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特表2023-544194ＰＥＴａｓｅ酵素の活性及び耐熱性を向上させるための変異
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-20
(54)【発明の名称】ＰＥＴａｓｅ酵素の活性及び耐熱性を向上させるための変異
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20231013BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231013BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20231013BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231013BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231013BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231013BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231013BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55 ZNA
C12N15/63 Z
C12N9/14
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521049
(86)(22)【出願日】2021-10-05
(85)【翻訳文提出日】2023-05-29
(86)【国際出願番号】 US2021053530
(87)【国際公開番号】W WO2022076380
(87)【国際公開日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】63/088,321
(32)【優先日】2020-10-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500039463
【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ，ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ
【住所又は居所原語表記】２１０ Ｗｅｓｔ ７ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ ７８７０１ Ｕ．Ｓ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ルー ホンユアン
(72)【発明者】
【氏名】ディアス ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】コール ハンナ
(72)【発明者】
【氏名】シュロフ ラガブ
(72)【発明者】
【氏名】エリントン アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】アルパー ハル
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01Y
4B065AA44X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA31
4B065CA55
(57)【要約】
ある範囲の温度及びｐＨにわたって活性を有するＰＥＴヒドロラーゼが提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＮ２３３、Ｓ５８、Ｎ１１４、Ｓ１２１、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、Ｔ１４０、Ｓ６１、Ｉ２０８、及びＲ２２４からなる群から選択される、配列番号１に対する位置
に対応する少なくとも１つの変異を有する、
操作されたＰＥＴ（ポリ（エチレンテレフタレート））ヒドロラーゼ。
【請求項2】
前記少なくとも１つの変異が、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される、請求項１に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
【請求項3】
前記少なくとも１つの変異が、Ｓ５８Ｙ、Ｓ５８Ｍ、Ｓ５８Ｌ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｐ、Ｓ６１Ｄ、Ｓ６１Ｅ、Ｓ６１Ｙ、Ｓ６１Ｆ、Ｎ１１４Ｈ、Ｎ１１４Ｌ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１４Ｓ、Ｎ１１４Ｔ、Ｔ１４０Ｙ、Ｔ１４０Ｌ、Ｔ１４０Ｉ、Ｔ１４０Ｖ、Ｔ１４０Ｓ、Ｉ２０８Ｍ、Ｉ２０８Ｈ、Ｉ２０８Ｆ、Ｉ２０８Ｙ、Ｉ２０８Ｐ、Ｉ２０８Ａ、Ｒ２２４Ｄ、Ｒ２２４Ｅ、Ｒ２２４Ｓ、Ｒ２２４Ｔ、Ｒ２２４Ｎ、Ｒ２２４Ｑ、Ｎ２２５Ｎ、Ｎ２２５Ｉ、Ｎ２２５Ｖ、Ｎ２２５Ｍ、Ｎ２２５Ａ、Ｎ２２５Ｌ、Ｎ２２５Ｓ、Ｎ２２５Ｔ、Ｎ２３３Ｒ、Ｎ２３３Ｙ、Ｎ２３３Ｈ、Ｎ２３３Ｐ、Ｍ２６２Ｌ、Ｍ２６２Ｉ、Ｍ２６２Ａ、Ｍ２６２Ｖ、Ｍ２６２Ｆ、Ｍ２６２Ｗ、Ｔ２７０Ｙ、Ｔ２７０Ｒ、及びＴ２７０Ｈからなる群から選択される、請求項１に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
【請求項4】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、２又は３と少なくとも９５％、９８％、又は９９％同一である、請求項１又は２又は３に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
【請求項5】
前記アミノ酸配列が、前記少なくとも１つの変異を除いて、配列番号１、２又は３と同一である、請求項１又は２又は３に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
【請求項6】
前記アミノ酸配列が、配列番号６～３４のうちの１つ以上と少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％同一である、請求項１又は２又は３に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
【請求項7】
前記アミノ酸配列が、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される、配列番号１に対する位置に対応する少なくとも２つの変異を有する、請求項１又は４のいずれか一項に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
【請求項8】
前記アミノ酸配列が、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、Ｒ２２４Ｑ、Ｓ５８Ｙ、Ｓ５８Ｍ、Ｓ５８Ｌ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｐ、Ｓ６１Ｄ、Ｓ６１Ｅ、Ｓ６１Ｙ、Ｓ６１Ｆ、Ｎ１１４Ｈ、Ｎ１１４Ｌ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１４Ｓ、Ｎ１１４Ｔ、Ｔ１４０Ｙ、Ｔ１４０Ｌ、Ｔ１４０Ｉ、Ｔ１４０Ｖ、Ｔ１４０Ｓ、Ｓ１２１Ｅ、Ｉ２０８Ｍ、Ｉ２０８Ｈ、Ｉ２０８Ｆ、Ｉ２０８Ｙ、Ｉ２０８Ｐ、Ｉ２０８Ａ、Ｒ２２４Ｄ、Ｒ２２４Ｅ、Ｒ２２４Ｓ、Ｒ２２４Ｔ、Ｒ２２４Ｎ、Ｒ２２４Ｑ、Ｎ２２５Ｎ、Ｎ２２５Ｉ、Ｎ２２５Ｖ、Ｎ２２５Ｍ、Ｎ２２５Ａ、Ｎ２２５Ｌ、Ｎ２２５Ｓ、Ｎ２２５Ｔ、Ｎ２３３Ｒ、Ｎ２３３Ｙ、Ｎ２３３Ｈ、Ｎ２３３Ｐ、Ｍ２６２Ｌ、Ｍ２６２Ｉ、Ｍ２６２Ａ、Ｍ２６２Ｖ、Ｍ２６２Ｆ、Ｍ２６２Ｗ、Ｔ２７０Ｙ、Ｔ２７０Ｒ、及びＴ２７０Ｈからなる群から選択される、配列番号１に対する位置に対応する２つ又は３つの変異を有する、請求項１又は４のいずれか一項に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項10】
前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼが、シグナルペプチドを更に含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
請求項９～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターであって、それにより、前記プロモーターが、前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼの発現を制御する、ベクター。
【請求項12】
請求項９～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項13】
微生物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項14】
細菌細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項15】
前記細菌細胞がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である、請求項に記載の宿主細胞。
【請求項16】
真菌細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項17】
ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）を分解する方法であって、ＰＥＴを、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼと、前記ＰＥＴを分解する条件下で接触させることを含む、方法。
【請求項18】
前記ＰＥＴを、前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼを発現及び分泌する宿主細胞と接触させることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼが精製されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記条件が、２５～７０℃の温度におけるインキュベーションを含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記温度が、２５～４０℃又は３０～４０℃又は２５～４５℃である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記温度が、４０～７０℃又は４５～６５℃又は４５～５５℃である、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記条件が、６～１０（例えば、６～８、７～８．５、又は８～１０）のｐＨにおけるインキュベーションを含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連特許出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６３／０８８，３２１号の優先権の利益を主張し、これは、あらゆる目的のために、参照により組み込まれる。
本出願は、２０２０年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６３／０８８，３２１号の優先権の利益を主張し、これは、あらゆる目的のために、参照により組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
今日、プラスチックは我々の日常生活において最も広く普及している人工材料となっている。その卓越した物理的・化学的特性ゆえに、プラスチックは、包装、衣料、自動車、電子機器、家庭、農業、建築、建設など、多くの産業に不可欠な多種多様な製品に加工されている。プラスチックの世界生産量は２０１８年に３億５，９００万トンに達したが、現在もプラスチック需要は依然として急増している。
今日、プラスチックは我々の日常生活において最も広く普及している人工材料となっている。その卓越した物理的・化学的特性ゆえに、プラスチックは、包装、衣料、自動車、電子機器、家庭、農業、建築、建設など、多くの産業に不可欠な多種多様な製品に加工されている。プラスチックの世界生産量は２０１８年に３億５，９００万トンに達したが、現在もプラスチック需要は依然として急増している。
【0003】
皮肉なことに、ほとんどのプラスチックは一回限りの使用を前提とした短命な製品である一方、非常に安定した分子構造に起因して、驚くほど長い寿命を有している。このような扱いにくいプラスチック製品の生産と消費が増え続けた結果、プラスチック廃棄物の蓄積は生態系に大きな脅威を与えることとなった。燃焼又は熱分解などの従来のプラスチック廃棄物管理技術は、エネルギー集約型のプロセスであることが多く、追加の環境汚染物質を生成する可能性がある。これとは対照的に、近年現れた加水分解性プラスチックの酵素分解は、温和な条件下で作用可能であり、解重合反応からプラスチックモノマーを回収することができる潜在性がある。そのため、これは学会及び産業界の双方で注目されている。特に、四番目に多く生産されているプラスチックポリマーであるＰＥＴの酵素加水分解は、近年大きな進歩を遂げている。
【0004】
過去１０年間において、ＰＥＴモノマーであるテレフタレート（ＴＰＡ）とエチレングリコール（ＥＧ）との間のエステル結合を切断可能な多数の酵素が発見された。代表的なものとして、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）ＫＷ３由来のＴｆＣｕｔ１及びＴｆＣｕｔ２（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｍａｋｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）ｗｉｔｈ Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ Ｆｕｓｃａ Ｃｕｔｉｎａｓｅ Ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｄｄｉｔｉｖｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－５２３７９－ｚ，Ｔｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１６；２０１５；Ｈｅｒｒｅｒｏ Ａｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．２０１１）、サッカロモノスポラ・ビリディス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ）ＡＨＫ１９０由来のＣｕｔ１９０（Ｏｄａ，Ｍａｓａｙｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８．“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＥＴ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｃａ２＋Ｉｏｎｓ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ ａ Ｃｕｔｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ Ｅｎｚｙｍｅ，Ｃｕｔ１９０＊，ａｎｄ Ｉｔｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３－０１８－９３７４－ｘ；Ｋａｗａｉ，Ｆｕｓａｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４．“Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃａ２＋－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ，Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒａｓｅ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ Ｖｉｒｉｄｉｓ ＡＨＫ１９０．”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３－０１４－５８６０－ｙ）、並びに枝葉堆肥メタゲノムに由来するＬＣ－クチナーゼ（Ｔｏｕｒｎｉｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，２０２０．“Ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＰＥＴ Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ Ｂｒｅａｋ ｄｏｗｎ ａｎｄ Ｒｅｃｙｃｌｅ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂｏｔｔｌｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２１４９－４；Ｓｈｉｒｋｅ，Ａｂｈｉｊｉｔ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８．“Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｌｅａｆ ａｎｄ Ｂｒａｎｃｈ Ｃｏｍｐｏｓｔ Ｃｕｔｉｎａｓｅ（ＬＣＣ）ｗｉｔｈ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＰＥＴ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．７ｂ０１１８９）は、他のＰＥＴヒドロラーゼと比較して比較的高いＰＥＴ分解活性を有することが報告されている。しかしながら、これらの酵素は、温和な温度では非常に低い活性を示し、最適な活性を発揮するためにかなり高い作動温度（＞６０℃）を必要とし、環境修復戦略として全細胞生体触媒に適用することは制限される。最近、Ｙｏｓｈｉｄａらは、新規ＰＥＴ資化性細菌イデオネラ・サカイエンシス（Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ）２０１－Ｆ６をＰＥＴボトルリサイクル現場から分離することに成功したことを、報告した。Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓｈｏｓｕｋｅ ｅｔ ａｌ，２０１６．“Ａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｈａｔ Ｄｅｇｒａｄｅｓ ａｎｄ Ａｓｓｉｍｉｌａｔｅｓ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２７８）：１１９６ ＬＰ－１１９９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ６３５９。この細菌は、クチナーゼ様酵素であるＩｓＰＥＴａｓｅを分泌し、これは常温でこれまで同定されたＰＥＴ分解酵素の中で最も高いＰＥＴ分解活性を示し、その有望な環境適用性を示している。環境ＰＥＴ修復のための全細胞生体触媒システムを開発するために、研究者らは、酵母（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＩＭＵＦＲＪ ５０，６８２）（Ｃｏｓｔａ，Ａｎｄｒｅｓｓａ Ｍａｉｏ ｄａ ｅｔ ａｌ．，２０２０．“Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）（ＰＥＴ）Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｙａｒｒｏｗｉａ Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ：Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｎｏｍｅｒｓ Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｐｒｏｃｂｉｏ．２０２０．０４．００１；Ｃｈｅｎ，Ｚｈｕｏｚｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＰＥＴａｓｅ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｃｉｔｏｔｅｎｖ．２０１９．１３６１３８）、及び微細藻類（フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）ＣＣ－１２４及びＣＣ－５０３）（Ｋｉｍ，Ｊｉ Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ－Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（ＰＥＴａｓｅ）ｉｎ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ．”Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９３４－０２０－０１３５５－８；Ｍｏｏｇ，Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９．“Ｕｓｉｎｇ ａ Ｍａｒｉｎｅ Ｍｉｃｒｏａｌｇａ ａｓ ａ Ｃｈａｓｓｉｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ（ＰＥＴ）Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．”Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９３４－０１９－１２２０－ｚ）を含むいくつかの異なるシャーシにＩｓＰＥＴａｓｅを取り付けることを試みた。
【0005】
