知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2023-543993遺伝性出血性毛細血管拡張症の治療における使用のためのアロステリックＡＫＴ阻害剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-19
(54)【発明の名称】遺伝性出血性毛細血管拡張症の治療における使用のためのアロステリックＡＫＴ阻害剤
(51)【国際特許分類】
C07D 498/04 20060101AFI20231012BHJP
A61K 31/5383 20060101ALI20231012BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20231012BHJP
A61P 25/06 20060101ALI20231012BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20231012BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20231012BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231012BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20231012BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231012BHJP
【ＦＩ】
C07D498/04 111
C07D498/04 CSP
A61K31/5383
A61P9/00
A61P25/06
A61P3/00
A61P11/00
A61P25/00
A61P9/12
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023519016
(86)(22)【出願日】2021-09-29
(85)【翻訳文提出日】2023-05-19
(86)【国際出願番号】 EP2021076811
(87)【国際公開番号】W WO2022069552
(87)【国際公開日】2022-04-07
(31)【優先権主張番号】2015536.2
(32)【優先日】2020-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523106137
【氏名又は名称】ヴァデリス セラピューティクス エージー
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＤＥＲＩＳ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】ピカール ダミアン
(72)【発明者】
【氏名】サン－メザール ピエール
【テーマコード（参考）】
4C072
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C072AA01
4C072BB02
4C072CC02
4C072CC11
4C072EE07
4C072FF07
4C072GG07
4C072HH01
4C072HH02
4C072UU01
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086CB22
4C086GA14
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA08
4C086ZA36
4C086ZA42
4C086ZA59
4C086ZC20
4C086ZC21
(57)【要約】
本発明は、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）の治療における使用のための式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）の治療における使用のための式（Ｉ）の化合物：【化1】
（式中、
各Ｘが、独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｒ１が、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され、各Ｃ１－Ｃ１０アルキルがハロゲン、－ＣＮ、－ＯＲ７、又は３～６員のシクロアルキルから選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよく；
Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され；又はＲ２及びＲ３が、それらが結合している窒素原子と共に、３～６員の複素環を形成し；
Ｒ４及びＲ５が、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、又はＣ２－Ｃ６アルキニルから選択され；又はＲ４及びＲ５が、それらが結合している炭素原子と共に、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、３～６員のシクロアルキル環又は複素環を形成し；
Ｒ６が、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、５～７員のアリール環又はヘテロアリール環であり；並びに
各Ｒ７が、独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択される）。
【請求項2】
式（Ｉ）の化合物が以下の構造を有する、請求項１に記載の使用のための化合物。【化2】
【請求項3】
Ｒ６が非置換型フェニルである、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。
【請求項4】
Ｒ４及びＲ５が、それらが結合している炭素原子と共に、シクロブチル環を形成する、請求項１～３のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項5】
各ＸがＯである、請求項１～４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項6】
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキルである、請求項１～５のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項7】
Ｒ１がメチル又はエチルである、請求項６に記載の使用のための化合物。
【請求項8】
Ｒ１が－（ＣＨ２）ｎＣＮ（式中、ｎが１、２、３、４、又は５である）である、請求項１～７のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項9】
Ｒ２及びＲ３がそれぞれ、水素である、請求項１～８のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項10】
式（Ｉ）の化合物が【化3】
又はその薬学的に許容される塩である、請求項１～９のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項11】
式（Ｉ）の化合物が【化4】
【請求項12】
薬学的に許容される塩が酒石酸塩、メシル酸塩、又はリン酸塩である、請求項１～１１のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項13】
薬学的に許容される塩が酒石酸塩である、請求項１２に記載の使用のための化合物。
【請求項14】
酒石酸塩がＬ－酒石酸塩である、請求項１３に記載の使用のための化合物。
【請求項15】
対象への経口投与のために製剤化される、請求項１～１４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項16】
対象がヒトである、請求項１～１５のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項17】
対象が成人である、請求項１６に記載の使用のための化合物。
【請求項18】
式（Ｉ）の化合物が２０～７５ｍｇ Ｑ．Ｄ．の用量で対象に投与される、請求項１７に記載の使用のための化合物。
【請求項19】
式（Ｉ）の化合物が１０～５０ｍｇ Ｑ．Ｄ．の用量で対象に投与される、請求項１７に記載の使用のための化合物。
【請求項20】
式（Ｉ）の化合物が２０～４０ｍｇ Ｑ．Ｄ．の用量で対象に投与される、請求項１９に記載の使用のための化合物。
【請求項21】
式（Ｉ）の化合物が２０～３０ｍｇ Ｑ．Ｄ．の用量で対象に投与される、請求項２０に記載の使用のための化合物。
【請求項22】
ＨＨＴの治療が、ＨＨＴに関連した出血の頻度、持続時間、又は強度を低下させることを含む、請求項１～２１のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項23】
ＨＨＴに関連した出血が胃腸（ＧＩ）出血である、請求項２２に記載の使用のための化合物。
【請求項24】
ＨＨＴに関連した出血が鼻出血である、請求項２２に記載の使用のための化合物。
【請求項25】
ＨＨＴの治療が対象においてヘモグロビンレベルを増加させることを含む、請求項１～２４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項26】
ＨＨＴの治療が対象において毛細血管拡張の数を減少させることを含む、請求項１～２５のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項27】
ＨＨＴの治療が対象において毛細血管拡張のサイズを低下させることを含む、請求項１～２６のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項28】
毛細血管拡張が皮膚毛細血管拡張である、請求項２６又は２７に記載の使用のための化合物。
【請求項29】
毛細血管拡張が鼻毛細血管拡張である、請求項２６又は２７に記載の使用のための化合物。
【請求項30】
毛細血管拡張が口腔毛細血管拡張である、請求項２６又は２７に記載の使用のための化合物。
【請求項31】
毛細血管拡張が胃腸毛細血管拡張である、請求項２６又は２７に記載の使用のための化合物。
【請求項32】
ＨＨＴの治療が、対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）の数を減少させることを含む、請求項１～３１のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項33】
ＨＨＴの治療が、対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）のサイズを低下させることを含む、請求項１～３２のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項34】
ＨＨＴの治療が対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）の形成を防止することを含む、請求項１～３３のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項35】
動静脈奇形が肺ＡＶＭである、請求項３２～３４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項36】
動静脈奇形が大脳（脳）ＡＶＭである、請求項３２～３４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項37】
動静脈奇形が内臓ＡＶＭである、請求項３２～３４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項38】
ＨＨＴの治療が心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の低下を含む、請求項１～３７のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項39】
ＨＨＴの治療が心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の防止を含む、請求項１～３８のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項40】
ＨＨＴの治療が対象における肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントの防止を含む、請求項１～２９のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項41】
ＨＨＴの治療が対象における肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントのグレードの低下を含む、請求項１～４０のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項42】
ＨＨＴの治療が対象における鉄分補給の必要性の低下を含む、請求項１～４１のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項43】
ＨＨＴの治療が、対象にとって必要である輸血の回数の減少を含む、請求項１～４２のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項44】
ＨＨＴの治療が肝血流の減少を含む、請求項１～４３のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項45】
ＨＨＴの治療が対象において肝移植の必要性を減らす、請求項１～４４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項46】
ＨＨＴの治療がＨＨＴの追加の症状の頻度及び／又は重症度の低下を含む、請求項１～４５のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項47】
追加の症状が、呼吸困難、片頭痛、疲労、神経学的事象、及び／又は塞栓性事象である、請求項４６に記載の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アロステリックＡＫＴ阻害剤及び遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ，Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia）の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＴＴ）は、世界中で５，０００～８，０００人に１人が罹る常染色体顕性遺伝性疾患である。臨床症状には、毛細血管を介在することなしの動脈と静脈の間の直接的接続からなる、肺、脳、及び肝臓の動静脈奇形（ＡＶＭ，arteriovenous malformation）が挙げられる。ＡＶＭは、治療されないならば、生命に関わる合併症を引き起こし得る。ＨＨＴ患者はまた、鼻、口腔、及び胃腸管において毛細血管拡張と名付けられた小さい動静脈奇形を発症する。これらの脆弱な血管は、容易に破裂して、出血し、重度かつ頻繁な出血エピソード後、再発性貧血を引き起こす（Dupuis-Girod et al., (2010), “Hereditary hemorrhagic telangiectasia: From molecular biology to patient care”, Journal of Thrombosis and Haemostasis. https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2010.03860.x；Iriarte et al., (2019), “PI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase) Activation and Endothelial Cell Proliferation in Patients with Hemorrhagic Hereditary Telangiectasia Type 1”, Cells. https://doi.org/10.3390/cells8090971）。
【0003】
これまで同定された変異の大部分は、２つの遺伝子内に見出されている。ＨＨＴ１は、ＥＮＧ（エンドグリン，endoglin）遺伝子内の変異によって引き起こされ、一方、ＨＨＴ２は、ＡＣＶＲＬ１（アクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１，Activin receptor-like kinase 1））内の変異によって引き起こされる。どちらも、主に内皮細胞に発現するトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β，Transforming Growth Factor-β）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ，Bone Morphogenetic Protein）の受容体である。変異は、ヌル対立遺伝子を表し、ハプロ不全がＨＨＴの根本原因であることを指し示している。ＥＮＧ又はＡＣＶＲＬ１（ＡＬＫ１）における変異がどのようにして病的血管新生をもたらすのかは、依然としてわからないところが多いままである。
【0004】
原因である遺伝子変異の同定及び動物モデルの作製により、内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の減少及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ，vascular endothelial growth factor）シグナル伝達活性の増加が、ＨＨＴにおける血管奇形の発生に関与していることが明らかにされている。これらの鍵となる経路における撹乱が、内皮細胞活性化をもたらし、その結果として、壁細胞の内皮からの脱離を生じる（Galaris et al., (2019), “Pericytes in Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia”, Advances in Experimental Medicine and Biology. https://doi.org/10.1007/978-3-030-16908-4_10）。この最初の不安定状態が、血管が血管新生性トリガーに曝された時、血管を不適切に応答させ、その結果として、過剰な血管成長、及び出血を起こしやすい血管異常の形成を生じる。
【0005】
最近、マウスモデル及びインビトロでの実験からの一連の研究により、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路とＨＨＴで観察される内皮細胞活性化の増加との間の関連が明らかにされた。ＡＬＫ１シグナル伝達の喪失は、内皮細胞におけるＰＴＥＮの低下により誘導されるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の増加と同時発生する（Jin et al., (2017), “Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling”, Nature Cell Biology, 19(6), 639-652. https://doi.org/10.1038/ncb3534；Ola et al., (2016), “PI3 kinase inhibition improves vascular malformations in mouse models of hereditary haemorrhagic telangiectasia”, Nature Communications, 7. https://doi.org/10.1038/ncomms13650；Ola et al. (2018), “SMAD4 Prevents Flow Induced Arteriovenous Malformations by Inhibiting Casein Kinase 2”, Circulation, 138(21), 2379-2394）。この観察は、ＨＨＴ１及びＨＨＴ２患者の皮膚毛細血管拡張生検において確認されており、内皮細胞増殖の増加が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路下流遺伝子の増加に結びつけられる（Alsina-Sanchis et al., (2018), “ALK1 loss results in vascular hyperplasia in mice and humans through PI3K activation”, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.118.310760）。
【0006】
Ｐｉ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達をターゲットとすることで、ＨＨＴに観察される病的血管新生の治療のための治療ストラテジーを提供し得る。しかしながら、安全かつ効果的な治療剤は、まだ知られていない。例として、広く用いられている汎Ｐｉ３Ｋ阻害剤である、ワートマニンは、ＡＬＫ１又はＳＭＡＤ４ ｉＫＯの網膜マウスモデルにおいてＡＶＭ形成を阻害することができるが（Ola et al., (2016)、(2018)、上記の通り）、エンドグリンの誘導型ノックアウト（Ｅｎｇ－ｉＫＯ，Endoglin-inducible knockout）モデルにおいては阻害できない（Jin et al., (2017)、上記の通り）。同様に、典型的なｍＴＯＲ阻害剤である、シロリムスは、Ｅｎｇ－ｉＫＯモデルにおいてＡＶＭ形成をブロックすることができない（Ruiz et al., (2019), “Sirolimus plus nintedanib treats vascular pathology in HHT mouse models”, BioRxiv Cell Biology. https://doi.org/10.1101/739144）。
【0007】
したがって、効果的であり、かつ受け入れられる安全性プロファイルを有する、ＨＨＴの治療剤を提供する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Dupuis-Girod et al., (2010), “Hereditary hemorrhagic telangiectasia: From molecular biology to patient care”, Journal of Thrombosis and Haemostasis. https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2010.03860.x
