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特表2023-544255ビニル部分を有するポリ－３－ヒドロキシアルカノエート及びその生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-23
(54)【発明の名称】ビニル部分を有するポリ－３－ヒドロキシアルカノエート及びその生産方法
(51)【国際特許分類】
C08G 63/06 20060101AFI20231016BHJP
C12P 7/62 20220101ALI20231016BHJP
C08G 63/78 20060101ALI20231016BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20231016BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20231016BHJP
C12N 1/15 20060101ALN20231016BHJP
C08L 101/16 20060101ALN20231016BHJP
【ＦＩ】
C08G63/06
C12P7/62
C08G63/78
C12N15/54 ZNA
C12N15/60 ZBP
C12N1/15
C08L101/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023516840
(86)(22)【出願日】2021-10-11
(85)【翻訳文提出日】2023-05-11
(86)【国際出願番号】 IB2021000690
(87)【国際公開番号】W WO2022074456
(87)【国際公開日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】20201070.8
(32)【優先日】2020-10-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523091626
【氏名又は名称】ポリファーム カナダ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＯＬＹＦＥＲＭ ＣＡＮＡＤＡ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ラムゼイ， ブルース
(72)【発明者】
【氏名】ラムゼイ， ジュリアナ
(72)【発明者】
【氏名】サンチェス‐フローレス， アラセリ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4J029
4J200
【Ｆターム（参考）】
4B064AD83
4B064CA02
4B064CA19
4B064CB24
4B064CC24
4B064CD07
4B064CD09
4B064CE03
4B064DA01
4B065AA26Y
4B065AA41X
4B065AA44Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB07
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4B065BC01
4B065CA12
4B065CA44
4J029AA07
4J029AB01
4J029AB04
4J029AC02
4J029AE06
4J029EA02
4J029EA05
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4J029HA05
4J029HB07
4J200AA02
4J200AA13
4J200BA03
4J200BA06
4J200BA12
4J200DA22
4J200EA01
(57)【要約】
短鎖長（ｓｃｌ）サブユニットと中鎖長（ｍｃｌ）サブユニットの両方を含むポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）コポリマーを生産する方法であって、ｍｃｌサブユニットの一部が反応性ビニル基を持つ、方法が提供される。この方法は、（ｉ）特定のクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子と、（ｉｉ）特定の（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子とを含む細胞を用意するステップと、アルケン酸を含む増殖培地中で前記細胞を培養するステップとを含む。反応性ビニル基を持つサブユニットを有するｓｃｌ－ｍｃｌ ＰＨＡは、例えば、生理活性分子の共有結合など、様々な用途において有用であることが期待されている。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ．８５．０～９９．５ｍｏｌ％の１つ又は複数の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、ｂ．０．５～５ｍｏｌ％の１つ又は複数の中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマーであって、
前記中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニットが側鎖にアルケン部分を含む、ポリエステルコポリマー。
【請求項2】
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマー。
【請求項3】
前記アルケン部分が末端アルケン部分である、請求項１又は２に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項4】
前記飽和短鎖長ポリヒドロキシアルカノエートサブユニットが飽和短鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項5】
前記飽和短鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットが３－ヒドロキシブチレートサブユニットである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項6】
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット
とを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項7】
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、ｂ．３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項8】
ａ．６０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、ｂ．０．５～４０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、請求項２に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項9】
ａ．７０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、ｂ．０．５～３０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、請求項２に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項10】
ａ．８０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、ｂ．０．５～２０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、請求項２に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項11】
ａ．９０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、ｂ．０．５～１０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、請求項２に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項12】
ａ．９５．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、ｂ．０．５～５．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、請求項２に記載のポリエステルコポリマー。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマーを生産する方法であって、ａ．ｉ．配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子と、
ｉｉ．配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子
とを含む細胞を用意するステップと、
ｂ．アルケン酸を含む増殖培地中で前記細胞を培養し、それによって前記ポリエステルコポリマーを得るステップ
とを含む、方法。
【請求項14】
前記クラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性、例えば、配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、配列番号２と少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性、例えば、配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ｐｈａＣ遺伝子が前記細胞に固有のものである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、広特異性（Ｒ）特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼである、請求項１３及び１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、前記細胞に固有のものではない、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０株由来のｐｈａＪ遺伝子である、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記細胞がカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）である、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞がカプリアビダス・ネカトールＨ１６株である、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＥ遺伝子をさらに含む、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする前記ｆａｄＥ遺伝子が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株由来のｆａｄＥ遺伝子である、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記細胞が、炭素源としてウンデカ－１０－エン酸を使用することができる、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記細胞が、唯一の炭素源としてウンデカ－１０－エン酸及びフルクトースを使用することができる、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも１５％の前記請求項のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー、例えば少なくとも２０％の前記ポリエステルを蓄積することができる、請求項１３～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも３０％の前記請求項のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマーを蓄積することができる、請求項１３～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記増殖培地が１３－酸化阻害剤を含む、請求項１３～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記１３－酸化防止剤がアクリル酸である、請求項１３～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記アルケン酸がウンデカ－１０－エン酸である、請求項１３～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記ｐｈａＣ遺伝子が前記細胞に固有のものである、請求項１３～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼである、請求項１３～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、前記細胞に固有のものではない、請求項１３～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、前記シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株由来のｐｈａＪ遺伝子である、請求項１３～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記細胞がカプリアビダス・ネカトールである、請求項１３～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記細胞がカプリアビダス・ネカトールＨ１６株である、請求項１３～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記細胞が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＥ遺伝子をさらに含む、請求項１３～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、配列番号３と少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性、例えば、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１３～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする前記ｆａｄＥ遺伝子が、前記大腸菌Ｋ１２株由来のｆａｄＥ遺伝子である、請求項１３～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記細胞が、炭素源としてウンデカ－１０－エン酸を使用することができる、請求項１３～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記細胞が、唯一の炭素源としてウンデカ－１０－エン酸及びフルクトースを使用することができる、請求項１３～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも１５％の請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー、例えば少なくとも２０％のポリエステルを蓄積することができる、請求項１３～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも３０％の請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマーを蓄積することができる、請求項１３～４２のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、２０２０年１０月９日に欧州特許庁に出願された欧州仮特許出願第ＥＰ２０２０１０７０．８号の優先権を主張し、その内容全体はすべての目的において参照により本明細書に組み込まれる。
[0001]本出願は、２０２０年１０月９日に欧州特許庁に出願された欧州仮特許出願第ＥＰ２０２０１０７０．８号の優先権を主張し、その内容全体はすべての目的において参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
[0002]本発明は、バイオポリマー及びその生産に関する。特に、本発明は、短鎖長及び短鎖長～中鎖長のポリ－３－ヒドロキシアルカノエート及びその微生物生産に関する。
【背景技術】
【0003】
[0003]ポリ－３－ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、おそらく炭素及びエネルギーを保全する、あるいは細胞内の酸化還元状態を制御する方法として、様々な微生物によって蓄積されるポリエステルのファミリーである。ＰＨＡは、構成モノマーの長さによって下位分類される。３－ヒドロキシプロパン酸、３－ヒドロキシブタン酸、及び３－ヒドロキシペンタン酸（Ｃ３～Ｃ５）のポリマーは、短鎖長（ｓｃｌ）ＰＨＡと呼ばれる。
