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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-23
(54)【発明の名称】アリールピロール誘導体の薬学的塩
(51)【国際特許分類】
C07D 207/337 20060101AFI20231016BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231016BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231016BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231016BHJP
A61K 31/402 20060101ALI20231016BHJP
【ＦＩ】
C07D207/337 CSP
A61P35/00
A61K45/00
A61P43/00 111
A61K31/402
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023519234
(86)(22)【出願日】2021-09-23
(85)【翻訳文提出日】2023-05-24
(86)【国際出願番号】 EP2021076203
(87)【国際公開番号】W WO2022063899
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】2015187.4
(32)【優先日】2020-09-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523107927
【氏名又は名称】センチネル オンコロジー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】メジャー、メリエル ルース
(72)【発明者】
【氏名】ボイル、ロバート ジョージ
(72)【発明者】
【氏名】トラバース、スチュアート
(72)【発明者】
【氏名】ウォーカー、デイビッド ウインター
(72)【発明者】
【氏名】ノーゼン、ジュリアン スコット
(72)【発明者】
【氏名】サントーニ、ステファニア
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA03
4C084NA05
4C084ZB26
4C084ZC20
4C084ZC41
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC05
4C086GA14
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA03
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC20
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明は、（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）－エチル］ベンズアミド（＋）－Ｌ－酒石酸塩、その調製方法、それを含有する医薬組成物、及びがんなどの疾患の治療におけるその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
酸と塩基との間のモル比が約１：１である、（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）－エチル］ベンズアミド（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【請求項2】
式（２）を有する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの（＋）－Ｌ－酒石酸塩。【化1】
【請求項3】
酸と塩基との間に約１：１のモル比が存在し、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドが単一のアトロプ異性体の形態である、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【請求項4】
単一のアトロプ異性体が式（１）のアトロプ異性体である、請求項３に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【請求項5】
単一のアトロプ異性体が４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドのＲアトロプ異性体である、請求項３に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【請求項6】
単一のアトロプ異性体が本明細書の例で記載されたようなアトロプ異性体Ａ－２である、請求項３に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【請求項7】
（＋）－Ｌ－酒石酸塩が本明細書の例で記載されたようなものである、請求項３に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【請求項8】
結晶形態である、請求項１～７のいずれかに記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【請求項9】
無水物である、請求項８に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【請求項10】
パターンＢとして本明細書で同定される無水物である、請求項９に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【請求項11】
（ａ）単一のアトロプ異性体が、組成物中に存在する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの唯一のアトロプ異性体であるか、又は（ｂ）前記単一のアトロプ異性体に対して、モル量で１０％未満の、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの任意の他のアトロプ異性体が存在する、のいずれかである、請求項１～１０のいずれかに記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩を含む物質の組成物。
【請求項12】
（ａ）単一のアトロプ異性体が、組成物中に存在する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの唯一のアトロプ異性体であるか、又は（ｂ）前記単一のアトロプ異性体に対して、モル量で０．１％未満の、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの任意の他のアトロプ異性体が存在する、のいずれかである、請求項１１に記載の物質の組成物。
【請求項13】
請求項１～１０のいずれかに記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩、又は請求項１１及び１２のいずれかに記載の物質の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項14】
がん、例えば本明細書の態様３．４～３．１６のいずれか１つに記載のがんの治療に使用するための、請求項１～１０のいずれかに記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩、又は請求項１１及び１２のいずれかに記載の物質の組成物。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれかに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、別の治療活性剤とを含む医薬組み合わせ。
【請求項16】
本明細書の態様１．１～１．１９、２．１～２．５、３．１～３．３４、４．１～４．１２、及び５．１～５．６のいずれか１つに記載の発明。【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
本発明は、トリアリールピロール化合物のアトロプ異性体の薬学的塩、その調製方法、それを含有する医薬組成物、及びがんなどの疾患の治療におけるその使用に関する。
【0002】
正常なＫＲＡＳ遺伝子によって発現されるタンパク質は、正常な組織のシグナル伝達に不可欠な機能を実行する。単一のアミノ酸置換、特に単一のヌクレオチド置換によるＫＲＡＳ遺伝子の変異は、多くのがんの発生に不可欠なステップである活性化変異の原因である。結果として生じる変異タンパク質は、肺腺癌、粘液腺腫、膵管癌、及び結腸直腸癌を含む様々な悪性腫瘍に関係している。Ｒａｓファミリーの他のメンバーと同様に、ＫＲＡＳタンパク質はＧＴＰａｓｅであり、多くのシグナル伝達経路に関与している。
【0003】
ＫＲＡＳは分子のオン／オフスイッチとして作用する。それはオンになると、増殖因子ならびにｃ－Ｒａｆ及びＰＩ－３キナーゼなどの他の受容体のシグナルの伝播に必要なタンパク質を補充して活性化する。通常のＫＲＡＳは、活性状態でＧＴＰに結合し、ヌクレオチドの末端ホスファートを切断して、それをＧＤＰに変換する固有の酵素活性がある。ＧＴＰをＧＤＰに変換すると、ＫＲＡＳはオフになる。変換速度は、通常遅いが、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）クラスのアクセサリータンパク質、例えばＲａｓＧＡＰによって劇的に高速化できる。次に、ＫＲＡＳはグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）クラスのタンパク質、例えばＳＯＳ１に結合することができ、これは結合したヌクレオチドの放出を強制する。その後、ＫＲＡＳはサイトゾル中に存在するＧＴＰに結合し、ｒａｓ－ＧＴＰからＧＥＦが放出される。変異体ＫＲＡＳでは、そのＧＴＰアーゼ活性が直接除去され、ＫＲＡＳを構成的に活性状態にする。変異体ＫＲＡＳは、多くの場合、コドン１２、１３、６１、又はそれらの混合物の変異を特徴とする。
【0004】
変異体ＫＲＡＳを保有するがん細胞の生存率は、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）に依存することが既知であり、ＰＬＫ１をサイレンシングすると変異体ＫＲＡＳを含有する細胞が死に至ることが示されている（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００９ Ｍａｙ ２９；１３７（５）：８３５－８４８を参照）。したがって、ＰＬＫ１を阻害する化合物は、ＫＲＡＳ変異から生じるがんの治療に有用であるはずであるが、ＰＬＫ１の保存されたＡＴＰ結合ドメインに結合するように設計された現在のキナーゼ阻害剤は、この作用機序にアクセスするには他のキナーゼと比べて非選択的すぎる場合がある（例えば、Ｅｌｓａｙｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１９）１１（１２），１３８３－１３８６を参照）。
【0005】
ＰＬＫ１は６０３個のアミノ酸からなるセリン／トレオニンキナーゼであり、分子量は６６ｋＤａであり、細胞周期の重要な調節因子である。特に、ＰＬＫ１は有糸分裂に重要であり、細胞周期のＭ期中の有糸分裂紡錘体の形成及び変化、ならびにＣＤＫ／サイクリン複合体の活性化に関与している。
【0006】
すべてのポロ様キナーゼは、Ｎ末端セリン／トレオニンキナーゼ触媒ドメイン及び１つ又は２つのポロボックスを含有するＣ末端領域を含有する（Ｌｏｗｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，（２００５），２４，２４８－２５９）。ポロ様キナーゼ１、２、及び３の場合、両方のポロボックスを含むＣ末端領域全体が、ポロボックスドメイン（ＰＢＤ）として既知の単一のモジュラーホスホセリン／スレオニン結合ドメインとして機能する。結合した基質が存在しない場合、ＰＢＤはキナーゼドメインの基礎活性を阻害する。ＰＢＤのその配位子へのリン酸化依存性結合は、キナーゼドメインを放出すると同時に、ポロ様キナーゼを特定の細胞内構造に局在化する。
【0007】
ＰＬＫＬ１は、そのポロボックスドメインを介して細胞内アンカー部位に局在化するため、ＰＬＫ１の作用は、ＰＢＤの機能を阻害することにより、その細胞内局在を妨害する小分子によって阻害することができることが示されている（Ｒｅｉｎｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，４５９－４６６，Ｍａｙ ２００８）。
【0008】
腫瘍タンパク質ｐ５３は腫瘍抑制因子として機能し、アポトーシス、ゲノムの安定性、及び血管新生の阻害の役割を果たす。ｐ５３欠損及び高いＰＬＫ１発現の両方を有する腫瘍は、ＰＬＫ１阻害剤に特に敏感である場合があることが既知である（Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ Ｒｅｖ Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ，（２０１４）．７６１，３１－３９）。
【0009】
したがって、文献における証拠は、ＰＢＤに結合してその機能を阻害する小分子がＰＬＫ１キナーゼの効果的な阻害剤であるはずであり、したがってＫＲＡＳ及び／又はｐ５３変異から生じるがんの治療にも有用であるはずであることも示唆している。特に、ＰＢＤドメインはＰＬＫにのみ存在するため、このドメインに対して設計された阻害剤が以前のＡＴＰ競合阻害剤よりも高い選択性を有する可能性により、ＫＲＡＳ変異体及びｐ５３欠損がんを標的とするより高い能力を可能にし得る。
【0010】
原発性脳がんの治療薬の特定及び開発は、特に難しいことが証明されている。標的がん療法、特にプロテインキナーゼ阻害剤を使用する療法は、製薬企業及びバイオテクノロジー企業にとって大きな焦点となっている（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１６，１３，２０９－－２２７）。しかしながら、３０個以上のキナーゼ阻害剤は、腫瘍学での使用が承認されているが、これらのいずれも原発性脳がんの治療用ではない。特に問題となっているのは、承認されたキナーゼ阻害剤腫瘍学薬のほとんどが、脳がんの治療に使用される場合に必要な脳への曝露を達成するために必要な薬物物質の品質を欠いていることである［ＪＭＣ ２０１６，５９（２２），１００３０－１００６６］。
【0011】
アルキル化剤テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）、Ｔｅｍｏｄａｌ（登録商標））は、現在、脳腫瘍多形性膠芽腫の第一選択治療薬であり、放射線療法と組み合わせて頻繁に使用されている。しかしながら、薬物耐性は膠芽腫の管理における主要な問題であり、したがってテモゾロミドの有用性を制限する。したがって、現時点では、悪性神経膠芽細胞腫は不治のままである。
【0012】
ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）は、多形性膠芽腫を含む様々な腫瘍タイプで過剰発現する（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１７，１０，２２－３２）。さらに、最近の研究では、ＰＬＫ１が多形性膠芽腫のチェックポイント適応及びテモゾロミド耐性を推進することが示されている［Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７，８，１５８２７－１５８３７］。
【0013】
上衣腫は脳及び脊髄の腫瘍であり、現在の標準治療は手術及び放射線に限定されている。ＰＬＫ１は上衣腫に関係しており、ＰＬＫ１の阻害剤は上衣腫細胞株に対して活性である［Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１１）２０，３８４－３９９］。
【0014】
ＰＬＫ１はまた、高悪性度で浸潤性な小児脳腫瘍であるびまん性橋神経膠腫（ＤＩＰＧ）の標的として研究されている［Ａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ（２０１６）１６，６４７ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１８）１９，１２，１０７８－１０８７］。
【0015】
より具体的には、ＰＬＫ１の阻害は、ＩＤＨ１変異神経膠腫におけるテモゾロミドの有効性を増強し［Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，（２０１７）８，９，１５８２７－１５８３７］、ＭＭＲ欠損のテモゾロミド耐性膠芽腫異種移植モデルにおける腫瘍の増殖を阻害することが示されている［Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ；１７（１２）Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１８］。
【0016】
上記の場合、現在の阻害剤は十分な脳曝露を欠く。
【0017】
ＰＬＫＬ１を阻害するが、薬物耐性を誘発せず、良好な脳曝露を示す化合物は、多形性膠芽腫及び他の脳がんの治療に有用であると期待される。
【0018】
ＰＬＫ４は、中心体複製において重要な役割を果たすセリン／トレオニンキナーゼのポロ様キナーゼファミリーのメンバーであり、中心小体複製の中心的調節因子として作用する（Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔ－Ｄｉａｓ，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２００５ １５（２４）；２１９９－２０７）。中心体におけるＰＬＫ４依存的変化は、有糸分裂時の非対称染色体分離をもたらし得、これは、染色体の誤分離及び有糸分裂欠陥後の細胞死を引き起こし得る。
【0019】
ＰＬＫ４は、ヒトがんにおいて異常に発現され、腫瘍形成及び転移に関係している。したがって、ＰＬＫ４は、がん療法の有望な標的として強調されている（Ｚｈａｏ，Ｊ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２０１９）。
【0020】
ＰＬＫ４は、ラブドイド腫瘍、髄芽腫及び脳の他の胎児性腫瘍（Ｐｅｄｉａｔｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ．２０１７）、ならびに乳がん、肺がん、黒色腫、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、及び卵巣がんを含む多くのがんで過剰発現される。ＰＬＫ４の上昇又は過剰活性化は、卵巣がん、乳がん、及び肺がんを含むがん患者における生存率の低下と関連している（Ｚｈａｏ，Ｊ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２０１９）。
【0021】
ＰＬＫ４阻害は、多形性膠芽腫の治療について研究されており、ＰＬＫ４がテモゾロミド化学感受性の調節において重要な役割を果たすことが実証されている。膠芽腫ＰＤＸモデルにおけるテモゾロミドとＰＬＫ４の阻害の組み合わせは、テモゾロミド単独と比較して抗腫瘍効果を増強することが示されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ ４４３，２０１９，９１－１０７）。
【0022】
ＰＬＫ４はがん発生においてｐ５３不活性化と協働することが報告されており、ＰＬＫ４過剰発現及びｐ５３欠損を有するがんは腫瘍を形成しやすいと予測されている（Ｓｅｒｃｉｎ，２０１６；Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８：１００－１１０）。したがって、ＰＬＫ４活性を阻害する化合物は、ｐ５３変異がんの治療に有用であると予想される。
【0023】
ＰＬＫ４の阻害は、肺がんにおいて抗腫瘍活性をもたらし、活性は、野生型及び変異体ＫＲＡＳを保有するがんにおいて見られる（Ｋａｗａｋａｍｉ，ＰＮＡＳ ２０１８，１１５（８）１９１３－１８）。したがって、ＰＬＫ４活性を阻害する化合物は、ＫＲＡＳ変異体がんの治療に有用であると予想される。
【0024】
現在のＰＬＫ４阻害剤はキナーゼ活性部位で作用し、脳浸透に最適ではない（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１９，２０，２１１２）。したがって、ＰＬＫ４のＰＢＤを阻害するが、良好な脳曝露も示す化合物は、多形性膠芽腫及び他の脳がんの治療に有用であると期待される。
【0025】
本発明者らの先の国際特許出願ＷＯ２０１８／１９７７１４は、以下の式の化合物を開示している：
（式中、環Ｘがベンゼン又はピリジン環であり、環Ｙはベンゼン、ピリジン、チオフェン、又はフラン環であり、Ａｒ１が置換されていてもよいベンゼン、ピリジン、チオフェン、又はフラン環であり、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７が水素又は様々な置換基である）。化合物は、抗がん活性を有し、経口投与後に良好な脳曝露を有すると記載されており、それらを脳がんの治療の良好な候補にする。化合物は膠芽腫細胞株に対して活性があり、ＰＬＫ１キナーゼのポロボックスドメインの阻害剤として作用すると考えられている。これらの化合物は、変異体ＲＡＳがん細胞株（ＨＣＴ１１６など）に対して活性があり、ＫＲＡＳ変異から生じるがんの治療にも有用であるはずであるとも開示している。
【化1】
（式中、環Ｘがベンゼン又はピリジン環であり、環Ｙはベンゼン、ピリジン、チオフェン、又はフラン環であり、Ａｒ１が置換されていてもよいベンゼン、ピリジン、チオフェン、又はフラン環であり、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７が水素又は様々な置換基である）。化合物は、抗がん活性を有し、経口投与後に良好な脳曝露を有すると記載されており、それらを脳がんの治療の良好な候補にする。化合物は膠芽腫細胞株に対して活性があり、ＰＬＫ１キナーゼのポロボックスドメインの阻害剤として作用すると考えられている。これらの化合物は、変異体ＲＡＳがん細胞株（ＨＣＴ１１６など）に対して活性があり、ＫＲＡＳ変異から生じるがんの治療にも有用であるはずであるとも開示している。
【発明の概要】
【0026】
現在、ＷＯ２０１８／１９７７１４の例３３の化合物、すなわち４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド、及びその類似体はアトロプ異性体を形成することが見出された。アトロプ異性体は、回転障壁に対するエネルギー障壁が個々の回転異性体の単離を可能にするのに十分に高い、単結合軸を中心とした妨げられた回転から生じる立体異性体である；ＬａＰｌａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５４：７００５－７０２２（２０１１）を参照。
【0027】
アトロプ異性体は、キラル軸が回転によってラセミ化するのに必要なエネルギーの量及びラセミ化が起こるのに必要な時間の長さに基づいて３つのカテゴリーに分類することができる。クラス１のアトロプ異性体は、８４ｋＪ／ｍｏｌ（２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）未満のキラル軸まわりの回転障壁を有し、室温において数分以内で測定される期間でラセミ化し；クラス２のアトロプ異性体は、８４～１１７ｋＪ／ｍｏｌ（２０～２８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の回転障壁を有し、室温において数時間～数ヶ月間で測定される期間でラセミ化し；クラス３のアトロプ異性体は、１１７ｋＪ／ｍｏｌ（２８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）超の回転障壁を有し、室温において数年間で測定される期間でラセミ化する。
【0028】
アトロプ異性体の立体化学構造は、図１に示す（Ｓ）－６，６’－ジニトロビフェニル－２，２’－ジカルボン酸によって例示されるＣａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－ＰｒｅｌｏｇのＲ及びＳ系を使用して割り当てることができる。
【0029】
この系では、アリール－アリール結合の両側の最も近い置換基にａ－ｂ－ｃ－ｄの順序で優先順位が割り当てられる。置換基ａ、ｂ、及びｃが反時計回りの配置にある場合、アトロプ異性体はＳ異性体である。対応するＲ異性体では、置換基ａ、ｂ、及びｃは時計回りの配置である。
【0030】
４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド及びその類似体のアトロプ異性体は、単離及び特性評価するのに十分に安定であり、８０℃までの温度に１０日間加熱しても、有意な程度までラセミ化しないことが見出されている。したがって、アトロプ異性体は、クラス３のアトロプ異性体として分類することができる。アトロプ異性は、２－トリフルオロメチル置換基とピロール環の２位及び５位に結合している芳香環との間の立体相互作用が、２－トリフルオロメチル置換された環とピロール環の窒素原子との間の結合のまわりの回転を妨げるために生じると考えられる。
【0031】
４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの２つの個々のアトロプ異性体は、有意に異なる生物学的特性を有することが分かっている。したがって、典型的には、対の一方のアトロプ異性体は、対の他方のアトロプ異性体よりも特定のがん標的に対して有意に活性である。目的の生物学的標的に対してより良好な生物活性を有するアトロプ異性体は、単結晶のＸ線解析によってＲ配置、すなわち化学構造（１）を有することが示されている。
【化2】
【0032】
酸と塩基との間に約１：１のモル比が存在し、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの（＋）－Ｌ－酒石酸塩が、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの遊離塩基形態、及び化合物の他の塩よりも有利であることがさらに見出された。
【0033】
（＋）－Ｌ－酒石酸は、遊離塩基よりも改善された水溶性で表面水分（９０％ＲＨで１％未満）のみを取り込む高度に結晶性で安定な固体であるという点で特に有利である。これらの特性は、それを医薬開発に特に適したものにする。
【0034】
したがって、第１の態様（態様１．１）では、本発明は、酸と塩基との間のモル比が約１：１である、（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）－エチル］ベンズアミド（＋）－Ｌ－酒石酸塩を提供する。
【0035】
さらなる態様では、本発明は以下を提供する：
１．２ 式（２）を有する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの（＋）－Ｌ－酒石酸塩：
１．２ 式（２）を有する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの（＋）－Ｌ－酒石酸塩：
【化3】
【0036】
１．３ 酸と塩基との間に約１：１のモル比が存在し、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドが単一のアトロプ異性体の形態である、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0037】
１．４ 単一のアトロプ異性体が式（１）のアトロプ異性体である、態様１．３に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0038】
１．５ 単一のアトロプ異性体が４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドのＲアトロプ異性体である、態様１．３に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0039】