【非特許文献2】Iriarte et al., (2019), “PI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase) Activation and Endothelial Cell Proliferation in Patients with Hemorrhagic Hereditary Telangiectasia Type 1”, Cells. https://doi.org/10.3390/cells8090971
【非特許文献3】Galaris et al., (2019), “Pericytes in Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia”, Advances in Experimental Medicine and Biology. https://doi.org/10.1007/978-3-030-16908-4_10
【非特許文献4】Jin et al., (2017), “Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling”, Nature Cell Biology, 19(6), 639-652. https://doi.org/10.1038/ncb3534
【非特許文献5】Ola et al., (2016), “PI3 kinase inhibition improves vascular malformations in mouse models of hereditary haemorrhagic telangiectasia”, Nature Communications, 7. https://doi.org/10.1038/ncomms13650
【非特許文献6】Ola et al. (2018), “SMAD4 Prevents Flow Induced Arteriovenous Malformations by Inhibiting Casein Kinase 2”, Circulation, 138(21), 2379-2394
【非特許文献7】Alsina-Sanchis et al., (2018), “ALK1 loss results in vascular hyperplasia in mice and humans through PI3K activation”, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.118.310760
【非特許文献8】Ruiz et al., (2019), “Sirolimus plus nintedanib treats vascular pathology in HHT mouse models”, BioRxiv Cell Biology. https://doi.org/10.1101/739144
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の第１の態様によれば、対象における遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物：
【0010】
【化1】
【0011】
又はその薬学的に許容される塩が提供される
（式中、
各Ｘは、独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｒ１は、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され、各Ｃ１－Ｃ１０アルキルはハロゲン、－ＣＮ、－ＯＲ７、又は３～６員のシクロアルキルから選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され；又はＲ２及びＲ３は、それらが結合している窒素原子と共に、３～６員の複素環を形成し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、又はＣ２－Ｃ６アルキニルから選択され；又はＲ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、３～６員のシクロアルキル環又は複素環を形成し；
Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、５～７員のアリール環又はヘテロアリール環であり；並びに
各Ｒ７は、独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択される）。
（式中、
各Ｘは、独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｒ１は、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され、各Ｃ１－Ｃ１０アルキルはハロゲン、－ＣＮ、－ＯＲ７、又は３～６員のシクロアルキルから選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され；又はＲ２及びＲ３は、それらが結合している窒素原子と共に、３～６員の複素環を形成し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、又はＣ２－Ｃ６アルキニルから選択され；又はＲ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、３～６員のシクロアルキル環又は複素環を形成し；
Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、５～７員のアリール環又はヘテロアリール環であり；並びに
各Ｒ７は、独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択される）。
【0012】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は以下の構造を有する：
【0013】
【化2】
【0014】
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及び－ＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、１つ又は２つ以上の置換基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＣＮ、－ＯＨ、及びハロゲンから選択される。他の実施形態において、Ｒ６は、非置換型フェニルである。
【0015】
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及び－ＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されている５～７員のヘテロアリール環である。いくつかの実施形態において、１つ又は２つ以上の置換基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＣＮ、－ＯＨ、及びハロゲンから選択される。他の実施形態において、Ｒ６は、非置換型５～７員のヘテロアリール環である。ある特定の実施形態において、ヘテロアリール環は、６員のヘテロアリール環である。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール環は、少なくとも１個の窒素原子を含有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール環は、少なくとも１個の酸素原子を含有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール環は、少なくとも１個の硫黄原子を含有する。例えば、ヘテロアリール環は、ピリジン、ピラン、チオピラン、ピロール、フラン、又はチオフェンであり得る。
【0016】
いくつかの実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、３～６員の非置換型のシクロアルキル環又は複素環を形成する。他の実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及び－ＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されている、３～６員の非置換型のシクロアルキル環又は複素環を形成する。例えば、シクロアルキル環は、シクロプロピル環、シクロブチル環、シクロペンチル環、又はシクロヘキシル環であり得る。いくつかの実施形態において、複素環は、少なくとも１個の窒素原子を含有する。いくつかの実施形態において、複素環は、少なくとも１個の酸素原子を含有する。いくつかの実施形態において、複素環は、少なくとも１個の硫黄原子を含有する。例えば、複素環は、ピペリジン、テトラヒドロピラン、チアン、ピロリジン、テトラヒドロフラン、又はテトラヒドロチオフェンであり得る。
【0017】
いくつかの実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、非置換型のシクロプロピル環、シクロブチル環、シクロペンチル環、又はシクロヘキシル環を形成する。他の実施形態において、シクロプロピル環、シクロブチル環、シクロペンチル環、又はシクロヘキシル環は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及び－ＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されている。いくつかの実施形態において、１つ又は２つ以上の置換基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＣＮ、－ＯＨ、及びハロゲンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、非置換型シクロブチル環を形成する。他の実施形態において、シクロブチル環は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及び－ＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されている。いくつかの実施形態において、１つ又は２つ以上の置換基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＣＮ、－ＯＨ、及びハロゲンから選択される。
【0018】
いくつかの実施形態において、各ＸはＯである。
【0019】
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、非置換型Ｃ１－Ｃ１０アルキル、非置換型Ｃ１－Ｃ６アルキル、又は非置換型Ｃ１－Ｃ４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、又はヘキシルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、又はｔ－ブチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、メチル又はエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、ハロゲン、－ＣＮ、－ＯＨ、又は３～６員のシクロアルキルから選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換された、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルキル、又はＣ１－Ｃ４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｎＣＮ（式中、ｎは１、２、３、４、又は５である）である。
【0020】
いくつかの実施形態において、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、独立して、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、独立して、水素、メチル、及びエチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、水素である。
【0021】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
【0022】
【化3】
【0023】
（式中、Ｒ８は－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、及びＣ１－Ｃ６アルキルから選択される）又はその薬学的に許容される塩である。
【0024】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
【0025】
【化4】
【0026】
又はその薬学的に許容される塩である。
【0027】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される塩は、酒石酸塩、メシル酸塩、又はリン酸塩である。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される塩は、酒石酸塩である。いくつかの実施形態において、酒石酸塩は、Ｌ－酒石酸塩である。
【0028】
いくつかの実施形態において、前記化合物は、対象への経口投与のために製剤化される。
【0029】
いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は成人である。いくつかのそのような実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、２０～７５ｍｇ Ｑ．Ｄ．の用量で対象に投与される。他のそのような実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、１０～５０ｍｇ Ｑ．Ｄ．、２０～４０ｍｇ Ｑ．Ｄ．、又は２０～３０ｍｇ Ｑ．Ｄ．の用量で対象に投与される。
【0030】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、ＨＨＴに関連した出血の頻度、持続時間、又は強度を低下させることを含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＨＴに関連した出血は、胃腸（ＧＩ，gastrointestinal）出血である。いくつかの実施形態において、ＨＨＴに関連した出血は、鼻出血である。
【0031】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象においてヘモグロビンレベルを増加させることを含む。
【0032】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象において毛細血管拡張の数を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象において毛細血管拡張のサイズを低下させることを含む。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は、皮膚毛細血管拡張である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は、鼻毛細血管拡張である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は、口腔毛細血管拡張である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は胃腸毛細血管拡張である。
【0033】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）の数及び／又はサイズを低下させることを含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象においてＡＶＭの形成を予防することを含む。いくつかのそのような実施形態において、動静脈奇形は肺ＡＶＭである。いくつかの実施形態において、動静脈奇形は脳(cerebral)（脳: brain）ＡＶＭである。いくつかの実施形態において、動静脈奇形は内臓ＡＶＭである。
【0034】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の低下を含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の予防を含む。
【0035】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象における肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントの予防を含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象における肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントのグレードの低下を含む。
【0036】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象における鉄補給の必要性の低下、例えば、対象にとって必要である鉄注入の回数の減少を含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象にとって必要である輸血の回数の減少を含む。
【0037】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、肝血流の減少を含む。
【0038】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象において肝移植の必要性を減らす。
【0039】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、ＨＨＴの追加の症状の頻度及び／又は重症度の低下を含む。そのような追加の症状には、呼吸困難、片頭痛、疲労、神経学的事象、及び塞栓性事象が挙げられ得る。
【0040】
本発明は又、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）の治療のための医薬の製造のための、上記の実施形態のいずれかに定義されているような式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【0041】
本発明は又、上記の実施形態のいずれかに定義されているような式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象における遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）の治療の方法を提供する。
【0042】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、ＨＨＴに関連した出血の頻度、持続時間、又は強度の低下を生じる。いくつかのそのような実施形態において、ＨＨＴに関連した出血は、胃腸（ＧＩ）出血である。いくつかの実施形態において、ＨＨＴに関連した出血は、鼻出血である。
【0043】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象においてヘモグロビンレベルの増加を生じる。
【0044】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象において毛細血管拡張の数の減少を生じる。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象において毛細血管拡張のサイズの低下を生じる。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張症は、皮膚毛細血管拡張症である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張症は、鼻毛細血管拡張症である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張症は、口腔毛細血管拡張症である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張症は胃腸毛細血管拡張症である。
【0045】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）の数の減少を生じる。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）のサイズの低下を生じる。いくつかの実施形態において、方法は、対象においてＡＶＭの形成を予防する。いくつかのそのような実施形態において、動静脈奇形は、肺ＡＶＭである。いくつかの実施形態において、動静脈奇形は脳ＡＶＭである。いくつかの実施形態において、動静脈奇形は内臓ＡＶＭである。
【0046】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象の生活の質の向上を生じる。
【0047】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の低下を生じる。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の予防を生じる。
【0048】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、対象において肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントを予防する。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、対象において肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントのグレードの低下を生じる。
【0049】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象における鉄補給の必要性の低下、例えば、対象にとって必要である鉄注入の回数の減少を生じる。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象にとって必要である輸血の回数の減少を生じる。
【0050】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、肝血流の減少を生じる。
【0051】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、対象において肝移植の必要性を減らす。