【0004】
[0004]６～１４個の炭素原子を有する３－ヒドロキシアルカン酸、すなわち、３－ヒドロキシヘキサン酸～３－ヒドロキシテトラデカン酸のポリマーは、中鎖長（ｍｃｌ）ＰＨＡと呼ばれる。側鎖の長さは、ＰＨＡの様々な機械的、物理的、及び化学的特性を付与する。
【0005】
[0005]ＰＨＡは、動物組織内でゆっくりと分解され、酸度又は毒性代謝物が比較的少なく放出されるので、生物医学的な用途を有することが明らかにされている。これらの用途の多くは、ＰＨＡにドープされた生理活性化合物の徐放を必要とするか、又はその徐放により改善される（Ｚｈａｎｇら ２０１８年）。ｓｃｌ－ｍｃｌ ＰＨＡコポリマーは、マウスにおける全身性エリテマトーデスを処置するためのＰＨＡナノ粒子の形成に使用されており、副作用は低減している（Ｈｕら ２０２０年）。用いる可能性のある別の分野は、治療薬の徐放が求められる創傷治癒においてである。Ｇｉｏｕｒｉｅｖａら ２０１９年は、ＰＨＡのドーピングを用いたそのような研究について報告している。
【0006】
[0006]Ｂ．セパシア（Ｂ．ｃｅｐａｃｉａ）ＩＰＴ６４は、無関係な炭素源由来の不飽和ｓｃｌサブユニット（３－ヒドロキシ－４－ペンテノエート）を含むｓｃｌ－ＰＨＡを蓄積するが、４－ペンテン酸が供給された場合、より多くのｓｃｌ－ＰＨＡが生成されることが明らかにされている（ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら ２０００年）。また、ロドスピリルム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）も、４－ペンテン酸が供給された場合、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシペンタン酸を含むｓｃｌ－ＰＨＡコポリマーに３－ヒドロキシ－４－ペンテノエートサブユニットを蓄積することが明らかにされている（Ｕｌｍｅｒら １９９４年、Ｂａｌｌｉｓｔｒｅｒｉら １９９５年、Ｂｅａｒら １９９７年）。しかし、４－ペンテン酸は高価であり、多くの又はほとんどの商業的な用途には適切ではない。さらに、短い側鎖しか生成されず、さらなる化学修飾には適さない可能性がある。また、９～１２％の３－ヒドロキシ－デカ－９－エノエートを含む３－ヒドロキシブタン酸のコポリマーを蓄積することができる組換え細菌株も開示されている（中国特許出願公開第１０９２６６５９７号）。
【0007】
[0007]上記で概説した可能性のある用途の多くは、ｓｃｌ－ｍｃｌ ＰＨＡをベースとしたものであり得る。したがって、反応基を持つサブユニットを含むそのようなｓｃｌ－ｍｃｌ ＰＨＡの利用可能性は、生理活性分子をポリマーに共有結合させることができるという理由から、非常に有用であり得る。しかし、今日まで、そのような反応基を有するｓｃｌ又はｓｃｌ－ｍｃｌ ＰＨＡを生産する実用法は開示されていない。さらに、中国特許出願公開第１０９２６６５９７号の開示は、基質として９－デセノールを使用してＰＨＡにＣ１０不飽和サブユニットを組み込む手段のみを提供している。これらのＰＨＡは、すべてのこうした用途に適しているというわけではなく、また９－デセノールなどの基質のコストは高いため、この方法を実施するにはかなりの費用がかかる可能性がある。さらに、中国特許出願公開第１０９２６６５９７号の菌株は、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）でわずかなパーセンテージのＰＨＡしかを蓄積することができず（例えば、ＣＤＷで１１．３％のＰＨＡ）、大規模生産において大きなデメリットとなり得る。中国特許出願公開第１０９２６６５９７の菌株は、ＰＨＡシンターゼをコードするｐｈａＣ遺伝子に関して、固有のものではない。
【0008】
[0008]カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）は、以前はアルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を含めた多くの様々な名称で知られており、ポリ－３－ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の最も有名な産生株である。ポリ－３－ヒドロキシ酪酸－ヒドロキシ吉草酸（Ｐ（ＨＢ－ＨＶ））コポリマーを生産する方法が発見されるまでは（Ｒａｍｓａｙら １９９０年）、３－ヒドロキシ酪酸のホモポリマーしか合成できないと考えられていた。カプリアビダス・ネカトールは、その収率が高く、生産速度が速いことから、最初のＩＣＩ Ｐ（ＨＢ－ＨＶ）生産工程に選択された。（Ｐ．Ａ．Ｈｏｌｍｅｓ、Ｓ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、及びＷ．Ｆ．Ｗｒｉｇｈｔ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｐａｔｅｎｔ６９、４９７、１９８７年４月。）
【0009】
[0009]ＰＨＡ合成における最終段階は、酵素のＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ）によって触媒される重合段階である。粗製Ｃ．ネカトールシンターゼは、数年後にネカトールシンターゼがいくらかの３－ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨｘ）を組み込むことができることが判明するまで（Ｄｅｎｎｉｓら １９９８年）、Ｃ５より大きい基質は受け入れられないと考えられていた（Ｈａｙｗｏｏｄら １９８９年）。その後、β－酸化障害された大腸菌にｐｈａＣをクローニングすることにより、カプリアビダス・ネカトールシンターゼは、ＨＯ（Ｃ８）及びＨＤＤ（Ｃ１２）を含むｍｃｌ－ＰＨＡを少量蓄積することができたが、驚いたことに、オクタノエート、デカノエート及びドデカノエートを供給した場合、ＨＤ（Ｃ１０）は蓄積されないことがわかった。これは、そのような作用の唯一の報告である。
【0010】
[0010]今日に至るまで、カプリアビダス・ネカトールのＰＨＡシンターゼの特異性は、分子量の小さい基質に限定されると一般的に考えられている。例えば、Ｍｅｚｚｏｌｌａら ２０１８年は、「ｐｈａＣ酵素を４つのクラスに分類したのは、短鎖長（ｓｃｌ）ポリマー又は中鎖長（ｍｃｌ）ポリマーを形成する優先度による基質特異性に応じたものである：クラスＩ、クラスＩＩＩ及びクラスＩＶは、プロピオネート、ブチレート、バレレート、及びヘキサノエート前駆体に応じてｓｃｌ－ＰＨＡを生産する。」と述べている。カプリアビダス・ネカトールＰＨＡシンターゼは、クラスＩシンターゼである。
【0011】
[0011]また、側鎖に末端アルケン部分を含むＰＨＡは、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）などのｍｃｌ－ＰＨＡ産生株によってのみ蓄積されると考えられている。例えば、Ｍｅｚｚｏｌｌａら ２０１８年は、「クラスＩＩのＰＨＡ重合酵素を持つシュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）によって生産される、不飽和モノマー（３－ヒドロキシアルケノエート）を含むＰＨＡも存在する。」と述べている。少量の３－ヒドロキシ－４－ペンテノエート（すなわち、ｓｃｌ－ＰＨＡ）を重合するクラスＩシンターゼの報告が１つ存在したが（ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら ２０００年）、カプリアビダス・ネカトールＰＨＡシンターゼを使用したｓｃｌ－ｍｃｌ－ＰＨＡコポリマー（ここで、ｍｃｌサブユニットはビニル基を含む）の生産は、報告されていない。
【0012】
[0012]したがって、ｓｃｌ飽和サブユニットと、反応性ビニル基を持つｍｃｌサブユニットとを有する新規のｓｃｌ－ｍｃｌ ＰＨＡを生産するためのより優れた方法が必要とされている。さらに、ＰＨＡが非持続性プラスチック又は環境に有害なプラスチックに置き換わるならば、より効率的な生産方法が必要とされる。
【発明の概要】
【0013】
[0013]本開示は、新規ＰＨＡ及びその生産方法を提供する。本発明者らは、驚いたことに、Ｃ．ネカトールの固有ＰＨＡシンターゼが、ｓｃｌサブユニットとｍｃｌサブユニットの両方を重合してコポリマーを形成できることを見出した。本発明者らは、開示したＰＨＡの生合成の成功が、広特異性（Ｒ）特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子の組み込みに依存することをさらに見出した。
【0014】
[0014]本開示の一態様は、
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマーを提供する。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマーを提供する。
【0015】
[0015]本開示の一態様は、
ａ．８５．０～９９．０ｍｏｌ％の１つ又は複数の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５ｍｏｌ％の１つ又は複数の中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマーであって、
[0016]前記中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニットが側鎖に末端アルケン部分を含む、ポリエステルコポリマーを提供する。
ａ．８５．０～９９．０ｍｏｌ％の１つ又は複数の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５ｍｏｌ％の１つ又は複数の中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマーであって、
[0016]前記中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニットが側鎖に末端アルケン部分を含む、ポリエステルコポリマーを提供する。
【0016】
[0017]本開示の一態様は、本開示のポリエステルコポリマーを生産することができる細胞であって、
ａ．配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子と、
ｂ．配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する（Ｒ）特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子
とを含む、細胞を提供する。
ａ．配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子と、
ｂ．配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する（Ｒ）特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子
とを含む、細胞を提供する。
【0017】
[0018]本開示の最後の態様は、本明細書に開示のポリエステルコポリマーを生産する方法であって、
ａ．本開示に記載の細胞を用意するステップと、
ｂ．アルケン酸を含む増殖培地中で前記細胞を培養し、それによってポリエステルコポリマーを得るステップ
とを含む、方法を提供する。
ａ．本開示に記載の細胞を用意するステップと、
ｂ．アルケン酸を含む増殖培地中で前記細胞を培養し、それによってポリエステルコポリマーを得るステップ
とを含む、方法を提供する。
【0018】
[0019]本明細書に開示の細胞は、ポリエステルコポリマーの細胞乾燥重量（ＣＤＷ）のポリエステルコポリマーパーセンテージで表される高収率のポリエステル生成物を提供する。
【0019】
[0020]ｍｃｌサブユニットのビニル部分は、本開示のポリエステルコポリマーのさらなる官能基化にとって有利となり得る。本開示のコポリマーは、側鎖に末端ビニル基を有するサブユニットを０．１～２０．０ｍｏｌ％含むので、本開示のポリエステルコポリマーは、少なくとも０．１の官能基化度が必要とされる官能基化ＰＨＡの生産に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【発明を実施するための形態】
【0021】
［定義］
[0028]本明細書で使用される場合の略語「ＰＨＡ」とは、ポリヒドロキシアルカノエート、特にポリ－３－ヒドロキシアルカノエートを意味するものとする。ＰＨＡはホモポリマー又はコポリマーのいずれかであり得る。
[0028]本明細書で使用される場合の略語「ＰＨＡ」とは、ポリヒドロキシアルカノエート、特にポリ－３－ヒドロキシアルカノエートを意味するものとする。ＰＨＡはホモポリマー又はコポリマーのいずれかであり得る。
【0022】
[0029]本明細書では、ＰＨＡモノマー単位について以下の略語を使用する：３ＨＢ（３－ヒドロキシ酪酸）、３ＨＨｘ（３－ヒドロキシヘキサン酸）、３ＨＨＯ（３－ヒドロキシオクタン酸）、３ＨＤ（３－ヒドロキシデカン酸）及び３ＨＨｐ（＝）（３－ヒドロキシヘプテン酸）。
【0023】
[0030]本明細書で使用される場合、用語（＝）は、モノマーサブユニットに関して、当該サブユニットがその側鎖に末端アルケンを含むことを意味するように使用される。
【0024】
[0031]カプリアビダス・ネカトールは、以前はラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）などの別名でも呼ばれていた。本発明は、現在カプリアビダス・ネカトールと呼ばれている細菌種に関する。
【0025】
[0032]本明細書で使用される場合、「サブユニット」とは、ポリマー骨格を構成する個別の反復分子部分を指す。本明細書では、サブユニットは、ポリマーが生成された元の非重合モノマー単位を参照することで同定することができる。例として、ＰＨＡのサブユニットは、３－ヒドロキシアルカノエートサブユニット又は３－ヒドロキシアルカン酸サブユニットと呼ぶことができる。
【0026】
[0033]ＰＨＡ中のサブユニットの含有量に関する「ｍｏｌ％」という用語は、ＰＨＡ中のサブユニットの総量と比較した前記サブユニットの量を指す。例えば、１０個のサブユニットごとに１個がＡ型である場合のＰＨＡは、１０ｍｏｌ％のＡを含むと考えられる。
【0027】
[0034]本明細書で使用される場合、「短鎖長」ヒドロキシアルカノエートサブユニットという用語は、３～５個の炭素原子を有するヒドロキシ－アルカノエートサブユニットを指す。特定の例は、３－ヒドロキシプロパノエートサブユニット、３－ヒドロキシブタノエートサブユニット、及び３－ヒドロキシペンタン酸サブユニットである。すなわち、ＰＨＡポリマー中のｓｃｌサブユニットは側鎖を有さないか、又は側鎖が１若しくは２個の炭素原子長である。ｓｃｌ ３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットは、式（Ｉ）の構造：
を有し、
[0035]式中、ＲはＨ、メチル又はエチルであり、点線はＰＨＡの他のサブユニットへの結合点を示す。
【化1】
を有し、
[0035]式中、ＲはＨ、メチル又はエチルであり、点線はＰＨＡの他のサブユニットへの結合点を示す。
【0028】
[0036]「ｓｃｌ－ヒドロキシアルケノエート」サブユニットという用語は、５個の炭素原子と、側鎖の炭素原子間に１個の炭素－炭素二重結合を有するサブユニットを指す。ｓｃｌ－ヒドロキシアルケノエートサブユニットの例は、３－ヒドロキシペンテノエートをベースとしたサブユニット、すなわち、式（ＩＩ）：
を有するサブユニットであり、
[0037]式中、点線は、ＰＨＡの他のサブユニットへの結合点を示す。
【化2】
を有するサブユニットであり、
[0037]式中、点線は、ＰＨＡの他のサブユニットへの結合点を示す。
【0029】
[0038]本明細書で使用される場合、「中鎖長」ヒドロキシアルカノエートサブユニットという用語は、６～１４個の炭素原子を有するヒドロキシ－アルカノエートサブユニットを指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、この用語は、式（ＩＩＩ）の構造：
を有する３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットを指し、
[0039]式中、Ｒは２～１０個の炭素原子を持つアルキル基であり、点線は、ＰＨＡの他のサブユニットへの結合点を示す。好ましくは、アルキル基は直鎖アルキル基である。
【化3】
を有する３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットを指し、
[0039]式中、Ｒは２～１０個の炭素原子を持つアルキル基であり、点線は、ＰＨＡの他のサブユニットへの結合点を示す。好ましくは、アルキル基は直鎖アルキル基である。
【0030】
[0040]「ｍｃｌ－ヒドロキシアルケノエート」サブユニットという用語は、６～１５個の炭素原子と、側鎖の炭素原子間に少なくとも１個の末端炭素－炭素二重結合を有するヒドロキシアルケノエートサブユニットを指す。ｍｃｌ－ヒドロキシアルケノエートサブユニットの例は、３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートをベースとしたサブユニット、すなわち、式（ＩＶ）：