１．６ 単一のアトロプ異性体が以下のパラメーターのいずれか１つ又は複数を特徴とする、態様１．３に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩：
（ｉ）本明細書の例３に実質的に記載されているようなＸ線結晶学データ；
（ｉｉ）本明細書のキラルＨＰＬＣ方法１によって決定した場合の約２０分（例えば約２０．５分）の保持時間；及び
（ｉｉｉ）本明細書の例２に記載の方法を用いて測定した場合の約－１１．７６°の比旋光度。
（ｉ）本明細書の例３に実質的に記載されているようなＸ線結晶学データ；
（ｉｉ）本明細書のキラルＨＰＬＣ方法１によって決定した場合の約２０分（例えば約２０．５分）の保持時間；及び
（ｉｉｉ）本明細書の例２に記載の方法を用いて測定した場合の約－１１．７６°の比旋光度。
【0040】
１．７ 単一のアトロプ異性体が本明細書の例で記載されたようなアトロプ異性体Ａ－２である、態様１．３に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0041】
１．８（＋）－Ｌ－酒石酸塩が本明細書の例で記載されたようなものである、態様１．３に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0042】
１．９ 結晶形態である、態様１．１～１．８のいずれか１つに記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0043】
１．１０ 無水物である、態様１．９に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0044】
１．１１ パターンＢとして本明細書で同定される無水物である、態様１．１０に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0045】
１．１２ 溶媒和物である、態様１．９に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0046】
１．１３ パターンＡとして本明細書で同定される溶媒和物である、態様１．１２に記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩。
【0047】
１．１４（ａ）単一のアトロプ異性体が、組成物中に存在する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの唯一のアトロプ異性体であるか、又は（ｂ）前記単一のアトロプ異性体に対して、モル量で１０％未満の、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの任意の他のアトロプ異性体が存在するのいずれかである、態様１．３～１．１３のいずれか１つに記載の（＋）－Ｌ－酒石酸塩を含む物質の組成物。
【0048】
１．１５（ａ）単一のアトロプ異性体が、組成物中に存在する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの唯一のアトロプ異性体であるか、又は（ｂ）前記単一のアトロプ異性体に対して、モル量で５％未満の、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの任意の他のアトロプ異性体が存在するのいずれかである、態様１．１４に記載の物質の組成物。
【0049】
１．１６（ａ）単一のアトロプ異性体が、組成物中に存在する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの唯一のアトロプ異性体であるか、又は（ｂ）前記単一のアトロプ異性体に対して、モル量で２％未満の、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの任意の他のアトロプ異性体が存在するのいずれかである、態様１．１４に記載の物質の組成物。
【0050】
１．１７（ａ）単一のアトロプ異性体が、組成物中に存在する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの唯一のアトロプ異性体であるか、又は（ｂ）前記単一のアトロプ異性体に対して、モル量で１．５％未満の、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの任意の他のアトロプ異性体が存在するのいずれかである、態様１．１４に記載の物質の組成物。
【0051】
１．１８（ａ）単一のアトロプ異性体が、組成物中に存在する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの唯一のアトロプ異性体であるか、又は（ｂ）前記単一のアトロプ異性体に対して、モル量で１％未満の、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの任意の他のアトロプ異性体が存在するのいずれかである、態様１．１４に記載の物質の組成物。
【0052】
１．１９（ａ）単一のアトロプ異性体が、組成物中に存在する４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの唯一のアトロプ異性体であるか、又は（ｂ）前記単一のアトロプ異性体に対して、モル量で０．１％未満の、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドの任意の他のアトロプ異性体が存在するのいずれかである、態様１．１４に記載の物質の組成物。
【0053】
定義
態様１．１～１．１９のいずれか１つで定義される、（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）－エチル］ベンズアミド（＋）－Ｌ－酒石酸塩、式（２）の化合物、及び物質の組成物は、集合的に又は総称して「本発明の酒石酸塩」と呼ばれることがある。したがって、「本発明の酒石酸塩」への言及は、文脈がそうでないことを示さない限り、態様１．１～１．１９のいずれか１つへの言及であると解釈され得る。
態様１．１～１．１９のいずれか１つで定義される、（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）－エチル］ベンズアミド（＋）－Ｌ－酒石酸塩、式（２）の化合物、及び物質の組成物は、集合的に又は総称して「本発明の酒石酸塩」と呼ばれることがある。したがって、「本発明の酒石酸塩」への言及は、文脈がそうでないことを示さない限り、態様１．１～１．１９のいずれか１つへの言及であると解釈され得る。
【0054】
同位体
態様１．１～１．１９のいずれか１つで定義される、物質の組成物、化合物又は塩は、１つ以上の同位体置換を含有し得、特定の要素への言及は、その範囲内にその要素のすべての同位体を含む。例えば、水素への言及には、その範囲内に１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、及び３Ｈ（Ｔ）が含まれる。同様に、炭素及び酸素への言及には、それぞれ１２Ｃ、１３Ｃ、及び１４Ｃ、ならびに１６Ｏ及び１８Ｏが含まれる。
態様１．１～１．１９のいずれか１つで定義される、物質の組成物、化合物又は塩は、１つ以上の同位体置換を含有し得、特定の要素への言及は、その範囲内にその要素のすべての同位体を含む。例えば、水素への言及には、その範囲内に１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、及び３Ｈ（Ｔ）が含まれる。同様に、炭素及び酸素への言及には、それぞれ１２Ｃ、１３Ｃ、及び１４Ｃ、ならびに１６Ｏ及び１８Ｏが含まれる。
【0055】
同位体は放射性でも非放射性であってもよい。本発明の一態様では、物質の組成物又はアトロプ異性体は放射性同位体を含有しない。そのような化合物は治療用途に好ましい。しかしながら、別の態様では、物質の組成物又はアトロプ異性体は１つ以上の放射性同位体を含有してもよい。そのような放射性同位体を含む化合物は、診断の状況において有用であり得る。
【0056】
溶媒和物及び無水物
態様１．１～１．１９のいずれか１つで定義される、物質の組成物、化合物又は塩は、溶媒和物及び無水物を形成し得る。
態様１．１～１．１９のいずれか１つで定義される、物質の組成物、化合物又は塩は、溶媒和物及び無水物を形成し得る。
【0057】
特定の溶媒和物は、本発明の物質の組成物又はアトロプ異性体の固体状態構造（例えば、結晶構造）への非毒性の薬学的に許容される溶媒（以下溶媒和溶媒と呼ばれる）の分子の組み込みにより形成される溶媒和物である。溶媒和物は、溶媒和溶媒を含有する溶媒又は溶媒の混合物で本発明の物質の組成物又はアトロプ異性体を再結晶化することにより調製することができる。溶媒和物が任意の所与のインスタンスで形成されたかどうかは、熱重量分析（ＴＧＥ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、及び粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）などの周知の標準的な技術を使用して、物質の組成物又はアトロプ異性体の結晶を分析に供することにより判定することができる。
【0058】
溶媒和物は、化学量論的又は非化学量論的溶媒和物であり得る。
【0059】
溶媒和物の例は、水、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、及びイソプロピルアルコール）、アルキルアルカノアートエステル（例えば、酢酸エチル及び酢酸イソプロピル）、エーテル（特に、１－４－ジオキサン及びテトラヒドロフランなどの環状エーテル）、及び単環式ラクタム（例えば、Ｎ－メチルピロリドン）から選択される１つ以上の溶媒のいずれか１つで形成されるものである。
【0060】
溶媒和物ならびにそれらの作製及び特性化に使用される方法のより詳細な議論については、Ｂｒｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＳＳＣＩ，Ｉｎｃ ｏｆ Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ，ＵＳＡ，１９９９，ＩＳＢＮ ０－９６７－０６７１０－３を参照されたい。
【0061】
溶媒和物を形成することに加えて、態様１．１～１．１９のいずれか１つで定義される物質の組成物、化合物又は塩は、無水物の形態で提供され得る。本明細書で使用される「無水物」という用語は、その三次元構造（例えば結晶形態）内に水を含有しない（好ましくは他の溶媒を含有しない）固体粒子形態を指すが、塩又は化合物の粒子は、その外表面に水分子が付着していてもよい。
【0062】
本発明の化合物の調製方法
本発明の（＋）－Ｌ－酒石酸塩は、式（１）のアトロプ異性体から、溶媒又は溶媒の混合物中で酒石酸と反応させ、次いで、溶媒又は溶媒の混合物から酒石酸塩を単離することにより調製することができる。
本発明の（＋）－Ｌ－酒石酸塩は、式（１）のアトロプ異性体から、溶媒又は溶媒の混合物中で酒石酸と反応させ、次いで、溶媒又は溶媒の混合物から酒石酸塩を単離することにより調製することができる。
【0063】
一態様では、式（１）のアトロプ異性体を１つの溶媒に溶解又は懸濁して第１の混合物を形成し、（＋）－Ｌ－酒石酸を同じ又は別の溶媒に溶解又は懸濁して第２の混合物を形成し、次いで第１及び第２の混合物を合わせて一定時間放置して（例えば、撹拌しながら）塩形成を起こさせ、続いて（＋）－Ｌ－酒石酸塩を単離することができる。
【0064】
第１及び第２の混合物を合わせる場合、式（１）のアトロプ異性体及び（＋）－Ｌ－酒石酸のモル量はほぼ同等であることが好ましい；すなわち、式（１）のアトロプ異性体と（＋）－Ｌ－酒石酸との間には、好ましくは１：１のモル比が存在する。
【0065】
（＋）－Ｌ－酒石酸塩は、濾過（沈殿が形成される場合）又は溶媒の蒸発により合わせた混合物から単離することができる。
【0066】
したがって、合わせた混合物中に２つ以上の溶媒が存在する場合、共溶媒又は貧溶媒として作用するように異なる溶媒を選択することができる。
【0067】
溶媒又は溶媒の混合物は、加熱された場合に少なくとも部分的に（＋）－Ｌ－酒石酸塩を溶液中に保持するが、溶媒又は溶媒の混合物が冷却された場合に塩を沈殿物として堆積させるように選択することができる。
【0068】
第１の混合物（式（１）のアトロプ異性体を含有する混合物）を形成するために使用される溶媒は、例えば、脂肪族ケトン、脂肪族酸の脂肪族エステル、非芳香族環状エーテル、及び脂肪族アルコールから選択することができる。
【0069】
脂肪族ケトンの好ましい例はアセトンである。
【0070】
脂肪族酸の脂肪族エステルの例には、酢酸のＣ２－４アルキルエステルが含まれ、特定の例はイソプロピルアセタートである。
【0071】
非芳香族環状エーテルの例には、ジオキサン、２－メチルテトラヒドロフラン、及びテトラヒドロフランが含まれ、特定の例は２－メチルテトラヒドロフランである。
【0072】
脂肪族アルコールの例は、Ｃ２－４脂肪族アルコール、より具体的にはイソプロピルアルコール及びブタノールなどのＣ３－４アルカノールである。
【0073】
第２の混合物（（＋）－Ｌ－酒石酸を含有する混合物）を形成するために使用される溶媒は、例えば、水、非芳香族環状エーテル、及び脂肪族アルコールから選択することができる。
【0074】
第２の混合物のための脂肪族アルコール溶媒の特定の例は、エタノールである。
【0075】
第２の混合物のための非芳香族環状エーテル溶媒の特定の例は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）である。
【0076】
第２の混合物の形成に使用するための溶媒の別の特定の例は水である。
【0077】
式（１）のアトロプ異性体の（＋）－Ｌ－酒石酸塩は、いくつかの結晶形態、特にパターンＡ（溶媒和物である）及びパターンＢ（無水物である）で存在することができる。異なる結晶形態の特性評価の詳細は、本明細書の他の箇所に提供される。異なる結晶形態は、塩の形成に使用される溶媒及び加熱条件を変化させることにより調製することができる。
【0078】
パターンＡを有する式（１）のアトロプ異性体の（＋）－Ｌ－酒石酸塩を作製するための一プロセスでは、アセトン中のアトロプ異性体の溶液を、２０℃～３０℃の範囲の温度（例えば、約２５℃）でエタノール中の（＋）－Ｌ－酒石酸の溶液と混合し、得られた混合物を、塩形成が起こるのに十分な時間（例えば１２～２４時間）撹拌するか、そうでなければかき混ぜ、次いで、塩を濾過により単離する。
【0079】
パターンＡを有する式（１）のアトロプ異性体の（＋）－Ｌ－酒石酸塩を作製するための別のプロセスでは、イソプロピルアルコール中のアトロプ異性体の溶液を、３５℃～４５℃の範囲の温度（例えば、約４０℃）でエタノール中の（＋）－Ｌ－酒石酸の溶液と混合し、得られた混合物を、約１～３時間にわたって２０℃～３０℃の範囲の温度（例えば、約２５℃）まで冷却し、次いで、塩を濾過により単離する。
【0080】
パターンＡを有する式（１）のアトロプ異性体の（＋）－Ｌ－酒石酸塩を作製するための別のプロセスでは、２－メチルテトラヒドロフラン中のアトロプ異性体の溶液を、２０℃～３０℃の範囲の温度（例えば、約２５℃）でエタノール中の（＋）－Ｌ－酒石酸の溶液と混合し、得られた混合物を、塩形成が起こるのに十分な時間（例えば１２～２４時間）撹拌するか、そうでなければかき混ぜ、次いで、塩を濾過により単離する。
【0081】
パターンＢを有する式（１）のアトロプ異性体の（＋）－Ｌ－酒石酸塩を作製するための一プロセスでは、３５℃～４５℃の範囲の温度（例えば、約４０℃）の酢酸イソプロピル中のアトロプ異性体の溶液を、エタノール中の（＋）－Ｌ－酒石酸の溶液と混合し、得られた混合物を、約１～３時間にわたって２０℃～３０℃の範囲の温度（例えば、約２５℃）まで冷却し、次いで、塩を濾過により単離する。
【0082】
パターンＢを有する式（１）のアトロプ異性体の（＋）－Ｌ－酒石酸塩を作製する別のプロセスでは、３５℃～４５℃の範囲の温度（例えば、約４０℃）の酢酸イソプロピル中のアトロプ異性体の溶液を、ＴＨＦ中の（＋）－Ｌ－酒石酸の溶液と混合し（分割して又は単回投入のいずれかで）、塩パターンＢの１つ以上のシード結晶を添加して沈殿物を得、混合物を２０℃～３０℃の範囲の温度（例えば、約２５℃）まで冷却し、沈殿物を濾過により単離することができる状態まで熟成させるのに十分な時間（例えば１２～２４時間、特に約２０時間）撹拌又はかき混ぜる。
【0083】
パターンＢを有する式（１）のアトロプ異性体の（＋）－Ｌ－酒石酸塩の別のプロセスでは、７０℃～８５℃の範囲の高温（例えば、約８０℃）のブタノール中のアトロプ異性体の溶液を、水中の（＋）－Ｌ－酒石酸の溶液と混合し（分割して又は単回投入のいずれかで）、得られた混合物を６５℃～７０℃の範囲の中間温度まで冷却した後、パターンＢ塩の１つ以上のシード結晶を添加し、混合物を３～１０℃の範囲の低温まで８～１５時間にわたって冷却し、その後、得られた混合物を低温又はその付近でさらに２～８時間（例えば、約６時間）撹拌又はかき混ぜ、次いで、形成されたパターンＢ塩を濾別する。
【0084】
式（１）のアトロプ異性体は、
（ａ）４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）－エチル］ベンズアミドのアトロプ異性体の混合物（例えば、ラセミ混合物）を分離すること；又は
（ｂ）式（３）のアトロプ異性体：
を式Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）－Ｎ（ＣＨ３）２のアミンとアミド形成条件下で反応させること
によって調製することができる。
（ａ）４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）－エチル］ベンズアミドのアトロプ異性体の混合物（例えば、ラセミ混合物）を分離すること；又は
（ｂ）式（３）のアトロプ異性体：
【化4】
を式Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）－Ｎ（ＣＨ３）２のアミンとアミド形成条件下で反応させること
によって調製することができる。
【0085】
式（１）、（２）及び（３）の化合物は、以下のスキーム１に示す経路により調製することができる。
【化5】
【0086】
スキーム１に示される合成経路の出発物質は、４－シアノ－アセトフェノン（４）及び４－クロロフェナシルブロミド（５）であり、これらは両方とも市販されている。
【0087】
ステップ１において、４－シアノ－アセトフェノン（４）と４－クロロフェナシルブロミド（５）を一緒に反応させて、４－［４－（４－クロロフェニル）－４－オキソ－ブタノイル］ベンゾニトリル（６）を得る。反応は、典型的には、好適な溶媒、例えばベンゼン又はトルエンなどの非極性（例えば、炭化水素）溶媒と第三級アルコール（例えば、ｔ－ブタノール）との混合物中、トリエチルアミンなどの第三級アミンの存在下、亜鉛（ＩＩ）塩（例えば、塩化亜鉛）の存在下で実施される。反応は、室温又は室温付近で、例えば、１２～６０時間にわたって実施することができる。
【0088】
ステップ２において、４－［４－（４－クロロフェニル）－４－オキソ－ブタノイル］ベンゾニトリル（６）を２－トリフルオロメチルアニリンと反応させて、４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）ベンゾニトリル（７）を得る。反応は、典型的には、好適な高沸点溶媒（例えば、ジオキサン）中、ｐ－トルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下、高温（例えば、１３０～１７０℃）及び／又はマイクロ波照射で実施される。反応は、１～１２時間、例えば１～６時間実施することができる。
【0089】
ステップ３において、４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）ベンゾニトリル（７）をアルカリ加水分解に供して、４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（８）を得る。加水分解反応は、典型的には、水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物（典型的には過剰量）の存在下で、メタノールなどのアルコールを含有し得る水性溶媒中、一般的には、例えば６０～８０℃の範囲の温度又は約２０時間以上までの期間、加熱しながら実施される。加水分解が完了すると、酸（８）は、典型的には、反応混合物を冷却及び酸性化することによって単離される。
【0090】
ステップ３に続いて、アトロプ異性体（１）への２つの可能な経路のうちの１つに従うことができる。ステップ４ｂ及び５ｂ及び６からなる一変形例において、４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（８）を、アミド形成条件下でＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンと反応させて、４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）－Ｎ－（２－（ジメチルアミノ）エチル）ベンズアミド（９）のアトロプ異性体のラセミ混合物を得、次いで、これをキラル分離によって個々のアトロプ異性体に分割して、アトロプ異性体（１）を得る。
【0091】
他の変形例では、ラセミ６，４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（８）をキラル分離に供してアトロプ異性体（３）を得、次いで、これをアミド形成条件下でＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンと反応させてアトロプ異性体（１）を得る。
【0092】
カルボン酸（３）及び（８）を、アミドカップリング試薬の存在下、アミド形成条件下でＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンと反応させる。そのようなアミドカップリング試薬の例には、１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１９５５，７７，１０６７）及び１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（本明細書ではＥＤＣ又はＥＤＣＩとも呼ばれる）（Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６１，２６，２５２５）などのカルボジイミド系カップリング試薬が含まれ、これらは典型的には１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（Ｌ．Ａ．Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９３，１１５，４３９７）又は１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（Ｋｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１０３，７０８，２０２４－２０３４）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）などのウロニウム系カップリング試薬、及びプロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）（Ａ．Ｇａｒｃｉａ，Ｓｙｎｌｅｔｔ，２００７，Ｎｏ．８，ｐｐ１３２８－１３２９を参照）と組み合わせて使用される。プロセスステップ５ａ及び５ｂで使用するための特定のアミドカップリング試薬は、ＨＡＴＵ及びＴ３Ｐである。
【0093】
アミドカップリング反応は、典型的には、非干渉性塩基、例えばトリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンなどの第三級アミンの存在下の室温又はその付近（例えば、１８～３０℃）で、テトラヒドロフランもしくはジメチルホルムアミド又はそれらの混合物などの非水性、極性、非プロトン性溶媒中で実施される。
【0094】
カルボン酸（８）及びアミド（９）のアトロプ異性体の混合物のキラル分離は、様々な技術を使用して行うことができる。例えば、キラルクロマトグラフィーを使用して、個々のアトロプ異性体を分離することができる。キラルクロマトグラフィー手順におけるアトロプ異性体の保持時間は、ＮＭＲ及びＭＳ特性が典型的に同じである個々のアトロプ異性体を区別し、特徴付ける手段を提供する。
【0095】
個々のアトロプ異性体を分離するために使用することができるキラルクロマトグラフィーカラムは、例えば官能化アミロース又はセルロースに基づくことができる固定化キラル固定相（ＣＳＦ）を含む。そのようなＣＳＦの例は、クロロ及び／又はメチル置換フェニルカルバマートで官能化されたアミロース及びセルロースである。本発明の個々のアトロプ異性体を単離するために使用され得るキラルカラムの特定の例は、Ｄａｉｃｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な「Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＧ」カラムである。
【0096】
上記キラルカラムと共に典型的に使用することができる移動相は、（Ａ）ジエチルアミンなどのアルキルアミン塩基を少量（例えば、最大１％（ｖ／ｖ）及びより通常には約０．１％（ｖ／ｖ））含有するｎ－ヘプタンなどの液体アルカン；ならびに（Ｂ）アルコール及びその混合物、例えばイソプロピルアルコールとメタノールの混合物（例えば、７０：３０ ＩＰＡ：ＭｅＯＨ）を含む。例えば、移動相は、比８０：２０～９５：５、例えば約８５：１５～約９０：１０の範囲でＡ：Ｂの混合物を含むことができる。移動相は、アイソクラティック又は勾配溶出法で使用され得るが、本発明の一態様では、アイソクラティック溶出法で使用される。
【0097】
本発明のアトロプ異性体は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）条件下でのキラルＨＰＬＣにより分割することもできる。超臨界流体クロマトグラフィーでは、移動相は、多くの場合、アルコール又はアルコールの混合物、例えばメタノール、エタノール、及びイソプロパノールなどの共溶媒と共に、二酸化炭素などの超臨界流体を含む。
【0098】
上記のＣｈｉｒａｌｐａｋ ＩＧカラムは、二酸化炭素／メタノール／イソプロパノール混合物を移動相として使用するＳＦＣクロマトグラフィー手順で使用することができる。
【0099】
ＳＦＣで使用するための他のキラルカラム／共溶媒の組み合わせには、以下が含まれる：
Ｌｕｘセルロース４（ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ）；
Ｌｕｘセルロース２（ＭｅＯＨ）；
Ｌｕｘアミロース１（ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ）；及び
ＹＭＣアミロース－ＳＡ（ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ）。
Ｌｕｘセルロース４（ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ）；
Ｌｕｘセルロース２（ＭｅＯＨ）；
Ｌｕｘアミロース１（ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ）；及び
ＹＭＣアミロース－ＳＡ（ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ）。
【0100】
キラルカラムのＬｕｘファミリーは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【0101】
ＹＭＣアミロース－ＳＡカラムは、ＹＭＣ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【0102】
上記キラルクロマトグラフィー法は、特にラセミ混合物（９）からアトロプ異性体（１）を分離するために使用され得る。
【0103】
キラルクロマトグラフィーの代替として、キラル酸（例えば、（＋）－１０－カンファースルホン酸）をラセミ混合物（９）と反応させて、ジアステレオ異性体の混合物としてキラル塩を形成することができ、これを結晶化によって分離してアトロプ異性体（１）の塩を得、次いでこれをアトロプ異性体（１）の遊離塩基に変換することができる。
【0104】
