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特表2023-544300バリアントＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ ＬＵＫＡ及びＬＵＫＢポリペプチド並びにワクチン組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-23
(54)【発明の名称】バリアントＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ ＬＵＫＡ及びＬＵＫＢポリペプチド並びにワクチン組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20231016BHJP
C07K 14/31 20060101ALI20231016BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231016BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231016BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231016BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231016BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231016BHJP
A61K 39/085 20060101ALI20231016BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20231016BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20231016BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231016BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C07K14/31
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/085
A61K39/39
A61P31/04
A61P37/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023519355
(86)(22)【出願日】2021-09-28
(85)【翻訳文提出日】2023-05-22
(86)【国際出願番号】 US2021052418
(87)【国際公開番号】W WO2022067255
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】63/084,273
(32)【優先日】2020-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．プルロニック
３．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514010601
【氏名又は名称】ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド
(71)【出願人】
【識別番号】500350265
【氏名又は名称】ニューヨーク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】モロウ，ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】コンスタンチノフ，セルゲイ
(72)【発明者】
【氏名】フールトセン，ジェローン
(72)【発明者】
【氏名】ルオ，ジンクアン
(72)【発明者】
【氏名】ソマニ，サンディープ
(72)【発明者】
【氏名】バックレー，ピーター ティー．
(72)【発明者】
【氏名】トレス，ビクター ジェイ．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA45
4B065CA46
4C085AA03
4C085AA04
4C085BA13
4C085BA43
4C085CC07
4C085DD61
4C085EE01
4C085EE03
4C085EE06
4C085FF24
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）及びロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）バリアントポリペプチド、並びにＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ及びＬｕｋＡＢバリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本開示は更に、これらのＬｕｋＡ及びＬｕｋＢバリアントを含むワクチン組成物、並びに対象においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を生成する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２５のバリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）ポリペプチドであって、前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、及びＶａｌ１９３に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、バリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＬｕｋＡポリペプチド。
【請求項2】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のＧｌｕ３２３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を更に含む、請求項１に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項3】
前記Ｇｌｕ３２３に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、グルタミン酸からアラニンへの（Ｇｌｕ３２３Ａｌａ）置換を含む、請求項２に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項4】
前記Ｌｙｓ８３に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、リジンからメチオニンへの（Ｌｙｓ８３Ｍｅｔ）置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項5】
前記Ｓｅｒ１４１に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、セリンからアラニンへの（Ｓｅｒ１４１Ａｌａ）置換を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項6】
前記Ｖａｌ１１３に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、バリンからイソロイシンへの（Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ）置換を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項7】
前記Ｖａｌ１９３に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、バリンからイソロイシンへの（Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ）置換を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項8】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３及びＧｌｕ３２３に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項２～７のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項9】
前記アミノ酸置換が、Ｌｙｓ８３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１４１Ａｌａ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ及びＧｌｕ３２３Ａｌａを含む、請求項８に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項10】
前記バリアントが、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ及びＧｌｕ３２０Ａｌａに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントである、請求項１に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項11】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項12】
前記バリアントが、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ及びＧｌｕ３２１Ａｌａに対応するアミノ酸置換を含む配列番号２のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントである、請求項１に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項13】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項14】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項15】
前記Ｔｙｒ７４に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、チロシンからシステインへの（Ｔｙｒ７４Ｃｙｓ）置換を含む、請求項１４に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項16】
前記Ａｓｐ１４０に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、アスパラギンからシステインへの（Ａｓｐ１４０Ｃｙｓ）置換を含む、請求項１４又は１５に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項17】
前記Ｇｌｙ１４９に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、グリシンからシステインへの（Ｇｌｙ１４９Ｃｙｓ）置換を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項18】
前記Ｇｌｙ１５６に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、グリシンからシステインへの（Ｇｌｙ１５６Ｃｙｓ）置換を含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項19】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９及びＧｌｙ１５６に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド
【請求項20】
前記バリアントが、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、Ｔｙｒ７１Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４６Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５３Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントである、請求項１４に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項21】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項22】
前記バリアントが、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ，Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、Ｔｙｒ７２Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３８Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４７Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５４Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号２のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントである、請求項１４に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項23】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項24】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｈｒ２４９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項25】
前記Ｔｈｒ２４９に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、トレオニンからバリンへの（Ｔｈｒ２４９Ｖａｌ）置換を含む、請求項２４に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項26】
前記バリアントＬｕｋＡタンパク質が、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド
【請求項27】
アミノ末端シグナル配列を更に含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項28】
前記アミノ末端シグナル配列が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項29】
アミノ末端精製配列を更に含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド。
【請求項30】
請求項１～２９のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項31】
請求項３０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項32】
請求項３１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項33】
配列番号３９のバリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸残基Ｖａｌ５３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、バリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチド。
【請求項34】
前記Ｖａｌ５３に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、バリンからロイシンへの（Ｖａｌ５３Ｌｅｕ）置換を含む、請求項３３に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項35】
前記バリアントが、配列番号１５のＶａｌ５３Ｌｅｕに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントである、請求項３３に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド
【請求項36】
前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項37】
前記バリアントが、配列番号１６のＶａｌ５３Ｌｅｕに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントである、請求項３３に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド
【請求項38】
前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項39】
前記バリアントが、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を更に含む、請求項３３又は３４に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項40】
前記Ｇｌｕ４５に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、グルタミン酸からシステインへの（Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ）置換を含む、請求項３９に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項41】
前記Ｇｌｕ１０９に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、グルタミン酸からシステインへの（Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ）置換を含む、請求項３９又は４０に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項42】
前記Ｔｈｒ１２１に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、トレオニンからシステインへの（Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ）置換を含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項43】
前記Ａｒｇ１５４に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、アルギニンからシステインへの（Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ）置換を含む、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項44】
前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項45】
前記バリアントが、配列番号１５のＶａｌ５３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ及びＡｒｇ１５４Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントである、請求項３９に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項46】
前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項47】
前記バリアントが、配列番号１６のＶａｌ５３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２３Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５５Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントである、請求項３３に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項48】
前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項49】
配列番号３９のバリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、バリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチド。
【請求項50】
前記Ｇｌｕ４５に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、グルタミン酸からシステインへの（Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ）置換を含み、前記Ｔｈｒ１２１に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、トレオニンからシステインへの（Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ）置換を含む、請求項４９に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項51】
前記Ｇｌｕ１０９に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、グルタミン酸からシステインへの（Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ）置換を含み、前記Ａｒｇ１５４に対応するアミノ酸残基での前記アミノ酸置換が、アルギニンからシステインへの（Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ）置換を含む、請求項４９又は５０に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項52】
前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項４９～５１のいずれか一項に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項53】
前記バリアントが、配列番号１５のＧｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５４Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントである、請求項５２に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項54】
前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項55】
前記バリアントが、配列番号１６のＧｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２３Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５５Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントである、請求項５２に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項56】
前記ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項57】
アミノ末端シグナル配列を更に含む、請求項３３～５６のいずれか一項に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項58】
前記アミノ末端シグナル配列が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド
【請求項59】
アミノ末端精製タグを更に含む、請求項３３～５８のいずれか一項に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチド。
【請求項60】
請求項３３～５９のいずれか一項に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項61】
請求項６０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項62】
請求項６０に記載の核酸分子に作動可能に連結された請求項３０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項63】
請求項６１又は６２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項64】
請求項１～２９のいずれか一項に記載の１つ以上のバリアントＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物。
【請求項65】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号１のバリアントである、請求項６４に記載のワクチン組成物。
【請求項66】
ロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する前記ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを更に含む、請求項６４又は６５に記載のワクチン組成物。
【請求項67】
ロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する前記ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを更に含む、請求項６４又は６５に記載のワクチン組成物。
【請求項68】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｌｙｓ８０、Ｓｅｒ１３８、Ｖａｌ１１０、Ｖａｌ１９０、及びＧｌｕ３２０Ａｌａに対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項６７に記載のワクチン組成物。
【請求項69】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、アミノ酸配列配列番号３を含み、前記ＬｕｋＢポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載のワクチン組成物。
【請求項70】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載のワクチン組成物。
【請求項71】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載のワクチン組成物。
【請求項72】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２のバリアントである、請求項６４に記載のワクチン組成物。
【請求項73】
ロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを更に含む、請求項７２に記載のワクチン組成物。
【請求項74】
ロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを更に含む、請求項７２に記載のワクチン組成物。
【請求項75】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基Ｌｙｓ８１、Ｓｅｒ１３９、Ｖａｌ１１１、Ｖａｌ１９１、及びＧｌｕ３２１Ａｌａに対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項７３に記載のワクチン組成物。
【請求項76】
前記ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、アミノ酸配列配列番号４を含み、前記ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項７５に記載のワクチン組成物。
【請求項77】
