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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-20
(54)【発明の名称】抗ＣＤ２２抗体分子又は抗原結合断片及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231013BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231013BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231013BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231013BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231013BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231013BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231013BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231013BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231013BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231013BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231013BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20231013BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C07K16/28
A61K39/395 N
A61K47/68
A61P35/00
A61P35/02
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023543258
(86)(22)【出願日】2021-09-29
(85)【翻訳文提出日】2023-05-26
(86)【国際出願番号】 CN2021121826
(87)【国際公開番号】W WO2022068899
(87)【国際公開日】2022-04-07
(31)【優先権主張番号】202011048723.0
(32)【優先日】2020-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523113766
【氏名又は名称】昆明賽諾制薬股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110003845
【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲ハオ▼ 振平
(72)【発明者】
【氏名】朱 建▲偉▼
(72)【発明者】
【氏名】徐 ▲リー▼
(72)【発明者】
【氏名】謝 ▲躍▼▲慶▼
(72)【発明者】
【氏名】江 ▲華▼
(72)【発明者】
【氏名】黄 海▲チウ▼
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C085AA14
4C085BB31
4C085BB36
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC23
4C085DD61
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明に提供するのは、単離抗ＣＤ２２抗体又はその抗原結合断片であり、更に提供するのはその使用である。該抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ２２組換えタンパク質及びＣＤ２２陽性細胞株に対する強い同定能及び高親和性、ＣＤ２２陽性細胞株に進入する強い内在化能力、並びに細菌外毒素との融合後に、ＣＤ２２陽性細胞株に対する有効な増殖阻害及び細胞アポトーシス効果を示す。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離抗ＣＤ２２抗体又はその抗原結合断片であって、該重鎖可変領域（ＶＨ）及び該軽鎖可変領域（ＶＬ）が、それぞれ、（１）配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号２５に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３、並びに配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号２４に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３、又は、
（２）配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号２６に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３、並びに配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号２４に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３、
を含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
前記重鎖可変領域が配列番号４、配列番号３、配列番号６、若しくは配列番号５に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号４、配列番号３、配列番号６、若しくは配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は、前記軽鎖可変領域が配列番号２、配列番号７、若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号７、若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、それぞれ、（１）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号７に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号７に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４）配列番号３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５）配列番号６に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（６）配列番号５に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗体がネズミ抗体、キメラ抗体又は完全若しくは部分的ヒト化抗体であり、或いは、前記抗体がｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ抗体であり、
好ましくは、前記抗体がモノクローナル抗体又は一本鎖抗体であり、
好ましくは、前記抗体が、ヒト又はネズミ定常領域、好ましくはヒト又はネズミ重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を含み、
好ましくは、前記抗体が重鎖及び軽鎖を含み、より好ましくは、前記抗体がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群より選択される重鎖定常領域及び／又はカッパ又はラムダ型軽鎖定常領域を含む、
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗体がモノクローナル抗体、好ましくはネズミ、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体であり、好ましくは、該モノクローナル抗体の軽鎖がカッパ型であり、
より好ましくは、該モノクローナル抗体がＩｇＧ１抗体である、
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２２抗体若しくはその抗原結合断片をコードするか、又は請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２２抗体若しくはその抗原結合断片に含まれる重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項8】
請求項６に記載の核酸分子及び／又は請求項７に記載のベクターを含むか、又は請求項６に記載の核酸分子及び／又は請求項７に記載のベクターで形質転換又はトランスフェクションされている宿主細胞。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載のベクター、及び／又は請求項８に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と療法剤であるパートナー分子とを含むイムノコンジュゲート。
