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▶ スタンダード ミロックス ファーマスーティカルス オサケユイチアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-19
(54)【発明の名称】ハイドロゲル材料
(51)【国際特許分類】
C08L 67/00 20060101AFI20231012BHJP
C08K 3/36 20060101ALI20231012BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20231012BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20231012BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20231012BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231012BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231012BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20231012BHJP
【ＦＩ】
C08L67/00
C08K3/36
A61K9/06
A61K47/34
A61K9/48
A61K45/00
A61P37/02
A61K39/39
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023519017
(86)(22)【出願日】2021-09-29
(85)【翻訳文提出日】2023-05-15
(86)【国際出願番号】 FI2021050641
(87)【国際公開番号】W WO2022069799
(87)【国際公開日】2022-04-07
(31)【優先権主張番号】20205956
(32)【優先日】2020-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523106148
【氏名又は名称】スタンダード ミロックス ファーマスーティカルス オサケユイチア
(74)【代理人】
【識別番号】100145849
【弁理士】
【氏名又は名称】井澤 眞樹子
(72)【発明者】
【氏名】ミカ ヨキネン
(72)【発明者】
【氏名】アラー カルユキビ
(72)【発明者】
【氏名】アリ ロスリング
(72)【発明者】
【氏名】タトゥ アスムス
(72)【発明者】
【氏名】ベスナ ブラゼヴィック
(72)【発明者】
【氏名】ベサ ハイトネン
(72)【発明者】
【氏名】オリ ライティネン
(72)【発明者】
【氏名】スヴィ ヘイニマーキ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4J002
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076AA53
4C076AA95
4C076CC07
4C076DD37
4C076EE27A
4C084AA17
4C084MA28
4C084MA37
4C084NA05
4C084ZB07
4C085AA38
4C085EE06
4C085FF11
4J002CF181
4J002CF182
4J002CH021
4J002CH022
4J002DJ016
4J002DJ017
4J002EX038
4J002FB146
4J002FB147
(57)【要約】
本発明は、下記式（１）を有する官能化トリブロック分子を０．１５～２１重量％含む第１のハイドロゲルを含むハイドロゲル材料に関し、
【化１】
（１）
ここで、第１のハイドロゲルの総重量を基にしてｎは４～６８０であり、ｍは１～１０である。
第１のハイドロゲルは第１のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～３．３重量％のシリカと、第１のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体とを含む。シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成する。
【選択図】
【図３】
【化１】
ここで、第１のハイドロゲルの総重量を基にしてｎは４～６８０であり、ｍは１～１０である。
第１のハイドロゲルは第１のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～３．３重量％のシリカと、第１のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体とを含む。シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成する。
【選択図】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１のハイドロゲルを含むハイドロゲル材料であって、該第１のハイドロゲルは、－０．１５重量％～２１重量％の下記式（１）の構造を有する官能化トリブロック分子と、
【化1】
ここで、第１のハイドロゲルの総重量を基にしてｎは４～６８０であり、ｍは１～１０である、
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～４．０重量％のシリカと、及び
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体と、を含み、
前記シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成する、ハイドロゲル材料。
【請求項2】
前記式（１）の官能化トリブロック分子及びシリカがコロイド粒子を形成し、前記粒子のネットワークが連続固体相を形成し、その中で水性液体相が均一に分布し、前記固体相及び水性液体相は、単一のハイドロゲルエンティティ中にある請求項１に記載のハイドロゲル材料。
【請求項3】
第２のハイドロゲルをさらに含み、該第２のハイドロゲルは、－ 前記第２のハイドロゲルの総重量を基にして０．１５～２１重量％の前記式（１）の官能化トリブロック分子と、
－ 前記第２のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～４．０重量％のシリカと、
－ 前記第２のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体とを、含み
ここで、シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、第２のハイドロゲルの前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成し、及び、
ここで、前記第２のハイドロゲルは、前記第１のハイドロゲル内に分散された均一に分布した粒子の形態であり、第１のハイドロゲルは連続相を形成し、
ただし、前記第２のハイドロゲル中ではシリカ及び前記式（１）を有する官能化トリブロック分子の総量は、前記第１のハイドロゲル中のシリカ及び前記式（１）を有する官能化トリブロック分子の総量よりも多い、請求項１又は２に記載のハイドロゲル材料。
【請求項4】
－ 前記式（１）の官能化トリブロック分子及び水性液体の第１の部分は、前記式（１）の官能化トリブロック分子及び水性液体のハイドロゲルを、水性液体の第２の部分の混合によって得られるシリカゾル中に分散した粒子に分解することによって得られる粒子の形態をとり、及び、－ 前記シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成し、したがってハイドロゲル材料を形成する、請求項１に記載のハイドロゲル材料。
【請求項5】
前記シリカは、アルコキシシラン由来のシリカ、好ましくは、テトラエトキシシラン由来のシリカである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のハイドロゲル材料。
【請求項6】
前記第１のハイドロゲル及び前記第２のハイドロゲルの前記水性液体は、水、水とエタノールの混合物、及び、生物学的に適合するバッファーの中から独立して選択される請求項１乃至５のいずれか一項に記載のハイドロゲル材料。
【請求項7】
前記水性液体は、５０～９５重量％の水を含み、残りがエタノールである水とエタノールの混合物である請求項６に記載のハイドロゲル材料。
【請求項8】
前記第１のハイドロゲル中に、少なくとも１のカプセル化された生物学的活性剤をさらに含む、請求項２、５、６又は７に記載のハイドロゲル材料。
【請求項9】
前記第１のハイドロゲル及び前記第２のハイドロゲルの少なくとも１つの中に、少なくとも１のカプセル化された生物学的活性剤をさらに含む、請求項３、５、６又は７に記載のハイドロゲル材料。
【請求項10】
前記式（１）の官能化トリブロック分子のハイドロゲル中に、少なくとも１のカプセル化された生物学的活性剤をさらに含む、請求項４乃至７のいずれか１項に記載のハイドロゲル材料。
【請求項11】
前記生物学的活性剤が、免疫調節剤及び治療活性剤からなる群から選択される、請求項７乃至１０のいずれかに記載のハイドロゲル材料。
【請求項12】
前記請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のハイドロゲル材料の、生物学的活性剤のコントロールドデリバリのための使用。
【請求項13】
前記請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のハイドロゲル材料の、生物学的活性剤の保護カプセル化のための使用。
【請求項14】
前記生物学的活性剤は安定性確保のためにカプセル化されている請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
生物学的活性剤を用いた免疫化においてアジュバント効果を引き起こすための、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のハイドロゲル材料の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ハイドロゲル材料に関する。本ハイドロゲル材料は、生物学的活性剤のコントロールドデリバリに特に有用である。
【背景技術】
【0002】
ハイドロゲルは、通常、連続固体相として、ポリマー鎖又は凝集コロイドのネットワークを含み、分散液体相として水を含む。三次元固体は、親水性ポリマー鎖が架橋によって共にホールドされることに起因するか、又は、コロイド、例えば、凝集によるコロイド粒子から形成される。ハイドロゲルは、液体相が水の、天然又は合成の高分子ネットワークである。それらは、組織工学の足場（スキャフォールド）として、薬物又は細胞のキャリアとして、又は徐放性薬物のドラックデリバリシステムとして使用可能である。
【0003】
本明細書において、以下の用語は以下の意味で使用される。
【0004】
ゾルは、少なくとも１つの液体相と１つの固体相の流動的で均一な混合物、つまりコロイド分散液であり、液体相は、例えば、水、エタノール、前駆体の残留物などであって連続相であり、固体相は、例えば、ここではトリブロック分子、官能化されたトリブロック及びシリカなどであって、コロイド粒子又は高分子の形態であり、前記液体相に均一に分散している。
【0005】
ゲルは、少なくとも１つの固体相と１つの液体相の非流動性の均質な混合物、すなわちコロイド分散液であって、ここで、トリブロック分子、官能化トリブロック、及びシリカなどの固体相は連続固体相を形成し、水、エタノール、固体相前駆体の残留物などの液体は、連続固体相中に均一的に分散されている。
固体相は、典型的には、化学反応により（例えば、重縮合などの重合により）形成されるか、又はナノスケール粒子などのコロイドの凝集により形成される凝集又は架橋分子構造である。
ゲル中では、凝集及び/又は架橋された固体相が、定義された空間全体に連続したネットワークを形成し、液体相が連続固体ネットワーク中に均一に分散されている。
固体相は、典型的には、化学反応により（例えば、重縮合などの重合により）形成されるか、又はナノスケール粒子などのコロイドの凝集により形成される凝集又は架橋分子構造である。
ゲル中では、凝集及び/又は架橋された固体相が、定義された空間全体に連続したネットワークを形成し、液体相が連続固体ネットワーク中に均一に分散されている。
【0006】
ゾル－ゲル転移とは、ゾルがゲルに変化するプロセスを指す用語である。ゾル－ゲル転移は、典型的には、コロイド粒子及び／又は高分子が凝集し、凝集体のサイズが大きくなり、最終的にゾルがゲルに変わる場合に生じ、そこで凝集体は、液体相の相分離のない系の容積全体にわたって連続固体相を形成し、すなわち、液体相は連続固体相に均一に分散したままである。
【0007】
ハイドロゲルは、液体相が水又は５０重量％を超える水を含む水ベースであるゲルである。連続ハイドロゲルは、１つの三次元構造におけるハイドロゲルである。分散ハイドロゲルは、連続三次元ハイドロゲルをより小さいハイドロゲル粒子に分解することによって形成されるハイドロゲル粒子のセットであり、典型的な場合、前記ハイドロゲル粒子は別の連続ハイドロゲルと混合される。
【0008】
本発明の文脈において流動混合物とは、材料、例えば固体相及び液体相による粘弾性特性を有するが、流動液体相が固体相より優勢であるゾルを指す。
本発明の文脈において、非流動混合物とは粘弾性材料、例えば、固体相が液体相よりも優勢であるため、静止時に流動特性を持たないハイドロゲルを指す。
流動混合物の場合、粘性特性（レオロジー法によって決定されるＧ''で示される粘性／損失弾性率）が弾性特性（Ｇ'で示される弾性率／貯蔵弾性率）よりも優勢である。
同様に、非流動混合物では、弾性特性（Ｇ'）が粘性特性（Ｇ''）よりも優勢である。
Ｇ’及びＧ''は、小角振動せん断下の線形粘弾性領域内で、例えば、コーンプレート又はプレート-プレート ジオメトリを備えたレオメータを使用した振動測定で測定しうる。
本発明の文脈において、非流動混合物とは粘弾性材料、例えば、固体相が液体相よりも優勢であるため、静止時に流動特性を持たないハイドロゲルを指す。
流動混合物の場合、粘性特性（レオロジー法によって決定されるＧ''で示される粘性／損失弾性率）が弾性特性（Ｇ'で示される弾性率／貯蔵弾性率）よりも優勢である。
同様に、非流動混合物では、弾性特性（Ｇ'）が粘性特性（Ｇ''）よりも優勢である。
Ｇ’及びＧ''は、小角振動せん断下の線形粘弾性領域内で、例えば、コーンプレート又はプレート-プレート ジオメトリを備えたレオメータを使用した振動測定で測定しうる。
【0009】
本発明の文脈において、ハイブリッド材料は、例えば、トリブロック分子及びシリカ等の２つ以上の成分を含み、成分間に化学結合がある材料である。
さらに、本明細書において、ハイブリッドという用語が使用される場合、それは、ハイドロゲル中で共に固体相を形成する少なくとも２つの成分を含む固体相を指す。
さらに、本明細書において、ハイブリッドという用語が使用される場合、それは、ハイドロゲル中で共に固体相を形成する少なくとも２つの成分を含む固体相を指す。
【0010】
Ｖｏｌ－％は体積パーセントを表し、ｗｔ－％は重量パーセントを表す。
【0011】
ナノ粒子（典型的には１～１００ｎｍのサイズを有する）及びコロイド（典型的には１～１０００ｎｍのサイズを有する）は、１～１００ｎｍの範囲で重複する値の範囲を有する。しかしながら、それらは、異なる化学的及び物理的性質を有する。ナノ粒子は通常、同じ材料（つまり、まったく同じ化学組成を持つ材料）と比較して、より大きな値で異なる材料特性を有し、例えば、表面特性が異なる可能性があり、それは、疎水性や導電率に関して異なる特性につながる可能性がある。１００～１０００ｎｍのサイズのコロイドは、重力がブラウン運動よりも未だ弱いため、ナノ粒子の特殊な化学的性質を失い始める。
したがって、ブラウン運動は、ゲル、懸濁液、エマルジョン、泡などのさまざまな分散液を製造する際に大きな影響を与え、安定した分散液を得ることが目的となる。
疎液コロイドは、コロイドが熱力学的に安定していない場合（但し、１５年又は１００年でさえも安定している可能性がある）のコロイド分散液に使用される用語である。
親液コロイドは熱力学的に安定しているが、ほとんど使用されない。
したがって、ブラウン運動は、ゲル、懸濁液、エマルジョン、泡などのさまざまな分散液を製造する際に大きな影響を与え、安定した分散液を得ることが目的となる。
疎液コロイドは、コロイドが熱力学的に安定していない場合（但し、１５年又は１００年でさえも安定している可能性がある）のコロイド分散液に使用される用語である。
親液コロイドは熱力学的に安定しているが、ほとんど使用されない。
【0012】
ナノ粒子又は疎液コロイドとは、通常、ある種の分子クラスターが、周囲の液体に実際に溶けないサイズと化学構造に達した状態を指す。
ただし、ナノ粒子又はコロイドはサイズが非常に小さいため、その密度が液体の密度よりも高い場合でも、周囲の液体に均一に分散されたままになる。
これは、ブラウン運動が重力よりも強いためである。したがって、ナノ粒子とコロイドは、液体中を移動すると、互いに衝突し、より大きな構造を形成しうる。例えば、それらは凝集でき、時にはそれらが重合するとさえ言える。
従って、コロイド粒子は、化学結合、及び、より弱い相互作用（ファンデルワールス相互作用など）を介して形成される凝集体であり、一方、本明細書の粒子は、三次元ゲルが機械的に分解されて粒子を形成するときに形成され、従って、その中に凝集されたコロイド粒子を含む。
ただし、ナノ粒子又はコロイドはサイズが非常に小さいため、その密度が液体の密度よりも高い場合でも、周囲の液体に均一に分散されたままになる。
これは、ブラウン運動が重力よりも強いためである。したがって、ナノ粒子とコロイドは、液体中を移動すると、互いに衝突し、より大きな構造を形成しうる。例えば、それらは凝集でき、時にはそれらが重合するとさえ言える。
従って、コロイド粒子は、化学結合、及び、より弱い相互作用（ファンデルワールス相互作用など）を介して形成される凝集体であり、一方、本明細書の粒子は、三次元ゲルが機械的に分解されて粒子を形成するときに形成され、従って、その中に凝集されたコロイド粒子を含む。
【0013】
文献「Radiopaque Organic-Inorganic Hybrids Based on Poly(D,L-lactide)”, Mazzocchetti et al., Biomacromolecules 2007, 8, 672-678」は、α，ω－トリエトキシシラン末端ポリ（Ｄ、Ｌ乳酸）から調製されたハイブリッド有機-無機ナノ複合体を開示しており、医療機器用の潜在的な放射線不透過性生体適合性コーティングとして使用されうる。
複合材の成分及び複合材自体がすべて水溶性というわけではない。さらに、この刊行物においては、テトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）が系に直接添加される。
複合材の成分及び複合材自体がすべて水溶性というわけではない。さらに、この刊行物においては、テトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）が系に直接添加される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】Radiopaque Organic-Inorganic Hybrids Based on Poly(D,L-lactide)”, Mazzocchetti et al., Biomacromolecules 2007, 8, 672-678
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
(目的と概要)
生物学的活性剤のコントロールドデリバリに適しており、特に様々な生物学的活性剤の保護カプセル化に有用なハイドロゲルを提供することを目的とする。
特定の目標の1つは、生物学的活性剤の熱安定性を確保するためのカプセル化である。
他の特定の目標は、注射可能でありながら生物学的活性剤をカプセル化できるハイドロゲル材料を提供することである。
生物学的活性剤のコントロールドデリバリに適しており、特に様々な生物学的活性剤の保護カプセル化に有用なハイドロゲルを提供することを目的とする。
特定の目標の1つは、生物学的活性剤の熱安定性を確保するためのカプセル化である。
他の特定の目標は、注射可能でありながら生物学的活性剤をカプセル化できるハイドロゲル材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本明細書は、以下のようなハイドロゲル材料に関する。