を有するサブユニットであり、
[0041]式中、点線はＰＨＡの他のサブユニットへの結合点を示す。サブユニットの側鎖は、分岐状であっても直鎖状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。側鎖は複数の末端二重結合を含み得るが、側鎖は、好ましくは、厳密には１個の末端二重結合を含む。
【化4】
を有するサブユニットであり、
[0041]式中、点線はＰＨＡの他のサブユニットへの結合点を示す。サブユニットの側鎖は、分岐状であっても直鎖状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。側鎖は複数の末端二重結合を含み得るが、側鎖は、好ましくは、厳密には１個の末端二重結合を含む。
【0031】
[0042]本明細書で使用される場合の「Ｘは、ｎ～ｍの範囲のＹを含む」などの語句は、Ｘが少なくともｎ、最大ｍのＹを含むことを指す。すなわち、この用語は、Ｘがｍを超えるＹを含まないことを示す。例えば、ポリエステル材料が０．５～５．０％の範囲でｍｃｌ ＰＨＡを含むことが記載されている場合、前記ポリエステル材料は５．０％を超えるｍｃｌ ＰＨＡを含まない。
【0032】
[0043]ＰＨＡシンターゼ及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼは、本明細書において交換可能に使用される。
【0033】
[0044]「細胞乾燥重量でＸ％のＹ」という語句は、本開示の細胞から得られる乾燥バイオマスが重量でＸ％のＹを含むことを意味するものとする。
【0034】
[0045]ＰＨＡシンターゼの説明における「型」及び「クラス」という用語は同義であり、例えば、Ｉ型ＰＨＡシンターゼは、クラスＩ ＰＨＡシンターゼと同義である。
【0035】
［ポリ－３－ヒドロキシアルカノエート］
【0036】
[0046]本開示は、ポリエステルコポリマーに関し、特にポリ－３－ヒドロキシアルカノエートに関する。ＰＨＡポリマーは熱可塑性であり、従来の加工装置によって加工することができる。特定の組成に応じて、ＰＨＡポリマーは延性及び弾性であり得るか、又は硬性及び脆性であり得、幅広い用途が可能である。
【0037】
[0047]本開示の一実施形態は、
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、ポリエステルコポリマーを提供する。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、ポリエステルコポリマーを提供する。
【0038】
[0048]ＰＨＡの物理的・機械的特性は、特定のＰＨＡサブユニットに依存し、したがって、前記サブユニットの特定の側鎖に依存する。ｓｃｌ－ＰＨＡは、ｍｃｌ－ＰＨＡ対応物と比較すると、高い結晶化度、高い融解温度、中程度のガラス転移温度を有する傾向がある。またｓｃｌ－ＰＨＡは、ｍｃｌ－ＰＨＡと比較すると、比較的高い引張強度及び高いヤング率を有する傾向もある。最後に、ｍｃｌ－ＰＨＡは、ｓｃｌ－ＰＨＡと比較すると、破断で高い伸長を有する傾向がある。多くの用途において、ＰＨＡがｓｃｌ－ＰＨＡの物理的・機械的特性を有し、しかも官能基化をすることができることが好ましい場合がある。これは、コポリマーに存在するｓｃｌ－ＰＨＡサブユニットを主体として有することによって達成することができる。したがって、本開示の一実施形態は、
ａ．８５．０～９９．０ｍｏｌ％の１つ又は複数の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５ｍｏｌ％の１つ又は複数の中鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマーであって、
前記中鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットが側鎖にアルケン部分を含む、ポリエステルコポリマーを提供する。
ａ．８５．０～９９．０ｍｏｌ％の１つ又は複数の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５ｍｏｌ％の１つ又は複数の中鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマーであって、
前記中鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットが側鎖にアルケン部分を含む、ポリエステルコポリマーを提供する。
【0039】
[0049]本開示の好ましい実施形態では、アルケン部分は末端アルケン部分である。
【0040】
[0050]ＰＨＡは、典型的には、３－ヒドロキシアルカン酸サブユニット又は４－ヒドロキシアルカン酸サブユニットのいずれかをベースとしている。本開示のＰＨＡシンターゼは、好ましくは、３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットを重合する。したがって、本開示の一実施形態では、ポリエステルコポリマーは、飽和短鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットである飽和短鎖長ポリヒドロキシアルカノエートサブユニットを含む。
【0041】
[0051]３－ヒドロキシ酪酸をベースとしたＰＨＡはコンポスト化しやすく、したがって、他の市販の熱可塑性物質と比べて注目されている。３－ヒドロキシ酪酸は、ｓｃｌ－ＰＨＡサブユニットである。したがって、本開示の一実施形態では、飽和短鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットは、３－ヒドロキシブチレートサブユニットである。
【0042】
[0052]本開示の文脈では、末端アルケン部分を含む側鎖がある程度の長さであることが好ましいと考えられる。これによって、末端アルケン部分がＰＨＡ骨格からある程度離され、次に、反応性部分、すなわちアルケン基がＰＨＡの骨格から除かれるので、官能基化がより容易になり得る。約４～６個の炭素原子の長さの側鎖を有するｍｃｌ－ＰＨＡサブユニットは、このことを達成するのに特に好ましいと考えられる。したがって、本開示の一実施形態では、ポリエステルコポリマーは、３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニットを含む。本開示の特定の実施形態では、ポリエステルコポリマーは、
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット
とを含む。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット
とを含む。
【0043】
[0053]本開示の一実施形態では、ポリエステルコポリマーは、３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニットを含む。本開示の特定の実施形態では、ポリエステルコポリマーは、
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニットとを含む。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニットとを含む。
【0044】
[0054]本開示のさらなる実施形態では、ポリエステルコポリマーは、
ａ．６０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～４０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
ａ．６０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～４０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
【0045】
[0055]本開示のよりさらなる実施形態では、ポリエステルコポリマーは、
ａ．７０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～３０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
ａ．７０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～３０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
【0046】
[0056]本開示のいっそうさらなる実施形態では、ポリエステルコポリマーは、
ａ．８０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～２０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
ａ．８０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～２０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
【0047】
[0057]本開示のよりいっそうさらなる実施形態では、ポリエステルコポリマーは、
ａ．９０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～１０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
ａ．９０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～１０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
【0048】
[0058]本開示のＰＨＡは、前記ＰＨＡを他の化合物で官能基化するのに有用であるアルケン部分を含む。これらの化合物は生理活性化合物である可能性があり、ひいては大型になり得るか、又は嵩張り得る。生理活性化合物が他の部分に接近されている場合、又は、例えばそれらの基質が生理活性化合物に適切に到達することができない場合、生理活性物質は活性の低下を示す場合がある。したがって、ＰＨＡは、生理活性化合物の結合に適した部位、すなわち末端アルケンをあまり多く含まないことが好ましく、その理由は、ＰＨＡの官能基化により、活性が最適よりも劣った生理活性物質が生成される可能性があるからである。生理活性化合物の遊離が下記に概説したような酵素を用いる切断によって達成される場合、高度のアルケン部分又は官能基化アルケン部分を有することはまた、酵素の活性も低下させ得る。したがって、本開示の好ましい実施形態では、ポリエステルコポリマーは、
ａ．９５．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
ａ．９５．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む。
【0049】
［ＰＨＡの官能基化］
[0059]ポリマー材料を含む多くの生理活性組成物、いわゆる「生理活性ポリマー」は、生理活性成分をポリマー材料とドーピングする（混合する）ことによって生理活性化される。このことは、ポリマー材料から生理活性成分が遊離する割合を制御することを困難にし得る。代わりに、生理活性成分をポリマー材料に共有結合させると、より安定的な組成物を提供することができ、生理活性成分の遊離割合は、例えば、切断可能なリンカーの切断によって、又はポリマー材料の酵素分解によって、より良好に制御され得る。本開示のＰＨＡのビニル部分は、生理活性成分、例えば、薬物、酵素及びホルモンなどの共有結合に適切に使用することができる。生理活性成分の遊離は、ＰＨＡを切断する解重合酵素、すなわちＰＨＡデポリメラーゼなどのエステラーゼ、又はＰＨＡを分解し、植物組織又は動物組織で確認されている他のエステラーゼによって作用され得る。これにより、遊離は拡散ではなく共有結合の切断に依存するため、生理活性成分の遊離割合をより良好に制御することができる。或いは、生理活性成分がポリマー材料から遊離されないこと、すなわち、ポリマー材料が生理活性成分の支持体として作用することが望まれる。この場合、生理活性成分をポリマーに共有結合させ、不可逆的に結合した生理活性成分を得ることが有利である。このような材料は、生理活性成分をドープしたポリマー材料よりもより安定的であることを証明することができるが、その理由は、生理活性成分がポリマーから漏出する可能性があるからである。本開示のＰＨＡのビニル部分は、生理活性成分の共有結合において適切に使用することができる。
[0059]ポリマー材料を含む多くの生理活性組成物、いわゆる「生理活性ポリマー」は、生理活性成分をポリマー材料とドーピングする（混合する）ことによって生理活性化される。このことは、ポリマー材料から生理活性成分が遊離する割合を制御することを困難にし得る。代わりに、生理活性成分をポリマー材料に共有結合させると、より安定的な組成物を提供することができ、生理活性成分の遊離割合は、例えば、切断可能なリンカーの切断によって、又はポリマー材料の酵素分解によって、より良好に制御され得る。本開示のＰＨＡのビニル部分は、生理活性成分、例えば、薬物、酵素及びホルモンなどの共有結合に適切に使用することができる。生理活性成分の遊離は、ＰＨＡを切断する解重合酵素、すなわちＰＨＡデポリメラーゼなどのエステラーゼ、又はＰＨＡを分解し、植物組織又は動物組織で確認されている他のエステラーゼによって作用され得る。これにより、遊離は拡散ではなく共有結合の切断に依存するため、生理活性成分の遊離割合をより良好に制御することができる。或いは、生理活性成分がポリマー材料から遊離されないこと、すなわち、ポリマー材料が生理活性成分の支持体として作用することが望まれる。この場合、生理活性成分をポリマーに共有結合させ、不可逆的に結合した生理活性成分を得ることが有利である。このような材料は、生理活性成分をドープしたポリマー材料よりもより安定的であることを証明することができるが、その理由は、生理活性成分がポリマーから漏出する可能性があるからである。本開示のＰＨＡのビニル部分は、生理活性成分の共有結合において適切に使用することができる。
【0050】
［ＰＨＡの生産用細胞］
[0060]本開示のＰＨＡは、適切な細胞培養を使用して生産することができる。本発明者らは、本開示のｓｃｌ－ｍｃｌ－ＰＨＡコポリマーの生合成が、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子と、（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子とを含む細胞によって達成され得ることを明らかにした。したがって、本開示の一実施形態は、
ａ．配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子と、
ｂ．配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子
とを含む、細胞であって、
[0061]前記細胞が本開示のポリエステルコポリマーを生産することができる、細胞を提供する。本開示のさらなる実施形態では、細胞はカプリアビダス・ネカトールである。
[0060]本開示のＰＨＡは、適切な細胞培養を使用して生産することができる。本発明者らは、本開示のｓｃｌ－ｍｃｌ－ＰＨＡコポリマーの生合成が、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子と、（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子とを含む細胞によって達成され得ることを明らかにした。したがって、本開示の一実施形態は、
ａ．配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子と、
ｂ．配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子
とを含む、細胞であって、
[0061]前記細胞が本開示のポリエステルコポリマーを生産することができる、細胞を提供する。本開示のさらなる実施形態では、細胞はカプリアビダス・ネカトールである。
【0051】
[0062]本発明者らは、特定のカプリアビダス・ネカトールＨ１６株が本開示の細胞の作製に有用であることを見出した。したがって、本開示の一実施形態では、細胞はカプリアビダス・ネカトールＨ１６株から作製されている。
【0052】
［ｐｈａＣ遺伝子及びＰＨＡシンターゼ］
[0063]ｓｃｌ－ｍｃｌ－ＰＨＡコポリマーの生合成は、クラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子のみを有する細胞株、特にカプリアビダス・ネカトールでは行うことができないと一般に考えられてきた。しかし、本発明者らは、カプリアビダス・ネカトールに固有のｐｈａＣ遺伝子が、ビニル側鎖を有するｓｃｌ－ｍｃｌ－ＰＨＡコポリマーを生産することができるクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードすることを見出した。したがって、本開示の一実施形態では、クラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子は、カプリアビダス・ネカトールに固有のｐｈａＣ遺伝子である。本開示の特定の実施形態では、ｐｈａＣ遺伝子は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードする。