【請求項11】
疾患を治療する薬剤の製造における、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項９に記載の組成物、及び／又は請求項１０に記載のイムノコンジュゲートの使用。
【請求項12】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項９に記載の組成物、及び／又は請求項１０に記載のイムノコンジュゲートを含むキット。
【請求項13】
疾患を治療する方法であって、その必要がある被験体に、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項９に記載の組成物、及び／又は請求項１０に記載のイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年９月２９日に出願された中国特許出願第２０２０１１０４８７２３．０号の優先権の利益を主張し、その全体が引用することで本明細書の一部をなす。
本出願は、２０２０年９月２９日に出願された中国特許出願第２０２０１１０４８７２３．０号の優先権の利益を主張し、その全体が引用することで本明細書の一部をなす。
【0002】
本開示は、生物医学の分野に、特に新規ヒト化抗ＣＤ２２抗体及びその適用に関する。
【背景技術】
【0003】
ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ－２）は、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）受容体であり、シアル酸（Ｓｉａ）含有グリカンに特異的に結合し、細胞接着及び／又は細胞シグナル伝達を促進する。ＣＤ２２発現はＢ細胞に限定され、Ｂ細胞阻害のベースラインレベルを確立する際に必須の役割を果たし、したがって体液性免疫におけるホメオスタシスの非常に重要な決定要因である。ＣＤ２２は、Ｂリンパ球性白血病／リンパ腫及び成熟Ｂ細胞白血病／リンパ腫を含む、多様なＢ細胞悪性疾患において新生物細胞中で発現される。ＣＤ２２の発現は、毛様細胞白血病（ＨＣＬ）及び前リンパ球性白血病において特に強いものであり得る。
【0004】
研究によって、抗ＣＤ２２抗体を自己免疫疾患及びＢ細胞腫瘍の治療に使用することができることがわかってきている。さらに、抗ＣＤ２２抗体は、しばしば、他の薬剤、例えば細胞傷害剤のコンジュゲート化のために開発され、その標的化特性によって、標的細胞への薬剤の標的化送達を可能にする。
【0005】
したがって、当該技術分野には、ＣＤ２２に関する高親和性を有し、単独で又は他の薬剤若しくは分子にコンジュゲート化された際のいずれかに、ＣＤ２２関連疾患の治療に使用することができる、新規抗ＣＤ２２抗体又はその断片に関する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記の技術的問題を解決するため、本開示は、ＣＤ２２に結合し、組換えＣＤ２２タンパク質及びＣＤ２２陽性細胞に対する強い認識能及び高親和性、ＣＤ２２陽性細胞内への強い内在化能、並びに細菌外毒素との融合後にＣＤ２２陽性細胞に対する強い増殖阻害及びアポトーシス誘導効果を示すヒト化抗ＣＤ２２抗体である、単離モノクローナル抗体を提供する。単離モノクローナル抗体に基づいて、本開示は、抗体の重要なドメインを含む多様な抗体形式及びその対応する使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の技術的解決法は以下の通りである。
【0008】
１つの態様において、本開示は、単離抗ＣＤ２２抗体又はその抗原結合断片を提供する。本明細書において用いられる際、抗体の「抗原結合断片」は、ＣＤ２２への抗体の結合能及び抗体の対応する生物学的活性を保持する、抗体の多様な機能断片を含む。
【0009】
配列構造に関して、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離抗ＣＤ２２抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）が、それぞれ、
（１）配列番号１９（ＩＹＤＭＳ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号２５（ＹＩＳＳＧＧＧＴＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号２１（ＨＳＧＹＧＴＨＷＧＶＬＦＡＹ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３、並びに配列番号２２（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３（ＹＴＳＩＬＨＳ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号２４（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３、又は、
（２）配列番号１９（ＩＹＤＭＳ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号２６（ＹＩＳＳＧＧＧＴＴＹＹＰＧＳＶＫＧ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号２１（ＨＳＧＹＧＴＨＷＧＶＬＦＡＹ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３、並びに配列番号２２（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３（ＹＴＳＩＬＨＳ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号２４（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３、
を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
（１）配列番号１９（ＩＹＤＭＳ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号２５（ＹＩＳＳＧＧＧＴＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号２１（ＨＳＧＹＧＴＨＷＧＶＬＦＡＹ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３、並びに配列番号２２（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３（ＹＴＳＩＬＨＳ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号２４（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３、又は、
（２）配列番号１９（ＩＹＤＭＳ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号２６（ＹＩＳＳＧＧＧＴＴＹＹＰＧＳＶＫＧ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号２１（ＨＳＧＹＧＴＨＷＧＶＬＦＡＹ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＨ－ＣＤＲ３、並びに配列番号２２（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３（ＹＴＳＩＬＨＳ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号２４（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）に示されるようなアミノ酸配列を有するＬ－ＣＤＲ３、
を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0010】
本開示によって提供される抗ＣＤ２２抗体又はその抗原結合断片は、抗原ＣＤ２２、特にヒトＣＤ２２に、高親和性で結合可能である。
【0011】
好ましくは、本開示によって提供される抗ＣＤ２２抗体又はその抗原結合断片において、重鎖可変領域は、配列番号４、配列番号３、配列番号６、若しくは配列番号５に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号４、配列番号３、配列番号６、若しくは配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得て、及び／又は軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号７、若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号７、若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0012】