しかしながら、ＩｓＰＥＴａｓｅの１つの大きな欠点は、融解温度（Ｔｍ）４８．８℃しか示さない、熱に弱い酵素である点である。ＩｓＰＥＴａｓｅは３０℃で２４時間培養すると、その酵素活性のほとんどが失われることが報告されている（Ｓｏｎ，Ｈｙｅｏｎｃｈｅｏｌ Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９．“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｔａｂｌｅ ＰＥＴａｓｅ ｆｒｏｍ Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ Ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＥＴ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．”ＡＣＳ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ９（４）：３５１９－２６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｃａｔａｌ．９ｂ００５６８）。それにもかかわらず、分解効率を最大限高めるためには、バイオレメディエーションに適用されるＰＥＴ分解酵素が、厳しい細胞外環境下（例えば、野生型ＰＥＴａｓｅの最適条件（温度、ｐＨ、塩濃度）以外の条件）でも長期間にわたって酵素活性を保持できることが、より理想的である。ＩｓＰＥＴａｓｅの低い熱安定性は、ＰＥＴの実際の酵素分解への利用を明らかに妨げると考えられる。ＩｓＰＥＴａｓｅの活性と安定性を改善するために、ＩｓＰＥＴａｓｅの結晶構造を決定し、その触媒機構を明らかにするために、かなりの研究努力がなされており（Ｊｏｏ，Ｓｅｏｎｇｊｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０２８８１－１；Ａｕｓｔｉｎ，Ｈａｒｒｙ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２０１８．“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａ Ｐｌａｓｔｉｃ－Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒａｓｅ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７１８８０４１１５）、この酵素の合理的なタンパク質工学のための新たな機会を広げている。ＩｓＰＥＴａｓｅの構造情報を利用して、いくつかの研究が単一点変異を導入することに成功し、ＰＥＴ分解の触媒活性を１．２倍～３．１倍高めることができた（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｉｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９．“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＴ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ａｓｐｅｃｔｓ．”ＡＣＳ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ９（５）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｃａｔａｌ．８ｂ０５１７１）。最近、Ｓｏｎらは、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較して、強化された熱安定性（Ｔｍ＝５７．７℃）及び４０℃で１４倍高いＰＥＴ分解活性を示すＩｓＰＥＴａｓｅＳ１２１Ｅ／Ｄ１８６Ｈ／Ｒ２８０Ａバリアントを作成した（Ｓｏｎ，Ｈｙｅｏｎｃｈｅｏｌ Ｆｒａｎｃｉｓら、２０１９、“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｔａｂｌｅ ＰＥＴａｓｅ ｆｒｏｍ Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ Ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＥＴ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．”ＡＣＳ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ９（４）：３５１９－２６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｃａｔａｌ．９ｂ００５６８）。最近では、Ｃｕｉらが計算機で設計し、ＩｓＰＥＴａｓｅＬ１１７Ｆ／Ｑ１１９Ｙ／Ｔ１４０Ｄ／Ｗ１５９Ｈ，Ｇ１６５Ａ／Ｉ１６８Ｒ／Ａ１８０Ｉ／Ｓ１８８Ｑ／Ｓ２１４Ｈ／Ｒ２８０Ａは、劇的に熱耐性（Ｔｍ＝７９．８℃）が向上しており、２桁以上高いＰＥＴ分解活性を有していると報告した（Ｃｕｉ，Ｙｉｎｇ－Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＰＥＴａｓｅ ｆｏｒ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＧＲＡＰＥ Ｓｔｒａｔｅｇｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／７８７０６９）。
【発明の概要】
【0006】
発明の簡単な概要
いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％）であるアミノ酸配列を含み、かつＮ２３３、Ｓ５８、Ｎ１１４、Ｓ１２１、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、Ｔ１４０、Ｓ６１、Ｉ２０８、及びＲ２２４からなる群から選択される配列番号１に対する位置に対応する少なくとも１つの変異を有する、操作されたＰＥＴ（ポリ（エチレンテレフタレート））ヒドロラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの変異は、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの変異は、Ｓ５８Ｙ、Ｓ５８Ｍ、Ｓ５８Ｌ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｐ、Ｓ６１Ｄ、Ｓ６１Ｅ、Ｓ６１Ｙ、Ｓ６１Ｆ、Ｎ１１４Ｈ、Ｎ１１４Ｌ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１４Ｓ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｔ１４０Ｙ、Ｔ１４０Ｌ、Ｔ１４０Ｉ、Ｔ１４０Ｖ、Ｔ１４０Ｓ、Ｉ２０８Ｍ、Ｉ２０８Ｈ、Ｉ２０８Ｆ、Ｉ２０８Ｙ、Ｉ２０８Ｐ、Ｉ２０８Ａ、Ｒ２２４Ｄ、Ｒ２２４Ｅ、Ｒ２２４Ｓ、Ｒ２２４Ｔ、Ｒ２２４Ｎ、Ｒ２２４Ｑ、Ｎ２２５Ｎ、Ｎ２２５Ｉ、Ｎ２２５Ｖ、Ｎ２２５Ｍ、Ｎ２２５Ａ、Ｎ２２５Ｌ、Ｎ２２５Ｓ、Ｎ２２５Ｔ、Ｎ２３３Ｒ、Ｎ２３３Ｙ、Ｎ２３３Ｈ、Ｎ２３３Ｐ、Ｍ２６２Ｌ、Ｍ２６２Ｉ、Ｍ２６２Ａ、Ｍ２６２Ｖ、Ｍ２６２Ｆ、Ｍ２６２Ｗ、Ｔ２７０Ｙ、Ｔ２７０Ｒ、Ｔ２７０Ｈ、Ｒ４３Ｋ、Ａ２４０Ｃ、及びＨ１８６Ｄからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１、２又は３と少なくとも９５％、９８％又は９９％同一である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、少なくとも１つの変異を除いて、配列番号１、２又は３と同一である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号６～３４のうちの１つ以上と、少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％同一である。
いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％）であるアミノ酸配列を含み、かつＮ２３３、Ｓ５８、Ｎ１１４、Ｓ１２１、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、Ｔ１４０、Ｓ６１、Ｉ２０８、及びＲ２２４からなる群から選択される配列番号１に対する位置に対応する少なくとも１つの変異を有する、操作されたＰＥＴ（ポリ（エチレンテレフタレート））ヒドロラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの変異は、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの変異は、Ｓ５８Ｙ、Ｓ５８Ｍ、Ｓ５８Ｌ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｐ、Ｓ６１Ｄ、Ｓ６１Ｅ、Ｓ６１Ｙ、Ｓ６１Ｆ、Ｎ１１４Ｈ、Ｎ１１４Ｌ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１４Ｓ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｔ１４０Ｙ、Ｔ１４０Ｌ、Ｔ１４０Ｉ、Ｔ１４０Ｖ、Ｔ１４０Ｓ、Ｉ２０８Ｍ、Ｉ２０８Ｈ、Ｉ２０８Ｆ、Ｉ２０８Ｙ、Ｉ２０８Ｐ、Ｉ２０８Ａ、Ｒ２２４Ｄ、Ｒ２２４Ｅ、Ｒ２２４Ｓ、Ｒ２２４Ｔ、Ｒ２２４Ｎ、Ｒ２２４Ｑ、Ｎ２２５Ｎ、Ｎ２２５Ｉ、Ｎ２２５Ｖ、Ｎ２２５Ｍ、Ｎ２２５Ａ、Ｎ２２５Ｌ、Ｎ２２５Ｓ、Ｎ２２５Ｔ、Ｎ２３３Ｒ、Ｎ２３３Ｙ、Ｎ２３３Ｈ、Ｎ２３３Ｐ、Ｍ２６２Ｌ、Ｍ２６２Ｉ、Ｍ２６２Ａ、Ｍ２６２Ｖ、Ｍ２６２Ｆ、Ｍ２６２Ｗ、Ｔ２７０Ｙ、Ｔ２７０Ｒ、Ｔ２７０Ｈ、Ｒ４３Ｋ、Ａ２４０Ｃ、及びＨ１８６Ｄからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１、２又は３と少なくとも９５％、９８％又は９９％同一である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、少なくとも１つの変異を除いて、配列番号１、２又は３と同一である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号６～３４のうちの１つ以上と、少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％同一である。
【0007】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される、配列番号１に対する位置に対応する少なくとも２つの変異を有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、Ｒ２２４Ｑ、Ｓ５８Ｙ、Ｓ５８Ｍ、Ｓ５８Ｌ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｐ、Ｓ６１Ｄ、Ｓ６１Ｅ、Ｓ６１Ｙ、Ｓ６１Ｆ、Ｎ１１４Ｈ、Ｎ１１４Ｌ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１４Ｓ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｔ１４０Ｙ、Ｔ１４０Ｌ、Ｔ１４０Ｉ、Ｔ１４０Ｖ、Ｔ１４０Ｓ、Ｉ２０８Ｍ、Ｉ２０８Ｈ、Ｉ２０８Ｆ、Ｉ２０８Ｙ、Ｉ２０８Ｐ、Ｉ２０８Ａ、Ｒ２２４Ｄ、Ｒ２２４Ｅ、Ｒ２２４Ｓ、Ｒ２２４Ｔ、Ｒ２２４Ｎ、Ｒ２２４Ｑ、Ｎ２２５Ｎ、Ｎ２２５Ｉ、Ｎ２２５Ｖ、Ｎ２２５Ｍ、Ｎ２２５Ａ、Ｎ２２５Ｌ、Ｎ２２５Ｓ、Ｎ２２５Ｔ、Ｎ２３３Ｒ、Ｎ２３３Ｙ、Ｎ２３３Ｈ、Ｎ２３３Ｐ、Ｍ２６２Ｌ、Ｍ２６２Ｉ、Ｍ２６２Ａ、Ｍ２６２Ｖ、Ｍ２６２Ｆ、Ｍ２６２Ｗ、Ｔ２７０Ｙ、Ｔ２７０Ｒ、Ｔ２７０Ｈ、Ｒ４３Ｋ、Ａ２４０Ｃ、及びＨ１８６Ｄからなる群から選択される、配列番号１に対する位置に対応する２つ又は３つ（又は４、５、６、７、８、９、又は１０）の変異を有する。
【0008】
また、上記又は本明細書の他の箇所に記載されるような、操作されたＰＥＴヒドロラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、操作されたＰＥＴヒドロラーゼは、シグナルペプチドを更に含む。
【0009】
また、上記又は本明細書の他の箇所に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターであって、それにより、プロモーターが、操作されたＰＥＴヒドロラーゼの発現を制御する、ベクターも提供される。
【0010】
また、上記又は本明細書の他の箇所に記載されたポリヌクレオチド又はベクターを含む、宿主細胞も提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、微生物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞である。いくつかの実施形態において、細菌細胞は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真菌細胞である。
【0011】
また、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）を分解する方法であって、ＰＥＴを、上記又は本明細書の他の箇所に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼと、ＰＥＴを分解する条件下で接触させることを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、ＰＥＴを、操作されたＰＥＴヒドロラーゼを発現及び分泌する宿主細胞と接触させることを含んでいる。いくつかの実施形態において、操作されたＰＥＴヒドロラーゼは精製される。
【0012】
いくつかの実施形態において、条件は、２５～７０℃の温度におけるインキュベーションを含む。いくつかの実施形態において、温度は２５～４０℃又は３０～４０℃又は２５～４５℃である。いくつかの実施形態において、温度は４０～７０℃又は４５～６５℃又は４５～５５℃である。
【0013】
いくつかの実施形態において、条件は、６～１０（例えば、６～８、７～８．５、又は８～１０）のｐＨにおけるインキュベーションを含む。
【0014】
定義
「ＰＥＴヒドロラーゼ」は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）プラスチックの、モノマーモノ－２－ヒドロキシエチルテレフタレート（ＭＨＥＴ）への加水分解を触媒する酵素のエステラーゼクラスに属する。ＰＥＴヒドロラーゼの例としては、野生型イデオネラ・サカイエンシスの「ＩｓＰＥＴａｓｅ」である配列番号１である。ＰＥＴヒドロラーゼ活性は、酵素がＰＥＴフィルムを分解する能力を測定することにより決定することができ、これは、設定時間中、設定条件下で酵素と共に、一定時間インキュベートした後のフィルムの重量変化により測定される。例えば、実施例７参照。
「ＰＥＴヒドロラーゼ」は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）プラスチックの、モノマーモノ－２－ヒドロキシエチルテレフタレート（ＭＨＥＴ）への加水分解を触媒する酵素のエステラーゼクラスに属する。ＰＥＴヒドロラーゼの例としては、野生型イデオネラ・サカイエンシスの「ＩｓＰＥＴａｓｅ」である配列番号１である。ＰＥＴヒドロラーゼ活性は、酵素がＰＥＴフィルムを分解する能力を測定することにより決定することができ、これは、設定時間中、設定条件下で酵素と共に、一定時間インキュベートした後のフィルムの重量変化により測定される。例えば、実施例７参照。
【0015】
「ポリヌクレオチド」は、典型的には５’から３’末端まで読まれたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーである。ポリヌクレオチドにはＲＮＡ及びＤＮＡがあり、天然源から単離されたもの、インビトロで合成されたもの、又は天然分子と合成分子との組み合わせから調製されたものがある。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、「塩基対」という用語と同等であると理解される。
【0016】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、天然に製造されたか、合成的に製造されたかにかかわらず、ペプチド結合によって結合したアミノ酸残基のポリマーである。
【0017】
２つの核酸配列又はポリペプチドは、以下に説明するように最大一致に関して整列させたときに、２つの配列において、それぞれ、ヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が同じである場合に「同一」であると言われる。用語「同一」又はパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は手動アライメント及び目視検査によって測定される、比較ウィンドウにわたって最大一致に関して比較し、アライメントさせたときに、同一であるか又は同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定パーセントを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。配列同一性の割合がタンパク質又はペプチドに関して使用される場合、同一でない残基位置は、しばしば保存的アミノ酸置換によって異なることが認識され、ここでアミノ酸残基は、同様の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存性を訂正するために上方調整することができる。この調整を行う手段は、当業者にはよく知られている。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それによってパーセント配列同一性を増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ （Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）において実行されるように、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１－１７（１９８８）のアルゴリズムに従って計算される。
【0018】
２つの核酸又はポリペプチドの文脈で使用される「実質的同一性」又は「実質的に同一」という表現は、基準配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を指す。代替的に、パーセント同一性は、７０％～１００％の任意の整数であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、好ましくは、以下に記載されるように、標準パラメータを使用するＢＬＡＳＴを使用して決定されるように、配列が基準配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する場合に、配列は参照配列と実質同一である。本開示の実施形態は、配列番号１～３のいずれか１つ以上と実質的に同一であり、本明細書に記載のように少なくとも１つのアミノ酸置換を含有するポリペプチドを提供する。
【0019】
配列比較のために、典型的には１つの配列は基準配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び基準配列をコンピューターに入力し、必要があれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することも、代替パラメータを指定することも可能である。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【0020】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析のためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを通じて一般に入手可能である。このアルゴリズムでは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントしたときに、ある正の値を持つ閾値スコアＴと一致するか満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定して、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ）。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として機能する。次に、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチした残基のペアに対する報酬スコア；常に＞０）とＮ（ミスマッチした残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使って計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを算出する。累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ低下するか、１つ以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積により累積スコアがゼロ以下になるか、いずれかの配列の末端に到達したときに、各方向へのワードヒットの拡張が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、Ｘは、アライメントの感度及び速度を決定する。アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワードサイズ（Ｗ）２８、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝１、Ｎ＝－２、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワードサイズ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）参照）。
【0021】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の尺度の１つは最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標となる。例えば、試験核酸と基準核酸の比較における最小和確率が約０．０１未満、より好ましくは約１０－５未満、最も好ましくは約１０－２０未満である場合、核酸は基準配列に類似するとみなされる。
【0022】
「アミノ酸変異」とは、所定の位置のアミノ酸残基（例えば、野生型ＰＥＴヒドロラーゼ又は他の非天然型ＰＥＴヒドロラーゼに生じる天然由来のアミノ酸残基）を他のアミノ酸残基（例えば、天然由来の残基以外）に置き換えることを指す。例えば、野生型イデオネラ・サカイエンシスＩｓＰＥＴａｓｅ野生型配列（配列番号１）の２３３位の天然由来のアミノ酸残基はアスパラギン（Ｎ）（Ｎ２３３）であり、したがって、Ｎ２３３におけるアミノ酸置換は、天然由来のアスパラギンをアスパラギン以外の任意のアミノ酸残基に置き換えることを指す。
【0023】
ポリペプチド配列の個々の置換は、コードされた配列中の単一のアミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を変化させ、その結果、アミノ酸が、化学的に類似したアミノ酸と置換される「保存的改変バリアント」となる。以下のアミノ酸は互いに保存的置換である：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【0024】
アミノ酸残基「［指定配列］のアミノ酸残基［Ｘ］に対応する」、アミノ酸置換「［指定配列］のアミノ酸置換［Ｘ］に対応する」等は、ポリペプチド及び配列を最適に整列させた場合に、指定配列の相当するアミノ酸と整列する、関心あるポリペプチド中のアミノ酸を指す。例えば、配列番号１の位置に対応するアミノ酸は、ＢＬＡＳＴのようなアラインメントアルゴリズムを使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置の「対応」は、配列番号１を別のＰＥＴヒドロラーゼ配列に対して整列させることによって決定される。試験ＰＥＴヒドロラーゼ配列が配列番号１と異なる場合（例えば、アミノ酸の変化又はアミノ酸の付加又は欠失によって）、例えば試験ＰＥＴヒドロラーゼがアミノ末端シグナル配列を有するか、又は１つ以上のアミノ酸を配列番号１に対して挿入していた場合、改善されたＰＥＴヒドロラーゼ活性に関連する特定の変異が、配列番号１におけるものと同じ数値位置番号にない場合があるが、その位置もアライメントによる決定のように配列番号１の位置に依然として、「対応」することになる。
【0025】
「宿主細胞」という用語は、異種ポリヌクレオチドを複製及び／又は転写及び／又は翻訳することができる任意の細胞を指す。したがって、「宿主細胞」は、インビトロ又はインビボに位置するかどうかにかかわらず、任意の原核細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むがこれに限定されない）又は真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、及び虫細胞を含むがこれに限定されない）を指す。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物に位置することができる。宿主細胞は、例えば、異種ポリヌクレオチドで形質転換され得る。
【0026】
「ベクター」は、コード配列及びコード配列の発現に必要な配列を含む核酸を指す。ベクターは、ウイルス性又は非ウイルス性であり得る。「プラスミド」とは、非ウイルス性ベクターであり、例えば、遺伝子の発現に必要な遺伝子及び／又は調節エレメントをコードする核酸分子である。「ウイルスベクター」とは、他の核酸を細胞内に輸送することができるウイルス由来の核酸である。ウイルスベクターは、適切な環境に存在する場合、ベクターによって運ばれる１つ以上の遺伝子によってコードされる１つ又は複数のタンパク質の発現を指示することが可能である。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】ニューラルネットワーク解析により予測された一連の変異を含むＩｓＰＥＴａｓｅバリアント、無効化ＩｓＰＥＴａｓｅ、及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅのエステラーゼ活性を、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較して示す棒グラフである。野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ及びそのバリアントのエステラーゼ活性は、酪酸レゾルフィンアッセイにより測定される。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「Ｄｅａｄ」は変異（Ｓ１６０Ａ）により酵素機能を失った無効化ＩｓＰＥＴａｓｅを表し、「ＷＴ」は野生型ＩｓＰｅｔａｓｅを表している。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図2】ニューラルネットワーク解析により予測された一連の変異を含むＩｓＰＥＴａｓｅバリアント、無効化ＩｓＰＥＴａｓｅ、及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅのＰＥＴ分解活性を、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較して示す棒グラフである。基質としてＰＥＴフィルムを使用し、酵素濃度２００ｎＭで野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ及びそのバリアントの加水分解活性を測定した。アッセイ反応は、４０℃で９６時間インキュベートした。酵素処理前後のＰＥＴフィルムサンプルを比較し、ＰＥＴａｓｅ処理したフィルムの質量損失を測定した。ＰＥＴａｓｅ処理したフィルムの写真は、ＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの異なる分解活性により、異なる表面侵食の程度を示す。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「Ｄｅａｄ」は変異（Ｓ１６０Ａ）により酵素機能を失った無効化ＩｓＰＥＴａｓｅを表し、「ＷＴ」は野生型ＩｓＰＥＴａｓｅを表している。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図3】野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較して高いＰＥＴ分解活性を示す、最初に予測された７つのニューラルネットワーク変異の残基ロケールを示している。
