特表 2023-543829 害虫制御のためのミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-18

(54)【発明の名称】害虫制御のためのミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20231011BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20231011BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231011BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231011BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20231011BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231011BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20231011BHJP

   A01P 7/04 20060101ALI20231011BHJP

   A01N 63/50 20200101ALI20231011BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/435 ZNA

C12N1/19

C07K19/00

C12P21/02 A

C12N15/63 Z

C12N15/113 Z

A01P7/04

A01N63/50

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023519531

(86)(22)【出願日】2021-09-27

(85)【翻訳文提出日】2023-05-25

(86)【国際出願番号】 US2021052259

(87)【国際公開番号】W WO2022067214

(87)【国際公開日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】63/084,339

(32)【優先日】2020-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522410008

【氏名又は名称】ヴェスタロン・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】カイル・シュナイダー

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンドラ・ハーゼ

(72)【発明者】

【氏名】ブレック・デイヴィス

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H011

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG30

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA12

4B065AA72X

4B065AA76X

4B065AA77X

4B065AA79X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA48

4H011AC01

4H011BB06

4H011BB19

4H011DH11

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA51

4H045DA83

4H045EA06

4H045FA74

(57)【要約】

新しい殺虫ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及びヌクレオチド；培養及び植物におけるそれらの発現；そのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及びヌクレオチドを産生する方法；新しいプロセス；新しい産生技術；新しい製剤；並びに新しい生物が開示される。本開示はまた、アメリカ砂漠クモ（Ｄｉｇｕｅｔｉａ ｃａｎｉｔｉｅｓ）から単離されたペプチド、ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａの天然に存在しない修飾形態である、Ｄｃ１ａ－バリアントポリペプチド（ＤＶＰ）と名づけられた新規の種のペプチドに関する。本明細書では、ＤＶＰをコードする遺伝子、遺伝子及びペプチドの両方の様々な製剤及び組み合わせ、並びに昆虫の制御に有用であるそれを使用するための方法について説明する。更に、本発明は、４つ以上のジスルフィド結合を有するポリペプチドから１つ以上のジスルフィド結合を除去することによって作製された、シスチンノット（ＣＫ）構造を有する新規組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシン（ｄｉｇｕｅｔｏｘｉｎ）バリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、ジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶである場合、ジスルフィド結合が除去される、請求項１に記載のＤＶＰ。

【請求項3】

前記ＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む、請求項１に記載のＤＶＰ。

【請求項4】

前記ＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む、請求項３に記載のＤＶＰ。

【請求項5】

前記ＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む、請求項４に記載のＤＶＰ。

【請求項6】

前記ＤＶＰが、２つ以上のＤＶＰのホモポリマー又はヘテロポリマーであり、各ＤＶＰの前記アミノ酸配列が、同じであるか、又は異なる、請求項１に記載のＤＶＰ。

【請求項7】

前記ＤＶＰが、切断可能又は切断不能リンカーによって分離された２つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質であり、各ＤＶＰの前記アミノ酸配列が、同じである場合も異なる場合もある、請求項１に記載のＤＶＰ。

【請求項8】

前記切断可能なリンカーが、昆虫の腸内又は血液リンパ内で切断可能である、請求項７に記載のＤＶＰ。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載のＤＶＰ又はそれらの組み合わせと、賦形剤と、を含む、組成物。

【請求項10】

ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドであって、前記ＤＶＰが、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列。

【請求項11】

前記ポリヌクレオチドが、ＤＶＰをコードする場合、Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶである場合、ジスルフィド結合が除去される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記ポリヌクレオチドが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を有するＤＶＰをコードする、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記ポリヌクレオチドが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を有するＤＶＰをコードする、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項14】

前記ポリヌクレオチドが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を有するＤＶＰをコードする、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

ＤＶＰを産生する方法であって、
（ａ）ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド又はその相補的ヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットを含むベクターを調製することであって、前記ＤＶＰが、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、調製することと、
（ｂ）前記ベクターを酵母細胞に導入することと、
（ｃ）前記ＤＶＰの発現及び増殖培地への分泌を可能にするように動作可能な条件下で、前記増殖培地中で前記酵母細胞を増殖することと、を含む、方法。

【請求項16】

Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶである場合、ジスルフィド結合が除去される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記ＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ＤＶＰが、２つ以上のＤＶＰのホモポリマー又はヘテロポリマーであり、各ＤＶＰの前記アミノ酸配列が、同じであるか、又は異なる、請求項１５に記載の方法。

【請求項21】

前記ＤＶＰが、切断可能又は切断不能リンカーによって分離された２つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質であり、各ＤＶＰの前記アミノ酸配列が、同じである場合も異なる場合もある、請求項１５に記載の方法。

【請求項22】

前記切断可能なリンカーが、昆虫の腸内又は血液リンパ内で切断可能である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ベクターが、アルファ－ＭＦシグナルを含むプラスミドである、請求項１５に記載の方法。

【請求項24】

前記ベクターが、酵母細胞中に形質転換される、請求項１５に記載の方法。

【請求項25】

前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の任意の種から選択される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記酵母細胞が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記酵母細胞が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓである、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＤＶＰが、前記増殖培地中に分泌される、請求項１５に記載の方法。

【請求項29】

前記ＤＶＰの発現が、酵母培養培地１リットル当たり、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ ２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１００，０００ｍｇ／ＬのＤＶＰの収量を提供する、請求項１５に記載の方法。

【請求項30】

前記培地中の前記ＤＶＰの発現が、前記培地中の単一のＤＶＰの前記発現をもたらす、請求項１５に記載の方法。

【請求項31】

前記培地中の前記ＤＶＰの発現が、前記培地中の２つ以上のＤＶＰポリペプチドを含むＤＶＰポリマーの前記発現をもたらす、請求項１５に記載の方法。

【請求項32】

前記ベクターが、２つ又は３つの発現カセットを含み、各発現カセットが、前記第１の発現カセットの前記ＤＶＰをコードするように動作可能である、請求項１５に記載の方法。

【請求項33】

前記ベクターが、２つ又は３つの発現カセットを含み、各発現カセットが、前記第１の発現カセットの前記ＤＶＰ、又は異なる発現カセットのＤＶＰをコードするように動作可能である、請求項１５に記載の方法。

【請求項34】

前記発現カセットが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能である、請求項１５に記載の方法。

【請求項35】

前記発現カセットが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記発現カセットが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

害虫を駆除、制御、又は阻害する方法であって、農薬有効量の請求項９に記載の組成物を、前記害虫の遺伝子座に、又は前記害虫による攻撃を受けやすい植物若しくは動物に適用することを含む、方法。

【請求項38】

前記害虫が、アヒマスフィンクスモス（ホーンワーム）（Ｅｕｍｏｒｐｈａ ａｃｈｅｍｏｎ）、アルファルファキャタピラー（Ｃｏｌｉａｓ ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ）、アーモンドモス（Ｃａｕｄｒａ ｃａｕｔｅｌｌａ）、アモルビアモス（Ａｍｏｒｂｉａ ｈｕｍｅｒｏｓａｎａ）、アーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．、例えば、ｅｘｉｇｕａ、ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、アーティチョークプルームモス（Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ）、アゼリアキャタピラー（Ｄａｔａｎａ ｍａｊｏｒ）、バッグワーム（Ｔｈｙｒｉｄｏｐｔｅｒｙｘ）、ｅｐｈｅｍｅｒａｅｆｏｒｍｉｓ）、バナナモス（Ｈｙｐｅｒｃｏｍｐｅ ｓｃｒｉｂｏｎｉａ）、バナナスキッパー（Ｅｒｉｏｎｏｔａ ｔｈｒａｘ）、ブラックヘディッドバドワーム（Ａｃｌｅｒｉｓ ｇｌｏｖｅｒａｎａ）、カルフォルニアオークワーム（Ｐｈｒｙｇａｎｉｄｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、スプリングキャンカーワーム（Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ ｍｅｒｒｉｃｃａｔａ）、チェリーフルーツワーム（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｐａｃｋａｒｄｉ）、チャイナマークモス（Ｎｙｍｐｈｕｌａ ｓｔａｇｎａｔａ）、シトラスカットワーム（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ ｃｕｒｉａｌｉｓ）、コドリングモス（Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、クランベリーフルーツワーム（Ａｃｒｏｂａｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｉｉ）、クロスストライプドキャベッジワーム（Ｅｖｅｒｇｅｓｔｉｓ ｒｉｍｏｓａｌｉｓ）、カットワーム（Ｎｏｃｔｕｉｄ種、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、ダグラスファータソックモス（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）、エルロモス（ホーンワーム）（Ｅｒｉｎｎｙｉｓ ｅｌｌｏ）、エルムスパンワーム（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ）、ヨーロピアングレープヴァインモス（Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ）、ヨーロピアンスキッパー（Ｔｈｙｍｅｌｉｃｕｓ ｌｉｎｅｏｌａ）、エセックススキッパー、フォールウェブワーム（Ｍｅｌｉｓｓｏｐｕｓ ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎｕｓ））、フィルバートリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ｒｏｓａｎｕｓ））、フルーツツリーリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌｉａ））、グレープベリーモス（Ｐａｒａｌｏｂｅｓｉａ ｖｉｔｅａｎａ））、グレープリーフローラー（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ））、グレープリーフスケルトナイザー（Ｈａｒｒｉｓｉｎａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ））、グリーンストライプドメープルワーム（Ｄｒｙｏｃａｍｐａ ｒｕｂｉｃｕｎｄａ））、Ｇｕｍｍｏｓｏｓ－Ｂａｔｒａｃｈｅｄｒａ ｃｏｍｏｓａｅ（ホッジズ）、ジプシーモス（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）、ヘムロックルーパー（Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ）、ホーンワーム（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｐｐ．）、インポーテッドキャベッジワーム（Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ）、アイオモス（Ａｕｔｏｍｅｒｉｓ ｉｏ）、ジャックパインバドワーム（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｐｉｎｕｓ）、ライトブラウンアップルモス（Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ）、メロンワーム（Ｄｉａｐｈａｎｉａ ｈｙａｌｉｎａｔａ）、ミモザウェブワーム（Ｈｏｍａｄａｕｌａ ａｎｉｓｏｃｅｎｔｒａ）、オブリークバンディッドリーフローラー（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ）、オリアンダーモス（Ｓｙｎｔｏｍｅｉｄａ ｅｐｉｌａｉｓ）、オムニバラスリーフローラー（Ｐｌａｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ）、オムニバラスルーパー（Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ ａｅｇｒｏｔａｔａ）、オレンジドッグ（Ｐａｐｉｌｉｏ ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ）、オレンジトートリクス（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｃｉｔｒａｎａ）、オリエンタルフルーツモス（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）、ピーチツイグボーア（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ）、パインバタフライ（Ｎｅｏｐｈａｓｉａ ｍｅｎａｐｉａ）、ポッドワーム、レッドバンディッドリーフローラー（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｖｅｌｕｔｉｎａｎａ）、レッドハンプトキャタピラー（Ｓｃｈｉｚｕｒａ ｃｏｎｃｉｎｎａ）、リンドワームコンプレックス（Ｖａｒｉｏｕｓ Ｌｅｐｓ．）、サドルバックキャタピラー（Ｓｉｂｉｎｅ ｓｔｉｍｕｌｅａ）、サドルプロミネントキャタピラー（Ｈｅｔｅｒｏｃａｍｐａ ｇｕｔｔｉｖｉｔｔａ）、ソルトマーシュキャタピラー（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ ａｃｒｅａ）、ソッドウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｓｐｐ．）、スパンワーム（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ）、フォールキャンカーワーム（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｍｅｔａｒｉａ）、スプルースバドワーム（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）、テントキャタピラー（Ｖａｒｉｏｕｓ Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、Ｔｈｅｃｌａ－Ｔｈｅｃｌａ Ｂａｓｉｌｉｄｅｓ（Ｇｅｙｒ）（Ｔｈｅｃｌａ ｂａｓｉｌｉｄｅｓ）、タバコホーンワーム（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）、タバコモス（Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｅｌｕｔｅｌｌａ）、タフテッドアップルバドモス（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｉｄａｅｕｓａｌｉｓ）、トゥイグボーア（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ）、ベアリアゲイティドカットワーム（Ｐｅｒｉｄｒｏｍａ ｓａｕｃｉａ）、ベアリアゲイティドリーフローラー（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｆｌａｖｅｄａｎａ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ウォルナットキャタピラー（Ｄａｔａｎａ ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ）、ウェブワーム（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ）、ウエスタンタソックモス（Ｏｒｇｙｉａ ｖｅｔｕｓｔａ）、サザンコーンストークボーア（Ｄｉａｔｒａｅａ ｃｒａｍｂｉｄｏｉｄｅｓ）、コーンイアワーム、スイートポテトウィービル、ペッパーウィービル、シトラスルートウィービル、ストロベリールートウィービル、ピーカンウィービル）、フィルバートウィービル、ライスウォーターウィービル、アルファルファウィービル、クローバーウィービル、ティーショット－ホールボーア、ルートウィービル、シュガーケインビートル、コーヒーベリーボーア、アニュアルブルーグラスウィービル（Ｌｉｓｔｒｏｎｏｔｕｓ ｍａｃｕｌｉｃｏｌｌｉｓ）、アジアティックガーデンビートル（Ｍａｌａｄｅｒａ ｃａｓｔａｎｅａ）、ヨーロピアンチェ－ファー（Ｒｈｉｚｏｔｒｏｑｕｓ ｍａｊａｌｉｓ）、グリーンジューンビートル（Ｃｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ）、ジャパニーズビートル（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、メイオアジューンビートル（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｓｐ．）、ノーザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、オリエンタルビートル（Ａｎｏｍａｌａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、サザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｌｕｒｉｄａ）、ビルバグ（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ｂｕｓｓｅｏｌａ ｆｕｓｃａ、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ、Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、及びＸａｎｔｈｏｇａｌｅｒｕｃａ ｌｕｔｅｏｌａからなる群からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記害虫が、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ｂｕｓｓｅｏｌａ ｆｕｓｃａ、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ、Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、及びＸａｎｔｈｏｇａｌｅｒｕｃａ ｌｕｔｅｏｌａからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項41】

前記ポリヌクレオチドが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能である、請求項４０に記載のベクター。

【請求項42】

前記ポリヌクレオチドが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能である、請求項４１に記載のベクター。

【請求項43】

酵母細胞であって、
（ａ）ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含む第１の発現カセットであって、前記ＤＶＰが、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、第１の発現カセット、又はその相補的ヌクレオチド配列を含む、酵母細胞。

【請求項44】

Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶである場合、ジスルフィド結合が除去される、請求項４３に記載の酵母細胞。

【請求項45】

前記ＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む、請求項４３に記載の酵母細胞。

【請求項46】

前記ＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む、請求項４５に記載の酵母細胞。

【請求項47】

前記ＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む、請求項４６に記載の酵母細胞。

【請求項48】

前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の任意の種から選択される、請求項４３に記載の酵母細胞。

【請求項49】

前記酵母細胞が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群から選択される、請求項４８に記載の酵母細胞。

【請求項50】

前記酵母細胞が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ又はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓである、請求項４９に記載の酵母細胞。

【請求項51】

組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）であって、前記組換えＣＲＰが、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を含み、

【化1】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、
システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、
前記第１のジスルフィド結合、前記第２のジスルフィド結合、及び前記第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、
前記第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、前記シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、
式中、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、
Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの組み合わせが、任意選択で、存在せず、
前記組換えＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを修飾することによって作製されており、前記１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、前記第１のジスルフィド結合でも、前記第２のジスルフィド結合でも、前記第３のジスルフィド結合でもなく、前記１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、前記ＣＫモチーフを形成せず、
前記修飾可能なＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾されており、
１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する前記修飾可能なＣＲＰから前記１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、前記式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する前記組換えＣＲＰをもたらし、
前記式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する前記組換えＣＲＰが、前記式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する、組換えシステインリッチタンパク質。

【請求項52】

前記ジスルフィド結合トポロジーが、以下のシスチンノットモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを形成する、請求項５１に記載の組換えＣＲＰ。

【請求項53】

前記ジスルフィド結合トポロジーが、ＩＣＫモチーフを形成する、請求項５２に記載の組換えＣＲＰ。

【請求項54】

前記修飾可能なＣＲＰが、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントである、請求項５１に記載の組換えＣＲＰ。

【請求項55】

前記修飾可能なＣＲＰが、配列番号１～２、１９３、１９５、又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の組換えＣＲＰ。

【請求項56】

前記組換えＣＲＰが、配列番号６～１４、１９７、１９９、又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の組換えＣＲＰ。

【請求項57】

式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を含む、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を作製する方法であって、

【化2】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、
システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、
前記第１のジスルフィド結合、前記第２のジスルフィド結合、及び前記第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、
前記第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、前記シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、
式中、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、
Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの組み合わせが、任意選択で、存在せず、
前記方法が、
（ａ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを提供することであって、前記１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、前記第１のジスルフィド結合でも、前記第２のジスルフィド結合でも、前記第３のジスルフィド結合でもなく、前記１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、前記ＣＫモチーフを形成しない、提供することと、
（ｂ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって前記修飾可能なＣＲＰを修飾することと、を含み、
１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する前記修飾可能なＣＲＰから前記１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、前記式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する前記組換えＣＲＰをもたらし、
前記式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する前記組換えＣＲＰが、前記式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する、方法。

【請求項58】

前記ジスルフィド結合トポロジーが、以下のシスチンノットモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを形成する、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記ジスルフィド結合トポロジーが、ＩＣＫモチーフを形成する、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記修飾可能なＣＲＰが、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記修飾可能なＣＲＰが、配列番号１～２、１９３、１９５、又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記組換えＣＲＰが、配列番号６～１４、１９７、１９９、又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）の収量を増加させる方法であって、前記方法が、
（ａ）式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を有する組換えＣＲＰを作製することであって、

【化3】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、
システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、
前記第１のジスルフィド結合、前記第２のジスルフィド結合、及び前記第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、
前記第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、前記シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、
式中、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、
Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、
前記組換えＣＲＰが、以下のプロセスに従って作製される、作製すること、
（ｂ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを提供することであって、前記１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、前記第１のジスルフィド結合でも、前記第２のジスルフィド結合でも、前記第３のジスルフィド結合でもなく、前記１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、前記ＣＫモチーフを形成しない、提供すること、
（ｃ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって前記修飾可能なＣＲＰを修飾すること、を含み、
１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する前記修飾可能なＣＲＰから前記１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、前記式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する前記組換えＣＲＰをもたらし、
前記式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する前記組換えＣＲＰが、前記式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する、方法。

【請求項64】

前記ジスルフィド結合トポロジーが、以下のシスチンノットモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを形成する、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記ジスルフィド結合トポロジーが、ＩＣＫモチーフを形成する、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記修飾可能なＣＲＰが、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントである、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記修飾可能なＣＲＰが、配列番号１～２、１９３、１９５、又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記組換えＣＲＰが、配列番号６～１４、１９７、１９９、又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項70】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項71】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項72】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項73】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項74】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項75】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項76】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項77】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項78】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項79】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項80】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項81】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１３に示されるアミノ酸を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項82】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１３に示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項83】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１７に示されるアミノ酸を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項84】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１７に示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項85】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１８に示されるアミノ酸を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項86】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１８に示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項87】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１９に示されるアミノ酸を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項88】

１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、前記ＤＶＰが、配列番号２１９に示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩。

【請求項89】

アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質であって、前記１つ以上のＤＶＰが、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、前記ＤＶＰが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、融合タンパク質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項90】

Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶである場合、ジスルフィド結合が除去される、請求項８９に記載の融合タンパク質。

【請求項91】

前記１つ以上のＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む、請求項８９に記載の融合タンパク質。

【請求項92】

前記１つ以上のＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む、請求項９１に記載の融合タンパク質。

【請求項93】

前記１つ以上のＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む、請求項９２に記載の融合タンパク質。

【請求項94】

前記１つ以上のＤＶＰが、２つ以上のＤＶＰのホモポリマー又はヘテロポリマーであり、各ＤＶＰの前記アミノ酸配列が、同じであるか、又は異なる、請求項８９に記載の融合タンパク質。

【請求項95】

前記１つ以上のＤＶＰ、前記アルファ－ＭＦ、又はそれらの組み合わせが、切断可能又は切断不能リンカーによって分離されている、請求項８９に記載の融合タンパク質。

【請求項96】

前記切断可能なリンカーが、昆虫の腸内又は血液リンパ内で切断可能である、請求項９５に記載の融合タンパク質。

【請求項97】

前記アルファ－ＭＦペプチドが、酵母種由来のアルファ－ＭＦペプチドである、請求項８９に記載の融合タンパク質。

【請求項98】

前記酵母種が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の任意の種から選択される、請求項９７に記載の融合タンパク質。

【請求項99】

前記酵母種が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群から選択される、請求項９８に記載の融合タンパク質。

【請求項100】

前記酵母種が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ又はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓである、請求項９９に記載の融合タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２８日に出願された米国仮出願第６３／０８４，３３９号の利益及び優先権を主張する。前述の出願の全内容は、本明細書に援用される。

【0002】

配列表
本出願は、２０２１年９月２７日午後６：３２に作成され、１２６ＫＢであり、本明細書とともに電子的に出願された、「２２５３１２－４９７８８４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（１２６キロバイト）と題された配列表全体を参照により組み込む。

【0003】

本開示は、殺虫タンパク質、ヌクレオチド、ペプチド、植物におけるそれらの発現、ペプチドを産生する方法、新しい製剤、及び昆虫の制御のための方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

有害な昆虫は、ヒトの健康及び食料安全性に対して世界的な脅威を表している。昆虫は病気の媒介生物であるため、ヒトの健康を脅かす。病気の最も悪名高い昆虫媒介生物の１つは蚊である。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ属の蚊は、ジカウイルス、チクングニアウイルス、及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属の原虫によって引き起こされる疾患であるマラリアの主な媒介生物である。別の蚊である、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉは、黄熱病及びデング熱を引き起こすウイルスの主な媒介生物である。Ａｅｄｅｓ ｓｐｐ．の蚊は様々な種類の脳炎の原因となるウイルスの媒介生物でもある。フィラリア症を引き起こす寄生性回虫であるＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ及びＢｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉは、通常、Ｃｕｌｅｘ、Ｍａｎｓｏｎｉａ、及びＡｎｏｐｈｅｌｅｓ属の蚊によって広がる。

【0005】

蚊と同様に、Ｄｉｐｔｅｒａの他のメンバーも、同様に太古の昔から人類を悩ませてきた。痛みのある咬傷を生じることに加えて、ウマバエ（ｈｏｒｓｅｆｌｉｅｓ）及びメクラアブ（ｄｅｅｒｆｌｉｅｓ）は、野兎病（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）及び炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の細菌病原体、並びに熱帯アフリカでロア糸状虫症を引き起こす寄生性回虫（Ｌｏａ ｌｏａ）を伝播する。

【0006】

クロバエ（Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ ｍｅｇａｃｅｐｈａｌａ）及びイエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）は、一瞬で腐敗及び糞便から飛び立ち、次の瞬間に私たちの家に降り立ち、私たちの食糧に赤痢、腸チフス、コレラ、灰白髄炎、イチゴ腫、ハンセン病、及び結核を広げる。

【0007】

Ｈｉｐｐｅｌａｔｅｓ属のＥｙｅ ｇｎａｔｓは、イチゴ腫（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）を引き起こすスピロヘータ病原体を運ぶことができ、結膜炎（はやり目）も広げる可能性がある。Ｇｌｏｓｓｉｎａ属のツェツェバエは、アフリカ睡眠病を引き起こす原虫病原体（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ及びＴ．ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）を伝染させる。Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ属のサンドフライは、南アメリカでカリオン病（オロヨ熱（Ｏｒｏｙｏ ｆｅｖｅｒ））を引き起こす細菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）の媒介生物である。アジア及び北アフリカの一部では、それらは、スナバエ熱（パパタチ熱）を引き起こすウイルス病原体、並びにリーシュマニア症を引き起こす原虫病原体（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．）を伝播する。

【0008】

ヒトの食料安全性も昆虫によって脅かされている。害虫は、商業目的及び個人的使用の両方に指定された食用作物を無差別に標的にしており、実際、害虫によって引き起こされる被害は、単なる不便から、前者では経済的破綻、後者では栄養失調又は飢餓などの極端なものまで全域に及ぶ可能性がある。害虫はまた、家畜にストレス及び病気を引き起こす。かつては地理的及び気候の境界によって制限されていた害虫は、世界的な旅行及び気候変動によりその範囲を拡大した。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）を記載する。本明細書では、ＤＶＰは、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、アミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含む。

【0010】

加えて、本開示は、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの組み合わせと、賦形剤とからなる組成物を記載する。

【0011】

本開示は、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドであって、ＤＶＰが、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列を記載する。

【0012】

加えて、本開示は、ＤＶＰを生成する方法を記載し、本方法は、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、及び／又はその相補的ヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットを含むベクターを調製することであって、当該ＤＶＰが、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、調製することと、ベクターを酵母細胞に導入することと、ＤＶＰの発現及び増殖培地への分泌を可能にするように動作可能な条件下で、増殖培地中で酵母細胞を増殖することと、を含む。

【0013】

本開示は、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの組み合わせと、賦形剤とからなる組成物の農薬有効量を害虫の遺伝子座に、又は害虫による攻撃を受けやすい植物若しくは動物に適用することを含む、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を記載する。

【0014】

加えて、本開示は、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含むベクターを記載する。

【0015】

本開示はまた、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含む第１の発現カセットを含む酵母株であって、当該ＤＶＰが、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、酵母株を記載する。

【0016】

加えて、本開示は、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる組換えＣＲＰであって、

【化1】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、当該組換えＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを修飾することによって作製されており、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、ＣＫモチーフを形成せず、修飾可能なＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾されており、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらし、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する、組換えＣＲＰを提供する。

【0017】

加えて、本開示は、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を含む、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を作製する方法であって、

【化2】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、当該方法が、（ａ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを提供することであって、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、ＣＫモチーフを形成しない、提供することと、（ｂ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって、修飾可能なＣＲＰを修飾することと、を含み、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらし、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する、方法を記載する。

【0018】

本開示はまた、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）の収量を増加させる方法であって、当該方法が、（ａ）式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を有する組換えＣＲＰを作製することであって、

【化3】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、当該組換えＣＲＰが、以下のプロセスに従って作製される、作製すること、（ｂ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを提供することであって、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、ＣＫモチーフを形成しない、提供すること、（ｃ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって、修飾可能なＣＲＰを修飾すること、を含み、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらし、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する、方法を記載する。

【0019】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0020】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0021】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0022】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0023】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0024】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0025】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0026】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0027】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0028】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0029】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0030】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0031】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１３に示されるアミノ酸を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0032】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１３に示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0033】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１７に示されるアミノ酸を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0034】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１７に示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0035】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１８に示されるアミノ酸を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0036】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１８に示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0037】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１９に示されるアミノ酸を含む、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0038】

加えて、本開示は、１つ以上の昆虫種に対して殺虫活性を有するジゲトキシンバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）であって、当該ＤＶＰが、配列番号２１９に示されるアミノ酸からなる、ジゲトキシンバリアントポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【0039】

加えて、本開示は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質であって、当該１つ以上のＤＶＰが、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＤＶＰが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、融合タンパク質、又はその薬学的に許容される塩を記載する。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】野生型（ＷＴ）Ｄｃ１ａの高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）標準曲線を示す。

【図2】純粋なＷＴ Ｄｃ１ａのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図3】ＤＶＰ Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ及びＣ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｗ３１Ｆ／Ｙ３２Ｓ／Ｐ３６Ａの相対収量を示すグラフを示す。ＤＶＰ Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｗ３１Ｆ／Ｙ３２Ｓ／Ｐ３６Ａは、Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａと比較して発現が６９％増加した。

【図4】Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａのクロマトグラムを示す。バックグラウンド、折り畳み、誤って折り畳まれたバリアントを示すピークが括弧内に示される。

【図5】Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖのクロマトグラムを示す。バックグラウンド、及び折り畳まれたバリアントを示すピークはラベルで示される。

【図6】活性を失うことなく発現の増加を示す、ＤＶＰの相対的発現の要約を示すグラフを示す。ＷＴ－Ｄｃ１ａ、及び以下のＤＶＰを分析した。（１）Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ、（２）Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ、（３）Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖ、及び（４）Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖ。

【図7】ＷＴ－Ｄｃ１ａ及び以下のＤＶＰの効果を評価するハエノックダウン実験の結果を示す。（１）Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ、（２）Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ、及び（３）Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖ。用量反応曲線は、２４時間でのノックダウンパーセント（すなわち、歩行不能）（２４時間でのノックダウン％）についてハエを評価することによって生成された。

【図8】野生型（三角形）、並びにＤＶＰ：（１）２４時間時点でのＣ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ（配列番号２９）（菱形）及びＣ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖ（配列番号５３）（正方形）のノックダウンパーセントを示すグラフを示す。

【図9】ＤＶＰ－殺虫タンパク質の概略図を示す。ここでは、構成要素は、以下のように定義される。「ＥＲＳＰ」は、小胞体シグナルペプチドを指し、「ＵＢＩ」は、ユビキチンモノマーを指し、「ＤＶＰ」は、ミュー－ジゲトキシンバリアントポリペプチドを指し、「Ｌ」は、介在リンカーペプチドを指し、「ＨＩＳ」は、ヒスチジンタグを指す。

【図10】ＷＴ Ｄｃ１ａ及びＤＶＰ－殺虫タンパク質を発現した植物のＨｉｓ－Ｔａｇウエスタンブロットを示す。各レーンは、変性タンパク質ゲル条件下で実行され、標準的なウエスタンブロット技術で視覚化された粗植物抽出物を表す。ウエスタンブロットで試験した試料の短縮名は、発現の評価システムとともに画像の上に列挙されている。記号（－）は、ブロット上にタンパク質が検出されていないことを示し、タンパク質が検出される場合、記号（＋）から（＋＋＋）は検出された量を示す。「ラダー」と示されたレーンは、分子量マーカーを示す。レーン「植物ＮＥＧ」は、陰性対照（すなわち、ＧＦＰ発現タバコタンパク質抽出物）を示す。「Ｍ番号」でラベル付けされたレーンは、評価されたＤＶＰ－殺虫タンパク質の短縮名を示す。レーン「ＷＴ」は、ＷＴミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａタンパク質を有する殺虫タンパク質を示す。

【図11】バックグラウンドＤＶＰと比較した高収量ＤＶＰの収量を示すグラフを示す。ここでは、以下の変異を有するバックグラウンドＤＶＰ上で点変異を作製した：Ｄ３８Ａ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓ。バックグラウンドＤＶＰへの変異は以下のとおりである：Ｌ４２Ｉ、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、Ｋ２Ｌ＋Ｙ３２Ｓ、Ｄ３８Ｔ、Ｄ３８Ｓ、及びＤ３８Ｍ。収量をｒｐＨＰＬＣを介して評価し、バックグラウンドＤＶＰに対して正規化した。追加の変異Ｌ４２Ｉ、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、Ｋ２Ｌ＋Ｙ３２Ｓ、Ｄ３８Ｔ、及びＤ３８Ｓを有するＤＶＰ、全てが、Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ ＤＶＰバックグラウンド（配列番号４７）対照と比較して改善された収量を有していた。

【図12】Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、及びＬ４２Ｉ変異の結果を示すグラフを示す。ここでは、ＤＶＰ：（１）Ｋ２Ｌ／Ｙ３２Ｓ／Ｌ４２Ｉ（配列番号２１７）、及び（２）Ｋ２Ｌ／Ｙ３２Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｉ／Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ（配列番号２１８）の収量を、ＷＴ Ｄｃ１ａ（配列番号２）の収量と比較した。Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、及びＬ４２Ｉの変異を組み合わせは、発現レベルの劇的な増加をもたらした。

【図13】シスチンノット（ＣＫ）構造を有する組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を記載する式（ＩＩ）を示す概略図を示す。ここでは、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩは、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶは、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖは、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩは、第３のジスルフィド結合によって接続されている（ジスルフィド結合は、システイン残基を接続する線によって示される）。第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合である。Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅは、各々、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットである。一部の実施形態では、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせは、任意選択で、存在しない。

【図14】ＨＰＬＣによって決定されたＷＴ ＡｐｓＩＩＩ及びＡｐｓＩＩＩシステイン欠失（ｄＣｙｓ）の相対収量を示す。（ｎ＝８）。破線は、中央値を示し、点線は四分位範囲の境界を示す。

【発明を実施するための形態】

【0041】

定義
「５’末端」及び「３’末端」という用語は、方向性、すなわち、ヌクレオチドポリマー（例えば、ＤＮＡ）の末端から末端への配向を指す。ポリヌクレオチドの５’末端は、５位炭素を有するポリヌクレオチドの末端である。

【0042】

「５’及び３’ホモロジーアーム」又は「５’及び３’アーム」又は「左右のアーム」は、宿主生物の染色体遺伝子座の遺伝子修飾を成功させるために、宿主生物における目的の標的ゲノム配列及び／又は内因性遺伝子と相同に組換える、ベクター及び／又は標的化ベクター中のポリヌクレオチド配列を指す。

【0043】

「ＡＣＴＸ」又は「ＡＣＴＸペプチド」又は「アトラコトキシン」は、Ａｔｒａｃｉｎａｅ科に属するクモから単離された殺虫ＩＣＫペプチドのファミリーを指す。そのようなクモの１つは、オーストラリアブルーマウンテンファネルウェブスパイダー（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｂｌｕｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ Ｆｕｎｎｅｌ－ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ）として知られており、これはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａという学名を有する。Ａｔｒａｃｉｎａｅ科種に由来するＡＣＴＸペプチドの例は、オメガ－ＡＣＴＸ、カッパ－ＡＣＴＸ、及びＵ－ＡＣＴＸペプチドである。

【0044】

「ＡＤＮ１プロモーター」は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ接着欠陥タンパク質１遺伝子に由来するプロモーター配列からなるＤＮＡセグメントを指す。

【0045】

「影響を及ぼす」とは、何かが別のものにどのように影響するか、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、薬物、又は化学物質が昆虫、例えば害虫にどのように影響するかを指す。

【0046】

「整列」は、２つ以上の配列（例えば、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列）の互いの関係を決定する目的で比較する方法を指す。整列は、典型的には、様々なアルゴリズムを適用するコンピュータプログラムによって実行されるが、しかしながら、手動で整列を実行することも可能である。整列プログラムは、典型的には、配列の潜在的な整列を反復し、置換テーブルを使用して整列をスコアリングし、様々な戦略を用いて、潜在的な最適整列スコアに到達する。一般に使用される整列アルゴリズムとしては、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．，ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３－４６８０，１９９４を参照）、ＣＬＵＳＴＡＬＶ（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＬＵＳＴＡＬＷ２，ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３（２１）：２９４７－２９４８，２００７を参照）、Ｍａｆｆｔ、Ｋａｌｉｇｎ、ＰｒｏｂＣｏｎｓ、及びＴ－Ｃｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０２：２０５－２１７，２０００を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。前述のアルゴリズムのうちの１つ以上を実装する例示的なプログラムとしては、ＤＮＡＳｔａｒからのＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．３８０１ Ｒｅｇｅｎｔ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）、ＭＵＳＣＬＥ、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅ、ＣＬＵＳＴＡＬＸ、ＣＬＵＳＴＡＬＶ、ＪａｌＶｉｅｗ、Ｐｈｙｌｉｐ、及びＡｃｃｅｌｒｙｓからのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，１０１８８ Ｔｅｌｅｓｉｓ Ｃｔ，Ｓｕｉｔｅ １００，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．９２１２１）が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、整列は、２つの配列間の類似性を最大化するために、比較される配列の一方又は両方に「位相シフト」及び／又は「ギャップ」を導入することになり、スコアリングは、整列した配列の関連性を定量的に発現するプロセスを指す。

【0047】

「アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチド」又は「アルファ－ＭＦシグナル」又は「アルファ－ＭＦ」又は「アルファ接合因子分泌シグナル」又は「αＭＦ分泌シグナル」（全て互換的に使用される）は、アルファ－ＭＦペプチドが目的の組換えペプチド（例えば、ＤＶＰ）に動作可能に連結されている場合、組換え発現系において分泌発現を可能にするシグナルペプチドを指す。アルファ－ＭＦペプチドは、新生組換えポリペプチドを組換え発現系（例えば、酵母組換え発現系）の分泌経路へ指示する。

【0048】

「薬剤」は、１つ以上の化学物質、分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、毒物、殺虫剤、農薬、有機化合物、無機化合物、原核生物、又は真核生物、及びそれらから産生される薬剤を指す。

【0049】

「農業的に許容される担体」は、農薬製剤技術において通常使用される全てのアジュバント、不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着剤、結合剤などを包含し、これらは、農薬製剤の当業者によく知られている。

【0050】

「アグロインフェクション」とは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを使用することによって、ＤＮＡが植物細胞に導入される植物形質転換方法を意味する。

【0051】

「ＢＡＡＳ」は、オオムギアルファアミラーゼシグナルペプチドを意味し、ＥＲＳＰの一例である。ＢＡＡＳの一例は、配列番号６０のアミノ酸配列を有するＢＡＡＳ（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＡ３２９２５．１）である。

【0052】

「バイオマス」は、任意の測定された植物性産物を指す。

【0053】

「バイナリベクター」又は「バイナリ発現ベクター」とは、Ｅ．ｃｏｌｉ株及びアグロバクテリウム株の両方でそれ自体を複製することができる発現ベクターを意味する。また、ベクターは、アグロバクテリウムによってコピーされ、植物細胞内に送達されるように、病原性遺伝子によって認識される、左右の境界配列によって括弧付けされたＤＮＡ（しばしばｔ－ＤＮＡと称される）の領域を含有する。

【0054】

「ｂｐ」又は「塩基対」は、互いに結合してａを形成する２つの化学塩基を含む分子を指す。例えば、ＤＮＡ分子は、２本のらせん鎖からなり、各鎖は、交互になるデオキシリボース基及びリン酸基から作られる骨格を有する。各デオキシリボースには、４つの塩基、すなわち、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの１つが結合し、アデニンは、チミンと塩基対を形成し、シトシンは、グアニンと塩基対を形成する。

【0055】

「Ｃ末端」は、ポリペプチドの末端に位置する遊離カルボキシル基（すなわち、－ＣＯＯＨ）を指す。

【0056】

「Ｃ_Ｅ」は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造におけるシスチンノットモチーフのジスルフィド結合形成に関与する第６のシステイン残基（すなわち、Ｃ^ＶＩ）に動作可能に連結されたＮ末端を有するペプチドサブユニットを指す。

【0057】

本明細書で使用される場合、上付きローマ数字を伴う文字「Ｃ」、すなわち、「Ｃ^Ｉ」、「Ｃ^ＩＩ」、「Ｃ^ＩＩＩ」、「Ｃ^ＩＶ」、「Ｃ^Ｖ」、及び「Ｃ^ＶＩ」は、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基を指し、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶは、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖは、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩは、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合である。したがって、修飾可能なＣＲＰは、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を形成するように動作可能である１つ以上のシステイン残基を有することができ、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、ＣＫモチーフを形成しない。したがって、上付きローマ数字Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩは、それぞれジスルフィド結合形成に関与する第１、第２、第３、第４、第５、及び第６のシステイン残基である所与のシステイン残基を示し、これらのジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成する前述の第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合であり、「Ｃ^Ｉ」、「Ｃ^ＩＩ」、「Ｃ^ＩＩＩ」、「Ｃ^ＩＶ」、「Ｃ^Ｖ」、及び「Ｃ^ＶＩ」とラベル付けされたシステイン残基、及び／又は上付きローマ数字Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩは、他のシステイン残基が非ＣＫジスルフィド結合を形成するかどうかに関係なく、他のシステイン残基が修飾可能なＣＲＰに存在する可能性があるため、アミノ酸配列の第１、第２、第３、第４、第５、及び第６のシステイン残基として示すことを意図したものではなく、そのように解釈されるべきではない。例えば、修飾可能なＣＲＰは、Ｃ^Ｉ残基の前のアミノ酸配列に存在するそのアミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端への読み取り）に存在する１つ以上のシステイン残基を有してもよい。同様に、１つ以上のシステイン残基は、非ＣＫジスルフィド結合を形成し得るか、又は形成し得ないペプチドサブユニットに存在し得る。

【0058】

「ｃＤＮＡ」又は「コピーＤＮＡ」又は「相補的ＤＮＡ」は、ＲＮＡの分子に相補的である分子を指す。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは、逆転写酵素によって触媒される反応において一本鎖ＲＮＡ鋳型から合成された二本鎖ＤＮＡであり得る。更に他の実施形態では、「ｃＤＮＡ」とは、天然の成熟ｍＲＮＡ種において見出される配列要素の配置を共有する全ての核酸を指し、配列要素は、エキソン並びに３’及び５’非コード領域である。通常、ｍＲＮＡ種は、連続したエキソンを有し、介在するイントロンは、タンパク質をコードする連続したオープンリーディングフレームを生成するために、核内ＲＮＡスプライシングによって除去される。一部の実施形態では、「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、それに由来するＤＮＡを指す。

【0059】

「ＣＥＷ」は、コーンイアワーム（Ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ）（オオタバコガ）を指す。

【0060】

「ＣＫ構造」又は「シスチンノット構造」は、例えば、３つのジスルフィド結合を含む、ＣＫモチーフを有するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質間の共有構造的類似性を指し、システインＣ^Ｉ及びＣ^ＩＶ、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖ、並びにＣ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩは、ジスルフィド結合によって接続される。一部の実施形態では、「共有構造的類似性」は、共有構造的特徴の存在、例えば、特定の位置での特定のアミノ酸の存在及び／又は同一性を指す。更に他の実施形態では、「共有構造的類似性」という用語は、構造要素（例えば、ループ、シート、ヘリックス、Ｈ結合ドナー、Ｈ結合アクセプター、グリコシル化パターン、塩架橋、及びジスルフィド結合）の存在及び／又は同一性を指す。一部の実施形態では、「共有構造的類似性」という用語は、互いと比較した原子又は部分の三次元置及び／又は配向（例えば、目的の薬剤と参照薬剤との間、それらの間又はその中の距離及び／又は角度）を指す。一部の実施形態では、ＣＫ構造は、以下の足場、フレームワーク、構造、及び／又は骨格：Ｎ_Ｅ－Ｃ^Ｉ－Ｌ_１－Ｃ^ＩＩ－Ｌ_２－Ｃ^ＩＩＩ－Ｌ_３－Ｃ^ＩＶ－Ｌ_４－Ｃ^Ｖ－Ｌ_５－Ｃ^ＶＩ－Ｃ_Ｅを含み、式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩは、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶは、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖは、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩは、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅは、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせは、任意選択で、存在しない。

【0061】

「切断可能なリンカー」については、リンカーを参照されたい。

【0062】

「クローニング」とは、ある供給源からのＤＮＡセグメント（例えば、通常は目的の遺伝子、例えば、ｄｖｐ）の挿入、及びそれを別の供給源からのＤＮＡセグメント（例えば、通常はベクター、例えば、プラスミド）と組換えて、通常は組換えＤＮＡを細菌又は酵母宿主に形質転換することによって、組換えられたＤＮＡ、又は「組換えＤＮＡ」を複製するように指示することに関するプロセス及び／又は方法を指す。

【0063】

「コード配列」又は「ＣＤＳ」は、適切な調節配列の制御下に置かれ、かつ必要な転写及び／又は翻訳分子因子の存在下に置かれた場合に、転写（例えば、ＤＮＡの場合）又は翻訳（例えば、ｍＲＮＡの場合）されてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質になり得る、ポリヌクレオチド又は核酸配列を指す。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の翻訳開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置するであろう。一部の実施形態では、コード配列は、非翻訳領域によって５’末端及び／又は３’末端に隣接され得る。一部の実施形態では、コード配列を使用して、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質産物を産生することができる。一部の実施形態では、コード配列は、別のコード配列又は局在化シグナル（例えば、核局在化シグナル）に融合されても、融合されなくてもよい。一部の実施形態では、コード配列は、ベクター又は発現構築物にクローニングされてもよく、ゲノムに組み込まれてもよく、又はＤＮＡ断片として存在してもよい。

【0064】

「コドン最適化」は、１つ以上の内因性、天然、及び／又は野生型コドンが、最終的には依然として同じアミノ酸をコードするが、対応する宿主において好ましいコドンで置き換えられる遺伝子の産生を指す。

【0065】

「相補的」とは、当業者に理解されるように、２つのポリヌクレオチドの相互作用表面のトポロジー的な適合性又は互いの一致を指す。したがって、２つの配列は、互いにハイブリダイズして、安定した逆平行二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いに「相補的である」。第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と実質的に同一である場合、又は第１のポリヌクレオチドが、厳密なハイブリダイズ条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる場合、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに相補的である。したがって、配列が５’－ＴＡＴＡＣ－３’であるポリヌクレオチドは、配列が５’－ＧＴＡＴＡ－３’であるポリヌクレオチドに相補的である。

【0066】

「条件培地」とは、細胞によって使用され、かつ細胞由来物質が濃縮されているが細胞を含まない、細胞培養培地を意味する。

【0067】

「コピー数」は、宿主細胞内にいつでも存在する、ベクター、発現カセット、増幅ユニット、遺伝子、又は実際には任意の定義されたヌクレオチド配列の同一のコピーの数を指す。例えば、一部の実施形態では、遺伝子又は別の定義された染色体ヌクレオチド配列は、染色体上に１つ、２つ、又はそれ以上のコピーで存在することができる。自律複製ベクターは、１つの宿主細胞当たり１つ又は数百のコピーで存在することができる。

【0068】

「培養」又は「細胞培養」は、人工的なインビトロ環境における細胞の維持を指す。

【0069】

「培養」は、様々な種類の培地上又は様々な種類の培地中での生物の増殖を指す。例えば、「培養」という用語は、液体培地又は固体培地における、好適な条件下での細胞集団の増殖を意味することができる。一部の実施形態では、培養とは、目的の異種ポリペプチド及び／又は他の所望の最終産物（典型的には、容器又はリアクター内での）発酵性組換え産生を指す。

【0070】

「シスチン」とは、酸化されたシステイン二量体を指す。シスチンは、２つのシステイン分子の酸化を介して得られる硫黄含有アミノ酸であり、ジスルフィド結合で連結される。

【0071】

「シスチンノットモチーフ」又は「ＣＫモチーフ」は、３つのジスルフィド結合を含むタンパク質構造モチーフを指す。本明細書で使用される「シスチンノットモチーフ」という用語は、３つのジスルフィド結合：第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合を含有する構造モチーフを指し、ジスルフィド結合のうちの２つの間に生じるペプチドのセクションは、第３のジスルフィド結合が通過するループを形成し、ロタキサン基底構造を形成する。第１のジスルフィド結合は、システイン残基Ｃ^ＩとＣ^ＩＶとの間に生じ、第２のジスルフィド結合は、システイン残基Ｃ^ＩＩとＣ^Ｖとの間に生じ、第３のジスルフィド結合は、システイン残基Ｃ^ＩＩＩとＣ^ＶＩとの間に生じ、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合である。一部の実施形態では、ジスルフィド結合トポロジーは、以下のシスチンノットモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを形成する。

【0072】

「Ｄｃ１ａ」又は「ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａ」は、「砂漠茂みクモ」としても知られる、アメリカ砂漠クモ（Ｄｉｇｕｅｔｉａ ｃａｎｉｔｉｅｓ）から単離されたポリペプチドを指す。野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａの一例は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＮＣＢＩ受託番号Ｐ４９１２６．１）である。

【0073】

「規定培地」とは、既知の化学成分で構成されるが、粗製タンパク質性抽出物又は酵母抽出物若しくはペプトンなどの副産物を含まない培地を意味する。

【0074】

「縮重」又は「コドン縮重」は、１つのアミノ酸が異なるヌクレオチドコドンによってコードされ得る現象を指す。したがって、タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子の核酸配列は、縮重により変化し得る。遺伝コードの縮重の結果として、多くの核酸配列は、特定の活性を有する所与のポリペプチドをコードすることができ、そのような機能的に等価なバリアントが本明細書に企図される。

【0075】

「ジスルフィド結合」又は「ジスルフィド架橋」は、側鎖上の２つのチオール基のカップリングによって誘導される２つのシステインアミノ酸間の共有結合を指す。一部の実施形態では、ジスルフィド結合は、ポリペプチド、例えば、ＣＲＩＰ中に存在する２つの異なるチオール基（－ＳＨ）の酸化折り畳みを介して生じる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも６つの異なるチオール基（すなわち、各々チオール基を含有する６つのシステイン残基）を含み得、したがって、一部の実施形態では、ポリペプチドは、３つ以上の分子内ジスルフィド結合を形成し得る。

【0076】

「ジスルフィド結合トポロジー」又は「ジスルフィド結合連結パターン」又は「ジスルフィド結合接続性」は、ジスルフィド結合及びシステイン残基の連結パターンを指す。一部の実施形態では、式（ＩＩ）のＣＫ構造を有するＣＲＩＰは、以下のジスルフィド結合接続性を有する３つのジスルフィド結合を形成する６つの保存されたシステイン残基（番号Ｉ～ＶＩ）を含む：Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶ、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖ、並びにＣ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩ。一部の実施形態では、ジスルフィド結合接続性は、トポロジー的に一定であり、ジスルフィド結合が、酸化還元条件を使用するなど、１つ以上のジスルフィドを分離することによってのみ変更され得ることを意味する。

【0077】

「二重発現カセット」は、同じベクター上に含有される２つのＤＶＰ発現カセットを指す。

【0078】

「二重導入遺伝子ペプチド発現ベクター」又は「二重導入遺伝子発現ベクター」は、ＤＶＰ発現カセットの２つのコピーを含む酵母発現ベクターを意味する。

【0079】

「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を指し、一本鎖又は二本鎖形態で配置することができる、１つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチド（すなわち、アデニン［Ａ］、グアニン［Ｇ］、チミン［Ｔ］、又はシトシン［Ｃ］）のポリマーを含む。例えば、１つ以上のヌクレオチドが、ポリヌクレオチドを生成する。

【0080】

「ｄＮＴＰ」は、ＤＮＡ及びＲＮＡを構成するヌクレオシド三リン酸を指す。

【0081】

「ｄｖｐ」又は「ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチド」又は「Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチド」又は「バリアントミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａポリヌクレオチド」は、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド配列を指す。「ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチド」という用語は、ＤＶＰ ＯＲＦに含有されるミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチド配列を記載するために使用される場合、それがベクターに含まれる場合、及び／又は殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドを記載する場合、「ｄｖｐ」及び／又は「Ｄｖｐ」として記載される。

【0082】

「ＤＶＰ」又は「ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリペプチド」は、野生型成熟ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａ（配列番号２）と何らかが異なるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質変異体若しくはバリアントを指し、例えば、一部の実施形態では、このバリアントは、野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａをコードするように動作可能なポリヌクレオチドへのアミノ酸置換、アミノ酸欠失／挿入、及び／又は変異若しくは相違であり得る。このバリエーションの結果は、野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａと比較して、１つ以上の昆虫種に対する増強された殺虫活性を有する、天然に存在しないポリペプチド及び／又はそれをコードするポリヌクレオチド配列である。

【0083】

「ＤＶＰ発現カセット」とは、プロモーター、エンハンサーエレメント、ｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、イントロン、転写後調節エレメント、及びＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、例えば、ＤＶＰ ＯＲＦなどの１つ以上の調節エレメントを指す。例えば、ＤＶＰ発現カセットの一例は、ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチドセグメント、ＡＤＨ１プロモーター、ＬＡＣ４ターミネーター、及びアルファ－ＭＦ分泌シグナルを含有するＤＮＡの１つ以上のセグメントである。ＤＶＰ発現カセットは、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするのに必要な核酸の全てを含む。

【0084】

「ＤＶＰ ＯＲＦ」は、ＤＶＰ、又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを指す。

【0085】

「ＤＶＰ ＯＲＦダイアグラム」は、ダイアグラム又は式形式で記載される１つ以上のＤＶＰ ＯＲＦの組成物を指す。例えば、「ＤＶＰ ＯＲＦダイアグラム」は、発現ＯＲＦ内に含まれるＤＮＡセグメントに対する頭文字又は略称を使用して記載され得る。したがって、一実施例では、「ＤＶＰ ＯＲＦダイアグラム」は、それぞれ、ＤＮＡセグメントを、「ｅｒｓｐ」（すなわち、ＥＲＳＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）、「リンカー」又は「Ｌ」（すなわち、ＬＩＮＫＥＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）、「ｓｔａ」（すなわち、ＳＴＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）、及び「ｄｖｐ」（すなわち、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチド配列）として、式形式で図示することによって、ＥＲＳＰ、ＬＩＮＫＥＲ、ＳＴＡ、及びＤＶＰをコードするポリヌクレオチドセグメントを記載し得る。ＤＶＰ ＯＲＦダイアグラムの例は、「ｅｒｓｐ－ｓｔａ－（リンカー_ｉ－ｄｖｐ_ｊ）_Ｎ」、又は「ｅｒｓｐ－（ｄｖｐ_ｊ－リンカー_ｉ）_Ｎ－ｓｔａ」、及び／又はそれらのＤＮＡセグメントの任意の組み合わせである。

【0086】

「ＤＶＰ－殺虫タンパク質」は、以下からなる任意のタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸配列、構成、又は配置を指す：（１）少なくとも１つのＤＶＰ又は２つ以上のＤＶＰ（当該２つ以上のＤＶＰは、同じであってもよく、又は異なってもよい）、及び（２）追加の非毒素ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、当該追加の非毒素ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、例えば、一部の実施形態では、以下のうちの１つ以上を行う能力を有する：昆虫がＤＶＰ－殺虫タンパク質に曝露される場合、ＤＶＰ単独と比較して、昆虫の死亡率を増加させ、及び／若しくは成長を阻害する；当該ＤＶＰ－殺虫タンパク質の発現を、例えば、宿主細胞若しくは発現システムにおいて、増加させる；並びに／又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の翻訳後プロセシングに影響を与える（例えば、ＤＶＰ－殺虫性タンパク質の分泌発現を可能にする）。一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、２つ以上のＤＶＰを含むポリマーであり得る。一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、２つ以上のＤＶＰを含むポリマーであり得、ＤＶＰが、リンカーペプチド、例えば、切断可能及び／又は切断不能リンカーを介して動作可能に連結されている。一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、安定化ドメイン（ＳＴＡ）、小胞体シグナル伝達タンパク質（ＥＲＳＰ）、昆虫切断可能若しくは昆虫切断不能リンカー（Ｌ）、及び／又はそれらの任意の他の組み合わせなどの１つ以上のタンパク質と動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを指し得る。一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、（１）野生型Ｄｃ１ａタンパク質、及び（２）追加の非毒素ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、例えば、ＥＲＳＰ、リンカー、ＳＴＡ、ＵＢＩ、又はヒスチジンタグ若しくは同様のマーカーを含む天然に存在しないタンパク質であり得る。一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、（１）ＤＶＰ、及び（２）アルファ接合因子ペプチドを含み得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、（１）ＤＶＰ、及び（２）アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）又はα接合因子（α－ＭＦ）分泌ドメイン（分泌発現用）を含み得る。一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、（１）ＤＶＰ、及び（２）Ｋ．ｌａｃｔｉｓα接合因子（α－ＭＦ）分泌ドメイン（分泌発現用）を含み得る。一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、（１）２つ以上のＤＶＰであって、ＤＶＰが、リンカーペプチド、例えば、切断可能及び／又は切断不能リンカーを介して動作可能に連結され、ＤＶＰは、同じであるか、又は異なる、２つ以上のＤＶＰと、（２）アルファ－ＭＦ、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓα接合因子（α－ＭＦ）分泌ドメイン（分泌発現用）と、を含み得る。

【0087】

「ＤＶＰ構築物」は、動作可能に連結されたポリペプチドセグメント（例えば、ＤＶＰ－殺虫タンパク質）のペプチド、ポリペプチド、及び／又はモチーフの三次元配置／配向を指す。例えば、ＤＶＰ ＯＲＦは、以下の構成要素又はモチーフ：ＤＶＰ、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、リンカーペプチド（Ｌ）、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。本明細書で使用される場合、「ＤＶＰ構築物」という用語は、構造モチーフの指定及び／又は配向を説明するために使用される。言い換えれば、ＤＶＰ構築物は、所与のＤＶＰ ＯＲＦ内に含有される構成要素又はモチーフの配置及び配向を記載する。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰ構築物は、限定されないが、以下のＤＶＰ－殺虫タンパク質のうちの１つの配向を記載する：ＥＲＳＰ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＤＶＰ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ）_Ｎ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－Ｌ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－Ｌ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－Ｌ－（ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－（ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＤＶＰ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－ＳＴＡ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－Ｌ－ＤＶＰ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－Ｌ－ＳＴＡ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－Ｌ－（ＤＶＰ－ＳＴＡ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－Ｌ－（ＳＴＡ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－Ｌ－（ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＳＴＡ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＤＶＰ－ＳＴＡ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＳＴＡ）_Ｎ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－Ｌ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－ＤＶＰ－Ｌ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－Ｌ－（ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－Ｌ）_Ｎ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－（Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－（ＤＶＰ）_Ｎ－Ｌ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－（ＤＶＰ－Ｌ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－ＤＶＰ）_Ｎ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－ＤＶＰ－Ｌ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＤＶＰ－Ｌ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－ＤＶＰ－ＳＴＡ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ－Ｌ ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－Ｌ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－ＳＴＡ）_Ｎ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－Ｌ－ＳＴＡ）_Ｎ、又はＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－ＳＴＡ－Ｌ）_Ｎ（式中、Ｎは、１～２００の範囲の整数である）。

【0088】

「ＥＬＩＳＡ」又は「ｉＥＬＩＳＡ」は、試料がプレートの表面に固定され、次いで、以下のように検出されるアッセイプロトコルを意味する：一次抗体が適用され、続いて、無色の基質を、試料にわたって検出及び定量化され得る着色された基質に変換する酵素にコンジュゲートされた二次抗体が適用される。プロトコル中、抗体は、そのエピトープに結合するもののみが検出のために残るように洗い流される。発明者らの手にある試料は主にタンパク質であり、ＥＬＩＳＡは回収されたタンパク質の量の定量化を可能にする。

【0089】

「内因性」は、天然に存在する、及び／又は生物に存在するポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はプロセス、例えば、特定の遺伝子操作の前に宿主細胞に既に存在する分子又は活性を指す。

【0090】

「エンハンサーエレメント」は、プロモーターに動作可能に連結されたＤＮＡ配列を指し、これは、エンハンサーエレメントの不在下でプロモーターから生じる転写活性と比較して、プロモーター上で増加した転写活性を発揮することができる。

【0091】

「ＥＲ」又は「小胞体」は、いくつかの翻訳後修飾プロセスが生じる、全ての真核生物に共通の細胞内小器官である。

【0092】

「ＥＲＳＰ」又は「小胞体シグナルペプチド」は、ＤＶＰをコードするｍＲＮＡ分子のタンパク質翻訳中に、宿主細胞のシグナル認識粒子によって認識及び結合されるアミノ酸のＮ末端配列であり、これは、タンパク質翻訳のリボソーム／ｍＲＮＡ複合体を細胞質内のＥＲに移動させる。結果として、タンパク質翻訳が、それがＥＲとドッキングするまで休止し、そこで、それが続き、得られたタンパク質がＥＲに注入される。

【0093】

「ｅｒｓｐ」は、ペプチドＥＲＳＰをコードするポリヌクレオチドを指す。

【0094】

「ＥＲ輸送」とは、翻訳後修飾、選別及び輸送のために、細胞で発現されたタンパク質のＥＲへの輸送を意味する。

【0095】

「発現カセット」は、組換え発現系において、導入遺伝子又は異種ポリヌクレオチド、例えば、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドの転写を完了するために必要な全てのＤＮＡエレメントを指す。したがって、一部の実施形態では、「発現カセット」とは、（１）目的のＤＮＡ配列（例えば、ＤＶＰをコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチド）、及び以下のうちの１つ以上を指す：（２）プロモーター、ターミネーター、及び／若しくはエンハンサーエレメント、（３）適切なｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、（４）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、（５）イントロン、並びに／又は（６）転写後調節エレメント。（１）と、（２）～（６）のうちの少なくとも１つとの組み合わせは、「発現カセット」と称される。

【0096】

例えば、一部の実施形態では、発現カセットは、（１）ＤＶＰをコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドであり得、更に１つ以上の以下を含む：（２）プロモーター、ターミネーター、及び／若しくはエンハンサーエレメント、（３）適切なｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、（４）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、（５）イントロン、並びに／又は（６）転写後調節エレメント。

【0097】

一部の実施形態では、発現カセットは、（１）ＤＶＰをコードするように動作可能な１つ以上の異種ポリヌクレオチドであり得、更に１つ以上の（２）プロモーター、ターミネーター、及び／若しくはエンハンサーエレメント、（３）適切なｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、（４）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、（５）イントロン、並びに／又は（６）転写後調節エレメントを含み、ＤＶＰをコードするように動作可能な１つ以上の異種ポリヌクレオチドの各々は、（２）～（６）のうちの１つ以上を更に含み、ＤＶＰは、同じであっても異なってもよい。

【0098】

例えば、一部の実施形態では、発現カセットは、（１）ＤＶＰをコードするように動作可能な第１の異種ポリヌクレオチド、及びＤＶＰをコードするように動作可能な１つ以上の追加の異種ポリヌクレオチドを指し得、更に、（２）プロモーター、ターミネーター、及び／若しくはエンハンサーエレメント、（３）適切なｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、（４）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、（５）イントロン、並びに／又は（６）転写後調節エレメントのうちの１つ以上を含み、ＤＶＰをコードするように動作可能な第１の異種ポリヌクレオチド、及びＤＶＰをコードするように動作可能な１つ以上の追加の異種ポリヌクレオチドのいずれかは、（２）～（６）のうちの１つ以上を更に含むか、又は、ＤＶＰをコードするように動作可能な第１の異種ポリヌクレオチドの各々、及びＤＶＰをコードするように動作可能な１つ以上の追加の異種ポリヌクレオチドの各々が、各々個別に、（２）～（６）のうちの１つ以上を更に含み、ＤＶＰは、同じであっても異なってもよい。

【0099】

代替的な実施形態では、２つの発現カセットがあり、各発現カセットは、ＤＶＰをコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを含み（すなわち、二重発現カセット）、ＤＶＰは、同じであっても異なってもよい。

【0100】

他の実施形態では、３つの発現カセットがあり、各発現カセットは、ＤＶＰをコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを含み（すなわち、三重発現カセット）、ＤＶＰは、同じであっても異なってもよい。

【0101】

一部の実施形態では、二重発現カセットは、第２の発現カセットを、第１の発現カセットを含有するベクターにサブクローニングすることによって生成され得る。一部の実施形態では、三重発現カセットは、第３の発現カセットを、第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含むベクターにサブクローニングすることによって生成され得る。発現カセット及びクローニング技術に関する方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。

【0102】

「ＦＥＣＴ」は、コーティングタンパク質遺伝子及び三重遺伝子ブロックを排除したフォックステールモザイクウイルスを使用した一過性植物発現システムを意味する。

【0103】

「ＧＦＰ」は、クラゲ、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光タンパク質を意味する。

【0104】

「増殖培地」は、インビトロで細胞を増殖させるために使用される栄養培地を指す。

【0105】

本明細書で使用される「腸」は、腸を含む任意の臓器、構造、組織、細胞、細胞外マトリックス、及び／又は空間、例えば、前腸、例えば、口、咽頭、食道、素嚢、前胃、若しくは素嚢；中腸、例えば、中腸盲腸、胃；後腸、例えば、ピロルム（ｐｙｌｏｒｕｍ）、回腸、直腸、若しくは肛門；囲食膜；微絨毛；基底膜；筋層；マルピーギ管；又は直腸膨大部を指し得る。

【0106】

「相同」とは、２つのポリペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す相同を指す。２つの比較される配列の両方における位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置が、アデニンによって占められている場合）、これらの分子は、その位置において相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される一致する又は相同の位置の数を、比較した位置の数で割って１００を掛けた関数である。相同とは、２つのポリペプチド分子間、又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。２つの比較される配列の両方における位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置が、アデニンによって占められている場合）、これらの分子は、その位置において相同である。２つの配列間の相同性は、２つの配列によって共有される一致する又は相同の位置の数の関数である。例えば、２つの配列において、１０個の位置のうちの６個が一致するか又は相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有する。

【0107】

核酸に関して使用される場合、「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分的な相同性又は完全な相同性（したがって、同一）が存在し得る。「配列同一性」は、２つ以上の核酸の間の関連性の尺度を指し、全比較長を参照して、パーセンテージとして与えられる。同一性の計算は、それぞれのより大きな配列において、同一であり、同じ相対位置にあるそれらのヌクレオチド残基を考慮に入れる。