第１のハイドロゲルを含むハイドロゲル材料であって、該第１のハイドロゲルは、
－０．１５重量％～２１重量％の下記式（１）の構造を有する官能化トリブロック分子と、
（１）
ここで、第１のハイドロゲルの総重量を基にしてｎは４～６８０であり、ｍは１～１０である、
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～４．０重量％のシリカと、及び
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体と、を含み、
前記シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成する、ハイドロゲル材料。
第１のハイドロゲルを含むハイドロゲル材料であって、該第１のハイドロゲルは、
－０．１５重量％～２１重量％の下記式（１）の構造を有する官能化トリブロック分子と、
【化1】
ここで、第１のハイドロゲルの総重量を基にしてｎは４～６８０であり、ｍは１～１０である、
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～４．０重量％のシリカと、及び
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体と、を含み、
前記シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成する、ハイドロゲル材料。
【0017】
本明細書はまた、生物学的活性剤のコントロールドデリバリ及び生物学的活性剤の保護カプセル化のためのハイドロゲル材料の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図6A】図６Ａは、連続ハイブリッド／複合ハイドロゲルＲ２１７－０２及び２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａ 及び Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ｂ）についての、室温（２５℃）で保存後４日目及び３３０日目における、抗原（ノロウイルスＰ－粒子）の累積放出を示す。
【図13】図１３は、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２についての、及び、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２）についての、室温（２５℃）でアルミホイルバッグに入れられたシリンジ中で保管後４日目及び２８日目の減衰係数（Ｇ''／Ｇ'）を示す。
【図14】図１４は、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２についての、及び、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２）についての、室温（２５℃）で保存後３６０日目の減衰係数（Ｇ''／Ｇ'）を示す。
【図15】図１５は、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２についての、及び、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２）についての、室温（２５℃）で保存後４日目の動的粘度を示す。
【図16】図１６は、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２についての、及び、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２）についての、室温でアルミホイルバッグに封されて保管後１日目の動的粘度を示す。
【図20A】図２０Ａは、１０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の２回投与で、又は、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルを処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧ抗体の動態を示す。
【図20B】図２０Ｂは、２０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の１回投与で、又は、２相ハイブリット／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧ抗体の動態を示す。
【図21A】図２１Ａは、１０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の２回投与で、又は、連続ハイブリッド／複合体 Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧの終点滴定を示す。
【図21B】図２１Ｂは、２０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の１回投与で、又は、２相ハイブリット／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧの終点滴定を示す。
【図22A】図２２Ａは、１０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の２回投与で、又は、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧ１の終点滴定を示す。
【図22B】図２２Ｂは、２０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の１回投与で、又は、２相ハイブリット／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧ１の終点滴定を示す。
【図23A】図２３Ａは、１０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の２回投与で、又は、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧ２aの終点滴定を示す。
【図23B】図２３Ｂは、２０μｇのノロウイルスＰ-粒子（ｐｐ）単独の１回投与で、又は、２相ハイブリット／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧ２の終点滴定を示す。
【図24A】図２４Ａは、１０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の２回投与で、又は、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧ抗体のアビディティを示す。
【図24B】図２４Ｂは、２０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の１回投与で、又は、２相ハイブリット／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける血清ＩｇＧ抗体のアビディティを示す。
【図25A】図２５Ａは、１０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の２回投与で、又は、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける異種ＮｏＶ ＶＬＰに対する交差反応性血清ＩｇＧ反応を示す。
【図25B】図２５Ｂは、２０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の１回投与で、又は、２相ハイブリット／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスにおける異種ＮｏＶ ＶＬＰに対する交差反応性血清ＩｇＧ反応を示す。
【図26A】図２６Ａは、１０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の２回投与で、又は、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスの血清抗体によるＨＢＧＡ受容体へのＧＩＩ．４ ＶＬＰ結合の相同遮断を示す。
【図26B】図２６Ｂは、２０μｇのノロウイルスＰ－粒子（ｐｐ）単独の１回投与で、又は、２相ハイブリット／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルで処方されて、免疫付与した後のマウスの血清抗体によるＨＢＧＡ受容体へのＧＩＩ．４ ＶＬＰ結合の相同遮断を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本明細書は、以下のような第１のハイドロゲルを含むハイドロゲル材料に関する。該第１のハイドロゲルは、
－ ０．１５重量％～２１重量％の下記式（１）の構造を有する官能化トリブロック分子と、
（１）
ここで、第１のハイドロゲルの総重量を基にしてｎは４～６８０であり、ｍは１～１０である、
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～４．０重量％のシリカと、及び
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体と、を含み、
前記シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成する。
－ ０．１５重量％～２１重量％の下記式（１）の構造を有する官能化トリブロック分子と、
【化1】
ここで、第１のハイドロゲルの総重量を基にしてｎは４～６８０であり、ｍは１～１０である、
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～４．０重量％のシリカと、及び
－ 前記第１のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体と、を含み、
前記シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成する。
【0020】
本ハイドロゲル材料は、さまざまな分野でいくつかの有用な特性を持っている。それは生物学的活性剤のコントロールドデリバリに非常に適していることが知られている。本ハイドロゲル材料と共に使用できるいくつかの特に適切な生物学的活性剤は、ワクチン抗原及び医薬品有効成分である。ハイドロゲル材料は、その投与を容易にする注射可能な形態にすることもできる。
従って、ハイドロゲル材料のレオロジー特性を広範囲に調整することができ、その注入性の調整が可能になりうる。注射可能とは、例えば、２５～２７Ｇ針、又は２３～３０Ｇ針、最も典型的には２５～３０Ｇ針などの細い針を通して注射できる生成物を意味する。
本ハイドロゲルは、その中の水性液体の量に関係なく、静止時、例えば貯蔵時には、非流動性である。しかしながら、水性液体の量が十分に多い場合、例えば９６～９９重量％の場合、例えば注射器のピストンによって圧力が加えられると、ハイドロゲルは針の中を流れて注入可能になる。従って、そのようなハイドロゲルはシアシニングとなる。
従って、ハイドロゲル材料のレオロジー特性を広範囲に調整することができ、その注入性の調整が可能になりうる。注射可能とは、例えば、２５～２７Ｇ針、又は２３～３０Ｇ針、最も典型的には２５～３０Ｇ針などの細い針を通して注射できる生成物を意味する。
本ハイドロゲルは、その中の水性液体の量に関係なく、静止時、例えば貯蔵時には、非流動性である。しかしながら、水性液体の量が十分に多い場合、例えば９６～９９重量％の場合、例えば注射器のピストンによって圧力が加えられると、ハイドロゲルは針の中を流れて注入可能になる。従って、そのようなハイドロゲルはシアシニングとなる。
【0021】
本材料及びそのすべての成分は水溶性である。本ハイドロゲル中の液体は水性であり、これは特に免疫調節剤及び治療活性剤の投与にとって重要である。実際、そのような使用では、最終生成物（the end product）の製造中だけでなく、完成生成物（the final product）においても薬剤の生物学的活性が保持されることが必要である。
さらに、体内での薬剤のデリバリ中、薬剤の放出は、ハイドロゲル材料の生物学的分解によって主に制御される。この生物学的分解は、主に組織液の水相への溶解によって生じる。本ハイドロゲルのすべての成分は、組織液の水相に溶解する。ポリマーは酵素反応によっても分解し、酵素は水相でも活性である。
特に興味深い利点は、本ハイドロゲル材料内に生物学的活性剤をカプセル化することにより、貯蔵時間及び温度の機能として、それらの熱安定性が保証され、すなわち、それらの生物学的活性が長期間維持されうることである。
ハイドロゲル材料は、投与されると生物学的活性剤の一定の放出速度を可能にもする。
さらに、体内での薬剤のデリバリ中、薬剤の放出は、ハイドロゲル材料の生物学的分解によって主に制御される。この生物学的分解は、主に組織液の水相への溶解によって生じる。本ハイドロゲルのすべての成分は、組織液の水相に溶解する。ポリマーは酵素反応によっても分解し、酵素は水相でも活性である。
特に興味深い利点は、本ハイドロゲル材料内に生物学的活性剤をカプセル化することにより、貯蔵時間及び温度の機能として、それらの熱安定性が保証され、すなわち、それらの生物学的活性が長期間維持されうることである。
ハイドロゲル材料は、投与されると生物学的活性剤の一定の放出速度を可能にもする。
【0022】
官能化されたトリブロック分子は、ハイブリッド、オリゴマー、又はポリマーと呼ばれることもある。それは、シリカでエンドキャップされている。
シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基と、式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基との間の－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合は化学結合である。
本明細書では、材料の一部はハイブリッドであり、他の材料は複合体の形態であるため、材料は一般にハイブリッド／複合体とも言われる。
シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基と、式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基との間の－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合は化学結合である。
本明細書では、材料の一部はハイブリッドであり、他の材料は複合体の形態であるため、材料は一般にハイブリッド／複合体とも言われる。
【0023】
ハイドロゲル材料は、１つの連続ハイドロゲルであるか、又は連続ハイドロゲル内に均一に分散された分散ハイドロゲル粒子から構成され得る。
【0024】
上記式（１）において、ｎは４～６８０であり、及び、ｍは１～１０である。
ｎの値は（ｍの値によるが）、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２０、１３５、１５０、２００、２２５、２７０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０又は６００から、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２０、１３５、１５０、２００、２２５、２７０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００又は６８０まで、である。
ｍの値は（ｎの値によるが）、例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８から２、３、４、５、６、７、８、９又は１０まで、である。
ｎの値は（ｍの値によるが）、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２０、１３５、１５０、２００、２２５、２７０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０又は６００から、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２０、１３５、１５０、２００、２２５、２７０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００又は６８０まで、である。
ｍの値は（ｎの値によるが）、例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８から２、３、４、５、６、７、８、９又は１０まで、である。
【0025】
したがって、本ハイドロゲル材料は、以下の表１に要約される様々な形態を有する。本明細書では、表１に示す型名を使用する。
【0026】
さまざまな種類のハイドロゲル材料について、以下に詳細を説明する。
【0027】
【表1】
【0028】
一実施形態によれば、式（１）の官能化トリブロック分子及びシリカはコロイド粒子を形成し、前記粒子のネットワークは連続固体相を形成し、その中に水性液体相が均一に分布し、前記固体相及び水性液体相は、単一のハイドロゲルエンティティ中にある。これは、表１の連続ハイブリッド／複合体である。
【0029】
この実施形態では、従って、ハイドロゲルは、固体粒子凝集体（コロイド粒子から形成されたコロイド凝集体）と水性液体との均一な混合物である。シリカは、少なくとも部分的にコロイド粒子及びコロイド凝集体の形態であり、トリブロック分子と化学結合を形成し、ハイブリッド材料を作る。コロイダルシリカ粒子は、分子の球状クラスターから形成され、その表面の原子は、トリブロック分子だけでなく他のコロイダルシリカ粒子を含む、材料内の他の化合物と化学結合を形成しうる。
【0030】
官能化トリブロック分子とシリカはどちらもナノスケールの構造である。官能化トリブロック分子は、水性液体に、可溶性な分子、又は部分的に可溶性であり、シリカはナノ粒子の形態をとる。
ハイブリッド／複合体は、シリカのＳｉ－ＯＨ－基が官能化トリブロック分子の末端においてＳｉ－Ｏ－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成する場合に形成される。１つの官能化トリブロック分子は、これらの結合を使用して別の官能化トリブロック分子と、ネットワークを従って形成しながら連結することもできる。
典型的には、各－Ｓｉ－（Ｏ）３－基は、０～３個の官能化トリブロック分子又は０～３個のシリカ分子に結合してもよい。
ハイブリッド／複合体は、シリカのＳｉ－ＯＨ－基が官能化トリブロック分子の末端においてＳｉ－Ｏ－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成する場合に形成される。１つの官能化トリブロック分子は、これらの結合を使用して別の官能化トリブロック分子と、ネットワークを従って形成しながら連結することもできる。
典型的には、各－Ｓｉ－（Ｏ）３－基は、０～３個の官能化トリブロック分子又は０～３個のシリカ分子に結合してもよい。
【0031】
さらに、シリカナノ粒子は、互いに結合（又は、凝集（aggregate）或いは弱い相互作用による集塊（agglomerate））することもできる。
シリカナノ粒子はまた、より大きな凝集体を形成することもあるが、ナノ粒子の少なくとも一部は、少なくとも1つの官能化トリブロック分子に結合している。
シリカナノ粒子はまた、より大きな凝集体を形成することもあるが、ナノ粒子の少なくとも一部は、少なくとも1つの官能化トリブロック分子に結合している。
【0032】
これらのハイドロゲル材料中のシリカは、コロイド又はナノ粒子又は凝集したナノ粒子（コロイドでもある）の形態をとる。シリカの４つの酸素は、別の分子、たとえば別のシリコンに結合する。シリカは環状構造を形成する傾向があり、環状（つまり球状）のシリカ分子は非常に急速に成長して、周囲の液体に溶けなくなるほどの大きさになるため、ナノ粒子又はコロイドと呼ぶことができる。
確かに、それは周囲の液体の中で独自の固体相を形成するが、液体中で安定した状態を維持するには、及び、可溶性分子と同じようにブラウン運動によって動き回るには、あまりにも小さい。
粒子の表面には多数の遊離Ｓｉ－ＯＨ－基があり、官能化トリブロック分子と反応して化学結合を形成し、ハイブリッド／複合体を形成する。
確かに、それは周囲の液体の中で独自の固体相を形成するが、液体中で安定した状態を維持するには、及び、可溶性分子と同じようにブラウン運動によって動き回るには、あまりにも小さい。