[0063]ｓｃｌ－ｍｃｌ－ＰＨＡコポリマーの生合成は、クラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子のみを有する細胞株、特にカプリアビダス・ネカトールでは行うことができないと一般に考えられてきた。しかし、本発明者らは、カプリアビダス・ネカトールに固有のｐｈａＣ遺伝子が、ビニル側鎖を有するｓｃｌ－ｍｃｌ－ＰＨＡコポリマーを生産することができるクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードすることを見出した。したがって、本開示の一実施形態では、クラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子は、カプリアビダス・ネカトールに固有のｐｈａＣ遺伝子である。本開示の特定の実施形態では、ｐｈａＣ遺伝子は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードする。
【0053】
［ｐｈａＪ遺伝子及び（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ］
[0064]本発明者らは、細胞が広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子を含むことが最も重要であることを見出した。（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼは、（３Ｒ）－ヒドロキシアシル－ＣｏＡから（２Ｅ）－エノイル－ＣｏＡを合成することを触媒するが、これは３－ヒドロキシアルカノエートの生合成における主要な工程である。（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡ水和物が短鎖長基質及び中鎖長基質の両方を受け入れ、その結果、ｓｃｌ－３－ヒドロキシアルカノエート、ｍｃｌ－３－ヒドロキシアルカノエート、及びｍｃｌ－３－ヒドロキシアルケノエートが生成され得ることが最も重要である。したがって、本開示の一実施形態では、（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼは、広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼである。カプリアビダス・ネカトールに固有のｐｈａＪ遺伝子は、ｓｃｌ基質のみを重合することができる（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする。したがって、本開示の一実施形態では、広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子は、その細胞に固有のものではない。ｐｈａＪ遺伝子はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、特にＫＴ２４４０株に存在する遺伝子に相当し得る。したがって、本開示の一実施形態では、広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子は、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株由来のｐｈａＪ遺伝子である。シュードモナス・プチダＫＴ２４４０の（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼのコード配列は、本明細書において配列番号４として提供されている。この遺伝子によってコードされている広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼは、本明細書において配列番号２として提供されている。本開示の一実施形態では、ｐｈａＪ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする。
[0064]本発明者らは、細胞が広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子を含むことが最も重要であることを見出した。（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼは、（３Ｒ）－ヒドロキシアシル－ＣｏＡから（２Ｅ）－エノイル－ＣｏＡを合成することを触媒するが、これは３－ヒドロキシアルカノエートの生合成における主要な工程である。（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡ水和物が短鎖長基質及び中鎖長基質の両方を受け入れ、その結果、ｓｃｌ－３－ヒドロキシアルカノエート、ｍｃｌ－３－ヒドロキシアルカノエート、及びｍｃｌ－３－ヒドロキシアルケノエートが生成され得ることが最も重要である。したがって、本開示の一実施形態では、（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼは、広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼである。カプリアビダス・ネカトールに固有のｐｈａＪ遺伝子は、ｓｃｌ基質のみを重合することができる（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする。したがって、本開示の一実施形態では、広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子は、その細胞に固有のものではない。ｐｈａＪ遺伝子はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、特にＫＴ２４４０株に存在する遺伝子に相当し得る。したがって、本開示の一実施形態では、広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子は、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株由来のｐｈａＪ遺伝子である。シュードモナス・プチダＫＴ２４４０の（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼのコード配列は、本明細書において配列番号４として提供されている。この遺伝子によってコードされている広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼは、本明細書において配列番号２として提供されている。本開示の一実施形態では、ｐｈａＪ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする。
【0054】
［ｆａｄＥ遺伝子］
[0065]ｆａｄＥ遺伝子は、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードしており、これは２，３－飽和アルカン酸のエノイル－ＣｏＡ、すなわち（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼの基質への反応を触媒する。したがって、本開示の細胞にｆａｄＥ遺伝子を組み込んで、（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼの基質を十分に供給することを確実にすることが好ましい場合がある。
[0065]ｆａｄＥ遺伝子は、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードしており、これは２，３－飽和アルカン酸のエノイル－ＣｏＡ、すなわち（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼの基質への反応を触媒する。したがって、本開示の細胞にｆａｄＥ遺伝子を組み込んで、（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼの基質を十分に供給することを確実にすることが好ましい場合がある。
【0055】
[0066]目的によっては、（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼは、ｆａｄＥ遺伝子産物が存在しなくても十分な基質を有している可能性があり、したがって、ｆａｄＥ遺伝子は、本ＰＨＡの生合成に有益であり得るが、常に必須ではない。したがって、本開示の一実施形態では、細胞は、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＥ遺伝子を含む。本開示の特定の実施形態では、ｆａｄＥ遺伝子は、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする。本開示の一実施形態では、ｆａｄＥ遺伝子は、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本開示の好ましい実施形態では、ｆａｄＥ遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株に固有のものである。
【0056】
［炭素源］
[0067]本開示の細胞は、炭素源としてアルケン酸を使用することができる。詳しくは、本開示の細胞は、末端アルケンを有するアルケン酸を使用することができると考えられる。アルケン酸の例は、ヘキサ－５－エン酸、ヘプタ－６－エン酸、オクタ－７－エン酸、ノナ－８－エン酸、デカ－９－エン酸、ウンデカ－１０－エン酸、及び／又はドデカ－１１－エン酸である。本開示の細胞は、炭素源としてウンデカ－１０－エン酸を使用することが明らかにされている。ウンデカ－１０－エン酸は、ｍｃｌ－３－ヒドロキシアルケノエートに変換され、本開示のＰＨＡコポリマーに組み込まれる。ウンデカ－１０－エン酸は安価な試薬である。したがって、本開示の好ましい実施形態では、細胞はウンデカ－１０－エン酸を使用することができる。
[0067]本開示の細胞は、炭素源としてアルケン酸を使用することができる。詳しくは、本開示の細胞は、末端アルケンを有するアルケン酸を使用することができると考えられる。アルケン酸の例は、ヘキサ－５－エン酸、ヘプタ－６－エン酸、オクタ－７－エン酸、ノナ－８－エン酸、デカ－９－エン酸、ウンデカ－１０－エン酸、及び／又はドデカ－１１－エン酸である。本開示の細胞は、炭素源としてウンデカ－１０－エン酸を使用することが明らかにされている。ウンデカ－１０－エン酸は、ｍｃｌ－３－ヒドロキシアルケノエートに変換され、本開示のＰＨＡコポリマーに組み込まれる。ウンデカ－１０－エン酸は安価な試薬である。したがって、本開示の好ましい実施形態では、細胞はウンデカ－１０－エン酸を使用することができる。
【0057】
[0068]本開示の細胞は、唯一の炭素源としてフルクトースを使用することができる。ウンデカ－１０－エン酸は、本開示のＰＨＡコポリマーを生産するのに望ましい。したがって、本開示の一実施形態では、細胞は、炭素源としてウンデカ－１０－エン酸及びフルクトースを使用することができる。
【0058】
［１３－酸化阻害］
[0069]１３－酸化は、増殖及び生産培地のウンデカ－１０－エン酸のｍｃｌ－３－ヒドロキシアルカノエート（Ｃ７及びＣ９）へのトランケーションを媒介する。したがって、ウンデカ－１０－エン酸が所望の基質に変換されるように、いくらかの１３－酸化が起こることが有利であり得る。しかし、１３－酸化はまた、所望の基質である３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエート及び３－ヒドロキシノン－８－エノエートのさらなる変換にも作用を及ぼし、細胞に利用され得るｍｃｌ－３－ヒドロキシアルケノエート基質の量を効果的に減少させうる。本発明者らは、あるレベルの１３－酸化阻害が、ウンデセン酸からの不飽和サブユニットの収率を増加させ、本開示のｓｃｌ－ｍｃｌ－ＰＨＡコポリマーが得られることを見出した。したがって、本開示の一実施形態では、細胞増殖培地は１３－酸化阻害剤を含む。本開示の好ましい実施形態では、１３－酸化阻害剤はアクリル酸である。
[0069]１３－酸化は、増殖及び生産培地のウンデカ－１０－エン酸のｍｃｌ－３－ヒドロキシアルカノエート（Ｃ７及びＣ９）へのトランケーションを媒介する。したがって、ウンデカ－１０－エン酸が所望の基質に変換されるように、いくらかの１３－酸化が起こることが有利であり得る。しかし、１３－酸化はまた、所望の基質である３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエート及び３－ヒドロキシノン－８－エノエートのさらなる変換にも作用を及ぼし、細胞に利用され得るｍｃｌ－３－ヒドロキシアルケノエート基質の量を効果的に減少させうる。本発明者らは、あるレベルの１３－酸化阻害が、ウンデセン酸からの不飽和サブユニットの収率を増加させ、本開示のｓｃｌ－ｍｃｌ－ＰＨＡコポリマーが得られることを見出した。したがって、本開示の一実施形態では、細胞増殖培地は１３－酸化阻害剤を含む。本開示の好ましい実施形態では、１３－酸化阻害剤はアクリル酸である。
【0059】
[0070]１３－酸化は、アルケン酸をＰＨＡに組み込むのに適した形態に変換するのに必要であるだけでなく、前記トランケーションから生成される所望の生成物の分解にも関与するので、特定のレベルの１３－酸化活性が達成されることが重要である。１３－酸化活性のレベルは、アクリル酸などの１３－酸化阻害剤を適切な濃度で添加することによって制御することができる。したがって、本開示の一実施形態では、増殖培地は１０～１００ｍＭのアクリル酸を含む。本開示のさらなる実施形態では、増殖培地は、１０～２０ｍＭのアクリル酸、例えば２０～３０ｍＭ、例えば３０～４０ｍＭ、例えば４０～５０ｍＭ、例えば５０～６０ｍＭ、例えば６０～７０ｍＭ、例えば７０～８０ｍＭ、例えば８０～９０ｍＭ、例えば９０～１００ｍＭのアクリル酸を含む。本開示の好ましい実施形態では、増殖培地は１０～４０ｍＭのアクリル酸を含む。
【0060】
［ＰＨＡコポリマーの蓄積］
[0071]本開示の細胞は、多量のＰＨＡコポリマーを蓄積することができる。本開示の一実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量で少なくとも１５％の本開示のＰＨＡを蓄積することができる。本開示のさらなる実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量で少なくとも２０％のＰＨＡを蓄積することができる。本開示のよりさらなる実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量で少なくとも２５％のＰＨＡコポリマーを蓄積することができる。いっそうのさらなる実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量で少なくとも３０％のＰＨＡコポリマーを蓄積することができる。
[0071]本開示の細胞は、多量のＰＨＡコポリマーを蓄積することができる。本開示の一実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量で少なくとも１５％の本開示のＰＨＡを蓄積することができる。本開示のさらなる実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量で少なくとも２０％のＰＨＡを蓄積することができる。本開示のよりさらなる実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量で少なくとも２５％のＰＨＡコポリマーを蓄積することができる。いっそうのさらなる実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量で少なくとも３０％のＰＨＡコポリマーを蓄積することができる。
【0061】
［ＰＨＡコポリマーを生産する方法］
[0072]本開示の一実施形態は、本開示のポリエステルコポリマーを生産する方法であって、
ａ．本明細書に開示の細胞を用意するステップと、
ｂ．アルケン酸を含む増殖培地中で前記細胞を培養し、それによって前記ポリエステルコポリマーを得るステップ
とを含む、方法を提供する。
[0072]本開示の一実施形態は、本開示のポリエステルコポリマーを生産する方法であって、
ａ．本明細書に開示の細胞を用意するステップと、
ｂ．アルケン酸を含む増殖培地中で前記細胞を培養し、それによって前記ポリエステルコポリマーを得るステップ
とを含む、方法を提供する。
【0062】
[0073]本開示のさらなる実施形態では、増殖培地はフルクトースを含む。本開示の別の実施形態では、増殖培地は１３－酸化阻害剤を含む。さらなる実施形態では、１３－酸化阻害剤はアクリル酸である。
【0063】
[0074]本開示の一実施形態では、細胞は２６．０～３１．０℃で、例えば２７．０～３０．０℃、例えば２７．５～２９．５℃で発酵される。別の実施形態では、細胞は６．６～７．１、例えば６．７～７．０のｐＨで発酵される。一実施形態では、空気飽和は２０％以上、例えば２５％以上、例えば３０％以上で維持される。