請求項３３～５６のいずれか一項に記載の１つ以上のバリアントＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物。
【請求項78】
ロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１（ＣＣ８）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する、ＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドを更に含む、請求項７７に記載のワクチン組成物。
【請求項79】
ロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号２（ＣＣ４５）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する、ＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドを更に含む、請求項７７に記載のワクチン組成物。
【請求項80】
請求項１～３２のいずれか一項に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドと、請求項３３～５６のいずれか一項に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドと、を含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物。
【請求項81】
アジュバントを更に含む、請求項６４～８０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項82】
１つ以上の追加のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原を更に含む、請求項６４～８１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項83】
対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を生成する方法であって、前記方法が、前記対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する前記免疫応答を生成するのに有効な条件下で、請求項６４～８１のいずれか一項に記載のワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項84】
対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を生成する方法における使用のための、請求項６４～８１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０８４，２７３号の優先権の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、バリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）及びロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質及びポリペプチド、これらのＬｕｋＡ及びＬｕｋＢバリアントを含むワクチン組成物、並びにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染症の治療及び／又は予防のための対象における細胞傷害を誘発するための記載されたワクチン組成物の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは、敗血症、感染性心内膜炎、及び毒素ショックを含む広範な侵襲的疾患、並びに重症度の低い皮膚及び軟部組織感染症を引き起こす（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ”Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２８（３）：６０３－６６１（２０１５））。現在、Ｓ．ａｕｒｅｕｓと闘うための承認されているワクチンはなく、抗生物質耐性出現によって治療の選択肢が更に制限されている（Ｓａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｒｏｍｉｓｅ ｔｏ Ｃｏｍｂａｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３７（３）：２３１－２４１（２０１６））。多様な臨床症候群を引き起こすＳ．ａｕｒｅｕｓの能力は、多くの場合、ゲノム量の大きな変化に関連している（Ｃｏｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｕｇｅ：Ｍｉｎｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｈｏｓｔ－Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：４３－５０（２０１８）及びＲｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｂａｃｔｅｒａｅｍｉａ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，”Ｎａｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２（１０）：１３８１－１３８８（２０１７））。特に、ゲノムの約４０％は、全てのＳ．ａｕｒｅｕｓ分離株によって共有されるわけではない（Ｂｏｓｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｓｔｒａｉｎｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｓｔｒａｉｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ Ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１３（２６）：Ｅ３８０１－３８０９（２０１６））ので、ワクチン及び生物製剤の生成のための保存された標的の特定を更に複雑にする。
【0004】
本開示は、当技術分野におけるこれら及び他の制限を克服することを対象とする。
【発明の概要】
【0005】
本開示の第１の態様は、バリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）タンパク質又はそのポリペプチドに関する。一態様では、ＬｕｋＡバリアントは、配列番号２５のアミノ酸残基Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、配列番号２５のＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドのバリアントである。
【0006】
本開示の追加の態様は、上記のものに対する１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加を有するＬｕｋＡバリアントに関する。本開示はまた、バリアントＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子、及び前述の核酸分子を含む発現ベクターにも関する。
【0007】
本開示の別の態様は、バリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はそのポリペプチドに関する。一態様では、ＬｕｋＢバリアントは、配列番号３９のアミノ酸残基Ｖａｌ５３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、配列番号３９のＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドのバリアントである。
【0008】
一態様では、ＬｕｋＢバリアントは、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１及びＡｒｇ１５４に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、配列番号３９のＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドのバリアントである。
【0009】
本開示の追加の態様は、上記のものに対する１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加を有するＬｕｋＢバリアントに関する。本開示はまた、バリアントＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子、及び前述の核酸分子を含む発現ベクターにも関する。
【0010】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＬｕｋＢポリペプチド又はＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードする核酸分子と作動可能に連結された、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを対象とする。
【0011】
本開示の別の態様は、本明細書に記載される発現ベクターのいずれか１つ以上を含む宿主細胞を対象とする。
【0012】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物を対象とする。
【0013】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＬｕｋＢバリアントポリペプチドを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物を対象とする。
【0014】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチド及び本明細書に記載されるＬｕｋＢバリアントポリペプチドを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物を対象とする。
【0015】
本開示の別の態様は、対象においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を生成する方法に関する。本方法は、対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する当該免疫応答を生成するのに有効な条件下で、本明細書に記載されるワクチン組成物を当該対象に投与することを含む。
【0016】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、多数の院内感染及び市中感染の原因となっている。免疫系によるクリアランスを逃れるために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、ロイコシジンとして知られる２成分の膜孔形成毒素の分泌を含む幅広い戦略を採用する。各ロイコシジンは、約３００アミノ酸長の２つのポリペプチドから構成され、宿主細胞標的化（そのクロマトグラフィー溶出プロファイルに基づく低速のＳ）及び重合（高速のＦ）サブユニットとして分類される。ヒトＳ．ａｕｒｅｕｓ単離株には、最大で５つのロイコシジンが記載されている。パントン－バレンタインロイコシジン（ＰＶＬ、又はＬｕｋＳＦ－ＰＶ）、ガンマ－ヘモリジン（ＨｌｇＡＢ及びＨｌｇＣＢ）、ロイコシジンＥＤ（ＬｕｋＥＤ）及びロイコシジンＡＢ（ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＧＨとも呼ばれる）。ロイコシジンは特定の細胞表面タンパク質受容体に結合し、オリゴマー細孔にアセンブルされ、最終的には急速な浸透圧の調節解除により細胞溶解を引き起こす（Ｓｐａａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎｓ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｂｉ－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｐｏｒｅ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｏｘｉｎｓ ｆｉｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５（７）：４３５－４４７（２０１７））。
【0017】
最も最近特定されたロイコシジン、ＬｕｋＡＢ（ＤｕＭｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ｔｈａｔ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ”Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（３）：８１４－８２５（２０１１））は、他の２成分ロイキジンと区別するいくつかの固有の特徴を有する。ＬｕｋＡ（Ｓ型）及びＬｕｋＢ（Ｆ型）サブユニットは、個々の単量体ではなく溶液中で予め組み立てられた二量体として存在する（ＤｕＭｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｒｕｃｉａｌ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＬｕｋＡＢ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８２（３）：１２６８－１２７６（２０１４））。更に、ＬｕｋＡＢは、宿主細胞表面上のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンを標的とし（ＤｕＭｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＬｕｋＡＢ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ｋｉｌｌｓ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ１１ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍａｃ－１”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１０（２６）：１０７９４－９（２０１３））、特定の７回膜貫通型ケモカイン受容体と相互作用するＰＶＬ、ＬｕｋＥＤ、ＨｌｇＡＢ、及びＨｌｇＣＢ とは異なる（Ｓｐａａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎｓ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｂｉ－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｐｏｒｅ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｏｘｉｎｓ ｆｉｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５（７）：４３５－４４７（２０１７））。最後に、ＬｕｋＡＢは、初代ヒト白血球を使用したエクスビボ感染モデルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ媒介性細胞溶解の原因となる主要な毒素である（ＤｕＭｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ｔｈａｔ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ”Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（３）：８１４－８２５（２０１１））。これらの固有の特徴は、他のロイコシジンとのＬｕｋＡＢの相違によって説明される可能性が高い。典型的には、各群内で、タイプＳ及びＦの構成要素は、それぞれ７１～８２％及び６５～８１％の同一性を共有するが、ＬｕｋＡ及びＬｕｋＢは、他のロイコシジンと３０％及び３９％でしか同一でない。重要なことに、ロイコシジンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）は、これまでに記載された全てのヒト感染分離株に存在し、最も遠いｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ系統間で最大２０％のアミノ酸の相違を呈する。
【0018】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの病因及び感染におけるＬｕｋＡＢ毒素の重要性を考慮して、新規のＬｕｋＡ及びＬｕｋＢバリアントタンパク質及びポリペプチドが本明細書に開示される。本明細書に開示されるＬｕｋＡ及びＬｕｋＢバリアントタンパク質及びポリペプチドは、互いに二量体化する能力を保持し、それらが、堅牢な免疫応答のため免疫系に対し天然毒素構造を維持し提示するが、細胞傷害活性を欠くため、理想的なワクチン候補となる。毎年多くの人がＳ．ａｕｒｅｕｓに感染することを考慮すると、これらの感染症のかなりの割合が、従来の抗生物質治療過程に対して抵抗性である可能性が高い。本明細書に記述されるそのような感染症を治療する、及びより重要なことに予防するための革新的なアプローチは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する防御に関与する最も重要な先天的免疫細胞である多型核白血球（ＰＭＮ）を殺傷する原因となるＬｕｋＡＢなどのＳ．ａｕｒｅｕｓの病原性因子を阻害することが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1-1】１５の異なるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＬｕｋＡアミノ酸配列のアライメントであり、クローン性複合体（ＣＣ）８（配列番号１）、ＣＣ４５（配列番号２）、ＣＣ３０のＨＭＰＲＥＦ０７７２＿０４４（ＴＣＨ６０）（配列番号２７）、ＣＣ３０のＳＡＲ２１０８（ＭＲＳＡ２５２）（配列番号３６）、ＣＣ４５のＳＡＬＧ＿０２３２９（Ａ９６３５）（配列番号３４）、ＣＣ３９８のＳＡＰＩＧ２０６１（ＳＴ３９８）（配列番号３５）、ＣＣ１０のＳＡＴＧ＿０１９３０（Ｄ１３９）（配列番号３７）、ＣＣ８のＮＥＷＭＡＮ（配列番号２６）、ＣＣ１５１のＳＡＢ１８７６Ｃ（ＲＦ１２２）（配列番号３２）、ＣＣ５のＳＡＶ２００５（Ｍｕ５０）（配列番号３８）、ＣＣ５のＳＡ１８１３（Ｎ３１５）（配列番号３１）、ＣＣ８のＳＡＣＯＬ２００６（配列番号３３）、ＣＣ７のＨＭＰＲＥ０７７６＿０１７３ ＵＳＡ３００（ＴＣＨ９５９）（配列番号２９）、ＣＣ７２のＨＭＰＲＥＦ０７７４＿２３５６ ＴＣＨ１３０（配列番号２８）、及びＣＣ１のＭＷ１９４２（ＭＷ２）（配列番号３０）が含まれる。アライメントされたものの比較から生成された大部分のＬｕｋＡ配列のアミノ酸配列は、配列番号２５として提供される。本明細書に記載されるアミノ酸置換の位置も、各ＬｕｋＡ配列内で特定される。
【図2-1】１４の異なるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＬｕｋＢアミノ酸配列のアライメントであり、ＬｕｋＢ ＣＣ８（配列番号１５）、ＣＣ４５（配列番号１６）、ＣＣ４５のＡ９６３５（配列番号４０）、ＣＣ３０のＥ１４１０（配列番号４３）、ＣＣ３０のＭＲＳＡ２５２（配列番号４５）、ＣＣ１０のＤ１３９（配列番号４２）、ＣＣ５のＭｕ．５０（配列番号４６）、ＣＣ２３９のＪＫＤ６００８（配列番号４４）、ＣＣ８のＣＯＬ（配列番号４１）、ＣＣ８のＵＳＡ３００＿ＦＰＲ３７５７（配列番号５０）、ＣＣ８のＮＥＷＭＡＮ（配列番号５１）、ＣＣ１５１のＲＦ１２２（配列番号４８）、ＣＣ１のＭＷ２（配列番号４７）、及びＣＣ７２のＴＣＨ１３０（配列番号４９）が含まれる。アライメントされたものの比較から生成された大部分のＬｕｋＢ配列のアミノ酸配列は、配列番号３９として提供される。本明細書に記載されるアミノ酸置換の位置も、各ＬｕｋＢ配列内で特定される。
【図3】免疫化に使用される様々なＬｕｋＡＢバリアントの細胞傷害性を示す。異なるＬｕｋＡＢバリアントの滴定による初代ヒトＰＭＮ（ｎ＝４）の中毒を１時間行った。細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒで評価した。データは、２つの別個の実験で得られ、４人のドナーからの平均±ＳＥＭである。
【図4-1】異なるＬｕｋＡＢバリアントで免疫化されたマウスにおける、ＬｕｋＡＢ ＣＣ８又はＣＣ４５に対する抗体力価を示す。Ｅｎｖｉｇｏ Ｈｓｄ：ＮＤ４（４週齢）マウス（ｎ＝５／抗原）に、５０μｌのアジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄと混合した５０μｌの１０％グリセロール１Ｘ ＴＢＳ中の、２０μｇのＬｕｋＡＢを皮下投与した。５匹のマウスのコホートはまた、同体積の１０％グリセロール１Ｘ ＴＢＳ及びＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄからなるモック免疫も受けた。同じ抗原アジュバントカクテルの２回のブースト（ブースト間は２週間間隔）の後、心臓穿刺を介してマウスから採血し、血清を得た。指示された免疫抗原で免疫化されたマウス由来の血清をプールし、段階希釈して、ＣＣ８ ＬｕｋＡＢ（図４Ａ）又はＣＣ４５ ＬｕｋＡＢ（図４Ｂ）に対する抗体力価を決定した。プレートを、２μｇ／ｍｌのＣＣ８又はＣＣ４５ ＬｕｋＡＢでコーティングした。ヒートマップは、二重測定値からの平均吸光度値を示す。
【図5】異なるＬｕｋＡＢ毒素に対して、異なるＬｕｋＡＢバリアントで免疫化されたマウス由来の血清に対する中和プロファイルを提供する。指示された抗原で免疫化されたマウス由来の４～０．０３１％の血清の存在下で、０．１５６μｇ／ｍｌ（ＬＤ９０）の指示されたＬｕｋＡＢバリアントによる１時間のヒトＰＭＮ（ｎ＝４）の中毒。指示された免疫抗原で免疫化されたマウス由来の血清をプールし、使用前に熱不活化した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒで細胞生存率を決定した。ヒートマップは、４人のドナーの死細胞の平均パーセンテージを表示し、黒は細胞死なしを、及び白は１００％の細胞死を表す。
【図6-1】指示された抗原で免疫されたマウス由来の２％（図６Ａ）、１％（図６Ｂ）、及び０．５％（図６Ｃ）のマウス血清の非存在下又は存在下でのＬＤ９０のＬｕｋＡＢ毒素配列バリアントによる中毒後の、死んだヒト多形核白血球のパーセンテージを示す表である。データは、死細胞のパーセンテージとして提示される。陰影のない細胞は、最も低い細胞死を示し、最も暗い灰色の陰影のある細胞は、最も高い細胞死を示す。
【図7-1】高濃度でのＬｕｋＡＢ ＲＡＲＰＲ－３３の中毒が細胞傷害性ではないことを示す。健康なドナー（ｎ＝４～６）からの新たに単離されたヒトＰＭＮを、異なる濃度のＬｕｋＡＢバリアントとともに１時間インキュベートした。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒの吸光度によって決定された（図７Ａ及び７Ｂ）。死細胞のパーセンテージは、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引きし、１００％死に設定されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００処理細胞に対して正規化することによって計算された。平均±ＳＥＭを示す。健康なドナー（ｎ＝４～６）から単離されたヒトＰＭＮを、異なる濃度のＬｕｋＡＢバリアントとともに２時間インキュベートした。細胞生存率は、ＬＤＨ放出によって決定された。（図７Ｃ及び７Ｄ）。平均±ＳＥＭを示す。
【図8-1】高濃度でのＬｕｋＡＢ ＲＡＲＰＲ－３３及びＤ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドの中毒を示す。健康なドナー（ｎ＝５）からの新たに単離されたヒトＰＭＮを、異なる濃度のＬｕｋＡＢバリアントとともに２時間インキュベートした。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒの吸光度によって決定された（図８Ａ及び８Ｂ）。死細胞のパーセンテージは、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引きし、１００％死に設定されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００処理細胞に対して正規化することによって計算された。平均±ＳＥＭを示す。健康なドナー（ｎ＝５）から単離されたヒトＰＭＮを、異なる濃度のＬｕｋＡＢバリアントとともに２時間インキュベートした。細胞生存率は、ＬＤＨ放出によって決定された（図８Ｃ及び８Ｄ）。平均±ＳＥＭを示す。
【図9】様々なＬｕｋＡＢ毒素に対して２つの異なるＬｕｋＡＢトキソイドで免疫されたマウス由来の血清の中和プロファイルを示す。２つの異なる抗原で免疫されたマウス由来の０．１２５％血清の存在下で、０．１５６μｇ／ｍｌ（ＬＤ９０）の指示されたＬｕｋＡＢ毒素バリアントによる１時間のヒトＰＭＮ（ｎ＝４）の中毒。両方の指示された免疫抗原で免疫化されたマウス由来の血清をプールし、使用前に熱不活化した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒで細胞生存率を決定した。棒グラフは、４人の異なるドナーの平均＋ＳＥＭを示す。統計的有意性は、対応のないｔ検定を使用して決定され、Ｐ＜０．０５は有意であるとみなされた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本開示は、バリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンタンパク質及びポリペプチド、並びにこれらのバリアントタンパク質及びポリペプチドを含む組成物を対象とする。本開示は更に、対象におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染を予防する方法に関する。
【0021】
定義
本組成物及び方法が説明される前に、本発明は、記載される特定の組成物又は方法論に限定されず、これらは変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定のバージョン又は実施形態のみを記述するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本明細書の実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本明細書の実施形態の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、好ましい方法、デバイス、及び材料をここで説明する。本明細書で言及された全ての刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本明細書の実施形態が、先行発明によってそのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
本組成物及び方法が説明される前に、本発明は、記載される特定の組成物又は方法論に限定されず、これらは変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定のバージョン又は実施形態のみを記述するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本明細書の実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本明細書の実施形態の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、好ましい方法、デバイス、及び材料をここで説明する。本明細書で言及された全ての刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本明細書の実施形態が、先行発明によってそのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【0022】
本明細書で使用される場合、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。
【0023】