粒子の表面には多数の遊離Ｓｉ－ＯＨ－基があり、官能化トリブロック分子と反応して化学結合を形成し、ハイブリッド／複合体を形成する。
【0033】
この最初のタイプの材料では、ナノ構造、つまり官能化トリブロック分子とシリカナノ粒子が凝集（又は重合）し、凝集が十分に進行すると、水性液体と非流動性のハイドロゲルを形成する。
ハイドロゲル材料が別の分子を封入するために使用される場合、この分子は非流動性ハイドロゲルが形成される前に混合物に加えられる。
ハイドロゲル材料が別の分子を封入するために使用される場合、この分子は非流動性ハイドロゲルが形成される前に混合物に加えられる。
【0034】
他の実施形態によれば、ハイドロゲル材料は、以下のような第２のハイドロゲルをさらに含む。該第２のハイドロゲルは、
－ 前記第２のハイドロゲルの総重量を基にして０．１５～０．８重量％の前記式（１）の官能化トリブロック分子と、
－ 前記第２のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～３．３重量％のシリカと、及び、
－ 前記第２のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体とを、含み
ここで、シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、第２のハイドロゲルの前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成し、及び、
ここで、前記第２のハイドロゲルは、前記第１のハイドロゲル内に分散された均一な分散粒子の形態であり、第１のハイドロゲルは連続相を形成し、
ただし、前記第２のハイドロゲル中ではシリカ及び前記式（１）を有する官能化トリブロック分子の総量は、前記第１のハイドロゲル中のシリカ及び前記式（１）を有する官能化トリブロック分子の総量よりも多い。
－ 前記第２のハイドロゲルの総重量を基にして０．１５～０．８重量％の前記式（１）の官能化トリブロック分子と、
－ 前記第２のハイドロゲルの総重量を基にして０．８５～３．３重量％のシリカと、及び、
－ 前記第２のハイドロゲルの総重量を基にして７５～９９重量％の水性液体とを、含み
ここで、シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、第２のハイドロゲルの前記式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成し、及び、
ここで、前記第２のハイドロゲルは、前記第１のハイドロゲル内に分散された均一な分散粒子の形態であり、第１のハイドロゲルは連続相を形成し、
ただし、前記第２のハイドロゲル中ではシリカ及び前記式（１）を有する官能化トリブロック分子の総量は、前記第１のハイドロゲル中のシリカ及び前記式（１）を有する官能化トリブロック分子の総量よりも多い。
【0035】
このハイドロゲル材料は、表１の２相ハイブリッド／複合体＃１である。
このハイドロゲル材料は、従って、同じ成分からなるが、異なる量で構成される２つの異なるハイドロゲルを有する。
最初のハイドロゲルは、ハイブリッド／複合体＃１の連続相を形成する。
第２のハイドロゲルは、まず非流動性ハイドロゲルを形成し、その後、第２のハイドロゲルの物理的構造が機械的に破壊されて粒子を形成する。次いで、これらの粒子は、第１のハイドロゲルがまだ流動可能である間に、第１のハイドロゲルの連続相に混合される。通常、第２のハイドロゲル（すなわち分散相）は、第１のハイドロゲルよりも少ない水性液体を含む。
このハイドロゲル材料は、従って、同じ成分からなるが、異なる量で構成される２つの異なるハイドロゲルを有する。
最初のハイドロゲルは、ハイブリッド／複合体＃１の連続相を形成する。
第２のハイドロゲルは、まず非流動性ハイドロゲルを形成し、その後、第２のハイドロゲルの物理的構造が機械的に破壊されて粒子を形成する。次いで、これらの粒子は、第１のハイドロゲルがまだ流動可能である間に、第１のハイドロゲルの連続相に混合される。通常、第２のハイドロゲル（すなわち分散相）は、第１のハイドロゲルよりも少ない水性液体を含む。
【0036】
一実施形態によれば、シリカ及び式（１）を有する官能化トリブロック分子の総量は、第１のハイドロゲルにおけるシリカ及び式（１）を有する官能化トリブロック分子の総量よりも、第２のハイドロゲルにおいて少なくとも２０％多い。
【0037】
生物学的活性剤又はその類似物がこのハイブリッド／複合体＃１内にカプセル化される場合、まだ流動可能な第２のハイドロゲル、又はまだ流動可能な第１のハイドロゲルのどちらかと、又はその両方と混合される。
より遅いデリバリが目的である場合、薬剤は、完成生成物において粒子である第２のハイドロゲルと混合される。
従って、このハイドロゲル材料は、ハイドロゲル材料の成分内の位置に応じて、２つの異なる速度で薬剤をデリバリできる可能性があるため、２つの異なる放出プロファイルを目的としている場合に特に適している。
より遅いデリバリが目的である場合、薬剤は、完成生成物において粒子である第２のハイドロゲルと混合される。
従って、このハイドロゲル材料は、ハイドロゲル材料の成分内の位置に応じて、２つの異なる速度で薬剤をデリバリできる可能性があるため、２つの異なる放出プロファイルを目的としている場合に特に適している。
【0038】
他の実施形態によれば、ハイドロゲルにおいて、
－ 式（１）の官能化トリブロック分子及び水性液体の第１の部分は、
式（１）の官能化トリブロック分子及び水性液体のハイドロゲルを、粒子へ分解することによって得られる粒子の形態であって、
水性液体の第２の部分を混合することによって得られるシリカゾル内に分散され、及び、
－ シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成し、従ってハイドロゲル材料を形成する。
－ 式（１）の官能化トリブロック分子及び水性液体の第１の部分は、
式（１）の官能化トリブロック分子及び水性液体のハイドロゲルを、粒子へ分解することによって得られる粒子の形態であって、
水性液体の第２の部分を混合することによって得られるシリカゾル内に分散され、及び、
－ シリカの－Ｓｉ－ＯＨ基は、式（１）の官能化トリブロック分子の－Ｓｉ－（Ｏ）３－基と－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－結合を形成し、従ってハイドロゲル材料を形成する。
【0039】
このハイドロゲル材料は、表１の２相ハイブリッド／複合体＃２である。ハイドロゲル材料は、上記のハイドロゲル材料と同じ化学成分を有するが、２つの異なる部分を有する。
この実施形態において、連続相は、シリカ及び水性液体によって形成され、分散相は、官能化トリブロック分子を水性液体と最初に混合することによって形成され、それは、非流動性ハイドロゲルを形成することを可能とし、及び得られたハイドロゲルは機械的に粒子に分解される。
これらの粒子は連続相に混合され、結果としてハイドロゲル材料が得られる。
生物学的活性剤又は類似物をハイドロゲルに添加する場合、官能化トリブロック分子と水性液体との混合物がまだ流動可能な状態で薬剤を添加することによって添加が行われる。
シリカゲルが連続相を形成するため、このタイプのハイブリッド／複合体＃２は注射可能に形成されうる。
この実施形態において、連続相は、シリカ及び水性液体によって形成され、分散相は、官能化トリブロック分子を水性液体と最初に混合することによって形成され、それは、非流動性ハイドロゲルを形成することを可能とし、及び得られたハイドロゲルは機械的に粒子に分解される。
これらの粒子は連続相に混合され、結果としてハイドロゲル材料が得られる。
生物学的活性剤又は類似物をハイドロゲルに添加する場合、官能化トリブロック分子と水性液体との混合物がまだ流動可能な状態で薬剤を添加することによって添加が行われる。
シリカゲルが連続相を形成するため、このタイプのハイブリッド／複合体＃２は注射可能に形成されうる。
【0040】
この実施形態では、最終のハイドロゲル材料は、第１のハイドロゲルと同じ方法で形成され、すなわち、化学反応はコロイドをもたらし、コロイドは凝集し、化学結合は第１のハイドロゲルと最終ハイドロゲル材料において同じタイプである。
【0041】
第１及び第２のハイドロゲルにおいて、成分は同じ、すなわち、式（１）の官能化トリブロック分子、シリカ及び水性液体である。
以下に示す量は、必要な変更を加えて、第１のハイドロゲル及び第２のハイドロゲルに適用される。
以下に示す量は、必要な変更を加えて、第１のハイドロゲル及び第２のハイドロゲルに適用される。
【0042】
式（１）の官能化トリブロック分子の量は、ハイドロゲルの総重量に基づいて、０．１５～２１．０重量％である。
従って、式（１）の官能化トリブロック分子の量は、例えば、ハイドロゲルの総重量に基づいて、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１５．０、１８．５、又は１９．５重量％、から、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１５．０、１８．０、１９．５又は２１．０重量％まで、を取りうる。
従って、式（１）の官能化トリブロック分子の量は、例えば、ハイドロゲルの総重量に基づいて、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１５．０、１８．５、又は１９．５重量％、から、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１５．０、１８．０、１９．５又は２１．０重量％まで、を取りうる。
【0043】
シリカの量は、ハイドロゲルの総重量に基づいて、０．８５～４．０重量％である。
従って、シリカの量は、例えば、ハイドロゲル総重量に基づいて、０．８５，１．０，１．２，１．５，１．８，２．０，２．２，２．５，２．７，２．９，３．０，３．１，３．２，３．３．，３．４，３．５，３．６又は３．７重量％、から、１．０、１．５、１．８、２．０、２．２、２．５、２．７、２．９、３．０、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９又は４．０重量％までを取りうる。
従って、シリカの量は、例えば、ハイドロゲル総重量に基づいて、０．８５，１．０，１．２，１．５，１．８，２．０，２．２，２．５，２．７，２．９，３．０，３．１，３．２，３．３．，３．４，３．５，３．６又は３．７重量％、から、１．０、１．５、１．８、２．０、２．２、２．５、２．７、２．９、３．０、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９又は４．０重量％までを取りうる。
【0044】
水性液体の量は、ハイドロゲルの総重量に基づいて、７５～９９重量％である。従って、水性液体の量は、例えば、ハイドロゲル総重量に基づいて、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９０、９２又は９５重量％から８０、８２、８５、８８、９０、９２、９４、９４、９５、９６、９７、９８又は９９重量％までを取りうる。
【0045】
本実施形態では、ハイドロゲルの一つは粒子の形態をとり、第２のハイドロゲル又は第１のハイドロゲルの粒子サイズは１ｍｍ未満である。実際に最も典型的な粒子径は、例えば、２５～２７Ｇの針を通過するような材料の流動性を維持するために、数十マイクロメートルである。好ましくは、粒子サイズは０．３ｍｍ未満である。
粒子サイズは、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３００、３５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００又は８５０μｍから、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３００、３５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００μｍ、までを取りうる。
粒子サイズは、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３００、３５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００又は８５０μｍから、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３００、３５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００μｍ、までを取りうる。
【0046】
本ハイドロゲル材料において、シリカは、好ましくはアルコキシシラン由来シリカ、より好ましくはテトラエトキシシラン由来シリカである。
【0047】
第１のハイドロゲル及び第２のハイドロゲルの水性液体は、好ましくは、水、水とエタノールの混合物、及び生物学的に適合するバッファーから独立して選択される。
そのような生物学的に適合するバッファーの例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、及びそれらの混合物である。
そのような生物学的に適合するバッファーの例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、及びそれらの混合物である。
【0048】
好ましい実施形態によれば、水性液体は、５０～９５重量％の水を含み、残りがエタノールである、水とエタノールの混合物である。
従って、混合物は、例えば６０重量％から９３重量％までの水を含み、残りはエタノールであってもよい。
従って、水の量は、水性液体の総重量の５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０又は８５重量％、から、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５重量％まで、を取りうる。水性液体は水のみであってもよい。
従って、混合物は、例えば６０重量％から９３重量％までの水を含み、残りはエタノールであってもよい。
従って、水の量は、水性液体の総重量の５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０又は８５重量％、から、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５重量％まで、を取りうる。水性液体は水のみであってもよい。
【0049】
本ハイドロゲル材料は、その中にカプセル化された少なくとも１つの生物学的活性剤をさらに含み得る。
生物学的活性剤は、その構造及びハイドロゲル材料の使用目的に応じて、ハイドロゲルの異なる部分にカプセル化することができる。
実際、生物学的活性剤は、第１のハイドロゲル内、第１のハイドロゲル及び第２のハイドロゲルの少なくとも１つ内、及び／又は式（１）の官能化トリブロック分子のゲル内にカプセル化され得る。
生物学的活性剤は、その構造及びハイドロゲル材料の使用目的に応じて、ハイドロゲルの異なる部分にカプセル化することができる。
実際、生物学的活性剤は、第１のハイドロゲル内、第１のハイドロゲル及び第２のハイドロゲルの少なくとも１つ内、及び／又は式（１）の官能化トリブロック分子のゲル内にカプセル化され得る。
【0050】
一実施形態によれば、生物学的活性剤は、免疫調節剤及び治療活性剤からなる群から選択される。
【0051】
生物学的活性剤のカプセル化は、デリバリ（例えば、経口又は非経口デリバリ）、投与、脱感作又は生物学的活性剤の保護（例えば、熱に対する）などの様々な用途のためであり得る。
【0052】
従って、生物学的活性剤は、例えば、ワクチン及びアレルギーに対する減感作剤などの免疫調節剤であり得る。いくつかの例は、抗原、ウイルス、特定の抗原、及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。
薬物とも呼ばれる治療活性剤のいくつかの例としては、ペプチド、タンパク質、生物学的薬物、バイオ医薬品、バイオシミラー薬物、バイオベター薬物、核酸ベースの薬物、細胞及びウイルスベクターなど、さまざまなサイズの薬物分子である。
ワクチンでは、抗原が本ハイドロゲル材料にカプセル化されている場合、追加のアジュバント（ワクチンで通常使用されるような）なしで抗原を投与できることがin vivo試験で観察されている。
薬物とも呼ばれる治療活性剤のいくつかの例としては、ペプチド、タンパク質、生物学的薬物、バイオ医薬品、バイオシミラー薬物、バイオベター薬物、核酸ベースの薬物、細胞及びウイルスベクターなど、さまざまなサイズの薬物分子である。
ワクチンでは、抗原が本ハイドロゲル材料にカプセル化されている場合、追加のアジュバント（ワクチンで通常使用されるような）なしで抗原を投与できることがin vivo試験で観察されている。
【0053】
本明細書はまた、生物学的活性剤のコントロールドデリバリのための、上記で説明したハイドロゲル材料の使用に関する。
また、生物学的活性剤の保護的カプセル化のためのそのようなハイドロゲル材料の使用にも関する。
保護的なカプセル化は、例えば、生物学的活性剤の安定性を確保するため、及び／又は制御的な放出までの保護のためであり得る。
また、生物学的活性剤の保護的カプセル化のためのそのようなハイドロゲル材料の使用にも関する。
保護的なカプセル化は、例えば、生物学的活性剤の安定性を確保するため、及び／又は制御的な放出までの保護のためであり得る。
【0054】
１つの特定の実施形態では、保護的なカプセル化は、生物学的活性剤の熱安定性を確保するためのものである。
熱安定性とは、生物学的活性剤を含む生成物が典型的な冷蔵保存温度（４～８℃）を超える温度にさらされた場合に、生物学的活性剤がいかなる形でも破壊、変性又は変化しないことをカプセル化が保証することを意味する。
それはまた、周囲温度（２０～２５℃）又は高温（＞２５℃、例えば３５～５０℃）での長期又は短期保存中に生物学的活性剤を保護することもできうる。
熱安定性とは、生物学的活性剤を含む生成物が典型的な冷蔵保存温度（４～８℃）を超える温度にさらされた場合に、生物学的活性剤がいかなる形でも破壊、変性又は変化しないことをカプセル化が保証することを意味する。
それはまた、周囲温度（２０～２５℃）又は高温（＞２５℃、例えば３５～５０℃）での長期又は短期保存中に生物学的活性剤を保護することもできうる。
【0055】
さらに、本ハイドロゲルは、生物学的活性剤を使用する免疫においてアジュバント効果を引き起こすために使用することができ、これは、抗原とともにデリバリされるハイドロゲルが、抗原単独の投与と比較して増強された免疫反応を引き起こすことを意味する。
【0056】
本ハイドロゲル材料は、様々な方法で製造することができる。
官能化トリブロック分子を製造するための１つの可能な方法は、以下のステップを含む。
－ Ｌ－ラクチドと分子量２００～３００００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコールを、ポリエチレングリコールのＬ－ラクチドに対するモル比２：１～２０：１で第１触媒の存在下で反応させて、トリブロック分子を得て、
－ 得られたトリブロック分子を第２の触媒の存在下、イソシアネートプロピルトリエトキシシランと、トリブロック分子のイソシアネートプロピルトリエトキシシランに対するモル比１：２で反応させて、官能化トリブロック分子を得る。
官能化トリブロック分子を製造するための１つの可能な方法は、以下のステップを含む。
－ Ｌ－ラクチドと分子量２００～３００００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコールを、ポリエチレングリコールのＬ－ラクチドに対するモル比２：１～２０：１で第１触媒の存在下で反応させて、トリブロック分子を得て、
－ 得られたトリブロック分子を第２の触媒の存在下、イソシアネートプロピルトリエトキシシランと、トリブロック分子のイソシアネートプロピルトリエトキシシランに対するモル比１：２で反応させて、官能化トリブロック分子を得る。
【0057】
第２のハイドロゲルは、同じ成分を有するが相対量が異なる第２のハイドロゲルを得るために、使用量が異なることを除いて、上記の第１のハイドロゲルと同じ方法で調製される。
どちらの場合も、目的は、ポリエチレングリコール分子の両末端基に等しい数のＬ－ラクチド基を有するようにすることであり、従って、モル比は上記の範囲内の任意の偶数になる。
どちらの場合も、目的は、ポリエチレングリコール分子の両末端基に等しい数のＬ－ラクチド基を有するようにすることであり、従って、モル比は上記の範囲内の任意の偶数になる。
【0058】