【0052】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、ＨＨＴの追加の症状の頻度及び／又は重症度の低下を生じる。そのような追加の症状には、呼吸困難、片頭痛、疲労、神経学的事象、及び塞栓性事象が挙げられ得る。
【0053】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象の生活の質の全体的な向上を生じる。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1A】～
【図1E】図１Ａは、ＡＫＴ２との複合体における化合物６の全体的な構造を示す図である。図１Ｂは、アロステリックポケットを拡大しかつアミノ酸相互作用を示す、複合体の構造を示す図である。図１Ｃは、アミノ酸相互作用の概略図である。図１Ｄは、ＡＫＴ２との複合体におけるＶＡＤ０４４の遊離塩基の構造（アロステリックポケットを拡大しかつアミノ酸相互作用を示す）を示す図である。図１Ｅは、アミノ酸相互作用の概略図である。
【図2A】～
【図2B】図２Ａは、異なるキナーゼの相対的配列相同性を示す樹形図である（図中、同じ分枝上にありかつ互いに近くに位置付けされるキナーゼは、高レベルの配列相同性を有する；一方、異なる分枝上に位置付けされるキナーゼは非常に異なる配列相同性を有する）。図２Ａに示されているように、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、及びＡＫＴ３は、非常に高いレベルの配列相同性を有する。ＰＤＫ１は、ＡＫＴ１／２／３と同じ主枝（「ＡＧＣ」とラベルされている）上に位置し、ＡＫＴ１／２／３との相対的に高いレベルの配列相同性を指し示している；一方、ｐ３８αは、全く異なる主枝（「ＣＭＧＣ」とラベルされている）上にあり、ＡＫＴ１／２／３とｐ３８αの間の低レベルの配列相同性を指し示している。図２Ｂは、ＶＡＤ０４４（６－（４－（１－アミノ－３－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン Ｌ－酒石酸塩）によって達成されたこれらの５つの選択されたキナーゼ（ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＰＤＫ１、及びｐ３８α）の％阻害を示す図である。
【図3A】～
【図3B】ペリフォシン（Perifosine）の安全性及び潜在的毒性を示す図である。図３Ａは仔の死亡率を示し、図３Ｂは、出生後４日目（Ｐ４）とＰ７の間での動物体重差を示す。全ての誤差バーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、各群の平均値を、ビヒクルのみを注射した対照群と比較した一元配置Ａｎｏｖａ及びダネットの事後検定による結果である。「ｎｓ」＝有意でない。
【図4A】～
【図4D】ペリフォシンがマウスにおいて弱い抗血管新生性を有することを示す図である。図４Ａは、Ｐ４にビヒクルのみ又はペリフォシンの５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、若しくは１００ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射後の、Ｐ７での野生型マウスの網膜血管におけるイソレクチンＢ４染色内皮細胞を示す。下部は、より高い倍率での血管網である。図４Ｂは、放射状伸展の定量化を示し、図２Ｃは、イソレクチンＢ４陽性表面積を示し、図４Ｄは、視野あたりの分岐点の数を示す。全ての誤差バーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１は、各群の平均値を、ビヒクルのみで治療した対照群と比較した一元配置Ａｎｏｖａ及びダネットの事後検定による結果である。「ｎｓ」＝有意でない。
【図5A】～
【図5F】Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスモデルにおいてＡＶＭ形成を予防するペリフォシンの有効性を示す図である。図５Ａは、ペリフォシンの注射スキームの図解である。図５Ｂは、内皮細胞を明らかに示すためにイソレクチンＢ４で染色されたＥｎｇ－ｉＫＯ網膜へのペリフォシンの効果を示す共焦点画像を示す。下部は、より高い倍率での血管網である。図５Ｃは、マウス１匹あたりのＡＶシャントの数を示す。図５Ｄは、放射状伸展の定量化を示し、図５Ｅは、イソレクチンＢ４陽性エリアを示し、図５Ｆは、視野あたりの分岐点の数を示す。全ての誤差バーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊ｐ＜０．０５は、各群の平均値を、Ｅｎｇ－ｉＫＯ群と比較した一元配置Ａｎｏｖａ及びダネットの事後検定による結果である。「ｎｓ」＝有意でない。
【図6A】～
【図6B】ユプロセルチブ（Uprosertib）の安全性及び潜在的毒性を示す図である。図６Ａは仔の死亡率を示し、図６Ｂは、出生後４日目（Ｐ４）とＰ７の間での動物体重差を示す。全ての誤差バーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊ｐ＜０．０５は、各群の平均値を、ビヒクルのみを注射した対照群と比較した一元配置Ａｎｏｖａ及びダネットの事後検定からの結果。「ｎｓ」＝有意でない。
【図7A】～
【図7D】マウスにおけるユプロセルチブの抗血管新生性を示す図である。図７Ａは、Ｐ４にビヒクルのみ又はユプロセルチブの２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射後の、Ｐ７での野生型マウスの網膜血管におけるイソレクチンＢ４染色内皮細胞を示す。下部は、血管網の拡大図である。図７Ｂは、放射状伸展の定量化を示し、図７Ｃは、イソレクチンＢ４陽性表面積を示し、図７Ｄは、視野あたりの分岐点の数を示す。全ての誤差バーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊ｐ＜０．０、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、各群の平均値を、ビヒクルのみで治療した対照群と比較した一元配置Ａｎｏｖａ及びダネットの事後検定による結果である。「ｎｓ」＝有意でない。
【図8A】～
【図8B】図８Ａはユプロセルチブの注射スキームの図解であり、図８Ｂは、仔の死亡率を示す図である。Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ｃｄｈ５－ＣｒｅＥＲＴ２動物に、Ｐ２においてタモキシフェン（５０μｇ）を注射して、新生仔マウスにおいてほぼ完全な遺伝子ノックアウトを誘導し、その後、Ｐ３及びＰ５において１回、ユプロセルチブの０ｍｇ／ｋｇ体重又は５ｍｇ／ｋｇ体重をＩＰ注射した。同じ体積のビヒクルが注射され、それが対照動物としての役割を果たした。
【図9A】～
【図9B】図９ＡはＶＡＤ０４４の注射スキームの図解であり、図９Ｂは、仔の死亡率を示す図である。Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ｃｄｈ５－ＣｒｅＥＲＴ２動物に、Ｐ２においてタモキシフェン（５０μｇ）を注射して、新生仔マウスにおいてほぼ完全な遺伝子ノックアウトを誘導し、その後、Ｐ３及びＰ５において１回、ＶＡＤ０４４の０ｍｇ／ｋｇ体重、２．５ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、又は１０ｍｇ／ｋｇ体重をＩＰ注射した。同じ体積のビヒクルが注射され、それが対照動物としての役割を果たした。その後、Ｐ７においてマウスを殺害し、記載されているように（Lebrin et al., 2010）、網膜を免疫蛍光染色のために処理した。
【図10A】～
【図10E】Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスモデルにおいてＡＶＭ形成を予防するＶＡＤ０４４の有効性を示す図である。図１０Ａは、内皮細胞を明らかに示すためにイソレクチンＢ４で染色されたＥｎｇ－ｉＫＯ網膜へのＶＡＤ０４４の効果を示す共焦点画像を示す。図１０Ｂは、マウス１匹あたりのＡＶシャントの数を示す。図１０Ｃは、放射状伸展の定量化を示し、図１０Ｄは、イソレクチンＢ４陽性エリアを示し、図１０Ｅは、視野あたりの分岐点の数を示す。全ての誤差バーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、各群の平均値を、Ｅｎｇ－ｉＫＯ群と比較した一元配置Ａｎｏｖａ及びダネットの事後検定による結果である。「ｎｓ」＝有意でない。
【図11】Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスの肺からのマウス初代内皮細胞の単離のための方法及び特徴づけ、並びに、前記細胞においてＥｎｇ遺伝子の欠失を誘導するためのＣｒｅリコンビナーゼのアデノウイルス感染（及びその後の、Ｅｎｇタンパク質の欠失）を示す図である。
【図12】正常な、及びＥｎｇを欠失した内皮細胞（ＥＣ，endothelial cells）におけるＡＫＴ及びＳＭＡＤシグナル伝達を示す図である。
【図13A】～
【発明を実施するための形態】
【0055】
上記で論じられているように、Ｐｉ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路のターゲティングは、ＨＨＴの治療のための治療ストラテジーを提供し得る。しかしながら、安全かつ効果的な治療剤は、まだ知られていない。
【0056】
ＡＫＴは、３つのアイソフォーム：ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、及びＡＫＴ３を有するセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。ＡＫＴ１は、出芽伸長及び血管リモデリングなどの血管新生シグナル伝達のいくつかの側面を促進する重要な下流エフェクター（例えば、ｅＮＯＳ、Ａｎｇ２、及びＦＯＸＯｓ）を調節することにより、内皮細胞において必須機能を有する（Lee et al., (2014), “Endothelial Akt1 mediates angiogenesis by phosphorylating multiple angiogenic substrates”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. https://doi.org/10.1073/pnas.1408472111）。いくつかの研究により、持続性内皮型ＡＫＴ活性化が、慢性血管透過性からの血管サイズの増加及び全身性浮腫を引き起こすことが示されている（Phung et al., (2006), “Pathological angiogenesis is induced by sustained Akt signaling and inhibited by rapamycin”, Cancer Cell. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2006.07.003）。同様に、内皮細胞におけるＡＫＴ１の無制御活性化は、インビボで血管奇形を誘発する（Perry et al., (2007), “AKT1 overexpression in endothelial cells leads to the development of cutaneous vascular malformations in vivo”, Archives of Dermatology. https://doi.org/10.1001/archderm.143.4.50）。したがって、ＡＫＴは、ＨＨＴにおいて観察される病的血管新生及び血管奇形を制御する鍵となる分子標的であり得る。
【0057】
本発明者らは、異なるタイプのＡＫＴ阻害剤を試験し、それらの毒性プロファイル、正常血管新生へのそれらの効果、及びＨＨＴのマウスモデルにおいて血管奇形の発生を予防するそれらの能力を評価した。その結果は、以下の実施例において詳細に論じられている。
【0058】
要約すれば、本発明者らは、驚くべきことに、下記の式（Ｉ）を有する特定のアロステリックＡＫＴ阻害剤が、ＨＨＴ １型（ＨＨＴ１）のＥｎｇ－ｉＫＯマウスモデルにおいて血管奇形の発生を予防することができることを見出した。下記の実施例に、より詳細に論じられているように、この化合物（及び２つの他の比較ＡＫＴ阻害剤）の安全性／毒性プロファイルが得られ、出生後７日目（Ｐ７）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスにおける血管新生の阻害のための各化合物の最小有効用量が、新生仔網膜血管新生モデルを用いて決定された。Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスにおける動静脈奇形（ＡＶＭ）の発生の予防のための各化合物の最小有効用量もまた、各化合物について決定された。
【0059】
本発明者らは、式（Ｉ）のアロステリックＡＫＴ阻害剤が、受け入れられる安全性プロファイルを示しながら、驚くべき低い投薬量（腫瘍学に典型的に用いられる投薬量のおよそ１０分の１）で、ＨＨＴに関連した血管奇形を治療及び／又は予防し得ることを予想外に見出した。
【0060】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象でのＨＨＴの治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物：
【0061】
【化5】
【0062】
又はその薬学的に許容される塩を提供する
（式中、
各Ｘは、独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｒ１は、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され、各Ｃ１－Ｃ１０アルキルはハロゲン、－ＣＮ、－ＯＲ７、又は３～６員のシクロアルキルから選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され；又はＲ２及びＲ３は、それらが結合している窒素原子と共に、３～６員の複素環を形成し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、又はＣ２－Ｃ６アルキニルから選択され；又はＲ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、３～６員のシクロアルキル環又は複素環を形成し；
Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、５～７員のアリール環又はヘテロアリール環であり；並びに
各Ｒ７は、独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択される）。
（式中、
各Ｘは、独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｒ１は、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され、各Ｃ１－Ｃ１０アルキルはハロゲン、－ＣＮ、－ＯＲ７、又は３～６員のシクロアルキルから選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択され；又はＲ２及びＲ３は、それらが結合している窒素原子と共に、３～６員の複素環を形成し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、又はＣ２－Ｃ６アルキニルから選択され；又はＲ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、３～６員のシクロアルキル環又は複素環を形成し；
Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７ ２、及び－ＮＲ７ ２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されてもよい、５～７員のアリール環又はヘテロアリール環であり；並びに
各Ｒ７は、独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択される）。
【0063】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は以下の構造：
【0064】
【化6】
【0065】
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及び－ＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、１つ又は２つ以上の置換基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＣＮ、－ＯＨ、及びハロゲンから選択される。他の実施形態において、Ｒ６は、非置換型フェニルである。
【0066】
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及び－ＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されている、５～７員のヘテロアリール環である。いくつかの実施形態において、１つ又は２つ以上の置換基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＣＮ、－ＯＨ、及びハロゲンから選択される。他の実施形態において、Ｒ６は、非置換型５～７員のヘテロアリール環である。ある特定の実施形態において、ヘテロアリール環は、６員のヘテロアリール環である。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール環は、少なくとも１個の窒素原子を含有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール環は、少なくとも１個の酸素原子を含有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール環は、少なくとも１個の硫黄原子を含有する。例えば、ヘテロアリール環は、ピリジン、ピラン、チオピラン、ピロール、フラン、又はチオフェンであり得る。
【0067】
いくつかの実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、３～６員の非置換型のシクロアルキル環又は複素環を形成する。他の実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及びＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されている、３～６員の非置換型のシクロアルキル環又は複素環を形成する。例えば、シクロアルキル環は、シクロプロピル環、シクロブチル環、シクロペンチル環、又はシクロヘキシル環であり得る。いくつかの実施形態において、複素環は、少なくとも１個の窒素原子を含有する。いくつかの実施形態において、複素環は、少なくとも１個の酸素原子を含有する。いくつかの実施形態において、複素環は、少なくとも１個の硫黄原子を含有する。例えば、複素環は、ピペリジン、テトラヒドロピラン、チアン、ピロリジン、テトラヒドロフラン、又はテトラヒドロチオフェンであり得る。
【0068】
いくつかの実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、非置換型のシクロプロピル環、シクロブチル環、シクロペンチル環、又はシクロヘキシル環を形成する。他の実施形態において、シクロプロピル環、シクロブチル環、シクロペンチル環、又はシクロヘキシル環は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及び－ＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されている。いくつかの実施形態において、１つ又は２つ以上の置換基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＣＮ、－ＯＨ、及びハロゲンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、それらが結合している炭素原子と共に、非置換型シクロブチル環を形成する。他の実施形態において、シクロブチル環は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、－ＣＮ、－ＯＲ７、ハロゲン、－ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ７
２、及び－ＮＲ７
２から選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換されている。いくつかの実施形態において、１つ又は２つ以上の置換基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＣＮ、－ＯＨ、及びハロゲンから選択される。
【0069】
いくつかの実施形態において、各ＸはＯである。
【0070】
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、非置換型Ｃ１－Ｃ１０アルキル、非置換型Ｃ１－Ｃ６アルキル、又は非置換型Ｃ１－Ｃ４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、又はヘキシルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、又はｔ－ブチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、メチル又はエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、ハロゲン、－ＣＮ、－ＯＨ、又は３～６員のシクロアルキルから選択される１つ又は２つ以上の置換基で置換された、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルキル、又はＣ１－Ｃ４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｎＣＮ（式中、ｎは１、２、３、４、又は５である）である。
【0071】
いくつかの実施形態において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素及びＣ１－Ｃ１０アルキルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、メチル、及びエチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、水素である。