別段の記載がない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などの任意の数値は、どの場合においても用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、数値は通常、列挙された値の±１０％が含まれる。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度が、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用には、文脈が別途明確に示さない限り、全ての可能性のある部分範囲、その範囲内の整数、及び値の端数を含む、その範囲内の全ての個々の数値が明示的に含まれる。
【0024】
別段の示唆がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の要素の中の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、単に通常の実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、又は確認することができるであろう。このような同等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0025】
本明細書で使用される場合、用語「含む」、「含んでいる」、「含まれる」、「含まれている」、「有する」、「有している」、「含有する」、「含有している」、又はそれらの任意の他の変形は、指定された整数若しくは整数の群を含めるが、任意の他の整数若しくは整数の群を除外しないことを暗示するものと理解され、非排他的又は無制限なものとして意図される。例えば、要素のリストを含む、組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されていない、又はこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に固有の他の要素を含むことができる。更に、反対の趣旨に明示的に言及されない限り、「又は」は、排他的又は、ではなく、包括的又は、を指す。例えば、条件Ａ又は条件Ｂは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真（又は存在）であり、Ｂが偽（又は存在せず）であり、Ａが偽（又は存在せず）であり、Ｂが真（又は存在）であり、かつＡ及びＢの両方が真（又は存在）である。本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素の間の結合用語「及び／又は」は、個々の選択肢及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって結合される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素を併せた適用可能性を指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つが、その意味の範囲内にあると理解され、したがって、本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」の要件を満たす。複数の選択肢の同時適用性もまた、意味のうちに含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすと理解される。
【0026】
本明細書で使用される場合、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」若しくは「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの変形は、任意の列挙された整数又は整数の群を含むことを示すが、指定された方法、構造、又は組成物に、追加の整数又は整数の群を追加することはできないことを示す。
【0027】
本明細書で使用される場合、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される、用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」若しくは「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの変形は、任意の列挙された整数又は整数の群を含むことを示し、かつ指定された方法、構造、又は組成物の基本特性又は新規な特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数の群を含むことを示す。
【0028】
本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、以下に限定されないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなどが挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられる。
【0029】
また、好ましい発明の構成要素の寸法又は特性を指す際に、本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概して」、「実質的に」などの用語は、当業者によって理解されるように、記載される寸法／特性が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似の軽微な変動を排除しないことを示すことも理解されるべきである。少なくとも、数値パラメータを含むこのような参照は、当技術分野で受け入れられている数学的及び産業的原理（例えば、丸め、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用して、最小の有効桁を変化させない変動が含まれる。
【0030】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ＬｕｋＡ及びＬｕｋＢポリペプチド並びにそれらをコードするポリヌクレオチド）との関連での用語「同一の」又は「同一性」パーセントは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は目視検査によって測定されるように、最大の一致が得られるように比較し整列された場合、同一であるか、又は同一であるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの指定されたパーセンテージを有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。
【0031】
配列比較については、典型的には、１つの配列が参照配列としての役割を果たし、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0032】
比較のための配列の最適なアライメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、又は目視検査により（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）、行うことができる。
【0033】
配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されている。
【0034】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小の総和確率（ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小の総和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似しているとみなされる。
【0035】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、保存的置換によってのみ２つのペプチドが異なる場合など、第２のポリペプチドに対し、実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【0036】
本明細書で使用される場合、同義で「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」と呼称される用語である「ポリヌクレオチド」は、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖若しくは、より典型的には二本鎖又は、一本鎖と二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。更に、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語は、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、並びに安定性のために、又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。「修飾された塩基」には、例えば、トリチル化塩基及びイノシンなどの異常な塩基が含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡに様々な改変がなされることができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に見られるように、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的、又は代謝的に改変された形態、並びにウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い比較的短い核酸鎖を包含する。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、例えば、遺伝子環境間の輸送又は宿主細胞における発現のために、所望される配列が挿入可能な、例えば制限及びライゲーション可能な任意の数の核酸を指す。核酸ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。ベクターには、プラスミド、ファージ、ファージミド、細菌ゲノム、ウイルスゲノム、自己増幅ＲＮＡ、レプリコンが含まれるが、これらに限定されない。
【0038】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、任意のタイプの細胞、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株由来の細胞であってもよい。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子でトランスフェクト又は形質導入された細胞である。別の実施形態では、「宿主細胞」はこのようなトランスフェクト細胞又は形質導入細胞の子孫又は潜在的な子孫である。細胞の子孫は、例えば、後続する世代において、又は核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組み込みにおいて発生し得る変異又は環境的影響に起因して、親細胞と同一であってもなくてもよい。
【0039】
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、ＲＮＡへの遺伝子の転写を包含する。この用語はまた、１つ以上のポリペプチドへのＲＮＡの翻訳を包含し、全ての天然に存在する転写後及び翻訳後修飾を更に包含する。発現されたポリペプチドは、宿主細胞の細胞質内、例えば細胞培養物の成長培地などの細胞外環境内、又は細胞膜に固定され得る。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指してもよく、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基に対する従来の１文字又は３文字のコードが使用される。本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」を互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖状又は分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。用語はまた、自然に又は介入により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作又は修飾である。また、定義内には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当技術分野で公知の他の修飾も含まれる。
【0041】
本明細書に記載されるポリペプチド配列は、ペプチドのＮ末端領域が左側にあり、Ｃ末端領域が右側にあるという通常の慣例に従って記述される。アミノ酸の異性体型は既知であるが、別段の明示的な示唆がない限り、表されるのはアミノ酸のＬ型である。
【0042】
用語「単離された」は、その起源の源の細胞材料、細菌材料、ウイルス材料、又は培養培地（組換えＤＮＡ技術によって作製された場合）、又は化学前駆体若しくは他の化学物質（化学的に合成された場合）を実質的に含まない核酸又はポリペプチドを指すことができる。更に、単離されたポリペプチドは、単離されたポリペプチドとして対象に投与され得るポリペプチドを指し、言い換えれば、ポリペプチドがカラムに付着されているか、又はゲルに埋め込まれている場合、ポリペプチドは単に「単離された」とみなされない場合がある。更に、「単離核酸断片」又は「単離ペプチド」は、断片として天然に存在しない、及び／又は典型的には機能状態ではない核酸又はタンパク質断片である。
【0043】
本明細書で使用される場合、語句「免疫応答」又はその等価な「免疫学的応答」は、レシピエント対象における本開示のタンパク質、ペプチド、炭水化物、又はポリペプチドに対して向けられる、体液性（抗体媒介性）、細胞性（抗原特異的Ｔ細胞又はその分泌産物によって媒介される）、又は体液性及び細胞性応答の両方の発生を指す。そのような応答は、免疫原の投与によって誘導される能動的応答、又は抗体、抗体含有物質、又は初回抗原刺激を受けたＴ細胞の投与によって誘導される受動的応答であり得る。細胞免疫応答は、クラスＩ又はクラスＩＩのＭＨＣ分子と関連したポリペプチドエピトープの提示によって誘発され、抗原特異的ＣＤ４（＋）Ｔヘルパー細胞及び／又はＣＤ８（＋）細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。応答はまた、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、好酸球、又は自然免疫の他の構成要素の活性化も含まれる。本明細書で使用される場合、「能動免疫」は、抗原の投与によって対象に付与される任意の免疫を指す。
【0044】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）バリアント
本開示の第１の態様は、バリアント、すなわち、非天然由来のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）タンパク質又はポリペプチドに関する。これらのバリアントＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドは、ＬｕｋＡＢ二成分毒素を非細胞傷害性にし、ＬｕｋＡＢヘテロ二量体を安定化し、融解温度を上昇させ、及び／又は溶解度を上昇させる、１つ以上のアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。本明細書に記載されるように、これらのバリアントＬｕｋＡタンパク質及びポリペプチドは、理想的なワクチン抗原候補であり、単独で、又はロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）野生型若しくはバリアントタンパク質若しくはポリペプチドと組み合わせて投与することができる。ＬｕｋＢタンパク質又はそのポリペプチドと組み合わせて投与される場合、結果として生じるトキソイドは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＬｕｋＡＢ毒素の構造を模倣し、それによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの最も強力な毒素のうちの１つに対する堅牢な免疫応答の生成を促進する。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、完全長成熟ＬｕｋＡタンパク質配列に対応するアミノ酸残基の全てを含む、完全長ＬｕｋＡタンパク質のバリアントである。本明細書で言及されるように、「成熟」ロイコシジンタンパク質配列は、アミノ末端分泌シグナルを欠くロイコシジンタンパク質の配列であり、典型的には、アミノ末端上に最初の２７～２８アミノ酸残基を含む。
本開示の第１の態様は、バリアント、すなわち、非天然由来のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）タンパク質又はポリペプチドに関する。これらのバリアントＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドは、ＬｕｋＡＢ二成分毒素を非細胞傷害性にし、ＬｕｋＡＢヘテロ二量体を安定化し、融解温度を上昇させ、及び／又は溶解度を上昇させる、１つ以上のアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。本明細書に記載されるように、これらのバリアントＬｕｋＡタンパク質及びポリペプチドは、理想的なワクチン抗原候補であり、単独で、又はロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）野生型若しくはバリアントタンパク質若しくはポリペプチドと組み合わせて投与することができる。ＬｕｋＢタンパク質又はそのポリペプチドと組み合わせて投与される場合、結果として生じるトキソイドは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＬｕｋＡＢ毒素の構造を模倣し、それによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの最も強力な毒素のうちの１つに対する堅牢な免疫応答の生成を促進する。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、完全長成熟ＬｕｋＡタンパク質配列に対応するアミノ酸残基の全てを含む、完全長ＬｕｋＡタンパク質のバリアントである。本明細書で言及されるように、「成熟」ロイコシジンタンパク質配列は、アミノ末端分泌シグナルを欠くロイコシジンタンパク質の配列であり、典型的には、アミノ末端上に最初の２７～２８アミノ酸残基を含む。
【0045】
任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、完全長成熟ＬｕｋＡタンパク質よりも短いバリアントである。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、長さが少なくとも１００アミノ酸残基である。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、長さが少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００アミノ酸残基である。
【0046】
本明細書に記載される例示的なＬｕｋＡバリアントタンパク質及びポリペプチドは、クローン性複合体ＣＣ８（配列番号１）及びＣＣ４５（配列番号２）のＬｕｋＡバリアントタンパク質であり（以下の表１を参照）、当業者であれば、配列番号１及び配列番号２との関連で同定されたＬｕｋＡのアミノ酸置換及び／又は欠失が、様々なクローン性複合体にわたって、又は様々なクローン性複合体にわたって高度に保存されているＬｕｋＡの領域内で、保存されるアミノ酸残基であることを容易に理解するであろう。実際に、１５種類の異なる株のＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＬｕｋＡタンパク質配列のアライメント（図１を参照）は、変異を受ける残基として本明細書で同定されるアミノ酸残基が、アライメントされたＬｕｋＡアミノ酸配列の１５個全てにわたって保存されている残基であることを示している。同定された変異の残基の位置は、個々のＬｕｋＡ配列間で異なる場合があるが、配列アライメントは、これらの位置間の対応を示している。明確にするために、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡコンセンサス配列を配列アライメントから生成し、特定のアミノ酸変異の場所を割り当てる目的で利用した。例えば、配列番号２５のリジン残基８３のアミノ酸置換は、配列番号１のＬｕｋＡ配列の８０位のリジン残基、配列番号２のＬｕｋＡ配列の８１位のリジン残基、及び配列番号２６～３８のＬｕｋＡ配列の８３位のリジン残基に対応する。したがって、本明細書に記載される同定されたアミノ酸変異は、現在又は将来知られる任意のＬｕｋＡアミノ酸配列の対応するアミノ酸残基に、普遍的に適用することができる。
【0047】
本開示のこの態様によれば、任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３に対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上でのアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、上記の１つ以上のアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失に加えて、配列番号２５のＧｌｕ３２３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換又は欠失を更に含む。任意の実施形態では、Ｇｌｕ３２３でのアミノ酸置換又は欠失は、配列番号２５の３２３位（Ｇｌｕ３２３Ａｌａ）でのグルタミン酸からアラニンへの置換を含む。
【0048】
任意の実施形態では、ＬｕｋＡ（及び本明細書に記載されるＬｕｋＢ）の１つ以上の同定された位置でのアミノ酸置換は、保存的置換である。こうした保存的置換は、あるアミノ酸残基を、機能的同等物として作用する同じクラスのメンバーである別のアミノ酸残基に置換することを含み、結果としてサイレントな改変をもたらす。すなわち、天然配列に対する変更は、ＬｕｋＡの基本的な特性を顕著に減少させないであろう。これらのアミノ酸残基のクラスには、非極性（疎水性）アミノ酸（例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニン）、極性中性アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン）、正に荷電した（塩基性）アミノ酸、（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、及び負に荷電した（酸性）アミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）が挙げられる。
【0049】
他の実施形態では、本明細書に記載されるバリアントロイコシジンポリペプチドの１つ以上の同定された位置でのアミノ酸置換は、非保存的改変（すなわち、同定された領域の配列、構造、機能、又は活性を破壊する置換）である。このような置換は、タンパク質の細胞傷害性を低減又は緩和する目的で望ましい場合がある。非保存的置換は、ある特定のクラスのアミノ酸残基を異なるクラスのアミノ酸残基で置換することを含む。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸残基の極性中性アミノ酸での置換、又はその逆である。別の実施形態では、非保存的置換は、正に荷電した（塩基性）アミノ酸残基の、アスパラギン酸及びグルタミン酸等の負に荷電した（酸性）アミノ酸残基との置換、又はその逆の置換を含む。そのような分子改変は、一本鎖鋳型（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８２：４８８－４９２（１９８５）、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、二本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐａｐｗｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ９（３）：３－４（１９９６）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用するプラスミド鋳型でのプライマー伸長法を含む、当技術分野で周知の方法によって、及びＰＣＲクローニング（Ｂｒａｍａｎ，Ｊ．（ｅｄ．），ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，２ｎｄ ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２００２）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって達成することができる。
【0050】
任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５の８３位でのリジンに対応する残基でのリジンからメチオニンへの置換（Ｌｙｓ８３Ｍｅｔ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１の８０位でのリジンに対応する残基でのリジンからメチオニンへの置換（Ｌｙｓ８０Ｍｅｔ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２の８１位でのリジンに対応する残基でのリジンからメチオニンへの置換（Ｌｙｓ８１Ｍｅｔ）を含む。
【0051】
任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５の１４１位でのセリンに対応する残基でのセリンからアラニンへの置換（Ｓｅｒ１４１Ａｌａ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１の１３８位でのセリンに対応する残基でのセリンからアラニンへの置換（Ｓｅｒ１３８Ａｌａ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２の１３９位でのセリンに対応する残基でのセリンからアラニンへの置換（Ｓｅｒ１３９Ａｌａ）を含む。
【0052】
任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５の１１３位でのバリンに対応する残基でのバリンからイソロイシンへの置換（Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１の１１０位でのバリンに対応する残基でのバリンからイソロイシンへの置換（Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２の１１１位でのバリンに対応する残基でのバリンからイソロイシンへの置換（Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ）を含む。
【0053】
任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５の１９３位でのバリンに対応する残基でのバリンからイソロイシンへの置換（Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１の１９０位でのバリンに対応する残基でのバリンからイソロイシンへの置換（Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２の１９１位でのバリンに対応する残基でのバリンからイソロイシンへの置換（Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ）を含む。
【0054】