「少なくとも７５％の同一性」は、配列に関して本開示の文脈において用いられる際、７５％以上の任意の同一性パーセント、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は更に９９％の同一性である。
【0013】
更に好ましくは、本開示によって提供される抗体又はその抗原結合断片において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、それぞれ、
（１）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号７に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号７に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４）配列番号３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５）配列番号６に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（６）配列番号５に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
を含む。
（１）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号７に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号７に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４）配列番号３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５）配列番号６に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（６）配列番号５に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
を含む。
【0014】
特に、本開示によって提供される抗体又はその抗原結合断片は、どちらも上述のようなＣＤＲ及びフレームワーク領域を、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のような配置で含む、少なくとも重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。更に或いは、「少なくとも７５％同一性」によるアミノ酸配列中の最大２５％の相違が、重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域の任意のフレームワーク領域中に、又は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の外部の本開示によって提供される抗体若しくはその抗原結合断片中の任意のドメイン若しくは配列中に存在し得る。相違は、任意の位置のアミノ酸欠失、付加又は置換から生じてもよい。
【0015】
本開示によって提供される抗体は、ネズミ抗体、キメラ抗体又は完全若しくは部分的ヒト化抗体であり、或いは、抗体は、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ抗体の形態である。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体又は一本鎖抗体である。
【0016】
可変領域に加えて、抗体又はその抗原結合断片は、ヒト又はネズミ定常領域、好ましくはヒト又はネズミ重鎖定常領域（ＣＨ）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖を含み、より好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群より選択される重鎖定常領域及び／又はカッパ若しくはラムダ型軽鎖定常領域を含む。本発明の１つの特定の実施の形態によれば、抗体は、モノクローナル抗体、好ましくはネズミ、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体である。本発明の１つの特定の実施の形態によれば、モノクローナル抗体はＩｇＧ１抗体である。
【0017】
更に好ましくは、本開示によって提供される抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号９に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び／又は配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【0018】
本発明の１つの特定の実施の形態によれば、本開示は、それぞれ、
（１）配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４）配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５）配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（６）配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖及び軽鎖を有するモノクローナル抗体を提供する。
（１）配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４）配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５）配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（６）配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖及び軽鎖を有するモノクローナル抗体を提供する。
【0019】
別の態様において、本開示は、本開示によって提供される抗ＣＤ２２抗体若しくはその抗原結合断片をコードするか、又は抗ＣＤ２２抗体若しくはその抗原結合断片に含まれる重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖をコードする、ヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。
【0020】
更なる態様において、本開示は、上述のような核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは真核発現ベクター、原核発現ベクター、人工染色体、ファージベクター等であることが可能である。
【0021】
また更なる態様において、本開示は、上述のような核酸分子若しくはベクターを含む宿主細胞、又は上述のような核酸分子若しくはベクターで形質転換若しくはトランスフェクションされている宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核又は真核細胞、例えば細菌、昆虫、真菌、植物又は動物細胞であることが可能である。
【0022】
本開示によって提供される抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて得られ得る。例えば、抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は抗体の重鎖及び／又は軽鎖を、本開示によって提供される核酸分子から得ることが可能であり、次いで、これらを、抗体の任意選択の他のドメインと共に抗体に組み立てることも可能であるし、或いは本開示によって提供される宿主細胞を、宿主細胞が抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は抗体の重鎖及び／又は軽鎖を発現し、これらを抗体に組み立てることを可能にする条件下で培養する。任意選択で、方法は、産生された抗体を回収する工程を更に含む。
【0023】
別の態様において、本開示は、本開示によって提供される抗体又はその抗原結合断片、核酸分子、ベクター及び／又は宿主細胞を含む組成物も提供する。好ましくは、組成物は、医薬的に許容され得るキャリアー、アジュバント、及び賦形剤を任意選択で更に含む医薬組成物である。
【0024】
更に別の態様において、本開示は、本明細書に提供される抗ＣＤ２２抗体又はその抗原結合断片と、療法剤であるパートナー分子とを含むイムノコンジュゲートも提供する。療法剤は、細胞毒（例えば緑膿菌（pseudomonas aeruginosa）外毒素（例えばＰＥ３８））、放射性同位体、抗生物質、小分子毒素、他の薬剤等であってもよい。
【0025】
さらに、本開示は、本開示によって提供される抗体又はその抗原結合断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞、組成物、及び／又はイムノコンジュゲートを含むキットも提供する。
【0026】