【図4】野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較したＩｓＰＥＴａｓｅバリアントのエステラーゼ活性を示す棒グラフである。野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ及びそのバリアントのエステラーゼ活性は、酪酸レゾルフィンアッセイにより測定される。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「ＴＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「Ｄｕｒａ」は変異Ｌ１１７Ｆ、Ｑ１１９Ｙ、Ｔ１４０Ｄ、Ｗ１５９Ｈ、Ｇ１６５Ａ、Ｉ１６８Ｒ、Ａ１８０Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ２１４Ｈ、Ｒ２８０Ａを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅを表し、「ＤＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「ＷＴ」は野生型ＩｓＰＥＴａｓｅを表す。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図5】異なる温度におけるＩｓＰＥＴａｓｅバリアントのＰＥＴ分解活性を示す棒グラフである。基質としてＰＥＴフィルムを使用し、酵素濃度２００ｎＭでＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの加水分解活性を測定した。アッセイ反応は、３０℃及び４０℃で９６時間、５０℃で４８時間インキュベートした。酵素処理前後のＰＥＴフィルムサンプルを比較し、ＰＥＴａｓｅ処理したフィルムの質量損失を測定した。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「ＴＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「Ｄｕｒａ」は変異Ｌ１１７Ｆ、Ｑ１１９Ｙ、Ｔ１４０Ｄ、Ｗ１５９Ｈ、Ｇ１６５Ａ、Ｉ１６８Ｒ、Ａ１８０Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ２１４Ｈ、Ｒ２８０Ａを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅを表し、「ＤＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅバリアントを表す。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図6】ニューラルネットワーク解析により予測された一連の変異を含むＴＮＫ（変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、Ｒ２８０Ａ、及びＮ２３３Ｋを含むＩｓＰＥＴａｓｅバリアント）バリアント、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、及びＤｕｒａＰＥＴａｓｅのエステラーゼ活性を、ＴＮＫと比較して示す棒グラフである。ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ、ＴＮＫ及びそのバリアントのエステラーゼ活性は、酪酸レゾルフィンアッセイによって測定される。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「ＴＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「ＴＮＫ＋Ｘ」は、ニューラルネットワーク解析により予測された変異のうちの１つを含むＴＮＫバリアントを表し、「Ｄｕｒａ」は変異Ｌ１１７Ｆ、Ｑ１１９Ｙ、Ｔ１４０Ｄ、Ｗ１５９Ｈ、Ｇ１６５Ａ、Ｉ１６８Ｒ、Ａ１８０Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ２１４Ｈ、Ｒ２８０Ａを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅを表し、「ＤＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅバリアントを表す。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図7】異なる温度における、ニューラルネットワーク解析により予測された一連の変異を含むＴＮＫ（変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、Ｒ２８０Ａ、及びＮ２３３Ｋを含むＩｓＰＥＴａｓｅバリアント）バリアント、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、及びＤｕｒａＰＥＴａｓｅのＰＥＴ分解活性を、ＴＮＫと比較して示す棒グラフである。基質としてＰＥＴフィルムを使用し、酵素濃度２００ｎＭでＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの加水分解活性を測定した。アッセイ反応は、３０℃、４０℃、５０℃、又は５５℃で９６時間インキュベートした。酵素処理前後のＰＥＴフィルムサンプルを比較し、ＰＥＴａｓｅ処理したフィルムの質量損失を測定した。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「ＴＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「ＴＮＫ＋Ｘ」は、ニューラルネットワーク解析により予測された変異Ｓ５８Ｅ、Ｎ１１４Ｔ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ６７Ｄ、Ｑ９１Ｉ、Ｓ１２１Ｅ、Ｔ６７Ｄ、Ｑ９１Ｉ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、Ｓ５８Ａ、及びＲ２２４Ｑのうちの１つを含むＴＮＫ Ｎｅｔｃを表し、「Ｄｕｒａ」は変異Ｌ１１７Ｆ、Ｑ１１９Ｙ、Ｔ１４０Ｄ、Ｗ１５９Ｈ、Ｇ１６５Ａ、Ｉ１６８Ｒ、Ａ１８０Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ２１４Ｈ、Ｒ２８０Ａを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅを表し、「ＤＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅバリアントを表す。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図8】野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ（配列番号１）と比較しての、ＷＴ ＩｓＰＥＴａｓｅの結晶構造に基づいてニューラルネットワークモデリングにより予測された１０個の選択された置換を含むＷＴ ＮＥＴ（配列番号５）、及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅの結晶構造に基づいてニューラルネットワークモデリングにより予測された６つの選択された置換を含むＴｈｅｒｍｏ ＮＥＴ（配列番号５）のアミノ酸配列のアライメントである。変異配列の改変は、強調表示されている。
【図9】図９ａ～ｃ：機械学習誘導予測より、様々なＰＥＴａｓｅスキャフォールドについて改善された酵素性能が付与された。９ａ．Ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅの出力により表現された、野生型ＰＥＴａｓｅタンパク質の構造。ＰＥＴａｓｅの各アミノ酸残基をＭｕｔｃｏｍｐｕｔｅで評価した結果、隣接する化学的微小環境と２０個の各アミノ酸の化学的適合性を反映する確率分布が得られた。野生型確率が低い（好ましくない）残基は赤、野生型確率が高い（好ましい）残基は青で表示されている。本研究で利用した両方の結晶構造に対するＭｕｔＣｏｍｐｕｔｅのインタラクティブな可視化は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅ．ｃｏｍ／ｐｅｔａｓｅ／５ｘｊｈ、及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅ．ｃｏｍ／ｐｅｔａｓｅ／６ｉｊ６において公開されている。９ｂ．Ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅで予測された４つの主な変異の微小環境。９ｃ．Ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅによって予測された変異のダウンセレクションの模式図、及び変異誘発により生成された変異の酵素的性能と、ダウンセレクションされた変異の比較。野生型ＰＥＴａｓｅ及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅの結晶構造を用いてＭｕｔＣｏｍｐｕｔｅを実行した結果、２つの予測ライブラリーが生成された。次に、予測されたアミノ酸及び野生型アミノ酸の間の確率の変化倍率により、予測値をランク付けした。段階的組み合わせ戦略を使用して、様々なＰＥＴａｓｅのスキャフォールドに単一又は複数の予測された変異を組み込むことにより、１５９個のバリアントが生成された。バリアントの実験的特性評価により、４つの主要な変異をダウンセレクションし、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）という３つのＰＥＴａｓｅスキャフォールドにわたって組み合わせ的にアセンブルし、全ての可能な組み合わせを作成した。ヒートマップは、得られたバリアントのＰＥＴ加水分解活性、及びバリアントのそれぞれのスキャフォールドに対する変化倍率を示している。ＰＥＴ加水分解活性は、９６時間の反応時間後、ＰＥＴａｓｅバリアントがｇｆ－ＰＥＴフィルムを加水分解して放出したＰＥＴモノマー（ＴＰＡとＭＨＥＴとの合計）の量を測定することで評価した。この図に示す全ての酵素について、緩衝液ＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ８）が使用された。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図10】αＰＥＴａｓｅのＰＥＴ加水分解活性は、温和な温度及び適度なｐＨで各種ＰＨＥより優れていた。反応温度４０℃において、αＰＥＴａｓｅ、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ、及びＩＣＣＭのｐＨ範囲（６．５～８．０）におけるＰＥＴ加水分解活性の比較。ＰＥＴ加水分解活性は、９６時間の反応時間後、試験されたＰＥＴがｇｆ－ＰＥＴフィルムを加水分解して放出したＰＥＴモノマー（ＴＰＡとＭＨＥＴとの合計）の量を測定することで評価した。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図11a】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。１１ａ．５１種類のポストコンシューマー・プラスチック製品から穴開けにより得たｐｃ－ＰＥＴフィルムの完全分解。
【図11b】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。１１ｂ．αＰＥＴａｓｅ、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ、及びＩＣＣＭの反応温度５０℃におけるＰＥＴ加水分解活性の時間経過。ＰＥＴ加水分解活性は、試験したＰＨＥによってｐｃ－ＰＥＴ（豆菓子プラスチック容器）フィルムを加水分解して放出されたＰＥＴモノマー量（ＴＰＡとＭＨＥＴとの合計）を様々な時点で測定することによって評価した。この図に示す全ての酵素について、緩衝液ＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ８）が使用された。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図11c】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。１１ｃ．αＰＥＴａｓｅによる様々な曝露時間後のｐｃ－ＰＥＴフィルムの原子間力顕微鏡画像。
【図11d】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。１１ｄ．αＰＥＴａｓｅを用いた大型未処理ＰＥＴ容器の５０℃での完全分解。
【図11e】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。ｅ．αＰＥＴａｓｅ、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ、及びＩＣＣＭによる市販ポリエステル製品の５０℃での分解。
【図12a】図１２ａ～ｃ：ＰＥＴの酵素的－化学的リサイクル及びインサイチュのバイオレメディエーションにおけるαＰＥＴａｓｅの応用。１２ａ．αＰＥＴａｓｅによるポストコンシューマー・プラスチック廃棄物の解重合及び化学重合を組み込んだＰＥＴのクローズドループリサイクルプロセスの模式図。再生バージンＰＥＴの結晶化度は、示差走査熱量測定により５８％と測定された。
【図12b】図１２ａ～ｃ：ＰＥＴの酵素的－化学的リサイクル及びインサイチュのバイオレメディエーションにおけるαＰＥＴａｓｅの応用。１２ｂ．Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｇｏ１９と外因性ＰＨＥとを組み合わせた同時プロセス：αＰＥＴａｓｅ、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ及びＩＣＣＭ。ＰＨＥ（αＰＥＴａｓｅ／ＷＴ／Ｔｈｅｒｍｏ／Ｄｕｒａ／βＰＥＴａｓｅ／ＬＣＣ／ＩＣＣＭ）及びＧＯ１９はＰＨＥとＰ．プチダＧｏ１９との同時処理を表し、ＰＨＥはＰ．プチダＧｏ１９なしで酵素を提示する対照条件を表す。遊離したＰＥＴモノマー、ｐｃ－ＰＥＴフィルムの質量損失、及びＰ．プチダＧｏ１９の細胞密度は、９６時間のインキュベーション後に測定した。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図12c】図１２ａ～ｃ：ＰＥＴの酵素的－化学的リサイクル及びインサイチュのバイオレメディエーションにおけるαＰＥＴａｓｅの応用。１２ｃ．αＰＥＴａｓｅ／ＷＴ／Ｔｈｅｒｍｏ／Ｄｕｒａ／βＰＥＴａｓｅを分泌可能な操作されたＰ．プチダＧｏ１９株の統合プロセス。遊離しれたＰＥＴモノマー、ｐｃ－ＰＥＴフィルムの質量損失、及びＰ．プチダＧｏ１９の細胞密度は、１２０時間のインキュベーション後に測定した。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図13】Ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅによって予測された変異を組み込んだＰＥＴａｓｅバリアント、及びそれぞれのスキャフォールドである野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）の耐熱性。各酵素の融解温度は示差走査熱量測定で決定した。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図14】αＰＥＴａｓｅによる各種ｐｃ－ＰＥＴフィルムの質量、結晶化度％、及び完全分解にかかる時間。円形のｐｃ－ＰＥＴフィルム（直径６ｍｍ）は、地元の食料品店チェーン（Ｗａｌｍａｒｔ、Ｃｏｓｔｃｏ、及びＨＥＢ）で入手可能な食品、飲料、薬品、事務用品、家庭用品及び化粧品の包装に使用される５１種類の異なるポストコンシューマー・プラスチック製品から穴開けにより得た。ｐｃ－ＰＥＴフィルムは、フィルムが完全に分解されるまで、５０℃でαＰＥＴａｓｅによる連続処理によって加水分解された。酵素溶液（１００ｍＭの緩衝液ＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ８）（ｐＨ８）中の２００ｎＭのαＰＥＴａｓｅ）は、２４時間ごとに補充した。無傷のｐｃ－ＰＥＴフィルムの結晶化度％は、示差走査熱量測定によって決定した。フィルムの初期質量は、デジタルスケールにより重量測定で決定した。ＤＳＣ及び重量測定の両方は、三つ組で実施した。平均値±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）が示されている。
【発明を実施するための形態】
【0028】
詳細な説明
本開示は、野生型酵素と比較して向上した酵素活性を示すＰＥＴヒドロラーゼ（すなわち、ＰＥＴａｓｅ）酵素の変異体型を提供する。本明細書に記載のＩｓＰＥＴａｓｅの変異体型は、より広い温度範囲、例えば、野生型酵素よりも低い温度にわたって触媒活性を維持することができ、並びにより広いｐＨ範囲にわたって改善された活性を維持することができる。
本開示は、野生型酵素と比較して向上した酵素活性を示すＰＥＴヒドロラーゼ（すなわち、ＰＥＴａｓｅ）酵素の変異体型を提供する。本明細書に記載のＩｓＰＥＴａｓｅの変異体型は、より広い温度範囲、例えば、野生型酵素よりも低い温度にわたって触媒活性を維持することができ、並びにより広いｐＨ範囲にわたって改善された活性を維持することができる。
【0029】
例えば、イデオネラ・サカイエンシスＩｓＰＥＴａｓｅ野生型配列のアミノ酸残基Ｎ２３３、Ｓ５８、Ｎ１１４、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、又はＴ１４０（配列番号１に示される）のリジン（Ｎ２３３Ｋ）、グルタミン酸（Ｓ５８Ｅ）、スレオニン（Ｎ１１４Ｔ）、システイン（Ｎ２２５Ｃ）、ロイシン（Ｍ２６２Ｌ）、バリン（Ｔ２７０Ｖ）、又はアスパラギン酸（Ｔ１４０Ｄ）による単一置換により、野生型酵素と比較してＰＥＴ分解活性が上昇したことが発見された。これらの単一変異体のうち、変異Ｎ２３３Ｋを含むＩｓＰＥＴａｓｅバリアントが最大の改善効果を示し、ＰＥＴフィルム分解アッセイにおいて４０℃で野生型ＩｓＰＥＴａｓｅより約８．５倍高いＰＥＴ分解活性を示した。
【0030】
更に、２つの公表されたＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの配列ＩｓＰＥＴａｓｅＳ１２１Ｅ／Ｄ１８６Ｈ／Ｒ２８０Ａ（本明細書では、「ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ」と称する）、及びＩｓＰＥＴａｓｅＬ１１７Ｆ／Ｑ１１９Ｙ／Ｔ１４０Ｄ／Ｗ１５９Ｈ，Ｇ１６５Ａ／Ｉ１６８Ｒ／Ａ１８０Ｉ／Ｓ１８８Ｑ／Ｓ２１４Ｈ／Ｒ２８０Ａ（本明細書では「ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ」と称する）（Ｃｕｉ，Ｙｉｎｇ－Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＰＥＴａｓｅ ｆｏｒ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＧＲＡＰＥ Ｓｔｒａｔｅｇｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／７８７０６９；Ｓｏｎ，Ｈｙｅｏｎｃｈｅｏｌ Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９．“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｔａｂｌｅ ＰＥＴａｓｅ ｆｒｏｍ Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ Ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＥＴ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．”ＡＣＳ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ９（４）：３５１９－２６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｃａｔａｌ．９ｂ００５６８）におけるアミノ酸残基Ｎ２３３をリジン（Ｎ２３３Ｋ）で置換すると、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ及びＤｕｒａＰＥＴａｓｅと比較して、熱安定性が高く、ＰＥＴ分解活性が高くなることがわかった。ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ及びＤｕｒａＰＥＴａｓｅのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２及び配列番号３に示す。より具体的には、Ｎ２３３Ｋのアミノ酸置換を含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアント（「ＴＮＫ」と表記し、その配列を配列番号４で示す）は、５０℃でＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅの約６．４倍高いＰＥＴ分解活性を示す。
【0031】
加えて、ＩｓＰＥＴａｓｅバリアント－ＴＮＫ配列（配列番号４で示す）のアミノ酸残基Ｓ５８、Ｎ１１４、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、Ｓ６１、Ｉ２０８又はＲ２２４のグルタミン酸（Ｓ５８Ｅ）又はアラニン（Ｓ５８Ａ）、スレオニン（Ｎ１１４Ｔ）、システイン（Ｎ２２５Ｃ）、ロイシン（Ｍ２６２Ｌ）、バリン（Ｔ２７０Ｖ）、スレオニン（Ｓ６１Ｔ）、バリン（Ｉ２０８Ｖ）又はグルタミン（Ｎ２２４Ｑ）による単一置換により、ＴＮＫ酵素と比較してＰＥＴ分解活性及び熱安定性がより高まることも発見された。具体的には、Ｒ２２４Ｑのアミノ酸置換を含むＴＮＫバリアントは、３０℃、４０℃、５０℃及び５５℃において、ＴＮＫよりも高いＰＥＴ分解活性を示す。
【0032】
本開示は、対照ＰＥＴヒドロラーゼと比較して特定のアミノ酸変化を有する操作された（すなわち、非天然）ＰＥＴ（ポリ（エチレンテレフタレート））ヒドロラーゼを提供し、それにより対照ＰＥＴヒドロラーゼと比較して、操作されたＰＥＴヒドロラーゼが特定の温度又はｐＨ、又はそれらの組み合わせにおける改善された耐熱性、改善された活性を有することとなる。対照ＰＥＴヒドロラーゼは、列挙された変異を欠くがそれ以外は同一のＰＥＴヒドロラーゼであり、典型的には、そこに変異が導入されるＰＥＴヒドロラーゼである。
【0033】