【0064】
[0075]本開示の一実施形態では、フルクトース、並びにアルカン酸及びアルケン酸の混合物が細胞に供給される。一実施形態では、フルクトースのアルカン酸及びアルケン酸の混合物に対する比は、９０：１０～１０：９０（ｍｏｌ（フルクトース）：ｍｏｌ（アルカン酸＋アルケン酸））である。好ましい実施形態では、フルクトースのアルカン酸及びアルケン酸の混合物に対する比は、約７０：３０（ｍｏｌ（フルクトース）：ｍｏｌ（アルカン酸＋アルケン酸））である。
【0065】
[0076]本開示の好ましい実施形態では、アルカン酸及びアルケン酸が細胞に供給される。本開示のさらなる実施形態では、アルカン酸及びアルケン酸は、９７：３～５０：５０（ｍｏｌ（アルカン酸）：ｍｏｌ（アルケン酸））の比で細胞に供給される。さらなる実施形態では、アルカン酸のアルケン酸に対する比は、約９０：１０（ｍｏｌ（アルカン酸）：ｍｏｌ（アルケン酸））である。本開示の特定の実施形態では、アルカン酸はデカン酸である。別の実施形態では、アルケン酸はデカ－９－エン酸である。
【0066】
[0077]本開示の一実施形態では、細胞は、「１３－酸化阻害」の項目で概説されている濃度の１３－酸化阻害剤の存在下で発酵される。
【実施例】
【0067】
［実施例１：組換え株の作製及び培養］
[0078]プラスミドｐＭＰＪＡＳ０３は、広宿主域のｐ－ＢＴＢ３（Ｌｙｎｃｈら、２００６年）及びｐＫ１８（Ｐｒｉｄｍｏｒｅ １９８７年）プラスミドを主鎖として使用して構築した。両プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、融合させて、ｐＭＰＪＡＳ０１を形成させた。ｆａｄＥＥｃを保有するプラスミドＧＳ４５６４０－１ ｐＢＳＫ遺伝子１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＣ＿０００９１３）をＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状化し、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化した。プラスミドＧＳ４５６４０－１遺伝子２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＣ＿００２９４７）由来の遺伝子ｐｈａＪＰｐをＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩで遊離させ、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化した。プラスミドｐＭＰＪＡＳ０２は、直鎖状化プラスミドＧＳ４５６４０－１ ｐＢＳＫ遺伝子１とｐｈａＪ１Ｐｐ断片とを融合することによって得られた。ｐＭＰＪＡＳ０２に保有されているｆａｄＥＥｃ－ｐｈａＪ１Ｐｐ断片をＡｃｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで遊離させ、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化し、ｐＭＰＪＡＳ０１に挿入してプラスミドｐＭＰＪＡＳ０３を作製した。このプラスミドをエレクトロポレーションによりＣ．ネカトールＨ１６に導入し、組換えＣ．ネカトールＨ１６／ｐＭＰＪＡＳ０３を作製した。この組換えプラスミドは、カナマイシン耐性特性及びクロラムフェニコール耐性特性、並びにアラビノースプロモーター（ａｒａＣ－ＰＢＡＤ）下のｆａｄＥＥｃ－ｐｈａＪ１Ｐｐ ＤＮＡ断片を保有していた。ｐＭＰＪＡＳ０３プラスミド構築の模式図を図７に示す。図４～図６は、ｐＭＰＪＡＳ０３を構築するために使用される残りのプラスミドの模式図を示す。プラスミド構築は、ゲル電気泳動スクリーニングで補助した。
[0078]プラスミドｐＭＰＪＡＳ０３は、広宿主域のｐ－ＢＴＢ３（Ｌｙｎｃｈら、２００６年）及びｐＫ１８（Ｐｒｉｄｍｏｒｅ １９８７年）プラスミドを主鎖として使用して構築した。両プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、融合させて、ｐＭＰＪＡＳ０１を形成させた。ｆａｄＥＥｃを保有するプラスミドＧＳ４５６４０－１ ｐＢＳＫ遺伝子１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＣ＿０００９１３）をＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状化し、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化した。プラスミドＧＳ４５６４０－１遺伝子２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＣ＿００２９４７）由来の遺伝子ｐｈａＪＰｐをＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩで遊離させ、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化した。プラスミドｐＭＰＪＡＳ０２は、直鎖状化プラスミドＧＳ４５６４０－１ ｐＢＳＫ遺伝子１とｐｈａＪ１Ｐｐ断片とを融合することによって得られた。ｐＭＰＪＡＳ０２に保有されているｆａｄＥＥｃ－ｐｈａＪ１Ｐｐ断片をＡｃｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで遊離させ、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化し、ｐＭＰＪＡＳ０１に挿入してプラスミドｐＭＰＪＡＳ０３を作製した。このプラスミドをエレクトロポレーションによりＣ．ネカトールＨ１６に導入し、組換えＣ．ネカトールＨ１６／ｐＭＰＪＡＳ０３を作製した。この組換えプラスミドは、カナマイシン耐性特性及びクロラムフェニコール耐性特性、並びにアラビノースプロモーター（ａｒａＣ－ＰＢＡＤ）下のｆａｄＥＥｃ－ｐｈａＪ１Ｐｐ ＤＮＡ断片を保有していた。ｐＭＰＪＡＳ０３プラスミド構築の模式図を図７に示す。図４～図６は、ｐＭＰＪＡＳ０３を構築するために使用される残りのプラスミドの模式図を示す。プラスミド構築は、ゲル電気泳動スクリーニングで補助した。
【0068】
[0079]組換えプラスミドｐＭＰＪＡＳ０３は、カナマイシン耐性遺伝子及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を保有し、アラビノースプロモーター（ａｒａＣ－ＰＢＡＤ）（Ａｒａｃｅｌｉら ２０２０年）下で大腸菌株Ｋ１２遺伝子由来のｆａｄＥ及びＰ．プチダ株ＫＴ２４４０遺伝子由来のｐｈａＪ１を共発現するように設計された。
【0069】
[0080]発酵は、５．０Ｌの攪拌槽バイオリアクター（Ｉｎｆｏｒ ＨＴ社、ボットミンゲン、スイス）で実施し、作業容量は３．０Ｌとした。温度は３０．０℃±１．０に設定し、ｐＨはＮＨ４ＯＨ ２８％（ｗ／ｖ）溶液又はＫＯＨ ２Ｍを添加することにより６．８５±０．０５に自動制御した。溶存酸素は、Ｉｎｇｏｌｄポーラログラフィック電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ社、米国）を用いてモニターし、空気飽和の３０％以上に維持した。純酸素を含む空気の添加を制御することにより、通気を２．０Ｌ／分に維持した。攪拌は、７００ｒｐｍの速度で、２つの６枚羽根のＲｕｓｈｔｏｎインペラーによって行った。ＣＯ２は、赤外線ＣＯ２モニター（Ｇｕａｒｄｉａｎ Ｐｌｕｓ，Ｔｏｐａｃ社、ヒンガン、マサチューセッツ州）を用いて出口ガス流で測定した。ＬａｂＶＩＥＷ６．１（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、オースティン、テキサス州）を使用して、ＣＯ２生成（ＣＰＲ ｇ／Ｌ ｈ）を記録し、貯留槽の質量に基づき、蠕動型ポンプを用いてフルクトース及びキャノーラ油／ＤＡの供給を制御した。炭素源は、キャノーラ油／ＤＡ混合物用のものと濃縮フルクトース溶液用の別のものの別々の貯留槽から供給した。
【0070】
[0081]３００ｍｌの接種液を５００ｍＬの３個の振盪用フラスコに分配し、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。２４時間後、接種液を無菌的にバイオリアクターに移した。発酵は３段階で実施した。
【0071】
[0082]第１段階：初期培養をバッチモードで行い、２．０ｇ／Ｌのフルクトースを唯一の炭素源として使用した。
【0072】
[0083]第２段階：指数関数的な細胞増殖。フルクトース及びキャノーラ油（９：１）を比増殖速度０．１４ｈ－１で供給した。ＰＨは、ＮＨ４ＯＨ ２８％（ｗ／ｖ）を添加することによって制御した。
【0073】
[0084]第３段階：ＮＨ４制限によるＰＨＡ合成。一定供給は、総基質（キャノーラ油／ＤＡ）を２．５ｇ／Ｌ ｈに設定した。キャノーラ油／ＤＡを混合する前に、１５％（ｖ／ｖ）の酢酸を添加することによってデカン酸を室温に可溶化した。ａｒａＣ－ＰＢＡＤプロモーターの制御下のプラスミドｐＭＰＪＡＳ０３中のｆａｄＥ遺伝子及びｐｈａＪ１遺伝子を、０．１％（ｖ／ｖ）のアラビノースを添加することにより、この段階開始時に構成的に発現させた。ＮＨ４濃度は、必要に応じて硫酸アンモニウムの水溶液を添加することによって培養物中約０．４ｇ／Ｌに維持した。
【0074】
［実施例２：フルクトース及びデカン酸を同時供給する連続培養］
【0075】
[0085]接種培地は、１リットル当たり、９．０ｇのフルクトース、３．７ｇのＮＨ４ＳＯ４、５．６６ｇのＮａＨ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．７０ｇのＫＨ２ＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１．０の栄養ブロスを含んでいた。連続培養無機培地は、１リットル当たり、１．８ｇのＮＨ４ＳＯ４、５．６６ｇのＮａＨ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．７０ｇのＫＨ２ＰＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏと、２．０ｍｌの微量元素溶液（１０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＨ３ＢＯ３、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２．２ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ２・４Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ及び１．０ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）を含んでいた。アラビノース０．１％、抗生物質、及びアクリル酸を無機培地に補充した。培養は、フルクトース／デカン酸（予め１５％（ｖ／ｖ）の酢酸を用いて室温で可溶化したもの）を同時供給して実施した。
【0076】
[0086]すべての発酵試験は、２８．５℃±１．０で、ｐＨを２Ｍ ＫＯＨ溶液を用いてｐＨ６．８５±０．０５に自動的に制御した、作業容量１．５Ｌの２．０Ｌ撹拌槽バイオリアクター（Ｂｉｏｆｌｏ ＩＩｃ社、ニューブランズウィック）で実施した。溶存酸素は、Ｉｎｇｏｌｄポーラログラフィック電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ社、米国）でモニターし、０．５Ｌ／分の通気及び７００ｒｐｍの攪拌速度を維持することにより、３０％以上の空気飽和に維持した。ＣＯ２は出口ガス流で測定し、赤外線ＣＯ２モニター（Ｇｕａｒｄｉａｎ Ｐｌｕｓ，Ｔｏｐａｃ社、ヒンガン、マサチューセッツ州）を用いて測定した。ＬａｂＶＩＥＷ ６．１（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、オースティン、テキサス州）を使用して、ＣＯ２生成（ＣＰＲｇ／Ｌ ｈ）を記録し、貯留槽の質量に基づき、蠕動型ポンプを用いてフルクトース及び脂肪酸の供給を自動制御した。
【0077】
[0087]１５０ｍｌの接種液を５００ｍＬの振盪フラスコで３０℃及び２００ｒｐｍにて培養した。２４時間後、接種液を無菌的にバイオリアクターに移した。
【0078】
[0088]まず、１０ｇ／Ｌのフルクトース及び４．２ｇ／ＬのＮＨ４ＳＯ４を補充した上記の無機塩培地を使用して、バイオリアクターをバッチモードで操作した。フルクトースが枯渇した後、システムを連続培養に移行し、０．１４ｈ－１の一定の希釈率とした。無機流量を０．２１Ｌ／ｈに設定し、総基質割合を５．７ｇ／Ｌに維持し、フルクトースとデカン酸のモル比をそれぞれ０．６９／０．３１とした。デカン酸には、すべての場合において１０％のウンデシレン酸を補充した。培養物の容量は、定常状態に達するまで１．５Ｌで維持した。ＤＯ及びＣＰＲがプラトーになった時点で定常状態と考えられ、最低５回の作業量に対して維持した。報告したデータは、各定常状態において３時間間隔で採取した少なくとも３つの試料の平均である。
【0079】
［実施例３：ＰＨＡの抽出及び分析］
材料及び方法
バイオマス及び栄養分析
[0089]２０ｍＬの培養試料を２連で採取し、６０００ｘｇで１５分間遠心分離した。得られたバイオマスペレットを２回蒸留水で洗浄し、凍結乾燥して細胞乾燥重量（ＣＤＷ）として測定した総バイオマスを評価した。上清は、栄養消費分析が実施されるまで－２０℃で保存した。フルクトースは、３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により比色定量した。アンモニウムは、フェノール・次亜塩素酸塩アッセイに従って分析した。リン酸塩は、ホスホモリブデートのモリブデンブルーへの還元により測定した。総残留キャノーラ油／ウンデシレン酸デカン酸／ウンデシレン酸濃度は、メタノリシス後、内部標準として安息香酸を使用するガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により決定した。
材料及び方法
バイオマス及び栄養分析
[0089]２０ｍＬの培養試料を２連で採取し、６０００ｘｇで１５分間遠心分離した。得られたバイオマスペレットを２回蒸留水で洗浄し、凍結乾燥して細胞乾燥重量（ＣＤＷ）として測定した総バイオマスを評価した。上清は、栄養消費分析が実施されるまで－２０℃で保存した。フルクトースは、３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により比色定量した。アンモニウムは、フェノール・次亜塩素酸塩アッセイに従って分析した。リン酸塩は、ホスホモリブデートのモリブデンブルーへの還元により測定した。総残留キャノーラ油／ウンデシレン酸デカン酸／ウンデシレン酸濃度は、メタノリシス後、内部標準として安息香酸を使用するガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により決定した。
【0080】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によるＰＨＡ含有量分析
[0090]脂肪酸メチルエステルの評価は、以下の方法に従って実施した：凍結乾燥バイオマス５０ｍｇを、クロロホルム２ｍＬ並びに１４％（ｖ／ｖ）硫酸及び内部標準としての０．２％（ｖ／ｖ）安息香酸を含むメタノール１ｍＬと混合した。反応は、気密性スクリューキャップ付きのホウケイ酸ガラスチューブで行った。試薬と凍結乾燥バイオマスをチューブ内で十分に混合し、１００±２℃の水浴内に４時間置いた。チューブを室温まで冷却し、２ｍＬの蒸留水を加え、得られた有機相を後でＧＣ分析用に静かに収集した。１μＬの試料を、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を搭載したＶａｒｉａｎ ＣＰ３９００ガスクロマトグラフに注入した。インジェクター及び検出器の温度は、それぞれ、２５０℃及び１７０℃であった。ＰＨＡ含有量（重量％）は、総ＰＨＡ濃度のバイオマスに対する割合のパーセンテージとして決定した。次いで、残留バイオマスを細胞濃度（ＣＤＷ）とＰＨＡ含有量の差として推定した。
[0090]脂肪酸メチルエステルの評価は、以下の方法に従って実施した：凍結乾燥バイオマス５０ｍｇを、クロロホルム２ｍＬ並びに１４％（ｖ／ｖ）硫酸及び内部標準としての０．２％（ｖ／ｖ）安息香酸を含むメタノール１ｍＬと混合した。反応は、気密性スクリューキャップ付きのホウケイ酸ガラスチューブで行った。試薬と凍結乾燥バイオマスをチューブ内で十分に混合し、１００±２℃の水浴内に４時間置いた。チューブを室温まで冷却し、２ｍＬの蒸留水を加え、得られた有機相を後でＧＣ分析用に静かに収集した。１μＬの試料を、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を搭載したＶａｒｉａｎ ＣＰ３９００ガスクロマトグラフに注入した。インジェクター及び検出器の温度は、それぞれ、２５０℃及び１７０℃であった。ＰＨＡ含有量（重量％）は、総ＰＨＡ濃度のバイオマスに対する割合のパーセンテージとして決定した。次いで、残留バイオマスを細胞濃度（ＣＤＷ）とＰＨＡ含有量の差として推定した。
【0081】