更なる態様において、本発明は、ＣＤ２２を発現する腫瘍又は癌を含む疾患の治療用の薬剤製造のための、本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞、組成物、及び／又はイムノコンジュゲートの使用も提供する。例えば、疾患は、ＣＤ２２関連Ｂ細胞悪性腫瘍、又はＣＤ２２の高発現によって特徴づけられるＢ細胞悪性腫瘍、例えばＣＤ２２高発現リンパ腫又は白血病である。好ましくは、リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫又はマントル細胞リンパ腫であり、白血病は慢性リンパ球性白血病、毛様細胞白血病又は急性リンパ球性白血病である。
【0027】
したがって、本開示は、疾患を治療する方法であって、その必要がある被験体に、本明細書に提供される抗体若しくはその抗原結合断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞、組成物、及び／又はイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。被験体は、ヒト又は非ヒト霊長類、及び家畜、農場又は実験哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、マウス、ウサギ等を含む、哺乳動物である。好ましくは、被験体はヒトである。疾患には、ＣＤ２２を発現する腫瘍又は癌が含まれる。例えば疾患は、ＣＤ２２関連Ｂ細胞悪性腫瘍、又はＣＤ２２の高発現によって特徴づけられるＢ細胞悪性腫瘍、例えばＣＤ２２高発現リンパ腫又は白血病である。好ましくは、リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫又はマントル細胞リンパ腫であり、白血病は慢性リンパ球性白血病、毛様細胞白血病又は急性リンパ球性白血病である。
【0028】
本発明の実施形態を、付随する図を参照して以下に詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】ＥＬＩＳＡによる、ＣＤ２２への本開示によって提供される抗体の結合の検出結果を示す図である。
【図2A】１：１結合モデルを用いたＳＰＲによる、ＣＤ２２に対する本開示によって提供される抗体の結合動力学の検出結果を示す図である。パネル２ＡはＨＡ２２ ｍＡｂである。
【図2B】１：１結合モデルを用いたＳＰＲによる、ＣＤ２２に対する本開示によって提供される抗体の結合動力学の検出結果を示す図である。パネル２ＢはｍＡｂ－１である。
【図2C】１：１結合モデルを用いたＳＰＲによる、ＣＤ２２に対する本開示によって提供される抗体の結合動力学の検出結果を示す図である。パネル２ＣはｍＡｂ－２である。
【図2D】１：１結合モデルを用いたＳＰＲによる、ＣＤ２２に対する本開示によって提供される抗体の結合動力学の検出結果を示す図である。パネル２ＤはｍＡｂ－３である。
【図2E】１：１結合モデルを用いたＳＰＲによる、ＣＤ２２に対する本開示によって提供される抗体の結合動力学の検出結果を示す図である。パネル２ＥはｍＡｂ－４である。
【図2F】１：１結合モデルを用いたＳＰＲによる、ＣＤ２２に対する本開示によって提供される抗体の結合動力学の検出結果を示す図である。パネル２ＦはｍＡｂ－５である。
【図2G】１：１結合モデルを用いたＳＰＲによる、ＣＤ２２に対する本開示によって提供される抗体の結合動力学の検出結果を示す図である。パネル２ＧはｍＡｂ－６である。
【図3】ＦＡＣＳによる、細胞膜上のＣＤ２２に対する本開示によって提供される抗体の結合の検出結果を示す図である。パネル３ＡはＲａｊｉ細胞であり、パネル３ＢはＲＥＨ細胞であり、パネル３ＣはＣＡ４６細胞である。
【図4】ＦＡＣＳによる、本開示によって提供される抗体のエンドサイトーシスの検出結果を示す図である。パネル４ＡはＲａｊｉ細胞であり、パネル４ＢはＣＡ４６細胞であり、パネル４ＣはＲＥＨ細胞である。
【図5】本開示によって提供される抗体のＡＤＣＣ活性の検出結果を示す図である。パネル５ＡはＣＡ４６細胞であり、パネル５ＢはＲａｊｉ細胞であり、パネル５ＣはＲＥＨ細胞である。
【図6A】５０μｇ／ｍＬの高用量での、本開示によって提供される抗体のＡＤＣＣ活性の検出結果を示す図である。パネル６ＡはＣＡ４６細胞である。
【図6B】５０μｇ／ｍＬの高用量での、本開示によって提供される抗体のＡＤＣＣ活性の検出結果を示す図である。パネル６ＢはＲａｊｉ細胞である。
【図6C】５０μｇ／ｍＬの高用量での、本開示によって提供される抗体のＡＤＣＣ活性の検出結果を示す図である。パネル６ＣはＲＥＨ細胞である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
以下に本発明を、具体例を参照して説明する。これらの実施例は本発明の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではないことが当業者には理解されよう。
【0031】
以下の実施例における実験手順は、特に明示がない限り、全て慣用のものである。以下の実施例で用いた原材料及び試薬は、特に明示がない限り、いずれも市販品である。
【実施例】
【0032】
実施例１ 抗体の構築及び調製
本実施例において、ＶＨ領域配列及びＶＬ領域配列を得て、これらを定常領域に融合させることによって、ＩｇＧ１型モノクローナル抗体を再構築した。
本実施例において、ＶＨ領域配列及びＶＬ領域配列を得て、これらを定常領域に融合させることによって、ＩｇＧ１型モノクローナル抗体を再構築した。
【0033】
１．１ ヒト化設計
フレームワークシャッフリング戦略を用いて、組換え免疫毒素ＨＡ２２に含まれる重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のフレームワーク領域中のアミノ酸を、元来のネズミのものからヒトのものに改変した。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムの両方、並びにオンラインツール（http://www.bioinf.org.uk/abs/）を用いて決定された全てのＣＤＲを、不変のままにした。最も近いヒト抗体マッチのため、ＨＡ２２のＶＨ及びＶＬ両方のフレームワーク及びＪ領域各々を、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（商標）（ＩＭＧＴ、http://www.imgt.org）中のヒト抗体生殖系列配列に対して整列した。バーニヤ残基（Vernier residue）と見なされるか、又はＶＨ／ＶＬ相互作用のために重要であると見なされるネズミ残基は、ＣＤ２２に対する特異性及び親和性を保持するため、変化させなかった。
フレームワークシャッフリング戦略を用いて、組換え免疫毒素ＨＡ２２に含まれる重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のフレームワーク領域中のアミノ酸を、元来のネズミのものからヒトのものに改変した。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムの両方、並びにオンラインツール（http://www.bioinf.org.uk/abs/）を用いて決定された全てのＣＤＲを、不変のままにした。最も近いヒト抗体マッチのため、ＨＡ２２のＶＨ及びＶＬ両方のフレームワーク及びＪ領域各々を、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（商標）（ＩＭＧＴ、http://www.imgt.org）中のヒト抗体生殖系列配列に対して整列した。バーニヤ残基（Vernier residue）と見なされるか、又はＶＨ／ＶＬ相互作用のために重要であると見なされるネズミ残基は、ＣＤ２２に対する特異性及び親和性を保持するため、変化させなかった。
【0034】
ヒト化設計パネルを用意して、最大ヒト化を所持する一方で、最適な親和性及び有効性プロファイルを維持する最終候補を選択するために評価した。
【0035】
１．２ 遺伝子配列決定
抗体のＨＡ２２及びヒト化型に含有される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を表１に示す。続くｍＡｂ再構築のため、Ｋａｂａｔ体系に従った抗体可変領域の定義によって、重鎖及び軽鎖のエルボー領域を決定し、かつＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を同定し、下線で示した。
抗体のＨＡ２２及びヒト化型に含有される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を表１に示す。続くｍＡｂ再構築のため、Ｋａｂａｔ体系に従った抗体可変領域の定義によって、重鎖及び軽鎖のエルボー領域を決定し、かつＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を同定し、下線で示した。
【0036】
【表1】
【0037】
１．３ ＩｇＧ１の定常領域のアミノ酸配列
可変領域の分析に際して、カッパ型軽鎖を有するように抗体を決定し、したがって、ＩｇＧ抗体の再構築のため、カッパ型軽鎖定常領域及びＩｇＧ１重鎖定常領域を選択した。定常領域配列を表２に示す。
可変領域の分析に際して、カッパ型軽鎖を有するように抗体を決定し、したがって、ＩｇＧ抗体の再構築のため、カッパ型軽鎖定常領域及びＩｇＧ１重鎖定常領域を選択した。定常領域配列を表２に示す。
【0038】
【表2】
【0039】
１．４ 再構築されたＩｇＧモノクローナル抗体