シリカゾルは、例えばテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）をｐＨ２、撹拌下で加水分解することによって調製することができる。水対ＴＥＯＳのモル比（Ｒ）は、例えば９８（Ｒ９８）とすることができる。加水分解後、シリカゾルを室温で、例えば１１５分間熟成させ、その後、０．１Ｍ ＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ７．２～７．４に調整する。
【0059】
ＴＥＯＳは、反応中に部分的にエタノールに変換される。水の量がＴＥＯＳと比較して過剰な場合（たとえば、Ｒ２００～Ｒ４００）、得られるハイドロゲル材料はより流動的であり、通常は細い針を使用して注入できる。
尚、得られたシリカゾルにはＴＥＯＳは含まれていない。
尚、得られたシリカゾルにはＴＥＯＳは含まれていない。
【0060】
単相ハイドロゲル材料は、官能化トリブロック分子を水溶液に溶解し、この混合物をシリカゾルに添加することによって調製することができる。その後、混合物を熟成させてハイドロゲル材料を形成する。
【0061】
２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル材料＃１（上記の表１で説明した）は、細い針を通して注入することによってせん断力を導入することにより、第２のハイドロゲル材料をゲル粒子に分散させて調製することができる。
【0062】
２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル材料＃２を調製するために、官能化トリブロック分子を含むハイドロゲル材料を非流動ハイドロゲルに形成し、次いでこのハイドロゲルを粒子に分解する。この粒子は、混合しながら作りたてのシリカゾルに添加される。
【0063】
ハイドロゲルを粒子にするための他の選択は以下を含む。
－ ゲルをプレスする等してゲルに圧力をかける；これにより、ペースト状の生成物が得られる。
－ ゲルに横方向のせん断力を加える；これにより、ペースト状の生成物又は液体生成物が得られる。
－ ゲルを混合し、これは本質的に、横方向のせん断力を加えるのと似ている；低い回転速度を使用するとペースト状の生成物になり、高い回転速度を使用すると流動性ゲルが得られる。
－ ボルテックスを用いて攪拌する等してゲルに振動を加える；元の均質なゲルが小さな断片に分解され、形成された断片はペースト状になる。
－ Ｔｕｒｒａｘミキシングを使用して高速分解を行う；ゲルは小さな成分に分解されるが、成分が受容器の壁と接触すると、ゲルはペースト状に戻る。
－ 鋭利な道具でゲルを切る；ペースト状のゲルはほとんど形成されず、体積が増加し、材料には静電気が帯電する。
－ ゲルの細断；ペースト状のゲルは形成されず、体積が増加し、材料には静電気が帯電する。
－ ゲルをふるいに押しとおすことによってゲルを粉砕する（ゲルは、例えば３日以上、十分に熟成させる必要がある）；これにより、多孔質でふわふわしたゲルになり、体積が４倍に増加し、材料には静電気が帯電する。
－ 例えば、乳鉢と乳棒、又はボールミル又は他のタイプのミルによる、ゲルへの機械的粉砕の適用。
－ ゲルをプレスする等してゲルに圧力をかける；これにより、ペースト状の生成物が得られる。
－ ゲルに横方向のせん断力を加える；これにより、ペースト状の生成物又は液体生成物が得られる。
－ ゲルを混合し、これは本質的に、横方向のせん断力を加えるのと似ている；低い回転速度を使用するとペースト状の生成物になり、高い回転速度を使用すると流動性ゲルが得られる。
－ ボルテックスを用いて攪拌する等してゲルに振動を加える；元の均質なゲルが小さな断片に分解され、形成された断片はペースト状になる。
－ Ｔｕｒｒａｘミキシングを使用して高速分解を行う；ゲルは小さな成分に分解されるが、成分が受容器の壁と接触すると、ゲルはペースト状に戻る。
－ 鋭利な道具でゲルを切る；ペースト状のゲルはほとんど形成されず、体積が増加し、材料には静電気が帯電する。
－ ゲルの細断；ペースト状のゲルは形成されず、体積が増加し、材料には静電気が帯電する。
－ ゲルをふるいに押しとおすことによってゲルを粉砕する（ゲルは、例えば３日以上、十分に熟成させる必要がある）；これにより、多孔質でふわふわしたゲルになり、体積が４倍に増加し、材料には静電気が帯電する。
－ 例えば、乳鉢と乳棒、又はボールミル又は他のタイプのミルによる、ゲルへの機械的粉砕の適用。
【0064】
［図面の詳細な説明］
図１～５Ａは、様々な中間生成物及び最終ハイドロゲル材料の構造を模式的に示す。ナノスケールでの正確な三次元構造は正確に知られていないため、それらはスケール上又は構造の正確な複製であると解釈されるべきではない。
図１～５Ａは、様々な中間生成物及び最終ハイドロゲル材料の構造を模式的に示す。ナノスケールでの正確な三次元構造は正確に知られていないため、それらはスケール上又は構造の正確な複製であると解釈されるべきではない。
【0065】
図１は、官能化トリブロック分子の構造を模式的に示す。この図において、ＬＡ１はラクチドを表し、ＰＥＧはポリエチレングリコールを表す。この図では、Ｒはプロピルである。
【0066】
【0067】
図３は、一実施形態による、シリカと官能化トリブロック分子との間の反応生成物の構造を概略的に示す。図２中のシリカ粒子は、官能化トリブロック分子の末端に結合していることが示されている。参照番号３で示される概略図は、生成物の様々な部分の相対的なサイズを示す。
【0068】
図４は、一実施形態によるハイドロゲル材料の構造を示す。ハイドロゲル材料はネットワーク構造を形成することが示される。
【0069】
図５Ａは、別の実施形態によるハイドロゲル材料、すなわち上記２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１の構造を示す。
拡大図４は、ハイドロゲル＃１のサブ構造を示す。
図５Ｂは、さらに別の実施形態によるハイドロゲル材料、すなわち上記２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２の構造を示し、拡大図５はハイドロゲル＃２の部分構造を示す。
拡大図４は、ハイドロゲル＃１のサブ構造を示す。
図５Ｂは、さらに別の実施形態によるハイドロゲル材料、すなわち上記２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２の構造を示し、拡大図５はハイドロゲル＃２の部分構造を示す。
【0070】
【実施例】
【0071】
材料及び方法
ハイドロゲルの調整
上記の表１で示したような、３つの異なるタイプのハイドロゲル材料を調製した。
ハイドロゲルの調整
上記の表１で示したような、３つの異なるタイプのハイドロゲル材料を調製した。
【0072】
ハイドロゲル材料の調製は、いくつかのステップで構成される。最初のステップは、最初にリンカー分子を調製し、続いて一次トリブロックを調製し、及び、イソシアネートプロピルトリエトキシシランでトリブロックシリカを官能化することによる官能化トリブロック分子の調製である。
この官能化トリブロック分子は、式（１）及び図１に示すとおりである。
この官能化トリブロック分子は、式（１）及び図１に示すとおりである。
【0073】
一方、シリカゾルは、図２に示すような、シリカゾルの調製剤である（図４を参照）。
その後、シリカゾルと官能化トリブロックから図３に示すようなハイブリッド／複合体を調製し、ハイブリッド／複合体ハイドロゲルを形成させる。（図４に示す）。
その後、シリカゾルと官能化トリブロックから図３に示すようなハイブリッド／複合体を調製し、ハイブリッド／複合体ハイドロゲルを形成させる。（図４に示す）。
【0074】
２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１及び＃２は、図５Ａ及び５Ｂに示すように、他のハイドロゲルを粒子に分散させた後、分散したハイドロゲル粒子を連続相として機能する別のハイドロゲルに混合することによって調製された。
【0075】
（連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルの調製と、ノロウイルスＰ－粒子／タンパク質埋め込み）
トリブロックの形成は、Ｌ－ラクチド（Sigma Aldrich）から、２－エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）によって触媒されるポリエチレングリコール(PEG, Sigma Aldrich)、（イニシエーターとしても機能する）への開環重合（ＲＯＰ）様反応を実行してリンカー分子(PEGの両末端がＬ－ラクチドでエンドキャップされている)を調製することによって開始された。
操作は、Ｎ２の不活性雰囲気のシュレンク ライン システム内で無溶剤のバルク重合として行われた。
中間ブロック（ポリエチレングリコール、PEG、200g/mol）の必要量は、モル比２：１（PLA:PEG）に従って計算された。
ＰＥＧを添加し、その後穏やかに攪拌しながら温度を１６０℃に上げた。
内容物が溶けるまで混合物を加熱した。モル比０．０５（触媒：PEG）のスズ（ＩＩ）２－エチルヘキサノエート（Sigma Aldrich）を溶融物にピペットで入れ、容器を密封した。
反応を１６０℃で９０分間進行させた。反応後、生成物を周囲温度まで冷却した。
生成物は、クロロホルムとヘキサンの２溶媒系（Sigma Aldrich）で精製された。
ヘキサンの上澄みをデカントし、クロロホルムを２段階で蒸発させた。
まず、クロロホルムをロータリーエバポレーター（IKA RV10）で真空度４５０ｍｂａｒ、４０℃で１５分間蒸発させた。２番目のステップでは、最後の微量の溶媒を真空ポンプで蒸発させた。
得られたトリブロックを水浴で+６０℃に加温し、圧力を拡散ポンプ(Vacuubrand RZ 2.5)でｐ＜０．１ｍｂａｒに下げた。
蒸発する物質は、液体窒素Ｎ２に浸した溶媒トラップに捕捉された。この手順は、溶融物上に気泡が形成されなくなるまで続けられた。
トリブロックの形成は、Ｌ－ラクチド（Sigma Aldrich）から、２－エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）によって触媒されるポリエチレングリコール(PEG, Sigma Aldrich)、（イニシエーターとしても機能する）への開環重合（ＲＯＰ）様反応を実行してリンカー分子(PEGの両末端がＬ－ラクチドでエンドキャップされている)を調製することによって開始された。
操作は、Ｎ２の不活性雰囲気のシュレンク ライン システム内で無溶剤のバルク重合として行われた。
中間ブロック（ポリエチレングリコール、PEG、200g/mol）の必要量は、モル比２：１（PLA:PEG）に従って計算された。
ＰＥＧを添加し、その後穏やかに攪拌しながら温度を１６０℃に上げた。
内容物が溶けるまで混合物を加熱した。モル比０．０５（触媒：PEG）のスズ（ＩＩ）２－エチルヘキサノエート（Sigma Aldrich）を溶融物にピペットで入れ、容器を密封した。
反応を１６０℃で９０分間進行させた。反応後、生成物を周囲温度まで冷却した。
生成物は、クロロホルムとヘキサンの２溶媒系（Sigma Aldrich）で精製された。
ヘキサンの上澄みをデカントし、クロロホルムを２段階で蒸発させた。
まず、クロロホルムをロータリーエバポレーター（IKA RV10）で真空度４５０ｍｂａｒ、４０℃で１５分間蒸発させた。２番目のステップでは、最後の微量の溶媒を真空ポンプで蒸発させた。
得られたトリブロックを水浴で+６０℃に加温し、圧力を拡散ポンプ(Vacuubrand RZ 2.5)でｐ＜０．１ｍｂａｒに下げた。
蒸発する物質は、液体窒素Ｎ２に浸した溶媒トラップに捕捉された。この手順は、溶融物上に気泡が形成されなくなるまで続けられた。
【0076】
次いで、調製したトリブロックをイソシアネートプロピルトリエトキシシラン（IPTS、Sigma Aldrich）と反応させて、官能化トリブロック分子を生成した。これは、トリブロック、ＩＰＴＳ、及びジブチル錫ジラウレート（触媒、Alfa Aesar）をテトラハイドロフラン（THF、Sigma Aldrich）にモル比１：２：０．０５で溶解することによって行った。
上記トリブロック調製ステップで説明したように、シュレンク ライン システムを使用して、混合物を不活性雰囲気下で６０℃に加熱した。反応は１時間進行させた。
ロータリーエバポレーター（IKA RV10）を使用して、３５７ｍｂａｒの真空で４０℃、１０分間、ＴＨＦを蒸発させ。次に、得られた官能化トリブロック分子を、ヘキサンとクロロホルムの２溶媒系に溶解した。官能化トリブロック分子のさらなる精製ステップは、トリブロック調製セクションで上記したとおり、正確に実行された。
上記トリブロック調製ステップで説明したように、シュレンク ライン システムを使用して、混合物を不活性雰囲気下で６０℃に加熱した。反応は１時間進行させた。
ロータリーエバポレーター（IKA RV10）を使用して、３５７ｍｂａｒの真空で４０℃、１０分間、ＴＨＦを蒸発させ。次に、得られた官能化トリブロック分子を、ヘキサンとクロロホルムの２溶媒系に溶解した。官能化トリブロック分子のさらなる精製ステップは、トリブロック調製セクションで上記したとおり、正確に実行された。
【0077】
次に、ハイブリッド／複合体ハイドロゲルの調製プロセスにおけるその他のステップの典型的な例を説明する。
ポリマーの分子量（すなわち、ポリエチレングリコールの分子量）及びＰ－粒子、官能化トリブロック分子、水、及びシリカの量は変え、調製プロセスは、混合、エイジング及びゲル化時間だけわずかに変えた以外は同じにして、いくつかの異なる配合物を調製した。
ポリマーの分子量（すなわち、ポリエチレングリコールの分子量）及びＰ－粒子、官能化トリブロック分子、水、及びシリカの量は変え、調製プロセスは、混合、エイジング及びゲル化時間だけわずかに変えた以外は同じにして、いくつかの異なる配合物を調製した。
【0078】
官能化されたトリブロック分子の合成後の次のステップは、シリカゾルの調製であった。オルトケイ酸テトラエチル（TEOS、Sigma Aldrich）はシリカ前駆体として使用された。ＴＥＯＳは、ｐＨ２（0.1M HCl、Merck Titripurを使用して調整）で攪拌されながら加水分解された。水対ＴＥＯＳのモル比（Ｒ）は９８（Ｒ９８）であった。加水分解後、シリカゾルを室温で１１５分間熟成させ、その後０．１Ｍ ＮａＯＨ（Merck Titripur）を使用してｐＨをｐＨ７．２～７．４に調整した。得られたシリカゾルは滅菌された０．４５μｍＰＥＳ膜シリンジフィルターで濾過された。
【0079】
２００ｍｇの官能化トリブロック分子（PEG 200g/molを含む）を、濃度２００マイクログラム／ｍｌ（200ppm）のノロウイルスＰ－粒子を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS、Sigma Aldrich）５０ｍｌに溶解した。
次いで、この混合物を５０ｍｌのＲ９８シリカゾル（pH7.2～7.4で約3分間熟成）に添加して、得られたゾル中のＰ－粒子濃度を１００ｐｐｍとした。
ゾル（総量約100ml）が非流動ゲルに変化する前（ゲル化時間は処方の詳細に応じて変化する）、２～５分以内にゾル（1ml）を注射器に移した。
水溶液（水とエタノール）の蒸発は、容器をプラスチックフィルムで覆うことによって、調製及びｐＨ調整の段階で最小限に抑えられた。
得られた水対ＴＥＯＳ比（Ｒ）は２１７（Ｒ２１７）であり、最終ハイドロゲル材料中のシリカの１．５重量％に相当する。官能化トリブロック分子の最終濃度は０．２重量％であり、Ｐ－粒子濃度は１００ｐｐｍ、すなわち最終ハイドロゲル材料１ｍｌ中０．１ｍｇであった。
上記の例では、ハイドロゲル材料の最終コードはＲ２１７－０．２であり、最終材料のシリカと官能化トリブロック分子の両方の含有量を示す。Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルの組成を表２に詳しく示す。
次いで、この混合物を５０ｍｌのＲ９８シリカゾル（pH7.2～7.4で約3分間熟成）に添加して、得られたゾル中のＰ－粒子濃度を１００ｐｐｍとした。
ゾル（総量約100ml）が非流動ゲルに変化する前（ゲル化時間は処方の詳細に応じて変化する）、２～５分以内にゾル（1ml）を注射器に移した。
水溶液（水とエタノール）の蒸発は、容器をプラスチックフィルムで覆うことによって、調製及びｐＨ調整の段階で最小限に抑えられた。
得られた水対ＴＥＯＳ比（Ｒ）は２１７（Ｒ２１７）であり、最終ハイドロゲル材料中のシリカの１．５重量％に相当する。官能化トリブロック分子の最終濃度は０．２重量％であり、Ｐ－粒子濃度は１００ｐｐｍ、すなわち最終ハイドロゲル材料１ｍｌ中０．１ｍｇであった。
上記の例では、ハイドロゲル材料の最終コードはＲ２１７－０．２であり、最終材料のシリカと官能化トリブロック分子の両方の含有量を示す。Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルの組成を表２に詳しく示す。
【0080】
【表2】
【0081】
実際のハイドロゲルは、官能化トリブロック分子、シリカ、水、及びエタノールで構成され、抗原がカプセル化されていた。それに加えて、ハイドロゲルは、構造内にカプセル化された残留物、すなわちＮａＣｌを含む場合がある。
異なる成分濃度に対応する異なるハイドロゲル材料を調整した（Ｒ２１７－０．１５、Ｒ３２８－０．２、Ｒ３２８－０．４、Ｒ３２８－０．８、Ｒ４０－０．２）。
より高いモル質量のＰＥＧ（2000g/mol及び6000g/mol）も、Ｒ２１７の連続ハイブリッド／複合体についてテストされたが、しかし、それらの注入特性は最適ではなかったため、ハイブリッド／複合体に関するより広範な研究は、トリブロック中の２００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧのみで実施された。
ただし、そのような材料（すなわち、モル質量が高いＰＥＧ）は、それらの特性がそれ以外の点では、以下のように調整及びテストされたものと類似しているため、非注射用途のデリバリの目的には有用である。
異なる成分濃度に対応する異なるハイドロゲル材料を調整した（Ｒ２１７－０．１５、Ｒ３２８－０．２、Ｒ３２８－０．４、Ｒ３２８－０．８、Ｒ４０－０．２）。
より高いモル質量のＰＥＧ（2000g/mol及び6000g/mol）も、Ｒ２１７の連続ハイブリッド／複合体についてテストされたが、しかし、それらの注入特性は最適ではなかったため、ハイブリッド／複合体に関するより広範な研究は、トリブロック中の２００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧのみで実施された。
ただし、そのような材料（すなわち、モル質量が高いＰＥＧ）は、それらの特性がそれ以外の点では、以下のように調整及びテストされたものと類似しているため、非注射用途のデリバリの目的には有用である。
【0082】
（２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲルの調製及びノロウイルスＰ－粒子／タンパク質埋め込み）
上記の官能化トリブロック分子は、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１及び＃２（上記の表１に記載）の一部である。
２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１では、分散したハイドロゲルの断片は連続相と同じ固体相で構成されているが、水の量は異なる。
２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２では、連続ハイドロゲルは無機シリカゲルであり、分散成分は有機ハイドロゲルである。２相ハイドロゲルの一般的な構造を図５Ａ及び５Ｂに示す。
実際のハイドロゲルは、官能化トリブロック分子、シリカ、水、及びエタノールで構成され、抗原がカプセル化されている。それに加えて、ハイドロロゲルは、構造内にカプセル化された残留物、すなわちＮａＣｌを含む場合がある。
上記の官能化トリブロック分子は、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１及び＃２（上記の表１に記載）の一部である。
２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１では、分散したハイドロゲルの断片は連続相と同じ固体相で構成されているが、水の量は異なる。
２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２では、連続ハイドロゲルは無機シリカゲルであり、分散成分は有機ハイドロゲルである。２相ハイドロゲルの一般的な構造を図５Ａ及び５Ｂに示す。