【0072】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
【0073】
【化7】
【0074】
（式中、Ｒ８は－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、及びＣ１－Ｃ６アルキルから選択される）又はその薬学的に許容される塩である。
【0075】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
【0076】
【化8】
【0077】
又はその薬学的に許容される塩である。
【0078】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される塩は、酒石酸塩、メシル酸塩、又はリン酸塩である。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される塩は、酒石酸塩である。いくつかのそのような実施形態において、酒石酸塩は、Ｌ－酒石酸塩である。
【0079】
いくつかの実施形態において、前記化合物は、対象への経口投与のために製剤化される。
【0080】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、ＨＨＴに関連した出血の頻度、持続時間、又は強度を低下させることを含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＨＴに関連した出血は、胃腸（ＧＩ）出血である。いくつかの実施形態において、ＨＨＴに関連した出血は、鼻出血である。
【0081】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象においてヘモグロビンレベルを増加させることを含む。
【0082】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象において毛細血管拡張の数を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象において毛細血管拡張のサイズを低下させることを含む。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は、皮膚毛細血管拡張である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は、鼻毛細血管拡張である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は、口腔毛細血管拡張である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は胃腸毛細血管拡張である。
【0083】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）の数を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）のサイズを低下させることを含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象においてＡＶＭの形成を予防することを含む。いくつかのそのような実施形態において、動静脈奇形は肺ＡＶＭである。いくつかの実施形態において、動静脈奇形は脳(cerebral)（脳: brain）ＡＶＭである。いくつかの実施形態において、動静脈奇形は内臓ＡＶＭである。
【0084】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の低下を含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の予防を含む。
【0085】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象における肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントの予防を含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象における肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントのグレードの低下を含む。
【0086】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象における鉄補給の必要性の低下、例えば、対象にとって必要である鉄注入の回数の減少を含む。いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象にとって必要である輸血の回数の減少を含む。
【0087】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、肝血流の減少を含む。
【0088】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、対象において肝移植の必要性を減らす。
【0089】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴの治療は、ＨＨＴの追加の症状の頻度及び／又は重症度の低下を含む。そのような追加の症状には、呼吸困難、片頭痛、疲労、神経学的事象、及び塞栓性事象が挙げられ得る。
【0090】
本発明は又、上記の実施形態のいずれかに定義されているような式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象における遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）の治療の方法を提供する。
【0091】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、ＨＨＴに関連した出血の頻度、持続時間、又は強度の低下を生じる。いくつかのそのような実施形態において、ＨＨＴに関連した出血は、胃腸（ＧＩ）出血である。いくつかの実施形態において、ＨＨＴに関連した出血は、鼻出血である。
【0092】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象においてヘモグロビンレベルの増加を生じる。
【0093】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象において毛細血管拡張の数の減少を生じる。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象において毛細血管拡張のサイズの低下を生じる。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は、皮膚毛細血管拡張である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は、鼻毛細血管拡張である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は、口腔毛細血管拡張である。いくつかの実施形態において、毛細血管拡張は胃腸毛細血管拡張である。
【0094】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）の数の減少を生じる。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象において動静脈奇形（ＡＶＭ）のサイズの低下を生じる。いくつかの実施形態において、方法は、対象においてＡＶＭの形成を予防する。いくつかのそのような実施形態において、動静脈奇形は、肺ＡＶＭである。いくつかの実施形態において、動静脈奇形は脳ＡＶＭである。いくつかの実施形態において、動静脈奇形は内臓ＡＶＭである。
【0095】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象の生活の質の向上を生じる。
【0096】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の低下を生じる。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、心不全及び肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の予防を生じる。
【0097】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、対象において肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントを予防する。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、対象において肺ＡＶＭにより誘発される右－左シャントのグレードの低下を生じる。
【0098】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象における鉄補給の必要性の低下、例えば、対象にとって必要である鉄注入の回数の減少を生じる。いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象にとって必要である輸血の回数の減少を生じる。
【0099】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、肝血流の減少を生じる。
【0100】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、対象において肝移植の必要性を減らす。
【0101】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、ＨＨＴの追加の症状の頻度及び／又は重症度の低下を生じる。そのような追加の症状には、呼吸困難、片頭痛、疲労、神経学的事象、及び塞栓性事象が挙げられ得る。
【0102】
いくつかの実施形態において、ＨＨＴを治療する方法は、結果として、対象の生活の質の全体的な向上を生じる。
【0103】
定義及び略語
本明細書で用いられる場合、用語「アロステリックＡＫＴ阻害剤」は、ＡＫＴと、その酵素の活性部位以外の部位で結合することにより、ＡＫＴの活性を阻害する物質を意味する。
本明細書で用いられる場合、用語「アロステリックＡＫＴ阻害剤」は、ＡＫＴと、その酵素の活性部位以外の部位で結合することにより、ＡＫＴの活性を阻害する物質を意味する。
【0104】
本明細書で用いられる場合、用語「ハロゲン」は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、及び－Ｉを指す。
【0105】
略語：
【0106】
【表1】
【0107】
［実施例］
【実施例1】
【0108】
６－（４－（１－アミノ－３－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オンの合成
６－（４－（１－アミノ－３－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン（本明細書で「ＶＡＤ０４４遊離塩基」と呼ばれる）を、国際公開第２０１１０７７０９８号パンフレット（特に、実施例９７、１１３、及び１３９（下記で再現された）参照）に示されているようなプロトコールに従って合成した。
６－（４－（１－アミノ－３－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン（本明細書で「ＶＡＤ０４４遊離塩基」と呼ばれる）を、国際公開第２０１１０７７０９８号パンフレット（特に、実施例９７、１１３、及び１３９（下記で再現された）参照）に示されているようなプロトコールに従って合成した。
【0109】
６－（４－（（１ｓ，３ｓ）－１－アミノ－３－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オンの合成：国際公開第２０１１０７７０９８号パンフレット実施例１３９から：
【0110】
【化9】
【0111】
ステップ１：ｔｅｒｔ－ブチル（（１ｓ，３ｓ）－１－（４－（１－エチル－２－オキソ－７－フェニル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル）フェニル）－３－ヒドロキシシクロブチル）カルバメート
１５ｍＬ反応チューブにおいて、１，４－ジオキサン（２．３ｍｌ）と水（０．８ｍｌ）の混合物中に６－ブロモ－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン＊（５０ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（（１ｓ，３ｓ）－３－ヒドロキシ－１－（４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェニル）シクロブチル）カルバメート＊＊（４９ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）、及び炭酸セシウム（２０４ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）を加えて、無色の溶液を得た。これを、窒素を１５分間、通気することにより脱気し、続いて［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（II）ジクロロメタン付加物（２０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を加え、さらに５分間、脱気した。その反応混合物を、窒素雰囲気下で１時間、５０℃に加熱し、その後、室温へ冷却させ、水（５ｍｌ）で希釈し、酢酸エチル（３×５ｍｌ）へ抽出した。その合わせた有機相を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥状態へ濃縮した。その残留物を、Biotage社製クロマトグラフィー（シクロヘキサン：酢酸エチル、９０：１０～０：１００の勾配溶出）により精製し、オフホワイト色の固体として所望の生成物（４５ｍｇ、７０％収率）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．２９～７．３５（５Ｈ，ｍ）、７．２８（１Ｈ，ｓ）、７．１８～７．２４（４Ｈ，ｍ）、４．９６（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．８８（２Ｈ，ｓ）、４．０５（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．０１（２Ｈ，ｑ）、２．９８（２Ｈ，ｂｒ ｓ）、２．７５（２Ｈ，ｂｒ ｓ）、１．２０～１．５１（９Ｈ，ｂｒ ｍ）、１．３２（３Ｈ，ｔ）。ＬＣＭＳ（メソッドＤ） ＲＴ＝１．２５分間、Ｍ＋Ｈ＋＝５１６．２０。
１５ｍＬ反応チューブにおいて、１，４－ジオキサン（２．３ｍｌ）と水（０．８ｍｌ）の混合物中に６－ブロモ－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン＊（５０ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（（１ｓ，３ｓ）－３－ヒドロキシ－１－（４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェニル）シクロブチル）カルバメート＊＊（４９ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）、及び炭酸セシウム（２０４ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）を加えて、無色の溶液を得た。これを、窒素を１５分間、通気することにより脱気し、続いて［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（II）ジクロロメタン付加物（２０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を加え、さらに５分間、脱気した。その反応混合物を、窒素雰囲気下で１時間、５０℃に加熱し、その後、室温へ冷却させ、水（５ｍｌ）で希釈し、酢酸エチル（３×５ｍｌ）へ抽出した。その合わせた有機相を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥状態へ濃縮した。その残留物を、Biotage社製クロマトグラフィー（シクロヘキサン：酢酸エチル、９０：１０～０：１００の勾配溶出）により精製し、オフホワイト色の固体として所望の生成物（４５ｍｇ、７０％収率）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．２９～７．３５（５Ｈ，ｍ）、７．２８（１Ｈ，ｓ）、７．１８～７．２４（４Ｈ，ｍ）、４．９６（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．８８（２Ｈ，ｓ）、４．０５（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．０１（２Ｈ，ｑ）、２．９８（２Ｈ，ｂｒ ｓ）、２．７５（２Ｈ，ｂｒ ｓ）、１．２０～１．５１（９Ｈ，ｂｒ ｍ）、１．３２（３Ｈ，ｔ）。ＬＣＭＳ（メソッドＤ） ＲＴ＝１．２５分間、Ｍ＋Ｈ＋＝５１６．２０。
【0112】
ステップ２：６－（４－（（１ｓ，３ｓ）－１－アミノ－３－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン
ｔｅｒｔ－ブチル（（１ｓ，３ｓ）－１－（４－（１－エチル－２－オキソ－７－フェニル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル）フェニル）－３－ヒドロキシシクロブチル）カルバメート（４５ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（１ｍＬ）中に溶解し、３０秒間、撹拌した。その溶液を、すぐに、減圧下で乾燥状態へ濃縮した。その残留物を、ジエチルエーテル（約３ｍＬ）中に溶解し、減圧下で３回、乾燥状態へ濃縮した。その後、その残留物を、ジエチルエーテル（３ｍＬ）中でスラリーにし、沈降後、上清溶媒をピペットにより除去した。これを３回、繰り返した。その残留溶媒を、一晩、凍結乾燥により除去し、オフホワイト色の固体として所望の化合物（３３ｍｇ、７１％収率）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ） δ ７．５５（１Ｈ，ｓ）、７．３９～７．４２（４Ｈ，ｍ）、７．２７～７．３１（３Ｈ，ｍ）、７．２０～７．２４（２Ｈ，ｍ）、４．９３（２Ｈ，ｓ）、４．０１～４．１１（３Ｈ，ｍ）、３．０３～３．１１（２Ｈ，ｍ）、２．４２～２．５０（２Ｈ，ｍ）、１．２８（３Ｈ，ｔ）。ＬＣＭＳ（メソッドＤ） ＲＴ＝０．７４分間、Ｍ＋Ｈ＋＝４１６．２０。
ｔｅｒｔ－ブチル（（１ｓ，３ｓ）－１－（４－（１－エチル－２－オキソ－７－フェニル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル）フェニル）－３－ヒドロキシシクロブチル）カルバメート（４５ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（１ｍＬ）中に溶解し、３０秒間、撹拌した。その溶液を、すぐに、減圧下で乾燥状態へ濃縮した。その残留物を、ジエチルエーテル（約３ｍＬ）中に溶解し、減圧下で３回、乾燥状態へ濃縮した。その後、その残留物を、ジエチルエーテル（３ｍＬ）中でスラリーにし、沈降後、上清溶媒をピペットにより除去した。これを３回、繰り返した。その残留溶媒を、一晩、凍結乾燥により除去し、オフホワイト色の固体として所望の化合物（３３ｍｇ、７１％収率）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ） δ ７．５５（１Ｈ，ｓ）、７．３９～７．４２（４Ｈ，ｍ）、７．２７～７．３１（３Ｈ，ｍ）、７．２０～７．２４（２Ｈ，ｍ）、４．９３（２Ｈ，ｓ）、４．０１～４．１１（３Ｈ，ｍ）、３．０３～３．１１（２Ｈ，ｍ）、２．４２～２．５０（２Ｈ，ｍ）、１．２８（３Ｈ，ｔ）。ＬＣＭＳ（メソッドＤ） ＲＴ＝０．７４分間、Ｍ＋Ｈ＋＝４１６．２０。
【0113】
＊６－ブロモ－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オンの合成：ＷＯ国際公開第２０１１０７７０９８号パンフレット実施例１１３（ステップ１～４）及びページ２２２（ステップ５）から：
ステップ１：エチル２－（（５－ブロモ－３－ニトロピリジン－２－イル）オキシ）アセテート
温度が３０℃未満に維持されるのを確かめながら、１，４－ジオキサン（２５０ｍｌ）中の水素化ナトリウム（５．３１ｇ、１３３ｍｍｏｌ）の懸濁液へ、グリコール酸エチル（１２．５６ｍｌ、１３３ｍｍｏｌ）を、３０分間にわたって滴下した。その結果生じた濃い懸濁液を、室温で１５分間、撹拌した。別の１Ｌ丸底フラスコにおいて、１，４－ジオキサン（１５０ｍｌ）中に５－ブロモ－２－クロロ－３－ニトロピリジン（２１ｇ、８８ｍｍｏｌ）を加えて、褐色の溶液を得た。水素化ナトリウムとグリコール酸エチルの懸濁液を、０℃で３０分間にわたって液滴で加えた。その結果生じた反応混合物を、一晩、８０℃に加熱した。
ステップ１：エチル２－（（５－ブロモ－３－ニトロピリジン－２－イル）オキシ）アセテート
温度が３０℃未満に維持されるのを確かめながら、１，４－ジオキサン（２５０ｍｌ）中の水素化ナトリウム（５．３１ｇ、１３３ｍｍｏｌ）の懸濁液へ、グリコール酸エチル（１２．５６ｍｌ、１３３ｍｍｏｌ）を、３０分間にわたって滴下した。その結果生じた濃い懸濁液を、室温で１５分間、撹拌した。別の１Ｌ丸底フラスコにおいて、１，４－ジオキサン（１５０ｍｌ）中に５－ブロモ－２－クロロ－３－ニトロピリジン（２１ｇ、８８ｍｍｏｌ）を加えて、褐色の溶液を得た。水素化ナトリウムとグリコール酸エチルの懸濁液を、０℃で３０分間にわたって液滴で加えた。その結果生じた反応混合物を、一晩、８０℃に加熱した。
【0114】
その反応混合物を、減圧下で濃縮し、粗残留物を、Biotage社製シリカクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン中０％～１０％酢酸エチルの勾配）により精製して、前記タイトルの化合物（１．８ｇ、４４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．４８（１Ｈ，ｓ）、８．４２（１Ｈ，ｓ）、５．０７（２Ｈ，ｓ）、４．２８～４．２４（２Ｈ，ｑ）、１．３１～１．２８（３Ｈ，ｔ）。
【0115】
ステップ２：エチル ２－（（３－ニトロ－５－フェニルピリジン－２－イル）オキシ）アセテート