ＰＨＡの抽出及び精製
[0091]凍結乾燥バイオマスをクロロホルムで浸漬し、室温で一晩、一定の攪拌下でインキュベートした。ＰＨＡを、濾過と１０容量の氷冷メタノールを用いた滴下添加による沈殿の後にクロロホルム溶液から回収した。ＰＨＡをクロロホルムに再懸濁し、メタノールで２回沈殿させた。２回目の沈殿後に、残留溶媒を蒸発させることによって除去した。
[0091]凍結乾燥バイオマスをクロロホルムで浸漬し、室温で一晩、一定の攪拌下でインキュベートした。ＰＨＡを、濾過と１０容量の氷冷メタノールを用いた滴下添加による沈殿の後にクロロホルム溶液から回収した。ＰＨＡをクロロホルムに再懸濁し、メタノールで２回沈殿させた。２回目の沈殿後に、残留溶媒を蒸発させることによって除去した。
【0082】
ＮＭＲによるＰＨＡ組成
[0092]ＰＨＡの化学構造を１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲ分析により調べた。約２０ｍｇのＰＨＡを１ｍＬの重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）に溶解し、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ４００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ社、ビラリカ、マサチューセッツ州）を使用し、さらなるＮＭＲスペクトルを記録した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを、室温にてそれぞれ４００ＭＨｚ及び１００ＭＨｚで得た。共鳴信号などの化学シフトは、ＣＤＣｌ３（内部標準）の１Ｈ ＮＭＲ：７．２６ｐｐｍ及び１３Ｃ ＮＭＲ：７７．４２の顕著な信号と比較してｐｐｍで示した。
[0092]ＰＨＡの化学構造を１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲ分析により調べた。約２０ｍｇのＰＨＡを１ｍＬの重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）に溶解し、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ４００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ社、ビラリカ、マサチューセッツ州）を使用し、さらなるＮＭＲスペクトルを記録した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを、室温にてそれぞれ４００ＭＨｚ及び１００ＭＨｚで得た。共鳴信号などの化学シフトは、ＣＤＣｌ３（内部標準）の１Ｈ ＮＭＲ：７．２６ｐｐｍ及び１３Ｃ ＮＭＲ：７７．４２の顕著な信号と比較してｐｐｍで示した。
【0083】
結果
[0093]Ｃ．ネカトールＨ１６／ｐＭＰＪＡＳ０３のフェドバッチ発酵により、４９重量％のＰＨＡを含む５９．７ｇ／Ｌの乾燥バイオマスが生成された。第３段階（ＰＨＡ蓄積段階）において、９０重量％のキャノーラ油及び１０重量％のウンデシレン酸を供給したところ、ＮＭＲによって明らかなように（図１）、３ＨＢ（９４．７３ｍｏｌ％）－ｃｏ－３ＨＨｘ（１．５１ｍｏｌ％）－ｃｏ－３ＨＨＯ（２．３３ｍｏｌ％）－ｃｏ－３ＨＤ（０．６９ｍｏｌ％）－ｃｏ－３ＨＨｐ（＝）（０．７３ｍｏｌ％）の最終ポリマー組成が得られた。これらの結果は、Ｃ．ネカトールでｐｈａＪを発現させると、固有のシンターゼがＣ１０程度の大きさの基質を重合し、Ｃ７程度の大きさのサブユニットにビニル基を組み込むことができることを示している。また結果からは、Ｃ１１基質のウンデシレン酸が、ポリマーに組み込まれる前に１３－酸化により４炭素でトランケートされることが明らかであった。０．７３ｍｏｌ％のこのサブユニットにビニル基を持つＰＨＡは、生理活性ＰＨＡを必要とする多くの用途に適していることが評価される。
[0093]Ｃ．ネカトールＨ１６／ｐＭＰＪＡＳ０３のフェドバッチ発酵により、４９重量％のＰＨＡを含む５９．７ｇ／Ｌの乾燥バイオマスが生成された。第３段階（ＰＨＡ蓄積段階）において、９０重量％のキャノーラ油及び１０重量％のウンデシレン酸を供給したところ、ＮＭＲによって明らかなように（図１）、３ＨＢ（９４．７３ｍｏｌ％）－ｃｏ－３ＨＨｘ（１．５１ｍｏｌ％）－ｃｏ－３ＨＨＯ（２．３３ｍｏｌ％）－ｃｏ－３ＨＤ（０．６９ｍｏｌ％）－ｃｏ－３ＨＨｐ（＝）（０．７３ｍｏｌ％）の最終ポリマー組成が得られた。これらの結果は、Ｃ．ネカトールでｐｈａＪを発現させると、固有のシンターゼがＣ１０程度の大きさの基質を重合し、Ｃ７程度の大きさのサブユニットにビニル基を組み込むことができることを示している。また結果からは、Ｃ１１基質のウンデシレン酸が、ポリマーに組み込まれる前に１３－酸化により４炭素でトランケートされることが明らかであった。０．７３ｍｏｌ％のこのサブユニットにビニル基を持つＰＨＡは、生理活性ＰＨＡを必要とする多くの用途に適していることが評価される。
【0084】
［実施例４：ＰＨＡの生産における１３－酸化の阻害 － ケモスタット］
[0094]アクリル酸などの１３－酸化防止剤の添加により、ビニルサブユニットの含有量が増加した。供給物中のアクリル酸を増やすとバイオマス生産は抑制されたが、ＰＨＡの蓄積は、試験した最高レベルの３０ｍＭ以上になるまで影響を受けなかった（図２）。アクリル酸を添加することにより、ｍｃｌ－ＰＨＡサブユニット含有量は、何も供給されなかった場合の約３ｍｏｌ％から、４０ｍＭのアクリル酸供給時の１０ｍｏｌ％を超えるまで増加し、ビニルサブユニット含有量は、０ｍｏｌ％から１．７ｍｏｌ％に増加した（表１）。より高いアクリル酸濃度では、いくらかの３－ヒドロキシノネノエートが蓄積された。約１７ｍｏｌ％のウンデシレン酸は不飽和サブユニットに変換された。ウンデシレン酸の他の炭素源に対する割合が増加すると、ビニルサブユニット含有量がさらに増加されるようである。ペンテン酸とは異なり、ウンデシレン酸（ヒマシ油由来）は安価であり、大量に入手することができる。この研究は、実用的で経済的な、ビニルサブユニットを有するｓｃｌ－ｍｃｌ ＰＨＡを生産する方法を明らかにしている。
[0094]アクリル酸などの１３－酸化防止剤の添加により、ビニルサブユニットの含有量が増加した。供給物中のアクリル酸を増やすとバイオマス生産は抑制されたが、ＰＨＡの蓄積は、試験した最高レベルの３０ｍＭ以上になるまで影響を受けなかった（図２）。アクリル酸を添加することにより、ｍｃｌ－ＰＨＡサブユニット含有量は、何も供給されなかった場合の約３ｍｏｌ％から、４０ｍＭのアクリル酸供給時の１０ｍｏｌ％を超えるまで増加し、ビニルサブユニット含有量は、０ｍｏｌ％から１．７ｍｏｌ％に増加した（表１）。より高いアクリル酸濃度では、いくらかの３－ヒドロキシノネノエートが蓄積された。約１７ｍｏｌ％のウンデシレン酸は不飽和サブユニットに変換された。ウンデシレン酸の他の炭素源に対する割合が増加すると、ビニルサブユニット含有量がさらに増加されるようである。ペンテン酸とは異なり、ウンデシレン酸（ヒマシ油由来）は安価であり、大量に入手することができる。この研究は、実用的で経済的な、ビニルサブユニットを有するｓｃｌ－ｍｃｌ ＰＨＡを生産する方法を明らかにしている。
【0085】
[0095]表１：供給物中のアクリル酸濃度の関数としてのＰＨＡコポリマー組成。ＰＨＡ含有量及び組成を３連で測定した。平均値及び標準偏差を示す。ａ：３ＨＢ：３－ヒドロキシブチレート；３ＨＶ：３－ヒドロキシバレレート；３ＨＨｘ：３－ヒドロキシヘキサノエート；３ＨＯ：３－ヒドロキシオクタノエート；３ＨＤ：３－ヒドロキシデカノエート；３ＨＨｐ（＝）：３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエート；３ＨＮｏ（＝）：３－ヒドロキシノン－８－エノエート
【表1】
【0086】
［項目］
本発明は、以下の項目によって部分的に定義される。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、ポリエステルコポリマー。
ａ．８５．０～９９．５ｍｏｌ％の１つ又は複数の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５ｍｏｌ％の１つ又は複数の中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマーであって、
前記中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニットが前記側鎖に末端アルケン部分を含む、ポリエステルコポリマー。
前記アルケン部分が末端アルケン部分である、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
前記飽和短鎖長ポリヒドロキシアルカノエートサブユニットが飽和短鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットである、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
前記飽和短鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットが３－ヒドロキシブチレートサブユニットである、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．６０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～４０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．７０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～３０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．８０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～２０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．９０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～１０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．９５．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマーを生産する方法であって、
ａ．ｉ．配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子と、
ｉｉ．配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子
とを含む細胞を用意するステップと、
ｂ．アルケン酸を含む増殖培地中で前記細胞を培養し、それによって前記ポリエステルコポリマーを得るステップ
とを含む、方法。
１４．前記クラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性、例えば、配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１５．前記（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、配列番号２と少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性、例えば、配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１６．前記ｐｈａＣ遺伝子が前記細胞に固有のものである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１７．前記（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１８．広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、前記細胞に固有のものではない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１９．広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株由来のｐｈａＪ遺伝子である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２０．前記細胞がカプリアビダス・ネカトールである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２１．前記細胞がカプリアビダス・ネカトールＨ１６株である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２２．前記細胞が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＥ遺伝子をさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２３．アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする前記ｆａｄＥ遺伝子が、大腸菌Ｋ１２株由来のｆａｄＥ遺伝子である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２４．前記細胞が、炭素源としてウンデカ－１０－エン酸を使用することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２５．前記細胞が、唯一の炭素源としてウンデカ－１０－エン酸及びフルクトースを使用することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２６．前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも１５％の前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー、例えば少なくとも２０％の前記ポリエステルを蓄積することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２７．前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも３０％の前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマーを蓄積することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２８．前記増殖培地が１３－酸化阻害剤を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２９．前記１３－酸化防止剤がアクリル酸である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３０．前記アルケン酸がウンデカ－１０－エン酸である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３１．前記ｐｈａＣ遺伝子が前記細胞に固有のものである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３２．前記（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３３．広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、前記細胞に固有のものではない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３４．広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、前記シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株由来のｐｈａＪ遺伝子である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３５．前記細胞がカプリアビダス・ネカトールである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３６．前記細胞がカプリアビダス・ネカトールＨ１６株である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３７．前記細胞が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＥ遺伝子をさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３８．前記アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、配列番号３と少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性、例えば、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３９．アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする前記ｆａｄＥ遺伝子が、前記大腸菌Ｋ１２株由来のｆａｄＥ遺伝子である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