任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３に対応する残基での任意の１つ以上の置換に加えて、配列番号２５の３２３位グルタミン酸残基に対応する残基でのグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｇｌｕ３２３Ａｌａ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のＬｙｓ８０、Ｓｅｒ１３８、Ｖａｌ１１０、Ｖａｌ１９０に対応する残基での任意の１つ以上の置換に加えて、配列番号１の３２０位グルタミン酸残基に対応する残基でのグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｇｌｕ３２０Ａｌａ）を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８１、Ｓｅｒ１３９、Ｖａｌ１１１、Ｖａｌ１９１に対応する残基での任意の１つ以上の置換に加えて、配列番号２の３２１位グルタミン酸残基に対応する残基でのグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｇｌｕ３２１Ａｌａ）を含む。
【0055】
任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３に対応する前述のアミノ酸残基のうちの２つでのアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を有するポリペプチドを含む。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、前述のアミノ酸残基のうちの３つでの、アミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、前述のアミノ酸残基のうちの４つ全てでの、アミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。任意の実施形態では、本開示のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１４１Ａｌａ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、及びＶａｌ１９３Ｉｌｅに対応する前述のアミノ酸残基での、リジンからメチオニンへの、セリンからアラニンへの、及びバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含む。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５の残基３２３に対応するアミノ酸残基での、グルタミン酸からアラニンへのアミノ酸置換（Ｇｌｕ３２３Ａｌａ）を更に含み、すなわち、バリアントＬｕｋＡは、配列番号２５のＬｙｓ８３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１４１Ａｌａ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ、及びＧｌｕ３２３Ａｌａに対応する置換を含む。
【0056】
本開示の例示的なバリアントＬｕｋＡポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１４１Ａｌａ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ、及びＧｌｕ３２３Ａｌａに対応するアミノ酸置換を所有する。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ及びＧｌｕ３２０Ａｌａに対応するアミノ酸置換を含むＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントである。任意の実施形態では、このＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。
【0057】
任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、及びＧｌｕ３２１Ａｌａに対応するアミノ酸置換を含むＣＣ４５Ｃ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、このＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。他の例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１４１Ａｌａ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ、及びＧｌｕ３２３Ａｌａの置換に対応するアミノ酸置換を含む、配列番号２６～３８のＬｕｋＡタンパク質のうちのいずれか１つを含む。
【0058】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上でのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、前述の１つ以上の残基でのアミノ酸置換は、ジスルフィド結合を形成してＬｕｋＡＢヘテロ二量体構造の立体構造を安定化することができるシステイン残基を導入する。例えば、一実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＴｙｒ７４に対応するアミノ酸残基でのチロシンからシステインへの置換（Ｔｙｒ７４Ｃｙｓ）を含み、配列番号２５のＡｓｐ１４０に対応するアミノ酸残基でのアスパラギンからシステインへの置換（Ａｓｐ１４０Ｃｙｓ）を含む。７４位及び１４０位のこれらのシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成し、それによって、野生型ＬｕｋＡと比較して、又はジスルフィド結合を形成することができる対のシステイン残基を含有しない他のバリアントＬｕｋＡポリペプチドと比較して、バリアントＬｕｋＡの熱安定性を増加させる。
【0059】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＧｌｙ１４９に対応するアミノ酸残基でのグリシンからシステインへの置換（Ｇｌｙ１４９Ｃｙｓ）を含み、配列番号２５のＧｌｙ１５６に対応するアミノ酸残基でのグリシンからシステインへの置換（Ｇｌｙ１５６Ｃｙｓ）を含む。１４９位及び１５６位で導入されたこれらのシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成し、それによって、野生型ＬｕｋＡと比較して、又はジスルフィド結合を形成することができる対のシステイン残基を含有しない他のバリアントＬｕｋＡポリペプチドと比較して、バリアントＬｕｋＡの熱安定性を増加させる。
【0060】
任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。任意の実施形態では、これらのアミノ酸残基の各々でのアミノ酸置換は、上記のようなシステイン残基の導入を伴う。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ７１、Ａｓｐ１３７、Ｇｌｙ１４６、及びＧｌｙ１５３に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。任意の実施形態では、これらのアミノ酸残基の各々でのアミノ酸置換は、システイン残基の導入を伴う。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基Ｔｙｒ７２、Ａｓｐ１３８、Ｇｌｙ１４７、及びＧｌｙ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。任意の実施形態では、これらのアミノ酸残基の各々でのアミノ酸置換は、システイン残基の導入を伴う。
【0061】
任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換と組み合わせて、Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、及びＧｌｕ３２３に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５の残基Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、及びＧｌｕ３２３並びに残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。
【0062】
任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のＬｙｓ８０、Ｓｅｒ１３８、Ｖａｌ１１０、Ｖａｌ１９０、Ｇｌｕ３２０、Ｔｙｒ７１、Ａｓｐ１３７、Ｇｌｙ１４６、及びＧｌｙ１５３の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、Ｔｙｒ７１Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４６Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５３Ｃｙｓの各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、このＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0063】
任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２のＬｙｓ８１、Ｓｅｒ１３９、Ｖａｌ１１１、Ｖａｌ１９１、Ｇｌｕ３２１、Ｔｙｒ７２、Ａｓｐ１３８、Ｇｌｙ１４７、及びＧｌｙ１５４の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、Ｔｙｒ７２Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３８Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４７Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５４Ｃｙｓの各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、このＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0064】
他の例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１４１Ａｌａ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２３、Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応するアミノ酸置換を含む、配列番号２６～３８のＬｕｋＡタンパク質のうちのいずれか１つを含む。
【0065】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｈｒ２４９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換又は欠失を含む。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントは、Ｔｈｒ２４９に対応する残基での置換を含み、置換は、この残基でのトレオニンからバリンへの置換（Ｔｈｒ２４９Ｖａｌ）である。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｈｒ２４６に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換又は欠失を含む。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基Ｔｈｒ２４７に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換又は欠失を含む。
【0066】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、本明細書に記載される他のアミノ酸残基置換のいずれか１つ、すなわち、配列番号２５のＬｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、Ｇｌｕ３２３、Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応する残基での置換、と組み合わせて、配列番号２５のＴｈｒ２４９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、本明細書に記載される他のアミノ酸残基置換のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又は９つ全てと組み合わせた、配列番号２５のＴｈｒ２４９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは配列番号２５のＬｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、Ｇｌｕ３２３、及びＴｈｒ２４９に対応する各々の残基でのアミノ酸置換を含む。
【0067】
任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のＬｙｓ８０、Ｓｅｒ１３８、Ｖａｌ１１０、Ｖａｌ１９０、Ｇｌｕ３２０、及びＴｈｒ２４６の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、及びＴｈｒ２４６Ｖａｌの各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。一実施形態では、前述の位置の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有する例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列、又は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。
【0068】
任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２のＬｙｓ８１、Ｓｅｒ１３９、Ｖａｌ１１１、Ｖａｌ１９１、Ｇｌｕ３２１、及びＴｈｒ２４７の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、及びＴｈｒ２４７Ｖａｌの各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。一実施形態では、前述の位置の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有する例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列、又は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。
【0069】
他の例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、Ｇｌｕ３２３、及びＴｈｒ２４９に対応するアミノ酸残基での記載されたアミノ酸置換を含む、配列番号２６～３８のＬｕｋＡタンパク質のうちのいずれか１つを含む。
【0070】
任意の実施形態では、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドは配列番号２５のＬｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、Ｇｌｕ３２３、Ｔｈｒ２４９、Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応する各々の残基でのアミノ酸置換を含む。
【0071】
任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のＬｙｓ８０、Ｓｅｒ１３８、Ｖａｌ１１０、Ｖａｌ１９０、Ｇｌｕ３２０、Ｔｙｒ７１、Ａｓｐ１３７、Ｇｌｙ１４６、Ｇｌｙ１５３、及びＴｈｒ２４６の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、Ｔｙｒ７１Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４６Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１５３Ｃｙｓ、及びＴｈｒ２４６Ｖａｌの各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。一実施形態では、前述の位置の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有する例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。
【0072】
任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２のＬｙｓ８１、Ｓｅｒ１３９、Ｖａｌ１１１、Ｖａｌ１９１、Ｇｌｕ３２１、Ｔｙｒ７２、Ａｓｐ１３８、Ｇｌｙ１４７、Ｇｌｙ１５４、及びＴｈｒ２４７の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、Ｔｙｒ７２Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３８Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１５４Ｃｙｓ、及びＴｈｒ２４７Ａｌａの各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。一実施形態では、前述の位置の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有する例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列、又は配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。
【0073】
他の例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、Ｇｌｕ３２３、Ｔｈｒ２４９、Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応する残基での記載されたアミノ酸置換を含む、配列番号２６～３８のＬｕｋＡタンパク質のうちのいずれか１つを含む。
【0074】
以下の表１は、本明細書に開示される例示的なバリアントＬｕｋＡアミノ酸配列を提供する。
【表1】
【0075】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）バリアント
本開示の別の態様は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）バリアントポリペプチドを対象とする。これらのＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、ＬｕｋＢの安定性を改善し、それによってＬｕｋＡＢのトキソイド安定性に寄与する、１つ以上のアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。本明細書に記載されるように、これらのＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、単独で、又はロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）野生型若しくはバリアントタンパク質若しくはポリペプチドと組み合わせて投与することができる理想的なワクチン抗原候補である。ＬｕｋＡ野生型ポリペプチド又はバリアントポリペプチドと組み合わせて投与される場合、結果として生じるトキソイドは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＬｕｋＡＢ毒素の構造を模倣し、それによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの最も強力な毒素のうちの１つに対する堅牢な免疫応答の生成を促進する。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、完全長成熟ＬｕｋＢタンパク質配列に対応するアミノ酸残基の全てを含む、完全長ＬｕｋＢタンパク質のバリアントである。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントは、完全長成熟ＬｕｋＢタンパク質よりも短い参照タンパク質のアミノ酸鎖を含む。一実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、長さが少なくとも１００アミノ酸残基である。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、長さが少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００アミノ酸残基である。
本開示の別の態様は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）バリアントポリペプチドを対象とする。これらのＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、ＬｕｋＢの安定性を改善し、それによってＬｕｋＡＢのトキソイド安定性に寄与する、１つ以上のアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。本明細書に記載されるように、これらのＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、単独で、又はロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）野生型若しくはバリアントタンパク質若しくはポリペプチドと組み合わせて投与することができる理想的なワクチン抗原候補である。ＬｕｋＡ野生型ポリペプチド又はバリアントポリペプチドと組み合わせて投与される場合、結果として生じるトキソイドは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＬｕｋＡＢ毒素の構造を模倣し、それによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの最も強力な毒素のうちの１つに対する堅牢な免疫応答の生成を促進する。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、完全長成熟ＬｕｋＢタンパク質配列に対応するアミノ酸残基の全てを含む、完全長ＬｕｋＢタンパク質のバリアントである。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントは、完全長成熟ＬｕｋＢタンパク質よりも短い参照タンパク質のアミノ酸鎖を含む。一実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、長さが少なくとも１００アミノ酸残基である。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、長さが少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００アミノ酸残基である。
【0076】
本明細書に記載される例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、クローン性複合体ＣＣ８（配列番号１５）及びＣＣ４５（配列番号１６）のＬｕｋＢバリアントであり（以下の表２を参照）、当業者であれば、配列番号１５及び配列番号１６との関連で同定されたＬｕｋＢのアミノ酸置換及び／又は欠失が、様々なクローン性複合体にわたって、又は様々なクローン性複合体にわたって高度に保存されているＬｕｋＢの領域内で、保存されるアミノ酸残基であることを容易に理解するであろう。１４種類の異なる株のＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＬｕｋＢタンパク質配列のアライメント（図２を参照）は、変異を受ける残基として本明細書で同定されるアミノ酸残基が、アライメントされたＬｕｋＢアミノ酸配列の１４個全てにわたって保存されている残基であることを示している。同定された変異の残基の位置は、個々のＬｕｋＢ－配列間で異なる場合があるが、配列アライメントは、これらの位置間の対応を示している。明確にするために、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢコンセンサス配列を配列アライメントから生成し、特定のアミノ酸変異の場所を割り当てる目的で利用した。例えば、配列番号３９のグルタミン酸残基１０９のアミノ酸置換は、配列番号１５、４２、４４、及び４６～５１のＬｕｋＢ配列の１０９位のグルタミン酸残基、配列番号１６、４０、４３、及び４５のＬｕｋＢ配列の１１０位のグルタミン酸残基、並びに配列番号４１のＬｕｋＢ配列の６０位のグルタミン酸残基に対応する。したがって、本明細書に記載される同定されたアミノ酸変異を、現在又は将来知られる任意のＬｕｋＢアミノ酸配列の対応するアミノ酸残基に、普遍的に適用することができる。
【0077】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸残基Ｖａｌ５３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換又は欠失を含む。任意の実施形態では、Ｖａｌ５３でのアミノ酸置換は、バリンからロイシンへの（Ｖａｌ５３Ｌｅｕ）置換を含む。一実施形態では、例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号３９のＶａｌ５３Ｌｅｕに対応する置換を含む。
【0078】
任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１５の５３位に対応するアミノ酸位置でのアミノ酸置換を有する、ＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１５の５３位に対応する位置でのバリンからロイシンへのアミノ酸置換を有する、ＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、５３位のバリンからロイシンへの置換を有する例示的なＣＣ８ ＬｕｋＢ配列は、配列番号１７のアミノ酸配列、又は配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0079】
任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１６の５３位に対応するアミノ酸位置でのアミノ酸置換を有する、ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１６の５３位に対応する位置でのバリンからロイシンへのアミノ酸置換を有する、ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。一実施形態では、配列番号３９のＶａｌ５３Ｌｅｕ置換に対応する置換を含む例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列、又は配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0080】
他の例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、Ｖａｌ５３Ｌｅｕに対応するアミノ酸置換を含む配列番号４０～５１のＬｕｋＢタンパク質のいずれか１つを含む。
【0081】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、前述の１つ以上の残基でのアミノ酸置換は、ジスルフィド結合を形成してＬｕｋＡＢヘテロ二量体構造の立体構造を安定化することができるシステイン残基を導入する。例えば、一実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＢバリアントタンパク質又はポリペプチドは、配列番号３９のＧｌｕ４５に対応するアミノ酸残基でのグルタミン酸からシステインへの置換（Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ）を含み、配列番号３９のＴｈｒ１２１に対応するアミノ酸残基でのトレオニンからシステインへの置換（Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ）を含む。４５位及び１２１位で導入されたこれらのシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成し、それによって、野生型ＬｕｋＢと比較して、又はジスルフィド結合を形成することができる対のシステイン残基を含有しない本明細書に記載される他のバリアントＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドと比較して、バリアントＬｕｋＢの熱安定性を増加させる。