【0108】

「ＩＣＫモチーフ」又は「ＩＣＫモチーフタンパク質」は、３つのジスルフィド架橋を有する少なくとも６つのハーフシスチンコアアミノ酸を有する１６～６０個のアミノ酸ペプチドを指す。一部の実施形態では、３つのジスルフィド架橋は、共有結合であり、６つのハーフシスチン残基のものであり、共有ジスルフィド結合は、Ｎ末端アミノ酸から始まる６つのコアハーフシスチンアミノ酸の第１及び第４、第２及び第５、並びに第３及び第６のハーフシスチンの間にある。一部の実施形態では、このモチーフを有するペプチドは、通常、モチーフの第４のコアハーフシスチンと第６のコアハーフシスチンとの間に位置する残基で構成されるベータヘアピン二次構造を含み、ヘアピンが、モチーフの３つのジスルフィド結合によって提供される構造的架橋によって安定化される。一部の実施形態では、追加のシステイン／シスチン又はハーフシスチンアミノ酸が、阻害剤シスチンノットモチーフ内に存在し得る。

【0109】

「同一性」とは、２つ以上のポリペプチド配列間又は２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指し、当該配列を比較することによって決定される。「同一性」という用語はまた、場合によっては、かかる配列のストリング間の一致によって決定される、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」及び「類似性」は、限定されないが、以下に記載される当業者に既知の無数の方法のうちのいずれか１つによって、容易に計算することができ、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）が含まれるが、これらに限定されない（これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。更に、同一性及び類似性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに成文化されている。例えば、一部の実施形態では、２つの配列間の同一性及び類似性を決定する方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）が含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）から公開されている（これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。

【0110】

「インビボ」とは、天然環境（例えば、動物又は細胞）、及び天然環境内で生じるプロセス又は反応を指す。

【0111】

「不活性」とは、何かが使用状態にない、例えば、休眠状態である、及び／又は機能していない状態を指す。例えば、遺伝子の文脈で使用される場合、又は遺伝子に関して言及される場合、不活性という用語は、当該遺伝子が、もはや遺伝子産物を能動的に合成しないか、当該遺伝子産物をタンパク質に翻訳しないか、又はその他、遺伝子にその正常な機能を行なわせないことを意味する。例えば、一部の実施形態では、不活性という用語は、遺伝子がＲＮＡを転写することの失敗、ＲＮＡプロセシングの失敗（例えば、プレｍＲＮＡプロセシング、ＲＮＡスプライシング、若しくは他の転写後修飾）、非コードＲＮＡ成熟化への干渉、ＲＮＡ輸送への干渉（例えば、核から細胞質へ）、翻訳への干渉、タンパク質折りたたみ、転座、タンパク質輸送、並びに／又は分子ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、転写因子、調節因子、阻害因子、若しくは前述のプロセスのうちのいずれかに寄与する他の因子のうちのいずれかへの阻害及び／若しくは干渉を指すことができる。

【0112】

「増加すること（Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」又は「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」又は「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」又は「増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｓ）」は、何か（例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の発現）をサイズ、量、強度、又は程度で大きくすることを指す。例えば、一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰからの１つ以上のジスルフィド結合の除去が、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰの作製をもたらすことができ、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有することは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰと比較して、以下の効果：組換えＣＲＰの発現レベルの増加、及び／又は組換えＣＲＰの収量の増加をもたらす。

【0113】

したがって、一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰにおける「増加した発現レベル」又は「発現レベルの増加」又は「増加した収量」又は「収量の増加」という用語は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰにおけるタンパク質の量、タンパク質の発現レベル、及び／又はタンパク質の収量と比較して、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰにおけるタンパク質の量、タンパク質の発現レベル、及び／又はタンパク質の収量の、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．８％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約１．２５％、少なくとも約１．５％、少なくとも約１．７５％、少なくとも約２％、少なくとも約２．２５％、少なくとも約２．５％、少なくとも約２．７５％、少なくとも約３％、少なくとも約３．２５％、少なくとも約３．５％、少なくとも約３．７５％、少なくとも約４％、少なくとも約４．２５％、少なくとも約４．５％、少なくとも約４．７５％、少なくとも約５％、少なくとも約５．２５％、少なくとも約５．５％、少なくとも約５．７５％、少なくとも約６％、少なくとも約６．２５％、少なくとも約６．５％、少なくとも約６．７５％、少なくとも約７％、少なくとも約７．２５％、少なくとも約７．５％、少なくとも約７．７５％、少なくとも約８％、少なくとも約８．２５％、少なくとも約８．５％、少なくとも約８．７５％、少なくとも約９％、少なくとも約９．２５％、少なくとも約９．５％、少なくとも約９．７５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、又は１００％超である増加を指す。

【0114】

「動作不能」とは、機能していない、機能不全、又はもはや機能することができない状態を指す。例えば、遺伝子の文脈で使用される場合、又は遺伝子を指す場合、動作不能という用語は、当該遺伝子が、永続的又は一過的にのいずれかで、もはやいつものように動作することができないことを意味する。例えば、一部の実施形態では、「動作不能」とは、遺伝子が、もはや遺伝子産物を合成することができないか、当該遺伝子産物をタンパク質に翻訳しないか、又はその他、遺伝子がその正常な機能を行うことができないことを意味する。例えば、一部の実施形態では、動作不能という用語は、遺伝子がＲＮＡを転写することの失敗、ＲＮＡプロセシングの失敗（例えば、プレｍＲＮＡプロセシング、ＲＮＡスプライシング、若しくは他の転写後修飾）、非コードＲＮＡ成熟化への干渉、ＲＮＡ輸送への干渉（例えば、核から細胞質へ）、翻訳への干渉、タンパク質折りたたみ、転座、タンパク質輸送、並びに／又は分子ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、転写因子、調節因子、阻害因子、若しくは前述のプロセスのうちのいずれかに寄与する他の因子のうちのいずれかへの阻害及び／若しくは干渉を指すことができる。

【0115】

「昆虫」には、「昆虫綱」綱の全ての生物が含まれる。「前成虫（ｐｒｅ－ａｄｕｌｔ）」という用語は、成虫期以前の生物の任意の形態を指し、例えば、卵、幼虫、及び若虫が含まれる。本明細書で使用される場合、「昆虫」という用語は、ダニを含むいずれの節足動物及び線形動物、並びに全ての作物、野菜、及び木に蔓延することが知られている昆虫を指し、林業、園芸、及び農業の分野において害虫とみなされる昆虫を含む。本明細書に開示される方法で保護され得る特定の作物の例は、ダイズ、トウモロコシ、ワタ、アルファルファ、及び野菜作物である。特定の作物及び昆虫のリストを、ここに示す。

【0116】

「昆虫腸内環境」又は「腸内環境」とは、昆虫又は昆虫の幼虫の前腸、中腸、又は後腸内で見出される特定のｐＨ及びプロテイナーゼ条件を意味する。

【0117】

「昆虫血リンパ環境」とは、昆虫又は昆虫の幼虫内で見出される特定のｐＨ及びプロテイナーゼ条件を意味する。

【0118】

本明細書で使用される場合、「殺虫」という用語は、概して、本明細書で使用されるポリペプチド又はタンパク質の、昆虫の死亡率を増加させるか、又は昆虫の成長速度を阻害する能力を指すために使用される。本明細書で使用される場合、「殺線虫性」という用語は、本明細書で使用されるポリペプチド又はタンパク質が、線虫の死亡率を増加させるか、又は線虫の成長速度を阻害する能力を指す。概して、「線虫」という用語は、当該生物の卵、幼虫、幼体、及び成熟形態を含む。

【0119】

「殺虫活性」とは、昆虫を、化合物、薬剤、又はペプチドに曝露した際又は後、昆虫が、死に、その動きを停止若しくは遅延させる；その摂食を停止若しくは遅延させる；その成長を停止若しくは遅延させる；混乱する（例えば、ナビゲーション、食べ物の位置決定、睡眠行動、及び／又は交配に関して）；蛹化に失敗する；繁殖を妨げる；かつ／又は昆虫が子孫を産むことを妨げ、及び／若しくは昆虫が稔性の子孫を産むことを妨げるいずれかとなることを意味する。

【0120】

「組み込み発現ベクター」又は「組み込みベクター」とは、それ自体を酵母細胞ゲノムの特定の遺伝子座に挿入し、安定して酵母ゲノムの一部となり得る酵母発現ベクターを意味する。

【0121】

「介在リンカー」は、タンパク質の異なる部分を分離するタンパク質中の短いペプチド配列、又は上流及び下流のＤＮＡ配列を分離するためのＯＲＦ中のリーディングフレームに配置される短いＤＮＡ配列を指す。例えば、一部の実施形態では、介在リンカーを使用して、タンパク質が、翻訳中に、独立した二次構造及び三次構造の形成を達成することを可能にすることができる。一部の実施形態では、介在リンカーは、植物細胞環境、昆虫及び／又はＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ腸内環境、並びに昆虫血リンパ及びＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ血リンパ環境において、切断に耐性又は感受性のいずれかであり得る。

【0122】

「単離された」とは、物及び／又は成分をその天然環境から分離することを指し、例えば、所与の属又は種から単離された毒素は、毒素がその天然環境から分離される（例えば、野生型生物から取り出される）ことを意味する。

【0123】

「カッパ－ＡＣＴＸペプチド」又は「κ－ＡＣＴＸ」（全て互換的に使用される）は、Ａｔｒａｃｉｎａｅサブファミリーに属するオーストラリアファネルウェブスパイダーから単離された殺虫阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ペプチドのファミリーに属するペプチドを指す。そのような１つのクモは、オーストラリアブルーマウンテンファネルウェブスパイダーとして知られており、これはＨａｙｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａという学名を有する。例示的な野生型カッパ－ＡＣＴＸペプチドが本明細書に提供され、アミノ酸配列：「ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＣＣＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ」（配列番号１９８）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ８２２２８．１）を有する。

【0124】

「ｋｂ」は、キロ塩基（すなわち、１０００塩基）を指す。本明細書で使用される場合、「ｋｂ」という用語は、核酸分子の長さを意味する。例えば、１ｋｂは、１０００ヌクレオチド長である核酸分子を指す。１ｋｂ長である二本鎖ＤＮＡの長さは、２，０００ヌクレオチドを含有する（すなわち、各鎖に１，０００ヌクレオチド）。代替的に、１ｋｂ長の一本鎖ＲＮＡの長さは、１，０００ヌクレオチドを含有する。

【0125】

「ｋＤａ」は、キロダルトン、１，０００ダルトンに等しい単位を指し、「ダルトン」又は「Ｄａ」は、分子量（ＭＷ）の単位である。

【0126】

「ノックイン（ｋｎｏｃｋ ｉｎ）」又は「ノックイン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）」又は「ノックイン（ｋｎｏｃｋｓ－ｉｎ）」又は「ノックイン（ｋｎｏｃｋｉｎｇ－ｉｎ）」は、内因性遺伝子を、外因性若しくは異種遺伝子又はその一部で置き換えることを指す。例えば、一部の実施形態では、「ノックイン」という用語は、相同組換えによって標的遺伝子座に所望のタンパク質をコードする核酸配列を導入し、それによって、所望のタンパク質を発現させることを指す。一部の実施形態では、「ノックイン」変異は、遺伝子配列を修飾して、機能喪失変異又は機能獲得変異を作製することができる。「ノックイン」という用語は、外来性若しくは異種ポリヌクレオチド配列若しくはそれらの断片がゲノムに導入される手順（例えば、「彼らがノックインを行った」、又は「彼らが異種遺伝子をノックインした」）、又は得られた細胞及び／若しくは生物（例えば、「細胞がノックインである」、又は「動物がノックインである」）を指すことができる。

【0127】

「ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）」又は「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」又は「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）」又は「ノックアウト」又は「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｓ－ｏｕｔ）」又は「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｉｎｇ－ｏｕｔ）」は、細胞の内因性ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の発現遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の部分的又は完全な抑制を指す。一部の実施形態では、「ノックアウト」は、全遺伝子、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードする遺伝子の一部の標的化された欠失によって達成され得る。結果として、欠失は、遺伝子を不活性に、部分的に不活性に、動作不能に、部分的に動作不能にすることができるか、又はその他、遺伝子が正常に発現する生物全体及び／若しくは細胞の任意の細胞における遺伝子若しくはその産物の発現を減少させることができる。「ノックアウト」という用語は、内因性遺伝子が完全に又は部分的に不活性又は動作不能にされる手順（例えば、「彼らがノックアウトを行った」、又は「彼らが内因性遺伝子をノックアウトした」）、あるいは得られた細胞及び／若しくは生物（例えば、「細胞がノックアウトである」、又は「動物がノックアウトである」）を指すことができる。

【0128】

「ノックダウン用量５０」又は「ＫＤ_５０」は、集団（例えば、Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）及び／又はＡｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）の集団）の５０％で麻痺又は運動の停止を引き起こすのに必要な用量中央値を指す。

【0129】

「ｌ」又は「リンカー」は、介在リンカーペプチドをコードするヌクレオチドを指す。

【0130】

「Ｌ_１」は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造におけるシスチンノットモチーフのジスルフィド結合形成に関与する第１のシステイン残基と第２のシステイン残基と（すなわち、Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＩ）の間に位置するペプチドサブユニットを指す。

【0131】

「Ｌ_２」は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造におけるシスチンノットモチーフのジスルフィド結合形成に関与する第２のシステイン残基と第３のシステイン残基と（すなわち、Ｃ^ＩＩ及びＣ^ＩＩＩ）の間に位置するペプチドサブユニットを指す。

【0132】

「Ｌ_３」は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造におけるシスチンノットモチーフのジスルフィド結合形成に関与する第３のシステイン残基と第４のシステイン残基と（すなわち、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＩＶ）の間に位置するペプチドサブユニットを指す。

【0133】

「Ｌ_４」は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造におけるシスチンノットモチーフのジスルフィド結合形成に関与する第４のシステイン残基と第５のシステイン残基と（すなわち、Ｃ^ＩＶ及びＣ^Ｖ）の間に位置するペプチドサブユニットを指す。

【0134】

「Ｌ_５」は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造におけるシスチンノットモチーフのジスルフィド結合形成に関与する第５のシステイン残基と第６のシステイン残基と（すなわち、Ｃ^Ｖ及びＣ^ＶＩ）の間に位置するペプチドサブユニットを指す。

【0135】

適切な文脈では、「Ｌ」は、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）を、追加のポリペプチド、例えば、ＤＶＰ及び／又は複数のＤＶＰと連結する介在リンカーペプチドを指す。アミノ酸に言及する場合、「Ｌ」はまた、ロイシンを意味し得る。

【0136】

「ＬＡＣ４プロモーター」又は「Ｌａｃ４プロモーター」又は「ｐＬａｃ４」は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ β－ガラクトシダーゼ遺伝子に由来するプロモーター配列からなるＤＮＡセグメントを指す。ＬＡＣ４プロモーターは、強力で誘導性のレポーターであり、酵母に形質転換された外因性遺伝子の発現を駆動するために使用される。

【0137】

「ＬＡＣ４ターミネーター」又は「Ｌａｃ４ターミネーター」は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ β－ガラクトシダーゼ遺伝子に由来する転写ターミネーター配列からなるＤＮＡセグメントを指す。

【0138】

「Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ腸内環境」とは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎの昆虫又は幼虫の前腸、中腸、又は後腸内で見出された特定のｐＨ及びプロテイナーゼ条件を意味する。

【0139】

「Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ血リンパ環境」とは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎの昆虫又は幼虫内で見られる特定のｐＨ及びプロテイナーゼ条件を意味する。

【0140】

「ＬＤ_２０」は、集団の２０％を死滅させるのに必要な用量を指す。

【0141】

「ＬＤ_５０」は、集団の５０％を死滅させるのに必要な用量を意味する致死量５０を指す。

【0142】

「リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）」又は「リンカー（ＬＩＮＫＥＲ）」又は「ペプチドリンカー」又は「Ｌ」又は「介在リンカー」は、２つのペプチドを一緒に連結するように動作可能な短いペプチド配列を指す。リンカーは、上流及び下流のＤＮＡ配列を分離するためにＯＲＦのリーディングフレーム内に配置される短いＤＮＡ配列を指し得る。一部の実施形態では、リンカーは、昆虫プロテアーゼによって切断可能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、タンパク質が、翻訳中に、独立した二次構造及び三次構造の形成を達成することを可能にすることができる。一部の実施形態では、リンカーは、植物細胞環境、昆虫及び／若しくはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ腸内環境、並びに／又は昆虫血リンパ及びＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ血リンパ環境において、切断に耐性又は感受性のいずれかであり得る。一部の実施形態では、リンカーは、プロテアーゼによって切断され得る。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、植物プロテアーゼ（例えば、パパイン、ブロメラン、フィシン、アクチニジン、ジンギバイン、及び／又はカルドシン）、昆虫プロテアーゼ、真菌プロテアーゼ、脊椎動物プロテアーゼ、無脊椎動物プロテアーゼ、細菌プロテアーゼ、哺乳類プロテアーゼ、爬虫類プロテアーゼ、又は鳥類プロテアーゼによって切断され得る。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能又は切断不能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、二次領域又は三次領域を含み、各領域は、少なくとも２つの種類のプロテアーゼによって切断可能であり、そのうちの１つが昆虫及び／又は線虫プロテアーゼであり、そのうちのもう１つがヒトプロテアーゼである。一部の実施形態では、リンカーは、（少なくとも）３つの役割（昆虫腸内環境で切断される、植物細胞で切断される、又は意図的に切断されないように設計される）のうちの１つを有することができる。

【0143】

「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」（複数形「培地（ｍｅｄｉａ）」）は、細胞培養で細胞を培養するための栄養液を指す。

【0144】

「ＭＯＡ」は、作用メカニズムを指す。

【0145】

「修飾可能なＣＲＰ」は、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有する第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合に加えて、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有するシステインリッチタンパク質を指し、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、ＣＫモチーフを形成しない。修飾可能なＣＲＰの例としては、「ＣＮＳＫＧＴＰＣＴＮＡＤＥＣＣＧＧＫＣＡＹＮＶＷＮＣＩＧＧＧＣＳＫＴＣＧＹ」（配列番号１９３、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ４９２６８．１）のアミノ酸配列を有するＡｐｓＩＩＩタンパク質、アミノ酸配列：「ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＣＣＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ」（配列番号１９８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ８２２２８．１）を有する野生型カッパ－ＡＣＴＸペプチド、及び又は配列番号１～２若しくは１９５のうちのいずれか１つが挙げられる。

【0146】

「分子量（ＭＷ）」は、分子の質量又は重量を指し、典型的には、「ダルトン（Ｄａ）」又は「キロダルトン（ｋＤａ）」で測定される。一部の実施形態では、ＭＷは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、分析用超遠心分離、又は光散乱を使用して計算することができる。一部の実施形態では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法は、以下のとおりである：目的の試料が、一組の分子量標準を用いてゲル上で分離される。試料を泳動し、次いで、ゲルを所望の染色で処理し、続いて、約２～１４時間脱色する。次のステップは、標準及び目的のタンパク質の相対的移動距離（Ｒｆ）を決定することである。移行距離は、以下の式を使用して決定することができる。

【数1】

【0147】

次に、ＭＷの対数は、標準におけるバンドについて得られた値に基づいて決定することができ、例えば、一部の実施形態では、ＳＤＳ変性ポリペプチドの分子量の対数及びその相対移動距離（Ｒｆ）をグラフにプロットする。グラフをプロットした後、導出された値を補間すると、未知のタンパク質バンドの分子量が得られるであろう。

【0148】

「モチーフ」は、何らかの生物学的有意性を有することに関与し、かつ／又は何らかの効果を発揮するか、又は何らかの生物学的プロセスに関与する、ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列を指す。

【0149】

「多重クローニング部位」又は「ＭＣＳ」は、目的のＤＮＡ配列が挿入され得る多数の制限部位を含む、ベクター上に見出されるＤＮＡのセグメントを指す。

【0150】

「変異体」とは、当該生物及び／又は配列を、天然に存在する、又は野生型の生物及び／又は配列とは異なるものにする（例えば、ＤＮＡ配列中の）変化を有する、生物、ＤＮＡ配列、ペプチド配列、又はポリペプチド配列を指す。例えば、野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａポリペプチドは、天然に存在しないＤＶＰをもたらすように改変され得る。

【0151】

「Ｎ_Ｅ」は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造におけるシスチンノットモチーフのジスルフィド結合形成に関与する第１のシステイン残基（すなわち、Ｃ^Ｉ）に動作可能に連結されたＣ末端を有するペプチドサブユニットを指す。

【0152】

「Ｎ末端」は、ポリペプチドの始まり又は開始に位置する遊離アミン基（すなわち、－ＮＨ_２）を指す。

【0153】

「ＮＣＢＩ」は、国立バイオテクノロジー情報センターを指す。

【0154】

「ｎｍ」は、ナノメートルを指す。

【0155】

「非極性アミノ酸」は、弱疎水性であり、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及びメチオニンを含むアミノ酸である。グリシン又はｇｌｙは、本発明のジペプチドに最も好ましい非極性アミノ酸である。

【0156】

「正規化ペプチド収量」とは、条件培地中のペプチド収量を、ペプチド収量を測定した時点での対応する細胞密度で割ったものを意味する。ペプチド収量は、単位体積における産生されたペプチドの質量（例えば、ｍｇ／リットル若しくはｍｇ／Ｌ）で、又はＨＰＬＣクロマトグラフにおける産生されたペプチドの紫外線吸光度ピーク面積（例えば、ｍＡｕ．ｓｅｃ）で表すことができる。細胞密度は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の波長での培養の可視光吸光度で表すことができる。

【0157】

「ＯＤ」は、光学密度を指す。典型的には、分光光度計を使用してＯＤが測定される。

【0158】

「ＯＤ６６０ｎｍ」又は「ＯＤ_{６６０ｎｍ}」は、６６０ナノメートル（ｎｍ）での光学密度を指す。

【0159】

「１文字コード」とは、タンパク質の一次構造における様々なアミノ酸を区別するために、その１文字コードに列挙されるペプチド配列を意味する：アラニン＝Ａ、アルギニン＝Ｒ、アスパラギン＝Ｎ、アスパラギン酸＝Ｄ、アスパラギン又はアスパラギン酸＝Ｂ、システイン＝Ｃ、グルタミン酸＝Ｅ、グルタミン＝Ｑ、グルタミン又はグルタミン酸＝Ｚ、グリシン＝Ｇ、ヒスチジン＝Ｈ、イソロイシン＝Ｉ、ロイシン＝Ｌ、リジン＝Ｋ、メチオニン＝Ｍ、フェニルアラニン＝Ｆ、プロリン＝Ｐ、セリン＝Ｓ、スレオニン＝Ｔ、トリプトファン＝Ｗ、チロシン＝Ｙ、及びバリン＝Ｖ。

【0160】

「動作可能」とは、使用される能力、何らかを行う能力、及び／又は何らかの機能若しくは結果を達成する能力を指す。例えば、一部の実施形態では、「動作可能な」とは、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又は他のヌクレオチド配列若しくは遺伝子が、ペプチド、ポリペプチド、及び／又はタンパク質をコードする能力を指す。例えば、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質をコードするように動作可能であってもよく、これは、ポリヌクレオチドが、タンパク質を生成する能力とともにそれを埋め込まれる情報を含むことを意味する（例えば、結果としてタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを転写することによって）。

【0161】

「動作可能に連結された」とは、このように記載された構成要素が、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、一部の実施形態では、動作可能に連結されたは、２つ以上のＤＮＡ、ペプチド、又はポリペプチド配列を指すことができる。他の実施形態では、動作可能に連結されたとは、一方のＤＮＡ配列の転写活性化が他方のＤＮＡ配列に作用することができるように、２つの隣接するＤＮＡ配列が一緒に配置されることを意味し得る。更に他の実施形態では、「動作可能に連結された」という用語は、２つ以上のペプチド及び／又はポリペプチドを指すことができ、当該２つ以上のペプチド及び／又はポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖を生成するような方法で連結されており、代替的に、動作可能に連結されたという用語は、一方のペプチドが他方に対して何らかの効果を及ぼすような方法で連結されている２つ以上のペプチドを指すことができる。更に他の実施形態では、動作可能に連結されたＤＮＡ配列は、一方の転写活性化が他方に作用することができるように、２つの隣接ＤＮＡ配列が一緒に配置されることを指すことができる。

【0162】

「ＯＲＦ」又は「オープンリーディングフレーム」は、翻訳開始シグナル（例えば、それぞれ、ＡＵＧ又はＡＴＧ）と、１つ以上のポリペプチド配列をコードする既知の終止コドンのうちのいずれか１つ以上との間の、一続きのＲＮＡ又はＤＮＡ配列を指す。換言すると、ＯＲＦは、リボソームが終止コドンに遭遇していないために読み取りを継続する（すなわち、新生タンパク質にアミノ酸を付加する）ことができる限り、ＲＮＡコードを翻訳するリボソームの観点から見た参照のフレームを記載する。したがって、「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、コード配列の翻訳開始コドンと終止コドンとの間のコードされたアミノ酸配列を指す。ここで、「開始コドン」及び「終止コドン」という用語は、それぞれ、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始及び鎖終止を指定するコード配列の３つの隣接するヌクレオチド（すなわち、コドン）の単位を指す。

【0163】

一部の実施形態では、ＯＲＦは、開始コドン（通常、ＤＮＡではＡＴＧ、及びＲＮＡではＡＵＧ）で始まり、終止コドン（通常、ＵＡＡ、ＵＡＧ、又はＵＧＡ）で終わる連続した一繋がりのコドンである。他の実施形態では、ＯＲＦは、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＵＧ又はＡＴＧ）と既知の終止コドンのうちのいずれか１つ以上との間の一続きのＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列であり得、当該一続きのＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列は、１つ以上のポリペプチド配列をコードする。一部の他の実施形態では、ＯＲＦは、ＡＴＧ開始コドンで始まり、ＴＧＡ、ＴＡＡ、又はＴＡＧ終止コドンで終わるタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり得る。ＯＲＦはまた、ＤＮＡがコードする翻訳されたタンパク質を意味し得る。一般に、当業者は、「オープンリーディングフレーム」の最も広い定義が、停止コドンを含まない一連のコドンを単純に企図するという事実に基づいて、「オープンリーディングフレーム」及び「ＯＲＦ」という用語を「コード配列」という用語と区別する。したがって、ＯＲＦは、イントロンを含有し得るが、コード配列は、リボソーム翻訳機構によって実際にアミノ酸に翻訳されるコドンに分割され得るそれらのヌクレオチド（例えば、連結されたエキソン）を指すことによって区別される（すなわち、コード配列がイントロンを含まない）。しかしながら、本明細書で使用される場合、「コード配列」、「ＣＤＳ」、「オープンリーディングフレーム」、及び「ＯＲＦ」という用語は、互換的に使用される。

【0164】

「除去組換えの（ｏｕｔ－ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ）」又は「除去組換え（ｏｕｔ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、インビボ相同組換え中の、２つの部位特異的組換え部位（例えば、標的ベクターのホモロジーアームに相同である標的遺伝子の５’及び３’ヌクレオチド配列）に隣接した遺伝子及び／又はポリヌクレオチド配列（例えば、内因性遺伝子）の除去を指す。「ノックアウト」を参照されたい。

【0165】

「ペプチド発現ベクター」とは、異種ペプチド導入遺伝子を含む宿主生物の発現ベクターを意味する。

【0166】

「ペプチド発現酵母株」、「ペプチド発現株」又は「ペプチド産生株」は、異種ペプチドを産生することができる酵母株を意味する。

【0167】

「ペプチドリンカー」は、リンカーを参照されたい。

【0168】

「ペプチドサブユニット」は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質中の上流、下流、及び／又は１つ以上のシステイン残基間のアミノ酸配列を指す。一部の実施形態では、ペプチドサブユニットは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰにおける上流、下流、及び／又はシステイン残基間にある。一部の実施形態では、ペプチドサブユニットは、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有し得る。更に他の実施形態では、ペプチドサブユニットは、１３個以上のアミノ酸残基の長さを有し得る。一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含む組換えＣＲＰにおけるペプチドサブユニットは、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅとして示される。

【0169】

「ペプチド導入遺伝子」又は「殺虫ペプチド導入遺伝子」又は「殺虫タンパク質導入遺伝子」又は「ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアント導入遺伝子」とは、ＤＶＰをコードし、生物学的発現システムにおいて翻訳され得るＤＮＡ配列を指す。

【0170】

「ペプチド収量」とは、ペプチド発現酵母株の細胞から産生される、条件培地中の殺虫ペプチドの濃度を意味する。これは、単位体積における産生されたペプチドの質量（例えば、ｍｇ／リットル若しくはｍｇ／Ｌ）で、又はＨＰＬＣクロマトグラフにおける産生されたペプチドの紫外線吸光度ピーク面積（例えば、ｍＡｕ．ｓｅｃ）で表すことができる。

【0171】

「害虫」には、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0172】

「農薬有効量（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌｌｙ－ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、少なくとも１つの害虫に死をもたらすことができるか、又は害虫の成長、摂食、又は正常な生理学的発生を顕著に低減することができる農薬の量を指す。この量は、例えば、制御される特定の標的害虫、処理される特定の環境、場所、植物、作物、又は農業用地、環境条件、並びに農薬的に有効なポリペプチド組成物の適用の方法、速度、濃度、安定性、及び量などの要因に応じて変化するであろう。製剤はまた、気候条件、環境考慮事項、及び／又は適用の頻度、及び／又は害虫蔓延の重症度に関して変化し得る。

【0173】

「薬学的に許容される塩」は、その酸塩又は塩基塩を作製することによって修飾されている化合物を指す。

【0174】

「植物」は、植物全体、植物組織、植物細胞、植物部分、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、むかご、胚、及びそれらの子孫を意味するものとする。植物細胞は、分化又は未分化であり得る（例えば、カルス、懸濁培養細胞、原形質細胞、葉細胞、根細胞、師部細胞、及び花粉）。

【0175】

「植物導入遺伝子タンパク質」とは、それをコードするＤＮＡ又はＲＮＡが１つ以上の植物細胞に送達された後に植物において発現される異種由来のタンパク質を意味する。

【0176】

「植物に組み込まれた保護剤」又は「ＰＩＰ」は、トランスジェニック植物によって産生される殺虫タンパク質、及び植物がそのタンパク質を産生するのに必要な遺伝物質を意味する。

【0177】

「植物切断可能リンカー」とは、植物プロテアーゼ認識部位を含み、かつ植物細胞におけるタンパク質発現プロセス中に切断され得る、切断可能なリンカーペプチド、又は切断可能なリンカーペプチドをコードするヌクレオチドを意味する。

【0178】

「植物再生培地」とは、植物成長に必要な要素及びビタミン並びに組織培養に由来する小植物を発芽及び生成することができる胚への細胞の再生を促進するために必要な植物ホルモンを含有する任意の培地を意味する。多くの場合、培地は、トランスジェニック細胞が、薬剤に対する耐性を付与する選択遺伝子を発現する選択薬剤を含有する。

【0179】

「プラスミド」は、目的の遺伝子（例えば、ｄｖｐ）の担体として機能し、生物に形質転換又はトランスフェクトされた場合、宿主生物とは独立してプラスミド内に含有されるＤＮＡ配列を複製及び発現することができるＤＮＡセグメントを指す。プラスミドは、ベクターの一種であり、「クローニングベクター」（すなわち、ＤＮＡ断片をクローニングするために、及び／又は何らかの選択を介してプラスミドを担持する宿主集団を選択するために使用される単純なプラスミド）又は「発現プラスミド」（すなわち、大量のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを産生するために使用されるプラスミド）であり得る。

【0180】

「極性アミノ酸」は、極性であり、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシンを含むアミノ酸であり、好ましい極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンであり、セリンが最も好ましい。

【0181】

「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はその類似体）のポリマー形態（例えば、２つ以上のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの配列）を指す。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれ、ポリヌクレオチドの修飾形態及び非修飾形態も含まれる（ポリヌクレオチドに対する修飾及びポリヌクレオチドの修飾は、例えば、メチル化、リン酸化、及び／又はキャッピングを含み得る）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、前述のいずれかのプライマー又は増幅コピーのうちの１つであり得る。

【0182】

更に他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子のオープンリーディングフレームをコードするように動作可能なヌクレオチドのポリマー形態を指すことができる。

【0183】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡを指すことができる。

【0184】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を行うことができる。ポリヌクレオチドの構造は、ポリヌクレオチドの方向性を示す、その５’末端若しくは３’末端又は末端によって参照され得る。ポリヌクレオチドの一本鎖中の隣接ヌクレオチドは、典型的には、それらの３’及び５’炭素間のホスホジエステル結合によって連結される。しかしながら、異なるヌクレオチドの結合、例えば、メチレン、ホスホロアミデート結合などを含む結合を使用することもできる。これは、それぞれの５’炭素及び３’炭素が、ポリヌクレオチドのいずれかの末端（これらは５’末端及び３’末端又は末端と呼ばれ得る）で曝露され得ることを意味する。５’末端及び３’末端は、それぞれの末端に結合した化学基のために、ホスホリル（ＰＯ_４）末端及びヒドロキシル（ＯＨ）末端と呼ぶこともできる。また、ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。別段の指定又は要求がない限り、ポリヌクレオチドを作製又は使用する任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知である又は予想される２つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。

【0185】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチド（非天然塩基を有するヌクレオチド、アザプリン又はデアザプリンなどの修飾天然塩基を有するヌクレオチドを含む）を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリ前又は後に付与され得る。

【0186】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションなどによって、重合後にも、更に修飾され得る。更に、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドの１つ以上の末端は、特定の方法でその末端が他のポリヌクレオチドと相互作用する（例えば、共有結合を形成する）ことを防ぐように保護され得るか、又はその他、修飾され得る。

【0187】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の特定の配列で構成され得る。また、ウラシル（Ｕ）は、例えば、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンの自然な置換として存在することもできる。ウラシルは、ＤＮＡにも使用され得る。したがって、「配列」という用語は、天然及び非天然塩基を含む、ポリヌクレオチド又は任意の核酸分子のアルファベット表記を指す。

【0188】

「ＲＮＡ分子」又はリボ核酸分子という用語は、ピリミジン塩基のうちの１つとして、デオキシリボース糖ではなくリボース糖を有し、典型的には、チミンではなくウラシルを有するポリヌクレオチドを指す。本発明のＲＮＡ分子は、一般に、一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。ＲＮＡ試料由来のＲＮＡ分子の文脈において、ＲＮＡ分子は、細胞核、ミトコンドリア、又は葉緑体中のＤＮＡから転写された一本鎖分子を含むことができ、これらは、それが転写されるＤＮＡ鎖に相補的なヌクレオチド塩基の直鎖配列を有する。

【0189】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の異種調節エレメントを更に含むことができる。例えば、一部の実施形態では、調節エレメントは、１つ以上のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、オペレーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、ＲＮＡ輸送エレメント、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ポリＵ配列、又はそれらの組み合わせである。

【0190】

「転写後調節エレメント」は、それが転写された後のｍＲＮＡに影響を及ぼすＤＮＡセグメント及び／又はメカニズムである。転写後メカニズムのメカニズムとしては、スプライシング事象、キャッピング、ポリ（Ａ）テールの付加、及び当業者に既知の他のメカニズムが挙げられる。

【0191】

「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の転写に結合し、転写を開始するＤＮＡの領域を指す。

【0192】

「タンパク質」は、本文書において、「ペプチド」及び／又は「ポリペプチド」と同じ意味を有する。

【0193】

「比率」は、２つの量又は２つの物体の間の定量的関係を指し、これは、２つ以上の量又は２つ以上の物体の間の関係（量（ａｍｏｕｎｔ）又は量（ｑｕａｎｔｉｔｙ））を示す。したがって、一部の実施形態では、比率は、第１の値が、第２を含む、又は第２の値内に含まれる回数を示す。

【0194】

「リーディングフレーム」は、二本鎖ＤＮＡ分子の６つの（各方向に３つの）可能なリーディングフレームのうちの１つを指す。使用されるリーディングフレームは、どのコドンがＤＮＡ分子のコード配列内のアミノ酸をコードするために使用されるかを決定する。一部の実施形態では、リーディングフレームは、ポリヌクレオチド及び／又は核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）中のヌクレオチドの配列を、連続した重複していないトリプレットのセットに分割する方法である。

【0195】

「組換えＣＲＰ」は、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を有しない修飾可能なＣＲＰに由来する、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を含む天然に存在しない組換えペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、例えば、その天然に存在する対応物と比較して、又は式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を有しないしない天然に存在しないタンパク質（例えば、非天然の修飾可能なＣＲＰ）と比較して、付加、欠失、及び／又は置換を含む１つ以上の変化を含むポリペプチドを包含し、かかる変化は、例えば、組換えＤＮＡ技術によって導入された。「組換え」という用語はまた、ヒトによって生成されるアミノ酸配列；人工ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質；融合タンパク質；及び／又はキメラポリペプチドを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなるペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質；ヒトによって生成されるヌクレオチド配列；人工ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは遺伝子；融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び／又はキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。発現されると、組換えペプチド、ポリペプチド、及び／又はタンパク質は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが含まれるが、これらに限定されない、当業者に既知の標準的な手順に従って精製され得る。一部の実施形態では、組換えタンパク質は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質合成を含む任意の手段によって産生され得る。

【0196】

「組換えＤＮＡ」又は「ｒＤＮＡ」は、２つ以上の異なるＤＮＡセグメントからなるＤＮＡを指す。

【0197】

「組換えベクター」は、外来ＤＮＡが挿入されたＤＮＡプラスミドベクターを意味する。

【0198】

「調節エレメント」は、核酸配列の発現及び／又はプロセシングの一部の態様を制御する遺伝子エレメントを指す。例えば、一部の実施形態では、調節エレメントは、転写レベル及び転写後レベルで見出すことができる。調節エレメントは、シス調節エレメント（ＣＲＥ）、又はトランス調節エレメント（ＴＲＥ）であり得る。一部の実施形態では、調節エレメントは、１つ以上のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、オペレーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、ＲＮＡ輸送エレメント、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ポリＵ配列、及び／又は遺伝子発現に影響を及ぼす（例えば、組織特異的、時間依存的な様式で、発現を増加させるか若しくは減少させ、かつ／又は構成的発現を引き起こす）他のエレメントであり得る。

【0199】

「制限酵素」又は「制限エンドヌクレアーゼ」は、指定された制限部位でＤＮＡを切断する酵素を指す。例えば、制限酵素は、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩＩ、又はＢｓｔＸＩ制限部位でプラスミドを切断して、プラスミドを直鎖状にすることができ、目的のＤＮＡをライゲーションすることができる。

【0200】

「制限部位」は、４～８ヌクレオチドの配列を含み、その配列が特定の制限酵素によって認識される、ＤＮＡ上の位置を指す。

【0201】

「選択遺伝子」とは、遺伝子修飾生物が選択圧下で増殖するための利点を付与する遺伝子を意味する。

【0202】

「血清型（ｓｅｒｏｖａｒ）」又は「血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）」は、抗原の特徴的なセットによって区別される密接に関連する微生物の群を指す。一部の実施形態では、血清型は、抗原的に及び血清学的に異なる様々な微生物である。

【0203】

「ｓｐ．」は、種を指す。

【0204】

「ｓｓｐ．」又は「ｓｕｂｓｐ．」は、亜種を指す。

【0205】

「サブクローニング」又は「サブクローニングされた」とは、ＤＮＡをあるベクターから別のベクターに、通常有利なベクターに移すプロセスを指す。例えば、変異体ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを、ｐＬＢ１０２プラスミドにサブクローニングし、その後、ｐＫＬＡＣ１プラスミドで形質転換された酵母コロニーを選択することができる。

【0206】

「ＳＳＩ」は、文脈依存的である頭文字である。これは、いくつかの文脈では、「部位特異的組み込み」を指すことができ、インビボでの相同組換えが、宿主生物のゲノム内の特定の部位で生じることを可能にする配列を指すように使用される。したがって、一部の実施形態では、「部位特異的組み込み」という用語は、導入遺伝子を宿主生物のゲノム内の標的部位に導くプロセスを指し、目的の遺伝子を宿主生物の予め選択されたゲノム位置に組み込むことを可能にする。しかしながら、他の文脈では、ＳＳＩは、「室内表面噴霧（ｓｕｒｆａｃｅ ｓｐｒａｙｉｎｇ ｉｎｄｏｏｒｓ）」を指すことができ、これは、壁、窓、床、及び天井などの媒介生物が生息する表面に可変量の殺虫剤を適用する技術である。

【0207】

「ＳＴＡ」又は「翻訳安定化タンパク質」又は「安定化ドメイン」又は「安定化タンパク質」（本明細書で互換的に使用される）は、タンパク質分解の細胞プロセスによって標的化されることなく細胞内に蓄積することができる十分な三次構造を有するペプチド又はタンパク質を意味する。タンパク質は、５～５０アミノ酸長であり得る。翻訳安定化タンパク質は、ＯＲＦの殺虫タンパク質又はＤＶＰをコードする配列と動作可能に連結されるタンパク質のＤＮＡ配列によってコードされる。動作可能に連結されたＳＴＡは、ＤＶＰの上流又は下流のいずれかであり得、介在配列がいずれかのＤＮＡ配列のフレームシフトをもたらさない限り、２つの配列（ＳＴＡ及びＤＶＰ）間に任意の介在配列を有することができる。翻訳安定化タンパク質はまた、腸壁を横断して昆虫の血リンパへのＤＶＰの送達を増加させる活性を有してもよい。ＳＴＡの例としては、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質、配列番号５７、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ４２２１２）、ＧＮＡ（配列番号５８、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＬ０７４７４．１）、又はＪｕｎ ａ ３（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ、配列番号５９、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ８１２９５．１）を含む、本明細書によって記載又は教示される翻訳安定化タンパク質のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。

【0208】

「ｓｔａ」は、翻訳安定化タンパク質をコードするヌクレオチドを意味する。

【0209】

「株」とは、同一の種の他のメンバーのものとは異なる、同一の系統に属する表現型及び／又は遺伝子型形質を示す、遺伝子バリアント、単離株、亜型、その群、又はその培養物を指す。例えば、一部の実施形態では、「株」という用語は、それらの種の他の酵母細胞と比較して、何らかの形でそれらを異なるようにする１つ以上の特性を有する１つ以上の酵母細胞を指すことができ、当該他の酵母細胞は１つ以上の特性を有しない。

【0210】

「構造モチーフ」は、ペプチド及び／又はポリペプチドの三次元配置、及び／又は動作可能に連結されたポリペプチドセグメントの配置を指す。例えば、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－Ｌ－ＤＶＰを含むポリペプチドは、ＥＲＳＰモチーフ、ＳＴＡモチーフ、ＬＩＮＫＥＲモチーフ、及びＤＶＰポリペプチドモチーフを有する。

【0211】

「毒素」は、毒液及び／又は毒、特に、特定の動物、高等植物、及び病原性細菌によって産生されるタンパク質又はコンジュゲートタンパク質を指す。一般に、「毒素」という用語は、天然物、例えば、サソリ、クモ、ヘビ、毒キノコなどで見出される分子及びペプチドを保持するが、「毒物」という用語は、人工物（ｍａｎ－ｍａｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）及び／又は人工物（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、例えば、人工化学農薬を保持する。しかしながら、本明細書で使用される場合、「毒素」及び「毒性物質」という用語は、同義的に使用される。

【0212】

「トランスフェクション」及び「形質転換」は、いずれも、宿主生物（例えば、原核生物又は真核生物）に外因性及び／又は異種のＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを含むベクター）を導入するプロセスを指す。一般に、当業者は、細菌細胞に外因性及び／若しくは異種のＤＮＡ又はＲＮＡを導入するプロセスを記載するために「形質転換」という用語を留保することがあり、真核細胞への外因性及び／若しくは異種のＤＮＡ又はＲＮＡの導入を記載するプロセスのために「トランスフェクション」という用語を留保することがある。しかしながら、本明細書で使用される場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、プロセスが、原核生物（例えば、細菌）又は真核生物（例えば、酵母、植物、若しくは動物）への外因性及び／若しくは異種のＤＮＡ又はＲＮＡの導入を記載するかどうかに関係なく、同義的に使用される。

【0213】

「導入遺伝子」は、植物に形質転換されるタンパク質をコードする異種及び／又は外因性ＤＮＡ配列を意味する。

【0214】

「トランスジェニック宿主細胞」又は「宿主細胞」とは、遺伝子で形質転換され、追加の選択遺伝子を介してそのトランスジェニック状態について選択された細胞を意味する。

【0215】

「トランスジェニック植物」とは、植物の全ての細胞がその導入遺伝子を含むように、外来のＤＮＡで形質転換された単一の細胞に由来する植物を意味する。

【0216】

「一過性発現システム」とは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベースのシステムを意味し、これは、武装解除植物ウイルスをコードするＤＮＡを、それが発現される植物細胞に送達する。植物ウイルスは、ＴＳＰの最大４０％の高濃度で目的のタンパク質を発現するように操作されている。

【0217】

「三重発現カセット」は、同じベクター上に含有される３つのＤＶＰ発現カセットを指す。

【0218】

「ＴＲＢＯ」とは、ウイルスコーティングタンパク質遺伝子が除去されたタバコモザイクウイルスを使用した一過性植物発現システムを意味する。

【0219】

「トリプシン切断」とは、プロテアーゼ酵素トリプシン（露出したリジン及びアルギニンアミノ酸残基を認識する）を使用して、その切断部位で切断可能リンカーを分離するインビトロアッセイを意味する。それはまた、トリプシン酵素がその部位を切断する行為を意味する。

【0220】

「ＴＳＰ」又は「全可溶性タンパク質」とは、植物組織試料から抽出され、抽出緩衝液中に可溶化され得るタンパク質の総量を意味する。

【0221】

「ＵＢＩ」は、ユビキチンを指す。例えば、一部の実施形態では、ＵＢＩは、Ｚｅａ ｍａｙｓから単離されたユビキチンモノマーを指すことができる。

【0222】

「ｖａｒ．」は、変種又は品種を指す。「ｖａｒ．」という用語は、種レベル及び／又は亜種（存在する場合）以下にランク付けされる分類学的カテゴリーを示すために使用される。一部の実施形態では、「ｖａｒ．」という用語は、軽微ではあるが永続的又は遺伝的な特徴において、同じ亜種又は種の他のメンバーとは異なるメンバーを表す。

【0223】

「バリアント」又は「バリアント配列」又は「バリアントペプチド」とは、１つ以上の保存的アミノ酸置換又は保存的修飾を有するアミノ酸配列を指す。「バリアント」における保存的アミノ酸置換は、その非バリアント形態との関連において、バリアントの活性を実質的に減少させない。例えば、一部の実施形態では、「バリアント」は、配列番号によって示される、開示される配列及び／又は特許請求される配列を有するペプチドと比較した場合、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する。

【0224】

「ベクター」は、目的の異種ポリヌクレオチド（例えば、ｄｖｐ）を受け入れるＤＮＡセグメントを指す。目的の異種ポリヌクレオチドは、「挿入物」又は「導入遺伝子」として知られている。

【0225】

「野生型」又は「ＷＴ」は、生物、ポリヌクレオチド配列、及び／又はポリペプチド配列が、その天然に存在する状態又は条件で見出され、かつ／又は観察される場合の、生物、ポリヌクレオチド配列、及び／又はポリペプチド配列の表現型及び／又は遺伝子型（すなわち、外観又は配列）を指す。

【0226】

「酵母発現ベクター」又は「発現ベクター」又は「ベクター」とは、酵母細胞に転写及び翻訳される異種遺伝子及び／又は発現カセットを導入することができるプラスミドを意味する。

【0227】

「収量」は、ペプチドの産生を指し、収量の増加は、産生量の増加、産生速度の増加、及び収量の平均値又は中央値の増加、及びより高い収量の頻度の増加を意味し得る。「収量」という用語は、「植物の収量」と同様に、植物作物の成長及び／又は生産に関連して使用される場合、植物によって産生されるバイオマスの質及び／又は量を指す。

【0228】

本明細書全体を通して、特に別段の定めがない限り、又は文脈上別段の定めが必要でない限り、単一のステップ、物質の組成物、一群のステップ、又は一群の物質の組成物は、それらのステップ、物質の組成物、一群のステップ、又は一群の物質の組成物のうちの１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含するものとみなされなければならない。

【0229】

本開示は、別段の指示がない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、固相及び液体核酸合成、溶液中のペプチド合成、固相ペプチド合成、免疫学、細胞培養、及び製剤の従来の技法を使用して、過度の実験なしで実施される。かかる手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｖｏｌｓ．Ｉ，ＩＩ，ａｎｄ ＩＩＩ全て、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，１９８５），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全てのテキスト、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ，１９８４）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全てのテキスト、及び、特に、そこにあるＧａｉｔ，ｐｐ１－２２、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ｐｐ３５－８１、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ，ｐｐ ８３－１１５、及びＷｕ ｅｔ ａｌ，ｐｐ １３５－１５１による論文、４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全てのテキスト、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８６）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全てのテキスト、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），全てのシリーズ、Ｊ．Ｆ．Ｒａｍａｌｈｏ Ｏｒｔｉｇａｏ，“Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｉｎ：Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｅｂｓｉｔｅ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｄ．，Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．，Ｌｉｅｎ，Ｅ．Ｌａｎｄ Ｆｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ．Ｌ．（１９７６）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３ ３３６－３４２、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９－２１５４、Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９７９）ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，３．ｅｄｓ．），ｖｏｌ．２，ｐｐ．１－２８４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１２．Ｗｉｉｎｓｃｈ，Ｅ．，ｅｄ．（１９７４）Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ ｉｎ Ｈｏｕｂｅｎ－Ｗｅｙｌｓ Ｍｅｔｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｕｌｅｒ，Ｅ．，ｅｄ．），ｖｏｌ．１５，４ｔｈ ｅｄ．，Ｐａｒｔｓ １ ａｎｄ ２，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．＆ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２５，４４９－４７４、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、並びにＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ，ｅｄ．，２０００）に記載されている（これらの参考文献の各々は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。

【0230】

本明細書全体を通して、文脈上別段の定めが必要でない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形例は、記載されたステップ若しくは要素若しくは整数、又は一群のステップ若しくは要素若しくは整数の包含を意味するが、任意の他のステップ若しくは要素若しくは整数、又は一群の要素若しくは整数の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。

【0231】

本明細書で言及される全ての特許出願、特許、及び刊行物は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、その全体が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、それらの全体が参照により援用される。また、本明細書で引用される全ての特許出願、特許、及び刊行物は、任意の定義、主題の免責事項、又は否認を除いて、かつ援用された資料が本明細書の開示と矛盾する場合を除いて（その場合は、本開示の文言が支配する）、参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0232】

野生型ジゲトキシン及びＤＶＰ
アメリカ砂漠クモ（Ｄｉｇｕｅｔｉａ ｃａｎｉｔｉｅｓ）は、アメリカ合衆国の砂漠及び半砂漠の生息地で見られるコーンウェブクモの一種である。Ｄｉｇｕｅｔｉａ ｃａｎｉｔｉｅｓは、哺乳類に影響を及ぼさないが、殺虫効果を有することが示されている毒素を産生する。Ｂｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｖｏｌｔａｇｅ－ｓｅｎｓｏｒ ｌｏｃｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｉｎｓｅｃｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｄｅｒ ｔｏｘｉｎ Ｄｃ１ａ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４ Ｊｕｌ １１；５：４３５０を参照されたい。

【0233】

Ｄｉｇｕｅｔｉａ ｃａｎｉｔｉｅｓが産生する毒素のうちの１つは、とりわけ、ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａ（μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、又は単に「Ｄｃ１ａ」としても知られている）である。配列番号１（ＮＣＢＩ受託番号Ｐ４９１２６．１）のアミノ酸配列を有する、Ｄｉｇｕｅｔｉａ ｃａｎｉｔｉｅｓ由来の例示的な野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａポリペプチド配列が本明細書に提供される。

【0234】

配列番号１に例示される野生型Ｄｃ１ａポリペプチドは、シグナルペプチド領域及びプロペプチド領域を含む。ポリペプチド処理後、成熟野生型Ｄｃ１ａポリペプチドは、「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号２）のアミノ酸配列を有する。Ｄｃ１ａは、伸長されたＮ末端セグメントに由来する３本鎖βシート及び残基Ｃ２５とＣ３９との間の大きなシスチン間ループとともに、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフを有する。Ｄｃ１ａは、Ｃ１２及びＣ２５、Ｃ１９及びＣ３９、Ｃ２４及びＣ５３、並びにＣ４１及びＣ５１でシステイン間のジスルフィド結合接合性を有する。

【0235】

ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）、又はその薬学的に許容される塩は、野生型成熟ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａ（配列番号２）とは異なる変異体又はバリアントであり、例えば、一部の実施形態では、この変異は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失／挿入、又は野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａをコードするポリヌクレオチドの変化であり得る。このバリエーションの結果は、野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａと比較して、１つ以上の昆虫種に対する増強された殺虫活性を有する、天然に存在しないポリペプチド及び／又はそれをコードするポリヌクレオチド配列である。

【0236】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、式（Ｉ）に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列であって、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖ、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、アミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0237】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含む。

【0238】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含む。

【0239】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含む。

【0240】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１３、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含む。

【0241】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、２つ以上のＤＶＰのホモポリマー又はヘテロポリマーであり得、各ＤＶＰのアミノ酸配列は、同じであるか、又は異なる。

【0242】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、切断可能又は切断不能リンカーによって分離された２つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質であり得、各ＤＶＰのアミノ酸配列は、同じである場合も異なる場合もある。一部の実施形態では、リンカーは、昆虫の腸内又は血液リンパ内で切断可能である。

【0243】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、１つ以上の追加のペプチド及び／又は産物と組み合わされ得る。例えば、ＤＶＰは、本明細書に記載されるＤＶＰ、及び賦形剤を含む組成物の一部であり得る。

【0244】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、ポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドであって、当該ＤＶＰが、式（Ｉ）に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列であって、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖである、アミノ酸配列を含み、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列。他の実施形態では、ポリヌクレオチドが、ＤＶＰをコードする場合、Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶ、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ又はＶである場合、ジスルフィド結合が除去される。

【0245】

更に他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその相補的ヌクレオチド配列を有するＤＶＰをコードする。

【0246】

更に他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその相補的ヌクレオチド配列を有するＤＶＰをコードする。

【0247】

更に他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその相補的ヌクレオチド配列を有するＤＶＰをコードする。

【0248】

更に他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２１３、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその相補的ヌクレオチド配列を有するＤＶＰをコードする。

【0249】

一部の実施形態では、植物、植物組織、植物細胞、植物種子、又はその一部は、本明細書に記載の１つ以上のＤＶＰ、又は本明細書に記載のＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを含み得る。

【0250】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、（ａ）ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットを含むベクターを調製することであって、当該ＤＶＰが、式（Ｉ）のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列であって、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖ、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、アミノ酸配列又はその薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される塩を含む、調製することと、（ｂ）ベクターを酵母細胞に導入することと、（ｃ）ＤＶＰの発現及び増殖培地への分泌を可能にするように動作可能な条件下で、増殖培地中で酵母細胞を増殖することと、を含む、方法によって産生され得る。一部の実施形態では、Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶである場合、ジスルフィド結合が除去される。

【0251】

一部の実施形態では、ベクターは、アルファ－ＭＦシグナルを含むプラスミドである。他の実施形態では、ベクターは、酵母株に形質転換される。例えば、一部の実施形態では、酵母株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の任意の種から選択される。一部の実施形態では、酵母株は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群から選択される。例えば、一部の実施形態では、酵母株は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓである。

【0252】

一部の実施形態では、ＤＶＰの発現が、培地１リットル当たり、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ ２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１００，０００ｍｇ／ＬのＤＶＰの収量を提供する。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰの発現は、培地１リットル当たり少なくとも１００ｍｇ／ＬのＤＶＰの収量を提供する。

【0253】

一部の実施形態では、培地中のＤＶＰの発現は、培地中の単一のＤＶＰの発現をもたらす。

【0254】

一部の実施形態では、培地中のＤＶＰの発現は、培地中の２つ以上のＤＶＰポリペプチドを含むＤＶＰポリマーの発現をもたらす。

【0255】

一部の実施形態では、ベクターは、２つ又は３つの発現カセットを含み、各発現カセットは、第１の発現カセットのＤＶＰをコードするように動作可能である。一部の実施形態では、ベクターは、２つ又は３つの発現カセットを含み、各発現カセットは、第１の発現カセットのＤＶＰ、又は異なる発現カセットのＤＶＰをコードするように動作可能である。一部の実施形態では、発現カセットは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるＤＶＰをコードするように動作可能である。

【0256】

本発明の例示的なＤＶＰは、以下の表１に提供される。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【0257】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、ジスルフィド欠失を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、ジスルフィド結合の欠失をもたらす、残基Ｃ４１及びＣ５１にアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、ジスルフィド欠失を有するＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ５１Ｇ、Ｃ５１Ｆ、及び／又はそれらの両方のアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、ジスルフィド欠失を有するＤＶＰは、配列番号５のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「ジスルフィド欠失」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ５１Ｇ、Ｃ５１Ｆ、及び／又はそれらの両方のアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0258】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ及びＣ５１Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号６のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ５１Ｇ、Ｃ５１Ｆ、及び／又はそれらの両方のアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0259】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ａ及びＣ５１Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号７のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ａ／Ｃ５１Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ａ及びＣ５１Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0260】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ及びＣ５１Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号８のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ及びＣ５１Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0261】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｖ及びＣ５１Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号９のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｖ／Ｃ５１Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｖ及びＣ５１Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0262】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ａ及びＣ５１Ｔのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ａ／Ｃ５１Ｔ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ａ及びＣ５１Ｔのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0263】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ａ及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ａ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ａ及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0264】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ａ及びＣ５１Ｖのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ａ／Ｃ５１Ｖ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ａ及びＣ５１Ｖのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0265】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１３のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0266】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１４のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0267】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＶ１７Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１５のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｖ１７Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＶ１７Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0268】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ２０Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１６のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ２０Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ２０Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0269】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＳ２１Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１７のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｓ２１Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＳ２１Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0270】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＷ３１Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１８のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｗ３１Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＷ３１Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0271】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＹ３２Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１９のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｙ３２Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＹ３２Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0272】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＰ３６Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２０のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｐ３６Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＰ３６Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0273】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0274】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＬ４２Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２２のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｌ４２Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＬ４２Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0275】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＶ５２Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２３のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｖ５２Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＶ５２Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0276】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＷ３１Ｆのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２４のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｗ３１Ｆ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＷ３１Ｆのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0277】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＹ３２Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２５のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｙ３２Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＹ３２Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0278】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｗ３１Ｆ、Ｙ３２Ｓ、及びＰ３６Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２６のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｗ３１Ｆ／Ｙ３２Ｓ／Ｐ３６Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｗ３１Ｆ、Ｙ３２Ｓ、及びＰ３６Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0279】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、及びＬ４２Ｎのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２７のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ２０Ａ／Ｌ４２Ｎ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、及びＬ４２Ｎのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0280】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、及びＬ４２Ｖのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２８のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ２０Ａ／Ｌ４２Ｖ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、及びＬ４２Ｖのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0281】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２９のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0282】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ３８Ｋのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３０のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ｋ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ３８Ｋのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0283】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ３８Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３１のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、及びＤ３８Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0284】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＶ５２Ｔのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３２のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｖ５２Ｔ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＶ５２Ｔのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0285】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＶ５２Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３３のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｖ５２Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＶ５２Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0286】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＶ１７Ｅのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３４のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｖ１７Ｅ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＶ１７Ｅのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0287】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｖのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３５のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｖのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0288】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３６のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0289】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｅのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３７のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｅ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｅのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0290】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｑのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３８のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｑ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｑのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0291】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＤ２０Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号３９のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｄ２０Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＤ２０Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0292】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、及びＹ３２Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４０のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ２０Ａ／Ｙ３２Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、及びＹ３２Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0293】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＹ３２Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４１のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｙ３２Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＹ３２Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0294】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＹ３２Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４２のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ２０Ａ／Ｄ３８Ａ／Ｙ３２Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、Ｄ３８Ａ、及びＹ３２Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0295】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、Ｗ３１Ｆ、Ｙ３２Ｓ、及びＰ３６Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４３のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ２０Ａ／Ｗ３１Ｆ／Ｙ３２Ｓ／Ｐ３６Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ａ、Ｄ２０Ａ、Ｗ３１Ｆ、Ｙ３２Ｓ、及びＰ３６Ａのアミノ酸置換を有する実施形態を指す。

【0296】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｄ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４４のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｄ３８Ａのアミノ酸置換を有する実施形態を指す。

【0297】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｔ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４５のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｔ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｔ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0298】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ｔ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４６のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ｔ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ｔ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0299】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｓ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４７のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｓ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0300】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ｓ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４８のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ｓ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0301】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｖ、Ｃ５１Ｔ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４９のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｖ／Ｃ５１Ｔ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｖ、Ｃ５１Ｔ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0302】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ｖ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号５０のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ｖ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｔ、Ｃ５１Ｖ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0303】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｖ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号５１のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｖ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｖ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0304】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｖ、Ｃ５１Ｓ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号５２のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｖ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｖ、Ｃ５１Ｓ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0305】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｓ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｖのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号５３のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｓ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｖのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0306】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｓ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｖのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号５３のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｓ、Ｄ３８Ａ、及びＬ４２Ｖのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0307】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｄ３８Ａ、Ｌ４２Ｉ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１０のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｉ／Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｄ３８Ａ、Ｌ４２Ｉ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指す。

【0308】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｋ２Ｌ、Ｄ３８Ａ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１１のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｋ２Ｌ／Ｄ３８Ａ／Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｋ２Ｌ、Ｄ３８Ａ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指し得る。

【0309】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｙ３２Ｓ、Ｄ３８Ａ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１２のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｙ３２Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｙ３２Ｓ、Ｄ３８Ａ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指し得る。

【0310】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、Ｄ３８Ａ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１３のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｋ２Ｌ／Ｙ３２Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、Ｄ３８Ａ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指し得る。

【0311】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｄ３８Ｔ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１４のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｄ３８Ｔ／Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｄ３８Ｔ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指し得る。

【0312】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｄ３８Ｓ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１５のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｄ３８Ｓ／Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｄ３８Ｓ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指し得る。

【0313】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、及びＬ４２Ｉのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１７のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｋ２Ｌ／Ｙ３２Ｓ／Ｌ４２Ｉ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、及びＬ４２Ｉのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指し得る。

【0314】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２と比較して、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、Ｌ４２Ｉ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１７のアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、「Ｋ２Ｌ／Ｙ３２Ｓ／Ｌ４２Ｉ／Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ」という用語は、配列番号２と比較して、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、Ｌ４２Ｉ、Ｃ４１Ｓ、及びＣ５１Ｓのアミノ酸置換を有するそれらの実施形態を指し得る。

【0315】

様々な実施形態では、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを使用して、植物細胞、酵母細胞、又は細菌細胞を形質転換し得る。一部の実施形態では、殺虫ＤＶＰトランスジェニックタンパク質は、当業者に既知の任意の様式で、植物又はその一部の表面に噴霧するか、又はその他、適用することができる組成物に製剤化され得る。したがって、宿主細胞、例えば植物細胞における適切な条件下で１つ以上のＤＶＰをコードするように動作可能なＤＮＡ構築物が本明細書に提供される。植物細胞の寄生性昆虫による害虫感染を制御するための方法は、本明細書に記載されるＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを、組換え技術によって、植物、植物組織、又は植物細胞に投与又は導入することと、当該組換えにより改変された植物、植物組織、又は植物細胞を、害虫に曝露された野外で育てることと、を含む。代替的に、ＤＶＰは、ＤＶＰ及び賦形剤からなる噴霧用組成物に製剤化され得、感染性昆虫によるＤＶＰの摂取時に有害な効果をもたらすように直接適用によって、感受性の植物に直接適用され得る。

【0316】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0317】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0318】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0319】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号２１３、若しくは２１７～２１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0320】

一部の実施形態では、ＤＶＰは、配列番号１２８、若しくは１４７に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0321】

一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドは、配列番号７７～１１４、１１６～１２２、１２４、１５６、１５８、１６４、１６７～１６８、１７２、１７４～１７５、２２０～２２５、又は２２７～２１９のうちのいずれか１つの核酸配列を有し得る。一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドは、配列番号７７～１１４、１１６～１２２、１２４、１５６、１５８、１６４、１６７～１６８、１７２、１７４～１７５、２２０～２２５、又は２２７～２１９のものと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を含み得る。

【0322】

一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドは、配列番号７７～１１４、１１６～１２２、１２４、１５６、１５８、１６４、１６７～１６８、１７２、１７４～１７５、２２０～２２５、又は２２７～２１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一である核酸配列を含み得る。

【0323】

一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードし得る。

【0324】

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含む。

【0325】

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含む。

【0326】

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２１３、若しくは２１７～２１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含む。

【0327】

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含む。

【0328】

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含む。

【0329】

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含む。

【0330】

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２１３、又は２１７～２１８のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を有するＤＶＰ、又はその相補的配列をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含む。

【0331】

ＤＶＰ－殺虫タンパク質
一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、任意のタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸配列、構成、構築物又は配置であり得、以下を含む：（１）少なくとも１つのＤＶＰ、又は２つ以上のＤＶＰ、及び（２）追加の非毒性ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質。例えば、一部の実施形態では、これらの追加のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、ＤＶＰ単独と比較して、ＤＶＰ－殺虫タンパク質に曝露された昆虫の死亡率を増加させ、及び／又は成長を阻害する能力；例えば、宿主細胞内で、ＤＶＰ－殺虫タンパク質の発現を増加させ、及び／又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の翻訳後処理に影響を及ぼす能力を有し得る。