４０．前記細胞が、炭素源としてウンデカ－１０－エン酸を使用することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
４１．前記細胞が、唯一の炭素源としてウンデカ－１０－エン酸及びフルクトースを使用することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
４２．前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも１５％の前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー、例えば少なくとも２０％のポリエステルを蓄積することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
４３．前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも３０％の前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマーを蓄積することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
本発明は、以下の項目によって部分的に定義される。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、ポリエステルコポリマー。
ａ．８５．０～９９．５ｍｏｌ％の１つ又は複数の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５ｍｏｌ％の１つ又は複数の中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニット
とを含むポリエステルコポリマーであって、
前記中鎖長３－ヒドロキシアルケノエートサブユニットが前記側鎖に末端アルケン部分を含む、ポリエステルコポリマー。
前記アルケン部分が末端アルケン部分である、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
前記飽和短鎖長ポリヒドロキシアルカノエートサブユニットが飽和短鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットである、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
前記飽和短鎖長３－ヒドロキシアルカノエートサブユニットが３－ヒドロキシブチレートサブユニットである、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．６０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～４０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．７０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～３０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．８０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～２０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．９０．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～１０．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
ａ．９５．０～９９．５ｍｏｌ％の飽和短鎖長ヒドロキシアルカノエートサブユニットと、
ｂ．０．５～５．０ｍｏｌ％の３－ヒドロキシヘプタ－６－エノエートサブユニット及び／又は３－ヒドロキシノン－８－エノエートサブユニット
とを含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー。
前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマーを生産する方法であって、
ａ．ｉ．配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するクラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするｐｈａＣ遺伝子と、
ｉｉ．配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子
とを含む細胞を用意するステップと、
ｂ．アルケン酸を含む増殖培地中で前記細胞を培養し、それによって前記ポリエステルコポリマーを得るステップ
とを含む、方法。
１４．前記クラスＩポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性、例えば、配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１５．前記（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、配列番号２と少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性、例えば、配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１６．前記ｐｈａＣ遺伝子が前記細胞に固有のものである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１７．前記（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１８．広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、前記細胞に固有のものではない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
１９．広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株由来のｐｈａＪ遺伝子である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２０．前記細胞がカプリアビダス・ネカトールである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２１．前記細胞がカプリアビダス・ネカトールＨ１６株である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２２．前記細胞が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＥ遺伝子をさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２３．アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする前記ｆａｄＥ遺伝子が、大腸菌Ｋ１２株由来のｆａｄＥ遺伝子である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２４．前記細胞が、炭素源としてウンデカ－１０－エン酸を使用することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２５．前記細胞が、唯一の炭素源としてウンデカ－１０－エン酸及びフルクトースを使用することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２６．前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも１５％の前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー、例えば少なくとも２０％の前記ポリエステルを蓄積することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２７．前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも３０％の前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマーを蓄積することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２８．前記増殖培地が１３－酸化阻害剤を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
２９．前記１３－酸化防止剤がアクリル酸である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３０．前記アルケン酸がウンデカ－１０－エン酸である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３１．前記ｐｈａＣ遺伝子が前記細胞に固有のものである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３２．前記（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３３．広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、前記細胞に固有のものではない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３４．広特異性（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする前記ｐｈａＪ遺伝子が、前記シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株由来のｐｈａＪ遺伝子である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３５．前記細胞がカプリアビダス・ネカトールである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３６．前記細胞がカプリアビダス・ネカトールＨ１６株である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３７．前記細胞が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＥ遺伝子をさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３８．前記アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、配列番号３と少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性、例えば、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
３９．アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする前記ｆａｄＥ遺伝子が、前記大腸菌Ｋ１２株由来のｆａｄＥ遺伝子である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
４０．前記細胞が、炭素源としてウンデカ－１０－エン酸を使用することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
４１．前記細胞が、唯一の炭素源としてウンデカ－１０－エン酸及びフルクトースを使用することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
４２．前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも１５％の前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマー、例えば少なくとも２０％のポリエステルを蓄積することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
４３．前記細胞が、細胞乾燥重量で少なくとも３０％の前記項目のいずれか一項に記載のポリエステルコポリマーを蓄積することができる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
【0087】
［配列］
配列番号１
[0096]ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ（ＰＨＡシンターゼ）：
MATGKGAAASTQEGKSQPFKVTPGPFDPATWLEWSRQWQGTEGNGHAAASGIPGLDALAGVKIAPAQLGDIQQRYMKDFSALWQAMAEGKAEATGPLHDRRFAGDAWRTNLPYRFAAAFYLLNARALTELADAVEADAKTRQRIRFAISQWVDAMSPANFLATNPEAQRLLIESGGESLRAGVRNMMEDLTRGKISQTDESAFEVGRNVAVTEGAVVFENEYFQLLQYKPLTDKVHARPLLMVPPCINKYYILDLQPESSLVRHVVEQGHTVFLVSWRNPDASMAGSTWDDYIEHAAIRAIEVARDISGQDKINVLGFCVGGTIVSTALAVLAARGEHPAASVTLLTTLLDFADTGILDVFVDEGHVQLREATLGGGAGAPCALLRGLELANTFSFLRPNDLVWNYVVDNYLKGNTPVPFDLLFWNGDATNLPGPWYCWYLRHTYLQNELKVPGKLTVCGVPVDLASIDVPTYIYGSREDHIVPWTAAYASTALLANKLRFVLGASGHIAGVINPPAKNKRSHWTNDALPESPQQWLAGAIEHHGSWWPDWTAWLAGQAGAKRAAPANYGNARYRAIEPAPGRYVKAKA
配列番号２
[0097]（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ：
MSQVTNTPYEALEVGQKAEYKKSVEERDIQLFAAMSGDHNPVHLDAEFAAKSMFRERIAHGMFSGALISAAVACTLPGPGTIYLGQQMSFQKPVKIGDTLTVRLEILEKLPKFKVRIATNVYNQNDELVVAGEAEILAPRKQQTVELVSPPNFVAS
配列番号３
[0098]アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ：
MMILSILATVVLLGALFYHRVSLFISSLILLAWTAALGVAGLWSAWVLVPLAIILVPFNFAPMRKSMISAPVFRGFRKVMPPMSRTEKEAIDAGTTWWEGDLFQGKPDWKKLHNYPQPRLTAEEQAFLDGPVEEACRMANDFQITHELADLPPELWAYLKEHRFFAMIIKKEYGGLEFSAYAQSRVLQKLSGVSGILAITVGVPNSLGPGELLQHYGTDEQKDHYLPRLARGQEIPCFALTSPEAGSDAGAIPDTGIVCMGEWQGQQVLGMRLTWNKRYITLAPIATVLGLAFKLSDPEKLLGGAEDLGITCALIPTTTPGVEIGRRHFPLNVPFQNGPTRGKDVFVPIDYIIGGPKMAGQGWRMLVECLSVGRGITLPSNSTGGVKSVALATGAYAHIRRQFKISIGKMEGIEEPLARIAGNAYVMDAAASLITYGIMLGEKPAVLSAIVKYHCTHRGQQSIIDAMDITGGKGIMLGQSNFLARAYQGAPIAITVEGANILTRSMMIFGQGAIRCHPYVLEEMEAAKNNDVNAFDKLLFKHIGHVGSNKVRSFWLGLTRGLTSSTPTGDATKRYYQHLNRLSANLALLSDVSMAVLGGSLKRRERISARLGDILSQLYLASAVLKRYDDEGRNEADLPLVHWGVQDALYQAEQAMDDLLQNFPNRVVAGLLNVVIFPTGRHYLAPSDKLDHKVAKILQVPNATRSRIGRGQYLTPSEHNPVGLLEEALVDVIAADPIHQRICKELGKNLPFTRLDELAHNALVKGLIDKDEAAILVKAEESRLRSINVDDFDPEELATKPVKLPEKVRKVEAA
配列番号４
[0099]Ｐ．プチダＫＴ２４４０由来のＰｈａＪ遺伝子のコード配列：