カルボン酸（８）のアトロプ異性体のラセミ混合物は、（Ｓ）－１－（４－メトキシフェニル）－エチルアミンなどのキラルアミンとの塩を形成して、例えば、キラルアミンとアトロプ異性体（１）との塩のシード結晶の助けを借りた結晶化によって分離することができるジアステレオ異性体の混合物を形成することによって分割することができる。
【0105】
上述のプロセスの特定の側面は、本発明のさらなる態様（態様２．１～２．５）を表す。したがって、本発明は、以下を提供する：
【0106】
２．１ アミド形成条件下での式（３）の化合物とＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンとの反応を含む、式（１）の化合物の調製方法。
【0107】
２．２ アミド形成条件が、アミドカップリング試薬、例えば本明細書に記載のアミドカップリング剤の存在を含む、態様２．１に記載の方法。
【0108】
２．３ アミドカップリング試薬がプロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）である、態様２．２に記載の方法。
【0109】
２．４ 式（３）の化合物の調製方法であって、例えば、キラルクロマトグラフィー又はキラル塩基との塩形成及び得られたキラル塩の分割による、式（８）のアトロプ異性体の混合物からの式（３）の化合物のキラル分離を含む、方法。
【0110】
２．５ 式（３）を有するアトロプ異性体化合物又はその塩（例えば、アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩などの金属塩、又はアンモニアもしくは有機アミンとの塩）。
【0111】
生物学的特性及び治療用途
以下の例に示される証拠は、本明細書で定義される式（１）のアトロプ異性体及びその酒石酸塩がＰＬＫ１及びＰＬＫ４キナーゼのポロボックスドメインの阻害剤ではあるが、ＰＬＫ１及びＰＬＫ４キナーゼの触媒ドメインを阻害しないことを示す。ＰＢＤドメインはＰＬＫにのみ存在するため、式（１）のアトロプ異性体及びその酒石酸塩は、ＡＴＰ競合キナーゼ阻害剤である化合物よりもはるかに高い選択性（したがって、オフターゲットキナーゼ阻害による望ましくない副作用が少ない）を示すはずである。式（１）のアトロプ異性体を９７個のキナーゼのパネルに対して試験し、他のキナーゼに対して無視できる活性を示した、以下の例７Ｆに記載される研究から得られた結果は、式（１）のアトロプ異性体が、他の構造的及び機能的に同様のキナーゼよりもＰＬＫ１－ＰＢＤ及びＰＬＫ４－ＰＢＤに対して高い選択性を有することを裏付けている。
以下の例に示される証拠は、本明細書で定義される式（１）のアトロプ異性体及びその酒石酸塩がＰＬＫ１及びＰＬＫ４キナーゼのポロボックスドメインの阻害剤ではあるが、ＰＬＫ１及びＰＬＫ４キナーゼの触媒ドメインを阻害しないことを示す。ＰＢＤドメインはＰＬＫにのみ存在するため、式（１）のアトロプ異性体及びその酒石酸塩は、ＡＴＰ競合キナーゼ阻害剤である化合物よりもはるかに高い選択性（したがって、オフターゲットキナーゼ阻害による望ましくない副作用が少ない）を示すはずである。式（１）のアトロプ異性体を９７個のキナーゼのパネルに対して試験し、他のキナーゼに対して無視できる活性を示した、以下の例７Ｆに記載される研究から得られた結果は、式（１）のアトロプ異性体が、他の構造的及び機能的に同様のキナーゼよりもＰＬＫ１－ＰＢＤ及びＰＬＫ４－ＰＢＤに対して高い選択性を有することを裏付けている。
【0112】
触媒ドメインではなくＰＢＤドメインを阻害するさらなる利点は、これにより、触媒ドメインを阻害するＰＬＫ１阻害剤と比較して、薬物耐性を誘発する傾向が低下し得ることである。
【0113】
ＰＬＫ１キナーゼのＰＢＤドメインの阻害剤としての、式（１）のアトロプ異性体及びその酒石酸塩の活性は、Ｎａｒｖａｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４，１０１７－１０２８，２０１７（１０１８頁及び１０２６頁を参照（方法の詳細））に記載されている蛍光偏光（ＦＰ）アッセイを使用して実証することができる。
【0114】
式（１）のアトロプ異性体及びその酒石酸塩は、ＫＲＡＳ変異体を構成的に活性化する結果として細胞経路の弱点を利用するのに有効であり得ると考えられ、したがって、ＫＲＡＳの調節により媒介される疾患及び状態の治療に有用であり得る。
【0115】
単一のヌクレオチド置換に起因するＫＲＡＳの変異は、様々な形態のがんに関連している。特に、ＫＲＡＳ変異は、白血病、結腸がん、膵臓がん、及び肺がんで高い割合で見られる。
【0116】
さらに、式（１）のアトロプ異性体及びその酒石酸塩が、ｐ５３の欠損又はＴＰ５３遺伝子の変異を特徴とするがんの治療に有用であり得ると考えられている。ＰＬＫ１はがん細胞のｐ５３を阻害すると考えられている。したがって、ＰＬＫ１阻害剤で治療すると、腫瘍細胞のｐ５３が活性化され、アポトーシスを誘発するはずである。
【0117】
ＫＲＡＳ変異体及びｐ５３欠損がんに対する式（１）のアトロプ異性体の活性は、少なくとも部分的に、上記のように、ＰＬＫ１キナーゼのＣ末端ポロボックスドメイン（ＰＢＤ）の阻害を介して生じると考えられている。ＫＲＡＳはＰＬＫ１との相互作用に依存することが既知である。
【0118】
式（１）のアトロプ異性体は、アトロプ異性体のＰＬＫ１－ＰＢＤ及びＰＬＫ４－ＰＢＤ阻害活性から生じると考えられる特性である、非会合染色体による有糸分裂停止を誘導する（以下の例７Ｃを参照）。
【0119】
アトロプ異性体は、多極紡錘体表現型を有する有糸分裂停止を誘導し、ＰＬＫ４阻害のよく記載された表現型である中心小体の増幅を引き起こす（Ｌｅｉ ２０１８，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｓｅａｓｅ ９，１０６６；Ｋａｗａｋａｍｉ，ＰＮＡＳ ２０１８，１１５（８）１９１３－１８）。これらの表現型は、式（１）のアトロプ異性体のＰＬＫ４－ＰＢＤ阻害活性から生じると考えられる。
【0120】
がん細胞株（Ｕ８７ＭＧ、ヒト脳（膠芽腫星状細胞腫））を利用する抗がん活性の主要なスクリーニングは、以下の例７Ａに記載されている。得られたデータは、式（１）のＲ－アトロプ異性体（アトロプ異性体Ａ－２）が、Ｕ８７ＭＧ細胞株に対して４．６μＭのＩＣ５０を有する対応するＳ－アトロプ異性体（Ａ－１）よりもはるかに活性である（０．２２μＭのＩＣ５０）ことを実証している。
【0121】
２つのアトロプ異性体（Ａ－２及びＡ－１）もまた、４８個のがん細胞株のパネルに対して試験し、結果を以下の例７Ｂに示す。試験したすべての細胞株において、式（１）のアトロプ異性体（Ａ－２）は、ほとんどの場合、アトロプ異性体（Ａ－１）より少なくとも１０倍程度活性であった。
【0122】
例７Ｂのデータは、式（１）のアトロプ異性体（Ａ－２）が、膵臓がん、大腸及び結腸直腸がん、肺がん、脳及び神経のがんなどの固形腫瘍、ならびにリンパ腫及び白血病などの血液がんに及ぶ広範囲の異なるがん細胞株に対して活性であることを実証している。
【0123】
式（１）のアトロプ異性体は、良好な経口バイオアベイラビリティを有し（以下の例７Ｇを参照）、経口投与された場合に良好な脳曝露を有する（例７Ｇ）。したがって、本発明の物質の組成物又はアトロプ異性体は、神経膠腫及び神経膠芽腫などの脳がんの治療に有用であるはずである。
【0124】
今日までに得られた証拠に基づいて、式（１）のアトロプ異性体は、広範囲のがん（及びそれらの良性の対応物）、例えば以下の態様に記載されるがんの治療に有用であると考えられる。
【0125】
したがって、さらなる態様（態様３．１～３．２５）では、本発明は、以下を提供する：
【0126】
３．１．ＰＬＫ１－ＰＢＤとして使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0127】
３．２ ＰＬＫ４－ＰＢＤ阻害剤として使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0128】
３．３ ＰＬＫ１－ＰＢＤ及びＰＬＫ４－ＰＢＤ阻害剤として使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0129】
３．４ がんが、上皮由来の腫瘍（腺癌、扁平上皮癌、移行上皮癌、及び他の癌を含む様々な種類の腺腫及び癌）、例えば、膀胱、尿路、乳房、胃腸管（食道、胃（胃部）、小腸、結腸、直腸、及び肛門を含む）の癌、肝臓（肝細胞がん）、胆嚢及び胆道系、膵外分泌、腎臓、肺（例えば、腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞癌、及び中皮腫）、頭頸部（例えば、舌、頬腔、喉頭、咽頭、鼻咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔、及び副鼻腔のがん）、卵巣、卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内膜、甲状腺（例えば、甲状腺濾胞癌）、副腎、前立腺、皮膚及び付属器（例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、角化棘細胞腫、形成異常母斑）；血液悪性腫瘍（すなわち、白血病、リンパ腫）ならびに血液悪性腫瘍及びリンパ系の関連状態を含む前悪性血液疾患及び境界悪性腫瘍の障害（例えば、急性リンパ性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ性白血病［ＣＬＬ］、Ｂ細胞リンパ腫、例えばびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫及び白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、毛様細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫、及び移植後リンパ増殖性障害）、ならびに骨髄系の血液学的悪性腫瘍及び関連状態（例えば、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、好酸球増加症候群、骨髄増殖性障害、例えば真性赤血球増加症、本態性血小板血症及び原発性骨髄線維症、骨髄増殖性症候群、骨髄異形成症候群、及び前骨髄球性白血病）；間葉由来の腫瘍、例えば軟部組織、骨、又は軟骨の肉腫、例えば骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、消化管間質腫瘍、良性及び悪性の組織球腫、ならびに隆起性皮膚線維肉腫；中枢又は末梢神経系の腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫及び神経膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍、ならびに神経鞘腫）；内分泌腫瘍（例えば、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、膵島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍、甲状腺髄様癌）；眼及び付属腫瘍（例えば、網膜芽細胞腫）；胚細胞及び栄養膜腫瘍（例えば、奇形腫、セミノーマ、未分化胚細胞腫（ｄｙｓｇｅｒｍｉｎｏｍａｓ）、胞状奇胎、及び絨毛癌）；ならびに小児及び胎児の腫瘍（例えば、髄芽腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、及び原始神経外胚葉性腫瘍）；又は、患者が悪性腫瘍に感受性がある先天性又はその他の症候群（例えば、色素性乾皮症）から選択される、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、がんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0130】
３．４Ａ がんが、膵臓がん、大腸及び結腸直腸がん、肺がん、脳及び神経のがん、血液がん（例えば、リンパ腫及び白血病）から選択される、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、がんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0131】
３．５ がんが、膵臓がん、大腸及び結腸直腸がん、肺がん、脳及び神経のがん、ならびにリンパ腫及び白血病などの血液がんから選択される、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、がんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0132】
３．６ がんが、神経膠腫及び神経膠芽腫（例えば、多形性膠芽腫、上衣腫、びまん性橋神経膠腫、ＩＤＨ１変異性神経膠腫）から選択される、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、がんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0133】
３．７ がんが、ラブドイド腫瘍、髄芽腫及び脳の他の胎児性腫瘍；乳がん、肺がん、黒色腫、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、及び卵巣がんから選択される、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、がんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0134】
３．７ 任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、がんの治療に使用するためであって、がんが以下から選択される、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物：
（ａ）乳がん、胃腸管がん、膵外分泌がん、肺及び前立腺がんから選択される上皮由来の腫瘍；
（ｂ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、及び骨髄異形成症候群などのＢ細胞リンパ腫から選択される血液悪性腫瘍；
（ｃ）骨肉腫及び横紋筋肉腫から選択される間葉由来の腫瘍；
（ｄ）神経膠腫、神経膠芽腫及び上衣腫から選択される中枢又は末梢神経系の腫瘍；ならびに
（ｅ）髄芽腫及び神経芽細胞腫から選択される小児腫瘍及び胎児性腫瘍。
（ａ）乳がん、胃腸管がん、膵外分泌がん、肺及び前立腺がんから選択される上皮由来の腫瘍；
（ｂ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、及び骨髄異形成症候群などのＢ細胞リンパ腫から選択される血液悪性腫瘍；
（ｃ）骨肉腫及び横紋筋肉腫から選択される間葉由来の腫瘍；
（ｄ）神経膠腫、神経膠芽腫及び上衣腫から選択される中枢又は末梢神経系の腫瘍；ならびに
（ｅ）髄芽腫及び神経芽細胞腫から選択される小児腫瘍及び胎児性腫瘍。
【0135】
３．８ がんが、ＰＬＫ１が関係している（例えば、ＰＬＫ１が過剰発現される）ものである、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、がんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0136】
３．９ がんが、態様３．４～３．７のいずれか１つで定義された通りである、態様３．８に記載の使用のための、酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0137】
３．１０ がんが、ＰＬＫ４が関係している（例えば、ＰＬＫ４が過剰発現される）ものである、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、がんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0138】
３．１１ がんが、態様３．４～３．７のいずれか１つで定義された通りである、態様３．１０に記載の使用のための、酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0139】
３．１２ がんが、ｐ５３欠損又はＴＰ５３遺伝子の変異を特徴とするものである、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、がんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0140】
３．１３ がんが、態様３．４～３．７のいずれか１つで定義された通りである、態様３．１２に記載の使用のための、酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0141】
３．１４ がんが、ＫＲＡＳの変異形態の存在を特徴とするものである、がんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0142】
３．１５ ＫＲＡＳの変異形態が、グリシン１２、グリシン１３、グルタミン６１、及びそれらの組み合わせから選択されるタンパク質中のアミノ酸に変異を有するものである、態様３．１４に記載の使用のための、酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0143】
３．１６ がんが、態様３．４～３．７のいずれか１つで定義された通りである、態様３．１４又は３．１５に記載の使用のための、酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0144】
３．１７ 任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、医薬品又は療法に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0145】
３．１８ ＫＲＡＳタンパク質の異常発現を特徴とする病状及び状態の予防又は治療において、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0146】
３．１９ 抗がん剤として使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0147】
３．２０ 態様３．４～３．１６のいずれか１つで定義されるがんに罹患している対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物対象）を治療する方法であって、任意に別の治療薬又は治療（例えば、抗がん剤又は療法）と組み合わせて、治療有効量の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【0148】
３．２１ 態様３．１～３．９のいずれか１つで定義される使用のために医薬品を製造するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物の使用。
【0149】
３．２２ ＰＬＫ１－ＰＢＤを阻害する方法であって、有効な阻害量の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物をＰＬＫ１－ＰＢＤと接触させることを含む、方法。
【0150】
３．２３ ＰＬＫ４－ＰＢＤを阻害する方法であって、有効な阻害量の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物をＰＬＫ４－ＰＢＤと接触させることを含む、方法。
【0151】
３．２４ ＰＬＫ１－ＰＢＤ及びＰＬＫ４－ＰＢＤを阻害する方法であって、有効な阻害量の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物をＰＬＫ１－ＰＢＤ及びＰＬＫ４－ＰＢＤと接触させることを含む、方法。
【0152】
３．２５ 有効な阻害量の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を、インビボで、例えばヒト対象などの哺乳動物対象において、ＰＬＫ１－ＰＢＤ及び／又はＰＬＫ４－ＰＢＤと接触させる、態様３．２２～３．２４のいずれか１つに記載の方法。
【0153】
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物の投与の前に、患者をスクリーニングして、患者が罹患している又は罹患している可能性のあるがんがＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４キナーゼレベルの上昇を特徴として、その結果ＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４キナーゼに対する活性を有する化合物による治療に感受性があるがんであるかどうかを判定し得る。
【0154】
例えば、患者から採取した生体サンプルを分析して、患者が罹患している又は罹患している可能性があるがんがＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４キナーゼのアップレギュレーションをもたらす遺伝的異常又は異常なタンパク質発現を特徴とするがんであるかどうかを判定し得る。アップレギュレーションという用語には、遺伝子増幅（すなわち、複数の遺伝子コピー）を含む発現又は過剰発現の上昇、転写効果による発現増加、ならびに変異による活性化を含む多動性及び活性化が含まれる。したがって、患者は、ＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４キナーゼのアップレギュレーションに特徴的なマーカーを検出するための診断試験に供してもよい。診断という用語にはスクリーニングが含まれる。マーカーには、例えば、ＰＬＫ１の変異を特定するためのＤＮＡ組成の測定などの遺伝子マーカーが含まれる。マーカーという用語には、酵素活性、酵素レベル、酵素状態（例えば、リン酸化又は非リン酸化）及び前述のタンパク質のｍＲＮＡレベルを含むＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４のアップレギュレーションに特徴的なマーカーも含まれる。
【0155】
ＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４キナーゼのアップレギュレーションを伴う腫瘍は、ＰＬＫ１阻害剤に特に敏感になり得る。ＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４のアップレギュレーションについて腫瘍を優先的にスクリーニングし得る。したがって、患者は、ＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４のアップレギュレーションに特徴的なマーカーを検出するための診断試験に供してもよい。典型的には、診断試験は、腫瘍生検サンプル、血液サンプル（腫瘍細胞の分離及び濃縮）、便生検、染色体分析、胸水、ならびに腹水から選択された生体サンプルで行われる。
【0156】
変異の同定及び分析ならびにタンパク質のアップレギュレーションの方法は、当業者に既知である。スクリーニング方法には、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）又はインサイチュハイブリダイゼーションなどの標準的な方法が含まれるが、これらに限定されない。
【0157】
ＲＴ－ＰＣＲによるスクリーニングでは、ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作成し、続いてＰＣＲでｃＤＮＡを増幅することにより、腫瘍内のｍＲＮＡのレベルを評価する。ＰＣＲ増幅の方法、プライマーの選択、及び増幅条件は、当業者に既知である。核酸操作及びＰＣＲは、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，ｏｒ Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ－ａｌ．，ｅｄｓ．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏに記載されている標準的な方法で実施される。核酸技術を伴う反応及び操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，３ｒｄ Ｅｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓにも記載されている。あるいは、市販のＲＴ－ＰＣＲ用キット（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、又は米国特許第４，６６６，８２８号；同４，６８３，２０２号；同４，８０１，５３１号；同５，１９２，６５９号、同５，２７２，０５７号、同５，８８２，８６４号、及び同６，２１８，５２９号に記載の方法論を使用してもよく、参照により本明細書に組み込まれる。
【0158】
ｍＲＮＡ発現を評価するためのインサイチュハイブリダイゼーション技術の例は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である（Ａｎｇｅｒｅｒ，１９８７ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６４９を参照）。
【0159】
一般に、インサイチュハイブリダイゼーションは、以下の主要なステップを含む：（１）分析する組織の固定ステップ；（２）標的核酸のアクセシビリティを高め、非特異的結合を減らすためのサンプルのプレハイブリダイゼーション処理ステップ；（３）生物学的構造又は組織内の核酸への核酸混合物のハイブリダイゼーションステップ；（４）ハイブリダイゼーションで結合していない核酸断片を除去するためのハイブリダイゼーション後洗浄ステップ；及び（５）ハイブリダイズした核酸断片の検出ステップ。そのような用途で使用されるプローブは、典型的には、例えば放射性同位体又は蛍光レポーターで標識されている。好ましいプローブは、過酷な条件下で標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、例えば約５０、１００、又は２００ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチド以上である。ＦＩＳＨを実施するための標準的な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｓ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄ．；ＩＳＢＮ：１－５９２５９－７６０－２；Ｍａｒｃｈ ２００４，ｐｐｓ．０７７－０８８；Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅに記載されている。
【0160】
あるいは、ｍＲＮＡから発現したタンパク質生成物は、腫瘍サンプルの免疫組織化学、マイクロタイタープレートを用いた固相イムノアッセイ、ウエスタンブロッティング、２次元ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、及び特定のタンパク質を検出するための当技術分野で既知の他の方法でアッセイされ得る。検出方法には、部位特異的抗体の使用が含まれる。当業者は、ＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４キナーゼのアップレギュレーションの検出のためのそのようなすべての周知の技術が本事例に適用可能であることを認識するであろう。
【0161】
あるいは、又は加えて、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物の投与の前に、患者をスクリーニングして、患者が罹患している又は罹患している可能性のあるがんが変異ＫＲＡＳを特徴として、その結果変異体ＫＲＡＳを保有するがん細胞に対して活性を有する化合物による治療に感受性があるがんであるかどうかを判定し得る。
【0162】
例えば、患者から採取された生体試料を分析して、患者が罹患している、又は罹患している可能性のあるがんが変異体ＫＲＡＳの存在を特徴とするものであるかどうかを判定し得る。したがって、例えば、患者はＫＲＡＳタンパク質のコドン１２、１３、６１、又はそれらの混合物における変異を検出するために診断試験に供してもよい。変異体ＫＲＡＳの市販の診断試験には、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃからのｃｏｂａｓ（登録商標）ＫＲＡＳ変異試験及びＱｉａｇｅｎ Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｌｔｄからのｔｈｅｒａｓｃｒｅｅｎ ＫＲＡＳ ＲＧＱ ＰＣＲキットが含まれる。