実際のハイドロゲルは、官能化トリブロック分子、シリカ、水、及びエタノールで構成され、抗原がカプセル化されている。それに加えて、ハイドロロゲルは、構造内にカプセル化された残留物、すなわちＮａＣｌを含む場合がある。
【0083】
２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（表３）では、両方の成分が同じタイプであり、アルコキシシラン－官能化トリブロック分子－シリカ ハイブリッド／複合体（有機－無機ハイブリッド／複合体）を含み、唯一の違いはハイドロゲルで使用される水の量である。
水対ＴＥＯＳのモル比（R40、R217及びR328）と官能化トリブロック分子含有量（R217には0.15及び0.2重量％、R328には0.2、0.4及び0.8重量％及びR40には0.2重量％）を有する異なる２相ハイドロゲルが調整されたが、Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２が、優れたレオロジー特性と注入性によって、より厳密な特性評価のために選択された。
前者の成分（ここではR217-0.2）は連続ハイドロゲル相を示し、後者の成分（ここではR40-0.2）は連続ハイドロゲル相に分散されたハイドロゲルである。
ノロウイルスＰ－粒子は、分散ハイドロゲルのみに、又は分散ハイドロゲルと連続ハイドロゲルの両方に、上記の対応する方法で埋め込まれた。
加えて、単量体緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）は、Ｒ２１７－０．２の別のカプセル化剤として使用された。
分散ハイドロゲルＲ４０－０．２は、この系に最初に非流動性ゲルを形成させる（Ｐ－粒子の効果的な埋め込みを保証する）ことによって調製された。
ハイドロゲル形成直後、非流動性のＲ４０－０２は、細い針（１８Ｇ）の注入によりせん断力を導入することによって、ゲル粒子に分散された。
水性液体（水及びエタノール）が系から蒸発するのを避けるために、この工程は急速に（１～２分以内に）行われた。
連続ハイドロゲルの主な機能は、注入マトリックスとして機能することであり、つまり、２相の系に細い針への注入に適したレオロジー特性を提供するが、例えば２相放出のような、異なる放出率を達成するための制御放出系の一部としても使用できる。
水対ＴＥＯＳのモル比（R40、R217及びR328）と官能化トリブロック分子含有量（R217には0.15及び0.2重量％、R328には0.2、0.4及び0.8重量％及びR40には0.2重量％）を有する異なる２相ハイドロゲルが調整されたが、Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２が、優れたレオロジー特性と注入性によって、より厳密な特性評価のために選択された。
前者の成分（ここではR217-0.2）は連続ハイドロゲル相を示し、後者の成分（ここではR40-0.2）は連続ハイドロゲル相に分散されたハイドロゲルである。
ノロウイルスＰ－粒子は、分散ハイドロゲルのみに、又は分散ハイドロゲルと連続ハイドロゲルの両方に、上記の対応する方法で埋め込まれた。
加えて、単量体緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）は、Ｒ２１７－０．２の別のカプセル化剤として使用された。
分散ハイドロゲルＲ４０－０．２は、この系に最初に非流動性ゲルを形成させる（Ｐ－粒子の効果的な埋め込みを保証する）ことによって調製された。
ハイドロゲル形成直後、非流動性のＲ４０－０２は、細い針（１８Ｇ）の注入によりせん断力を導入することによって、ゲル粒子に分散された。
水性液体（水及びエタノール）が系から蒸発するのを避けるために、この工程は急速に（１～２分以内に）行われた。
連続ハイドロゲルの主な機能は、注入マトリックスとして機能することであり、つまり、２相の系に細い針への注入に適したレオロジー特性を提供するが、例えば２相放出のような、異なる放出率を達成するための制御放出系の一部としても使用できる。
【0084】
表３は、カプセル化された抗原及び残留物を含む２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（R217-0.2/R40-0.2）の組成を示す（A:質量比25:75のR217とR40の両方中の抗原、及び、B:R40のみの中の抗原）。
【0085】
【表3】
【0086】
２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２では、連続成分はシリカハイドロゲルであり、分散成分はアルコシキシラン－官能化トリブロック分子と水から構成されるハイドロゲルであった。シリカ、シロキサン官能化トリブロック分子、及び水の重量比が異なる４つの異なるハイドロゲル配合物を調製した（表４）。
オルトケイ酸テトラエチル（TEOS、Sigma Aldrich）をシリカ前駆体として使用した。ＴＥＯＳは、撹拌下、ｐＨ２（0.1M HClを使用して調整）で加水分解された。
水対ＴＥＯＳのモル比（Ｒ）は、各配合について２２０（Ｒ２２０）であった。シリカ、官能化トリブロック分子及び水との均一な系を確立するために、追加のエタノールを水溶液中に使用した（ＴＥＯＳからのシリカゾルの形成は、副生成物であるエタノールの形成をもたらす）。
得られたシリカのｐＨを（0.1M NaOHを使用して）ｐＨ５～６に調整した後、シロキサン官能化トリブロック分子及び水を含む有機ハイドロゲル部を添加した。
分散有機ハイドロゲルの調製は、この系に最初に非流動ハイドロゲルを形成させる（Ｐ－粒子の効果的な埋め込みを保証する）ことによって開始された。ハイドロゲル形成後、ハイドロゲルをハイドロゲル粒子に粉砕することにより、構造を粒子に分散させた。
水の分離を避けるために、分散した有機ハイドロゲル粒子の新しく作製したシリカゾルへの添加を１～２分ですばやく行い、系全体をＵｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５（ステーターS25N-18G付き）を使用して均質化した。
有機ハイドロゲルを分散させる方法は、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１の場合とは異なるが、これは、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２の固形分の相違する量がより多いためである。
シリカゲルと有機ハイドロゲルの粒子の混合物は、約３０分で非流動ハイドロゲルに変わり、有機ハイドロゲル部の沈降を避けるために、ハイドロゲル形成に先だって混合が行われる。
オルトケイ酸テトラエチル（TEOS、Sigma Aldrich）をシリカ前駆体として使用した。ＴＥＯＳは、撹拌下、ｐＨ２（0.1M HClを使用して調整）で加水分解された。
水対ＴＥＯＳのモル比（Ｒ）は、各配合について２２０（Ｒ２２０）であった。シリカ、官能化トリブロック分子及び水との均一な系を確立するために、追加のエタノールを水溶液中に使用した（ＴＥＯＳからのシリカゾルの形成は、副生成物であるエタノールの形成をもたらす）。
得られたシリカのｐＨを（0.1M NaOHを使用して）ｐＨ５～６に調整した後、シロキサン官能化トリブロック分子及び水を含む有機ハイドロゲル部を添加した。
分散有機ハイドロゲルの調製は、この系に最初に非流動ハイドロゲルを形成させる（Ｐ－粒子の効果的な埋め込みを保証する）ことによって開始された。ハイドロゲル形成後、ハイドロゲルをハイドロゲル粒子に粉砕することにより、構造を粒子に分散させた。
水の分離を避けるために、分散した有機ハイドロゲル粒子の新しく作製したシリカゾルへの添加を１～２分ですばやく行い、系全体をＵｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５（ステーターS25N-18G付き）を使用して均質化した。
有機ハイドロゲルを分散させる方法は、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１の場合とは異なるが、これは、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２の固形分の相違する量がより多いためである。
シリカゲルと有機ハイドロゲルの粒子の混合物は、約３０分で非流動ハイドロゲルに変わり、有機ハイドロゲル部の沈降を避けるために、ハイドロゲル形成に先だって混合が行われる。
【0087】
表４は、カプセル化された抗原と残留物を含む２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２のさまざまな組成を示す。
【0088】
【表4】
【0089】
ノロウイルスＰ－粒子は、上記のように２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２に埋め込まれたが（つまり、Ｐ－粒子溶液は、ハイドロゲル形成に先立ち流動する液体のような構造をまだ持っている間に系に追加された）、この場合においては、分散されたのは有機ハイドロゲルの中のみである。必要に応じて、ここでもＰ－粒子又は他の生物学的活性剤を、分散及び連続ハイドロゲルの両方の中に埋め込むことができる。
【0090】
（ｅＧＦＰの産生と特性）
単量体緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）は、産生生物として遺伝子組み換え大腸菌（単量体緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に形質転換した）を使用して産生された。タンパク質は、分子生物学の標準的な方法を使用して精製された。
単量体緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）は、産生生物として遺伝子組み換え大腸菌（単量体緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に形質転換した）を使用して産生された。タンパク質は、分子生物学の標準的な方法を使用して精製された。
【0091】
ハイドロゲル中へのｅＧＦＰの埋め込みは、以下のような手順が使用された。実験では２０１７年製、－２０℃で保管されたタンパク質ストックが使用された。
上記の実験の前に、タンパク質含有量をμＢＣＡ（マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット、マイクロプレート手順、Thermo ScientificTM）で測定した。濃度は２．２ｍｇ／ｍｌであった。ｅＧＦＰのモル質量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）で約４０ｋＤａであると決定された。
上記の実験の前に、タンパク質含有量をμＢＣＡ（マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット、マイクロプレート手順、Thermo ScientificTM）で測定した。濃度は２．２ｍｇ／ｍｌであった。ｅＧＦＰのモル質量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）で約４０ｋＤａであると決定された。
【0092】
溶解実験
（Ｐ粒子とｅＧＦＰの放出とハイブリッド／複合体ハイドロゲルの生分解）
溶解実験、すなわちＰ－粒子の放出とハイブリッド／複合体ハイドロゲル（R217-0.2及びR217-0.2-R40-0.2）の溶解は、ＰＢＳ中又は約ｐＨ７．４に緩衝化されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）中のいずれかで３７℃の振とう浴中で行われた。
Ｐ－粒子の放出にはＰＢＳが使用され、無機有機ハイブリッド／複合体の溶解にはＴＲＩＳが使用された。
溶解実験は、実際にはハイブリッド/複合体ハイドロゲルの無機部分（非晶質シリカ）のシンク条件を意味するシンク条件（溶解生成物による溶解速度を妨げることなく自由な溶解を確実にするための）で実施された。
溶解媒体は、すべてのサンプリング時点で定期的にリフレッシュされ、シンク内の状態が維持された（溶解した非晶質シリカの濃度が３０ｐｐｍ未満）。各時点で３つの複製が収集された。
（Ｐ粒子とｅＧＦＰの放出とハイブリッド／複合体ハイドロゲルの生分解）
溶解実験、すなわちＰ－粒子の放出とハイブリッド／複合体ハイドロゲル（R217-0.2及びR217-0.2-R40-0.2）の溶解は、ＰＢＳ中又は約ｐＨ７．４に緩衝化されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）中のいずれかで３７℃の振とう浴中で行われた。
Ｐ－粒子の放出にはＰＢＳが使用され、無機有機ハイブリッド／複合体の溶解にはＴＲＩＳが使用された。
溶解実験は、実際にはハイブリッド/複合体ハイドロゲルの無機部分（非晶質シリカ）のシンク条件を意味するシンク条件（溶解生成物による溶解速度を妨げることなく自由な溶解を確実にするための）で実施された。
溶解媒体は、すべてのサンプリング時点で定期的にリフレッシュされ、シンク内の状態が維持された（溶解した非晶質シリカの濃度が３０ｐｐｍ未満）。各時点で３つの複製が収集された。
【0093】
Ｐ－粒子とｅＧＦＰの放出は、分光光度計（Hidex Sense Microplate Reader）による５６２ｎｍでの比色検出用のマイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Microplate Procedure、Thermo ScientificTM）で総タンパク質分析法により分析した。
ハイブリッド／複合体ハイドロゲル（連続ハイブリッド／複合体及び２相ハイブリッド／複合体＃１）の溶解速度は、ＧＦ－ＡＡＳ（Shimadzu 6650F、GFA-EX7）によるシリカの溶解を時間の関数として測定することによって推定され、それは、ハイブリッド／複合体ハイドロゲルの総固形分３．５％（２相ハイブリッド／複合ハイドロゲル ＃２－Ｄの）－８２．５％（２相ハイブリッド／複合ハイドロゲル ＃１－Ｂの）に相当する。
分析に先立ち、Ｐ－粒子を含む液体サンプルを濃縮した。溶解測定が（シリカに関する）シンク条件で実施され、その結果非常に希釈されたサンプルが得られたため、濃縮が実行された（及び、放出における生分解及び拡散関連成分の両方を考慮に入れて放出の実際のメカニズムを見つけるために、また異なる材料バージョン間の実際の違いを観察するために、シンク条件が使用された。）。
シリカの沈下限界は約３０ｐｐｍであったため、カプセル化された物質の最大濃度は、充填率に応じて同じ限界に相関する。
シリカの総質量に対する充填率が１％の場合、カプセル化された物質の溶解サンプル中の最大濃度はわずか０．３ｐｐｍである。
サンプルの濃縮は、遠心膜濾過（Eppendorf Centrifuge 5810 R、８０００～１００００Ｇ、１５～３０分間、Amicon（登録商標）Ultra-15 遠心フィルター Ultracel（登録商標）-3K を使用)又は凍結乾燥（Christ Epsilon 1-6D、－３５℃での負荷及び最大凍結温度、続く主乾燥で－１５℃まで温度を徐々に上昇させ、最終乾燥は－１０℃で２３分間、２０℃で２０分間）のいずれかによって行われ、その後、凍結乾燥したＰ－粒子をより少ない体積の液体体に再分散させる。
ハイブリッド／複合体ハイドロゲル（連続ハイブリッド／複合体及び２相ハイブリッド／複合体＃１）の溶解速度は、ＧＦ－ＡＡＳ（Shimadzu 6650F、GFA-EX7）によるシリカの溶解を時間の関数として測定することによって推定され、それは、ハイブリッド／複合体ハイドロゲルの総固形分３．５％（２相ハイブリッド／複合ハイドロゲル ＃２－Ｄの）－８２．５％（２相ハイブリッド／複合ハイドロゲル ＃１－Ｂの）に相当する。
分析に先立ち、Ｐ－粒子を含む液体サンプルを濃縮した。溶解測定が（シリカに関する）シンク条件で実施され、その結果非常に希釈されたサンプルが得られたため、濃縮が実行された（及び、放出における生分解及び拡散関連成分の両方を考慮に入れて放出の実際のメカニズムを見つけるために、また異なる材料バージョン間の実際の違いを観察するために、シンク条件が使用された。）。
シリカの沈下限界は約３０ｐｐｍであったため、カプセル化された物質の最大濃度は、充填率に応じて同じ限界に相関する。
シリカの総質量に対する充填率が１％の場合、カプセル化された物質の溶解サンプル中の最大濃度はわずか０．３ｐｐｍである。
サンプルの濃縮は、遠心膜濾過（Eppendorf Centrifuge 5810 R、８０００～１００００Ｇ、１５～３０分間、Amicon（登録商標）Ultra-15 遠心フィルター Ultracel（登録商標）-3K を使用)又は凍結乾燥（Christ Epsilon 1-6D、－３５℃での負荷及び最大凍結温度、続く主乾燥で－１５℃まで温度を徐々に上昇させ、最終乾燥は－１０℃で２３分間、２０℃で２０分間）のいずれかによって行われ、その後、凍結乾燥したＰ－粒子をより少ない体積の液体体に再分散させる。
【0094】
（粒子組成と整合性の研究のためのハイドロゲルＲ２１７からのＰ－粒子の溶解）
放出された抗原がさまざまな温度に保たれた後に無傷であったかどうかを調べるために、０．５ｍｇ／ｍｌのＰ－粒子を含むハイドロゲルを１０ｋＤａカットオフ透析カセット（Slide-A-Lyzer、ThermoFisher）に溶解した。
まず、ハイドロゲルを注射器から取り出し、重さを量り、透析カセットに移した。カセットは、室温で１週間にわたって５回交換された０．８ＬのＰＢＳ中で透析された。
次に、カセットにゲルの残留物が存在しないことを確認した後、カセットからの溶液をマイクロ遠心チューブに移し、分注し、分析のために－２０℃で保存した。
放出された抗原がさまざまな温度に保たれた後に無傷であったかどうかを調べるために、０．５ｍｇ／ｍｌのＰ－粒子を含むハイドロゲルを１０ｋＤａカットオフ透析カセット（Slide-A-Lyzer、ThermoFisher）に溶解した。
まず、ハイドロゲルを注射器から取り出し、重さを量り、透析カセットに移した。カセットは、室温で１週間にわたって５回交換された０．８ＬのＰＢＳ中で透析された。
次に、カセットにゲルの残留物が存在しないことを確認した後、カセットからの溶液をマイクロ遠心チューブに移し、分注し、分析のために－２０℃で保存した。
【0095】
（放出メカニズム実験）
Ｐ－粒子の放出メカニズムは、シリカ飽和ＰＢＳで又は約ｐＨ７．４に緩衝されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）で、３７℃の振とう浴中で調べられた。シリカ飽和媒体は、シリカの飽和レベル（約１３０ｐｐｍ）に達するまで、非晶質ゾル－ゲル誘導シリカ片を媒体に溶解することによって調製した。ハイブリッド／複合体ハイドロゲルの大部分（シリカ）の溶解が防止された場合、Ｐ－粒子は主に拡散によってのみ放出される。
次に、拡散の結果を、マトリックスの生分解と拡散の両方が同時に発生する可能性があるシンク条件で実施された放出実験と比較した。
Ｒ２１７ベースのカプセル化されたＰ－粒子を含む連続ハイブリッド／複合体とｅＧＦＰの放出メカニズムが調べられた。
Ｐ－粒子の放出メカニズムは、シリカ飽和ＰＢＳで又は約ｐＨ７．４に緩衝されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）で、３７℃の振とう浴中で調べられた。シリカ飽和媒体は、シリカの飽和レベル（約１３０ｐｐｍ）に達するまで、非晶質ゾル－ゲル誘導シリカ片を媒体に溶解することによって調製した。ハイブリッド／複合体ハイドロゲルの大部分（シリカ）の溶解が防止された場合、Ｐ－粒子は主に拡散によってのみ放出される。
次に、拡散の結果を、マトリックスの生分解と拡散の両方が同時に発生する可能性があるシンク条件で実施された放出実験と比較した。
Ｒ２１７ベースのカプセル化されたＰ－粒子を含む連続ハイブリッド／複合体とｅＧＦＰの放出メカニズムが調べられた。
【0096】
レオロジー測定と注入実験
レオロジー測定は、モジュラーレオメーター（Anton Paar MCR 104）を使用して実施された。試料は、１ｍｌ注射器（Becton Dickinson）から２５Ｇ針（Becton Dickinson Microlance）を通しジオメトリ（２０ｍｍプレート－プレート）上に注入された。振幅スイープ測定は、一定の６．２８ｒａｄ／ｓ角周波数で０．０１～１０％のひずみ値で実施された。周波数スイープは、振幅スイープ測定によって定義された一定のひずみにおいて周波数０．０１～１００ｒａｄ／ｓで実施された。