表１に提供されるＶ領域配列を表２に提供される定常領域配列に融合することにより、表３に示される完全重鎖及び完全軽鎖を再構築した。
表１に提供されるＶ領域配列を表２に提供される定常領域配列に融合することにより、表３に示される完全重鎖及び完全軽鎖を再構築した。
【0040】
【表3】
【0041】
１．５ モノクローナル抗体の調製
ｐＣＤＮＡ ３．４ベクターをｍＡｂ用の発現ベクターとして用いた。コドン最適化後、全遺伝子を合成し、ｐＣＤＮＡ ３．４ベクター内に挿入し、内毒素不含プラスミド調製キットを用いてトランスフェクション用の発現ベクターを調製した。一過性発現宿主用の宿主としてＥｘｐｉＣＨＯ細胞株を用いた。一過性トランスフェクション後、細胞培養上清を採取し、親和性精製を通じて抗体を得て、次いでこれを同定し、－８０℃で保存した。
ｐＣＤＮＡ ３．４ベクターをｍＡｂ用の発現ベクターとして用いた。コドン最適化後、全遺伝子を合成し、ｐＣＤＮＡ ３．４ベクター内に挿入し、内毒素不含プラスミド調製キットを用いてトランスフェクション用の発現ベクターを調製した。一過性発現宿主用の宿主としてＥｘｐｉＣＨＯ細胞株を用いた。一過性トランスフェクション後、細胞培養上清を採取し、親和性精製を通じて抗体を得て、次いでこれを同定し、－８０℃で保存した。
【0042】
実施例２ ＣＤ２２抗原への抗体の結合の検出
本実施例において、ＥＬＩＳＡプレートをＣＤ２２抗原でコーティングして、評価しようとする抗体を捕捉し、Ｆｄ領域を特異的に認識可能なＨＲＰ標識二次抗体を通じて発色させて、ＣＤ２２抗原への各ｍＡｂの結合（ＥＣ５０）を検出した。
本実施例において、ＥＬＩＳＡプレートをＣＤ２２抗原でコーティングして、評価しようとする抗体を捕捉し、Ｆｄ領域を特異的に認識可能なＨＲＰ標識二次抗体を通じて発色させて、ＣＤ２２抗原への各ｍＡｂの結合（ＥＣ５０）を検出した。
【0043】
ＥＬＩＳＡプレートを、１ウェルあたり１００μｌの２００ｎｇ／ｍＬのＣＤ２２抗原（ビオチン化ヒトＳｉｇｌｅｃ－２／ＣＤ２２タンパク質、Ｆｃ、Ａｖｉｔａｇ（商標）、ACROBiosystems（ARCO））で、４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いで添加したブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ＋３％ミルク）によって３７℃で１時間～２時間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで再び洗浄した。
【0044】
試験しようとする各抗体を、勾配をつけてＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡで希釈して、それぞれ、０．０１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．２５ｎｇ／ｍＬ、１．２８ｎｇ／ｍＬ、６．４０ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、２００００ｎｇ／ｍＬの濃度の抗体希釈物を得て、各希釈物の１００μｌをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、これを次いで、３７℃で１時間インキュベーションした。
【0045】
インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで洗浄した。１：１００００希釈した二次抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｄ二次抗体、ＨＲＰ、ＲＥＦ：ＳＡ５－１０１９０、Invitrogen、ＵＳＡ）１００μｌをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、これを次いで、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、プレートをＰＢＳＴで洗浄した。
【0046】
ＴＭＢ溶液（ＴＭＢ単一構成要素基質溶液、カタログ番号ＰＲ１２００、Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.）１００μｌをプレートの各ウェルに添加し、これを次いで、室温で１５分間インキュベーションした。次いで、５０μｌの停止緩衝液（ＥＬＩＳＡ停止緩衝液（１０倍）、カタログ番号Ｃ１０５８、Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.）をそこに添加し、プレートを振盪した。４５０ｎｍでの吸光度値を検出した。結果を図１及び表４に示す。
【0047】
図１及び表４に示されるように、アイソタイプ対照のＯＤ４５０値は０．１未満であり、非特異的結合による結果に対する干渉はないことが示された。４パラメータ非線形適合の適合度は０．９９より高い優れた適合度であり、結果が客観的に分析可能であることを示した。最高値は、ｍＡｂ－６が２．４３５～２．５６４に達する顕著に高いシグナル値を示すことを示し、これは、ＨＡ２２ ｍＡｂの値である２．１４７～２．２８３よりも有意に高く、ｍＡｂ－６が飽和結合のより高いプラトーを有することを示した。ｍＡｂ－１の最高値は１．７２６～１．７９５であり、ＨＡ２２ ｍＡｂの２．１４７～２．２８３よりも有意により低く、残りのｍＡｂ－２、ｍＡｂ－３、ｍＡｂ－４、及びｍＡｂ－５の最高値はＨＡ２２ ｍＡｂのものに匹敵するか又はそれよりもわずかに高かった。
【0048】
陽性抗体ＨＡ２２ ｍＡｂのＥＣ５０値は２０．２８ｎｇ／ｍＬであり、ｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６のＥＣ５０値は全てＨＡ２２ ｍＡｂのものより低く、ＥＣ５０値は以下のようにランク付け可能である：ｍＡｂ－２＜ｍＡｂ－６＜ｍＡｂ－３＜ｍＡｂ－４＜ｍＡｂ－１＜ｍＡｂ－５＜ＨＡ２２ ｍＡｂ。
【0049】
【表4】
【0050】
実施例３ ＣＤ２２抗原に対する抗体の結合動力学に関する研究
本実施例において、抗原に対する抗体の結合動力学をＳＰＲによって検出した。
本実施例において、抗原に対する抗体の結合動力学をＳＰＲによって検出した。
【0051】
以下の試薬及び材料を主に用いた。
固定する抗原：ＣＤ２２－Ｆｃビオチン化抗原：ACROBiosystems（ARCO）ＳＩ２－Ｈ８２Ｆ８
試験する抗体：抗ＣＤ２２ ｍＡｂ、
チップＳＡ、
固定緩衝液：（１）１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨ、
（２）１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨ／５０％イソプロパノール、
泳動緩衝液：１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液、
再生緩衝液：グリシン、ｐＨ１．５。
固定する抗原：ＣＤ２２－Ｆｃビオチン化抗原：ACROBiosystems（ARCO）ＳＩ２－Ｈ８２Ｆ８
試験する抗体：抗ＣＤ２２ ｍＡｂ、
チップＳＡ、
固定緩衝液：（１）１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨ、
（２）１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨ／５０％イソプロパノール、
泳動緩衝液：１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液、
再生緩衝液：グリシン、ｐＨ１．５。
【0052】
実験工程は以下の通りであった。
１）センサーチップＳＡを取り、その表面を超純水で清浄化し、窒素下で乾燥した後、スロット内に挿入した。それぞれ、固定緩衝液（１）及び（２）を９６ウェルプレート中のカラムＡ１及びＡ２に添加し、３．８５ｎＭ ＣＤ２２－Ｆｃビオチン化抗原を１ウェルあたり２００μＬで、カラムＡ３中の対応するウェル内に添加した。抗原を固定するようにプログラムを設定し、約７０ＲＵのデルタＲＵが達成されたら、固定を停止した。
２）会合時間２５０秒及び解離時間６００秒を含むプログラム「結合試験」を設定し、ＨＡ２２ ｍＡｂを用いて試験を行い、４％～５％の解離度が示された。
３）ＨＡ２２ ｍＡｂを１０００ｎＭに希釈し、続いて１００ｎＭに希釈して、更に、１ウェルあたり約２５０μＬの最終体積で、１００ｎＭから出発して８回、２倍希釈した。会合時間２５０秒及び解離時間６００秒で、抗原へのその抗体番号１の結合能を検出するため、プログラムをセットアップした。分析ソフトウェアは、ＨＡ２２ ｍＡｂの結合が正常に適合することを示した。
４）全ての抗体、即ちｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６を１０００ｎＭに希釈し、続いて１００ｎＭに希釈して、更に、１ウェルあたり約２５０μＬの最終体積で、１００ｎＭから出発して８回、２倍希釈した。工程３におけるものと同じプログラムをセットアップして、バッチの親和性を検出した。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価を用いて結果を分析した。