実施例で考察されたように、変異は、いくつかの異なるＰＥＴヒドロラーゼに挿入され、一般に、各ケースで活性の改善が示されている。したがって、本開示は、アミノ酸配列に対する、変異のうちの１つ以上の導入を提供し、アミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２又は配列番号３と実質的に（例えば、少なくとも７０、８０、９０又は９５％）同一であり、Ｎ２３３、Ｓ５８、Ｎ１１４、Ｓ１２１、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、Ｔ１４０、Ｓ６１、Ｉ２０８、及びＲ２２４からなる群から選択される配列番号１に対する位置に対応する少なくとも１つの変異を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの変異は、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの変異は、Ｓ５８Ｙ／Ｍ／Ｌ／Ｖ／Ｐ、Ｓ６１Ｄ／Ｅ／Ｙ／Ｆ、Ｎ１１４Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ｔ１４０Ｙ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｓ、Ｉ２０８Ｍ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｐ／Ａ、Ｒ２２４Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｎ／Ｑ、Ｎ２２５Ｎ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ａ／Ｌ／Ｓ／Ｔ、Ｎ２３３Ｒ／Ｙ／Ｈ／Ｐ、Ｍ２６２Ｌ／Ｉ／Ａ／Ｖ／Ｆ／Ｗ、及びＴ２７０Ｙ／Ｒ／Ｈからなる群から選択される。
【0034】
いくつかの実施形態において、ＰＥＴヒドロラーゼは、２、３、４、５、６、７、又はそれを上回る上記変異を有し得る。具体的に開示される変異の例示的な組み合わせには、表２に記載されるものが含まれ、これらは、例えば、配列番号１又は配列番号２又は配列番号３と実質的に（例えば、少なくとも７０、８０、９０、又は９５％）同一であるアミノ酸配列に導入され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＥＴヒドロラーゼは、Ｎ２３３置換（例えば、Ｎ２３３Ｋに限定されない）、及びＳ５８、Ｎ１１４、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、Ｓ６１、Ｉ２０８、Ｒ２２４、Ｒ４３、Ａ２４０、及びＨ１８６（例えば、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、Ｒ２２４Ｑ、Ｒ４３Ｋ、Ａ２４０Ｃ、又はＨ１８６Ｄのうちの１つに限定されない）における少なくとも１つの更なる置換を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＥＴヒドロラーゼは、Ｎ２３３置換（例えば、Ｎ２３３Ｋに限定されない）及びＲ２２４置換（例えば、Ｒ２２４Ｑに限定されない）を含む。いくつかの実施形態において、上記の置換のいずれかを、Ｓ１２１Ｅ／Ｄ１８６Ｈ／Ｒ２８０Ａのうちの１つ、２つ又は３つ全てと組み合わせることができる。
【0035】
例えば、配列番号１、２又は３と少なくとも９５％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列に含まれ得る例示的な変異体としては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：Ｎ２３３Ｋ（例えば、配列番号１において）、Ｓ１２１Ｅ（例えば、配列番号１において）、Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号１において）、Ｒ２２４Ｑ（例えば、配列番号１において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｓ１２１Ｅ（例えば、配列番号１において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｒ２２４Ｑ（例えば、配列番号１において）、Ｒ２２４Ｑ＋Ｓ１２１Ｅ（例えば、配列番号１において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号１において）、Ｒ２２４Ｑ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号１において）、Ｓ１２１Ｅ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号１において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｒ２２４Ｑ＋Ｓ１２１Ｅ（例えば、配列番号１において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｒ２２４Ｑ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号１において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｓ１２１Ｅ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号１において）、Ｒ２２４Ｑ＋Ｓ１２１Ｅ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号１において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｒ２２４Ｑ＋Ｓ１２１Ｅ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号１において）、Ｎ２３３Ｋ（例えば、配列番号２において）、Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号２において）、Ｒ２２４Ｑ（例えば、配列番号２において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号２において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｒ２２４Ｑ（例えば、配列番号１又は２）、Ｒ２２４Ｑ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号２において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｒ２２４Ｑ＋Ｔ１４０Ｄ（例えば、配列番号２において）、Ｎ２３３Ｋ（例えば、配列番号３において）、Ｓ１２１Ｅ（例えば、配列番号３において）、Ｒ２２４Ｑ（例えば、配列番号３において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｒ２２４Ｑ（例えば、配列番号３において）、Ｎ２３３Ｋ＋Ｓ１２１Ｅ（例えば、配列番号３において）、Ｒ２２４Ｑ＋Ｓ１２１Ｅ（例えば、配列番号３において）、又はＲ２２４Ｑ＋Ｓ１２１Ｅ＋Ｎ２３３Ｋ（例えば、配列番号３において）。
【0036】
例示的な配列には、以下のように配列番号６～３４が挙げられるが、これらに限定されない。
【0037】
ＷＴ ＰＥＴａｓｅスキャフォールド（配列番号１）上に構築された変異体
【0038】
ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅスキャフォールド（配列番号２）上に構築された変異体
【0039】
ＤｕｒａＰＥＴａｓｅスキャフォールド（配列番号３）上に構築された変異体
【0040】
本開示はまた、本明細書に記載の操作されたＰＥＴヒドロラーゼをコードする核酸、例えば、配列番号１又は配列番号２又は配列番号３と実質的に（例えば、少なくとも７０、８０、９０、又は９５％）同一であり、Ｎ２３３、Ｓ５８、Ｎ１１４、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、Ｔ１４０、Ｓ６１、Ｉ２０８、及びＲ２２４からなる群から選択される配列番号１に対する位置に対応する少なくとも１つの変異を有するアミノ酸を含む、ＰＥＴヒドロラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、核酸は、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。コード配列は、それが発現されるであろう細胞に対してコドン最適化され得る。
【0041】
ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝的組換えの分野における日常的な技術を使用して発現させることができる。このような技術を開示する基本的なテキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４－１９９９）がある。ポリペプチドの改変は、生理活性を低下させることなく、付加的になされ得る。いくつかの改変は、ドメインのクローニング、発現、又は組み込みを容易にするために行われ得る。本明細書に記載のタンパク質は、当業者によって周知である標準方法を使用して作製され得る。大腸菌などの原核細胞又は他の原核宿主を含むがこれらに限定されない種々の宿主細胞における組換え発現は、当技術分野でよく知られている。
【0042】
複合体中の所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、及び組換え発現ベクターを含む宿主細胞、並びに組換え法によるかかるベクター及び宿主細胞の作製方法は、当業者にはよく知られている。
【0043】
ポリヌクレオチドは、当技術分野でよく知られた技術によって合成又は調製され得る。所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、当業者に知られた技術に従って合成され、及び／又はクローニングされ、発現され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、標準的な方法を使用して特定のレシピエントに対してコドン最適化されるであろう。例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、微生物宿主、例えば、酵母又は細菌における発現のためにコドン最適化され得る。
【0044】
有用な細菌の例としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）、及びパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。所望のタンパク質をコードする核酸は、各宿主に適した発現制御配列に作動可能に連結される。大腸菌の場合、これにはＴ７、ｔｒｐ又はλプロモーターのようなプロモーター、リボソーム結合部位、好ましくは転写終結シグナルを含み得る。タンパク質はまた、哺乳類、昆虫、植物、又は酵母細胞のような他の細胞で発現され得る。
【0045】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド構築物は、例えば、検出又は精製の目的のために、１つ以上のアフィニティタグを含む。多くの好適切タグが、例えば、Ｋｉｍｐｌｅらにより記載されたもの（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３；７３（１）：９．９．１－９．９．２３）を含む、ポリペプチド構築物に含まれ得る。アフィニティタグの例としては、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）部位、ＦＬＡＧエピトープ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）部位；Ｍｙｃエピトープ、ポリヒスチジンタグ（例えば、ＨＨＨＨＨＨ）、及びストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、米国特許第５，５０６，１２１号に記載されているものなど）が挙げられるが、これらに限定されない。アフィニティタグは、ポリペプチド構築物中の１つ以上の位置に含まれ得る。ストレプトアビジン結合ペプチドのようなアフィニティタグは、例えば、ポリペプチド構築物のＮ末端又はポリペプチド構築物のＣ末端に存在し得る。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、アフィニティタグ、例えば、追加のアミノ酸残基を有するか又は有さない配列ＤＹＫＤＤＤＤＫを含むＦＬＡＧエピトープを含んでいる。
【0046】
本明細書に記載のポリペプチドは、細胞内で発現させることができ、又は細胞から分泌させることができる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ポリペプチドが細胞から分泌されるように、発現されたポリペプチドのアミノ末端に連結される。
【0047】
一旦発現されると、ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（全体として、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２），Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）参照）。少なくとも約９０～９５％の均質性（例えば、９８～９９％以上の均質性）の実質的に純粋な組成物が、特定の実施形態において提供される。
【0048】
また、ＰＥＴプラスチックディスクと、本明細書に記載の１つ以上の操作されたＰＥＴヒドロラーゼとを含む反応混合物、並びに酵素とのインキュベーション後のディスクのパーセント質量損失によって測定されるＰＥＴプラスチックの分解を実証するためにこのような反応混合物を使用する方法が提供される。反応混合物中の操作されたＰＥＴヒドロラーゼは、精製形態であり得るか、又は宿主細胞中で発現され得る（すなわち、酵素を発現する宿主細胞が、反応混合物中に存在し得る）。記載されたＰＥＴヒドロラーゼのいくつかの利点は、それらが高温で改善された活性を示し得ると同時に、以前に記載された操作された又はネイティブＰＥＴａｓｅよりも高いレベルの活性で、低いｐＨ条件及び低い温度でプラスチックを分解することができるという利点を有していることである。
【0049】
ポリエステル含有材料を分解するのに必要な時間は、ポリエステル含有材料自体（すなわち、プラスチック製品の性質及び起源、その組成、形状など）、使用する正確な酵素及び酵素の量、並びに様々なプロセスパラメータ（すなわち、温度、ｐＨ、追加剤、撹拌など）に依存して変化し得る。
【0050】
いくつかの実施形態では、分解方法の条件は、常温、例えば２５～４５℃の温度を含む。これらの温度は、宿主細胞（例えば、細菌細胞）がＰＥＴヒドロラーゼを発現し、宿主細胞が反応混合物中のＰＥＴプラスチックに接触する実施形態において特に有用であり得る。細胞による最適な生存及び酵素発現のための正確な温度を選択することができる。
【0051】
代替的に、いくつかの実施形態では、ＰＥＴヒドロラーゼは、例えば４０～７０℃又は４５～６５℃又は４５～５５℃のような高い温度下でＰＥＴプラスチックと共にインキュベートされる。
【0052】
いくつかの実施形態では、温度は、分解される材料中のＰＥＴプラスチックのガラス転移温度（Ｔｇ）未満に維持される。いくつかの実施形態では、温度は、分解される材料中のＰＥＴプラスチックのガラス転移温度（Ｔｇ）以上で維持される。いくつかの実施形態では、プロセスは、酵素が複数回使用され、及び／又はリサイクルされ得る温度で、連続的な方式で実施される。
【0053】
種々のｐＨを、記載された酵素と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、酵素及びＰＥＴプラスチックは、６～１０（例えば、６～８、７～８．５、又は８～１０）のｐＨの下で反応される。より中性のｐＨ範囲は、例えば、酵素を発現する細胞がプラスチックとインキュベートされる場合に使用され得る。
【0054】
いくつかの実施形態では、プラスチックとＰＥＴヒドロラーゼとの間の接触面を増加させるように、その構造を物理的に変化させるために、プラスチック含有材料は、ＰＥＴヒドロラーゼと接触させる前に前処理される場合がある。
【0055】
任意に、解重合から生じるモノマー及び／又はオリゴマーを、順次又は連続的に回収することができる。出発プラスチック含有材料に応じて、単一のタイプのモノマー及び／又はオリゴマー、又はいくつかの異なるタイプのモノマー及び／又はオリゴマーが回収され得る。
【0056】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のＰＥＴヒドロラーゼを第２の酵素と組み合わせて（同時又は順次）、プラスチック製品を分解させる。例えばいくつかの実施形態では、第２の酵素はＭＨＥＴａｓｅ酵素である（例えば、Ｐａｌｍら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．１０：１７１７（２０１９）参照）。
【0057】
回収されたモノマー及び／又はオリゴマーは、あらゆる好適な精製方法を使用して、更に精製し、再重合可能な形態に調整することができる。精製方法の例としては、ストリッピング処理、水溶液による分離、蒸気選択的凝縮、バイオプロセス後の媒体のろ過及び濃縮、分離、蒸留、真空蒸発、抽出、電気透析、吸着、イオン交換、沈殿、結晶化、濃度及び酸付加脱水及び沈殿、ナノフィルトレーション、酸触媒処理、半連続モード蒸留又は連続モード蒸留、溶媒抽出、蒸発濃縮、蒸発結晶化、液液抽出、水素化、共沸蒸留プロセス、吸着、カラムクロマトグラフィー、単純真空蒸留及び精密ろ過が挙げられ、これらを組み合わせても、組み合わせなくてもよい。代替的に、回収／遊離したモノマーは、細胞によって（明示的な回収の有無にかかわらず）、様々な製品の製造のための炭素源として使用され得る。これは、細胞をプラスチック及び酵素と共インキュベートすることによって、又は逐次プロセスで達成することができる。
【0058】
以下の実施例は、本発明の態様を例示するものであり、それを限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0059】
実施例１：ニューラルネットワーク解析で予測される変異
ＩｓＰＥＴａｓｅの熱安定性を更に改善するために、より高い適合性を有するＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの設計のために、構造ベースの深層学習人工知能（Ａ．Ｉ．）モデルを導入した（Ｓｈｒｏｆｆ，Ｒａｇｈａｖ ｅｔ ａｌ．，２０１９．“Ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｅｐ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”ＢｉｏＲｘｉｖ，Ｊａｎｕａｒｙ，８３３９０５．Ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／８３３９０５）。この３Ｄ畳み込みニューラルネットワークＡ．Ｉ．モデルは、アミノ酸残基とその周囲の化学環境との正しい関連性を学習するように訓練されていた。このモデルは、タンパク質構造中の好ましくないアミノ酸残基を特定し、タンパク質全体のフォールディング及び機能を向上させるために最適な置換を予測することができる。ＩｓＰＥＴａｓｅ及びＰＥＴフィルム分解アッセイのニューラルネットワーク解析を通じて、ＩｓＰＥＴａｓｅのＰＥＴ分解活性を促進することができる点変異を特定した。
ＩｓＰＥＴａｓｅの熱安定性を更に改善するために、より高い適合性を有するＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの設計のために、構造ベースの深層学習人工知能（Ａ．Ｉ．）モデルを導入した（Ｓｈｒｏｆｆ，Ｒａｇｈａｖ ｅｔ ａｌ．，２０１９．“Ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｅｐ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”ＢｉｏＲｘｉｖ，Ｊａｎｕａｒｙ，８３３９０５．Ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／８３３９０５）。この３Ｄ畳み込みニューラルネットワークＡ．Ｉ．モデルは、アミノ酸残基とその周囲の化学環境との正しい関連性を学習するように訓練されていた。このモデルは、タンパク質構造中の好ましくないアミノ酸残基を特定し、タンパク質全体のフォールディング及び機能を向上させるために最適な置換を予測することができる。ＩｓＰＥＴａｓｅ及びＰＥＴフィルム分解アッセイのニューラルネットワーク解析を通じて、ＩｓＰＥＴａｓｅのＰＥＴ分解活性を促進することができる点変異を特定した。
【0060】
野生型ＰＥＴａｓｅの耐熱性を向上させるために、３Ｄ畳み込みニューラルネットワークＡ．Ｉ．モデル（Ｓｈｒｏｆｆら、２０１９）が、より高い適合性を有するＩｓＰＥＴａｓｅバリアントを再設計するために適用された。最初に、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅに対してニューラルネットワーク解析を実施した。ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに寄託された野生型ＩｓＰＥＴａｓｅの結晶構造（ＰＤＢ：６ＥＱＥ、５ＸＧ０、５ＸＪＨ）を使用して、好ましくない野生型アミノ酸残基が特定され、酵素の全体的な適合性を促進し得るアミノ酸残基に置換することが提案される。その結果、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ１１４Ｔ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、又はＴ１４０Ｄ、Ｓ１２１Ｅ、Ｔ６７Ｄ、及びＱ９１Ｉの１０個のアミノ酸置換が野生型ＩｓＰＥＴａｓｅの変異誘発に選ばれた（表１）。その後、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅについても、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに寄託されている結晶構造（ＰＤＢ：６ｉＪ６）を使用して、ニューラルネットワーク解析を行った。その結果、ニューラルネットワークモデルにより１０個のアミノ酸置換が予測された（表１）。これら２つの予測セットで重複する変異と、ＴＮＫ酵素で提示されている変異を除いて、Ｓ５８Ｅ、Ｎ１１４Ｔ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ６７Ｄ、Ｑ９１Ｉ、Ｓ１２１Ｅ、Ｔ６７Ｄ、Ｑ９１Ｉ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、Ｓ５８Ａ及びＲ２２４Ｑを含む１１個のアミノ酸置換が、更にＴＮＫ酵素の変異誘発に選ばれた。
【0061】
単一又は複数のニューラルネット変異を、異なる遺伝子バックグラウンド（ＷＴ ＩｓＰＥＴａｓｅ、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ）へ導入した。表２は、作成され、かつ特徴付けられている変異体のリストである。
マークは、ＷＴ ＩｓＰＥＴａｓｅ、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、又はＤｕｒａＰＥＴａｓｅバックグラウンドにおける特定の変異の変異体が作成されたことを示す。「＋」マークは、それぞれの祖先型酵素と比較してＰＥＴ分解活性の向上が見られた変異体を強調している。表３は、様々な酵素反応温度でＰＥＴ分解活性が向上した全ての変異体をまとめたものである。「＋」マークは、特定の温度でそれぞれの祖先型酵素と比較してＰＥＴ分解活性の改善を示した変異体を強調している。これに対して、「－」マークは、特定の温度でそれぞれの祖先型酵素と比較して、ＰＥＴ分解活性の改善又は劣化を示していない変異体を強調している。
【0062】
【表1】
【0063】
【表2】
【0064】
【表3】
【0065】
実施例２：イデオネラ・サカイエンシス２０１－Ｆ６ ＩｓＰＥＴａｓｅ遺伝子のクローニング
シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のＩｓＰＥＴａｓｅの分泌を可能にするために、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＭＯ－１９のマルトテトラオース形成アミラーゼ由来のシグナルペプチド－ＳＰｐｓｔｕ（２１アミノ酸）のヌクレオチド配列（Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９８９．“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ（ＡｍｙＰ）ｆｏｒ Ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＭＯ－１９．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ｊｂ．１７１．３．１３３３－１３３９．１９８９）を使用して、ＩｓＰＥＴａｓｅの元のシグナルペプチド配列（最初の２７アミノ酸）を置換し、クローニング用の合成遺伝子を作製した。この合成遺伝子を鋳型として使用して、Ｎ末端にＳＰｐｓｔｕが提示されたＩｓＰＥＴａｓｅ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。その後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法を使用して、ＰＣＲ産物を改変ｐＢＴＫ５５２ベクターにサブクローニングし（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｓｅａｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２０１８．“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｅｅ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ ａ Ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｂｒｏａｄ－Ｈｏｓｔ－Ｒａｎｇｅ Ｐｌａｓｍｉｄｓ．”ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．７ｂ００３９９）、ここで抗生物質耐性マーカーをスペクチノマイシンからカナマイシン耐性遺伝子に切り替えた。エレクトロコンピテントセル大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０βを、標準的なエレクトロポレーションプロトコルに従って、ギブソンアセンブリ産物で形質転換した。得られた発現プラスミド（ｐＬＨ２と命名）ＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、クローニング宿主の一晩培養から抽出された。抽出したプラスミドのＤＮＡ配列は、サンガーシークエンスで検証した。次に、Ｐ．プチダＫＴ２４４０のエレクトロコンピテントセルを、生成した発現プラスミドｐＬＨ２で形質転換した。
シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のＩｓＰＥＴａｓｅの分泌を可能にするために、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＭＯ－１９のマルトテトラオース形成アミラーゼ由来のシグナルペプチド－ＳＰｐｓｔｕ（２１アミノ酸）のヌクレオチド配列（Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９８９．“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ（ＡｍｙＰ）ｆｏｒ Ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＭＯ－１９．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ｊｂ．１７１．３．１３３３－１３３９．１９８９）を使用して、ＩｓＰＥＴａｓｅの元のシグナルペプチド配列（最初の２７アミノ酸）を置換し、クローニング用の合成遺伝子を作製した。この合成遺伝子を鋳型として使用して、Ｎ末端にＳＰｐｓｔｕが提示されたＩｓＰＥＴａｓｅ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。その後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法を使用して、ＰＣＲ産物を改変ｐＢＴＫ５５２ベクターにサブクローニングし（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｓｅａｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２０１８．“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｅｅ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ ａ Ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｂｒｏａｄ－Ｈｏｓｔ－Ｒａｎｇｅ Ｐｌａｓｍｉｄｓ．”ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．７ｂ００３９９）、ここで抗生物質耐性マーカーをスペクチノマイシンからカナマイシン耐性遺伝子に切り替えた。エレクトロコンピテントセル大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０βを、標準的なエレクトロポレーションプロトコルに従って、ギブソンアセンブリ産物で形質転換した。得られた発現プラスミド（ｐＬＨ２と命名）ＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、クローニング宿主の一晩培養から抽出された。抽出したプラスミドのＤＮＡ配列は、サンガーシークエンスで検証した。次に、Ｐ．プチダＫＴ２４４０のエレクトロコンピテントセルを、生成した発現プラスミドｐＬＨ２で形質転換した。
【0066】
実施例３：ＩｓＰＥＴａｓｅタンパク質の発現及び精製
発現プラスミドｐＬＨ２を保有するＰ．プチダＫＴ２４４０株のシングルコロニーを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地２ｍｌに接種し、３０℃／２２５ｒｐｍで一夜培養した。一晩培養した培養液（１５０μｌ使用）を５００ｍｌのシェイクフラスコで１０００倍希釈してスケールアップし、３７℃／２２５ｒｐｍで細胞密度０．６（光学密度［ＯＤ６００］）まで培養した。イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．２ｍＭを添加してタンパク質発現を誘導し、細胞を３０℃／２２５ｒｐｍで２４時間培養した。
発現プラスミドｐＬＨ２を保有するＰ．プチダＫＴ２４４０株のシングルコロニーを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地２ｍｌに接種し、３０℃／２２５ｒｐｍで一夜培養した。一晩培養した培養液（１５０μｌ使用）を５００ｍｌのシェイクフラスコで１０００倍希釈してスケールアップし、３７℃／２２５ｒｐｍで細胞密度０．６（光学密度［ＯＤ６００］）まで培養した。イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．２ｍＭを添加してタンパク質発現を誘導し、細胞を３０℃／２２５ｒｐｍで２４時間培養した。
【0067】
分泌されたＩｓＰＥＴａｓｅの単離は、誘導された細胞培養物を１４，０００ｇで１０分間遠心分離し、分泌タンパク質を有する上清を得た。この上清をＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ－ＮＴＡ Ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、製造者の指示に従い精製を行った。タンパク質溶出の脱塩は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ ＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、製造者の指示に従い実施した。精製及び脱塩の全ての工程は、４℃の低温室で行った。その後、精製したタンパク質をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ装置（５０ｍｌ、１０ＫＤａカットオフ）で濃縮し、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．０）で保存した。タンパク質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。
【0068】
実施例４：イデオネラ・サカイエンシス２０１－Ｆ６ ＩｓＰＥＴａｓｅバリアント遺伝子のクローニング
ニューラルネットワークモデリングにより予測された単一点変異を持つＩｓＰＥＴａｓｅバリアントを作成するために、部位特異的変異誘発を、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に記載されているＰＣＲ法を使用して実施した。変異誘発ＰＣＲ反応の鋳型としてプラスミドｐＬＨ２を使用した。対応するプライマー配列及びアニーリング温度は、ＮＥＢａｓｅＣｈａｎｇｅｒ（商標）ツールを使用して設計及び作成した。Ｓｔｅｌｌａｒ（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をクローニング宿主として使用し、製造元の説明書に記載されている熱ショック法を使用して、ライゲーションしたプラスミドで形質転換した。プラスミドの抽出、配列決定、及びＩｓＰＥＴａｓｅバリアントをコードするプラスミドでのＰ．プチダＫＴ２４４０の形質転換は、プラスミドｐＬＨ２について実施例２に記載したのと同じ条件下で実施した。
ニューラルネットワークモデリングにより予測された単一点変異を持つＩｓＰＥＴａｓｅバリアントを作成するために、部位特異的変異誘発を、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に記載されているＰＣＲ法を使用して実施した。変異誘発ＰＣＲ反応の鋳型としてプラスミドｐＬＨ２を使用した。対応するプライマー配列及びアニーリング温度は、ＮＥＢａｓｅＣｈａｎｇｅｒ（商標）ツールを使用して設計及び作成した。Ｓｔｅｌｌａｒ（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をクローニング宿主として使用し、製造元の説明書に記載されている熱ショック法を使用して、ライゲーションしたプラスミドで形質転換した。プラスミドの抽出、配列決定、及びＩｓＰＥＴａｓｅバリアントをコードするプラスミドでのＰ．プチダＫＴ２４４０の形質転換は、プラスミドｐＬＨ２について実施例２に記載したのと同じ条件下で実施した。
【0069】
実施例５：ＩｓＰＥＴａｓｅバリアントタンパク質の発現及び精製
ＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの発現及び精製は、ＩｓＰＥＴａｓｅタンパク質について実施例３に記載した条件と同じ条件で実施した。
ＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの発現及び精製は、ＩｓＰＥＴａｓｅタンパク質について実施例３に記載した条件と同じ条件で実施した。
【0070】
実施例６：酪酸レゾルフィンを使用するエステラーゼ活性解析のインビトロ解析
酪酸レゾルフィンエステルに対する酵素活性を比較するために、２００ｍＭの精製酵素を、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で１０ｍＭの酪酸レゾルフィン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に室温でインキュベートした。より詳細には、精製酵素をまず１００ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、２００ｎＭの最終濃度を得た。その後、希釈した各酵素サンプルの１０μｌを、９６ウェルバックポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルにピペットで移した。アッセイ試薬の酪酸レゾルフィンを各サンプルウェルに９０μｌ添加することでアッセイ反応を開始し、直ちにＩｎｆｉｎｉｔｅ２００（登録商標）ＰＲＯマイクロプレートプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ ＡＧ）で１０分間、レゾルフィンの蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８８ｎｍ）を連続計測した。
酪酸レゾルフィンエステルに対する酵素活性を比較するために、２００ｍＭの精製酵素を、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で１０ｍＭの酪酸レゾルフィン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に室温でインキュベートした。より詳細には、精製酵素をまず１００ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、２００ｎＭの最終濃度を得た。その後、希釈した各酵素サンプルの１０μｌを、９６ウェルバックポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルにピペットで移した。アッセイ試薬の酪酸レゾルフィンを各サンプルウェルに９０μｌ添加することでアッセイ反応を開始し、直ちにＩｎｆｉｎｉｔｅ２００（登録商標）ＰＲＯマイクロプレートプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ ＡＧ）で１０分間、レゾルフィンの蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８８ｎｍ）を連続計測した。
【0071】
実施例７：市販のＰＥＴフィルムを使用するＰＥＴ分解活性のインビトロ解析
ＩｓＰＥＴａｓｅ及びその酵素バリアントによるＰＥＴの分解率を評価するために、市販のＰＥＴフィルム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、米国５７７－５２９－５０；仕様：密度１．３～１．４ｇｃｍ－３、屈折率１．５８～１．６４、２５℃における水に対する透過性１００×１０－１３ ｃｍ３．ｃｍ ｃｍ－２ ｓ－１ Ｐａ－１、熱膨張係数２０～８０×１０－６Ｋ－１、２３℃における熱伝導率０．１３～０．１５ Ｗ ｍ－１ Ｋ－１）を基材として、Ｐ．プチダから分泌された精製ＩｓＰＥＴａｓｅ酵素及びそのバリアントと共に、分解アッセイに使用した。ＰＥＴフィルムは直径６ｍｍの円形に調製し、１％ＳＤＳ、２０％エタノール、脱イオン水で３回洗浄した。その後、５０ｍＭ、ｐＨ９．０の緩衝液グリシン－ＮａＯＨ中の精製ＩｓＰＥＴａｓｅ ２００ｎＭを含有するガラス試験管に、フィルムを添加した。その後、反応混合物を３０／４０／５０／５５℃で４８／９６時間インキュベートした。その後、得られたＰＥＴａｓｅ処理フィルムを再び３回洗浄し、次いで、重量測定の前に、３０℃で２４時間、真空下でサンプルを乾燥させた。酵素処理前後のＰＥＴフィルムサンプルの重量を比較し、質量損失を算出した。
ＩｓＰＥＴａｓｅ及びその酵素バリアントによるＰＥＴの分解率を評価するために、市販のＰＥＴフィルム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、米国５７７－５２９－５０；仕様：密度１．３～１．４ｇｃｍ－３、屈折率１．５８～１．６４、２５℃における水に対する透過性１００×１０－１３ ｃｍ３．ｃｍ ｃｍ－２ ｓ－１ Ｐａ－１、熱膨張係数２０～８０×１０－６Ｋ－１、２３℃における熱伝導率０．１３～０．１５ Ｗ ｍ－１ Ｋ－１）を基材として、Ｐ．プチダから分泌された精製ＩｓＰＥＴａｓｅ酵素及びそのバリアントと共に、分解アッセイに使用した。ＰＥＴフィルムは直径６ｍｍの円形に調製し、１％ＳＤＳ、２０％エタノール、脱イオン水で３回洗浄した。その後、５０ｍＭ、ｐＨ９．０の緩衝液グリシン－ＮａＯＨ中の精製ＩｓＰＥＴａｓｅ ２００ｎＭを含有するガラス試験管に、フィルムを添加した。その後、反応混合物を３０／４０／５０／５５℃で４８／９６時間インキュベートした。その後、得られたＰＥＴａｓｅ処理フィルムを再び３回洗浄し、次いで、重量測定の前に、３０℃で２４時間、真空下でサンプルを乾燥させた。酵素処理前後のＰＥＴフィルムサンプルの重量を比較し、質量損失を算出した。
【0072】
ある実験では、上記のようなＰＥＴフィルム分解アッセイを使用して、ＩｓＰＥＴａｓｅ Ｎｅｔ単一バリアントのＰＥＴ分解活性を、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ、活性が完全に失われた変異ＰＥＴａｓｅ、及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅと比較する。アッセイ反応は、４０℃で９６時間インキュベートした。その結果を図２に示す。この結果は、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ１１４Ｔ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄが、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較して変異体のＰＥＴ分解活性を高くすることができる有益な置換であることを実証している。これらの単一変異体の中で、変異Ｎ２３３Ｋを含むバリアントは、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅに対して約８．５倍高いＰＥＴ分解活性を示し、最大の改善につながった。
【0073】
１つの実験において、上記と同じＰＥＴフィルム分解アッセイを使用して、それぞれ、ＴＮＫ及びＤＮＫのＰＥＴ分解活性をＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ及びＤｕｒａＰＥＴａｓｅと比較した。アッセイ反応は、３０／４０℃で９６時間、又は５０℃で４８時間インキュベートした。その結果を図５に示す。この結果から、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ及びＤｕｒａＰＥＴａｓｅのアミノ酸配列における置換Ｎ２３３Ｋによっても、ＰＥＴ分解性能が向上することが実証される。具体的には、ＴＮＫは３０℃及び４０℃でＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅとほぼ同様のＰＥＴ分解活性を示したが、５０℃ではＴＮＫがＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅの６．４倍高い活性を示した。これは、置換Ｎ２３３Ｋが、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅの熱耐性を更に改善することを示唆している。これとは対照的に、ＤＮＫは５０℃でＤｕｒａＰＥＴａｓｅよりわずかに高いＰＥＴ分解活性を示すにとどまった。
【0074】
別の実験では、上記のようなＰＥＴフィルム分解アッセイを使用して、ＴＮＫ Ｎｅｔ単一バリアントのＰＥＴ分解活性を、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ及びＴＮＫと比較している。アッセイ反応は、３０／４０／５０／５５℃で９６時間インキュベートした。その結果を図７に示す。この結果は、Ｓ５８Ｅ、Ｎ１１４Ｔ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｓ５８Ａ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ及びＲ２２４Ｑが、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較して変異体のＰＥＴ分解活性を高くすることができる有益な置換であることを実証している。これらの単一変異体のうち、変異Ｎ２３３Ｋを含むバリアントは、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅに対して約８．５倍高いＰＥＴ分解活性を示し、最大の改善につながった。
【0075】
実施例８：
酵素の構造解析に基づき、以下の更なる残基が、活性を改善するための置換のために特定された。
酵素の構造解析に基づき、以下の更なる残基が、活性を改善するための置換のために特定された。
【0076】
Ｓ５８Ｙ－チロシンは、Ｒ５９とカチオン－π相互作用を形成し、Ｓ１４２及びＳ１４３と近くの水分子と水素結合し、高温でタンパク質がアンフォールディングしないように保つことができる。
【0077】
Ｓ５８Ｍ／Ｌ／Ｖ－メチオニン、ロイシン、イソロイシン、及びバリンは、αヘリックスとβシートの間に形成された疎水性ポケットに折り畳まれた非構造化ループを維持し、それらを高温で一緒に保つのを助けることができる。
【0078】
Ｓ５８Ｐ－プロリンは、２本のβストランド間の非構造化ループの柔軟性を制限し、より高温でそれらを一緒に保つことができる。
【0079】
Ｓ６１Ｄ／Ｅ－このセリンは現在Ｒ１３２と水素結合を形成している。このアルギニンはアニオン性残基の近くにはなく、むしろＲ５９に近いため、反発性の静電的相互作用が生じる。この残基のＡＳＰ又はＧＬＵは、Ｒ５９とＲ１３２の間に陰イオンを付加し、結果として、タンパク質を高温で折り畳んだままにする静電引力が生じる。
【0080】
Ｓ６１Ｙ／Ｆ－Ｒ５９とＲ１３２の両方とカチオンπ相互作用を形成することができ、結果として、タンパク質を高温で折り畳んだままにする静電引力が生じる。
【0081】
Ｎ１１４Ｈ／Ｌ／Ｒ－Ｄ１１８と塩橋を形成することができ、Ｑ１２６並びにバックボーン残基Ｔ６３及びＧ６４と水素結合することができる。
【0082】
Ｎ１１４Ｓ／Ｔ－Ｄ１１８及びＱ１２６並びにバックボーン残基Ｔ６３及びＧ６４と水素結合することができる。
【0083】
Ｔ１４０：このスレオニンは、部分的に溶媒にさらされた非構造化ループにある。
【0084】
Ｔ１４０Ｙ－チロシンは、溶媒との水素結合を保持し、Ｒ５９とカチオン－π相互作用を形成する可能性がある。
【0085】
Ｔ１４０Ｌ／Ｉ／Ｖ－この非構造化ループが由来するβシートとαヘリックスとの間の疎水性崩壊を助けることができる。
【0086】
Ｔ１４０Ｓ－溶媒との相互作用を助けることができ、非構造化ループのＳ１４２及びＳ１４３と水素結合してループを緊密に保つことができる。
【0087】
Ｉ２０８Ｍ／Ｈ／Ｆ／Ｙ－近くの残基（Ｙ８７、Ｗ１８５、Ｈ２３７）及びテレフタレート基質のベンゼン環のπ電子と相互作用することができる。
【0088】
Ｉ２０８Ｐ－これは非構造化ループであり、Ｄ２０６を触媒三残基の適切な位置に保持するために、何らかの順序を必要とする。この非構造化ループ内の何らかの柔軟性を取り除くことで、触媒三残基がより高い温度で機能するようになる。
【0089】
Ｉ２０８Ａ－活性部位の求核性Ｓ１６０に対する潜在的な立体障害を除去することになる。
【0090】
Ｒ２２４Ｄ／Ｅ－このアルギニンは、近くにアニオン性残基がなく溶媒に露出しており、Ｋ１７７、Ｋ２２７、Ｒ２６０と反発する相互作用を有するように考えられる。したがって、陰イオン性アミノ酸（ＡＳＰ／ＧＬＵ）を配置することにより、この領域の静電的性質が改善され、耐熱性が向上する。
【0091】
Ｒ２２４Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ－これらのアミノ酸は、反発するカチオンを取り除き、領域の静電相互作用を緩和し、水素結合に寄与する。
【0092】
Ｎ２２５Ｎ－ＡＳＮは疎水性ポケットにある。しかし、バックボーンカルボニルと水素結合する。
【0093】
Ｎ２２５Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ａ／Ｌ－ポケットの疎水性を高め、より高い温度でアンフォールディングしないようにする。
【0094】
Ｎ２２５Ｓ／Ｔ－Ｔ１９５及びＶ１９６へのバックボーン水素結合を維持するが、疎水性ポケットにそれほど突き出ないようにする。
【0095】
Ｎ２３３Ｒ／Ｙ／Ｈ－このアスパラギンは３つのアニオン（Ｅ２０４、Ｅ２３１、Ｄ２８３）に隣接しており、カチオンはこの領域の強い反発静電気を緩和する。
【0096】
Ｎ２３３Ｐ－このアスパラギンは、βストランドの最後と、活性部位に触媒性ヒスチジンを保持する非構造化ループの最初にある。プロリンはこのβストランドをキャップし、触媒性Ｈｉｓへの剛性を助け、より高い温度で触媒的に活性を保持する。
【0097】
Ｍ２６２：このメチオニンは、中央に位置するβシートと緊密な疎水性ポケットにある。
【0098】
Ｍ２６２Ｌ／Ｉ／Ａ／Ｖ－他の疎水性残基は立体障害により強い疎水性相互作用を有し、タンパク質が高温でアンフォールディングしないように保つことができる。
【0099】
Ｍ２６２Ｆ／Ｗ－Ｆ１０６とのπ－πスタッキングにより、疎水性崩壊を強化することができる。
【0100】
Ｔ２７０Ｙ／Ｒ／Ｈ－カチオンがＥ２７４と塩橋を、Ｆ２７１とカチオン－π相互作用を形成し得、この領域が高温で局所構造を保持することを可能にする。
【0101】
実施例９：