【0332】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、２つ以上のＤＶＰを含むポリマーであり得る。更に他の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、２つ以上のＤＶＰを含むポリマーであり得、ＤＶＰが、リンカーペプチド、例えば、切断可能及び／又は切断不能リンカーを介して動作可能に連結されている。

【0333】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、安定化ドメイン（ＳＴＡ）、小胞体シグナル伝達タンパク質（ＥＲＳＰ）、昆虫切断可能若しくは昆虫切断不能リンカー（Ｌ）、及び／又はそれらの任意の他の組み合わせなどの１つ以上のタンパク質と動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを指し得る。

【0334】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、適切に折り畳まれた場合、又はその最も自然な熱力学的状態において、１種類以上の昆虫に対して殺虫活性を発揮するアミノ酸のポリマーであり得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、異なる２つ以上のＤＶＰを含むポリマーであり得る。他の実施形態では、殺虫タンパク質は、同じである２つ以上のＤＶＰのポリマーであり得る。

【0335】

更に他の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、１つ以上のＤＶＰと、ＤＶＰ－殺虫タンパク質の折り畳みを補助し得る１つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質と、を含み得る。

【0336】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、１つ以上のＤＶＰと、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質と、を含み得、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、安定性又は溶解性を助けるタンパク質タグである。他の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、親和性精製を助けるタンパク質タグであり得る。

【0337】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、安定化ドメイン（ＳＴＡ）、小胞体シグナル伝達タンパク質（ＥＲＳＰ）、昆虫切断可能又は昆虫切断不能リンカー、１つ以上の異種ペプチド、１つ以上の追加のポリペプチド、及び／又はそれらの任意の他の組み合わせなどの１つ以上のタンパク質と動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを指し得る。一部の実施形態では、殺虫タンパク質は、本明細書に開示される１つ以上のＤＶＰを含み得る。

【0338】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、ＤＶＰホモポリマー、例えば、同じＤＶＰである２つ以上のＤＶＰモノマーを含み得る。一部の実施形態では、殺虫タンパク質は、ＤＶＰヘテロポリマー（例えば、ＤＶＰモノマーが異なる、２つ以上のＤＶＰモノマー）を含むことができる。

【0339】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0340】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９に示されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0341】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0342】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0343】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有する１つ以上のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0344】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９に示されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0345】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、１つ以上のＤＶＰを含み得、ＤＶＰは、同じであるか又は異なる。

【0346】

切断可能及び切断不能リンカーの生成のための例示的な方法は、米国特許出願第１５／７２７，２７７号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００４２号に見出すことができる（それらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。

【0347】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、本明細書に記載の１つ以上のＤＶＰを含み、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された、融合タンパク質であり得る。

【0348】

「アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチド」又は「アルファ－ＭＦシグナル」又は「アルファ－ＭＦ」又は「アルファ接合因子分泌シグナル」又は「αＭＦ分泌シグナル」（全て互換的に使用される）は、アルファ－ＭＦペプチドが目的の組換えペプチド（例えば、ＤＶＰ）に動作可能に連結されている場合、組換え発現系において分泌発現を可能にするシグナルペプチドを指す。アルファ－ＭＦペプチドは、新生組換えポリペプチドを組換え発現系（例えば、酵母組換え発現系の分泌経路へ方向付ける。

【0349】

アルファ－ＭＦペプチドは、当技術分野で周知である。例示的なアルファ－ＭＦペプチドが、本明細書に提供され、ｐＫＬＡＣ１ベクターのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓアルファ接合因子プレプロ分泌リーダー（配列番号２４６）、ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿４５４８１４（配列番号２４７）、Ｍｆ（アルファ）１／Ｍｆ（アルファ）２（配列番号２４８、ＮＣＢＩ受託番号ＱＥＵ６１４１１．１）、接合因子アルファ前駆体Ｎ末端（配列番号２４９、ＮＣＢＩ受託番号ＫＡＧ０６７４３１０）などが含まれるが、これらに限定されない。

【0350】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰであって、当該１つ以上のＤＶＰは、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＤＶＰが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、１つ以上のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0351】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰであって、当該１つ以上のＤＶＰが、式（Ｉ）に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であり、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖ、ＤＶＰが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴであり、Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶである場合、次いで、ジスルフィド結合が除去される、１つ以上のＤＶＰ又はその薬学的に許容される塩を含み得る。

【0352】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、１つ以上のＤＶＰは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む。

【0353】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、１つ以上のＤＶＰは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む。

【0354】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、１つ以上のＤＶＰは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む。

【0355】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、１つ以上のＤＶＰは、２つ以上のＤＶＰのホモポリマー又はヘテロポリマーであり、各ＤＶＰのアミノ酸配列は、同じであるか、又は異なる。

【0356】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、１つ以上のＤＶＰ、アルファ－ＭＦ、又はそれらの組み合わせは、切断可能又は切断不能リンカーによって分離される。

【0357】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、切断可能なリンカーは、昆虫の腸内又は血液リンパ内で切断可能である。

【0358】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、アルファ－ＭＦペプチドは、酵母種に由来するアルファ－ＭＦペプチドである。

【0359】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、アルファ－ＭＦペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の任意の種から選択される酵母種に由来する。

【0360】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、アルファ－ＭＦペプチドは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群から選択される酵母種に由来する。

【0361】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、アルファ－ＭＦペプチドは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ又はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓに由来する。

【0362】

一部の実施形態では、アルファ－ＭＦペプチドは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓに由来するアルファ－ＭＦペプチドであり得る。

【0363】

一部の実施形態では、アルファ－ＭＦペプチドは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓα接合因子（α－ＭＦ）分泌ドメイン（分泌発現用）であり得る。

【0364】

一部の実施形態では、アルファ－ＭＦペプチドは、配列番号２４６～２４９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有し得る。

【0365】

一部の実施形態では、アルファ－ＭＦペプチドは、配列番号２４６に示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を有し得る。

【0366】

一部の実施形態では、アルファ－ＭＦペプチドは、配列番号２４６～２４９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有し得る。

【0367】

一部の実施形態では、アルファ－ＭＦペプチドは、配列番号２４６に示されるアミノ酸配列を有し得る。

【0368】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を有する１つ以上のＤＶＰを含み得、１つ以上のＤＶＰが、配列番号２４６～２４９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するアルファ－ＭＦペプチドに動作可能に連結されている。

【0369】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を有する１つ以上のＤＶＰを含み得、１つ以上のＤＶＰが、配列番号２４６～２４９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するアルファ－ＭＦペプチドに動作可能に連結されており、追加の非毒素ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を更に含み、例えば、一部の実施形態では、当該追加の非毒素ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、以下のうちの１つ以上を行う能力を有する：昆虫がＤＶＰ－殺虫タンパク質に曝露される場合、ＤＶＰ単独と比較して、昆虫の死亡率を増加させ、及び／若しくは成長を阻害する；当該ＤＶＰ－殺虫タンパク質の発現を、例えば、宿主細胞若しくは発現システムにおいて、増加させる；並びに／又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の翻訳後プロセシングに影響を与える（例えば、ＤＶＰ－殺虫性タンパク質の分泌発現を可能にする）。

【0370】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含み得、２つ以上のＤＶＰが、存在する。

【0371】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含むことができ、２つ以上のＤＶＰが、存在し、ＤＶＰ及び／又はアルファ－ＭＦペプチドは、リンカーペプチド、例えば、切断可能及び／又は切断不能リンカーを介して動作可能に連結されている。

【0372】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質であり得、更に、安定化ドメイン（ＳＴＡ）、小胞体シグナル伝達タンパク質（ＥＲＳＰ）、昆虫切断可能若しくは昆虫切断不能リンカー（Ｌ）、及び／又はそれらの任意の他の組み合わせなどの１つ以上のタンパク質と動作可能に連結されている。

【0373】

本明細書に記載されるＤＶＰのうちのいずれかは、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質を産生するために使用され得る。本明細書に記載されるＤＶＰのうちのいずれかは、アルファ接合因子（アルファ－ＭＦ）ペプチドに動作可能に連結された１つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質を産生するために使用され得、例えば、１つ以上のＤＶＰは、同様に本明細書に記載される配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ配列を有する。

【0374】

例示的なＤＶＰ及びＤＶＰ－殺虫タンパク質
一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号４７）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0375】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号４７）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0376】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＶＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号５３）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0377】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＶＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号５３）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0378】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＴＶＫＳＧＦＦＳＳＫＭＶＣＲＤＶ」（配列番号１３６）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0379】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＴＶＫＳＧＦＦＳＳＫＭＶＣＲＤＶ」（配列番号１３６）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0380】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＤＶＫＳＧＦＦＳＳＫＥＶＣＲＤＶ」（配列番号１３９）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0381】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＤＶＫＳＧＦＦＳＳＫＥＶＣＲＤＶ」（配列番号１３９）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0382】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＥＶＫＳＧＦＦＳＳＫＫＶＣＲＤＶ」（配列番号１４０）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0383】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＥＶＫＳＧＦＦＳＳＫＫＶＣＲＤＶ」（配列番号１４０）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0384】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＥＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＴＶＫＳＧＦＦＳＳＫＡＶＣＲＤＶ」（配列番号１４４）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0385】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＥＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＴＶＫＳＧＦＦＳＳＫＡＶＣＲＤＶ」（配列番号１４４）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0386】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＮＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＴＶＫＳＧＦＦＳＳＫＡＶＣＲＤＶ」（配列番号１４６）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0387】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＮＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＴＶＫＳＧＦＦＳＳＫＡＶＣＲＤＶ」（配列番号１４６）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0388】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＹＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＴＶＫＳＧＦＦＳＳＫＡＶＣＲＤＶ」（配列番号１４７）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0389】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＹＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＴＶＫＳＧＦＦＳＳＫＡＶＣＲＤＶ」（配列番号１４７）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0390】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＡＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１８７）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0391】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＡＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１８７）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0392】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＫＫＷＲＡＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１８８）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0393】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＫＫＷＲＡＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１８８）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0394】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＨＫＷＲＡＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１８９）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0395】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＨＫＷＲＡＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１８９）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0396】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＦＳＫＷＲＰＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１９０）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0397】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＦＳＫＷＲＰＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１９０）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0398】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＦＳＫＷＲＡＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１９１）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0399】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＦＳＫＷＲＡＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号１９１）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0400】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＡＣＲＳＩＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２０９）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0401】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＡＣＲＳＩＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２０９）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0402】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＩＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１０）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0403】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＩＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１０）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0404】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１１）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0405】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１１）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0406】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＡＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１２）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0407】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＡＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１２）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0408】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＡＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１３）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0409】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＡＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１３）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0410】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＴＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１４）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0411】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＴＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１４）、又はその薬学的に許容される塩を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0412】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＳＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１５）、又はその薬学的に許容される塩。

【0413】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＳＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１５）、又はその薬学的に許容される塩。

【0414】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＤＣＲＣＩＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号２１７）、又はその薬学的に許容される塩。

【0415】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＤＣＲＣＩＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号２１７）、又はその薬学的に許容される塩。

【0416】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＡＣＲＳＩＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１８）、又はその薬学的に許容される塩。

【0417】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＡＣＲＳＩＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１８）、又はその薬学的に許容される塩。

【0418】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＩＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１９）、又はその薬学的に許容される塩。

【0419】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、アミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＩＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１９）、又はその薬学的に許容される塩。

【0420】

ＤＶＰを産生するための方法
タンパク質を産生する方法は当該技術分野において周知であり、様々な技術が利用可能である。例えば、一部の実施形態では、タンパク質は、組換え法を使用して産生され得るか、又は化学的に合成され得る。

【0421】

一部の実施形態では、本発明のＤＶＰは、タンパク質を産生するための任意の既知の方法を使用して作製することができる。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰは、限定されないが、酵母発現システム又は細菌発現システムなどの組換え発現システムを使用して作製することができる。しかしながら、当業者であれば、他のタンパク質産生の方法が利用可能であることを認識するであろう。

【0422】

一部の実施形態では、本発明は、組換え発現システムを使用して、ＤＶＰを産生する方法を提供する。

【0423】

一部の実施形態では、本発明は、ＤＶＰを産生する方法を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、当該方法は、（ａ）ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる第１の発現カセットを含むベクターを調製することと、（ｂ）ベクターを宿主細胞（例えば、細菌若しくは酵母、又は昆虫、又は植物細胞、又は動物細胞）に導入することと、（ｃ）ＤＶＰの発現及びその増殖培地への分泌を可能にするように動作可能な条件下で、酵母株を増殖培地で増殖させることと、を含む。一部の関連する実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞である。

【0424】

本発明は、多種多様な宿主細胞において実施可能である（以下の宿主細胞のセクションを参照されたい）。実際、本発明のエンドユーザーは、自身が選択する任意の宿主細胞において、その教示を実践することができる。したがって、一部の実施形態では、宿主細胞は、エンドユーザーの要件を満たす任意の宿主細胞であってもよく、すなわち、一部の実施形態では、ＤＶＰの発現は、様々な宿主細胞を使用して、かつ本明細書の教示に基づいて達成され得る。例えば、一部の実施形態では、ユーザーは、ある特定の種類の宿主細胞（例えば、酵母細胞又は細菌細胞）を、別のものとは対照的に使用することを望む場合があり、所与の宿主細胞の好みは、可用性からコストまでの範囲であり得る。

【0425】

例えば、一部の実施形態では、一部の実施形態では、本発明は、ＤＶＰを産生する方法を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、当該方法は、（ａ）ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる第１の発現カセットを含むベクターを調製することと、（ｂ）ベクターを宿主細胞（例えば、細菌若しくは酵母、又は昆虫、又は植物細胞、又は動物細胞）に導入することと、（ｃ）ＤＶＰの発現及びその増殖培地への分泌を可能にするように動作可能な条件下で、酵母株を増殖培地で増殖させることと、を含む。一部の関連する実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞である。

【0426】

野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａの単離及び変異化
様々な例示的な実施形態では、ＤＶＰは、野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａポリヌクレオチド配列に変異を作製することと、そのミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチド（ｄｖｐ）配列を適切なベクターに挿入することと、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドが発現するような方法で宿主生物を形質転換することと、宿主生物を培養して所望の量のＤＶＰを生成することと、次いで、宿主生物中及び／又はその周辺からＤＶＰを精製することと、によって得られ得る。

【0427】

野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａ毒素は、当業者に既知の技術のいずれかを使用して、毒液から単離することができ、毒液は、次いで、クモ、例えばＤｉｇｕｅｔｉａ ｃａｎｉｔｉｅｓの毒腺から単離することができる。例えば、一部の実施形態では、毒液は、米国特許第５，６８８，７６４号に記載されている方法に従って、単離することができる（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0428】

野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａポリヌクレオチド配列は、ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａポリヌクレオチド配列に方向付けられるプライマープローブを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。代替的に、野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａポリヌクレオチド配列及び／又はＤＶＰポリヌクレオチド配列は化学的に合成され得る。例えば、野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａポリヌクレオチド配列及び／又はＤＶＰポリヌクレオチド配列は、ホスホラミダイト、トリエステル、ホスファイト、又はＨ－ホスホネート法などのオリゴヌクレオチド合成方法を使用して生成され得る（Ｅｎｇｅｌｓ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．（１９８９），Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ（７７）］．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２８：７１６－７３４を参照されたい（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される））。

【0429】

野生型ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａポリヌクレオチド配列における変異の産生は、当業者に周知の様々な手段によって達成され得る。変異誘発の方法としては、クンケル法、カセット変異誘発、ＰＣＲ部位特異的変異誘発、「完全殺人（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍｕｒｄｅｒ）」技術（ｄｅｌｉｔｔｏ ｐｅｒｆｅｔｔｏ）、ＰＣＲ及び１個のリサイクル可能なマーカーを用いた直接遺伝子欠失及び部位特異的変異誘発、長い相同領域を用いたＰＣＲ及び１個のリサイクル可能なマーカーを用いた直接遺伝子欠失及び部位特異的変異誘発、「ポップインポップアウト」法、並びにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ９が挙げられる。部位特異的変異誘発の例示的な方法は、Ｒｕｖｋｕｎ ＆ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８１ Ｊａｎ １；２８９（５７９３）：８５－８、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ：ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８１ Ａｕｇ １１；９（１５）：３６４７－５６、Ｄａｌｂａｄｉｅ－ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８２ Ｎｏｖ；７９（２１）：６４０９－１３、Ｂａｃｈｍａｎ．Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１３；５２９：２４１－８、Ｃａｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ａｕｇ １；２０１３（８）：７３８－４２、及びＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９－２３に見出すことができる（前述の参考文献の全ての開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。

【0430】

ＤＶＰポリヌクレオチドの化学合成
一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅｗｉｚ（登録商標）（例えば、ＴｕｒｂｏＧＥＮＥ（商標）、ＰｒｉｏｒｉｔｙＧＥＮＥ、及びＦｒａｇｍｅｎｔＧＥＮＥ）、又はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）（例えば、Ｃｕｓｔｏｍ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏｓ Ｄｅｓｉｇｎ及びＯｒｄｅｒ Ｃｕｓｔｏｍ ＤＮＡ Ｏｌｉｇｏｓ）によって提供されるものなど市販のポリヌクレオチド合成サービスを使用して、化学的に合成され得る。ＤＮＡ及び／又はカスタムの化学的に合成されたポリヌクレオチドを生成するための例示的な方法は、当該技術分野において周知であり、１９９５年２月１３日に出願された米国特許第５，７３６，１３５号（第０８／３８９，６１５号）に例示的に提供される（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。また、Ａｇａｒｗａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．１９７２ Ｊｕｎ；１１（６）：４５１－９、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８２ Ｎｏｖ １１；１０（２１）：６５５３－６５７０、Ｓｏｎｄｅｋ ＆ Ｓｈｏｒｔｌｅ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｒａｎｄｏｍ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ｓｕｂｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９２ Ａｐｒ １５；８９（８）：３５８１－３５８５、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ，ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．１２，１９９２，ｐｐ．２２２３－２３１１、Ａｇｒａｗａｌ（１９９３）Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０も参照されたい（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0431】

化学合成ポリヌクレオチドは、当該配列内のヌクレオチドの配置（すなわち、シトシン［Ｃ］、グアニン［Ｇ］、アデニン［Ａ］、又はチミン［Ｔ］分子の配置）に基づいて、所望のポリペプチドを生成するように調整されたＤＮＡ配列を生成することを可能にし、化学合成されたＤＮＡポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡ配列のコドンに対応する各アミノ酸のアミノ酸配列に翻訳され得る。したがって、ｍＲＮＡ配列から翻訳されるポリペプチド鎖のアミノ酸組成物は、２０個のアミノ酸のうちのどのアミノ酸が伸長するポリペプチドに付加されるかを決定する基礎となるコドンを変更することによって変化させることができる。したがって、挿入、置換、欠失、及びフレームシフトなどのＤＮＡにおける変異が、基礎となるコドンに応じて、アミノ酸の挿入、置換、又は欠失を引き起こし得る。

【0432】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは化学的に合成され得、当該ポリヌクレオチドは、１つ以上の変異を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、鋳型ＤＮＡ配列から作製され得る。更に他の実施形態では、ｍＲＮＡをクローニングし、コンピテント細胞に形質転換し得る。

【0433】

ベクター及び形質転換
本発明のベクターは、１つ以上の異種ポリヌクレオチドを宿主細胞（例えば、酵母細胞）に導入するための手段を指す。当業者に既知の様々な利用可能なベクター及びクローニング戦略が存在する。

【0434】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入（例えば、形質転換）するために挿入され得、それが複製され得る、キャリア核酸分子を指す。一部の実施形態では、ベクターは、「ベクターエレメント」、例えば、限定されないが、複製起点（ＯＲＩ）、選択を可能にする遺伝子又はヌクレオチド配列（例えば、抗生物質耐性を付与する遺伝子又は定義された培地での成長を可能にするヌクレオチド配列）、複数のクローニング部位、プロモーター領域、プライマー結合部位、及び／又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0435】

一部の実施形態では、ベクターに挿入されるポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列のいくつかは、「異種」又は「外因性」であり得、これは、ベクターが導入される細胞に対して外来性であること、又は配列が、細胞における配列に相同であるが、配列が通常見出されない宿主細胞の核酸内の位置にあることを意味する。例えば、一部の実施形態では、組換え酵母細胞は、内因性ヌクレオチド配列を含む異種ポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され得るが、内因性ヌクレオチド配列が通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にある。

【0436】

ベクターは、本発明の異種ポリヌクレオチドを調製する手段として、又は組換え酵母細胞を生成するために使用される細胞を最終的に形質転換する手段として、及び／又は異種ポリペプチドの発現を増加させる方法としてその両方で使用され得る。

【0437】

一部の実施形態では、ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が含まれる。例えば、一部の実施形態では、ベクターは、異種ポリヌクレオチド及び／又は発現カセットを転写及び翻訳されるように宿主細胞に導入することができるプラスミドであり得る。

【0438】

当業者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９９６（これらはともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている標準的な組換え技術を介してベクターを構築するための十分な装備があるであろう。

【0439】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドをコードすることに加えて、ベクターはまた、標的分子をコードし得る。標的分子は、所望のポリヌクレオチドを特定の組織、細胞、又は他の位置に方向付けるものである。

【0440】

一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドは、任意の好適なベクター、例えば、増幅のためのプラスミド、バクテリオファージ、又はウイルスベクターに挿入され得、それによって、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるものなどの当該技術分野で既知の方法を使用して、増殖され得る。

【0441】

化学的に合成されたＤＮＡポリヌクレオチド配列及び／又は変異誘発を介して改変された野生型ＤＮＡポリヌクレオチド配列からＤＶＰを得ることは、そのＤＮＡ配列を適切なベクターにクローニングすることによって達成され得る。利用可能な様々な発現ベクター、宿主生物、及び当業者に既知のクローニング戦略が存在する。例えば、ベクターは、プラスミドであってもよく、転写及び翻訳される異種遺伝子及び／又は発現カセットを、酵母細胞に導入することができる。「ベクター」という用語は、担体核酸分子を指すように使用され、それに核酸配列を挿入して、それが複製され得る細胞に導入することができる。ベクターは、複製起点（ＯＲＩ）、選択を可能にする抗生物質耐性を付与する遺伝子、複数のクローニング部位、プロモーター領域、非細菌トランスフェクションのための選択マーカー、及びプライマー結合部位などの「ベクターエレメント」を含み得る。核酸配列は、「外因性」であり得、これは、ベクターが導入される細胞に対して外来性であること、又は配列が、細胞における配列に相同であるが、配列が通常見出されない宿主細胞の核酸内の位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が含まれる。当業者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６（これらはともに、参照により本明細書に援用される）に記載されている標準的な組換え技術を通してベクターを構築するための十分な装備があるであろう。Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチドをコードすることに加えて、ベクターは、標的分子をコードし得る。標的化分子は、所望の核酸を特定の組織、細胞、又は他の位置に方向付けるものである。

【0442】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能なポリヌクレオチドは、宿主細胞に形質転換され得る。

【0443】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能なポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングされ、宿主細胞に形質転換され得る。

【0444】

一部の実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦは、宿主細胞に形質転換され得る。

【0445】

ＤＶＰ（例えば、ＤＶＰ ＯＲＦ）又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能なポリヌクレオチド配列に加えて、調節エレメントとして知られている既知の追加のＤＮＡセグメントを、外来のＤＮＡ又は導入遺伝子の発現の増強を可能にするベクターにクローニングすることができ、かかる追加のＤＮＡセグメントの例としては、（１）プロモーター、ターミネーター、及び／又はエンハンサーエレメント、（２）適切なｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、（３）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、（４）イントロン、並びに（５）転写後調節エレメントが挙げられる。目的のＤＮＡセグメント（例えば、ｄｖｐ）と、前述のシス作用性エレメントのうちのいずれか１つとの組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれる。

【0446】

一部の実施形態では、発現カセット又はＤＶＰ発現カセットは、１つ以上のＤＶＰ、及び／又は１つ以上のＤＶＰ－殺虫タンパク質を含有し得る。

【0447】

一部の実施形態では、発現カセット又はＤＶＰ発現カセットは、１つ以上のＤＶＰ、及び／又は１つ以上のＤＶＰ－殺虫タンパク質と、（１）プロモーター、ターミネーター、及び／若しくはエンハンサーエレメント、（２）適切なｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、（３）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、（４）イントロン、並びに（５）転写後調節エレメントなどの１つ以上の追加の調節エレメントと、を含有し得る。

【0448】

一部の実施形態では、単一発現カセットは、前述の調節エレメントのうちの１つ以上と、ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチドと、を含有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰ発現カセットは、ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチドと、α－ＭＦシグナル、Ｋｅｘ２部位、ＬＡＣ４ターミネーター、ＡＤＮ１プロモーター、並びに５’末端及び３’末端上のＬＡＣ４プロモーターに隣接するアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）選択マーカーと、を含み得る。

【0449】

一部の実施形態では、ベクターにクローニングされた多数の発現カセットが存在し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチドを含む第１の発現カセットが存在し得る。代替的な実施形態では、ＤＶＰをコードするように動作可能な２つの発現カセット（すなわち、二重発現カセット）が存在する。他の実施形態では、ＤＶＰをコードするように動作可能な３つの発現カセット（すなわち、三重発現カセット）が存在する。

【0450】

一部の実施形態では、二重発現カセットは、第１のＤＶＰ発現カセットを含有するベクターに第２のＤＶＰ発現カセットをサブクローニングすることによって生成され得る。

【0451】

一部の実施形態では、三重発現カセットは、第１及び第２のＤＶＰ発現カセットを含むベクターに第３のＤＶＰ発現カセットをサブクローニングすることによって生成され得る。

【0452】

一部の実施形態では、ＤＶＰポリヌクレオチドは、様々なクローニング戦略、並びに当業者に容易に入手可能な市販のクローニングキット及び材料を使用して、ベクターにクローニングされ得る。例えば、ＤＶＰポリヌクレオチドは、戦略（例えば、ＳｎａｐＦａｓｔ、Ｇａｔｅｗａｙ、ＴＯＰＯ、Ｇｉｂｓｏｎ、ＬＩＣ、ＩｎＦｕｓｉｏｎＨＤ、又はＥｌｅｃｔｒａ戦略）を使用して、ベクターにクローニングされ得る。ＤＶＰを産生するために使用され得る多数の市販のベクターが存在する。例えば、ＤＶＰポリヌクレオチドを、５分間、室温で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、ｐＣＲ（商標）ＩＩ－ＴＯＰＯベクター又はＰＣＲ（商標）２．１－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットとして市販されている）を組み合わせて使用して生成することができ、次いで、ＴＯＰＯ（登録商標）反応物を、コンピテント細胞に形質転換することができ、その後、色の変化に基づいて選択することができる（Ｊａｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｓ：ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｏｒｅ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｙｅａｓｔ．２００４ Ａｕｇ；２１（１１）：９４７－６２を参照のこと。また、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９７も参照されたい。この開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0453】

一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び／又は人工染色体（例えば、ＹＡＣ）などのベクターにクローニングされ得る。

【0454】

一部の実施形態では、以下を行うことによって、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを、宿主としてＥ．ｃｏｌｉを使用して、ベクター（例えば、プラスミドベクター）に挿入することができる：目的のＤＮＡセグメントを挿入できるようにするために、必要な制限酵素を使用して、約２～５μｇのベクターＤＮＡを消化し、続いて、一晩インキュベーションして完全な消化を達成し（自己ライゲーション／再環化を回避するために、アルカリホスファターゼを使用して、５’末端を脱リン酸化する場合がある）、消化されたベクターを、ゲル精製する。次に、ＰＣＲを介して、目的のＤＮＡセグメント、例えば、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを増幅し、当業者に既知の技術を使用して（例えば、ＰＣＲクリーンアップキットを使用することによって）、ＰＣＲ反応物から、任意の過剰の酵素、プライマー、取り込まれていないｄＮＴＰ、短い失敗したＰＣＲ産物、及び／又は塩を除去する。約２０ｎｇのベクター、約１００～１，０００ｎｇ又は目的のＤＮＡセグメント、２μＬの１０×緩衝液（すなわち、３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ_２、２６μＭのＮＡＤ、１ｍＭのＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ８；２５℃で保存）、１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む混合物を作製し、Ｈ_２Ｏを添加して全て総体積を２０μＬにすることによって、目的のＤＮＡセグメントを、ベクターにライゲーションする。次いで、ライゲーション反応混合物を、室温で２時間、又は１６℃で一晩インキュベートすることができる。次いで、ライゲーション反応物（すなわち、約１μＬ）を、例えば、エレクトロポレーション又は化学的方法を使用することによって、コンピテント細胞に形質転換することができる。次いで、コロニーＰＣＲを実施して、目的のＤＮＡセグメントを含むベクターを特定することができる。

【0455】

一部の実施形態では、他のＤＮＡセグメントとともに、ＤＶＰ発現カセットを構成する、ＤＶＰ（例えば、ＤＶＰ ＯＲＦ）をコードするポリヌクレオチドは、宿主酵母細胞からの分泌用に設計され得る。ＤＶＰ発現カセットを設計する例示的な方法は、以下のとおりである：カセットは、シグナルペプチド配列から始まり、続いて、Ｋｅｘ２切断部位（リジン－アルギニン）をコードするＤＮＡ配列、続いて、ＤＶＰポリヌクレオチド導入遺伝子（ＤＶＰ ＯＲＦ）であり得、５’末端にグリシン－セリンコドン、最後に、３’末端に終止コドンが付加される。次いで、これらの全てのエレメントを、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として、酵母細胞において融合ペプチドに発現させる。α接合因子（αＭＦ）シグナル配列は、組換え酵母の内因性分泌経路を介した組換え殺虫ペプチドの代謝プロセスを促進するために最も頻繁に使用され、すなわち、発現された融合ペプチドは、典型的には、小胞体内に入り、α接合因子シグナル配列が、シグナルペプチダーゼ活性によって除去され、次いで、得られた殺虫プロペプチドが、ゴルジ装置に輸送され、上述のリジン－アルギニンジペプチドが、Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼによって完全に除去され、その後、成熟ポリペプチド（すなわち、ＤＶＰ）が、細胞から分泌される。

【0456】

一部の実施形態では、組換え酵母細胞におけるポリペプチド発現レベルは、特定の宿主酵母種に基づいてコドンを最適化することによって増強され得る。所与の宿主生物の内因性オープンリーディングフレームで観察される自然に発生するコドンの頻度は、必ずしも高効率発現のために最適化する必要はない。更に、異なる酵母種（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）は、高効率発現のために異なる最適コドンを有する。したがって、シグナル配列、Ｋｅｘ２切断部位、及びＤＶＰをコードする配列エレメントを含むＤＶＰ発現カセットについては、それらが組換え酵母細胞において１つの融合ペプチドとして最初に翻訳されるため、コドン最適化が考慮される必要がある。

【0457】

一部の実施形態では、コドン最適化されたＤＶＰ発現カセットは、酵母発現用の酵母特異的発現ベクターにライゲーションされ得る。エピソームベクター及び組み込みベクターを含む、酵母発現用に利用可能な多くの発現ベクターがあり、これらは通常、特定の酵母株のために設計されている。ペプチド産生に使用される特定の酵母発現システムを考慮して、適切な発現ベクターを慎重に選択する必要がある。一部の実施形態では、組み込みベクターを使用することができ、これは、形質転換された酵母細胞の染色体に組み込まれ、細胞の分裂及び増殖のサイクルを通して安定に維持される。組み込みＤＮＡ配列は、形質転換された酵母種における標的化されたゲノムＤＮＡ遺伝子座と相同であり、かかる組み込み配列としては、ｐＬＡＣ４、２５Ｓ ｒＤＮＡ、ｐＡＯＸ１、及びＴＲＰ２などが挙げられる。殺虫ペプチド導入遺伝子の位置は、組み込みＤＮＡ配列（挿入ベクター）に隣接していてもよく、又は組み込みＤＮＡ配列（置換ベクター）内であってもよい。

【0458】

一部の実施形態では、発現ベクター又はクローニングベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＤＮＡ調製のためのＥ．ｃｏｌｉエレメント、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、抗生物質選択マーカーなどを含み得る。一部の実施形態では、ベクターは、目的の導入遺伝子の発現に必要な一連の配列エレメント、例えば、転写プロモーター、ターミネーター、酵母選択マーカー、宿主酵母ＤＮＡに相同な組み込みＤＮＡ配列などを含み得る。天然及び操作されたプロモーター、例えば、ｐＬＡＣ４、ｐＡＯＸ１、ｐＵＰＰ、ｐＡＤＨ１、ｐＴＥＦ、ｐＧａｌ１などの酵母プロモーター及びその他を含む、多くの好適な酵母プロモーターがあり、一部の実施形態で使用され得る。

【0459】

一部の実施形態では、アセトアミドプロトトロフィー選択、ゼオシン耐性選択、ジェネティシン耐性選択、ノウルセオトリシン耐性選択、ウラシル欠失選択、及び／又は他の選択方法などの選択方法を使用してもよい。例えば、一部の実施形態では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのａｍｄＳ遺伝子を、選択マーカーとして使用することができる。選択マーカーを使用するための例示的な方法は、米国特許第６，５４８，２８５号（１９９７年４月３日出願）、同第６，１６５，７１５号（１９９８年６月２２日出願）、及び同第６，１１０，７０７号（１９９７年１月１７日出願）に見出すことができる（それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0460】

一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドは、ｐＫＬＡＣ１ベクターに挿入され得る。ｐＫＬＡＣ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．（アイテム番号（ＮＥＢ＃Ｅ１０００）から市販されている。ｐＫＬＡＣ１は、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓにおける組換えタンパク質（例えば、ＤＶＰ）の高レベル発現を達成するように設計される。ｐＫＬＡＣ１プラスミドは、単独で、又はＫ．ｌａｃｔｉｓタンパク質発現キットの一部として注文することができる。ｐＫＬＡＣ１プラスミドは、ＳａｃＩＩ又はＢｓｔＸＩ制限酵素を使用して、線状化することができ、αＭＦ分泌シグナルの下流にＭＣＳを有する。αＭＦ分泌シグナルは、組換えタンパク質を分泌経路へ方向付け、次いで、Ｋｅｘ２により切断され、目的のペプチド、例えば、ＤＶＰがもたらされる。Ｋｅｘ２は、カルシウム依存性セリンプロテアーゼであり、分泌経路のプロタンパク質の活性化に関与し、市販されている（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（登録商標）；アイテム番号４５０－４５）。

【0461】

一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドでライゲーションされたｐＫＬＡＣ１プラスミドで形質転換された酵母コロニーの選択の後に、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを、ｐＬＢ１０２プラスミドに挿入するか、又はｐＬＢ１０２プラスミドにサブクローニングすることができる。ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドでライゲーションされたｐＫＬＡＣ１プラスミドで形質転換された酵母、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓは、形質転換された酵母細胞が、その唯一の窒素源としてアセトアミドを含有するＹＣＢ培地で増殖することを可能にするアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）に基づいて選択され得る。一度、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドでライゲーションされたｐＫＬＡＣ１プラスミドで形質転換された陽性の酵母コロニーを特定する。

【0462】

一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを、当業者が容易に入手することができる他の市販のプラスミド及び／又はベクターに挿入することができ、例えば、プラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（非営利プラスミドレポジトリ）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｔａｋａｒａ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、及びＰｒｏｍｅｇａ（商標）から入手可能である。

【0463】

一部の実施形態では、１つ以上のＤＶＰ発現カセットで形質転換された酵母細胞は、酵母培養物においてＤＶＰを、培地１リットル当たり、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ ２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１００，０００ｍｇ／ＬのＤＶＰの収量で産生し得る。

【0464】

一部の実施形態では、１つ以上のＤＶＰ発現カセットで形質転換されたＫ．ｌａｃｔｉｓの培養物は、酵母培養物においてＤＶＰを、以下を含有する増殖培地１リットル当たり、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ ２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１００，０００ｍｇ／ＬのＤＶＰの収量で産生し得る：（１）ＭＳＭ培地レシピ：２ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム二水和物、１ｇ／Ｌの硫酸カルシウム二水和物（０．７９ｇ／Ｌの無水硫酸カルシウム）、４２．９ｇ／Ｌのリン酸一カリウム、５．１７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１４．３３ｇ／Ｌの硫酸カリウム、１１．７ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、２ｍＬ／ＬのＰＴＭ１微量塩溶液、０．４ｐｐｍのビオチン（５００×、２００ｐｐｍストックから）、１～２％の純粋なグリセロール又は他の炭素源。（２）ＰＴＭ１微量塩溶液：硫酸銅－５Ｈ２Ｏ ６．０ｇ、ヨウ化ナトリウム ０．０８ｇ、硫酸マンガン－Ｈ２Ｏ ３．０ｇ、モリブデン酸ナトリウム－２Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ、ホウ酸 ０．０２ｇ、塩化コバルト ０．５ｇ、塩化亜鉛 ２０．０ｇ、硫酸鉄－７Ｈ_２Ｏ ６５．０ｇ、ビオチン ０．２ｇ、硫酸 ５．０ｍｌ、水を添加し最終体積を１リットルにする。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ規定培地（ＤＭＳｏｒ）の例示的な組成物は、以下のとおりである。１１．８３ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、２．２９９ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、２０ｇ／Ｌの発酵性糖、例えば、ガラクトース、マルトース、ラトトリオース、スクロース、フルクトース、若しくはグルコース、及び／又は糖アルコール、例えば、エリスリトール、水素化デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、及びキシリトール、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）ＳＯ_４、０．３３ｇ／ＬのＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／ＬのＫＣｌ、５ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、３０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＺｎＣｌ_２、１ｍｇ／ＬのＫＩ、２ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、８ｍｇ／ＬのＮａ_２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、０．４ｍｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、１５ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ_３．６Ｈ_２Ｏ、０．８ｍｇ／Ｌのビオチン、２０ｍｇ／Ｌのパントテン酸カルシウム、１５ｍｇ／Ｌのチアミン、１６ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、１０ｍｇ／Ｌのニコチン酸、及び４ｍｇ／Ｌのピリドキシン、選択マーカー、並びに適切な発現を可能にする条件下の培養。

【0465】

一部の実施形態では、ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチドを含む１つ以上の発現カセットを、ベクターに挿入して、約１００ｍｇ／ＬのＤＶＰ（酵母発酵液の上清）の収量をもたらし得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチドを含む２つの発現カセットを、ベクター、例えば、ｐＫＳ０２２プラスミドに挿入して、約２ｇ／ＬのＤＶＰ（酵母発酵液の上清）の収量をもたらし得る。代替的に、一部の実施形態では、ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチドを含む３つの発現カセットを、ベクター、例えば、ｐＬＢ１０３ｂＴプラスミドに挿入し得る。

【0466】

一部の実施形態では、Ｋ．ｌａｃｔｉｓゲノムへの最適化されたＤＶＰ導入遺伝子の１つ以上のコピーの組み込みを可能にするために、複数のＤＶＰ発現カセットを、酵母にトランスフェクトし得る。複数のＤＶＰ発現カセットをＫ．ｌａｃｔｉｓゲノムに導入する例示的な方法は、以下のとおりである：インタクトのＬＡＣ４プロモーターエレメント、コドン最適化ＤＶＰ ＯＲＦエレメント、及びｐＬＡＣ４ターミネーターエレメントを含む、ＤＶＰ発現カセットＤＮＡ配列を合成する；インタクトの発現カセットを、ｐＬＢ１０Ｖ５のｐＬＡＣ４ターミネーターの下流にある、ｐＬＢ１０３ｂベクターのＳａｌ ＩとＫｐｎ Ｉ制限部位との間にライゲーションして、二重導入遺伝子ＤＶＰ発現ベクター、ｐＫＳ０２２を得る；次いで、二重導入遺伝子ベクター、ｐＫＳ０２２を、Ｓａｃ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化し、エレクトロポレーションによって、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＹＣＴ３０６株に形質転換する。次いで、得られた酵母コロニーを、５ｍＭのアセトアミドを補充したＹＣＢ寒天プレート上で増殖させる（アセトアミダーゼ発現細胞のみが、アセトアミドを窒素の代謝源として効率的に使用することができる）。酵母コロニーを評価するために、ｐＫＳ０２２酵母プレートから、約１００～４００個のコロニーを採取してもよい。コロニーからの接種物を、炭素源として２％の糖アルコールを添加した２．２ｍＬのＫ．ｌａｃｔｉｓ規定培地で各々培養する。培養物を、２３．５℃で、２８０ｒｐｍで振盪しながら、６日間インキュベートし、この時点で、培養物中の細胞密度は、６００ｎｍでの光吸光度（ＯＤ６００）によって示されるように、最大レベルに達する。次いで、細胞を、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって培養物から除去し、得られた上清（条件培地）を、ＨＰＬＣ収量分析用に、０．２μＭ膜を通して濾過する。

【0467】

発現カセット
ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドに加えて、調節エレメントとして知られる追加のＤＮＡセグメントを、異種ポリヌクレオチドの発現の増強を可能にするベクターにクローニングし得る。かかる調節エレメントの例としては、（１）プロモーター、ターミネーター、及び／若しくはエンハンサーエレメント、（２）適切なｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、（３）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、（４）イントロン、並びに／又は（５）転写後調節エレメントが挙げられる。

【0468】

上述したように、目的のＤＮＡセグメント（例えば、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチド）と、前述のシス作用エレメントのうちのいずれか１つとの組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれる。

【0469】

したがって、一部の実施形態では、調節エレメントとして知られるこれらの追加のＤＮＡセグメントは、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドに関して、動作可能に、任意の方向で連結され得る。

【0470】

例えば、一部の実施形態では、ベクターは、発現カセットを含み得、発現カセットは、１つ以上の（１）プロモーター、ターミネーター、及び／又はエンハンサーエレメント、（２）適切なｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、（３）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、（４）イントロン、並びに（５）転写後調節エレメントを含み、これは、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌク質の発現の増強を可能にする。

【0471】

一部の実施形態では、ベクターは、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な複数の異種ポリヌクレオチドを含み得、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な個々の異種ポリヌクレオチドの各々は、１つ以上の（１）プロモーター、ターミネーター、及び／又はエンハンサーエレメント、（２）適切なｍＲＮＡ安定化ポリアデニル化シグナル、（３）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、（４）イントロン、並びに（５）転写後調節エレメントを含む独自の発現カセットを有し、それぞれ、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドの各々の発現の増強を可能にする。

【0472】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、１つ以上の発現カセットを含み得る。

【0473】

一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の発現カセットを含み得る。

【0474】

クローニング戦略
適切なポリヌクレオチドのベクターへの挿入は、様々な手順によって行われ得る。

【0475】

概して、ＤＮＡ配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼでの挿入物及びベクターの消化後に、ベクターの所望の位置にライゲーションされる。代替的に、挿入物及びベクターの両方の平滑端部をライゲーションし得る。様々なクローニング技術が、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９７及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（それらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）において開示されている。かかる手順及び他は、当業者の範囲内であるとみなされる。

【0476】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを、当業者が容易に入手することができる他の市販のプラスミド及び／又はベクターに挿入することができ、例えば、プラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（非営利プラスミドレポジトリ）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｔａｋａｒａ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、及びＰｒｏｍｅｇａ（商標）から入手可能である。

【0477】

一部の実施形態では、ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であり得る。他の実施形態では、ベクターは、染色体、非染色体、及び合成ＤＮＡ配列、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、及び仮性狂犬病などのウイルスＤＮＡを含み得る。

【0478】

一部の実施形態では、脊椎動物細胞などの真核細胞と適合するベクターが使用され得る。真核細胞ベクターは、当該技術分野で周知であり、商業的供給源から入手可能である。企図されるベクターは、（細菌内でのベクターの増殖を促進するために）原核配列と、非細菌細胞内で機能的である１つ以上の真核転写単位の両方を含有し得る。典型的には、かかるベクターは、所望の組換えＤＮＡ分子の挿入のための便利な制限部位を提供する。ｐｃＤＮＡＩ、ｐＳＶ２、ｐＳＶＫ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＰＶＶ－１／ＰＭＬ２ｄ、及びｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ番号３１２５５）由来のベクターは、非ヒト細胞のトランスフェクションに好適な哺乳類ベクターの例である。一部の実施形態では、前述のベクターのいくつかは、原核細胞及び真核細胞の両方における複製及び薬剤耐性選択を容易にするために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列で修飾され得る。代替的に、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）、又はエプスタインバーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、ブタ細胞におけるタンパク質の発現に使用し得る。プラスミドの調製及び宿主細胞の形質転換に用いられる様々な方法は、当該技術分野で周知である。

【0479】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドに加えて、ベクターは、膜又は分泌を標的にするためのシグナル配列又はリーダー配列、並びにプロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及び／又はエンハンサーなどの発現調節エレメントを含み得、その目的に応じて様々な形態で構築され得る。開始コドン及び終止コドンは、概して、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられ、遺伝子構築物が投与された対象において機能的である必要があり、コード配列とインフレームである必要がある。

【0480】

一部の実施形態では、ベクターのプロモーターは、構成的又は誘導性であり得る。加えて、発現ベクターには、ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする選択可能マーカーを含み得、複製可能な発現ベクターには、複製起点を含み得る。ベクターは、自己複製可能であってもよく、又は宿主ＤＮＡに組み込まれてもよい。

【0481】

転写活性遺伝子が標的とされる場合には、構築物の設計が、内因性プロモーターによって指示されるように転写されるマーカーをもたらす場合、プロモーターの使用は必要とされない場合がある。かかる標的化された修飾を実施するための例示的な構築物及びベクターが本明細書に記載される。しかしながら、かかるアプローチで使用され得る他のベクターは、当該技術分野で既知であり、本発明での使用に容易に適合され得る。

【0482】

一部の実施形態では、標的化ベクターを使用し得る。塩基性標的化ベクターは、部位特異的組み込み（ＳＳＩ）配列、例えば、標的化されている内因性ＤＮＡセグメントに相同である配列の５’及び３’ホモロジーアームを含む。

【0483】

一部の実施形態では、標的化ベクターは、１つ以上の陽性及び／又は陰性選択マーカーを任意選択で含み得る。一部の実施形態では、選択マーカーを使用して、遺伝子機能を破壊し、及び／又は形質転換後に統合された標的化ベクターヌクレオチド配列を有する細胞を同定することができる。

【0484】

一部の実施形態では、標的化ベクターの使用は、内因性遺伝子と区別可能な制限パターンを作製するために、１つ以上の変異を含む異種ポリヌクレオチドを利用し得る（導入遺伝子及び内因性遺伝子が類似している場合）。

【0485】

ホモロジーアーム
当業者であれば、標的化された遺伝子修飾には、ベクターのゲノムへの組み込みが促進され得るように、標的化された遺伝子との相同性領域（又はその隣接領域）を含む核酸分子ベクターの使用が必要であることを認識するであろう。したがって、標的化ベクターは、概して、以下の３つの主要領域を含有するように設計される：（１）標的化される遺伝子座に相同である第１の領域、（２）標的遺伝子座に挿入され、及び／又は標的化された遺伝子座の一部分を特異的に置き換える異種ポリヌクレオチド配列（例えば、目的のタンパク質をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含み、及び／又は抗生物質耐性タンパク質などの選択マーカーをコードする）である第２の領域、並びに（３）第１の領域と同様に、標的化された遺伝子座に相同であるが、典型的にはゲノムの第１の領域と隣接していない第３の領域。

【0486】

標的化ベクターと標的化された内因性又は野生型遺伝子座との間の相同組換えは、標的化ベクターに表される相同性の２つの領域間の任意の遺伝子座配列の欠失、並びにその配列の、例えば、目的のポリヌクレオチド及び任意選択で１つ以上の追加の調節エレメントをコードする異種配列での置換、又はその配列への挿入をもたらす。

【0487】

相同組換えを容易にするために、標的化ベクターの第１及び第３の領域（上記を参照）は、標的化される遺伝子（又は隣接領域）に対して実質的な同一性を示す配列を含む。「実質的に同一」とは、別の配列のものと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、更により好ましくは１００％同一である配列を有することを意味する。配列同一性は、典型的には、ＢＬＡＳＴ（登録商標）（基本局所アライメント検索ツール）又はＢＬＡＳＴ（登録商標）２を使用して、そこで指定された既定パラメータで測定される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０、Ｔａｔｉａｎａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７－２５０，１９９９を参照されたい）。これらのソフトウェアプログラムは、様々な置換、欠失、及び他の修正に相同性の程度を割り当てることによって、類似の配列を一致させる。したがって、標的化された遺伝子座と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、更により好ましくは１００％配列同一性を有する配列を本発明で使用して、相同組換えを容易にし得る。

【0488】

相同性の２つの領域（すなわち、上記の第１及び第３の領域）の合計サイズは、例えば、約１～２５キロベース（ｋｂ）（例えば、約２～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、又は約６～１０ｋｂ）であり得、標的化された遺伝子座の一部分を置き換える第２の領域のサイズは、例えば、約０．５～５ｋｂ（例えば、約１～４ｋｂ、約１～３ｋｂ、約１～２ｋｂ、又は約３～４ｋｂ）であり得る。

【0489】

一部の実施形態では、標的化ベクターは、概して、選択マーカー及び部位特異的組み込み（ＳＳＩ）配列を含み得る。ＳＳＩ配列は、目的の導入遺伝子、例えば、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを含み得、これは、「５’及び３’ホモロジーアーム」又は「５’及び３’アーム」又は「左及び右アーム」又は「ホモロジーアーム」と呼ばれる２つのゲノムＤＮＡ断片に隣接する。これらのホモロジーアームは、宿主生物の染色体遺伝子座の成功裏の遺伝子修飾を達成するために、宿主生物における標的ゲノム配列及び／又は目的の内因性遺伝子と組換える。

【0490】

標的化ベクターのホモロジーアームを設計する場合、５’及び３’アームの両方は、効率的な配列のインビボ対合、及びクロスオーバー形成を生じさせるために、標的化される内因性配列との十分な配列相同性を有する必要がある。ホモロジーアームの長さは可変であるが、両アームの合計で少なくとも５～８ｋｂをカバーする相同性（短いアームの長さは１ｋｂ以上）は、組換えを成功させるために従うことができる一般的なガイドラインである。

【0491】

一部の実施形態では、５’及び／又は３’ホモロジーアームは、変化し得る。例えば、一部の実施形態では、異なる遺伝子座は、５’及び／又は３’ホモロジーアーム、例えば、本明細書に記載のホモロジーアームの上流及び／又は下流のいずれかによって標的化され、異なる位置で目的の配列を交換し得る。

【0492】

ベクター設計及びインビボ相同組換えの更なる例示的な方法は、「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒｓ」と題された米国特許第５，４６４，７６４号（１９９３年２月４日出願、譲受人Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」と題された米国特許第５，７３３，７６１号（１９９５年５月２６日出願、譲受人Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、「Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ＤＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」と題された米国特許第５，７８９，２１５号（１９９７年８月７日出願、譲受人ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ」と題された米国特許第６，０９０，５５４号（１９９７年１０月３１日出願、譲受人Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｏｐｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｗｈｅｒｅ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｓ ｍａｄｅ」と題された米国特許第６，５２８，３１４号（１９９５年６月６日出願、譲受人Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，Ｐａｓｔｅｕｒ）、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」と題された米国特許第６，５３７，５４２号（２０００年４月１４日出願、譲受人Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ」と題された米国特許第８，０４８，６４５号（２００１年８月１日出願、譲受人Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ ＳＡ）、及び「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」と題された米国特許第８，１７３，３９４号（２００９年４月６日出願、譲受人Ｗｙｅｔｈ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）に見出すことができる（それらの開示内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0493】

選択マーカーに関する例示的な説明及び方法は、Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７）、Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２）、Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０）、Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１）、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３－５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２（１９９３）、Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７（１９９３）、Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ Ｙ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ Ｙ（１９９０）；ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ Ｙ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）、米国特許第６，５４８，２８５号（１９９７年４月３日出願）、同第６，１６５，７１５号（１９９８年６月２２日出願）、及び同第６，１１０，７０７号（１９９７年１月１７日出願）（これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）において提供されている。

【0494】

例示的なベクター
一部の実施形態では、本発明は、（ａ）異種ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列であって、（ｉ）ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能なヌクレオチド配列を含む、異種ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列、（ｂ）５’ホモロジーアーム、及び３’ホモロジーアームを含む、ベクターを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなり、当該５’ホモロジーアーム及び当該３’ホモロジーアームが、異種ポリヌクレオチドの上流及び下流にそれぞれ位置し、当該ベクターが、異種ポリヌクレオチドの内因性宿主細胞遺伝子座への相同組換え媒介性組み込みを可能にするように動作可能であり、当該相同組換え媒介性組み込みが、内因性宿主細胞ＤＮＡセグメントの異種ポリヌクレオチドとの置換をもたらす。

【0495】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列は、（ｉ）ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能なヌクレオチド配列を、ベクター（例えば、プラスミド）にクローニング又は挿入し得ることを含む。他の実施形態では、異種ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列の成分、すなわち（ｉ）ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能なヌクレオチド配列のうちのいずれかを、クローニング又はベクターに挿入し得る。

【0496】

一部の実施形態では、組換え宿主細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるベクターで形質転換され、当該異種ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列を含み、動作可能に任意の方向で連結される：（ｉ）ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な少なくとも１つのヌクレオチド配列。

【0497】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドは、様々なクローニング戦略、並びに当業者に容易に入手可能な市販のクローニングキット及び材料を使用して、ベクターにクローニングされ得る。

【0498】

例えば、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチド及び／又はヌクレオチド配列は、ＳｎａｐＦａｓｔ、Ｇａｔｅｗａｙ、ＴＯＰＯ、Ｇｉｂｓｏｎ、ＬＩＣ、ＩｎＦｕｓｉｏｎＨＤ、又はＥｌｅｃｔｒａ戦略などの戦略を使用してベクターにクローニングされ得る。

【0499】

本発明のベクターを産生するために使用され得る多数の市販のベクターが存在する。例えば、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを、５分間、室温で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、ｐＣＲ（商標）ＩＩ－ＴＯＰＯベクター又はＰＣＲ（商標）２．１－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットとして市販されている）を組み合わせて使用して生成することができ、次いで、ＴＯＰＯ（登録商標）反応物を、コンピテント細胞に形質転換することができ、その後、色の変化に基づいて選択することができる（Ｊａｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｓ：ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｏｒｅ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｙｅａｓｔ．２００４ Ａｕｇ；２１（１１）：９４７－６２を参照のこと。また、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９７も参照されたい。この開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0500】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び／又は人工染色体（例えば、ＹＡＣ）などのベクターにクローニングされ得る。

【0501】

一部の実施形態では、以下を行うことによって、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを、宿主としてＥ．ｃｏｌｉを使用して、ベクター（例えば、プラスミドベクター）に挿入することができる：目的のＤＮＡセグメントを挿入できるようにするために、必要な制限酵素を使用して、約２～５μｇのベクターＤＮＡを消化し、続いて、一晩インキュベーションして完全な消化を達成し（自己ライゲーション／再環化を回避するために、アルカリホスファターゼを使用して、５’末端を脱リン酸化する場合がある）、消化されたベクターを、ゲル精製する。次に、ＰＣＲを介して、目的のＤＮＡセグメント、例えば、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを増幅し、当業者に既知の技術を使用して（例えば、ＰＣＲクリーンアップキットを使用することによって）、ＰＣＲ反応物から、任意の過剰の酵素、プライマー、取り込まれていないｄＮＴＰ、短い失敗したＰＣＲ産物、及び／又は塩を除去する。約２０ｎｇのベクター、約１００～１，０００ｎｇ又は目的のＤＮＡセグメント、２μＬの１０×緩衝液（すなわち、３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ_２、２６μＭのＮＡＤ、１ｍＭのＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ８；２５℃で保存）、１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む混合物を作製し、Ｈ_２Ｏを添加して全て総体積を２０μＬにすることによって、目的のＤＮＡセグメントを、ベクターにライゲーションする。次いで、ライゲーション反応混合物を、室温で２時間、又は１６℃で一晩インキュベートすることができる。次いで、ライゲーション反応物（すなわち、約１μＬ）を、例えば、エレクトロポレーション又は化学的方法を使用することによって、コンピテント細胞に形質転換することができる。次いで、コロニーＰＣＲを実施して、目的のＤＮＡセグメントを含むベクターを特定することができる。

【0502】

一部の実施形態では、他のＤＮＡセグメントとともに、発現ＯＲＦを構成する、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドは、宿主酵母細胞からの分泌用に設計され得る。発現ＯＲＦを設計する例示的な方法は、以下のとおりである：ＯＲＦは、シグナルペプチド配列から始まり、続いて、Ｋｅｘ２切断部位（リジン－アルギニン）をコードするＤＮＡ配列、続いて、異種ポリヌクレオチド導入遺伝子であり得、５’末端にグリシン－セリンコドン、最後に、３’末端に終止コドンが付加される。次いで、これらの全てのエレメントを、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として、酵母細胞において融合ペプチドに発現させる。α接合因子（αＭＦ）シグナル配列は、組換え酵母の内因性分泌経路を介した組換え殺虫ペプチドの代謝プロセスを促進するために最も頻繁に使用され、すなわち、発現された融合ペプチドは、典型的には、小胞体内に入り、α接合因子シグナル配列が、シグナルペプチダーゼ活性によって除去され、次いで、得られた殺虫プロペプチドが、ゴルジ装置に輸送され、上述のリジン－アルギニンジペプチドが、Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼによって完全に除去され、その後、成熟ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質が、細胞から分泌される。

【0503】

一部の実施形態では、組換え細胞におけるポリペプチド発現レベルは、特定の宿主酵母種に基づいてコドンを最適化することによって増強され得る。所与の宿主生物の内因性オープンリーディングフレームで観察される自然に発生するコドンの頻度は、必ずしも高効率発現のために最適化する必要はない。更に、異なる酵母種（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）は、高効率発現のために異なる最適コドンを有する。したがって、シグナル配列、Ｋｅｘ２切断部位、及び異種ポリペプチドをコードする配列エレメントを含む発現ＯＲＦについては、それらが組換え酵母細胞において１つの融合ペプチドとして最初に翻訳されるため、コドン最適化が考慮される必要がある。

【0504】

一部の実施形態では、コドン最適化された発現ＯＲＦは、酵母発現用の酵母特異的発現ベクターにライゲーションされ得る。エピソームベクター及び組み込みベクターを含む、酵母発現用に利用可能な多くの発現ベクターがあり、これらは通常、特定の酵母細胞のために設計されている。ペプチド産生に使用される特定の酵母発現システムを考慮して、適切な発現ベクターを慎重に選択する必要がある。一部の実施形態では、組み込みベクターを使用することができ、これは、形質転換された酵母細胞の染色体に組み込まれ、細胞の分裂及び増殖のサイクルを通して安定に維持される。組み込みＤＮＡ配列は、形質転換された酵母種における標的化されたゲノムＤＮＡ遺伝子座と相同であり、かかる組み込み配列としては、ｐＬＡＣ４、２５Ｓ ｒＤＮＡ、ｐＡＯＸ１、及びＴＲＰ２などが挙げられる。殺虫ペプチド導入遺伝子の位置は、組み込みＤＮＡ配列（挿入ベクター）に隣接していてもよく、又は組み込みＤＮＡ配列（置換ベクター）内であってもよい。

【0505】

一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＤＮＡ調製のためのＥ．ｃｏｌｉエレメント（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、抗生物質選択マーカーなど）を含み得る。一部の実施形態では、ベクターは、目的の導入遺伝子の発現に必要な一連の配列エレメント（例えば、転写プロモーター、ターミネーター、酵母選択マーカー、宿主酵母ＤＮＡに相同な組み込みＤＮＡ配列など）を含み得る。天然及び操作されたプロモーター（例えば、ｐＬＡＣ４、ｐＡＯＸ１、ｐＵＰＰ、ｐＡＤＨ１、ｐＴＥＦ、ｐＧａｌ１などの酵母プロモーター及びその他）を含む、多くの好適な酵母プロモーターがあり、一部の実施形態で使用することができる。

【0506】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを、当業者が容易に入手することができる他の市販のプラスミド及び／又はベクターに挿入することができ、例えば、プラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（非営利プラスミドレポジトリ）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｔａｋａｒａ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、及びＰｒｏｍｅｇａ（商標）から入手可能である。

【0507】

ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを含むベクターの調製に続いて、ベクターを酵母細胞に形質転換して、本発明の組換え酵母細胞を産生する。

【0508】

一部の実施形態では、本発明のベクターは、（ａ）異種ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列であって、（ｉ）ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドを含む、異種ポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列、（ｂ）５’ホモロジーアーム、及び３’ホモロジーアームを含み、当該５’ホモロジーアーム及び当該３’ホモロジーアームが、異種ポリヌクレオチドの上流及び下流にそれぞれ位置し、当該ベクターが、異種ポリヌクレオチドの内因酵母性宿主細胞遺伝子座への相同組換え媒介性組み込みを可能にするように動作可能であり、当該相同組換え媒介性組み込みが、内因性宿主細胞ＤＮＡセグメントの異種ポリヌクレオチドとの置換をもたらす。

【0509】

一部の実施形態では、ベクターは、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含み得る。

【0510】

一部の実施形態では、ベクターは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含み得る。

【0511】

一部の実施形態では、ベクターは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ配列を有するＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含み得る。

【0512】

一部の実施形態では、ベクターは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるＤＶＰアミノ配列をコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含み得る。

【0513】

一部の実施形態では、ベクターは、配列番号２１３、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるＤＶＰアミノ配列をコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的配列を含み得る。

【0514】

形質転換及び細胞培養方法
「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、ともに、宿主生物に外因性及び／又は異種のＤＮＡ又はＲＮＡを導入するプロセスを記載する。一般に、当業者は、細菌細胞に外因性及び／若しくは異種のＤＮＡ又はＲＮＡを導入するプロセスを記載するために「形質転換」という用語を留保することがあり、真核細胞への外因性及び／若しくは異種のＤＮＡ又はＲＮＡの導入を記載するプロセスのために「トランスフェクション」という用語を留保することがある。しかしながら、本明細書で使用される場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、プロセスが、原核生物（例えば、細菌）又は真核生物（例えば、酵母、植物、若しくは動物）への外因性及び／若しくは異種のＤＮＡ又はＲＮＡの導入を記載するかどうかに関係なく、同義的に使用される。

【0515】

一部の実施形態では、宿主細胞を、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドで形質転換し得る。

【0516】

一部の実施形態では、ＤＶＰ発現カセットを含有するベクターを発現プラスミドにクローニングし、宿主細胞に形質転換し得る。一部の実施形態では、酵母細胞は、本明細書に記載されるそれらの酵母細胞のうちのいずれか１つであり得る。

【0517】

一部の実施形態では、宿主細胞は、以下の方法を使用して形質転換され得る：エレクトロポレーション、細胞圧搾、マイクロインジェクション、インペイルフェクション、静水圧の使用、ソノポレーション、光学トランスフェクション、継続注入、リポフェクション、ウイルスの使用による（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、及びレトロウイルス）、化学ホスフェート法、ＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を介したエンドサイトーシス、プロトプラスト融合、流体力学的送達、マグネトフェクション、ヌクレオインフェクション、及び／又はその他の方法。トランスフェクション及び／又は形質転換技術に関する例示的な方法は、Ｍａｋｒｉｄｅｓ（２００３），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｅｌｖｅｓｉｅｒ、Ｗｏｎｇ，ＴＫ ＆ Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０７，５８４－５８７（１９８２）、Ｐｏｔｔｅｒ ＆ Ｈｅｌｌｅｒ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００３ Ｍａｙ；ＣＨＡＰＴＥＲ：Ｕｎｉｔ－９．３、Ｋｉｍ ＆ Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ．Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１０ Ａｕｇ；３９７（８）：３１７３－３１７８に見出すことができる（これらの参考文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。

【0518】

一部の実施形態では、エレクトロポレーションを使用して、１つ以上のＤＶＰ発現カセットで細胞を形質転換し得、それは、酵母培養物においてＤＶＰを、培地１リットル当たり、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ ２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１００，０００ｍｇ／ＬのＤＶＰの収量で産生し得る。

【0519】

エレクトロポレーションは、細胞に電気を印加し、細胞膜を透過性にして、その結果、細胞に外因性ＤＮＡを導入することが可能になる技術である。エレクトロポレーションは、当業者に容易に知られており、エレクトロポレーションを達成するために必要なツール及びデバイスが市販されている（例えば、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）エレクトロポレーションシステム、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション用トランスフェクションシステム、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、及び他のツール及び／又はデバイス）。エレクトロポレーションの例示的な方法は、Ｐｏｔｔｅｒ ＆ Ｈｅｌｌｅｒ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００３ Ｍａｙ；ＣＨＡＰＴＥＲ：Ｕｎｉｔ－９．３、Ｓａｉｔｏ（２０１５）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｐｒｅｓｓ、Ｐａｋｈｏｍｏｖ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓに示されている（これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0520】