【0163】
変異体ＫＲＡＳを有する腫瘍は、ＰＬＫ１及び／又はＰＬＫ４阻害剤に特に敏感であり得る。変異の同定及び分析ならびにタンパク質のアップレギュレーションの方法は、当業者に既知である。スクリーニング方法には、上記のように、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）又はインサイチュハイブリダイゼーションなどの標準的な方法が含まれるが、これらに限定されない。
【0164】
したがって、さらなる態様（態様３．２６～３．３４）では、本発明は、以下を提供する：
【0165】
３．２６ スクリーニングされ、ＰＬＫ１キナーゼ（例えばＰＬＫ１過剰発現）のレベルの上昇を特徴とするがんに罹患していると判定された対象（例えば、ヒト対象）のがんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0166】
３．２７ スクリーニングされ、ＰＬＫ４キナーゼ（例えばＰＬＫ４過剰発現）のレベルの上昇を特徴とするがんに罹患していると判定された対象（例えば、ヒト対象）のがんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0167】
３．２８ スクリーニングされ、ＰＬＫ１キナーゼ及びＰＬＫ４キナーゼ（例えばＰＬＫ１及びＰＬＫ４過剰発現）のレベルの上昇を特徴とするがんに罹患していると判定された対象（例えば、ヒト対象）のがんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0168】
３．２９ スクリーニングされ、ＫＲＡＳに対する活性を有する化合物による治療に感受性のある疾患もしくは状態に罹患している、又は罹患するリスクがあると判定された対象（例えば、ヒト対象）のがんの治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0169】
３．３０ スクリーニングされ、変異ＫＲＡＳを特徴とする、及び変異体ＫＲＡＳを保有するがん細胞に対する活性を有する化合物による治療に感受性のあるがんに罹患していると判定された対象（例えば、ヒト対象）の治療に使用するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0170】
３．３１ がんが、態様３．４～３．１６のいずれか１つで定義されるがんである、態様３．２６～３．３０のいずれか１つに記載の使用のための酒石酸塩、又は物質の組成物。
【0171】
３．３２ 態様３．２６～３．３１のいずれか１つで定義される使用のために医薬品を製造するための、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物の使用。
【0172】
３．３３ ＫＲＡＳの変異形態の存在を特徴とする病状又は状態（例えば、がん、例えば、態様３．４～３．１６のいずれか１つで定義されるがん）を診断及び治療する方法であって、（ｉ）対象（例えばヒト対象）をスクリーニングして、対象が罹患している又は罹患している可能性のある疾患又は状態が、ＫＲＡＳに対して活性を有する化合物による治療に感受性があるものであるかどうかを判定すること；及び（ｉｉ）対象がこのように感受性のある疾患又は状態であることが示された場合、その後、治療有効量の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【0173】
３．３４ ＫＲＡＳの変異形態の存在を特徴とする病状又は状態（例えば、がん、例えば、態様３．４～３．１６のいずれか１つで定義されるがん）を治療する方法であって、スクリーニングされ、ＫＲＡＳに対して活性を有する化合物による治療に感受性のある疾患もしくは状態に罹患している、又は罹患するリスクがあると判定された対象（例えばヒト対象）に、治療有効量の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を投与することを含む、方法。
【0174】
医薬製剤
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物は、典型的には、医薬組成物の形態で患者に投与される。したがって、本発明の別の態様（態様４．１）では、本発明は、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物は、典型的には、医薬組成物の形態で患者に投与される。したがって、本発明の別の態様（態様４．１）では、本発明は、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0175】
さらなる態様では、以下が提供される：
【0176】
４．２ 約１％（ｗ／ｗ）～約９５％（ｗ／ｗ）の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、９９％（ｗ／ｗ）～５％（ｗ／ｗ）の薬学的に許容される賦形剤又は賦形剤の組み合わせと、任意に１つ以上のさらなる治療活性成分とを含む、態様４．１に記載の医薬組成物。
【0177】
４．３ 約５％（ｗ／ｗ）～約９０％（ｗ／ｗ）の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、９５％（ｗ／ｗ）～１０％の薬学的賦形剤又は賦形剤の組み合わせと、任意に１つ以上のさらなる治療活性成分とを含む、態様４．２に記載の医薬組成物。
【0178】
４．４ 約１０％（ｗ／ｗ）～約９０％（ｗ／ｗ）の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、９０％（ｗ／ｗ）～１０％の薬学的賦形剤又は賦形剤の組み合わせとを含む、態様３．３に記載の医薬組成物。
【0179】
４．５ 約２０％（ｗ／ｗ）～約９０％（ｗ／ｗ）の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、８０％（ｗ／ｗ）～１０％の薬学的賦形剤又は賦形剤の組み合わせとを含む、態様４．４に記載の医薬組成物。
【0180】
４．６ 約２５％（ｗ／ｗ）～約８０％（ｗ／ｗ）の態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、７５％（ｗ／ｗ）～２０％の薬学的賦形剤又は賦形剤の組み合わせとを含む、態様３．５に記載の医薬組成物。
【0181】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口、局所、鼻腔内、気管支内、眼科、耳、直腸、膣内、又は経皮投与に好適な任意の形態であり得る。組成物が非経口投与を目的とする場合、それらは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下投与用に、又は注射、注入、もしくは他の送達手段による標的器官もしくは組織への直接送達用に処方することができる。
【0182】
経口投与に好適な医薬剤形には、錠剤、カプセル、カプレット、丸薬、ロゼンジ、シロップ、溶液、スプレー、粉末、顆粒、エリキシル及び懸濁液、舌下錠、スプレー、ウエハース又はパッチ、ならびに頬パッチが含まれる。
【0183】
したがって、さらなる態様では、本発明は以下を提供する：
【0184】
４．７ 経口投与に適している、態様４．１～４．６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【0185】
４．８ 錠剤、カプセル、カプレット、丸薬、ロゼンジ、シロップ、溶液、スプレー、粉末、顆粒、エリキシル及び懸濁液、舌下錠、スプレー、ウエハース又はパッチ、ならびに頬パッチから選択される、態様４．７に記載の医薬組成物。
【0186】
４．９ 錠剤及びカプセルから選択される、態様４．８に記載の医薬組成物。
【0187】
４．１０ 非経口投与に適している、態様４．１～４．６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【0188】
４．１１ 静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下投与用に、又は注射、注入、もしくは他の送達手段による標的器官もしくは組織への直接送達用に処方される、態様４．１０に記載の医薬組成物。
【0189】
４．１２ 注射又は注入のための溶液又は懸濁液である、態様４．１１に記載の医薬組成物。
【0190】
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を含有する医薬組成物（例えば、態様４．１～４．１２のいずれか１つで定義される）は、既知の技術に従って処方することができ、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡを参照されたい。
【0191】
したがって、錠剤組成物（態様４．９）は、糖もしくは糖アルコールなどの不活性希釈剤又は担体、例えばラクトース、スクロース、ソルビトール、もしくはマンニトール；ならびに／又は炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、タルク、炭酸カルシウムなどの非糖由来希釈剤、もしくはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロースもしくはその誘導体、及びコーンスターチなどのデンプンとともに活性化合物の単位用量を含有することができる。錠剤は、ポリビニルピロリドンなどの結合剤及び造粒剤、崩壊剤（例えば、架橋カルボキシメチルセルロースなどの膨潤性架橋ポリマー）、潤滑剤（例えば、ステアラート）、防腐剤（例えば、パラベン）、酸化防止剤（例えば、ＢＨＴ）、緩衝剤（例えば、ホスファート又はシトラート緩衝液）、ならびにシトラート／ビカルボナート混合物などの発泡剤も含有し得る。そのような賦形剤は周知であり、ここで詳細に議論する必要はない。
【0192】
カプセル製剤（態様４．９）は、硬ゼラチン又は軟ゼラチンの種類のものであってもよく、固体、半固体、又は液体形態の活性成分を含有することができる。ゼラチンカプセルは、動物ゼラチンもしくはその合成物又は植物由来の同等物から形成することができる。
【0193】
固体剤形（例えば；錠剤、カプセルなど）はコーティングされていてもコーティングされていなくてもよいが、典型的にはコーティング、例えば保護フィルムコーティング（例えば、ワックスもしくはワニス）又は放出制御コーティングを有する。コーティング（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）タイプのポリマー）は、胃腸管内の所望の位置で活性成分を放出するように設計することができる。したがって、コーティングは、胃腸管内の特定のｐＨ条件下で分解し、それにより胃又は回腸もしくは十二指腸内で物質の組成物又はアトロプ異性体を選択的に放出するように選択することができる。
【0194】
コーティングの代わりに、又はそれに加えて、薬物は、放出制御剤、例えば、胃腸管内で酸性又はアルカリ性が変化する条件下で物質の組成物又はアトロプ異性体を選択的に放出するように適合され得る放出遅延剤を含む固体マトリックスで提示することができる。あるいは、マトリックス材料又は放出遅延コーティングは、剤形が胃腸管を通過するときに実質的に連続して侵食される侵食性ポリマー（例えば、無水マレイン酸ポリマー）の形態をとることができる。
【0195】
局所使用のための組成物には、軟膏、クリーム、スプレー、パッチ、ゲル、液滴、及び挿入物（例えば、眼内挿入物）が含まれる。そのような組成物は、既知の方法に従って処方することができる。
【0196】
非経口投与用の組成物（態様４．１０～４．１２）は、典型的には、滅菌水溶液もしくは油性溶液もしくは微細懸濁液として提供され、又は注射用滅菌水で即座に補うための微粉化滅菌粉末形態で提供され得る。
【0197】
直腸又は膣内投与用の製剤の例には、例えば、活性化合物を含有する成形された塑造可能な又はワックス状の材料から形成され得るペッサリー及び坐剤が含まれる。
【0198】
吸入による投与のための組成物は、吸入可能な粉末組成物又は液体もしくは粉末スプレーの形態をとってもよく、粉末吸入器又はエアロゾル分配装置を使用して標準形態で投与することができる。そのような装置は周知である。吸入による投与の場合、粉末製剤は、典型的には、ラクトースなどの不活性固体粉末希釈剤とともに活性化合物を含む。
【0199】
医薬組成物は、一般に、単位剤形で提供され、それ自体、典型的には所望のレベルの生物活性を提供するのに十分な化合物を含有する。例えば、態様４．１～４．９のいずれか１つに記載）、経口投与を意図した組成物は、２ミリグラム～２００ミリグラム、より一般的には１０ミリグラム～１００ミリグラム、例えば１２．５ミリグラム、２５ミリグラム、及び５０ミリグラムの活性成分を含有してもよい。
【0200】
ポソロジー
活性化合物（態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物）は、それを必要とする患者（例えば、ヒト又は動物の患者）に、所望の治療効果、例えば上記の態様３．１～３．３４に記載の効果を達成するのに十分な量で投与される。
活性化合物（態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物）は、それを必要とする患者（例えば、ヒト又は動物の患者）に、所望の治療効果、例えば上記の態様３．１～３．３４に記載の効果を達成するのに十分な量で投与される。
【0201】
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物は、一般に、そのような投与を必要とする対象、例えばヒト又は動物の患者、好ましくはヒトに投与される。
【0202】
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物は、典型的には、治療的又は予防的に有用であり、一般に無毒である量で投与される。しかしながら、特定の状況では、本発明の化合物を投与する利点は、毒性効果又は副作用の欠点を上回る場合があり、その場合、ある程度の毒性に関連する量で化合物を投与することが望ましいと考えられる場合がある。
【0203】
一態様では、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物の典型的な１日用量は、体重１キログラムあたり０．０２５ミリグラム～５ミリグラム、例えば体重１キログラムあたり最大３ミリグラム、より典型的には体重１キログラムあたり０．１５ミリグラム～５ミリグラムの範囲であり得るが、必要に応じて、高用量又は低用量を投与してもよい。
【0204】
別の態様では、態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物の典型的な１日用量は、体重１キログラムあたり０．０２５ミリグラム～５０ミリグラム、例えば体重１キログラムあたり最大３０ミリグラム、より典型的には体重１キログラムあたり０．１５ミリグラム～５０ミリグラム（例えば、１キログラムあたり０．５ミリグラムから３０ミリグラム）の範囲であり得るが、必要に応じて、高用量又は低用量を投与してもよい。
【0205】
例として、本発明の一態様では、１２．５ｍｇの初期開始用量は、１日２～３回投与され得る。投与量は、医師が判定したように、個人の最大耐量及び有効用量に達するまで、３～５日ごとに１日１２．５ｍｇずつ増やすことができる。
【0206】
本発明の別の態様では、週１回の投与スケジュールは、第１週に０．５～１．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ）の初期開始用量、続いて第２週以降に、対象に対する治療効果及び忍容性に合わせ最大投与量まで用量を漸増（例えば、３回、４回又は５回までの用量漸増のために以前の用量を２回又は３回）することによって構成することができる。例えば、第１週に、１ｍｇ／ｋｇの開始用量を投与し、続いて第２週に３ｍｇ／ｋｇ、第３週に９ｍｇ／ｋｇ及び第４週に２７ｍｇ／ｋｇの用量に増加させてもよい。
【0207】
最終的に、投与される化合物の量は、治療される疾患又は生理学的状態の性質、ならびに所与の投与計画によってもたらされる治療効果及び副作用の有無に見合ったものとなり、医師の裁量になる。
【0208】
併用療法
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物は、単独の化学療法剤として、又はより一般的には、化学療法剤との併用療法もしくは様々な増殖性病状もしくは状態の予防もしくは治療における放射線療法のいずれかとして有用であると考えられる。そのような病状及び状態の例は上記に示されている。
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物は、単独の化学療法剤として、又はより一般的には、化学療法剤との併用療法もしくは様々な増殖性病状もしくは状態の予防もしくは治療における放射線療法のいずれかとして有用であると考えられる。そのような病状及び状態の例は上記に示されている。
【0209】
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と同時投与され得る化学療法剤又は他の治療の特定の例は以下を含む：
・トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン）
・代謝拮抗剤：（例えば、シタラビン又はゲムシタビン）
・チューブリンターゲティング剤（例えば、パクリタキセル）
・ＤＮＡバインダー及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤
・ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ又はアファチニブ）
・ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、エベロリムス）
・ＰＩ３Ｋ経路阻害剤（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１）
・Ａｋｔ阻害剤
・アルキル化剤（例えば、テモゾロミド）
・モノクローナル抗体。
・アンチホルモン
・シグナル伝達阻害剤
・プロテアソーム阻害剤
・ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤
・サイトカイン及びレチノイド
・低酸素誘発ＤＮＡ損傷剤（例えば、チラパザミン）
・アロマターゼ阻害剤
・抗Ｈｅｒ２抗体（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｐｏ．ｉｎｔ／ｐｃｔｄｂ／ｅｎ／ｗｏ．ｊｓｐ？ｗｏ＝２００７０５６１１８を参照）
・抗ｃｄ２０抗体（例えば、リツキシマブ）
・血管新生の阻害剤
・ＨＤＡＣ阻害剤
・ＭＥＫ阻害剤
・Ｂ－Ｒａｆ阻害剤
・ＥＲＫ阻害剤
・ＨＥＲ２小分子阻害剤（例えば、ラパチニブ又はアファチニブ）
・Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ）
・ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）
・Ｍｐｓ１／ＴＴＫ阻害剤
・オーロラＢ阻害剤
・ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤
・ＩＤＨ１又はＩＤＨ２阻害剤
・ＢＲＤ４阻害剤
・テモゾロミド
・ＰＤ１、ＰＤＬ－１、及びＣＴＬＡ４を含むシグナル成分を遮断する免疫チェックポイントの阻害剤；ならびに
・Ｇ１２Ｃ（例えば、ソトラシブ）などの特定の変異に対するものを含むＫＲＡＳ遮断薬；
・Ｂｃｌ２阻害剤（例えば、ベネトクラックス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、サブトクラックス（ｓａｂｕｔｏｃｌａｘ）、又はオバトクラックス（ｏｂａｔｏｃｌａｘ））；ならびに
・放射線療法。
・トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン）
・代謝拮抗剤：（例えば、シタラビン又はゲムシタビン）
・チューブリンターゲティング剤（例えば、パクリタキセル）
・ＤＮＡバインダー及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤
・ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ又はアファチニブ）
・ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、エベロリムス）
・ＰＩ３Ｋ経路阻害剤（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１）
・Ａｋｔ阻害剤
・アルキル化剤（例えば、テモゾロミド）
・モノクローナル抗体。
・アンチホルモン
・シグナル伝達阻害剤
・プロテアソーム阻害剤
・ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤
・サイトカイン及びレチノイド
・低酸素誘発ＤＮＡ損傷剤（例えば、チラパザミン）
・アロマターゼ阻害剤
・抗Ｈｅｒ２抗体（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｐｏ．ｉｎｔ／ｐｃｔｄｂ／ｅｎ／ｗｏ．ｊｓｐ？ｗｏ＝２００７０５６１１８を参照）
・抗ｃｄ２０抗体（例えば、リツキシマブ）
・血管新生の阻害剤
・ＨＤＡＣ阻害剤
・ＭＥＫ阻害剤
・Ｂ－Ｒａｆ阻害剤
・ＥＲＫ阻害剤
・ＨＥＲ２小分子阻害剤（例えば、ラパチニブ又はアファチニブ）
・Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ）
・ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）
・Ｍｐｓ１／ＴＴＫ阻害剤
・オーロラＢ阻害剤
・ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤
・ＩＤＨ１又はＩＤＨ２阻害剤
・ＢＲＤ４阻害剤
・テモゾロミド
・ＰＤ１、ＰＤＬ－１、及びＣＴＬＡ４を含むシグナル成分を遮断する免疫チェックポイントの阻害剤；ならびに
・Ｇ１２Ｃ（例えば、ソトラシブ）などの特定の変異に対するものを含むＫＲＡＳ遮断薬；
・Ｂｃｌ２阻害剤（例えば、ベネトクラックス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、サブトクラックス（ｓａｂｕｔｏｃｌａｘ）、又はオバトクラックス（ｏｂａｔｏｃｌａｘ））；ならびに
・放射線療法。
【0210】
態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と同時投与され得る化学療法剤又は他の治療の好ましい例は以下から選択され得る：
・トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン）
・代謝拮抗剤：（例えば、シタラビン又はゲムシタビン）
・チューブリンターゲティング剤（例えば、パクリタキセル）
・ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ又はアファチニブ）
・ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、エベロリムス）
・アルキル化剤（例えば、テモゾロミド）
・抗ｃｄ２０抗体（例えば、リツキシマブ）
・ＰＤ１、ＰＤＬ－１、及びＣＴＬＡ４を含むシグナル成分を遮断する免疫チェックポイントの阻害剤；ならびに
・Ｇ１２Ｃ（例えば、ソトラシブ）などの特定の変異に対するものを含むＫＲＡＳ遮断薬；
・Ｂｃｌ２阻害剤（例えば、ベネトクラックス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、サブトクラックス（ｓａｂｕｔｏｃｌａｘ）、又はオバトクラックス（ｏｂａｔｏｃｌａｘ））；ならびに
・放射線療法。
・トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン）
・代謝拮抗剤：（例えば、シタラビン又はゲムシタビン）
・チューブリンターゲティング剤（例えば、パクリタキセル）
・ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ又はアファチニブ）
・ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、エベロリムス）
・アルキル化剤（例えば、テモゾロミド）
・抗ｃｄ２０抗体（例えば、リツキシマブ）
・ＰＤ１、ＰＤＬ－１、及びＣＴＬＡ４を含むシグナル成分を遮断する免疫チェックポイントの阻害剤；ならびに
・Ｇ１２Ｃ（例えば、ソトラシブ）などの特定の変異に対するものを含むＫＲＡＳ遮断薬；
・Ｂｃｌ２阻害剤（例えば、ベネトクラックス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、サブトクラックス（ｓａｂｕｔｏｃｌａｘ）、又はオバトクラックス（ｏｂａｔｏｃｌａｘ））；ならびに
・放射線療法。
【0211】
したがって、さらなる態様では、本発明は以下を提供する：
【0212】
５．１ 態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、別の治療活性剤とを含む医薬組み合わせ。
【0213】
５．２ 前記別の治療薬が上に列挙される特定及び好ましい化学療法剤から選択される、態様５．１に記載の医薬組み合わせ。
【0214】
５．３ 前記別の治療薬が抗がん剤である、態様５．１に記載の医薬組み合わせ。
【0215】
５．４ 態様１．１～１．１９のいずれか１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物及び前記別の治療活性剤が、単一の医薬組成物又は患者パックで提供される、態様５．１～５．３のいずれか１つに記載の医薬組み合わせ。
【0216】
５．５ 態様１．１～１．１９のいずれかに１つに記載の酒石酸塩、又は物質の組成物と、別の治療活性剤と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【0217】
５．６ がんに罹患している対象の治療方法であって、治療有効量の態様５．１～５．５のいずれか１つに記載の医薬組み合わせを対象に投与することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【0218】
【図1】アトロプ異性体のＲ／Ｓ分類系を示す概略図である。
【図2】単結晶Ｘ線結晶学的研究により決定された４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）－フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）－エチル］ベンズアミドのアトロプ異性体Ａ－２の三次元構造の描写である。
【図3】２つのアトロプ異性体Ａ－１（Ｓ）及びＡ－２（Ｒ）の概略立体化学図、ならびにＣａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－Ｐｒｅｌｏｇ（ＣＩＰ）配列規則を使用してそれらの立体化学構造を割り当てるための基礎である。
【図4】アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図5】アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＡ塩（底部の線）及びパターンＢ塩（上部及び中央の線）の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図6】アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基の熱プロファイルを示し、示差走査熱量測定プロット（線６Ａ）及び熱重量分析プロット（線６Ｂ）を示す。
【図7】アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＡ塩の熱プロファイルを示し、示差走査熱量測定プロット（線７Ａ）及び熱重量分析プロット（線７Ｂ）を示す。
