちＣ１７１＊）、Ｗ１９２（すなわちＷ１９２＊）、Ｅ６７６（すなわちＥ６７６＊）若しくはＧ７９１（すなわちＧ７９１＊）ナンセンス突然変異が挙げられる。
【0080】
ある特定の実施形態では、本発明の方法はまた、対象から得られた生物学的試料中の１つ以上の非コード体細胞突然変異を検出するステップを含んでもよい。本発明者らは、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している患者のＮＥＡＴ１遺伝子における非コード突然変異を検出した。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、ＮＥＡＴ１遺伝子における１つ以上の非コード体細胞突然変異を検出することを更に含む。ある特定の実施形態では、ＮＥＡＴ１遺伝子において検出される１つ以上の非コード体細胞突然変異は、突然変異を含む肝細胞に選択的利点を付与するものである。
【0081】
本発明の方法において検出され得るＮＥＡＴ１遺伝子における非コード体細胞突然変異の例としては、ＧＲＣｈ３７ｄ５ヒト参照ゲノムによるそれらのゲノム位置を参照することによって提供される、ヒト染色体１１上の以下の突然変異が挙げられる：６５１９０７８４ Ｇ＞Ａ；６５１９３３３３ Ｃ＞Ｔ；６５１９４１９５ ｄｅｌｌ９；６５１９７６７４ Ｃ＞Ｔ；６５１９７６８８ Ｃ＞Ｇ；６５１９８６１０ ｄｅｌ４７；６５２０１０６６ ｄｅｌ ＡＡＴＴ（図８では「ｄｅｌＡＡＴＴ」と称される）；６５２０１７６３ Ｇ＞Ｔ；６５２０２０５３ Ｇ＞Ａ；６５２０２１３１ ｄｅｌＴ；６５２０２７８３ Ｔ＞Ａ；６５２０３８２３ Ｃ＞Ｔ；６５２０３９２１ Ｃ＞Ａ；６５２０４７３１ Ｃ＞Ｔ；６５２０５４４５ Ｔ＞Ｃ；６５２０５７７０ Ｔ＞Ａ；６５２０７５６３ ｄｅｌＡ；６５２１０１３９ ｄｅｌ１１；及び６５２１０７１１ Ｃ＞Ｔ（図８も参照されたい）。
【0082】
特定の実施形態では、本発明の方法はまた、生物学的試料中のＤＮＡ分子のテロメア長を決定するステップと、生物学的試料中のＤＮＡ分子のテロメア長を、正常な肝細胞から得られたＤＮＡ分子のテロメア長と比較するステップと、を含み得る。以前の報告は、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤなどの慢性肝疾患がテロメア短縮に関連することを示唆している（Ｗｉｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢＪ，２００２，１６，９３５－４２）。すなわち、罹患肝細胞において、テロメア長は、非罹患肝細胞におけるテロメア長よりも短いことが多い。したがって、対象から得られた生物学的試料中のＤＮＡ分子のテロメア長は、対象におけるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤの更なる指標、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＦＬＤを発症するリスクの増加の更なる指標、対象がより重症型の肝疾患を発症するリスクの増加の更なる指標、及び／又は対象が関連する疾患若しくは状態を発症するリスクの増加の更なる指標として使用され得る。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、
ｃ）生物学的試料中のＤＮＡ分子のテロメア長を決定するステップと、
ｄ）生物学的試料中のＤＮＡ分子のテロメア長を、正常な肝細胞（例えば、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患していない対象から、又は健康な対象の肝臓の領域から得られた肝細胞）から得られたＤＮＡ分子の平均テロメア長と比較するステップと、を更に含み得る。典型的には、ＤＮＡ分子は、同じ対象由来の正常な肝細胞から、又はＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患していない年齢が一致した対象由来の正常な肝細胞から得られる。ある特定の例示的な実施形態では、本方法は、
ｃ）生物学的試料中のＤＮＡ分子の平均テロメア長を決定するステップと、
ｄ）生物学的試料中のＤＮＡ分子の平均テロメア長を、正常な肝細胞から得られたＤＮＡ分子の平均テロメア長と比較するステップと、を更に含み得る。本明細書で使用される場合、「平均テロメア長」という用語は、所与の試料において測定されたテロメアの平均長である。平均テロメア長は、所与の試料についてのテロメア長の平均値、中央値又は最頻値であり得る。典型的には、平均テロメア長は、所与の試料についてのテロメア長の平均値である。あるいは、平均テロメア長は、所定の試料中のクローンについてのテロメア長の平均値、中央値又は最頻値であり得る。
ｃ）生物学的試料中のＤＮＡ分子のテロメア長を決定するステップと、
ｄ）生物学的試料中のＤＮＡ分子のテロメア長を、正常な肝細胞（例えば、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患していない対象から、又は健康な対象の肝臓の領域から得られた肝細胞）から得られたＤＮＡ分子の平均テロメア長と比較するステップと、を更に含み得る。典型的には、ＤＮＡ分子は、同じ対象由来の正常な肝細胞から、又はＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患していない年齢が一致した対象由来の正常な肝細胞から得られる。ある特定の例示的な実施形態では、本方法は、
ｃ）生物学的試料中のＤＮＡ分子の平均テロメア長を決定するステップと、
ｄ）生物学的試料中のＤＮＡ分子の平均テロメア長を、正常な肝細胞から得られたＤＮＡ分子の平均テロメア長と比較するステップと、を更に含み得る。本明細書で使用される場合、「平均テロメア長」という用語は、所与の試料において測定されたテロメアの平均長である。平均テロメア長は、所与の試料についてのテロメア長の平均値、中央値又は最頻値であり得る。典型的には、平均テロメア長は、所与の試料についてのテロメア長の平均値である。あるいは、平均テロメア長は、所定の試料中のクローンについてのテロメア長の平均値、中央値又は最頻値であり得る。
【0083】
対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを診断又は予後診断する場合、追加のリスク因子も考慮され得る。更なる危険因子としては、典型的には、年齢、メタボリックシンドロームの存在、性別、民族、食事因子、喫煙状態（例えば、現在の喫煙者又は以前の喫煙者）、閉塞性睡眠時無呼吸、肥満、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（例えば、高コレステロール血症）及び心血管疾患が挙げられる。体細胞突然変異に加えて遺伝因子（例えば、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂ、並びにＣＬＣＮ５及びＮＥＡＴ１遺伝子内の体細胞突然変異）もまた、本発明の方法において考慮され得る。例えば、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子における生殖系列多型は、ＮＡＦＬＤに対する遺伝的リスクを増加させることが知られており（Ｓｏｏｋｏｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００９；５０：２１１１－６）、したがって考慮されてもよい。更なる例として、ＦＯＸＯ１及びＧＰＡＭにおける生殖系列多型などの、インスリン抵抗性又は脂質合成に関連する遺伝子における生殖系列多型もまた考慮されてもよい。ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに関連していると推測される生殖系列多型の例は、Ｖａｌｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐｔａｏｌｏｇｙ，２００９，５０，Ｓ２６５、及びＨａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０２１，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．３２０３８に記載されている。
【0084】
例示的な実施形態では、本発明の方法は、対象の１つ以上の肝細胞に選択された利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異の存在及び／又はレベル（例えば、コピー数）に基づいて、更に、対象の肝細胞の１つ以上の更なる遺伝的及び／又は物理的特徴、例えば、以下の特徴：
対象の肝細胞における突然変異シグネチャーの存在及び／又は発生；
ＣＬＣＮ５遺伝子における体細胞突然変異の存在及び／又はレベル（例えば、コピー数）；
非コード体細胞突然変異、例えば、ＮＥＡＴ１遺伝子における非コード体細胞突然変異の存在及び／又はレベル（例えば、コピー数）；
肝生検試料中の肝細胞に選択的利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異を保有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質が由来する肝生検試料のサイズ及び／又は割合；
対象由来の１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡのテロメア長；及び／又は
年齢、メタボリックシンドロームの存在、性別、民族、食事要因、喫煙状態（例えば、現在の喫煙者又は以前の喫煙者）、閉塞性睡眠時無呼吸、肥満、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（例えば、高コレステロール血症）及び心血管疾患などの対象の更なる危険因子、のうちの１つ以上に基づいて、スコアを計算することを含むステップｃ）を更に含み得る。
対象の肝細胞における突然変異シグネチャーの存在及び／又は発生；
ＣＬＣＮ５遺伝子における体細胞突然変異の存在及び／又はレベル（例えば、コピー数）；
非コード体細胞突然変異、例えば、ＮＥＡＴ１遺伝子における非コード体細胞突然変異の存在及び／又はレベル（例えば、コピー数）；
肝生検試料中の肝細胞に選択的利点を付与する１つ以上の体細胞突然変異を保有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質が由来する肝生検試料のサイズ及び／又は割合；
対象由来の１つ以上の肝細胞に由来するＤＮＡのテロメア長；及び／又は
年齢、メタボリックシンドロームの存在、性別、民族、食事要因、喫煙状態（例えば、現在の喫煙者又は以前の喫煙者）、閉塞性睡眠時無呼吸、肥満、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（例えば、高コレステロール血症）及び心血管疾患などの対象の更なる危険因子、のうちの１つ以上に基づいて、スコアを計算することを含むステップｃ）を更に含み得る。
【0085】
対象の１つ以上の肝細胞における体細胞突然変異の存在及び／又はレベル（例えば、コピー数）、並びに上述の遺伝的及び／又は物理的特徴のうちの１つ以上に基づくスコアの計算は、好適な疾患モニタリングプログラム、好適な治療を決定する際に臨床医に更なるガイダンスを提供するか、又は対象が寛解していることを臨床医に知らせ得る。
【0086】
対象におけるＮＡＬＦＬＤ又はＡＲＬＤ進行をモニタリングする方法：
本発明はまた、疾患モニタリングの増加から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法であって、上記のステップａ）及びｂ）を含む、方法を提供する。対象のモニタリングの増加は、循環肝酵素レベルをモニタリングするためのコンピュータ断層撮影（computerized tomography、ＣＴ）スキャン及び／又は血液検査などのＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに適したモニタリング技術を使用して、定期的な間隔（例えば、毎年１回、６ヶ月に１回又は３ヶ月に１回）で対象をモニタリングすることを含み得る。
本発明はまた、疾患モニタリングの増加から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法であって、上記のステップａ）及びｂ）を含む、方法を提供する。対象のモニタリングの増加は、循環肝酵素レベルをモニタリングするためのコンピュータ断層撮影（computerized tomography、ＣＴ）スキャン及び／又は血液検査などのＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに適したモニタリング技術を使用して、定期的な間隔（例えば、毎年１回、６ヶ月に１回又は３ヶ月に１回）で対象をモニタリングすることを含み得る。
【0087】
本明細書に記載される診断及び予後診断方法はまた、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの発症又は進行をモニタリングするために使用され得る。例えば、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤのモニタリングは、本明細書に記載の方法のステップａ）及びｂ）を数日、数週間、数ヶ月又は数年の間隔で繰り返すことによって達成され得る。本明細書に記載の診断方法及び予後診断方法は、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクのある対象のモニタリング、より重症型の肝疾患を発症するリスクのある対象のモニタリング、肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクのある対象のモニタリング、及び／又はＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤの治療を受けている対象におけるＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤのモニタリングに特に適している。例示的な実施形態では、本明細書に記載の診断方法又は予後診断方法のステップａ）及びｂ）は、毎週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、毎月１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、又は６ヶ月ごとに１回実施される。特定の例示的な実施形態では、ステップａ）及びｂ）は、２年に１回、毎年１回、毎年２回、又は毎年３回の間隔で繰り返される。例えば、ステップａ）及びｂ）は、２年に１回、毎年１回、毎年２回、又は毎年３回、１～５年、１～１０年、１～２０年、１～３０年、若しくは１～４０年間にわたって繰り返され得る。
【0088】
ＮＡＬＦＬＤ又はＡＲＬＤを診断又は予後判定するためのインビボ方法：
本発明はまた、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを診断又は予後判定するための方法であって、
ａ）ある用量の診断プローブを対象に投与するステップと、
ｂ）対象において診断プローブを検出するステップであって、当該診断プローブが、対象の肝臓におけるＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の体細胞突然変異の存在及び／又は非存在を示し、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子内の体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＦＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は消化管がんなどの肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、ステップと、を含む方法を提供する。
本発明はまた、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを診断又は予後判定するための方法であって、
ａ）ある用量の診断プローブを対象に投与するステップと、
ｂ）対象において診断プローブを検出するステップであって、当該診断プローブが、対象の肝臓におけるＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の体細胞突然変異の存在及び／又は非存在を示し、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子内の体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＦＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は消化管がんなどの肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、ステップと、を含む方法を提供する。
【0089】
本発明はまた、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤを診断又は予後判定するための方法であって、
－対象は、診断プローブが投与された対象であり、
－当該方法は、対象において診断プローブを検出するステップを含み、診断プローブは、対象の肝臓におけるＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の存在又は非存在を示すものであり、
１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は消化管がんなどの肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、方法を提供する。
－対象は、診断プローブが投与された対象であり、
－当該方法は、対象において診断プローブを検出するステップを含み、診断プローブは、対象の肝臓におけるＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の存在又は非存在を示すものであり、
１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は消化管がんなどの肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、方法を提供する。
【0090】
本発明はまた、対象におけるＮＡＬＦＬＤ又はＡＲＬＤの診断又は予後判定において使用するための診断プローブであって、当該使用が、
ａ）ある用量の診断プローブを対象に投与することと、
ｂ）対象において診断プローブを検出することであって、当該診断プローブが、対象の肝臓におけるＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の存在及び／又は非存在を示し、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は消化管がんなどの肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出することと、を含む、方法を提供する。
ａ）ある用量の診断プローブを対象に投与することと、
ｂ）対象において診断プローブを検出することであって、当該診断プローブが、対象の肝臓におけるＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の存在及び／又は非存在を示し、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象がＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤに罹患しているか、ＮＡＦＬＤ若しくはＡＲＬＤを発症するリスクがあるか、より重症型の肝疾患を発症するリスクがあるか、及び／又は消化管がんなどの肝疾患に関連する疾患若しくは状態を発症するリスクがあることを示す、検出することと、を含む、方法を提供する。
【0091】
本明細書に記載のＮＡＬＦＬＤ又はＡＲＬＤを診断又は予後判定するためのインビボ方法における使用に適した診断プローブには、１つ以上の体細胞突然変異を含むＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ若しくはＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子に特異的に結合するか、又は１つ以上の体細胞突然変異を含むそれぞれの遺伝子によってコードされるＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ若しくはＴＮＲＣ６Ｂタンパクに特異的に結合する、小分子、ペプチド（環状ペプチドを含む）、タンパク、核酸（例えば、アンチセンスヌクレオチド配列；三重らせん；ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ；及び生物学的に活性なタンパク、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチド）、合成又は天然無機分子、及び合成又は天然有機分子が含まれるが、これらに限定されない。このような予後診断プローブは、対象におけるＮＡＬＦＬＤの画像化及び／又は診断若しくは予後判定に適した「標識」を含み得る。好適な標識としては、例えば、放射性同位体、放射性核種、同位体、陽電子放射体、ガンマ放射体、蛍光基、発光基、発色基、ビオチン（例えば、ストレプトアビジン複合体化と組み合わせて）又は光親和性基が挙げられる。選択される標識のタイプは、所望の検出方法に依存する。ある特定の実施形態では、ＮＡＦＬＤの診断又は予後判定に使用するための診断プローブは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization、ＦＩＳＨ）に適した蛍光標識を含む。
【0092】
誤解を避けるために、本明細書に記載のインビボ方法は、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の検出を可能にし、当該少なくとも１つ以上の体細胞突然変異が対象の肝細胞に選択的利点を付与する診断プローブの使用を含み得る。
【0093】
治療に適したＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤ患者の選択：
本発明はまた、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、
ａ１）対象から得られた生物学的試料を提供するステップと、
ｂ１）生物学的試料中のＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ、及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するステップであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象が、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る対象であることを示す、ステップと、を含む。
本発明はまた、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、