一部の実施形態では、エレクトロポレーションを使用して、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを酵母に導入し得、例えば、一部の実施形態では、プラスミドにクローニングされ、エレクトロポレーションを介して酵母細胞に形質転換されたＤＶＰ発現カセット。

【0521】

一部の実施形態では、プラスミドにクローニングされ、エレクトロポレーションを介して酵母細胞に形質転換されたＤＶＰ発現カセットは、以下を行うことによって達成され得る。約１０～２００ｍＬの酵母抽出物ペプトンデキストロース（ＹＥＰＤ）に好適な酵母種、例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどを接種し、３０℃のシェーカー上で、酵母培養の初期の対数増殖期（例えば、約０．６～２×１０^８細胞／ｍＬ）までインキュベーションする；酵母を、滅菌遠心チューブに回収し、４℃で、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（注記：手順中に細胞を冷したままにする）、細胞を、４０ｍＬの氷冷滅菌脱イオン水で洗浄し、細胞を、２３，０００ｒｐｍで５分間ペレット化する；洗浄ステップを繰り返し、細胞を、２０ｍＬの１Ｍの発酵性糖（例えば、ガラクトース、マルトース、ラトトリオース（ｌａｔｏｔｒｉｏｓｅ）、スクロース、フルクトース、若しくはグルコース）及び／又は糖アルコール（例えば、エリスリトール、水素化デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、及びキシリトール）に再懸濁し、続いて、３，０００ｒｐｍで５分間スピンダウンする；細胞を、適量の氷冷１Ｍの発酵性糖（例えば、ガラクトース、マルトース、ラトトリオース、スクロース、フルクトース、若しくはグルコース）及び／又は糖アルコール（例えば、エリスリトール、水素化デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、及びキシリトール）で再懸濁して、最終細胞密度を３×１０^９細胞／ｍＬにする（１．５×１０^９細胞／ｍＬ～６×１０^９細胞／ｍＬが許容可能な細胞密度）；４０μｌの酵母懸濁液を、予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（注記：試料がアルミニウムキュベットの両側に接触していることを確認する）中にＤＶＰをコードする線状ポリヌクレオチド（約１μｇ）を含む約１～４μｌ（１００～３００ｎｇ／μｌの濃度）のベクターと混合する；ＲＣ回路の最適な時定数（５ｍｓ）で、２０００Ｖの単一のパルスを提供し、次いで、細胞を、０．５ｍＬのＹＥＤ及び０．５ｍＬの１Ｍの発酵性糖（例えば、ガラクトース、マルトース、ラトトリオース、スクロース、フルクトース、若しくはグルコース）及び／又は糖アルコール（例えば、エリスリトール、水素化デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、及びキシリトール）混合液中で回復させ、次いで、選択プレート上に広げる。

【0522】

一部の実施形態では、エレクトロポレーションを使用して、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを酵母に導入することができ、例えば、プラスミドにクローニングされ、エレクトロポレーションを介してＫ．ｌａｃｔｉｓ細胞に形質転換されたＤＶＰは、以下を行うことによって達成され得る。約１０～２００ｍＬの酵母抽出物ペプトンデキストロース（ＹＥＰＤ）を接種し、３０℃のシェーカー上で、酵母培養の初期の対数増殖期（例えば、約０．６～２×１０^８細胞／ｍＬ）までインキュベーションする；酵母を、滅菌遠心チューブに回収し、４℃で、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（注記：手順中に細胞を冷したままにする）、細胞を、４０ｍＬの氷冷滅菌脱イオン水で洗浄し、細胞を、２３，０００ｒｐｍで５分間ペレット化する；洗浄ステップを繰り返し、細胞を、２０ｍＬの１Ｍの発酵性糖（例えば、ガラクトース、マルトース、ラトトリオース（ｌａｔｏｔｒｉｏｓｅ）、スクロース、フルクトース、若しくはグルコース）及び／又は糖アルコール（例えば、エリスリトール、水素化デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、及びキシリトール）に再懸濁し、続いて、３，０００ｒｐｍで５分間スピンダウンする；細胞を、適量の氷冷１Ｍの発酵性糖（例えば、ガラクトース、マルトース、ラトトリオース、スクロース、フルクトース、若しくはグルコース）及び／又は糖アルコール（例えば、エリスリトール、水素化デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、及びキシリトール）で再懸濁して、最終細胞密度を３×１０^９細胞／ｍＬにする；４０μｌの酵母懸濁液を、予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（注記：試料がアルミニウムキュベットの両側に接触していることを確認する）中にＤＶＰをコードする線状ポリヌクレオチド（約１μｇ）を含む約１～４μｌのベクターと混合する；ＲＣ回路の最適な時定数（５ｍｓ）で、２０００Ｖの単一のパルスを提供し、次いで、細胞を、０．５ｍＬのＹＥＤ及び０．５ｍＬの１Ｍの発酵性糖（例えば、ガラクトース、マルトース、ラトトリオース、スクロース、フルクトース、若しくはグルコース）及び／又は糖アルコール（例えば、エリスリトール、水素化デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、及びキシリトール）混合液中で回復させ、次いで、選択プレート上に広げる。

【0523】

一部の実施形態では、本明細書に記載の例示される方法、すなわち、酵母を利用する本発明のベクター、並びに方法形質転換及び発酵の使用は、培地１リットル当たり、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ ２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１００，０００ｍｇ／ＬのＤＶＰの量でのＤＶＰの産生をもたらし得る。

【0524】

一部の実施形態では、エレクトロポレーションを使用して、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、以下によって植物プロトプラストに導入することができる：植物プロトプラスト溶液（例えば、約８ｍＬの１０ｍＭの２－［Ｎ－モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．５）、０．０１％（ｗ／ｖ）のペクチラーゼ、１％（ｗ／ｖ）のマセロザイム、４０ｍＭのＣａＣｌ_２、及び０．４Ｍのマンニトール）中の滅菌植物材料をインキュベートし、混合物を、ロータリーシェーカーに約３～６時間、３０℃で添加して、プロトプラストを生成する；８０μｍメッシュのナイロンスクリーン濾過によりデブリを除去する；約４ｍｌの植物エレクトロポレーション緩衝液（例えば、５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．４Ｍのマンニトール、及びＰＢＳ）でスクリーンをリンスする；滅菌１５ｍＬコニカル遠心チューブ中でプロトプラストを合わせ、次いで、約３００×ｇで約５分間遠心分離する；遠心分離後、上清を廃棄し、５ｍＬの植物エレクトロポレーション緩衝液で洗浄する；プロトプラストを、植物エレクトロポレーション緩衝液中に、１ｍＬの液体当たり約１．５×１０^６～２×１０^６ｍＬのプロトプラストで再懸濁さする；約０．５ｍＬのプロトプラスト懸濁液を、１つ以上のエレクトロポレーションキューブに移し、氷上にセットし、ベクターを添加する（注記：安定した形質転換のために、ベクターは、上記の制限方法のいずれかを使用して線状化され、約１～１０μｇのベクターが使用される；一過性発現の場合、ベクターは、そのスーパーコイル状態で保持されてもよく、約１０～４０μｇのベクターが使用され得る）；ベクターとプロトプラスト懸濁液を混合する；キュベットをエレクトロポレーション装置に配置し、約１～２ｋＶで１回以上電撃を与える（最初に、反応を最適化しながら、３～２５μＦの容量を使用してもよい）；キュベットを氷に戻し、形質転換された細胞を、完全培地中に２０倍希釈する；約４８時間後、プロトプラストを回収する。

【0525】

異種ポリヌクレオチド組み込み分析
ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドの組み込みは、当該技術分野で既知の方法によって分析され得る。例えば、一部の実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）及びパラログ比試験（ＰＲＴ）を使用して、異種ポリヌクレオチドが組み込まれているかどうかを決定し得る。一部の実施形態では、ｑＰＣＲを使用して、組換え宿主細胞への、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能な異種ポリヌクレオチドの組み込みを確認する。

【0526】

定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現の分析及びコピー数変動の定量化のために利用されてきた。ｑＰＣＲは、未知のコピー数を有する試験遺伝子座及び既知のコピー数を有する参照遺伝子座の増幅を伴う。アッセイには、蛍光色素及び挿入色素の２つのアプローチがある。いずれのアプローチにおいても、蛍光は、ＰＣＲの各サイクルで倍増し、開始鋳型の量は、蛍光の特定の閾値レベルを達成するために必要なサイクルの数から決定され得る。実際のｑＰＣＲ実験は、試料調製後半日かかる。ｑＰＣＲデータ解析に一般的に用いられる方法は、ＰＣＲシグナルを標準曲線に関連付けることによる絶対定量化と、ある群における標的転写物のＰＣＲシグナルを別の群に関連付ける相対定量化である。

【0527】

ＤＮＡコピー数を測定するために、アンプリコンは、その遺伝子に固有の配列を有するエキソン又はイントロン内のいずれかに配置される必要がある。２つのコピーを有する対照遺伝子も含める必要がある。全ての成分を含むマスターミックスを調製し、９６又は３８４ウェルプレート分配する。各反応に鋳型及び／又はプライマーを添加する。アッセイは、ｑＰＣＲ機上で実施され、データは、リアルタイムで収集される。

【0528】

ＤＶＰの化学的合成
ペプチド合成又は化学合成又はペプチド及び／又はポリペプチドを使用して、ＤＶＰを生成し得る。これらの方法は、当業者によって、及び／又は商業ベンダー（例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）の使用を通して実施され得る。例えば、一部の実施形態では、化学的ペプチド合成は、液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）、又は固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して達成され得る。

【0529】

一部の実施形態では、ペプチド合成は、後続アミノ酸のカルボキシル基を先行アミノ酸のＮ末端にカップリングすることで、新生ポリペプチド鎖が生成される戦略（自然界で見られるポリペプチド合成の種類とは反対のプロセス）を使用することによって、一般に達成され得る。

【0530】

ペプチドの脱保護は、ポリペプチドの化学合成における重要な最初のステップである。ペプチドの脱保護は、アミノ酸の官能基が望ましくない若しくは非特異的な反応又は副反応に関与するのを防ぐために、化学物質を使用することによって当該アミノ酸の反応性基をブロックするプロセスであり、言い換えれば、アミノ酸が、これらの望ましくない反応に関与することから「保護される」。

【0531】

ペプチド鎖を合成する前に、アミノ酸を「脱保護」して、鎖が形成される（すなわち、アミノ酸が結合する）ことを可能にしなければならない。Ｎ末端を保護するために使用される化学物質としては、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、及びｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）が挙げられ、それらの各々は、それぞれ、穏和な塩基（例えば、ピペリジン）及び適度に強い酸（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））の使用を介して除去することができる。

【0532】

必要なＣ末端保護剤は、使用される化学ペプチド合成戦略の種類に依存する。例えば、ＬＰＰＳは、Ｃ末端アミノ酸の保護を必要とするが、ＳＰＰＳは、保護基として作用する固体支持体を必要としない。側鎖アミノ酸は、個々のペプチド配列及びＮ末端保護戦略に基づいて変化するいくつかの異なる保護基の使用を必要とする。しかしながら、典型的には、側鎖アミノ酸に使用される保護基は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）又はベンジル（Ｂｚｌ）保護基に基づく。

【0533】

ペプチド合成手順の次のステップは、アミノ酸のカップリングである。アミノ酸のカップリングを実現するには、入ってくるアミノ酸のＣ末端カルボン酸を活性化しなければならない。これは、入ってくるアミノ酸のカルボキシル基と反応してＯ－アシルイソ尿素中間体を形成する、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などのカルボジイミドを使用して達成することができる。その後、Ｏ－アシルイソ尿素中間体は、伸長するペプチド鎖のＮ末端上の一級アミノ基を介する求核攻撃によって置換される。カルボジイミドによって生成された反応性中間体は、アミノ酸のラセミ化をもたらすことができる。アミノ酸のラセミ化を回避するために、Ｏ－アシルイソ尿素中間体と反応するために、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）などの試薬を添加する。使用され得る他のカップル剤としては、追加の活性化塩基を有する２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、及びベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）が挙げられる。最後に、アミノ酸の脱保護及びカップリングがそれに続く。

【0534】

合成プロセスの終了時に、ポリペプチドからの保護基の除去（通常、酸分解を介して起こるプロセス）が行われなければならない。どの試薬がペプチド切断に必要なのかを決定することは、使用する保護スキームと全体的な合成方法との関係による。例えば、一部の実施形態では、臭化水素（ＨＢｒ）、フッ化水素（ＨＦ）、又はトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）を使用して、Ｂｚｌ基及びＢｏｃ基を切断することができる。代替的に、他の実施形態では、ＴＦＡなどのそれほど強くない酸により、ｔＢｕｔ基及びＦｍｏｃ基の酸分解がもたらされ得る。最後に、ペプチドは、ペプチドの生理化学的特徴（例えば、電荷、サイズ、疎水性など）に基づいて精製することができる。ペプチドを精製するために使用することができる技術としては、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を含む精製技術が挙げられる。

【0535】

ペプチド合成の例示的な方法は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｇ．Ｗ．ａｎｄ ＭｃＧｒｅｇｏｒ Ａ．Ｃ．（１９５７）Ｔ－ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．７９，６１８０－３、Ｃａｒｐｉｎｏ Ｌ．Ａ．（１９５７）Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ．Ｉｖ．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｒｏｍ １，１－ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ－２－ａｒｅｎｅｓｕｌｆｏｎｈｙｄｒａｚｉｄｅｓ１－４．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．７９，４４２７－３１、ＭｃＫａｙ Ｆ．Ｃ．ａｎｄ Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ Ｎ．Ｆ．（１９５７）Ｎｅｗ ａｍｉｎｅ－ｍａｓｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．７９，４６８６－９０、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ．（１９６３）Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．８５，２１４９－５４、Ｃａｒｐｉｎｏ Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｈａｎ Ｇ．Ｙ．（１９７２）９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３７，３４０４－９、及びＡ Ｌｌｏｙｄ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．２７８、米国特許第３，７１４，１４０号（１９７１年３月１６日出願）、同第４，４１１，９９４号（１９７８年６月８日出願）、同第７，７８５，８３２号（２００６年１月２０日出願）、同第８，３１４，２０８号（２００６年２月１０日出願）、及び同第１０，４４２，８３４号（２０１５年１０月２日出願）、並びに米国特許出願第２００５／０１６５２１５号（２００４年１２月２３日出願）に見出すことができる（それらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。

【0536】

細胞培養及び発酵技術
細胞培養技術は、当該技術分野で周知である。一部の実施形態では、培養方法及び／又は材料は、選択された宿主細胞に基づいて適応を必要とするであろう（例えば、ｐＨ、温度、培地含有量などを修正する）。一部の実施形態では、培地培養物は、唯一の炭素源（例えば、ソルビトール）を含有する。一部の実施形態では、本発明の組換え酵母細胞を産生するために、任意の既知の培養技術を用いてもよい。

【0537】

例示的な培養方法は、米国特許第３，９３３，５９０号、同第３，９４６，７８０号、同第４，９８８，６２３号、同第５，１５３，１３１号、同第５，１５３，１３３号、同第５，１５５，０３４号、同第５，３１６，９０５号、同第５，３３０，９０８号、同第６，１５９，７２４号、同第７，４１９，８０１号、同第９，３２０，８１６号、同第９，７１４，４０８号、及び同第１０，５６３，１６９号に提供されている（それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。

【0538】

宿主細胞
本発明の方法、組成物、ＤＶＰ及びＤＶＰ－殺虫タンパク質は、任意の細胞型、例えば、真核細胞又は原核細胞において実施され得る。

【0539】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、原核生物である。例えば、一部の実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性生物などの古細菌又は真正細菌であり得る。有用な細菌の例としては、大腸菌属（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、腸内細菌、シュードモナス属種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、クレブシエラ属、プロテウス属、シゲラ属、根粒菌属、ビトレオシラ属、又はパラコッカス属が挙げられる。

【0540】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、単細胞性の細胞であり得る。例えば、一部の実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌などの細菌細胞であり得る。

【0541】

一部の実施形態では、宿主細胞は、以下からなる属から選択される細菌であり得る：Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｃｈｌｏｒａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｐｒｏｓｔｈｅｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｐｕｌｏｐｉｓｃｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｍｍａｔａ、Ｐｉｒｅｌｌｕｌａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｓｔｈｅｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉｉ、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ、Ｗｏｌｂａｃｈｉａ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｙｔｈｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｇａｌｌｉｏｎｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏａｒｃｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｕｃｃｉｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ、Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ、Ｔｈｉｏｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｓａｒｃｉｎａ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、又はＴｈｅｒｍｕｓ。

【0542】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、以下の細菌種のうちの１つから選択され得る：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌｉｃａｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｈｅｒｍａｎｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｖｕｌｎｅｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｇａｒｉｃｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｇａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｇｉｎｏｖｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｓｐｌｅｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｅｌａｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂａｔｕｍｉｃｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｉｔｉｄｉｓｍｕｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｍｏｒｉｃｏｌｏｒａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｔｅｒｐｅｎｉｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｉｌｉｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｉｎｄｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｒｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｒｉｄｉａｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｃｈａｓｔｒｅｌｌａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｌｅｒｏｎｉａｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｆｕｌｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｖｏｎａｎｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒａｔｈｏｎｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅａｃｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍａｅｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｕｍｓｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｘａｎｔｈｏｍａｒｉｎａ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｉｎｊｕｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒｅｎｎｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｎｇｅｌａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｇｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｓｓａｒｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｉｇｕｌａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｏａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｈｏｄｅｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｒｉｖｉａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂａｌｅａｒｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｌｌａｎａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｎｎａｂｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｒｉｃａｐａｐｙａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｒｅｍａｅ、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ

【0543】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、真核生物であり得る。

【0544】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、以下のクレードに属する細胞であり得る：オピストコンタ、緑色植物（例えば、藻類及び植物）、アメーボゾア、ケルコゾア、アルベオラータ、鞭毛虫、ヘテロコンタ、ディシクリスタータ、又はエクスカバータ。

【0545】

一部の実施形態では、本明細書に記載の手順及び方法は、例えば、後生動物、襟鞭毛虫、又は真菌である宿主細胞を使用して達成することができる。

【0546】

一部の実施形態では、本明細書に記載の手順及び方法は、真菌である宿主細胞を使用して達成することができる。例えば、一部の実施形態では、宿主細胞は、以下の真核生物門に属する細胞であり得る：子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門、微胞子虫門、又は接合菌門。

【0547】

一部の実施形態では、本明細書に記載の手順及び方法は、以下の属のうちの１つに属する真菌である宿主細胞を使用して達成することができる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、又はＵｓｔｉｌａｇｏ。

【0548】

一部の実施形態では、本明細書に記載の手順及び方法は、以下の種のうちの１つに属する真菌である宿主細胞を使用して達成することができる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ；Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｅｌａｔｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｓｐｈａｅｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、及びＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ；Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ；Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｏｎｉｃａ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ、又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ。

【0549】

一部の実施形態では、本明細書に記載の手順及び方法は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである宿主細胞を使用して達成することができる。

【0550】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、以下の属のうちの１つに属する真菌であり得る：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、又はＵｓｔｉｌａｇｏ。

【0551】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科のメンバーであり得る。例えば、一部の実施形態では、宿主細胞は、以下のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科内の属のうちの１つであり得る：Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｙｎｉｃｌｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｌａｃｈａｎｃｅａ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎａｋａｓｅｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐａｔｈａｓｐｏｒａ、Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ、Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、又はＺｙｇｏｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ。

【0552】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、以下のうちの１つであり得る：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｅｌａｔｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｓｐｈａｅｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｏｎｉｃａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ、又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ。

【0553】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ｃａｎｄｉｄａ属内の種であり得る。例えば、宿主細胞は、以下のうちの１つであり得る：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｍｐｈｉｘｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｒｇｅｎｔｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｌａｎｋｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｌａｔｔａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｒａｃａｒｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｒｐｏｐｈｉｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｒｖａｊａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｏｒｙｄａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｏｓｓｅｙｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｆｒｕｃｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｈｕｍｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｓｅｃｔａｍｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｊｅｆｆｒｅｓｉｉ、又はＣａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ。

【0554】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属内の種であり得る。例えば、宿主細胞は、以下のうちの１つであり得る：Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ａｅｓｔｕａｒｉｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｂｚｈａｎｓｋｉｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、又はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ。

【0555】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属内の種であり得る。例えば、宿主細胞は、以下のうちの１つであり得る：Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓｅ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｈｅｅｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｈｍｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、又はＰｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ。

【0556】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属内の種であり得る。例えば、宿主細胞は、以下のうちの１つであり得る：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ａｒｂｏｒｉｃｏｌｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｕｌｄｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｉｏｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｕｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｏｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｔｉｎｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｋａｔａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｚｏｎａｔｕｓ。

【0557】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、以下のうちの１つであり得る：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、又はＨａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ。

【0558】

組換えＤＶＰを生成するための宿主生物としての酵母細胞の使用は、当業者に周知の例外的な方法である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、酵母の任意の種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の任意の種を含むが、これらに限定されない）を用いて実施することができ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの任意の種が含まれ、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種は、以下の株から選択される：ＩＮＶＳｃ１、ＹＮＮ２７、Ｓ１５０－２Ｂ、Ｗ３０３－１Ｂ、ＣＧ２５、Ｗ３１２４、ＪＲＹ１８８、ＢＪ５４６４、ＡＨ２２、ＧＲＦ１８、Ｗ３０３－１Ａ、及びＢＪ３５０５。一部の実施形態では、ピキア属種のメンバーには、ピキア属の任意の種が含まれ（例えば、ピキア属種Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、以下の株から選択される：Ｂｇ０８、Ｙ－１１４３０、Ｘ－３３、ＧＳ１１５、ＧＳ１９０、ＪＣ２２０、ＪＣ２５４、ＧＳ２００、ＪＣ２２７、ＪＣ３００、ＪＣ３０１、ＪＣ３０２、ＪＣ３０３、ＪＣ３０４、ＪＣ３０５、ＪＣ３０６、ＪＣ３０７、ＪＣ３０８、ＹＪＮ１６５、ＫＭ７１、ＭＣ１００－３、ＳＭＤ１１６３、ＳＭＤ１１６５、ＳＭＤ１１６８、ＧＳ２４１、ＭＳ１０５、任意のｐｅｐ４ノックアウト株及び任意のｐｒｂ１ノックアウト株、並びに以下の株から選択されるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ：Ｂｇ０８、Ｘ－３３、ＳＭＤ１１６８、及びＫＭ７１。一部の実施形態では、任意のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種を使用して、本明細書に記載の方法を達成することができ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの任意の種（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）が含まれ、本発明者らの教示として、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓの染色は、以下の株であり得るが、必ずしもこれらから選択する必要はない：ＧＧ７９９、ＹＣＴ３０６、ＹＣＴ２８４、ＹＣＴ３８９、ＹＣＴ３９０、ＹＣＴ５６９、ＹＣＴ５９８、ＮＲＲＬ Ｙ－１１４０、ＭＷ９８－８Ｃ、ＭＳ１、ＣＢＳ２９３．９１、Ｙ７２１、ＭＤ２／１、ＰＭ６－７Ａ、ＷＭ３７、Ｋ６、Ｋ７、２２ＡＲ１、２２Ａ２９５－１、ＳＤ１１、ＭＧ１／２、ＭＳＫ１１０、ＪＡ６、ＣＭＫ５、ＨＰ１０１、ＨＰ１０８、及びＰＭ６－３Ｃ、加えて、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ種は、ＧＧ７９９、ＹＣＴ３０６、及びＮＲＲＬ Ｙ－１１４０から選択される。

【0559】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅであり得る。

【0560】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓであり得る。

【0561】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒであり得る。

【0562】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓであり得る。

【0563】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓであり得る。

【0564】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉであり得る。

【0565】

一部の実施形態では、本明細書に記載の手順及び方法は、酵母の任意の種で達成することができ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａの任意の種及び好ましくはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを含むＨａｎｓｅｎｕｌａの種の任意の種を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載の手順及び方法は、酵母の任意の種で達成することができ、Ｙａｒｒｏｗｉａの任意の種、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載の手順及び方法は、酵母の任意の種で達成することができ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの任意の種を含むが、これらに限定されず、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの任意の種、及び好ましくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅが含まれる。

【0566】

一部の実施形態では、酵母種、例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びその他を、宿主生物として使用することができる。酵母細胞培養技術は、当業者に周知である。酵母細胞培養の例示的な方法は、Ｅｖａｎｓ，Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９６）、Ｂｉｌｌ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１２）、Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｓｓｉｏｎ Ｙｅａｓｔ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（２０１６）、Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｉｎ ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１４；７８（６）：１０９０－３、Ｄｙｍｏｎｄ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１３；５３３：１９１－２０４、Ｌｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔｓ ｆｏｒ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２０１１ Ｍａｙ；５０（５）：３２５－８、及びＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｓｅｐ ２；６４：２０．９．１－１６に見出すことができる（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0567】

酵母細胞発酵培地及びストックのレシピは、以下のように記載される：（１）ＭＳＭ培地レシピ：２ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム二水和物、１ｇ／Ｌの硫酸カルシウム二水和物（０．７９ｇ／Ｌの無水硫酸カルシウム）、４２．９ｇ／Ｌのリン酸一カリウム、５．１７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１４．３３ｇ／Ｌの硫酸カリウム、１１．７ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、２ｍＬ／ＬのＰＴＭ１微量塩溶液、０．４ｐｐｍのビオチン（５００×、２００ｐｐｍストックから）、１～２％の純粋なグリセロール又は他の炭素源。（２）ＰＴＭ１微量塩溶液：硫酸銅－５Ｈ２Ｏ ６．０ｇ、ヨウ化ナトリウム ０．０８ｇ、硫酸マンガン－Ｈ２Ｏ ３．０ｇ、モリブデン酸ナトリウム－２Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ、ホウ酸 ０．０２ｇ、塩化コバルト ０．５ｇ、塩化亜鉛 ２０．０ｇ、硫酸鉄－７Ｈ_２Ｏ ６５．０ｇ、ビオチン ０．２ｇ、硫酸 ５．０ｍｌ、水を添加し最終体積を１リットルにする。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ規定培地（ＤＭＳｏｒ）の例示的な組成物は、以下のとおりである。１１．８３ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、２．２９９ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、２０ｇ／Ｌの発酵性糖、例えば、ガラクトース、マルトース、ラトトリオース、スクロース、フルクトース、若しくはグルコース、及び／又は糖アルコール、例えば、エリスリトール、水素化デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、及びキシリトール、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）ＳＯ_４、０．３３ｇ／ＬのＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／ＬのＫＣｌ、５ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、３０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＺｎＣｌ_２、１ｍｇ／ＬのＫＩ、２ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、８ｍｇ／ＬのＮａ_２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、０．４ｍｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、１５ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ_３．６Ｈ_２Ｏ、０．８ｍｇ／Ｌのビオチン、２０ｍｇ／Ｌのパントテン酸カルシウム、１５ｍｇ／Ｌのチアミン、１６ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、１０ｍｇ／Ｌのニコチン酸、及び４ｍｇ／Ｌのピリドキシン。

【0568】

酵母細胞は、４８ウェルのディープウェルプレートで培養することができる（接種後、滅菌透気性カバーで密封する）。プレート上で培養された酵母（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のコロニーを採取し、ウェル当たり２．２ｍＬの培地（ＤＭＳｏｒで構成される）を含むディープウェルプレートに接種することができる。接種されたディープウェルプレートは、冷蔵インキュベーターシェーカー内で２８０ｒｐｍで振盪しながら、２３．５℃で６日間増殖され得る。接種後６日目に、条件培地を、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収する必要がある。続いて、０．２２μＭ膜を備えた濾過プレートを使用して濾過し、濾過された培地をＨＰＬＣ分析にかける。

【0569】

一部の実施形態では、酵母細胞は、（ａ）ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットを含むベクターを調製することであって、当該ＤＶＰが、式（Ｉ）のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列であって、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖ、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、アミノ酸配列又はその薬学的に許容される塩を含む、調製すること、（ｂ）ベクターを酵母細胞に導入すること、及び（ｃ）ＤＶＰの発現及び増殖培地への分泌を可能にするように動作可能な条件下で、増殖培地中で酵母細胞を増殖することによって産生され得る。

【0570】

一部の実施形態では、酵母細胞は、（ａ）ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットを含むベクターを調製することであって、当該ＤＶＰが、式（Ｉ）のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列であって、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖ、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、アミノ酸配列又はその薬学的に許容される塩を含む、調製すること、（ｂ）ベクターを酵母細胞に導入すること、及び（ｃ）ＤＶＰの発現及び増殖培地への分泌を可能にするように動作可能な条件下で、増殖培地中で酵母細胞を増殖することによって産生され得、Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ若しくはＶである場合、ジスルフィド結合が、除去される。

【0571】

一部の実施形態では、酵母細胞は、（ａ）ＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチド、又はその相補的ヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットを含むベクターを調製することであって、当該ＤＶＰが、式（Ｉ）のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列であって、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖ、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、アミノ酸配列又はその薬学的に許容される塩を含む、調製すること、（ｂ）ベクターを酵母細胞に導入すること、及び（ｃ）ＤＶＰの発現及び増殖培地への分泌を可能にするように動作可能な条件下で、増殖培地中で酵母細胞を増殖することによって産生され得、Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ若しくはＶである場合、ジスルフィド結合が、除去される。

【0572】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を含む。

【0573】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む。

【0574】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を含む。

【0575】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む。

【0576】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を含む。

【0577】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む。

【0578】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を含む。

【0579】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列を含む。

【0580】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、２つ以上のＤＶＰのホモポリマー又はヘテロポリマーであり得、各ＤＶＰのアミノ酸配列は、同じであるか、又は異なる。

【0581】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰは、切断可能又は切断不能リンカーによって分離された２つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質であり得、各ＤＶＰのアミノ酸配列は、同じである場合も異なる場合もある。

【0582】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、リンカーは、昆虫の腸内又は血液リンパ内で切断可能である。

【0583】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ベクターは、アルファ－ＭＦシグナルを含むプラスミドである。

【0584】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、ベクターは、酵母細胞に形質転換される。

【0585】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の任意の種から選択される。

【0586】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、酵母細胞は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群から選択される。

【0587】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、酵母細胞は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓである。

【0588】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰの発現は、培地１リットル当たり、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１１０ｍｇ／Ｌ、１２０ｍｇ／Ｌ、１３０ｍｇ／Ｌ、１４０ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、１６０ｍｇ／Ｌ、１７０ｍｇ／Ｌ、１８０ｍｇ／Ｌ、１９０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、７５０ｍｇ／Ｌ、１，０００ｍｇ／Ｌ、１，２５０ｍｇ／Ｌ、１，５００ｍｇ／Ｌ、１，７５０ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも２０，０００ｍｇ／ＬのＤＶＰの収量を提供する。

【0589】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を発現するように動作可能であり得、ＤＶＰの発現は、培地１リットル当たり、少なくとも１００ｍｇ／ＬのＤＶＰの収量を提供する。

【0590】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を発現するように動作可能であり得、培地中のＤＶＰの発現は、培地中の単一のＤＶＰの発現をもたらす。

【0591】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を発現するように動作可能であり得、培地中のＤＶＰの発現は、培地中の２つ以上のＤＶＰポリペプチドを含むＤＶＰポリマーの発現をもたらす。

【0592】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を発現するように動作可能であり得、ベクターは、２つ又は３つの発現カセットを含み、各発現カセットは、第１の発現カセットのＤＶＰをコードするように動作可能である。

【0593】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を発現するように動作可能であり得、ベクターは、２つ又は３つの発現カセットを含み、各発現カセットは、第１の発現カセットのＤＶＰ、又は異なる発現カセットのＤＶＰをコードするように動作可能である。

【0594】

一部の実施形態では、酵母細胞は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫性タンパク質を発現するように動作可能であり得、発現カセットは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるＤＶＰアミノ配列をコードするように動作可能である。

【0595】

前述の方法のうちのいずれか、及び／又は本明細書に記載される方法のうちのいずれかを使用して、本明細書に記載されるＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質のうちの１つ以上を産生し得る。例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、本開示に記載のＤＶＰのうちの１つ以上、例えば、同様に本明細書に記載される配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、若しくは２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるＤＶＰアミノ配列を産生し得る。

【0596】

酵母形質転換、ＤＶＰ精製、及び分析
酵母形質転換の例示的な方法は、以下のとおりである：ＤＶＰ ＯＲＦを担持する発現ベクターを、酵母細胞に形質転換する。まず、発現ベクターは、通常、相同組換えを介した染色体への組み込みを促進するために、特異的な制限酵素切断によって線状化される。次いで、線状発現ベクターは、形質転換の化学的方法又はエレクトロポレーション法によって酵母細胞に形質転換され、相同組換えにより酵母ゲノムの標的化された遺伝子座に組み込まれる。組み込みは、同じ染色体遺伝子座で複数回行われ得る。したがって、形質転換された酵母細胞のゲノムは、ＤＶＰ発現カセットを複数のコピー含み得る。正常に形質転換された酵母細胞は、発現ベクターに操作され、ＤＶＰ ＯＲＦが酵母染色体にともに組み込まれる選択的マーカーを有利にする増殖条件を使用して同定され得る。かかるマーカーの例としては、アセトアミドプロトトロフィー、ゼオシン耐性、ジェネティシン耐性、ノウルセオトリシン耐性、及びウラシルプロトトロフィーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0597】

遺伝子及び遺伝子ネットワークのエピジェネティック修飾、並びに形質転換手順を受ける集団の個々の細胞で生じる組み込み事象の数の変動などの予測不可能で可変的な要因の影響により、所与の形質転換プロセスの個々の酵母コロニーは、ＤＶＰ ＯＲＦを産生する能力が異なるであろう。したがって、ＤＶＰ導入遺伝子を担持するトランスジェニック酵母コロニーは、高収量株についてスクリーニングされる必要がある。かかるスクリーニングのための２つの有効な方法は（各々、その後の分析のための条件培地試料を提供するトランスジェニック酵母の小規模培養の増殖に依存する）、逆相ＨＰＬＣ又はイエバエ注射手順を使用して、陽性トランスジェニック酵母コロニーからの条件培地試料を分析する。

【0598】

トランスジェニック酵母培養は、各チューブに５～１０ｍＬの規定培地を添加した１４ｍＬ丸底ポリプロピレン培養チューブを使用して行うか、又は各ウェルに２．２ｍＬの規定培地を添加した４８ウェルのディープウェル培養プレートで行うことができる。粗製タンパク質性抽出物又は副産物（例えば、酵母抽出物若しくはペプトン）を含まない規定培地を培養に使用して、その後のスクリーニングステップのために回収された条件培地中のタンパク質のバックグラウンドを減らす。培養は、最大細胞密度に達するまで、約５～６日間、最適な温度（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓの場合は２３．５℃）で実施される。ここで、ＤＶＰが、形質転換酵母細胞によって産生され、細胞から増殖培地に分泌されるであろう。スクリーニングのための試料を調製するために、細胞を遠心分離によって培養物から除去し、上清を条件培地として回収し、次いで、０．２２μｍフィルター膜を通して濾過することによって浄化し、次いで、株スクリーニングの準備をする。

【0599】

一部の実施形態では、ＤＶＰで形質転換された陽性酵母コロニーは、推定酵母コロニーの逆相ＨＰＬＣ（ｒｐＨＰＬＣ）スクリーニングを介してスクリーニングされ得る。このスクリーニング方法では、Ｃ１８の結合相を有するＨＰＬＣ分析用カラムを使用することができる。移動相溶媒としてアセトニトリル及び水を使用し、ペプチド検出には２２０ｎｍに設定された紫外線吸光度検出器を使用する。適量の条件培地試料をｒｐＨＰＬＣシステムにロードし、移動相溶媒の線形勾配で溶出する。ＨＰＬＣクロマトグラフにおける殺虫ペプチドの対応するピーク面積を使用して、条件培地中のＤＶＰ濃度を定量化する。既知の量の純粋なＤＶＰを、同じＨＰＬＣプロトコルで、同じｒｐＨＰＬＣカラムを通して実行して、ペプチドの保持時間を確認し、定量化のための標準的なペプチドＨＰＬＣ曲線を生成する。

【0600】

陽性Ｋ．ｌａｃｔｉｓ細胞の例示的な逆相ＨＰＬＣスクリーニングプロセスは、以下のとおりである：ＤＶＰ ＯＲＦを発現ベクターｐＫＬＡＣ１に挿入し、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡからのＫ．ｌａｃｔｉｓ株ＹＣＴ３０６に形質転換することができる。ｐＫＬＡＣ１ベクターは、組み込み発現ベクターである。ＤＶＰ導入遺伝子がｐＫＬＡＣ１にクローニングされ、ＹＣＴ３０６に形質転換されたら、それらの発現を、ＬＡＣ４プロモーターによって制御した。得られた形質転換コロニーは、α接合因子シグナルペプチド、Ｋｅｘ２切断部位、及び成熟ＤＶＰを含むプレプロペプチドを産生した。α接合因子シグナルペプチドは、プレプロペプチドを内因性分泌経路に入るように誘導し、成熟ＤＶＰが、増殖培地に放出される。

【0601】

一部の実施形態では、ＤＶＰ発現のためのコドン最適化は、２ラウンドで行われ得、例えば、第１のラウンドでは、高発現ＤＮＡ配列のいくつかの共通の特徴に基づいて、α接合因子シグナルペプチド、Ｋｅｘ２切断部位、及びＤＶＰを発現するＤＶＰ ＯＲＦの複数のバリアントが設計され、それらの発現レベルが、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＹＣＴ３０６株で評価され、初期Ｋ．ｌａｃｔｉｓ発現アルゴリズムをもたらされる。最適化の第２のラウンドでは、追加のバリアントＤＶＰ ＯＲＦが、初期Ｋ．ｌａｃｔｉｓ発現アルゴリズムに基づいて設計され、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ発現アルゴリズムが更に微調整され、Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおけるＤＶＰ発現のための最良のＯＲＦが特定され得る。一部の実施形態では、前述の最適化から得られたＤＮＡ配列は、α－ＭＦシグナルペプチド、Ｋｅｘ２切断部位、及びＤＶＰをコードするオープンリーディングフレームを有することができ、これらを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉ制限部位を使用してｐＫＬＡＣ１ベクターにクローニングして、ＤＶＰ発現ベクターを得ることができる。

【0602】

一部の実施形態では、酵母、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、ＤＶＰ発現カセットで形質転換され得る。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換するための例示的な方法は、以下のとおりである：酵母ベクターを使用して、ＤＶＰ発現カセットをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換することができる。ベクターは、当業者に既知の商業ベンダーから入手することができる。一部の実施形態では、ベクターは、組み込みベクターであり、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター（ｐＵＰＰ）を使用して、異種導入遺伝子の発現を増強する。一部の実施形態では、ベクターは、異なる選択戦略を提供してもよく、例えば、一部の実施形態では、ベクター間の唯一の違いは、一方のベクターが宿主酵母にＧ４１８耐性を提供してもよく、他方のベクターがゼオシン耐性を提供してもよいことであり得る。一部の実施形態では、ＤＶＰをコードする相補的オリゴヌクレオチドの対を、２つの酵母発現ベクターへのサブクローニング用に設計及び合成し得る。ハイブリダイゼーション反応は、対応する相補的オリゴヌクレオチドを、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８）（全て最終濃度）中で、２０μＭの最終濃度に混合し、次いで、９５℃で２０分間インキュベートし、続いて、９２℃から始めて１７℃で終わり、温度が２０分毎に３℃の低下するように９時間インキュベートすることによって実施され得る。ハイブリダイゼーション反応により、ＤＶＰをコードするＤＮＡ断片がもたらされる。２つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクターを、ＢｓａＩ－ＨＦ制限酵素で消化し得、次いで、この反応の二本鎖ＤＮＡ産物を、標準的な手順を使用して線状化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクターにサブクローニングする。サブクローンの配列の検証後、プラスミドのアリコートを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（例えば、Ｂｇ０８）へのエレクトロポレーションによってトランスフェクトし得る。得られた形質転換酵母は、ベクターに操作されたエレメントによって付与された耐性（例えば、この例では、ゼオシン又はＧ４１８に対する）に基づいて選択され得る。

【0603】

ペプチド収量のスクリーニング及び評価
一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の収量は、Ｏｎｙｘモノリシック４．５×１００ｍｍ Ｃ１８逆相分析用ＨＰＬＣカラム及びオートインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムを使用して評価され得る。Ｏｎｙｘモノリシック４．５×１００ｍｍ Ｃ１８逆相分析用ＨＰＬＣカラム及びオートインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムの例示的な使用は、以下のとおりである：形質転換Ｋ．ｌａｃｔｉｓ細胞由来の濾過した条件培地試料を、Ｏｎｙｘモノリシック４．５×１００ｍｍ Ｃ１８逆相分析用ＨＰＬＣカラム及び自動注入器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムを使用して、ＨＰＬＣ分析に使用される２つの移動相溶媒を構成するＨＰＬＣグレードの水と０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルとを分析することによって分析する；ＤＶＰ又はＤｖｐ－殺虫タンパク質の両方のピーク面積を、ＨＰＬＣクロマトグラフを使用して分析し、次いで、条件培地中のペプチド濃度を計算するために使用し、正規化されたペプチド収量としての（ＯＤ６００の測定によって決定される）対応する最終細胞密度に更に正規化することができる。

【0604】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質で形質転換された陽性酵母コロニーは、イエバエ注射アッセイを使用してスクリーニングされ得る。ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、測定された用量で背側胸部の体壁を通して注射した場合、イエバエを麻痺／殺傷することができる。ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の有効性は、ペプチドの麻痺／致死用量の中央値（ＰＤ_５０／ＬＤ_５０）によって定義され得、これは、それぞれ、注射されたイエバエの５０％のノックダウン率又は死亡率をもたらす。純粋なＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、通常、イエバエ注射アッセイで使用され、ＰＤ_５０／ＬＤ_５０値が決定され得る標準的な用量反応曲線を生成する。純粋なＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の標準用量反応曲線の分析からのＰＤ_５０／ＬＤ_５０値を使用して、形質転換酵母によって産生されたＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の定量化は、対応する条件培地の段階希釈液を用いたイエバエ注射アッセイを使用して達成され得る。

【0605】

例示的なイエバエ注射バイオアッセイは、以下のとおりである：条件培地を段階希釈して、イエバエ注射バイオアッセイから完全な用量反応曲線を生成する。注射前に、成体イエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）をＣＯ_２で固定化し、注射用に１２～１８ｍｇのイエバエを選択する。１ｃｃシリンジと３０ゲージ針を装填したマイクロアプリケーターを使用して、ハエ１匹当たり０．５μＬの段階希釈した条件培地試料を、背側胸部の体壁を通してイエバエに注射する。注射したイエバエを、蓋の上に湿らせた濾紙及び呼吸孔を備えた密閉容器に配置し、それらを、注射２４時間後に、ノックダウン率又は死亡率のスコアリングによって調べる。正規化した収量を算出する。ペプチド収量は、条件培地中のｍｇ／Ｌの単位のペプチド濃度を意味する。しかしながら、ペプチド収量は、株の産生速度を正確に比較するには必ずしも十分ではない。個々の株は、異なる増殖速度を有し得る。したがって、培養物を回収すると、異なる培養物は、細胞密度が異なり得る。より高い産生速度を有する別の株よりも、株のペプチド産生速度が低い場合でさえ、高い細胞密度を有する培養物は、培地中により高い濃度のペプチドを産生し得る。したがって、「正規化された収量」という用語は、ペプチド収量を、対応する培養物の細胞密度で割ることによって作成され、これにより、株間のペプチド産生速度のより良い比較が可能になる。細胞密度は、６００ｎｍの光の吸光度によって、「Ａ」（吸光度単位）の単位で表される。

【0606】

ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質での形質転換を経た酵母コロニーをスクリーニングすることで、数百の潜在的なコロニーから高収量の酵母株を特定することができる。本明細書に記載の最適化された発酵培地及び発酵条件を使用した場合、これらの株をバイオリアクターで発酵させると、少なくとも最大４ｇ／Ｌ、又は少なくとも最大３ｇ／Ｌ、又は少なくとも最大２ｇ／ＬのＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の収量が達成され得る。より高い産生速度（ｍｇ／Ｌで表示）は、約１００ｍｇ／Ｌ～約１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約９０，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約８０，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約７０，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約６０，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約５０，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約４０，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約３０，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約２０，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約１７，５００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約１５，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約１２，５００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約１０，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約９，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約８，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約７，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約６，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約５，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～約３，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～２，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～１，５００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～１，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～７５０ｍｇ／Ｌ、若しくは約１００ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１５０ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約２００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約３００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約４００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約５００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約７５０ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１，２５０ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１，５００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約２，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約２，５００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約３，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約３，５００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約４，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約４，５００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約５，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約６，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約７，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約８，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約９，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１０，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１２，５００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１５，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約１７，５００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約２０，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約３０，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約４０，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約５０，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約６０，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約７０，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約８０，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ、若しくは約９０，０００ｍｇ／Ｌ～１００，０００ｍｇ／Ｌ程度、又は提供された任意の値のいずれかの範囲、あるいは変換前にペプチドを産生するために使用した同じ若しくは類似の産生方法を使用して変換前のペプチドで達成され得る収量よりも更に高い収量であり得る。

【0607】

薬学的に許容される塩
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」及び「農業的に許容される塩」という用語は、同義である。一部の実施形態では、適用可能な場合、本明細書に記載のＤＶＰの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、結晶形態、並びに個々の異性体、鏡像異性体、互変異性体、ジアステレオマー、及びプロドラッグを利用することができる。

【0608】

一部の実施形態では、本発明の薬学的に許容される塩は、親化合物の所望の薬理活性を有する。かかる塩には、無機酸で形成される酸付加塩、有機酸で形成される酸付加塩、又は親化合物中に存在する酸性プロトンが金属イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルミニウムイオン）によって置き換えられるときに形成される塩、又は有機塩基（例えば、エタノールアミン）との配位が含まれる。

【0609】

一部の実施形態では、薬学的に許容される塩は、従来の毒性又は非毒性の塩を含む。例えば、一部の実施形態では、従来の非毒性塩には、フマル酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、塩酸塩などのものが含まれる。一部の実施形態では、本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって親化合物から合成することができる。一部の実施形態では、かかる塩は、これらの化合物の遊離酸形態又は遊離塩基形態を、水中若しくは有機溶媒中若しくはこれら２つの混合物中で、化学量論的な量の適切な塩基又は酸と反応させることによって調製することができる。一部の実施形態では、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８に見出される（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0610】

一部の実施形態では、薬学的に許容される塩は、塩酸塩、ナトリウム、硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩又は二リン酸塩、塩化物、カリウム、マレイン酸塩、カルシウム、クエン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、酒石酸塩、アルミニウム、又はグルコン酸塩のうちの１つであり得る。

【0611】

一部の実施形態では、塩を形成するために使用することができる薬学的に許容される酸のリストは、グリコール酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、イソ酪酸、乳酸（ＤＬ）、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸（－Ｌ）、マロン酸、マンデル酸（ＤＬ）、メタンスルホン酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロプリオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ピログルタミン酸（－Ｌ）、サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸（＋Ｌ）、チオシアン酸、トルエンスルホン酸（ｐ）、ウンデシレン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、２，２－ジクロロ酢酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、２－オキソグルタル酸、４－アセトアミド安息香酸、４－アミノサリチル酸、酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｌ）、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、樟脳酸（＋）、樟脳－１０－スルホン酸（＋）、カプリン酸（デカン酸）、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリン酸（オクタン酸）、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸（Ｄ）、グルコン酸（Ｄ）、グルクロン酸（Ｄ）、グルタミン酸、グルタル酸、又はグリセロリン酸を含む。

【0612】

一部の実施形態では、薬学的に許容される塩は、任意の有機付加塩又は無機付加塩であり得る。

【0613】

一部の実施形態では、塩は、遊離酸として無機酸及び有機酸を使用することができる。無機酸は、塩酸、臭素酸、硝酸、硫酸、過塩素酸、リン酸などであってもよい。有機酸は、クエン酸、酢酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グルコン酸、コハク酸、酒石酸、ガラクツロン酸、エンボン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、シュウ酸、（Ｄ）又は（Ｌ）リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、サリチル酸、クエン酸、安息香酸、マロン酸などであってもよい。

【0614】

一部の実施形態では、塩は、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）及びアルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）を含む。例えば、酸付加塩としては、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸水素塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフタレン酸塩、２－ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、サッカリン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リジン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、亜鉛塩などが挙げられ、なかでも、塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩などが使用され得る。

【0615】

更に他の実施形態では、薬学的に許容される塩は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、ステアリン酸、コハク酸、エチルコハク酸、ラクトビオン酸、グルコン酸、グルコヘプトン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ラウリル硫酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アジピン酸、システイン、Ｎ－アセチルシステイン、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、ヨウ化水素酸、ニコチン酸、シュウ酸、ピクリン酸、チオシアン酸、ウンデカン酸、ポリアクリル酸、又はカルボキシルビニルポリマーなどの酸との塩であり得る。

【0616】

一部の実施形態では、薬学的に許容される塩は、無機塩基又は有機塩基のいずれかから調製され得る。無機塩基に由来する塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、第一鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、第二鉄、マンガン塩などが含まれるが、これらに限定されない。好ましい無機塩は、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム塩である。有機塩基に由来する塩には、限定されないが、一級、二級、及び三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、並びに環状アミンを含み、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ－アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジンなどが挙げられる。好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、トロメタミン、及びコリンである。

【0617】

一部の実施形態では、薬学的に許容される塩は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに、ヒト及び下等動物の組織と接触させて使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比に見合った塩を指す。薬学的に許容される塩は、当該技術分野で周知である。例えば、薬学的に許容される塩は、Ｓ．Ｍ．ＢｅｒｇｅらのＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９（１９７７）に詳細に記載されている（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0618】

一部の実施形態では、本発明の化合物の最終的な単離及び精製中に、又は遊離塩基の官能基を好適な有機酸と別々に反応させることによって、本発明の塩をインサイツで調製することができる。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩の例は、アミノ基の塩であり、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸）、又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、若しくはマロン酸）と形成されるか、又はイオン交換などの当該技術分野で使用される他の方法を使用することによって形成される。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルピオロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピルビン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。更なる薬学的に許容される塩としては、適切な場合、非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオン（ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成される）が挙げられる。

【0619】

薬学的に許容される塩の例示的な記載は、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ａｕｇ ２３，（２００２）に提供されている（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0620】

植物又はその一部へのＤＶＰの組み込み
本明細書に記載のＤＶＰ、及び／又は本明細書に記載の少なくとも１つのＤＶＰを含む殺虫タンパク質は、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質及び／又はそれをコードするポリヌクレオチド配列の安定した発現又は一過性発現のいずれかのために、植物、植物組織、植物細胞、植物種子、及び／又はその植物部分に組み込まれ得る。

【0621】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、当該技術分野で既知の組換え技術を使用して、植物に組み込まれ得る。一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、１つ以上のＤＶＰモノマーを含み得る殺虫タンパク質の形態であり得る。

【0622】

本明細書で使用される場合、トランスジェニック植物、植物組織、植物細胞、及び植物種子に関して、「ＤＶＰ」という用語は、ＤＶＰ－殺虫タンパク質も包含し、「ＤＶＰポリヌクレオチド」は、同様に、１つ以上のＤＶＰを含む殺虫タンパク質を発現及び／又はコードするように動作可能なポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの群を包含するようにも使用される。

【0623】

植物にＤＶＰを組み込む目的は、昆虫によって摂取される植物組織で発現するトランスジェニックＤＶＰの昆虫の摂取を介して、ＤＶＰ及び／又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を害虫に送達することである。昆虫がその食物からＤＶＰを摂取すると（例えば、ＤＶＰで形質転換されたトランスジェニック植物に対する昆虫の接触を介して）、摂取されたＤＶＰは、成長を阻害し、動きを損なわせ、又は更に昆虫を死滅させる能力を有し得る。したがって、ＤＶＰのポリヌクレオチド及び／又はＤＶＰのポリペプチドを発現するトランスジェニック植物は、表皮（例えば、葉肉）、周皮、篩部、木部、柔組織、厚角組織、一次分裂組織、二次分裂組織が含まれるが、これらに限定されない様々な植物組織において、当該ＤＶＰのポリヌクレオチド／ポリペプチドを発現し得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチド配列は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプロモーターを含む調節領域に動作可能に連結され得、植物の葉肉組織におけるＤＶＰの発現をもたらす。

【0624】

ＤＶＰ及び／又はＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック植物は、当業者に周知の様々な方法及びプロトコルのうちのいずれか１つによって生成され得、本発明のかかる方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入するための特定の方法を使用する必要はなく、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも１つの細胞の内部にアクセスすることができることのみを必要とする。ヌクレオチド構築物を植物に導入するための方法は、当該技術分野で既知であり、安定的形質転換方法、一過性形質転換方法、及びウイルス媒介性方法が含まれるが、これらに限定されない。「トランスジェニック植物」又は「形質転換植物」又は「安定的に形質転換した」植物、若しくは細胞、若しくは組織は、外因性核酸配列又はＤＮＡ断片が植物細胞に取り込まれた、又は組み込まれた植物を指す。これらの核酸配列には、外因性であるか、又は非形質転換植物細胞に存在しない配列、並びに内因性であるか、又は非形質転換植物細胞に存在し得る配列が含まれる。「異種」とは、概して、細胞又はそれらが存在する天然ゲノムの一部に対して内在性ではなく、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクションなどによって細胞に付加された核酸配列を指す。

【0625】

植物細胞の形質転換は、当該技術分野で既知のいくつかの技術のうちの１つによって達成することができる。典型的には、目的の外因性又は異種のペプチド若しくはポリペプチド（例えば、ＤＶＰ）を発現する構築物は、遺伝子の転写を駆動するプロモーター、並びに転写終結及びポリアデニル化を可能にする３’非翻訳領域を含有するであろう。そのような構築物の設計及び構成は、当該技術分野で周知である。一部の実施形態では、遺伝子は、得られるペプチドが分泌されるように操作され得るか、又はその他、植物細胞内の特定の領域及び／又はオルガネラに標的化され得る。例えば、遺伝子は、ペプチドの小胞体への移行を促進するために、シグナルペプチドを含むように操作され得る。イントロンのｍＲＮＡプロセシングが発現に必要とされるように、イントロンを含むように植物発現カセットを操作することも好ましい場合がある。

【0626】

典型的には、植物発現カセットを、植物形質転換ベクターに挿入することができる。この植物形質転換ベクターは、植物の形質転換を達成するために必要な１つ以上のＤＮＡベクターを含み得る。例えば、２つ以上の連続したＤＮＡセグメントからなる植物形質転換ベクターを利用することは、当該技術分野で一般的な方法である。これらのベクターは、当該技術分野において「バイナリベクター」と称されることが多い。バイナリベクター、並びにヘルパープラスミドを伴うベクターは、最も多くの場合、アグロバクテリウム媒介性形質転換に使用され、効率的な形質転換を達成するために必要なＤＮＡセグメントのサイズ及び複雑性はかなり大きく、機能を別々のＤＮＡ分子上に分けることが有利である。バイナリベクターは、典型的には、プラスミドベクターを含み、これには、Ｔ－ＤＮＡ導入に必要なシス作用性配列（例えば、左縁及び右縁）である、植物細胞で発現され得るように操作される選択マーカーと、「目的の遺伝子」（トランスジェニック植物の生成が望まれる植物細胞で発現され得るように操作される遺伝子）と、が含まれる。このプラスミドベクター上にも、細菌の複製に必要な配列が存在する。シス作用性配列は、植物細胞への効率的な導入及びそこでの発現を可能にする様式で配置される。例えば、選択マーカー遺伝子及びＤＶＰは、左縁と右縁との間に位置する。多くの場合、第２のプラスミドベクターは、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ－ＤＮＡ導入を媒介するトランス作用性因子を含む。このプラスミドは、多くの場合、当該技術分野で理解されているように、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染、及び境界配列での切断によるＤＮＡの導入、及びウイルス媒介性ＤＮＡ導入を可能にする病原性機能（Ｖｉｒ遺伝子）を含む（Ｈｅｌｌｅｎｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５：４４６－４５１）。いくつかの種類のアグロバクテリウム株（例えば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を植物の形質転換に使用することができる。第２のプラスミドベクターは、他の方法（例えば、マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール）によって植物を形質転換するのに必要ではない。

【0627】

一般に、植物形質転換方法は、異種ＤＮＡを標的植物細胞（例えば、未熟又は成熟胚、浮遊培養物、未分化カルス、プロトプラストなど）に導入し、続いて、（選択マーカー遺伝子に応じて）適切に選択された最大閾値レベルを適用して、形質転換された植物細胞を未形質転換細胞集団の群から回収することを含む。外植片は、通常、新鮮に供給される同じ培地に移され、いつものように培養される。続いて、形質転換された細胞を、最大閾値レベルの選択剤を補充した再生培地上に置いた後、苗条に分化させる。次いで、苗条は、根付いた苗条又は小植物を回収するための選択発根培地に移される。次いで、トランスジェニック小植物は、成熟植物に成長し、稔性種子を産生する（例えば、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１－２８２、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５－７５０）。外植片は、通常、新鮮に供給される同じ培地に移され、いつものように培養される。トランスジェニック植物を生成するための技術及び方法の一般的な記載は、Ａｙｒｅｓ ａｎｄ Ｐａｒｋ（１９９４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３：２１９－２３９、及びＢｏｍｍｉｎｅｎｉ ａｎｄ Ｊａｕｈａｒ（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ ４２：１０７－１２０に見出される。形質転換された材料は多くの細胞を含むため、形質転換細胞及び非形質転換細胞の両方が、対象となる標的カルス、組織、又は細胞群の任意の部分に存在する。非形質転換細胞を死滅させ、形質転換細胞の増殖を可能にする能力により、形質転換された植物培養物がもたらされる。多くの場合、形質転換された植物細胞を迅速に回収し、トランスジェニック植物の生成を成功させるには、非形質転換細胞を除去する能力が制約となる。

【0628】

形質転換プロトコル、並びにヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換の標的となる植物又は植物細胞の種類（すなわち、単子葉植物又は双子葉植物）に応じて異なる場合がある。トランスジェニック植物の生成は、これらに限定されないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接遺伝子導入、アグロバクテリウムによる植物細胞への異種ＤＮＡの導入（アグロバクテリウム媒介性形質転換）、粒子に付着させた異種外来ＤＮＡによる植物細胞の衝撃、弾道粒子加速、エアロゾルビーム形質転換、Ｌｅｃ１形質転換、及びＤＮＡを導入するための様々な他の非粒子直接媒介性方法を含むいくつかの方法のうちの１つによって行われ得る。例示的な形質転換プロトコルは、米国出願公開第２００１／００２６９４１号、米国特許第４，９４５，０５０号、国際公開第９１／００９１５号、及び米国出願公開第２００２／０１５０６６号に開示されている（それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。

【0629】

葉緑体はまた、容易に形質転換され得、葉緑体の形質転換に関する方法が、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６－８５３０、Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３－９１７、Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１－６０６を参照されたい（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。葉緑体形質転換の方法は、選択マーカーを含むＤＮＡの粒子銃送達及び相同組換えによるプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。加えて、プラスチド形質転換は、核コード及びプラスチド指向性ＲＮＡポリメラーゼの組織特異的発現によるサイレントプラスチド媒介性導入遺伝子のトランス活性化によって達成され得る。かかるシステムは、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１－７３０５に報告されている。

【0630】

異種外来ＤＮＡを植物細胞に組み込んだ後、当業者は次いで、培地中に最大閾値レベルの適切な選択化学物質／試薬（例えば、抗生物質）を適用し、非形質転換細胞を死滅させ、当該生存細胞を定期的に新鮮な培地に移すことによって、この選択処理から生き残る推定上の形質転換細胞を分離し、増殖させることができる。連続的な継代及び適切な選択による負荷によって、当業者は、プラスミドベクターで形質転換された細胞を特定し、増殖させる。次いで、分子及び生化学的方法を使用して、トランスジェニック植物のゲノムに組み込まれた目的の異種遺伝子の存在を確認することができる。

【0631】

形質転換された細胞を、当業者に既知の従来の方法に従って、植物へと成長させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１－８４を参照されたい（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。次いで、これらの植物を成長させ、同じ形質転換株又は異なる株のいずれかで受粉させ、得られたハイブリッドは、特定された所望の表現型特徴の構成的発現を有する。２世代以上を増殖させて、所望の表現型特徴の発現が安定に維持され、遺伝することを確実にし、次いで、所望の表現型特徴の発現が確実に達成されるように種子を採取することができる。このようにして、本開示は、本発明のヌクレオチド構築物（例えば、それらのゲノムに安定して組み込まれた本発明の発現カセット）を有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。

【0632】

様々な実施形態では、本開示は、上記のように、昆虫プロテアーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ（本明細書では「プロテアーゼ」と総称する）の基質として作用する、ＤＶＰ－殺虫タンパク質を提供する。

【0633】

一部の実施形態では、ＤＶＰの発現を受容し得るトランスジェニック植物若しくはその部分には、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ、カボチャ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ豆、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、台木、ライムギ、ベニバナ、灌木、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウスイートガム、サツマイモ、スイッチグラス、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、コムギ植物が含まれ得る。

【0634】

一部の実施形態では、トランスジェニック植物は、本明細書に記載のＤＮＡ構築物で最初に形質転換された細胞から成長し得る。他の実施形態では、トランスジェニック植物は、特定の組織又は植物部分、例えば、葉、茎、花、萼片、果実、根、若しくは種子、又はそれらの組み合わせにおいて、コードされたＤＶＰを発現し得る。

【0635】

一部の実施形態では、植物、植物組織、植物細胞、又は植物種子を、ＤＶＰで形質転換することができ、ＤＶＰは、本発明のＤＶＰのいずれかのアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載の１つ以上のＤＶＰ）、又はそれをコードするポリヌクレオチドを有する。

【0636】

一部の実施形態では、植物、植物組織、植物細胞、又は植物種子を、配列番号１８７～１９１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ配列を有するＤＶＰで形質転換し得る。

【0637】

一部の実施形態では、植物、植物組織、植物細胞、又は植物種子を、ＤＶＰで形質転換することができ、ＤＶＰは、２つ以上のＤＶＰポリペプチドのホモポリマー又はヘテロポリマーであり、各ＤＶＰのアミノ酸配列は、同じあるか、又は異なるか、又は同じをコードするポリヌクレオチドである。

【0638】

物へのポリヌクレオチド組み込み、そこから発現されるタンパク質
トランスジェニック植物における異種ポリペプチドの発現に関する課題は、宿主生物における発現時に導入されたポリペプチドの所望の効果（例えば、殺虫活性）を維持することである。かかる効果を維持する１つの方法は、動作可能に連結された小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）の使用を通して、適切なタンパク質折り畳みの可能性を高めることである。トランスジェニックタンパク質の効果を維持する別の方法は、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）を組み込むことである。

【0639】

植物を、上記のトランスフェクション方法のいずれかを使用して、ＤＶＰ又は１つ以上のＤＶＰを含むＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするＤＮＡ配列で一過性又は安定的にトランスフェクトし得る。代替的に、植物を、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトし得、当該ＤＶＰは、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、リンカー、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）、又はそれらの組み合わせをコードするように動作可能なポリヌクレオチドに動作可能に連結され得る。例えば、一部の実施形態では、トランスジェニック植物又は植物ゲノムを、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、ＤＶＰ、及び／又は介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ、Ｌ）をコードするポリヌクレオチド配列でトランスフェクトし得、したがって、異種ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡが形質転換植物で発現され、続いて、当該ｍＲＮＡがペプチドに翻訳される。

【0640】

胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）
組換えタンパク質のＥＲへの細胞内標的化は、当該組換えタンパク質に動作可能に連結されたＥＲＳＰの使用を通して達成することができ、これにより、かかるタンパク質の正しいアセンブリ及び／又は折り畳み、並びに植物におけるこれらの組換えタンパク質の高レベルの蓄積を可能にする。宿主タンパク質の細胞内貯蔵への区画化に関する例示的な方法は、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（２）：７０３－７０８，１９９９、Ｓｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３３３－３３８，２０００、Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１－１０９，１９９８、及び Ｓｔｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：５８３－５９０，２０００に記載されている（それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。したがって、組換えタンパク質の正しいアセンブリ及び／又は折り畳みを達成する１つの方法は、目的の組換えタンパク質に小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）を動作可能に連結することである。

【0641】

一部の実施形態では、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）を含むペプチドは、ＤＶＰに動作可能に連結され得（ＥＲＳＰ－ＤＶＰと称される）、当該ＥＲＳＰは、当該ペプチドのＮ末端である。一部の実施形態では、ＥＲＳＰペプチドは、長さが３～６０個のアミノ酸、長さが５～５０個のアミノ酸、長さが２０～３０個のアミノ酸である。