【図8】アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩の熱プロファイルを示し、示差走査熱量測定プロット（線８Ａ）及び熱重量分析プロット（線８Ｂ）を示す。
【図9】アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩に対して実施された重量法蒸気収着研究における重量変化対相対湿度のプロットである。
【図10】０．０３μＭ濃度のアトロプ異性体Ａ－１又はアトロプ異性体Ａ－２のいずれかでＵ８７ＭＧ細胞を処理した後に観察された異なる有糸分裂表現型（非会合染色体、多極紡錘体／異常な細胞質分裂、単極紡錘体、正常な前中期、後に生成される正常な中期）の割合を示す棒グラフである。
【図11】０．０２μＭ濃度のアトロプ異性体Ａ－１又はアトロプ異性体Ａ－２のいずれかで処理した後のＨｅＬａ細胞に存在する中心小体の数を示す棒グラフである。
【図12】アトロプ異性体Ａ－２のマウスへの経口及びｉ．ｖ．投与後の時間に対する血漿濃度のプロットである。２４時間まで伸びる下側の線は、２ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与の線である。他方の線は、１０ｍｇ／ｋｇのｐ．ｏ．投与についてである。
【図13】アトロプ異性体Ａ－２のマウスへの経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ）後の時間に対する血漿及び脳濃度のプロットである。上側の線は脳濃度を示し、下側の線は血漿濃度を示す。
【図14】アトロプ異性体Ａ－２の投与後のＵ８７ＭＧ皮下異種移植モデルの雄性無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積対時間のプロットである。
【図15】アトロプ異性体Ａ－２の投与後のＵ８７－Ｌｕｃ同所異種移植モデルの雄性無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍の増殖に関連する生物発光シグナルのグラフ比較である。
【図16】アトロプ異性体Ａ－２の投与後のＨＣＴ１１６皮下異種移植モデルの雄性無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積対時間のプロットである。
【0219】
例
ここで、以下の例に記載される特定の態様を参照することにより、本発明を例示するが、これらに限定するものではない。
ここで、以下の例に記載される特定の態様を参照することにより、本発明を例示するが、これらに限定するものではない。
【0220】
プロトン磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、特に明記しない限り、２７℃でジメチルスルホキシド－ｄ６（ＤＭＳＯ－ｄ６）又はメタノール－ｄ４（ＭｅＯＨ－ｄ４）（示されているように）において４００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ ４００機器で記録され、以下のように報告される：化学シフトδ／ｐｐｍ（多重度ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｄｄ＝ダブルダブレット、ｄｔ－ダブルトリプレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット、ｂｒ＝ブロード、プロトンの数）。残留プロトン性溶媒を内部参照として使用した。
【0221】
液体クロマトグラフィー及び質量分析は、以下に示すシステム及び動作条件を使用して実施した。異なる同位体を有する原子が存在し、単一の質量が引用されている場合、化合物に引用されている質量はモノアイソトピック質量（つまり、３５Ｃｌ；７９Ｂｒなど）である。
【0222】
ＬＣＭＳ条件
以下の例で示されるＬＣＭＳデータは、以下に記載されている方法のうちの１つを使用して得られた。
以下の例で示されるＬＣＭＳデータは、以下に記載されている方法のうちの１つを使用して得られた。
【0223】
ＬＣＭＳ法１
ＬＣＭＳは、ＰＤＡフォトダイオードアレイ検出器及びＱＤａ質量検出器を備えたＵＰＬＣ ＡＱＵＩＴＹで実施した。使用したカラムは、Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．９μｍであった。カラム流量は１．２ｍＬ／分であり、使用した移動相は、（Ａ）ＭｉｌｌｉＱ水中の０．１％ギ酸（ｐＨ＝２．７０）（Ｂ）水：アセトニトリル（１０：９０）中の０．１％ギ酸、注入量は４～７μＬであった。サンプルをメタノール：アセトニトリル中で調製して、約２５０ｐｐｍの濃度を達成した。
ＬＣＭＳは、ＰＤＡフォトダイオードアレイ検出器及びＱＤａ質量検出器を備えたＵＰＬＣ ＡＱＵＩＴＹで実施した。使用したカラムは、Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．９μｍであった。カラム流量は１．２ｍＬ／分であり、使用した移動相は、（Ａ）ＭｉｌｌｉＱ水中の０．１％ギ酸（ｐＨ＝２．７０）（Ｂ）水：アセトニトリル（１０：９０）中の０．１％ギ酸、注入量は４～７μＬであった。サンプルをメタノール：アセトニトリル中で調製して、約２５０ｐｐｍの濃度を達成した。
【0224】
溶出には以下の勾配を使用した：
【表1】
【0225】
質量パラメーター
プローブ：ＥＳＩキャピラリー
供給源温度：１２０℃
プローブ温度：６００℃
キャピラリー電圧：０．８ＫＶ（＋Ｖｅ及び－Ｖｅ）
コーン電圧：１０＆３０Ｖ
イオン化のモード：正及び負
プローブ：ＥＳＩキャピラリー
供給源温度：１２０℃
プローブ温度：６００℃
キャピラリー電圧：０．８ＫＶ（＋Ｖｅ及び－Ｖｅ）
コーン電圧：１０＆３０Ｖ
イオン化のモード：正及び負
【0226】
ＨＰＬＣ分析
報告されるＨＰＬＣデータは、以下の方法を用いて得られた。
報告されるＨＰＬＣデータは、以下の方法を用いて得られた。
【0227】
ＨＰＬＣ法１
ＨＰＬＣ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００／１２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＡＣＥ ３ Ｃ１８、１５０×４．６ｍｍ、粒径３．０μｍ（例：Ｈｉｃｈｒｏｍ、品番：ＡＣＥ－１１１－１５４６）であった。流量は１．０ｍＬ／分であった。移動相Ａは水：トリフルオロ酢酸（１００：０．１％）、移動相Ｂはアセトニトリル：トリフルオロ酢酸（１００：０．１％）であった。注入量は５μＬであり、以下の勾配を使用した：
ＨＰＬＣ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００／１２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＡＣＥ ３ Ｃ１８、１５０×４．６ｍｍ、粒径３．０μｍ（例：Ｈｉｃｈｒｏｍ、品番：ＡＣＥ－１１１－１５４６）であった。流量は１．０ｍＬ／分であった。移動相Ａは水：トリフルオロ酢酸（１００：０．１％）、移動相Ｂはアセトニトリル：トリフルオロ酢酸（１００：０．１％）であった。注入量は５μＬであり、以下の勾配を使用した：
【表2】
【0228】
キラルＨＰＬＣ分析
報告されるキラルＨＰＬＣデータは、以下に記載されている方法のうちの１つを使用して得られた。
報告されるキラルＨＰＬＣデータは、以下に記載されている方法のうちの１つを使用して得られた。
【0229】
キラルＨＰＬＣ法１
キラルＨＰＬＣは分析であり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＣＨＩＲＡＬ ＰＡＫ ＩＧ、２５０×４．６ｍｍ、５μｍであった。カラム流量は１．０ｍＬ／分であり、移動相は：（Ａ）ｎ－ヘプタン中の０．１％ｖ／ｖ ＤＥＡ及び（Ｂ）ＩＰＡ：ＭｅＯＨ（７０：３０）であった。注入量は２５μＬであった。サンプルをＩＰＡ：ＭｅＯＨ中で調製して、約２５０ｐｐｍの濃度を達成し、以下のアイソクラティック法を用いた：
キラルＨＰＬＣは分析であり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＣＨＩＲＡＬ ＰＡＫ ＩＧ、２５０×４．６ｍｍ、５μｍであった。カラム流量は１．０ｍＬ／分であり、移動相は：（Ａ）ｎ－ヘプタン中の０．１％ｖ／ｖ ＤＥＡ及び（Ｂ）ＩＰＡ：ＭｅＯＨ（７０：３０）であった。注入量は２５μＬであった。サンプルをＩＰＡ：ＭｅＯＨ中で調製して、約２５０ｐｐｍの濃度を達成し、以下のアイソクラティック法を用いた：
【表3】
【0230】
キラルＨＰＬＣ法３
キラルＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＣＨＩＲＡＬ ＰＡＫ ＩＧ、２５０×４．６ｍｍ、５μｍであった。カラム流量は１．０ｍＬ／分であり、移動相は：（Ａ）ｎ－ヘプタン中の０．１％ｖ／ｖ ＤＥＡ及び（Ｂ）ＩＰＡ：ＭＥＯＨ（７０：３０）であった。注入量は１０μＬであった。サンプルをＩＰＡ：ＭｅＣＮ中で調製して、約２５０ｐｐｍの濃度を達成し、以下のアイソクラティック法を用いた：
キラルＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＣＨＩＲＡＬ ＰＡＫ ＩＧ、２５０×４．６ｍｍ、５μｍであった。カラム流量は１．０ｍＬ／分であり、移動相は：（Ａ）ｎ－ヘプタン中の０．１％ｖ／ｖ ＤＥＡ及び（Ｂ）ＩＰＡ：ＭＥＯＨ（７０：３０）であった。注入量は１０μＬであった。サンプルをＩＰＡ：ＭｅＣＮ中で調製して、約２５０ｐｐｍの濃度を達成し、以下のアイソクラティック法を用いた：
【表4】
【0231】
キラルＨＰＬＣ法４
以下のアイソクラティック法を使用することを除いてキラル法３と同一の条件：
以下のアイソクラティック法を使用することを除いてキラル法３と同一の条件：
【表5】
【0232】
キラルＨＰＬＣ法５
以下のアイソクラティック法を使用することを除いてキラル法３と同一の条件：
以下のアイソクラティック法を使用することを除いてキラル法３と同一の条件：
【表6】
【0233】
キラルＨＰＬＣ法６
キラルＨＰＬＣは分析であり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００／１２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ－Ｈ；２５０×４．６ｍｍ、５．０μｍであった。カラム流量は１．０ｍＬ／分であり、移動相はヘキサン：ＥｔＯＨ：ＴＦＡ（９０：１０：０．１％）であった。注入量は５μＬであった。サンプルを１００％ＥｔＯＨ中で調製して、約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度を達成した。
キラルＨＰＬＣは分析であり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００／１２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ－Ｈ；２５０×４．６ｍｍ、５．０μｍであった。カラム流量は１．０ｍＬ／分であり、移動相はヘキサン：ＥｔＯＨ：ＴＦＡ（９０：１０：０．１％）であった。注入量は５μＬであった。サンプルを１００％ＥｔＯＨ中で調製して、約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度を達成した。
【0234】
キラルＨＰＬＣ法７
キラルＨＰＬＣは分析であり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００／１２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＡ、２５０×４．６ｍｍ、５．０μｍであった。カラム流量は１．０ｍＬ／分であり、移動相はヘキサン：ＥｔＯＨ：エタノールアミン（９０：１０：０．１％）であった。注入量は５μＬであった。サンプルを１００％ＥｔＯＨ中で調製して、約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度を達成した。
キラルＨＰＬＣは分析であり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００／１２００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。使用したカラムは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＡ、２５０×４．６ｍｍ、５．０μｍであった。カラム流量は１．０ｍＬ／分であり、移動相はヘキサン：ＥｔＯＨ：エタノールアミン（９０：１０：０．１％）であった。注入量は５μＬであった。サンプルを１００％ＥｔＯＨ中で調製して、約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度を達成した。
【0235】
分取キラルＨＰＬＣ法：
アトロプ異性体を、以下の分取キラルＨＰＬＣ法のうちの１つを使用して単離した。
アトロプ異性体を、以下の分取キラルＨＰＬＣ法のうちの１つを使用して単離した。
【0236】
分取キラルＨＰＬＣ法１
分取キラルＨＰＬＣは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＧ ＳＦＣ、２１×２５０ｍｍ、５μｍカラムを使用し、（Ａ）ヘプタン中の０．１％ＤＥＡ及び（Ｂ）ＩＰＡを移動相として溶出し、流量３０ｍＬ／分及び以下のアイソクラティック系を用いて実施した：
分取キラルＨＰＬＣは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＧ ＳＦＣ、２１×２５０ｍｍ、５μｍカラムを使用し、（Ａ）ヘプタン中の０．１％ＤＥＡ及び（Ｂ）ＩＰＡを移動相として溶出し、流量３０ｍＬ／分及び以下のアイソクラティック系を用いて実施した：
【表7】
【0237】
分取キラルＨＰＬＣ法２
分取キラルＨＰＬＣは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＧ ＳＦＣカラム、２１×２５０ｍｍ、５μｍを使用し、（Ａ）ヘプタン中の０．１％ＤＥＡ及び（Ｂ）ＩＰＡ：ＭｅＯＨ（９０：１０）を移動相とし、流量２２ｍＬ／分で溶出して実施し、溶出には以下のアイソクラティック系を使用した：
分取キラルＨＰＬＣは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＧ ＳＦＣカラム、２１×２５０ｍｍ、５μｍを使用し、（Ａ）ヘプタン中の０．１％ＤＥＡ及び（Ｂ）ＩＰＡ：ＭｅＯＨ（９０：１０）を移動相とし、流量２２ｍＬ／分で溶出して実施し、溶出には以下のアイソクラティック系を使用した：
【表8】
【0238】
例１
（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド
（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド
【化6】
【0239】
表題化合物を、上記のスキーム１に示す合成経路のステップ１、２、３、４ｂ、及び５ｂに従って調製した。
【0240】
ステップ１：４－［４－（４－クロロフェニル）－４－オキソ－ブタノイル］ベンゾニトリル（６）
【化7】
【0241】
塩化亜鉛（３０．５ｇ、２２３ｍｍｏｌ）を真空下で融解するまで加熱し、次いで室温まで冷却した。トルエン（１００ｍＬ）、ｔｅｒｔ－ブタノール（１６．５ｍＬ、１７２ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（２４ｍＬ、１７２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で窒素雰囲気下で２時間撹拌し、その時点で塩化亜鉛は完全に溶解した。４－シアノアセトフェノン（２５ｇ、１７２ｍｍｏｌ）及び４－クロロフェナシルブロミド（４０．２ｇ、１７２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で４８時間撹拌した。次いで、反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、水（５×１００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発させた。得られた残渣を、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４００ｍＬ）を使用する粉砕により精製して、表題化合物（３０ｇ、１０１ｍｍｏｌ、５９％）を得た。
【0242】
ステップ２：４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）ベンゾニトリル（７）
【化8】
【0243】
４－（４－（４－クロロフェニル）－４－オキソブタノイル）ベンゾニトリル（３０ｇ、１０１ｍｍｏｌ）、２－トリフルオロメチルアニリン（４８．７９ｇ、３０３ｍｍｏｌ）、及びｐ－トルエンスルホン酸（１．９２ｇ、１０．０９９ｍｍｏｌ）のジオキサン（３００ｍＬ）中撹拌溶液を、１５０℃で１６時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を、溶離剤として８％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカゲル（６０～１２０メッシュ）のカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（３０ｇ、７１ｍｍｏｌ、７０％）を得た。
【0244】
ステップ３：４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（８）
【化9】
【0245】
４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）ベンゾニトリル（２ｇ、４．７３９ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）中溶液に、水（１０ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（１．８９ｇ、４７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を９０℃で２４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）を使用することによる粉砕により精製して、表題化合物（１．８ｇ、４．１ｍｍｏｌ、８６％）を得た。
【0246】
ステップ４ｂ：４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）－Ｎ－（２－（ジメチルアミノ）エチル）ベンズアミド（９）
【化10】
【0247】
４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（１．８ｇ、４．０ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１２ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．１３ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）、続いて（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム－３－オキシドヘキサフルオロホスファート）（ＨＡＴＵ）（４．６５ｇ、１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、続いてＮ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミン（１．０８ｇ、１２ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌を室温で４時間続けた。次いで、混合物を氷冷水（１５０ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。得られた残渣を、６％メタノール／ジクロロメタンで溶出する中性アルミナのカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（１．２ｇ、２．３ｍｍｏｌ、５７％）をアトロプ異性体の混合物として得た。
【0248】
ステップ５ｂ：アトロプ異性体の分離
４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドのアトロプ異性体は、分取キラルＨＰＬＣ法１を使用するキラルＨＰＬＣにより分割した。
４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドのアトロプ異性体は、分取キラルＨＰＬＣ法１を使用するキラルＨＰＬＣにより分割した。
【0249】
２つのピークを単離した：
ピーク１：例Ａ－１、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドーアトロプ異性体１（０．３ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、３８％、＞９９％ｅｅ）、及び：
ピーク２：例Ａ－２、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドーアトロプ異性体２（０．３１ｇ、０．６０６ｍｍｏｌ、３９％、９８％ｅｅ）。
ピーク１：例Ａ－１、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドーアトロプ異性体１（０．３ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、３８％、＞９９％ｅｅ）、及び：
ピーク２：例Ａ－２、４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミドーアトロプ異性体２（０．３１ｇ、０．６０６ｍｍｏｌ、３９％、９８％ｅｅ）。
【0250】
化合物は、それらの塩酸塩として単離することもできる。
【0251】
例２
アトロプ異性体のさらなる精製及び特性評価
アトロプ異性体Ａ－１：（Ｓ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド塩酸塩
例１、ステップ５ｂのピーク１（０．３１ｇ、０．６０６ｍｍｏｌ）をＨＰＬＣグレードの水（３０ｍＬ）中で撹拌し、続いて１０分間超音波処理し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出することによりさらに精製した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮し、その後凍結乾燥させて、非晶質固体（０．２９０ｇ、０．５６７ｍｍｏｌ、９４％）を得、これをジクロロメタン（７．１２ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を０℃まで冷却し、ジオキサン（１．４２ｍＬ）中の４Ｎ ＨＣｌを添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を濃縮し、高真空下で乾燥させた。ジエチルエーテル（１０ｍＬ）を使用した粉砕及び凍結乾燥による精製により、表題化合物（０．３ｇ、０．５６ｍｍｏｌ、９８％）をオフホワイトの固体として得た。
アトロプ異性体のさらなる精製及び特性評価
アトロプ異性体Ａ－１：（Ｓ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド塩酸塩
例１、ステップ５ｂのピーク１（０．３１ｇ、０．６０６ｍｍｏｌ）をＨＰＬＣグレードの水（３０ｍＬ）中で撹拌し、続いて１０分間超音波処理し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出することによりさらに精製した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮し、その後凍結乾燥させて、非晶質固体（０．２９０ｇ、０．５６７ｍｍｏｌ、９４％）を得、これをジクロロメタン（７．１２ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を０℃まで冷却し、ジオキサン（１．４２ｍＬ）中の４Ｎ ＨＣｌを添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を濃縮し、高真空下で乾燥させた。ジエチルエーテル（１０ｍＬ）を使用した粉砕及び凍結乾燥による精製により、表題化合物（０．３ｇ、０．５６ｍｍｏｌ、９８％）をオフホワイトの固体として得た。
【0252】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １０．０３，（ｂｒｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），７．８１－７．６８（ｍ，６Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，２Ｈ），７．１０－７．０３（ｍ，４Ｈ），６．６７－６．５８（ｍ，２Ｈ），３．５６－３．５４（ｍ，２Ｈ），３．２０－３．１８（ｍ，２Ｈ），２．７６（ｓ，６Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法１）－ＲＴ２．５４、ＭＨ＋５１２．４
【0253】
アトロプ異性体Ａ－２：（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド塩酸塩
アトロプ異性体Ａ－２の塩酸塩を、ピーク２から出発してアトロプ異性体Ａ－１に使用したのと同じ方法を使用して調製して、表題化合物（０．３１ｇ、０．５６ｍｍｏｌ、９９％）をオフホワイトの固体として得た。
アトロプ異性体Ａ－２の塩酸塩を、ピーク２から出発してアトロプ異性体Ａ－１に使用したのと同じ方法を使用して調製して、表題化合物（０．３１ｇ、０．５６ｍｍｏｌ、９９％）をオフホワイトの固体として得た。
【0254】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ９．９１（ｂｒｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），７．８１－７．６８（ｍ，６Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ，２Ｈ），７．１０－７．０３（ｍ，４Ｈ），６．６７－６．５８（ｍ，２Ｈ），３．５６－３．５４（ｍ，２Ｈ），３．２０－３．１８（ｍ，２Ｈ），２．７７（ｓ，６Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法１）－ＲＴ２．５６、ＭＨ＋５１２．４
【0255】
アトロプ異性体Ａ－２（下記の例３を参照）の単結晶Ｘ線結晶解析は、アトロプ異性体Ａ－２がＲ異性体（化合物（１））であるため、アトロプ異性体Ａ－１がＳ異性体でなければならないことを示した。
【0256】
キラル分析
アトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２のキラル特性の分析を、キラルＨＰＬＣにより得られたそれらの旋光度及びそれらの保持時間を測定することにより実施した。
アトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２のキラル特性の分析を、キラルＨＰＬＣにより得られたそれらの旋光度及びそれらの保持時間を測定することにより実施した。
【0257】
比旋光度プロトコル：
機器：光学活性ＡＡ－１０自動偏光計
波長：５８９ｎｍ
温度：２３℃
セルの経路長：１ｄｍ
溶媒：クロロホルム（Ｆｉｓｈｅｒ、ＨＰＬＣグレード）
濃度：１．０ｇ／１００ｍＬ
機器：光学活性ＡＡ－１０自動偏光計
波長：５８９ｎｍ
温度：２３℃
セルの経路長：１ｄｍ
溶媒：クロロホルム（Ｆｉｓｈｅｒ、ＨＰＬＣグレード）
濃度：１．０ｇ／１００ｍＬ
【0258】
サンプリング技術：
機器のスイッチを入れ、較正の前３０分間安定させた後、光学活性石英コントロールプレート（Ｓ／Ｎ０００４９）を使用して確認した。黄色ナトリウムＤ線を使用して２３℃での角回転を（サンプル管なしで最初に機器をゼロにした後）３４．１６°で測定した。機器をゼロにし、次いでクロロホルムをサンプル管に充填し、機器がまだ０．００（＋／－０．０２）を読み取っていることを確認することによって、サンプル管の品質を確認した。機器をクロロホルムブランクでゼロにした。サンプルをＣＨＣｌ３（２ｍＬ中２ｍｇ）に溶解し、濾過し、２ｍＬを細胞にピペットで入れてαを測定した。