レオロジー測定は、モジュラーレオメーター（Anton Paar MCR 104）を使用して実施された。試料は、１ｍｌ注射器（Becton Dickinson）から２５Ｇ針（Becton Dickinson Microlance）を通しジオメトリ（２０ｍｍプレート－プレート）上に注入された。振幅スイープ測定は、一定の６．２８ｒａｄ／ｓ角周波数で０．０１～１０％のひずみ値で実施された。周波数スイープは、振幅スイープ測定によって定義された一定のひずみにおいて周波数０．０１～１００ｒａｄ／ｓで実施された。
【0097】
調製したハイブリッド／複合体ハイドロゲル材料の注入性能を調べた。試験は、連続ハイブリッド／複合体及び２相ハイブリッド／複合体＃１ハイドロゲルに対して行った。
材料は、１ｍｌ注射器（BectonDickinson）から２５Ｇ針（BectonDickinsonMicrolance）を介して通常の力で注入された。ハイドロゲルのラインをプラスチック製トレイに注入し、結果を視覚的に検査した。
注入の滑らかさ、相分離の兆候、見かけの均一性、及び溶解緩衝液との適合性が記録され、評価された。
材料は、１ｍｌ注射器（BectonDickinson）から２５Ｇ針（BectonDickinsonMicrolance）を介して通常の力で注入された。ハイドロゲルのラインをプラスチック製トレイに注入し、結果を視覚的に検査した。
注入の滑らかさ、相分離の兆候、見かけの均一性、及び溶解緩衝液との適合性が記録され、評価された。
【0098】
2.4 ノロウイルスＰ－粒子の製造及び精製
Ｈｉｓタグ付きノロウイルスＰ－粒子は、Koho et al.に記載されているように、大腸菌ＢＬ２１スター細胞で生成された（Journal of Virological Methods 179(2012)1－7）。ペレット化した細菌細胞をＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ（登録商標）－Ｃ３－ホモジナイザー（AvestinInc.）で溶解バッファー（50mM NaH2PO4、600mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0）に溶解した後、細胞溶解物を１００００Ｘｇで、４℃で３０分間清澄化し、清澄化したライセートを、ニッケル荷電セファロース（Merck、HisTrap FF Crude）を使用したアフィニティー精製に使用した。精製されたＰ－粒子は、ＰＢＳに対して透析され、その後、分析及びさらなる使用のために無菌濾過された。Ｐ－粒子の濃度は、ＢＣＡアッセイ（Pierce）で測定した。
Ｈｉｓタグ付きノロウイルスＰ－粒子は、Koho et al.に記載されているように、大腸菌ＢＬ２１スター細胞で生成された（Journal of Virological Methods 179(2012)1－7）。ペレット化した細菌細胞をＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ（登録商標）－Ｃ３－ホモジナイザー（AvestinInc.）で溶解バッファー（50mM NaH2PO4、600mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0）に溶解した後、細胞溶解物を１００００Ｘｇで、４℃で３０分間清澄化し、清澄化したライセートを、ニッケル荷電セファロース（Merck、HisTrap FF Crude）を使用したアフィニティー精製に使用した。精製されたＰ－粒子は、ＰＢＳに対して透析され、その後、分析及びさらなる使用のために無菌濾過された。Ｐ－粒子の濃度は、ＢＣＡアッセイ（Pierce）で測定した。
【0099】
動的光散乱解析
Ｐ－粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）分析は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ機器（Malvern Instruments Ltd.、ウスターシャー、英国）を用いて行った。
流体力学的直径は、ＰＢＳ中、２５℃で３つの１０×１０秒のデータセットを使用して決定された。Koho et al.（Antiviral Research 104 (2014) 93－101）に記載されているように、試料を段階的な加熱にもかけた。つまり、２５℃から開始して、各サンプルを５℃ずつ昇温し、分析前に各温度で５分間平衡化した。サンプルは９０℃の最終温度まで加熱され、その後２５℃まで冷却された。連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２からＰＢＳに溶解したＰ－粒子の整合性と組成を調べるために、２５℃でＤＬＳを使用して分析した。
Ｐ－粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）分析は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ機器（Malvern Instruments Ltd.、ウスターシャー、英国）を用いて行った。
流体力学的直径は、ＰＢＳ中、２５℃で３つの１０×１０秒のデータセットを使用して決定された。Koho et al.（Antiviral Research 104 (2014) 93－101）に記載されているように、試料を段階的な加熱にもかけた。つまり、２５℃から開始して、各サンプルを５℃ずつ昇温し、分析前に各温度で５分間平衡化した。サンプルは９０℃の最終温度まで加熱され、その後２５℃まで冷却された。連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２からＰＢＳに溶解したＰ－粒子の整合性と組成を調べるために、２５℃でＤＬＳを使用して分析した。
【0100】
エンドトキシン測定
精製された抗原からエンドトキシンが除去されていることを確認するために、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒＴＭ Ｇｅｌ Ｃｌｏｔ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（GenScript）を製造元の指示に従って使用して、Ｐ－粒子のエンドトキシンレベルを測定した。
精製された抗原からエンドトキシンが除去されていることを確認するために、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒＴＭ Ｇｅｌ Ｃｌｏｔ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（GenScript）を製造元の指示に従って使用して、Ｐ－粒子のエンドトキシンレベルを測定した。
【0101】
ノロウイルスＶＬＰの製造と精製
GII.4(1999, acc. no. AF080551)、GII.4 New Orleans(NO; 2010, acc. no. GU445325)、GII.4 Sydney(Syd;2012、acc.no.AFV08795.1)、GII.12(1998、acc.no.AJ277618)、及びGII.17（2015, acc. no.BAR42289）由来のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩＩカプシッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、他の文献（Huhti et al Arch Virol 2010 155; Blazevic et al. Vaccine 2011 29; Malm et al. Clinical and vaccine immunology 2015 22）で詳細に説明されているように、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Invitrogen、Carlsbad、CA）によってＳｆ９昆虫細胞で産生され、ショ糖勾配超遠心分離により精製された。
これらのＶＬＰは、in vitro免疫原性アッセイの抗原として使用された。
GII.4(1999, acc. no. AF080551)、GII.4 New Orleans(NO; 2010, acc. no. GU445325)、GII.4 Sydney(Syd;2012、acc.no.AFV08795.1)、GII.12(1998、acc.no.AJ277618)、及びGII.17（2015, acc. no.BAR42289）由来のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩＩカプシッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、他の文献（Huhti et al Arch Virol 2010 155; Blazevic et al. Vaccine 2011 29; Malm et al. Clinical and vaccine immunology 2015 22）で詳細に説明されているように、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Invitrogen、Carlsbad、CA）によってＳｆ９昆虫細胞で産生され、ショ糖勾配超遠心分離により精製された。
これらのＶＬＰは、in vitro免疫原性アッセイの抗原として使用された。
【0102】
動物の免疫化
無菌の雌性６週齢のBALB/c OlaHsd マウス（Envigo、Horst、オランダ）を無作為に８つのグループ（Gr I-VIII、３又は５匹のマウス／実験グループ）に分け、特定の制御条件下で実験開始までの１週間順応させた。
動物は、１０μｇ用量で２回、又は２０μｇ用量で１回の無菌ＰＢＳ（Lonza、Verviers、Belgium）で希釈されたＮｏＶ Ｐ－粒子で、又は連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２又は２相ハイブリッド／複合体＃１Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２（Ａ及びＢ、表３）ハイドロゲルが処方されて免疫化された。
被験物質は、研究週０及び３週目に右脇腹への皮下（s.c.）注射（100μl容量）によって投与された。表５は、使用したワクチン製剤、注射用量、及び免疫法を示す。
対照群には、Ｒ２１７－０．２又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲル、又はＡｌ（ＯＨ）３（Alhydrogel;InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）を配合したＰ－粒子のみを投与した。免疫化は、イソフルラン(Attane vet, Vet Medic Animal Health Oy)の吸入による全身麻酔下で行った。
無菌の雌性６週齢のBALB/c OlaHsd マウス（Envigo、Horst、オランダ）を無作為に８つのグループ（Gr I-VIII、３又は５匹のマウス／実験グループ）に分け、特定の制御条件下で実験開始までの１週間順応させた。
動物は、１０μｇ用量で２回、又は２０μｇ用量で１回の無菌ＰＢＳ（Lonza、Verviers、Belgium）で希釈されたＮｏＶ Ｐ－粒子で、又は連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２又は２相ハイブリッド／複合体＃１Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２（Ａ及びＢ、表３）ハイドロゲルが処方されて免疫化された。
被験物質は、研究週０及び３週目に右脇腹への皮下（s.c.）注射（100μl容量）によって投与された。表５は、使用したワクチン製剤、注射用量、及び免疫法を示す。
対照群には、Ｒ２１７－０．２又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲル、又はＡｌ（ＯＨ）３（Alhydrogel;InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）を配合したＰ－粒子のみを投与した。免疫化は、イソフルラン(Attane vet, Vet Medic Animal Health Oy)の吸入による全身麻酔下で行った。
【0103】
血清抗体反応の動態を試験するために、研究週０（採血前、非免疫血清）及び研究週３週目に、尾から採血し、血液サンプルを採取した。
全血と糞便は屠殺時（５又は６週目）に採取され、公知の手順に従って処理された（"Norovirus VLPs and rotavirus VP6 protein as combined vaccine for childhood gastroenteritis" Blazevic et al, Vaccine Oct 19;29(45):8126-33.; "A comparison of immunogenicity of norovirus GII-4 virus-like particles and P-particles", Tamminen et al., Immunology 2012 Jan;135(1):89-99）。
実験手順は、フィンランド国立実験委員会の規則とガイドラインに従って実施された(許可番号 ESAVI/10800/04.10.07/2016)。動物の苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われた。研究期間中、動物福祉が監視された。
全血と糞便は屠殺時（５又は６週目）に採取され、公知の手順に従って処理された（"Norovirus VLPs and rotavirus VP6 protein as combined vaccine for childhood gastroenteritis" Blazevic et al, Vaccine Oct 19;29(45):8126-33.; "A comparison of immunogenicity of norovirus GII-4 virus-like particles and P-particles", Tamminen et al., Immunology 2012 Jan;135(1):89-99）。
実験手順は、フィンランド国立実験委員会の規則とガイドラインに従って実施された(許可番号 ESAVI/10800/04.10.07/2016)。動物の苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われた。研究期間中、動物福祉が監視された。
【0104】
表５に、抗原の組成、注射量及び免疫法を示す。
【0105】
【表5】
【0106】
抗原-特異的抗体反応
Ｐ－粒子に対して生じた抗体反応は、ＥＬＩＳＡによって個々のマウスの血清サンプル中のＩｇＧ及びＩｇＧサブタイプレベルを測定して決定された。採用されたＥＬＩＳＡの手順は、以前我々の研究室によって公知にされたものと類似しており(Blazevic et al. Vaccine 2011 29; Tamminen et al. Immunology. 2012 135(1):89-99)、従って、以下に手短な概略のみ示す。
ハーフエリア ポリスチレンプレート（Corning Inc.、Corning、NY）を１ウェルあたり５０ｎｇのＮｏＶ Ｐ－粒子でコーティングした。
１：２００希釈又は連続２倍希釈の血清中の抗原－特異的抗体は、ＨＲＰ結合抗マウス ＩｇＧ（Sigma-Aldrich）、ＩｇＧ１（Invitrogen）又はＩｇＧ２ａ（Invitrogen）とＳＩＧＭＡ ＦＡＳＴ ＯＰＤ基質（Sigma-Aldrich）の組み合わせで検出された。
エンドポイント力価は、カットオフ値を超えるＯＤ４９０（>0.1 OD490単位）での最高サンプル希釈の逆数として定義された。
Ｐ－粒子に対して生じた抗体反応は、ＥＬＩＳＡによって個々のマウスの血清サンプル中のＩｇＧ及びＩｇＧサブタイプレベルを測定して決定された。採用されたＥＬＩＳＡの手順は、以前我々の研究室によって公知にされたものと類似しており(Blazevic et al. Vaccine 2011 29; Tamminen et al. Immunology. 2012 135(1):89-99)、従って、以下に手短な概略のみ示す。
ハーフエリア ポリスチレンプレート（Corning Inc.、Corning、NY）を１ウェルあたり５０ｎｇのＮｏＶ Ｐ－粒子でコーティングした。
１：２００希釈又は連続２倍希釈の血清中の抗原－特異的抗体は、ＨＲＰ結合抗マウス ＩｇＧ（Sigma-Aldrich）、ＩｇＧ１（Invitrogen）又はＩｇＧ２ａ（Invitrogen）とＳＩＧＭＡ ＦＡＳＴ ＯＰＤ基質（Sigma-Aldrich）の組み合わせで検出された。
エンドポイント力価は、カットオフ値を超えるＯＤ４９０（>0.1 OD490単位）での最高サンプル希釈の逆数として定義された。
【0107】
抗体アビディティ
ＮｏＶ ＧＩＩ．４型特異的ＩｇＧ抗体のアビディティは、上記１．５に記載されたＥＬＩＳＡ法（Tamminen et al.Immunology. 2012 135(1):89-99）に従って、１：２００希釈血清中で評価したが、アビディティの低い抗体を除去するために追加の尿素処理を行った。
プレートを５０ｎｇのＮｏＶ ＧＩＩ．４ ＶＬＰでコーティングした。結果はアビディティ指数：（尿素を含むＯＤ４９０／尿素を含まないＯＤ４９０）×１００％、として表した
ＮｏＶ ＧＩＩ．４型特異的ＩｇＧ抗体のアビディティは、上記１．５に記載されたＥＬＩＳＡ法（Tamminen et al.Immunology. 2012 135(1):89-99）に従って、１：２００希釈血清中で評価したが、アビディティの低い抗体を除去するために追加の尿素処理を行った。
プレートを５０ｎｇのＮｏＶ ＧＩＩ．４ ＶＬＰでコーティングした。結果はアビディティ指数：（尿素を含むＯＤ４９０／尿素を含まないＯＤ４９０）×１００％、として表した
【0108】
交差反応性抗体
交差反応性のＮｏＶ特異的ＩｇＧ抗体は、上記のようにＥＬＩＳＡで検出された。但し、プレートは、１ウェルあたりＧＩＩ．４ ＮＯ、ＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙ、ＧＩＩ．１２、及びＧＩＩ．１７ ＶＬＰを含む５０ｎｇの異種ＮｏＶ ＶＬＰでコーティングされていた。１：２００の血清希釈をアッセイに使用した。
交差反応性のＮｏＶ特異的ＩｇＧ抗体は、上記のようにＥＬＩＳＡで検出された。但し、プレートは、１ウェルあたりＧＩＩ．４ ＮＯ、ＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙ、ＧＩＩ．１２、及びＧＩＩ．１７ ＶＬＰを含む５０ｎｇの異種ＮｏＶ ＶＬＰでコーティングされていた。１：２００の血清希釈をアッセイに使用した。
【0109】
ブロッキング抗体
ＮｏＶ ＶＬＰのＨＢＧＡ受容体への結合を防止する誘導抗体の能力は、すでに公知の手順（Malm et al. Clin Exp Immunol 2017;189(3):331－41）に従って、ＰＧＭタイプ ＩＩＩ（Sigma Chemicals）をＨＢＧＡソース(Lindesmith et al. J Virol 2012; 86:873－83)として使用するブロッキングアッセイで評価された。
すなわち、プレインキュベートしたＧＩＩ．４ ＶＬＰと段階希釈した血清の混合物を、ＰＧＭでコーティングしたマイクロウェルプレートに加えた。
結合したＶＬＰは、１．２で上述した受容体結合アッセイに従って、ヒトＮｏＶ ＧＩＩ．４抗血清及びＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧの組み合わせで検出された。結果はブロッキング指数：１００％－［（ＯＤ４９０サンプル／ＯＤ４９０最大結合）×１００％］として表した。
ＮｏＶ ＶＬＰのＨＢＧＡ受容体への結合を防止する誘導抗体の能力は、すでに公知の手順（Malm et al. Clin Exp Immunol 2017;189(3):331－41）に従って、ＰＧＭタイプ ＩＩＩ（Sigma Chemicals）をＨＢＧＡソース(Lindesmith et al. J Virol 2012; 86:873－83)として使用するブロッキングアッセイで評価された。
すなわち、プレインキュベートしたＧＩＩ．４ ＶＬＰと段階希釈した血清の混合物を、ＰＧＭでコーティングしたマイクロウェルプレートに加えた。
結合したＶＬＰは、１．２で上述した受容体結合アッセイに従って、ヒトＮｏＶ ＧＩＩ．４抗血清及びＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧの組み合わせで検出された。結果はブロッキング指数：１００％－［（ＯＤ４９０サンプル／ＯＤ４９０最大結合）×１００％］として表した。
【0110】