１Ｌ丸底フラスコにおいて、エチル ２－（５－ブロモ－３－ニトロピリジン－２－イルオキシ）アセテート（１８．３３ｇ、６０．１ｍｍｏｌ）、フェニルボロン酸（１０．９９ｇ、９０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（４．７３ｇ、１８．０２ｍｍｏｌ）、及びフッ化セシウム（４５．６ｇ、３００ｍｍｏｌ）を、１，２－ジメトキシエタン（３００ｍｌ）中に加えて、黄色の溶液を得た。その反応混合物を、窒素を３０分間、通気することにより脱気した。酢酸パラジウム（II）（２．０２３ｇ、９．０１ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を、窒素雰囲気下で一晩、７５℃に加熱した。その反応混合物を、室温に冷却し、減圧下で乾燥状態へ濃縮して、褐色の固体を得た。これを、ジクロロメタン中に再溶解し、濾過し、減圧下で乾燥状態へ濃縮して、褐色の固体を得た。その粗残留物を、Biotage社製クロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン中５％～６０％酢酸エチルの勾配）によって精製して、前記タイトルの化合物（６．９ｇ、３８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．５８（１Ｈ，ｓ）、８．５６（１Ｈ，ｓ）、７．５９～７．５２（２Ｈ，ｍ）、７．４８～７．４６（２Ｈ，ｍ）、７．４５～７．４３（１Ｈ，ｍ）、５．１３（２Ｈ，ｓ）、４．３０～４．２６（２Ｈ，ｑ）、１．３３～１．３０（３Ｈ，ｔ）。
１Ｌ丸底フラスコにおいて、エチル ２－（５－ブロモ－３－ニトロピリジン－２－イルオキシ）アセテート（１８．３３ｇ、６０．１ｍｍｏｌ）、フェニルボロン酸（１０．９９ｇ、９０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（４．７３ｇ、１８．０２ｍｍｏｌ）、及びフッ化セシウム（４５．６ｇ、３００ｍｍｏｌ）を、１，２－ジメトキシエタン（３００ｍｌ）中に加えて、黄色の溶液を得た。その反応混合物を、窒素を３０分間、通気することにより脱気した。酢酸パラジウム（II）（２．０２３ｇ、９．０１ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を、窒素雰囲気下で一晩、７５℃に加熱した。その反応混合物を、室温に冷却し、減圧下で乾燥状態へ濃縮して、褐色の固体を得た。これを、ジクロロメタン中に再溶解し、濾過し、減圧下で乾燥状態へ濃縮して、褐色の固体を得た。その粗残留物を、Biotage社製クロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン中５％～６０％酢酸エチルの勾配）によって精製して、前記タイトルの化合物（６．９ｇ、３８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．５８（１Ｈ，ｓ）、８．５６（１Ｈ，ｓ）、７．５９～７．５２（２Ｈ，ｍ）、７．４８～７．４６（２Ｈ，ｍ）、７．４５～７．４３（１Ｈ，ｍ）、５．１３（２Ｈ，ｓ）、４．３０～４．２６（２Ｈ，ｑ）、１．３３～１．３０（３Ｈ，ｔ）。
【0116】
ステップ３：７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン
５００ｍｌ丸底フラスコにおいて、エチル ２－（３－ニトロ－５－フェニルピリジン－２－イルオキシ）アセテート（４．６ｇ、１５．２２ｍｍｏｌ）を、塩酸、３７％（４０ｍｌ）中に加えて、黄色の懸濁液を得た。その混合物を、０～５℃に冷却し、続いて、スズ粉末（９．９４ｇ、８４ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。その添加は発熱性であるとわかった。加える間、注意を要する。その後、その混合物を、室温でさらに３０分間、全ての発泡が止むまで、撹拌した。その反応混合物を、窒素雰囲気下で３時間、８０℃に加熱した。その反応混合物を、室温に冷却し、水（８００ｍｌ）で希釈した。その白色の沈殿物を、濾過により単離し、水（１００ｍｌ）で洗浄し、吸引乾燥して、白色の固体を得た。その固体を、トルエン（３×３０ｍｌ）と共沸して、前記タイトルの化合物として白色の固体（２．６ｇ、７７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ） δ １０．４１（１Ｈ，ｓ）、８．１０（１Ｈ，ｓ）、７．５９（２Ｈ，ｄ）、７．４９～７．４２（２Ｈ，ｔ）、７．３９～７－３８（１Ｈ，ｄ）、４．８３（２Ｈ，ｓ）。
５００ｍｌ丸底フラスコにおいて、エチル ２－（３－ニトロ－５－フェニルピリジン－２－イルオキシ）アセテート（４．６ｇ、１５．２２ｍｍｏｌ）を、塩酸、３７％（４０ｍｌ）中に加えて、黄色の懸濁液を得た。その混合物を、０～５℃に冷却し、続いて、スズ粉末（９．９４ｇ、８４ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。その添加は発熱性であるとわかった。加える間、注意を要する。その後、その混合物を、室温でさらに３０分間、全ての発泡が止むまで、撹拌した。その反応混合物を、窒素雰囲気下で３時間、８０℃に加熱した。その反応混合物を、室温に冷却し、水（８００ｍｌ）で希釈した。その白色の沈殿物を、濾過により単離し、水（１００ｍｌ）で洗浄し、吸引乾燥して、白色の固体を得た。その固体を、トルエン（３×３０ｍｌ）と共沸して、前記タイトルの化合物として白色の固体（２．６ｇ、７７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ） δ １０．４１（１Ｈ，ｓ）、８．１０（１Ｈ，ｓ）、７．５９（２Ｈ，ｄ）、７．４９～７．４２（２Ｈ，ｔ）、７．３９～７－３８（１Ｈ，ｄ）、４．８３（２Ｈ，ｓ）。
【0117】
ステップ４：６－ブロモ－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン
１０ｍｌマイクロ波バイアルにおいて、７－フェニル－１ Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン（５０ｍｇ、０．２２１ｍｍｏｌ）及びＮ－ブロモスクシンイミド（７８．６ｍｇ、０．４４１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１ｍｌ）中に加えた。その反応混合物を、マイクロ波照射下で３０分間、８０℃に加熱した。その反応混合物を、室温に冷却し、酢酸エチル（１０ｍｌ）で希釈した。その有機溶液を、水（２×１０ｍｌ）及びブライン（２×１０ｍｌ）で洗浄した。その有機相を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。その粗残留物を、Biotage社製クロマトグラフィー（ジクロロメタン中０％～５％メタノールの勾配）により精製して、黄色の固体として前記タイトルの化合物（６１ｍｇ、９０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ） δ ７．４８～７．３２（５Ｈ，ｍ）、７．１２（１Ｈ，ｓ）、４．８２（２Ｈ，ｓ）。
１０ｍｌマイクロ波バイアルにおいて、７－フェニル－１ Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン（５０ｍｇ、０．２２１ｍｍｏｌ）及びＮ－ブロモスクシンイミド（７８．６ｍｇ、０．４４１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１ｍｌ）中に加えた。その反応混合物を、マイクロ波照射下で３０分間、８０℃に加熱した。その反応混合物を、室温に冷却し、酢酸エチル（１０ｍｌ）で希釈した。その有機溶液を、水（２×１０ｍｌ）及びブライン（２×１０ｍｌ）で洗浄した。その有機相を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。その粗残留物を、Biotage社製クロマトグラフィー（ジクロロメタン中０％～５％メタノールの勾配）により精製して、黄色の固体として前記タイトルの化合物（６１ｍｇ、９０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ） δ ７．４８～７．３２（５Ｈ，ｍ）、７．１２（１Ｈ，ｓ）、４．８２（２Ｈ，ｓ）。
【0118】
ステップ５：６－ブロモ－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン
１５ｍＬ反応チューブにおいて、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中に６－ブロモ－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン（３００ｍｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）、ヨードエタン（０．０９５ｍＬ、１．１８０ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（４０８ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）を加えて、褐色の懸濁液を得た。これを、５０℃、窒素雰囲気下で６０分間、撹拌した。その反応混合物を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×５ｍＬ）中へ抽出した。その合わせた有機相を、５０：５０の水：ブライン（３×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥状態へ濃縮して、褐色の固体を得た。これを、Biotage社製クロマトグラフィー（２５ｇシリカカートリッジ、シクロヘキサン：酢酸エチル、９０：１０～２０：８０の勾配溶出）により精製して、ベージュ色の固体として前記タイトルの化合物（１６０ｍｇ、４８．８％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．５８～７．３７（５Ｈ，ｍ）、７．２１（１Ｈ，ｓ）、４．８６（２Ｈ，ｓ）、３．９６（２Ｈ，ｑ）、１．２７（３Ｈ，ｔ）。ＬＣＭＳ（メソッドＤ） ＲＴ １．２９３分間、Ｍ＋１＝３３４。
１５ｍＬ反応チューブにおいて、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中に６－ブロモ－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン（３００ｍｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）、ヨードエタン（０．０９５ｍＬ、１．１８０ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（４０８ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）を加えて、褐色の懸濁液を得た。これを、５０℃、窒素雰囲気下で６０分間、撹拌した。その反応混合物を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×５ｍＬ）中へ抽出した。その合わせた有機相を、５０：５０の水：ブライン（３×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥状態へ濃縮して、褐色の固体を得た。これを、Biotage社製クロマトグラフィー（２５ｇシリカカートリッジ、シクロヘキサン：酢酸エチル、９０：１０～２０：８０の勾配溶出）により精製して、ベージュ色の固体として前記タイトルの化合物（１６０ｍｇ、４８．８％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．５８～７．３７（５Ｈ，ｍ）、７．２１（１Ｈ，ｓ）、４．８６（２Ｈ，ｓ）、３．９６（２Ｈ，ｑ）、１．２７（３Ｈ，ｔ）。ＬＣＭＳ（メソッドＤ） ＲＴ １．２９３分間、Ｍ＋１＝３３４。
【0119】
＊＊ｔｅｒｔ－ブチル（（１ｓ，３ｓ）－３－ヒドロキシ－１－（４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェニル）シクロブチル）カルバメートの合成（国際公開第２０１１０７７０９８号パンフレットの実施例９７から）：
４０ｍＬ反応チューブにおいて、ｔｅｒｔ－ブチル（１ｓ，３ｓ）－１－（４－ブロモフェニル）－３－ヒドロキシシクロブチルカルバメート＊＊＊（０．２５ｇ、０．７３１ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１４ｍｌ）中に加えて、無色の溶液を得た。これを、窒素を２０分間、通気することにより脱気し、続いて、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（II）ジクロロメタン付加物（６０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を加えた。窒素をさらに１５分間、通気した後、酢酸カリウム（１４３ｍｇ、１．４６１ｍｍｏｌ）及びビス（ピナコラート）ジボロン（２２３ｍｇ、０．８７７ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を、一晩、加熱還流し、その後、減圧下で乾燥状態へ濃縮し、Biotage社製クロマトグラフィー（シクロヘキサン：酢酸エチル、８８：１２～０：１００の勾配溶出）により精製して、静置により固体化する無色の油として所望の生成物（２４０ｍｇ、８４％収率）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．７１（２Ｈ，ｄ）、７．４４（２Ｈ，ｄ）、４．１５（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、２．８７～２．９８（２Ｈ，ｍ）、２．２７～２．４４（２Ｈ，ｍ）、１．２２～１．４９（２１Ｈ，ｂｒ ｍ）。
（＊＊＊ ＷＯ国際公開第２００９１４８８８７号パンフレット及び国際公開第２００９１４８９１６号パンフレットに記載された合成）
４０ｍＬ反応チューブにおいて、ｔｅｒｔ－ブチル（１ｓ，３ｓ）－１－（４－ブロモフェニル）－３－ヒドロキシシクロブチルカルバメート＊＊＊（０．２５ｇ、０．７３１ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１４ｍｌ）中に加えて、無色の溶液を得た。これを、窒素を２０分間、通気することにより脱気し、続いて、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（II）ジクロロメタン付加物（６０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を加えた。窒素をさらに１５分間、通気した後、酢酸カリウム（１４３ｍｇ、１．４６１ｍｍｏｌ）及びビス（ピナコラート）ジボロン（２２３ｍｇ、０．８７７ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を、一晩、加熱還流し、その後、減圧下で乾燥状態へ濃縮し、Biotage社製クロマトグラフィー（シクロヘキサン：酢酸エチル、８８：１２～０：１００の勾配溶出）により精製して、静置により固体化する無色の油として所望の生成物（２４０ｍｇ、８４％収率）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．７１（２Ｈ，ｄ）、７．４４（２Ｈ，ｄ）、４．１５（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、２．８７～２．９８（２Ｈ，ｍ）、２．２７～２．４４（２Ｈ，ｍ）、１．２２～１．４９（２１Ｈ，ｂｒ ｍ）。
（＊＊＊ ＷＯ国際公開第２００９１４８８８７号パンフレット及び国際公開第２００９１４８９１６号パンフレットに記載された合成）
【実施例2】
【0120】
インビトロでの薬動力学
６－（４－（１－アミノ－３－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン Ｌ－酒石酸塩（ＶＡＤ０４４）が、生化学キナーゼアッセイにおいて、完全長ＡＫＴ１及びＡＫＴ２の活性を強力かつ選択的に阻害することが見出され、ＩＣ５０値は、それぞれ、１２５ｎＭ及び９５ｎＭであった（ＡＫＴ３に対する５００ｎＭを超える値と比較して）。しかしながら、不活性プレクストリン相同（ＰＨ，pleckstrin homology）ドメインを含有する、３つ全てのＡＫＴアイソフォームの変異型は、ＶＡＤ０４４によって阻害されなかった。さらに、ＶＡＤ０４４を増加性濃度のＡＴＰとインキュベートすることは、ＡＴＰについてのＫｍにおいて実行された実験と比較した場合、ＩＣ５０値に効果を生じなかった。これは、ＶＡＤ０４４についての結合の様式がアロステリックであり、ＡＴＰ濃度に無関係であることを確信させる。
６－（４－（１－アミノ－３－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン Ｌ－酒石酸塩（ＶＡＤ０４４）が、生化学キナーゼアッセイにおいて、完全長ＡＫＴ１及びＡＫＴ２の活性を強力かつ選択的に阻害することが見出され、ＩＣ５０値は、それぞれ、１２５ｎＭ及び９５ｎＭであった（ＡＫＴ３に対する５００ｎＭを超える値と比較して）。しかしながら、不活性プレクストリン相同（ＰＨ，pleckstrin homology）ドメインを含有する、３つ全てのＡＫＴアイソフォームの変異型は、ＶＡＤ０４４によって阻害されなかった。さらに、ＶＡＤ０４４を増加性濃度のＡＴＰとインキュベートすることは、ＡＴＰについてのＫｍにおいて実行された実験と比較した場合、ＩＣ５０値に効果を生じなかった。これは、ＶＡＤ０４４についての結合の様式がアロステリックであり、ＡＴＰ濃度に無関係であることを確信させる。
【0121】
ＶＡＤ０４４の推定上のアロステリック結合様式は、ＡＫＴ２との複合体におけるＶＡＤ０４４遊離塩基に近いアナログ（化合物６、下記）に関して得られた高解像度（２．３２Å）共結晶構造により、確認された（図１Ａ参照）。
【0122】
【化10】
【0123】
図１Ｂに示されているように、化合物６は、キナーゼドメイン及びＰＨドメインのＮローブとＣローブの界面におけるヒンジ領域から約１０Å離れたアロステリック結合ポケットにおいて結合する。
【実施例3】
【0124】
キナーゼ選択性、並びに受容体及びイオンチャネルのプロファイル
ＶＡＤ０４４は、ＡＫＴ１及びＡＫＴ２の強力なアロステリック阻害剤である。ＶＡＤ０４４の、標的非関連タンパク質キナーゼに対する選択性ウィンドウ、Ｇタンパク質共役型受容体、及びイオンチャネルを試験した。良好な選択性ウィンドウは、患者において有効であると予想される薬理学的濃度における好ましい安全性プロファイルを示唆する。
ＶＡＤ０４４は、ＡＫＴ１及びＡＫＴ２の強力なアロステリック阻害剤である。ＶＡＤ０４４の、標的非関連タンパク質キナーゼに対する選択性ウィンドウ、Ｇタンパク質共役型受容体、及びイオンチャネルを試験した。良好な選択性ウィンドウは、患者において有効であると予想される薬理学的濃度における好ましい安全性プロファイルを示唆する。
【0125】
キナーゼ選択性
ＶＡＤ０４４は、４５０個のキナーゼのパネルに対して試験した場合、１０μＭにおいて、ＡＫＴ１及びＡＫＴ２に対する選択性が高いことが示された（図２Ｂに示されているように、ＡＫＴ１の８９％阻害及びＡＫＴ２の９５％阻害を達成した）。とりわけ、７５％より高い阻害は、たった２つの他のキナーゼ：ｐ３８α及びＰＤＫ１（同様に図２Ｂに示されているように、それぞれ、８４％及び７７％阻害）に関してのみ達成された。ＡＫＴ３の阻害は７２％だけ達成された（図２Ｂ参照）。
ＶＡＤ０４４は、４５０個のキナーゼのパネルに対して試験した場合、１０μＭにおいて、ＡＫＴ１及びＡＫＴ２に対する選択性が高いことが示された（図２Ｂに示されているように、ＡＫＴ１の８９％阻害及びＡＫＴ２の９５％阻害を達成した）。とりわけ、７５％より高い阻害は、たった２つの他のキナーゼ：ｐ３８α及びＰＤＫ１（同様に図２Ｂに示されているように、それぞれ、８４％及び７７％阻害）に関してのみ達成された。ＡＫＴ３の阻害は７２％だけ達成された（図２Ｂ参照）。
【0126】
１０点の滴定曲線によるさらなる分析により、ｐ３８α及びＰＤＫ１に対するＩＣ５０が１０μＭより高いことが確認された。
【0127】
加えて、ＶＡＤ０４４についてのＩＣ５０値は、ＡＫＴ３アイソフォームに対して（それに対するＶＡＤ０４４のＥＣ５０値は５００ｎＭより高かった）より、ＡＫＴ１及びＡＫＴ２に対してはるかに低いことが見出された（それぞれ、ＩＣ５０＝１２５ｎＭ及びＩＣ５０＝９５ｎＭ）。
【0128】
したがって、上記の結果は、ＶＡＤ０４４がＡＫＴ１及びＡＫＴ２の強力かつ選択的な阻害剤であることを実証している。
【0129】
受容体及びイオンチャネルのプロファイル
１０μＭにおいて試験した場合、ＶＡＤ０４４は、心臓イオンチャネルＮａｖ１．５、Ｃａｖ１．２、Ｋｖ４．３、ＫＣｈＩＰ２、Ｋｖ１．５、ＫＣＮＱ１、ｍｉｎＫ、Ｋｉｒ２．１、及びＨＣＮ４をそれらの活性の２５％より下へは阻害せず、７６個の受容体及びイオンチャネルのパネル（Millipore社 創薬安全性及び責任パネル（Drug Discovery Safety and Liability Panel））において優秀な選択性を示した。特に、３つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ，G protein-coupled receptors）だけが１０μＭにおいて５０％より高い阻害を実証し－すなわち、ＬＰＡ１受容体、モチリン受容体、及びＰ２Ｙ１受容体（それぞれ、５７．４％、５０．０％、及び５０．６％の平均パーセンテージ阻害値を示す）－、１つのＧＰＣＲだけが、ＧＰＣＲ活性の２０％より大きい増加を有する、アゴニスト活性を示した（すなわち、ＧＰＲ１４、１０μＭにおいて２９．５％の増加が観察された）。これらの結果は、下記の表２に示されている：
１０μＭにおいて試験した場合、ＶＡＤ０４４は、心臓イオンチャネルＮａｖ１．５、Ｃａｖ１．２、Ｋｖ４．３、ＫＣｈＩＰ２、Ｋｖ１．５、ＫＣＮＱ１、ｍｉｎＫ、Ｋｉｒ２．１、及びＨＣＮ４をそれらの活性の２５％より下へは阻害せず、７６個の受容体及びイオンチャネルのパネル（Millipore社 創薬安全性及び責任パネル（Drug Discovery Safety and Liability Panel））において優秀な選択性を示した。特に、３つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ，G protein-coupled receptors）だけが１０μＭにおいて５０％より高い阻害を実証し－すなわち、ＬＰＡ１受容体、モチリン受容体、及びＰ２Ｙ１受容体（それぞれ、５７．４％、５０．０％、及び５０．６％の平均パーセンテージ阻害値を示す）－、１つのＧＰＣＲだけが、ＧＰＣＲ活性の２０％より大きい増加を有する、アゴニスト活性を示した（すなわち、ＧＰＲ１４、１０μＭにおいて２９．５％の増加が観察された）。これらの結果は、下記の表２に示されている：