機器のスイッチを入れ、較正の前３０分間安定させた後、光学活性石英コントロールプレート（Ｓ／Ｎ０００４９）を使用して確認した。黄色ナトリウムＤ線を使用して２３℃での角回転を（サンプル管なしで最初に機器をゼロにした後）３４．１６°で測定した。機器をゼロにし、次いでクロロホルムをサンプル管に充填し、機器がまだ０．００（＋／－０．０２）を読み取っていることを確認することによって、サンプル管の品質を確認した。機器をクロロホルムブランクでゼロにした。サンプルをＣＨＣｌ３（２ｍＬ中２ｍｇ）に溶解し、濾過し、２ｍＬを細胞にピペットで入れてαを測定した。
【0259】
比旋光度を以下の式から計算した：［α］Ｔλ＝（α×１００）／（ｃｌ）
【表9】
【0260】
アトロプ異性体の分類
単離されたアトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２について安定性試験を実施した。
単離されたアトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２について安定性試験を実施した。
【0261】
アトロプ異性体Ａ－１及びアトロプ異性体Ａ－２の相互変換を評価するために、キラル安定性を４０℃及び８０℃でモニターした。以下に示す結果によって示されるように、いずれの温度で１０日間加熱しても相互変換は観察されなかった。
【表10】
【0262】
プロトコル：
１．２×１ｍｇの純粋なアトロプ異性体を、密封されたドラムバイアル内の１ｍＬのエタノールに溶解した。
２．一組のバイアルを４０℃で加熱し、別の組を８０℃で加熱した。
３．指定された時点で、各ストック溶液（１ｍＬ）から２０μＬのアリコートを取り、ヘキサン：エタノール；８０：２０の８０μＬ溶液を含有するＨＰＬＣバイアルにクエンチし、２００ｐｐｍの最終濃度を得、サンプルをキラルＨＰＬＣにより分析した。
４．分析を以下の時点で実施した：キラルＨＰＬＣ法５を使用して、４０℃で保ったサンプルについては０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、及び２４０時間、８０℃で保ったサンプルについては２４時間、９６時間、及び２４０時間。
１．２×１ｍｇの純粋なアトロプ異性体を、密封されたドラムバイアル内の１ｍＬのエタノールに溶解した。
２．一組のバイアルを４０℃で加熱し、別の組を８０℃で加熱した。
３．指定された時点で、各ストック溶液（１ｍＬ）から２０μＬのアリコートを取り、ヘキサン：エタノール；８０：２０の８０μＬ溶液を含有するＨＰＬＣバイアルにクエンチし、２００ｐｐｍの最終濃度を得、サンプルをキラルＨＰＬＣにより分析した。
４．分析を以下の時点で実施した：キラルＨＰＬＣ法５を使用して、４０℃で保ったサンプルについては０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、及び２４０時間、８０℃で保ったサンプルについては２４時間、９６時間、及び２４０時間。
【0263】
単離されたアトロプ異性体、Ａ－１及びＡ－２の安定性は、それらがクラス３のアトロプ異性体であることを確認した（ＬａＰｌａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５４：７００５－７０２２（２０１１）））。
【0264】
例３
アトロプ異性体Ａ－２のＸ線結晶解析
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基を調製し、以下のように単結晶をＸ線結晶研究に供した。
アトロプ異性体Ａ－２のＸ線結晶解析
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基を調製し、以下のように単結晶をＸ線結晶研究に供した。
【0265】
実験：
アトロプ異性体Ａ－２の単一の定義されていない形態学的結晶を、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）からの再結晶により得た。好適な結晶０．１９×０．１３×０．０４ｍｍ３を選択し、ＭｉＴｉＧｅｎ ＭｉｃｒｏＭｏｕｎｔを使用して、ＨｙＰｉｘ－６０００ＨＥ検出器を備えたＲｉｇａｋｕ ＸｔａＬＡＢ Ｓｙｎｇｅｒｙ－Ｓ回折計に取り付けた。データ収集中、結晶を一定のＴ＝１２３（２）Ｋに保った。
アトロプ異性体Ａ－２の単一の定義されていない形態学的結晶を、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）からの再結晶により得た。好適な結晶０．１９×０．１３×０．０４ｍｍ３を選択し、ＭｉＴｉＧｅｎ ＭｉｃｒｏＭｏｕｎｔを使用して、ＨｙＰｉｘ－６０００ＨＥ検出器を備えたＲｉｇａｋｕ ＸｔａＬＡＢ Ｓｙｎｇｅｒｙ－Ｓ回折計に取り付けた。データ収集中、結晶を一定のＴ＝１２３（２）Ｋに保った。
【0266】
データはＣｕＫα線を使用して作成した。達成された最大分解能はΘ＝７４．２６３°（０．８０Å）であった。データ削減、スケーリング、及び吸収補正を実行した。最終的な完全性は、Θで７４．２６３°に対して１００．００％であった。化合物の吸収係数μは波長（λ＝１．５４２Å）で１．７６１ｍｍ－１と決定された。
【0267】
ＣｒｙｓＡｌｉｓＰｒｏソフトウェアを使用してデータを収集及び処理し、Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｐｈａｓｉｎｇ解決法を使用してＳｈｅｌＸＴ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，２０１５）構造解決プログラムを用いて、及びグラフィカルインターフェースとしてＯｌｅｘ２（Ｄｏｌｏｍａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００９）を使用することにより構造を解明した。最小二乗最小化を使用して、ＳｈｅｌＸＬ－２０１８／３（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，２０１８）のバージョン２０１８／３でモデルを精密化した。
【0268】
結晶構造は単斜晶であることが見出され、空間群Ｐ２１（＃４）に割り当てられた。
【0269】
すべての非水素原子を異方的に精密化した。水素原子の位置を幾何学的に計算し、ライディングモデルを使用して精密化した。
【0270】
参考文献：Ｏ．Ｖ．Ｄｏｌｏｍａｎｏｖ ａｎｄ Ｌ．Ｊ．Ｂｏｕｒｈｉｓ ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｇｉｌｄｅａ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｈ．Ｐｕｓｃｈｍａｎｎ，Ｏｌｅｘ２：Ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．，（２００９），４２，３３９－３４１。
Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＳｈｅｌＸＬ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，（２０１５），Ｃ７１，３－８。
Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．，ＳｈｅｌＸＴ－Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｐａｃｅ－ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｒｙｓｔａｌ－ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，（２０１５），Ａ７１，３－８。
Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＳｈｅｌＸＬ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，（２０１５），Ｃ７１，３－８。
Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．，ＳｈｅｌＸＴ－Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｐａｃｅ－ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｒｙｓｔａｌ－ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，（２０１５），Ａ７１，３－８。
【0271】
研究の結果を以下の表１～７に示す。
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15-1】
【表15-2】
【表16-1】
【表16-2】
【表17】
【0272】
以下に示すデータに基づいて、アトロプ異性体Ａ－２は、図２及び図３に示すＲ配置を有すると考えられ、したがって、（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）－エチル］ベンズアミドと命名することができる。
【0273】
例４
（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド酒石酸塩の調製及び特性評価
方法１：酒石酸塩の小規模調製
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基（９０４．２ｍｇ）をアセトン（９．０４２ｍＬ、１０体積）に懸濁し、２５℃で４０分間撹拌した。溶液が目に見える微粒子を含まなくなった時、溶液を１２個の等量のアリコート（６０３μＬ）に分け、サンプルあたり約６０．３ｍｇの活性含有量を得た。
（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド酒石酸塩の調製及び特性評価
方法１：酒石酸塩の小規模調製
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基（９０４．２ｍｇ）をアセトン（９．０４２ｍＬ、１０体積）に懸濁し、２５℃で４０分間撹拌した。溶液が目に見える微粒子を含まなくなった時、溶液を１２個の等量のアリコート（６０３μＬ）に分け、サンプルあたり約６０．３ｍｇの活性含有量を得た。
【0274】
エタノール中２４７μＬの０．５Ｍ酒石酸溶液のアリコート（１．０５当量）を、２５℃で遊離塩基溶液のアリコートに添加した。混合物を２５℃で１８時間撹拌した後、白色の懸濁液が形成され、次いで、得られた固体を濾過（ＰＴＦＥ １０ミクロンフリットカートリッジ）により単離し、真空中４０℃で約７２時間乾燥させた。得られた塩を酒石酸塩パターンＡ（溶媒和物）として標識した。
【0275】
方法２：アトロプ異性体Ａ－２の酢酸イソプロピル溶液を使用した酒石酸塩の調製
アトロプ異性体Ａ－２（７４９．８ｍｇ）を酢酸イソプロピル（１５ｍＬ、２０体積）に懸濁し、懸濁液をかき混ぜながら４０℃に加熱した。溶液が目に見える微粒子を含まなくなった時、溶液を１２個の等量のアリコート（１ｍｌ）に分け、サンプルあたり約５０ｍｇの活性含有量を得た。エタノール中１９５．３μＬの１Ｍアトロプ異性体Ａ－２溶液のアリコートを、４０℃で遊離塩基溶液のアリコートに添加した。得られた混合物を約１０℃／時間の冷却速度で２５℃まで冷却した。形成した白色の懸濁液及び得られた固体を、次いで、濾過により単離し、真空中４０℃で約１８時間乾燥させた。得られた塩を酒石酸塩パターンＢとして標識した。
アトロプ異性体Ａ－２（７４９．８ｍｇ）を酢酸イソプロピル（１５ｍＬ、２０体積）に懸濁し、懸濁液をかき混ぜながら４０℃に加熱した。溶液が目に見える微粒子を含まなくなった時、溶液を１２個の等量のアリコート（１ｍｌ）に分け、サンプルあたり約５０ｍｇの活性含有量を得た。エタノール中１９５．３μＬの１Ｍアトロプ異性体Ａ－２溶液のアリコートを、４０℃で遊離塩基溶液のアリコートに添加した。得られた混合物を約１０℃／時間の冷却速度で２５℃まで冷却した。形成した白色の懸濁液及び得られた固体を、次いで、濾過により単離し、真空中４０℃で約１８時間乾燥させた。得られた塩を酒石酸塩パターンＢとして標識した。
【0276】
方法３：アトロプ異性体Ａ－２のイソプロピルアルコール溶液を使用した酒石酸塩の調製
アトロプ異性体Ａ－２（７５０．１ｍｇ）を最初にイソプロピルアルコール（１５ｍｌ、２０体積）に懸濁したことを除いて、方法２に従って、酒石酸パターンＡ塩を調製した。
アトロプ異性体Ａ－２（７５０．１ｍｇ）を最初にイソプロピルアルコール（１５ｍｌ、２０体積）に懸濁したことを除いて、方法２に従って、酒石酸パターンＡ塩を調製した。
【0277】
方法４：アトロプ異性体Ａ－２の２－メチル－テトラヒドロフラン溶液を使用した酒石酸塩の調製
アトロプ異性体Ａ－２（９１３．９ｍｇ）を最初に２－メチル－テトラヒドロフラン（１５ｍｌ、２０体積）、（９．１３９ｍＬ、１０体積）に懸濁し、２５℃で約４０分間撹拌し、次いで、エタノール中１Ｍ酒石酸の２５０μｌ（１．０５当量）アリコートをＡ－２遊離塩基溶液のアリコート（６０９μＬ）に添加したことを除いて、方法１を繰り返し、酒石酸パターンＡ塩を得た。
アトロプ異性体Ａ－２（９１３．９ｍｇ）を最初に２－メチル－テトラヒドロフラン（１５ｍｌ、２０体積）、（９．１３９ｍＬ、１０体積）に懸濁し、２５℃で約４０分間撹拌し、次いで、エタノール中１Ｍ酒石酸の２５０μｌ（１．０５当量）アリコートをＡ－２遊離塩基溶液のアリコート（６０９μＬ）に添加したことを除いて、方法１を繰り返し、酒石酸パターンＡ塩を得た。
【0278】
方法５：アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩の５００ｍｇスケールでの調製
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基（５２１．５ｍｇ）をガラスバイアルに秤量し、酢酸イソプロピル（２０体積、１０．４３０ｍｌ）を投入した。混合物を４０℃に加熱し、１５分間撹拌して透明な溶液を得た。次いで、溶液に、３ｍＬのテトラヒドロフランに溶解した酒石酸（１．０５当量、１６２．５ｍｇ）を投入した。得られた混合物をアトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢでシードし、これにより塩を４０℃で直ちに沈殿させ、移動懸濁液を形成させた。混合物を２５℃まで冷却し、２０時間撹拌した。得られた固体を濾過により単離し、真空中４０℃で乾燥させて、アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩を収率８４％で得た。
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基（５２１．５ｍｇ）をガラスバイアルに秤量し、酢酸イソプロピル（２０体積、１０．４３０ｍｌ）を投入した。混合物を４０℃に加熱し、１５分間撹拌して透明な溶液を得た。次いで、溶液に、３ｍＬのテトラヒドロフランに溶解した酒石酸（１．０５当量、１６２．５ｍｇ）を投入した。得られた混合物をアトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢでシードし、これにより塩を４０℃で直ちに沈殿させ、移動懸濁液を形成させた。混合物を２５℃まで冷却し、２０時間撹拌した。得られた固体を濾過により単離し、真空中４０℃で乾燥させて、アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩を収率８４％で得た。
【0279】
方法６：アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩（無水形態）のスケールアップ調製
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基（１０．０４９７ｇ）をＢｕｃｈｉフラスコに秤量し、酢酸イソプロピル（２０体積、２００ｍｌ）を投入した。混合物を４０℃に加熱し、微粒子のない透明な溶液を得、３０分間撹拌した。溶液に、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解した酒石酸（３．１９５４ｇ、１．０８当量）を投入し、酸を以下のように少しずつ添加した：４０℃で１５ｍＬ；アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩でシードし、３０分間撹拌；１０ｍＬ添加し、１時間撹拌；１０ｍＬ添加し、３０分間撹拌；１５ｍＬ添加し、３０分間撹拌した。次いで、白色の懸濁液を１０℃／時間の冷却速度で室温に冷却し、１８時間撹拌した。得られた固体を真空中で濾過により単離し、酢酸イソプロピル（２×２体積）で洗浄し、真空中の４０℃で２０時間乾燥させて、Ａ－２酒石酸パターンＢ塩（無水）を収率９７％；ＨＰＬＣ純度９９．７４％（ＨＰＬＣ法１）、キラル純度９９．２７％（キラルＨＰＬＣ法７）で得た。
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基（１０．０４９７ｇ）をＢｕｃｈｉフラスコに秤量し、酢酸イソプロピル（２０体積、２００ｍｌ）を投入した。混合物を４０℃に加熱し、微粒子のない透明な溶液を得、３０分間撹拌した。溶液に、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解した酒石酸（３．１９５４ｇ、１．０８当量）を投入し、酸を以下のように少しずつ添加した：４０℃で１５ｍＬ；アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩でシードし、３０分間撹拌；１０ｍＬ添加し、１時間撹拌；１０ｍＬ添加し、３０分間撹拌；１５ｍＬ添加し、３０分間撹拌した。次いで、白色の懸濁液を１０℃／時間の冷却速度で室温に冷却し、１８時間撹拌した。得られた固体を真空中で濾過により単離し、酢酸イソプロピル（２×２体積）で洗浄し、真空中の４０℃で２０時間乾燥させて、Ａ－２酒石酸パターンＢ塩（無水）を収率９７％；ＨＰＬＣ純度９９．７４％（ＨＰＬＣ法１）、キラル純度９９．２７％（キラルＨＰＬＣ法７）で得た。
【0280】
方法７：ブタノール／水９６：４からの冷却結晶化によるアトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩（無水形態）の代替のスケールアップ調製
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基（３６．７９ｇ）をフラスコに秤量し、ブタノール（２８２．５７ｍｌ、７．６８体積）を投入した。混合物を８０℃に加熱し（淡黄色の濁った溶液）、３０分間撹拌した後、８０℃で予熱したＭｙａ＊ベッセルに清澄化した。次いで、溶液に、Ｌ－（＋）－酒石酸（１．０２３当量、１１．０８０６ｇ）を水溶液（１１．７７ｍＬ、０．３２体積の初期ＡＰＩチャージ）として投入した。酸溶液を清澄化しながら、８０℃で滴下を行った。次いで、混合物を３０分間かけて６８℃まで冷却し、０．１％の粉砕アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩シード結晶（３２．６ｍｇ）でシードし、１時間保持した。次いで、混合物を５℃まで５℃／時間の冷却速度で冷却し、５℃で６時間撹拌した後、固体を単離した。固体を真空中で濾過し、ブタノールで２回洗浄し、フィルター上で１５分間乾燥させ、次いで４０℃で２０時間乾燥させて、アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩（無水）を収率８３％；ＨＰＬＣ純度９９．８４％（ＨＰＬＣ法１）、キラル純度９９．６６％（キラルＨＰＬＣ法７）で得た。
アトロプ異性体Ａ－２遊離塩基（３６．７９ｇ）をフラスコに秤量し、ブタノール（２８２．５７ｍｌ、７．６８体積）を投入した。混合物を８０℃に加熱し（淡黄色の濁った溶液）、３０分間撹拌した後、８０℃で予熱したＭｙａ＊ベッセルに清澄化した。次いで、溶液に、Ｌ－（＋）－酒石酸（１．０２３当量、１１．０８０６ｇ）を水溶液（１１．７７ｍＬ、０．３２体積の初期ＡＰＩチャージ）として投入した。酸溶液を清澄化しながら、８０℃で滴下を行った。次いで、混合物を３０分間かけて６８℃まで冷却し、０．１％の粉砕アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩シード結晶（３２．６ｍｇ）でシードし、１時間保持した。次いで、混合物を５℃まで５℃／時間の冷却速度で冷却し、５℃で６時間撹拌した後、固体を単離した。固体を真空中で濾過し、ブタノールで２回洗浄し、フィルター上で１５分間乾燥させ、次いで４０℃で２０時間乾燥させて、アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩（無水）を収率８３％；ＨＰＬＣ純度９９．８４％（ＨＰＬＣ法１）、キラル純度９９．６６％（キラルＨＰＬＣ法７）で得た。
【0281】
＊注：温度制御及び／又は規定の加熱／冷却プロファイルを必要とする前述の平衡化又は結晶化では、ＲａｄｌｅｙのＭｙａ４ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎを使用した。ＲａｄｌｅｙのＭｙａ４ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎは、磁気撹拌能力及びオーバーヘッド撹拌能力、ならびに２～４００ｍＬスケールの混合物に対して－３０～１８０℃の温度範囲を有する４ゾーンの反応ステーションである。必要な反応条件は、Ｍｙａ ４ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐａｄを介してプログラムした。
【0282】
アトロプ異性体Ａ－２酒石酸塩の特性評価
１：１（遊離塩基：酒石酸のモル比）化学量論的塩としての塩の同一性を、オートサンプラーを備えたＪＥＯＬ ＥＣＸ ４００ＭＨｚ分光計を使用して収集したそれらの１Ｈ ＮＭＲスペクトルから確認した。サンプルを分析に好適な重水素化溶媒に溶解した。データは、Ｄｅｌｔａ ＮＭＲ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン４．３を使用して取得した。
１：１（遊離塩基：酒石酸のモル比）化学量論的塩としての塩の同一性を、オートサンプラーを備えたＪＥＯＬ ＥＣＸ ４００ＭＨｚ分光計を使用して収集したそれらの１Ｈ ＮＭＲスペクトルから確認した。サンプルを分析に好適な重水素化溶媒に溶解した。データは、Ｄｅｌｔａ ＮＭＲ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン４．３を使用して取得した。
【0283】
酒石酸塩は、以下に記載する技術を使用する、粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、熱重量分析（ＴＧＡ）、重量溶解度試験、及び重量法蒸気収着試験を使用して特性評価した。
【0284】
粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）
粉末Ｘ線回折パターンを、ＣｕＫα線（４５ｋＶ、４０ｍＡ）、θ－θゴニオメーター、集光ミラー、発散スリット（１／２”）、入射ビーム及び発散ビームの両方におけるソーラースリット（４ｍｍ）、ならびにＰＩＸｃｅｌ検出器を使用してＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ回折計で収集した。データ収集に使用したソフトウェアはＸ’Ｐｅｒｔ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、バージョン２．２ｆであり、データはＸ’Ｐｅｒｔ Ｄａｔａ Ｖｉｅｗｅｒ、バージョン１．２ｄを使用して提示した。ＸＲＰＤパターンは、ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯを使用して、周囲条件下で透過箔サンプルステージ（ポリイミド－カプトン、厚さ１２．７μｍのフィルム）を介して周囲条件下で取得した。データ収集範囲は２．９９４～３５°２θであり、連続走査速度は０．２０２００４°ｓ－１であった。
粉末Ｘ線回折パターンを、ＣｕＫα線（４５ｋＶ、４０ｍＡ）、θ－θゴニオメーター、集光ミラー、発散スリット（１／２”）、入射ビーム及び発散ビームの両方におけるソーラースリット（４ｍｍ）、ならびにＰＩＸｃｅｌ検出器を使用してＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ回折計で収集した。データ収集に使用したソフトウェアはＸ’Ｐｅｒｔ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、バージョン２．２ｆであり、データはＸ’Ｐｅｒｔ Ｄａｔａ Ｖｉｅｗｅｒ、バージョン１．２ｄを使用して提示した。ＸＲＰＤパターンは、ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯを使用して、周囲条件下で透過箔サンプルステージ（ポリイミド－カプトン、厚さ１２．７μｍのフィルム）を介して周囲条件下で取得した。データ収集範囲は２．９９４～３５°２θであり、連続走査速度は０．２０２００４°ｓ－１であった。
【0285】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＤＳＣデータは、４５ポジションのサンプルホルダーを備えたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｐｙｒｉｓ ６０００ ＤＳＣで収集した。機器を、認証されたインジウムを使用してエネルギー及び温度の較正について検証した。所定量のサンプル０．５～３．０ｍｇをピンホール付きアルミニウムパンに入れ、２０℃．ｍｉｎ－で３０～３５０℃に加熱するか、又は実験によって変化させた。２０ｍｌ／分－１での乾燥窒素のパージをサンプル上に維持した。機器の制御、データの取得、及び分析を、Ｐｙｒｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１１．１．１改訂版Ｈを用いて実行した。
ＤＳＣデータは、４５ポジションのサンプルホルダーを備えたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｐｙｒｉｓ ６０００ ＤＳＣで収集した。機器を、認証されたインジウムを使用してエネルギー及び温度の較正について検証した。所定量のサンプル０．５～３．０ｍｇをピンホール付きアルミニウムパンに入れ、２０℃．ｍｉｎ－で３０～３５０℃に加熱するか、又は実験によって変化させた。２０ｍｌ／分－１での乾燥窒素のパージをサンプル上に維持した。機器の制御、データの取得、及び分析を、Ｐｙｒｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１１．１．１改訂版Ｈを用いて実行した。
【0286】
熱重量分析（ＴＧＡ）
ＴＧＡデータは、２０ポジションオートサンプラーを備えたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｐｙｒｉｓ １ ＴＧＡで収集した。機器を、認証された重量ならびに認証されたアルメル及びパークアロイ（Ｐｅｒｋａｌｌｏｙ）を使用して温度について較正した。所定量のサンプル１～５ｍｇを風袋計量済みアルミニウムるつぼに入れ、周囲温度から４００℃まで２０℃．分－１で加熱した。２０ｍｌ／分－１での窒素パージをサンプル上に維持した。機器の制御、データの取得、及び分析を、Ｐｙｒｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１１．１．１改訂版Ｈを用いて実行した。
ＴＧＡデータは、２０ポジションオートサンプラーを備えたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｐｙｒｉｓ １ ＴＧＡで収集した。機器を、認証された重量ならびに認証されたアルメル及びパークアロイ（Ｐｅｒｋａｌｌｏｙ）を使用して温度について較正した。所定量のサンプル１～５ｍｇを風袋計量済みアルミニウムるつぼに入れ、周囲温度から４００℃まで２０℃．分－１で加熱した。２０ｍｌ／分－１での窒素パージをサンプル上に維持した。機器の制御、データの取得、及び分析を、Ｐｙｒｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１１．１．１改訂版Ｈを用いて実行した。