粘膜ＩｇＧ反応
粘膜ＩｇＧ抗体の検出のために、段階希釈した１０％糞便懸濁液を、上記１．５で説明したＥＬＩＳＡ法で検査した。プレートを５０ｎｇのＮｏＶ ＧＩＩ．４ ＶＬＰでコーティングした。
粘膜ＩｇＧ抗体の検出のために、段階希釈した１０％糞便懸濁液を、上記１．５で説明したＥＬＩＳＡ法で検査した。プレートを５０ｎｇのＮｏＶ ＧＩＩ．４ ＶＬＰでコーティングした。
【0111】
結果と考察
In vitroでの溶解及び抗原放出
抗原（Ｐ－粒子）放出速度及び異なるハイブリッド／複合体ハイドロゲルのシリカの溶解速度のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解結果を図６～８に示す。
アルミホイルバッグに入れられた注射器に入れ、室温（２５℃）で４日間及び３３０日間保管した後の、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２及び２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１の２つのバリエーション；Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａ（Ｒ２１７－０．２及びＲ４０－０．２ハイドロゲルの両方にある抗原（ＡＧ））及びＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ｂ（Ｒ４０－０．２ハイドロゲルのみにある抗原（ＡＧ））についての抗原（Ｐ－粒子）放出率を図６Ａに示す。図６Ｂは、同じ条件でのシリカの累積放出を示す。
In vitroでの溶解及び抗原放出
抗原（Ｐ－粒子）放出速度及び異なるハイブリッド／複合体ハイドロゲルのシリカの溶解速度のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解結果を図６～８に示す。
アルミホイルバッグに入れられた注射器に入れ、室温（２５℃）で４日間及び３３０日間保管した後の、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２及び２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１の２つのバリエーション；Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａ（Ｒ２１７－０．２及びＲ４０－０．２ハイドロゲルの両方にある抗原（ＡＧ））及びＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ｂ（Ｒ４０－０．２ハイドロゲルのみにある抗原（ＡＧ））についての抗原（Ｐ－粒子）放出率を図６Ａに示す。図６Ｂは、同じ条件でのシリカの累積放出を示す。
【0112】
図７は、２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃２Ｃについての、抗原（Ｐ－粒子）の累積放出とシリカの溶解を示す。
異なる時点でのシリカとＰ－粒子の放出量の重量比は、右側の第２Ｙ軸に示されている。
異なる時点でのシリカとＰ－粒子の放出量の重量比は、右側の第２Ｙ軸に示されている。
【0113】
図８は、２相ハイブリッド／複合ハイドロゲル＃２Ｄの抗原（Ｐ－粒子）の累積放出とシリカの溶解を示す。異なる時点でのシリカとＰ－粒子の放出量の重量比は、右側の第２Ｙ軸に示されている。
【0114】
カプセル化されたｅＧＦＰを含むＲ２１７－０．２の放出結果は、シリカの溶解とｅＧＦＰの放出が全く同時に起こることを示しているが、カプセル化されたｅＧＦＰの量には多少の違いがある。
１００μｌのＲ２１７－０．２中の２０μｇのｅＧＦＰの場合、最初はｅＧＦＰの放出速度とシリカの溶解速度の両方が少し遅くなるが、ほぼ同時に約１００％に達する。
１００μｌのＲ２１７－０．２中の２０μｇのｅＧＦＰの場合、最初はｅＧＦＰの放出速度とシリカの溶解速度の両方が少し遅くなるが、ほぼ同時に約１００％に達する。
【0115】
図９は、１００μｌのハイドロゲル中の１０μｇのｅＧＦＰを加えたＲ２１７－０．２のｅＧＦＰの累積放出とシリカの溶解を示す。異なる時点でのシリカとｅＧＦＰの放出量の重量比は、右側の第２Ｙ軸に示す。
【0116】
図１０は、１００μｌのハイドロゲルに２０μｇのｅＧＦＰを加えたＲ２１７－０．２のｅＧＦＰの累積放出とシリカの溶解を示す。異なる時点でのシリカとｅＧＦＰの放出量の重量比は、右側の第２Ｙ軸に示す。
【0117】
材料のカプセル化効率を調べるために、ハイドロゲル１００μｌあたり１０μｇ及び２０μｇのｅＧＦＰを含むＲ２１７－０．２からのシリカ飽和溶解媒体からのｅＧＦＰの累積放出を測定した。
図９と１０に示すように、最初の５時間でｅＧＦＰがハイドロゲルから拡散した速度はシンク条件下よりも約５０％遅かった。
放出率は２４時間後にわずかに遅くなり、１０μｇ／１００μlの材料では２５％、２０μｇ／１００μのバージョンでは３５％で横ばいになった。
図９と１０に示すように、最初の５時間でｅＧＦＰがハイドロゲルから拡散した速度はシンク条件下よりも約５０％遅かった。
放出率は２４時間後にわずかに遅くなり、１０μｇ／１００μlの材料では２５％、２０μｇ／１００μのバージョンでは３５％で横ばいになった。
【0118】
図１１は、１０μｇ／ハイドロゲル１００μｌのｅＧＦＰ濃度でのＲ２１７－０．２からのｅＧＦＰの累積拡散を示す。
【0119】
図１２は、２０μｇ／ハイドロゲル１００μｌのｅＧＦＰ濃度でのＲ２１７－０．２からのｅＧＦＰの累積拡散を示す。
【0120】
２４時間又は２５時間でのｅＧＦＰの濃度は、タンパク質のストック濃度の０．５％未満であるため、飽和に関して、ｅＧＦＰが、それ自体の放出を妨げる可能性は低い。
さらに、拡散測定中、サンプル量が１０μｇ／１００μｌの場合、ｅＧＦＰの放出速度は２４時間後にプラトーに達し、ある程度安定したままであるが、２０μｇ／１００μｌのバージョンでも同様に観察され、それはまだ安定しているようにみえる。
シンク内の溶解との比較すると、いくらかの拡散が発生する一方で、材料の分解が起こらない限り、全ｅＧＦＰペイロードが効果的に放出されないことを示唆している。
さらに、拡散測定中、サンプル量が１０μｇ／１００μｌの場合、ｅＧＦＰの放出速度は２４時間後にプラトーに達し、ある程度安定したままであるが、２０μｇ／１００μｌのバージョンでも同様に観察され、それはまだ安定しているようにみえる。
シンク内の溶解との比較すると、いくらかの拡散が発生する一方で、材料の分解が起こらない限り、全ｅＧＦＰペイロードが効果的に放出されないことを示唆している。
【0121】
レオロジー
図１３は、室温（２５℃）でアルミホイルバッグに囲まれた注射器に保管した後４日目及び２８日目の、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２について及び２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（R217-0.2/R40-0.2）についての減衰係数（G'’/G'）を示す。
図１３は、室温（２５℃）でアルミホイルバッグに囲まれた注射器に保管した後４日目及び２８日目の、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２について及び２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（R217-0.2/R40-0.2）についての減衰係数（G'’/G'）を示す。
【0122】
図１４は、室温（２５℃）で保管後３６０日目の連続ハイブリッド／複合ハイドロゲルＲ２１７－０．２及び２相ハイブリッド／複合ハイドロゲル＃１（R217-0.2/R40-0.2）についての減衰係数（G''/G'）を示す。注射器は、アルミホイルバッグに隔離されている。
サンプルは、最初のステップが周波数スイープ、続いて回転測定（せん断速度ランプ：shear rate ramp 1-100 1/s）、及び、再び周波数スイープ測定の３部構成の測定を受けた。
サンプルは、最初のステップが周波数スイープ、続いて回転測定（せん断速度ランプ：shear rate ramp 1-100 1/s）、及び、再び周波数スイープ測定の３部構成の測定を受けた。
【0123】
図１５は、室温（２５℃）で保存後４日目の連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２及び２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１（R217-0.2/R40-0.2）の動的粘度を示す。
【0124】
図１６は、室温で密封されたアルミホイルバッグに保管した後３６０日目の連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２及び２相ハイブリッド／複合体＃１（R217-0.2/R40-0.2）の動的粘度を示す。
【0125】
レオロジー測定は、調査されたハイブリッド／複合体ハイドロゲルが、２５℃のアルミホイルバッグに入れられた注射器で２８日間保管した後でも、レオロジー特性を非常によく保持することを示している。
減衰係数（損失正接又は損失係数とも呼ばれる）は、損失弾性率と貯蔵弾性率（G''/G'）の比率であり、静止時（例：注射器内）のハイブリッド／複合ハイドロゲルの粘弾性特性を示す。
減衰係数の結果は、ハイドロゲルが保管中にその構造を保持し、２５℃で２８日間保管した後も特性に大きな変化がないことを示している（図１３）。
動的粘度（図１６）は注射器からの注入をシミュレートしており、調査したどちらのハイドロゲルも、２５℃で４日間保存した後、明らかにシアシニングしていた。特性は１年間で比較的変化していない（図１４及び１７）。
違いは、主に動的粘度で発生する。全体として、小さなせん断速度での最小粘度は大幅に低下し、材料がシアシニングする速度はＤ４及びＤ２８のケースと比較して遅くなる。全体的な動作は変化せず、この材料は、保管中にそのレオロジー特性を保持することができた。
減衰係数（損失正接又は損失係数とも呼ばれる）は、損失弾性率と貯蔵弾性率（G''/G'）の比率であり、静止時（例：注射器内）のハイブリッド／複合ハイドロゲルの粘弾性特性を示す。
減衰係数の結果は、ハイドロゲルが保管中にその構造を保持し、２５℃で２８日間保管した後も特性に大きな変化がないことを示している（図１３）。
動的粘度（図１６）は注射器からの注入をシミュレートしており、調査したどちらのハイドロゲルも、２５℃で４日間保存した後、明らかにシアシニングしていた。特性は１年間で比較的変化していない（図１４及び１７）。
違いは、主に動的粘度で発生する。全体として、小さなせん断速度での最小粘度は大幅に低下し、材料がシアシニングする速度はＤ４及びＤ２８のケースと比較して遅くなる。全体的な動作は変化せず、この材料は、保管中にそのレオロジー特性を保持することができた。
【0126】
注入性
レオロジー測定に加えて、ハイブリッド／複合体ハイドロゲルの注入性と安定性が、１ｍｌ注射器から２５Ｇ針を通して材料を注入することによって評価された。
注入性又は相分離の可能性の評価は、室温（２５℃）でアルミホイルバッグに入れられたシリンジ中で保存された後４、２８、１８０、及び３３０日後の、Ｐ－粒子 Ｒ２１７－０．２（ＡＧ）が埋め込まれた連続ハイブリッド／複合ハイドロゲル、及び、Ｐ－粒子 Ｒ２１７－０．２（ＡＧ）及びＰ－粒子（Ｒ２１７－０．２－Ｒ４０－０．２（ＡＧ）及びＲ２１７－０．２（ＡＧ）－Ｒ４０－０．２（ＡＧ））が埋め込まれた２つのバリエーションの２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１を０から５の基準に従って評価した（表６）。注入の滑らかさの基準は次のように定義される。
５＝非常に滑らか、４＝ほとんど滑らか、３＝かなり滑らか、２＝部分的に滑らか、１＝不均一、まったく滑らかではない、０＝注入できない。
相分離の基準は次のように定義される。
５＝相分離なし、４＝最小限の相分離、３＝相分離はあるが注入後は可逆、２＝相分離、注入後は不可逆、１＝明らかな相分離、０＝まったくゲルではない。
レオロジー測定に加えて、ハイブリッド／複合体ハイドロゲルの注入性と安定性が、１ｍｌ注射器から２５Ｇ針を通して材料を注入することによって評価された。
注入性又は相分離の可能性の評価は、室温（２５℃）でアルミホイルバッグに入れられたシリンジ中で保存された後４、２８、１８０、及び３３０日後の、Ｐ－粒子 Ｒ２１７－０．２（ＡＧ）が埋め込まれた連続ハイブリッド／複合ハイドロゲル、及び、Ｐ－粒子 Ｒ２１７－０．２（ＡＧ）及びＰ－粒子（Ｒ２１７－０．２－Ｒ４０－０．２（ＡＧ）及びＲ２１７－０．２（ＡＧ）－Ｒ４０－０．２（ＡＧ））が埋め込まれた２つのバリエーションの２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１を０から５の基準に従って評価した（表６）。注入の滑らかさの基準は次のように定義される。
５＝非常に滑らか、４＝ほとんど滑らか、３＝かなり滑らか、２＝部分的に滑らか、１＝不均一、まったく滑らかではない、０＝注入できない。
相分離の基準は次のように定義される。
５＝相分離なし、４＝最小限の相分離、３＝相分離はあるが注入後は可逆、２＝相分離、注入後は不可逆、１＝明らかな相分離、０＝まったくゲルではない。
【0127】
表６は、２５℃で保存した後のさまざまな時点での注入の滑らかさと相分離に関する注入実験を示す。スコアは３回の反復注入の平均である。
【0128】
【表6】
【0129】
注入実験は、４日目に観察された滑らかさは保存中に変化しないことを示しており、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルと２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１の間で観察された小さな変化は、構造の違い、つまり２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１の両バージョンに存在する個別のゲル粒子に由来する。
それらはすべて注入可能であるが、結果は、連続相と分散相の両方にカプセル化されたＰ－粒子を含むＲ２１７－０．２（ＡＧ）－Ｒ４０－０．２（ＡＧ）は本質的にやや不均一であるが、それでも注入可能であることを示唆している。
カプセル化された抗原の量は非常に少ないため、それがそのような影響を与える可能性は低く、むしろ調製プロセスのわずかな違い（Ｒ２１７－０．２でのＰ－粒子の追加）であって、それらは、厳密な準備プロセスの制御の必要性を強調する。
観察された最小又は公正な相分離は、注入を開始するときに最初に出てくる少量の水、又は注入に関連するハイドロゲルの塊の観察に関連している。しかしながら、ゲルの塊は、注入後に再び統合されたハイドロゲルの成形体を形成する。
それらはすべて注入可能であるが、結果は、連続相と分散相の両方にカプセル化されたＰ－粒子を含むＲ２１７－０．２（ＡＧ）－Ｒ４０－０．２（ＡＧ）は本質的にやや不均一であるが、それでも注入可能であることを示唆している。
カプセル化された抗原の量は非常に少ないため、それがそのような影響を与える可能性は低く、むしろ調製プロセスのわずかな違い（Ｒ２１７－０．２でのＰ－粒子の追加）であって、それらは、厳密な準備プロセスの制御の必要性を強調する。
観察された最小又は公正な相分離は、注入を開始するときに最初に出てくる少量の水、又は注入に関連するハイドロゲルの塊の観察に関連している。しかしながら、ゲルの塊は、注入後に再び統合されたハイドロゲルの成形体を形成する。
【0130】
Ｐ－粒子の高温溶液中での凝集体形成
以前に示したように（Journal of Virological Methods 179 (2012) 1－7）、ノロウイルスＰ－粒子は、ＤＬＳで分析すると、溶液中でおよそ１５～１７ｎｍの直径を持つ（図示せず）。
Ｐ－粒子の熱安定性を調べるために、最初に、溶液中でそれらが凝集する温度を決定した。この分析によると、急激な温度誘起凝集が５０℃を超える温度で発生し、すべてのＰ－粒子が５５℃で３００～８３０ｎｍの範囲の凝集体を形成することがわかった（図１７）。
これらの結果に基づいて、次の温度を使用して長期保存及び溶解実験を行った：ＲＴ、３７℃、及び５０℃。
以前に示したように（Journal of Virological Methods 179 (2012) 1－7）、ノロウイルスＰ－粒子は、ＤＬＳで分析すると、溶液中でおよそ１５～１７ｎｍの直径を持つ（図示せず）。
Ｐ－粒子の熱安定性を調べるために、最初に、溶液中でそれらが凝集する温度を決定した。この分析によると、急激な温度誘起凝集が５０℃を超える温度で発生し、すべてのＰ－粒子が５５℃で３００～８３０ｎｍの範囲の凝集体を形成することがわかった（図１７）。
これらの結果に基づいて、次の温度を使用して長期保存及び溶解実験を行った：ＲＴ、３７℃、及び５０℃。
【0131】
図１７は、ＤＬＳで測定されたＰ－粒子の熱安定性を示す。図１７Ａでは、異なる温度での１６ｎｍ粒子の割合を示し、図１７Ｂでは、５０℃と５５℃で測定したＰ－粒子の体積分布の差を示す。図１７Ａ及び１７Ｂはいずれも、３回の個別の測定の平均を示す。
【0132】
溶解後の粒子の整合性
ハイドロゲルから溶解した粒子の整合性をＤＬＳで調べた。２８週間のフォローアップ中、室温に保たれたハイドロゲルから放出された実質的にすべての粒子は予想されるサイズのままであり、３７℃に保たれたハイドロゲルから放出された粒子は１９週間まで予想された半径１５～１７ｎｍの範囲であった（図１８）。
ＲＴで保存された溶液中の対照サンプルは無傷のままであったが、３７℃で保存されたものは６週間後に破壊され始め、１６週間以内に完全に破壊された。さらに、５０℃に保たれたハイドロゲルと溶液サンプルの両方はそれぞれ４週間又は２週間以内に破壊された。
ハイドロゲルから溶解した粒子の整合性をＤＬＳで調べた。２８週間のフォローアップ中、室温に保たれたハイドロゲルから放出された実質的にすべての粒子は予想されるサイズのままであり、３７℃に保たれたハイドロゲルから放出された粒子は１９週間まで予想された半径１５～１７ｎｍの範囲であった（図１８）。
ＲＴで保存された溶液中の対照サンプルは無傷のままであったが、３７℃で保存されたものは６週間後に破壊され始め、１６週間以内に完全に破壊された。さらに、５０℃に保たれたハイドロゲルと溶液サンプルの両方はそれぞれ４週間又は２週間以内に破壊された。
【0133】
図１８は、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２（図１８Ａ）から、又はＤＬＳで決定された温度を示す溶液中に保たれた対照粒子（図１８Ｂ）から放出されたＰ－粒子の１６ｎｍ集合体の総体積を示す。
【0134】
ＴＥＭ画像
透過型電子顕微鏡画像は、ハイドロゲルが３７℃において、溶液中で同じ温度に保たれた対照粒子よりも長くＰ－粒子を保護することを示す。
透過型電子顕微鏡画像は、ハイドロゲルが３７℃において、溶液中で同じ温度に保たれた対照粒子よりも長くＰ－粒子を保護することを示す。
【0135】
ＴＥＭは、対照Ｐ－粒子が典型的な形状を持ち、約１７～２０ｎｍの予想されるサイズであることを示している（図１９、上のパネル）。
Ｐ－粒子は、溶液中で２０週間、ＲＴで安定した状態を保つ（図１９、左下パネル）が、溶液中で３７℃、１２週間保持すると消失するようである（図１９、中央パネル）。ＲＴ及び３７℃で保存した後にハイドロゲルから溶解したＰ－粒子は、１９週間後も無傷のようである（図１９、中央下パネル）。
Ｐ－粒子は、溶液中で２０週間、ＲＴで安定した状態を保つ（図１９、左下パネル）が、溶液中で３７℃、１２週間保持すると消失するようである（図１９、中央パネル）。ＲＴ及び３７℃で保存した後にハイドロゲルから溶解したＰ－粒子は、１９週間後も無傷のようである（図１９、中央下パネル）。
【0136】
エンドトキシンレベル
エンドトキシンレベルを決定して、抗原からのエンドトキシンの除去を確認した。抗原には細菌性エンドトキシンが含まれていなかったため（<0.012EU/10μgタンパク質）、精製されたＰ－粒子には残留不純物は検出されなかった。
エンドトキシンレベルを決定して、抗原からのエンドトキシンの除去を確認した。抗原には細菌性エンドトキシンが含まれていなかったため（<0.012EU/10μgタンパク質）、精製されたＰ－粒子には残留不純物は検出されなかった。
【0137】
血清ＩｇＧ抗体の発生