１）センサーチップＳＡを取り、その表面を超純水で清浄化し、窒素下で乾燥した後、スロット内に挿入した。それぞれ、固定緩衝液（１）及び（２）を９６ウェルプレート中のカラムＡ１及びＡ２に添加し、３．８５ｎＭ ＣＤ２２－Ｆｃビオチン化抗原を１ウェルあたり２００μＬで、カラムＡ３中の対応するウェル内に添加した。抗原を固定するようにプログラムを設定し、約７０ＲＵのデルタＲＵが達成されたら、固定を停止した。
２）会合時間２５０秒及び解離時間６００秒を含むプログラム「結合試験」を設定し、ＨＡ２２ ｍＡｂを用いて試験を行い、４％～５％の解離度が示された。
３）ＨＡ２２ ｍＡｂを１０００ｎＭに希釈し、続いて１００ｎＭに希釈して、更に、１ウェルあたり約２５０μＬの最終体積で、１００ｎＭから出発して８回、２倍希釈した。会合時間２５０秒及び解離時間６００秒で、抗原へのその抗体番号１の結合能を検出するため、プログラムをセットアップした。分析ソフトウェアは、ＨＡ２２ ｍＡｂの結合が正常に適合することを示した。
４）全ての抗体、即ちｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６を１０００ｎＭに希釈し、続いて１００ｎＭに希釈して、更に、１ウェルあたり約２５０μＬの最終体積で、１００ｎＭから出発して８回、２倍希釈した。工程３におけるものと同じプログラムをセットアップして、バッチの親和性を検出した。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価を用いて結果を分析した。
【0053】
結果を図２及び表５に示す。
【0054】
【表5】
【0055】
実施例４ ＣＤ２２陽性細胞株への抗体の結合に関する研究
Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ２２の比較的高発現を有する）、ＣＡ４６細胞（ＣＤ２２の比較的高発現を有する）、及びＲＥＨ細胞（ＣＤ２２の比較的中程度の発現を有する）を選択し、ＦＡＣＳを通じて得られた濃度に対する平均蛍光強度の曲線によって、抗体の細胞結合能を評価した。
Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ２２の比較的高発現を有する）、ＣＡ４６細胞（ＣＤ２２の比較的高発現を有する）、及びＲＥＨ細胞（ＣＤ２２の比較的中程度の発現を有する）を選択し、ＦＡＣＳを通じて得られた濃度に対する平均蛍光強度の曲線によって、抗体の細胞結合能を評価した。
【0056】
試薬：
ＦＡＣＳ緩衝液：２％ＦＢＳ＋ＰＢＳ、
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＦＩＴＣ：Invitrogen、カタログ番号３１５２９、
４％ＰＦＡ、
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）、Jackson Immunoresearch、カタログ番号１０９－１３６－１７０
ＦＡＣＳ緩衝液：２％ＦＢＳ＋ＰＢＳ、
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＦＩＴＣ：Invitrogen、カタログ番号３１５２９、
４％ＰＦＡ、
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）、Jackson Immunoresearch、カタログ番号１０９－１３６－１７０
【0057】
実験工程は以下の通りであった。
１）対数増殖期のＲａｊｉ細胞、ＣＡ４６細胞及びＲＥＨ細胞を採取し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
２）１０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ＋ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄した。
３）細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、細胞密度を２Ｅ６／ｍＬに調整した。
４）細胞懸濁物を９６ウェル丸底プレートに１ウェルあたり５０μＬで添加し、次いでプレートを氷上に置いた。
５）検出しようとする各抗体を８つの濃度：１００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．０３２μｇ／ｍＬ、０．００６４μｇ／ｍＬ及び０．００１２８μｇ／ｍＬに連続して５倍希釈した。
６）希釈した抗体を、細胞の入ったウェルに体積比１：１で添加し、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０８μｇ／ｍＬ、０．０１６μｇ／ｍＬ、０．００３２μｇ／ｍＬ、０．０００６４μｇ／ｍＬの最終濃度を得て、細胞懸濁物と混合し、次いでプレートを、４℃の冷蔵庫中、氷上に置き、３０分間インキュベーションした。
７）インキュベーション後、細胞を取り出し、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
８）２０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
９）細胞を２％ＰＦＡ、室温で２０分間固定した。
１０）２０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
１１）二次抗体（Ｒａｊｉ細胞及びＲＥＨ細胞にはヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＦＩＴＣを用い、ＣＡ４６細胞にはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）を用いた）を緩衝液中１：８００で配合し、各１００μＬを細胞に添加し、次いで、プレートを４℃の冷蔵庫中、氷上に置き、３０分間インキュベーションした。
１２）インキュベーション後、細胞を２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
１３）上清を廃棄し、２０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
１４）細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、そしてＦＩＴＣの蛍光強度及びＡＰＣの蛍光強度を検出した。
１）対数増殖期のＲａｊｉ細胞、ＣＡ４６細胞及びＲＥＨ細胞を採取し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
２）１０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ＋ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄した。
３）細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、細胞密度を２Ｅ６／ｍＬに調整した。
４）細胞懸濁物を９６ウェル丸底プレートに１ウェルあたり５０μＬで添加し、次いでプレートを氷上に置いた。
５）検出しようとする各抗体を８つの濃度：１００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．０３２μｇ／ｍＬ、０．００６４μｇ／ｍＬ及び０．００１２８μｇ／ｍＬに連続して５倍希釈した。
６）希釈した抗体を、細胞の入ったウェルに体積比１：１で添加し、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０８μｇ／ｍＬ、０．０１６μｇ／ｍＬ、０．００３２μｇ／ｍＬ、０．０００６４μｇ／ｍＬの最終濃度を得て、細胞懸濁物と混合し、次いでプレートを、４℃の冷蔵庫中、氷上に置き、３０分間インキュベーションした。
７）インキュベーション後、細胞を取り出し、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
８）２０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
９）細胞を２％ＰＦＡ、室温で２０分間固定した。
１０）２０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
１１）二次抗体（Ｒａｊｉ細胞及びＲＥＨ細胞にはヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＦＩＴＣを用い、ＣＡ４６細胞にはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）を用いた）を緩衝液中１：８００で配合し、各１００μＬを細胞に添加し、次いで、プレートを４℃の冷蔵庫中、氷上に置き、３０分間インキュベーションした。
１２）インキュベーション後、細胞を２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
１３）上清を廃棄し、２０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
１４）細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、そしてＦＩＴＣの蛍光強度及びＡＰＣの蛍光強度を検出した。
【0058】
結果を図３及び表６－１～表６－３に示す。
【0059】
【表6】
【0060】