【0130】
【表2】
【0131】
上記の結果は、ＶＡＤ０４４が、試験された受容体及びイオンチャネルに干渉しないことを実証している。
【0132】
したがって、ＶＡＤ０４４のインビトロでの酵素プロファイルは以下のように要約することができる：
－ ＶＡＤ０４４は、ＡＫＴ１及びＡＫＴ２を強力かつ選択的に阻害し（ＩＣ５０＝１２５ｎＭ及び９５ｎＭ）、ＡＫＴ３アイソフォーム（ＩＣ５０＞５００ｎＭ）に対して少なくとも５倍のウィンドウ（window）を有する
－ ＶＡＤ０４４は、幅広いパネルの試験されたキナーゼ、受容体、及びイオンチャネルに干渉しない。
－ ＶＡＤ０４４は、ＡＫＴ１及びＡＫＴ２を強力かつ選択的に阻害し（ＩＣ５０＝１２５ｎＭ及び９５ｎＭ）、ＡＫＴ３アイソフォーム（ＩＣ５０＞５００ｎＭ）に対して少なくとも５倍のウィンドウ（window）を有する
－ ＶＡＤ０４４は、幅広いパネルの試験されたキナーゼ、受容体、及びイオンチャネルに干渉しない。
【実施例4】
【0133】
３つのＡＫＴ阻害剤化合物のＥｎｇ－ｉＫＯマウスにおける安全性／毒性；抗血管新生性；及びＡＶＭ形成を予防する能力の研究
材料／方法
マウス
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ妊娠中の雌は、Janvier Labs社により提供された。Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（Mahmoud et al., (2010), “Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin”, Circulation Research. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.109.211037）が、Ｃｄｈ５（ＰＡＣ）－ＣｒｅＥＲＴ２（１２）と交雑されて、内皮特異的誘導型Ｅｎｇノックアウトが作製された。動物飼育及び手順は、オランダ政府ガイドライン及び欧州議会の指令２０１０／６３／ＥＵに従った。用いられる動物の数及びそれらの苦痛を最小限にするためにあらゆる努力がなされた。Leiden University Medical Centerの施設内動物福祉委員会（プロジェクト番号ＡＶＤ１１６００２０１７１６２８）が全プロトコールを承認した。雄及び雌のマウスは、網膜血管新生を研究するために出生後第１週中に用いられた。
材料／方法
マウス
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ妊娠中の雌は、Janvier Labs社により提供された。Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（Mahmoud et al., (2010), “Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin”, Circulation Research. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.109.211037）が、Ｃｄｈ５（ＰＡＣ）－ＣｒｅＥＲＴ２（１２）と交雑されて、内皮特異的誘導型Ｅｎｇノックアウトが作製された。動物飼育及び手順は、オランダ政府ガイドライン及び欧州議会の指令２０１０／６３／ＥＵに従った。用いられる動物の数及びそれらの苦痛を最小限にするためにあらゆる努力がなされた。Leiden University Medical Centerの施設内動物福祉委員会（プロジェクト番号ＡＶＤ１１６００２０１７１６２８）が全プロトコールを承認した。雄及び雌のマウスは、網膜血管新生を研究するために出生後第１週中に用いられた。
【0134】
インビボでのＡＫＴ阻害
安全性／毒性プロファイル及び血管新生を阻害する最小有効用量の同定
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊの仔に、Ｐ４に１回、ペリフォシンを５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、２５ｍｇ／ｋｇ体重、５０ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは１００ｍｇ／ｋｇ体重で、又はユプロセルチブを０ｍｇ／ｋｇ体重、２．５ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、２５ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ体重で、又は２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇでＶＡＤ０４４を注射し、その後、Ｐ７に殺害した。網膜を、記載されているように（Lebrin et al., (2010), “Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia”, Nature Medicine. https://doi.org/10.1038/nm.2131）、免疫蛍光染色のために処理した。
安全性／毒性プロファイル及び血管新生を阻害する最小有効用量の同定
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊの仔に、Ｐ４に１回、ペリフォシンを５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、２５ｍｇ／ｋｇ体重、５０ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは１００ｍｇ／ｋｇ体重で、又はユプロセルチブを０ｍｇ／ｋｇ体重、２．５ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、２５ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ体重で、又は２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇでＶＡＤ０４４を注射し、その後、Ｐ７に殺害した。網膜を、記載されているように（Lebrin et al., (2010), “Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia”, Nature Medicine. https://doi.org/10.1038/nm.2131）、免疫蛍光染色のために処理した。
【0135】
Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスにおいてＡＶＭ形成を予防する最小有効用量の同定：
Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ｃｄｈ５－ＣｒｅＥＲＴ２に、Ｐ２において、タモキシフェン（５０μｇ）を注射して、新生仔マウスにおいてほぼ完全な遺伝子ノックアウトを誘導し、その後、Ｐ３及びＰ５において１回、ペリフォシンを０ｍｇ／ｋｇ体重、２５ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ体重でＩＰ注射し、又はＰ３、Ｐ４、Ｐ５、及びＰ６において１回、ペリフォシンを１０ｍｇ／ｋｇ体重でＩＰ注射した。同じ体積のビヒクルが注射され、それが対照動物としての役割を果たした。その後、Ｐ７において、マウスを安楽死させ、網膜を、記載されているように（Lebrin et al.、上記の通り）、免疫蛍光染色のために処理した。
Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ｃｄｈ５－ＣｒｅＥＲＴ２に、Ｐ２において、タモキシフェン（５０μｇ）を注射して、新生仔マウスにおいてほぼ完全な遺伝子ノックアウトを誘導し、その後、Ｐ３及びＰ５において１回、ペリフォシンを０ｍｇ／ｋｇ体重、２５ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ体重でＩＰ注射し、又はＰ３、Ｐ４、Ｐ５、及びＰ６において１回、ペリフォシンを１０ｍｇ／ｋｇ体重でＩＰ注射した。同じ体積のビヒクルが注射され、それが対照動物としての役割を果たした。その後、Ｐ７において、マウスを安楽死させ、網膜を、記載されているように（Lebrin et al.、上記の通り）、免疫蛍光染色のために処理した。
【0136】
Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ｃｄｈ５－ＣｒｅＥＲＴ２に、Ｐ２において、タモキシフェン（５０ｍｇ）を注射して、新生仔マウスにおいてほぼ完全な遺伝子ノックアウトを誘導し、その後、Ｐ３において１回、ユプロセルチブを０ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、２．５ｍｇ／ｋｇ体重、又は５ｍｇ／ｋｇ体重でＩＰ注射した。同じ体積のビヒクルが注射され、それが対照動物としての役割を果たした。その後、Ｐ７において、マウスを安楽死させ、網膜を、記載されているように（Lebrin et al.、上記の通り）、免疫蛍光染色のために処理した。
【0137】
Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ｃｄｈ５－ＣｒｅＥＲＴ２に、Ｐ２において、タモキシフェン（５０ｍｇ）を注射して、新生仔マウスにおいてほぼ完全な遺伝子ノックアウトを誘導し、その後、Ｐ３及びＰ５において１回、ＶＡＤ０４４を０ｍｇ／ｋｇ体重、２．５ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、又は１０ｍｇ／ｋｇ体重でＩＰ注射した。同じ体積のビヒクルが注射され、それが対照動物としての役割を果たした。その後、Ｐ７において、マウスを安楽死させ、網膜を、記載されているように（Lebrin et al.、上記の通り）、免疫蛍光染色のために処理した。
【0138】
網膜血管網の分析
網膜血管網について、マウス１匹あたりのＡＶシャントの数の定量化を手作業で行った。視神経からの放射状伸展、血管長、及び分岐点を、Lebrin et al., (2010), “Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia”, Nature Med, 16(4), 420-8；Gkatzis et al., (2016), “Interaction Between ALK1 Signaling and Connexin40 in the Development of Arteriovenous Malformations”, Arterioscler Thromb Vasc Biol., 36(4), 707-17；及びThalgott et al., (2018), “Decreased Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Contributes to the Pathogenesis of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia Type 2”, Circulation, 138(23), 2698- 2712に記載されているように、網膜あたり少なくとも４つの視野において、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（米国国立衛生研究所（US National Institute of Health））により分析した。カスタムの当研究所作成マクロは、同じ処理及び定量化パラメータを用いる、画像の自動処理を可能にした。簡単に述べれば、画像の輝度を、特定の画像ヒストグラムコンテンツに依存するピクセル極値を改変することにより、増強した。ガウシアンフィルターを適用して、均一性の強度を低下させた。フィルター次数は、画像解像度に依存した。次に、閾値ステップを、二値画像を生じる、Ｏｔｓｕの方法又はＬｉの方法などのグローバル閾値技術に基づいて、計算した。その後、中央値フィルターを適用して、偽分岐点検出を引き起こし得る潜在的局所不規則性を排除した。二値画像から、血管密度を定量化した（画像におけるピクセルの総数で割られた、血管に関連したピクセルの比率として算出される）。他のパラメータについて、まず、画像の骨格を、ｉｍａｇｅＪを用いて計算し、その後、血管の全長を、ＩｍａｇｅＪからのＭｅａｓｕｒｅ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ Ｌｅｎｇｔｈプラグインを用いて、定量化した。分岐点の数を、ＩｍａｇｅＪのＡｎａｌｙｚｅ Ｓｋｅｌｅｔｏｎプラグインから抽出した。全ての結果を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌソフトウェアに転送し、当研究所カスタム作成プログラムを用いて、自動再編成した。処理の各ステップにおいて作成された全ての画像は保存されているので、異常な結果がないことを保証するために、視覚的な制御を行った。
網膜血管網について、マウス１匹あたりのＡＶシャントの数の定量化を手作業で行った。視神経からの放射状伸展、血管長、及び分岐点を、Lebrin et al., (2010), “Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia”, Nature Med, 16(4), 420-8；Gkatzis et al., (2016), “Interaction Between ALK1 Signaling and Connexin40 in the Development of Arteriovenous Malformations”, Arterioscler Thromb Vasc Biol., 36(4), 707-17；及びThalgott et al., (2018), “Decreased Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Contributes to the Pathogenesis of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia Type 2”, Circulation, 138(23), 2698- 2712に記載されているように、網膜あたり少なくとも４つの視野において、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（米国国立衛生研究所（US National Institute of Health））により分析した。カスタムの当研究所作成マクロは、同じ処理及び定量化パラメータを用いる、画像の自動処理を可能にした。簡単に述べれば、画像の輝度を、特定の画像ヒストグラムコンテンツに依存するピクセル極値を改変することにより、増強した。ガウシアンフィルターを適用して、均一性の強度を低下させた。フィルター次数は、画像解像度に依存した。次に、閾値ステップを、二値画像を生じる、Ｏｔｓｕの方法又はＬｉの方法などのグローバル閾値技術に基づいて、計算した。その後、中央値フィルターを適用して、偽分岐点検出を引き起こし得る潜在的局所不規則性を排除した。二値画像から、血管密度を定量化した（画像におけるピクセルの総数で割られた、血管に関連したピクセルの比率として算出される）。他のパラメータについて、まず、画像の骨格を、ｉｍａｇｅＪを用いて計算し、その後、血管の全長を、ＩｍａｇｅＪからのＭｅａｓｕｒｅ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ Ｌｅｎｇｔｈプラグインを用いて、定量化した。分岐点の数を、ＩｍａｇｅＪのＡｎａｌｙｚｅ Ｓｋｅｌｅｔｏｎプラグインから抽出した。全ての結果を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌソフトウェアに転送し、当研究所カスタム作成プログラムを用いて、自動再編成した。処理の各ステップにおいて作成された全ての画像は保存されているので、異常な結果がないことを保証するために、視覚的な制御を行った。
【0139】
統計解析を、Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（GraphPad社）で実施した。実験の大部分について、多重比較のために一元配置ＡＮＯＶＡを用いた。結果は、平均値±ＳＥＭとして表されている。事後ペアワイズについて、ダネット検定を用いた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、又は＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１の値は、統計的有意性を示す。血管構造変化に関係したパラメータにおけるおよそ１５％の群内変動は、以前、本発明者らによって観察されており、したがって、およそ２０～３０％の対照と変異体マウスとの間の差が予測された。したがって、状態あたり８匹のマウスの群は、統計的差を明らかに示すと予想された。
【0140】
マウス内皮細胞単離、培養、及び刺激
Galaris et al., (2021) “In vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing” J Vis Exp (171)に記載されているように、Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ仔から肺を、外科的に摘出し、氷冷ＤＭＥＭ中ですすぎ、内皮細胞を単離した。要約すれば、組織を、ハサミを用いて刻み、ＤＭＥＭ－３ｍｇ／ｍｌ １コラゲナーゼＡ（１０１０３５８６００１、Roche社）中、３７℃で１５分間、消化させ、その後、７０μｍストレーナーに通して濾過した。細胞上清を、２００ｇで５分間、遠心分離し、ＣＤ４５＋細胞を、ラット抗マウスＣＤ４５抗体（５５０５３９、BD Pharmigen社）でコーティングされたDynabeadsヒツジ抗ラットＩｇＧ（１１０３５、Invitrogen社）を用いて除去した。内皮細胞を、ラット抗マウスＰＥＣＡＭ１抗体（５５０２７４、BD Pharmigen社）でコーティングされたDynabeadsヒツジ抗ラットＩｇＧ（１１０３５、Invitrogen社）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、ソートした。ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡで５回、洗浄した後、細胞を、６ウェルプレートに播種した。肺及び肝臓ＥＣを、２～３継代の間、ウシ胎仔血清、ヒト上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、ヒト血管内皮細胞増殖因子－１６５、アスコルビン酸、ヘパリン、及びハイドロコルチゾン（C-39211、SupplementPack EC GM2、PromoCell社）で補われた内皮細胞増殖培地２（C-22011、PromoCell社）中に維持した。
Galaris et al., (2021) “In vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing” J Vis Exp (171)に記載されているように、Ｅｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ仔から肺を、外科的に摘出し、氷冷ＤＭＥＭ中ですすぎ、内皮細胞を単離した。要約すれば、組織を、ハサミを用いて刻み、ＤＭＥＭ－３ｍｇ／ｍｌ １コラゲナーゼＡ（１０１０３５８６００１、Roche社）中、３７℃で１５分間、消化させ、その後、７０μｍストレーナーに通して濾過した。細胞上清を、２００ｇで５分間、遠心分離し、ＣＤ４５＋細胞を、ラット抗マウスＣＤ４５抗体（５５０５３９、BD Pharmigen社）でコーティングされたDynabeadsヒツジ抗ラットＩｇＧ（１１０３５、Invitrogen社）を用いて除去した。内皮細胞を、ラット抗マウスＰＥＣＡＭ１抗体（５５０２７４、BD Pharmigen社）でコーティングされたDynabeadsヒツジ抗ラットＩｇＧ（１１０３５、Invitrogen社）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、ソートした。ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡで５回、洗浄した後、細胞を、６ウェルプレートに播種した。肺及び肝臓ＥＣを、２～３継代の間、ウシ胎仔血清、ヒト上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、ヒト血管内皮細胞増殖因子－１６５、アスコルビン酸、ヘパリン、及びハイドロコルチゾン（C-39211、SupplementPack EC GM2、PromoCell社）で補われた内皮細胞増殖培地２（C-22011、PromoCell社）中に維持した。
【0141】
ＥＣを、６ウェルプレートに播種し、９０％コンフルエンスまで増殖させた。その後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、６時間、血清飢餓にした。ＶＥＧＦ－Ａ（２５ｎｇ/ｍｌ）での３０分間の刺激の前に、細胞を、内皮細胞増殖培地２（C-22011、PromoCell社）中０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、５．０ｍＭ、又は１０．０ｍＭにおけるＶＡＤ０４４で１時間、処理した。細胞を、冷たいＰＢＳで洗浄し、その後、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（ＰＰＣ１０１０、Sigma-Aldrich社）を含有するＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Tris-HCl ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１％ Triton X-100、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ，Sodium Dodecyl Sulfate）、０．５％ デオキシコール酸塩）中に溶解した。
【0142】
アデノウイルス感染
肺又は肝臓ＥＣに、Ｃｒｅリコンビナーゼ（SL100707、SignaGen Laboratories社）を発現するアデノウイルスを、５００の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ，multiplicity of infection）を用いて、６時間、感染させ、ＰＢＳで洗浄し、その後、使用前に、内皮細胞増殖培地２中、１２～６０時間、培養した。