ａ１）対象から得られた生物学的試料を提供するステップと、
ｂ１）生物学的試料中のＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ、及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するステップであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象が、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る対象であることを示す、ステップと、を含む。
【0094】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＦＯＸＯ１又はＧＰＡＭ活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤに罹患している対象を同定するための方法に関する。実施形態では、本方法は、
ａ１）対象から得られた生物学的試料を提供するステップと、
ｂ１）生物学的試料中のＦＯＸＯ１及び／又はＧＰＡＭ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するステップであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象が、ＦＯＸＯ１又はＧＰＡＭ活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る対象であることを示す、ステップと、を含む。
ａ１）対象から得られた生物学的試料を提供するステップと、
ｂ１）生物学的試料中のＦＯＸＯ１及び／又はＧＰＡＭ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するステップであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象が、ＦＯＸＯ１又はＧＰＡＭ活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る対象であることを示す、ステップと、を含む。
【0095】
ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質の活性を阻害及び／又は調節するために使用され得る好適な治療剤としては、小分子、ペプチド（環状ペプチドを含む）、タンパク質、核酸（例えば、アンチセンスヌクレオチド配列；三重らせん；ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ；及び生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチド）、合成又は天然無機分子、合成又は天然有機分子、及びＣＲＩＳＰＲ（すなわち、クラスタリングされた規則的な間隔の短い回文配列リピート）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、治療剤は、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質に結合し、その活性を阻害する有機小分子化合物であってもよく、又は例えば、治療剤は、１つ以上の体細胞突然変異を含むＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質の発現をノックダウンするｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであってもよい。
【0096】
ＦＯＸＯ１タンパクの活性を阻害及び／又は調節する好適な治療剤の具体例としては、ＡＳ１８４２８５６とも呼ばれる５－アミノ－７－（シクロヘキシルアミノ）－ｌ－エチル－６－フルオロ－４－オキソ－ｌ，４－ジヒドロキノリン－３－カルボン酸（参照により本明細書に組み込まれる欧州特許出願公開第１６５０１９２（Ａ１）号及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１０ ７８（５）９６１－９７０を参照されたい）、及び２－［２－（メチルアミノ）ピリミジン－４－イル］－ｌ，５，６，７－テトラヒドロピロロ［３，２－ｃ］ピリジン－４－オン（すなわち、Ｌａｎｇｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２０１７の化合物８）などのＬａｎｇｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれるＣｅｌｌ，２０１７，１７１，８２４－８３５）に開示された化合物が挙げられる。
【0097】
本発明における使用に適した治療剤の更なる例は、ＧＰＡＭタンパクの小分子阻害剤であるＦＳＧ６７である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｙｄｙｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００９，２８；５２（１０）：３３１７－２７及びＫｕｈａｊｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１；３０１（１）：Ｒ１１６－３０）。
【0098】
本発明はまた、ＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤの治療において使用するための治療剤であって、当該使用が、
ａ２）対象から得られた生物学的試料を提供するステップと、
ｂ２）生物学的試料中のＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するステップであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象が、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る対象であることを示す、ステップと、
ｃ２）ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質活性を阻害又は調節する治療剤の１以上の用量を対象に投与するステップと、を含む、治療剤を提供する。
ａ２）対象から得られた生物学的試料を提供するステップと、
ｂ２）生物学的試料中のＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するステップであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象が、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る対象であることを示す、ステップと、
ｃ２）ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質活性を阻害又は調節する治療剤の１以上の用量を対象に投与するステップと、を含む、治療剤を提供する。
【0099】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＮＡＦＬＤの治療において使用するための治療剤であって、当該使用が、
ａ２）対象から得られた生物学的試料を提供するステップと、
ｂ２）生物学的試料中のＦＯＸＯ１及び／又はＧＰＡＭ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するステップであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象が、ＦＯＸＯ１又はＧＰＡＭタンパク質活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る対象であることを示す、ステップと、
ｃ２）ＦＯＸＯ１又はＧＰＡＭ活性を阻害又は調節する治療剤の１以上の用量を対象に投与するステップと、を含む、治療剤を提供する。
ａ２）対象から得られた生物学的試料を提供するステップと、
ｂ２）生物学的試料中のＦＯＸＯ１及び／又はＧＰＡＭ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するステップであって、１つ以上の体細胞突然変異の存在は、対象が、ＦＯＸＯ１又はＧＰＡＭタンパク質活性を阻害又は調節する治療剤による治療から利益を得る対象であることを示す、ステップと、
ｃ２）ＦＯＸＯ１又はＧＰＡＭ活性を阻害又は調節する治療剤の１以上の用量を対象に投与するステップと、を含む、治療剤を提供する。
【0100】
誤解を避けるために、本明細書に記載されるステップａ１）、ｂ１）、ａ２）及びｂ２）は、独立して、本明細書の上記に記載される本発明によるＮＡＦＬＤ（又はＡＲＬＤ）を診断又は予後判定するための方法のステップａ）及びｂ）について本明細書に記載される特徴及びステップのうちのいずれかを含み得る。また、誤解を避けるために、本明細書に記載される方法のステップｂ２）は、対象の１つ以上の肝細胞に選択的利点を付与するＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出することを含み得る。
【0101】
誤解を避けるために、本明細書で使用される場合、「体細胞突然変異」という用語は、「１つ以上の体細胞突然変異」という用語を含むことが理解されるべきである。例えば、「体細胞突然変異」という用語は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上の体細胞突然変異を指し得る。本明細書における「ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子」への任意の言及は、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子のうちの１つ以上の選択を含むことも理解されるべきである。すなわち、本発明の方法は、例えば、ＦＯＸＯ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異、ＧＰＡＭ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異、ＣＩＤＥＢ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異、ＦＯＸＯ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異、ＡＣＶＲ２Ａ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異、ＡＬＢ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異、及び／又はＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異の検出を含み得る。
【0102】
キット：
本発明はまた、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤ（又はＡＦＬＤ）の診断又は予後診断に使用するためのインビトロ診断キットであって、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するための１つ以上の試薬を含み、任意選択的にＣＬＣＮ５遺伝子及び／又はＮＥＡＴ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するための１つ以上の試薬を含む、インビトロ診断キットを提供する。
本発明はまた、対象におけるＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤ（又はＡＦＬＤ）の診断又は予後診断に使用するためのインビトロ診断キットであって、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するための１つ以上の試薬を含み、任意選択的にＣＬＣＮ５遺伝子及び／又はＮＥＡＴ１遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するための１つ以上の試薬を含む、インビトロ診断キットを提供する。
【0103】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象におけるＮＡＦＬＤの診断又は予後診断に使用するためのインビトロ診断キットであって、ＦＯＸＯ１及び／又はＧＰＡＭ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するための１つ以上の試薬を含み、任意選択的にＣＬＣＮ５遺伝子及び／又はＡＣＶＲ２Ａ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出するための１つ以上の試薬を含む、インビトロ診断キットに関する。
【0104】
任意選択的に、キットは、テロメア長を測定するのに有用な１つ以上の試薬を含み得る。
【0105】
「キット」という用語は、本発明の１つ以上のバイオマーカーを特異的に検出するための少なくとも１つの試薬、例えばプローブ又は小分子を含む任意の製品（例えばパッケージ又は容器）を指す。キットは、本発明の方法を実行するためのユニットとして販売促進、流通、又は販売され得る。
【0106】
キットは、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及びＴＮＲＣ６Ｂからなる群から選択される遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出及び／又は定量するのに必要な１つ以上の試薬を含んでもよい。本発明のキットはまた、ＣＬＣＮ５遺伝子及び／又はＡＣＶＲ２Ａ遺伝子内の１つ以上の体細胞突然変異を検出及び／又は定量するための１つ以上の試薬を任意選択的に含んでもよい。試薬の特定の例としては、ＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子配列の一部分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。このようなオリゴヌクレオチドの設計は、当業者の能力の範囲内である。好適には、そのようなオリゴヌクレオチドは、１つ以上の体細胞突然変異を含むＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子配列を増幅、定量又は配列決定するために使用され得る。
【0107】
ある特定の実施形態では、キットは、１つ以上の突然変異アミノ酸を含むＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパクに結合する結合タンパクを含んでもよい。好適な結合タンパク質には、１つ以上の突然変異アミノ酸を含むＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質に特異的に結合するポリクロナール又はモノクロナール抗体が含まれる。好適には、そのような結合タンパク質は、生物学的試料中の１以上の突然変異を含むＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ又はＴＮＲＣ６Ｂタンパク質のレベルを定量するための方法において使用され得る。
【0108】
ある特定の実施形態では、キットは、１つ以上の参照標準、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を更に含み得る。このような参照標準は、例えば、１つ以上の体細胞突然変異を含まないＦＯＸＯ１、ＧＰＡＭ、ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ及び／若しくはＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子又はタンパク質、例えば、「野生型ＦＯＸＯ１」及び「野生型ＧＰＡＭ」遺伝子又はタンパク質、並びに例えば、野生型ＣＩＤＥＢ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＬＢ若しくはＴＮＲＣ６Ｂタンパク質又は遺伝子に対応する核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であってもよい。キットは、一般的な分子タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質及びベータ－ガラクトシダーゼ）を含んでもよい。キット中の試薬は、個々の容器中に、又は単一容器中の２つ以上の試薬の混合物として提供されてもよい。更に、キット内の成分の使用を記載する説明資料を含めることができる。説明資料はまた、結果の解釈、例えば、肯定的な所見を構成するために特定の分析物のどのレベルをとるべきかについてのガイダンスを提供し得る。
【0109】
キットはまた、キットが設計される特定の用途を容易にするための追加の成分を含んでもよい。例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルタセット、ヒツジ抗マウスＨＲＰなどの適切な二次標識など）及び対照に必要な試薬（例えば、対照生物学的試料又は標準）を更に含んでもよい。キットは更に、ヘルスケア環境において開示される本発明の方法において使用するために必要なグレードの緩衝液及び他の試薬を含み得る。非限定的な例としては、担体タンパク質又は界面活性剤などの非特異的結合を減少させる薬剤が挙げられる。
【0110】
等価物：
本発明は、本明細書において広く包括的に記載されている。当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料及び構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料及び／又は構成が、本発明の教示が使用される特定の１つ若しくは複数の用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、日常的な実験のみを使用して認識するか、又は確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は、例としてのみ提示されており、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内では、本発明は、具体的に記載及び特許請求される以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載の各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、そのような特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせが、本発明の範囲内に含まれる。
本発明は、本明細書において広く包括的に記載されている。当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料及び構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料及び／又は構成が、本発明の教示が使用される特定の１つ若しくは複数の用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、日常的な実験のみを使用して認識するか、又は確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は、例としてのみ提示されており、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内では、本発明は、具体的に記載及び特許請求される以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載の各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、そのような特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせが、本発明の範囲内に含まれる。
【0111】
更に、一般的な開示内に含まれるより狭い種群及び亜群の各々も、本発明の一部を形成する。これは、除外されるものが本明細書に具体的に記載されているかどうかにかかわらず、属から任意の主題を除外する条件又は否定的限定（negative limitation）下で、本発明の一般的な説明を含む。
【0112】
参照による組み込み：
論文、特許及び特許出願、並びに本明細書で言及又は引用される他の文書及び電子利用可能な情報の内容は、各個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度まで、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。出願人は、そのような論文、特許、特許出願、又は他の紙（physical）文書及び電子文書からの任意及び全ての材料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を保有する。
論文、特許及び特許出願、並びに本明細書で言及又は引用される他の文書及び電子利用可能な情報の内容は、各個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度まで、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。出願人は、そのような論文、特許、特許出願、又は他の紙（physical）文書及び電子文書からの任意及び全ての材料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を保有する。
【0113】
ここで、以下の実施例を参照することにより、本発明を非限定的に説明する。
【実施例】
【0114】
材料及び方法
肝臓試料：
全ての生物学的試料は、Ｌｏｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（１６／ＮＩ／０１９６）によって承認された手順に従って、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）からインフォームドコンセントを得て収集した。試料を液体窒素中で急速凍結し、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ ＮＨＳ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｔｒｕｓｔにおいて－８０℃で保存した。
肝臓試料：
全ての生物学的試料は、Ｌｏｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（１６／ＮＩ／０１９６）によって承認された手順に従って、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）からインフォームドコンセントを得て収集した。試料を液体窒素中で急速凍結し、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ ＮＨＳ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｔｒｕｓｔにおいて－８０℃で保存した。
【0115】