【0642】

一部の実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦは、その５’末端のｅｒｓｐから始まる。ＤＶＰが、トランスジェニック植物から発現される場合、適切に折り畳まれ、機能するためには、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドとインフレームで融合されたｅｒｓｐヌクレオチドを有する必要がある。細胞翻訳プロセス中、翻訳されたＥＲＳＰは、シグナル認識粒子と呼ばれる細胞成分と結合することによって、翻訳されているＤＶＰを植物細胞の小胞体膜（ＥＲ）に挿入するように指示することができる。ＥＲ内で、ＥＲＳＰペプチドは、シグナルペプチダーゼによって切断され、ＤＶＰは、ＥＲに放出され、ＤＶＰが、翻訳後修飾プロセス（例えば、ジスルフィド結合の形成）中に適切に折り畳まれる。追加の保持タンパク質シグナルなしで、タンパク質は、ＥＲを介してゴルジ装置に輸送され、そこで最終的には、形質膜の外側に、アポプラスト空間に分泌される。ＤＶＰは、アポプラスト空間に効率的に蓄積して、植物における殺虫用量に到達することができる。

【0643】

ＥＲＳＰペプチドは、植物翻訳ＤＶＰ複合体のＮ末端領域にあり、ＥＲＳＰ部分は、約３～６０個のアミノ酸で構成される。一部の実施形態では、それは、５～５０個のアミノ酸である。一部の実施形態では、それは、１０～４０個のアミノ酸であるが、ほとんどの場合、１５～２０、２０～２５、又は２５～３０個のアミノ酸で構成される。ＥＲＳＰは、これがタンパク質の輸送を指示することから、いわゆるシグナルペプチドである。シグナルペプチドはまた、標的化シグナル、シグナル配列、輸送ペプチド、又は局在化シグナルとも呼ばれることがある。ＥＲ輸送のためのシグナルペプチドは、多くの場合、１５～３０個のアミノ酸残基長であり、正に荷電したアミノ末端、それに隣接する疎水性残基のコア、及び極性であるが無荷電のカルボキシ末端領域からなる三者構成を有する。（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ＥＲ ｍｅｍｂｒａｎｅ，”Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２０１１，１８０８：９１２－９２４）。

【0644】

多くのＥＲＳＰが知られている。ＥＲＳＰは、植物ＥＲＳＰに由来するものである必要はなく、非植物ＥＲＳＰが、本明細書に記載される手順で機能する。しかしながら、多くの植物ＥＲＳＰがよく知られており、ここでは、いくつかの植物由来ＥＲＳＰについて記載する。例えば、一部の実施形態では、ＥＲＳＰは、オオムギアルファアミラーゼシグナルペプチド（ＢＡＡＳ）であり得、これは、植物Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅに由来し、以下のようなアミノ酸配列を有する：「ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧ」（配列番号６０）。

【0645】

植物ＥＲＳＰは、植物のアポプラスト空間に発現及び放出されることが既知のタンパク質のゲノム配列から選択され、これには、ＢＡＡＳ、ニンジンエクステンシン、及びタバコＰＲ１などの例が含まれる。以下の参考文献は、更なる記載を提供する（参照によりその全体が本明細書に援用される）。Ｄｅ Ｌｏｏｓｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｌｌｏｗｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ”Ｇｅｎｅ，９９（１９９１）９５－１００（Ｄｅ Ｌｏｏｓｅ，Ｍ．らは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａからのエクステンションコード遺伝子の構造解析を記載し、その配列は、タンパク質の小胞体への移行のための典型的なシグナルペプチドを含む）、Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．“Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ａｌｐｈａ－ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｃａｒｇｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｐｌａｓｔｉｄｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ”Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４ Ｊｕｌ；１３５（３）：１３６７－７７．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊｕｌ ２．（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．らは、トランスジェニックタバコにおいて、シグナルペプチドの有無でα－アミラーゼの発現を分析することによって、植物細胞におけるα－アミラーゼの細胞内局在を研究した）。これらの参考文献及び他の文献は、本明細書に記載の方法、手順、並びにペプチド、タンパク質、及びヌクレオチド複合体、及び構築物において使用され得るシグナルペプチドを教示及び開示する。

【0646】

一部の実施形態では、ＥＲＳＰは、以下、ＢＡＡＳ、タバコエクステンシンシグナルペプチド、修飾タバコエクステンシンシグナルペプチド、又はＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ由来のＪｕｎ ａ ３シグナルペプチドのうちの１つを含むことができるが、これらに限定されない。例えば、一部の実施形態では、植物は、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）及び／又はＤＶＰとして本明細書に記載されるペプチドのうちのいずれかをコードするヌクレオチドで形質転換され得る。

【0647】

タバコエクステンシンシグナルペプチドモチーフは、別の例示的な種類のＥＲＳＰである。Ｍｅｍｅｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ，ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９３，Ｖ４：１０１１－１０２２、Ｐｏｇｕｅ ＧＰ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１０，Ｖ８：６３８－６５４を参照されたい（これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。

【0648】

一部の実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦは、タバコエクステンシンのシグナルペプチドモチーフをコードするように動作可能なヌクレオチド配列を有し得る。一実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦは、配列番号６１によるエクステンシンモチーフをコードし得る。別の実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦは、配列番号６２に記載のエクステンシンモチーフをコードし得る。

【0649】

エクステンシンのシグナルモチーフを有する実施形態を生成する方法の例示的な実施例は、以下のとおりである。エクステンシンモチーフをコードするＤＮＡ配列は、４つの合成ＤＮＡプライマーを有するオリゴ伸長ＰＣＲを使用して設計され（例えば、配列番号６３又は配列番号６４に示されるＤＮＡ配列）、制限部位（例えば、５’末端のＰａｃ Ｉ制限部位、及び３’末端のＧＦＰ配列の５’末端）の末端部位は、鋳型として機能するエクステンシンＤＮＡ配列を用いたＰＣＲにより付加され、断片が得られ、断片は、フォワードＰＣＲプライマーとして使用され、ＤＶＰ ＯＲＦ（例えば、ｐＦＥＣＴベクターに含まれる「ｇｆｐ－ｌ－ｄｖｐ」）をコードするＤＮＡ配列を増幅し、したがって、ＥＲＳＰがエクステンシンである「ＥＲＳＰ－ＧＦＰ－Ｌ－ＤＶＰ」をコードする（Ｎ’端末からＣ’端末へ）ＤＶＰ ＯＲＦを産生する。次いで、得られたＤＮＡ配列を、ＦＥＣＴベクターのＰａｃ Ｉ及びＡｖｒ ＩＩ制限部位にクローニングして、ＧＦＰ融合ＤＶＰの一過性植物発現のためのｐＦＥＣＴ－ＤＶＰベクターを生成することができる。

【0650】

一部の実施形態では、例示的な発現システムは、ＤＶＰ ＯＲＦを含むＦＥＣＴ発現ベクターを、アグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換し、形質転換されたＧＶ３１０１を、ＤＶＰ ＯＲＦの一過性発現のためにタバコ葉に注射することを含み得る。

【0651】

翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）
翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）は、植物組織において、ＤＶＰの量を増加させることができる。ＤＶＰ ＯＲＦのうちの１つであるＥＲＳＰ－ＤＶＰは、トランスフェクトされた植物において適切に折り畳まれたＤＶＰを発現するのに十分であるが、一部の実施形態では、害虫の被害から植物を効果的に保護するには、植物で発現されたＤＶＰが蓄積することが必要であり得る。適切に構築されたＤＶＰ ＯＲＦのトランスフェクションにより、トランスジェニック植物は、より多くの量の正しく折り畳まれたＤＶＰを発現及び蓄積することができる。植物がより多くの量の適切に折り畳まれたＤＶＰを蓄積するとき、植物は、植物を攻撃及び摂食する害虫に対して、より容易に抵抗、阻害、及び／又は殺傷することができる。トランスジェニック組織におけるポリペプチドの蓄積を増加させる１つの方法は、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）の使用によるものである。翻訳安定化タンパク質を使用して、植物組織中のＤＶＰの蓄積を有意に増加させ、したがって、害虫耐性に関してＤＶＰでトランスフェクトされた植物の有効性を増加させることができる。翻訳安定化タンパク質は、タンパク質分解の細胞プロセスによって標的化されることなく、細胞内に蓄積することができる十分な三次構造を有するタンパク質である。

【0652】

一部の実施形態では、翻訳安定化タンパク質は、別のタンパク質のドメインであり得るか、又はタンパク質配列全体を含み得る。一部の実施形態では、翻訳安定化タンパク質は、５～５０個のアミノ酸、５０～２５０個のアミノ酸（例えば、ＧＮＡ）、２５０～７５０個のアミノ酸（例えば、キチナーゼ）、及び７５０～１５００個のアミノ酸（例えば、エンハンシン）であり得る。

【0653】

翻訳安定化タンパク質の一実施形態は、少なくとも１つのＤＶＰを含む融合タンパク質のポリマーであり得る。翻訳安定化タンパク質の使用を例示するために、翻訳安定化タンパク質の具体的な例が本明細書に提供される。この例は、本開示又は特許請求の範囲を限定することを何ら意図するものではない。有用な翻訳安定化タンパク質は当該技術分野において周知であり、この種類の任意のタンパク質を本明細書に開示されるように使用することができる。ペプチドの産生を評価及び試験するための手順は、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される。１つの翻訳安定化タンパク質の一例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号５７；ＮＣＢＩ受託番号Ｐ４２２１２．１）である。

【0654】

一部の実施形態では、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）を含むタンパク質は、ＤＶＰに動作可能に連結され得、これが次に、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）に動作可能に連結され得る。ここで、この構成は、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－ＤＶＰ又はＥＲＳＰ－ＤＶＰ－ＳＴＡと称され、当該ＥＲＳＰは、当該タンパク質のＮ末端であり、当該ＳＴＡは、ＤＶＰのＮ末端側（上流）又はＤＶＰのＣ末端側（下流）のいずれかにあり得る。一部の実施形態では、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－ＤＶＰ又はＥＲＳＰ－ＤＶＰ－ＳＴＡと称されるタンパク質は、本明細書に記載のＥＲＳＰ又はＤＶＰのうちのいずれかを含み、ＳＴＡに動作可能に連結され得、ＳＴＡは、例えば、本文書に記載又は教示される翻訳安定化タンパク質のうちのいずれかであり、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質、配列番号５７、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ４２２１２）、又はＪｕｎ ａ ３（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ、配列番号５９、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ８１２９５．１）が含まれる。

【0655】

翻訳安定化タンパク質の更なる例は、以下の参考文献に見出すことができる（それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）：Ｋｒａｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ａｎｄ ｇｕｔ ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ ｏｆ Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ”Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９３，ｐｐ．６９１－７０１．（Ｋｒａｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．らは、タバコスズメガＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａからキチナーゼをコードするｃＤＮＡを単離し、配列決定した）、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．“Ｌｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（１９９１），７２，２６４５－２６５１．これらの参考文献及び他の文献は、本明細書に記載の方法、手順、並びにペプチド、タンパク質、及びヌクレオチド複合体、及び構築物において使用され得る翻訳安定化タンパク質を教示及び開示する。

【0656】

一部の実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦは、ＳＴＡを含有するＤＶＰ ＯＲＦを使用して、植物、例えば、タバコ植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに形質転換され得る。例えば、一部の実施形態では、ＳＴＡは、Ｊｕｎ ａ ３であり得る。成熟Ｊｕｎ ａ ３は、約３０ｋＤａの植物防御タンパク質であり、一部の人々に対してアレルゲンでもある。Ｊｕｎ ａ ３は、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ樹によって産生され、一部の実施形態では、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）として使用され得る。一部の実施形態では、Ｊｕｎ ａ ３のアミノ酸配列は、配列番号６５に示される配列であり得る。他の実施形態では、Ｊｕｎ ａ ３アミノ酸配列は、配列番号５９に示される配列であり得る。

【0657】

リンカー
リンカータンパク質は、ＤＶＰ ＯＲＦを構成する異なるモチーフの適切な折り畳みを補助する。本発明に記載のＤＶＰ ＯＲＦはまた、ＤＶＰ（ｄｖｐ）をコードするポリヌクレオチド配列と翻訳安定化タンパク質（ｓｔａ）をコードするポリヌクレオチド配列との間、又は発現ＯＲＦが複数のＤＶＰドメイン発現を含む場合、ＤＶＰをコードする複数のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列の間、すなわち、（ｌ－ｄｖｐ）_Ｎ若しくは（ｄｖｐ－ｌ）_Ｎに介在リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を組み込む。介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲＳ又はＬ）は、発現したＤＶＰ構築物の異なる部分を分離し、発現プロセス中の複合体の異なる部分の適切な折り畳みを助ける。発現されたＤＶＰ構築物において、異なる機能性ドメインを分離するために、異なる介在リンカーペプチドが関与し得る。一部の実施形態では、ＬＩＮＫＥＲは、ＤＶＰに結合され、この二価基は、保護される植物において、適切に折り畳まれたＤＶＰの蓄積を促進するために、最大１０回（Ｎ＝１～１０）、場合によっては１０回超（例えば、Ｎ＝２００）繰り返すことができる。

【0658】

一部の実施形態では、介在リンカーペプチドは、１～３０アミノ酸長であり得る。しかしながら、必ずしも植物で発現されたＤＶＰに必須な成分ではない。

【0659】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、切断可能ペプチドに動作可能に連結された少なくとも１つのＤＶＰを含む。他の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、切断不能ペプチドに動作可能に連結された少なくとも１つのＤＶＰを含む。

【0660】

切断可能なリンカーペプチドを、ＤＶＰ ＯＲＦに設計して、形質転換された植物で発現されたＤＶＰ複合体から適切なＤＶＰが放出され、害虫の被害に関してＤＶＰが植物に与える保護を改善することができる。ある種類の介在リンカーペプチドは、植物切断可能リンカーペプチドである。この種類のリンカーペプチドは、植物の翻訳後修飾中に発現されたＤＶＰ ＯＲＦ複合体から完全に除去することができる。したがって、一部の実施形態では、この種類の介在リンカーペプチドによって連結された適切に折り畳まれたＤＶＰは、植物において翻訳後修飾中に発現されたＤＶＰ ＯＲＦ複合体から、植物細胞に放出され得る。

【0661】

別の種類の切断可能な介在リンカーペプチドは、植物において発現プロセス中に切断可能ではない。しかしながら、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、又は金属プロテアーゼに特異的なプロテアーゼ切断部位を有する。切断可能なリンカーペプチドの種類は、昆虫及びＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎの腸内環境並びに／又は昆虫及びＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎの血リンパ環境で見出されるプロテアーゼによって消化されて、昆虫の腸内又は血リンパ中にＤＶＰを放出することができる。本開示によって教示される情報を使用して、本発明で有用であろうＬＩＮＫＥＲの他の例を作製又は見出すことは、当業者にとって日常的なことであるはずである。

【0662】

一部の実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦは、「ＩＧＥＲ」（配列番号５４）のアミノ酸コードを有する、切断可能な種類の介在リンカー（例えば、配列番号５４に列挙されるもの）を含むことができる。この介在リンカー又はＬＩＮＫＥＲの分子量は、４７３．５３ダルトンである。他の実施形態では、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）は、任意の種類のプロテアーゼ切断部位、すなわち、切断不能な介在リンカーペプチド、例えば、リンカー「ＥＴＭＦＫＨＧＬ」（配列番号５６）を含まないものであってもよい。

【0663】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、２つ以上の切断可能なペプチドを有することができ、殺虫タンパク質は、昆虫切断可能リンカー（Ｌ）を含み、昆虫切断可能リンカーが、（ＤＶＰ－Ｌ）_ｎ（式中、「ｎ」は、１～２００、又は１～１００、又は１～１０の範囲の整数である）を含む構築物とインフレームで融合される。別の実施形態では、本明細書に記載されるＤＶＰ－殺虫タンパク質は、昆虫切断可能リンカー（Ｌ）及び／又はリピート構築物（Ｌ－ＤＶＰ）_ｎ若しくは（ＤＶＰ－Ｌ）_ｎ（式中、「ｎ」は、１～２００、又は１～１００、又は１～１０の範囲の整数である）と動作可能に連結されているＤＶＰと動作可能に連結された小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）を含む。

【0664】

一部の実施形態では、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）を含むタンパク質は、ＤＶＰ及び介在リンカーペプチド（Ｌ又はリンカー）に動作可能に連結され得る（かかる構築物は、ＥＲＳＰ－Ｌ－ＤＶＰ又はＥＲＳＰ－ＤＶＰ－Ｌと称される）。ここで、当該ＥＲＳＰは、当該タンパク質のＮ末端であり、当該Ｌ又はリンカーは、ＤＶＰのＮ末端側（上流）又はＤＶＰのＣ末端側（下流）のいずれかにあり得る。本明細書に記載のＥＲＳＰ又はＤＶＰのうちのいずれかを含む、ＥＲＳＰ－Ｌ－ＤＶＰ、又はＥＲＳＰ－ＤＶＰ－Ｌと称されるタンパク質は、切断不能リンカーペプチド又は切断可能リンカーペプチドであり得るリンカー「Ｌ」を有し得、これはタンパク質発現プロセス中に植物細胞内で切断可能であり得るか、又は昆虫腸内環境及び／若しくは血リンパ環境で切断可能であり得る。

【0665】

一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、本明細書に記載される、又は本明細書によって教示される介在リンカーペプチド（リンカー又はＬ）のいずれかを含むことができ、これには以下の配列が含まれるが、これらに限定されない：ＩＧＥＲ（配列番号５４）、ＥＥＫＫＮ（配列番号５５）、及びＥＴＭＦＫＨＧＬ（配列番号５６）、又はそれらの組み合わせ。

【0666】

様々な実施形態では、例示的な殺虫タンパク質は、（ＥＲＳＰ）－（ＤＶＰ－Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）－（Ｌ）－（ＤＶＰ－Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）－（Ｌ－ＤＶＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）－（Ｌ－ＤＶＰ）_ｎ－（Ｌ）である（式中、「ｎ」は、１～２００、又は１～１００、又は１～１０の範囲の整数である）。上述の様々な関連する実施形態では、ＤＶＰは、前述のミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリペプチドであり、Ｌは、切断不能又は切断可能ペプチドであり、ｎは、１～２００の範囲の整数、好ましくは、１～１００の範囲の整数、より好ましくは、１～１０の範囲の整数である。一部の実施形態では、ＤＶＰ－殺虫タンパク質は、同じか、又は異なるＤＶＰペプチド、及び同じか、又は異なる昆虫切断可能ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、Ｃ末端ＤＶＰは、昆虫腸管環境において切断されるように動作可能である切断可能ペプチドと、そのＣ末端で動作可能に連結されている。一部の実施形態では、Ｎ末端ＤＶＰは、昆虫腸管環境において切断されるように動作可能である切断可能ペプチドと、そのＮ末端で動作可能に連結されている。

【0667】

昆虫腸内環境で見出される利用可能なプロテアーゼ及びペプチダーゼのうちのいくつかは、これらの酵素がしばしば空間的及び時間的に発現されるため、昆虫の生活環に依存する。昆虫の消化器系は、消化管及びそれに関連する腺で構成される。食物が口に入り、分泌物と混合される（消化プロテアーゼ及びペプチダーゼが含まれる場合と含まれない場合がある）。前腸及び後腸は、外胚葉起源である。前腸は、概して、生食（ｒａｗ ｆｏｏｄ）の貯蔵庫としての役割を果たす。前腸からは、食物の個別のボーラスが中腸（ｍｉｄｇｕｔ）（中腸（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｎ）又は胃）に入る。中腸は、食物栄養素の消化及び吸収の部位である。概して、中腸における特定のプロテアーゼ及びペプチダーゼの存在は、腸のｐＨに従う。ヒトの胃腸系における特定のプロテアーゼ及びペプチダーゼには、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、及びジペプチダーゼが含まれ得る。

【0668】

昆虫の腸内環境は、ペプチド及びタンパク質が消化中に分解される草食動物種における消化器系の領域を含む。昆虫の腸内環境で見出される利用可能なプロテアーゼ及びペプチダーゼのうちのいくつかは、以下を含み得る：（１）セリンプロテアーゼ、（２）システインプロテアーゼ、（３）アスパラギン酸プロテアーゼ、及び（４）メタロプロテアーゼ。

【0669】

植物食性昆虫の消化器系における２つの主なプロテアーゼのクラスは、セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼである。Ｍｕｒｄｏｃｋら（１９８７）は、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａに属する様々な害虫の中腸酵素の詳細な研究を行った。Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら（２００８）は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａに属する様々な害虫の中腸酵素に関して報告している。セリンプロテアーゼは、幼虫の腸内環境を支配し、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａにおいて、総消化活性の約９５％に寄与するが、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ種では、システインプロテアーゼを含むより広範囲の主な腸内プロテアーゼを有することが知られている。

【0670】

パパインファミリーは、多種多様な活性を有するペプチダーゼを含み、広い特異性を有するエンドペプチダーゼ（例えば、パパイン）、非常に狭い特異性を有するエンドペプチダーゼ（例えば、グリシルエンドペプチダーゼ）、アミノペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、並びにエンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼの両方の活性を有するペプチダーゼ（例えば、カテプシンＢ及びＨ）が含まれる。様々な昆虫の中腸に見出される他の例示的なプロテアーゼとしては、トリプシン様酵素、例えば、トリプシン及びキモトリプシン、ペプシン、カルボキシペプチダーゼ－Ｂ及びアミノトリペプチダーゼが挙げられる。

【0671】

セリンプロテアーゼは、ほぼ全ての動物及び微生物に広く分布している（Ｊｏａｎｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。高等生物では、２％近くの遺伝子がこれらの酵素をコードしている（Ｂａｒｒｅｔｔｅ－Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。セリンプロテアーゼは、宿主生物の維持及び生存に本質的に不可欠であり、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。セリンプロテアーゼは、従来、それらの基質特異性によって、特に、Ｐ１の残基が：トリプシン様（Ｐ１で好ましくはＬｙｓ／Ａｒｇ）、キモトリプシン様（Ｐ１でＰｈｅ／Ｔｙｒ／Ｌｅｕなどの大きな疎水性残基）、又はエラスターゼ様（Ｐ１でＡｌａ／Ｖａｌなどの小さな疎水性残基）であるかによって（Ｔｙｎｄａｌｌ ｅｔ．ａｌ．，２００５による改訂）、分類されている。セリンプロテアーゼは、タンパク質分解酵素の１つのクラスであり、その中心的な触媒機構が、３つの不変残基、アスパラギン酸、ヒスチジン、及び特有の反応性セリン（後に「触媒三残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）」という名前が生まれた）で構成される。Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ三残基は、少なくとも４つの異なる構造的文脈で見出すことができる（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，２００２）。これら４つのクランのセリンプロテアーゼは、キモトリプシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼＹ、及びＣｌｐプロテアーゼに代表される。キモトリプシン様クランの３つのセリンプロテアーゼは、キモトリプシン、トリプシン、及びエラスターゼであり、最も詳細に研究されている。より最近では、Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｇｌｕ、Ｓｅｒ－Ｌｙｓ／Ｈｉｓ、Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ、及びＮ末端Ｓｅｒを含む、消化におけるそれらの役割に対して、新規の触媒三残基及び二残基を有するセリンプロテアーゼが発見されている。

【0672】

昆虫の腸内環境で見出される、よく研究された消化酵素のクラスの１つは、システインプロテアーゼのクラスである。「システインプロテアーゼ」という用語は、酵素の触媒部位にシステイン残基の高反応性チオール基を有するプロテアーゼを記載することが意図される。多くの植物食性昆虫及び植物寄生線虫が、少なくとも一部、タンパク質消化のために中腸システインプロテアーゼに依存しているという証拠がある。これらには、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、特に、スカッシュバグ（ｓｑｕａｓｈ ｂｕｇ）（Ａｎａｓａ ｔｒｉｓｔｉｓ）、グリーンスティンクバグ（ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、Ｒｉｐｔｏｒｔｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ、及びこれまでに調べられたほぼ全てのＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ、特に、コロラドポテトビートル（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅａｅｍｌｉｎｅａｔａ）、スリーラインドポテトビートル（ｔｈｒｅｅ－ｌｉｎｅｄ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｌｅｍａ ｔｒｉｌｉｎｅａｔａ）、アスパラガスビートル（ａｓｐａｒａｇｕｓ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｃｒｉｏｃｅｒｉｓ ａｓｐａｒａｇｉ）、メキシカンビーンビートル（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）、レッドフラワービートル（ｒｅｄ ｆｌｏｕｒ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｔｒｉｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）、コンフーズドフラワービートル（ｃｏｎｆｕｓｅｄ ｆｌｏｕｒ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃｏｎｆｕｓｕｍ）、フリービートル（ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｓｐｐ．、Ｈａｌｔｉｃａ ｓｐｐ．、及びＥｐｉｔｒｉｘ ｓｐｐ．）、コーンルートワーム（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ Ｓｐｐ．）、カウピーウィービル（ｃｏｗｐｅａ ｗｅｅｖｉｌ）（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ａｃｕｌａｔｕｅ）、ボールウィービル（ｂｏｌｌ ｗｅｅｖｉｌ）（Ａｎｔｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ライスウィービル（ｒｉｃｅ ｗｅｅｖｉｌ）（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａ）、メイズウィービル（ｍａｉｚｅ ｗｅｅｖｉｌ）（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｚｅａｍａｉｓ）、グレイニイウィービル（ｇｒａｎａｒｙ ｗｅｅｖｉｌ）（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｕｓ）、エジプシャンアルファルファウィービル（Ｅｇｙｐｔｉａｎ ａｌｆａｌｆａ ｗｅｅｖｉｌ）（Ｈｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ）、ビーンウィービル（ｂｅａｎ ｗｅｅｖｉｌ）（Ａｃａｎｔｈｏｓｅｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、レッサーグレインボーア（ｌｅｓｓｅｒ ｇｒａｉｎ ｂｏｒｅｒ）（Ｒｈｙｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ）、イエローミールワーム（ｙｅｌｌｏｗ ｍｅａｌ ｗｏｒｍ）（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ）、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、特に、ウエスタンフラワートリプ（ｗｅｓｔｅｒｎ ｆｌｏｗｅｒ ｔｈｒｉｐ）（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉ ｅｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、Ｄｉｐｔｅｒａ、特に、ｌｅａｆｍｉｎｅｒ ｓｐｐ．（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、植物寄生性線虫、特に、ポテトシスト線虫（ｐｏｔａｔｏ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）、ビートシスト線虫（ｂｅｅｔ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）、及びルートノット線虫（ｒｏｏｔ ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）が含まれるが、これらに限定されない。

【0673】

消化酵素の別のクラスは、アスパラギン酸プロテアーゼである。「アスパラギン酸プロテアーゼ」という用語は、酵素の触媒部位に２つの反応性の高いアスパラギン酸残基を保有し、ほとんどの場合、ペプスタチン（ほぼ全ての既知のアスパラギン酸プロテアーゼの低分子量阻害剤）によるその特異的阻害を特徴とするプロテアーゼを記載することを意図している。多くの植物食性昆虫は、タンパク質消化のために、部分的には中腸のアスパラギン酸プロテアーゼに依存しているという証拠がある（ほとんどの場合、システインプロテアーゼとともに）。これらには、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、特に、（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ）、及びトコジラミ（ｂｅｄｂｕｇ）（Ｃｉｍｅｘ ｓｐｐ．）、及びＰｈｙｍａｔｉｄａｅ、Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ、Ｌｙｇａｅｉｄａｅ、及びＢｅｌｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ科のメンバー、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ（Ｍｅｌｏｉｄａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ、Ｃｏｃｃｉｎｅｌｉｄａｅ、及びＢｒｕｃｈｉｄａｅの科で、全てＣｕｃｕｊｉｆｏｒｍｉａシリーズに属する）、特に、コロラドポテトビートル（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）、スリーラインドポテトビートル（ｔｈｒｅｅ－ｌｉｎｅｄ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｌｅｍａｔｒｉ ｌｉｎｅａｔａ）、サザン及びウエスタンコーンルートワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ及びＤ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）、ボールウィービル（ｂｏｌｌ ｗｅｅｖｉｌ）（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、スカッシュバグ（ｓｑｕａｓｈ ｂｕｇ）（Ａｎａｓａｔｒｉｓｔｉｓ）、フリービートル（ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａ）、ブルーチッドビートル（ｂｒｕｃｈｉｄ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ）、メキシカンビーンビートル（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）、ソイビーンリーフマイナー（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）（Ｏｄｏｎｔｏｔａ ｈｏｒｎｉ）、マージンドブリスタービートル（ｍａｒｇｉｎｅｄ ｂｌｉｓｔｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｅｐｉｃａｕｔａ ｐｅｓｔｉｆｅｒａ）、及びレッドフラワービートル（ｒｅｄ ｆｌｏｕｒ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｔｒｉｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）、Ｄｉｐｔｅｒａ、特に、イエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）が含まれるが、これらに限定されない。Ｔｅｒｒａ ａｎｄ Ｆｅｒｒｅｉｒａ（１９９４）Ｃｏｍｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９Ｂ：１－６２、Ｗｏｌｆｓｏｎ ａｎｄ Ｍｕｒｄｏｃｋ（１９９０）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．１６：１０８９－１１０２を参照されたい。

【0674】

介在リンカーペプチドの他の例は、参照によりその全体が本明細書に援用される以下の参考文献に見出すことができる：植物で発現されるセリンプロテイナーゼ阻害剤前駆体は、Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｆｒｏｍ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ”Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５；２３０：２５０－２５７において開示される、６つの同じリンカーペプチドによって分離された５つの同種タンパク質インヒビターを含むことが見出された。６つの異なるリンカーによる緑色蛍光タンパク質の折り畳み挙動の比較は、Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．“Ｄｅ ｎｏｖｏ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ＧＦＰ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５ Ｏｃｔ ２１；３５３（２）：３９７－４０９において調査されている。ヒトＧａｌＮＡｃ－ＴｓファミリーのアイソフォームであるＧａｌＮＡｃ－Ｔ２は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ Ｄａｓｋａｌｏｖａ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ Ｌ．ｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０ Ａｕｇ ２４；１０：６２において、発現時に、その局在及び機能が保持されることが示された。内因性プラスチドタンパク質がストロミュールを通って移動する能力は、Ｋｗｏｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．“ＧＦＰ－ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｒｕｂｉｓｃｏ ａｎｄ ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｐｌａｓｔｉｄ ｓｔｒｏｍｕｌｅｓ ａｎｄ ｔｒａｆｆｉｃ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａｓｔｉｄｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，２００４ Ｍａｒ；５５（３９７）：５９５－６０４．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊａｎ ３０に示されている。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ビリオンの表面の操作に関する報告は、蚊のデカペプチドホルモンであるトリプシン調節性卵形性阻害因子（ＴＭＯＦ）を用いて、Ｂｏｒｏｖｓｋｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｅｄｅｓ ｔｒｙｐｓｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｏｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｏｆ ＴＭＶ：Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｌａｒｖｉｃｉｄｅ”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，２００６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １２；１０３（５０）：１８９６３－１８９６８によって作製された。これらの参考文献及び他の文献は、本明細書に記載の方法、手順、並びにペプチド、タンパク質、及びヌクレオチド複合体、及び構築物において使用され得る介在リンカーを教示及び開示する。

【0675】

ＤＶＰ ＯＲＦ及びＤＶＰ構築物
「ＤＶＰ ＯＲＦ」は、ＤＶＰ、及び／又は１つ以上の安定化タンパク質、分泌シグナル、又は標的指向性シグナル、例えば、ＥＲＳＰ又はＳＴＡをコードするヌクレオチドを指し、翻訳される能力を有するＯＲＦのヌクレオチドとして定義される。したがって、「ＤＶＰ ＯＲＦダイアグラム」は、ダイアグラム又は式形式で記載される１つ以上のＤＶＰ ＯＲＦの組成物を指す。例えば、「ＤＶＰ ＯＲＦダイアグラム」は、発現ＯＲＦ内に含まれるＤＮＡセグメントに対する頭文字又は略称を使用して記載され得る。したがって、一実施例では、「ＤＶＰ ＯＲＦダイアグラム」は、それぞれ、ＤＮＡセグメントを、「ｅｒｓｐ」（すなわち、ＥＲＳＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）、「リンカー」又は「Ｌ」（すなわち、ＬＩＮＫＥＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）、「ｓｔａ」（すなわち、ＳＴＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）、及び「ｄｖｐ」（すなわち、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチド配列）として、式形式で図示することによって、ＥＲＳＰ、ＬＩＮＫＥＲ、ＳＴＡ、及びＤＶＰをコードするポリヌクレオチドセグメントを記載し得る。ＤＶＰ ＯＲＦダイアグラムの例は、「ｅｒｓｐ－ｓｔａ－（リンカー_ｉ－ｄｖｐ_ｊ）_Ｎ」、又は「ｅｒｓｐ－（ｄｖｐ_ｊ－リンカー_ｉ）_Ｎ－ｓｔａ」、及び／又はそれらのＤＮＡセグメントの任意の組み合わせである。

【0676】

以下の式は、ＥＲＳＰ、ＳＴＡ、リンカー、及びＤＶＰをコードするＤＶＰ ＯＲＦの２つの例を記載する：
ｅｒｓｐ－ｓｔａ－ｌ－ｄｖｐ又はｅｒｓｐ－ｄｖｐ－ｌ－ｓｔａ

【0677】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＶＰ発現オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ポリヌクレオチド配列であり、植物がｍＲＮＡを発現することを可能にし、それが次に、ペプチドに翻訳され、発現され、適切に折り畳まれ、並びに／又は、当該タンパク質が１つ以上の害虫を阻害及び／若しくは死滅させるのに十分な用量を提供する程度に蓄積されるであろう。一実施形態では、タンパク質ＤＶＰ ＯＲＦの例は、ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチド（ｄｖｐ）をコードするポリヌクレオチド、「ｅｒｓｐ」（すなわち、ＥＲＳＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）、「リンカー」（すなわち、ＬＩＮＫＥＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）、「ｓｔａ」（すなわち、ＳＴＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）、又はこれらの任意の組み合わせであり得、以下の式形式で記載することができる：
ｅｒｓｐ－ｓｔａ－（リンカー_ｉ－ｄｖｐ_ｊ）_ｎ、又はｅｒｓｐ－（ｄｖｐ_ｊ－リンカー_ｉ）_ｎ－ｓｔａ

【0678】

ポリヌクレオチド式の前述の例示的な実施形態は、以下のタンパク質複合体をもたらすであろう：ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－（ＬＩＮＫＥＲ_Ｉ－ＤＶＰ_Ｊ）_Ｎ（４つの可能なペプチド成分が含まれ、各成分がダッシュ符号で区切られている）。ｅｒｓｐのヌクレオチド成分は、植物小胞体輸送シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）をコードするポリヌクレオチドセグメントである。ｓｔａの成分は、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、これは、植物において発現されるＤＶＰの蓄積を助けるが、一部の実施形態では、ｓｔａの包含は、ＤＶＰ ＯＲＦに必要ではない場合がある。リンカー_ｉの成分は、介在リンカーペプチド（Ｌ又はＬＩＮＫＥＲ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、ＯＲＦに含まれる他の成分及び翻訳安定化タンパク質からＤＶＰを分ける。下付き文字「ｉ」は、一部の実施形態では、異なる種類のリンカーペプチドが、ＤＶＰ ＯＲＦに使用され得ることを示す。構成要素「ｄｖｐ」は、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドセグメント（ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチド配列としても知られる）を示す。下付き文字「ｊ」は、異なるミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチドが、ＤＶＰ ＯＲＦに含まれ得ることを示す。例えば、一部の実施形態では、ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチド配列は、アミノ酸置換又はアミノ酸欠失を有するＤＶＰをコードし得る。「（リンカー_ｉ－ｄｖｐ_ｊ）_ｎ」に示される下付き文字「ｎ」は、介在リンカーペプチド及びＤＶＰをコードするヌクレオチドの構造が、同じＤＶＰ ＯＲＦの同じオープンリーディングフレーム内で「ｎ」回繰り返され得ることを示し、「ｎ」は、１～１０の任意の整数であり得、「ｎ」は、１～１０であり得、具体的には、「ｎ」は、１、２、３、４、又は５であり得、一部の実施形態では、「ｎ」は、６、７、８、９、又は１０である。繰り返しは、異なる介在リンカー（ＬＩＮＫＥＲ）及び異なるＤＶＰをコードするポリヌクレオチドセグメントを含有し得る。同じＤＶＰ ＯＲＦ内の繰り返しを含む異なるポリヌクレオチドセグメントは、全て同じ翻訳フレーム内にある。一部の実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦにｓｔａポリヌクレオチドを含めることは必要ではない場合がある。例えば、ｅｒｓｐポリヌクレオチド配列は、リンカーなしでＤＶＰバリアントポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに直接連結され得る。

【0679】

前述の例示的な式において、ポリペプチド「ＤＶＰ」をコードするポリヌクレオチド「ｄｖｐ」は、本明細書に記載される任意のＤＶＰをコードするポリヌクレオチド配列であり得る。

【0680】

前述の例示的な式では、ポリペプチド「ＤＶＰ」をコードするポリヌクレオチド「ｄｖｐ」は、本明細書に記載の任意のＤＶＰ、例えば、配列番号１８７～１９１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＶＰをコードするポリヌクレオチド配列であり得る。

【0681】

前述の方法のうちのいずれか、及び／又は本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して、本明細書に記載のＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質のうちのいずれか１つ以上を発現するように動作可能な１つ以上のポリヌクレオチドを植物又はその植物部分に組み込むことができる。

【0682】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下のＤＶＰ構築物の配向及び／又は配置を有するＤＶＰ－殺虫タンパク質をコードするように動作可能である：ＥＲＳＰ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＤＶＰ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ）_Ｎ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－Ｌ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－Ｌ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－Ｌ－（ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－（ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＤＶＰ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－ＳＴＡ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－Ｌ－ＤＶＰ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－Ｌ－ＳＴＡ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－Ｌ－（ＤＶＰ－ＳＴＡ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－Ｌ－（ＳＴＡ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－Ｌ－（ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＳＴＡ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＤＶＰ－ＳＴＡ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＳＴＡ）_Ｎ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－（Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－Ｌ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－ＤＶＰ－Ｌ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－Ｌ－（ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－Ｌ）_Ｎ－ＤＶＰ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－（Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－Ｌ－ＤＶＰ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－（ＤＶＰ）_Ｎ－Ｌ、ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－（ＤＶＰ－Ｌ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－ＤＶＰ）_Ｎ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＳＴＡ－ＤＶＰ－Ｌ）_Ｎ、ＥＲＳＰ－ＤＶＰ－Ｌ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－ＤＶＰ－ＳＴＡ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ）_Ｎ－ＳＴＡ－Ｌ ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－Ｌ）_Ｎ－ＳＴＡ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－ＳＴＡ）_Ｎ－Ｌ、ＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－Ｌ－ＳＴＡ）_Ｎ、又はＥＲＳＰ－（ＤＶＰ－ＳＴＡ－Ｌ）_Ｎ（式中、Ｎは、１～２００の範囲の整数である）。

【0683】

本開示は、任意の植物種の形質転換に使用され得、単子葉植物及び双子葉植物を含むが、これらに限定されない。トランスジェニックアプローチ又はＰＥＰが特に有用であろう作物としては、アルファルファ、ワタ、トマト、トウモロコシ、コムギ、トウモロコシ、スイートコーン、ルーサン、ダイズ、モロコシ、エンドウ、アマニ、ベニバナ、ナタネ、セイヨウアブラナ、イネ、ダイズ、オオムギ、ヒマワリ、木（針葉樹及び落葉樹を含む）、花（商業的に栽培されるもの、温室で栽培されるものを含む）、ハウチワマメ、スイッチグラス、サトウキビ、ジャガイモ、トマト、タバコ、ジュウジバナ、ピーマン、サトウダイコン、オオムギ、及びセイヨウアブラナ、アブラナ属種、ライムギ、アワ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサヤ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類、カカオ、チャ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、カセイ、パパイア、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観賞植物又は針葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。

【0684】

ポリヌクレオチドによる植物の形質転換
一部の実施形態では、上記及び本明細書に記載のＤＶＰ ＯＲＦ及びＤＶＰ構築物は、ＤＶＰが植物において一過的又は安定的に発現されるように、任意の植物発現ベクターにクローニングされ得る。

【0685】

一過性植物発現システムを使用して、いくつかの成分の必要性、いくつかの成分のコドン最適化、各成分の順序の最適化などを含む、植物におけるいくつかの特定のＤＶＰ発現のためのＤＶＰ ＯＲＦの構造を速やかに最適化することができる。一過性植物発現ベクターは、多くの場合、植物ウイルスゲノムに由来する。植物ウイルスベクターは、植物ウイルスの感染性により、植物における外来遺伝子の発現が迅速かつ高レベルであるという利点を提供する。植物ウイルスゲノムの全長をベクターとして使用することができるが、多くの場合、ウイルス成分（例えば、コートタンパク質）を欠失させ、その場所に、トランスジェニックＯＲＦがサブクローニングされる。かかる部位にＤＶＰ ＯＲＦをサブクローニングして、ウイルスベクターを作製することができる。これらのウイルスベクターは、それ自体が感染性であるため、例えば、植物の創傷、噴霧などを介して、機械的に植物に導入することができる。また、アグロインフェクション、クラウンゴール細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又は毛状根細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＴ－ＤＮＡにウイルスベクターをクローニングすることによって、植物にトランスフェクトすることもできる。このベクターにおけるＤＶＰの発現は、ＲＮＡウイルスの複製によって制御され、複製のためのｍＲＮＡへのウイルスの翻訳は、強力なウイルスプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター）によって制御される。ＤＶＰ ＯＲＦを有するウイルスベクターは、通常、Ｅ．ｃｏｌｉ株及びアグロバクテリウム株の両方でそれ自体を複製することができるバイナリベクターにおいて、Ｔ－ＤＮＡ領域にクローニングされる。植物の一過性トランスフェクションは、ＤＶＰ発現用のウイルスベクターを含むアグロバクテリウム細胞を植物の葉に浸潤させることによって行うことができる。一時的な形質転換植物では、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）により、短期間で外来タンパク質の発現が停止することが一般的である。時に、ＰＴＧＳ抑制タンパク質遺伝子は、ＤＶＰ ＯＲＦとともに、発現を駆動する同じ種類のウイルスベクターで、一過的に、植物に共形質転換される必要がある。これにより、植物におけるＤＶＰの発現が改善され、長続きする。最も一般的に使用されているＰＴＧＳ抑制タンパク質は、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）から発見されたＰ１９タンパク質である。

【0686】

一部の実施形態では、植物の一過性トランスフェクションは、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを、容易に入手可能なベクターのうちのいずれか１つと組換えることによって達成することができ（本明細書上記参照）、マーカー又はシグナルを使用して確認することができる（例えば、ＧＦＰ発光）。一部の実施形態では、一過的にトランスフェクトされた植物は、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを、ベクターのＧＦＰ－ハイブリッド融合タンパク質をコードするＤＮＡと組換え、標的化された発現用に設計された異なるＦＥＣＴベクターを使用して、当該ベクターを植物（例えば、タバコ）にトランスフェクションすることによって作製され得る。一部の実施形態では、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドは、ＡＰＯ蓄積（アポプラスト局在）のためのｐＦＥＣＴベクター、ＣＹＴＯ蓄積（細胞質局在）のためのｐＦＥＣＴベクター、又はＥＲ蓄積（小胞体体局在）のためのｅｒｓｐベクターとともにｐＦＥＣＴベクターを用いて組換えることができる。

【0687】

例示的な一過性植物形質転換戦略は、その高効率性、容易性、及び低コストにより、植物ウイルスベクターを使用したアグロインフェクションである。一部の実施形態では、タバコモザイクウイルス過剰発現システムを使用して、ＤＶＰで植物を一過性に形質転換し得る。ＴＲＢＯ，Ｌｉｎｄｂｏ ＪＡ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖ１４５：１２３２－１２４０を参照されたい（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0688】

ＴＲＢＯ ＤＮＡベクターは、アグロインフェクションのためのＴ－ＤＮＡ領域を有し、これは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含み、ウイルスコーティングタンパク質をコードする遺伝子を用いずに、タバコモザイクウイルスＲＮＡの発現を駆動する。更に、このシステムは、「非武装（ｄｉｓａｒｍｅｄ）」ウイルスゲノムを使用し、したがって、植物から植物へのウイルスの伝播を効果的に防ぐことができる。

【0689】

別の実施形態では、ＦＥＣＴウイルス一過性植物発現システムを使用して、植物をＤＶＰで一過的に形質転換し得る。Ｌｉｕ Ｚ ＆ Ｋｅａｒｎｅｙ ＣＭ，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１０：８８を参照されたい（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＦＥＣＴベクターは、アグロインフェクションのためのＴ－ＤＮＡ領域を含み、これは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含み、ウイルスコーティングタンパク質及びトリプル遺伝子ブロックをコードする遺伝子を用いずに、フォックステールモザイクウイルスＲＮＡの発現を駆動する。更に、このシステムは、「非武装（ｄｉｓａｒｍｅｄ）」ウイルスゲノムを使用し、したがって、植物から植物へのウイルスの伝播を効果的に防ぐことができる。導入された異種遺伝子を効率的に発現させるために、ＦＥＣＴ発現システムは、導入されたＴ－ＤＮＡの転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を防ぐために、トマトブッシースタントウイルス由来のＲＮＡサイレンシングサプレッサータンパク質であるＰ１９を更に共発現させる必要がある（ＴＲＢＯ発現系は、Ｐ１９の共発現を必要としない）。

【0690】

一部の実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦは、一連の翻訳的に融合された構造モチーフをコードするように設計することができ、以下のように記載することができる：Ｎ’－ＥＲＳＰ－ＳＴＡ－Ｌ－ＤＶＰ－Ｃ’（式中、「Ｎ’」及び「Ｃ’」は、それぞれＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を示し、ＥＲＳＰモチーフは、オオムギアルファアミラーゼシグナルペプチド（ＢＡＡＳ）（配列番号６０）であり得、安定化タンパク質（ＳＴＡ）は、ＧＦＰ（配列番号５７）であり得、リンカーペプチド「Ｌ」は、ＩＧＥＲ（配列番号５４）であり得る）。一部の実施形態では、ｅｒｓｐ－ｓｔａ－ｌ－ｄｖｐ ＯＲＦは、制限部位（例えば、５’末端のＰａｃ Ｉ制限部位、及び３’末端のＡｖｒ ＩＩ制限部位）を含むように化学的に合成され得る。一部の実施形態では、ＤＶＰ ＯＲＦをＦＥＣＴ発現ベクター（ｐＦＥＣＴ）のＰａｃ Ｉ及びＡｖｒ ＩＩ制限部位にクローニングして、ＦＥＣＴ一過性植物発現システム（ｐＦＥＣＴ－ＤＶＰ）のためのミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアント発現ベクターを生成することができる。ＦＥＣＴ発現システムにおける発現を最大化するために、一部の実施形態は、共形質転換のために生成されたＲＮＡサイレンシングサプレッサータンパク質Ｐ１９（ｐＦＥＣＴ－Ｐ１９）を発現するＦＥＣＴベクターを有し得る。

【0691】

一部の実施形態では、ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアント発現ベクターは、ＴＲＢＯ一過性植物発現システムで使用するために、例えば、日常的なＰＣＲ手順を実施し、上記のＤＶＰ ＯＲＦの３’末端にＮｏｔ Ｉ制限部位を付加し、次いで、ＤＶＰ ＯＲＦをＴＲＢＯ発現ベクターのＰａｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ制限部位にクローニングすることによって組換えることができる（ｐＴＲＢＯ－ＤＶＰ）。

【0692】

一部の実施形態では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株（例えば、市販のＧＶ３１０１細胞）は、１つ以上の一過性発現システム（例えば、ＦＥＣＴ及びＴＲＢＯ発現システム）を使用して、植物組織（例えば、タバコ葉）におけるＤＶＰ ＯＲＦの一過性発現のために使用することができる。このような一過性トランスフェクションプロトコルの例示的な実施例としては、以下が挙げられる：ＧＶ３１０１の一晩培養を使用して、２００ｍＬのＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を接種することができる。細胞を、ＯＤ６００が０．５～０．８の対数増殖期まで増殖させ、次いで、細胞を、４℃で、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによってペレット化することができる。次いで、細胞を、１０ｍＬの予冷したＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で１回洗浄し、次いで、２０ｍＬのＬＢ培地に再懸濁することができる。次いで、ＧＶ３１０１の細胞再懸濁液を、２５０μＬ画分で１．５ｍＬのマイクロチューブにアリコートすることができる。次いで、アリコートを、液体窒素中で急速凍結し、将来の形質転換用に－８０℃で保存することができる。次いで、ｐＦＥＣＴ－ＤＶＰ及びｐＴＲＢＯ－ＤＶＰベクターは、以下のように、凍結融解法を使用して、コンピテントＧＶ３１０１細胞に形質転換することができる：保存されたコンピテントＧＶ３１０１細胞を氷上で解凍し、１～５μｇの純粋なＤＮＡ（ｐＦＥＣＴ－ＤＶＰ又はｐＴＲＢＯ－ＤＶＰベクター）と混合する。細胞－ＤＮＡ混合物を、氷上で５分間保持し、－８０℃に５分間移し、３７℃の水浴中で５分間インキュベートする。次いで、凍結融解処理された細胞を、１ｍＬのＬＢ培地に希釈し、揺動台上で、室温で、２～４時間振盪する。次いで、細胞－ＤＮＡ混合物の２００μＬのアリコートを、適切な抗生物質（１０μｇ／ｍＬのリファンピシン、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを、ｐＦＥＣＴ－ＤＶＰ形質転換及びｐＴＲＢＯ－ＤＶＰ形質転換の両方に使用することができる）を含むＬＢ寒天プレート上に広げ、２８℃で２日間インキュベートする。次いで、得られた形質転換コロニーを採取し、形質転換ＤＮＡを分析するための適切な抗生物質を含む６ｍＬのＬＢ培地のアリコート中で培養し、形質転換ＧＶ３１０１細胞のグリセロールストックを作製する。

【0693】

一部の実施形態では、植物組織（例えば、タバコ葉）の一過性形質転換は、針なしの３ｍＬ注射器を用いて葉注射を使用して実行され得る。例示的な一実施例では、形質転換ＧＶ３１０１細胞を、（上記のように）適切な抗生物質とともにＬＢプレート上に画線し、２８℃で２日間インキュベートする。形質転換ＧＶ３１０１細胞のコロニーを、５ｍｌのＬＢ－ＭＥＳＡ培地（１０ｍＭのＭＥＳ、及び２０μＭのアセトシリンゴン、並びに上記の同じ抗生物質を補充したＬＢ培地）に接種し、２８℃で一晩増殖させる。一晩培養した細胞を、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって回収し、最終ＯＤ６００が１．０で、誘導培地（１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００μＭのアセトシリンゴン）に再懸濁する。次いで、細胞を誘導培地中で２時間、室温で一晩インキュベートすることで、タバコ葉の一過性形質転換の準備が整う。処理された細胞は、針が装着されていない３ｍＬシリンジを使用した注射によって、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物についている葉の下側に浸潤させることができる。

【0694】

一部の実施形態では、一過性形質転換は、ＧＶ３１０１細胞の１つの集団をｐＦＥＣＴ－ＤＶＰ又はｐＴＲＢＯ－ＤＶＰでトランスフェクトし、別の集団をｐＦＥＣＴ－Ｐ１９でトランスフェクトし、２つの細胞集団を、３ｍＬ注射器を用いた注射によって、タバコ葉の浸潤のために、等量で一緒に混合することによって達成され得る。

【0695】

ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドの安定した組み込みは、本開示でも可能であり、例えば、ＤＶＰ ＯＲＦは、安定した植物形質転換技術を使用して植物ゲノムに組み込むこともでき、したがって、ＤＶＰは、植物において安定して発現され、形質転換された植物を世代から世代へと保護することができる。植物の安定した形質転換のために、ＤＶＰ発現ベクターは、環状又は線状であり得る。ＤＶＰ ＯＲＦ、ＤＶＰ発現カセット、及び／又は安定した植物形質転換のためのＤＶＰをコードするポリヌクレオチドを有するベクターは、当業者に既知であるものに基づいて、並びに／又はＧｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ２．０（Ａｔｕｍ Ｂｉｏ）、ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ（Ｃｙａｇｅｎ）、ＳｎａｐＧｅｎｅ（登録商標）ビューア、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）プラスミド構築サービス（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び／若しくは他の市販のプラスミド設計サービスなどの予測ベクター設計ツールを使用することによって、植物における最適な発現のために慎重に設計されるべきである。Ｔｏｌｍａｃｈｏｖ，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５４２：１１７－２９を参照されたい。ＤＶＰの発現は、通常、トランスジェニック植物の一部又は全ての細胞における転写を促進するプロモーターによって制御される。プロモーターは、強力な植物ウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の構成的３５Ｓプロモーターであり得る。また、プロモーターは、強力な植物プロモーター、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のヒドロペルオキシドリアーゼプロモーター（ｐＨＰＬ）、ダイズ由来のＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘポリユビキチン（Ｇｍｕｂｉ）プロモーター、異なる植物種（イネ、トウモロコシ、ジャガイモなど）由来のユビキチンプロモーターなどであり得る。植物転写ターミネーターは、多くの場合、ＲＮＡポリメラーゼ及びｍＲＮＡの転写を停止させるために、ＯＲＦの終止コドンの後にあるが多い。ＤＶＰの発現を評価するために、レポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳストレイニングアッセイのためのβ－グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、紫外線下で緑色蛍光を検出するための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子）をＤＶＰ発現ベクターに含めることができる。形質転換植物を選択するために、ＤＶＰ発現ベクターには、通常、選択マーカー遺伝子が含まれる。一部の実施形態では、マーカー遺伝子発現産物は、特定の抗生物質（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン）又は特定の除草剤（例えば、グリホサートなど）に対する耐性を、形質転換植物に提供することができる。植物形質転換にアグロインフェクション技術を採用する場合、Ｔ－ＤＮＡ部分を植物に輸送するために、Ｔ－ＤＮＡの左縁及び右縁の配列もＤＶＰ発現ベクターに含まれる。

【0696】

構築されたＤＶＰ発現ベクターは、多くのトランスフェクション技術を使用して、植物細胞又は組織にトランスフェクションすることができる。アグロインフェクションは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ系統を使用して、植物を形質転換する非常に人気のある方法である。粒子衝撃（遺伝子銃又は微粒子銃とも呼ばれる）技術は、植物トランスフェクションの非常に一般的な方法でもある。他のあまり一般的ではないトランスフェクション方法としては、組織エレクトロポレーション、炭化ケイ素ウィスカー、ＤＮＡの直接注入などが挙げられる。トランスフェクション後、トランスフェクトされた植物細胞又は組織を、植物再生培地に配置し、トランスフェクトされた植物細胞又は組織を、トランスジェニック植物に再生させる。

【0697】

形質転換植物の評価は、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、及びタンパク質レベルで達成することができる。安定して形質転換された植物は、これらの全てのレベルで評価することができ、一過的に形質転換された植物は、通常、タンパク質レベルでのみ評価される。ＤＶＰ ＯＲＦが、安定して形質転換された植物のゲノムに組み込まれていることを確実にするために、ゲノムＤＮＡを、安定して形質転換された植物組織から抽出し、ＰＣＲ又はサザンブロットを使用して分析することができる。安定して形質転換された植物におけるＤＶＰの発現は、例えば、ノーザンブロット又はＲＴ－ＰＣＲを使用して、形質転換された植物組織から抽出された総ｍＲＮＡを分析することによって、ＲＮＡレベルで評価することができる。形質転換された植物におけるＤＶＰの発現は、タンパク質レベルで直接評価することもできる。形質転換植物におけるＤＶＰの発現を評価するための多くの方法がある。ＤＶＰ ＯＲＦにレポーター遺伝子が含まれる場合、レポーター遺伝子アッセイを行うことができる。例えば、一部の実施形態では、ＧＵＳレポーター遺伝子発現用のＧＵＳストレイニングアッセイ、ＧＦＰレポーター遺伝子発現用の緑色蛍光検出アッセイ、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現用のルシフェラーゼアッセイ、及び／又は他のレポーター技術を用いてもよい。

【0698】

一部の実施形態では、総タンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用してＤＶＰの発現を直接評価し、試料中の総タンパク質レベルを評価するために、形質転換された植物組織から抽出することができる。

【0699】

一部の実施形態では、分析用ＨＰＬＣクロマトグラフィー技術、ウエスタンブロット技術、又はｉＥＬＩＳＡアッセイを採用して、形質転換された植物組織から抽出された総タンパク質試料中のＤＶＰを定性的又は定量的に評価することができる。ＤＶＰ発現はまた、形質転換された植物組織から抽出された総タンパク質試料を、昆虫バイオアッセイで使用することによって評価することもできる。例えば、一部の実施形態では、形質転換された植物組織又は形質転換された植物自体全体を、昆虫バイオアッセイで使用して、ＤＶＰの発現及びそれが植物を保護する能力を評価することができる。

【0700】

一部の実施形態では、本発明の植物、植物組織、植物細胞、植物種子、又はその一部は、１つ以上のＤＶＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、当該ＤＶＰは、少なくともであるアミノ酸配列を含む。

【0701】

変換成功の確認
植物細胞への異種外来ＤＮＡの導入後、植物ゲノムにおける異種遺伝子の形質転換又は組み込みは、組み込まれた遺伝子と関連する核酸、タンパク質、及び代謝産物の分析などの様々な方法によって確認される。

【0702】

ＰＣＲ分析は、土壌に移植する前の初期段階で組み込まれた遺伝子の存在について、形質転換された細胞、組織、又は苗条をスクリーニングする迅速な方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。ＰＣＲは、目的の遺伝子又はアグロバクテリウムベクターバックグラウンドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われる。

【0703】

植物の形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって確認することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）。一般に、全ＤＮＡは、形質転換された植物から抽出され、適切な制限酵素で消化され、アガロースゲル中で分画され、ニトロセルロース又はナイロン膜に移される。次いで、膜又は「ブロット」を、例えば、放射標識^３２Ｐ標的ＤＮＡ断片でプローブして、標準的な技術に従って、植物ゲノムに導入された遺伝子の組み込みを確認する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）。

【0704】

ノーザンブロット分析では、ＲＮＡを形質転換植物の特定の組織から単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲル中で分画し、当該技術分野で日常的に使用される標準的な手順に従って、ナイロンフィルター上にブロットする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）。次いで、ＤＶＰをコードするポリヌクレオチドによってコードされるＲＮＡの発現は、当該技術分野で既知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）によって、フィルターをＤＶＰに由来する放射性プローブにハイブリダイゼーションすることによって試験する。

【0705】

トランスジェニック植物について、ウエスタンブロット、生化学的アッセイなどを行って、ＤＶＰ上に存在する１つ以上のエピトープに結合する抗体を使用して、標準的な手順によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）、ＤＶＰ遺伝子によってコードされるタンパク質の存在を確認してもよい。

【0706】

植物形質転換の成功を決定するために、例えば、クロラムフェニコールに対する耐性、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシンなどのいくつかのマーカーが開発されている。葉緑体代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子も、選択マーカーとして使用することができる。例えば、グリホサート、ブロモキシニル、又はイミダゾリノンなどの植物除草剤に耐性を提供する遺伝子は、特定の用途を見出すことができる。かかる遺伝子が報告されている（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３１０－６３１４（ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ遺伝子）、及びＳａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２１８８（ＡＨＡＳイミダゾリノン耐性遺伝子））。更に、本明細書に開示される遺伝子は、細菌、酵母、又は植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。植物、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、むかご、胚、又はその子孫における導入遺伝子の存在を検出するための方法は、当該技術分野で周知である。一実施形態では、導入遺伝子の存在は、農薬活性を試験することによって検出される。

【0707】

ＤＶＰ及び／又はミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリヌクレオチドを発現する稔性植物は、農薬活性について試験され得、植物は、更なる育種のために選択される最適な活性を示す。害虫活性をアッセイする方法は、当該技術分野で利用可能である。一般に、タンパク質は混合され、摂食アッセイで使用される。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０－２９３を参照されたい。

【0708】

一部の実施形態では、一過性トランスフェクション手順の成功を評価することは、レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）の発現に基づいて決定することができる。一部の実施形態では、ＧＦＰは、ＦＥＣＴ及び／又はＴＲＢＯベクターで形質転換されたタバコ葉において、ＵＶ光下で検出され得る。

【0709】

一部の実施形態では、ＤＶＰ発現は、植物（例えば、タバコ）において定量的に評価され得る。タバコ植物におけるＤＶＰ定量を例示する例示的な手順は、以下のとおりである。形質転換された葉組織の１００ｍｇのディスクを、１０００μＬのピペット先端の大きな開口部で葉を打ち抜くことによって収集する。採取した葉組織を、直径５／３２インチのステンレス鋼研削球を含む２ｍＬマイクロチューブに入れ、－８０℃で１時間凍結し、Ｔｒｏｅｍｎｅｒ－Ｔａｌｂｏｙｓハイスループットホモジナイザーを使用してホモジナイズする。次に、７５０μＬの氷冷ＴＳＰ－ＳＥ１抽出溶液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム溶液、１：１００希釈プロテアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＩＥＣＡ、８％のＰＶＰＰ、ｐＨ７．０）をチューブに添加し、ボルテックスする。次いで、マイクロチューブを、室温で１５分間静置し、次いで、４℃で、１６，０００ｇで１５分間遠心分離する。得られた上清を１００μＬを採取し、底部に空の受け皿Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートを備えた０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルターマイクロタイタープレート中のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０充填済みカラムにロードする。次いで、マイクロタイタープレートを、４℃で、８００ｇで２分間遠心分離する。次いで、得られた濾液（タバコ葉の総可溶性タンパク質抽出物（ＴＳＰ抽出物）と呼ぶ）は、定量分析の準備が整う。

【0710】

一部の実施形態では、ＴＳＰ抽出物の総可溶性タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを使用して推定することができる。既知の濃度のＢＳＡタンパク質標準を使用して、タンパク質定量化の標準曲線を作成することができる。例えば、２μＬの各ＴＳＰ抽出物を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイキットの２００μＬの発色試薬（ＣＰＰＡ試薬）に混合し、１０分間インキュベートすることができる。次いで、制御ソフトウェアとしてＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを使用して、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ－Ｍ２プレートリーダーを使用して、ＯＤ５９５を読み取ることによって発色反応を評価することができる。総可溶性タンパク質の濃度は、ＦＥＣＴ及びＴＲＢＯを介して形質転換された植物からのＴＳＰ抽出物中で、それぞれ約０．７８８±０．２０μｇ／μＬ又は約０．５３３±０．０３μｇ／μＬであり得、その結果を使用して、ｉＥＬＩＳＡアッセイについて、ＴＳＰ（％ＴＳＰ）中の発現されたミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントペプチドのパーセンテージを計算することができる。

【0711】

一部の実施形態では、間接ＥＬＩＳＡ（ｉＥＬＩＳＡ）アッセイを使用して、ＦＥＣＴ及び／又はＴＲＢＯ発現システムで一過的に形質転換されたタバコ葉におけるＤＶＰ含有量を定量的に評価することができる。ＤＶＰを定量化するためにｉＥＬＩＳＡを使用する例示的な例は、以下のとおりである。５μＬの葉ＴＳＰ抽出物を、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＤ ９６ウェルプレートのウェル内で、９５μＬのＣＢ２溶液（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈し、必要に応じて、段階希釈を行う。次いで、抽出試料から得られた葉タンパク質を、暗所で、室温で３時間ウェル壁をコーティングし、次いでその後、ＣＢ２溶液を除去する。各ウェルを、２００μＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄する。１５０μＬのブロッキング溶液（５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳ中のＢｌｏｃｋ ＢＳＡ）を各ウェルに添加し、暗所で、室温で１時間インキュベートする。ブロッキング溶液を除去した後、ウェルのＰＢＳ洗浄、１００μＬのＤＶＰに対する一次抗体（カスタム抗体はＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されている；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）；又は当業者に容易に入手可能な知識を使用して調製される）。ブロッキング溶液中に１：２５０希釈で希釈された抗体を各ウェルに添加し、暗所で、室温で１時間インキュベートする。一次抗体を除去し、各ウェルをＰＢＳで４回洗浄する。１００μＬのＨＲＰコンジュゲート二次抗体（すなわち、一次抗体を生成するために使用した宿主種に対する抗体；ブロッキング溶液中で１：１０００希釈で使用される）を各ウェルに添加し、暗所で１時間室温でインキュベートする。二次抗体を除去し、ウェルを１００μＬのＰＢＳで洗浄する。基質溶液（ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質溶液Ａと溶液Ｂとの１：１混合物、ＫＰＬ）を各ウェルに添加し、十分な発色が明らかになるまで発色反応を進める。１００μＬのペルオキシダーゼ停止溶液を各ウェルに添加して、反応を停止させる。プレート内の各反応混合物の光吸光度を、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ－Ｍ２プレートリーダーを使用して４０５ｎｍで読み取り、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを対照ソフトウェアとして使用する。純粋なＤＶＰ試料の既知の濃度を段階希釈し、ｉＥＬＩＳＡアッセイで上述したのと同じ方法で処理して、定量分析のための質量－吸光度標準曲線を生成することができる。発現されたＤＶＰは、ＦＥＣＴ形質転換タバコからの葉ＴＳＰ抽出物では約３．０９±１．８３ｎｇ／μＬで、及びＴＲＢＯ形質転換タバコからの葉ＴＳＰ抽出物では約３．５６±０．７４ｎｇ／μＬで、ｉＥＬＩＳＡによって検出することができる。代替的に、発現されたＤＶＰは、ＦＥＣＴ形質転換植物では、約０．４０％の総可溶性タンパク質（％ＴＳＰ）であり、ＴＲＢＯ形質転換植物では、約０．６７％のＴＳＰであり得る。