肺又は肝臓ＥＣに、Ｃｒｅリコンビナーゼ（SL100707、SignaGen Laboratories社）を発現するアデノウイルスを、５００の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ，multiplicity of infection）を用いて、６時間、感染させ、ＰＢＳで洗浄し、その後、使用前に、内皮細胞増殖培地２中、１２～６０時間、培養した。
【0143】
免疫蛍光染色
眼を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）において室温で１０分間、固定し、網膜を解剖し、ＰＢＳ中４％ＰＦＡにおいて４℃で一晩、後固定し、その後、免疫染色のために処理した。網膜を、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、及び０．５％Triton X-100中４℃で一晩、透過処理し、ＰＢＳ中ですすぎ、ＰＢｌｅｃ（ＰＢＳ、ｐＨ６．８、１％ Triton-X-100、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｎＣｌ２）中で２回、洗浄し、その後、ＰＢｌｅｃ中ビオチン化グリフォニア・シンプリシフォリア（Griffonia simplicifolia）レクチン（イソレクチンＢ４）（Ｂ－１２０５、Vector Laboratories社、１：５０）において４℃で一晩、インキュベートした。ＰＢＳ中での５回の洗浄後、試料を、ストレプトアビジンＣｙ－３（ＰＡ４３００１、Sigma-Aldrich社、１：１００）、並びにＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．２５％X-100中に希釈されたＦＩＴＣコンジュゲート型ａ－ＳＭＡ（クローン１Ａ４）（Ｆ３７７７、Sigma-Aldrich社）と４℃で２時間、インキュベートした。洗浄後、フラットホールマウント網膜を、DAKO培地（Ｓ３０２３、Dako社）にマウントした。ホールマウント網膜の完全な高解像度３次元レンダリングを、レーザー走査顕微鏡ＳＰ５又はＳＰ８（Leica社）を用いて、取得した。
眼を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）において室温で１０分間、固定し、網膜を解剖し、ＰＢＳ中４％ＰＦＡにおいて４℃で一晩、後固定し、その後、免疫染色のために処理した。網膜を、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、及び０．５％Triton X-100中４℃で一晩、透過処理し、ＰＢＳ中ですすぎ、ＰＢｌｅｃ（ＰＢＳ、ｐＨ６．８、１％ Triton-X-100、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｎＣｌ２）中で２回、洗浄し、その後、ＰＢｌｅｃ中ビオチン化グリフォニア・シンプリシフォリア（Griffonia simplicifolia）レクチン（イソレクチンＢ４）（Ｂ－１２０５、Vector Laboratories社、１：５０）において４℃で一晩、インキュベートした。ＰＢＳ中での５回の洗浄後、試料を、ストレプトアビジンＣｙ－３（ＰＡ４３００１、Sigma-Aldrich社、１：１００）、並びにＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．２５％X-100中に希釈されたＦＩＴＣコンジュゲート型ａ－ＳＭＡ（クローン１Ａ４）（Ｆ３７７７、Sigma-Aldrich社）と４℃で２時間、インキュベートした。洗浄後、フラットホールマウント網膜を、DAKO培地（Ｓ３０２３、Dako社）にマウントした。ホールマウント網膜の完全な高解像度３次元レンダリングを、レーザー走査顕微鏡ＳＰ５又はＳＰ８（Leica社）を用いて、取得した。
【0144】
ウェスタンブロット及び定量化
試料を、１０分間、煮沸し、タンパク質を、１０％アクリルアミドゲル上で分離し、５％ＢＳＡ又は５％粉ミルク／Tris緩衝食塩水／Tween 20でのブロッキング前に、ニトロセルロース膜上に転写し、以下の一次抗体とインキュベートした：ウサギ抗ホスホＡｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）（４４－６２１Ｇ、Invitrogen社）、ウサギ抗Ａｋｔ１（２９３８Ｓ、Cell Signaling社）、ウサギ抗ホスホＳｍａｄ１／５（Ｓｅｒ４６３／４６５）（９５１６Ｓ、Cell Signaling社）、ウサギ抗Ｓｍａｄ１（６９４４Ｓ、Cell Signaling社）、マウス抗ホスホ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｅ１０）（９１０６Ｓ、Cell signaling社）、ウサギｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（９１０２Ｓ、Cell Signaling社）、ヤギ抗エンドグリン（ＡＦ１０９７、R&D systems社）、及びマウス抗β－アクチン（Ａ５４４１、Sigma-Aldrich社）。ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧ若しくはＨＲＰ抗マウスＩｇＧ（それぞれ、Ｗ４０１１又はＷ４０２１、Promega社）又はＨＲＰ抗ヤギＩｇＧ（ＨＡＦ０１７、R&D systems社）を用いて検出し、続いて、BIO-RAD社ChemiDoc imagerでスキャンした。画像を、線形範囲で捕獲し、タンパク質レベル及びタンパク質リン酸化レベルを測定するためにＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた。全てのブロットについて、図に指し示されているように、バックグラウンドを引き算し、結果を標準化した。
試料を、１０分間、煮沸し、タンパク質を、１０％アクリルアミドゲル上で分離し、５％ＢＳＡ又は５％粉ミルク／Tris緩衝食塩水／Tween 20でのブロッキング前に、ニトロセルロース膜上に転写し、以下の一次抗体とインキュベートした：ウサギ抗ホスホＡｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）（４４－６２１Ｇ、Invitrogen社）、ウサギ抗Ａｋｔ１（２９３８Ｓ、Cell Signaling社）、ウサギ抗ホスホＳｍａｄ１／５（Ｓｅｒ４６３／４６５）（９５１６Ｓ、Cell Signaling社）、ウサギ抗Ｓｍａｄ１（６９４４Ｓ、Cell Signaling社）、マウス抗ホスホ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｅ１０）（９１０６Ｓ、Cell signaling社）、ウサギｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（９１０２Ｓ、Cell Signaling社）、ヤギ抗エンドグリン（ＡＦ１０９７、R&D systems社）、及びマウス抗β－アクチン（Ａ５４４１、Sigma-Aldrich社）。ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧ若しくはＨＲＰ抗マウスＩｇＧ（それぞれ、Ｗ４０１１又はＷ４０２１、Promega社）又はＨＲＰ抗ヤギＩｇＧ（ＨＡＦ０１７、R&D systems社）を用いて検出し、続いて、BIO-RAD社ChemiDoc imagerでスキャンした。画像を、線形範囲で捕獲し、タンパク質レベル及びタンパク質リン酸化レベルを測定するためにＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた。全てのブロットについて、図に指し示されているように、バックグラウンドを引き算し、結果を標準化した。
【0145】
新生仔マウスにおけるＶＡＤ０４４の薬物動態学（ＰＫ）プロファイル
ＶＡＤ０４４を、滅菌ＰＢＳ中に製剤化し、Ｐ３及びＰ５に、新生仔マウスにおいて、腹腔内（ｉ．ｐ．，intra-peritoneal）ルートで、２．５ｍｇ／ｋｇの用量濃度及び１０μｌ／ｇの用量体積で投与した。注射後２４時間目及び４８時間目に、血漿の調製のために、イソフルラン麻酔下で各マウスから末梢血試料を収集した。本研究において１時点あたり４匹の新生仔マウスを用いた。血漿調製のために、血液をＥＤＴＡコーティング化microvettes（Sartsed社）へ収集した。血液を、２７００ｘｇで１０分間、遠心分離し、おおよそ３０～４０μｌの血漿を取り出し、ポリプロピレンチューブへ分注した（動物あたり２個のアリコート）。血漿試料を、バイオアナリシスまで－８０℃で保管した。血漿試料中のＶＡＤ０４４化合物レベルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定した。２４時間目及び４８時間目におけるＶＡＤ０４４血漿中濃度は、以下の式を用いてＣａｖｇの算出を可能にする：ＡＵＣ０－ｉｎｆ／（４８時間にわたる区間数）。
ＶＡＤ０４４を、滅菌ＰＢＳ中に製剤化し、Ｐ３及びＰ５に、新生仔マウスにおいて、腹腔内（ｉ．ｐ．，intra-peritoneal）ルートで、２．５ｍｇ／ｋｇの用量濃度及び１０μｌ／ｇの用量体積で投与した。注射後２４時間目及び４８時間目に、血漿の調製のために、イソフルラン麻酔下で各マウスから末梢血試料を収集した。本研究において１時点あたり４匹の新生仔マウスを用いた。血漿調製のために、血液をＥＤＴＡコーティング化microvettes（Sartsed社）へ収集した。血液を、２７００ｘｇで１０分間、遠心分離し、おおよそ３０～４０μｌの血漿を取り出し、ポリプロピレンチューブへ分注した（動物あたり２個のアリコート）。血漿試料を、バイオアナリシスまで－８０℃で保管した。血漿試料中のＶＡＤ０４４化合物レベルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定した。２４時間目及び４８時間目におけるＶＡＤ０４４血漿中濃度は、以下の式を用いてＣａｖｇの算出を可能にする：ＡＵＣ０－ｉｎｆ／（４８時間にわたる区間数）。
【0146】
ヒト用量のモデリング
ヒト用量モデリング分析を、ＭＯＮＯＬＩＸ（バージョン２０１９Ｒ１）の適格インストールでの非線形混合効果モデリングアプローチを用いて実施した。Ｒ（バージョン３．５．３）を、データの処理前及び処理後並びにモデルアウトプットについての分析において用いた。モデルを構築するためにマウス種、ラット種、及びイヌ種において作成された全てのＰＫ生データは、表３に要約され、その表３は、全分析に含まれる動物の数及び試料の数の概観を示す。
ヒト用量モデリング分析を、ＭＯＮＯＬＩＸ（バージョン２０１９Ｒ１）の適格インストールでの非線形混合効果モデリングアプローチを用いて実施した。Ｒ（バージョン３．５．３）を、データの処理前及び処理後並びにモデルアウトプットについての分析において用いた。モデルを構築するためにマウス種、ラット種、及びイヌ種において作成された全てのＰＫ生データは、表３に要約され、その表３は、全分析に含まれる動物の数及び試料の数の概観を示す。
【0147】
【表3】
【0148】
ヒトモデルのＰＫパラメータを、体重とのクリアランス及び体積パラメータの相対成長率に基づいて決定した。生物学的利用率及び吸収率について、仮定を立てなければならなかった。吸収率ｋａｂｓは、－０．２５の指数部を有する体重との相対成長率を用いて、イヌにおける値から導かれた。この指数部は、ｋａｂｓとしての同じ物理的単位、１／時間に関連した他のパラメータについて以前、観察されており、Dawson TH. Allometric relations and scaling laws for the cardiovascular system of mammals. Systems. 2014 Jun;2(2):168-85を参照されたい。現分析におけるデータは、ヒトにおける生物学的利用率の値の情報を与えることができなかった。したがって、合理的な仮定を立てなければならず、ヒトにおける５０％生物学的利用率は、十分控え目な見積りであると仮定された。
【0149】
下記で論じられているように、マウス新生仔の血漿における２．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＬＣ／ＭＳ／ＭＳバイオアナリシスにより測定されたＶＡＤ０４４遊離塩基の血液暴露は、４８時間の投薬区間にわたる２２．９ｎｇ／ｍｌ（又は５５．１ｎＭ）のＣａｖｇに対応する。ＰＫモデリングに基づいて、この暴露は、ヒトにおいて（ＶＡＤ０４４遊離塩基の）２０ｍｇ～４０ｍｇの単回固定用量Ｑ．Ｄ．で達成されると推定される。この投薬は、７０ｋｇのヒト成人について、及び５０％～７５％のＶＡＤ０４４の推定生物学的利用率を以て、算出されている。
【0150】
評価された化合物
異なるＡＫＴキナーゼ阻害性を有する３つの化合物を試験した：
（ｉ）ペリフォシン（比較化合物）：アルキルリン脂質クラスのＡＫＴ阻害剤。ＡＴＰ結合性キナーゼ阻害剤と違って、ペリフォシンは、ＡＫＴのプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインをターゲットし、したがって、それの細胞膜への転位置を予防する（Gradziel et al., (2014), “Cytotoxic amphiphiles and phosphoinositides bind to two discrete sites on the Akt1 PH domain”, Biochemistry, https://doi.org/10.1021/bi401720v；Kondapaka et al., (2003), “Perifosine, a novel alkylphospholipid, inhibits protein kinase B activation”, Molecular Cancer Therapeutics；Rios-Marco et al., (2017), “Alkylphospholipids: An update on molecular mechanisms and clinical relevance”, In Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2017.02.016)）
（ii）ユプロセルチブ（比較化合物）：ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、及びＡＫＴ３のＡＴＰ競合的阻害剤。それは又、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢを含むＰＫＣファミリーメンバー、加えてｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼＰＲＫＧ１及びＲＯＣＫキナーゼを潜在的に阻害することができる（Dumble et al., (2014), “Discovery of novel AKT inhibitors with enhanced anti-tumor effects in combination with the MEK inhibitor”, PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0100880）
（iii）ＶＡＤ０４４（本発明の化合物）：他のキナーゼに対して優秀な選択性を有する、ＡＫＴ１／２の新規のアロステリック阻害剤。上記で論じられているように、ＶＡＤ０４４は、下記で示された化合物のＬ－酒石酸塩である（「ＶＡＤ０４４遊離塩基」と呼ばれる）：
異なるＡＫＴキナーゼ阻害性を有する３つの化合物を試験した：
（ｉ）ペリフォシン（比較化合物）：アルキルリン脂質クラスのＡＫＴ阻害剤。ＡＴＰ結合性キナーゼ阻害剤と違って、ペリフォシンは、ＡＫＴのプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインをターゲットし、したがって、それの細胞膜への転位置を予防する（Gradziel et al., (2014), “Cytotoxic amphiphiles and phosphoinositides bind to two discrete sites on the Akt1 PH domain”, Biochemistry, https://doi.org/10.1021/bi401720v；Kondapaka et al., (2003), “Perifosine, a novel alkylphospholipid, inhibits protein kinase B activation”, Molecular Cancer Therapeutics；Rios-Marco et al., (2017), “Alkylphospholipids: An update on molecular mechanisms and clinical relevance”, In Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2017.02.016)）
（ii）ユプロセルチブ（比較化合物）：ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、及びＡＫＴ３のＡＴＰ競合的阻害剤。それは又、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢを含むＰＫＣファミリーメンバー、加えてｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼＰＲＫＧ１及びＲＯＣＫキナーゼを潜在的に阻害することができる（Dumble et al., (2014), “Discovery of novel AKT inhibitors with enhanced anti-tumor effects in combination with the MEK inhibitor”, PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0100880）
（iii）ＶＡＤ０４４（本発明の化合物）：他のキナーゼに対して優秀な選択性を有する、ＡＫＴ１／２の新規のアロステリック阻害剤。上記で論じられているように、ＶＡＤ０４４は、下記で示された化合物のＬ－酒石酸塩である（「ＶＡＤ０４４遊離塩基」と呼ばれる）：
【0151】
【化11】
【0152】
ＩＵＰＡＣ名：６－（４－（１－アミノ－３－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）－１－エチル－７－フェニル－１Ｈ－ピリド［２，３－ｂ］［１，４］オキサジン－２（３Ｈ）－オン
【0153】
ペリフォシンのプロファイル
毒性
Ｐ４に５～２５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でペリフォシンを１回、注射された新生仔マウスにおいて有害効果は観察されなかった。５０ｍｇ／ｋｇにおけるペリフォシンの投与は、体重増加を遅らせ、１００ｍｇ／ｋｇにおけるペリフォシンの投与は、重大な仔の死亡を誘導した（図３参照）。したがって、以前、新生仔マウスにおいて試験されておりかつＨＨＴ患者において鼻出血の重症度及び頻度を低下させることが報告されたサリドマイド（Lebrin et al.、上記の通り）などの薬物と比較した場合、ペリフォシンの安全性プロファイルは良好である。
毒性
Ｐ４に５～２５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でペリフォシンを１回、注射された新生仔マウスにおいて有害効果は観察されなかった。５０ｍｇ／ｋｇにおけるペリフォシンの投与は、体重増加を遅らせ、１００ｍｇ／ｋｇにおけるペリフォシンの投与は、重大な仔の死亡を誘導した（図３参照）。したがって、以前、新生仔マウスにおいて試験されておりかつＨＨＴ患者において鼻出血の重症度及び頻度を低下させることが報告されたサリドマイド（Lebrin et al.、上記の通り）などの薬物と比較した場合、ペリフォシンの安全性プロファイルは良好である。
【0154】
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおける抗血管新生性
Ｐ４に１回、投与された低用量のペリフォシン（５～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量）は、血管新生に影響しなかった（図４Ａ～Ｄ参照）。２５～１００ｍｇ／ｋｇの範囲である高用量のペリフォシンのみが、結果として網膜血管床の微小な変化を生じ、分岐点の数及び血管エリアのわずかな減少があった（図４Ａ～Ｄ参照）。１００ｍｇ／ｋｇにおけるペリフォシンは又、血管の放射状伸展の低下をもたらし、微小な内皮細胞抗遊走性を明らかに示した（図４Ａ～Ｂ参照）。結論として、ペリフォシンは、弱い抗血管新生性を呈する。
Ｐ４に１回、投与された低用量のペリフォシン（５～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量）は、血管新生に影響しなかった（図４Ａ～Ｄ参照）。２５～１００ｍｇ／ｋｇの範囲である高用量のペリフォシンのみが、結果として網膜血管床の微小な変化を生じ、分岐点の数及び血管エリアのわずかな減少があった（図４Ａ～Ｄ参照）。１００ｍｇ／ｋｇにおけるペリフォシンは又、血管の放射状伸展の低下をもたらし、微小な内皮細胞抗遊走性を明らかに示した（図４Ａ～Ｂ参照）。結論として、ペリフォシンは、弱い抗血管新生性を呈する。
【0155】
Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスにおいてＡＶＭ形成を予防する能力
５０μｇタモキシフェンを、Ｐ２ Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスに注射した。その後、マウスに、ペリフォシンをＰ３及びＰ５に（２５ｍｇ／ｋｇ体重又は５０ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ）（図５Ａ）か又はＰ３～Ｐ６の毎日（１０ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ）かのいずれかで腹腔内投与した。Ｐ７において、網膜を分析した（図５Ａ）。ビヒクルのみ、又はタモキシフェンとビヒクルのみを注射された同腹仔を対照として用いた。予想通り、Ｐ２におけるＥｎｇのコンディショナル欠失は、網膜ＡＶＭ形成（図５Ｂ）及び中程度の低下した血管伸長（図３Ｄ）を結果として生じた。ペリフォシンは、試験された用量及び注射スキームにおいて（図５Ａ～Ｆ）、Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスにおいてＡＶＭ形成を予防することができず（図５Ｃ）、かつ血管新生を阻害しなかった（図５Ｄ～Ｅ）。さらに、２５ｍｇ／ｋｇにおけるペリフォシンの毎日の腹腔内投与は、仔の死亡を結果として生じた（データ未呈示）。