結腸直腸がん転移の肝臓切除を受けている患者から正常な肝臓組織を得た。転移から離れた標本を得て、組織病理学的検査で腫瘍がないことを確認した。１人の患者（ＰＤ３６７１８）は、同側の肝臓への術前門脈塞栓術を受けたが、切除の前にネオアジュバント化学療法を受けた者はいなかった。バックグラウンド疾患肝組織は、肝細胞がん（ＨＣＣ）のための肝臓切除、又はＨＣＣ若しくは肝不全のための肝移植のいずれかを受けている、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又はアルコール関連肝疾患（ＡＲＬＤ）を有する対象から得た。経動脈化学塞栓術による単回治療を受けた１人の患者（ＰＤ３７１１８）を除いて、術前局所領域療法を受けた者はいなかった。ＰＮＰＬＡ３（ｒｓ７３８４０９）多型遺伝子型は、全ゲノム配列決定データに由来した。
【0116】
全ての肝臓標本を、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションに使用された新鮮凍結ブロックから離れたホルマリン固定パラフィン包埋（formalin-fixed paraffin-embedded、ＦＦＰＥ）試料について、Ｋｌｅｉｎｅｒシステム（Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００５；４１（６）：１３１３－１３２１）に従って採点した。ＮＡＦＬＤ用に開発されたＫｌｅｉｎｅｒスコアは、脂肪症、小葉炎症及び肝細胞バルーニングの存在を評価して、累積ＮＡＦＬＤ活動性スコア（NAFLD activity score、ＮＡＳ）を生成する。これを、ＡＲＬＤについて検証されたスコアリングシステムの非存在下で、正常試料及びＡＲＬＤ試料に適用して、疾患のステージ及びグレードに関して研究の全ての試料間の比較可能性を可能にした。細胞性又は結節性異形成の存在又は非存在を、臨床ＦＦＰＥ試料において全体的に、並びに特に、レーザーキャプチャーマイクロセクション（laser capture microsection、ＬＣＭ）及び配列決定に使用した新鮮凍結ブロックにおいて評価した。
【0117】
試料調製：
肝生検組織切片の調製、レーザーキャプチャーマイクロセクション（ＬＣＭ）及びその後の細胞溶解、ＤＮＡ抽出、及び全ゲノム配列決定（whole genome sequencing、ＷＧＳ）に使用したプロトコルは、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５７４，５３８－５４２）によって以前に記載されたものに従った。簡潔に述べると、２０μｍ厚の組織切片（Ｌｅｉｃａクリオトームを用いて調製）を７０％エタノールで固定し、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＬＭＤ ７０００を使用するその後のＬＣＭ生成のためにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。次いで、Ａｒｃｔｕｒｕｓ（登録商標）ＰｉｃｏＰｕｒｅ（登録商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の指示に従って使用して、マイクロダイセクションした試料を溶解した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定のためのＤＮＡライブラリーを、ペアエンドＷＧＳへの提出のために低入力量のＤＮＡのために最適化されたプロトコルを使用して調製した。得られたリードを、ＢＷＡ－ＭＥＭアルゴリズム（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１０，２６，５８９－５９５）を使用してＧＲＣｈ３７ｄ５ヒト参照ゲノムにマッピングした。
肝生検組織切片の調製、レーザーキャプチャーマイクロセクション（ＬＣＭ）及びその後の細胞溶解、ＤＮＡ抽出、及び全ゲノム配列決定（whole genome sequencing、ＷＧＳ）に使用したプロトコルは、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５７４，５３８－５４２）によって以前に記載されたものに従った。簡潔に述べると、２０μｍ厚の組織切片（Ｌｅｉｃａクリオトームを用いて調製）を７０％エタノールで固定し、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＬＭＤ ７０００を使用するその後のＬＣＭ生成のためにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。次いで、Ａｒｃｔｕｒｕｓ（登録商標）ＰｉｃｏＰｕｒｅ（登録商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の指示に従って使用して、マイクロダイセクションした試料を溶解した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定のためのＤＮＡライブラリーを、ペアエンドＷＧＳへの提出のために低入力量のＤＮＡのために最適化されたプロトコルを使用して調製した。得られたリードを、ＢＷＡ－ＭＥＭアルゴリズム（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１０，２６，５８９－５９５）を使用してＧＲＣｈ３７ｄ５ヒト参照ゲノムにマッピングした。
【0118】
この研究で使用されたデータセットは、５人の正常肝臓対照、アルコール関連肝疾患（ＡＲＬＤ）を有する１０人及びＮＡＦＬＤを有する１７人を含む、３２個の肝臓試料からの１２０２個のゲノムを含んだ。これらの試料のうちの９つは、同期性ＨＣＣ及び根底にある肝硬変を有する患者からのものであった。５年の期間にわたってＮＡＦＬＤを有する１人の患者からの３つの肝切除試料（試料ＰＤ３７９１８ｂ、ＰＤ３７９１５ｂ及びＰＤ３７９１０ｂ）を含む、更なる８つの試料が、根底に肝硬変を有しないＨＣＣを有していた。患者の臨床的及び組織学的特徴は、根底にある疾患プロセスについて予想された分布を示した。
【0119】
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、肝臓試料からの全ゲノム配列決定のために１００～５００個の肝細胞の連続群を単離した。マイクロダイセクションを３１×の平均深度まで配列決定した。体細胞置換及び構造バリアントを、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）によって記載された方法に従ってコールしたが、インデルコールの特徴付け及び精度を改善するために勾配ブースティング回帰木を使用した。体細胞突然変異の完全なカタログを用いて、系統樹構造、クローンサイズ、ドライバー突然変異、テロメア長及び突然変異シグネチャーを推測した。
【0120】
ＳＮＶコーリング：
この研究で使用されたＳＮＶコーリングワークフローのいくつかのステップは、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１９）によって以前に記載された。基本的なＳＮＶ同定は、一塩基置換（single base substitution、ＳＢＳ）バリアントをコールするために、期待値最大化（ＣａＶＥＭａｎ）アルゴリズム（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５６，１５．１０．１－１５．１０．１８（２０１６））を通してＣａｎｃｅｒ Ｖａｒｉａｎｔｓを使用し、患者ごとのバルク生検を適合正常対照とした。８つの解剖学的肝臓セグメントから生検された２人のＮＡＦＬＤ患者について、突然変異をコールするために、甲状腺濾胞ＬＣＭ試料を不適合対照として使用した。二次十字形ＤＮＡ構造の不正確なプロセシングから生じる重複リード及びＬＣＭライブラリー調製特異的人為的変異体を、特注のプロセシング後フィルタリングで除去した。後者のフィルタリングステップは、少なくとも２つの配列決定されたＤＮＡ断片を支持する全ての変異体を考慮するように構成された。現在の研究では、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１９）に記載されているエントロピーメトリックベースのバリアントフィルタリングステップを、Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７８，２６６－２７２（２０２０））によって記載されているようなベータ二項ベースのフィルタリング手法で置き換えたが、これは、真正の体細胞突然変異が典型的には過剰分散している（すなわち、各患者に属するゲノムのセット中の限られた数のゲノムのみに存在する）一方で、系統的アーチファクト又は生殖系列バリアントは一般に分散不足であり、同じ患者の生検からのマイクロダイセクションに由来する全てではないが多くのゲノムにわたって観察可能であるという原理に基づいている。この研究において、各ＳＮＶについての突然変異保有及び総リードの数は、患者特異的に全てのマイクロダイセクションにわたってコールされたＳＮＶ当たりの各塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）についての生の対立遺伝子カウントを列挙することによって計算され、ここで、≧０．１の分散推定値を有する突然変異は、真の体細胞バリアントである可能性が高いと考えられた。有効性を保証するために、ゲノムブラウザを使用して最終ＳＮＶコールのサブセットの手動検査を実行した。更なるチェックは、組織学画像によって捕捉されるような空間的に近接するマイクロダイセクションが、（すなわち、同じ組織切片上のｘ－ｙ空間に関して同じ近傍内、同じ肝硬変結節内、又は異なるｚ平面からの組織切片上の重複するｘ－ｙ位置に）共通の突然変異を共有することをチェックすることを含んでいた。
この研究で使用されたＳＮＶコーリングワークフローのいくつかのステップは、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１９）によって以前に記載された。基本的なＳＮＶ同定は、一塩基置換（single base substitution、ＳＢＳ）バリアントをコールするために、期待値最大化（ＣａＶＥＭａｎ）アルゴリズム（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５６，１５．１０．１－１５．１０．１８（２０１６））を通してＣａｎｃｅｒ Ｖａｒｉａｎｔｓを使用し、患者ごとのバルク生検を適合正常対照とした。８つの解剖学的肝臓セグメントから生検された２人のＮＡＦＬＤ患者について、突然変異をコールするために、甲状腺濾胞ＬＣＭ試料を不適合対照として使用した。二次十字形ＤＮＡ構造の不正確なプロセシングから生じる重複リード及びＬＣＭライブラリー調製特異的人為的変異体を、特注のプロセシング後フィルタリングで除去した。後者のフィルタリングステップは、少なくとも２つの配列決定されたＤＮＡ断片を支持する全ての変異体を考慮するように構成された。現在の研究では、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１９）に記載されているエントロピーメトリックベースのバリアントフィルタリングステップを、Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７８，２６６－２７２（２０２０））によって記載されているようなベータ二項ベースのフィルタリング手法で置き換えたが、これは、真正の体細胞突然変異が典型的には過剰分散している（すなわち、各患者に属するゲノムのセット中の限られた数のゲノムのみに存在する）一方で、系統的アーチファクト又は生殖系列バリアントは一般に分散不足であり、同じ患者の生検からのマイクロダイセクションに由来する全てではないが多くのゲノムにわたって観察可能であるという原理に基づいている。この研究において、各ＳＮＶについての突然変異保有及び総リードの数は、患者特異的に全てのマイクロダイセクションにわたってコールされたＳＮＶ当たりの各塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）についての生の対立遺伝子カウントを列挙することによって計算され、ここで、≧０．１の分散推定値を有する突然変異は、真の体細胞バリアントである可能性が高いと考えられた。有効性を保証するために、ゲノムブラウザを使用して最終ＳＮＶコールのサブセットの手動検査を実行した。更なるチェックは、組織学画像によって捕捉されるような空間的に近接するマイクロダイセクションが、（すなわち、同じ組織切片上のｘ－ｙ空間に関して同じ近傍内、同じ肝硬変結節内、又は異なるｚ平面からの組織切片上の重複するｘ－ｙ位置に）共通の突然変異を共有することをチェックすることを含んでいた。
【0121】
ＳＮＶクラスターを同定するために階層ディリクレ過程を使用する：
ノンパラメトリックベイズ階層ディリクレ過程（hierarchical Dirichlet process、ＨＤＰ）を実施して、各患者生検について複数のマイクロダイセクションにわたってコールされた類似のバリアント対立遺伝子画分（ＶＡＦ）を有するＳＮＶをクラスタリングした。クラスタリングアルゴリズムの完全な数学的及び実施の詳細は、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１９）に記載されている。このＮ次元ディリクレ過程（N-dimensional Dirichlet process、ＮＤＰ）クラスタリング手法は、１０，０００回のバーンイン反復と、それに続くクラスタリングに使用された５，０００回の事後ギブスサンプリング反復とを用いて実行された。このクラスのアルゴリズムは、見つけるクラスターの数を任意に予め指定する必要がないので、ＳＮＶクラスターの同定のために選択された。代わりに、各サンプリング反復において、前の反復において存在しなかった新しいクラスターに突然変異が割り当てられることになる定義された確率が存在する。他方、クラスターはまた、全てのメンバー突然変異が他のクラスターに割り当てられる場合、将来の反復において除去することもできる。このようにして、ＳＮＶクラスターの数は、サンプリングチェーン全体にわたって変化することが許容される。多数のクラスターからなる過度に複雑な解決策（これは、情報価値のないクラスターを作製する可能性を増加させる）を避けるために、患者当たり１００個のＳＮＶクラスターという上限を課した。ラベル．スイッチングＲパッケージ（Ｐａｐａｓｔａｍｏｕｌｉｓ，Ｐ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ６９，（２０１５））から補正されたＥＣＲアルゴリズムのマルチスレッドバージョンを、迅速なラベルスイッチング補正のために使用した。最低５０個のユニークな突然変異を含むＳＮＶクラスターのみを下流分析のために保持した。このアルゴリズムへの入力は、マイクロダイセクションごとの各コールされたバリアントのカバレッジ及びカウントからなる患者ごとのデータ表を含んでいた。
ノンパラメトリックベイズ階層ディリクレ過程（hierarchical Dirichlet process、ＨＤＰ）を実施して、各患者生検について複数のマイクロダイセクションにわたってコールされた類似のバリアント対立遺伝子画分（ＶＡＦ）を有するＳＮＶをクラスタリングした。クラスタリングアルゴリズムの完全な数学的及び実施の詳細は、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１９）に記載されている。このＮ次元ディリクレ過程（N-dimensional Dirichlet process、ＮＤＰ）クラスタリング手法は、１０，０００回のバーンイン反復と、それに続くクラスタリングに使用された５，０００回の事後ギブスサンプリング反復とを用いて実行された。このクラスのアルゴリズムは、見つけるクラスターの数を任意に予め指定する必要がないので、ＳＮＶクラスターの同定のために選択された。代わりに、各サンプリング反復において、前の反復において存在しなかった新しいクラスターに突然変異が割り当てられることになる定義された確率が存在する。他方、クラスターはまた、全てのメンバー突然変異が他のクラスターに割り当てられる場合、将来の反復において除去することもできる。このようにして、ＳＮＶクラスターの数は、サンプリングチェーン全体にわたって変化することが許容される。多数のクラスターからなる過度に複雑な解決策（これは、情報価値のないクラスターを作製する可能性を増加させる）を避けるために、患者当たり１００個のＳＮＶクラスターという上限を課した。ラベル．スイッチングＲパッケージ（Ｐａｐａｓｔａｍｏｕｌｉｓ，Ｐ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ６９，（２０１５））から補正されたＥＣＲアルゴリズムのマルチスレッドバージョンを、迅速なラベルスイッチング補正のために使用した。最低５０個のユニークな突然変異を含むＳＮＶクラスターのみを下流分析のために保持した。このアルゴリズムへの入力は、マイクロダイセクションごとの各コールされたバリアントのカバレッジ及びカウントからなる患者ごとのデータ表を含んでいた。
【0122】
３２人の患者のうち１１人（３４．３％）に及ぶ少数のクラスター（９６６人のうち１３人、１．３４％）は、分割不足であることが見出され、いかなる突然変異も共有しないマイクロダイセクションからなっていた。このような問題のあるマイクロダイセクションを分離して、更なる独立したクラスターを形成した。対応する組織学画像の詳細な検査によって、患者特異的な配列決定された材料の各セットについて、空間的に隣接又は近接するマイクロダイセクションのクラスタリングを検証した。
【0123】
クラスタリングアルゴリズムは、設計によって試料にわたるＶＡＦの類似性に基づいて各突然変異を１つのクラスターに割り当てるので、ＦＯＸＯ１ホットスポット突然変異は、患者生検のいくつかのマイクロダイセクションにおいて起こり得る複数の独立した獲得事象の可能性を説明するために、最小数のクラスターに手動で再割り当てされた。具体的には、倹約的ホットスポット再割り当ては、ホットスポットを保有するマイクロダイセクション（及びそれらがメンバーであるＳＮＶクラスター）を最初に同定することを必要とした。次に、最も系統発生的に親のクラスターの最小サブセットが同定され（系統樹の推論のための方法を参照のこと）、ここで、各々は、ホットスポットについての支持の少なくとも１つの生のリードを有する最大数のメンバーマイクロダイセクションを有し、その結果、全てのホットスポット保有マイクロダイセクションを説明した。重要なことに、いくつかのホットスポット保有マイクロダイセクションは、複数のクラスターのメンバーであったが、ホットスポットは、このような場合に最大数のホットスポット含有切断を有するクラスターにのみ割り当てられた。少数の症例について、候補ホットスポット保有クラスターのいくつかのメンバー切断は、低いカバレッジに起因してホットスポット突然変異のいかなる証拠も有しなかった。これらの場合、組織学画像をチェックして、問題の切断の空間的位置決めが、同じクラスター内のホットスポット保有切断に対して近位であるか遠位であるかを決定した。これらの候補切断がホットスポットを保有する可能性の更なる支持として、真正ホットスポット含有切断との突然変異の共有を評価した。
【0124】
系統樹の推論：
Ｎｉｋ－Ｚａｉｎａｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｉｋ－Ｚａｉｎａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ２１ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃｅｌｌ １４９，９９４－１００７（２０１２））を適用して、ＮＤＰアルゴリズムによって同定された患者ごとのＳＮＶクラスター間の系統発生的クローン関係を推測した。ここで、各クラスターは系統樹の枝として表される。所与のクラスターは、突然変異のクラスターを保有する細胞の割合が、同じマイクロダイセクション内の突然変異の別のクラスターを含有する細胞の割合と比較して、全てのメンバーのマイクロダイセクションにおいてより低く、それらのそれぞれの突然変異細胞分画（cell fraction、ＣＦ）の合計もまた１００％超である場合、別のクラスター内にネスティングされている（すなわち、サブクローン関係）強い証拠を有すると見なされる。そうでなければ、ペアワイズ突然変異体ＣＦの合計が１００％以下である場合、ネスティングの弱い証拠のみが存在する。いくつかのマイクロダイセクションのみが、別のものと比較して、所与のＳＮＶクラスターのより低いＣＦを有する場合、クラスターは、独立しており、かつ互いにネスティングされていないと解釈される。本研究では、突然変異体ＣＦが０．０５超であるクラスターのみを分析し、一方、各ＳＮＶクラスターのＣＦは、各マイクロダイセクションについてのＶＡＦの中央値の２倍として計算し、これは二倍性を仮定する。
Ｎｉｋ－Ｚａｉｎａｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｉｋ－Ｚａｉｎａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ２１ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃｅｌｌ １４９，９９４－１００７（２０１２））を適用して、ＮＤＰアルゴリズムによって同定された患者ごとのＳＮＶクラスター間の系統発生的クローン関係を推測した。ここで、各クラスターは系統樹の枝として表される。所与のクラスターは、突然変異のクラスターを保有する細胞の割合が、同じマイクロダイセクション内の突然変異の別のクラスターを含有する細胞の割合と比較して、全てのメンバーのマイクロダイセクションにおいてより低く、それらのそれぞれの突然変異細胞分画（cell fraction、ＣＦ）の合計もまた１００％超である場合、別のクラスター内にネスティングされている（すなわち、サブクローン関係）強い証拠を有すると見なされる。そうでなければ、ペアワイズ突然変異体ＣＦの合計が１００％以下である場合、ネスティングの弱い証拠のみが存在する。いくつかのマイクロダイセクションのみが、別のものと比較して、所与のＳＮＶクラスターのより低いＣＦを有する場合、クラスターは、独立しており、かつ互いにネスティングされていないと解釈される。本研究では、突然変異体ＣＦが０．０５超であるクラスターのみを分析し、一方、各ＳＮＶクラスターのＣＦは、各マイクロダイセクションについてのＶＡＦの中央値の２倍として計算し、これは二倍性を仮定する。
【0125】
同じクラスターの他のメンバー切断といかなる突然変異も共有しないマイクロダイセクションを含有する問題のあるＳＮＶクラスターを、新しい独立したクラスターに分割し、鳩の巣原理を使用して同じ患者生検内の全ての他のクラスターとの系統発生的関連性について個々に再評価した。
【0126】
選択下での突然変異の同定：
任意のコード突然変異が非腫瘍性慢性肝疾患組織において選択下にあるかどうかを決定するために、遺伝子、タンパク質ドメイン、コドン及びホットスポットのレベルについてｄＮ／ＤＳｃｖ法（Ｍａｒｔｉｎｃｏｒｅｎａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７１，１０２９－１０４１．ｅ２１（２０１７））を使用して、同義突然変異獲得率から予測される数と比較してより多い数の非同義突然変異を有する遺伝子を同定した。この分析のために、全てのＳＮＶクラスターのセットにわたる固有の突然変異を入力として使用し、一方、０．０５未満の多重仮説検定について補正されたｑ値を有する突然変異を選択下にあると見なした。選択下にあり得る非コード突然変異の同定のために、ＮＢＲアルゴリズムを使用した（Ｒｈｅｉｎｂａｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５７８，１０２－１１１（２０２０））。