パネル３Ａ及び表４に示されるように、全ての適合パラメータＲ２は０．９５より高い値に到達し、参照抗体ＨＡ２２ ｍＡｂのＥＣ５０値は１５２ｎｇ／ｍＬであり、抗体の最大蛍光シグナルは７５０６～８１３１の間であって、プラトー期に到達した。ｍＡｂ－１の最大蛍光シグナルは、参照抗体ＨＡ２２ ｍＡｂのものに匹敵する一方、残りのｍＡｂの最大蛍光シグナルは全て、参照抗体ＨＡ２２ ｍＡｂのものより高く、最大蛍光シグナルは以下のようにランク付け可能である。ｍＡｂ－６＞ｍＡｂ－５＞ｍＡｂ－３＞ｍＡｂ－４＞ｍＡｂ－２＞ｍＡｂ－１＞ＨＡ２２ ｍＡｂ。より高い蛍光強度は、ヒト化ｍＡｂがＨＡ２２ ｍＡｂよりも、Ｒａｊｉ細胞に対してより高い結合潜在能力を有することを示す。蛍光シグナルは１０ｎｇ／ｍＬの濃度で既に検出可能であり、Ｒａｊｉ細胞に対する各抗体の結合が１０ｎｇ／ｍＬで達成されることを示した。抗体ｍＡｂ－３、ｍＡｂ－５、及びｍＡｂ－６は、５０μｇ／ｍＬでなお蛍光シグナルプラトーに到達せず、そのため得られたＥＣ５０値は不正確なものであったが、全体の線形性評価から、ｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６は、Ｒａｊｉ細胞に対して匹敵するか又は更により強い結合能を有すると決定可能である。
【0061】
【表7】
【0062】
パネル３Ｂ及び表６－２に示されるように、ＣＤ２２の中程度の発現を持つＲＥＨ細胞に対して、ｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６は、ＨＡ２２ ｍＡｂと比較して、ＲＥＨ細胞に対し、匹敵するか又は更により強い結合能を有した。
【0063】
【表8】
【0064】
パネル３Ｃ及び表６－３に示されるように、ＣＤ２２の高い発現を持つＣＡ４６細胞に対して、ｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６は、ＨＡ２２ ｍＡｂのものと類似の結合特性を保持し、これら全ては高いＣＡ４６結合を達成した。３つのＣＤ２２陽性細胞株全てに対する検出結果によれば、ヒト化ｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６は、ＨＡ２２ ｍＡｂのものに匹敵するか、又は更により優れた細胞結合能を保持し得る。
【0065】
実施例５ 抗体の内在化効率に関する研究
ＣＤ２２は、内在化の効率的な標的であるため、ＣＤ２２に対する抗体の内在化効率は、しばしば、免疫毒素及びＡＤＣの発現に関する評価の最も重要な指標である。ヒト化抗体、即ちｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６の内在化効率を評価するため、３つのＣＤ２２陽性細胞株（Ｒａｊｉ細胞、ＣＡ４６細胞及びＲＥＨ細胞）を評価のために選択し、抗体の内在化効率を、参照抗体ＨＡ２２ ｍＡｂのものと比較した。
ＣＤ２２は、内在化の効率的な標的であるため、ＣＤ２２に対する抗体の内在化効率は、しばしば、免疫毒素及びＡＤＣの発現に関する評価の最も重要な指標である。ヒト化抗体、即ちｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６の内在化効率を評価するため、３つのＣＤ２２陽性細胞株（Ｒａｊｉ細胞、ＣＡ４６細胞及びＲＥＨ細胞）を評価のために選択し、抗体の内在化効率を、参照抗体ＨＡ２２ ｍＡｂのものと比較した。
【0066】
試薬：
ＦＡＣＳ緩衝液：２％ＦＢＳ＋ＰＢＳ、
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＦＩＴＣ：Invitrogen、カタログ番号３１５２９、
４％ＰＦＡ、
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）、Jackson Immunoresearch、カタログ番号１０９－１３６－１７０
ＦＡＣＳ緩衝液：２％ＦＢＳ＋ＰＢＳ、
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＦＩＴＣ：Invitrogen、カタログ番号３１５２９、
４％ＰＦＡ、
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）、Jackson Immunoresearch、カタログ番号１０９－１３６－１７０
【0067】
実験工程は以下の通りであった。
１）対数増殖期のＲａｊｉ細胞、ＣＡ４６細胞及びＲＥＨ細胞を採取し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
２）１０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
３）細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、細胞密度を５Ｅ６／ｍＬに調整した。
４）細胞懸濁物を９６ウェル丸底プレートに１ウェルあたり１００μＬで添加し、次いでプレートを氷上に置いた。
５）１００μｇ／ｍＬの試験しようとする抗体のストック溶液を調製し、１ウェルあたり１００μＬでプレートのウェルに溶液を添加して、５０μｇ／ｍＬの抗体濃度を得て、プレート中の細胞及び溶液を混合し、次いでプレートを４℃の冷蔵庫中、氷上に置き、３０分間インキュベーションした。
６）インキュベーション後、プレートを取り出し、細胞を４℃、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
７）２０００ｒｐｍ、４℃で３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
８）１つのプレートを「０時間プレート」として用いた。この中の細胞を、２％ＰＦＡで、室温で２０分間固定し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し（２０００ｒｐｍ、３分間）、ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、続く二次抗体標識のため、４℃に置いた。
９）他のプレートを「０．５時間プレート」、「１時間プレート」、「２時間プレート」、及び「４時間プレート」として用い、プレートの各ウェル中の細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、プレートを静置培養のため、３７℃定温インキュベーターに入れ、培養時間を記録した。
１０）プレートを、それぞれ、０．５時間、１時間、２時間、及び４時間で取り出した。
１１）全てのプレートを２０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。
１２）二次抗体を緩衝液中で配合し、各１００μＬを細胞に添加し、次いでプレートを４℃の冷蔵庫中、氷上に置き、３０分間インキュベーションした。
１３）インキュベーション後、細胞を２０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。
１４）上清を廃棄し、２０００ｒｐｍ、４℃で３分間の遠心分離によって、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。
１５）細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、検出した。
１）対数増殖期のＲａｊｉ細胞、ＣＡ４６細胞及びＲＥＨ細胞を採取し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
２）１０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
３）細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、細胞密度を５Ｅ６／ｍＬに調整した。
４）細胞懸濁物を９６ウェル丸底プレートに１ウェルあたり１００μＬで添加し、次いでプレートを氷上に置いた。
５）１００μｇ／ｍＬの試験しようとする抗体のストック溶液を調製し、１ウェルあたり１００μＬでプレートのウェルに溶液を添加して、５０μｇ／ｍＬの抗体濃度を得て、プレート中の細胞及び溶液を混合し、次いでプレートを４℃の冷蔵庫中、氷上に置き、３０分間インキュベーションした。
６）インキュベーション後、プレートを取り出し、細胞を４℃、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
７）２０００ｒｐｍ、４℃で３分間の遠心分離によって、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
８）１つのプレートを「０時間プレート」として用いた。この中の細胞を、２％ＰＦＡで、室温で２０分間固定し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し（２０００ｒｐｍ、３分間）、ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、続く二次抗体標識のため、４℃に置いた。
９）他のプレートを「０．５時間プレート」、「１時間プレート」、「２時間プレート」、及び「４時間プレート」として用い、プレートの各ウェル中の細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、プレートを静置培養のため、３７℃定温インキュベーターに入れ、培養時間を記録した。