【0712】

混合物、組成物及び製剤
本明細書で使用される場合、「組成物」及び「製剤」という用語は、互換的に使用される。

【0713】

本明細書で使用される場合、「ｖ／ｖ」又は「％ ｖ／ｖ」又は「体積当たりの体積」は、溶液の体積濃度を指す（「ｖ／ｖ」は体積当たりの体積を表す）。ここで、ｖ／ｖは、溶液の両方の成分が液体である場合に使用することができる。例えば、５０ｍＬの成分Ｘを５０ｍＬの水で希釈すると、１００ｍＬの総体積に５０ｍＬの成分Ｘが存在することになり、したがって、これは、「５０％ ｖ／ｖの成分Ｘ」として表すことができる。体積当たりの体積パーセント（％ ｖ／ｖ）は、以下のように計算される。（溶質の体積（ｍＬ）／溶液の体積（１００ｍＬ））；例えば、％ ｖ／ｖ＝ｍＬの溶質／１００ｍＬの溶液。

【0714】

本明細書で使用される場合、「ｗ／ｗ」又は「％ ｗ／ｗ」又は「重量／重量」は、溶液の重量濃度、すなわち、重量／重量パーセント（「ｗ／ｗ」は、重量当たりの重量を表す）を指す。ここで、ｗ／ｗは、１００ｇの溶液又は混合物中の構成成分のグラム数（ｇ）を表す。例えば、３０ｇの成分Ｘ、及び７０ｇの水からなる混合物は、「３０％ ｗ／ｗの成分Ｘ」として表される。重量当たりの重量パーセント（％ ｗ／ｗ）は、以下のように計算される：（溶質の重量（ｇ）／溶液の重量（ｇ））×１００、又は（溶質の質量（ｇ）／溶液の質量（ｇ））×１００。

【0715】

本明細書で使用される場合、「ｗ／ｖ」又は「％ ｗ／ｖ」又は「体積当たりの重量」は、溶液の質量濃度、すなわち、重量／体積パーセントを指す（「ｗ／ｖ」は体積当たりの重量を表す）。ここで、ｗ／ｖは、１００ｍＬの溶液中の構成成分のグラム（ｇ）の数を表す。例えば、１ｇの成分Ｘを使用して、１００ｍＬの総体積を構成する場合、「成分Ｘの１％ ｗ／ｖ溶液」が作られている。体積当たりの重量パーセント（％ ｗ／ｖ）は、以下のように計算される：（溶質の質量（ｇ）／溶液の体積（ｍＬ））×１００。

【0716】

本明細書に記載されるＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質（例えば、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９に示されるアミノ酸配列を有するＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩）のうちのいずれかを使用して、混合物及び／又は組成物を作製することができ、当該混合物及び／又は組成物は少なくとも１つのＤＶＰからなる。

【0717】

組成物、生成物、ポリペプチド、及び／又はＤＶＰを発現するように動作可能なポリヌクレオチドで形質転換され、本明細書に記載される植物のいずれも、害虫、その成長、及び／又はそれらの作用、特に植物へのそれらの損傷によって引き起こされる損傷を制御するために使用され得る。

【0718】

ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む組成物、例えば、農薬組成物は、エアロゾル及び／又はエアロゾル化生成物、例えば、噴霧、燻蒸剤、粉末、粉塵、及び／又はガス；種子粉衣；経口調製物（例えば、昆虫の餌など）；ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、及び／又はＤＶＰ ＯＲＦを（一過的及び／又は安定的のいずれか）発現及び／又は産生するトランスジェニック生物、例えば、植物又は動物を含むことができるが、これらに限定されない。

【0719】

組成物は、粉末、粉塵、ペレット、顆粒、噴霧、エマルション、コロイド、溶液などとして製剤化することができ、ポリペプチドを含む細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、又は濃縮などの従来の手段によって調製することができる。少なくとも１つのかかる農薬ポリペプチドを含有する全てのかかる組成物では、ポリペプチドが、約１重量％～約９９重量％の濃度で存在し得る。

【0720】

一部の実施形態では、本明細書に記載の農薬組成物は、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はその薬学的に許容される塩のいずれかを、所望の農業的に許容される担体とともに、製剤化することによって作製することができる。組成物は、投与前、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）、乾燥、又は水性担体、培地、又は好適な希釈剤（例えば、生理食塩水及び／若しくは他の緩衝液）などの適切な手段で製剤化され得る。一部の実施形態では、製剤化された組成物は、粉塵材料若しくは粒状材料、又は油（植物油若しくはミネラルオイル）エマルション、若しくは水エマルション、若しくは油／水エマルション中の懸濁液、又は水和剤、又は農業用途に好適な任意の他の担体材料と組み合わせた形態であり得る。好適な農業的担体は、固体又は液体であり得、当該技術分野において周知である。一部の実施形態では、製剤は、１つ以上の固体又は液体アジュバントと混合され得、様々な手段によって、例えば、従来の製剤技術を使用して、農薬組成物を好適なアジュバントと均一に混合、ブレンド、及び／又は粉砕することによって調製され得る。好適な製剤化及び適用方法は、米国特許第６，４６８，５２３号に記載されている（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0721】

一部の実施形態では、組成物は、ＤＶＰ及び賦形剤を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。

【0722】

一部の実施形態では、組成物は、ＤＶＰ－殺虫タンパク質及び賦形剤を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。

【0723】

一部の実施形態では、組成物は、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤と、を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。

【0724】

噴霧用組成物
本発明の噴霧産物の例としては、農業用途のフィールド噴霧用製剤及び居住空間又は商業空間の内部空間で使用するための屋内噴霧が挙げられ得る。一部の実施形態では、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む残留噴霧又は空間噴霧を使用して、内部空間の害虫を減少させるか、又は除去することができる。

【0725】

室内表面噴霧（ｓｕｒｆａｃｅ ｓｐｒａｙｉｎｇ ｉｎｄｏｏｒｓ）（ＳＳＩ）は、壁、窓、床、天井などの媒介生物がいる室内表面に、可変量の噴霧可能な量の殺虫剤を適用する技術である。可変量の噴霧可能な量の主な目標は、害虫（例えば、ハエ、ノミ、ダニ、又は蚊の媒介生物）の寿命を減少させ、それによって、病気の伝染を軽減又は阻止することである。二次的な影響は、処理領域内の害虫の密度を減少させることである。ＳＳＩは、ライム病、サルモネラ、チングニアウイルス、ジカウイルス、及びマラリアなどの媒介害虫疾患を制御するための方法として使用することができ、また、リーシュマニア症及びシャーガス病などの媒介昆虫によって運ばれる寄生虫の管理にも使用することができる。ジカウイルス、チングニアウイルス、マラリアを保有する多くの媒介蚊には、血液を吸った後に家の中にいる内向性（ｅｎｄｏｐｈｉｌｉｃ）の媒介蚊が含まれる。これらの蚊は、特に、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤と、を含む噴霧可能な組成物を用いて、室内での表面噴霧（ＳＳＩ）を介して制御されやすい。その名が示すように、ＳＳＩは、残留殺虫剤による家の壁及び他の表面に組成物を適用することを伴う。

【0726】

一実施形態では、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む組成物であって、賦形剤は、これらの表面に接触する昆虫害虫をノックダウンするであろう。ＳＳＩは、人が蚊に噛まれるのを直接防ぐものではない。むしろ、ＳＳＩは、通常、蚊が血液を吸った後、噴霧された表面にいる場合、害虫を制御する。したがって、ＳＳＩは、他の人への感染の伝播を防止する。効果を発揮するには、ある地域の非常に高い割合（通常、４０～８０パーセント超）の世帯に、ＳＳＩを適用する必要がある。したがって、良好な残留有効性及び許容可能な臭気を有する本発明による噴霧は、一体化された媒介害虫を管理又は制御する溶液の成分として特に好適である。

【0727】

活性ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質が、塗料のように住居の表面（例えば、壁又は天井）に結合することを必要とするＳＳＩとは対照的に、例えば、本発明の空間噴霧生成物は、所与の期間にわたって空気中に散布されることが意図された多数の小さな殺虫液滴の生成に依存する。これらの液滴が標的害虫に影響を及ぼす場合、それらは、害虫を制御するのに有効なノックダウン有効用量のＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質を送達する。空間噴霧を生成するための従来の方法は、熱霧化（それによって、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む組成物の濃い雲が、厚い霧の外観を与えて産生される）及び超低体積（ＵＬＶ）を含み、それによって、液滴が、低温の機械的エアロゾル生成機械によって産生される。エアゾル缶などのすぐに使用できるエアゾルも使用され得る。

【0728】

広い地域を一度に処理可能であるため、前述の方法は、特定の地域における飛来害虫の個体数を迅速に減少させるための非常に効果的な方法である。また、適用からの残存活性が非常に限られているため、完全に有効にするには、５～７日間隔で繰り返す必要がある。この方法は、害虫の数を迅速に減少させる必要がある流行状況において、特に効果的であり得る。そのため、都市部のデング熱対策キャンペーンで使用することができる。

【0729】

効果的な空間散布は、一般に、以下の特定の原理に依存する。標的昆虫は、通常、噴霧雲を飛翔している（又は、露出した表面にいる間に影響を受けることがある）。したがって、噴霧液滴と標的昆虫との間の接触の効率が重要である。これは、噴霧液滴が最適な期間空気中に残り、適切な用量の殺虫剤を含むことを確実にすることによって達成される。これら２つの問題は、主に、液滴サイズを最適化することによって対処される。液滴が大きすぎると、急速に地面に落ち、適用中に遭遇した植生又は他の障害物に浸透しない（適用の有効面積を制限する）。これらの大きな液滴の１つが個々の昆虫に影響を与える場合、個々の昆虫ごとに高用量が送達されるため、それは「オーバーキル」でもある。液滴が小さすぎると、空気力学により標的昆虫に付着しないか（衝突しない）、対流によって大気中に上へと運ばれ得る。空間散布を適用するための液滴の最適なサイズは、体積中央径（ＶＭＤ）が１０～２５ミクロンの液滴である。

【0730】

一部の実施形態では、噴霧可能な組成物は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0731】

一部の実施形態では、噴霧可能な組成物は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0732】

フォーム
ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む本発明の活性組成物は、エアロゾル化フォーム用途を含む、エアロゾルベースの用途として噴霧製品で利用可能にしてもよい。加圧缶は、エアロゾルを形成するための典型的なビヒクルである。使用されるＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質と適合性のあるエアロゾル噴射剤。好ましくは、液化ガス式噴射剤が使用される。

【0733】

好適な噴射剤としては、圧縮空気、二酸化炭素、ブタン、及び窒素が挙げられる。活性化合物組成物中の噴射剤の濃度は、ピリジン組成物の約５重量パーセント～約４０重量パーセント、好ましくは、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含むものの約１５重量パーセント～約３０重量パーセントである。

【0734】

一実施形態では、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む製剤はまた、１つ以上の発泡剤を含み得る。使用され得る発泡剤としては、ラウレス硫酸ナトリウム、コカミドＤＥＡ、及びコカミドプロピルベタインが挙げられる。好ましくは、ラウレス硫酸ナトリウム、コカミドＤＥＡ、及びコカミドプロピルが、組み合わせて使用される。活性化合物組成物中の発泡剤の濃度は、組成物の約１０重量パーセント～約２５重量パーセント、より好ましくは、１５重量パーセント～２０重量パーセントである。

【0735】

かかる製剤が発泡剤を含まないエアゾル用途で使用される場合、使用する前に直接混合する必要がなく、本発明の活性組成物を使用することができる。しかしながら、発泡剤を含むエアロゾル製剤は、使用直前に混合（すなわち、振盪）する必要がない。加えて、発泡剤を含む製剤を長期間使用する場合、それらは、使用中に定期的に追加の混合を必要とする場合がある。

【0736】

一部の実施形態では、エアロゾル化フォームは、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0737】

一部の実施形態では、エアロゾル化フォームは、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0738】

燃焼製剤
一部の実施形態では、居住地域はまた、ロウソク、スモークコイル、若しくは香片含有組成物などの燃焼製剤（ｂｕｒｎｉｎｇ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を使用することによって、活性ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質で処理されてもよい。例えば、組成物は、「加熱式」芳香剤（ａｉｒ ｆｒｅｓｈｅｎｅｒ）などの家庭用品に製剤化され得、殺虫性組成物が（例えば、電気的に又は燃焼によって）加熱時に放出される。ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む本発明の活性化合物組成物は、エアロゾル、蚊取りコイル、及び／又は気化器又は霧化器として噴霧製品中で利用可能であってもよい。

【0739】

一部の実施形態では、燃焼製剤は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0740】

一部の実施形態では、燃焼製剤は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0741】

生地処理
一部の実施形態では、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む殺虫有効組成物を含有する布地及び衣服が作製され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の高分子材料、繊維、糸、織物、網物、又は基質中のＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の濃度は、例えば、０．０５～１５重量パーセント、好ましくは０．２～１０重量パーセント、より好ましくは０．４～８重量パーセント、特に０．５～５重量パーセント、例えば、１～３重量パーセントの比較的広い濃度範囲内で変化させることができる。

【0742】

同様に、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む組成物の濃度（表面を処理するための、又は繊維、糸、網物、織物をコーティングするための）は、例えば、０．１～７０重量パーセント、例えば、０．５～５０重量パーセント、好ましくは、１～４０重量パーセント、より好ましくは、５～３０重量パーセント、特に、１０～２０重量パーセントの比較的広い濃度範囲内で変化させることができる。

【0743】

ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の濃度は、ノックダウン有効性、耐久性、及び毒性に関する要件が満たされるように、適用分野に応じて選択することができる。材料の特性を適応させることもでき、このようにしてカスタマイズされた織物生地を入手することができる。

【0744】

したがって、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩の有効量は、特定の使用パターン、制御が最も望まれる害虫、及びＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質が使用されるであろう環境に依存し得る。したがって、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩の有効量は、害虫の制御が達成されるのに十分である。

【0745】

一部の実施形態では、生地処理は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0746】

一部の実施形態では、布地処理は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0747】

表面処理組成物
一部の実施形態では、本開示は、建物の内部の壁、床及び天井をコーティングするため、並びに基材又は非生物材料をコーティングするための、ＤＶＰ及び賦形剤を含むか、又はＤＶＰ－殺虫タンパク質及び賦形剤を含む組成物又は製剤を提供する。ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む本発明の組成物は、念頭に置いた目的のために既知の技術を使用して調製され得る。ＤＶＰ－殺虫タンパク質及び賦形剤を含む組成物の調製物は、化合物の表面又は他の基質への結合を容易にするための結合剤も含有するように製剤化され得る。結合に有用な薬剤は当該技術分野で既知であり、形態がポリマーである傾向がある。特定の多孔性及び／又は結合特性を有する壁面に適用される組成物に好適な結合剤の種類は、繊維、糸、織物、又は網物と比較して異なり、したがって、当業者は、既知の教示に基づいて、所望の表面及び／又は基質に基づいて好適な結合剤を選択するであろう。

【0748】

典型的な結合剤は、ポリビニルアルコール、修飾デンプン、ポリビニルアクリレート、ポリアクリル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、ポリウレタン、及び修飾植物油である。好適な結合剤は、多種多様なポリマー及びコポリマー、並びにそれらの組み合わせに由来するラテックス分散体を含むことができる。本発明の組成物中の結合剤として使用するのに好適なラテックスは、スチレン、アルキルスチレン、イソプレン、ブタジエン、アクリロニトリル、低級アルキルアクリレート、塩化ビニル、塩化ビニリデン、低級カルボン酸、及びα、β－エチレン性不飽和カルボン酸のポリマー及びコポリマーを含み、それらの中で共重合した３つ以上の異なるモノマー種を含むポリマー、並びにシリコーン又はポリウレタンの分散後懸濁液を含む。活性成分を他の表面に結合するためのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ポリマーもまた好適であり得る。

【0749】

一部の実施形態では、表面処理組成物は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0750】

一部の実施形態では、表面処理組成物は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0751】

分散剤
一部の例示的な実施形態では、本開示による殺虫剤製剤は、ＤＶＰ、ＤＶＰ殺虫性タンパク質、若しくは薬学的に許容されるその塩、及び賦形剤、希釈剤若しくは担体（例えば、水など）、高分子結合剤、及び／又は分散剤、重合剤、乳化剤、増粘剤、アルコール、香料、若しくは当該技術分野で既知の噴霧可能な殺虫剤の調製に使用される任意の他の不活性賦形剤などの追加の成分からなり得る。

【0752】

一部の実施形態では、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む組成物は、懸濁液又はカプセル懸濁液などのいくつかの異なる形態又は製剤タイプで調製され得る。また、当業者は、特定のＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の特性、その使用、及びその適用タイプに基づいて、関連する組成物を調製することができる。例えば、本開示の方法、実施形態、及び他の態様では、使用されるＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、懸濁液製剤又はカプセル懸濁液製剤に封入され得る。封入されたＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、改善された洗浄堅牢性を提供することができ、またより長期間の活性を提供することができる。製剤は、有機系又は水性（好ましくは、水性）であり得る。

【0753】

一部の実施形態では、分散剤は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0754】

一部の実施形態では、分散剤は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0755】

マイクロカプセル化
本開示による組成物及び方法で使用するのに好適なマイクロカプセル化ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、当該技術分野で既知の任意の好適な技術を用いて調製され得る。例えば、材料をマイクロカプセル化するための様々なプロセスがこれまで開発されてきた。これらのプロセスは、３つのカテゴリー：物理的方法、相分離、及び界面反応に分類することができる。物理的方法のカテゴリーでは、マイクロカプセル壁材料及びコア粒子が物理的に合わされ、壁材料がコア粒子の周りを流れてマイクロカプセルを形成する。相分離のカテゴリーでは、マイクロカプセルは、壁材料が溶解され、（例えば、コアセルベーションによって）連続相から物理的に分離され、コア粒子の周囲に堆積される不混和連続相中でコア材料を乳化又は分散させることによって形成される。界面反応のカテゴリーでは、マイクロカプセルは、不混和連続相でコア材料を乳化又は分散させることによって形成され、次いで、界面重合反応がコア粒子の表面で起こるようにされる。マイクロカプセル中に存在するＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の濃度は、マイクロカプセルの０．１～６０重量％で変化し得る。

【0756】

一部の実施形態では、マイクロカプセル化は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0757】

一部の実施形態では、マイクロカプセル化は、約０．００５重量％～約９９重量％の範囲の量のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はその薬学的に許容される塩を含有し得る。

【0758】

キット、製剤、分散剤、及びそれらの成分
本開示による組成物（ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む）、方法、実施形態、及び他の態様で使用される製剤は、全ての成分を水と一緒に混合することによって形成され得、任意選択で、好適な混合及び／又は分散凝集体を使用し得る。概して、かかる製剤は、１０～７０℃、好ましくは、１５～５０℃、より好ましくは、２０～４０℃の温度で形成される。概して、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、及び／又は（Ｄ）のうちの１つ以上を含む製剤が可能であり、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩（農薬として）（Ａ）、固体ポリマー（Ｂ）、任意選択的な追加の添加剤（Ｄ）を使用して、それらを水性成分（Ｃ）中に分散させることが可能である。結合剤が本発明の組成物中（ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む）に存在する場合、水中の高分子結合剤（Ｂ）の分散液、及び事前に別々に調製された水中のＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質（Ａ）の水性製剤を使用することが好ましい。かかる別個の製剤は、それぞれの製剤に（Ａ）及び／又は（Ｂ）を安定化するための追加の添加剤が含まれていてもよい（それらは市販されている）。第２のプロセスステップでは、かかる生製剤及び任意選択的に追加の水（成分（Ｃ））を添加する。また、前述のスキームに基づく上記成分の組み合わせも同様に、例えば、（Ａ）及び／又は（Ｂ）の予め形成された分散液を使用し、それを固体（Ａ）及び／又は（Ｂ）と混合することによって可能である。高分子結合剤（Ｂ）の分散液は、化学物質製造業者によって既に作製された既製の分散液であってもよい。

【0759】

更に、「手作りの」分散液、すなわち、エンドユーザーによって小規模に作製された分散液を使用することも、本発明の範囲内である。かかる分散液は、水中に約２０パーセントの結合剤（Ｂ）の混合物を提供し、混合物を９０℃～１００℃の温度に加熱し、混合物を数時間集中的に撹拌することによって作製され得る。本発明によるプロセスのためにエンドユーザーが容易に使用できるように、最終製品として製剤を製造することが可能である。また、当然、濃縮物を製造することも同様に可能であり、これは、エンドユーザーによって、使用のための所望の濃度に、追加の水（Ｃ）で希釈され得る。

【0760】

一実施形態では、ＳＳＩ用途に好適な組成物（ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む）、又はコーティング製剤（ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む）は、活性成分及び水などの担体を含有し、分散剤、湿潤剤、不凍剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、及び結合剤又はステッカーから選択される１つ以上の共形成剤であり得る。

【0761】

一部の実施形態では、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩の例示的な固形製剤は、概して、粒径分布ｄ（０．５）が、概して３～２０μｍ、好ましくは５～１５μｍ、特に７～１２μｍであるなどの所望の粒径に粉砕される。

【0762】

更に、製剤を、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩（Ａ）を含む少なくとも第１の成分と、少なくとも１つのポリマー結合剤（Ｂ）を含む第２の成分と、を含むキットとして、エンドユーザーに出荷することが可能であり得る。更なる添加剤（Ｄ）が、キットの第３の別個の成分であってもよく、又は成分（Ａ）及び／又は（Ｂ）と既に混合されていてもよい。エンドユーザーは、キットの成分に水（Ｃ）を添加し、混合するだけで、使用のための製剤を調製することができる。キットの成分は、水中の製剤であってもよい。当然、成分のうちの１つの水性製剤を、他の成分の乾燥製剤と組み合わせることが可能である。例として、キットは、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩の１つの製剤（Ａ）及び任意選択で水（Ｃ）と、少なくとも１つのポリマー結合剤（Ｂ）、成分としての水（Ｃ）及び任意選択で成分としての水（Ｄ）の第２の別個の製剤とからなり得る。

【0763】

成分（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、及び任意選択的に（Ｄ）の濃度は、コーティング／処理に使用される技術に応じて、当業者によって選択される。概して、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩（Ａ）の量は、組成物の重量に基づいて、最大５０、１０～４０、特に１５～３０重量パーセントなど好ましくは１～５０重量パーセントであり得る。ポリマー結合剤（Ｂ）の量は、組成物の重量に基づいて、０．０１～３０重量パーセント、好ましくは０．５～１５重量パーセント、より好ましくは１～１０重量パーセント、特に１～５重量パーセントの範囲であり得る。追加の成分（Ｄ）の量は、存在する場合、一般に、組成物の重量に基づいて、０．１～２０重量パーセント、好ましくは０．５～１５重量パーセントである。好適な量の顔料及び／又は染料及び／又は香料は、存在する場合、一般に、組成物の重量に基づいて、０．０１～５重量パーセント、好ましくは０．１～３重量パーセント、より好ましくは０．２～２重量パーセントである。すぐに使用できる典型的な製剤は、０．１～４０パーセント、好ましくは１～３０パーセントの成分（Ａ）、（Ｂ）、及び任意選択的に（Ｄ）を含み、残りの量は水（Ｃ）である。エンドユーザーによって希釈される濃縮物の典型的な濃度は、５～７０パーセント、好ましくは１０～６０パーセントの成分（Ａ）、（Ｂ）、及び任意選択的に（Ｄ）を含み得、残りの量は水（Ｃ）である。

【0764】

例示的な混合物、組成物、産物、及びトランスジェニック生物
本開示は、１つ以上のＤＶＰ、又は１つ以上のＤＶＰ－殺虫タンパク質を含有する、又はトランスジェニック生物の場合、発現する、又はそうでなければ産生する混合物、組成物、生成物、及びトランスジェニック生物を企図する。

【0765】

一部の実施形態では、例示的混合物は、（１）ＤＶＰ、若しくはＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩、及び（２）賦形剤（例えば、本明細書に記載の賦形剤のいずれか）からなる。

【0766】

一部の実施形態では、本発明の混合物は、（１）１つ以上のＤＶＰ、若しくは１つ以上のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩及び（２）１つ以上の賦形剤（例えば、本明細書に記載の賦形剤のいずれか）からなる。

【0767】

一部の実施形態では、本発明の混合物は、（１）１つ以上のＤＶＰ、若しくは１つ以上のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩及び（２）１つ以上の賦形剤（例えば、本明細書に記載の賦形剤のいずれか）からなり、前述の（１）又は（２）のいずかを同時に、又は連続で使用し得る。

【0768】

ＤＶＰ、又はＤＶＰ－殺虫タンパク質（本明細書に記載される）を利用する組み合わせ、混合物、生成物、ポリペプチド、及び／又は植物のいずれも、害虫、その成長、及び／又はそれらの作用、特に植物へのそれらの損傷によって引き起こされる損傷を制御するために使用され得る。

【0769】

ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む組成物は、農薬組成物を含み得る。例えば、一部の実施形態では、農薬組成物は、エアロゾル及び／又はエアロゾル化生成物（例えば、噴霧、燻蒸剤、粉末、粉塵、及び／又はガス）、種子粉衣、経口調製物（例えば、昆虫食品など）、又は一過性及び／若しくは安定的のいずれかで、ＤＶＰ若しくはＤＶＰ－殺虫タンパク質を発現及び／若しくは産生するトランスジェニック生物（例えば、細胞、植物、又は動物）を含むことができるが、これらに限定されない。

【0770】

一部の実施形態では、本開示の活性成分は、組成物の形態で適用することができ、他の非活性化合物と同時に又は順次処理される作物領域又は植物に適用することができる。これこれらの化合物は、肥料、除草剤、凍結保護剤、界面活性剤、洗剤、石鹸、休眠油、ポリマー、及び／又は製剤の単回適用後の標的領域の長期投薬を可能にする徐放性若しくは生分解性の担体製剤であり得る。これらの非活性化合物のうちの１つ以上は、所望により、製剤化技術分野において通常用いられる更なる農業的に許容される担体、界面活性剤又は塗布促進アジュバントとともに調製され得る。好適な担体及びアジュバントは、固体又は液体であり得、製剤技術において通常用いられる物質（例えば、天然又は再生ミネラル物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着剤、結合剤、又は肥料）に相当する。同様に、製剤は、農薬製剤の標的害虫による摂食又は摂取を可能にするために、食用の「ベイト」に調製され得るか、又は害虫の「トラップ」に加工され得る。

【0771】

本開示の有効成分、又は本開示の本明細書に記載の方法によって産生されるＤＶＰ若しくはＤＶＰ－殺虫タンパク質若しくはその薬学的に許容される塩と賦形剤とからなる本開示の農薬組成物を適用する方法には、葉の適用、種子コーティング、及び土壌の適用が含まれる。一部の実施形態では、適用の数及び適用の速度は、対応する害虫による蔓延の強度に依存する。

【0772】

ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む組成物は、粉末、粉塵、ペレット、顆粒、噴霧、エマルション、コロイド、溶液などとして製剤化することができ、ポリペプチドを含む細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、又は濃縮などの従来の手段によって調製することができる。少なくとも１つのかかる農薬ポリペプチドを含有する全てのかかる組成物では、ポリペプチドが、約１重量％～約９９重量％の濃度で存在し得る。

【0773】

一部の実施形態では、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質（又はそれらの薬学的に許容される塩）を含有する組成物は、環境地域に予防的に適用されて、本発明の方法によって所与の地域で死滅する又は数が減少し得る、感受性の害虫、例えば、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ及び／又はＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ害虫による蔓延を防止し得る。一部の実施形態では、害虫は、農薬有効量のポリペプチドを摂取するか、又はそれに接触する。

【0774】

一部の実施形態では、本明細書に記載の農薬組成物は、ＤＶＰ若しくはＤＶＰ－殺虫タンパク質又はそれらの薬学的に許容される塩を形質転換された細菌、酵母、又は他の細胞、結晶及び／若しくは胞子懸濁液、又は単離されたタンパク質成分のいずれかを、所望の農業的に許容される担体とともに製剤化することによって作製され得る。組成物は、投与前、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）、乾燥、又は水性担体、培地、又は好適な希釈剤（例えば、生理食塩水及び／若しくは他の緩衝液）などの適切な手段で製剤化され得る。一部の実施形態では、製剤化された組成物は、粉塵材料若しくは粒状材料、又は油（植物油若しくはミネラルオイル）エマルション、若しくは水エマルション、若しくは油／水エマルション中の懸濁液、又は水和剤、又は農業用途に好適な任意の他の担体材料と組み合わせた形態であり得る。好適な農業的担体は、固体又は液体であり得、当該技術分野において周知である。一部の実施形態では、製剤は、１つ以上の固体又は液体アジュバントと混合され得、様々な手段によって、例えば、従来の製剤技術を使用して、農薬組成物を好適なアジュバントと均一に混合、ブレンド、及び／又は粉砕することによって調製され得る。好適な製剤化及び適用方法は、米国特許第６，４６８，５２３号に記載されている（その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0775】

本発明の使用方法
植物、植物部分、及び種子を保護するための方法
一部の実施形態では、本発明は、ＤＶＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドを発現する植物を提供することを含む、昆虫から植物を保護する方法を提供する。

【0776】

一部の実施形態では、本発明は、ＤＶＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドを発現する植物を提供することを含む、昆虫から植物を保護する方法を提供し、当該ＤＶＰは、本明細書に記載されるＤＶＰである。

【0777】

一部の実施形態では、本発明は、ＤＶＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドを発現する植物を提供することを含む、昆虫から植物を保護する方法を提供し、ＤＶＰは、配列番号１８７～１９１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ配列を有する。

【0778】

一部の実施形態では、本発明は、ＤＶＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドを発現する植物を提供することを含む、昆虫から植物を保護する方法を提供し、ＤＶＰは、配列番号１８７～１９１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。

【0779】

一部の実施形態では、本発明は、ＤＶＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドを発現する植物を提供することを含む、昆虫から植物を保護する方法を提供し、ＤＶＰは、２つ以上のＤＶＰのホモポリマー又はヘテロポリマーを更に含み、各ＤＶＰのアミノ酸配列は、同じであるか、又は異なる。

【0780】

一部の実施形態では、本発明は、ＤＶＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドを発現する植物を提供することを含む、昆虫から植物を保護する方法を提供し、ＤＶＰは、切断可能又は切断不能リンカーによって分離された２つ以上のＤＶＰを含む融合タンパク質であり得、各ＤＶＰのアミノ酸配列は、同じである場合も異なる場合もある。

【0781】

一部の実施形態では、本発明は、ＤＶＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドを発現する植物を提供することを含む、昆虫から植物を保護する方法を提供し、リンカーは、昆虫の腸内又は血液リンパ内で切断可能である。

【0782】

一部の実施形態では、本発明は、昆虫を制御するための方法であって、そのゲノムに安定的に組み込まれた発現カセットを含むトランスジェニック植物を当該昆虫に提供することを含み、当該安定的に組み込まれた発現カセットは、ＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。

【0783】

一部の実施形態では、本開示は、農学的及び／又は非農学的用途において有害無脊椎動物（ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｐｅｓｔ）を制御するための方法であって、有害無脊椎動物又その環境、植物表面若しくはその一部を含む固体表面を、生物学的有効量の本発明のＤＶＰのうちの１つ以上、又はＤＶＰ－殺虫タンパク質若しくはその薬学的に許容可能な塩と、接触することを含む、方法を提供する。

【0784】

一部の実施形態では、本開示は、農学的及び／又は非農学的用途において有害無脊椎動物（ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｐｅｓｔ）を制御するための方法であって、有害無脊椎動物又その環境、植物表面若しくはその一部を含む固体表面を、本発明の少なくとも１つＤＶＰと、賦形剤を含む組成物の生物学的有効量と、接触することを含む、方法を提供する。

【0785】

有害無脊椎動物を制御するための方法
一部の実施形態では、本開示は、農学的及び／又は非農学的用途において有害無脊椎動物（ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｐｅｓｔ）を制御するための方法であって、有害無脊椎動物又その環境、植物表面若しくはその一部を含む固体表面を、本発明の少なくとも１つＤＶＰ－殺虫タンパク質と、賦形剤を含む組成物の生物学的有効量と、接触することを含む、方法を提供する。

【0786】

以下を含む好適な組成物の例：（１）本発明の少なくとも１つのＤＶＰ、本発明のＤＶＰのうちの２つ以上、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、２つ以上のＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩、及び（２）液体溶液、乳剤、粉末、顆粒、ナノ粒子、微小粒子、又はそれらの組み合わせの形態で送達される不活性成分を獲るように製剤化された当該組成物を含む、賦形剤。

【0787】

一部の実施形態では、有害無脊椎動物から畑作物を保護するための本発明の化合物、混合物、又は組成物との接触を達成するために、化合物又は組成物は、典型的には、作物を植える前の作物の種子、作物植物の葉（例えば、葉、茎、花、果実）、又は作物が植えられる前若しくは植えられた後の土壌若しくは他の増殖培地に適用される。

【0788】

接触方法の一実施形態は、噴霧による方法である。代替的に、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、賦形剤とを含む粒状組成物を植物の葉又は土壌に適用することができる。本発明の化合物はまた、植物を本発明の化合物を含む組成物と接触させることによって、植物の取り込みを通して効果的に送達され得、組成物が、液体製剤の土壌ドレンチ（ｓｏｉｌ ｄｒｅｎｃｈ）、土壌への顆粒製剤、育苗箱（ｎｕｒｓｅｒｙ ｂｏｘ）処理、又は移植ディップ（ｄｉｐ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）として適用される。注目すべきは、土壌ドレンチ液体製剤の形態の本開示の組成物である。また、注目すべきは、有害無脊椎動物を制御するための方法であり、有害無脊椎動物又はその環境を生物学的有効量のＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質と接触させることを含む。更に注目すべきは、一部の例示的な実施形態では、例示的な方法は、土壌環境を企図し、組成物が土壌ドレンチ製剤として土壌に適用される。更に、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩も、侵入の遺伝子座に局所的に適用することによって有効であることに留意されたい。他の接触方法としては、直接及び残留噴霧、空中散布、ゲル、シードコーティング、マイクロカプセル化、浸透性摂取、ベイト、耳タグ、ボーラス、噴霧器、燻蒸剤、エアロゾル、粉塵、及び多くの他のものによる本発明の化合物又は組成物の適用が挙げられる。接触方法の一実施形態は、本発明の化合物又は組成物を含む寸法的に安定な肥料顆粒、スティック、又は錠剤である。本発明の化合物は、無脊椎動物制御デバイス（例えば、防虫ネット、衣類への適用、ロウソク製剤への適用など）を製造するための材料に含浸させることもできる。

【0789】

一部の実施形態では、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩は、有害無脊椎動物から種子を保護するための種子処理においても有用である。本開示及び特許請求の範囲の文脈において、種子を処置することは、種子を、典型的には本発明の組成物として製剤化される、生物学的有効量のＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と接触させることを意味する。この種子処理は、無脊椎動物の土壌害虫から種子を保護し、一般に、発芽する種子から発生する苗の、土壌と接触する根及び他の植物部分も保護することができる。種子処理はまた、発育中の植物内のＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質の移動によって葉の保護を提供してもよい。種子処理は、全ての種類の種子に適用することができ、特殊な形質を発現するように遺伝的に形質転換された植物が発芽するであろう種子が含まれる。加えて、ＤＶＰ又はＤＶＰ－殺虫タンパク質は、既に形質転換されている植物又はその一部、例えば、植物細胞又は植物種子、例えば、グリホサートに対する耐性を提供するグリホサートアセチルトランスフェラーゼなどの除草剤耐性を発現するものに形質転換され得る。

【0790】

種子処理の１つの方法は、種子を播種する前に、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩（すなわち、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と賦形剤とを含む配合された組成物又は混合物として）で種子を噴霧又は粉砕することである。種子処理のために製剤化される組成物は、概して、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、フィルム形成剤又は接着剤からなる。したがって、典型的には、本開示の種子コーティング組成物は、生物学的有効量のＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、フィルム形成剤又は接着剤からなる。種子は、流動性懸濁液濃縮物を直接種子の転動床に噴霧し、次いで、種子を乾燥させることによってコーティングすることができる。代替的に、他の製剤タイプ（例えば、湿潤粉末、溶液、サスポエマルション、乳化可能な濃縮物、及び水中のエマルション）を種子に噴霧することができる。このプロセスは、種子にフィルムコーティングを適用するために特に有用である。様々なコーティング機及びプロセスが、当業者に利用可能である。好適なプロセスとしては、Ｐ．Ｋｏｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｅｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，１９９４ ＢＣＰＣ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｎｏ．５７に列挙されているものが挙げられる（それに列挙されている参考文献及びその開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。

【0791】

処理された種子は、典型的には、１００ｋｇの種子当たり約０．０１ｇ～１ｋｇの範囲の量（すなわち、処理前の種子の約０．００００１～１重量％）のＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩を含む。種子処理のために製剤化される流動性懸濁液は、典型的には、約０．５～約７０％の活性成分、約０．５～約３０％の被膜形成接着剤、約０．５～約２０％の分散剤、０～約５％の増粘剤、０～約５％の顔料及び／又は色素、０～約２％の消泡剤、０～約１％の防腐剤、並びに０～約７５％の揮発性液体希釈剤を含む。

【0792】

組成物を使用する方法
一部の実施形態では、本発明は、昆虫を制御するために、（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を使用する方法であって、ＤＶＰは、本明細書に記載のＤＶＰのうちの１つ又は任意の組み合わせ、例えば、１つ以上の昆虫種に対する殺虫活性を有するＤＶＰから選択され、当該ＤＶＰは、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖに記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、アミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含み、当該方法は、混合物を調製し、次いで当該混合物を昆虫の遺伝子座に適用することを含む。

【0793】

一部の実施形態では、本発明は、昆虫を制御するための混合物を使用する方法を提供し、当該混合物は、（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含み、昆虫は以下からなる群から選択される：アヒマスフィンクスモス（ホーンワーム）（Ｅｕｍｏｒｐｈａ ａｃｈｅｍｏｎ）、アルファルファキャタピラー（Ｃｏｌｉａｓ ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ）、アーモンドモス（Ｃａｕｄｒａ ｃａｕｔｅｌｌａ）、アモルビアモス（Ａｍｏｒｂｉａ ｈｕｍｅｒｏｓａｎａ）、アーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．（例えば、ｅｘｉｇｕａ、ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、アーティチョークプルームモス（Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ）、アゼリアキャタピラー（Ｄａｔａｎａ ｍａｊｏｒ）、バッグワーム（Ｔｈｙｒｉｄｏｐｔｅｒｙｘ）、ｅｐｈｅｍｅｒａｅｆｏｒｍｉｓ）、バナナモス（Ｈｙｐｅｒｃｏｍｐｅ ｓｃｒｉｂｏｎｉａ）、バナナスキッパー（Ｅｒｉｏｎｏｔａ ｔｈｒａｘ）、ブラックヘディッドバドワーム（Ａｃｌｅｒｉｓ ｇｌｏｖｅｒａｎａ）、カルフォルニアオークワーム（Ｐｈｒｙｇａｎｉｄｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、スプリングキャンカーワーム（Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ ｍｅｒｒｉｃｃａｔａ）、チェリーフルーツワーム（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｐａｃｋａｒｄｉ）、チャイナマークモス（Ｎｙｍｐｈｕｌａ ｓｔａｇｎａｔａ）、シトラスカットワーム（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ ｃｕｒｉａｌｉｓ）、コドリングモス（Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、クランベリーフルーツワーム（Ａｃｒｏｂａｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｉｉ）、クロスストライプドキャベッジワーム（Ｅｖｅｒｇｅｓｔｉｓ ｒｉｍｏｓａｌｉｓ）、カットワーム（Ｎｏｃｔｕｉｄ種、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、ダグラスファータソックモス（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）、エルロモス（ホーンワーム）（Ｅｒｉｎｎｙｉｓ ｅｌｌｏ）、エルムスパンワーム（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ）、ヨーロピアングレープヴァインモス（Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ）、ヨーロピアンスキッパー（Ｔｈｙｍｅｌｉｃｕｓ ｌｉｎｅｏｌａ、エセックススキッパー、フォールウェブワーム（Ｍｅｌｉｓｓｏｐｕｓ ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎｕｓ））、フィルバートリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ｒｏｓａｎｕｓ））、フルーツツリーリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌｉａ））、グレープベリーモス（Ｐａｒａｌｏｂｅｓｉａ ｖｉｔｅａｎａ））、グレープリーフローラー（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ））、グレープリーフスケルトナイザー（Ｈａｒｒｉｓｉｎａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）（地面のみ）、グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ））、グリーンストライプドメープルワーム（Ｄｒｙｏｃａｍｐａ ｒｕｂｉｃｕｎｄａ））、Ｇｕｍｍｏｓｏｓ－Ｂａｔｒａｃｈｅｄｒａ ｃｏｍｏｓａｅ（ホッジズ）、ジプシーモス（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）、ヘムロックルーパー（Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ）、ホーンワーム（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｐｐ．）、インポーテッドキャベッジワーム（Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ）、アイオモス（Ａｕｔｏｍｅｒｉｓ ｉｏ）、ジャックパインバドワーム（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｐｉｎｕｓ）、ライトブラウンアップルモス（Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ）、メロンワーム（Ｄｉａｐｈａｎｉａ ｈｙａｌｉｎａｔａ）、ミモザウェブワーム（Ｈｏｍａｄａｕｌａ ａｎｉｓｏｃｅｎｔｒａ）、オブリークバンディッドリーフローラー（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ）、オリアンダーモス（Ｓｙｎｔｏｍｅｉｄａ ｅｐｉｌａｉｓ）、オムニバラスリーフローラー（Ｐｌａｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ）、オムニバラスルーパー（Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ ａｅｇｒｏｔａｔａ）、オレンジドッグ（Ｐａｐｉｌｉｏ ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ）、オレンジトートリクス（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｃｉｔｒａｎａ）、オリエンタルフルーツモス（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）、ピーチツイグボーア（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ）、パインバタフライ（Ｎｅｏｐｈａｓｉａ ｍｅｎａｐｉａ）、ポッドワーム、レッドバンディッドリーフローラー（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｖｅｌｕｔｉｎａｎａ）、レッドハンプトキャタピラー（Ｓｃｈｉｚｕｒａ ｃｏｎｃｉｎｎａ）、リンドワームコンプレックス、サドルバックキャタピラー（Ｓｉｂｉｎｅ ｓｔｉｍｕｌｅａ）、サドルプロミネントキャタピラー（Ｈｅｔｅｒｏｃａｍｐａ ｇｕｔｔｉｖｉｔｔａ）、ソルトマーシュキャタピラー（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ ａｃｒｅａ）、ソッドウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｓｐｐ．）、スパンワーム（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ）、フォールキャンカーワーム（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｍｅｔａｒｉａ）、スプルースバドワーム（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）、テントキャタピラー（Ｖａｒｉｏｕｓ Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、Ｔｈｅｃｌａ－Ｔｈｅｃｌａ Ｂａｓｉｌｉｄｅｓ（Ｇｅｙｒ）（Ｔｈｅｃｌａ ｂａｓｉｌｉｄｅｓ）、タバコホーンワーム（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）、タバコモス（Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｅｌｕｔｅｌｌａ）、タフテッドアップルバドモス（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｉｄａｅｕｓａｌｉｓ）、トゥイグボーア（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ）、ベアリアゲイティドカットワーム（Ｐｅｒｉｄｒｏｍａ ｓａｕｃｉａ）、ベアリアゲイティドリーフローラー（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｆｌａｖｅｄａｎａ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ウォルナットキャタピラー（Ｄａｔａｎａ ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ）、ウェブワーム（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ）、ウエスタンタソックモス（Ｏｒｇｙｉａ ｖｅｔｕｓｔａ）、サザンコーンストークボーア（Ｄｉａｔｒａｅａ ｃｒａｍｂｉｄｏｉｄｅｓ）、コーンイアワーム、スイートポテトウィービル、ペッパーウィービル、シトラスルートウィービル、ストロベリールートウィービル、ピーカンウィービル）、フィルバートウィービル、ライスウォーターウィービル、アルファルファウィービル、クローバーウィービル、ティーショット－ホールボーア、ルートウィービル、シュガーケインビートル、コーヒーベリーボーア、アニュアルブルーグラスウィービル（Ｌｉｓｔｒｏｎｏｔｕｓ ｍａｃｕｌｉｃｏｌｌｉｓ）、アジアティックガーデンビートル（Ｍａｌａｄｅｒａ ｃａｓｔａｎｅａ）、ヨーロピアンチェ－ファー（Ｒｈｉｚｏｔｒｏｑｕｓ ｍａｊａｌｉｓ）、グリーンジューンビートル（Ｃｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ）、ジャパニーズビートル（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、メイオアジューンビートル（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｓｐ．）、ノーザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、オリエンタルビートル（Ａｎｏｍａｌａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、サザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｌｕｒｉｄａ）、ビルバグ（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ｂｕｓｓｅｏｌａ ｆｕｓｃａ、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ、Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、及び／又はＸａｎｔｈｏｇａｌｅｒｕｃａ ｌｕｔｅｏｌａ。

【0794】

一部の実施形態では、本発明は、昆虫から植物を保護する方法を提供し、１つ以上のＤＶＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドを発現する植物を提供することを含む。

【0795】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、本明細書に記載のＤＶＰのうちの１つ又は任意の組み合わせ、例えば、殺虫ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａバリアントポリペプチド（ＤＶＰ）から選択され、当該ＤＶＰは、式（Ｉ）に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列であって、式（ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖ、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴである、アミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を含み、混合物は、害虫の遺伝子座、又は害虫による攻撃を受けやすい植物若しくは動物に適用される。

【0796】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、式（Ｉ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を有し、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｄ－Ｇ－Ｄ－Ｖ－Ｅ－Ｇ－Ｐ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｋ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｘ_２－Ｅ－Ｃ－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｇ－Ｅ－Ｃ－Ｃ－Ｑ－Ｋ－Ｑ－Ｙ－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｋ－Ｗ－Ｒ－Ｘ_７－Ｌ－Ｘ_８－Ｃ－Ｒ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｋ－Ｓ－Ｇ－Ｆ－Ｆ－Ｓ－Ｓ－Ｋ－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｃ－Ｒ－Ｄ－Ｖ、ポリペプチドが、配列番号２に示されるジゲトキシンの野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、式中、Ｘ_１が、Ｋ又はＬであり、Ｘ_２が、Ｖ、Ａ、又はＥであり、Ｘ_３が、Ｄ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ_４が、Ｓ又はＡであり、Ｘ_５が、Ｗ、Ａ、Ｆであり、Ｘ_６が、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、又はＫであり、Ｘ_７が、Ｐ又はＡであり、Ｘ_８が、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、又はＭであり、Ｘ_９が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１０が、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、又はＱであり、Ｘ_１１が、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、又はＶであり、Ｘ_１２が、Ｖ、Ａ、又はＴであり、Ｘ_９が、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶであるか、又はＸ_１１が、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、若しくはＶである場合、次いで、ジスルフィド結合が除去される。

【0797】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を有する。

【0798】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、配列番号６～４３、４５～５１、５３、１２８、１３０、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０２～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。

【0799】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を有する。

【0800】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、配列番号６～１１、１５～１６、２０～２２、２４～２６、２９、３５、４５～４８、５３、１２８、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２０７、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ配列有する。

【0801】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を有する。

【0802】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、配列番号４７、５３、１３６、１３９～１４０、１４４、１４６～１４７、１８７～１９１、２１０～２１５、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。

【0803】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ配列を有する。

【0804】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、ＤＶＰは、配列番号２１３、又は２１７～２１９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。

【0805】

一部の実施形態では、本発明は、害虫を駆除、制御、又は阻害する方法を提供し、害虫の部位への農薬有効量の（１）ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩と、（２）賦形剤とを含む混合物を適用することを含み、害虫は、以下からなる群から選択される：アヒマスフィンクスモス（ホーンワーム）（Ｅｕｍｏｒｐｈａ ａｃｈｅｍｏｎ）、アルファルファキャタピラー（Ｃｏｌｉａｓ ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ）、アーモンドモス（Ｃａｕｄｒａ ｃａｕｔｅｌｌａ）、アモルビアモス（Ａｍｏｒｂｉａ ｈｕｍｅｒｏｓａｎａ）、アーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．（例えば、ｅｘｉｇｕａ、ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、アーティチョークプルームモス（Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ）、アゼリアキャタピラー（Ｄａｔａｎａ ｍａｊｏｒ）、バッグワーム（Ｔｈｙｒｉｄｏｐｔｅｒｙｘ）、ｅｐｈｅｍｅｒａｅｆｏｒｍｉｓ）、バナナモス（Ｈｙｐｅｒｃｏｍｐｅ ｓｃｒｉｂｏｎｉａ）、バナナスキッパー（Ｅｒｉｏｎｏｔａ ｔｈｒａｘ）、ブラックヘディッドバドワーム（Ａｃｌｅｒｉｓ ｇｌｏｖｅｒａｎａ）、カルフォルニアオークワーム（Ｐｈｒｙｇａｎｉｄｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、スプリングキャンカーワーム（Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ ｍｅｒｒｉｃｃａｔａ）、チェリーフルーツワーム（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｐａｃｋａｒｄｉ）、チャイナマークモス（Ｎｙｍｐｈｕｌａ ｓｔａｇｎａｔａ）、シトラスカットワーム（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ ｃｕｒｉａｌｉｓ）、コドリングモス（Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、クランベリーフルーツワーム（Ａｃｒｏｂａｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｉｉ）、クロスストライプドキャベッジワーム（Ｅｖｅｒｇｅｓｔｉｓ ｒｉｍｏｓａｌｉｓ）、カットワーム（Ｎｏｃｔｕｉｄ種、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、ダグラスファータソックモス（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）、エルロモス（ホーンワーム）（Ｅｒｉｎｎｙｉｓ ｅｌｌｏ）、エルムスパンワーム（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ）、ヨーロピアングレープヴァインモス（Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ）、ヨーロピアンスキッパー（Ｔｈｙｍｅｌｉｃｕｓ ｌｉｎｅｏｌａ、エセックススキッパー、フォールウェブワーム（Ｍｅｌｉｓｓｏｐｕｓ ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎｕｓ））、フィルバートリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ｒｏｓａｎｕｓ））、フルーツツリーリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌｉａ））、グレープベリーモス（Ｐａｒａｌｏｂｅｓｉａ ｖｉｔｅａｎａ））、グレープリーフローラー（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ））、グレープリーフスケルトナイザー（Ｈａｒｒｉｓｉｎａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）（地面のみ）、グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ））、グリーンストライプドメープルワーム（Ｄｒｙｏｃａｍｐａ ｒｕｂｉｃｕｎｄａ））、Ｇｕｍｍｏｓｏｓ－Ｂａｔｒａｃｈｅｄｒａ ｃｏｍｏｓａｅ（ホッジズ）、ジプシーモス（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）、ヘムロックルーパー（Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ）、ホーンワーム（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｐｐ．）、インポーテッドキャベッジワーム（Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ）、アイオモス（Ａｕｔｏｍｅｒｉｓ ｉｏ）、ジャックパインバドワーム（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｐｉｎｕｓ）、ライトブラウンアップルモス（Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ）、メロンワーム（Ｄｉａｐｈａｎｉａ ｈｙａｌｉｎａｔａ）、ミモザウェブワーム（Ｈｏｍａｄａｕｌａ ａｎｉｓｏｃｅｎｔｒａ）、オブリークバンディッドリーフローラー（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ）、オリアンダーモス（Ｓｙｎｔｏｍｅｉｄａ ｅｐｉｌａｉｓ）、オムニバラスリーフローラー（Ｐｌａｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ）、オムニバラスルーパー（Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ ａｅｇｒｏｔａｔａ）、オレンジドッグ（Ｐａｐｉｌｉｏ ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ）、オレンジトートリクス（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｃｉｔｒａｎａ）、オリエンタルフルーツモス（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）、ピーチツイグボーア（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ）、パインバタフライ（Ｎｅｏｐｈａｓｉａ ｍｅｎａｐｉａ）、ポッドワーム、レッドバンディッドリーフローラー（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｖｅｌｕｔｉｎａｎａ）、レッドハンプトキャタピラー（Ｓｃｈｉｚｕｒａ ｃｏｎｃｉｎｎａ）、リンドワームコンプレックス、サドルバックキャタピラー（Ｓｉｂｉｎｅ ｓｔｉｍｕｌｅａ）、サドルプロミネントキャタピラー（Ｈｅｔｅｒｏｃａｍｐａ ｇｕｔｔｉｖｉｔｔａ）、ソルトマーシュキャタピラー（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ ａｃｒｅａ）、ソッドウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｓｐｐ．）、スパンワーム（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ）、フォールキャンカーワーム（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｍｅｔａｒｉａ）、スプルースバドワーム（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）、テントキャタピラー（Ｖａｒｉｏｕｓ Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、Ｔｈｅｃｌａ－Ｔｈｅｃｌａ Ｂａｓｉｌｉｄｅｓ（Ｇｅｙｒ）（Ｔｈｅｃｌａ ｂａｓｉｌｉｄｅｓ）、タバコホーンワーム（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）、タバコモス（Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｅｌｕｔｅｌｌａ）、タフテッドアップルバドモス（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｉｄａｅｕｓａｌｉｓ）、トゥイグボーア（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ）、ベアリアゲイティドカットワーム（Ｐｅｒｉｄｒｏｍａ ｓａｕｃｉａ）、ベアリアゲイティドリーフローラー（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｆｌａｖｅｄａｎａ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ウォルナットキャタピラー（Ｄａｔａｎａ ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ）、ウェブワーム（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ）、ウエスタンタソックモス（Ｏｒｇｙｉａ ｖｅｔｕｓｔａ）、サザンコーンストークボーア（Ｄｉａｔｒａｅａ ｃｒａｍｂｉｄｏｉｄｅｓ）、コーンイアワーム、スイートポテトウィービル、ペッパーウィービル、シトラスルートウィービル、ストロベリールートウィービル、ピーカンウィービル）、フィルバートウィービル、ライスウォーターウィービル、アルファルファウィービル、クローバーウィービル、ティーショット－ホールボーア、ルートウィービル、シュガーケインビートル、コーヒーベリーボーア、アニュアルブルーグラスウィービル（Ｌｉｓｔｒｏｎｏｔｕｓ ｍａｃｕｌｉｃｏｌｌｉｓ）、アジアティックガーデンビートル（Ｍａｌａｄｅｒａ ｃａｓｔａｎｅａ）、ヨーロピアンチェ－ファー（Ｒｈｉｚｏｔｒｏｑｕｓ ｍａｊａｌｉｓ）、グリーンジューンビートル（Ｃｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ）、ジャパニーズビートル（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、メイオアジューンビートル（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｓｐ．）、ノーザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、オリエンタルビートル（Ａｎｏｍａｌａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、サザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｌｕｒｉｄａ）、ビルバグ（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ｂｕｓｓｅｏｌａ ｆｕｓｃａ、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ、Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、及び／又はＸａｎｔｈｏｇａｌｅｒｕｃａ ｌｕｔｅｏｌａ。

【0806】

農作物及び害虫
これらの方法によって制御され得る特定の作物害虫及び昆虫には、以下が含まれる：Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ（ゴキブリ）、Ｉｓｏｐｔｅｒａ（シロアリ）、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ（ワタリバッタ、バッタ、コオロギ）、Ｄｉｐｔｅｒａ（イエバエ、カ、ツェツェバエ、ガガンボ、ショウジョウバエ）、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ（アリ、スズメバチ、ミツバチ、ハバチ、ヒメバチ、及びタマバチ）、Ａｎｏｐｌｕｒａ（ハジラミ及びシラミ）、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ（ノミ）、及びＨｅｍｉｐｔｅｒａ（虫及びアブラムシ）、並びにＡｃａｒｉ（ダニ及びダニ）などのクモ類、及びこれらの生物の各々が保有する寄生虫。

【0807】

「害虫」には、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0808】

害虫としては、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ａｎｏｐｌｕｒａ、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａなどの目から選択される昆虫が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、害虫としては、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、及びＤｉｐｔｅｒａが挙げられる。

【0809】

殺虫性ポリペプチドによる処理に好適な農業的、家庭的及び／又は医学的／獣医学的重要性を有する昆虫には、以下のクラス及び命令のメンバーが含まれるが、これらに限定されない。

【0810】

Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａには、Ａｄｅｐｈａｇａ及びＰｏｌｙｐｈａｇａが含まれる。Ａｄｅｐｈａｇａには、Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ及びＧｙｒｉｎｏｉｄｅａのスーパーファミリーが含まれる。Ｐｏｌｙｐｈａｇａには、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ、Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ、Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ、Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ、Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ、Ｄａｓｃｉｌｌｏｉｄｅａ、Ｄｒｙｏｐｏｉｄｅａ、Ｂｙｒｒｈｏｉｄｅａ、Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ、Ｍｅｌｏｉｄｅａ、Ｍｏｒｄｅｌｌｏｉｄｅａ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ、Ｂｏｓｔｒｉｃｈｏｉｄｅａ、Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ、Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ、及びＣｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａのスーパーファミリーが含まれる。Ｃａｒａｂｏｉｄｅａスーパーファミリーには、Ｃｉｃｉｎｄｅｌｉｄａｅ、Ｃａｒａｂｉｄａｅ、及びＤｙｔｉｓｃｉｄａｅが含まれる。Ｇｙｒｉｎｏｉｄｅａスーパーファミリーには、Ｇｙｒｉｎｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＨｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａには、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＳｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａには、Ｓｉｌｐｈｉｄａｅ及びＳｔａｐｈｙｌｉｎｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＣａｎｔｈａｒｏｉｄｅａには、Ｃａｎｔｈａｒｉｄａｅ及びＬａｍｐｙｒｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＣｌｅｒｏｉｄｅａには、Ｃｌｅｒｉｄａｅ及びＤｅｒｍｅｓｔｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＥｌａｔｅｒｏｉｄｅａには、Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ及びＢｕｐｒｅｓｔｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＣｕｃｕｊｏｉｄｅａには、Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＭｅｌｏｉｄｅａには、Ｍｅｌｏｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＴｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａには、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＳｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａには、Ｐａｓｓａｌｉｄａｅ及びＳｃａｒａｂａｅｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＣｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａには、Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＣｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａには、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅが含まれる。スーパーファミリーＣｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａには、Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ及びＳｃｏｌｙｔｉｄａｅが含まれる。

【0811】

Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａの例としては、アメリカンビーンウィービル（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｂｅａｎ ｗｅｅｖｉｌ）Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ、リーフビートル（ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ）Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ、クリックビートル（ｃｌｉｃｋ ｂｅｅｔｌｅ）（Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｌｉｎｅａｔｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｂｉｃｏｌｏｒ）、グレインビートル（ｇｒａｉｎ ｂｅｅｔｌｅ）Ａｈａｓｖｅｒｕｓ ａｄｖｅｎａ、サマーシェーファー（ｓｕｍｍｅｒ ｓｃｈａｆｅｒ）Ａｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ、ファーニチャービートル（ｆｕｒｎｉｔｕｒｅ ｂｅｅｔｌｅ）Ａｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｓｐｐ．（ウィービル（ｗｅｅｖｉｌ））、ピグミーマンゴールドビートル（Ｐｙｇｍｙ ｍａｎｇｏｌｄ ｂｅｅｔｌｅ）Ａｔｏｍａｒｉａ ｌｉｎｅａｒｉｓ、カーペットビートル（ｃａｒｐｅｔ ｂｅｅｔｌｅ）（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ ｓｐｐ、Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｓｐｐ）、カウピーウィービル（ｃｏｗｐｅａ ｗｅｅｖｉｌ）Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ｍａｃｕｌａｔｅｓ、フライドフルーツビートル（ｆｒｉｅｄ ｆｒｕｉｔ ｂｅｅｔｌｅ）Ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ、キャベッジシードポッドウィービル（ｃａｂｂａｇｅ ｓｅｅｄｐｏｄ ｗｅｅｖｉｌ）Ｃｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｓｓｉｍｉｌｉｓ、レイプウィンターステムウィービル（ｒａｐｅ ｗｉｎｔｅｒ ｓｔｅｍ ｗｅｅｖｉｌ）Ｃｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｐｉｃｉｔａｒｓｉｓ、ワイアワーム（ｗｉｒｅｗｏｒｍ）Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ｖｅｓｐｅｒｔｉｎｕｓ及びＣｏｎｏｄｅｒｕｓ ｆａｌｌｉ、バナナウィービル（ｂａｎａｎａ ｗｅｅｖｉｌ）Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ ｓｏｒｄｉｄｕｓ、ニュージーランドグラスグラブ（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｇｒａｓｓ ｇｒｕｂ）Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ、ジューンビートル（Ｊｕｎｅ ｂｅｅｔｌｅ）Ｃｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ、サンフラワーステムウィービル（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｔｅｍ ｗｅｅｖｉｌ）Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ ａｄｓｐｅｒｓｕｓ、ラーダービートル（ｌａｒｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ ｌａｒｄａｒｉｕｓ、コーンルートワーム（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、メキシカンビーンビートル（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ）Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ、オールドハウスボーア（ｏｌｄ ｈｏｕｓｅ ｂｏｒｅｒ）Ｈｙｌｏｔｒｏｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ、ルーサンウィービル（ｌｕｃｅｒｎｅ ｗｅｅｖｉｌ）Ｈｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ、シャイニースパイダービートル（ｓｈｉｎｙ ｓｐｉｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）Ｇｉｂｂｉｕｍ ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ、シガレットビートル（ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｂｅｅｔｌｅ）Ｌａｓｉｏｄｅｒｍａ ｓｅｒｒｉｃｏｒｎｅ、コロラドポテトビートル（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ）Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、リクタスビートル（Ｌｙｃｔｕｓ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｌｙｃｔｕｓ ｓｐｐ）、ポレンビートル（ｐｏｌｌｅｎ ｂｅｅｔｌｅ）Ｍｅｌｉｇｅｔｈｅｓ ａｅｎｅｕｓ、コモンコックスシェーファー（ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｃｋｓｈａｆｅｒ）Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ、アメリカンスパイダービートル（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓｐｉｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）Ｍｅｚｉｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、ゴールデンスパイダービートル（ｇｏｌｄｅｎ ｓｐｉｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）Ｎｉｐｔｕｓ ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ、グレインビートル（ｇｒａｉｎ ｂｅｅｔｌｅ）Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ及びＯｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｍｅｒｃａｔｏｒ、ブラックヴァインウィービル（ｂｌａｃｋ ｖｉｎｅ ｗｅｅｖｉｌ）Ｏｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｕｌｃａｔｕｓ、マスタードビートル（ｍｕｓｔａｒｄ ｂｅｅｔｌｅ）Ｐｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ、クルーシファーフリービートル（ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、ストライプドフリービートル（ｓｔｒｉｐｅｄ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｔｒｉｏｌａｔａ、キャベッジステムフリービートル（ｃａｂｂａｇｅ ｓｔｅａｍ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ ｃｈｒｙｓｏｃｅｐｈａｌａ、Ｐｔｉｎｕｓ ｓｐｐ（スパイダービートル（ｓｐｉｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅ））、レッサーグレインボーア（ｌｅｓｓｅｒ ｇｒａｉｎ ｂｏｒｅｒ）Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ、ピーウィービル及びビーンウィービル（ｐｅａ ａｎｄ ｂｅｅｎ ｗｅｅｖｉｌ）Ｓｉｔｏｎａ ｌｉｎｅａｔｕｓ、ライスビートル及びグラナリービートル（ｒｉｃｅ ａｎｄ ｇｒａｎａｒｙ ｂｅｅｔｌｅ）Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ及びＳｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｅｓ、レッドサンフラワーシードウィービル（ｒｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｗｅｅｖｉｌ）Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ、ドラッグストアビートル（ｄｒｕｇｓｔｏｒｅ ｂｅｅｔｌｅ）Ｓｔｅｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｃｅｕｍ、イエローミールワームビートル（ｙｅｌｌｏｗ ｍｅａｌｗｏｒｍ ｂｅｅｔｌｅ）Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ、フラワービートル（ｆｌｏｕｒ ｂｅｅｔｌｅ）Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ及びＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃｏｎｆｕｓｕｍ、ウェアハウスビートル及びキャビネットビートル（ｗａｒｅｈｏｕｓｅ ａｎｄ ｃａｂｉｎｅｔ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ）、及びサンフラワービートル（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。