任意のコード突然変異が非腫瘍性慢性肝疾患組織において選択下にあるかどうかを決定するために、遺伝子、タンパク質ドメイン、コドン及びホットスポットのレベルについてｄＮ／ＤＳｃｖ法（Ｍａｒｔｉｎｃｏｒｅｎａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７１，１０２９－１０４１．ｅ２１（２０１７））を使用して、同義突然変異獲得率から予測される数と比較してより多い数の非同義突然変異を有する遺伝子を同定した。この分析のために、全てのＳＮＶクラスターのセットにわたる固有の突然変異を入力として使用し、一方、０．０５未満の多重仮説検定について補正されたｑ値を有する突然変異を選択下にあると見なした。選択下にあり得る非コード突然変異の同定のために、ＮＢＲアルゴリズムを使用した（Ｒｈｅｉｎｂａｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５７８，１０２－１１１（２０２０））。
【0127】
インデルコーリング：
以前に記載されたＢｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１９）のように、ｃｇｐＰｉｎｄｅｌを用いてインデルコーリングを実行した（Ｒａｉｎｅ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ５２，１５．７．１－１５．７．１２（２０１５））。ナイーブベイズアルゴリズムを使用して、各コールされたインデルを、ＮＤＰアルゴリズムを使用して同定されたＳＮＶクラスターに割り当てた。ＳＮＶコーリング中に行ったように、ベータ二項過剰分散フィルタを、各患者生検から作製された一連のマイクロダイセクションにわたる各コールされたインデルの生カウントに適用して、アーチファクトを更にフィルタリング除去し、ここで、０．１以上の過剰分散値及び０．０２５以上のＶＡＦを有するバリアントは、真である可能性が高いと考えられた。
以前に記載されたＢｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１９）のように、ｃｇｐＰｉｎｄｅｌを用いてインデルコーリングを実行した（Ｒａｉｎｅ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ５２，１５．７．１－１５．７．１２（２０１５））。ナイーブベイズアルゴリズムを使用して、各コールされたインデルを、ＮＤＰアルゴリズムを使用して同定されたＳＮＶクラスターに割り当てた。ＳＮＶコーリング中に行ったように、ベータ二項過剰分散フィルタを、各患者生検から作製された一連のマイクロダイセクションにわたる各コールされたインデルの生カウントに適用して、アーチファクトを更にフィルタリング除去し、ここで、０．１以上の過剰分散値及び０．０２５以上のＶＡＦを有するバリアントは、真である可能性が高いと考えられた。
【0128】
真正物のインデルの特徴のより良い理解を得るために、患者当たりの近接したマイクロダイセクション間で共有されるインデルのグラウンドトゥルースセットを、研究コホートに対応する組織学画像のセットの詳細なレビューを通して最初に同定した。次に、ホモポリマーの数、インデルが反復ＨＧ１９領域で発生したかどうか、ベータ二項フィルタからの分散推定値、及び様々なｃｇｐＰｉｎｄｅｌ ＶＣＦフィールド（すなわち、曖昧なリード及び未知のリードを除外するＶＡＦ、ＱＵＡＬ－アンカーリードのマッピング品質の合計を示す、カバレッジ、ｃｏｖｅｒａｇｅ＿ａｌｔ：バリアントサポートリードの数、ＰｉｎｄｅｌからのＳＩスコア、ＬＥＮ－塩基対におけるバリアント長、ＲＥＰ：反復の数、ＮＢ－Ｔｕｍ：標的試料において同様のインデル事象を示すマイナス鎖に対して一次アライナーによってマッピングされたリードの数、ＮＤ：標的試料におけるインデルを伴う又は伴わない一次アライナーからのマイナス鎖マッピングリードの数、ＮＰ－Ｔｕｍ：標的試料におけるマイナス鎖に対してＰｉｎｄｅｌによってマッピングされたリードの数、ＮＲ－Ｔｕｍ：ＮＰ－Ｔｕｍ及びＮＤ－Ｔｕｍの固有の和集合、ＮＵ－Ｔｕｍ：ＮＰ－Ｔｕｍ及びＮＢ－Ｔｕｍの固有の和集合、ＰＢ－Ｔｕｍ：標的試料における類似のインデル事象を示すプラス鎖に対して一次アライナーによってマッピングされたリードの数、ＰＤ－Ｔｕｍ：標的試料におけるインデルを伴う又は伴わない一次アライナーからのプラス鎖マッピングリードの数、ＰＰ－Ｔｕｍ：標的試料におけるプラス鎖に対してＰｉｎｄｅｌによってマッピングされたリードの数、ＰＲ－Ｔｕｍ：ＰＰ－Ｔｕｍ及びＰＤ－Ｔｕｍの固有の和集合、ＰＵ－Ｔｕｍ：ＰＰ－Ｔｕｍ及びＰＢ－Ｔｕｍの固有の和集合、ＡＭＢ－Ｔｕｍ：標的試料において同じ特異性を有する両方の対立遺伝子上にマッピングしている曖昧なリード、ＵＮＫ－Ｔｕｍ：バリアント位置にミスマッチを含み、最初のヒットとして参照にアラインしない未知のリード、ＶＴ：挿入又は欠失のいずれかのバリアント型）を含むインデルのいくつかの特徴を、統計モデリングのために考慮した。
【0129】
真のセットにおける可能性が高い実際のインデルの典型的な属性を解明するために、これらのパラメータを、ＲにおけるＸＧＢｏｏｓｔアルゴリズムへの入力として使用して（Ｃｈｅｎ，Ｔ．＆Ｇｕｅｓｔｒｉｎ，Ｃ．ＸＧＢｏｏｓｔ：Ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｔｒｅｅ Ｂｏｏｓｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，ｄｌ．ａｃｍ．ｏｒｇ，７８５－７９４（ＡＣＭ，２０１６）．ｄｏｉ：１０．１１４５／２９３９６７２．２９３９７８５）を使用して、一連の１，０００個の勾配ブースティング回帰木（分類及び回帰木（classification and regression tree、ＣＡＲＴ）としても知られる）を構築した。最小グリッド探索ベースの手法を使用して手動ハイパーパラメータ調整を実行して、学習率（∈）０．００３、リープノードパーティショニングのための最小損失低減（γ）２０、回帰木を学習するための訓練データにおけるインデルの６０％及び共変量の８０％のサブサンプリング率、並びに最大木深度３に到達した。更に、モデル学習を実行しつつ、バイナリロジスティック目的関数を最適化し、Ｌ２正則化係数（λ）及びバイアスを０．５に設定し、一つ抜き交差検証（leave-one-out-cross-validation）を可能にし、かつモデル訓練メトリックを設定して、受信者動作曲線下面積（area under the receiver operator curve、ＡＵＲＯＣ）を評価した。他の全てのハイパーパラメータは、ソフトウェアドキュメンテーションに従ってデフォルト値又は推奨値に設定した。モデル訓練プロセスの終わりに、バイナリアンサンブル分類器が構築され、そこでは、各々が低い予測力を有する多数の浅い回帰木からのスコアが組み合わされて、高い予測力を与える。いわゆるアンサンブルブースティングフレームワークでは、回帰木のセットは、ロジスティック損失関数が最小化されるように従属変数に直接適合するように訓練された最初の木（ｔ＝０）を用いて加法的に訓練され（この場合、インデルが患者固有の真理セットの特徴に類似する特徴を有するか否かである）、一方、後続の木は、前の反復（ｔ－１）まで学習された全体モデルの残差に適合するように訓練される。次いで、各インデルについて、回帰木基本学習器からの一連のスコアを重み付けして組み合わせて、所与のインデルが真のバリアント又は人為的バリアントである可能性が高いかどうかの確率を表す最終スコアに到達した。０．７超のモデルスコアを使用して、ありそうな実際のインデルを同定した。回帰木アンサンブルモデルの予測精度は、モデル予測されたインデルとグラウンドトゥルースインデルとのセット間の比較から得られるＡＵＲＯＣを評価することによって、患者ごとに評価した。
【0130】
ブースティング回帰フォレストモデルでは、Ｎ個の木（インデルの予測特徴をモデルスコアにマッピングする基本学習器関数ｆｔ（ｘｉ）は、予測因子及び従属変数対を含む訓練データセットから学習され
【0131】
【数1】
【0132】
【数2】
【0133】
【数3】
【0134】
ここで∈は学習率であり、これは、訓練データへの過剰適合から保護するために、全体モデルスコアに対する各木の寄与をスケーリングする。
【0135】
ブースティング回帰フォレストを構築するために、逐次木構造学習の加法プロセスが採用され、ここでｆｔ（ｘｉ）は、以下の目的関数を最小化する各訓練反復において学習される。
【0136】
【数4】
Ｏｂｊ（ｔ）は、回帰木ｔについて最適化される目的関数であり、
ｆｔ（ｘｉ）は、特徴値ｘｉ，のスコアを評価する回帰木ｔを示し、
ｇｉは、前の反復からのモデルスコアに関する損失関数の一次導関数であり
【0137】
【数5】
【0138】
【数6】
Ω（ｆｔ）は、Ｔ個の葉と葉ノードｊに割り当てられたインデルのスコアのベクトルωｊのＬ２ノルムの関数として定義される回帰木ｔの複雑さを記述する正則化項である。
【0139】
あり得る実際のインデル又は人為的なインデルの二項分類が目的であったので、この研究ではロジスティック損失関数を使用した。ロジスティック損失を近似するために、二次テイラー展開を使用する。したがって、各訓練反復は、ｇｉ及びｈｉの計算から開始する。
【0140】
【数7】
【0141】
【数8】
【0142】
【数9】
【0143】
【数10】
【0144】
【数11】
【0145】
［１０］を［７］に代入すると、所与の木構造の最適性の尺度として目的関数値ｏｂｊ＊が与えられ、ここで、より低い値がより好ましい。
【0146】
【数12】
【0147】
任意の所与の木について無数の可能なノード構成が存在することが多いので、最適値を有する木構造を見つけるために、全ての可能な木構造についてｏｂｊ＊を計算することは実際的ではない。代わりに、貪欲法を採用して、深度０の最小木から開始して、一度に一分岐ずつ木を成長させた。次いで、成長中の回帰木ｔ内の各葉ノードについて、以下の利得メトリックを計算し、これは、各新しい分割が導入された後の目的関数値の変化を評価する。このようにして、利得が最大になるように木を成長させた。
【0148】
【数13】
【0149】
ここで
【0150】
【数14】
【0151】
【数15】
これらの３つの括弧内の項はともに、訓練損失低減を表す。最後に＼ｇａｍｍａは、新しい分割を導入するときに木構造に複雑さを追加するコストを考慮する正則化項を表す。更に＼ｇａｍｍａはまた、所与の回帰木の所与の葉ノードを分割するために必要な損失低減の最小量としても機能し、ここで、より大きい値は、新たな分岐点の追加がより少ない木をもたらすことになる。これは、以下の条件がより頻繁に真になるためである。
【0152】
【数16】
【0153】
グラウンドトゥルースセットが、カバレッジが低い遺伝子座に真に存在する近接して共有されるインデル、又は特定のマイクロダイセクションに対してプライベートであるインデルを捕捉しないことは注目に値する。このカテゴリーにおけるインデルは、グラウンドトゥルースバリアントに類似する属性を有することが多いことが見出され、したがって、高いモデルスコアを有し、これは、ゲノムブラウザを使用する手動レビューを通して実際的である可能性が高いことが検証された。
【0154】
各モデル特徴の重要性は、シャープレイ（Ｓｈａｐｌｅｙ）値を使用して評価された。シャープレイ値は、ゲーム理論に根ざした概念であり、複数の寄与者から所与の結果への寄与を、証明可能なほど公平に決定するための方法を提供する（Ｓｈａｐｌｅｙ，Ｌ．Ｓ．１７．Ａ Ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｎ－Ｐｅｒｓｏｎ Ｇａｍｅｓ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｇａｍｅｓ（ＡＭ－２８），Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ ３０７－３１８（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１６）．ｄｏｉ：１０．１５１５／９７８１４００８８１９７０－０１８／ｈｔｍｌ及びＬｕｎｄｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．＆Ｌｅｅ，Ｓ．－Ｌ Ａ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ．４７６５－４７７４（２０１７）を参照されたい）。数値は、評価されている特徴を除いて、特徴グループ化の全ての可能な順列を一緒に説明するモデルのセットにわたる所与の予測特徴を有する及び有しないモデルスコアの差の加重平均に基づいて計算した。したがって、特徴のシャープレイ値は、モデルスコア全体に対するその特徴の値の平均寄与（効果）を表し、これは以下のように計算した。
【0155】
【数17】
φｉ（ｐ）は、モデル予測ｐについての特徴ｉのシャープレイ値であり、
Ｓ⊆Ｎ／ｉは、特徴ｉを除く、特徴グループ化の全ての可能なセット（Ｓ）を表し、
｜Ｓ｜！は、セットＳ内の特徴の順列の数を表し、
（ｎ－｜Ｓ｜－１）！は、考慮されるｎ個の特徴の合計のうちセットＳにない特徴の順列の数を表し、
ｐ（Ｓ∪ｉ）は、特徴ｉを有するモデル予測ｐであり、
ｐ（Ｓ）は、特徴ｉのないモデル予測ｐである。
【0156】
回帰フォレストの場合、所与の予測特徴のシャープレイ値は、構成要素木のアンサンブルにおけるその特徴に対応するシャープレイ値の加重和であった。ここで、特に回帰木ベースのモデルのために設計されたＳＨＡＰ（ＳＨａｐｌｅｙ Ａｄｄｉｔｉｖｅ ｅｘＰｌａｎａｔｉｏｎｓ）実装が使用され、これは、アンサンブル内の各回帰木に存在する特徴のサブセットに基づいてシャープレイ値をより迅速に計算する（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ＆Ｌｅｅ，２０１７）。所与のインデルが実際的である可能性が高いか、人為的である可能性が高いかの特定の予測について、全体モデルスコアを、各予測特徴のシャープレイ値（予測への寄与）と訓練データから計算されたベースライン（平均）モデルスコアとの和として分解した。インデルが実際的である可能性が高いか人為的である可能性が高いかを高度に予測する特徴の存在又は非存在は、モデルスコアの大きな変化をもたらす。そのような影響力のある特徴の高い値は、スコアに正又は負のいずれかで寄与し、典型的には０より大きい又は小さいシャープレイ値と関連し、それぞれ真又は偽のインデルの形質に対応する。逆に、全体モデルスコアに対する無視できる影響を有する特徴は、ほぼ０のシャープレイ値を有する。
【0157】
構造バリアントコーリング：
大きなゲノムセグメントに影響を及ぼす欠失、逆位、縦列重複、及び転座を含む構造バリアント（Structural variant、ＳＶ）が、ＢＲＡＳＳ（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｖｉａ ａｓｓｅｍｂｌｙ）アルゴリズムを使用してコールされた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４０，７２２－７２９（２００８））（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃａｎｃｅｒｉｔ／ＢＲＡＳＳ）。次に、３段階プロセスを使用して、ＢＲＡＳＳと呼ばれる可能性のある人為的なＳＶをフィルタリングして除去した。第一に、各マイクロダイセクションにおいて検出されたＳＶ事象を、対応する正常バルク対照試料のパネルに存在するものと比較することに基づいて、ＬＣＭライブラリー調製プロトコルによって導入された人為的変異体を同定し、除去するカスタムパイプラインを開発した。第二に、全ての残りのＳＶの詳細な手動レビューを、ゲノムブラウザ及びバリアントアノテーションを使用して行った。最後に、ＳＮＶ及びインデルが供されたサニティチェックと同様に、各ＳＶの存在を、可能であれば近接するマイクロダイセクション間でチェックした。ここで、実際のバリアントは、このような切断クラスターによって共有されることが予想される。
大きなゲノムセグメントに影響を及ぼす欠失、逆位、縦列重複、及び転座を含む構造バリアント（Structural variant、ＳＶ）が、ＢＲＡＳＳ（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｖｉａ ａｓｓｅｍｂｌｙ）アルゴリズムを使用してコールされた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４０，７２２－７２９（２００８））（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃａｎｃｅｒｉｔ／ＢＲＡＳＳ）。次に、３段階プロセスを使用して、ＢＲＡＳＳと呼ばれる可能性のある人為的なＳＶをフィルタリングして除去した。第一に、各マイクロダイセクションにおいて検出されたＳＶ事象を、対応する正常バルク対照試料のパネルに存在するものと比較することに基づいて、ＬＣＭライブラリー調製プロトコルによって導入された人為的変異体を同定し、除去するカスタムパイプラインを開発した。第二に、全ての残りのＳＶの詳細な手動レビューを、ゲノムブラウザ及びバリアントアノテーションを使用して行った。最後に、ＳＮＶ及びインデルが供されたサニティチェックと同様に、各ＳＶの存在を、可能であれば近接するマイクロダイセクション間でチェックした。ここで、実際のバリアントは、このような切断クラスターによって共有されることが予想される。
【0158】
より複雑なゲノム再配置事象、例えばクロモスリプシス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ１４４，２７－４０（２０１１））（１つ以上の染色体が数千もの断片に粉砕され、続いて無秩序に融合して戻される）を、ＳＶの最終セットの詳細な手動レビューを通して更に同定した。
【0159】
クローン面積の計算：
１，２０２個のマイクロダイセクションの正確な空間位置を、ＬＭＤ７レーザーマイクロダイセクション内蔵カメラを用いて撮影した一連の顕微鏡画像において捕捉した。各切断の外縁のデカルト座標を、画像処理ＭＡＴＬＡＢツールボックスからのエッジ関数において実施されるようなＣａｎｎｙ法（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｋ．ｍａｔｈｗｏｒｋｓ．ｃｏｍ／ｍａｔｌａｂｃｅｎｔｒａｌ／ｆｉｌｅｅｘｃｈａｎｇｅ／４６８５９－ｃａｎｎｙ－ｅｄｇｅ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を使用して抽出した。これにより、マイクロダイセクションごとにｘ－ｙ座標のセットが得られ、それぞれのＷＧＳプロファイルに対応するように手動でアノテーションした。次に、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）クラスターを、各クラスターに割り当てられた突然変異を有するそれらのそれぞれのメンバーのマイクロダイセクションの同定から開始して、個々にプロセシングした。各ＳＮＶクラスターについて、突然変異体ＣＦ（すなわち、２×ＶＡＦ中央値）を使用して、組織切片画像上の各メンバー切断のｘ－ｙ座標を調整して、遺伝子クローンサイズをより正確に反映させた。続いて、得られた多角形を、対応するクローン領域を表す単一の実体にマージする前に、所与のＳＮＶクラスターの各メンバーマイクロダイセクションの調整された空間座標を包含するように、最小楕円凸包を描いた。画素からミクロンへの変換を適用して単位を平方ミクロンに変換する前に、クローン面積を最初に平方画素に関して計算した。このために、倍率変換係数は、組織切片の高解像度走査組織学画像の上に重ねられたスケールインジケータの画像を最初に生成することによって計算した。これは、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＰｈｏｔｏｎｉｃｓからのＮＤＰ．ｖｉｅｗ２ ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙスライドスキャナ画像ビューイングソフトウェアを使用して行った。次いで、スケールインジケータ画像を、ｍａｇｉｃｋ画像処理パッケージ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｍａｇｉｃｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用してＲ統計プログラミング環境にロードして、各組織切片画像についてミリメートル当たりの正確なピクセル数を決定した。この研究では、ＶＡＦ＞０．０５の突然変異に寄与したマイクロダイセクションのみをクローンサイズ計算に含めた。
１，２０２個のマイクロダイセクションの正確な空間位置を、ＬＭＤ７レーザーマイクロダイセクション内蔵カメラを用いて撮影した一連の顕微鏡画像において捕捉した。各切断の外縁のデカルト座標を、画像処理ＭＡＴＬＡＢツールボックスからのエッジ関数において実施されるようなＣａｎｎｙ法（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｋ．ｍａｔｈｗｏｒｋｓ．ｃｏｍ／ｍａｔｌａｂｃｅｎｔｒａｌ／ｆｉｌｅｅｘｃｈａｎｇｅ／４６８５９－ｃａｎｎｙ－ｅｄｇｅ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を使用して抽出した。これにより、マイクロダイセクションごとにｘ－ｙ座標のセットが得られ、それぞれのＷＧＳプロファイルに対応するように手動でアノテーションした。次に、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）クラスターを、各クラスターに割り当てられた突然変異を有するそれらのそれぞれのメンバーのマイクロダイセクションの同定から開始して、個々にプロセシングした。各ＳＮＶクラスターについて、突然変異体ＣＦ（すなわち、２×ＶＡＦ中央値）を使用して、組織切片画像上の各メンバー切断のｘ－ｙ座標を調整して、遺伝子クローンサイズをより正確に反映させた。続いて、得られた多角形を、対応するクローン領域を表す単一の実体にマージする前に、所与のＳＮＶクラスターの各メンバーマイクロダイセクションの調整された空間座標を包含するように、最小楕円凸包を描いた。画素からミクロンへの変換を適用して単位を平方ミクロンに変換する前に、クローン面積を最初に平方画素に関して計算した。このために、倍率変換係数は、組織切片の高解像度走査組織学画像の上に重ねられたスケールインジケータの画像を最初に生成することによって計算した。これは、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＰｈｏｔｏｎｉｃｓからのＮＤＰ．ｖｉｅｗ２ ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙスライドスキャナ画像ビューイングソフトウェアを使用して行った。次いで、スケールインジケータ画像を、ｍａｇｉｃｋ画像処理パッケージ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｍａｇｉｃｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用してＲ統計プログラミング環境にロードして、各組織切片画像についてミリメートル当たりの正確なピクセル数を決定した。この研究では、ＶＡＦ＞０．０５の突然変異に寄与したマイクロダイセクションのみをクローンサイズ計算に含めた。