１０）プレートを、それぞれ、０．５時間、１時間、２時間、及び４時間で取り出した。
１１）全てのプレートを２０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。
１２）二次抗体を緩衝液中で配合し、各１００μＬを細胞に添加し、次いでプレートを４℃の冷蔵庫中、氷上に置き、３０分間インキュベーションした。
１３）インキュベーション後、細胞を２０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。
１４）上清を廃棄し、２０００ｒｐｍ、４℃で３分間の遠心分離によって、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。
１５）細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、検出した。
【0068】
結果を図４に示す。
【0069】
０時間ではエンドサイトーシスは全く起こらず、抗体は細胞表面上で、１００％濃縮され、経時的に、抗体は細胞内にエンドサイトーシスされて、検出可能な膜表面上の抗体の量は減少した。より低い抗体シグナルが検出されるほど、より多くのエンドサイトーシスが起こっている。図４に示されるように、Ｒａｊｉ細胞、ＣＡ４６細胞及びＲＥＨ細胞内への抗体のエンドサイトーシスの割合を評価した際、ｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６とＨＡ２２ ｍＡｂとの間には、エンドサイトーシス率の有意な相違は見られず、最大エンドサイトーシス効率は、Ｒａｊｉ細胞及びＣＡ４６細胞上では０．５時間で、ＲＥＨ細胞上では１時間で達成された。７つの抗体は匹敵するエンドサイトーシスの割合を示したが、平均蛍光強度値の分析によって、エンドサイトーシスされる分子の数の大きな相違が見られ得た。ＣＡ４６細胞上で、抗体は本質的に同一の数のエンドサイトーシス分子を達成した一方、Ｒａｊｉ細胞及びＲＥＨ細胞上では、ヒト化抗体ｍＡｂ－１～ｍＡｂ－６のエンドサイトーシスされる分子の数は、参照抗体ＨＡ２２ ｍＡｂのものよりも有意により高く、以下のように高い方から低い方にランク付け可能であった。ｍＡｂ－６＞ｍＡｂ－５＞ｍＡｂ－４＞ｍＡｂ－３＞ｍＡｂ－２＝ｍＡｂ－１＝ＨＡ２２ ｍＡｂ。
【0070】
実施例６ 抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の検出
候補抗体が抗体依存性細胞傷害を有するかどうかを評価するため、ＡＤＣＣアッセイのため、３つの腫瘍細胞株、即ち異なるＣＤ２２発現レベルを有するＲａｊｉ細胞株、ＣＡ４６細胞株及びＲＥＨ細胞株を標的細胞として選択し、ＰＢＭＣをエフェクター細胞として選択した。
候補抗体が抗体依存性細胞傷害を有するかどうかを評価するため、ＡＤＣＣアッセイのため、３つの腫瘍細胞株、即ち異なるＣＤ２２発現レベルを有するＲａｊｉ細胞株、ＣＡ４６細胞株及びＲＥＨ細胞株を標的細胞として選択し、ＰＢＭＣをエフェクター細胞として選択した。
【0071】
試薬：
Ｒ－１０培地：フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０＋１０％不活性化ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、
Ｒ－２培地：フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０＋２％不活性化ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、
Ｃｙｔｏｔｏｘ Ｇｌｏ（商標）細胞傷害性アッセイキット（Promega、カタログ番号Ｇ９２９１）。
Ｒ－１０培地：フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０＋１０％不活性化ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、
Ｒ－２培地：フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０＋２％不活性化ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、
Ｃｙｔｏｔｏｘ Ｇｌｏ（商標）細胞傷害性アッセイキット（Promega、カタログ番号Ｇ９２９１）。
【0072】
実験工程は以下の通りであった。
１）ＰＢＭＣを１日前に融解した。
２）実験当日、融解したＰＢＭＣを採取し、２００ｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を２ｍＬの新鮮なＲ－１０培地に再懸濁し、計数し、細胞密度を５Ｅ６細胞／ｍＬに調整した。細胞懸濁物を１ウェルあたり５０μＬでプレートに添加して、１ウェルあたり２５００００細胞を得るか、又はＲ－１０培地を添加した。
３）検出しようとする抗体を、Ｒ－２培地で２００μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、０．３２μｇ／ｍＬ、０．０６４μｇ／ｍＬ、０．０１２８μｇ／ｍＬ及び０．００２５６μｇ／ｍＬに希釈し、１ウェルあたり２５μＬをプレートに添加して、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０８μｇ／ｍＬ、０．０１６μｇ／ｍＬ、０．００３２μｇ／ｍＬ、及び０．０００６４μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
４）Ｒａｊｉ細胞、ＣＡ４６細胞及びＲＥＨ細胞をＲ－１０培地で２Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、プレート内に１ウェルあたり２５μＬで添加して、５０：１のエフェクター対標的比を達成した。
５）プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションし、発色させ、Ｃｙｔｏｔｏｘ Ｇｌｏ（商標）細胞傷害性アッセイキット中の使用説明書に従って検出した。
１）ＰＢＭＣを１日前に融解した。
２）実験当日、融解したＰＢＭＣを採取し、２００ｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を２ｍＬの新鮮なＲ－１０培地に再懸濁し、計数し、細胞密度を５Ｅ６細胞／ｍＬに調整した。細胞懸濁物を１ウェルあたり５０μＬでプレートに添加して、１ウェルあたり２５００００細胞を得るか、又はＲ－１０培地を添加した。
３）検出しようとする抗体を、Ｒ－２培地で２００μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、０．３２μｇ／ｍＬ、０．０６４μｇ／ｍＬ、０．０１２８μｇ／ｍＬ及び０．００２５６μｇ／ｍＬに希釈し、１ウェルあたり２５μＬをプレートに添加して、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０８μｇ／ｍＬ、０．０１６μｇ／ｍＬ、０．００３２μｇ／ｍＬ、及び０．０００６４μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
４）Ｒａｊｉ細胞、ＣＡ４６細胞及びＲＥＨ細胞をＲ－１０培地で２Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、プレート内に１ウェルあたり２５μＬで添加して、５０：１のエフェクター対標的比を達成した。
５）プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションし、発色させ、Ｃｙｔｏｔｏｘ Ｇｌｏ（商標）細胞傷害性アッセイキット中の使用説明書に従って検出した。
【0073】
【0074】
図５に示されるように、７つのｍＡｂは全て、異なるＣＤ２２発現レベルを持つ腫瘍細胞に対して、有意なＡＤＣＣ効果を持たず、用量－反応依存曲線は適合不能である一方、これらは５０μｇ／ｍＬの高用量でわずかなＡＤＣＣ効果を示した。
【0075】
５０μｇ／ｍＬの用量で観察された細胞傷害を分析すると、図６に示されるように、ｍＡｂ－３は比較的低い細胞傷害を有し、アイソタイプ対照と相違がなかった。抗体ｍＡｂ－１、ｍＡｂ－２、ｍＡｂ－４、ｍＡｂ－５、及びｍＡｂ－６は、高いＣＤ２２発現レベルを有するＲａｊｉ細胞及びＣＡ４６細胞に対して、ＨＡ２２と異ならない細胞傷害を示した。しかし、ｍＡｂ－２は、低いＣＤ２２発現レベルを有するＲＥＨ細胞に対して、ＨＡ２２ ｍＡｂよりもわずかにより強力な細胞傷害を示した。結論として、７つのＩｇＧ１抗体によって、有意なＡＤＣＣ効果は示されなかった。
【0076】
本発明の実施形態に関する以上の説明は、本発明を限定することを意図するものではなく、当業者は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で本発明に種々の変更及び修正を加えることができ、これは添付の特許請求の範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【配列表】
【国際調査報告】