【0812】

Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ（イアーウィグ）の例としては、ヨーロピアンイアーウィッグ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｅａｒｗｉｇ）Ｆｏｒｆｉｃｕｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ、及びストライプドイアウィッグ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｅａｒｗｉｇ）Ｌａｂｉｄｕｒａ ｒｉｐａｒｉａが挙げられるが、これらに限定されない。

【0813】

Ｄｉｃｔｖｏｎｔｅｒａの例としては、オリエンタルコックローチ（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ）Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、ジャーマンコックローチ（Ｇｅｒｍａｎ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ）Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ、マデイラコックローチ（Ｍａｄｅｉｒａ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ）Ｌｅｕｃｏｐｈａｅａ ｍａｄｅｒａｅ、アメリカンコックローチ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ）Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ、及びスモーキーブラウンコックローチ（ｓｍｏｋｙｂｒｏｗｎ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ）Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｆｕｌｉｇｉｎｏｓａが挙げられるが、これらに限定されない。

【0814】

Ｄｉｐｌｏｎｏｄａの例としては、スポッテッドスネークミリピード（ｓｐｏｔｔｅｄ ｓｎａｋｅ ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ）Ｂｌａｎｉｕｌｕｓ ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ、フラットバックミリピード（ｆｌａｔ－ｂａｃｋ ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ）Ｂｒａｃｈｙｄｅｓｍｕｓ ｓｕｐｅｒｕｓ、及びグリーンハウスミリピード（ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ）Ｏｘｉｄｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。

【0815】

Ｄｉｐｔｅｒａ目には、Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ、Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ、及びＣｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ亜目が含まれる。Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ亜目には、Ｔｉｐｕｌｉｄａｅ、Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ、Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ、Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｉｄａｅ、Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ科が含まれる。Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ亜目には、Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ、Ｔａｂａｎｉｄａｅ、Ｔｈｅｒｅｖｉｄａｅ、Ａｓｉｌｉｄａｅ、Ｍｙｄｉｄａｅ、Ｂｏｍｂｙｌｉｉｄａｅ、及びＤｏｌｉｃｈｏｐｏｄｉｄａｅ科が含まれる。Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ亜目には、Ａｓｃｈｉｚａ及びＡｓｃｈｉｚａ門が含まれる。Ａｓｃｈｉｚａ門には、Ｐｈｏｒｉｄａｅ、Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ、及びＣｏｎｏｐｉｄａｅ科が含まれる。Ａｓｃｈｉｚａ門には、Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ及びＣａｌｙｐｔｒａｔａｅ節が含まれる。Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ節には、Ｏｔｉｔｉｄａｅ、Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ、Ａｇｒｏｍｙｚｉｄａｅ、及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ科が含まれる。Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ節には、Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃｉｄａｅ、Ｏｅｓｔｒｉｄａｅ、Ｔａｃｈｉｎｉｄａｅ、Ａｎｔｈｏｍｙｉｉｄａｅ、Ｍｕｓｃｉｄａｅ、Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ、及びＳａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ科が含まれる。

【0816】

Ｄｉｐｔｅｒａの例には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イエバエ（ｈｏｕｓｅ ｆｌｙ）（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、アフリカンタンブフライ（Ａｆｒｉｃａｎ ｔｕｍｂｕ ｆｌｙ）（Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、バイティングミッジ（ｂｉｔｉｎｇ ｍｉｄｇｅ）（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）、ビーラウス（ｂｅｅ ｌｏｕｓｅ）（Ｂｒａｕｌａ ｓｐｐ．）、ビートフライ（ｂｅｅｔ ｆｌｙ）Ｐｅｇｏｍｙｉａ ｂｅｔａｅ、ブラックフライ（ｂｌａｃｋ ｆｌｙ）（Ｃｎｅｐｈｉａ ｓｐｐ．、Ｅｕｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ボットフライ（ｂｏｔ ｆｌｙ）（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ ｓｐｐ．、Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｏｅｓｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、クレーンフライ（ｃｒａｎｅ ｆｌｙ）（Ｔｉｐｕｌａ ｓｐｐ．）、アイナット（ｅｙｅ ｇｎａｔ）（Ｈｉｐｐｅｌａｔｅｓ ｓｐｐ．）、フィルスブリーディングフライ（ｆｉｌｔｈ－ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｆｌｙ）（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｓｐｐ．、Ｆａｎｎｉａ ｓｐｐ．、Ｈｅｒｍｅｔｉａ ｓｐｐ．、Ｌｕｃｉｌｉａ ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃａ ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃｉｎａ ｓｐｐ．、Ｐｈａｅｎｉｃｉａ ｓｐｐ．、Ｐｈｏｒｍｉａ ｓｐｐ．）、フレッシュフライ（ｆｌｅｓｈ ｆｌｙ）（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｓｐｐ．、Ｗｏｈｌｆａｈｒｔｉａ ｓｐｐ．）、フリットフライ（ｆｌｉｔ ｆｌｙ）Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ、ショウジョウバエ（ｆｒｉｔ，ｆｒｕｉｔｆｌｙ）（Ｄａｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）、ヘッド及びキャノンフライ（ｈｅａｄ ａｎｄ ｃａｎｏｎ ｆｌｙ）（Ｈｙｄｒｏｔｅａ ｓｐｐ．）、ヘシアンフライ（ｈｅｓｓｉａｎ ｆｌｙ）Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、ホーン及びバッファローフライ（ｈｏｒｎ ａｎｄ ｂｕｆｆａｌｏ ｆｌｙ）（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ ｓｐｐ．）、ホース及びディアフライ（ｈｏｒｓｅ ａｎｄ ｄｅｅｒ ｆｌｙ）（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ ｓｐｐ．、Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ ｓｐｐ．、Ｔａｂａｎｕｓ ｓｐｐ．）、ラウスフライ（ｌｏｕｓｅ ｆｌｙ）（Ｌｉｐｏｐｔｅｎａ ｓｐｐ．、Ｌｙｎｃｈｉａ ｓｐｐ．、及びＰｓｅｕｄｏｌｙｎｃｈｉａ ｓｐｐ．）、メドフライ（ｍｅｄｆｌｙ）（Ｃｅｒａｔｉｔｕｓ ｓｐｐ．）、蚊（Ａｅｄｅｓ ｓｐｐ．、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．、Ｃｕｌｅｘ ｓｐｐ．、Ｐｓｏｒｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、サンドフライ（ｓａｎｄｆｌｙ）（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ^．ｓｐｐ．）、スクリューワームフライ（ｓｃｒｅｗ－ｗｏｒｍ ｆｌｙ）（Ｃｈｔｙｓｏｍｙａ ｂｅｚｚｉａｎａ及びＣｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、シープケッド（ｓｈｅｅｐ ｋｅｄ）（Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ ｓｐｐ．）、ステーブルフライ（ｓｔａｂｌｅ ｆｌｙ）（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｓｐｐ．）、ツェツェバエ（ｔｓｅｔｓｅ ｆｌｙ）（Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｓｐｐ．）、及びワーブルフライ（ｗａｒｂｌｅ ｆｌｙ）（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）。

【0817】

Ｉｓｏｎｔｅｒａ（シロアリ）の例としては、Ｈｏｄｏｔｅｎｎｉｔｉｄａｅ、Ｋａｌｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ、Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ、Ｒｈｉｎｏｔｅｎｎｉｔｉｄａｅ、Ｓｅｒｒｉｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ、Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ、及びＴｅｒｍｏｐｓｉｄａｅ科の種が挙げられるが、これらに限定されない。

【0818】

Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａの例としては、ベッドバグ（ｂｅｄ ｂｕｇ）Ｃｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ、コットンステイナー（ｃｏｔｔｏｎ ｓｔａｉｎｅｒ）Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、サンペスト（Ｓｕｎｎ ｐｅｓｔ）Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ ｉｎｔｅｇｒｉｃｅｐｓ、ターニッシュドプラントバグ（ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ）Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、グリーンスティンクバグ（ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）Ｎｅｚａｒａ ａｎｔｅｎｎａｔａ、サザングリーンスティンクバグ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ、及びトリアトミドバグ（ｔｒｉａｔｏｍｉｄ ｂｕｇ）Ｐａｎｓｔｒｏｇｙｌｕｓ ｍｅｇｉｓｔｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐａｌｌｅｓｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｄｉｍｉｄｉａｔａ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、及びＴｒｉａｔｏｍａ ｓｏｒｄｉｄａが挙げられるが、これらに限定されない。

【0819】

Ｈｏｍｏｐｔｅｒａの例としては、カリフォルニアレッドスケール（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｒｅｄ ｓｃａｌｅ）Ａｏｎｉｄｉｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉｉ、ブラックビーンエイフィド（ｂｌａｃｋ ｂｅａｎ ａｐｈｉｄ）Ａｐｈｉｓ ｆａｂａｅ、コットンエイフィド又はメロンエイフィド（ｃｏｔｔｏｎ ｏｒ ｍｅｌｏｎ ａｐｈｉｄ）Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、グリーンアップルエイフィド（ｇｒｅｅｎ ａｐｐｌｅ ａｐｈｉｄ）Ａｐｈｉｓ ｐｏｍｉ、シトラススパイニーホワイトフライ（ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｉｎｙ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）Ａｌｅｕｒｏｃａｎｔｈｕｓ ｓｐｉｎｉｆｅｒｕｓ、オリアンダースケール（ｏｌｅａｎｄｅｒ ｓｃａｌｅ）Ａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｈｅｄｅｒａｅ、スイートポテトホワイトフライ（ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）Ｂｅｍｅｓｉａ ｔａｂａｃｉ、キャベッジエイフィド（ｃａｂｂａｇｅ ａｐｈｉｄ）Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、ペアシラ（ｐｅａｒ ｐｓｙｌｌａ）Ｃａｃｏｐｓｙｌｌａ ｐｙｒｉｃｏｌａ、カーラントエイフィド（ｃｕｒｒａｎｔ ａｐｈｉｄ）Ｃｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ ｒｉｂｉｓ、グレープフィロキセラ（ｇｒａｐｅ ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ）Ｄａｋｔｕｌｏｓｐｈａｉｒａ ｖｉｔｉｆｏｌｉａｅ、シトラスシラ（ｃｉｔｒｕｓ ｐｓｙｌｌａ）Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ ｃｉｔｒｉ、ポテトリーフホッパー（ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ、ビーンリーフホッパー（ｂｅａｎ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）Ｅｍｐｏａｓｃａ ｓｏｌａｎａ、ヴァインリーフホッパー（ｖｉｎｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）Ｅｍｐｏａｓｃａ ｖｉｔｉｓ、ウーリーエイフィド（ｗｏｏｌｌｙ ａｐｈｉｄ）Ｅｒｉｏｓｏｍａ ｌａｎｉｇｅｒｕｍ、ヨーロピアンフルーツスケール（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｆｒｕｉｔ ｓｃａｌｅ）Ｅｕｌｅｃａｎｉｕｍ ｃｏｒｎｉ、ミーリープラムエイフィド（ｍｅａｌｙ ｐｌｕｍ ａｐｈｉｄ）Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ、スモールブラウンプラントホッパー（ｓｍａｌｌ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ）Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ、ポテトエイフィド（ｐｏｔａｔｏ ａｐｈｉｄ）Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ、グリーンピーエイフィド（ｇｒｅｅｎ ｐｅａｃｈ ａｐｈｉｄ）Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、グリーンライスリーフホッパー（ｇｒｅｅｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ、ブラウンプラントホッパー（ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ）Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ、ゴールフォーミングエイフィド（ｇａｌｌ－ｆｏｒｍｉｎｇ ａｐｈｉｄ）（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｓｐｐ．）、ホップエイフィド（ｈｏｐ ａｐｈｉｄ）Ｐｈｏｒｏｄｏｎ ｈｕｍｕｌｉ、バードチェリーエイフィド（ｂｉｒｄ－ｃｈｅｒｒｙ ａｐｈｉｄ）Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ、ブラックスケール（ｂｌａｃｋ ｓｃａｌｅ）Ｓａｉｓｓｅｔｉａ ｏｌｅａｅ、グリーンバグ（ｇｒｅｅｎｂｕｇ）Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ、グレインエイフィド（ｇｒａｉｎ ａｐｈｉｄ）Ｓｉｔｏｂｉｏｎ ａｖｅｎａｅ、及びグリーンハウスホワイトフライ（ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。

【0820】

Ｉｓｏｐｏｄａの例としては、限定されないが、コモンピルバグ（ｃｏｍｍｏｎ ｐｉｌｌｂｕｇ）Ａｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ及びコモンウッドラウス（ｃｏｍｍｏｎ ｗｏｏｄｌｏｕｓｅ）Ｏｎｉｓｃｕｓ ａｓｅｌｌｕｓが挙げられるが、これらに限定されない。

【0821】

Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目には、Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ、Ｐｉｅｒｉｄａｅ、Ｌｙｃａｅｎｉｄａｅ、Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ、Ｄａｎａｉｄａｅ、Ｓａｔｙｒｉｄａｅ、Ｈｅｓｐｅｒｉｉｄａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ、Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ、Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ、Ａｒｃｔｉｉｄａｅ、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ、Ｌｙｍａｎｔｒｉｉｄａｅ、Ｓｅｓｉｉｄａｅ、及びＴｉｎｅｉｄａｅ科が含まれる。

【0822】

Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａ（サマーフルーツトートリクスモス（ｓｕｍｍｅｒ ｆｒｕｉｔ ｔｏｒｔｒｉｘ ｍｏｔｈ））、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｏｌｏｎ（ブラックカットワーム（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ））、Ａｒｃｈｉｐｓ ｐｏｄａｎａ（フルーツツリートートリクスモス（ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅ ｔｏｒｔｒｉｘ ｍｏｔｈ））、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｐｙｒｉｖｏｒｅｌｌａ（ペアリーフマイナー（ｐｅａｒ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ（コットンリーフパーフォレーター（ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｐｅｒｆｏｒａｔｏｒ））、Ｂｕｐａｌｕｓ ｐｉｎｉａｒｉｕｓ（パインルーパー（ｐｉｎｅ ｌｏｏｐｅｒ））、Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ（コドリングモス（ｃｏｄｌｉｎｇ ｍｏｔｈ））、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ストライプドライスボーア（ｓｔｒｉｐｅｄ ｒｉｃｅ ｂｏｒｅｒ））、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（イースタンスプルースバドワーム（ｅａｓｔｅｒｎ ｓｐｒｕｃｅ ｂｕｄｗｏｒｍ））、Ｃｏｃｈｙｌｉｓ ｈｏｓｐｅｓ（バンディッドサンフラワーモス（ｂａｎｄｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ））、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（サウスウエスタンコーンボーア（ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ））、Ｅａｒｌｓ ｉｎｓｕｌａｎａ（エジプシャンボールワーム（Ｅｇｙｐｔｉａｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ））、Ｅｕｐｈｅｓｔｉａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ（メディタレイニアンフラワーモス（Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｆｌｏｕｒ ｍｏｔｈ））、Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ（ヨーロピアングレープベリーモス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｇｒａｐｅ ｂｅｒｒｙ ｍｏｔｈ））、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ（ブラウンテイルモス（ｂｒｏｗｎ－ｔａｉｌ ｍｏｔｈ））、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｓｕｂｆｌａｖａ（オリエンタルツソックモス（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｔｕｓｓｏｃｋ ｍｏｔｈ））、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ（グレーターワックスモス（ｇｒｅａｔｅｒ ｗａｘ ｍｏｔｈ））、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ（コットンボールワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ））、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ（コットンボールワーム）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（タバコバドワーム（ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ））、Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｔｅｌｌａ（ブラウンハウスモス（ｂｒｏｗｎ ｈｏｕｓｅ ｍｏｔｈ））、Ｈｏｍｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ（サンフラワーモス（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ））、Ｈｏｍｏｎａ ｍａｇｎａｎｉｍａ（オリエンタルティーツリートートリクスモス（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｔｅａ ｔｒｅｅ ｔｏｒｔｒｉｘ ｍｏｔｈ））、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ（スポッテッドテンティフォームリーフマイナー（ｓｐｏｔｔｅｄ ｔｅｎｔｉｆｏｒｍ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ（ジプシーモス（ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ））、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ（テントキャタピラー（ｔｅｎｔ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（キャベッジアーミーワーム（ｃａｂｂａｇｅ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ（バーサアーミーワーム（Ｂｅｒｔｈａ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、ホーンワーム（ｈｏｒｎｗｏｒｍ）Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＭａｎｕｄｕｃａ ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ、Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａ（ウィンターモス（ｗｉｎｔｅｒ ｍｏｔｈ））、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（ヨーロピアンコーンボーア（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ））、Ｐａｎｏｌｉｓ ｆｌａｍｍｅａ（パインビューティーモス（ｐｉｎｅ ｂｅａｕｔｙ ｍｏｔｈ））、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ピンクボールワーム（ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ））、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ（シトラスリーフマイナー（ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））、Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（キャベッジホワイトバタフライ（ｃａｂｂａｇｅ ｗｈｉｔｅ ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ））、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（ダイアモンドバックモス（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ））、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ソイビーンルーパー（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ））、Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ（イエローベアモス（ｙｅｌｌｏｗ ｂｅａｒ ｍｏｔｈ））、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ（ビートアーミー（ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（フォールアーミーワーム（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ（コットンリーフワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆｗｏｒｉｎ））、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ（コモンカットワーム（ｃｏｍｍｏｎ ｃｕｔｗｏｒｍ））、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｐｒａｅｆｉｃａ（イエローストライプドアーミーワーム（ｙｅｌｌｏｗｓｔｒｉｐｅｄ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、Ｓｙｌｅｐｔａ ｄｅｒｏｇａｔａ（コットンリーフローラー（ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｒｏｌｌｅｒ））、Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ（ウェビングクローズモス（ｗｅｂｂｉｎｇ ｃｌｏｔｈｅｓ ｍｏｔｈ））、Ｔｉｎｅｏｌａ ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ（ケースメイキングクローズモス（ｃａｓｅ－ｍａｋｉｎｇ ｃｌｏｔｈｅｓ ｍｏｔｈ））、Ｔｏｒｔｒｉｘ ｖｉｒｉｄａｎａ（ヨーロピアンオークリーフローラー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｏａｋ ｌｅａｆｒｏｌｌｅｒ））、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（キャベッジルーパー（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ））、及びＹｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ（スモールエルミンモス（ｓｍａｌｌ ｅｒｍｉｎｅ ｍｏｔｈ））。

【0823】

Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａの例としては、コモンクリケット（ｃｏｍｍｏｎ ｃｒｉｃｋｅｔ）Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、ツリーローカスト（ｔｒｅｅ ｌｏｃｕｓｔ）（Ａｎａｃｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、マイグラトリローカスト（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｌｏｃｕｓｔ）Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、ツーストライプドグラスホッパー（ｔｗｏｓｔｒｉｐｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ、ディファレンシャルグラスホッパー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、レッドレッグドグラスホッパー（ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、マイグラトリグラスホッパー（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ノーザンモールクリケット（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍｏｌｅ ｃｒｉｃｋｅｔ）Ｎｅｏｃｕｒｔｉｌｌａ ｈｅｘａｄｅｃｔｙｌａ、レッドローカスト（ｒｅｄ ｌｏｃｕｓｔ）Ｎｏｍａｄａｃｒｉｓ ｓｅｐｔｅｍｆａｓｃｉａｔａ、ショートウィングドモールクリケット（ｓｈｏｒｔｗｉｎｇｅｄ ｍｏｌｅ ｃｒｉｃｋｅｔ）Ｓｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓ、サザンモールクリケット（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍｏｌｅ ｃｒｉｃｋｅｔ）Ｓｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｂｏｒｅｌｌｉｉ、タウニーモールクリケット（ｔａｗｎｙ ｍｏｌｅ ｃｒｉｃｋｅｔ）Ｓｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｖｉｃｉｎｕｓ、及びデザートローカスト（ｄｅｓｅｒｔ ｌｏｃｕｓｔ）Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａが挙げられるが、これらに限定されない。

【0824】

Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａの例としては、キャトルバイティングラウス（ｃａｔｔｌｅ ｂｉｔｉｎｇ ｌｏｕｓｅ）Ｂｏｖｉｃｏｌａ ｂｏｖｉｓ、ｂｉｔｉｎｇ ｌｉｃｅ（Ｄａｍａｌｉｎｉａ ｓｐｐ．）、キャットラウス（ｃａｔ ｌｏｕｓｅ）Ｆｅｌｉｃｏｌａ ｓｕｂｒｏｓｔｒａｔａ、ショートノーズドキャトルラウス（ｓｈｏｒｔｎｏｓｅｄ ｃａｔｔｌｅ ｌｏｕｓｅ）Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｅｌｏｙｓｔｅｒｎｕｓ、テイルスイッチラウス（ｔａｉｌ－ｓｗｉｔｃｈ ｌｏｕｓｅ）Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｑｕａｄｒｉｐｅｒｉｕｓｓｕｓ、ホッグラウス（ｈｏｇ ｌｏｕｓｅ）Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｓｕｉｓ、フェースラウス（ｆａｃｅ ｌｏｕｓｅ）Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｏｖｉｌｌｕｓ、フットラウス（ｆｏｏｔ ｌｏｕｓｅ）Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｐｅｄａｌｉｓ、ドッグサッキングラウス（ｄｏｇ ｓｕｃｋｉｎｇ ｌｏｕｓｅ）Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｓｅｔｏｓｕｓ、ロングノーズドキャトルラウス（ｌｏｎｇ－ｎｏｓｅｄ ｃａｔｔｌｅ ｌｏｕｓｅ）Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｖｉｔｕｌｉ、チキンボディラウス（ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｏｄｙ ｌｏｕｓｅ）Ｍｅｎａｃａｎｔｈｕｓ ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ、ポールトリシャフトラウス（ｐｏｕｌｔｒｙ ｓｈａｆｔ ｌｏｕｓｅ）Ｍｅｎｏｐｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、ヒューマンボディラウス（ｈｕｍａｎ ｂｏｄｙ ｌｏｕｓｅ）Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ、ピュビックラウス（ｐｕｂｉｃ ｌｏｕｓｅ）Ｐｈｔｈｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ、リトルブルーキャトルラウス（ｌｉｔｔｌｅ ｂｌｕｅ ｃａｔｔｌｅ ｌｏｕｓｅ）Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ ｃａｐｉｌｌａｔｕｓ、及びドッグバイティングラウス（ｄｏｇ ｂｉｔｉｎｇ ｌｏｕｓｅ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ ｃａｎｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。

【0825】

Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａの例としては、ブックライス（ｂｏｏｋｌｉｃｅ）Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｂｏｓｔｒｙｃｈｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｄｅｃｏｌｏｒ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、及びＴｒｏｇｉｕｍ ｐｕｌｓａｔｏｒｉｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａの例としては、トリノミ（ｂｉｒｄ ｆｌｅａ）Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ、イヌノミ（ｄｏｇ ｆｌｅａ）Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｃａｎｉｓ、ネコノミ（ｃａｔ ｆｌｅａ）Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｌｓ、ヒトノミ（ｈｕｍａｎ ｆｌｅａ）Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ、及びケオプスネズミノミ（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｒａｔ ｆｌｅａ）Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。

【0826】

Ｓｙｍｐｈｙｌａの例としては、ガーデンシンフィラン（ｇａｒｄｅｎ ｓｙｍｐｈｙｌａｎ）Ｓｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔｅが挙げられるが、これに限定されない。

【0827】

Ｔｈｙｓａｎｕｒａの例としては、グレイシルバーフィッシュ（ｇｒａｙ ｓｉｌｖｅｒｆｉｓｈ）Ｃｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔａ、フォーラインドシルバーフィッシュ（ｆｏｕｒ－ｌｉｎｅｄ ｓｉｌｖｅｒｆｉｓｈ）Ｃｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｑｕａｄｒｉｓｅｒｉａｔａ、コモンシルバーフィッシュ（ｃｏｍｍｏｎ ｓｉｌｖｅｒｆｉｓｈ）Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ、及びファイアブラット（ｆｉｒｅｂｒａｔ）Ｔｈｅｎｎｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａが挙げられるが、これらに限定されない。

【0828】

Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａの例としては、タバコトリプ（ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｉｐ）Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ、フラワートリプ（ｆｌｏｗｅｒ ｔｈｒｉｐ）Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｉｎｔｏｎｓａ、ウエスタンフラワートリプ（ｗｅｓｔｅｒｎ ｆｌｏｗｅｒ ｔｈｒｉｐ）Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、コットンバドトリプ（ｃｏｔｔｏｎ ｂｕｄ ｔｈｒｉｐ）Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｓｃｈｕｌｔｚｅｉ、バンディッドグリーンハウストリプ（ｂａｎｄｅｄ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｔｈｒｉｐ）Ｈｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ、ソイビーントリプ（ｓｏｙｂｅａｎ ｔｈｒｉｐ）Ｎｅｏｈｙｄａｔｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ケリーズシトラストリプ（Ｋｅｌｌｙ’ｓ ｃｉｔｒｕｓ ｔｈｒｉｐ）Ｐｅｚｏｔｈｒｉｐｓ ｋｅｌｌｙａｎｕｓ、アボガドトリプ（ａｖｏｃａｄｏ ｔｈｒｉｐ）Ｓｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ ｐｅｒｓｅａｅ、メロントリプ（ｍｅｌｏｎ ｔｈｒｉｐ）Ｔｈｒｉｐｓ ｐａｌｍｉ、及びオニオントリプ（ｏｎｉｏｎ ｔｈｒｉｐ）、Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉが挙げられるが、これらに限定されない。

【0829】

Ｎｅｍａｔｏｄｅの例としては、限定されないが、ネコブ線虫（ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）、シスト線虫（ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）、及びネグサレ線虫（ｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ）などの寄生線虫が挙げられ、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．、及びＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．が含まれる。特に、以下のシスト線虫のメンバーが含まれるが、これらに限定されない：Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（ダイズシスト線虫（ｓｏｙｂｅａｎ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ（ビートシスト線虫（ｂｅｅｔ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ（穀類シスト線虫（ｃｅｒｅａｌ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、及びＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ及びＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｉｌｉｄａ（ポテトシスト線虫（ｐｏｔａｔｏ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ））。ネグサレ線虫には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ種。

【0830】

本発明の影響を受けやすい他の昆虫種には、例えば、蚊、例えば、Ａｅｄｅｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ、及びＣｕｌｅｘ属由来の蚊、ダニ、ノミ、及びハエなどの公衆衛生及び動物衛生上の懸念を引き起こす有害節足動物が含まれる。

【0831】

一実施形態では、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩を使用して、外部寄生虫を処理することができる。外部寄生虫には、ノミ（ｆｌｅａｓ）、ダニ（ｔｉｃｋｓ）、マンジ（ｍａｎｇｅ）、コダニ（ｍｉｔｅｓ）、蚊、厄介なハエ（ｎｕｉｓａｎｃｅ ｆｌｉｅｓ）及びアブ（ｂｉｔｉｎｇ ｆｌｉｅｓ）、シラミ（ｌｉｃｅ）、並びに前述の外部寄生虫のうちの１つ以上を含む組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。「ノミ」という用語は、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ目の寄生ノミの通常種又は偶生種、特に、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ種特に、Ｃ．ｆｅｌｌｓ及びＣ．ｃａｍｓ、ネズミノミ（ｒａｔ ｆｌｅａ）（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓ）、及びヒトノミ（ｈｕｍａｎ ｆｌｅａ）（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）を含む。

【0832】

本発明は、主要な作物の害虫を制御、阻害、及び／又は殺すために使用され得、例えば、一部の実施形態では、主要な作物及び対応する害虫は、以下を含むが、これらに限定されない：トウモロコシ：Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ ヨーロピアンコーンボーア（ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ ブラックカットワーム（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ コーンイアワーム（ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ フォールアーミーワーム（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ サウスウエスタンコーンボーア（ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ レッサーコーンストークボーア（ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ シュガーケインボーア（ｓｕｒｇａｒｃａｎｅ ｂｏｒｅｒ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ウエスタンコーンルートワーム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ ｂａｒｂｅｒｉ ノーザンコーンルートワーム（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ サザンコーンルートワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．ワイヤワーム（ｗｉｒｅｗｏｒｍ）、Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ ノーザンマスクドチェイファー（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）（ホワイトグラブ（ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂ））、Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａ サザンマスクドチェイファー（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）（ホワイトグラブ（ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂ））、Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ ジャパニーズビートル（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ コーンフリービートル（ｃｏｒｎ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ メイズビルバグ（ｍａｉｚｅ ｂｉｌｌｂｕｇ）、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ コーンリーフエイフィド（ｃｏｒｎ ｌｅａｆ ａｐｈｉｄ）、Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ コーンルートエイフィド（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ａｐｈｉｄ）、Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ チンチバグ（ｃｈｉｎｃｈ ｂｕｇ）、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ レッドレッグドグラスホッパー（ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ マイグラトリグラスホッパー（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ シードコーンマゴット（ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ）、Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ コーンブロットリーフマイナー（ｃｏｒｎ ｂｌｏｔ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）、Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ グラストリップス（ｇｒａｓｓ ｔｈｒｉｐ）、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｍｉｌｅｓｔａ スィーフアント（ｔｈｉｅｆ ａｎｔ）、Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ ツースポッテッドスパイダーマイト（ｔｗｏｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）。モロコシ：Ｃｈｉｌｏ ｐａｒｔｅｌｌｕｓ ソルガムボーア（ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｏｒｅｒ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ フォールアーミーワーム（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ コーンイアワーム（ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ）、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ レッサーコーンストークボーア（ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）、Ｆｅｌｔｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ グラニュレイトカットワーム（ｇｒａｎｕｌａｔｅ ｃｕｔｗｏｒｍ）、Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ ホワイトグラブ（ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂ）、Ｅｌｅｏｄｅｓ Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ａｎｄ Ａｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．ワイアワーム（ｗｉｒｅｗｏｒｍ）、Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ シリアルリーフビートル（ｃｅｒｅａｌ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ コーンフリービートル（ｃｏｒｎ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ メイズビルバグ（ｍａｉｚｅ ｂｉｌｌｂｕｇ）、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ コーンリーフエイフィド（ｃｏｒｎ ｌｅａｆ ａｐｈｉｄ）、Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ イエローシュガーケインエイフィド（ｙｅｌｌｏｗ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ａｐｈｉｄ）、Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ チンチバグ（ｃｈｉｎｃｈ ｂｕｇ）、Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ ソルガムミッジ（ｓｏｒｇｈｕｍ ｍｉｄｇｅ）、Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ カーミンスパイダーマイト（ｃａｒｍｉｎｅ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）、Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ ツースポッテッドスパイダーマイト（ｔｗｏｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）。コムギ：Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ アーミーワーム（ａｒｍｙ ｗｏｒｍ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ フォールアーミーワーム（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ レッサーコーンストークボーア（ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）、Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ ウエスタンカットワーム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｕｔｗｏｒｍ）、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ レッサーコーンストークボーア（ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）、Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ シリアルリーフビートル（ｃｅｒｅａｌ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ クローバーリーフウィービル（ｃｌｏｖｅｒ ｌｅａｆ ｗｅｅｖｉｌ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ サザンコーンルートワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、ロシアンウィートエイフィィド（Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ）、Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ グリーンバグ（ｇｒｅｅｎｂｕｇ）、Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ イングリッシュグレインエイフィド（Ｅｎｇｌｉｓｈ ｇｒａｉｎ ａｐｈｉｄ）、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ レッドレッグドグラスホッパー（ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ ディファレンシャルグラスホッパー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ マイグラトリグラスホッパー（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ ヘシアンフライ（Ｈｅｓｓｉａｎ ｆｌｙ）、Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ ウィートミッジ（ｗｈｅａｔ ｍｉｄｇｅ）、Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ ウィートステムマゴット（ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｍａｇｇｏｔ）、Ｈｙｌｅｍｙａ ｃｏａｒｃｔａｔａ ウィートバルブフライ（ｗｈｅａｔ ｂｕｌｂ ｆｌｙ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ タバコスリップス（ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｉｐ）、Ｃｅｐｈｕｓ ｃｉｎｃｔｕｓ ウィートステムソーフライ（ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｓａｗｆｌｙ）、Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ ウィートカールマイト（ｗｈｅａｔ ｃｕｒｌ ｍｉｔｅ）。ヒマワリ：Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ サンフラワーバドモス（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄ ｍｏｔｈ）、Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ サンフラワーモス（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ）、Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ サンフラワービートル（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｂｏｔｈｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ キャロットビートル（ｃａｒｒｏｔ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ サンフラワーシードミッジ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｍｉｄｇｅ）。ワタ：Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ コットンバドワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｂｕｄｗｏｒｍ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ コットンボールワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ ビートアーミーワーム（ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ ピンクボールワーム（ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ ボールウィービル（ｂｏｌｌ ｗｅｅｖｉｌ）、Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ コットンエイフィド（ｃｏｔｔｏｎ ａｐｈｉｄ）、Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ コットンフリーホッパー（ｃｏｔｔｏｎ ｆｌｅａｈｏｐｐｅｒ）、Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ バンディッドウィングドホワイトフライ（ｂａｎｄｅｄ ｗｉｎｇｅｄ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）、Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ ターニシュドプラントバグ（ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ）、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ レッドレッグドグラスホッパー（ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ ディファレンシャルグラスホッパー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ オニオントリプ（ｏｎｉｏｎ ｔｈｒｉｐ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ タバコトリプ（ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｉｐ）、Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ カーミンスパイダーマイト（ｃａｒｍｉｎｅ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）、Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ ツースポッテッドスパイダーマイト（ｔｗｏｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）。イネ：Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ シュガーケインボーア（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂｏｒｅｒ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ フォールアーミーワーム（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ コーンイアワーム（ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ）、Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ グレープコラスピス（ｇｒａｐｅ ｃｏｌａｓｐｉｓ）、Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ ライスウォーターウィービル（ｒｉｃｅ ｗａｔｅｒ ｗｅｅｖｉｌ）、Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ライスウィービル（ｒｉｃｅ ｗｅｅｖｉｌ）、Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ ライスリーフホッパー（ｒｉｃｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）、Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ チンチバグ（ｃｈｉｎｃｈ ｂｕｇ）、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ グリーンスティンクバグ（ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）。ダイズ：Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ ソイビーンルーパー（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ）、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ ベルベットビーンキャタピラー（ｖｅｌｖｅｔ ｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ グリーンクローバーワーム（ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒ ｗｏｒｍ）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ ヨーロピアンコーンボーア（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ ブラックカットワーム（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ ビートアーミーワーム（ｂｅｅｔ ａｒ
ｍｙｗｏｒｍ）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ コットンバドワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｂｕｄｗｏｒｍ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ コットンボールワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ メキシカンビーンビートル（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ グリーンビーチエイフィド（ｇｒｅｅｎ ｐｅａｃｈ ａｐｈｉｄ）、Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ ボテトリーフホッパー（ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ グリーンスティンクバグ（ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ レッドレッグドグラスホッパー（ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ ディファレンシャルグラスホッパー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ シードコーンマゴット（ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ）、Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ソイビーントリプ（ｓｏｙｂｅａｎ ｔｈｒｉｐ）、Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ オニオントリプ（ｏｎｉｏｎ ｔｈｒｉｐ）、Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ ストロベリースパイダーマイト（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）、Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ ツースポッテッドスパイダーマイト（ｔｗｏｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）。オオムギ：Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ ヨーロピアンコーンボーア（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ ブラックカットワーム（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）、Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ グリーンバグ（ｇｒｅｅｎｂｕｇ）、Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ チンチバグ（ｃｈｉｎｃｈ ｂｕｇ）、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ グリーンスティンクバグ（ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ ブラウンスティンクバグ（ｂｒｏｗｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）、Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ シードコーンマゴット（ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ）、Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ ヘシアンフライ（Ｈｅｓｓｉａｎ ｆｌｙ）、Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ ブラウンウィートマイト（ｂｒｏｗｎ ｗｈｅａｔ ｍｉｔｅ）。セイヨウアブラナ：Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ キャベッジエイフィド（ｃａｂｂａｇｅ ａｐｈｉｄ）、Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ フリービートル（Ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ バーサアーミーワーム（Ｂｅｒｔｈａ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ダイアモンドバックモス（Ｄｉａｍｏｎｄ－ｂａｃｋ ｍｏｔｈ）、Ｄｅｌｉａ ｓｓｐ．ルートマゴット（Ｒｏｏｔ ｍａｇｇｏｔ）。

【0833】

一部の実施形態では、ＤＶＰ、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、又はそれらの薬学的に許容される塩を用いて、前述の昆虫のうちのいずれか１つ以上を処理することができる。

【0834】

本発明の影響を受けやすい昆虫としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｌａｔｔａｒｉａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍｉｄａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ、Ｒｈａｂｄｉｔｉｄａ、Ｓｉｐｈｏｎｏｐｔｅｒａ、及びＴｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ。属種は以下のように示される：Ａｃｔｅｂｉａ ｆｅｎｎｉｃａ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ、Ａ．ｓｅｇｅｔｕｍ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｃｉｔｒａｎａ、Ａｒｔｏｇｅｉａ ｒａｐａｅ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｂｕｓｓｅｏｌａ ｆｕｓｃａ、Ｃａｃｙｒｅｕｓ ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｈｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ、Ｃ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｃ．ｐｉｎｕｓ ｐｉｎｕｓ、Ｃ．ｒｏｓａｃｅｎａ、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｎｏｐｏｍｏｒｐｈａ ｃｒａｍｅｒｅｌｌａ、Ｃｔｅｎｏｐｓｕｅｓｔｉｓ ｏｂｌｉｑｕａｎａ、Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｄａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｌｉｓ、Ｄ．ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｅｌａｓｍｏｌｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｉｕｓ、Ｅｌｄａｎａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ、Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ、Ｅｐｉｎｏｔｉａ ａｐｏｒｅｍａ、Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｇｅｎｕｓ－Ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、Ｈ．ｐｕｎｃｔｉｇｅｒａ、Ｈ．ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ、Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ、Ｌｅｇｕｍｉｎｉｖｏｒａ ｇｌｙｃｉｎｉｖｏｒｅｌｌａ、Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｍ．ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ、Ｍａｒａｓｍｉａ ｐａｔｎａｌｉｓ、Ｍａｒｕｃａ ｖｉｔｒａｔａ、Ｏｒｇｙｉａ ｌｅｕｃｏｓｔｉｇｍａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｏ．ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｐａｎｄｅｍｉｓ ｐｙｒｕｓａｎａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ ｃｏｆｆｅｅｌｌａ、Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａ ｏｐｅｒｃｕｌｌｅｌａ、Ｐｉａｎｏｔｏｒｔｒｉｘ ｏｃｔｏ、Ｐｉａｔｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ、Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔａｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ、Ｓｃｉｒｏｐｏｐｈａｇａ ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ、Ｓｅｓａｍｉａ ｃａｌａｍｉｓｔｉｓ、Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｅｍｐｔａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、Ｔｅｃｉａ ｓｏｌａｎｉｖｏｒａ、Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｗｉｓｅａｎａ ｃｅｒｖｉｎａｔａ、Ｗｉｓｅａｎａ ｃｏｐｕｌａｒｉｓ、Ｗｉｓｅａｎａ ｊｏｃｏｓａ、Ｂｌａｔｔａｒｉａ ｂｌａｔｔｅｌｌａ、Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ ｘｅｎｙｌｌａ、Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ ｆｏｌｓｏｍｉａ、Ｆｏｌｓｏｍｉａ ｃａｎｄｉｄａ、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍｉｄａ ｆａｓｃｉｏｌａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ ｏｎｃｏｐｅｌｔｒｕｓ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ ｂｅｍｉｓｉａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ ｍｙｚｕｓ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ ｄｉｐｒｉｏｎ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ ａｐｉｓ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ Ｍａｃｒｏｃｅｎｔｒｕｓ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ Ｍｅｔｅｏｒｕｓ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ Ｎａｓｏｎｉａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ、Ｉｓｏｐｏｄａ ｐｏｒｃｅｌｌｉｏ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ Ａｃｈｔａ、Ｐｒｏｓｔｉｇｍａｔａ ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ｄｉｓｔｏｌａｂｒｅｌｌｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ、及びＳｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ。

【0835】

本開示は、植物形質転換のための方法を提供し、これは、任意の植物種（単子葉植物及び双子葉植物を含むが、これらに限定されない）の形質転換のために使用され得る。トランスジェニックアプローチが特に有用であろう作物としては、アルファルファ、ワタ、トマト、トウモロコシ、コムギ、トウモロコシ、スイートコーン、ルーサン、ダイズ、モロコシ、エンドウ、アマニ、ベニバナ、ナタネ、セイヨウアブラナ、イネ、ダイズ、オオムギ、ヒマワリ、木（針葉樹及び落葉樹を含む）、花（商業的に栽培されるもの、温室で栽培されるものを含む）、ハウチワマメ、スイッチグラス、サトウキビ、ジャガイモ、トマト、タバコ、ジュウジバナ、ピーマン、サトウダイコン、オオムギ、及びセイヨウアブラナ、アブラナ属種、ライムギ、アワ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサヤ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類、カカオ、チャ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、カセイ、パパイア、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観賞植物又は針葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。

【0836】

本開示は、植物形質転換のための方法を提供し、これは、任意の植物種（単子葉植物及び双子葉植物を含むが、これらに限定されない）の形質転換のために使用され得る。トランスジェニックアプローチ又は植物に組み込まれた保護剤（ＰＩＰ）が特に有用であろう作物としては、アルファルファ、ワタ、トマト、トウモロコシ、コムギ、トウモロコシ、スイートコーン、ルーサン、ダイズ、モロコシ、エンドウ、アマニ、ベニバナ、ナタネ、セイヨウアブラナ、イネ、ダイズ、オオムギ、ヒマワリ、木（針葉樹及び落葉樹を含む）、花（商業的に栽培されるもの、温室で栽培されるものを含む）、ハウチワマメ、スイッチグラス、サトウキビ、ジャガイモ、トマト、タバコ、ジュウジバナ、ピーマン、サトウダイコン、オオムギ、及びセイヨウアブラナ、アブラナ属種、ライムギ、アワ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサヤ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類、カカオ、チャ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、カセイ、パパイア、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観賞植物又は針葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。

【0837】

一部の実施形態では、本発明の組成物、混合物、及び／又は方法は、以下からなる群から選択される昆虫及び／又は害虫の遺伝子座に適用され得る：ルーパー、オムニバラスリーフローラー、ホーンワーム、インポーテッドキャベッジワーム、ダイアモンドバックモス、グリーンクローバーワーム、ウェブワーム、ソルトマーシュキャタピラー、アーミーワーム、カットワーム、クロスストライプドキャベッジワーム、ポッドワーム、ベルベットビーンキャタピラー、ソイビーンルーパー、トマトフルーツワーム、ベアリアゲイティドカットワーム、メロンワーム、リンドワームコンプレックス、フルーツツリーリーフローラー、シトラスカットワーム、ヘリオティス、オレンジドッグ、シトラスカットワーム、レッドハンプドキャタピラー、テントキャタピラー、フォールウェブワーム、ウォールナッツキャタピラー、カンカーワーム、ジプシーモス、ベアリアゲイティドリーフローラー、レッドバンディッドリーフローラー、タフテッドアップルバドモス、オリエンタルフルーツモス）、フィルバートリーフローラー、オブリークバンディッドリーフローラー、コドリングモス、トゥイグボーア、グレープリーフスケルトナイザー、グレープリーフローラー、アキーマスフィンクスモス（ホーンワーム）、オレンジトートリクス、タバコバドワーム、グレープベリーモス、スパンワーム、アルファルファキャタピラー、コットンボールワーム、ヘッドモス、アもビアモス、オムニバラスルーパー、エローモス（ホーンワーム）、イオモス、オリアンダーモス、アゼリアキャタピラー、ホーンワーム、リーフローラー、バナナスキッパー、Ｂａｔｒａｃｈｅｄｒａ ｃｏｍｏｓａｅ（ホッジ）、テクラモス、アーティチョークプルームモス、シスルバタフライ、バッグワーム、スプリング＆フォールカンカーワーム、エルムスパンワーム、カルフォルニアオーク、パインバタフライ 、スプルースバドワーム、サドルプロミネントキャタピラー、ダグラスファアタソックモス、ウエスタンタソックモス、ブラックヘディッドバドワーム、ミモザウェブワーム、ジャックパインバドワーム、サドルバックキャタピラー、グリーンストライプドメープルワーム、又はヘムロックルーパー。

【0838】

一部の実施形態では、本発明の組成物、混合物、及び／又は方法は、以下からなる群から選択される昆虫及び／又は害虫の遺伝子座に適用され得る：アヒマスフィンクスモス（ホーンワーム）（Ｅｕｍｏｒｐｈａ ａｃｈｅｍｏｎ）、アルファルファキャタピラー（Ｃｏｌｉａｓ ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ）、アーモンドモス（Ｃａｕｄｒａ ｃａｕｔｅｌｌａ）、アモルビアモス（Ａｍｏｒｂｉａ ｈｕｍｅｒｏｓａｎａ）、アーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．（例えば、ｅｘｉｇｕａ、ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、アーティチョークプルームモス（Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ）、アゼリアキャタピラー（Ｄａｔａｎａ ｍａｊｏｒ）、バッグワーム（Ｔｈｙｒｉｄｏｐｔｅｒｙｘ）、ｅｐｈｅｍｅｒａｅｆｏｒｍｉｓ）、バナナモス（Ｈｙｐｅｒｃｏｍｐｅ ｓｃｒｉｂｏｎｉａ）、バナナスキッパー（Ｅｒｉｏｎｏｔａ ｔｈｒａｘ）、ブラックヘディッドバドワーム（Ａｃｌｅｒｉｓ ｇｌｏｖｅｒａｎａ）、カルフォルニアオークワーム（Ｐｈｒｙｇａｎｉｄｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、スプリングキャンカーワーム（Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ ｍｅｒｒｉｃｃａｔａ）、チェリーフルーツワーム（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｐａｃｋａｒｄｉ）、チャイナマークモス（Ｎｙｍｐｈｕｌａ ｓｔａｇｎａｔａ）、シトラスカットワーム（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ ｃｕｒｉａｌｉｓ）、コドリングモス（Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、クランベリーフルーツワーム（Ａｃｒｏｂａｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｉｉ）、クロスストライプドキャベッジワーム（Ｅｖｅｒｇｅｓｔｉｓ ｒｉｍｏｓａｌｉｓ）、カットワーム（Ｎｏｃｔｕｉｄ種、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、ダグラスファータソックモス（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）、エルロモス（ホーンワーム）（Ｅｒｉｎｎｙｉｓ ｅｌｌｏ）、エルムスパンワーム（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ）、ヨーロピアングレープヴァインモス（Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ）、ヨーロピアンスキッパー（Ｔｈｙｍｅｌｉｃｕｓ ｌｉｎｅｏｌａ）（エセックススキッパー）、フォールウェブワーム（Ｍｅｌｉｓｓｏｐｕｓ ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎｕｓ）、フィルバートリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ｒｏｓａｎｕｓ）、フルーツツリーリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌｉａ）、グレープベリーモス（Ｐａｒａｌｏｂｅｓｉａ ｖｉｔｅａｎａ）、グレープリーフローラー（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ）、グレープリーフスケルトナイザー（Ｈａｒｒｉｓｉｎａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）（地面のみ）、グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ）、グリーンストライプドメープルワーム（Ｄｒｙｏｃａｍｐａ ｒｕｂｉｃｕｎｄａ）、Ｇｕｍｍｏｓｏｓ－Ｂａｔｒａｃｈｅｄｒａ ｃｏｍｏｓａｅ（ホッジズ）、ジプシーモス（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）、ヘムロックルーパー（Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ）、ホーンワーム（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｐｐ．）、インポーテッドキャベッジワーム（Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ）、アイオモス（Ａｕｔｏｍｅｒｉｓ ｉｏ）、ジャックパインバドワーム（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｐｉｎｕｓ）、ライトブラウンアップルモス（Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ）、メロンワーム（Ｄｉａｐｈａｎｉａ ｈｙａｌｉｎａｔａ）、ミモザウェブワーム（Ｈｏｍａｄａｕｌａ ａｎｉｓｏｃｅｎｔｒａ）、オブリークバンディッドリーフローラー（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ）、オリアンダーモス（Ｓｙｎｔｏｍｅｉｄａ ｅｐｉｌａｉｓ）、オムニバラスリーフローラー（Ｐｌａｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ）、オムニバラスルーパー（Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ ａｅｇｒｏｔａｔａ）、オレンジドッグ（Ｐａｐｉｌｉｏ ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ）、オレンジトートリクス（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｃｉｔｒａｎａ）、オリエンタルフルーツモス（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）、ピーチツイグボーア（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ）、パインバタフライ（Ｎｅｏｐｈａｓｉａ ｍｅｎａｐｉａ）、レッドバンディッドリーフローラー（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｖｅｌｕｔｉｎａｎａ）、レッドハンプトキャタピラー（Ｓｃｈｉｚｕｒａ ｃｏｎｃｉｎｎａ）、リンドワームコンプレックス（Ｖａｒｉｏｕｓ Ｌｅｐｓ．）、サドルバックキャタピラー（Ｓｉｂｉｎｅ ｓｔｉｍｕｌｅａ）、サドルプロミネントキャタピラー（Ｈｅｔｅｒｏｃａｍｐａ ｇｕｔｔｉｖｉｔｔａ）、ソルトマーシュキャタピラー（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ ａｃｒｅａ）、ソッドウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｓｐｐ．）、スパンワーム（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ）、フォールキャンカーワーム（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｍｅｔａｒｉａ）、スプルースバドワーム（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）、テントキャタピラー（Ｖａｒｉｏｕｓ Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、Ｔｈｅｃｌａ－Ｔｈｅｃｌａ Ｂａｓｉｌｉｄｅｓ（Ｇｅｙｒ）（Ｔｈｅｃｌａ ｂａｓｉｌｉｄｅｓ）、タバコホーンワーム（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）、タバコモス（Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｅｌｕｔｅｌｌａ）、タフテッドアップルバドモス（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｉｄａｅｕｓａｌｉｓ）、トゥイグボーア（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ）、ベアリアゲイティドカットワーム（Ｐｅｒｉｄｒｏｍａ ｓａｕｃｉａ）、ベアリアゲイティドリーフローラー（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｆｌａｖｅｄａｎａ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ウォルナットキャタピラー（Ｄａｔａｎａ ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ）、ウェブワーム（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ）、ウエスタンタソックモス（Ｏｒｇｙｉａ ｖｅｔｕｓｔａ）、サザンコーンストークボーア（Ｄｉａｔｒａｅａ ｃｒａｍｂｉｄｏｉｄｅｓ）、コーンイアワーム、スイートポテトウィービル、ペッパーウィービル、シトラスルートウィービル、ストロベリールートウィービル、ピーカンウィービル）、フィルバートウィービル、ライスウォーターウィービル、アルファルファウィービル、クローバーウィービル、ティーショット－ホールボーア、ルートウィービル、シュガーケインビートル、コーヒーベリーボーア、アニュアルブルーグラスウィービル（Ｌｉｓｔｒｏｎｏｔｕｓ ｍａｃｕｌｉｃｏｌｌｉｓ）、アジアティックガーデンビートル（Ｍａｌａｄｅｒａ ｃａｓｔａｎｅａ）、ヨーロピアンチェ－ファー（Ｒｈｉｚｏｔｒｏｑｕｓ ｍａｊａｌｉｓ）、グリーンジューンビートル（Ｃｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ）、ジャパニーズビートル（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、メイオアジューンビートル（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｓｐ．）、ノーザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、オリエンタルビートル（Ａｎｏｍａｌａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、サザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｌｕｒｉｄａ）、ビルバグ（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ｂｕｓｓｅｏｌａ ｆｕｓｃａ、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ、Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、及び／又はＸａｎｔｈｏｇａｌｅｒｕｃａ ｌｕｔｅｏｌａ。

【0839】

一部の実施形態では、本発明の組成物、混合物、及び／又は方法は、以下からなる群から選択される成虫の遺伝子座に適用され得る：アジアティックガーデンビートル（Ｍａｌａｄｅｒａ ｃａｓｔａｎｅａ）、ゴールドスポッテッドオークボーア（Ａｇｒｉｌｕｓ ｃｏｘａｌｉｓ ａｕｒｏｇｕｔｔａｔｕｓ）、グリーンジューンビートル（Ｃｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ）、ジャパニーズビートル（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、メイ又はジューンビートル（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｓｐ．）、オリエンタルビートル（Ａｎｏｍａｌａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、及び／又はソープベリーボーア（Ａｇｒｉｌｕｓ ｐｒｉｏｎｕｒｕｓ）。

【0840】

一部の実施形態では、本発明の組成物、組み合わせ、及び／又は方法は、以下からなる群から選択される幼虫（一年地虫）である昆虫及び／又は害虫の遺伝子座に適用され得る：アニュアルブルーグラスウィービル（Ｌｉｓｔｒｏｎｏｔｕｓ ｍａｃｕｌｉｃｏｌｌｉｓ）、アジアティックガーデンビートル（Ｍａｌａｄｅｒａ ｃａｓｔａｎｅａ）、ヨーロピアンチェ－ファー（Ｒｈｉｚｏｔｒｏｑｕｓ ｍａｊａｌｉｓ）、グリーンジューンビートル（Ｃｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ）、ジャパニーズビートル（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、メイ又はジューンビートル（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｓｐ．）、ノーザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、オリエンタルビートル（Ａｎｏｍａｌａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、サザンマスクドチェ－ファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｌｕｒｉｄａ）、及びビルバグ（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）。

【0841】

シスチンノット構造
システインリッチタンパク質（ＣＲＰ）は、システイン残基に富むペプチドであり、一部の実施形態では、かかるシステイン残基間にジスルフィド結合を形成するように動作可能である。一部の実施形態では、ＣＲＰは、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のシステインアミノ酸を含有する。一部の実施形態では、ＣＲＰ中に存在するシステイン残基は、３つ以上のジスルフィド結合を形成し得る。一部の実施形態では、ジスルフィド結合は、殺虫ペプチドの折り畳み、三次元構造、及び活性に寄与する。

【0842】

ＣＲＰは、それらのシステイン－システインジスルフィド結合の効力により、環境に曝露されたときに顕著な安定性を有し得る。一部の実施形態では、ＣＲＰは、殺虫特性を有し得る。例えば、一部の実施形態では、ＣＲＰは、システインリッチ殺虫タンパク質（ＣＲＩＰ）であり得る。一部の実施形態では、システイン－システインジスルフィド結合、及びそれらから形成される三次元構造は、これらのタンパク質の殺虫性質において重要な役割を果たす。

【0843】

一部の実施形態では、ＣＲＰ中に存在する３つのジスルフィド結合は、シスチンノット（ＣＫ）モチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し得る。シスチンノット（ＣＫ）モチーフは、少なくとも３つのジスルフィド架橋又は結合（システイン分子の対の間に形成される）を含むタンパク質構造モチーフである。シスチンノットは、構造内の内部リングを形成する、２つのジスルフィド結合及びそれらの接続する骨格セグメントから構築され、それは、第３のジスルフィド結合によってねじ切られインターロック及び交差分岐構造を形成し、ロタキサン基質を形成する。

【0844】

一部の実施形態では、３つのジスルフィド結合は、以下のＣＫモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを作製するジスルフィド結合トポロジーを有する。

【0845】

阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）、又は「ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）」は、少なくとも３つのジスルフィド結合を含有するタンパク質構造モチーフである。結合間のペプチドサブユニットとともに、２つのジスルフィド（それぞれ、第１及び第４のシステイン及並びに第２及び第５のシステインを連結する）は、第３のジスルフィド結合（配列中の第３及び第６のシステインを連結する）が通過するループを形成し、ノットを形成する。モチーフは、クモ科及び軟体動物などの無脊椎動物毒素に一般的である。モチーフは、植物に見られるいくつかの阻害タンパク質にも見出される。

【0846】

ＩＣＫモチーフを含むタンパク質は、１６～６０個のアミノ酸長であり得、少なくとも６個のハーフシスチンコアアミノ酸は少なくとも３つのジスルフィド架橋を有し、３個のジスルフィド架橋は共有結合であり、６個のハーフシスチン残基のうち、共有ジスルフィド結合は、Ｎ末端アミノ酸から始まる６個のコアハーフシスチンアミノ酸の第１の（Ｃ^Ｉ）及び第４の（Ｃ^ＩＶ）、第２の（Ｃ^ＩＩ）及び第５の（Ｃ^Ｖ）、並びに第３の（Ｃ^ＩＩＩ）及び第６の（Ｃ^ＶＩ）ハーフシスチン間にある。概して、この種類のタンパク質は、通常、モチーフの第４のコアハーフシスチンと第６のコアハーフシスチンとの間に位置する残基で構成されるベータヘアピン二次構造を含み、ヘアピンが、モチーフの３つのジスルフィド結合によって提供される構造的架橋によって安定化される。追加のシステイン／シスチン又はハーフシスチンアミノ酸が、阻害剤シスチンノットモチーフ内に存在し得ることに留意されたい。

【0847】

環状シスチンノット（ＣＣＫ）又はシクロチドはＩＣＫに類似しているが、ＣＣＫペプチドは環化されている。ＣＣＫは、２つの主要な構造サブファミリーに分類される：メビウスシクロチドは、２つの中ではあまり一般的ではないが、ループ５にシスプロリンを含み、局所的な１８０°骨格ねじれを誘導する。トリプシン阻害剤シクロチドは、配列変動及び自然活性に基づいて独自のファミリーに分類される。トリプシン阻害剤シクロチドは、他のシクロチドよりも、ノット又は阻害剤シスチンノットとして知られるカボチャ植物由来の非環状トリプシン阻害剤のファミリーにより相同である。ここで、「環状」又は「環化された」とは、遊離アミノ末端及びカルボキシ末端を含まないアミノ酸残基又はその類似体の配列を含む分子を指す。一部の実施形態では、環化されたペプチドは、アミド（ペプチド）結合を介してペプチド内の全てのアミノ酸間の結合を含むが、他の化学リンカーも可能である。

【0848】

成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）も同様に、ＩＣＫペプチドと同様のモチーフを有するが、そのトポロジーは、Ｃ^ＩとＣ^ＩＶとの間の結合がループ（それぞれ、Ｃ^ＩＩ及びＣ^ＶシステインとＣ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩシステインとの間に形成される）を通るようなものである。

【0849】

結合を除去することにより式（ＩＩ）のＣＫ構造に到達する
本発明は、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる組換えＣＲＰを操作する方法であって、

【化4】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、当該組換えＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを修飾することによって作製されており、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、ＣＫモチーフを形成せず、修飾可能なＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾されており、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらし、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する、方法を企図し、教示する。

【0850】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるＣＲＩＰは、以下のプロセス：７つ以上のシステインアミノ酸残基を有するポリペプチドから１つ以上のシステインアミノ酸残基を除去することに従って作製され、ポリペプチドは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない。

【0851】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰから１つ以上のシステインアミノ酸残基を除去することにより、修飾可能なＣＲＰからの１つ以上のジスルフィド結合の除去がもたらされる。

【0852】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することにより、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰがもたらされ、以下の効果がもたらされる：式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しないポリペプチドと比較して、例えば、組換えタンパク質発現系における組換えＣＲＰの発現の増加。

【0853】

当業者に既知のペプチド収量を測定するための様々な方法がある。一部の実施形態では、ペプチド収量は、「正規化ペプチド収量」であり得、これは、条件培地中のペプチド収量を、ペプチド収量を測定した時点での対応する細胞密度で割ったものを意味する。ペプチド収量は、単位体積における産生されたペプチドの質量（例えば、ｍｇ／リットル若しくはｍｇ／Ｌ）で、又はＨＰＬＣクロマトグラフにおける産生されたペプチドの紫外線吸光度ピーク面積（例えば、ｍＡｕ．ｓｅｃ）で表すことができる。細胞密度は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の波長での培養の可視光吸光度で表すことができる。「ＯＤ」は、光学密度を指す。典型的には、分光光度計を使用してＯＤが測定される。細胞集団の経時的な増殖を測定する場合、紫外線分光法よりもＯＤ６００が好ましい。これは、過剰な紫外線光の下では細胞が損傷を受けることから、６００ｎｍの波長で、そうならないようにするためである。「ＯＤ６６０ｎｍ」又は「ＯＤ_{６６０ｎｍ}」は、６６０ナノメートル（ｎｍ）での光学密度を指す。

【0854】

一部の実施形態では、本発明の組換えＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有するタンパク質を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造は、システイン及びジスルフィド結合トポロジーの構成を指し、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有するタンパク質は、共通の構造的類似性を有する。ここで、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造は、３つのジスルフィド結合によって連結された６つのシステイン残基を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなり、ジスルフィド結合は、システインＣ^ＩとＣ^ＩＶとの間、Ｃ^ＩＩとＣ^Ｖとの間、及びＣ^ＩＩＩとＣ^ＶＩとの間に接続される。

【0855】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又は１００％超と等しい又はそれより多い発現レベルの増加を有する。

【0856】

一部の実施形態では、本発明の組換えＣＲＰは、ジスルフィド結合トポロジーを有し、ジスルフィド結合トポロジーは、以下のシスチンノットモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを形成する。

【0857】

一部の実施形態では、本発明の組換えＣＲＰは、ジスルフィド結合トポロジーを有し、ジスルフィド結合トポロジーは、ＩＣＫモチーフを形成する。

【0858】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰであり、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、ＣＫモチーフを形成しない。

【0859】

したがって、一部の実施形態では、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び／又は第３のジスルフィド結合ではない任意の追加のジスルフィド結合であり、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合である。言い換えれば、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び／若しくは第３のジスルフィド結合ではない追加のジスルフィド結合が存在する、並びに／又はそれらの接続する骨格セグメントと協調して、構造内のリングを形成する２つのジスルフィド結合、及び／若しくはこの環をねじ切ってインターロッキング及びクロスブレース構造を形成する第３のジスルフィド結合のうちの１つではない場合、したがって、かかる追加のジスルフィド結合は、非ＣＫジスルフィド結合である。

【0860】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰであり、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、ＣＫモチーフを形成せず、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾され得る。

【0861】

一部の実施形態では、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらす。

【0862】

一部の実施形態では、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾ＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することにより、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰがもたらされ、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾ＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する。

【0863】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較した式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰの発現レベルの増加は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．８％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約１．２５％、少なくとも約１．５％、少なくとも約１．７５％、少なくとも約２％、少なくとも約２．２５％、少なくとも約２．５％、少なくとも約２．７５％、少なくとも約３％、少なくとも約３．２５％、少なくとも約３．５％、少なくとも約３．７５％、少なくとも約４％、少なくとも約４．２５％、少なくとも約４．５％、少なくとも約４．７５％、少なくとも約５％、少なくとも約５．２５％、少なくとも約５．５％、少なくとも約５．７５％、少なくとも約６％、少なくとも約６．２５％、少なくとも約６．５％、少なくとも約６．７５％、少なくとも約７％、少なくとも約７．２５％、少なくとも約７．５％、少なくとも約７．７５％、少なくとも約８％、少なくとも約８．２５％、少なくとも約８．５％、少なくとも約８．７５％、少なくとも約９％、少なくとも約９．２５％、少なくとも約９．５％、少なくとも約９．７５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、又は１００％超からの範囲の組換えＣＲＰの発現レべルの増加であり得る。

【0864】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較した式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰの発現レベルの増加は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルより、約０．０１％から、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、５００％、５１０％、５２０％、５３０％、５４０％、５５０％、５６０％、５７０％、５８０％、５９０％、６００％、６１０％、６２０％、６３０％、６４０％、６５０％、６６０％、６７０％、６８０％、６９０％、７００％、７１０％、７２０％、７３０％、７４０％、７５０％、７６０％、７７０％、７８０％、７９０％、８００％、８１０％、８２０％、８３０％、８４０％、８５０％、８６０％、８７０％、８８０％、８９０％、９００％、９１０％、９２０％、９３０％、９４０％、９５０％、９６０％、９７０％、９８０％、９９０％、約１０００％超までの範囲の増加であり得る。

【0865】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾される。

【0866】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントである。

【0867】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、配列番号１～２、１９３、１９５又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0868】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、配列番号１～２、１９３、１９５又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。

【0869】

一部の実施形態では、組換えＣＲＰは、配列番号６～１４、１９７、１９９又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0870】

一部の実施形態では、組換えＣＲＰは、配列番号６～１４、１９７、１９９又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。

【0871】

式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含む組換えＣＲＰを作製する方法
一部の実施形態では、本発明は、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を含む組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を作製する方法であって、

【化5】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｃ_３、Ｌ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、当該方法が、（ａ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを提供することであって、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、ＣＫモチーフを形成しない、提供することと、（ｂ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって、修飾可能なＣＲＰを修飾することと、を含み、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらし、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する、方法を提供する。

【0872】

一部の実施形態では、本方法は、ジスルフィド結合トポロジーを有する組換えＣＲＰを提供し、ジスルフィド結合トポロジーは、以下のシスチンノットモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを形成する。