【0160】
対立遺伝子及びインデルのカウント
各塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の生対立遺伝子カウント及びフィルタリングされていないリードの総カバレッジを、最小マッピング及び塩基品質をそれぞれ３０及び２５に設定しながら、ＳＢＳ型バリアントのためのａｌｌｅｌｅＣｏｕｎｔソフトウェアを使用して列挙して、ベータ二項ベースのフィルタのための入力を生成した（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｉｔ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ａｌｌｅｌｅＣｏｕｎｔ／）。ＮＤＰクラスタリングへの入力及びインデルのカウントのために、ｃｇｐＶＡＦソフトウェアを使用した（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃａｎｃｅｒｉｔ／ｖａｆＣｏｒｒｅｃｔ）。
各塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の生対立遺伝子カウント及びフィルタリングされていないリードの総カバレッジを、最小マッピング及び塩基品質をそれぞれ３０及び２５に設定しながら、ＳＢＳ型バリアントのためのａｌｌｅｌｅＣｏｕｎｔソフトウェアを使用して列挙して、ベータ二項ベースのフィルタのための入力を生成した（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｉｔ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ａｌｌｅｌｅＣｏｕｎｔ／）。ＮＤＰクラスタリングへの入力及びインデルのカウントのために、ｃｇｐＶＡＦソフトウェアを使用した（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃａｎｃｅｒｉｔ／ｖａｆＣｏｒｒｅｃｔ）。
【0161】
対立遺伝子カウンターソフトウェアを使用して、ＬＣＭマイクロダイセクション及びバルク対照試料の両方のｂａｍファイルから直接、各塩基のフィルタリングされていない生のカウント数を決定した。ＦＯＸＯ１ Ｓ２２Ｗホットスポットドライバー突然変異を保有することが見出された各患者についてのこれらのカウントデータから積み重ねられたバープロットを作成して、クローン及びバルク対照（利用可能な場合）にわたるその分布を可視化した。
【0162】
クローンサイズの比較：
クローン面積（ｐｍ２）を、この研究において見出されたドライバー突然変異を保有する肝細胞と保有しない肝細胞との間で比較した。具体的には、各ドナー由来の変異クローンの数の間のクローン面積（クローンの変異数によって重み付けされた）を、対応する各ドナーから無作為に選択された野生型クローンの同等数と比較することができるように、各ドライバー突然変異について、ドライバー突然変異についてのクローン野生型を、変異を有する各ドナーから均一かつ無作為にサンプリングした。ｇｇｓｔａｔｓｐｌｏｔ Ｒパッケージを使用してクローン面積の比較を行い、ｐ値に対する多重仮説検定補正のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を適用し、ノンパラメトリック対比較のためのデフォルトＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用した（Ｐａｔｉｌ，Ｉ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ６，１－５（２０２１））。
クローン面積（ｐｍ２）を、この研究において見出されたドライバー突然変異を保有する肝細胞と保有しない肝細胞との間で比較した。具体的には、各ドナー由来の変異クローンの数の間のクローン面積（クローンの変異数によって重み付けされた）を、対応する各ドナーから無作為に選択された野生型クローンの同等数と比較することができるように、各ドライバー突然変異について、ドライバー突然変異についてのクローン野生型を、変異を有する各ドナーから均一かつ無作為にサンプリングした。ｇｇｓｔａｔｓｐｌｏｔ Ｒパッケージを使用してクローン面積の比較を行い、ｐ値に対する多重仮説検定補正のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を適用し、ノンパラメトリック対比較のためのデフォルトＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用した（Ｐａｔｉｌ，Ｉ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ６，１－５（２０２１））。
【0163】
肝臓質量推定：
この研究において同定されたドライバー突然変異の各々を保有する肝細胞のグラム数の計算において、いくつかの仮定を行った：（１）試料を構成する大多数の細胞種は肝細胞であり（Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１８，２０９６－２１１２（２０１９））、ここで、ドライバー突然変異は二倍体ゲノム領域において生じ、したがって、突然変異体肝細胞画分＝２×ドライバー対立遺伝子頻度である；（２）各ＬＣＭマイクロダイセクションは、１００～５００個の肝細胞を含むと推定され、（３）典型的な１．５ｋｇのヒト肝臓１ｇ当たり１．１６×１０８個の肝細胞が存在する（Ｌｉｐｓｃｏｍｂ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５２，３７６－３８７（１９９８）及びＳｏｈｌｅｎｉｕｓ－Ｓｔｅｒｎｂｅｃｋ，Ａ．－Ｋ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ２０，１５８２－１５８６（２００６）を参照されたい）。本発明者らの研究における各ドナーについて、突然変異した肝細胞の肝臓全体の質量（グラム）を、最初に組織学画像を使用して全ての配列決定されたＬＣＭ解剖の面積（ピクセル）を計算することによって、各ドライバー突然変異について推測した。各切断が１００～５００個の肝細胞を含むと推定されたので、Ｒ ｌｉｎＭａｐ関数を使用して線形適合を実行して、この範囲内の全てのＬＣＭ切断面積をマッピングし、各ＬＣＭ切断を構成する肝細胞の数を効果的に推定した。次いで、各ドライバー突然変異のバリアント対立遺伝子頻度を使用して、各ＬＣＭ切断における変異体保有細胞の割合を推測した。次に、各ドライバーを含有するドナー当たりの配列決定された材料の割合を、全てのドナー特異的配列決定ＬＣＭ切断からの推定値を合計することによって計算した。次いで、これらのドナーレベル推定値を使用して、典型的なヒト肝臓における肝細胞の推定数に基づいて各ドライバーを保有する肝細胞の割合を概算した。次いで、これらの値を最終的に使用して、典型的なヒト肝臓の重量が１．５ｋｇであると仮定して、各ドナーについて各ドライバーを含有する肝臓のグラム数を推定した。
この研究において同定されたドライバー突然変異の各々を保有する肝細胞のグラム数の計算において、いくつかの仮定を行った：（１）試料を構成する大多数の細胞種は肝細胞であり（Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１８，２０９６－２１１２（２０１９））、ここで、ドライバー突然変異は二倍体ゲノム領域において生じ、したがって、突然変異体肝細胞画分＝２×ドライバー対立遺伝子頻度である；（２）各ＬＣＭマイクロダイセクションは、１００～５００個の肝細胞を含むと推定され、（３）典型的な１．５ｋｇのヒト肝臓１ｇ当たり１．１６×１０８個の肝細胞が存在する（Ｌｉｐｓｃｏｍｂ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５２，３７６－３８７（１９９８）及びＳｏｈｌｅｎｉｕｓ－Ｓｔｅｒｎｂｅｃｋ，Ａ．－Ｋ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ２０，１５８２－１５８６（２００６）を参照されたい）。本発明者らの研究における各ドナーについて、突然変異した肝細胞の肝臓全体の質量（グラム）を、最初に組織学画像を使用して全ての配列決定されたＬＣＭ解剖の面積（ピクセル）を計算することによって、各ドライバー突然変異について推測した。各切断が１００～５００個の肝細胞を含むと推定されたので、Ｒ ｌｉｎＭａｐ関数を使用して線形適合を実行して、この範囲内の全てのＬＣＭ切断面積をマッピングし、各ＬＣＭ切断を構成する肝細胞の数を効果的に推定した。次いで、各ドライバー突然変異のバリアント対立遺伝子頻度を使用して、各ＬＣＭ切断における変異体保有細胞の割合を推測した。次に、各ドライバーを含有するドナー当たりの配列決定された材料の割合を、全てのドナー特異的配列決定ＬＣＭ切断からの推定値を合計することによって計算した。次いで、これらのドナーレベル推定値を使用して、典型的なヒト肝臓における肝細胞の推定数に基づいて各ドライバーを保有する肝細胞の割合を概算した。次いで、これらの値を最終的に使用して、典型的なヒト肝臓の重量が１．５ｋｇであると仮定して、各ドナーについて各ドライバーを含有する肝臓のグラム数を推定した。
【0164】
突然変異シグネチャーの抽出にＨＤＰを使用する：
ＨＤＰアルゴリズムは、ＨＤＰ Ｒパッケージ（ｈｔｔｐｓ：／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｎｉｃｏｌａｒｏｂｅｒｔｓ／ｈｄｐ）を使用して、正常肝臓及び慢性肝疾患試料において同定された１，０１３個のＳＮＶクラスターのそれぞれにおいてコールされたＳＢＳのセットを構成する突然変異シグネチャーを抽出した。アルゴリズムへの入力は、突然変異カテゴリーの各々についてのＳＮＶクラスター当たりの突然変異カウントのマトリックスからなり、これは、この場合、６つのＳＢＳタイプ（Ｃ＞Ａ、Ｃ＞Ｇ、Ｃ＞Ｔ、Ｔ＞Ａ、Ｔ＞Ｃ、Ｔ＞Ｇ）によって定義される１９２個のトリヌクレオチド突然変異コンテキスト（ＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒＭａｔｒｉｘＧｅｎｅｒａｔｏｒソフトウェア（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｅ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０，１－１２（２０１９）を使用して生成された）からなり、各々は、転写及び非転写鎖について、突然変異塩基（３’及び５’）に隣接する塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）の全ての可能な組み合わせによって更に定義された。ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＰＣＡＷＧ）研究からの６５個の以前に同定された１９２個のコンテキストベースの突然変異シグネチャーの参照カタログを、以前の情報として使用した（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７８，９４－１０１（２０２０））。既知の肝臓関連シグネチャーの抽出を容易にするために、肝細胞がん（ＨＣＣ）試料において以前に観察されたシグネチャー（すなわち、ＳＢＳ１、ＳＢＳ３、ＳＢＳ４、ＳＢＳ５、ＳＢＳ６、ＳＢＳ９、ＳＢＳ１２、ＳＢＳ１４、ＳＢＳ１６、ＳＢＳ１７ａ、ＳＢＳ１７ｂ、ＳＢＳ１８、ＳＢＳ１９、ＳＢＳ２２、ＳＢＳ２３、ＳＢＳ２４、ＳＢＳ２６、ＳＢＳ２８、ＳＢＳ２９、ＳＢＳ３０、ＳＢＳ３１、ＳＢＳ３５、ＳＢＳ３７、ＳＢＳ４０）に、分析中に１０００の偽カウントのデフォルト重み付けを割り当てた。残りの先行シグネチャーを、分析においてそれらを完全に除外しないように、１００のより低い重み付けを割り当てた。設計により、ＨＤＰにより、以前の情報として供給された既知のシグネチャーのセットとは異なる新規の突然変異シグネチャーについてのある程度のデノボ発見が可能になる。肝臓関連突然変異シグネチャーの抽出を更に導くために、３１４個のＨＣＣ ＷＧＳプロファイルも分析に含めた。１００，０００回の反復のバーンインを使用し、続いて、５００回の事後ギブスサンプリング反復を５００回の反復間隔で実行し、一方で、クラスター融合対分割の程度（それぞれ、より低い値対より高い値）を制御する濃度パラメータを各反復で合計５回調整し、突然変異が最初にランダムに割り当てられる７０個のクラスターから開始した。独立した事後サンプリングの仮定に違反する可能性を最小限に抑えるために、事後試料の広い収集間隔と組み合わせた長いバーンインが選択された。更に、７０個の初期クラスターを使用して、突然変異の開始分布が６５個全ての以前の参照シグネチャーにわたって広がり、いくつかの追加クラスターを加えて、所与の先行物のセットを超えて新規突然変異シグネチャーの抽出を促進することを確実にした。各反復において、各突然変異は、同じ突然変異カテゴリー、試料、又は親ノードにおいて高い割合の突然変異を有するクラスターに割り当てられる。コサイン類似度が０．９超であるクラスターは、デフォルト設定に従ってマージされ、一方、不確実なクラスターメンバーシップに起因して抽出されたシグネチャーのセットに割り当てられていない残りの突然変異は、結果として生じるモデルによって説明されないデータのパーセンテージを表すために一緒にグループ化される。０．８超のコサイン類似度（ｐｈｉｌｅｎｔｒｏｐｙ Ｒパッケージ（Ｄｒｏｓｔ，Ｈ．－Ｇ．，Ｊ．Ｏｐｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｏｆｔｗ．３，７６５（２０１８））を手動検査とともに使用して、抽出されたシグネチャーのうちのいずれかが既知の先行物のいずれかと一致するかどうかを判定し、わずかに低い類似度閾値を使用して、基準シグネチャーの可能な変動を説明した。摂動（Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）モデル（Ｑｉａｏ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ８，ｅｌ００２８３８（２０１２））として知られる計算デコンボリューション法を使用して、既知のシグネチャーと抽出されたシグネチャーとの間の類似性の二次尺度として、ＨＤＰ抽出シグネチャーのそれぞれを構成するＰＣＡＷＧ突然変異シグネチャーの寄与パーセントを推定した。任意の以前のシグネチャーとの密接な一致を妥当な確実性を伴って割り当てることができない程十分に一意であった抽出シグネチャーは、新規であると見なされた。この分析のために、６つの独立した事後サンプリングチェーンを同時に実行して、全ての突然変異について安定なクラスター割り当てへの収束を測定し、ここで、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００及び６００００００のランダムシードをそれぞれ割り当てた。シグネチャー抽出に使用される濃度パラメータ設定を含む全体的なＨＤＰノード構造を、図１７において概説する。
ＨＤＰアルゴリズムは、ＨＤＰ Ｒパッケージ（ｈｔｔｐｓ：／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｎｉｃｏｌａｒｏｂｅｒｔｓ／ｈｄｐ）を使用して、正常肝臓及び慢性肝疾患試料において同定された１，０１３個のＳＮＶクラスターのそれぞれにおいてコールされたＳＢＳのセットを構成する突然変異シグネチャーを抽出した。アルゴリズムへの入力は、突然変異カテゴリーの各々についてのＳＮＶクラスター当たりの突然変異カウントのマトリックスからなり、これは、この場合、６つのＳＢＳタイプ（Ｃ＞Ａ、Ｃ＞Ｇ、Ｃ＞Ｔ、Ｔ＞Ａ、Ｔ＞Ｃ、Ｔ＞Ｇ）によって定義される１９２個のトリヌクレオチド突然変異コンテキスト（ＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒＭａｔｒｉｘＧｅｎｅｒａｔｏｒソフトウェア（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｅ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０，１－１２（２０１９）を使用して生成された）からなり、各々は、転写及び非転写鎖について、突然変異塩基（３’及び５’）に隣接する塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）の全ての可能な組み合わせによって更に定義された。ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＰＣＡＷＧ）研究からの６５個の以前に同定された１９２個のコンテキストベースの突然変異シグネチャーの参照カタログを、以前の情報として使用した（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７８，９４－１０１（２０２０））。既知の肝臓関連シグネチャーの抽出を容易にするために、肝細胞がん（ＨＣＣ）試料において以前に観察されたシグネチャー（すなわち、ＳＢＳ１、ＳＢＳ３、ＳＢＳ４、ＳＢＳ５、ＳＢＳ６、ＳＢＳ９、ＳＢＳ１２、ＳＢＳ１４、ＳＢＳ１６、ＳＢＳ１７ａ、ＳＢＳ１７ｂ、ＳＢＳ１８、ＳＢＳ１９、ＳＢＳ２２、ＳＢＳ２３、ＳＢＳ２４、ＳＢＳ２６、ＳＢＳ２８、ＳＢＳ２９、ＳＢＳ３０、ＳＢＳ３１、ＳＢＳ３５、ＳＢＳ３７、ＳＢＳ４０）に、分析中に１０００の偽カウントのデフォルト重み付けを割り当てた。残りの先行シグネチャーを、分析においてそれらを完全に除外しないように、１００のより低い重み付けを割り当てた。設計により、ＨＤＰにより、以前の情報として供給された既知のシグネチャーのセットとは異なる新規の突然変異シグネチャーについてのある程度のデノボ発見が可能になる。肝臓関連突然変異シグネチャーの抽出を更に導くために、３１４個のＨＣＣ ＷＧＳプロファイルも分析に含めた。１００，０００回の反復のバーンインを使用し、続いて、５００回の事後ギブスサンプリング反復を５００回の反復間隔で実行し、一方で、クラスター融合対分割の程度（それぞれ、より低い値対より高い値）を制御する濃度パラメータを各反復で合計５回調整し、突然変異が最初にランダムに割り当てられる７０個のクラスターから開始した。独立した事後サンプリングの仮定に違反する可能性を最小限に抑えるために、事後試料の広い収集間隔と組み合わせた長いバーンインが選択された。更に、７０個の初期クラスターを使用して、突然変異の開始分布が６５個全ての以前の参照シグネチャーにわたって広がり、いくつかの追加クラスターを加えて、所与の先行物のセットを超えて新規突然変異シグネチャーの抽出を促進することを確実にした。各反復において、各突然変異は、同じ突然変異カテゴリー、試料、又は親ノードにおいて高い割合の突然変異を有するクラスターに割り当てられる。コサイン類似度が０．９超であるクラスターは、デフォルト設定に従ってマージされ、一方、不確実なクラスターメンバーシップに起因して抽出されたシグネチャーのセットに割り当てられていない残りの突然変異は、結果として生じるモデルによって説明されないデータのパーセンテージを表すために一緒にグループ化される。０．８超のコサイン類似度（ｐｈｉｌｅｎｔｒｏｐｙ Ｒパッケージ（Ｄｒｏｓｔ，Ｈ．－Ｇ．，Ｊ．Ｏｐｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｏｆｔｗ．３，７６５（２０１８））を手動検査とともに使用して、抽出されたシグネチャーのうちのいずれかが既知の先行物のいずれかと一致するかどうかを判定し、わずかに低い類似度閾値を使用して、基準シグネチャーの可能な変動を説明した。摂動（Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）モデル（Ｑｉａｏ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ８，ｅｌ００２８３８（２０１２））として知られる計算デコンボリューション法を使用して、既知のシグネチャーと抽出されたシグネチャーとの間の類似性の二次尺度として、ＨＤＰ抽出シグネチャーのそれぞれを構成するＰＣＡＷＧ突然変異シグネチャーの寄与パーセントを推定した。任意の以前のシグネチャーとの密接な一致を妥当な確実性を伴って割り当てることができない程十分に一意であった抽出シグネチャーは、新規であると見なされた。この分析のために、６つの独立した事後サンプリングチェーンを同時に実行して、全ての突然変異について安定なクラスター割り当てへの収束を測定し、ここで、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００及び６００００００のランダムシードをそれぞれ割り当てた。シグネチャー抽出に使用される濃度パラメータ設定を含む全体的なＨＤＰノード構造を、図１７において概説する。
【0165】
【0166】
患者を、数年間にわたって追跡した。特定の患者については、切除試料を１年間にわたって数回採取した。図１６Ｃは、５年の期間にわたる１人の患者からの３つの肝臓切除試料を示す。各生検における突然変異の更なる詳細を図１６Ｄ、図１６Ｅ及び図１６Ｆに示す。
【0167】
図１６Ｇ、図１６Ｈ及び図１６１には、正常肝細胞、ＡＲＬＤ罹患細胞、ＮＡＦＬＤ罹患細胞の試料における、及び８個全ての解剖学的セグメントがサンプリングされた２人のＮＡＦＬＤ患者におけるシグネチャーの分布が示されている。
【0168】
本発明者らは、１人のＮＡＦＬＤ患者において、シグネチャーは、最初の肝臓切除標本には存在しなかったが、５年の研究にわたって強度が次第に増加したことに注目した（図１６Ｄ～図１６Ｆ）。したがって、このシグネチャーは、肝疾患が進行するにつれて次第により顕著になり、異物代謝障害の悪化に関連している可能性がある。
【0169】
突然変異シグネチャーの抽出にＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒを使用する：
ＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒＥｘｔｒａｃｔｏｒ ｐｙｔｈｏｎパッケージ（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７８，９４－１０１（２０２０））（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＡｌｅｘａｎｄｒｏｖＬａｂ／ＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒＥｘｔｒａｃｔｏｒ）は、非負行列因子分解アルゴリズムに基づき、突然変異シグネチャー同定のための代替手段として役立った。アルゴリズムは、１５個の突然変異シグネチャーを同定し、１，０００回の反復で実行するように構成された。ＨＤＰ及びＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒ抽出された１９２個のトリヌクレオチドコンテキストシグネチャーの比較を、コサイン類似性メトリックを評価することによって実行し、ここで、０．８超の値は、シグネチャーの所与の対が互いに同じ又はわずかに異なるバージョンであることを示すと見なした。
ＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒＥｘｔｒａｃｔｏｒ ｐｙｔｈｏｎパッケージ（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７８，９４－１０１（２０２０））（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＡｌｅｘａｎｄｒｏｖＬａｂ／ＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒＥｘｔｒａｃｔｏｒ）は、非負行列因子分解アルゴリズムに基づき、突然変異シグネチャー同定のための代替手段として役立った。アルゴリズムは、１５個の突然変異シグネチャーを同定し、１，０００回の反復で実行するように構成された。ＨＤＰ及びＳｉｇＰｒｏｆｉｌｅｒ抽出された１９２個のトリヌクレオチドコンテキストシグネチャーの比較を、コサイン類似性メトリックを評価することによって実行し、ここで、０．８超の値は、シグネチャーの所与の対が互いに同じ又はわずかに異なるバージョンであることを示すと見なした。
【0170】
ＦＯＸＯ１－ｅＧＦＰ画像化及びハイコンテント解析：
Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２及びＳＰＹ－５５５－アクチン（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ）で対比染色したＦＯＸＯ１－ｅＧＦＰ発現細胞のハイコンテント及び生細胞分析を、２０×空気ＮＡ＝０．４対物レンズを使用してＯｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳシステムで行った。固定した細胞の画像を、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析した。完全な分析配列を得た。簡単に説明すると、非細胞性物質（例えば、カバースリップの縁によって生じた明るい領域）を除去した。核をＤＡＰＩ蛍光からセグメント化した。各核の周囲からの９ピクセル幅の細胞質環を、ＧＦＰ蛍光からセグメント化し、バックグラウンド領域を、任意の核から１２０～１５０ピクセル離れた任意の無細胞領域からサンプリングした。核面積、真円度、及び幅：長さの比に閾値を設定することによって、断片又は他の非細胞性の小さな物体から核をフィルタリングした。平均核、細胞質及びバックグラウンドＧＦＰ蛍光強度を測定し、これらから、バックグラウンドを差し引いた値を用いて各セルについて核細胞質比を計算した。これらの値のｌｏｇ１０を取った。
Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２及びＳＰＹ－５５５－アクチン（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ）で対比染色したＦＯＸＯ１－ｅＧＦＰ発現細胞のハイコンテント及び生細胞分析を、２０×空気ＮＡ＝０．４対物レンズを使用してＯｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳシステムで行った。固定した細胞の画像を、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析した。完全な分析配列を得た。簡単に説明すると、非細胞性物質（例えば、カバースリップの縁によって生じた明るい領域）を除去した。核をＤＡＰＩ蛍光からセグメント化した。各核の周囲からの９ピクセル幅の細胞質環を、ＧＦＰ蛍光からセグメント化し、バックグラウンド領域を、任意の核から１２０～１５０ピクセル離れた任意の無細胞領域からサンプリングした。核面積、真円度、及び幅：長さの比に閾値を設定することによって、断片又は他の非細胞性の小さな物体から核をフィルタリングした。平均核、細胞質及びバックグラウンドＧＦＰ蛍光強度を測定し、これらから、バックグラウンドを差し引いた値を用いて各セルについて核細胞質比を計算した。これらの値のｌｏｇ１０を取った。
【0171】
生細胞については、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（ＭｃＱｕｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ１６，ｅ２００５９７０（２０１８））を用いて同様の分析を行った。完全な分析配列を得た。簡単に述べると、照明補正画像を、多項式適合によってＧＦＰ及びＨｏｅｃｈｓｔチャネルの両方について計算し、減算した。Ｈｏｅｃｈｓｔ画像から核をセグメント化した。細胞質をＧＦＰシグナルからセグメント化し、核の周りの９ピクセル幅のリングを使用して測定を核周囲領域に限定した。平均核及び細胞質ＧＦＰ強度を測定し、核を時系列を通して追跡した。核：細胞質比を計算し、これらの値のｌｏｇ１０を取った。
【0172】
生細胞からの結果は、４つのウェルからプールされたデータの中央値±分散として表示され、それぞれ８つの視野で、ウェル当たり１０００～２０００個の細胞が分析され、条件当たり合計６０００～７５００個の細胞が得られる。
【0173】
免疫ブロッティングによるタンパク質発現；
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上での免疫ブロッティングを、以下の抗体：抗β－アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５４４１、１：５０００）；抗Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２９３８、１：１０００）；抗ホスホ－Ａｋｔ（Ｔ３０８）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４０５６、１：１０００）；抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ、ａｂ６５５６、１：１０００）；抗ＦＯＸＯ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２８８０、１：１０００）；抗ホスホＦＯＸＯ１（Ｔ２４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（９４６４、１：１０００）を使用して、Ｈｏａｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｈｏａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．１８，９７９－９９２（２０１６））によって報告されたように実行した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上での免疫ブロッティングを、以下の抗体：抗β－アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５４４１、１：５０００）；抗Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２９３８、１：１０００）；抗ホスホ－Ａｋｔ（Ｔ３０８）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４０５６、１：１０００）；抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ、ａｂ６５５６、１：１０００）；抗ＦＯＸＯ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２８８０、１：１０００）；抗ホスホＦＯＸＯ１（Ｔ２４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（９４６４、１：１０００）を使用して、Ｈｏａｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｈｏａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．１８，９７９－９９２（２０１６））によって報告されたように実行した。
【0174】
メタボロミクス：
野生型ＦＯＸＯ１－ｅＧＦＰ又はＦＯＸＯ１Ｓ２２Ｗのいずれかを発現するＨｅｐＧ２細胞を無血清培地中で一晩培養した後、１００ｎＭインスリンの存在下又は非存在下で３時間刺激してから回収した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ドライアイス上で５０％メタノール、３０％アセトニトリル（両方ともＦｉｓｈｅｒ）、２０％超純水及び５μＭバリンｄ８（内部対照、ＣＫ同位体）中で抽出及び溶解した。次いで、細胞溶解物上清を、ＬＣ－ＭＳベースのメタボロミクスを実行するまで－８０℃で保存した。
野生型ＦＯＸＯ１－ｅＧＦＰ又はＦＯＸＯ１Ｓ２２Ｗのいずれかを発現するＨｅｐＧ２細胞を無血清培地中で一晩培養した後、１００ｎＭインスリンの存在下又は非存在下で３時間刺激してから回収した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ドライアイス上で５０％メタノール、３０％アセトニトリル（両方ともＦｉｓｈｅｒ）、２０％超純水及び５μＭバリンｄ８（内部対照、ＣＫ同位体）中で抽出及び溶解した。次いで、細胞溶解物上清を、ＬＣ－ＭＳベースのメタボロミクスを実行するまで－８０℃で保存した。
【0175】
代謝産物のＨＩＬＩＣクロマトグラフィー分離は、二成分溶媒系を有する２．１×２０ｍｍガードカラム（両方とも粒径５ｍｍ）を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｅｑｕａｎｔ ＺＩＣ－ｐＨＩＬＩＣ分析カラム（５μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を使用して達成した。溶媒Ａは、２０ｍＭ炭酸アンモニウム、０．０５％水酸化アンモニウムであった。溶媒Ｂはアセトニトリルであった。カラムオーブン及びオートサンプラートレイをそれぞれ４０℃及び４℃に保持した。クロマトグラフィー勾配を、以下のように０．２００ｍＬ／分の流速で流した：０～２分：８０％Ｂ；２～１７分：８０％Ｂから２０％Ｂへの直線勾配；１７～１７．１分：２０％Ｂから８０％Ｂへの直線勾配；１７．１～２２．５分：８０％Ｂで保持。試料を無作為化し、ＬＣ－ＭＳを用いて盲検様式で分析し、注入量は５μｌであった。プール試料を、全ての個々の試料の等しい混合物から生成し、品質管理として試料配列内に規則的な間隔で散在させて分析した。
【0176】
代謝産物を、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣに連結したＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＨＲＭＳ）で測定した。質量分析計は、スプレー電圧を＋４．５ｋＶ／－３．５ｋＶに設定し、加熱キャピラリーを３２０℃に保持し、補助ガスヒーターを２８０℃に保持して、フルスキャン、極性切り替えモードで操作した。シースガス流量を２５単位に設定し、補助ガス流量を１５単位に設定し、スイープガス流量を０単位に設定した。ＨＲＭＳデータ取得は、ｍ／ｚ＝７０～９００の範囲で行い、分解能は７０，０００に設定し、ＡＧＣ標的は１×１０６に設定し、最大注入時間（ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ、Ｍａｘ ＩＴ）は１２０ｍｓに設定した。代謝産物の同一性を、２つのパラメータを使用して確認した：（１）前駆イオンｍ／ｚは、化学式によって予測される理論質量の５ｐｐｍ以内で一致した；（２）代謝産物の保持時間は、同じクロマトグラフィー法で行った精製標準物質の保持時間の５％以内であった。Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒソフトウェアＴｒａｃｅｆｉｎｄｅｒ ５．０を使用して、クロマトグラムレビュー及びピーク面積積分を実行し、検出された各代謝産物のピーク面積を、その試料の総イオンカウント（total ion count、ＴＩＣ）に対して正規化して、機器分析を通して試料操作から導入された任意の変動を補正した。正規化された面積を、更なる統計データ分析のための変数として使用した。
【0177】
メタボロミクスデータの統計解析は、予測変数としてインスリン（あり又はなし）及びＦＯＸＯ１状態（突然変異体又は野生型）、並びに従属変数として正規化代謝産物レベルを用いた線形モデルを使用して実行した。尤度比検定を使用してｐ値を生成し、次いでこれを、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して多重仮説検定について補正した。有意性についてはｑ＜０．０１の閾値を用いた。
【0178】
ＨｅｐＧ２細胞株：ＲＮＡ配列決定データ前処理：
ＨｅｐＧ２細胞株試料（ｎ＝３０）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００プラットフォームを使用して２レーンの１５０塩基対ペアエンドＲＮＡ配列決定に供した。使用したヒト参照ゲノムは、Ｅｎｓｅｍｂｌリリース７５データに基づく遺伝子アノテーションを有する、１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔからのｈｓ３７ｄ５であった。アダプター及び低品質リードを、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＦｅｌｉｘＫｒｕｅｇｅｒ／ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅ）を、以下のパラメータ：－ｑ２０－ｆａｓｔｑｃ－－ペアードストリンジェンシー１－長さ２０－ｅ ０．１で使用した。Ｓｐｌｉｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｏ ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＳＴＡＲ）ａｌｉｇｎｅｒを使用して、生の配列リードをＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）ヒト参照ゲノムにマッピングした（Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２９，１５－２１（２０１３））。置換が、ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを使用してコールされた（Ｐｏｐｌｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ １－２２（２０１８）．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０１１７８）。特徴カウントソフトウェア（Ｌｉａｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３０，９２３－９３０（２０１４）．）を使用して、遺伝子発現値を要約し、一方、ＥｄｇｅＲ Ｒパッケージからのｃｐｍ関数を使用して、データを対数カウント・パー・ミリオンスケールに正規化した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２６，１３９－１４０（２０１０））。全てのヒートマップは、ｐｈｅａｔｍａｐ Ｒパッケージ（ｈｔｔｐｓｙ／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｐｊｅｃｔ．ｐｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｐｈｅａｔｍａｐ／ｊｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを使用して生成した。
ＨｅｐＧ２細胞株試料（ｎ＝３０）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００プラットフォームを使用して２レーンの１５０塩基対ペアエンドＲＮＡ配列決定に供した。使用したヒト参照ゲノムは、Ｅｎｓｅｍｂｌリリース７５データに基づく遺伝子アノテーションを有する、１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔからのｈｓ３７ｄ５であった。アダプター及び低品質リードを、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＦｅｌｉｘＫｒｕｅｇｅｒ／ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅ）を、以下のパラメータ：－ｑ２０－ｆａｓｔｑｃ－－ペアードストリンジェンシー１－長さ２０－ｅ ０．１で使用した。Ｓｐｌｉｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｏ ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＳＴＡＲ）ａｌｉｇｎｅｒを使用して、生の配列リードをＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）ヒト参照ゲノムにマッピングした（Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２９，１５－２１（２０１３））。置換が、ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを使用してコールされた（Ｐｏｐｌｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ １－２２（２０１８）．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０１１７８）。特徴カウントソフトウェア（Ｌｉａｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３０，９２３－９３０（２０１４）．）を使用して、遺伝子発現値を要約し、一方、ＥｄｇｅＲ Ｒパッケージからのｃｐｍ関数を使用して、データを対数カウント・パー・ミリオンスケールに正規化した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２６，１３９－１４０（２０１０））。全てのヒートマップは、ｐｈｅａｔｍａｐ Ｒパッケージ（ｈｔｔｐｓｙ／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｐｊｅｃｔ．ｐｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｐｈｅａｔｍａｐ／ｊｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを使用して生成した。
【0179】
遺伝子セット濃縮分析：
遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ ｖ３．０）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ１０２，１５５４５－１５５５０（２００５））を、遺伝子の事前にランク付けされた遺伝子リスト、２０００の順列、並びに多くて５００の遺伝子を有する全ての遺伝子オントロジー及びリアクトーム関連遺伝子セット（２０２１年６月１日バージョン、ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｂａｄｅｒｌａｂ．ｏｒｇ／ＥＭ＿Ｇｅｎｅｓｅｔｓ／からダウンロード）を使用して実行した。具体的には、各遺伝子について、２つの線形モデルを、Ｒ統計プログラミング環境においてＩｍ関数を使用して構築し、一方のモデルは、独立変数としてＦＯＸＯ１ドライバー及びインスリン状態（すなわち、存在又は非存在のいずれか）の両方を有し、他方のモデルはインスリン状態のみを含んだ。両方のモデルにおける従属変数は、モデルにおける遺伝子の発現である。次に、尤度比検定を使用して、遺伝子当たりのネスティングされたモデルの各対間のｐ値を計算した。続いて、このｐ値に、各遺伝子のドライバーを有するモデルにおける突然変異状態の回帰係数の符号を乗じた。最後に、遺伝子リストをｐ値のこのセットに従って次のようにランク付けした：－（≒０）．．．－０．０５．．．－０．９９．．．０．９９．．．０．０５．．．≒０において、リストの最下部の遺伝子は、インスリン状態の影響を説明しながら、ＦＯＸＯ１ドライバーの存在と最も関連すると予想される。
遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ ｖ３．０）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ１０２，１５５４５－１５５５０（２００５））を、遺伝子の事前にランク付けされた遺伝子リスト、２０００の順列、並びに多くて５００の遺伝子を有する全ての遺伝子オントロジー及びリアクトーム関連遺伝子セット（２０２１年６月１日バージョン、ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｂａｄｅｒｌａｂ．ｏｒｇ／ＥＭ＿Ｇｅｎｅｓｅｔｓ／からダウンロード）を使用して実行した。具体的には、各遺伝子について、２つの線形モデルを、Ｒ統計プログラミング環境においてＩｍ関数を使用して構築し、一方のモデルは、独立変数としてＦＯＸＯ１ドライバー及びインスリン状態（すなわち、存在又は非存在のいずれか）の両方を有し、他方のモデルはインスリン状態のみを含んだ。両方のモデルにおける従属変数は、モデルにおける遺伝子の発現である。次に、尤度比検定を使用して、遺伝子当たりのネスティングされたモデルの各対間のｐ値を計算した。続いて、このｐ値に、各遺伝子のドライバーを有するモデルにおける突然変異状態の回帰係数の符号を乗じた。最後に、遺伝子リストをｐ値のこのセットに従って次のようにランク付けした：－（≒０）．．．－０．０５．．．－０．９９．．．０．９９．．．０．０５．．．≒０において、リストの最下部の遺伝子は、インスリン状態の影響を説明しながら、ＦＯＸＯ１ドライバーの存在と最も関連すると予想される。
【0180】
実施例１：肝臓試料におけるドライバー突然変異の同定
Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５７４（７７７９）：５３８－５４２）は、健康な肝臓及び罹患した肝臓からの４８２個の全ゲノムを配列決定したが、選択圧下での遺伝子の明確な同定のための統計的検出力を欠いていた。Ｂｒｕｎｎｅｒらによって使用された方法よりもドライバー突然変異（すなわち、選択的利点を与える突然変異）を検出するための力を改善するために、Ｂｒｕｎｎｅｒらからのデータを、２０個の肝臓試料からの追加の１１０８個の全ゲノム配列とともに使用した。これらの試料は、主にＮＡＦＬＤを有する患者からのものであったが、疾患重症度によって異なっていた。図１に示す階層的な実験計画を使用して試料を分析した。簡単に説明すると、約１ｃｍ３の肝臓組織試料ごとに、２１～５２個の別々のマイクロダイセクションを捕捉し、そのそれぞれが１００～５００個の肝細胞を含んでいた。ＮＡＦＬＤを有する２人の患者において、それらの外植された肝臓の８つ全てのクイノー解剖学的セグメントから別個の試料を採取し、各セグメントからの２２～２８個のマイクロダイセクションを配列決定した。この階層的実験設計は、患者当たりの複数のゲノムから生じる非独立性を管理するために特殊化した統計分析を使用して、個々のクローン、解剖学的セグメント及び患者にわたる体細胞突然変異の不均一性の定量を可能にした。
Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５７４（７７７９）：５３８－５４２）は、健康な肝臓及び罹患した肝臓からの４８２個の全ゲノムを配列決定したが、選択圧下での遺伝子の明確な同定のための統計的検出力を欠いていた。Ｂｒｕｎｎｅｒらによって使用された方法よりもドライバー突然変異（すなわち、選択的利点を与える突然変異）を検出するための力を改善するために、Ｂｒｕｎｎｅｒらからのデータを、２０個の肝臓試料からの追加の１１０８個の全ゲノム配列とともに使用した。これらの試料は、主にＮＡＦＬＤを有する患者からのものであったが、疾患重症度によって異なっていた。図１に示す階層的な実験計画を使用して試料を分析した。簡単に説明すると、約１ｃｍ３の肝臓組織試料ごとに、２１～５２個の別々のマイクロダイセクションを捕捉し、そのそれぞれが１００～５００個の肝細胞を含んでいた。ＮＡＦＬＤを有する２人の患者において、それらの外植された肝臓の８つ全てのクイノー解剖学的セグメントから別個の試料を採取し、各セグメントからの２２～２８個のマイクロダイセクションを配列決定した。この階層的実験設計は、患者当たりの複数のゲノムから生じる非独立性を管理するために特殊化した統計分析を使用して、個々のクローン、解剖学的セグメント及び患者にわたる体細胞突然変異の不均一性の定量を可能にした。
【0181】
Ｂｒｕｎｎｅｒらからのデータと組み合わせた場合、データセットは、事前のネオアジュバント療法を受けていない５人の正常肝臓対照、アルコール関連肝疾患（ＡＲＬＤ）を有する１０人及びＮＡＦＬＤを有する１９人を含む、３４人の肝臓試料からの１５９０個のゲノムを含んでいた。ＡＲＬＤ又はＮＡＦＬＤを有する全ての患者は、ＨＣＣ、肝不全又は両方を有し、組織は、肝臓切除又は移植に由来した。全体として、９つの試料は、同期性ＨＣＣ及び根底にある肝硬変を有する患者からのものであった。５年の期間にわたる１人の患者からの３つの肝臓切除試料を含む、更なる８つの試料が、根底にある肝硬変を伴わないＨＣＣを有していた。全ての試料は、専門の肝臓病理学者による中央組織学的レビューを受け、患者の組織学的及び臨床的特徴は、根底にある疾患プロセスについて予想されるものと一致した。マイクロダイセクションを３１×の平均深度まで配列決定した。
【0182】
正の選択下でタンパクコード突然変異を同定するために、ｄＮｄＳｃｖアルゴリズム（Ｍａｒｔｉｎｏｃｏｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１７，１７１，１０２９－１０４１）を用いて、遺伝子中の有意に過剰な非同義突然変異についてスクリーニングした。
【0183】
非コードドライバー突然変異を検索するために、ＮＢＲアルゴリズム（Ｒｈｅｉｎｂａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０２０，５７８，１０２－１１１）を使用して、プロモーター、エンハンサー、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ長鎖非コードＲＮＡ遺伝子及びマイクロＲＮＡをスクリーニングした。
【0184】
結果：
全てのタンパク質コード遺伝子にわたって、遺伝子ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＬＣＮ５、ＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ、ＡＬＢ、ＧＰＡＭ及びＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子は、多重仮説検定の補正後に突然変異の有意な再発を有することが見出された（ｑ＜０．０５、すなわち、ＦＯＸＯ１（ｑ＜２×１０－１６）、ＣｌＤＥＢ（ｑ＜２×１０－１６）、ＡＣＶＲ２Ａｑ＝７×１０－９）、ＡＬＢ（８×１０－１０）、ＧＰＡＭｑ＝１×１０－５）及びＴＮＲＣ６Ｂ（ｑ＝０．０４））（ＭａｒｔｉｎｃｏｒｅｎａＣｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１７１，１０２９－１０４１（２０１７）。非コード突然変異がＮＥＡＴ１において同定された。突然変異遺伝子の詳細を以下に示す。
全てのタンパク質コード遺伝子にわたって、遺伝子ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＬＣＮ５、ＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ、ＡＬＢ、ＧＰＡＭ及びＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子は、多重仮説検定の補正後に突然変異の有意な再発を有することが見出された（ｑ＜０．０５、すなわち、ＦＯＸＯ１（ｑ＜２×１０－１６）、ＣｌＤＥＢ（ｑ＜２×１０－１６）、ＡＣＶＲ２Ａｑ＝７×１０－９）、ＡＬＢ（８×１０－１０）、ＧＰＡＭｑ＝１×１０－５）及びＴＮＲＣ６Ｂ（ｑ＝０．０４））（ＭａｒｔｉｎｃｏｒｅｎａＣｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１７１，１０２９－１０４１（２０１７）。非コード突然変異がＮＥＡＴ１において同定された。突然変異遺伝子の詳細を以下に示す。
【0185】
ａ）コード突然変異：
ＦＯＸＯ１：
ＦＯＸＯ１遺伝子において同定された突然変異は、非常に有意で過剰なミスセンス突然変異であることが見出された（ｑ＜２×１０－１６）。全体として、独立したＦＯＸＯ１突然変異を獲得した２６個の別々のクローンが同定された。これらは、８人の患者からの４５個の個々のマイクロダイセクション間に分布していた。これらのうち、２４個のクローンは、Ｓ２２Ｗアミノ酸置換を生じると予測される同一の塩基変化を含んでいた（図２Ａ）。他の２つの突然変異は、Ｒ２１Ｌ置換及びＳ２２＊ナンセンス突然変異を生成するであろう。他の２つの突然変異は、Ｒ２１Ｌ置換及びＳ２２＊ナンセンス突然変異を生じると予測された。後者は、正常な肝臓試料からの単一のマイクロダイセクションにおけるものであり、その生物学的重要性は不明である。Ｓ２２Ｗ突然変異は、ＡＲＬＤ又はＮＡＦＬＤを有する患者においてのみ見られた。ＦＯＸＯ１遺伝子の第１のイントロン内の体細胞構造バリアントが、ＮＡＦＬＤを有する患者からのマイクロダイセクションにおいて観察された。これは、第１３染色体に影響を及ぼす染色体異常事象の状況において生じた（図２Ｄ）。
ＦＯＸＯ１：
ＦＯＸＯ１遺伝子において同定された突然変異は、非常に有意で過剰なミスセンス突然変異であることが見出された（ｑ＜２×１０－１６）。全体として、独立したＦＯＸＯ１突然変異を獲得した２６個の別々のクローンが同定された。これらは、８人の患者からの４５個の個々のマイクロダイセクション間に分布していた。これらのうち、２４個のクローンは、Ｓ２２Ｗアミノ酸置換を生じると予測される同一の塩基変化を含んでいた（図２Ａ）。他の２つの突然変異は、Ｒ２１Ｌ置換及びＳ２２＊ナンセンス突然変異を生成するであろう。他の２つの突然変異は、Ｒ２１Ｌ置換及びＳ２２＊ナンセンス突然変異を生じると予測された。後者は、正常な肝臓試料からの単一のマイクロダイセクションにおけるものであり、その生物学的重要性は不明である。Ｓ２２Ｗ突然変異は、ＡＲＬＤ又はＮＡＦＬＤを有する患者においてのみ見られた。ＦＯＸＯ１遺伝子の第１のイントロン内の体細胞構造バリアントが、ＮＡＦＬＤを有する患者からのマイクロダイセクションにおいて観察された。これは、第１３染色体に影響を及ぼす染色体異常事象の状況において生じた（図２Ｄ）。
【0186】
ＦＯＸＯ１ Ｓ２２Ｗ突然変異を有する７人の患者のうち、６人は、異なるクローンにおける突然変異の複数の独立した獲得についての明確な証拠（すなわち、収束進化）を有した（図３Ｃ）。
【0187】
肝臓の８つ全ての解剖学的セグメントがサンプリングされた２人の患者において、ＦＯＸＯ１ Ｓ２２Ｗ突然変異が、一方の患者において３つの異なるセグメントで、他方において４つのセグメントで見出された。更に、単一のセグメント内であっても、複数の独立して獲得されたＦＯＸＯ１突然変異が存在し、その結果、これらの２人の患者のうちの１人は、サンプリングされた領域の中にＦＯＸＯ１ Ｓ２２Ｗを有する９個の独立したクローンを有した。
【0188】
単一セグメントからの試料を分析した患者のうち、１人は、約１ｃｍ３以内のＦＯＸＯ１ミスセンス突然変異の５回の独立した獲得を有した。更なる患者は３回の別個の発生を有し、２人の患者は２回の別個の獲得を有した。
【0189】
これらの患者の系統樹を対応する肝臓試料の組織学上に階層化すると、平行進化を介して獲得されたＦＯＸＯ１突然変異が、典型的にはＦＯＸＯ１の野生型の介在領域によって分離された、地理的に異なる領域に位置することが明らかになった（図３Ａ～図３Ｃ）。
【0190】
ＣＩＤＥＢ：
肝臓及び脂肪組織内の脂質代謝に関与する３つのＣＩＤＥファミリー遺伝子のうちの１つであるＣＩＤＥＢ内に有意に過剰な体細胞突然変異が存在することが観察された（ｑ＜２×１０－１６）。ＣＩＤＥＢは、肝細胞において活性な主要なファミリーメンバーであり、ノックアウトマウスモデルは、食事性脂肪性肝炎に対する抵抗性及びインスリン感受性の増加を示す（Ｌｉｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００７，５６，２５２３－２５３２。これらのタンパク質は、異なる液滴上のＣＩＤＥタンパク質間のホモ二量体の形成によって媒介される、細胞内脂肪液滴の融合を調節する（Ｓｃｈｕｌｚｅ，ＲＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２１８，２０９６－２１１２（２０１９）及びＬｉｐｓｃｏｍｂ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５２，３７６－３８７（１９９８））。ホモ二量体化は、一方の脂肪液滴からのＣＩＤＥタンパク質上の正に荷電した残基と他方の負に荷電した残基との間の静電接触を介して起こる。
肝臓及び脂肪組織内の脂質代謝に関与する３つのＣＩＤＥファミリー遺伝子のうちの１つであるＣＩＤＥＢ内に有意に過剰な体細胞突然変異が存在することが観察された（ｑ＜２×１０－１６）。ＣＩＤＥＢは、肝細胞において活性な主要なファミリーメンバーであり、ノックアウトマウスモデルは、食事性脂肪性肝炎に対する抵抗性及びインスリン感受性の増加を示す（Ｌｉｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００７，５６，２５２３－２５３２。これらのタンパク質は、異なる液滴上のＣＩＤＥタンパク質間のホモ二量体の形成によって媒介される、細胞内脂肪液滴の融合を調節する（Ｓｃｈｕｌｚｅ，ＲＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２１８，２０９６－２１１２（２０１９）及びＬｉｐｓｃｏｍｂ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５２，３７６－３８７（１９９８））。ホモ二量体化は、一方の脂肪液滴からのＣＩＤＥタンパク質上の正に荷電した残基と他方の負に荷電した残基との間の静電接触を介して起こる。
【0191】
ＣＩＤＥＢでは、２つのナンセンス突然変異及び１つの終止欠失突然変異に加えて、１８個のミスセンス突然変異が観察された（図４Ａ）。ミスセンス突然変異がＣＩＤＥタンパク質のホモ二量体化に関与する２つのドメインに主に位置し、それらの多くが荷電残基を中性残基に切り替える（Ｒ４５Ｗ、Ｒ４５Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｒ１４４Ｐ）か、又は電荷を逆転させる（Ｄ４２Ｈ、Ｋ６２Ｅ、Ｅ７８Ｋ）かのいずれかであった。以前のインビトロ突然変異誘発研究は、本発明者らの患者において突然変異した残基の一部を含む、これらの重要な保存残基上の電荷を変化させることが、ホモ二量体化を無効にし、細胞内での脂肪液滴の融合及び増殖を妨げることを示した（Ｓｃｈｕｌｚｅ，ＲＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２１８，２０９６－２１１２（２０１９）及びＬｉｐｓｃｏｍｂ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９８，１５２，３７６－３８７）。
【0192】
ＦＯＸＯ１について見られるように、ＣＩＤＥＢにおける突然変異は、１人の患者の肝臓内の複数の独立したクローンにおいて頻繁に獲得された。例えば、肝臓の８つのクイノーセグメント全てがサンプリングされたＮＡＦＬＤ患者の１人において、ＣＩＤＥＢにおいて非同義突然変異を有する１４個のクローンが見出され、８つのセグメントのうちの６つに分布していた（図４Ｂ～図４Ｃ）。
【0193】
ＧＰＡＭ：
別の有意に変異した遺伝子は、ミトコンドリアグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするＧＰＡＭであった。この酵素は、トリアシルグリセロール合成における律速ステップ、すなわちグリセロール－３－リン酸による長鎖アシル－ＣｏＡのエステル化を触媒する（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｅ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２０，１－１２（２０１９）及びＡｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５７８，９４－１０１（２０２０）を参照されたい）。他のグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼイソ酵素と比較して、ＧＰＡＭは、グルコースから合成された遊離脂肪酸を貯蔵トリグリセリドに組み込む、肝臓におけるデノボ脂質生成に特に重要である（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５７８，９４－１０１（２０２０））。この機能と一致して、ＧＰＡＭ転写は、インスリンシグナル伝達によって急速に上方制御される（Ｅｒｉｃｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７（２７２）：７２９８－７３０５）。
別の有意に変異した遺伝子は、ミトコンドリアグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするＧＰＡＭであった。この酵素は、トリアシルグリセロール合成における律速ステップ、すなわちグリセロール－３－リン酸による長鎖アシル－ＣｏＡのエステル化を触媒する（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｅ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２０，１－１２（２０１９）及びＡｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５７８，９４－１０１（２０２０）を参照されたい）。他のグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼイソ酵素と比較して、ＧＰＡＭは、グルコースから合成された遊離脂肪酸を貯蔵トリグリセリドに組み込む、肝臓におけるデノボ脂質生成に特に重要である（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５７８，９４－１０１（２０２０））。この機能と一致して、ＧＰＡＭ転写は、インスリンシグナル伝達によって急速に上方制御される（Ｅｒｉｃｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７（２７２）：７２９８－７３０５）。
【0194】
１２個のミスセンス変異及び３個のタンパク質短縮型変異がＧＰＡＭにおいて観察され（ｑ＝１×１０－５）、７人の患者に影響を及ぼした（図５Ａ）。１つのマイクロダイセクションにおいて遺伝子の２０ｋｂ上流から始まる縦列重複（不確定な重要性）（図５Ｂ）もまた観察された。ナンセンス及びフレームシフト突然変異と組み合わせた突然変異のホットスポット残基の不在は、これらの突然変異の可能性のある結果がタンパク質機能の障害であることを示唆している。ＦＯＸＯ１及びＣＩＤＥＢ突然変異に関しては、同じ患者の肝臓試料からの異なるクローンにおけるＧＰＡＭにおける体細胞突然変異の収束獲得の証拠があった。例えば、１人の患者は、ＧＰＡＭに影響を及ぼす７つの別個の事象を有していたが（図５Ｃ）、別の患者は、２つの別個の事象を有していた（図５Ｄ及び図５Ｅ）。
【0195】
ＡＣＶＲ２Ａ：
突然変異をコードするタンパク質を含む４つの遺伝子のうちの１つは、ＡＣＶＲ２Ａであった。この遺伝子は、既知のＨＣＣ遺伝子に限定されることが報告されているＴＧＦ－βスーパーファミリー中のアクチビン－Ａの受容体をコードする（Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９））。ＡＣＶＲ２Ａ遺伝子は、ＨＣＣの５～１０％において突然変異しており、タンパク質短縮事象の優勢は、それが腫瘍抑制遺伝子として作用することを示唆している。最近のメタ分析は、ＡＣＶＲ２Ａにおける突然変異が、ウイルスＨＣＣよりもＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤ関連ＨＣＣの症例においてより頻繁に見られることを示唆している（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１９（２５）：４６３－４７２）。本研究では、ＡＣＶＲ２Ａにおける１３個のミスセンス突然変異、２個のナンセンス突然変異及び１個のスプライス部位インデル（ｑ＝７×１０－９）、並びに構造変異による４個の大規模欠失が観察された（図６Ａ及び図６Ｂ）。ＡＲＬＤを有する１人の患者において、２つの独立したミスセンス点突然変異及び独立したクローンにおけるＡＣＶＲ２Ａにおける大規模欠失が見られ、これは、この患者内のドライバー突然変異の収束進化と一致した。
突然変異をコードするタンパク質を含む４つの遺伝子のうちの１つは、ＡＣＶＲ２Ａであった。この遺伝子は、既知のＨＣＣ遺伝子に限定されることが報告されているＴＧＦ－βスーパーファミリー中のアクチビン－Ａの受容体をコードする（Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９））。ＡＣＶＲ２Ａ遺伝子は、ＨＣＣの５～１０％において突然変異しており、タンパク質短縮事象の優勢は、それが腫瘍抑制遺伝子として作用することを示唆している。最近のメタ分析は、ＡＣＶＲ２Ａにおける突然変異が、ウイルスＨＣＣよりもＮＡＦＬＤ又はＡＲＬＤ関連ＨＣＣの症例においてより頻繁に見られることを示唆している（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１９（２５）：４６３－４７２）。本研究では、ＡＣＶＲ２Ａにおける１３個のミスセンス突然変異、２個のナンセンス突然変異及び１個のスプライス部位インデル（ｑ＝７×１０－９）、並びに構造変異による４個の大規模欠失が観察された（図６Ａ及び図６Ｂ）。ＡＲＬＤを有する１人の患者において、２つの独立したミスセンス点突然変異及び独立したクローンにおけるＡＣＶＲ２Ａにおける大規模欠失が見られ、これは、この患者内のドライバー突然変異の収束進化と一致した。
【0196】
ＴＮＲＣ６Ｂ：
ＴＮＲＣ６Ｂは、マイクロＲＮＡプロセシングに関与するタンパクをコードする（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．２００５（１５）：２１４９－２１５５）。ＴＮＲＣ６Ｂにおいて３つのナンセンス、２つの必須スプライス部位及び１つの大きなインフレーム欠失、並びに３つのミスセンス突然変異が観察された（ｑ＝０．０４；図９）。タンパク質切断変異体のこの優勢は、遺伝子の不活性化が肝細胞に正の選択的利点を付与することを示唆する。驚くべきことに、ＮＡＦＬＤを有する１人の患者は、ＴＮＲＣ６Ｂにおいて５つの異なる突然変異を有し、これは、独立した肝実質細胞クローンにおける収束進化と一致した。
ＴＮＲＣ６Ｂは、マイクロＲＮＡプロセシングに関与するタンパクをコードする（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．２００５（１５）：２１４９－２１５５）。ＴＮＲＣ６Ｂにおいて３つのナンセンス、２つの必須スプライス部位及び１つの大きなインフレーム欠失、並びに３つのミスセンス突然変異が観察された（ｑ＝０．０４；図９）。タンパク質切断変異体のこの優勢は、遺伝子の不活性化が肝細胞に正の選択的利点を付与することを示唆する。驚くべきことに、ＮＡＦＬＤを有する１人の患者は、ＴＮＲＣ６Ｂにおいて５つの異なる突然変異を有し、これは、独立した肝実質細胞クローンにおける収束進化と一致した。
【0197】
ＣＬＣＮ５：
ＣＬＣＮ５遺伝子はクロライドチャネルをコードし、これはＸ連鎖腎石灰化症を引き起こすが、生殖系列において突然変異した場合に既知の肝臓表現型を引き起こさない。ＣＬＣＮ５において３つのミスセンス及び４つのナンセンス変異（ｑ＝０．０４）が観察され、患者全体に分布していた（図７）。これには、２人の健康な対照が含まれていた。したがって、ＣＬＣＮ５突然変異の慢性肝疾患への関連性は不明である。
ＣＬＣＮ５遺伝子はクロライドチャネルをコードし、これはＸ連鎖腎石灰化症を引き起こすが、生殖系列において突然変異した場合に既知の肝臓表現型を引き起こさない。ＣＬＣＮ５において３つのミスセンス及び４つのナンセンス変異（ｑ＝０．０４）が観察され、患者全体に分布していた（図７）。これには、２人の健康な対照が含まれていた。したがって、ＣＬＣＮ５突然変異の慢性肝疾患への関連性は不明である。
【0198】
ｂ）非コード突然変異：
長鎖非コードＲＮＡであるＮＥＡＴ１は、多重仮説検定に対する補正後のバックグラウンド期待値と比較して有意に過剰な突然変異を示した（ｑ＜１ｘ１０－１０；図８）。この遺伝子は、ＨＣＣを含むヒトがんの範囲において反復的に突然変異するが、これはおそらく、正の選択下にあるのではなく、ゲノムの超変異性領域内に存在するためである。重要なことに、ＨＣＣ及び異形成結節において一般的であるＴＥＲＴプロモーターに影響を及ぼす標準的ホットスポット突然変異又は構造バリアントはいずれもが存在せず、一方、同じプロトコルを使用して配列決定された同期ＨＣＣの１１／２２（５０％）がこれらのドライバーを有していた。