【0082】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＢバリアントタンパク質又はポリペプチドは、配列番号３９のＧｌｕ１０９に対応するアミノ酸残基でのグルタミン酸からシステインへの置換（Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ）を含み、配列番号３９のＡｒｇ１５４に対応するアミノ酸残基でのアルギニンからシステインへの置換（Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ）を含む。１０９位及び１５４位に導入されたこれらのシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成し、それによって、野生型ＬｕｋＢと比較して、又はジスルフィド結合を形成することができる対のシステイン残基を含有しない他のＬｕｋＢバリアントポリペプチドと比較して、ＬｕｋＢバリアントの熱安定性を増加させる。
【0083】
任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。任意の実施形態では、これらのアミノ酸残基の各々でのアミノ酸置換は、上記のようなシステイン残基の導入を伴う。
【0084】
任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、これらのアミノ酸残基の各々でのアミノ酸置換は、上記のようなシステイン残基の導入を伴う。一実施形態では、配列番号３９のＧｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する残基でのシステインアミノ酸置換を含む例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列、又は配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0085】
任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１１０、Ｔｈｒ１２２、及びＡｒｇ１５５に対応するアミノ酸残基のうちのいずれか１つでのアミノ酸置換を含むＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１１０、Ｔｈｒ１２２、及びＡｒｇ１５５に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、これらのアミノ酸残基の各々でのアミノ酸置換は、上記のようなシステイン残基の導入を伴う。別の実施形態では、配列番号３９のＧｌｕ４５、Ｇｌｕ１１０、Ｔｈｒ１２２、及びＡｒｇ１５５に対応する残基でのシステインアミノ酸置換を含むＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列、又は配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0086】
他の例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号３９の残基、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する残基での記載されたアミノ酸置換を含む、配列番号４０～５１のＬｕｋＢタンパク質のうちのいずれか１つを含む。
【0087】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号３９のＧｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換と組み合わせて、配列番号３９のＶａｌ５３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸残基Ｖａｌ５３、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸残基Ｖａｌ５３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５４Ｃｙｓに対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、例示的なＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列、又は配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0088】
任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸残基Ｖａｌ５３、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１１０、Ｔｈｒ１２２、及びＡｒｇ１５５に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。任意の実施形態では、ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸残基Ｖａｌ５３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２３Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５５Ｃｙｓ に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。前述の位置の各々に対応する残基でのアミノ酸置換を有する例示的なＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列、又は配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。
【0089】
他の例示的なＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、配列番号３９のＶａｌ５３、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する残基での記載されたアミノ酸置換を含む、配列番号４０～５１のＬｕｋＢタンパク質のうちのいずれか１つを含む。
【0090】
以下の表２は、本明細書に開示される例示的なバリアントＬｕｋＢアミノ酸配列を提供する。
【表2】
【0091】
本明細書の開示の全ての態様によれば、本明細書に開示のバリアントＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、１つ以上の異種アミノ酸配列を更に含み得る。好適な異種アミノ酸配列には、限定されないが、タグ配列、免疫原、シグナル配列などが含まれる。好適なタグ配列としては、限定されるものではないが、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、ＦＬＡＧタグ、ステップタグＩＩ、ユビキチンタグ、ＮｕｓＡタグ、キチン結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、Ｈａｔ－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼが挙げられる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｅｒｐｅ Ｋ．，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｔａｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｓｉｏｎｓ：Ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｔｏ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：５２３－３３（２００３）を参照されたい）。好適な免疫原としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープが挙げられる。好適なシグナル配列としては、限定されるものではないが、ＰｅｌＢシグナル配列、Ｓｅｃシグナル配列、Ｔａｔシグナル配列、ＡｍｙＥシグナル配列（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｕｄｌ Ｒ．，“Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ １７：５２（２０１８）を参照されたい）が挙げられる。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、ＰｅｌＢ配列（ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ、配列番号２３）を含む。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡ及び／又はそのＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、Ｈｉｓ－タグ（例えば、ＮＳＡＨＨＨＨＨＨＧＳ、配列番号２４）を含む。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、前述のＰｅｌＢ配列及びＨｉｓ－タグの両方を含む。
【0092】
バリアントＬｕｋＡ及びＬｕｋＢポリヌクレオチド並びに構築物
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＬｕｋＡ及びＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を対象とする。本明細書に記載される核酸分子には、単離ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド配列、発現ベクターの一部、又はインビトロ又はインビボ転写／翻訳に使用される線状ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む線状ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の一部、並びに本明細書に記載されるＬｕｋＡ及びＬｕｋＢバリアントポリペプチドの原核細胞及び真核細胞の発現及び分泌に適合するベクターが挙げられる。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡポリヌクレオチド及びＬｕｋＢポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含む。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡポリヌクレオチド及びＬｕｋＢポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡを含む。
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＬｕｋＡ及びＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を対象とする。本明細書に記載される核酸分子には、単離ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド配列、発現ベクターの一部、又はインビトロ又はインビボ転写／翻訳に使用される線状ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む線状ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の一部、並びに本明細書に記載されるＬｕｋＡ及びＬｕｋＢバリアントポリペプチドの原核細胞及び真核細胞の発現及び分泌に適合するベクターが挙げられる。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡポリヌクレオチド及びＬｕｋＢポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含む。任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡポリヌクレオチド及びＬｕｋＢポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡを含む。
【0093】
本開示のポリヌクレオチドは、核酸自動合成装置での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成によって生成され得、完全な一本鎖又は二本鎖分子に組み立てられ得る。あるいは、本開示のポリヌクレオチドは、ＰＣＲとそれに続くルーチンクローニングなどの他の技術によって生成され得る。所与の配列のポリヌクレオチドを生成又は取得するための技術は、当技術分野で周知である。
【0094】
任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２５の８３位のリジンに対応する残基でのリジンからメチオニンへの置換（Ｌｙｓ８３Ｍｅｔ）を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号２５の１４１位でのセリンに対応する残基でのセリンからアラニンへの置換（Ｓｅｒ１４１Ａｌａ）を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号２５の１１３位のバリンに対応する残基でのバリンからイソロイシンへの置換（Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ）を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号２５の１９３位のバリンに対応する残基でのバリンからイソロイシンへの置換（Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ）を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、前述のアミノ酸残基に対応する残基、すなわち、配列番号２５のＬｙｓ８０３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１４１Ａｌａ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、及びＶａｌ１９３Ｉｌｅでの、リジンからメチオニンへの、セリンからアラニンへの、及びバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、Ｇｌｕ３２３Ａｌａに対応するアミノ酸置換を更に含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードし、すなわち、ポリヌクレオチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１４１Ａｌａ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ、及びＧｌｕ３２３Ａｌａ置換に対応する置換を含むＬｕｋＡバリアントをコードする。
【0095】
一実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ及びＧｌｕ３２０Ａｌａに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１のバリアントをコードする核酸分子である。ＣＣ８ ＬｕｋＡをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５２として本明細書に提供される。したがって、任意の実施形態では、例示的な核酸分子は、配列番号５２のバリアントであり、当該バリアントは、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0096】
一実施形態では、ＣＣ８ Ｌｕｋ８バリアントをコードする例示的な核酸分子は、配列番号３（ＬｕｋＡ ＣＣ８ Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、Ｌｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ）のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする核酸分子である。このＬｕｋＡ ＣＣ８バリアントをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。任意の実施形態では、このＬｕｋＡ ＣＣ８バリアントをコードする核酸分子は、配列番号５４のヌクレオチド配列を含む。
【0097】
別の実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、及びＧｌｕ３２１Ａｌａに対応するアミノ酸置換を含む、配列番号２のバリアントをコードする核酸分子である。ＣＣ４５ ＬｕｋＡをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５３として本明細書に提供される。したがって、任意の実施形態では、例示的な核酸分子は、配列番号５３のバリアントであり、当該バリアントは、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0098】
一実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号４（ＬｕｋＡ ＣＣ４５ Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、Ｌｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ）のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする核酸分子である。このＬｕｋＡ ＣＣ４５バリアントをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５５に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。任意の実施形態では、このＬｕｋＡ ＣＣ８バリアントをコードする核酸分子は、配列番号５５のヌクレオチド配列を含む。
【0099】
任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上でのアミノ酸置換を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２５のＴｙｒ７４に対応するアミノ酸残基でのチロシンからシステインへの置換（Ｔｙｒ７４Ｃｙｓ）を含み、配列番号２５のＡｓｐ１４０に対応するアミノ酸残基でのアスパラギンからシステインへの置換（Ａｓｐ１４０Ｃｙｓ）を含む、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２５のＧｌｙ１４９に対応するアミノ酸残基でのグリシンからシステインへの置換（Ｇｌｙ１４９Ｃｙｓ）を含み、配列番号２５のＧｌｙ１５６に対応するアミノ酸残基でのグリシンからシステインへの置換（Ｇｌｙ１５６Ｃｙｓ）を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、これらのアミノ酸残基の各々でのアミノ酸置換は、上記のようなシステイン残基である。
【0100】
任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換と組み合わせて、Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、及びＧｌｕ３２３に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２５の残基Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、及びＧｌｕ３２３並びに残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。
【0101】
一実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、Ｔｙｒ７１Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４６Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５３Ｃｙｓの各々に対応するアミノ酸置換を含む配列番号１のバリアントをコードする核酸分子である。一実施形態では、例示的な核酸分子は、配列番号５（ＬｕｋＡ ＣＣ８ Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、Ｌｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ７１Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４６Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１５３Ｃｙｓ）のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする核酸分子である。
【0102】
別の実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、Ｔｙｒ７２Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３８Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４７Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５４Ｃｙｓの各々に対応するアミノ酸置換を含む配列番号２のバリアントをコードする核酸分子である。一実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号６（ＬｕｋＡ ＣＣ４５ Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、Ｌｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｔｙｒ７２Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３８Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１５４Ｃｙｓ）のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする核酸分子である。
【0103】
任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｈｒ２４９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換又は欠失を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２５の２４９位に対応するこの残基でのトレオニンからバリンへの置換を含むＬｕｋＡバリアントをコードする。任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２５のＬｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３、Ｇｌｕ３２３、Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９、及びＧｌｙ１５６に対応する残基でのアミノ酸置換のうちのいずれか１つ又は全てと組み合わせて、Ｔｈｒ２４９に対応する位置でのアミノ酸置換を含むＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする。
【0104】
一実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２０Ａｌａ及びＴｈｒ２４６Ｖａｌの各々に対応するアミノ酸置換を含む配列番号１のバリアントをコードする核酸分子である。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号７（ＬｕｋＡ ＣＣ８ Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、Ｌｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、及びＴｈｒ２４６Ｖａｌ）のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする核酸分子である。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、Ｌｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２４６Ｖａｌ、Ｔｙｒ７１Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４６Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５３Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む、配列番号９のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント配列をコードする核酸分子である。本開示の例示的な核酸分子は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子を包含する。任意の実施形態では、配列番号９のこのＬｕｋＡ ＣＣ８バリアントをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５６に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。任意の実施形態では、このＬｕｋＡ ＣＣ８バリアントをコードする核酸分子は、配列番号５６のヌクレオチド配列を含む。
【0105】
別の実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、及びＴｈｒ２４７Ｖａｌの各々に対応するアミノ酸置換を含む配列番号２のバリアントをコードする核酸分子である。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号８（ＬｕｋＡ ＣＣ４５ Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、Ｌｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２４７Ｖａｌ）のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする核酸分子である。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、Ｌｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ７２Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３８Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４７Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５４Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む、配列番号１０のＬｕｋＡバリアント配列をコードする核酸分子である。本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子を包含する。任意の実施形態では、配列番号１０のこのＬｕｋＡ ＣＣ４５バリアントをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５７に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。任意の実施形態では、このＬｕｋＡ ＣＣ８バリアントをコードする核酸分子は、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む。
【0106】