プラスチック廃棄物の生成増加及び蓄積は、生態学的な問題を引き起こしている。現在のプラスチック廃棄物管理は、持続不可能でエネルギー集約的、又は危険な物理化学的及び機械的プロセスに大きく依存するが、一方で、酵素分解はプラスチック廃棄物のリサイクルに対して環境に配慮した持続可能なルートを提供する。ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）は、包装材並びに布地及び使い捨て容器の製造に広く使用されており、世界の固体廃棄物の１２％を占めている。しかしながら、これまでにいくつかのＰＥＴヒドロラーゼが報告されているものの、堅牢性に欠ける、又は反応温度がかなり高い（約７０℃）ことにより、バイオレメディエーションなどの実用化が妨げられている。ここで、構造ベースの深層学習モデルを使用して、イデオネラ・サカイエンシス由来の高度に堅牢で機能的なＰＥＴヒドロラーゼを設計する。結果として得られた、最も優れた変異体（αＰＥＴａｓｅ）は、広い適度な温度範囲（特に３０～５０℃）において、葉枝堆肥クチナーゼ及びその変異体を含む対応するものよりも、優れたＰＥＴ加水分解活性を示すだけでなく、向上した耐熱性及びｐＨ耐性も有している。５１種類の異なるプラスチック製品から採取した未処理のポストコンシューマーＰＥＴは、全てαＰＥＴａｓｅによって１週間以内に完全に分解され、５０℃では２４時間という短時間で完全に分解されることを実証する。また、αＰＥＴａｓｅによるＰＥＴ廃棄物の酵素的解重合から回収したモノマーを重合することにより、バージンＰＥＴを再合成することができることを示し、ＰＥＴのクローズドループリサイクルプロセスを実証する。適度な温度における優勢な活性及び微生物との卓越した適合性により、αＰＥＴａｓｅは、酵素ベースと細胞ベースの両方のプラットフォームで理想的な触媒となる。この点で、我々は、分泌型αＰＥＴａｓｅを発現する操作されたシュードモナス株がＰＥＴを分解し、分解産物であるテレフタル酸を増殖のための炭素及びエネルギー源として利用できる、連続的かつ統合的なバイオプロセスを実証し、αＰＥＴａｓｅが環境バイオレメディエーション用途に大きな可能性を秘めていることを示唆する。
プラスチック廃棄物の生成増加及び蓄積は、生態学的な問題を引き起こしている。現在のプラスチック廃棄物管理は、持続不可能でエネルギー集約的、又は危険な物理化学的及び機械的プロセスに大きく依存するが、一方で、酵素分解はプラスチック廃棄物のリサイクルに対して環境に配慮した持続可能なルートを提供する。ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）は、包装材並びに布地及び使い捨て容器の製造に広く使用されており、世界の固体廃棄物の１２％を占めている。しかしながら、これまでにいくつかのＰＥＴヒドロラーゼが報告されているものの、堅牢性に欠ける、又は反応温度がかなり高い（約７０℃）ことにより、バイオレメディエーションなどの実用化が妨げられている。ここで、構造ベースの深層学習モデルを使用して、イデオネラ・サカイエンシス由来の高度に堅牢で機能的なＰＥＴヒドロラーゼを設計する。結果として得られた、最も優れた変異体（αＰＥＴａｓｅ）は、広い適度な温度範囲（特に３０～５０℃）において、葉枝堆肥クチナーゼ及びその変異体を含む対応するものよりも、優れたＰＥＴ加水分解活性を示すだけでなく、向上した耐熱性及びｐＨ耐性も有している。５１種類の異なるプラスチック製品から採取した未処理のポストコンシューマーＰＥＴは、全てαＰＥＴａｓｅによって１週間以内に完全に分解され、５０℃では２４時間という短時間で完全に分解されることを実証する。また、αＰＥＴａｓｅによるＰＥＴ廃棄物の酵素的解重合から回収したモノマーを重合することにより、バージンＰＥＴを再合成することができることを示し、ＰＥＴのクローズドループリサイクルプロセスを実証する。適度な温度における優勢な活性及び微生物との卓越した適合性により、αＰＥＴａｓｅは、酵素ベースと細胞ベースの両方のプラットフォームで理想的な触媒となる。この点で、我々は、分泌型αＰＥＴａｓｅを発現する操作されたシュードモナス株がＰＥＴを分解し、分解産物であるテレフタル酸を増殖のための炭素及びエネルギー源として利用できる、連続的かつ統合的なバイオプロセスを実証し、αＰＥＴａｓｅが環境バイオレメディエーション用途に大きな可能性を秘めていることを示唆する。
【0102】
ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）は、合成繊維の７０％及び非繊維プラスチック包装の１０％を構成し（Ｇｅｙｅｒ，Ｒ．，Ｊａｍｂｅｃｋ，Ｊ．Ｒ．＆ Ｌａｗ，Ｋ．Ｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｕｓｅ，ａｎｄ ｆａｔｅ ｏｆ ａｌｌ ｐｌａｓｔｉｃｓ ｅｖｅｒ ｍａｄｅ．Ｓｃｉ．Ａｄｖ．３，（２０１７））、それに応じて、使い捨ての製造された材料の膨大な廃棄物の流れの典型となっている。しかし、ＰＥＴの循環型炭素経済は、迅速な酵素的解重合、及びそれに続く化学的再重合又は他の製品へのアップサイクル／価値化によって理論的に達成可能である（Ｓｉｍｏｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂａｌ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｔｏ ａｄｄｒｅｓｓ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｃｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）．３７３，４３ ＬＰ－４７（２０２１）），（Ｋａｗａｉ，Ｆ．，Ｋａｗａｂａｔａ，Ｔ．＆ Ｏｄａ，Ｍ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ＰＥＴ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｗａｓｔｅ ｓｔｒｅａｍ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｉｅｌｄｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０３，（２０１９））。しかしながら、既存の全てのＰＥＴ加水分解酵素（ＰＨＥ）は、適度なｐＨ／温度範囲で機能する、または未処理のポストコンシューマー・プラスチックを直接利用する能力が制限されている。このような特性は、インサイチュのバイオレメディエーション及び簡便で低コストの工業規模プロセスに不可欠である（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．ＰＥＴの生分解：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ａｓｐｅｃｔｓ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃａｔａｌ．８ｂ０５１７１）。これらの制限を克服するために、深層学習及びタンパク質工学のアプローチを採用して、他の全ての既知のＰＨＥ、及び派生変異体を上回る様式で、広範囲の生のＰＥＴ基質（モデル及び実際のポストコンシューマーＰＥＴの両方）、温度、及びｐＨレベルにわたって例外的に高い活性を有するＰＨＥを生成した。
【0103】
ＰＥＴの酵素的解重合は、２００５年に初めて報告され、エステラーゼ、リパーゼ、及びクチナーゼに由来する１９種類の異なるＰＨＥを使用して最近実証されている（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＴ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ａｓｐｅｃｔｓ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃａｔａｌ．８ｂ０５１７１），（Ｉｎｄｅｒｔｈａｌ，Ｈ．，Ｔａｉ，Ｓ．Ｌ．＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．Ｌ．Ｎｏｎ－Ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ Ｐｌａｓｔｉｃｓ－Ａｎ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｌｏｏｋ ａｔ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂｉｏ－Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｔｅｃｈ．２０２０．０５．００４），（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｄａｉ，Ｌ．，Ｍａ，Ｌ．＆ Ｇｕｏ，Ｒ．Ｔ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０２０）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７０－０２０－０１６３－６）。しかしながら、これらの酵素の大部分は、高い反応温度（すなわち、ＰＥＴのガラス転移温度約７０℃以上）においてのみ、評価できる加水分解活性を示す。例えば、人工の葉枝堆肥クチナーゼ（ＬＣＣ）は、前処理したポストコンシューマーＰＥＴを、７２℃、ｐＨ８．０で１０時間以内に９０％分解することができる（Ｔｏｕｒｎｉｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＰＥＴ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｂｒｅａｋ ｄｏｗｎ ａｎｄ ｒｅｃｙｃｌｅ ｐｌａｓｔｉｃ ｂｏｔｔｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２０２０）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２１４９－４）。他のほとんどのＰＨＥも同様に、適度な温度（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｄｅｇｒａｄｅｓ ａｎｄ ａｓｓｉｍｉｌａｔｅｓ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）．（２０１６）．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ６３５９）、及びより中性のｐＨ条件下では、不十分な活性を示し（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｃａｔａｌ．（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１９２９－０２１－００６１６－ｙ）、ＰＥＴ廃棄物のインサイチュの微生物によるバイオレメディエーションソリューションに大きな制約を与えている。回収不能なプラスチックの４０％が自然環境に存在するため、この制限は重大な懸念事項である（Ｗｏｒｍ，Ｂ．，Ｌｏｔｚｅ，Ｈ．Ｋ．，Ｊｕｂｉｎｖｉｌｌｅ，Ｉ．，Ｗｉｌｃｏｘ，Ｃ．＆ Ｊａｍｂｅｃｋ，Ｊ．Ｐｌａｓｔｉｃ ａｓ ａ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｍａｒｉｎｅ Ｐｏｌｌｕｔａｎｔ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（２０１７）．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｅｎｖｉｒｏｎ－１０２０１６－０６０７００）。加えて、未処理のポストコンシューマー・プラスチック廃棄物を常温付近で変換することが、産業用途では望ましいのに対し、高温や前処理は純運転コストを増加させる。
【0104】
一方、ＰＥＴ資化性細菌イデオネラ・サカイエンシス由来のＰＨＥ（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｄｅｇｒａｄｅｓ ａｎｄ ａｓｓｉｍｉｌａｔｅｓ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－３５１，１１９６ ＬＰ－１１９９（２０１６）．）（ＰＥＴａｓｅ）は常温で動作可能であるが、非常に不安定であり、３７℃でも２４時間後には活性が失われる（Ｓｏｎ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｔａｂｌｅ ＰＥＴａｓｅ ｆｒｏｍ Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＥＴ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．９，３５１９－３５２６（２０１９））。よって、実用化には限界がある。それにもかかわらず、この中温性酵素は、これまでにも耐熱性、堅牢性、機能性を向上させる試みがなされてきた。（Ｓｏｎ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｔａｂｌｅ ＰＥＴａｓｅ ｆｒｏｍ Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＥＴ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．９、３５１９－３５２６（２０１９）），（Ａｕｓｔｉｎ，Ｈ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａ ｐｌａｓｔｉｃ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ａｒｏｍａｔｉｃ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１５，Ｅ４３５０－Ｅ４３５７（２０１８）），（Ｊｏｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，（２０１８）），（Ｈａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＰＥＴ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１７－０２２５５－ｚ），（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｍ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｎ．，Ｏｄａ，Ｋ．＆ Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｏａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ａｎｉｏｎｉｃ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ（２０１８）．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｓｓｃ．２０１８０２０９６），（Ｃｕｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ＰＥＴａｓｅ ｆｏｒ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ Ａｍｂｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＧＲＡＰＥ Ｓｔｒａｔｅｇｙ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃａｔａｌ．０ｃ０５１２６），（Ｃｈｅｎ，Ｋ．，Ｈｕ，Ｙ．，Ｄｏｎｇ，Ｘ．＆ Ｓｕｎ，Ｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ＥＫｙｌａｔｅｄ ＰＥＴａｓｅ Ｔｏｗａｒｄ ＰＥＴ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．１１，７３５８－７３７０（２０２１））。最も注目に値する操作されたＰＥＴａｓｅバリアントであるＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｓｏｎ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｔａｂｌｅ ＰＥＴａｓｅ ｆｒｏｍ Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＥＴ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．９，３５１９－３５２６ （２０１９））、及びＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｃｕｉ，Ｙ．－Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＰＥＴａｓｅ ｆｏｒ ｐｌａｓｔｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＧＲＡＰＥ ｓｔｒａｔｅｇｙ．（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１１０１／７８７０６９）は、それぞれ、合理的なタンパク質工学及び計算機による再設計によって作製された。これら２つの変異体は、特定の条件下で耐熱性及び触媒活性が改善されたが（Ｓｏｎ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｔａｂｌｅ ＰＥＴａｓｅ ｆｒｏｍ Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＥＴ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．９，３５１９－３５２６（２０１９）），（Ｃｕｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ＰＥＴａｓｅ ｆｏｒ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ Ａｍｂｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＧＲＡＰＥ Ｓｔｒａｔｅｇｙ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃａｔａｌ．０ｃ０５１２６）、温和な温度では全体のＰＥＴ加水分解活性は低かった。
【0105】
我々は、より焦点を絞ったタンパク質工学的アプローチでは、全体的な安定性と活性との間の進化的なトレードオフを克服することはできず、中立的で構造に基づいた深層学習ニューラルネットワークが、あらゆる条件下で一般的に酵素の機能を改善する可能性があると仮定した。そこで、三次元自己教師型畳み込みニューラルネットワーク、ＭｕｔＣｏｍｐｕｔｅを採用した（Ｓｈｒｏｆｆ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｇｕｉｄｅｄ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｅｐ ｌｅａｒｎｉｎｇ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ（２０２０）．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．０ｃ００３４５）。このアルゴリズムは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋにある１９，０００を超える配列多様なタンパク質構造で訓練され、アミノ酸残基を局所的な化学的微小環境と関連付ける。具体的には、野生型ＰＥＴａｓｅ及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（結晶構造ＰＤＢ：５ＸＪＨ及び６ＩＪ６）の各残基における２０個の正規アミノ酸を全てシミュレーションした構造適合の離散確率分布を得るために、ＭｕｔＣｏｍｐｕｔｅを採用した。変異の対象となる重大な残基の選択を支援するために、この分布をタンパク質の結晶構造上に表示して（図９ａ）、野生型アミノ酸残基が置換候補よりも「適合性が低い」位置を特定した。また、タンパク質工学の実験に焦点を当てるため、これらの予測値を更に適合確率の予測された変化倍率でランク付けし、最も一致しない残基を変異誘発の対象とした。段階的組み合わせ戦略を使用して、このリストの残基を使用して、様々なＰＥＴａｓｅスキャフォールドに単一又は複数の予測される変異を組み込むために、合計１５９個のバリアントを生成した。向上した触媒活性（エステラーゼ活性及びプラスチック分解速度で測定）並びに耐熱性（タンパク質融点（Ｔｍ）で測定）を示すバリアントを、更に評価した。このセットのうち、４つの予測される変異（Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２３３Ｋ、Ｒ２２４Ｑ、Ｔ１４０Ｄ）（図９ｂ）は、単独及び組み合わせの両方で最高の改善をもたらすため、更なる組み合わせによる組み立て及び追跡調査解析に選択された。
【0106】
３つのＰＥＴａｓｅスキャフォールド（野生型ＰＥＴａｓｅ、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ）にわたって、これら４つの変異の２９の可能な組み合わせ全てを組み立てた。注目すべきは、２つは、複数回の試行後、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅバックグラウンドを使用して精製することができなかった点である。残りの２７個の変異体の耐熱性解析の結果、２４個（約８９％）がそれぞれのスキャフォールドに比べてＴｍを上昇させた（図１３）。それぞれのＰＥＴａｓｅスキャフォールドから耐熱性の最も高い変化が観察されたのは、Ｔｍ５８．１℃のバリアント、ＰＥＴａｓｅＮ２３３Ｋ／Ｔ１４０Ｄ（ＷＴ ＰＥＴａｓｅからΔＴｍ＝１０℃）、Ｔｍ６７．４℃のＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅＮ２３３Ｋ／Ｒ２２４Ｑ（ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅからのΔＴｍ＝９℃）、及びＴｍ８３．５℃のＤｕｒａＰＥＴａｓｅＮ２３３Ｋ（ＤｕｒａＰＥＴａｓｅからのΔＴｍ＝５℃）であった。後者の変異体は、これまでに報告されている最も耐熱性が高いＰＥＴａｓｅ変異体を代表している。また、２７個のバリアント全てのタンパク質収量が親スキャフォールドと比較して向上しており（最大３．８倍増加）、Ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅがより安定性の高い変異体を同定できることが更に強調された。これらの変異は、スキャフォールドにわたって移し替え可能（ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ）であり、組み合わせの相乗効果を発揮することから、このニューラルネットワークベースのアプローチの威力を実証している。
【0107】
次に、文献（Ｔｏｕｒｎｉｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＰＥＴ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｂｒｅａｋ ｄｏｗｎ ａｎｄ ｒｅｃｙｃｌｅ ｐｌａｓｔｉｃ ｂｏｔｔｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２０２０）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２１４９－４）で一般的に使用されている非晶質ＰＥＴフィルム（ｇｆ－ＰＥＴ、サプライヤーＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ）を使用して、３０～６０℃の温度範囲でこれらのより安定なバリアントのＰＥＴ加水分解活性を評価しようと試みた。この比較から、機械学習による予測により、全てのスキャフォールドにおいてＰＥＴ加水分解活性が大幅に向上し、作動温度範囲が拡大したことが直ちに判明した（図９ｃ）。特に、ＰＥＴａｓｅＮ２３３Ｋ／Ｒ２２４Ｑ／Ｓ１２１Ｅは、野生型ＰＥＴａｓｅと比較して、それぞれ、３０℃及び４０℃で３．４倍及び２９倍のＰＥＴ加水分解活性の増加を示した（図９ｃ）。ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅスキャフォールドに基づく酵素変異体は、作動温度範囲が拡大されており（３０～６０℃）、対応するものよりも有意に高い活性を示した。このセットの中で、最も優れたＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアント－ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅＮ２３３Ｋ／Ｒ２２４Ｑ（αＰＥＴａｓｅと命名）は、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ単独と比較して、それぞれ、４０℃及び５０℃で２．４倍及び３８倍高い活性を示した（図９ｃ）。５０℃では、αＰＥＴａｓｅは全ての変異体の中で最も高い全体分解を示し、９６時間で３３．８ｍＭのＰＥＴモノマーを放出する温度活性を示した（図９ｃ）。ＤｕｒａＰＥＴａｓｅスキャフォールドは一般に、温和な温度（３０～５０℃）では比較的低い活性を示したが、最も耐熱性の高いＰＥＴａｓｅ変異体－ＤｕｒａＰＥＴａｓｅＮ２３３Ｋ（βＰＥＴａｓｅと命名）によって示されるように、高温（５５～６０℃）で改善が実現した（図９ｃ）。