５０μｇタモキシフェンを、Ｐ２ Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスに注射した。その後、マウスに、ペリフォシンをＰ３及びＰ５に（２５ｍｇ／ｋｇ体重又は５０ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ）（図５Ａ）か又はＰ３～Ｐ６の毎日（１０ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ）かのいずれかで腹腔内投与した。Ｐ７において、網膜を分析した（図５Ａ）。ビヒクルのみ、又はタモキシフェンとビヒクルのみを注射された同腹仔を対照として用いた。予想通り、Ｐ２におけるＥｎｇのコンディショナル欠失は、網膜ＡＶＭ形成（図５Ｂ）及び中程度の低下した血管伸長（図３Ｄ）を結果として生じた。ペリフォシンは、試験された用量及び注射スキームにおいて（図５Ａ～Ｆ）、Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスにおいてＡＶＭ形成を予防することができず（図５Ｃ）、かつ血管新生を阻害しなかった（図５Ｄ～Ｅ）。さらに、２５ｍｇ／ｋｇにおけるペリフォシンの毎日の腹腔内投与は、仔の死亡を結果として生じた（データ未呈示）。
【0156】
ユプロセルチブプロファイル
毒性
ユプロセルチブは、Ｐ４におけるユプロセルチブ（１０～５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度）の単回注射後にＰ４～Ｐ７において観察された野生型マウスの仔の生存率及び体重によって証明されているように、毒性が高いことが見出された － 図６Ａ～Ｂ参照のこと。Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスに投与された１～５ｍｇ／ｋｇ体重の用量は、仔の大部分の死亡を結果として生じることが見出された。
毒性
ユプロセルチブは、Ｐ４におけるユプロセルチブ（１０～５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度）の単回注射後にＰ４～Ｐ７において観察された野生型マウスの仔の生存率及び体重によって証明されているように、毒性が高いことが見出された － 図６Ａ～Ｂ参照のこと。Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスに投与された１～５ｍｇ／ｋｇ体重の用量は、仔の大部分の死亡を結果として生じることが見出された。
【0157】
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおける抗血管新生性
Ｐ４に１回、投与された低用量（５～２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）においてさえも、ユプロセルチブは、血管新生を阻害し、放射状伸展のわずかな減少（図７Ｂ）；血管エリア（図７Ｃ）及び分岐点の数（図７Ｄ）の著しい減少を生じ、内皮細胞抗増殖性効果を示唆した。これらの結果は、ユプロセルチブが、マウス網膜における血管新生の強力な阻害剤であることを示している。
Ｐ４に１回、投与された低用量（５～２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）においてさえも、ユプロセルチブは、血管新生を阻害し、放射状伸展のわずかな減少（図７Ｂ）；血管エリア（図７Ｃ）及び分岐点の数（図７Ｄ）の著しい減少を生じ、内皮細胞抗増殖性効果を示唆した。これらの結果は、ユプロセルチブが、マウス網膜における血管新生の強力な阻害剤であることを示している。
【0158】
Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスにおいてＡＶＭ形成を予防する能力
Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスに、ユプロセルチブをＰ３及びＰ５において２回、注射した（図８Ａ）。しかしながら、ユプロセルチブの２回の注射が、仔の大部分の死亡を結果として生じることが見出され（図８Ｂ）、試験される用量でマウスにおいてＡＶＭ形成を予防するユプロセルチブの能力のさらなる調査が妨げられた。
Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスに、ユプロセルチブをＰ３及びＰ５において２回、注射した（図８Ａ）。しかしながら、ユプロセルチブの２回の注射が、仔の大部分の死亡を結果として生じることが見出され（図８Ｂ）、試験される用量でマウスにおいてＡＶＭ形成を予防するユプロセルチブの能力のさらなる調査が妨げられた。
【0159】
ＶＡＤ０４４プロファイル
化合物ＶＡＤ０４４は、腫瘍異種移植モデルにおける以前の前臨床研究において良好な安全性プロファイルを有することがすでに示されており、したがって、追加の安全性／毒性研究は実施しなかった。
化合物ＶＡＤ０４４は、腫瘍異種移植モデルにおける以前の前臨床研究において良好な安全性プロファイルを有することがすでに示されており、したがって、追加の安全性／毒性研究は実施しなかった。
【0160】
Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスにおいてＡＶＭ形成を予防する能力
試験された濃度は、ユプロセルチブについて用いられたものと同等であった（図９Ａ）。これらの濃度において、新生仔Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスにＶＡＤ０４４を２回（Ｐ３及びＰ５において）、１．２５～１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の薬物濃度で注射した時、有害効果は観察されなかった（図９Ｂ）。ＶＡＤ０４４は、２．５ｍｇ／ｋｇ及びそれ以上の濃度において、Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスでＡＶシャント形成を効率的に予防した（図１０Ａ～Ｂ）。１．２５ｍｇ／ｋｇの用量は、ＡＶシャント形成を予防するのに有効ではないことが見出された（図１０Ａ～Ｂ）。ＶＡＤ０４４は又、Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスの網膜血管網の密度を正常化することができ（図１０Ｄ）、血管新生へは微小な効果を生じ、Ｅｎｇ－ｉＫＯ血管網の放射状伸展（図１０Ｃ）及び分岐点の数（図１０Ｅ）をわずかに低下させた。マウス新生仔の血漿中の２．５ｍｇ／ｋｇの用量におけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳバイオアナリシスによるＶＡＤ０４４遊離塩基の血液暴露は、４８時間の投薬区間にわたる２２．９ｎｇ／ｍｌ（又は５５，１ｎＭ）のＣａｖｇに対応する。
試験された濃度は、ユプロセルチブについて用いられたものと同等であった（図９Ａ）。これらの濃度において、新生仔Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスにＶＡＤ０４４を２回（Ｐ３及びＰ５において）、１．２５～１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の薬物濃度で注射した時、有害効果は観察されなかった（図９Ｂ）。ＶＡＤ０４４は、２．５ｍｇ／ｋｇ及びそれ以上の濃度において、Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスでＡＶシャント形成を効率的に予防した（図１０Ａ～Ｂ）。１．２５ｍｇ／ｋｇの用量は、ＡＶシャント形成を予防するのに有効ではないことが見出された（図１０Ａ～Ｂ）。ＶＡＤ０４４は又、Ｅｎｇ－ｉＫＯマウスの網膜血管網の密度を正常化することができ（図１０Ｄ）、血管新生へは微小な効果を生じ、Ｅｎｇ－ｉＫＯ血管網の放射状伸展（図１０Ｃ）及び分岐点の数（図１０Ｅ）をわずかに低下させた。マウス新生仔の血漿中の２．５ｍｇ／ｋｇの用量におけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳバイオアナリシスによるＶＡＤ０４４遊離塩基の血液暴露は、４８時間の投薬区間にわたる２２．９ｎｇ／ｍｌ（又は５５，１ｎＭ）のＣａｖｇに対応する。
【0161】
マウス初代内皮細胞におけるエンドグリンタンパク質欠失は、ＡＫＴ活性化を優先的に誘導した
初代内皮細胞を、出生後７日目（Ｐ７）のＥｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ仔の肺から、コラゲナーゼＩに基づいた酵素消化、続いて、ＰＥＣＡＭ１コーティング化マイクロビーズでの細胞ソーティングを用いて単離した（図１１Ａ）。ＣＤ４５コーティング化マイクロビーズを用いて、ＣＤ４５＋／ＰＥＣＡＭ１＋免疫細胞集団を枯渇させた（図１１Ａ）。単離されたＣＤ４５－／ＰＥＣＡＭ１＋細胞集団は、内皮細胞のそれと似ており、少なくとも３継代の間、培養することができた。ＰＥＣＡＭ１及びＶＥ－カドヘリン染色により、内皮細胞のアイデンティティが確認された（図１１Ｂ）。
初代内皮細胞を、出生後７日目（Ｐ７）のＥｎｇｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ仔の肺から、コラゲナーゼＩに基づいた酵素消化、続いて、ＰＥＣＡＭ１コーティング化マイクロビーズでの細胞ソーティングを用いて単離した（図１１Ａ）。ＣＤ４５コーティング化マイクロビーズを用いて、ＣＤ４５＋／ＰＥＣＡＭ１＋免疫細胞集団を枯渇させた（図１１Ａ）。単離されたＣＤ４５－／ＰＥＣＡＭ１＋細胞集団は、内皮細胞のそれと似ており、少なくとも３継代の間、培養することができた。ＰＥＣＡＭ１及びＶＥ－カドヘリン染色により、内皮細胞のアイデンティティが確認された（図１１Ｂ）。
【0162】
Ｃｒｅ－Ｌｏｘ系をうまく利用して、Ｅｎｇ遺伝子を切除するために、初代内皮細胞培養物に、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする組換えアデノウイルスを感染させた。アデノウイルス感染は非常に効率的であり、細胞生存率に効果を生じなかった。ほとんど全ての細胞が、最初の１０時間以内に遺伝子組換えを起こし、エンドグリンは、相対的に安定なタンパク質であり、半減期がおよそ１７時間と見積もられたため、均一な内皮細胞培養物は、感染後最初の６０時間以内に得られ、染色及びウェスタンブロット分析により示されているように、エンドグリンレベルは、正常から、半分低下し、完全な喪失までわたった（図１１Ｃ～Ｄ）。
【0163】
その後、Ｅｎｇタンパク質発現が枯渇した肺内皮細胞におけるＡｋｔ及びＳｍａｄ１シグナル伝達経路の活性化を調べた。細胞を、エンドグリン発現の異なるレベルに対応する感染後の異なる時点において、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１、及びＢＭＰ９で３０分間、処理した。Ｊａｋｏｂｓｓｏｎの研究室（Jin et al., 2017、上記の通り）により以前発表されているように、本発明者らは、エンドグリンタンパク質発現減少が、Ａｋｔリン酸化の増加と関連していることを確認することができた（図１２Ａ）。最も興味深いことには、Ｅｎｇタンパク質の５０％の低下が、正常レベルのエンドグリンを発現する内皮細胞と比較して、Ａｋｔリン酸化の増加を誘導し（図１２Ａ）、一方、Ｓｍａｄ１リン酸化は、変化していない（図１２Ｂ）ため、ＡＫＴリン酸化が、Ｅｎｇタンパク質減少に対してより感受性が高い。この結果は、エンドグリン発現の半分の低下が、ＶＥＧＦ応答の増加及びＡＫＴシグナル伝達の増加（増殖及び遊走を増加させ、血管奇形に寄与する）を誘導し、一方、古典的ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達は正常のままであることを示唆する。
【0164】
対照及びＥｎｇ－ｉＫＯマウス内皮細胞におけるＶＡＤ０４４ ＩＣ５０の測定
その後、ＶＡＤ０４４の、Ｅｎｇ－ｉＫＯマウス由来の単離された初代肺内皮細胞への効果を、試験した。予想通り、Ｃｒｅアデノウイルス感染は、６０時間後、エンドグリン発現の完全な喪失を結果として生じた（図１３Ａ）。Ｅｎｇ発現の正常レベルを有する対照由来のＥＣは、ＶＡＤ０４４に対して感受性が高く、ＩＣ５０は５５ｎＭにおいて測定され、一方、Ｅｎｇ発現の完全喪失を提示する肺マウス内皮細胞におけるＶＡＤ０４４のＩＣ５０は、９３ｎＭであった（図１３Ｂ）。このＩＣ５０の約２倍のシフトは、Ｅｎｇタンパク質が完全にノックダウンされた場合のＡＫＴ活性化の増加（約２～４倍）によって説明することができる（図１２Ａ）。並行して、選択性の対照として、ｐ４２／ｐ４４リン酸化を分析し、ＶＡＤ０４４がＭＡＰＫ経路へ影響を生じないことが確認された（図１３Ｃ）。
その後、ＶＡＤ０４４の、Ｅｎｇ－ｉＫＯマウス由来の単離された初代肺内皮細胞への効果を、試験した。予想通り、Ｃｒｅアデノウイルス感染は、６０時間後、エンドグリン発現の完全な喪失を結果として生じた（図１３Ａ）。Ｅｎｇ発現の正常レベルを有する対照由来のＥＣは、ＶＡＤ０４４に対して感受性が高く、ＩＣ５０は５５ｎＭにおいて測定され、一方、Ｅｎｇ発現の完全喪失を提示する肺マウス内皮細胞におけるＶＡＤ０４４のＩＣ５０は、９３ｎＭであった（図１３Ｂ）。このＩＣ５０の約２倍のシフトは、Ｅｎｇタンパク質が完全にノックダウンされた場合のＡＫＴ活性化の増加（約２～４倍）によって説明することができる（図１２Ａ）。並行して、選択性の対照として、ｐ４２／ｐ４４リン酸化を分析し、ＶＡＤ０４４がＭＡＰＫ経路へ影響を生じないことが確認された（図１３Ｃ）。
【0165】
結果／考察
ユプロセルチブは、ＡＫＴ１、２、及び３のアイソフォームのＡＴＰキナーゼ結合ポケットと結合する、競合的ＡＫＴ阻害剤である。この化合物は、強力な汎ＡＴＰキナーゼポケット阻害を有する典型的な低分子量スキャフォールドである（Dumble et al., 2014）。しかしながら、ＡＫＴとプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、又はプロテインキナーゼＧ（ＰＫＧ）との間にＡＴＰ結合ポケットにおける高度の相同性がある。したがって、ユプロセルチブは、ＰＫＡ、ＰＫＧ、ＰＫＣ、加えてＲＯＣＫキナーゼに対して強い阻害を提示する。この「オフターゲット」キナーゼ活性は、副作用の増加を伴う場合が多い（Rodon et al., (2013), “Development of PI3K inhibitors: Lessons learned from early clinical trials”, Nature Reviews Clinical Oncology, https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2013.10）。
ユプロセルチブは、ＡＫＴ１、２、及び３のアイソフォームのＡＴＰキナーゼ結合ポケットと結合する、競合的ＡＫＴ阻害剤である。この化合物は、強力な汎ＡＴＰキナーゼポケット阻害を有する典型的な低分子量スキャフォールドである（Dumble et al., 2014）。しかしながら、ＡＫＴとプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、又はプロテインキナーゼＧ（ＰＫＧ）との間にＡＴＰ結合ポケットにおける高度の相同性がある。したがって、ユプロセルチブは、ＰＫＡ、ＰＫＧ、ＰＫＣ、加えてＲＯＣＫキナーゼに対して強い阻害を提示する。この「オフターゲット」キナーゼ活性は、副作用の増加を伴う場合が多い（Rodon et al., (2013), “Development of PI3K inhibitors: Lessons learned from early clinical trials”, Nature Reviews Clinical Oncology, https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2013.10）。
【0166】
対照的に、アロステリック阻害剤は、ＡＫＴに対するより高い特異性を有するように思われる。例えば、ＶＡＤ０４４は、新しいＡＫＴアロステリック阻害剤であり、それは、ＡＫＴ１及び２に対して強い効力を有するこのクラスの阻害剤において、最も高い選択性プロファイルの一つを提供する（米国特許第９２２１８３８号明細書）。ペリフォシンは、ＡＫＴのプレクストリン相同ドメインをターゲットし、それにより、活性化に必要とされる細胞膜へのそれの転位置を予防する、珍しいアロステリック阻害剤である。
【0167】
ＶＡＤ０４４のＡＫＴキナーゼ阻害に関する生化学的及び細胞性効力は、ユプロセルチブのそれに匹敵する。例として、ユプロセルチブ及びＶＡＤ０４４は、類似した生化学的キナーゼ活性アッセイに基づいて、それぞれ、１８０ｎＭ及び１２５ｎＭの、ＡＫＴ１に対するＩＣ５０を示す（Pachl, et al (2013). “Characterization of a chemical affinity probe targeting Akt kinases”, Journal of Proteome Research, https://doi.org/10.1021/pr400455j；及び上記のＶＡＤ０４４に関する実施例３参照）。同様に、どちらの分子も、ユプロセルチブについての３４～１４３ｎＭ、及びＶＡＤ０４４についての５０～１３０ｎＭを含む、Ｐｉ３Ｋα又はＰＴＥＮ変異体細胞株（例えば、ＭＣＦ７、ＢＴ４７４、又はＬｎＣＡＰ）におけるＡＫＴキナーゼ阻害について同等のＩＣ５０範囲を提示する。対照的に、ペリフォシンは、ＶＡＤ０４４とユプロセルチブのどちらよりも弱い効力を有し、類似した細胞株におけるＡＫＴへの細胞性阻害活性はｕＭ範囲である（Gradziel et al., 2014；Kondapaka et al., 2003；Rios-Marco et al., 2017、上記の通り）。
【0168】
上記結果は、受け入れられる安全性と望ましい阻害効力の両方を有するペリフォシン及びユプロセルチブについての治療的投薬量ウィンドウを同定することが不可能であったことを示している。ペリフォシンについて、ＡＫＴキナーゼの完全阻害が予想され得る高い投薬量においてさえも、正常な血管新生及びＡＶＭシャントへの効果はわずかであった。許容され得る最も高い用量（２５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ）において、ＨＨＴ１マウスモデルでのシャント形成において有意な効果は観察されなかった。１０ｍｇ／ｋｇで毎日注射された場合、効力傾向が観察されたが、統計的有意性は達成されなかった。対照的に、ユプロセルチブは、Ｐ３において１回、注射された場合、強力な抗血管新生性を提示した。５ｍｇ／ｋｇの用量は、耐容性が良く、効力研究に選択された。しかしながら、Ｐ３及びＰ６において２回、注射された場合、５ｍｇ／ｋｇ用量は、高レベルの仔の死亡率を結果として生じ、したがって、ＡＶＭシャント形成を予防することにおけるそれの効力の少しの更なる評価も妨害された。これは、ユプロセルチブの、Ｐ３～Ｐ７の間の仔の発達に関与し得るＰＫＡ、ＰＫＧ、及びＲＯＣＫキナーゼへのオフターゲット阻害効果により得る（Shi et al., (2011), “Rho-kinase in development and heart failure: Insights from genetic models”, Pediatric Cardiology. https://doi.org/10.1007/s00246-011-9920-0）。
【0169】
５ｍｇ／ｋｇの類似した用量において、ＶＡＤ０４４の２回の注射は、耐容性が良く、死亡は観察されなかった。２．５ｍｇ／ｋｇにおいて、ＶＡＤ０４４は、ＡＶＭシャント形成を完全に予防することができた。驚くべきことに、この用量は、シャント形成を予防することに完全に効果的でありながらも、正常な血管新生にほとんど又は全く影響を生じない。
【0170】
この結果は、ＶＡＤ０４４が、ＨＨＴに観察される血管欠陥をＡＫＴ経路阻害の機構によって治療し得ることを示唆している。それは又、部分的経路阻害が、ＨＨＴに観察される血管欠陥を治療するのに十分であり得ることも示唆している。第１に、上記の結果は、内皮細胞におけるＥｎｇ欠失が、ＳＭＡＤシグナル伝達が正常のままでありながら、ＡＫＴシグナル伝達を優先的に、２～４倍、過剰活性化することを確認している。上記の結果において同定されているような、２．５ｍｇ／ｋｇの最小有効用量は、２２．９ｎｇ／ｍｌ（又は５５．１ｎＭ）のＶＡＤ０４４遊離塩基Ｃａｖｇの血液暴露に対応する。この濃度は、低く、正常な内皮細胞におけるＡＫＴ阻害についてのＶＡＤ０４４のＩＣ５０、及びＥｎｇタンパク質が欠失した内皮細胞におけるＡＫＴ阻害についてのＶＡＤ０４４のＩＣ３０～４０と等価である。驚くべきことに、ＨＨＴモデルにおけるＶＡＤ０４４の最小有効用量は、腫瘍学適応症においてよりはるかに低い。インビトロでのＭＣＦ７腫瘍細胞におけるＶＡＤ０４４のＩＣ５０は類似しているが（約５０ｎＭ）、腫瘍異種移植モデルにおけるインビボでの最小有効用量は、３０ｍｇ／ｋｇ、すなわち、上記のＨＨＴ１マウスモデルにおいての約１０倍である。異なるＰＫモデリングに基づいて、２２．９ｍｇ／ｍＬのＣａｖｇに対応するこの有効濃度は、ヒトにおいて、（ＶＡＤ０４４遊離塩基の）２０～４０ｍｇの単回固定用量Ｑ．Ｄ．で達成されることが推定される。この投薬は、７０ｋｇのヒト成人について、及び５０～７５％のＶＡＤ０４４の推定生物学的利用率を以て、算出されている。
【0171】
全体的に見ると、これらの結果は、ＨＨＴ遺伝子欠失を保有する血管構造及び内皮細胞が、ＡＫＴ阻害に対して非常に感受性が高いことを示唆している。したがって、低用量のＶＡＤ０４４は、おそらくＰＩ３Ｋアルファ又はＴＩＥ２の体細胞変異に起因する異常増殖症候群又は静脈奇形に観察されているように、ＨＨＴに観察されるようなＢＭＰ９シグナル伝達の抑制によるだけでなく、機能獲得変異によっても、経路が過剰活性化されている場合に、血管奇形を制御することに効果的であり得る（Castillo et al., (2016), “Phosphoinositide 3-kinase: a new kid on the block in vascular anomalies”, Journal of Pathology (Vol. 240, Issue 4, pp. 387-396). John Wiley and Sons Ltd. https://doi.org/10.1002/path.4802）。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【国際調査報告】