本開示の別の態様は、本明細書に開示されるＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象とする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３９のアミノ酸残基Ｖａｌ５３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換又は欠失を含むＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、Ｖａｌ５３でのアミノ酸置換は、バリンからロイシンへの（Ｖａｌ５３Ｌｅｕ）置換を含む。一実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号１５の５３位でのアミノ酸置換を含む配列番号１５のバリアントをコードする核酸分子である。ＣＣ８ ＬｕｋＢをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５８として本明細書に提供される。したがって、任意の実施形態では、例示的な核酸分子は、配列番号５８のバリアントであり、当該バリアントは、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0107】
一実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１７（ＬｕｋＢ ＣＣ８ Ｖ５３Ｌ）のＬｕｋＢバリアントペプチド、又は配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする。このＬｕｋＢ ＣＣ８ Ｖ５３Ｌバリアントをコードする例示的な核酸分子は、配列番号６０に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。任意の実施形態では、このＬｕｋＡ ＣＣ８バリアントをコードする核酸分子は、配列番号６０のヌクレオチド配列を含む。
【0108】
別の実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号１６の５３位でのアミノ酸置換を含む配列番号１６のバリアントをコードする核酸分子である。ＣＣ４５ ＬｕｋＢをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５９として本明細書に提供される。したがって、任意の実施形態では、例示的な核酸分子は、配列番号５９のバリアントであり、当該バリアントは、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0109】
別の実施形態では、本開示の例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１８（ＬｕｋＢ ＣＣ４５ Ｖ５３Ｌ）のＬｕｋＢバリアントペプチド、又は配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする。このＬｕｋＢ ＣＣ４５ Ｖ５３Ｌバリアントをコードする例示的な核酸分子は、配列番号６１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。任意の実施形態では、このＬｕｋＡ ＣＣ４５バリアントをコードする核酸分子は、配列番号６１のヌクレオチド配列を含む。
【0110】
任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードする。一実施形態では、前述の１つ以上の残基でのアミノ酸置換は、ジスルフィド結合を形成してＬｕｋＡＢヘテロ二量体構造の立体構造を安定化することができる１つ以上のシステイン残基を導入する。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３９のＧｌｕ４５に対応するアミノ酸残基でのグルタミン酸からシステインへの置換（Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ）、及び配列番号３９のＴｈｒ１２１に対応するアミノ酸残基でのトレオニンからシステインへの置換（Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ）を含むＬｕｋＢバリアントタンパク質又はポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３９のＧｌｕ１０９に対応するアミノ酸残基でのグルタミン酸からシステインへの置換（Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ）、及び配列番号３９のＡｒｇ１５４に対応するアミノ酸残基でのアルギニンからシステインへの置換（Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ）を含むＬｕｋＢバリアントタンパク質又はポリペプチドをコードする。
【0111】
任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードする。任意の実施形態では、これらのアミノ酸残基の各々でのアミノ酸置換は、上記のようなシステイン残基の導入を伴う。
【0112】
一実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号１５のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む配列番号１５のバリアントをコードする核酸分子である。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２１（ＬｕｋＢ ＣＣ８ Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５４Ｃｙｓ）のアミノ酸配列を含むＬｕｋＢバリアントペプチド、又は配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする。別の実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号１６のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１１０、Ｔｈｒ１２２及びＡｒｇ１５５に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、配列番号１６のバリアントをコードする核酸分子である。任意の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２２（ＬｕｋＢ ＣＣ４５ Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ａｒｇ１５５Ｃｙｓ）のアミノ酸配列を含むＬｕｋＢバリアントペプチド、又は配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする。
【0113】
任意の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３９のＧｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１及びＡｒｇ１５４に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換と組み合わせて、配列番号３９のＶａｌ５３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含むＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードする。一実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号１５のアミノ酸残基Ｖａｌ５３、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む配列番号１５のバリアントをコードする核酸分子である。任意の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１９（ＬｕｋＢ ＣＣ８ Ｖａｌ５３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５４Ｃｙｓ）のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢバリアントペプチド、又は配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする。別の実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする核酸分子であり、例えば、配列番号１６のアミノ酸残基Ｖａｌ５３、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１１０、Ｔｈｒ１２２及びＡｒｇ１５５に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む配列番号１６のバリアントをコードする核酸分子である。任意の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２０（ＬｕｋＢ ＣＣ４５ Ｖａｌ５３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ａｒｇ１５５Ｃｙｓ）のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢバリアントペプチド、又は配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列、をコードする。
【0114】
別の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、本明細書に開示されるＬｕｋＡ配列及びＬｕｋＢ配列をコードする核酸分子である。一実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ４５ ＬｕｋＡ配列（バリアント又は非バリアント）及びＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列（バリアント又は非バリアント）をコードするポリヌクレオチドである。例えば、本明細書に開示されるＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント配列及びＣＣ４５ ＬｕｋＢ非バリアント配列をコードするポリヌクレオチド、又は本明細書に開示されるＣＣ４５ ＬｕｋＡ非バリアント配列及びＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列をコードするポリヌクレオチド。
【0115】
別の実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ８ ＬｕｋＡ配列（バリアント又は非バリアント）及びＣＣ８ ＬｕｋＢ配列（バリアント又は非バリアント）をコードするポリヌクレオチドである。例えば、本明細書に開示されるＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント配列及びＣＣ８ ＬｕｋＢ非バリアント配列をコードするポリヌクレオチド、又は本明細書に開示されるＣＣ８ ＬｕｋＡ非バリアント配列及びＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列をコードするポリヌクレオチド。
【0116】
別の実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ４５ ＬｕｋＡ配列（バリアント又は非バリアント）及びＣＣ８ ＬｕｋＢ配列（バリアント又は非バリアント）をコードするポリヌクレオチドである。例えば、本明細書に開示されるＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント配列及びＣＣ８ ＬｕｋＢ非バリアント配列をコードするポリヌクレオチド、又は本明細書に開示されるＣＣ４５ ＬｕｋＡ非バリアント配列及びＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列をコードするポリヌクレオチド。
【0117】
別の実施形態では、例示的な核酸分子は、ＣＣ８ ＬｕｋＡ配列（バリアント又は非バリアント）及びＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列（バリアント又は非バリアント）をコードする核酸分子である。例えば、本明細書に開示されるＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント配列及びＣＣ４５ ＬｕｋＢ非バリアント配列をコードするポリヌクレオチド、又は本明細書に開示されるＣＣ８ ＬｕｋＡ非バリアント配列及びＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列をコードするポリヌクレオチドである。
【0118】
別の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、ＬｕｋＡバリアント配列及びＬｕｋＢ野生型配列をコードするポリヌクレオチドである。例えば、配列番号１５又は配列番号１６のＬｕｋＢ野生型（すなわち、非バリアント）配列と組み合わせた、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のうちのいずれか１つから選択されるＬｕｋＡバリアント配列をコードするポリヌクレオチド。
【0119】
任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、ＬｕｋＡ野生型配列及びＬｕｋＢバリアント配列をコードするポリヌクレオチドである。例えば、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のいずれか１つから選択されるＬｕｋＢバリアント配列と組み合わせた配列番号１又は配列番号２のＬｕｋＡ野生型配列をコードするポリヌクレオチド。
【0120】
任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、ＬｕｋＡバリアント配列及びＬｕｋＢバリアント配列をコードするポリヌクレオチドである。例えば、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のうちのいずれか１つから選択されるＬｕｋＢバリアント配列と組み合わせた、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のうちのいずれか１つから選択されるＬｕｋＡバリアント配列をコードするポリヌクレオチド。
【0121】
任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号３のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号４のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号５のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号６のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号７のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号８のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号９のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１０のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１１のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１２のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５若しくは１６のＬｕｋＢ非バリアント配列、配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１３のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１４のＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１７若しくは１８のＬｕｋＢバリアント配列、配列番号１９若しくは２０のＬｕｋＢバリアント配列、又は配列番号２１若しくは２２のＬｕｋＢバリアント配列をコードする。
【0122】
任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１７のＬｕｋＢバリアント配列、及び配列番号１若しくは２のＬｕｋＡ非バリアント配列、配列番号３若しくは４のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号５若しくは６のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号７若しくは８のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号９若しくは１０のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号１１若しくは１２のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号１３若しくは１４のＬｕｋＡバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１８のＬｕｋＢバリアント配列、及び配列番号１若しくは２のＬｕｋＡ非バリアント配列、配列番号３若しくは４のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号５若しくは６のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号７若しくは８のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号９若しくは１０のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号１１若しくは１２のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号１３若しくは１４のＬｕｋＡバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号１９のＬｕｋＢバリアント配列、及び配列番号１若しくは２のＬｕｋＡ非バリアント配列、配列番号３若しくは４のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号５若しくは６のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号７若しくは８のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号９若しくは１０のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号１１若しくは１２のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号１３若しくは１４のＬｕｋＡバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号２０のＬｕｋＢバリアント配列、及び配列番号１若しくは２のＬｕｋＡ非バリアント配列、配列番号３若しくは４のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号５若しくは６のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号７若しくは８のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号９若しくは１０のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号１１若しくは１２のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号１３若しくは１４のＬｕｋＡバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号２１のＬｕｋＢバリアント配列、及び配列番号１若しくは２のＬｕｋＡ非バリアント配列、配列番号３若しくは４のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号５若しくは６のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号７若しくは８のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号９若しくは１０のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号１１若しくは１２のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号１３若しくは１４のＬｕｋＡバリアント配列をコードする。任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号２２のＬｕｋＢバリアント配列、及び配列番号１若しくは２のＬｕｋＡ非バリアント配列、配列番号３若しくは４のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号５若しくは６のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号７若しくは８のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号９若しくは１０のＬｕｋＡバリアント配列、配列番号１１若しくは１２のＬｕｋＡバリアント配列、又は配列番号１３若しくは１４のＬｕｋＡバリアント配列をコードする。
【0123】
任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号４のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列をコードする。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体（ＲＡＲＰＲ－１５）をコードする例示的な核酸分子は、配列番号５９（ＣＣ４５ ＬｕｋＢ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５５（ＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体をコードする例示的な核酸分子は、配列番号５９のヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５５のヌクレオチド配列を含む。
【0124】
任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号４のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント配列及び配列番号１８のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体（ＲＡＲＰＲ－３０）をコードする例示的な核酸分子は、配列番号６１（ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５５（ＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体をコードする例示的な核酸分子は、配列番号６１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５５のヌクレオチド配列を含む。
【0125】
任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号３のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント配列、及び配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体（ＲＡＲＰＲ－３２）をコードする例示的な核酸分子は、配列番号５８（ＣＣ８ ＬｕｋＢ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５４（ＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体をコードする例示的な核酸分子は、配列番号５８のヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５４のヌクレオチド配列を含む。
【0126】
任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号３のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント配列及び配列番号１８のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体（ＲＡＲＰＲ－３３）をコードする例示的な核酸分子は、配列番号６１（ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５４（ＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体をコードする例示的な核酸分子は、配列番号６１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５４のヌクレオチド配列を含む。
【0127】
任意の実施形態では、本開示の例示的な核酸分子は、配列番号３のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント配列及び配列番号１７のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列をコードする。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体（ＲＡＲＰＲ－３４）をコードする例示的な核酸分子は、配列番号６０（ＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５４（ＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む。このＬｕｋＡＢヘテロ二量体をコードする例示的な核酸分子は、配列番号６０のヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５４のヌクレオチド配列を含む。
【0128】
本開示の例示的な核酸分子配列を、以下の表３に提供する。
【表3】
【0129】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるバリアントＬｕｋＡポリペプチド及びＬｕｋＢポリペプチドをコードする核酸分子は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化の方法は既知であり、以前に記載されている（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｅｅｄの国際特許出願公開ＷＯ１９９６／０９３７８）。野生型配列と比較して、少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンで置換される場合、配列は、コドン最適化されたとみなされる。本明細書では、好ましくないコドンは、同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも生物体で使用される頻度低いコドンであり、より好ましいコドンは、好ましくないコドンよりも生物体でより頻繁に使用されるコドンである。特定の生物体に対するコドン使用の頻度は、当技術分野で周知であり利用可能なコドン頻度表に見出すことができる。好ましくは、複数の好ましくないコドン、例えば、１０％、４０％、６０％、８０％を超える好ましくないコドン、好ましくは、ほとんどの（例えば、少なくとも９０％）又は全ての好ましくないコドンが、より好ましいコドンによって置換される。好ましくは、生物において最も頻繁に使用されるコドンが、コドン最適化配列で使用される。好ましいコドンによる置換は、一般により高い発現をもたらす。