【0287】
重量溶解度
塩の水への溶解度は、重量溶解度プロトコルを使用して測定した。
塩の水への溶解度は、重量溶解度プロトコルを使用して測定した。
【0288】
１ｍｌの水を結晶管に充填した。固体を風袋引きしたガラスバイアルに秤量し、溶液に少しずつ添加し、各添加後に濁った溶液が観察されるまでバイアルを秤量した。次いで、ｍｇでの量を計算して、ｍｇ／ｍｌ単位の溶解度を得た。
【0289】
特性評価研究から得られた結果を以下の表８に示す。
【表18】
【0290】
重量法蒸気収着（ＧＶＳ）
以下に示すプロトコルを使用して、アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩に対してＧＶＳ研究を実施した。
以下に示すプロトコルを使用して、アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩に対してＧＶＳ研究を実施した。
【0291】
収着等温線は、ＩＧＡｓｏｒｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ６．５０．４８により制御されるＨｉｄｅｎ Ｉｓｏｃｈｅｍａ水分収着分析器（モデルＩＧＡｓｏｒｐ）を使用して得た。サンプルを機器制御により一定温度（２５℃）で維持した。湿度は、乾燥窒素と湿潤窒素の流れを混合することにより制御し、総流量は２５０ｍｌ／分－１であった。機器を、３つの較正されたＲｏｔｒｏｎｉｃ塩溶液（１０－５０－８８％）を測定することにより相対湿度含有量について検証した。サンプルの重量変化を、微量天秤（精度＋／－０．００５ｍｇ）により湿度の関数としてモニターした。規定量のサンプルを風袋引きしたメッシュのステンレス鋼バスケットに周囲条件下で入れた。完全な実験サイクルは、典型的には、０～９０％の範囲にわたって、一定温度（２５℃）及び１０％ＲＨ間隔での３回のスキャン（収着、脱着、及び収着）（各湿度レベルについて６０分間）からなった。このタイプの実験は、明確な湿度範囲のセットにわたって水分を吸収する（又は吸収しない）研究サンプルの能力を実証するはずである。
【0292】
ＧＶＳ分析（図９を参照）は、最初の脱着前に約０．３％の水分含有量を示した。８０～９０％のＲＨでは、水分のわずかにより高い増加があり、固体は約０．８％の水分を得る。第２の吸収／脱着サイクルは、吸湿がどのように完全に可逆的であり、０％ＲＨで０重量％に戻ることを示す。０％ＲＨ及び９０％ＲＨで最低３時間保持したＧＶＳサイクリング後のＸＲＰＤにより、両方のＲＨ値で無水パターンＢを得た。
【0293】
したがって、アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩は安定な固体として存在し、形態を変化させることなく表面水分のみを吸収すると結論付けることができる。
【0294】
例５
（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド酒石酸塩のさらなる特性評価
溶解度
アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩は、水性製剤に非常に可溶性であり、経口送達に適していることが分かった。連続的に撹拌し、４０℃まで穏やかに加温した後、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン２０％ｗ／ｖの水溶液中で＞１００ｍｇ／ｍＬの濃度が達成された。
（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド酒石酸塩のさらなる特性評価
溶解度
アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩は、水性製剤に非常に可溶性であり、経口送達に適していることが分かった。連続的に撹拌し、４０℃まで穏やかに加温した後、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン２０％ｗ／ｖの水溶液中で＞１００ｍｇ／ｍＬの濃度が達成された。
【0295】
粉末密度
かさ密度は、５０ｍＬガラスビーカーにアトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩を投入することによって測定した。化合物を秤量する前に静置させ、約４０ｍＬの体積占有及びかさ密度を計算した。
かさ密度は、５０ｍＬガラスビーカーにアトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩を投入することによって測定した。化合物を秤量する前に静置させ、約４０ｍＬの体積占有及びかさ密度を計算した。
【0296】
タップ密度は、６～８ｍＬのアトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩を１０ｍＬメスシリンダーに投入し、その後、ゴムマット及び木槌を使用して垂直及び水平に手動で１５分間、又はそれ以上沈降しない一貫した床が達成されるまで、材料を繰り返しタップし、振動させることによって決定した。次いで、タップ密度を計算した。
【0297】
アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩は、０．５５ｇ／ｍＬの粉末かさ密度値及び約０．６５９ｇ／ｍＬのタップ密度を有する。
【0298】
薬物粉末の流動性、したがってカプセル形態での製剤化に対するその適合性は、以下の式に従ってそのかさ密度及びタップ密度から計算することができるそのＣａｒｒ指数及びＨａｕｓｎｅｒ比によって定義することができる。
Ｃａｒｒ圧縮性指数＝１００（ρＴ－ρＢ）／ρＴ
Ｈａｕｓｎｅｒ比＝ρＴ／ρＢ
Ｃａｒｒ圧縮性指数＝１００（ρＴ－ρＢ）／ρＴ
Ｈａｕｓｎｅｒ比＝ρＴ／ρＢ
【0299】
次いで、Ｃａｒｒ指数及びＨａｕｓｎｅｒ比を、以下の表に記載の流動性記述子に変換することができる（出典：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｅａｒｃｈｇａｔｅ．ｎｅｔ／ｆｉｇｕｒｅ／Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ－ｆｏｒ－Ｃａｒｒｓ－ｉｎｄｅｘ－ａｎｄ－Ｈａｕｓｎｅｒ－ｒａｔｉｏ＿ｔｂｌ１＿３２５３６５０２９）。
アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩について、Ｃａｒｒ指数は１６．５％と計算され、Ｈａｕｓｎｅｒ比は１．１９と計算され、「中」の流動性を示した。したがって、この塩形態は、カプセル投与の粉末に適している。
【表19】
アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩について、Ｃａｒｒ指数は１６．５％と計算され、Ｈａｕｓｎｅｒ比は１．１９と計算され、「中」の流動性を示した。したがって、この塩形態は、カプセル投与の粉末に適している。
【0300】
安定性
アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩の安定性を、２組の保存条件を用いて評価した。すなわち、２５℃±２℃／６０％ＲＨ及び４０℃±２℃／７５％ＲＨである。安定性プロトコルはＩＣＨガイドラインに従った。
アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩の安定性を、２組の保存条件を用いて評価した。すなわち、２５℃±２℃／６０％ＲＨ及び４０℃±２℃／７５％ＲＨである。安定性プロトコルはＩＣＨガイドラインに従った。
【0301】
したがって、アトロプ異性体Ａ－２酒石酸パターンＢ塩（１容器あたり１ｇ）を以下の充填剤成分と共に２５℃／６０％ＲＨ及び４０℃／７５％ＲＨでＩＣＨ定格安定性キャビネットに入れた：
－ダブルポリテンバッグ（ベンダー－Ａｒｍａｇｒｉｐ；パーツ番号Ｇ０１－ＰＢ－１２０）、
－スクリューキャップクロージャ付き広口ＨＤＰＥボトル（ベンダー－Ｃｕｒｔｅｃ；パーツ番号４３０３）、
－プラスチックタイストリップ（ベンダー－Ｔｈｏｍａｓ＆Ｂｅｔｔｓ；パーツ番号ＴＹ１２５－４０－１００）。
－ダブルポリテンバッグ（ベンダー－Ａｒｍａｇｒｉｐ；パーツ番号Ｇ０１－ＰＢ－１２０）、
－スクリューキャップクロージャ付き広口ＨＤＰＥボトル（ベンダー－Ｃｕｒｔｅｃ；パーツ番号４３０３）、
－プラスチックタイストリップ（ベンダー－Ｔｈｏｍａｓ＆Ｂｅｔｔｓ；パーツ番号ＴＹ１２５－４０－１００）。
【0302】
保存後、これらのサンプルを安定性キャビネットから取り出し、外観、カールフィッシャー滴定（ＫＦ）による含水量、及び純度について分析した。
【0303】
含水量及びＨＰＬＣによる化学純度の変化は、６ヶ月にわたって観察されなかった。含水量及びＨＰＬＣによる化学純度の変化は、６ヶ月にわたって観察されなかった。
【表20】
【0304】
例６
（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド（アトロプ異性体Ａ－２）を調製するための代替方法
（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド（アトロプ異性体Ａ－２）を調製するための代替方法
【化11】
【0305】
表題化合物を、上記のスキーム１に示す合成経路のステップ１、２、３、４ａ、及び５ａに従って調製した。この経路では、キラル分割は、ジメチルアミノエチルアミド（９）ではなくカルボン酸中間体（８）で実施される。
【0306】
ステップ１：４－［４－（４－クロロフェニル）－４－オキソ－ブタノイル］ベンゾニトリル（６）
フラスコにテトラヒドロフラン（４ｍＬ／ｇ）を投入し、塩化亜鉛（１．２２２ｇ／ｇ、１．３当量）を少しずつ添加して白色の移動懸濁液を得、これを１５分間撹拌した。ｔｅｒｔ－ブタノール（０．６６ｍＬ／ｇ、１当量）、続いてトリエチルアミン（０．９６ｍＬ／ｇ、１当量）を少しずつ添加し、温度を４０℃未満に維持した。反応物を２時間撹拌した。４－シアノアセトフェノン（１ｇ／ｇ、１当量）及び４－クロロフェナシルブロミド（１．６１ｇ／ｇ、１当量）を添加し、反応混合物を２０℃（±５）で４８時間又は反応が完了するまで撹拌した。ＨＣｌ水溶液での沈殿及びＨＣｌ水溶液とメタノール中のスラリーにより生成物を単離した。得られた固体を真空下（４５℃）で乾燥させて、表題化合物を淡黄色の固体として得た。
フラスコにテトラヒドロフラン（４ｍＬ／ｇ）を投入し、塩化亜鉛（１．２２２ｇ／ｇ、１．３当量）を少しずつ添加して白色の移動懸濁液を得、これを１５分間撹拌した。ｔｅｒｔ－ブタノール（０．６６ｍＬ／ｇ、１当量）、続いてトリエチルアミン（０．９６ｍＬ／ｇ、１当量）を少しずつ添加し、温度を４０℃未満に維持した。反応物を２時間撹拌した。４－シアノアセトフェノン（１ｇ／ｇ、１当量）及び４－クロロフェナシルブロミド（１．６１ｇ／ｇ、１当量）を添加し、反応混合物を２０℃（±５）で４８時間又は反応が完了するまで撹拌した。ＨＣｌ水溶液での沈殿及びＨＣｌ水溶液とメタノール中のスラリーにより生成物を単離した。得られた固体を真空下（４５℃）で乾燥させて、表題化合物を淡黄色の固体として得た。
【0307】
ステップ２：４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）ベンゾニトリル（７）
４－（４－（４－クロロフェニル）－４－オキソブタノイル）ベンゾニトリル（１ｇ／ｇ、１当量）をフラスコに入れ、ジオキサン（１０ｍＬ／ｇ）を添加して、黄色の懸濁液を得た。２－トリフルオロメチルアニリン（１．２６９ｍＬ／ｇ、３当量）を一度に、続いてｐ－トルエンスルホン酸（０．０６３９９ｇ／ｇ、０．１当量）を添加し、反応混合物を１０１℃で４０～７２時間加熱した（必要に応じてｐ－トルエンスルホン酸の追加分（０．１当量）を８時間ごとに添加して反応を完了させた）。反応混合物を室温まで冷却し、真空下で濃縮した。得られた油性残渣をメタノール（１０ｍＬ／ｇ）中でスラリー化することにより精製した。固体を濾過により単離し、真空下で乾燥させて（４５℃）、表題化合物を黄色の固体として得た。
４－（４－（４－クロロフェニル）－４－オキソブタノイル）ベンゾニトリル（１ｇ／ｇ、１当量）をフラスコに入れ、ジオキサン（１０ｍＬ／ｇ）を添加して、黄色の懸濁液を得た。２－トリフルオロメチルアニリン（１．２６９ｍＬ／ｇ、３当量）を一度に、続いてｐ－トルエンスルホン酸（０．０６３９９ｇ／ｇ、０．１当量）を添加し、反応混合物を１０１℃で４０～７２時間加熱した（必要に応じてｐ－トルエンスルホン酸の追加分（０．１当量）を８時間ごとに添加して反応を完了させた）。反応混合物を室温まで冷却し、真空下で濃縮した。得られた油性残渣をメタノール（１０ｍＬ／ｇ）中でスラリー化することにより精製した。固体を濾過により単離し、真空下で乾燥させて（４５℃）、表題化合物を黄色の固体として得た。
【0308】
ステップ３：４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（８）
メタノール（１０．９ｍＬ／ｇ）中の４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）ベンゾニトリル（１ｇ／ｇ、１当量）に、水酸化ナトリウム（０．９４８ｇ／ｇ、１０当量）水溶液（５ｍＬ／ｇ）を１５分かけて滴下し、得られた混合物を７０～７６℃で１８時間又は完了するまで撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、酸性化し、生成物を濾過により単離し、水（５ｍＬ／ｇ）及びアセトニトリル（３ｍＬ／ｇ）で洗浄した。生成物をアセトン／水（２０体積、７５：２５）中５０～５５℃でスラリー化し、真空下で乾燥させて（６０℃）、表題化合物を黄色の固体として得た。
メタノール（１０．９ｍＬ／ｇ）中の４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）ベンゾニトリル（１ｇ／ｇ、１当量）に、水酸化ナトリウム（０．９４８ｇ／ｇ、１０当量）水溶液（５ｍＬ／ｇ）を１５分かけて滴下し、得られた混合物を７０～７６℃で１８時間又は完了するまで撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、酸性化し、生成物を濾過により単離し、水（５ｍＬ／ｇ）及びアセトニトリル（３ｍＬ／ｇ）で洗浄した。生成物をアセトン／水（２０体積、７５：２５）中５０～５５℃でスラリー化し、真空下で乾燥させて（６０℃）、表題化合物を黄色の固体として得た。
【0309】
ステップ４ａ：（８）のキラル分割による（Ｒ）４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（３）
４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（１ｇ／ｇ、１当量）をフラスコに加え、続いてテトラヒドロフラン（２ｍＬ／ｇ）及びアセトニトリル（０．７５ｍＬ／ｇ）を添加した。（Ｓ）－１－（４－メトキシフェニル）－エチルアミン（０．３３５ｍＬ／ｇ、１当量）を５分かけて滴下し、得られた反応混合物を４０～５０℃で１５分間撹拌し、次いで、室温まで冷却した。アセトニトリル（７．２５ｍＬ／ｇ）を添加し、反応物をシードした（０．０００１ｇ／ｇ、９９％ｅｅ、所望のアトロプ異性体の（Ｓ）－１－（４－メトキシフェニル）－エチルアミン塩）。反応混合物を１６時間撹拌し、得られた固体をアセトニトリルで濾過洗浄により単離した。アセトニトリル中の高温（７５～８０℃）スラリーは、キラル塩を白色の固体として得た（収率４０％、９８．１６％ｅｅ）。１Ｍ ＨＣｌ（２．２当量）を使用してＴＨＦ／水（２／２体積）中で塩破壊を行い、酸を得、これを水中スラリーによってさらに精製して、表題化合物（９０．５２ｇ、塩破壊収率９７％、全体収率３９％、９８．０６％ｅｅ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２，８３（ｂｒｓ，１Ｈ），７．７７－７．６７（ｍ，６Ｈ），７．２３－７．１０（ｍ，２Ｈ），７．０８－７．０１（ｍ，４Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝４．０ Ｈｚ，１Ｈ），６．５９－６．５８（ｄ，Ｊ＝４．０ Ｈｚ，１Ｈ）．キラルＨＰＬＣ法６を用いたキラルＨＰＬＣは、単一のアトロプ異性体、ＲＴ６．０８３分、９９．０２面積％（マイナーアトロプ異性体、ＲＴ７．０７分、０．９８面積％）を示した。
４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（１ｇ／ｇ、１当量）をフラスコに加え、続いてテトラヒドロフラン（２ｍＬ／ｇ）及びアセトニトリル（０．７５ｍＬ／ｇ）を添加した。（Ｓ）－１－（４－メトキシフェニル）－エチルアミン（０．３３５ｍＬ／ｇ、１当量）を５分かけて滴下し、得られた反応混合物を４０～５０℃で１５分間撹拌し、次いで、室温まで冷却した。アセトニトリル（７．２５ｍＬ／ｇ）を添加し、反応物をシードした（０．０００１ｇ／ｇ、９９％ｅｅ、所望のアトロプ異性体の（Ｓ）－１－（４－メトキシフェニル）－エチルアミン塩）。反応混合物を１６時間撹拌し、得られた固体をアセトニトリルで濾過洗浄により単離した。アセトニトリル中の高温（７５～８０℃）スラリーは、キラル塩を白色の固体として得た（収率４０％、９８．１６％ｅｅ）。１Ｍ ＨＣｌ（２．２当量）を使用してＴＨＦ／水（２／２体積）中で塩破壊を行い、酸を得、これを水中スラリーによってさらに精製して、表題化合物（９０．５２ｇ、塩破壊収率９７％、全体収率３９％、９８．０６％ｅｅ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２，８３（ｂｒｓ，１Ｈ），７．７７－７．６７（ｍ，６Ｈ），７．２３－７．１０（ｍ，２Ｈ），７．０８－７．０１（ｍ，４Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝４．０ Ｈｚ，１Ｈ），６．５９－６．５８（ｄ，Ｊ＝４．０ Ｈｚ，１Ｈ）．キラルＨＰＬＣ法６を用いたキラルＨＰＬＣは、単一のアトロプ異性体、ＲＴ６．０８３分、９９．０２面積％（マイナーアトロプ異性体、ＲＴ７．０７分、０．９８面積％）を示した。
【0310】
キラル分割は、（Ｓ）－（－）－１－フェニルエチルアミンを使用して達成することもできる。
【0311】
ステップ５ａ：（Ｒ）－４－［５－（４－クロロフェニル）－１－［２－（トリフルオロメチル）フェニル］ピロール－２－イル］－Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド（１）
４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（単一のアトロプ異性体、（３））（１ｇ／ｇ、１当量）をＴＨＦ（５ｍＬ／ｇ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン（０．７５ｍＬ／ｇ、３当量）、続いてＤＩＰＥＡ（１．５８ｍＬ／ｇ、４当量）を滴下した。ＴＨＦ中の５０％Ｔ３Ｐ（２．７２ｍＬ／ｇ、２当量）を滴下し、反応混合物を２０℃で１５分間撹拌した。反応が完了するまで、ＴＨＦ中の５０％Ｔ３Ｐの追加分を添加した。反応混合物をｐＨ８～１０になるまで１０％ブライン（２ｍＬ／ｇ）及び水酸化ナトリウム溶液（２ｍＬ／ｇ）で希釈した。層を分離し、水層を酢酸エチル（２×５ｍＬ／ｇ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、表題化合物（８０ｇ、１５６ｍｍｏｌ、７１％）を白色のトリボルミネセンス固体として得た。キラルＨＰＬＣ法７を用いたキラルＨＰＬＣは、単一のアトロプ異性体、ＲＴ１２．６２分、９９．３２面積％（マイナーアトロプ異性体、ＲＴ１０．５８分、０．６７面積％）を示した。
４－（５－（４－クロロフェニル）－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）安息香酸（単一のアトロプ異性体、（３））（１ｇ／ｇ、１当量）をＴＨＦ（５ｍＬ／ｇ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン（０．７５ｍＬ／ｇ、３当量）、続いてＤＩＰＥＡ（１．５８ｍＬ／ｇ、４当量）を滴下した。ＴＨＦ中の５０％Ｔ３Ｐ（２．７２ｍＬ／ｇ、２当量）を滴下し、反応混合物を２０℃で１５分間撹拌した。反応が完了するまで、ＴＨＦ中の５０％Ｔ３Ｐの追加分を添加した。反応混合物をｐＨ８～１０になるまで１０％ブライン（２ｍＬ／ｇ）及び水酸化ナトリウム溶液（２ｍＬ／ｇ）で希釈した。層を分離し、水層を酢酸エチル（２×５ｍＬ／ｇ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、表題化合物（８０ｇ、１５６ｍｍｏｌ、７１％）を白色のトリボルミネセンス固体として得た。キラルＨＰＬＣ法７を用いたキラルＨＰＬＣは、単一のアトロプ異性体、ＲＴ１２．６２分、９９．３２面積％（マイナーアトロプ異性体、ＲＴ１０．５８分、０．６７面積％）を示した。
【0312】
例７
生物活性
Ａ．Ｕ８７ＭＧヒト膠芽腫がん細胞の生存率に対するアトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２の効果を測定するアッセイ
以下のプロトコルを使用して、Ｕ８７ＭＧ細胞の生存率に対するアトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２の効果を測定した。
生物活性
Ａ．Ｕ８７ＭＧヒト膠芽腫がん細胞の生存率に対するアトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２の効果を測定するアッセイ
以下のプロトコルを使用して、Ｕ８７ＭＧ細胞の生存率に対するアトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２の効果を測定した。
【0313】
Ｕ８７ＭＧ細胞を、推奨される増殖培地／補助物質（ＡＴＣＣ）中で増殖させた。細胞を５０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに３７℃、５％ＣＯ２で一晩播種した。細胞を、関連する濃度の試験化合物で７２時間処理した。７２時間のインキュベーション後、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）比色アッセイを用いて生存率を確立した。生存率をＤＭＳＯ処理対照サンプルの平均に対して計算し、細胞増殖の阻害についてのＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰（４パラメーターロジスティック方程式）により計算した。
【0314】
上記プロトコルに従ってアトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２について得られたＩＣ５０値を以下の表９に示す。
【表21】
【0315】
Ｂ．多様ながん細胞株パネルのがん細胞の生存率に対するアトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２の効果を測定するアッセイ
アトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２に対する感受性を示す腫瘍タイプを同定するために、多様ながん細胞株に対するスクリーニングを実行した。アトロプ異性体Ａ－１／Ａ－２の希釈液を使用するハイスループット増殖アッセイで、４８種のがん由来細胞株のパネルをスクリーニングした。スクリーニングされた細胞株には、膵臓、大腸／結腸直腸、肺、脳及び神経のがん、ならびにリンパ腫及び白血病細胞株を代表するものが含まれた。細胞株を化合物の連続半対数希釈物で処理し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して増殖について７２時間後にアッセイした。ＩＣ５０値を、非線形回帰モデルを使用して用量－反応データを適合させることにより計算した。アトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２のマイクロモル濃度でのＩＣ５０値を以下の表１０に示す。
データから分かり得るように、アトロプ異性体Ａ－２は、すべての細胞株に対してアトロプ異性体Ａ－１よりも有意に活性な細胞増殖阻害剤であった。
アトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２に対する感受性を示す腫瘍タイプを同定するために、多様ながん細胞株に対するスクリーニングを実行した。アトロプ異性体Ａ－１／Ａ－２の希釈液を使用するハイスループット増殖アッセイで、４８種のがん由来細胞株のパネルをスクリーニングした。スクリーニングされた細胞株には、膵臓、大腸／結腸直腸、肺、脳及び神経のがん、ならびにリンパ腫及び白血病細胞株を代表するものが含まれた。細胞株を化合物の連続半対数希釈物で処理し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して増殖について７２時間後にアッセイした。ＩＣ５０値を、非線形回帰モデルを使用して用量－反応データを適合させることにより計算した。アトロプ異性体Ａ－１及びＡ－２のマイクロモル濃度でのＩＣ５０値を以下の表１０に示す。
【表22-1】
【表22-2】
データから分かり得るように、アトロプ異性体Ａ－２は、すべての細胞株に対してアトロプ異性体Ａ－１よりも有意に活性な細胞増殖阻害剤であった。
【0316】
Ｃ．有糸分裂の細胞に対するアトロプ異性体Ａ－２の効果を測定するアッセイ
ＰＬＫ１及びＰＬＫ４のＰＢＤを介してそれらのパートナーに結合するＰＬＫ１及びＰＬＫ４の能力を阻害すると、細胞が有糸分裂で停止することは公知である。実験的には、これは、有糸分裂細胞中にのみ存在するマークであるリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨ３）の免疫蛍光検出により、試験化合物で処理した後の特定の時点で有糸分裂している細胞の数を評価することで測定することができる。ＰＬＫ１／４－ＰＢＤ阻害剤は、ｐＨ３陽性細胞の用量依存性の増加を引き起こすと予想され、これは、有糸分裂指数（ＭＩ）－特定の時点で、この有糸分裂マークに対して陽性である細胞のパーセンテージとして報告する。
ＰＬＫ１及びＰＬＫ４のＰＢＤを介してそれらのパートナーに結合するＰＬＫ１及びＰＬＫ４の能力を阻害すると、細胞が有糸分裂で停止することは公知である。実験的には、これは、有糸分裂細胞中にのみ存在するマークであるリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨ３）の免疫蛍光検出により、試験化合物で処理した後の特定の時点で有糸分裂している細胞の数を評価することで測定することができる。ＰＬＫ１／４－ＰＢＤ阻害剤は、ｐＨ３陽性細胞の用量依存性の増加を引き起こすと予想され、これは、有糸分裂指数（ＭＩ）－特定の時点で、この有糸分裂マークに対して陽性である細胞のパーセンテージとして報告する。
【0317】
異なる有糸分裂表現型が、細胞におけるＰＬＫ１及びＰＬＫ４の阻害後に誘導される。ＰＬＫ１のＰＢＤドメインの破壊は、ＡＴＰ競合ＰＬＫ１阻害剤によって誘導される単極紡錘体表現型とは異なる表現型である、非会合染色体による有糸分裂停止を引き起こすことが実証されている（Ｈａｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １７，４４８－４５９）。中心小体の集合はＰＬＫ４によって制御され、阻害剤は中心体の欠陥に起因して多極紡錘体表現型を誘導し、これが異常な細胞質分裂をもたらす（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２３９）；１１５５－１１６０）。
【0318】
以下のプロトコルを使用して、有糸分裂における細胞の停止及び表現型の分析に対するアトロプ異性体Ａ－２の効果を測定した。
【0319】
有糸分裂指数及び表現型プロトコル