長鎖非コードＲＮＡであるＮＥＡＴ１は、多重仮説検定に対する補正後のバックグラウンド期待値と比較して有意に過剰な突然変異を示した（ｑ＜１ｘ１０－１０；図８）。この遺伝子は、ＨＣＣを含むヒトがんの範囲において反復的に突然変異するが、これはおそらく、正の選択下にあるのではなく、ゲノムの超変異性領域内に存在するためである。重要なことに、ＨＣＣ及び異形成結節において一般的であるＴＥＲＴプロモーターに影響を及ぼす標準的ホットスポット突然変異又は構造バリアントはいずれもが存在せず、一方、同じプロトコルを使用して配列決定された同期ＨＣＣの１１／２２（５０％）がこれらのドライバーを有していた。
【0199】
実施例２：ＦＯＸＯ１突然変異の評価：
ＦＯＸＯ１は、インスリンシグナル伝達の下流の重要な転写因子である。絶食状態では、インスリンなしで、ＦＯＸＯ１は肝細胞の核において活性であり、糖新生、解糖及び脂肪分解経路における遺伝子の発現を上方制御する。インスリンがその受容体に結合すると、ＡＫＴはＰＩ３Ｋを介して活性化される。続いて、ＡＫＴは核内のＦＯＸＯ１をリン酸化し、Ｔ２４のスレオニンは３つの既知のＡＫＴリン酸化標的の１つである。慢性肝疾患において本発明者らによって観察された突然変異は、進化を通じて高度に保存されているＲ２１及びＳ２２アミノ酸に影響を及ぼし（図２Ａ）、ＲＳｘＴｘＰモチーフにおいて最初の２つを形成する。スレオニンＴ２４がリン酸化されると、モチーフは１４－３－３タンパク質の標準的な結合部位となり、ＦＯＸＯ１を核から細胞質へと輸出し、そこでタンパク質はユビキチン化及びプロテアソーム分解を受ける。Ｓ２２残基は、それ自体がＡＭＰＫによってリン酸化され、２つの機構：ＡＫＴによるＴ２４リン酸化の低減及び立体障害による１４－３－３結合の遮断によってＦＯＸＯ１の輸出を阻害する（Ｓａｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１９，２９４，１３１０６－１３１１６）。本発明者らは、Ｓ２２を嵩高いトリプトファンで置換すると、ＦＯＸＯ１の核外輸送が同様に阻害されると仮定する。
ＦＯＸＯ１は、インスリンシグナル伝達の下流の重要な転写因子である。絶食状態では、インスリンなしで、ＦＯＸＯ１は肝細胞の核において活性であり、糖新生、解糖及び脂肪分解経路における遺伝子の発現を上方制御する。インスリンがその受容体に結合すると、ＡＫＴはＰＩ３Ｋを介して活性化される。続いて、ＡＫＴは核内のＦＯＸＯ１をリン酸化し、Ｔ２４のスレオニンは３つの既知のＡＫＴリン酸化標的の１つである。慢性肝疾患において本発明者らによって観察された突然変異は、進化を通じて高度に保存されているＲ２１及びＳ２２アミノ酸に影響を及ぼし（図２Ａ）、ＲＳｘＴｘＰモチーフにおいて最初の２つを形成する。スレオニンＴ２４がリン酸化されると、モチーフは１４－３－３タンパク質の標準的な結合部位となり、ＦＯＸＯ１を核から細胞質へと輸出し、そこでタンパク質はユビキチン化及びプロテアソーム分解を受ける。Ｓ２２残基は、それ自体がＡＭＰＫによってリン酸化され、２つの機構：ＡＫＴによるＴ２４リン酸化の低減及び立体障害による１４－３－３結合の遮断によってＦＯＸＯ１の輸出を阻害する（Ｓａｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１９，２９４，１３１０６－１３１１６）。本発明者らは、Ｓ２２を嵩高いトリプトファンで置換すると、ＦＯＸＯ１の核外輸送が同様に阻害されると仮定する。
【0200】
この仮説を評価するために、ＨｅｐＧ２（図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｄ、図１０Ｅ）、Ｈｅｐ３Ｂ（図１０Ｆ）及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５（図１０Ｇ）ＨＣＣ細胞株を、以下に記載されるように、Ｃ末端緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰ）に融合された野生型、Ｒ２１Ｌ又はＳ２２Ｗ変異体を含むＦＯＸＯ１のレトロウイルス構築物で形質導入した。
【0201】
ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞はＡＴＣＣから入手し、５％ＣＯ２大気中のダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium、ＤＭＥＭ）／１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で培養した。細胞同一性を、ＳＴＲ（短い縦列リピート）遺伝子型決定によって確認した。細胞をマイコプラズマ汚染について定期的に試験し、常に陰性であることが見出された。インスリン（Ｓｉｇｍａ）刺激は、１００ｎＭの最終濃度で１５分間インスリンを添加する前に、無血清ＤＭＥＭ中で１６時間細胞を培養することによって実行した。
【0202】
細胞を、ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ Ｉｎｃ．から購入した野生型ＦＯＸＯ１（ＮＭ＿００２０１５．４）（ＶＢ１９０７０９－１０３０ｐｗｋ）、ＦＯＸＯ１Ｒ２１Ｌ（ＶＢ１９０７０９－１０２８ｂｊｍ）又はＦＯＸＯ１Ｓ２２Ｗ（ＶＢ１９０７０９－１０３２ｎｗａ）を含有するレトロウイルスベクター（ｐＭＳＣＶ－ｈＦＯＸＯｌ－ｅＧＦＰ：Ｐ２Ａ：ピューロマイシン）で形質導入した。
【0203】
結果：
血清飢餓下では、野生型及び変異体ＦＯＸＯ１－ＧＦＰの両方が、インスリンシグナル伝達の非存在下で予想されるように、主に核に局在した。インスリン又は血清の添加により、野生型ＦＯＸＯ１－ＧＦＰで形質導入された細胞は、インスリンの既知の効果と一致して、タンパク質の迅速な核外輸送を示した。しかしながら、インスリン又は血清の存在下でさえ、変異体ＦＯＸＯ１－ＧＦＰで形質導入された細胞は、高い核－細胞質比で、実質的なレベルの核タンパク質を維持した。ＦＯＸＯ１中のリン酸化Ｔ２４に対する抗体は、突然変異体構築物への結合を示さなかった（図１０Ｈ）。
血清飢餓下では、野生型及び変異体ＦＯＸＯ１－ＧＦＰの両方が、インスリンシグナル伝達の非存在下で予想されるように、主に核に局在した。インスリン又は血清の添加により、野生型ＦＯＸＯ１－ＧＦＰで形質導入された細胞は、インスリンの既知の効果と一致して、タンパク質の迅速な核外輸送を示した。しかしながら、インスリン又は血清の存在下でさえ、変異体ＦＯＸＯ１－ＧＦＰで形質導入された細胞は、高い核－細胞質比で、実質的なレベルの核タンパク質を維持した。ＦＯＸＯ１中のリン酸化Ｔ２４に対する抗体は、突然変異体構築物への結合を示さなかった（図１０Ｈ）。
【0204】
１０５個の代謝産物のレベルを、野生型又はＳ２２Ｗ ＦＯＸＯ１－ＧＦＰを有するＨｅｐＧ２細胞（インスリンあり及びなし）について、５つの独立した複製において測定した（図１０Ｃ）。全体として、４３個の代謝産物が、Ｓ２２Ｗ構築物と野生型構築物との間で有意に異なり、解糖／糖新生及びペントースリン酸経路における多くの中間体が、ヘキソースリン酸、ペントースリン酸、セドヘプツロース７－リン酸、グリセルアルデヒド３－リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸を含む、突然変異体ＦＯＸＯ１－ＧＦＰを有する細胞内で上昇した。
【0205】
形質導入されたＨｅｐＧ２細胞株のＲＮＡ配列決定は、細胞周期（ｑ＜０．０００１）、脂質異化作用（ｑ＜０．０００１）及びＦＯＸＯ媒介転写標的（ｑ＝０．００８）に関与する遺伝子セットの有意な上方制御；並びにアポトーシス促進プロセス（ｑ＝０．０００４）及び標準的な解糖（ｑ＜０．０００１）に関連する遺伝子セットの下方制御を明らかにした。（図１０Ｈ～図１０Ｌ）。これは、慢性肝疾患において見られる再発性ＦＯＸＯ１突然変異が機能的であり、肝細胞代謝の変化を誘導し、肝細胞生存の変化に寄与することを示唆する。
【0206】
実施例３：ドライバー突然変異を有するクローン及び患者の特性
肝臓の８つのクイノーセグメントの全てがサンプリングされた２人の患者について、同定されたドライバー突然変異及び他のゲノム特徴が複数の領域にわたって複製されたことが見出され、このことは、単一の試料からの知見が肝臓全体を広く代表することを示唆している。したがって、分析した肝臓試料から外挿することにより、有意な遺伝子のそれぞれにドライバー突然変異を有する全肝腫瘤を推定した（図１２Ａ）。これは、第一に、ドライバー突然変異を有するクローンが一部の患者において数百グラムの肝臓質量を占め得ること、及び第二に、ドライバーの分布が、どの遺伝子が影響を受け、どのレベルの関与が観察されたかについて、かなりの患者間変動を示すことを明らかにした。興味深いことに、ＦＯＸＯ１（ｐ＝０．００５、ウィルコクソン検定）、ＣＩＤＥＢ（ｐ＝０．００１）及びＡＣＶＲ２Ａ（ｐ＝０．００１）における突然変異を保有するクローンの推定サイズは、野生型クローンよりも平均して大きく（図１２Ｂ）、このことは、これらの突然変異がクローンに選択的利点を付与し、それらの優先的拡大を可能にすることを示している。
肝臓の８つのクイノーセグメントの全てがサンプリングされた２人の患者について、同定されたドライバー突然変異及び他のゲノム特徴が複数の領域にわたって複製されたことが見出され、このことは、単一の試料からの知見が肝臓全体を広く代表することを示唆している。したがって、分析した肝臓試料から外挿することにより、有意な遺伝子のそれぞれにドライバー突然変異を有する全肝腫瘤を推定した（図１２Ａ）。これは、第一に、ドライバー突然変異を有するクローンが一部の患者において数百グラムの肝臓質量を占め得ること、及び第二に、ドライバーの分布が、どの遺伝子が影響を受け、どのレベルの関与が観察されたかについて、かなりの患者間変動を示すことを明らかにした。興味深いことに、ＦＯＸＯ１（ｐ＝０．００５、ウィルコクソン検定）、ＣＩＤＥＢ（ｐ＝０．００１）及びＡＣＶＲ２Ａ（ｐ＝０．００１）における突然変異を保有するクローンの推定サイズは、野生型クローンよりも平均して大きく（図１２Ｂ）、このことは、これらの突然変異がクローンに選択的利点を付与し、それらの優先的拡大を可能にすることを示している。
【0207】
ＦＯＸＯ１におけるＳ２２Ｗホットスポット突然変異、並びにＣＩＤＥＢ及びＧＰＡＭにおける突然変異は、健康な対照肝臓試料では観察されなかったが、ＡＲＬＤ及びＮＡＦＬＤの両方からの肝臓組織で見られ、これらの選択的利点が疾患の発症又は進行の間に現れることを暗示している。中等度のコホートサイズにもかかわらず、ＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ及びＧＰＡＭにおける突然変異は、広範な患者の特徴：両方の性別；広い年齢範囲；２型糖尿病の有無；及び様々な重症度の組織学的異常、にわたって見られた（図１２Ｃ～図１２Ｅ）。これは、コホートからの結果がＡＲＬＤ及びＮＡＦＬＤ患者にわたって一般化されることを示唆する。
【0208】
実施例４：ＨＣＣの選択的ランドスケープとの比較
選択的ランドスケープをＨＣＣと比較するために、ＩＣＧＣデータポータルに記録されたフランス、日本、中国及び米国から１６７０個のＨＣＣについての突然変異コールにアクセスした。以前に報告されているように、ＡＣＶＲ２Ａは、ＨＣＣにおける既知の腫瘍抑制遺伝子であり（例えば、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｅｌｌ１６９，１３２７－１３４１（２０１７）を参照されたい）、１６７０個のＨＣＣにおいて報告された７７個の非同義突然変異を有する（本発明者らの１５９０個の慢性肝疾患ゲノムにおける１６個の点変異及び４個の構造バリアントと比較して；補足表Ｓ８～Ｓ９）。ＴＮＲＣ６Ｂはまた、ＨＣＣにおいて有意に突然変異しており（ｑ＝０．０００１）、タンパク質短縮突然変異が優勢である（２４個のバリアント）。このことは、それがＨＣＣ並びにＡＲＬＤ及びＮＡＦＬＤからの再生肝臓における腫瘍抑制遺伝子であることを示唆している。
選択的ランドスケープをＨＣＣと比較するために、ＩＣＧＣデータポータルに記録されたフランス、日本、中国及び米国から１６７０個のＨＣＣについての突然変異コールにアクセスした。以前に報告されているように、ＡＣＶＲ２Ａは、ＨＣＣにおける既知の腫瘍抑制遺伝子であり（例えば、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｅｌｌ１６９，１３２７－１３４１（２０１７）を参照されたい）、１６７０個のＨＣＣにおいて報告された７７個の非同義突然変異を有する（本発明者らの１５９０個の慢性肝疾患ゲノムにおける１６個の点変異及び４個の構造バリアントと比較して；補足表Ｓ８～Ｓ９）。ＴＮＲＣ６Ｂはまた、ＨＣＣにおいて有意に突然変異しており（ｑ＝０．０００１）、タンパク質短縮突然変異が優勢である（２４個のバリアント）。このことは、それがＨＣＣ並びにＡＲＬＤ及びＮＡＦＬＤからの再生肝臓における腫瘍抑制遺伝子であることを示唆している。
【0209】
コホートにおいて非常に頻繁に変異した３つの代謝遺伝子ＦＯＸＯ１、ＣＩＤＥＢ及びＧＰＡＭは、ＨＣＣにおいて有意に変異しなかった（それぞれｑ＝１．０、１．０及び０．６）。ＦＯＸＯ１ Ｓ２２Ｗ突然変異は、１６７０個のＨＣＣのうち３個のみで見出され（０．１８％、Ｃｌ９５％＝０．０５～０．６％）、コホートにおいてこの突然変異を保有する２４個のクローンよりも有意に低かった（ｐ＝２×１０－５、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）。ＧＰＡＭについて、同義突然変異に対する非同義突然変異の分布は、単一遺伝子として試験した際の予測とは有意に異なっていたが（ｐ＝０．００６）、多重仮説検定の補正ではもはや有意ではなかった（ｑ＝０．６）。
【0210】
実施例５：テロメア長及び遺伝率
Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４７，５０５－５１１（２０１５）、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４４，７６０－４（２０１２）、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４８，５００－５０９（２０１６）、及びＬｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５７８，１１２－１２１（２０２０）に報告されているように、大多数のＨＣＣは、テロメラーゼ遺伝子であるＴＥＲＴを活性化させる突然変異を有する。しかしながら、ここで研究した再生結節では、ＴＥＲＴプロモーター中の標準的ホットスポットに影響を及ぼす１つの突然変異のみが観察された。試料中のテロメア動態を評価するために、各マイクロダイセクションについてのテロメア長（Ｆａｒｍｅｒｙ，Ｊ．Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１８，８，１－１７）を推定した。
Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４７，５０５－５１１（２０１５）、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４４，７６０－４（２０１２）、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４８，５００－５０９（２０１６）、及びＬｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５７８，１１２－１２１（２０２０）に報告されているように、大多数のＨＣＣは、テロメラーゼ遺伝子であるＴＥＲＴを活性化させる突然変異を有する。しかしながら、ここで研究した再生結節では、ＴＥＲＴプロモーター中の標準的ホットスポットに影響を及ぼす１つの突然変異のみが観察された。試料中のテロメア動態を評価するために、各マイクロダイセクションについてのテロメア長（Ｆａｒｍｅｒｙ，Ｊ．Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１８，８，１－１７）を推定した。
【0211】
テロメアリード（ＴＴＡＧＧＧ及びＣＣＣＴＡＡ六量体を含有する）について対応するＷＧＳデータを分析することによって、研究した各マイクロダイセクションのテロメア長（塩基対の単位で）を推定した。これを達成するために、Ｔｅｌｏｍｅｒｅｃａｔ ｖ３．４．０ソフトウェアを使用し（Ｆａｒｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１９））、長さ補正を可能にし、シミュレーションの数を１００に設定して長さ推定値の不確実性を抑制した。各ＳＮＶクラスターに、最も高いＶＡＦ中央値を有するメンバーマイクロダイセクションに対応するテロメア長を割り当てた。
【0212】
テロメア長は、ベイズ混合効果モデルを使用してモデル化され、これらは、本発明者らがテロメア長に対する年齢、クローンサイズ及び疾患の効果を評価することを可能にし、同時に、クローン間の系統発生的関係及び患者内の非独立性から生じる相関を制御及び定量した。使用した特定のアルゴリズムは、ＲパッケージＭＣＭＣｇｌｍｍ（Ｈａｄｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｆｔｗ．２０１０，３３，１－２２）であった。
【0213】
これらのモデルを効果的に使用するために、系統樹上のクローン間の関連性マトリックスを構築した。これは、木をウルトラメトリックにすることを必要とした（すなわち、全ての先端が同じ点で終了する）ことを必要とした。木をウルトラメトリックにするための既存の方法があるが、それらは、正常組織における体細胞突然変異についての現在の目的に特に適していなかった。本発明者らは、初期突然変異の真の数を推定するためのより多くの検出力を確立した（初期突然変異は、２回以上のマイクロダイセクションにおいて、平均して、より高いバリアント対立遺伝子画分において見られるため）。本発明者らによって見出された後期のシングルトン枝の枝長の推定値は、それほど確かではない。したがって、本発明者らは、各分岐点（合体）を分子時間の所与の割合に置くための再帰関数を開発した。木の根から開始し、先端に向かって進行して、各合体の位置は、根とその合体との間で獲得された変異の数を、その数に合体から下降する枝における突然変異の数の平均を加えたもので割ったものとして推定される。
【0214】
ベイズ線形混合効果モデルを使用して、テロメア長をモデル化した。従属変数は、各クローンの平均テロメア長（「長さ」）であり、塩基対で測定され、ガウス分布に従うと予想された。固定効果は以下の通りであった：病因（ＡＲＬＤ及びＮＡＦＬＤについてのダミー変数）；患者の年齢（歳）；そのクローンにおける突然変異の数；及びクローン面積。本発明者らは、各患者についてのランダム効果と、ブロック対角行列の形態で符号化された系統関係についてのランダム効果とを適合させた。先行物は、情報価値のない逆ウィッシャート分布であった。ＭＣＭＣチェーンは、バーンインとしてこれらのうちの１，０００，０００個を用いて１１，０００，０００回の反復について実行し、１０００回の反復ごとに間引きした。
【0215】
ＭＣＭＣチェーンに関する通常の診断をチェックし、これらは、（１）バーンインが完了した後に変数に系統的な傾向がなかったことを示した（バーンインは十分な長さであった）；（２）自己相関は、チェーンの１０００番目のインスタンスごとに間引きされた隣接推定値の間で比較的低かった；（３）収束の診断試験は全て合格であったことを示した。
【0216】
テロメア長の「体細胞遺伝率」の推定値は、系統発生関係を記述する変数に起因するランダム効果における分散成分対残留分散及び患者間効果に起因する分散を計算することによって導出された。テロメア長についての「体細胞遺伝率」の推定値は、２１％（９５％事後間隔＝０～４４％）であった。すなわち、年齢、疾患及びクローンサイズの影響が説明されると、コホートにわたるテロメア長の残留変動の約２１％は、クローン間の系統発生関係によって説明することができる。しかしながら、この推定値にはいくらかの不安定性があり、おそらくＭＣＭＣ鎖の反復の約２６％は体細胞遺伝率を示唆しない。いずれにしても、この試料間相関の交絡効果は、モデリングフレームワーク内で補正されている。
【0217】
結果：
全ゲノム配列決定データからの各マイクロダイセクションについてのテロメア長を推定した。コホート全体にわたってテロメア長にかなりの個体間及び個体内変動が観察され、正常肝臓と比較してＮＡＦＬＤ及びＡＲＬＤではテロメアが明らかに短かった（図１３Ａ、図１３Ｂ及び図Ｂ１５。これらのテロメア長を系統樹上に階層化すると、平均して、より密接に関連するクローンが、関連しないクローンよりも類似したテロメア長を有することが明らかになった（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。
全ゲノム配列決定データからの各マイクロダイセクションについてのテロメア長を推定した。コホート全体にわたってテロメア長にかなりの個体間及び個体内変動が観察され、正常肝臓と比較してＮＡＦＬＤ及びＡＲＬＤではテロメアが明らかに短かった（図１３Ａ、図１３Ｂ及び図Ｂ１５。これらのテロメア長を系統樹上に階層化すると、平均して、より密接に関連するクローンが、関連しないクローンよりも類似したテロメア長を有することが明らかになった（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。
【0218】
ベイズ混合効果モデルを使用してテロメア長をモデル化した。これは、テロメア長に対する年齢、クローンサイズ及び疾患の効果の評価を可能にし、同時に、クローン間の系統発生的関係から生じる相関を制御した。正常な肝臓と比較して、テロメア長は、ＡＲＬＤを有する患者においてかなり短かった（平均Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ＝－４４０ｂｐ；９５％事後間隔（Ｐｌ９５％）＝－７５０：１３０ｂｐ；ｐＰｏｓｔｅｒｉｏｒ＝０．００９）及びＮＡＦＬＤ（平均Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ＝－５５０ｂｐ；Ｐｌ９５％＝－８２０：２７０ｂｐ；ｐＰｏｓｔｅｒｉｏｒ＝０．０００６；図１２Ｃ）。疾患についてのこれらの効果の大きさは、年齢に伴うテロメア長の比較的わずかな短縮をかなり上回った（平均Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ＝－６ｂｐ／１０歳；Ｐｌ９５％＝－１５：＋２ｂｐ／１０歳；ＰＰｏｓｔｅｒｉｏｒ＝０．１）。更に、テロメアは、クローンのサイズが増加するにつれて次第に短くなった（平均Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ＝－１００ｂｐ／ｌｏｇ１０（μｍ２）；Ｐｌ９５％＝－１６０：－５０ｂｐ／ｌｏｇ１０（μｍ２）；ｐＰｏｓｔｅｒｉｏｒ＜０．０００１）。
【0219】
これらのデータは、ＡＲＬＤ及びＮＡＦＬＤがテロメアの実質的な減少に関連しており、年齢に伴うテロメア長の比較的小さな短縮を上回っていることを示唆している。更に、テロメアは、クローンのサイズが増加するにつれて次第に短くなるが、これはおそらく、疾患進行中の肝細胞再生に関連する余分な細胞分裂を反映している。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図10H】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図16G】
【図16H】
【図16I】
【図17】
【国際調査報告】