本ハイドロゲルがアジュバント／デリバリシステムとして機能する可能性を調べるために、マウスを２回の１０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又は連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルに埋め込んで、又は、１回の２０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又は、２相ハイブリッド／複合体＃１Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルに埋め込んで、免疫化した。
比較のため、実験グループの１つにＡｌ（ＯＨ）３を配合したＰ－粒子を投与した。図２０は、研究週０、３及び５又は６週でのＰ－粒子に対する血清ＩｇＧ抗体の発生を示す。
結果によると、Ｐ－粒子の1回の投与による免疫は、抗原がＲ２１７－０．２ハイドロゲル又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａハイドロゲル（２５ｗｔ－％、Ｒ２１７－０．２中の抗原）との共投与である場合には、非常に強力な免疫反応のみを誘発した。
これは、単独免疫後３週目の抗体反応の増加が、Ｒ４０－０．２ではなくＲ２１７－０．２成分に由来することを示す。Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルを含むＰ－粒子の２回目の投与は、すでに誘導された反応を著しく上昇させた。
本ハイドロゲルがアジュバント／デリバリシステムとして機能する可能性を調べるために、マウスを２回の１０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又は連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルに埋め込んで、又は、１回の２０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又は、２相ハイブリッド／複合体＃１Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルに埋め込んで、免疫化した。
比較のため、実験グループの１つにＡｌ（ＯＨ）３を配合したＰ－粒子を投与した。図２０は、研究週０、３及び５又は６週でのＰ－粒子に対する血清ＩｇＧ抗体の発生を示す。
結果によると、Ｐ－粒子の1回の投与による免疫は、抗原がＲ２１７－０．２ハイドロゲル又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａハイドロゲル（２５ｗｔ－％、Ｒ２１７－０．２中の抗原）との共投与である場合には、非常に強力な免疫反応のみを誘発した。
これは、単独免疫後３週目の抗体反応の増加が、Ｒ４０－０．２ではなくＲ２１７－０．２成分に由来することを示す。Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルを含むＰ－粒子の２回目の投与は、すでに誘導された反応を著しく上昇させた。
【0138】
図２０は、２回の１０μｇ用量のＰ－粒子（pp）単独で、又はＲ２１７－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２０Ａ）、又は１回の２０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルと処方されて免疫化された後のマウスにおける血清ＩｇＧ抗体の動態を示す（図２０Ｂ）。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。
示された研究週における尾の血液サンプルと最終血清のグループ平均ＯＤ値が示されている。免疫ポイントは矢印で示す。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。
示された研究週における尾の血液サンプルと最終血清のグループ平均ＯＤ値が示されている。免疫ポイントは矢印で示す。
【0139】
さらに、幾何平均力価は、Ｒ２１７－０．２又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａハイドロゲル（Ｒ２１７－０．２中、２５重量％の抗原）を含むＰ－粒子、を投与されたマウスのグループでかなり高く（逆数力価>4.2log10）、同時投与によりＰ－粒子単独で観察されたレベルより１８倍又は１０倍高いレベルが得られた（図２１）。
これは、Ｒ２１７－０．２が抗原特異的ＩｇＧ反応の大きさを増加させることを示している。しかし、Ｐ－粒子に対するＲ２１７－０．２の観察された効果は、Ａｌ（ＯＨ）３ハイドロゲルの効果と同様である（図２１及び２２）。ネガティブコントロールマウスは、Ｐ－粒子に対して反応がなかった。
これは、Ｒ２１７－０．２が抗原特異的ＩｇＧ反応の大きさを増加させることを示している。しかし、Ｐ－粒子に対するＲ２１７－０．２の観察された効果は、Ａｌ（ＯＨ）３ハイドロゲルの効果と同様である（図２１及び２２）。ネガティブコントロールマウスは、Ｐ－粒子に対して反応がなかった。
【0140】
図２１Ａ及び２１Ｂは、２回の１０μｇ用量のＰ粒子（ｐｐ）を単独で、又はＲ２１７－０．２ハイドロゲルを処方されて（図２１Ａ）、又は１回の２０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルを処方されて（図２１Ｂ）免疫化されたマウスにおける血清ＩｇＧの終点滴定を示す。対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。示されているのはグループの平均ＯＤである。
【0141】
血清抗原特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブタイプ
抗原特異的ＩｇＧサブタイプ、ＩｇＧ１（Ｔｈ２反応の特質）及びＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１反応の特質）は、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２又はＡｌ（ＯＨ）３で処方されたＰ－粒子のみが、混合免疫反応、すなわちＴｈ２型及びＴｈ１型を誘導することが分析によって示された（図２２及び２３）。
各Ｐ－粒子製剤がＴｈ２免疫反応を誘発したにもかかわらず、Ｐ－粒子と、Ｒ２１７－０．２、又は２相ハイブリッド／複合体＃１Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａハイドロゲル（Ｒ２１７－０．２中の２５質量％の抗原）、又はＡｌ（ＯＨ）３との共投与は、Ｐ粒子のみの投与と比較して、より高いレベルのＩｇＧ１を生成した（図２２）。
むしろ、Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３と同時投与されたＰ－粒子によってのみ、中程度のＴｈ１免疫反応が誘導された（図２３）。
これらの結果は、Ｒ２１７－０．２が免疫反応の質を改善し、好ましくは、Ａｌ（ＯＨ）３と同様のＴｈ２アジュバントとして機能することを示唆している。
抗原特異的ＩｇＧサブタイプ、ＩｇＧ１（Ｔｈ２反応の特質）及びＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１反応の特質）は、連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２又はＡｌ（ＯＨ）３で処方されたＰ－粒子のみが、混合免疫反応、すなわちＴｈ２型及びＴｈ１型を誘導することが分析によって示された（図２２及び２３）。
各Ｐ－粒子製剤がＴｈ２免疫反応を誘発したにもかかわらず、Ｐ－粒子と、Ｒ２１７－０．２、又は２相ハイブリッド／複合体＃１Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａハイドロゲル（Ｒ２１７－０．２中の２５質量％の抗原）、又はＡｌ（ＯＨ）３との共投与は、Ｐ粒子のみの投与と比較して、より高いレベルのＩｇＧ１を生成した（図２２）。
むしろ、Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３と同時投与されたＰ－粒子によってのみ、中程度のＴｈ１免疫反応が誘導された（図２３）。
これらの結果は、Ｒ２１７－０．２が免疫反応の質を改善し、好ましくは、Ａｌ（ＯＨ）３と同様のＴｈ２アジュバントとして機能することを示唆している。
【0142】
図２２は、２回の１０μｇ用量のＰ－粒子（ｐｐ）を単独で、又はＲ２１７－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２２Ａ）、又は１回の２０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２２Ｂ）免疫化された後のマウスにおける血清ＩｇＧ１の終点滴定を示す。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。示されているのは、グループの平均ＯＤである。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。示されているのは、グループの平均ＯＤである。
【0143】
図２３は、２回の１０μｇ用量のＰ－粒子（pp）を単独で、又はＲ２１７－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２３Ａ）、又は、１回の２０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又は、Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２３Ｂ）、免疫化後のマウスにおける血清ＩｇＧ２ａの終点滴定を示す。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。示されているのはグループの平均ＯＤである。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。示されているのはグループの平均ＯＤである。
【0144】
抗体アビディティ
抗ＧＩＩ．４ ＩｇＧ抗体のアビディティに関する個々の免疫血清の評価（図２４）は、Ｐ－粒子単独での免疫化は、Ｐ－粒子と連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２、又は２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａハイドロゲル（Ｒ２１７－０．２中、２５重量％の抗原）の組み合わせで誘導された抗体と比較して（アビディティ指数＞６０％）、かなり低いアビディティを持つ抗体（アビディティ指数＜１０％）を誘導したことを示した。
略同じレベルが、Ａｌ（ＯＨ）３を配合したＰ－粒子によって誘発された。この分析によるとＲ２１７－０．２は抗体の親和性を向上させる。
抗ＧＩＩ．４ ＩｇＧ抗体のアビディティに関する個々の免疫血清の評価（図２４）は、Ｐ－粒子単独での免疫化は、Ｐ－粒子と連続ハイブリッド／複合体ハイドロゲルＲ２１７－０．２、又は２相ハイブリッド／複合体ハイドロゲル＃１Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａハイドロゲル（Ｒ２１７－０．２中、２５重量％の抗原）の組み合わせで誘導された抗体と比較して（アビディティ指数＞６０％）、かなり低いアビディティを持つ抗体（アビディティ指数＜１０％）を誘導したことを示した。
略同じレベルが、Ａｌ（ＯＨ）３を配合したＰ－粒子によって誘発された。この分析によるとＲ２１７－０．２は抗体の親和性を向上させる。
【0145】
図２４は、２回の１０μｇ用量のＰ-粒子（ｐｐ）を単独で、又はＲ２１７－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２４Ａ）、又は１回の２０μｇ用量のＰ-粒子単独で、又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－２０ハイドロゲルと処方されて（図２４Ｂ）免疫化されたマウスにおける血清ＩｇＧ抗体のアビディティを示す。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。グループの平均アビディティ指数（％）が示される。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。グループの平均アビディティ指数（％）が示される。
【0146】
交差反応性血清ＩｇＧ反応
血清抗体の交差反応性は、遺伝子群ＩＩ由来の４つの異種ＮｏＶ ＶＬＰ（GII.4 NO、GII.4 Sydney、GII.12、及びGII.17）に対して測定された。
Ｐ－粒子単独での免疫後に交差反応性ＩｇＧ抗体は検出されなかったが、Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３を含む製剤では、かなり広い交差反応性を持つ抗体が得られた（図２５）。
結果は、交差反応性抗体反応の増加はＲ２１７－０．２に由来するが、Ｒ４０－０．２に由来しないことを示唆している。
血清抗体の交差反応性は、遺伝子群ＩＩ由来の４つの異種ＮｏＶ ＶＬＰ（GII.4 NO、GII.4 Sydney、GII.12、及びGII.17）に対して測定された。
Ｐ－粒子単独での免疫後に交差反応性ＩｇＧ抗体は検出されなかったが、Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３を含む製剤では、かなり広い交差反応性を持つ抗体が得られた（図２５）。
結果は、交差反応性抗体反応の増加はＲ２１７－０．２に由来するが、Ｒ４０－０．２に由来しないことを示唆している。
【0147】
図２５は、２回の１０μｇ用量のＰ－粒子（ｐｐ）単独で、又は連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２５Ａ）、又は１回の２０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又は２相ハイブリッド／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２５Ｂ）免疫化されたマウスにおける、異種ＮｏＶ ＶＬＰに対する交差反応性血清ＩｇＧ反応を示す。対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。示されているのはグループの平均ＯＤである。
【0148】
中和抗体
誘導された抗体の中和能力は、ＰＧＭベースのブロッキングアッセイを使用して、相同なＧＩＩ．４ ＶＬＰに対するブロッキング活性を測定することで調べられた。
１０μｇ用量のＰ粒子製剤又は２０μｇ用量の２相ハイブリッド／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａ（Ｒ２１７－０．２中、２５重量％の抗原）で処方されたもの、を受けた実験群は、検出可能なブロッキングアビリティを持つ抗体を生成し、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３と抗原の共投与（図２６）で活性を有意に上昇させた。
Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３を配合したＰ－粒子のみが、ＶＬＰ結合を５０％以上ブロックできる抗体を誘導した。分析に基づくと、ブロッキング抗体の大幅な増加は、Ｒ２１７－０．２とＡｌ（ＯＨ）３を含む処方に由来する。
誘導された抗体の中和能力は、ＰＧＭベースのブロッキングアッセイを使用して、相同なＧＩＩ．４ ＶＬＰに対するブロッキング活性を測定することで調べられた。
１０μｇ用量のＰ粒子製剤又は２０μｇ用量の２相ハイブリッド／複合体＃１ Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２Ａ（Ｒ２１７－０．２中、２５重量％の抗原）で処方されたもの、を受けた実験群は、検出可能なブロッキングアビリティを持つ抗体を生成し、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３と抗原の共投与（図２６）で活性を有意に上昇させた。
Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３を配合したＰ－粒子のみが、ＶＬＰ結合を５０％以上ブロックできる抗体を誘導した。分析に基づくと、ブロッキング抗体の大幅な増加は、Ｒ２１７－０．２とＡｌ（ＯＨ）３を含む処方に由来する。
【0149】
図２６は、２回の１０μｇ用量のＰ－粒子（ｐｐ）単独で又はＲ２１７－０．２ハイドロゲルと共に処方されて（図２６Ａ）、又は１回の２０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又はＲ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルと共に処方されて（図２６Ｂ）免疫化されたマウスの血清抗体によるＨＢＧＡ受容体へのＧＩＩ．４ ＶＬＰ結合の相同遮断を示す。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。表示されているのはグループの平均ブロッキングインデックス（％）である。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。表示されているのはグループの平均ブロッキングインデックス（％）である。
【0150】
粘膜抗体
粘膜抗体分析は、Ｐ－粒子のみによる免疫化は糞便抗体のレベルが非常に低い（又は陰性である）ことを示したが、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３による抗原の処方は粘膜抗体の規模を増加させた（図２７）。
粘膜抗体分析は、Ｐ－粒子のみによる免疫化は糞便抗体のレベルが非常に低い（又は陰性である）ことを示したが、連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲル又はＡｌ（ＯＨ）３による抗原の処方は粘膜抗体の規模を増加させた（図２７）。
【0151】
図２７は、２回の１０μｇ用量のＰ－粒子（ｐｐ）を単独で又はＲ２１７－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２７Ａ）、又は１回の２０μｇ用量のＰ－粒子単独で、又は２相ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２／Ｒ４０－０．２ハイドロゲルと処方されて（図２７Ｂ）免疫化されたマウスにおける糞便ＩｇＧ抗体の終点滴定を示す。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。
表示されているのはグループの平均ブロッキングインデックス（％）である。表示されているのはグループの平均ＯＤである。
対照マウスには、Ａｌ（ＯＨ）３を含むＰ－粒子又は抗原を含まないハイドロゲルを投与した。
表示されているのはグループの平均ブロッキングインデックス（％）である。表示されているのはグループの平均ＯＤである。
【0152】
結論
連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルは、血清及び粘膜免疫反応の大きさを増加させるための、及び、抗体アビディティ、交差反応性、中和抗体の観点から免疫反応の質と機能を改善するための、アジュバントとして機能する。
連続ハイブリッド／複合体Ｒ２１７－０．２ハイドロゲルは、血清及び粘膜免疫反応の大きさを増加させるための、及び、抗体アビディティ、交差反応性、中和抗体の観点から免疫反応の質と機能を改善するための、アジュバントとして機能する。
【0153】
Ｒ２１７－０．２の観察されたアジュバント効果は、Ａｌ（ＯＨ）３ハイドロゲルの効果に匹敵する。ハイドロゲルから放出されたタンパク質は、ＤＬＳによるとオリジナルのＰ－粒子に似ている。さらに、ＤＬＳによると、Ｐ－粒子は５５℃以上の温度で凝集する。
【0154】
また、１６ｎｍ粒子は、室温及び３７℃での保存後にハイドロゲルから放出される可能性があるが、５０℃での保存後では放出されず、及び、放出された粒子の濃度は時間の経過とともに減少するようであることも示された。
溶液中の保存と比較して、本ハイドロゲルは、保存期間が５週間を超えた後、３７℃で１５ｎｍ粒子の割合が増加しているように見え、ハイドロゲル中のＰ－粒子の安定化が示唆される。
溶液中の保存と比較して、本ハイドロゲルは、保存期間が５週間を超えた後、３７℃で１５ｎｍ粒子の割合が増加しているように見え、ハイドロゲル中のＰ－粒子の安定化が示唆される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】
【図23A】
【図23B】
【図24A】
【図24B】
【図25A】
【図25B】
【図26A】
【図26B】
【図27A】
【図27B】
【国際調査報告】