【0108】
これらの変異体の環境条件に対する触媒回復力を評価するため、αＰＥＴａｓｅ及びβＰＥＴａｓｅを、ｇｆ－ＰＥＴを使用して、４０℃、様々なｐＨ範囲（６．５～８．０）で、野生型ＰＥＴａｓｅ、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ、最も活性な変異体ＬＣＣＦ２４３Ｉ／Ｄ２３８Ｃ／Ｓ２８３Ｃ／Ｎ２４６Ｍ（ＩＣＣＭ）を含む、既に報告された野生型及び変異体ＰＨＥと比較した（図１０）。この比較分析により、αＰＥＴａｓｅが低ｐＨレベル及び常温で機能するユニークな触媒能力を有することが実証された。具体的には、αＰＥＴａｓｅは全てのｐＨ条件下で他のＰＨＥより優れていた。特にｐＨ７では、αＰＥＴａｓｅは４０℃において野生型ＰＥＴａｓｅの１１５倍の活性を示した（図１０）。このような酵素性能から、αＰＥＴａｓｅは、インサイチュのプラスチック・バイオレメディエーションに見られるＰＥＴの温和な温度及び適度なｐＨにおける酵素分解のための優れた候補となる。
【0109】
モデルプラスチック基材の他に、未処理のポストコンシューマーＰＥＴ（ｐｃ－ＰＥＴ）に対するＰＥＴａｓｅ酵素の性能を実証することが重要である。注目すべきは、上記や文献で使用されているｇｆ－ＰＥＴとは異なり、単一のポストコンシューマーＰＥＴ基材が存在しないことである。そこで、食品、飲料、薬品、事務用品、日用品、及び化粧品などの包装に使用されているポストコンシューマー・プラスチック製品について、地元の食料品店チェーンで５１種類のサンプルを集め、この原料を５０℃においてαＰＥＴａｓｅで酵素処理した（図１４）。結晶化度及び厚みなどの物理的特性を含む不均一性、並びに添加剤及び可塑剤などの異なる組成にもかかわらず、この幅広いＰＥＴ製品の穴開けにより得たサンプルは、αＰＥＴａｓｅによっていずれも１週間以内、最短２４時間で完全に分解された（図１１ａ）。プラスチックの厚さは分解時間と相関していたが（厚さと質量とが関連しているため）、この測定基準及び結晶化度のいずれも、単独では、全体の分解率は決定されなかった。
【0110】
上記で試験したポストコンシューマー製品のうち、５０℃で２４時間以内にαＰＥＴａｓｅが完全に分解した豆菓子容器のサンプルを、更に評価した。経時的解析（図１１ｂ）により、このｐｃ－ＰＥＴフィルムの分解は、放出された総ＰＥＴモノマーからみて、αＰＥＴａｓｅを使用してほぼ直線的な減衰率を示すことが判明した。それに伴い、αＰＥＴａｓｅによるｐｃ－ＰＥＴフィルムの分解は、２４時間での１．２％から７．７％への結晶化度の増加をもたらした。原子間力顕微鏡（図１１ｃ）及び走査型電子顕微鏡は、αＰＥＴａｓｅの反応進行により、ｐｃ－ＰＥＴ表面にますます深く大きな穴が生成され、反応時間と共に表面粗さが増加することを示した。これとは対照的に、このｐｃ－ＰＥＴに対する野生型ＰＥＴａｓｅ、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ、及びＩＣＣＭのＰＥＴ加水分解活性は、同じ条件下でαＰＥＴａｓｅのそれよりも大幅に（４．２～２９５倍）低かった（図１１ｂ）。興味深いことに、先に報告した最適反応温度７２℃においても（Ｔｏｕｒｎｉｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＰＥＴ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｂｒｅａｋ ｄｏｗｎ ａｎｄ ｒｅｃｙｃｌｅ ｐｌａｓｔｉｃ ｂｏｔｔｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２０２０）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２１４９－４）、ＬＣＣ及びＩＣＣＭの活性は、５０℃において依然として、αＰＥＴａｓｅのそれよりも６．３倍及び２．７倍低かった。更に実験的に解析したところ、ＬＣＣ及びＩＣＣＭは６０℃において、このｐｃ－ＰＥＴフィルムに対して最も高い分解率を示すことが判明した。しかしながら、６０℃においても、ＬＣＣ及びＩＣＣＭの活性は、５０℃におけるαＰＥＴａｓｅのそれよりも依然として低かった。更に、αＰＥＴａｓｅを用いたプロセスは、単に正味の反応体積を増加させるだけで、未処理の大きなプラスチック片（この場合、１１ｍｇではなく４ｇ）にも容易に拡張できることを実証している（図１１ｄ）。これらの結果から、αＰＥＴａｓｅは、より高い反応温度を必要とするＩＣＣＭとは対照的に、より低い運転コスト及びポストコンシューマーＰＥＴの高い分解効率という利点を有する、未処理の生のＰＥＴ廃棄物のリサイクルを目的とした酵素ベースのプラットフォームの有望な生体触媒として機能し得る。
【0111】
包装材料以外にも、ＰＥＴは合成繊維産業で多く使用されている。この目的のために、市販のポリエステル製品を部分的に分解するためのαＰＥＴａｓｅの応用の可能性を評価した。５つの異なる市販のポリエステル製品を５０℃においてαＰＥＴａｓｅで処理したところ、他のＰＨＥで処理したサンプルのそれと比較して、テレフタル酸（ＴＰＡ）及びモノ－（２－ヒドロキシエチル）テレフタレートをより多く放出した（図１１ｅ）。このことから、αＰＥＴａｓｅは織物に埋め込まれたマイクロプラスチックを迅速かつ効率的に分解するために使用できる可能性があり、市販のポリエステル製品からＰＥＴモノマーを回収し、マイクロファイバーの環境への溶出を低減するための潜在的なルートを提供する。
【0112】
このαＰＥＴａｓｅ変異体の常温及びｐＨ条件下での高い活性から、この酵素はＰＥＴの様々な酵素－微生物的、酵素－化学的処理に好適であると仮定した。この点で、ＰＥＴの分解は循環型プラスチック経済の半分に過ぎず、我々はここで、αＰＥＴａｓｅが化学的及び生物学的リサイクル／アップサイクリングアプリケーションの両方の用途に適合することを実証する。最初に、αＰＥＴａｓｅを利用してポストコンシューマー・プラスチック廃棄物を分解し、引き続き、モノマーを回収することで、クローズドサイクルのＰＥＴ再利用を実証する。次に、分解液から直接、化学重合を使用してバージンＰＥＴを再生する（図１２ａ）。分解から再重合までの完全なサイクルは、わずか数日間で完了した。これらの結果は、非石油資源からバージンＰＥＴを生成するクローズドループの酵素／化学リサイクルプロセスの実現可能性を実証する。
【0113】
第２に、αＰＥＴａｓｅの常温での分解能力を利用して、モノマーの直接解重合及び微生物価値化／バイオレメディエーションを実現しようと試みた。この目的のために、αＰＥＴａｓｅを使用して同時及び統合的な生分解の両方のスキームを評価した。特に、土壌細菌シュードモナス・プチダＧｏ１９（Ｎａｒａｎｃｉｃ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｕｍｓｏｎｇｅｎｓｉｓ ＧＯ１６：ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ＰＥＴ ｍｏｎｏｍｅｒ ｕｐｃｙｃｌｉｎｇ ｉｎｔｏ ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１１１１／１７５１－７９１５．１３７１２）、（Ｋｅｎｎｙ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｕｐ－ｃｙｃｌｉｎｇ ｏｆ ＰＥＴ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）ｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｌａｓｔｉｃ ＰＨＡ（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｅｓ８０１０１０ｅ）は、ＴＰＡを炭素及びエネルギー源として自然に利用することができる。最初に、ＰＥＴの解重合及び発酵を同時に行う可能性を探求するため、外因性αＰＥＴａｓｅと、その宿主を組み合わせることを試みた。Ｐ．プチダＧｏ１９を、他の炭素源を含まない未処理のｐｃ－ＰＥＴフィルムを添加した最小限の培地に接種した。培地に２００ｍＭの精製αＰＥＴａｓｅを添加し、３５℃でインキュベーションしたところ、ｐｃ－ＰＥＴフィルムが分解され、不透明になり、初期重量の１１．５±０．３％が失われると同時に、Ｐ．プチダＧｏ１９の増殖が観察された（図１２ｂ）。この実験を通して、αＰＥＴａｓｅによるｐｃ－ＰＥＴフィルムの加水分解で遊離したＴＰＡが、Ｐ．プチダＧｏ１９の増殖に消費されたことを観察した（図１２ｂ）。これとは対照的に、このようなプロセスにおいて、触媒として野生型ＰＥＴａｓｅ、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ、又はＩＣＣＭを使用した場合、Ｐ．プチダＧｏ１９の細胞密度及びｐｃ－ＰＥＴフィルムの重量損失は全てαＰＥＴａｓｅを使用した場合に比べて有意に低かった（図１２ｂ）。これらの結果は、試験した他のＰＨＥと比較すると、αＰＥＴａｓｅが、細胞増殖適合条件下で最高のＰＥＴ加水分解活性を示すことを実証した。
【0114】
最後に、Ｐ．プチダＧｏ１９にαＰＥＴａｓｅの発現を組み込んで、ｐｃ－ＰＥＴをバイオマスに変換することを可能にし、統合的なバイオプロセスを開発しようと試みた。これを行うために、Ｐ．プチダＧｏ１９を操作して、３０ｍｇ／Ｌの高収率でαＰＥＴａｓｅを効率的に分泌させた。統合プロセスをＴＰＡでプライミングした後、操作された株にｐｃ－ＰＥＴフィルムを唯一の炭素源として供給した。３５℃における９６時間のインキュベーション後、フィルムの不透明度及び１８．１±３．１％の重量損失で証明されるように、Ｐ．プチダＧｏ１９はｐｃ－ＰＥＴフィルムを部分的に分解した。同様に、遊離したモノマーは、細胞増殖に直接利用された（図１２ｃ）。この実証は、酵素生産を統合して、常温及び中性ｐＨにおけるオンサイトのＰＥＴ解重合及びＴＰＡのバイオマスへの変換を実行する最初の統合バイオプロセスを示している。
【0115】
結論として、本研究では、構造ベースの深層学習モデルを利用して、種々のＰＥＴａｓｅスキャフォールドにわたって安定性及び機能の向上を付与する移し替え可能な変異を同定した。最良のバリアントであるαＰＥＴａｓｅは、広い温度範囲（３０～５０℃）で優勢な活性を示し、細胞増殖条件との卓越した適合性を示す。我々は、この能力を、未処理の粗大ポストコンシューマーＰＥＴ廃棄物を迅速かつ効率的に分解し、織物に埋め込まれたマイクロプラスチックを減少させることで実証する。この変異体の特性は、Ｐ．プチダＧｏ１９を使用して、同時及び統合バイオプロセスによって実証されたように、低コストの産業リサイクル及びインサイチュプラスチックバイオレメディエーション用途の両方に好適である。総合すると、これらの結果は、構造ベースの深層学習がタンパク質工学にもたらし得る影響、及び中温性酵素を直接のプラスチック解重合のための広範な生体触媒に進化させる有用性を実証している。
【0116】
配列
配列番号１
長さ：２９０
他の情報：野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ
配列：１
配列番号１
長さ：２９０
他の情報：野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ
配列：１
【0117】
配列番号２
長さ：２９０
他の情報：ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（ＩｓＰＥＴａｓｅＳ１２１Ｅ／Ｄ１８６Ｈ／Ｒ２８０Ａ）
配列：２
長さ：２９０
他の情報：ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（ＩｓＰＥＴａｓｅＳ１２１Ｅ／Ｄ１８６Ｈ／Ｒ２８０Ａ）
配列：２
【0118】
配列番号３
長さ：２９０
他の情報：ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（ＩｓＰＥＴａｓｅＬ１１７Ｆ／Ｑ１１９Ｙ／Ｔ１４０Ｄ／Ｗ１５９Ｈ，Ｇ１６５Ａ／Ｉ１６８Ｒ／Ａ１８０Ｉ／Ｓ１８８Ｑ／Ｓ２１４Ｈ／Ｒ２８０Ａ）
配列：３
長さ：２９０
他の情報：ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（ＩｓＰＥＴａｓｅＬ１１７Ｆ／Ｑ１１９Ｙ／Ｔ１４０Ｄ／Ｗ１５９Ｈ，Ｇ１６５Ａ／Ｉ１６８Ｒ／Ａ１８０Ｉ／Ｓ１８８Ｑ／Ｓ２１４Ｈ／Ｒ２８０Ａ）
配列：３
【0119】
配列番号４
長さ：２９０
他の情報：ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（ＩｓＰＥＴａｓｅＳ１２１Ｅ／Ｄ１８６Ｈ／Ｒ２８０Ａ／Ｎ２３３Ｋ）
配列：４
長さ：２９０
他の情報：ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（ＩｓＰＥＴａｓｅＳ１２１Ｅ／Ｄ１８６Ｈ／Ｒ２８０Ａ／Ｎ２３３Ｋ）
配列：４
【0120】
配列番号５
長さ：２９０
他の情報：ＷＴ ＮＥＴ
配列：５
長さ：２９０
他の情報：ＷＴ ＮＥＴ
配列：５
【0121】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例示及び実施例により若干詳細に説明されているが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲の範囲内で特定の変更及び改変が実施され得ることを理解するであろう。加えて、本明細書で与えられている各参考文献は、各参考文献が個々に参照により組み込まれるのと同程度に、その全体が参照により組み込まれる。本出願と、本明細書で与えられている参考文献との間に矛盾が存在する場合、本出願が優先されるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図11e】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図13】
【図14】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0013】
いくつかの実施形態において、条件は、６～１０（例えば、６～８、７～８．５、又は８～１０）のｐＨにおけるインキュベーションを含む。
[本発明１００１]
配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ
Ｎ２３３、Ｓ５８、Ｎ１１４、Ｓ１２１、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、Ｔ１４０、Ｓ６１、Ｉ２０８、及びＲ２２４からなる群から選択される、配列番号１に対する位置
に対応する少なくとも１つの変異を有する、
操作されたＰＥＴ（ポリ（エチレンテレフタレート））ヒドロラーゼ。
[本発明１００２]
前記少なくとも１つの変異が、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される、本発明１００１の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００３]
前記少なくとも１つの変異が、Ｓ５８Ｙ、Ｓ５８Ｍ、Ｓ５８Ｌ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｐ、Ｓ６１Ｄ、Ｓ６１Ｅ、Ｓ６１Ｙ、Ｓ６１Ｆ、Ｎ１１４Ｈ、Ｎ１１４Ｌ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１４Ｓ、Ｎ１１４Ｔ、Ｔ１４０Ｙ、Ｔ１４０Ｌ、Ｔ１４０Ｉ、Ｔ１４０Ｖ、Ｔ１４０Ｓ、Ｉ２０８Ｍ、Ｉ２０８Ｈ、Ｉ２０８Ｆ、Ｉ２０８Ｙ、Ｉ２０８Ｐ、Ｉ２０８Ａ、Ｒ２２４Ｄ、Ｒ２２４Ｅ、Ｒ２２４Ｓ、Ｒ２２４Ｔ、Ｒ２２４Ｎ、Ｒ２２４Ｑ、Ｎ２２５Ｎ、Ｎ２２５Ｉ、Ｎ２２５Ｖ、Ｎ２２５Ｍ、Ｎ２２５Ａ、Ｎ２２５Ｌ、Ｎ２２５Ｓ、Ｎ２２５Ｔ、Ｎ２３３Ｒ、Ｎ２３３Ｙ、Ｎ２３３Ｈ、Ｎ２３３Ｐ、Ｍ２６２Ｌ、Ｍ２６２Ｉ、Ｍ２６２Ａ、Ｍ２６２Ｖ、Ｍ２６２Ｆ、Ｍ２６２Ｗ、Ｔ２７０Ｙ、Ｔ２７０Ｒ、及びＴ２７０Ｈからなる群から選択される、本発明１００１の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００４]
前記アミノ酸配列が、配列番号１、２又は３と少なくとも９５％、９８％、又は９９％同一である、本発明１００１又は１００２又は１００３の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００５]
前記アミノ酸配列が、前記少なくとも１つの変異を除いて、配列番号１、２又は３と同一である、本発明１００１又は１００２又は１００３の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００６]
前記アミノ酸配列が、配列番号６～３４のうちの１つ以上と少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％同一である、本発明１００１又は１００２又は１００３の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００７]
前記アミノ酸配列が、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される、配列番号１に対する位置に対応する少なくとも２つの変異を有する、本発明１００１又は１００４のいずれかの操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００８]
前記アミノ酸配列が、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、Ｒ２２４Ｑ、Ｓ５８Ｙ、Ｓ５８Ｍ、Ｓ５８Ｌ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｐ、Ｓ６１Ｄ、Ｓ６１Ｅ、Ｓ６１Ｙ、Ｓ６１Ｆ、Ｎ１１４Ｈ、Ｎ１１４Ｌ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１４Ｓ、Ｎ１１４Ｔ、Ｔ１４０Ｙ、Ｔ１４０Ｌ、Ｔ１４０Ｉ、Ｔ１４０Ｖ、Ｔ１４０Ｓ、Ｓ１２１Ｅ、Ｉ２０８Ｍ、Ｉ２０８Ｈ、Ｉ２０８Ｆ、Ｉ２０８Ｙ、Ｉ２０８Ｐ、Ｉ２０８Ａ、Ｒ２２４Ｄ、Ｒ２２４Ｅ、Ｒ２２４Ｓ、Ｒ２２４Ｔ、Ｒ２２４Ｎ、Ｒ２２４Ｑ、Ｎ２２５Ｎ、Ｎ２２５Ｉ、Ｎ２２５Ｖ、Ｎ２２５Ｍ、Ｎ２２５Ａ、Ｎ２２５Ｌ、Ｎ２２５Ｓ、Ｎ２２５Ｔ、Ｎ２３３Ｒ、Ｎ２３３Ｙ、Ｎ２３３Ｈ、Ｎ２３３Ｐ、Ｍ２６２Ｌ、Ｍ２６２Ｉ、Ｍ２６２Ａ、Ｍ２６２Ｖ、Ｍ２６２Ｆ、Ｍ２６２Ｗ、Ｔ２７０Ｙ、Ｔ２７０Ｒ、及びＴ２７０Ｈからなる群から選択される、配列番号１に対する位置に対応する２つ又は３つの変異を有する、本発明１００１又は１００４のいずれかの操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００９]
本発明１００１～１００８のいずれかの操作されたＰＥＴヒドロラーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明１０１０]
前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼが、シグナルペプチドを更に含む、本発明１００９のポリヌクレオチド。
[本発明１０１１]
本発明１００９～１０１０のいずれかのポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターであって、それにより、前記プロモーターが、前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼの発現を制御する、ベクター。
[本発明１０１２]
本発明１００９～１０１０のいずれかのポリヌクレオチド又は本発明１０１１のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明１０１３]
微生物細胞である、本発明１０１２の宿主細胞。
[本発明１０１４]
細菌細胞である、本発明１０１２の宿主細胞。
[本発明１０１５]
前記細菌細胞がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である、本発明の宿主細胞。
[本発明１０１６]
真菌細胞である、本発明１０１２の宿主細胞。
[本発明１０１７]
ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）を分解する方法であって、ＰＥＴを、本発明１００１～１００８のいずれかの操作されたＰＥＴヒドロラーゼと、前記ＰＥＴを分解する条件下で接触させることを含む、方法。
[本発明１０１８]
前記ＰＥＴを、前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼを発現及び分泌する宿主細胞と接触させることを含む、本発明１０１７の方法。
[本発明１０１９]
前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼが精製されている、本発明１０１７の方法。
[本発明１０２０]
前記条件が、２５～７０℃の温度におけるインキュベーションを含む、本発明１０１７～１０１９のいずれかの方法。
[本発明１０２１]
前記温度が、２５～４０℃又は３０～４０℃又は２５～４５℃である、本発明１０２０の方法。
[本発明１０２２]
前記温度が、４０～７０℃又は４５～６５℃又は４５～５５℃である、本発明１０２０の方法。
[本発明１０２３]
前記条件が、６～１０（例えば、６～８、７～８．５、又は８～１０）のｐＨにおけるインキュベーションを含む、本発明１０１７～１０２２のいずれかの方法。
[本発明１００１]
配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ
Ｎ２３３、Ｓ５８、Ｎ１１４、Ｓ１２１、Ｎ２２５、Ｍ２６２、Ｔ２７０、Ｔ１４０、Ｓ６１、Ｉ２０８、及びＲ２２４からなる群から選択される、配列番号１に対する位置
に対応する少なくとも１つの変異を有する、
操作されたＰＥＴ（ポリ（エチレンテレフタレート））ヒドロラーゼ。
[本発明１００２]
前記少なくとも１つの変異が、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される、本発明１００１の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００３]
前記少なくとも１つの変異が、Ｓ５８Ｙ、Ｓ５８Ｍ、Ｓ５８Ｌ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｐ、Ｓ６１Ｄ、Ｓ６１Ｅ、Ｓ６１Ｙ、Ｓ６１Ｆ、Ｎ１１４Ｈ、Ｎ１１４Ｌ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１４Ｓ、Ｎ１１４Ｔ、Ｔ１４０Ｙ、Ｔ１４０Ｌ、Ｔ１４０Ｉ、Ｔ１４０Ｖ、Ｔ１４０Ｓ、Ｉ２０８Ｍ、Ｉ２０８Ｈ、Ｉ２０８Ｆ、Ｉ２０８Ｙ、Ｉ２０８Ｐ、Ｉ２０８Ａ、Ｒ２２４Ｄ、Ｒ２２４Ｅ、Ｒ２２４Ｓ、Ｒ２２４Ｔ、Ｒ２２４Ｎ、Ｒ２２４Ｑ、Ｎ２２５Ｎ、Ｎ２２５Ｉ、Ｎ２２５Ｖ、Ｎ２２５Ｍ、Ｎ２２５Ａ、Ｎ２２５Ｌ、Ｎ２２５Ｓ、Ｎ２２５Ｔ、Ｎ２３３Ｒ、Ｎ２３３Ｙ、Ｎ２３３Ｈ、Ｎ２３３Ｐ、Ｍ２６２Ｌ、Ｍ２６２Ｉ、Ｍ２６２Ａ、Ｍ２６２Ｖ、Ｍ２６２Ｆ、Ｍ２６２Ｗ、Ｔ２７０Ｙ、Ｔ２７０Ｒ、及びＴ２７０Ｈからなる群から選択される、本発明１００１の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００４]
前記アミノ酸配列が、配列番号１、２又は３と少なくとも９５％、９８％、又は９９％同一である、本発明１００１又は１００２又は１００３の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００５]
前記アミノ酸配列が、前記少なくとも１つの変異を除いて、配列番号１、２又は３と同一である、本発明１００１又は１００２又は１００３の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００６]
前記アミノ酸配列が、配列番号６～３４のうちの１つ以上と少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％同一である、本発明１００１又は１００２又は１００３の操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００７]
前記アミノ酸配列が、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、及びＲ２２４Ｑからなる群から選択される、配列番号１に対する位置に対応する少なくとも２つの変異を有する、本発明１００１又は１００４のいずれかの操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００８]