ATGAGCCAGGTGACCAACACCCCGTACGAGGCCCTGGAGGTGGGCCAGAAGGCCGAGTACAAGAAGAGCGTGGAGGAGCGCGACATCCAGCTGTTCGCCGCCATGAGCGGCGACCACAACCCGGTGCACCTGGACGCCGAGTTCGCCGCCAAGAGCATGTTCGCGAGCGCATCGCCCACGGCATGTTCAGCGGCGCCCTGATCAGCGCCGCCGTGGCCTGCACCCTGCCGGGCCCGGGCACCATCTACCTGGGCCAGCAGATGAGCTTCCAGAAGCCGGTGAAGATCGGCGACACCCTGACCGTGCGCCTGGAGATCCTGGAGAAGCTGCCGAAGTTCAAGGTGCGCATCGCCACCAACGTGTACAACCAGAACGACGAGCTGGTGGTGGCCGGCGAGGCCGAGATCCTGGCCCCGCGCAAGCAGCAGACCGTGGAGCTGGTGAGCCCGCCGAACTTCGTGGCCAGCTGA
配列番号５
[0100]大腸菌Ｋ１２由来のＦａｄＥ遺伝子のコード配列：
ATGATGATCCTGAGCATCCTGGCCACCGTGGTGCTGCTGGGCGCCCTGTTCTACCACCGCGTGAGCCTGTTCATCAGCAGCCTGATCCTGCTGGCCTGGACCGCCGCCCTGGGCGTGGCCGGCCTGTGGAGCGCCTGGGTGCTGGTGCCGCTGGCCATCATCCTGGTGCCGTTCAACTTCGCCCCGATGCGCAAGAGCATGATCAGCGCCCCGGTGTTCCGCGGCTTCCGCAAGGTGATGCCGCCGATGAGCCGCACCGAGAAGGAGGCCATCGACGCCGGCACCACCTGGTGGGAGGGCGACCTGTTCCAGGGCAAGCCGGACTGGAAGAAGCTGCACAACTACCCGCAGCCGCGCCTGACCGCCGAGGAGCAGGCCTTCCTGGACGGCCCGGTGGAGGAGGCCTGCCGCATGGCCAACGACTTCCAGATCACCCACGAGCTGGCCGACCTGCCGCCGGAGCTGTGGGCCTACCTGAAGGAGCACCGCTTCTTCGCCATGATCATCAAGAAGGAGTACGGCGGCCTGGAGTTCAGCGCCTACGCCCAGAGCCGCGTGCTGCAGAAGCTGAGCGGCGTGAGCGGCATCCTGGCCATCACCGTGGGCGTGCCGAACAGCCTGGGCCCGGGCGAGCTGCTGCAGCACTACGGCACCGACGAGCAGAAGGACCACTACCTGCCGCGCCTGGCCCGCGGCCAGGAGATCCCGTGCTTCGCCCTGACCAGCCCGGAGGCCGGCAGCGACGCCGGCGCCATCCCGGACACCGGCATCGTGTGCATGGGCGAGTGGCAGGGCCAGCAGGTGCTGGGCATGCGCCTGACCTGGAACAAGCGCTACATCACCCTGGCCCCGATCGCCACCGTGCTGGGCCTGGCCTTCAAGCTGAGCGACCCGGAGAAGCTGCTGGGCGGCGCCGAGGACCTGGGCATCACCTGCGCCCTGATCCCGACCACCACCCCGGGCGTGGAGATCGGCCGCCGCCACTTCCCGCTGAACGTGCCGTTCCAGAACGGCCCGACCCGCGGCAAGGACGTGTTCGTGCCGATCGACTACATCATCGGCGGCCCGAAGATGGCCGGCCAGGGCTGGCGCATGCTGGTGGAGTGCCTGAGCGTGGGCCGCGGCATCACCCTGCCGAGCAACAGCACCGGCGGCGTGAAGAGCGTGGCCCTGGCCACCGGCGCCTACGCCCACATCCGCCGCCAGTTCAAGATCAGCATCGGCAAGATGGAGGGCATCGAGGAGCCGCTGGCCCGCATCGCCGGCAACGCCTACGTGATGGACGCCGCCGCCAGCCTGATCACCTACGGCATCATGCTGGGCGAGAAGCCGGCCGTGCTGAGCGCCATCGTGAAGTACCACTGCACCCACCGCGGCCAGCAGAGCATCATCGACGCCATGGACATCACCGGCGGCAAGGGCATCATGCTGGGCCAGAGCAACTTCCTGGCCCGCGCCTACCAGGGCGCCCCGATCGCCATCACCGTGGAGGGCGCCAACATCCTGACCCGCAGCATGATGATCTTCGGCCAGGGCGCCATCCGCTGCCACCCGTACGTGCTGGAGGAGATGGAGGCCGCCAAGAACAACGACGTGAACGCCTTCGACAAGCTGCTGTTCAAGCACATCGGCCACGTGGGCAGCAACAAGGTGCGCAGCTTCTGGCTGGGCCTGACCCGCGGCCTGACCAGCAGCACCCCGACCGGCGACGCCACCAAGCGCTACTACCAGCACCTGAACCGCCTGAGCGCCAACCTGGCCCTGCTGAGCGACGTGAGCATGGCCGTGCTGGGCGGCAGCCTGAAGCGCCGCGAGCGCATCAGCGCCCGCCTGGGCGACATCCTGAGCCAGCTGTACCTGGCCAGCGCCGTGCTGAAGCGCTACGACGACGAGGGCCGCAACGAGGCCGACCTGCCGCTGGTGCACTGGGGCGTGCAGGACGCCCTGTACCAGGCCGAGCAGGCCATGGACGACCTGCTGCAGAACTTCCCGAACCGCGTGGTGGCCGGCCTGCTGAACGTGGTGATCTTCCCGACCGGCCGCCACTACCTGGCCCCGAGCGACAAGCTGGACCACAAGGTGGCCAAGATCCTGCAGGTGCCGAACGCCACCCGCAGCCGCATCGGCCGCGGCCAGTACCTGACCCCGAGCGAGCACAACCCGGTGGGCCTGCTGGAGGAGGCCCTGGTGGACGTGATCGCCGCCGACCCGATCCACCAGCGCATCTGCAAGGAGCTGGGCAAGAACCTGCCGTTCACCCGCCTGGACGAGCTGGCCCACAACGCCCTGGTGAAGGGCCTGATCGACAAGGACGAGGCCGCCATCCTGGTGAAGGCCGAGGAGAGCCGCCTGCGCAGCATCAACGTGGACGACTTCGACCCGGAGGAGCTGGCCACCAAGCCGGTGAAGCTGCCGGAGAAGGTGCGCAAGGTGGAGGCCGCCTAA
配列番号１
[0096]ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ（ＰＨＡシンターゼ）：
MATGKGAAASTQEGKSQPFKVTPGPFDPATWLEWSRQWQGTEGNGHAAASGIPGLDALAGVKIAPAQLGDIQQRYMKDFSALWQAMAEGKAEATGPLHDRRFAGDAWRTNLPYRFAAAFYLLNARALTELADAVEADAKTRQRIRFAISQWVDAMSPANFLATNPEAQRLLIESGGESLRAGVRNMMEDLTRGKISQTDESAFEVGRNVAVTEGAVVFENEYFQLLQYKPLTDKVHARPLLMVPPCINKYYILDLQPESSLVRHVVEQGHTVFLVSWRNPDASMAGSTWDDYIEHAAIRAIEVARDISGQDKINVLGFCVGGTIVSTALAVLAARGEHPAASVTLLTTLLDFADTGILDVFVDEGHVQLREATLGGGAGAPCALLRGLELANTFSFLRPNDLVWNYVVDNYLKGNTPVPFDLLFWNGDATNLPGPWYCWYLRHTYLQNELKVPGKLTVCGVPVDLASIDVPTYIYGSREDHIVPWTAAYASTALLANKLRFVLGASGHIAGVINPPAKNKRSHWTNDALPESPQQWLAGAIEHHGSWWPDWTAWLAGQAGAKRAAPANYGNARYRAIEPAPGRYVKAKA
配列番号２
[0097]（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ：
MSQVTNTPYEALEVGQKAEYKKSVEERDIQLFAAMSGDHNPVHLDAEFAAKSMFRERIAHGMFSGALISAAVACTLPGPGTIYLGQQMSFQKPVKIGDTLTVRLEILEKLPKFKVRIATNVYNQNDELVVAGEAEILAPRKQQTVELVSPPNFVAS
配列番号３
[0098]アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ：
MMILSILATVVLLGALFYHRVSLFISSLILLAWTAALGVAGLWSAWVLVPLAIILVPFNFAPMRKSMISAPVFRGFRKVMPPMSRTEKEAIDAGTTWWEGDLFQGKPDWKKLHNYPQPRLTAEEQAFLDGPVEEACRMANDFQITHELADLPPELWAYLKEHRFFAMIIKKEYGGLEFSAYAQSRVLQKLSGVSGILAITVGVPNSLGPGELLQHYGTDEQKDHYLPRLARGQEIPCFALTSPEAGSDAGAIPDTGIVCMGEWQGQQVLGMRLTWNKRYITLAPIATVLGLAFKLSDPEKLLGGAEDLGITCALIPTTTPGVEIGRRHFPLNVPFQNGPTRGKDVFVPIDYIIGGPKMAGQGWRMLVECLSVGRGITLPSNSTGGVKSVALATGAYAHIRRQFKISIGKMEGIEEPLARIAGNAYVMDAAASLITYGIMLGEKPAVLSAIVKYHCTHRGQQSIIDAMDITGGKGIMLGQSNFLARAYQGAPIAITVEGANILTRSMMIFGQGAIRCHPYVLEEMEAAKNNDVNAFDKLLFKHIGHVGSNKVRSFWLGLTRGLTSSTPTGDATKRYYQHLNRLSANLALLSDVSMAVLGGSLKRRERISARLGDILSQLYLASAVLKRYDDEGRNEADLPLVHWGVQDALYQAEQAMDDLLQNFPNRVVAGLLNVVIFPTGRHYLAPSDKLDHKVAKILQVPNATRSRIGRGQYLTPSEHNPVGLLEEALVDVIAADPIHQRICKELGKNLPFTRLDELAHNALVKGLIDKDEAAILVKAEESRLRSINVDDFDPEELATKPVKLPEKVRKVEAA
配列番号４
[0099]Ｐ．プチダＫＴ２４４０由来のＰｈａＪ遺伝子のコード配列：
ATGAGCCAGGTGACCAACACCCCGTACGAGGCCCTGGAGGTGGGCCAGAAGGCCGAGTACAAGAAGAGCGTGGAGGAGCGCGACATCCAGCTGTTCGCCGCCATGAGCGGCGACCACAACCCGGTGCACCTGGACGCCGAGTTCGCCGCCAAGAGCATGTTCGCGAGCGCATCGCCCACGGCATGTTCAGCGGCGCCCTGATCAGCGCCGCCGTGGCCTGCACCCTGCCGGGCCCGGGCACCATCTACCTGGGCCAGCAGATGAGCTTCCAGAAGCCGGTGAAGATCGGCGACACCCTGACCGTGCGCCTGGAGATCCTGGAGAAGCTGCCGAAGTTCAAGGTGCGCATCGCCACCAACGTGTACAACCAGAACGACGAGCTGGTGGTGGCCGGCGAGGCCGAGATCCTGGCCCCGCGCAAGCAGCAGACCGTGGAGCTGGTGAGCCCGCCGAACTTCGTGGCCAGCTGA
配列番号５
[0100]大腸菌Ｋ１２由来のＦａｄＥ遺伝子のコード配列：
ATGATGATCCTGAGCATCCTGGCCACCGTGGTGCTGCTGGGCGCCCTGTTCTACCACCGCGTGAGCCTGTTCATCAGCAGCCTGATCCTGCTGGCCTGGACCGCCGCCCTGGGCGTGGCCGGCCTGTGGAGCGCCTGGGTGCTGGTGCCGCTGGCCATCATCCTGGTGCCGTTCAACTTCGCCCCGATGCGCAAGAGCATGATCAGCGCCCCGGTGTTCCGCGGCTTCCGCAAGGTGATGCCGCCGATGAGCCGCACCGAGAAGGAGGCCATCGACGCCGGCACCACCTGGTGGGAGGGCGACCTGTTCCAGGGCAAGCCGGACTGGAAGAAGCTGCACAACTACCCGCAGCCGCGCCTGACCGCCGAGGAGCAGGCCTTCCTGGACGGCCCGGTGGAGGAGGCCTGCCGCATGGCCAACGACTTCCAGATCACCCACGAGCTGGCCGACCTGCCGCCGGAGCTGTGGGCCTACCTGAAGGAGCACCGCTTCTTCGCCATGATCATCAAGAAGGAGTACGGCGGCCTGGAGTTCAGCGCCTACGCCCAGAGCCGCGTGCTGCAGAAGCTGAGCGGCGTGAGCGGCATCCTGGCCATCACCGTGGGCGTGCCGAACAGCCTGGGCCCGGGCGAGCTGCTGCAGCACTACGGCACCGACGAGCAGAAGGACCACTACCTGCCGCGCCTGGCCCGCGGCCAGGAGATCCCGTGCTTCGCCCTGACCAGCCCGGAGGCCGGCAGCGACGCCGGCGCCATCCCGGACACCGGCATCGTGTGCATGGGCGAGTGGCAGGGCCAGCAGGTGCTGGGCATGCGCCTGACCTGGAACAAGCGCTACATCACCCTGGCCCCGATCGCCACCGTGCTGGGCCTGGCCTTCAAGCTGAGCGACCCGGAGAAGCTGCTGGGCGGCGCCGAGGACCTGGGCATCACCTGCGCCCTGATCCCGACCACCACCCCGGGCGTGGAGATCGGCCGCCGCCACTTCCCGCTGAACGTGCCGTTCCAGAACGGCCCGACCCGCGGCAAGGACGTGTTCGTGCCGATCGACTACATCATCGGCGGCCCGAAGATGGCCGGCCAGGGCTGGCGCATGCTGGTGGAGTGCCTGAGCGTGGGCCGCGGCATCACCCTGCCGAGCAACAGCACCGGCGGCGTGAAGAGCGTGGCCCTGGCCACCGGCGCCTACGCCCACATCCGCCGCCAGTTCAAGATCAGCATCGGCAAGATGGAGGGCATCGAGGAGCCGCTGGCCCGCATCGCCGGCAACGCCTACGTGATGGACGCCGCCGCCAGCCTGATCACCTACGGCATCATGCTGGGCGAGAAGCCGGCCGTGCTGAGCGCCATCGTGAAGTACCACTGCACCCACCGCGGCCAGCAGAGCATCATCGACGCCATGGACATCACCGGCGGCAAGGGCATCATGCTGGGCCAGAGCAACTTCCTGGCCCGCGCCTACCAGGGCGCCCCGATCGCCATCACCGTGGAGGGCGCCAACATCCTGACCCGCAGCATGATGATCTTCGGCCAGGGCGCCATCCGCTGCCACCCGTACGTGCTGGAGGAGATGGAGGCCGCCAAGAACAACGACGTGAACGCCTTCGACAAGCTGCTGTTCAAGCACATCGGCCACGTGGGCAGCAACAAGGTGCGCAGCTTCTGGCTGGGCCTGACCCGCGGCCTGACCAGCAGCACCCCGACCGGCGACGCCACCAAGCGCTACTACCAGCACCTGAACCGCCTGAGCGCCAACCTGGCCCTGCTGAGCGACGTGAGCATGGCCGTGCTGGGCGGCAGCCTGAAGCGCCGCGAGCGCATCAGCGCCCGCCTGGGCGACATCCTGAGCCAGCTGTACCTGGCCAGCGCCGTGCTGAAGCGCTACGACGACGAGGGCCGCAACGAGGCCGACCTGCCGCTGGTGCACTGGGGCGTGCAGGACGCCCTGTACCAGGCCGAGCAGGCCATGGACGACCTGCTGCAGAACTTCCCGAACCGCGTGGTGGCCGGCCTGCTGAACGTGGTGATCTTCCCGACCGGCCGCCACTACCTGGCCCCGAGCGACAAGCTGGACCACAAGGTGGCCAAGATCCTGCAGGTGCCGAACGCCACCCGCAGCCGCATCGGCCGCGGCCAGTACCTGACCCCGAGCGAGCACAACCCGGTGGGCCTGCTGGAGGAGGCCCTGGTGGACGTGATCGCCGCCGACCCGATCCACCAGCGCATCTGCAAGGAGCTGGGCAAGAACCTGCCGTTCACCCGCCTGGACGAGCTGGCCCACAACGCCCTGGTGAAGGGCCTGATCGACAAGGACGAGGCCGCCATCCTGGTGAAGGCCGAGGAGAGCCGCCTGCGCAGCATCAACGTGGACGACTTCGACCCGGAGGAGCTGGCCACCAAGCCGGTGAAGCTGCCGGAGAAGGTGCGCAAGGTGGAGGCCGCCTAA
【0088】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】