【0873】

一部の実施形態では、本方法は、ジスルフィド結合トポロジーを有する組換えＣＲＰを提供し、ジスルフィド結合トポロジーは、ＩＣＫモチーフを形成する。

【0874】

一部の実施形態では、本方法は、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰである修飾可能なＣＲＰを提供し、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、ＣＫモチーフを形成しない。したがって、一部の実施形態では、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び／又は第３のジスルフィド結合ではない任意の追加のジスルフィド結合であり、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合である。言い換えれば、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び／若しくは第３のジスルフィド結合ではない追加のジスルフィド結合が存在する、並びに／又はそれらの接続する骨格セグメントと協調して、構造内のリングを形成する２つのジスルフィド結合、及び／若しくはこの環をねじ切ってインターロッキング及びクロスブレース構造を形成する第３のジスルフィド結合のうちの１つではない場合、したがって、かかる追加のジスルフィド結合は、非ＣＫジスルフィド結合である。

【0875】

一部の実施形態では、本方法は、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを提供し、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、ＣＫモチーフを形成せず、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾され得る。

【0876】

一部の実施形態では、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾ＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することにより、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰがもたらされ、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾ＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する。

【0877】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較した式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰの発現レベルの増加は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．８％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約１．２５％、少なくとも約１．５％、少なくとも約１．７５％、少なくとも約２％、少なくとも約２．２５％、少なくとも約２．５％、少なくとも約２．７５％、少なくとも約３％、少なくとも約３．２５％、少なくとも約３．５％、少なくとも約３．７５％、少なくとも約４％、少なくとも約４．２５％、少なくとも約４．５％、少なくとも約４．７５％、少なくとも約５％、少なくとも約５．２５％、少なくとも約５．５％、少なくとも約５．７５％、少なくとも約６％、少なくとも約６．２５％、少なくとも約６．５％、少なくとも約６．７５％、少なくとも約７％、少なくとも約７．２５％、少なくとも約７．５％、少なくとも約７．７５％、少なくとも約８％、少なくとも約８．２５％、少なくとも約８．５％、少なくとも約８．７５％、少なくとも約９％、少なくとも約９．２５％、少なくとも約９．５％、少なくとも約９．７５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、又は１００％超からの範囲の組換えＣＲＰの発現レべルの増加であり得る。

【0878】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較した式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰの発現レベルの増加は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルより、約０．０１％から、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、５００％、５１０％、５２０％、５３０％、５４０％、５５０％、５６０％、５７０％、５８０％、５９０％、６００％、６１０％、６２０％、６３０％、６４０％、６５０％、６６０％、６７０％、６８０％、６９０％、７００％、７１０％、７２０％、７３０％、７４０％、７５０％、７６０％、７７０％、７８０％、７９０％、８００％、８１０％、８２０％、８３０％、８４０％、８５０％、８６０％、８７０％、８８０％、８９０％、９００％、９１０％、９２０％、９３０％、９４０％、９５０％、９６０％、９７０％、９８０％、９９０％、約１０００％超までの範囲の増加であり得る。

【0879】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾される。

【0880】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントである。

【0881】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰを提供する方法ステップは、配列番号１～２、１９３、１９５又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を提供することを含む。

【0882】

一部の実施形態では、組換えＣＲＰの作製は、配列番号６～１４、１９７、１９９又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む組換えＣＲＰの作製をもたらす。

【0883】

一部の実施形態では、本方法は、以下のシスチンノットモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを形成するジスルフィド結合トポロジーを有する組換えＣＲＰをもたらす。

【0884】

一部の実施形態では、本方法は、ＩＣＫモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有する組換えＣＲＰを提供する。

【0885】

一部の実施形態では、本方法は、修飾可能なＣＲＰを提供し、修飾可能なＣＲＰは、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントである。

【0886】

一部の実施形態では、本方法は、配列番号１～２、１９３、１９５又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む修飾可能なＣＲＰを提供する。

【0887】

一部の実施形態では、本方法は、配列番号１～２、１９３、１９５又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる修飾可能なＣＲＰを提供する。

【0888】

一部の実施形態では、本方法は、配列番号６～１４、１９７、１９９又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む組換えＣＲＰを作製する。

【0889】

一部の実施形態では、本方法は、配列番号６～１４、１９７、１９９又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる組換えＣＲＰを作製する。

【0890】

組換えＣＲＰの収量を増加させる方法
一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）の収量を増加させる方法を提供し、当該方法は、（ａ）式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を有する組換えＣＲＰを作製することであって、

【化6】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、当該組換えＣＲＰが、以下のプロセスに従って作製される、作製することと、（ｂ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを提供することであって、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、ＣＫモチーフを形成しない、提供することと、（ｃ）１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって、修飾可能なＣＲＰを修飾することと、を含み、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらし、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する。

【0891】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、ジスルフィド結合トポロジーを有する組換えＣＲＰを提供し、ジスルフィド結合トポロジーは、以下のシスチンノットモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを形成する。

【0892】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、ジスルフィド結合トポロジーを有する組換えＣＲＰを提供し、ジスルフィド結合トポロジーは、ＩＣＫモチーフを形成する。

【0893】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰである修飾可能なＣＲＰを提供し、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、ＣＫモチーフを形成しない。したがって、一部の実施形態では、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び／又は第３のジスルフィド結合ではない任意の追加のジスルフィド結合であり、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合である。言い換えれば、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び／若しくは第３のジスルフィド結合ではない追加のジスルフィド結合が存在する、並びに／又はそれらの接続する骨格セグメントと協調して、構造内のリングを形成する２つのジスルフィド結合、及び／若しくはこの環をねじ切ってインターロッキング及びクロスブレース構造を形成する第３のジスルフィド結合のうちの１つではない場合、したがって、かかる追加のジスルフィド結合は、非ＣＫジスルフィド結合である。

【0894】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを提供し、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合は、ＣＫモチーフを形成せず、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾され得る。

【0895】

一部の実施形態では、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾ＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することにより、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰがもたらされ、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾ＣＲＰのタンパク質の収量又はタンパク質の発現レベルと比較して、増加したタンパク質の発現レベル又は増加したタンパク質の収量を有する。

【0896】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較した式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰの発現レベルの増加は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．８％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約１．２５％、少なくとも約１．５％、少なくとも約１．７５％、少なくとも約２％、少なくとも約２．２５％、少なくとも約２．５％、少なくとも約２．７５％、少なくとも約３％、少なくとも約３．２５％、少なくとも約３．５％、少なくとも約３．７５％、少なくとも約４％、少なくとも約４．２５％、少なくとも約４．５％、少なくとも約４．７５％、少なくとも約５％、少なくとも約５．２５％、少なくとも約５．５％、少なくとも約５．７５％、少なくとも約６％、少なくとも約６．２５％、少なくとも約６．５％、少なくとも約６．７５％、少なくとも約７％、少なくとも約７．２５％、少なくとも約７．５％、少なくとも約７．７５％、少なくとも約８％、少なくとも約８．２５％、少なくとも約８．５％、少なくとも約８．７５％、少なくとも約９％、少なくとも約９．２５％、少なくとも約９．５％、少なくとも約９．７５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、又は１００％超からの範囲の組換えＣＲＰの発現レべルの増加であり得る。

【0897】

一部の実施形態では、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較した式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰの発現の収量レベルの増加は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルより、約０．０１％から、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、５００％、５１０％、５２０％、５３０％、５４０％、５５０％、５６０％、５７０％、５８０％、５９０％、６００％、６１０％、６２０％、６３０％、６４０％、６５０％、６６０％、６７０％、６８０％、６９０％、７００％、７１０％、７２０％、７３０％、７４０％、７５０％、７６０％、７７０％、７８０％、７９０％、８００％、８１０％、８２０％、８３０％、８４０％、８５０％、８６０％、８７０％、８８０％、８９０％、９００％、９１０％、９２０％、９３０％、９４０％、９５０％、９６０％、９７０％、９８０％、９９０％、約１０００％超までの範囲の増加であり得る。

【0898】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾される修飾可能なＣＲＰを提供する。

【0899】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントである修飾可能なＣＲＰを提供する。

【0900】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰを提供する収量ステップを増加させる方法は、配列番号１～２、１９３、１９５又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を提供することを含む。

【0901】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、組換えＣＲＰの作製をもたらし、当該組換えＣＲＰは、配列番号６～１４、１９７、１９９又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0902】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、以下のシスチンノットモチーフ：阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフ、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）モチーフ、又は環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフのうちの１つを形成するジスルフィド結合トポロジーを有する組換えＣＲＰをもたらす。

【0903】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、ＩＣＫモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有する組換えＣＲＰを提供する。

【0904】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、修飾可能なＣＲＰを提供し、修飾可能なＣＲＰは、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントである。

【0905】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、配列番号１～２、１９３、１９５又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む修飾可能なＣＲＰを提供する。

【0906】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、配列番号１～２、１９３、１９５又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる修飾可能なＣＲＰを提供する。

【0907】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、配列番号６～１４、１９７、１９９又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む組換えＣＲＰを作製する。

【0908】

一部の実施形態では、収量を増加させる方法は、配列番号６～１４、１９７、１９９又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる組換えＣＲＰを作製する。

【0909】

一部の実施形態では、本発明は、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる組換えＣＲＰを提供し、

【化7】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、当該組換えＣＲＰが、以下のプロセス：１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することに従って、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントを修飾することによって作製されており、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することにより、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰがもたらされ、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する。

【0910】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾される。

【0911】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、野生型μ－ＤＧＴＸ－Ｄｃ１ａ、ＤＶＰ、カッパ－ＡＣＴＸ、ＡｐｓＩＩＩ、又はそれらのバリアントである。

【0912】

一部の実施形態では、修飾可能なＣＲＰは、配列番号１～２、１９３、１９５又は１９８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0913】

一部の実施形態では、組換えＣＲＰは、配列番号６～１４、１９７、１９９又は２０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0914】

例示的なシスチンノット構造の実施形態
一部の実施形態では、ポリペプチドは、システイン及び／又はジスルフィド結合を有し得るが、本発明の式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有し得ない。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、７つ以上のシステインアミノ酸残基を有し得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、４つ以上のジスルフィド結合を有し得る。

【0915】

ここで、本発明者らは、式（ＩＩ）のＣＫ構造に到達するために、修飾可能なＣＲＰに由来する組換えＣＲＰ、及びそれに関する方法を提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明は、１つのシステイン残基の除去を含むように修飾された７つのシステイン残基を有する修飾可能なＣＲＰを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、１つのシステイン残基の除去は、式（ＩＩ）のＣＫ構造を有するポリペプチドをもたらす。

【0916】

一部の実施形態では、本発明は、２つのシステイン残基の除去を含むように修飾された８つのシステイン残基を有する修飾可能なＣＲＰを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、２つのシステイン残基の除去は、式（ＩＩ）のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらす。

【0917】

一部の実施形態では、本発明は、３つのシステイン残基の除去を含むように修飾された９つのシステイン残基を有する修飾可能なＣＲＰを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、３つのシステイン残基の除去は、式（ＩＩ）のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらす。

【0918】

一部の実施形態では、本発明は、４つのシステイン残基の除去を含むように修飾された１０個のシステイン残基を有する修飾可能なＣＲＰを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、４つのシステイン残基の除去は、式（ＩＩ）のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらす。

【0919】

一部の実施形態では、本発明は４つ以上のジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、修飾可能なＣＲＰは、１、２、３、４、５個以上のジスルフィド結合を除去することによって、３つのジスルフィド結合を有するように修飾されている。

【0920】

一部の実施形態では、本発明の修飾可能なＣＲＰは、７つ以上のシステインアミノ酸残基を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のシステインアミノ酸残基を除去することによって修飾され得、修飾可能なＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しず、１つ以上のシステインアミノ酸残基をポリペプチドから除去することは、修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することをもたらす。

【0921】

一部の実施形態では、本発明は、４つのジスルフィド結合を有する有するポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、１つのジスルフィド結合を除去して、式（ＩＩ）のＣＫ構造を作製し、ジスルフィド結合は、システイン残基：Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶ、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖ、並びにＣ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩの間で形成され、例えば、１～４、２～５、３～６ジスルフィド結合接続合性を有するシスチンノットである。

【0922】

一部の実施形態では、本発明は、８つのシステインを有するポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、２つのシステインを除去して、式（ＩＩ）のＣＫ構造を作製し、ジスルフィド結合は、システイン残基：Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶ、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖ、並びにＣ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩの間で形成され、例えば、１～４、２～５、３～６ジスルフィド結合接続合性を有するシスチンノットである。

【0923】

一部の実施形態では、本発明は、ポリペプチドの発現を増加させる方法を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該方法は、１つ以上のシステインを除去することによって生じ、本方法は、以下のステップのうちの１つ以上を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる：（ａ）修飾可能なＣＲＰの３Ｄ構造を取得及び／又は作成すること、（ｂ）修飾可能なＣＲＰの３Ｄ構造に基づいて１つ以上のシステインを除去するための１つ以上の部位を予測すること、並びに（ｃ）予測される部位のうちの１つ以上で１つ以上のシステインを除去することによって修飾可能なＣＲＰを修飾すること、当該１つ以上のシステインの除去は、少なくとも１つの非ＣＫジスルフィド結合の除去を可能にする。

【0924】

一部の実施形態では、本発明は、天然の単一遺伝子の産物であり、１つ以上のシステイン残基を除去することによって変異されたポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該システイン残基の除去は、当該除去されたシステインを含有しない修飾可能なＣＲＰと比較して、組換えＣＲＰの発現を増加させる１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合の除去を可能にする。

【0925】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット構造を含み、

【化8】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、当該組換えＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを修飾することによって作製されており、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、ＣＫモチーフを形成せず、修飾可能なＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾されており、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらし、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有し、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅペプチドサブユニットの各アミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列の群と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一を有し：Ｎ_Ｅは、ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧであり、Ｌ_１は、ＫＫＹＤＶＥであり、Ｌ_２は、ＤＳＧＥであり、Ｌ_３は、存在せず、Ｌ_４は、ＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＤであり、Ｌ_５は、ＲＧＬＫＳＧＦＦＳＳＫＦＶであり、Ｃ_Ｅは、ＲＤＶである。

【0926】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する：ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＤＣＲＧＬＫＳＧＦＦＳＳＫＦＶＣＲＤＶ（配列番号５）。

【0927】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下であるアミノ酸配列を有する：ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＤＣＲＧＬＫＳＧＦＦＳＳＫＦＶＣＲＤＶ（配列番号５）。

【0928】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する：ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＡＣＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ（配列番号１９９）。

【0929】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下であるアミノ酸配列を有する：ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＡＣＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ（配列番号１９９）。

【0930】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する：ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＡＡＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ（配列番号２０１）。

【0931】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下であるアミノ酸配列を有する：ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＡＡＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ（配列番号２０１）。

【0932】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する：ＧＳＣＮＳＫＧＴＰＣＴＮＡＤＥＣＣＧＧＫＣＡＹＮＶＷＮＡＩＧＧＧＡＳＫＴＣＧＹ（配列番号１９７）。

【0933】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下であるアミノ酸配列を有する：ＧＳＣＮＳＫＧＴＰＣＴＮＡＤＥＣＣＧＧＫＣＡＹＮＶＷＮＡＩＧＧＧＡＳＫＴＣＧＹ（配列番号１９７）。

【0934】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する：ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＤＣＲＧＬＫＳＧＦＦＳＳＫＦＶＣＲＤＶ（配列番号５）、又はその相補的ヌクレオチド配列。

【0935】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下であるアミノ酸配列を有する：ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＤＣＲＧＬＫＳＧＦＦＳＳＫＦＶＣＲＤＶ（配列番号５）、又はその相補的ヌクレオチド配列。

【0936】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する：ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＡＣＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ（配列番号１９９）、又はその相補的ヌクレオチド配列。

【0937】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下であるアミノ酸配列を有する：ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＡＣＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ（配列番号１９９）、又はその相補的ヌクレオチド配列。

【0938】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する：ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＡＡＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ（配列番号２０１）、又はその相補的ヌクレオチド配列。

【0939】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下であるアミノ酸配列を有する：ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＡＡＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ（配列番号２０１）、又はその相補的ヌクレオチド配列。

【0940】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．７％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する：ＧＳＣＮＳＫＧＴＰＣＴＮＡＤＥＣＣＧＧＫＣＡＹＮＶＷＮＡＩＧＧＧＡＳＫＴＣＧＹ（配列番号１９７）、又はその相補的ヌクレオチド配列を含む。

【0941】

一部の実施形態では、本発明は、組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）をコードするように動作可能なポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該ＣＲＰは、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を含み、かつ、以下であるアミノ酸配列を有する：ＧＳＣＮＳＫＧＴＰＣＴＮＡＤＥＣＣＧＧＫＣＡＹＮＶＷＮＡＩＧＧＧＡＳＫＴＣＧＹ（配列番号１９７）、又はその相補的ヌクレオチド配列を含む。

【実施例】

【0942】

本明細書の実施例は、本発明を限定することを意図するものではなく、また本発明を限定するために使用されるべきではなく、それらは本発明を例示するために提供されているに過ぎない。倍率発現の以下のカテゴリは次のとおりである。減少＝＜０．９、類似＝０．９～１．１、わずかに増加＝１．１～２．９、増加＝３．０～１０．０及び大きく増加＝＞１０。倍率活性の以下のカテゴリは次のとおりである。減少＝＞１．５、及び類似＝０．７～１．４。

【0943】

実施例１．酵母形質転換
酵母形質転換
個々のＯＲＦは、野生型Ｄｃ１ａをコードするように動作可能なポリヌクレオチド、又は所与のＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチドのいずれか、及びアルファ接合因子分泌シグナルの配列を含有するように構築した。次いで、これらのＯＲＦをｐＫｌａｃ１ベクターに挿入した（カタログ番号Ｎ３７４０、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、２４０ Ｃｏｕｎｔｙ Ｒｏａｄ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ ０１９３８－２７２３）。ｐＫｌａｃ１ベクターは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓＰ_{ＬＡＣ４－ＰＢＩ}プロモーター（１）、Ｋ．ｌａｃｔｉｓα接合因子（α－ＭＦ）分泌ドメインをコードするＤＮＡ（分泌発現のための）、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＬＡＣ４転写ターミネーター（ＴＴ）、及び酵母ＡＤＨ２プロモーター（Ｐ_ＡＤＨ２）から発現される真菌アセトアミダーゼ選択可能マーカー遺伝子（ＡＭＤＳ）を含有する。加えて、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐＫＬＡＣ１の増殖のために、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点（ＯＲＩ）及びアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ^Ｒ）が存在する。

【0944】

次いで、得られたベクター、すなわち、ｐＫｌａｃ１－ＷＴ－Ｄｃ１ａ、及び様々なｐＫｌａｃ１－ＤＶＰベクターを線形化し、ＬＡＣ４遺伝子座でのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ宿主ゲノムへの線形化されたベクターの複数のコピーの安定した組み込みために、電気有能なＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ宿主細胞に形質転換した。

【0945】

次いで、形質転換されたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓを、唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する選択寒天上に配置して、発現カセットの複数の挿入及びそのアセトアミダーゼ選択を含有する株を同定した。

【0946】

実施例２．収量分析
収量分析
次いで、ＷＴ Ｄｃ１ａ及びＤＶＰコロニーを、２％のソルビトール及び０．２％のコーンスティープリカーを含む最小培地中で、２３．５℃で６日間培養した。折り畳まれたＷＴ Ｄｃ１ａ及びＤＶＰの発現を、Ｃｈｒｏｍｏｌｏｌｉｔｈ Ｃ１８カラム（ＥＭＤ）でのＨＰＬＣ分離及び１５～３５％のアセトニトリルの溶出勾配によって評価した。折り畳まれたＷＴ Ｄｃ１ａ及びＤＶＰピークを定量化し、対照と比較した（ｎ＝４の最小値）。野生型Ｄｃ１ａは、クロマトグラム上に可視的な折り畳まれたピークを有しなかったため、産生された総Ｄｃ１ａを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ クマシー染色を減少させることによって推定し、イオン交換クロマトグラフィー後に様々なＤｃ１ａ種を定量化することによって折り畳まれたＤｃ１ａと折り畳まれていないＤｃ１ａとの比率を推定した。

【0947】

実施例３．イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィー
ＳＰ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＷＴ Ｄｃ１ａ及びＤＶＰをカチオン交換により精製した。樹脂を３０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中で平衡化した。Ｄｃ１ａを含有する使用済み上清を、ｐＨが３．０未満のビーズに直接適用した。ビーズを洗浄し、（１）３０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、（２）３０ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ６．０）、（３）３０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び（４）３０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭの塩化ナトリウムの２～３カラム体積（ＣＶ）で段階的に溶出した。

【0948】

正味正電荷を増加させる変異を含まない野生型Ｄｃ１ａ及びＤＶＰの場合、折り畳まれたＷＴ Ｄｃ１ａ及びＤＶＰは、溶出緩衝液（３）中で鋭いピークとして溶出され、一方、Ｄｃ１ａの誤った折り畳みバージョンは、より高い塩濃度の緩衝液（４）で溶出された。予想どおり、Ｄｃ１ａの全体的な電荷を増加させた変異体は、より高い塩濃度で溶出した。折り畳まれたＤｃ１ａを含有する画分をプールし、水に対して繰り返し透析して、塩及び緩衝液を除去した。精製した材料は、活性を失わずに－８０℃で無期限に、又は活性を失わずに４℃で６ヶ月を超えて保管することがでた。

【0949】

実施例４．ＨＰＬＣ標準曲線
ＨＰＬＣ標準曲線
１～２ミリグラムのＷＴ Ｄｃ１ａを、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｃ１８カラム（ＥＭＤ）でのＨＰＬＣ分画を使用して、９９％超の純度まで更に精製した。凍結乾燥後、Ｄｃ１ａを、１６１８０Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数（ε）を用いてＡ２８０吸光度によって定量した。５～１００μｇの濃度の範囲を用いてＨＰＬＣ標準曲線を設定し、勾配を用いて未知の試料の定量化を行った。図１及び２。

【0950】

簡潔に述べると、ＨＰＬＣ標準曲線を以下のように行った。水中の精製されたＤｃ１ａの連続希釈液をＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｃ１８カラム（４．６ｘ１００ｍｍ）に注入し、８分間にわたって２ｍＬ分^－１の流量及び１８～３６％のアセトニトリルの勾配で溶出した。６つの試料からのＤｃ１ａピーク面積を濃度に対してプロットし、線形関係の勾配を使用して、未知の試料の濃度を定量した。１吸光度単位の高さに達した試料は、ＨＰＬＣ検出器の線形範囲外であると仮定したため、計算から落とした。

【0951】

実施例５．残基Ｃｙｓ４１及びＣｙｓ５１における第４のジスルフィド結合の除去
残基Ｃｙｓ４１及びＣｙｓ５１における第４のジスルフィド結合の除去
Ｄｃ１ａの残基Ｃｙｓ４１及びＣｙｓ５１における変異（すなわち、第４のジスルフィドが接続する残基）が活性に影響を与えることなく発現を増加させることができるかどうかを試験するために、各システインに対して集中変異スキャンを実施した。ここで、野生型アミノ酸配列システイン残基を同様に小さいアミノ酸で置き換えることは、ペプチド活性に対して無視できる影響であると仮定された。集中変異スキャンは、Ｄｃ１ａの野生型システインをアラニン、スレオニン、セリン、又はバリンに変異させることによって進行した。集中突然変異スキャンの結果は、全ての変異が、Ｄｃ１ａの全体的な発現及び適切な折り畳みを改善することをもたらしたことを明らかにした。表２．

【0952】

Ｄｃ１ａの集中変異解析の結果、変異体「Ｔ／Ａ」（又は「Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ」）は、発現及び活性の最良の組み合わせを示したことが明らかになった。したがって、Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａバリアントは、後続の実験で実施されたアラニンスキャンのバックグラウンドとして使用された。

【表2】

【0953】

実施例６．Ｄｃ１ａのアラニンスキャン
Ｄｃ１ａのアラニンスキャン
どの残基が発現及び／又は活性の増加のいずれかに関与している可能性があるかを決定するために、Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ ＤＶＰに対してアラニンスキャンを行った。

【0954】

Ｄｃ１ａのアラニンスキャンは、全ての位置で単一のアラニンポイント変異体を設計することによって実施した。設計された構築物を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｗｉｓｔｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／；６８１ Ｇａｔｅｗａｙ Ｂｌｖｄ Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ ９４０８０）によって合成し、クローン化した。次に、４～８個の変換体を、２％のソルビトール及び０．２％のコーンスティープリカーを含む最小培地中で、２３．５℃で６日間培養し、それらの発現をＨＰＬＣ定量によって評価した。発現を平均化し、対照（Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ）に対して正規化し、改善された発現を有する変異体を、イエバエに対する生物活性について評価した。

【0955】

アラニンスキャンは、いくつかの残基の変異が発現の観察可能な増加をもたらしたことを実証した。表３、強調表示されたグレーを参照されたい。これらの位置を、変異誘発スクリーニングを用いて、発現、折り畳み、及び活性について更に分析した。

【表3-1】

【表3-2】

【0956】

実施例７．残基Ａ１０、Ｗ３１、Ｙ３２、Ｋ３３、及びＰ３６の変異誘発スキャン
残基Ａ１０、Ｗ３１、Ｙ３２、Ｋ３３、及びＰ３６の変異誘発スキャン
発現及び／又は活性に影響を及ぼす追加の位置を更に解明するために、残基Ａ１０、Ｗ３１、Ｙ３２、Ｋ３３、及びＰ３６の変異誘発スキャンを行った。

【0957】

変異体を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｗｉｓｔｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／；６８１ Ｇａｔｅｗａｙ Ｂｌｖｄ Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ ９４０８０）によって合成し、クローン化した。ここで、４～８個の変換体を、２％のソルビトール及び０．２％のコーンスティープリカーを含む最小培地中で、２３．５℃で６日間培養し、それらの発現をＨＰＬＣ定量によって評価した。発現を平均化し、対照（Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ）に対して正規化し、改善された発現を有する変異体を、イエバエに対する生物活性について評価した。

【0958】

変異誘発スキャンの結果を以下の表４に示す。Ｗ３１位は、アラニンに変異した場合、活性が低下していたが、フェニルアラニンとの置換は、収量ブーストをもたらし、活性の損失をもたらさなかった。Ｙ３２位は、アラニンに変異したときに同様の収量ブースト及び活性低下を有したが、セリンに変異した場合、良好な活性及び増加した発現を示した。アラニンへのＰ３６の変異は、他の変異よりも優れていた。各変異を一緒に組み合わせると（Ｗ３１Ｆ、Ｙ３２Ｓ、Ｐ３６Ａ）、非修飾バージョンよりも発現が６９％増加した。図３．

【表4】

【0959】

実施例８．残基Ｖ１７、Ｄ２０、及びＳ２１の変異誘発スキャン
残基Ｖ１７、Ｄ２０、及びＳ２１の変異誘発スキャン
発現及び／又は活性に影響を及ぼす追加の位置を更に解明するために、残基Ｖ１７、Ｄ２０、及びＳ２１の変異誘発スキャンを行った。変異体を合成し、上述のようにクローニングした。

【0960】

変異誘発スキャンの結果を以下の表５に示す。Ｄ２０位は、活性の喪失を伴わずに良好な発現を示し、興味深いことに、アラニンのみが、その位置での野生型残基よりも優れた性能を示した。Ｄ２０Ａを、Ｖ１７又はＬ４２位での他の変形と組み合わせると、発現の減少をもたらした。Ｓ２１位は、アラニンに変異した場合、発現の増加を示したが、活性が低下した。Ｓ２１の他の変異は、同じ増加した発現を示すことができなかったため、それ以上追求しなかった。

【表5】

【0961】

実施例９．Ｄ３８位の評価
Ｄ３８位の評価
発現及び／又は活性に影響を及ぼす追加の位置を更に解明するために、残基Ｄ３８の変異誘発スキャンを行った。

【0962】

アラニンに変異したときに大きな発現ブーストを与えたため、変異スキャンによってＤ３８位をスクリーニングした。次いで、発現のための変異体の最適な組み合わせを同定するために、Ｄ３８Ａを、Ｌ４２又はＶ５２変異体と組み合わせて、並びにＷ３１Ｆ、Ｙ３２Ｓ、及びＰ３６Ａからなる、以前に同定された最適化された変異体の有無にかかわらず、Ｄ２０Ａと組み合わせて評価した。変異体を合成し、上述の方法に従ってクローニングした。発現を平均化し、対照（Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ）に対して正規化し、改善された発現を有する変異体を、イエバエに対する生物活性について評価した。

【0963】

変異誘発スキャンの結果を以下の表６に示す。Ｄ３８Ａ位は、活性の損失なしに発現の大幅な増加を示し、ＨＰＬＣ上のＤｃ１ａピークの数が減少した。図４及び５を参照されたい。他の突然変異体は、同様の特性の組み合わせを示さなかった。次に、Ｌ４２及びＶ５２変異体の組み合わせをＤ３８Ａで評価した。Ｖ５２変異体は、発現を減少させたが、いくつかのＬ４２変異体は、Ｄ３８Ａと組み合わせた場合に発現を増加させ、Ｌ４２Ｖは最も強い結果を示した。

【表6】

【0964】

実施例１０．システイン変異体の更なる最適化
システイン変異体の更なる最適化
４１位及び５１位のシステイン残基（すなわち、第４のジスルフィド結合の接続性を提供する残基）の再最適化を、Ｄ３８Ａ ＤＶＰに対して行った。除去された第４のジスルフィドの近くで、２つの追加の変異（すなわち、Ｄ３８Ａ及びＬ４２Ｖ）が最適であることが見出されたため、Ｃ４１及びＣ５１の変異を再最適化し、Ｄ３８Ａが存在する場合、これらの位置での変異体の最良の組み合わせを見出した。変異体を合成し、上述の方法に従ってクローニングした。

【0965】

再最適化の結果を以下の表７に示す。Ｄ３８Ａの再最適化スキャンの結果に基づいて、Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓは、Ｄ３８Ａ及びＬ４２Ｖと組み合わせるのに最適なジスルフィド変異体のセットとして選択された。図５及び６．

【表7】

【0966】

したがって、個体及び組み合わせた変異を、ヘッドトゥーヘッドアッセイにおいて発現及び活性について比較した。本明細書で探索した４つの変異、すなわち、Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖの組み合わせを有し、「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＶＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号５３）のアミノ酸配列を有し、イエバエの生体活性を失うことなく、ＷＴに対して約２００倍の発現を増加させたＤＶＰ。図６．

【0967】

実施例１１．イエバエ注射
イエバエ注射
１４～２０ｍｇの体重の成体イエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）をＣＯ_２を使用して麻酔し、胸腔内に０．５μＬのＷＴ Ｄｃ１ａ及び以下のＤＶＰを注射した：（１）Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ、（２）Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ、及び（３）Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖ。結果を図７に示す。

【0968】

用量反応曲線は、２４時間でのノックダウンパーセント（すなわち、歩行不能）（２４時間でのノックダウン％）についてハエを評価することによって生成された。ＣＯ_２制御下で、ハエは数分後に歩く能力を取り戻し、その後すぐに飛行する能力を取り戻した。中間レベルのＤｃ１ａを投薬されたハエは、立って歩く能力を取り戻したが、これらのハエは飛行能力を取り戻すことができなかった。注射後１５～３０分後、ハエは、痙攣性麻痺の短いエピソードによって散在する弛緩性麻痺を示し始め、１時間後に強度が頂点に達し、立つことができなくなった。まだ麻痺していたが２４時間で死んでいないハエは、弛緩性麻痺を示し、脱水による死亡が発生した注射後７２時間まで回復しなかった。図７．

【0969】

図７に示すように、ＤＶＰ Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ及びＣ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖは、ＷＴ－Ｄｃ１ａと比較して優れたノックダウン能力を示した。２４時間で５０％ノックダウンを達成するために、Ｃ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａは、１１．３ｐｍｏｌ／ｇの用量を必要とし、Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖは、１３．５ｐｍｏｌ／ｇの用量を必要とし、代替的に、ＷＴ－Ｄｃ１ａは、１５．６ｐｍｏｌ／ｇの用量を必要とした。

【0970】

実施例１２．コーンイアワーム（ＣＥＷ）注射
コーンイアワーム（ＣＥＷ）注射
ＣＥＷに注入されたＤＶＰを評価するアッセイを、以下のように実施した。コーンイアワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）幼虫に４齢で注射した。Ｈ．ｚｅａの卵を購入し（Ｂｅｎｚｏｎ、Ｃａｒｌｉｓｌｅ，ＰＡ）、汎用鱗翅目食餌（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）で４齢まで育てた。注射前に、ｐｍｏｌ／ｇ用量を計算するために、幼虫を秤量した。注射量は、１μＬであり、３０ゲージの針及びガラス製シリンジで、手動マイクロアプリケータ（Ｂｕｒｋａｒｄ、Ｒｉｃｋｍａｎｓｗｏｒｔｈ，Ｈｅｒｔｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で行った。注射後、幼虫を汎用鱗翅目食餌の新しい囲いに入れ、注射後２４時間のその状態（死亡率、亜致死的効果、及び行動を含む）を評価した。

【0971】

ここでは、野生型Ｄｃ１ａ及びＣ４１Ｔ／Ｃ５１Ａ／Ｄ３８Ａ（配列番号２９）及びＣ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｖ（配列番号５３）をＣＥＷに注射し、２４時間でノックダウンパーセントを評価した。

【0972】

図８に示されるように、システイン除去変異体の注射は、ＣＥＷ死亡率の数桁減少をもたらした。活性の喪失は、Ｃ４１Ａ／Ｃ５１Ａ変異体が２５００ｐｍｏｌ／ｇの高用量で活性を有しなかったため、シスチン結合位置（Ｃ４１及びＣ５１）に局在しているようにであった。イエバエ及びＣＥＷノックダウンを比較した表を以下に示す。

【表8】

【0973】

実施例１３．ＣＥＷ殺虫活性を改善する変異
ＣＥＷ殺虫活性を改善する変異
Ｄｃ１ａの変異を作製して、ＣＥＷ活性の回復をスクリーニングした。ここで、変異体を合成し、上述の方法に従ってクローニングした。簡潔に述べると、４つの個々の形質転換体を、２％のソルビトール及び０．２％のコーンスティープリカーを含む最小培地中で、２３．５℃で６日間培養した。上清を混合し、３０００Ｄａ分子量カットオフを有する遠心濾過カセット（Ｐａｌｌ）を使用して１０倍濃縮した。次いで、濃縮物をコーンイアワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）に注射した。

【0974】

コーンイアワーム（ＣＥＷ）幼虫に４齢で注射した。Ｈ．ｚｅａの卵を購入し（Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７ Ｋｕｈｎ Ｄｒ，Ｃａｒｌｉｓｌｅ，ＰＡ，１７０１５）、汎用鱗翅目食餌（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）で４齢まで育てた。注射前に、ｐｍｏｌ／ｇ用量を計算するために、幼虫を秤量した。注射量は、１μＬであり、３０ゲージの針及びガラス製シリンジで、手動マイクロアプリケータ（Ｂｕｒｋａｒｄ、Ｒｉｃｋｍａｎｓｗｏｒｔｈ，Ｈｅｒｔｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で行った。注射部位は最も後ろの腿の１つの基部の近くであった。注射後、幼虫を汎用鱗翅目食餌の新しい囲いに入れ、注射後２４時間のその状態（死亡率、亜致死的効果、及び行動を含む）を評価する。

【表9-1】

【表9-2】

【表10】

【0975】

特徴付けの後、Ｃ４１位のバリン又はメチオニンは、ＷＴと同様のより高い活性をもたらすことが示されたが、バリンは収量を低下させた。Ｄ２０のチロシンへの変異はまた、変異体がＣ４１Ｔ／Ｃ５１Ａであっても、ＷＴ様活性を回復することができた。

【0976】

実施例１４．植物におけるＤＶＰ－殺虫タンパク質の発現
植物におけるＤＶＰ－殺虫タンパク質の発現
植物、植物組織、植物細胞、植物種子、又はその一部におけるＤＶＰ－殺虫タンパク質の発現を評価した。ここで、ＤＶＰ－殺虫タンパク質のクローニング及び発現は、ＦＥＣＴ（Ｌｉｕ Ｚ ＆ Ｋｅａｒｎｅｙ ＣＭ，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１０：８８、その全体が参照により本明細書に援用される）と称されるタバコ一過性発現システム技術を使用して実施した。

【0977】

簡潔に述べると、ＦＥＣＴベクターは、アグロインフェクションのためのＴ－ＤＮＡ領域を含有し、これは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含有し、ウイルスコーティングタンパク質及びトリプル遺伝子ブロックをコードする遺伝子を用いずに、フォックステールモザイクウイルスＲＮＡの発現を駆動する。コーティングタンパク質及びトリプルブロックの代わりに、高レベルの一過性ウイルス発現のために、ＤＶＰ ＯＲＦをＰａｃＩ部位に続いてＮ’からＣ’にサブクローニングすることを可能にする一対のサブクローニング部位（ＰａｃＩ及びＡｖｒＩＩ）がある。この「非武装」ウイルスゲノムは、植物から植物への伝播を防ぐ。ＤＶＰを発現するためにサブクローニングされたＦＥＣＴベクターに加えて、導入されたＴ－ＤＮＡの転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を防止するために、トマトブッシースタントウイルス由来のＲＮＡサイレンシング抑制タンパク質であるＰ１９をコードする第２のＦＥＣＴベクターが共発現される。一過性植物発現系を含むアグロバクテリウムを、以下に記載されるように、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に注射した。

【0978】

ここで、調査したＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下の成分、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、ユビキチンモノマー、介在リンカーペプチド、及びヒスチジンタグを含んだ。

【0979】

使用されたＥＲＳＰモチーフは、以下のアミノ酸配列を有する２４個のアミノ酸ペプチドであるオオムギアルファアミラーゼシグナルペプチド（ＢＡＡＳ）であった（Ｎ’からＣ’、１文字コード）：ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧ（配列番号６０）。

【0980】

使用したＺｅａ ｍａｙｓユビキチンモノマーは、以下のアミノ酸配列（Ｎ’からＣ’、１文字コード）を有する７５個のアミノ酸ペプチドであった：ＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＡＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（配列番号１８３）（ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿０２０４０４０４９．１）。

【0981】

ＤＶＰ－殺虫タンパク質で使用されるＤＶＰ ＯＲＦをコードするように動作可能なポリヌクレオチドは、以下の表１１に見出される。

【0982】

使用した介在連結ペプチドは、以下のアミノ酸配列（Ｎ’からＣ’、１文字コード）を有した：ＡＬＫＦＬＶ（配列番号１８４）又はＩＧＥＲ（配列番号５４）。

【0983】

使用したヒスチジンタグは、以下のアミノ酸配列（Ｎ’からＣ’、１文字コード）を有した：ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１８５）。

【0984】

したがって、この実施例で使用される例示的なＤＶＰ－殺虫タンパク質は、以下の要素及び配向を有する構築物を有する：
ＥＲＳＰ－ＵＢＩ－Ｌ－ＤＶＰ－ＨＩＳ

【0985】

ＤＶＰ－殺虫タンパク質の完全なアミノ酸配列の例は、以下のとおりである。
ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＡＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧＡＬＫＦＬＶＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＤＣＲＣＬＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶＨＨＨＨＨＨ（配列番号１８６）

【0986】

ＤＶＰ－殺虫タンパク質の一般的な概略図を図９に示す。ここで、前述の構築物は、以下のように定義される構成要素を有する。「ＥＲＳＰ」は、小胞体シグナルペプチドを指し、「ＵＢＩ」は、ユビキチンモノマーを指し、「ＤＶＰ」は、ミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａ毒素又はＤＶＰを指し、「Ｌ」は、介在リンカーペプチドを指し、「ＨＩＳ」は、ヒスチジンタグを指す。

【0987】

次に、ＤＶＰ－殺虫タンパク質、すなわち、以下のＯＲＦを有するＤＮＡをコードするように動作可能なポリヌクレオチド：「ＢＡＡＳ：ＵＢＩ：Ｌ：ＤＶＰ：ｈＩＳ」又は「ｂａａｓ－ｕｂｉ－ｌ－ｄｖｐ－ｈｉｓ」（ＢＡＡＳは、ＥＲＳＰであり、ＵＢＩは、ユビキチンであり、Ｌは、ペプチドを連結している）を、ＦＥＣＴ発現ベクターのＰａｃＩ及びＡｖｒＩＩ制限部位にクローニングして、一過性ベクターを作製した。次いで、これらの一過性ベクターを、以下のとおり、凍結融解法を使用してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株、ＧＶ３１０１細胞に形質転換した。保管されたコンピテントＧＶ３１０１細胞を氷上で解凍し、次いで、１～５μｇの純粋な一過性ベクターＤＮＡと混合した。次いで細胞－ＤＮＡ混合物を、氷上で５分間保持し、－８０℃に５分間移し、３７℃の水浴中で５分間インキュベートした。次いで、凍結融解処理された細胞を、１ｍＬのＬＢ培地に希釈し、揺動台上で、室温で、２～４時間振盪した。次いで、細胞－ＬＢ混合物を、５，０００ｒｃｆで２分間スピンダウンしてペレット細胞にし、次いで、８００μＬのＬＢ上清を除去した。次いで、細胞を残りの液体中に再懸濁し、形質転換された細胞－ＬＢ混合物の全体積（約２００μＬ）を、適切な抗生物質（すなわち、１０μｇ／ｍＬのリファンピシン、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）を含むＬＢ寒天プレート上に広げ、２日間、２８℃でインキュベートした。次いで、得られた形質転換コロニーを採取し、形質転換ＤＮＡを分析に必要な適切な抗生物質を含むＬＢ培地の６ｍＬのアリコート中で培養し、形質転換ＧＶ３１０１細胞のグリセロールストックを作製した。

【0988】

次いで、形質転換されたＧＶ３１０１細胞を、以前に作製されたグリセロールストックからの適切な抗生物質（上記のように）を含むＬＢプレート上に画線し、２８℃で２日間インキュベートした。形質転換ＧＶ３１０１細胞のコロニーを使用して、５ｍＬのＬＢ－ＭＥＳＡ培地（１０ｍＭのＭＥＳ、２０μＭのアセトシリンゴンを補充したＬＢ培地）、及び上述の同じ抗生物質を接種した。次いで、コロニーを２８℃で一晩増殖させ、次いで、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞を採取し、最終的なＯＤ６００で１．０の誘導培地（１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのアセトシリンゴン）中に再懸濁した。次いで、細胞を、室温で、誘導培地中で２時間～一晩インキュベートした。この時点で、細胞はタバコの葉の一過性形質転換の準備ができていた。

【0989】

ＦＥＣＴは、Ｐ１９発現及び目的遺伝子の発現の混合物を用いるため、ｐＦＥＣＴ－Ｐ１９形質転換ＧＶ３１０１細胞の細胞培養及び目的遺伝子培養を等量に混合してタバコの葉を浸潤させた後、植物の葉に注射した。処理された細胞は、針が装着されていない３ｍＬシリンジを使用した注射によって、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物についている葉の下側に浸潤させた。タバコの葉におけるタンパク質の発現を、浸潤後６～８日で評価した。

【0990】

全長のＤＶＰ－殺虫タンパク質を、手動抽出技術を使用してタバコから精製した。葉組織を、浸潤領域から直径３０ｍｍのパンチを介して得、巻き上げ、２つの直径５／３２インチのステンレス鋼研削ボールを有する２ｍＬの円錐底管の中に入れ、液体窒素中で凍結させた。次いで、Ｔｒｏｅｍｎｅｒ－Ｔａｌｂｏｙｓ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを使用して試料を均質化した。次いで、７５０μＬの氷冷全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）抽出液（リン酸ナトリウム溶液５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐＨ７．０）をチューブに添加し、ボルテックスした。次いで、マイクロチューブを、室温で１５分間インキュベートし続け、次いで、４℃で、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離した。次いで、１００μＬの得られた上清を採取し、底部に空の受け皿Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートを備えた０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルターマイクロタイタープレート中のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０充填済みカラムにロードした。次いで、マイクロタイタープレートを、４℃で、８００ｇで２分間遠心分離した。次いで、タバコの葉の得られた濾液（以下、「総可溶性タンパク質抽出物」又は「ＴＳＰ抽出物」と呼ぶ）は、下流の分析の準備をした。

【0991】

次いで、試料を、標準的なウエスタンブロッティング技術を使用して分析した。タンパク質試料１０μＬを９μＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２Ｘ ＳＤＳローディングバッファー及び２μＬのＮｏｖｅｘ １０Ｘ還元剤と混合し、試料を８５℃で５分間加熱することにより、タンパク質ゲル用の試料を調製した。次いで、試料をロードし、上部タンク中の０．１％のチオグリコール酸ナトリウム及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ ２ ＭＷＭを含む１ｘＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｒｉｃｉｎｅランニング緩衝液中のＮｏｖｅｘ Ｐｒｅｃａｓｔ、１６％のＴｒｉｃｉｎｅゲル上で実行した。ゲルを１５０Ｖで７５分間実行した。次いで、ｉＢＬＯＴシステムでの７分間の移送プログラムを使用して、ゲルを新規ＰＶＤＦ膜に移した。転写が完了したら、ブロット膜を容器に移し、緩衝液Ａ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌの１０ｘＴＢＳ（０．２５Ｍのトリス塩基、１．３７ＭのＮａＣｌ、０．０３ＭのＫＣＬ、ｐＨ７．４）から作製した１ｘＴＢＳ）で、室温で穏やかに揺動することによって５分間洗浄した。次いで、緩衝液Ｂ（１％ＢＳＡを有する緩衝液Ａ）を使用して、１時間、遮断ステップを行った。次いで、ブロットを、５分間の緩衝液Ｃ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有する緩衝液Ｂ）の洗浄で３回すすいだ。これに続いて、緩衝液Ｃ中の１：１００００希釈のＭａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ抗Ｈｉｓ抗体を１時間行った。次いで、ブロットを、緩衝液Ｃで各５分間、３回すすいだ。これに続いて、緩衝液Ｃ中の１：３０００希釈のＢｉｏＲａｄヤギ抗マウスＡＰコンジュゲート抗体（二次抗体）を１時間行った。次いで、ブロットを、緩衝液Ｃで各５分間を２回、緩衝液Ａで５分間を１回、すすいだ。その後、ブロットはＢｉｏＲａｄＡＰデベロッパーとともに現像され、水ですすぐことによって停止される。

【0992】

図１０は、ｄｃ１ａ及び変異体を発現した植物のＨｉｓ－Ｔａｇウエスタンブロットを示す。各ウェルは、変性タンパク質ゲル条件下で実行され、標準的なウエスタンブロット技術で視覚化された粗植物抽出物を表す。ウエスタンブロットで試験した試料の短縮名は、発現の評価システムとともに画像の上に列挙されている。記号（－）は、ブロット上にタンパク質が検出されていないことを示し、タンパク質が検出される場合、記号（＋）から（＋＋＋）は目視検査によって検出された相対量を示す。「ラダー」と示されたレーンは、分子量マーカーを示す。レーン「植物ＮＥＧ」は、陰性対照（すなわち、ＧＦＰ発現タバコタンパク質抽出物）を示す。「Ｍ番号」でラベル付けされたレーンは、評価されたＤＶＰ－殺虫タンパク質の短縮名を示し、以下の表中に見ることができる。レーン「ＷＴ」は、ＷＴミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａタンパク質を有するＤＶＰ－殺虫タンパク質を示す。

【表11】

【0993】

実施例１５．植物発現タンパク質を用いたイエバエ注射アッセイ
植物発現タンパク質を用いたイエバエ注射アッセイ
イエバエに、上述の植物抽出プロセスから得られたＴＳＰ抽出物を注射した。注射の前に、成体イエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）をＣＯ_２で固定し、体重（１２～２０ｍｇ）に基づいて注射のために選択した。１ｃｃ注射器及び３０ゲージの針を充填したマイクロアプリケータを使用して、１匹のハエ当たり、０．５μＬの所与の処置（陰性対照又は天然に存在しないミュー－ジゲトキシン－Ｄｃ１ａ殺虫タンパク質）を、背部胸部の体壁を介してハエに注射した。注射したイエバエを、蓋の上に湿らせた濾紙及び呼吸孔を備えた密閉容器に配置し、それらを、注射後２時間に、影響を受けたスコアリングに基づいて評価した。影響を受けるスコアには、ノックダウン及び死亡が含まれる。

【0994】

イエバエ注射アッセイの結果を以下に示す。

【表12】

【0995】

実施例１６．高収量ＤＶＰ
Ｃ４１Ｓ、Ｃ５１Ｓ、及びＤ３８Ａのアミノ酸置換を有するＤＶＰ、すなわち「ＡＫＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＹＫＷＲＰＬＡＣＲＳＬＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ；配列番号４７）を更に評価して、配列番号４７への点変異が改善された発現をもたらし得るかどうかを決定した。このＣ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ ＤＶＰバックグラウンドに対して、以下の追加の変異が作製された。Ｌ４２Ｉ、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、Ｋ２Ｌ＋Ｙ３２Ｓ、Ｄ３８Ｔ、Ｄ３８Ｓ、及びＤ３８Ｍ。

【0996】

ポリヌクレオチド構築物を合成し、クローニングし、上述のように発現させ、収量をＣ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ ＤＶＰ（配列番号４７）の平均収量に対して正規化した。以下の表に示される、ＤＶＰをオードするように動作可能であった構築物が作成された。

【表13】

【0997】

表１３のＤＶＰをコードするように動作可能なポリヌクレオチド構築物を、上述のようにｐＫｌａｃ１ベクター（カタログ番号Ｎ３７４０、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、２４０ Ｃｏｕｎｔｙ Ｒｏａｄ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ ０１９３８－２７２３）に挿入した（実施例１を参照されたい）。次いで、得られたベクターを線形化し、ＬＡＣ４遺伝子座でのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ宿主ゲノムへの線形化されたベクターの複数のコピーの安定した組み込みために、電気有能なＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ宿主細胞に形質転換した。次いで、形質転換されたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓを、唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する選択寒天上に配置して、発現カセットの複数の挿入及びそのアセトアミダーゼ選択を含有する株を同定した。

【0998】

次いで、コロニーを、２％のソルビトール及び０．２％のコーンスティープリカーを含む最小培地中で、２３．５℃で６日間培養した。ＤＶＰの発現を、Ｃｈｒｏｍｏｌｏｌｉｔｈ Ｃ１８カラム（ＥＭＤ）でのＨＰＬＣ分離及び１５～３５％のアセトニトリルの溶出勾配によって評価した。１～２ｍｇのＷＴ ＡｐｓＩＩＩを、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｃ１８カラム（ＥＭＤ）上でのＨＰＬＣ分画を使用して、９９％超の純度まで更に精製した。凍結乾燥後、ＷＴ ＡｐｓＩＩＩを、１６１８０Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数（ε）を用いてＡ２８０吸光度によって定量した。５～１００μｇの濃度の範囲を用いてＨＰＬＣ標準曲線を設定し、勾配を用いて未知の試料の定量化を行った。

【0999】

配列番号２１０～２１９のＤＶＰの収量を、配列番号４７のＤＶＰの収量と比較した。収量を、ｒｐＨＰＬＣピーク面積に基づいて決定し、次いで、総組み込み遺伝子コピーに対して正規化した。遺伝子コピー測定を決定するために、酵母ｇＤＮＡ抽出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｇＤＮＡを抽出し、デルタデルタＣｔ（ΔΔＣｔ）法を使用したｑＰＣＲ分析によってコピー数を決定した。ピーク領域を、Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ ＤＶＰバックグラウンド（配列番号４７）に対して正規化した。

【1000】

図１１に示されるように、Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ ＤＶＰバックグラウンドへの追加の変異、すなわち、Ｌ４２Ｉ、Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、Ｋ２Ｌ＋Ｙ３２Ｓ、Ｄ３８Ｔ、及びＤ３８Ｓは、全て、Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ ＤＶＰバックグラウンド（配列番号４７）対照と比較して改善された収量を有していた。

【1001】

実施例１７．高収量ＤＶＰを改善する変異
実施例１６で同定したＤＶＰを更に評価した。ここで、以下のＤＶＰを野生型Ｄｃ１ａ（配列番号２）と比較した。（１）アミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＤＣＲＣＩＫＳＧＦＦＳＳＫＣＶＣＲＤＶ」（配列番号２１７）を有するＫ２Ｌ／Ｙ３２Ｓ／Ｌ４２Ｉ ＤＶＰ、及び（２）アミノ酸配列：「ＡＬＤＧＤＶＥＧＰＡＧＣＫＫＹＤＶＥＣＤＳＧＥＣＣＱＫＱＹＬＷＳＫＷＲＰＬＡＣＲＳＩＫＳＧＦＦＳＳＫＳＶＣＲＤＶ」（配列番号２１８）を有するＫ２Ｌ／Ｙ３２Ｓ／Ｄ３８Ａ／Ｌ４２Ｉ／Ｃ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ ＤＶＰ。

【1002】

前述のＤＶＰを、実施例１６に記載の方法に従って合成し、クローニングした。発現を、実施例１６に記載されるように、ｒｐＨＰＬＣによって決定した。ピーク領域を野生型Ｄｃ１ａ（配列番号２）に対して正規化した。以下の表は、ＤＶＰの要約及びその発現の倍率改善を示している。

【表14】

【1003】

図１２及び表１４に示されるように、変異Ｋ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、及びＬ４２Ｉ（配列番号２１７）を組み合わせると、野生型Ｄｃ１ａと比較して収量が劇的に改善された（１９倍の改善）。更に、ジスルフィド結合欠失（すなわち、Ｃ４１Ｓ／Ｃ４１Ｓ）を含むＣ４１Ｓ／Ｃ５１Ｓ／Ｄ３８Ａ ＤＶＰバックグラウンド変異体におけるＫ２Ｌ、Ｙ３２Ｓ、及びＬ４２Ｉ変異を組み合わせは、発現の更なる大きな増加をもたらした（６３倍の改善）。図１２．

【1004】

実施例１８．シスチンノット構造：概要
シスチンノット構造
本発明は、式（ＩＩ）に記載のシスチンノット（ＣＫ）構造を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる組換えＣＲＰを操作する方法であって、

【化9】

【1005】

式中、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩが、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶが、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖが、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩが、第３のジスルフィド結合によって接続されており、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合が、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合であり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅが、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットであり、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせが、任意選択で、存在せず、当該組換えＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰを修飾することによって作製されており、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、第１のジスルフィド結合でも、第２のジスルフィド結合でも、第３のジスルフィド結合でもなく、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合が、ＣＫモチーフを形成せず、修飾可能なＣＲＰが、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を除去することによって修飾されており、１つ以上の非ＣＫジスルフィド結合を有する修飾可能なＣＲＰから１つ以上のジスルフィド結合を除去することが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰをもたらし、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＣＲＰが、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有しない修飾可能なＣＲＰの発現レベルと比較して、増加した発現レベルを有する、方法を企図し、教示する。

【1006】

図１３は、シスチンノット（ＣＫ）構造を有する組換えシステインリッチタンパク質（ＣＲＰ）を記載する式（ＩＩ）を示す概略図を示す。ここでは、Ｃ^Ｉ～Ｃ^ＶＩは、システイン残基であり、システイン残基Ｃ^Ｉ及びＣ^ＩＶは、第１のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩ及びＣ^Ｖは、第２のジスルフィド結合によって接続されており、Ｃ^ＩＩＩ及びＣ^ＶＩは、第３のジスルフィド結合によって接続されている（ジスルフィド結合は、システイン残基を接続する線によって示される）。第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、第１のジスルフィド結合、第２のジスルフィド結合、及び第３のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成する唯一のジスルフィド結合である。Ｎ_Ｅ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５、及びＣ_Ｅは、各々、１～１３個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を含むペプチドサブユニットである。一部の実施形態では、Ｎ_Ｅ、Ｌ_３、Ｃ_Ｅ、又はそれらの任意の組み合わせは、任意選択で、存在しない。

【1007】

実施例１９．式（ＩＩ）のＣＫ構造に到達する：ＡｐｓＩＩＩ
タンパク質ミュー－シルトタウキシン－Ａｓ１ａ（「ＡｐｓＩＩＩ」又は「Ａｐｓ－３」としても知られる）は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有するように修飾された修飾可能なＣＲＰである。ＡｐｓＩＩＩは、トラップドアスパイダーであるＡｐｏｍａｓｔｕｓ ｓｃｈｌｉｎｇｅｒｉに見出される殺虫タンパク質である。「ＣＮＳＫＧＴＰＣＴＮＡＤＥＣＣＧＧＫＣＡＹＮＶＷＮＣＩＧＧＧＣＳＫＴＣＧＹ」配列番号１９３のアミノ酸配列を有する例示的な野生型ＡｐｓＩＩＩタンパク質が本明細書に提供される（ＮＣＢＩ受託番号Ｐ４９２６８．１）。

【1008】

野生型ＡｐｓＩＩＩタンパク質は、１～１５位、８～１９位、１４～３５位、及び２６～３１位に４つのジスルフィド結合を有する。１～１５位、８～１９位、１４～３５位のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合トポロジーを有し、２６～３１位のジスルフィド結合は、非ＣＫジスルフィド結合、すなわち、シスチンノットモチーフの作製に関与しないジスルフィド結合を表す。したがって、非ＣＫジスルフィド結合スパニング２６～３１位を除去して、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えＡｐｓＩＩＩを作製した。

【1009】

ポリヌクレオチド構築物を合成し、クローニングし、上述のように発現させ、収量を野生型ＡｐｓＩＩＩの平均に対して正規化した。結果は、余分な非コアＩＣＫジスルフィドが除去された場合、収量のほぼ５０％の改善を示す。

【1010】

簡潔に述べると、以下の構築物が作製された：組換え野生型ＡｐｓＩＩＩ（配列番号１９５）をコードするように動作可能なポリヌクレオチド（配列番号１９４）及びＡｐｓＩＩＩ ｄＣｙｓ変異体（配列番号１９７）をコードするように動作可能なポリヌクレオチド（配列番号１９６）。ここで、ＡｐｓＩＩＩ ｄＣｙｓ変異体は、配列番号１９３に示されるＷＴ ＡｐｓＩＩＩ配列と比較して、Ｃ２６Ａ及びＣ３１Ａ変異を有する。Ｃ２６Ａ及びＣ３１Ａ変異は、第４のジスルフィド結合を除去する。

【1011】

これらのポリヌクレオチド構築物を、上述のように、ｐＫｌａｃ１ベクター（カタログ番号Ｎ３７４０、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、２４０ Ｃｏｕｎｔｙ Ｒｏａｄ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ ０１９３８－２７２３）に挿入した（実施例１を参照されたい）。次いで、得られたベクターを線形化し、ＬＡＣ４遺伝子座でのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ宿主ゲノムへの線形化されたベクターの複数のコピーの安定した組み込みために、電気有能なＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ宿主細胞に形質転換した。次いで、形質転換されたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓを、唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する選択寒天上に配置して、発現カセットの複数の挿入及びそのアセトアミダーゼ選択を含有する株を同定した。

【1012】

次いで、コロニーを、２％のソルビトール及び０．２％のコーンスティープリカーを含む最小培地中で、２３．５℃で６日間培養した。ＷＴ ＡｐｓＩＩＩ及びＡｐｓＩＩＩ ｄＣｙｓの発現を、Ｃｈｒｏｍｏｌｏｌｉｔｈ Ｃ１８カラム（ＥＭＤ）でのＨＰＬＣ分離及び１５～３５％のアセトニトリルの溶出勾配によって評価した。１～２ｍｇのＷＴ ＡｐｓＩＩＩを、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｃ１８カラム（ＥＭＤ）上でのＨＰＬＣ分画を使用して、９９％超の純度まで更に精製した。凍結乾燥後、ＷＴ ＡｐｓＩＩＩを、１６１８０Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数（ε）を用いてＡ２８０吸光度によって定量した。５～１００μｇの濃度の範囲を用いてＨＰＬＣ標準曲線を設定し、勾配を用いて未知の試料の定量化を行った。

【1013】

ＷＴ ＡｐｓＩＩＩ及びＡｐｓＩＩＩ ｄＣｙ（各ｎ＝８）の収量を、ｒｐＨＰＬＣピーク面積に基づいて決定し、次いで、総組み込み遺伝子コピーに対して正規化した。遺伝子コピー測定を決定するために、酵母ｇＤＮＡ抽出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｇＤＮＡを抽出し、デルタデルタＣｔ（ΔΔＣｔ）法を使用したｑＰＣＲ分析によってコピー数を決定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ．９．２．０を用いて、相対収量を示すヴァイオリンプロットを生成した。図１４．結果は、余分な非ＣＫジスルフィドが除去された場合、収量の５０．２％の改善を示す。

【1014】

実施例２０．式（ＩＩ）のＣＫ構造に到達する：Ｋ－ＡＣＴＸペプチド
修飾可能なＣＲＰであるカッパ－ＡＣＴＸペプチド（別名「カッパ－ＡＣＴＸ」又は「κ－ＡＣＴＸ」）を、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有するように修飾した。

【1015】

カッパ－ＡＣＴＸは、Ａｔｒａｃｉｎａｅサブファミリーに属するオーストラリアファネルウェブスパイダーから単離された殺虫阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ペプチドのメンバーである。そのようなクモの１つは、オーストラリアブルーマウンテンファネルウェブスパイダー（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｂｌｕｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ Ｆｕｎｎｅｌ－ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ）として知られており、これはＨａｙｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａという学名を有する。例示的な野生型カッパ－ＡＣＴＸペプチドが本明細書に提供され、アミノ酸配列：「ＡＩＣＴＧＡＤＲＰＣＡＡＣＣＰＣＣＰＧＴＳＣＫＡＥＳＮＧＶＳＹＣＲＫＤＥＰ」（配列番号１９８）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ８２２２８．１）を有する。

【1016】

野生型カッパ－ＡＣＴＸタンパク質は、３～１７位、１０～２２位、１３～１４位、及び１６～３２位に４つのジスルフィド結合を有する。３～１７位、１０～２２位、及び１６～３２位のジスルフィド結合は、シスチンノットモチーフを形成するジスルフィド結合であり、ジスルフィド結合トポロジーは、ＩＣＫを形成する。ジスルフィド結合スパニング１３～１４位は、非ＣＫジスルフィド結合、すなわち、シスチンノットモチーフ（すなわち、ＩＣＫ）の作製に関与しないジスルフィド結合を表す。したがって、非ＣＫジスルフィド結合スパニング１３～１４位を除去して、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有する組換えカッパ－ＡＣＴＸを作製した。

【1017】

カッパ－ＡＣＴＸ ＯＲＦをコードするポリヌクレオチド構築物を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｗｉｓｔｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／；６８１ Ｇａｔｅｗａｙ Ｂｌｖｄ Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ ９４０８０）によって合成し、クローン化した。カッパ－ＡＣＴＸ ＯＲＦは、以下のタンパク質をコードした：ＷＴ カッパ－ＡＣＴＸ（配列番号１９８）、Ｃ１３Ａ変異を有するカッパ－ＡＣＴＸ変異体（配列番号１９９）、Ｃ１４Ａ変異を有するカッパ－ＡＣＴＸ変異体（配列番号２００）、及びＣ１３Ａ及びＣ１４Ａ変異を有するカッパ－ＡＣＴＸ変異体（配列番号２０１）。

【1018】

構築物をコドン最適化し、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓアルファ接合因子プレ／プロ配列（αＭＦ）との融合として合成し、ｐＫｌａｃ１のＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にライゲーションした（カタログ番号Ｎ３７４０、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、２４０ Ｃｏｕｎｔｙ Ｒｏａｄ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ ０１９３８－２７２３）。ｐＫｌａｃ１ベクターは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓＰ_{ＬＡＣ４－ＰＢＩ}プロモーター（１）、Ｋ．ｌａｃｔｉｓα接合因子（α－ＭＦ）分泌ドメインをコードするＤＮＡ（分泌発現のための）、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＬＡＣ４転写ターミネーター（ＴＴ）、及び酵母ＡＤＨ２プロモーター（Ｐ_ＡＤＨ２）から発現される真菌アセトアミダーゼ選択可能マーカー遺伝子（ＡＭＤＳ）を含有する。加えて、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐＫＬＡＣ１の増殖のために、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点（ＯＲＩ）及びアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ^Ｒ）が存在する。

【1019】

ベクターをＳａｃＩＩで消化し、線状化し、細菌Ｏｒｉ及び選択マーカーを除去し、次いで、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓのエレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションした。次いで、コロニーを、２％のソルビトール及び０．２％のコーンスティープリカーを含む最小培地中で、２３．５℃で６日間培養した。唯一の窒素源としてアセトアミドを含む選択プレート上で、複数の遺伝子コピー形質転換体を選択した。

【1020】

収量の比較は、上述のＨＰＬＣ手順で決定されたピーク面積（ｍＡＵ）に基づいた。簡潔に述べると、タンパク質を発現するクローンを、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｃ１８カラム（４．６×１００ｍｍ）でのＨＰＬＣによって評価し、２ｍＬ分－１の流量で、５分間にわたる５～３０％のアセトニトリルの勾配で溶出した。

【1021】

以下の表は、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造に到達するために、カッパ－ＡＣＴＸから近接ジスルフィド結合を除去した結果を示す。

【表15】

【1022】

上記の表１４に示されるように、式（ＩＩ）に記載のＣＫ構造を有するようにカッパ－ＡＣＴＸを修正すると、収量が増加した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

2023543829000001.app

【国際調査報告】