前記アミノ酸配列が、Ｎ２３３Ｋ、Ｓ５８Ｅ、Ｓ５８Ａ、Ｎ１１４Ｔ、Ｓ１２１Ｅ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ１４０Ｄ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、Ｒ２２４Ｑ、Ｓ５８Ｙ、Ｓ５８Ｍ、Ｓ５８Ｌ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｐ、Ｓ６１Ｄ、Ｓ６１Ｅ、Ｓ６１Ｙ、Ｓ６１Ｆ、Ｎ１１４Ｈ、Ｎ１１４Ｌ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１４Ｓ、Ｎ１１４Ｔ、Ｔ１４０Ｙ、Ｔ１４０Ｌ、Ｔ１４０Ｉ、Ｔ１４０Ｖ、Ｔ１４０Ｓ、Ｓ１２１Ｅ、Ｉ２０８Ｍ、Ｉ２０８Ｈ、Ｉ２０８Ｆ、Ｉ２０８Ｙ、Ｉ２０８Ｐ、Ｉ２０８Ａ、Ｒ２２４Ｄ、Ｒ２２４Ｅ、Ｒ２２４Ｓ、Ｒ２２４Ｔ、Ｒ２２４Ｎ、Ｒ２２４Ｑ、Ｎ２２５Ｎ、Ｎ２２５Ｉ、Ｎ２２５Ｖ、Ｎ２２５Ｍ、Ｎ２２５Ａ、Ｎ２２５Ｌ、Ｎ２２５Ｓ、Ｎ２２５Ｔ、Ｎ２３３Ｒ、Ｎ２３３Ｙ、Ｎ２３３Ｈ、Ｎ２３３Ｐ、Ｍ２６２Ｌ、Ｍ２６２Ｉ、Ｍ２６２Ａ、Ｍ２６２Ｖ、Ｍ２６２Ｆ、Ｍ２６２Ｗ、Ｔ２７０Ｙ、Ｔ２７０Ｒ、及びＴ２７０Ｈからなる群から選択される、配列番号１に対する位置に対応する２つ又は３つの変異を有する、本発明１００１又は１００４のいずれかの操作されたＰＥＴヒドロラーゼ。
[本発明１００９]
本発明１００１～１００８のいずれかの操作されたＰＥＴヒドロラーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明１０１０]
前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼが、シグナルペプチドを更に含む、本発明１００９のポリヌクレオチド。
[本発明１０１１]
本発明１００９～１０１０のいずれかのポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターであって、それにより、前記プロモーターが、前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼの発現を制御する、ベクター。
[本発明１０１２]
本発明１００９～１０１０のいずれかのポリヌクレオチド又は本発明１０１１のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明１０１３]
微生物細胞である、本発明１０１２の宿主細胞。
[本発明１０１４]
細菌細胞である、本発明１０１２の宿主細胞。
[本発明１０１５]
前記細菌細胞がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である、本発明の宿主細胞。
[本発明１０１６]
真菌細胞である、本発明１０１２の宿主細胞。
[本発明１０１７]
ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）を分解する方法であって、ＰＥＴを、本発明１００１～１００８のいずれかの操作されたＰＥＴヒドロラーゼと、前記ＰＥＴを分解する条件下で接触させることを含む、方法。
[本発明１０１８]
前記ＰＥＴを、前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼを発現及び分泌する宿主細胞と接触させることを含む、本発明１０１７の方法。
[本発明１０１９]
前記操作されたＰＥＴヒドロラーゼが精製されている、本発明１０１７の方法。
[本発明１０２０]
前記条件が、２５～７０℃の温度におけるインキュベーションを含む、本発明１０１７～１０１９のいずれかの方法。
[本発明１０２１]
前記温度が、２５～４０℃又は３０～４０℃又は２５～４５℃である、本発明１０２０の方法。
[本発明１０２２]
前記温度が、４０～７０℃又は４５～６５℃又は４５～５５℃である、本発明１０２０の方法。
[本発明１０２３]
前記条件が、６～１０（例えば、６～８、７～８．５、又は８～１０）のｐＨにおけるインキュベーションを含む、本発明１０１７～１０２２のいずれかの方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0027】
【図1】ニューラルネットワーク解析により予測された一連の変異を含むＩｓＰＥＴａｓｅバリアント、無効化ＩｓＰＥＴａｓｅ、及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅのエステラーゼ活性を、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較して示す棒グラフである。野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ及びそのバリアントのエステラーゼ活性は、酪酸レゾルフィンアッセイにより測定される。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「Ｄｅａｄ」は変異（Ｓ１６０Ａ）により酵素機能を失った無効化ＩｓＰＥＴａｓｅを表し、「ＷＴ」は野生型ＩｓＰｅｔａｓｅを表している。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図2】ニューラルネットワーク解析により予測された一連の変異を含むＩｓＰＥＴａｓｅバリアント、無効化ＩｓＰＥＴａｓｅ、及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅのＰＥＴ分解活性を、野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較して示す棒グラフである。基質としてＰＥＴフィルムを使用し、酵素濃度２００ｎＭで野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ及びそのバリアントの加水分解活性を測定した。アッセイ反応は、４０℃で９６時間インキュベートした。酵素処理前後のＰＥＴフィルムサンプルを比較し、ＰＥＴａｓｅ処理したフィルムの質量損失を測定した。ＰＥＴａｓｅ処理したフィルムの写真は、ＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの異なる分解活性により、異なる表面侵食の程度を示す。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「Ｄｅａｄ」は変異（Ｓ１６０Ａ）により酵素機能を失った無効化ＩｓＰＥＴａｓｅを表し、「ＷＴ」は野生型ＩｓＰＥＴａｓｅを表している。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図3】野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較して高いＰＥＴ分解活性を示す、最初に予測された７つのニューラルネットワーク変異の残基ロケールを示している。
【図4】野生型ＩｓＰＥＴａｓｅと比較したＩｓＰＥＴａｓｅバリアントのエステラーゼ活性を示す棒グラフである。野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ及びそのバリアントのエステラーゼ活性は、酪酸レゾルフィンアッセイにより測定される。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「ＴＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「Ｄｕｒａ」は変異Ｌ１１７Ｆ、Ｑ１１９Ｙ、Ｔ１４０Ｄ、Ｗ１５９Ｈ、Ｇ１６５Ａ、Ｉ１６８Ｒ、Ａ１８０Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ２１４Ｈ、Ｒ２８０Ａを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅを表し、「ＤＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「ＷＴ」は野生型ＩｓＰＥＴａｓｅを表す。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図5】異なる温度におけるＩｓＰＥＴａｓｅバリアントのＰＥＴ分解活性を示す棒グラフである。基質としてＰＥＴフィルムを使用し、酵素濃度２００ｎＭでＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの加水分解活性を測定した。アッセイ反応は、３０℃及び４０℃で９６時間、５０℃で４８時間インキュベートした。酵素処理前後のＰＥＴフィルムサンプルを比較し、ＰＥＴａｓｅ処理したフィルムの質量損失を測定した。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「ＴＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「Ｄｕｒａ」は変異Ｌ１１７Ｆ、Ｑ１１９Ｙ、Ｔ１４０Ｄ、Ｗ１５９Ｈ、Ｇ１６５Ａ、Ｉ１６８Ｒ、Ａ１８０Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ２１４Ｈ、Ｒ２８０Ａを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅを表し、「ＤＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅバリアントを表す。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図6】ニューラルネットワーク解析により予測された一連の変異を含むＴＮＫ（変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、Ｒ２８０Ａ、及びＮ２３３Ｋを含むＩｓＰＥＴａｓｅバリアント）バリアント、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、及びＤｕｒａＰＥＴａｓｅのエステラーゼ活性を、ＴＮＫと比較して示す棒グラフである。ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ、ＴＮＫ及びそのバリアントのエステラーゼ活性は、酪酸レゾルフィンアッセイによって測定される。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「ＴＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「ＴＮＫ＋Ｘ」は、ニューラルネットワーク解析により予測された変異のうちの１つを含むＴＮＫバリアントを表し、「Ｄｕｒａ」は変異Ｌ１１７Ｆ、Ｑ１１９Ｙ、Ｔ１４０Ｄ、Ｗ１５９Ｈ、Ｇ１６５Ａ、Ｉ１６８Ｒ、Ａ１８０Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ２１４Ｈ、Ｒ２８０Ａを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅを表し、「ＤＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅバリアントを表す。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図7】異なる温度における、ニューラルネットワーク解析により予測された一連の変異を含むＴＮＫ（変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、Ｒ２８０Ａ、及びＮ２３３Ｋを含むＩｓＰＥＴａｓｅバリアント）バリアント、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ、及びＤｕｒａＰＥＴａｓｅのＰＥＴ分解活性を、ＴＮＫと比較して示す棒グラフである。基質としてＰＥＴフィルムを使用し、酵素濃度２００ｎＭでＩｓＰＥＴａｓｅバリアントの加水分解活性を測定した。アッセイ反応は、３０℃、４０℃、５０℃、又は５５℃で９６時間インキュベートした。酵素処理前後のＰＥＴフィルムサンプルを比較し、ＰＥＴａｓｅ処理したフィルムの質量損失を測定した。「Ｔｈｅｒｍｏ」は変異Ｓ１２１Ｅ、Ｄ１８６Ｈ、及びＲ２８０Ａを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅを表し、「ＴＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅバリアントを表し、「ＴＮＫ＋Ｘ」は、ニューラルネットワーク解析により予測された変異Ｓ５８Ｅ、Ｎ１１４Ｔ、Ｎ２２５Ｃ、Ｍ２６２Ｌ、Ｔ２７０Ｖ、Ｔ６７Ｄ、Ｑ９１Ｉ、Ｓ１２１Ｅ、Ｔ６７Ｄ、Ｑ９１Ｉ、Ｓ６１Ｔ、Ｉ２０８Ｖ、Ｓ５８Ａ、及びＲ２２４Ｑのうちの１つを含むＴＮＫ Ｎｅｔｃを表し、「Ｄｕｒａ」は変異Ｌ１１７Ｆ、Ｑ１１９Ｙ、Ｔ１４０Ｄ、Ｗ１５９Ｈ、Ｇ１６５Ａ、Ｉ１６８Ｒ、Ａ１８０Ｉ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ２１４Ｈ、Ｒ２８０Ａを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅを表し、「ＤＮＫ」は変異Ｎ２３３Ｋを含むＤｕｒａＰＥＴａｓｅバリアントを表す。全てのサンプルは精製タンパク質サンプルであり、タンパク質濃度に対して正規化されている。
【図8】野生型ＩｓＰＥＴａｓｅ（配列番号１）と比較しての、ＷＴ ＩｓＰＥＴａｓｅの結晶構造に基づいてニューラルネットワークモデリングにより予測された１０個の選択された置換を含むＷＴ ＮＥＴ（配列番号５）、及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅの結晶構造に基づいてニューラルネットワークモデリングにより予測された６つの選択された置換を含むＴｈｅｒｍｏ ＮＥＴ（配列番号３５）のアミノ酸配列のアライメントである。変異配列の改変は、強調表示されている。図は、配列番号１、５、および３５をそれぞれ出現順に開示している。
【図9】図９ａ～ｃ：機械学習誘導予測より、様々なＰＥＴａｓｅスキャフォールドについて改善された酵素性能が付与された。９ａ．Ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅの出力により表現された、野生型ＰＥＴａｓｅタンパク質の構造。ＰＥＴａｓｅの各アミノ酸残基をＭｕｔｃｏｍｐｕｔｅで評価した結果、隣接する化学的微小環境と２０個の各アミノ酸の化学的適合性を反映する確率分布が得られた。野生型確率が低い（好ましくない）残基は赤、野生型確率が高い（好ましい）残基は青で表示されている。本研究で利用した両方の結晶構造に対するＭｕｔＣｏｍｐｕｔｅのインタラクティブな可視化は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅ．ｃｏｍ／ｐｅｔａｓｅ／５ｘｊｈ、及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅ．ｃｏｍ／ｐｅｔａｓｅ／６ｉｊ６において公開されている。９ｂ．Ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅで予測された４つの主な変異の微小環境。９ｃ．Ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅによって予測された変異のダウンセレクションの模式図、及び変異誘発により生成された変異の酵素的性能と、ダウンセレクションされた変異の比較。野生型ＰＥＴａｓｅ及びＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅの結晶構造を用いてＭｕｔＣｏｍｐｕｔｅを実行した結果、２つの予測ライブラリーが生成された。次に、予測されたアミノ酸及び野生型アミノ酸の間の確率の変化倍率により、予測値をランク付けした。段階的組み合わせ戦略を使用して、様々なＰＥＴａｓｅのスキャフォールドに単一又は複数の予測された変異を組み込むことにより、１５９個のバリアントが生成された。バリアントの実験的特性評価により、４つの主要な変異をダウンセレクションし、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）という３つのＰＥＴａｓｅスキャフォールドにわたって組み合わせ的にアセンブルし、全ての可能な組み合わせを作成した。ヒートマップは、得られたバリアントのＰＥＴ加水分解活性、及びバリアントのそれぞれのスキャフォールドに対する変化倍率を示している。ＰＥＴ加水分解活性は、９６時間の反応時間後、ＰＥＴａｓｅバリアントがｇｆ－ＰＥＴフィルムを加水分解して放出したＰＥＴモノマー（ＴＰＡとＭＨＥＴとの合計）の量を測定することで評価した。この図に示す全ての酵素について、緩衝液ＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ８）が使用された。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図10】αＰＥＴａｓｅのＰＥＴ加水分解活性は、温和な温度及び適度なｐＨで各種ＰＨＥより優れていた。反応温度４０℃において、αＰＥＴａｓｅ、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ、及びＩＣＣＭのｐＨ範囲（６．５～８．０）におけるＰＥＴ加水分解活性の比較。ＰＥＴ加水分解活性は、９６時間の反応時間後、試験されたＰＥＴがｇｆ－ＰＥＴフィルムを加水分解して放出したＰＥＴモノマー（ＴＰＡとＭＨＥＴとの合計）の量を測定することで評価した。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図11a】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。１１ａ．５１種類のポストコンシューマー・プラスチック製品から穴開けにより得たｐｃ－ＰＥＴフィルムの完全分解。
【図11b】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。１１ｂ．αＰＥＴａｓｅ、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ、及びＩＣＣＭの反応温度５０℃におけるＰＥＴ加水分解活性の時間経過。ＰＥＴ加水分解活性は、試験したＰＨＥによってｐｃ－ＰＥＴ（豆菓子プラスチック容器）フィルムを加水分解して放出されたＰＥＴモノマー量（ＴＰＡとＭＨＥＴとの合計）を様々な時点で測定することによって評価した。この図に示す全ての酵素について、緩衝液ＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ８）が使用された。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図11c】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。１１ｃ．αＰＥＴａｓｅによる様々な曝露時間後のｐｃ－ＰＥＴフィルムの原子間力顕微鏡画像。
【図11d】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。１１ｄ．αＰＥＴａｓｅを用いた大型未処理ＰＥＴ容器の５０℃での完全分解。
【図11e】図１１ａ～ｄ：ポストコンシューマーＰＥＴプラスチック及びポリエステル製品の酵素的解重合におけるαＰＥＴａｓｅの優れた性能。ｅ．αＰＥＴａｓｅ、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ、及びＩＣＣＭによる市販ポリエステル製品の５０℃での分解。
【図12a】図１２ａ～ｃ：ＰＥＴの酵素的－化学的リサイクル及びインサイチュのバイオレメディエーションにおけるαＰＥＴａｓｅの応用。１２ａ．αＰＥＴａｓｅによるポストコンシューマー・プラスチック廃棄物の解重合及び化学重合を組み込んだＰＥＴのクローズドループリサイクルプロセスの模式図。再生バージンＰＥＴの結晶化度は、示差走査熱量測定により５８％と測定された。
【図12b】図１２ａ～ｃ：ＰＥＴの酵素的－化学的リサイクル及びインサイチュのバイオレメディエーションにおけるαＰＥＴａｓｅの応用。１２ｂ．Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｇｏ１９と外因性ＰＨＥとを組み合わせた同時プロセス：αＰＥＴａｓｅ、野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）、βＰＥＴａｓｅ、ＬＣＣ及びＩＣＣＭ。ＰＨＥ（αＰＥＴａｓｅ／ＷＴ／Ｔｈｅｒｍｏ／Ｄｕｒａ／βＰＥＴａｓｅ／ＬＣＣ／ＩＣＣＭ）及びＧＯ１９はＰＨＥとＰ．プチダＧｏ１９との同時処理を表し、ＰＨＥはＰ．プチダＧｏ１９なしで酵素を提示する対照条件を表す。遊離したＰＥＴモノマー、ｐｃ－ＰＥＴフィルムの質量損失、及びＰ．プチダＧｏ１９の細胞密度は、９６時間のインキュベーション後に測定した。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図12c】図１２ａ～ｃ：ＰＥＴの酵素的－化学的リサイクル及びインサイチュのバイオレメディエーションにおけるαＰＥＴａｓｅの応用。１２ｃ．αＰＥＴａｓｅ／ＷＴ／Ｔｈｅｒｍｏ／Ｄｕｒａ／βＰＥＴａｓｅを分泌可能な操作されたＰ．プチダＧｏ１９株の統合プロセス。遊離しれたＰＥＴモノマー、ｐｃ－ＰＥＴフィルムの質量損失、及びＰ．プチダＧｏ１９の細胞密度は、１２０時間のインキュベーション後に測定した。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図13】Ｍｕｔｃｏｍｐｕｔｅによって予測された変異を組み込んだＰＥＴａｓｅバリアント、及びそれぞれのスキャフォールドである野生型ＰＥＴａｓｅ（ＷＴ）、ＴｈｅｒｍｏＰＥＴａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＤｕｒａＰＥＴａｓｅ（Ｄｕｒａ）の耐熱性。各酵素の融解温度は示差走査熱量測定で決定した。全ての測定は三つ組で実施した（ｎ＝３）。
【図14】αＰＥＴａｓｅによる各種ｐｃ－ＰＥＴフィルムの質量、結晶化度％、及び完全分解にかかる時間。円形のｐｃ－ＰＥＴフィルム（直径６ｍｍ）は、地元の食料品店チェーン（Ｗａｌｍａｒｔ、Ｃｏｓｔｃｏ、及びＨＥＢ）で入手可能な食品、飲料、薬品、事務用品、家庭用品及び化粧品の包装に使用される５１種類の異なるポストコンシューマー・プラスチック製品から穴開けにより得た。ｐｃ－ＰＥＴフィルムは、フィルムが完全に分解されるまで、５０℃でαＰＥＴａｓｅによる連続処理によって加水分解された。酵素溶液（１００ｍＭの緩衝液ＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ８）（ｐＨ８）中の２００ｎＭのαＰＥＴａｓｅ）は、２４時間ごとに補充した。無傷のｐｃ－ＰＥＴフィルムの結晶化度％は、示差走査熱量測定によって決定した。フィルムの初期質量は、デジタルスケールにより重量測定で決定した。ＤＳＣ及び重量測定の両方は、三つ組で実施した。平均値±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）が示されている。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0045】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド構築物は、例えば、検出又は精製の目的のために、１つ以上のアフィニティタグを含む。多くの好適切タグが、例えば、Ｋｉｍｐｌｅらにより記載されたもの（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３；７３（１）：９．９．１－９．９．２３）を含む、ポリペプチド構築物に含まれ得る。アフィニティタグの例としては、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）部位、ＦＬＡＧエピトープ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）部位；Ｍｙｃエピトープ、ポリヒスチジンタグ（例えば、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３６））、及びストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、米国特許第５，５０６，１２１号に記載されているものなど）が挙げられるが、これらに限定されない。アフィニティタグは、ポリペプチド構築物中の１つ以上の位置に含まれ得る。ストレプトアビジン結合ペプチドのようなアフィニティタグは、例えば、ポリペプチド構築物のＮ末端又はポリペプチド構築物のＣ末端に存在し得る。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、アフィニティタグ、例えば、追加のアミノ酸残基を有するか又は有さない配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３７）を含むＦＬＡＧエピトープを含んでいる。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】