【0130】
本開示のポリヌクレオチドは、通常の分子生物学技術を使用してクローニングされてもよく、又はＤＮＡ合成及び／若しくは分子クローニングの分野で事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）による日常的な手順を使用して実施することができるＤＮＡ合成によってデノボで作製されてもよい。
【0131】
任意の実施形態では、前述の核酸分子は、ベクター、すなわち、本明細書に記載されるワクチン組成物で使用するための発現ベクターに挿入される。あるいは、これらの核酸分子は、コードされたバリアントＬｕｋＡタンパク質、バリアントＬｕｋＢタンパク質、又はバリアントＬｕｋＡＢ複合体（安定ヘテロ二量体として）の発現及び単離のために、適切な宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトされる発現ベクターに挿入されてもよく、バリアントＬｕｋＡＢ複合体は、本明細書に開示されているバリアントＬｕｋＡ及び非バリアントＬｕｋＢ、非バリアントＬｕｋＡ、及びバリアントＬｕｋＢ、又はバリアントＬｕｋＡ及びバリアントＬｕｋＢを含む。
【0132】
本開示のこの態様によれば、本明細書に記載されるＳ．ａｕｒｅｕｓＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢタンパク質及びそのポリペプチドをコードする核酸分子は、核酸配列構築物によってコードされるＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを発現することができる任意の発現ベクターに組み込むことができる。適切な発現ベクターは、そのようなベクターによってコードされるＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドの発現を制御、調節、引き起こす、又は可能にする核酸配列要素を含む。こうした要素は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系においてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含んでもよい。適切なベクターには、ＤＮＡベクター、プラスミドベクター、線状核酸、及びウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【0133】
一実施形態では、発現ベクターは、環状プラスミドである（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＤＮＡ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｂａｓｅｄ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ＨＩＶ－１ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｂ，”Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．９：２２５３－２２６２（２０１３）を参照されたい）。プラスミドは、細胞ゲノムへの組み込みによって標的細胞を形質転換するか、又は染色体外に存在することができる（例えば、複製起源を有する自律複製プラスミド）。例示的なプラスミドベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、ｐｒｏｖａｘ、又は組換え核酸配列構築物によってコードされるバリアントＬｕｋＡ及び／又はバリアントＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを発現することができる任意の他のプラスミド発現ベクターが挙げられる。
【0134】
別の実施形態では、発現ベクターは線状発現カセット（「ＬＥＣ」）である。ＬＥＣは、本明細書に記載される組換え核酸分子によってコードされるＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを発現するために電気穿孔を介して対象に効率的に送達することができる。ＬＥＣは、リン酸骨格を欠いた任意の線状ＤＮＡであってもよい。一実施形態では、ＬＥＣは、いかなる抗生物質耐性遺伝子及び／又はリン酸骨格も含有しない。別の実施形態では、ＬＥＣは、所望の遺伝子発現とは関係のない他の核酸配列を含有しない。
【0135】
ＬＥＣは、線状化することができる任意のプラスミドに誘導されてもよい。プラスミドは、本明細書に記載される組換え核酸分子によってコードされるＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを発現する能力を有し得る。例示的なプラスミドとしては、限定されるものではないが、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）、ｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、若しくはｐｒｏｖａｘ、又は組換え核酸配列構築物によってコードされるバリアントＬｕｋＡ及び／又はバリアントＬｕｋＢタンパク質若しくはポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターが挙げられる。
【0136】
別の実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。ＬｕｋＡ及び／又はｔ ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを発現することができる好適なウイルスベクターには、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，”Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．２（１）：５１－７０（２０１１）、Ｕｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ－Ｂａｓｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，”Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：６２４－６４１（２０１４）、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，“Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３（２００８）を参照されたい）、レンチウイルスベクター（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ－Ｂａｓｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，”Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：６２４－６４１（２０１４）、及びＨｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２３９：４５－６１（２０１１）を参照されたい）、レトロウイルスベクター（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ－Ｂａｓｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，”Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：６２４－６４１（２０１４）を参照されたい）、ワクシニアウイルス、複製欠損アデノウイルスベクター、及びガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクター（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８７２，００５号を参照されたい）が含まれる。ベクターとしての使用に適したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成及び単離する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５（２００５）、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，“Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３（２００８）を参照されたい）。
【0137】
本明細書に記載されるＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子は、典型的には、最大発現を達成するために、発現ベクター構築物において、プロモーター、翻訳開始、３’非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組み合わされる。ＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢタンパク質又はそのポリペプチドの発現を駆動するのに好適なプロモーター配列には、限定されるものではないが、伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス前書記遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）及びＣＫ６プロモーターが含まれる。当技術分野で公知の宿主細胞における遺伝子発現を駆動するのに好適な他のプロモーターも、本明細書に開示される発現構築物への組み込みに適している。
【0138】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＬｕｋＡポリペプチド及び／又はＬｕｋＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを含む宿主細胞を対象とする。本明細書に記載されるＬｕｋＡタンパク質及びＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドをコードする発現構築物は、宿主細胞内に同時トランスフェクトされてもよく、連続的にトランスフェクトされてもよく、又は別々にトランスフェクトされてもよい。本明細書に記載されるＬｕｋＡタンパク質及びＬｕｋＢタンパク質及びポリペプチドは、当技術分野で周知のように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン性集団によって任意選択的に産生することができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８７－２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４－２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７－２００１）を参照されたい）。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってもよい。
【0139】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡポリペプチド及び／又はＬｕｋＢポリペプチドは、細菌細胞で産生される。適切な細菌宿主細胞としては、限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ宿主細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞、及びＢａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞が挙げられる。任意の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞である。任意の実施形態では、宿主細胞は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ宿主細胞である。
【0140】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡポリペプチド及び／又はＬｕｋＢポリペプチドは、真核細胞で産生される。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物の起源であってもよい。哺乳動物真核細胞には、例えばハイブリドーマ又は骨髄腫細胞株などの不死化細胞株、例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳＯ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ第８５１１０５０３号）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株などが挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）、又はＤＧ４４などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【0141】
本明細書に記載されるＬｕｋＡポリペプチド及びＬｕｋＢポリペプチドは、上記に記載される単離されたポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞を使用する様々な技術のいずれかによって調製され得る。一般に、タンパク質は、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地からタンパク質又はポリペプチドを回収するために一般的に使用される標準的なクローニング及び細胞培養技術によって産生される。宿主細胞へのトランスフェクションは、外因性ＤＮＡの原核性又は真核性宿主細胞への導入に一般的に使用される様々な技術を使用して、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどによって実施することができる。
【0142】
本明細書に記載されるＬｕｋＡポリペプチド及び／又はＬｕｋＢポリペプチドは、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の追加（ペグ化）及び脂質付加などの非天然共有結合性修飾などのプロセスによって、翻訳後修飾され得る。そのような修飾は、インビボ又はインビトロで起こり得る。
【0143】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるＬｕｋＡ及びＬｕｋＢのポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、好ましくは「単離された」ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドである。本明細書に開示されるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを記載するために使用される場合、「単離された」とは、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが、その生産環境の構成要素から特定され、分離され、及び／又は回収されたことを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、その生産環境から他の構成要素との会合がない。組換え形質導入細胞から生じるものなどのその生産環境の汚染構成要素は、典型的には医薬品の使用を妨げる可能性のある物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含む可能性がある。ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含むがこれに限定されない公知の方法によって、組換え細胞培養物から回収及び精製される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もまた精製に使用することができる。
【0144】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチン組成物
本開示の別の態様は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物を対象とする。任意の実施形態では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチン組成物は、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドのうちの任意の１つ以上、又は本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子を含む。特に、ワクチン組成物のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、本明細書で同定及び記載される１つ以上のアミノ酸残基のいずれかでの、アミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＡバリアントは、配列番号２５のバリアント、又は配列番号１、２、若しくは２６～３８のいずれか１つのバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＡバリアントは、配列番号１のバリアント（ＣＣ８）を含む。例示的なＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントには、配列番号３、５、７、９、及び１３のＬｕｋＡバリアントが含まれるが、これらに限定されない。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＡバリアントは、配列番号２のバリアント（ＣＣ４５）を含む。例示的なＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントには、配列番号４、６、８、１０、１１、１２、及び１４のＬｕｋＡバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
本開示の別の態様は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物を対象とする。任意の実施形態では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチン組成物は、本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドのうちの任意の１つ以上、又は本明細書に記載されるＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子を含む。特に、ワクチン組成物のＬｕｋＡバリアントポリペプチドは、本明細書で同定及び記載される１つ以上のアミノ酸残基のいずれかでの、アミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＡバリアントは、配列番号２５のバリアント、又は配列番号１、２、若しくは２６～３８のいずれか１つのバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＡバリアントは、配列番号１のバリアント（ＣＣ８）を含む。例示的なＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントには、配列番号３、５、７、９、及び１３のＬｕｋＡバリアントが含まれるが、これらに限定されない。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＡバリアントは、配列番号２のバリアント（ＣＣ４５）を含む。例示的なＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントには、配列番号４、６、８、１０、１１、１２、及び１４のＬｕｋＡバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【0145】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるＳ．ａｕｒｅｕｓワクチン組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0146】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるＳ．ａｕｒｅｕｓワクチン組成物は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0147】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるＳ．ａｕｒｅｕｓワクチン組成物は、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0148】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるＳ．ａｕｒｅｕｓワクチン組成物は、本明細書に記載されるバリアントＬｕｋＢタンパク質若しくはポリペプチドのうちの任意の１つ以上、又は本明細書に記載されるＬｕｋＢバリアントタンパク質若しくはポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子を含む。特に、ワクチン組成物のＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、本明細書で同定及び記載される１つ以上のアミノ酸残基のいずれかでの、アミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＢバリアントは、配列番号３９のバリアント、又は配列番号１５、１６、若しくは４０～５１のいずれか１つのバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＢバリアントは、配列番号１５のバリアント（ＣＣ８）を含む。例示的なＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントには、配列番号１７、１９、及び２１のＬｕｋＢバリアントが含まれるが、これらに限定されない。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＢバリアントは、配列番号１６のバリアント（ＣＣ４５）を含む。例示的なＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントには、配列番号１８、２０、及び２１のＬｕｋＢバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【0149】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるワクチン組成物は、ＬｕｋＡタンパク質とＬｕｋＢタンパク質の両方を含む。したがって、任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ非バリアント配列、又は配列番号１５に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアント配列と組み合わせた配列番号１のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ＣＣ８ ＬｕｋＢ配列バリアント配列は、配列番号１７、１９及び２１から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢに対して８５％以上の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９及び２１から選択されるＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号３のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列に対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９及び２１から選択されるＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号５のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９及び２１から選択されるＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号７のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９及び２１から選択されるＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号９のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0150】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントを含む。
【0151】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント及び配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントを含む。
【0152】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアント配列と組み合わせた配列番号１のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列は、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号３のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号５のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号７のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号９のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0153】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントを含む。
【0154】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントを含む。
【0155】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントを含む。
【0156】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント及び配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントを含む。
【0157】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、アミノ酸配列配列番号３を含むバリアントＬｕｋＡタンパク質及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬｕｋＢタンパク質を含む。
【0158】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアント配列と組み合わせた、配列番号２のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列は、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号４のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント配列、と組み合わせた配列番号６のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント、と組み合わせた配列番号８のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント、と組み合わせた配列番号１０のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント、と組み合わせた配列番号１１のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢに対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１８、２０、及び２２から選択されるＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント、と組み合わせた配列番号１２のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0159】