細胞を９６ウェルプレートに１００００個／ウェルで培養し、一晩インキュベートした。翌日、ＤＭＳＯ中のアトロプ異性体Ａ－２ストックを培地に希釈し、次いで、細胞に対する最大最終ＤＭＳＯ濃度０．２％で細胞に添加した。細胞を化合物と２４時間インキュベートし、次いで３．７％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｙｄｅ）で固定した。細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理し、次いで抗ホスホヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ５１７６）とインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、４ｕｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｈ３５７０）の存在下でＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０３４）とインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｖ４ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを使用してＡｒｒａｙｓｃａｎ ＶＴｉ ＨＣＳ機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で画像化した。ホスホヒストンＨ３染色の強度に基づいて、有糸分裂細胞を同定するために、ユーザ定義の閾値を適用した。
細胞を９６ウェルプレートに１００００個／ウェルで培養し、一晩インキュベートした。翌日、ＤＭＳＯ中のアトロプ異性体Ａ－２ストックを培地に希釈し、次いで、細胞に対する最大最終ＤＭＳＯ濃度０．２％で細胞に添加した。細胞を化合物と２４時間インキュベートし、次いで３．７％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｙｄｅ）で固定した。細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理し、次いで抗ホスホヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ５１７６）とインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、４ｕｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｈ３５７０）の存在下でＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０３４）とインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｖ４ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを使用してＡｒｒａｙｓｃａｎ ＶＴｉ ＨＣＳ機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で画像化した。ホスホヒストンＨ３染色の強度に基づいて、有糸分裂細胞を同定するために、ユーザ定義の閾値を適用した。
【0320】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、最小二乗適合及び制約なしで、ｌｏｇ（阻害剤）対応答変数の傾きを使用して、化合物濃度に対する有糸分裂細胞％をプロットした。
【0321】
上記のプロトコルに従って得られた結果から、アトロプ異性体Ａ－２について、ＨｅＬａ及びＵ８７ＭＧ細胞株に対する有糸分裂におけるＥＣ５０値及び細胞のパーセンテージを得た。ＥＣ５０値を以下の表１１に示す。
別個の研究では、上記のプロトコルに従うが、アトロプ異性体Ａ－１及びアトロプ異性体Ａ－２のそれぞれについて０．０３μＭの単一の化合物濃度を使用して、Ｕ８７ＭＧ細胞で観察された有糸分裂表現型の頻度を手動で評価し、Ａ－１及びＡ－２のそれぞれについて以下の表現型：非会合染色体、多極紡錘体／異常な細胞質分裂、単極紡錘体、正常な前中期、正常な中期に分類した。結果を図１０に示す。
【表23】
別個の研究では、上記のプロトコルに従うが、アトロプ異性体Ａ－１及びアトロプ異性体Ａ－２のそれぞれについて０．０３μＭの単一の化合物濃度を使用して、Ｕ８７ＭＧ細胞で観察された有糸分裂表現型の頻度を手動で評価し、Ａ－１及びＡ－２のそれぞれについて以下の表現型：非会合染色体、多極紡錘体／異常な細胞質分裂、単極紡錘体、正常な前中期、正常な中期に分類した。結果を図１０に示す。
【0322】
図１０に示す結果は、アトロプ異性体Ａ－２が、アトロプ異性体Ａ－１よりも正常な有糸分裂を破壊するのにはるかに大きな効果を有することを実証している。したがって、Ａ－１では、細胞の７６％が正常な有糸分裂表現型を示し、ＤＭＳＯ対照で処理した細胞の７７％に匹敵し、ＤＭＳＯ対照で処理した２３％と比較して２４％が異常な細胞質分裂を示した。ＤＭＳＯ対照又はアトロプ異性体Ａ－１処理細胞のいずれにおいても、非会合染色体表現型の証拠は見られなかった。対照的に、より活性なアトロプ異性体Ａ－２での細胞の処理は、１７％のみの正常な有糸分裂表現型を有する細胞、７０％の異常な細胞質分裂を有する細胞、及び１３％の非会合染色体を有する細胞をもたらした。これらの表現型は、有糸分裂中のＰＬＫ１及びＰＬＫ４活性の破壊と一致する。
【0323】
Ｄ．中心体に対するアトロプ異性体Ａ－２の効果を測定するアッセイ
上記の研究Ｃの結果は、アトロプ異性体Ａ－２が、調節不全の中心体機能に特徴的な有糸分裂効果を引き起こすことを示す。したがって、中心体機能に対するＡ－２の効果をさらに調査した。セントリン１－ＧＦＰ融合タンパク質を安定に発現するＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに一晩播種した。細胞をアトロプ異性体Ａ－２（ＤＭＳＯ中０．０２μＭの濃度）又はＤＭＳＯ対照で７２時間処理し、次いで蛍光顕微鏡を使用して画像化した。各処理条件について複数の細胞視野を捕捉し、その後画像を手動で分析した。セントリン１－ＧＦＰは、中心小体を別々の焦点として特異的にマークし、したがって、細胞あたりの中心小体数を定量するために使用することができる。したがって、各処理条件について、１００個の細胞を分析し、各細胞に存在する中心小体の数を記録した。次いで、データをビン（中心小体なし、１つの中心小体、２つの中心小体、及び２つを超える中心小体）に分離し、図１１に示す。
上記の研究Ｃの結果は、アトロプ異性体Ａ－２が、調節不全の中心体機能に特徴的な有糸分裂効果を引き起こすことを示す。したがって、中心体機能に対するＡ－２の効果をさらに調査した。セントリン１－ＧＦＰ融合タンパク質を安定に発現するＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに一晩播種した。細胞をアトロプ異性体Ａ－２（ＤＭＳＯ中０．０２μＭの濃度）又はＤＭＳＯ対照で７２時間処理し、次いで蛍光顕微鏡を使用して画像化した。各処理条件について複数の細胞視野を捕捉し、その後画像を手動で分析した。セントリン１－ＧＦＰは、中心小体を別々の焦点として特異的にマークし、したがって、細胞あたりの中心小体数を定量するために使用することができる。したがって、各処理条件について、１００個の細胞を分析し、各細胞に存在する中心小体の数を記録した。次いで、データをビン（中心小体なし、１つの中心小体、２つの中心小体、及び２つを超える中心小体）に分離し、図１１に示す。
【0324】
データから、アトロプ異性体Ａ－２が、ＨｅＬａ細胞のＰＬＫ４阻害表現型の証拠を示すと結論付けることができる。
【0325】
Ｅ．野生型対ＫＲＡＳ ＨｅＬａ細胞の生存率に対するアトロプ異性体Ａ－２の効果を測定するアッセイ
野生型ＨｅＬａ細胞及びＫＲＡＳ癌遺伝子を有するＨｅＬａ細胞に対するアトロプ異性体Ａ－２の効果を比較するためにアッセイを行った。
野生型ＨｅＬａ細胞及びＫＲＡＳ癌遺伝子を有するＨｅＬａ細胞に対するアトロプ異性体Ａ－２の効果を比較するためにアッセイを行った。
【0326】
したがって、アトロプ異性体Ａ－２は、ＦＬＰ－ｉｎ／Ｔ－Ｒｅｘシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、野生型又は発がん性のＫＲａｓＧ１２Ｖ導入遺伝子を誘導的に発現するように設計されたＨｅＬａ細胞で試験した。細胞を培養し、次いでドキシサイクリンの有無にかかわらず導入遺伝子の発現を誘導し、次いで連続希釈アトロプ異性体Ａ－２で処理した。７２時間のインキュベーション後、細胞力価ブルー試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＢＭＧ Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーを使用して、細胞の生存率を評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、野生型又は発がん性のＧ１２Ｖ ＫＲＡＳの細胞の生存率に対するＰＢＤ阻害の効果を評価した。
【0327】
上記のプロトコルに従って得られた結果から、アトロプ異性体Ａ－２について、野生型及びＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＨｅＬａ細胞株に対するＧＩ５０値を決定し、以下の表１２に示す。
【表24】
【0328】
Ｆ．キナーゼ選択性アッセイ
本明細書で提供される証拠は、アトロプ異性体Ａ－２が、ＰＬＫ１及びＰＬＫ４のＰＢＤドメインに結合するが、ＰＬＫ１及びＰＬＫ４の触媒ドメインには結合せず、他のキナーゼよりも良好な選択性を示すはずであることを示す。アトロプ異性体Ａ－２を、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ＫｉｎｏｍｅＳｃｒｅｅｎアッセイを使用して、３μＭの濃度でキノーム全体に分布する９７個のキナーゼのパネルに対するオフターゲット活性について試験することにより調査した。
本明細書で提供される証拠は、アトロプ異性体Ａ－２が、ＰＬＫ１及びＰＬＫ４のＰＢＤドメインに結合するが、ＰＬＫ１及びＰＬＫ４の触媒ドメインには結合せず、他のキナーゼよりも良好な選択性を示すはずであることを示す。アトロプ異性体Ａ－２を、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ＫｉｎｏｍｅＳｃｒｅｅｎアッセイを使用して、３μＭの濃度でキノーム全体に分布する９７個のキナーゼのパネルに対するオフターゲット活性について試験することにより調査した。
【0329】
ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ＫｉｎｏｍｅＳｃｒｅｅｎアッセイは、溶液中でキナーゼに結合又は捕捉することができる固体支持された対照化合物の使用によって、キナーゼに対する化合物の結合親和性を測定する部位特異的競合結合アッセイである。キナーゼ阻害剤試験化合物が存在しない場合、キナーゼのすべてが固体支持体に結合する。キナーゼ阻害剤試験化合物がアッセイミックスに添加される場合、固体支持体に結合するキナーゼの量は減少し、減少の程度はキナーゼ阻害剤としての試験化合物の効力に依存する。キナーゼに対する試験化合物の効力は、所与の濃度の試験化合物で固体支持体に結合するキナーゼのパーセンテージ（対照パーセント）として表すことができ、パーセンテージが低いほど、試験化合物のキナーゼ結合能はより強力である。したがって、１００％の対照パーセント値は、キナーゼのすべてが固体支持体に結合しているので、試験化合物がキナーゼに全く結合しないことを示すであろう。逆に、０％の対照パーセント値は、固体支持体に結合しているものがないので、試験化合物がすべてのキナーゼに結合したことを示すであろう。
【0330】
プロトコル：
ほとんどのアッセイのために、キナーゼタグ付きＴ７ファージ株を、ＢＬ２１株に由来する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主において２４ウェルブロックで並行して増殖させた。
ほとんどのアッセイのために、キナーゼタグ付きＴ７ファージ株を、ＢＬ２１株に由来する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主において２４ウェルブロックで並行して増殖させた。
【0331】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を対数期まで増殖させ、凍結ストックからのＴ７ファージで感染させ（感染多重度＝０．４）、溶解するまで（９０～１５０分間）３２℃で振盪しながらインキュベートした。溶解物を遠心分離し（６，０００×ｇ）、濾過して（０．２μｍ）、細胞残屑を除去した。残りのキナーゼをＨＥＫ－２９３細胞で産生し、続いてｑＰＣＲ検出のためにＤＮＡでタグ付けした。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズをビオチン化小分子リガンドで室温で３０分間処理して、キナーゼアッセイ用の親和性樹脂を生成した。リガンドを有するビーズを過剰のビオチンでブロックし、ブロッキング緩衝液（ＳｅａＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄して、未結合リガンドを除去し、非特異的ファージ結合を減少させた。結合反応物を、キナーゼ、リガンドを有するアフィニティービーズ、及び試験化合物を１×結合緩衝液（２０％ＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、６ｍＭ ＤＴＴ）中で合わせることによってアセンブルした。試験化合物を１００％ＤＭＳＯ中の４０×ストックとして調製し、アッセイで直接希釈した。すべての反応は、最終容量０．０２ｍｌのポリプロピレン３８４ウェルプレート中で実行した。アッセイプレートを室温で振盪しながら１時間インキュベートし、アフィニティービーズを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。次いで、ビーズを溶出緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５μＭ非ビオチン化アフィニティーリガンド）に再懸濁し、室温で振盪しながら３０分間インキュベートした。溶出液中のキナーゼ濃度をｑＰＣＲにより測定した。
【0332】
キナーゼ活性部位に結合し、直接的に（立体的に）又は間接的に（アロステリックに）キナーゼが固定化リガンドに結合するのを妨げる化合物は、固体支持体上に捕捉されるキナーゼの量を減少させる。逆に、キナーゼに結合しない試験分子は、固体支持体上に捕捉されたキナーゼの量に影響を及ぼさない。
【0333】
試験分子のキナーゼへの結合の強度は、対照パーセント（％Ｃｔｒｌ）として表すことができる。
【0334】
対照パーセント（％Ｃｔｒｌ）
化合物（複数可）を３０００ｎＭの濃度でスクリーニングし、一次スクリーニング結合相互作用の結果を「％Ｃｔｒｌ」として報告し、以下の頁では、数字が小さいほど、マトリックスにおけるヒットが強いことを示す。
％Ｃｔｒｌ計算
化合物（複数可）を３０００ｎＭの濃度でスクリーニングし、一次スクリーニング結合相互作用の結果を「％Ｃｔｒｌ」として報告し、以下の頁では、数字が小さいほど、マトリックスにおけるヒットが強いことを示す。
％Ｃｔｒｌ計算
【数1】
【0335】
パネルキナーゼに対するアトロプ異性体Ａ－２の％Ｃｔｒｌ値を以下の表１３に示す。
【表25-1】
【表25-2】
【0336】
９７個のキナーゼに対する結果は、アトロプ異性体Ａ－２が広範囲のキナーゼに対してわずかな又は存在しない結合活性を有し、したがって、オフターゲットキナーゼ阻害に関連する問題を被りにくいことを実証している。
【0337】
ＰＬＫ１及びＰＬＫ４の場合、アトロプ異性体Ａ－２は、これらのキナーゼの触媒ドメインに対してほとんど又は全く結合親和性を示さなかった（それぞれ９７％及び１００％の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値）。したがって、上記の例で実証されたＰＬＫ１／ＰＬＫ４阻害活性を示す活性プロファイルは、ＰＬＫ１及びＰＬＫ４の非触媒ポロボックスドメインへの結果であると結論付けられる。
【0338】
Ｇ．マウスＰＫにおける経口バイオアベイラビリティ及び脳曝露の判定
アトロプ異性体Ａ－２をインビボマウスモデルで評価して、ｐ．ｏ．及びｉ．ｖ．投与後の脳及び血漿濃度を決定した。
アトロプ異性体Ａ－２をインビボマウスモデルで評価して、ｐ．ｏ．及びｉ．ｖ．投与後の脳及び血漿濃度を決定した。
【0339】
以下のプロトコルに従った：
雄のＣＤ－１マウスに、アトロプ異性体Ａ－２をｉ．ｖ．投与（２ｍｇ／ｋｇ）又はｐ．ｏ．投与（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかによって投与した。
雄のＣＤ－１マウスに、アトロプ異性体Ａ－２をｉ．ｖ．投与（２ｍｇ／ｋｇ）又はｐ．ｏ．投与（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかによって投与した。
【0340】
分析のために、２、１０、３０分、１、２、４、８、及び２４（ｉ．ｖの場合）でのｉ．ｖ．レッグの８個のサンプル、１５、３０分、１、２、４、８、２４、４８、及び７２時間でのｐ．ｏ．レッグの９個のサンプルを採取した。
【0341】
アトロプ異性体Ａ－２は、各時点あたりＮ＝３匹のマウスのｉ．ｖ．及びｐ．ｏ．投与のために１０％ＤＭＳＯ／９５％ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（水中２０％ｗ／ｖ）で処方した。
【0342】
投与後、最終血液サンプルを個々の動物から採取し、抗凝固剤（ＥＤＴＡ）を含有する標識ポリプロピレンチューブに送達した。コホート内のすべての動物のサンプリングが完了するまでの間、サンプルを最大３０分間、湿った氷上で保持した。血液サンプルを血漿のために遠心分離し（４℃、２１１００ｇで５分間）、得られた血漿を対応する標識チューブに移した。各ＰＯ投与された動物の終末脳を切除し、生理食塩水ですすぎ、予め秤量した標識ポリプロピレンチューブに入れ、貯蔵前にサンプルを再秤量した。
【0343】
液体クロマトグラフィーを使用して定量的生物分析を実施し、質量分析を実行した。結果を以下の表１４及び１５ならびに図１２及び１３に示す。
【0344】
経口バイオアベイラビリティ
結果は、マウスへの経口投与後にアトロプ異性体Ａ－２が高度に吸収されることを実証している。
【表26】
【表27】
結果は、マウスへの経口投与後にアトロプ異性体Ａ－２が高度に吸収されることを実証している。
【0345】
脳曝露
表１６に示す脳曝露試験の結果は、アトロプ異性体Ａ－２がマウスへの経口投与後に３．３のＡＵＣ Ｂ：Ｐ比で高い脳曝露を有することを実証している。
【表28】
表１６に示す脳曝露試験の結果は、アトロプ異性体Ａ－２がマウスへの経口投与後に３．３のＡＵＣ Ｂ：Ｐ比で高い脳曝露を有することを実証している。
【0346】
Ｈ．インビボ有効性
アトロプ異性体Ａ－２は、以下に記載される研究により示されるように、腫瘍を皮下及び同所に移植した場合、膠芽腫マウスモデルにおいて有効性を示す。
アトロプ異性体Ａ－２は、以下に記載される研究により示されるように、腫瘍を皮下及び同所に移植した場合、膠芽腫マウスモデルにおいて有効性を示す。
【0347】
（ｉ）Ｕ８７ＭＧ皮下異種移植モデルにおけるインビボ抗がん活性
Ｕ８７ＭＧ腫瘍を保有する雄性無胸腺ヌードマウスに、１００ｍｇ／ｋｇのアトロプ異性体Ａ－２の経口用量を１、４、及び７日目に与え、腫瘍体積を２０日間にわたって測定した。同じ時点でのみビヒクルを受容した腫瘍保有マウスの対照群の腫瘍体積も測定した。図１４に示すように、処置群は、対照と比較して有意に減少した腫瘍体積を示した（１３日目に３．８５％Ｔ／Ｃ）。
Ｕ８７ＭＧ腫瘍を保有する雄性無胸腺ヌードマウスに、１００ｍｇ／ｋｇのアトロプ異性体Ａ－２の経口用量を１、４、及び７日目に与え、腫瘍体積を２０日間にわたって測定した。同じ時点でのみビヒクルを受容した腫瘍保有マウスの対照群の腫瘍体積も測定した。図１４に示すように、処置群は、対照と比較して有意に減少した腫瘍体積を示した（１３日目に３．８５％Ｔ／Ｃ）。
【0348】
（ｉｉ）Ｕ８７－Ｌｕｃ同所異種移植モデルにおけるインビボ抗がん活性
Ｕ８７－Ｌｕｃ細胞を雄性無胸腺ヌードマウスの脳内に脳内移植し、腫瘍の増殖を生物発光シグナルによってモニターした。処置群では、動物に、１００ｍｇ／ｋｇのアトロプ異性体Ａ－２の経口用量を１、４、７、１０、及び１３日目に与えた。対照群の動物にはビヒクルのみを与えた。図１５に示す結果は、１５日目の処置群対対照群の腫瘍シグナルの減少を実証している。
Ｕ８７－Ｌｕｃ細胞を雄性無胸腺ヌードマウスの脳内に脳内移植し、腫瘍の増殖を生物発光シグナルによってモニターした。処置群では、動物に、１００ｍｇ／ｋｇのアトロプ異性体Ａ－２の経口用量を１、４、７、１０、及び１３日目に与えた。対照群の動物にはビヒクルのみを与えた。図１５に示す結果は、１５日目の処置群対対照群の腫瘍シグナルの減少を実証している。
【0349】
（ｉｉｉ）ＨＣＴ１１６腫瘍を保有するマウスのインビボ抗がん活性
アトロプ異性体Ａ－２は、以下のように、ＫＲＡＳ変異結腸直腸がんモデルにおいて有効性を示した。
アトロプ異性体Ａ－２は、以下のように、ＫＲＡＳ変異結腸直腸がんモデルにおいて有効性を示した。
【0350】
ＨＣＴ１１６異種移植腫瘍を保有する雄性無胸腺ヌードマウスに、１００ｍｇ／ｋｇのアトロプ異性体Ａ－２の経口用量を１、８、及び１５日目に与え、腫瘍体積を３週間にわたって測定した。同じ時点でのみビヒクルを受容した腫瘍保有マウスの対照群の腫瘍体積も測定した。
【0351】
図１６に示す結果は、２０日目で腫瘍の増殖に対する顕著な効果（ＴＧＩ ６０％）を実証している。
【0352】
医薬製剤
（ｉ）錠剤製剤
態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を含有する錠剤組成物は、５０ｍｇの化合物を希釈剤として１９７ｍｇのラクトース（ＢＰ）、及び潤滑剤として３ｍｇのステアリン酸マグネシウムと混合し、圧縮して既知の方法で錠剤を形成することにより調製される。
（ｉ）錠剤製剤
態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を含有する錠剤組成物は、５０ｍｇの化合物を希釈剤として１９７ｍｇのラクトース（ＢＰ）、及び潤滑剤として３ｍｇのステアリン酸マグネシウムと混合し、圧縮して既知の方法で錠剤を形成することにより調製される。
【0353】
（ｉｉ）カプセル製剤
カプセル製剤は、１００ｍｇの態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を１００ｍｇのラクトースと混合し、得られた混合物を標準的な不透明な硬ゼラチンカプセルに充填することにより調製される。
カプセル製剤は、１００ｍｇの態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を１００ｍｇのラクトースと混合し、得られた混合物を標準的な不透明な硬ゼラチンカプセルに充填することにより調製される。
【0354】
（ｉｉｉ）注射製剤Ｉ
注射による投与のための非経口組成物は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を１０％のプロピレングリコールを含有する水に溶解して１．５重量％の活性化合物の濃度を得ることにより調製することができる。次いで、溶液を濾過滅菌し、アンプルに充填して密封する。
注射による投与のための非経口組成物は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の酒石酸塩、又は物質の組成物を１０％のプロピレングリコールを含有する水に溶解して１．５重量％の活性化合物の濃度を得ることにより調製することができる。次いで、溶液を濾過滅菌し、アンプルに充填して密封する。
【0355】
（ｉｖ）注射製剤ＩＩ
注射用の非経口組成物は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の酒石酸塩、又は物質の組成物（２ｍｇ／ｍｌ）及びマンニトール（５０ｍｇ／ｍｌ）を水に溶解し、溶液を滅菌濾過し、密封可能な１ｍｌのバイアル又はアンプルに充填することにより調製される。
注射用の非経口組成物は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の酒石酸塩、又は物質の組成物（２ｍｇ／ｍｌ）及びマンニトール（５０ｍｇ／ｍｌ）を水に溶解し、溶液を滅菌濾過し、密封可能な１ｍｌのバイアル又はアンプルに充填することにより調製される。
【0356】
（ｖ）注射製剤ＩＩＩ
注射又は注入によるｉ．ｖ．送達用製剤は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の物質の組成物を２０ｍｇ／ｍｌの水に溶解することにより調製することができる。次いで、バイアルを密封し、オートクレーブ滅菌する。
注射又は注入によるｉ．ｖ．送達用製剤は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の物質の組成物を２０ｍｇ／ｍｌの水に溶解することにより調製することができる。次いで、バイアルを密封し、オートクレーブ滅菌する。
【0357】
（ｖｉ）注射製剤ＩＶ
注射又は注入によるｉ．ｖ．送達用製剤は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の物質の組成物を、２０ｍｇ／ｍｌの緩衝液（例えば、０．２ＭアセタートｐＨ４．６）を含有する水に溶解することにより調製することができる。次いで、バイアルを密封し、オートクレーブ滅菌する。
注射又は注入によるｉ．ｖ．送達用製剤は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の物質の組成物を、２０ｍｇ／ｍｌの緩衝液（例えば、０．２ＭアセタートｐＨ４．６）を含有する水に溶解することにより調製することができる。次いで、バイアルを密封し、オートクレーブ滅菌する。
【0358】
（ｖｉｉ）皮下注射製剤
皮下投与用組成物は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の物質の組成物を医薬品グレードのコーン油と混合して５ｍｇ／ｍｌの濃度にすることにより調製される。組成物は滅菌され、好適な容器に充填される。
皮下投与用組成物は、態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の物質の組成物を医薬品グレードのコーン油と混合して５ｍｇ／ｍｌの濃度にすることにより調製される。組成物は滅菌され、好適な容器に充填される。
【0359】
（ｖｉｉｉ）凍結乾燥製剤
態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の物質の組成物を配合したアリコートを５０ｍｌバイアルに入れ、凍結乾燥する。凍結乾燥中、組成物は（－４５°Ｃ）で１ステップ凍結プロトコルを使用して凍結する。アニーリングのために温度を－１０°Ｃに上げ、次いで下げて－４５°Ｃで凍結させ、その後＋２５°Ｃで約３４００分間一次乾燥し、その後温度が５０°Ｃの場合はステップを増やして二次乾燥する。一次及び二次乾燥中の圧力は８０ミリトールに設定する。
態様１．１～１．１９のいずれか１つ、又は上記の例に記載の物質の組成物を配合したアリコートを５０ｍｌバイアルに入れ、凍結乾燥する。凍結乾燥中、組成物は（－４５°Ｃ）で１ステップ凍結プロトコルを使用して凍結する。アニーリングのために温度を－１０°Ｃに上げ、次いで下げて－４５°Ｃで凍結させ、その後＋２５°Ｃで約３４００分間一次乾燥し、その後温度が５０°Ｃの場合はステップを増やして二次乾燥する。一次及び二次乾燥中の圧力は８０ミリトールに設定する。
【0360】
等価物
前述の例は、本発明を説明する目的で提示されており、本発明の範囲に何らかの制限を課すものと解釈されるべきではない。本発明の基礎をなす原理から逸脱することなく、上記で説明し、例で示した本発明の具体的な態様に対して多数の修正及び変更を行い得ることは容易に明らかであろう。そのようなすべての修正及び変更は、本出願に包含されることが意図されている。
前述の例は、本発明を説明する目的で提示されており、本発明の範囲に何らかの制限を課すものと解釈されるべきではない。本発明の基礎をなす原理から逸脱することなく、上記で説明し、例で示した本発明の具体的な態様に対して多数の修正及び変更を行い得ることは容易に明らかであろう。そのようなすべての修正及び変更は、本出願に包含されることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】