一実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＢと組み合わせて配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0160】
一実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＢと組み合わせて配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0161】
一実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＢと組み合わせて配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0162】
一実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＢと組み合わせて配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0163】
一実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントと組み合わせて配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0164】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアント配列と組み合わせた、配列番号２のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント配列は、配列番号１７、１９及び２１から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列に対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９、及び２１から選択されるバリアント配列、と組み合わせた配列番号４のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列に対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９、及び２１から選択されるバリアント配列、と組み合わせた配列番号６のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列に対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９、及び２１から選択されるバリアント配列、と組み合わせた配列番号８のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列に対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９、及び２１から選択されるバリアント配列、と組み合わせた配列番号９のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列に対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９、及び２１から選択されるバリアント配列、と組み合わせた配列番号１０のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列に対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９、及び２１から選択されるバリアント配列、と組み合わせた配列番号１１のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列、又は配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢ配列に対して＞８５％の配列同一性を有するそのバリアント、例えば、配列番号１７、１９、及び２１から選択されるバリアント配列、と組み合わせた配列番号１２のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントを含む。
【0165】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるバリアントＬｕｋＢバリアントポリペプチドのいずれか、又はＬｕｋＢバリアントをコードする核酸分子を含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物を対象とする。特に、ワクチン組成物のＬｕｋＢバリアントポリペプチドは、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失を含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＢバリアントは、配列番号１５のバリアント（ＣＣ８）を含む。例示的なＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントには、配列番号１７、１９、及び２１のＬｕｋＢバリアントが含まれるが、これらに限定されない。任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＢバリアントは、配列番号１６のバリアント（ＣＣ４５）を含む。例示的なＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントには、配列番号１８、２０、及び２２のＬｕｋＢバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【0166】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるワクチン組成物は、ＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドとともに、本明細書に記載されるＬｕｋＢバリアントポリペプチドを含む。したがって、任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１のＣＣ８ ＬｕｋＡ配列、又は配列番号１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアント配列と組み合わせた、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント、例えば、配列番号１７、１９、及び２１のバリアント、を含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号２のＣＣ４５ ＬｕｋＡ配列、又は配列番号２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアント配列と組み合わせた、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント、例えば、配列番号１７、１９、及び２１のバリアント、を含む。
【0167】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１のＣＣ８ ＬｕｋＡ配列、又は配列番号１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するバリアント配列と組み合わせた、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント、例えば、配列番号１８、２０、又は２２のバリアント含む。任意の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号２のＣＣ４５ ＬｕｋＡ配列、又は配列番号２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアント配列と組み合わせた、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント、例えば、配列番号１８、２０、又は２２のバリアントを含む。
【0168】
本開示のワクチン組成物は、本明細書に記載されるＬｕｋＡポリペプチド及び／又はＬｕｋＢポリペプチドを、薬学的に許容可能な担体及び任意選択的に薬学的に許容可能な賦形剤とともに製剤化することによって調製される。薬学的に許容可能な担体を含む薬学的に活性な成分の製剤化は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）、及びそれ以降の版）。追加の原料の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、等張化調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。本発明の医薬組成物を製剤化する際に、１つ以上の薬学的に許容可能な担体を使用することができる。
【0169】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」及び「薬学的に許容可能な賦形剤」（例えば、希釈剤、免疫刺激剤、アジュバント、抗酸化剤、保存剤、及び可溶化剤などの添加剤）は、使用される投与量及び濃度で組成物を投与された対象に対して非毒性である。薬学的に許容可能な担体の例としては、水、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び別の有機酸で緩衝された水が含まれる。本開示で有用であり得る薬学的に許容可能な賦形剤の代表例には、アスコルビン酸などの抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又は非イオン性界面活性剤が含まれる。
【0170】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるワクチン組成物は、液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ゲルなどを含み得る。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０％ｗ／ｗの水、又は少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％ｗ／ｗの水を含む。
【0171】
ワクチン組成物は、１つ以上のアジュバントを更に含み得る。本明細書で使用される場合、用語「アジュバント」は、本明細書に記載されるＬｕｋＡポリペプチド及び／又はＬｕｋＢポリペプチドと併せて投与された場合に、ポリペプチドに対する免疫応答を増強、強化、及び／又はブーストする化合物を指す。しかしながら、アジュバント化合物が単独で投与される場合、アジュバント化合物は、それをコードする前述のポリペプチド又はポリヌクレオチドに対する免疫応答を生じさせない。アジュバントは、例えば、リンパ球のリクルート、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞の刺激、並びに抗原提示細胞の刺激を含む、いくつかの機構によって免疫応答を増強することができる。
【0172】
ＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢポリペプチド及び／又はそれらをコードするポリヌクレオチドを含む本明細書に記載されるワクチン組成物は、アジュバントを含むか、又はアジュバントと組み合わせて投与される。本明細書に記載されるワクチン組成物と組み合わせた投与のためのアジュバントは、ワクチン組成物の投与の前に、併用して、又は後に投与することができる。
【0173】
好適なアジュバントは当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、フラジェリン、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェノール、ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、及びリポソームポリカチオンＤＮＡ粒子が含まれる。アジュバントの追加的な例としては、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３５５，６２５号に記載されるようなβ－グルカン、又は顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）が挙げられる。
【0174】
追加的な例示的なアジュバントには、アルミニウム塩（ミョウバン）（ミョウバン又はナノミョウバン製剤（ｎａｎｏａｌｕｍ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を含むナノ粒子を含む、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、及び酸化アルミニウムなど）、リン酸カルシウム（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｓｓｏｎ ＪＤ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １６：２８９－２９９（２０１７））、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）又は３－ｄｅ－Ｏ－アシル化モノホスホリル リピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）（例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる英国特許第ＧＢ２２２０２１１号、ＥＰ０９７１７３９、ＥＰ１１９４１６６、ＵＳ６４９１９１９を参照されたい）、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３及びＡＳ０４（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥＰ１１２６８７６、ＡＳ０４に関してＵＳ７３５７９３６ ＥＰ０６７１９４８、ＥＰ０７６１２３１、ＡＳ０２に関してＵＳ５７５０１１０を参照されたい）、イミダゾピリジン化合物（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１０９８１２を参照されたい）、イミダゾキノキサリン化合物（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１０９８１３を参照されたい）、デルタ－イヌリン（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰｅｔｒｏｖｓｋｙ Ｎ ａｎｄ ＰＤ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｖａｃｃｉｎｅ ３３：５９２０－５９２６（２０１５））、ＳＴＩＮＧ－活性化合成環状ジヌクレオチド（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／００５６２２４）、レシチンとカルボマーホモポリマーの組み合わせ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ６，６７６，９５８）、サポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ及びＱＳ２１（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＺｈｕ Ｄ ａｎｄ Ｗ Ｔｕｏ，２０１６，Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ３：ｅ１１３（ｄｏｉ：１０．４１７２／２３２９－６８３６．１０００ｅ１１３））、任意選択的にＱＳ７との組み合わせ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）、ＵＳ ５，０５７，５４０を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。任意の実施形態では、アジュバントは、フロイントアジュバント（完全又は不完全）である。任意の実施形態では、アジュバントは、例えば、Ｂｒｅｎｎｔａｇ（現Ｃｒｏｄａ）又はＩｎｖｉｖｏｇｅｎから商業的に入手可能な、Ｑｕｉｌ－Ａを含む。ＱｕｉｌＡは、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ ｔｒｅｅ由来のサポニンの水抽出可能な画分を含有する。これらのサポニンは、共通のトリテルペノイド骨格構造を有するトリテルペノイドサポニンのグループに属する。サポニンは、Ｔ依存性抗原及びＴ非依存性抗原に対する強力なアジュバント応答、並びに強力な細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球応答を誘導し、粘膜抗原に対する応答を増強することが知られている。したがって、任意の実施形態では、アジュバントはサポニンを含む。任意の実施形態では、アジュバントは、ＱＳ－２１を含む。
【0175】
任意の実施形態では、サポニンは、コレステロール及びリン脂質と組み合わされて、異なる起源の幅広い抗原に対する抗体介在性及び細胞介在性の免疫応答の両方を活性化することができる免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を形成する。特定の実施形態では、アジュバントはＡＳ０１、例えばＡＳ０１Ｂである。ＡＳ０１は、ＭＰＬ（３－Ｏ－デスアシル－４’－モノホスホリルリピドＡ）、ＱＳ２１（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ、画分２１）、及びリポソームを含有するアジュバント系である。特定の実施形態において、ＡＳ０１は、市販されているか、又はＷＯ９６／３３７３９に記載されるように作製することができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定のアジュバントは、エマルジョンを含み、これは、例えば、油及び水などの２つの不混和流体の混合物であり、そのうちの一方は、他方の内部に小液滴として懸濁され、それらは表面活性剤によって安定化される。水中油型エマルジョンは、油の小さな液滴を囲む連続相を形成する水を有し、油中水型エマルジョンは、連続相を形成する油を有する。特定の水中油型エマルジョンは、スクアレン（代謝可能な油）を含む。特定のアジュバントは、ブロック共重合体を含み、これは、２つの単量体が一緒にクラスターを形成して、反復単位のブロックを形成するときに形成される共重合体である。ブロック共重合体、スクアレン、及び微粒子安定剤を含む油中水型エマルジョンの例は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に取得できるＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）である。
【0176】
任意選択的に、エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストなどの更なる免疫刺激成分と組み合わされ得るか、又はこれを含み得る。本明細書に開示される組成物で使用するためのアジュバントの組み合わせの好適であるが非限定的な例としては、水中油型エマルジョン（スクアレン又はピーナッツオイルなど）、ＭＦ５９（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥＰ０３９９８４３、ＵＳ６２９９８８４、ＵＳ６４５１３２５を参照されたい）、及び任意選択的にモノホスホリルリピドＡなどの免疫刺激剤及び／又はＡＳ０２などのＱＳ２１と組み合わされた、ＡＳ０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｔｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：８６－９１（１９９７）を参照されたい）が含まれる。アジュバントの更なる例は、ＡＳ０１Ｅ及びＡＳ０１Ｂなどの、ＭＰＬ及びＱＳ２１などの免疫刺激剤を含有するリポソームである（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０２０６７５８を参照されたい）。アジュバントの他の例は、ＣｐＧ及びイミダゾキノリン（イミキモド及びＲ８４８など）である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｅｅｄ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１９：１５９７－１６０８（２０１３）を参照されたい）。本発明による任意の実施形態では、アジュバントは、Ｔｈ１アジュバントである。
【0177】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるワクチン組成物のアジュバントは、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト単独又は別のアジュバントとの組み合わせを含有する。ＴＬＲ４アゴニストは当技術分野で周知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＩｒｅｔｏｎ ＧＣ及びＳＧ Ｒｅｅｄ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １２：７９３－８０７（２０１３）を参照されたい。任意の実施形態では、アジュバントは、リピドＡ、又はその類似体若しくは誘導体を含むＴＬＲ４アゴニストである。
【0178】
任意の実施形態では、ワクチン組成物のアジュバントは、リピドＡ又はリピドＡ類似体又は誘導体を含有する。本明細書で使用される場合、用語「リピドＡ」は、グルコサミンを含み、グラム陰性細菌の外膜の外葉にＬＰＳ分子を固定するケトシド結合を介してＬＰＳ分子の内核においてケト－デオキシオクツロソネートに連結されるＬＰＳ分子の疎水性脂質部分を指す。本明細書で使用される場合、リピドＡには、天然に存在するリピドＡ、その混合物、類似体、誘導体、及び前駆体が含まれる。用語は、単糖類、例えば、リピドＸと称されるリピドＡの前駆体、二糖リピドＡ、ヘプタアシルリピドＡ、ヘキサアシルリピドＡ、ペンタアシルリピドＡ、テトラアシルリピドＡ、例えば、リピドＩＶＡと称されるリピドＡのテトラアシル前駆体、脱リン酸化リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ、ジホスホリルリピドＡ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のリピドＡなどを含む。いくつかの免疫活性化リピドＡ構造には、６つのアシル鎖が含有されている。グルコサミン糖に直接結合している４つの一次アシル鎖は、通常１０～１６炭素の長さの３－ヒドロキシアシル鎖である。２つの追加のアシル鎖は、多くの場合、一次アシル鎖の３－ヒドロキシ基に結合される。Ｅ．ｃｏｌｉリピドＡは、一例として、典型的には、糖に結合した４つのＣ１４の３－ヒドロキシアシル鎖と、それぞれ２’位及び３’位で一次アシル鎖の３－ヒドロキシ基に結合した１つのＣ１２及び１つのＣ１４とを有する。
【0179】
本明細書で使用される場合、用語「リピドＡ類似体又は誘導体」は、リピドＡの構造及び免疫活性に類似するが、自然界では必ずしも自然に存在しない分子を指す。リピドＡ類似体又は誘導体は、短縮又は縮合されるように、及び／又はそれらのグルコサミン残基を別のアミン糖残基、例えばガラクトサミン残基で置換するように、還元末端のグルコサミン－１－リン酸の代わりに２－デオキシ－２－アミノグルコン酸を含有するように、４’位のリン酸の代わりにガラクツロン酸部分を有するように、改変され得る。リピドＡ類似体又は誘導体は、細菌から単離されたリピドＡから、例えば、化学的誘導によって、又は化学合成されることによって、例えば、好ましいリピドＡの構造を最初に決定し、その類似体又はその誘導体を合成することによって調製されてもよい。リピドＡ類似体又は誘導体は、ＴＬＲ４アゴニストアジュバントとしても有用である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｒｅｇｇ ＫＡ ｅｔ ａｌ，ＭＢｉｏ ８，ｅＤＤ４９２－１７，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００４９２－１７（２０１７）を参照されたい）。
【0180】
ＭＰＬ及び３Ｄ－ＭＰＬは、リピドＡ毒性を弱毒化するように改変されたリピドＡ類似体又は誘導体である。リピドＡ、ＭＰＬ、及び３Ｄ－ＭＰＬは、長い脂肪酸鎖が付着した糖骨格を有し、骨格は、グリコシド結合内に２つの６－炭素糖、及び４位にホスホリル部分を含有する。典型的には、５～８個の長鎖脂肪酸（通常１２～１４個の炭素原子）が糖骨格に付着される。天然源由来のため、ＭＰＬ又は３Ｄ－ＭＰＬは、例えばヘプタアシル、ヘキサアシル、ペンタアシルなどの、様々な脂肪酸の長さを有する多くの脂肪酸置換パターンの複合又は混合物として存在し得る。これは、本明細書に記載される他のリピドＡ類似体又は誘導体のいくつかにも当てはまるが、合成リピドＡバリアントも定義され、均質であり得る。ＭＰＬ及びその製造は、ＵＳ４，４３６，７２７に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。３Ｄ－ＭＰＬは、ＵＳ４，９１２，０９４Ｂ１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、３位で還元末端グルコサミンと結合したエステルである３－ヒドロキシミリスチン酸アシル残基の選択的な除去によってＭＰＬとは異なる。本明細書に記載されるワクチン組成物への含有に好適なリピドＡ（類似体、誘導体）の例には、ＭＰＬ、３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥＰ１３８５５４１を参照されたい）、ＰＥＴ－リピドＡ、ＧＬＡ（グリコピーラノシル脂質アジュバント、合成二糖糖脂質（ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３１０６０２及びＵＳ８７２２０６４を参照されたい）、ＳＬＡ（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、ヒトワクチン用にＴＬＲ４リガンドを最適化するための構造－機能アプローチが記載される、Ｃａｒｔｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：ｅ１０８（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１６．６３）（２０１６））、ＰＨＡＤ（リン酸化ヘキサアシル二糖、その構造はＧＬＡの構造と同じである）、３Ｄ－ＰＨＡＤ、３Ｄ－（６－アシル）－ＰＨＡＤ（３Ｄ（６Ａ）－ＰＨＡＤ）、Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号２８７１８０－６３－６）、ＯＮＯ４００７、ＯＭ－１７４などが挙げられる。任意の実施形態では、ワクチン組成物のアジュバントは、３Ｄ－ＭＰＬ、ＧＬＡ、又はＳＬＡから選択されるリピドＡ類似体又は誘導体を含むＴＬＲ４アゴニストアジュバントである。特定の実施形態では、リピドＡ類似体又は誘導体は、リポソームで製剤化される。
【0181】
好ましくは、ＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバントは、アジュバント中の免疫調節分子及び／又は免疫原のための様々な送達系となる、様々な手法で、例えば、エマルジョンで、例えば、油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョン又は水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョン（例は、ＭＦ５９、ＡＳ０３である）、安定（ナノ－）エマルジョン（ＳＥ）、脂質懸濁液、リポソーム、（高分子）ナノ粒子、ビロソーム、吸着ミョウバン（ａｌｕｍ ａｄｓｏｒｂｅｄ）、水性製剤（ＡＦ）などで、製剤化され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１９：１５９７－１６０８（２０１３）及びＡｌｖｉｎｇ ＣＲ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：３１０－３１５（２０１２）を参照されたい）。
【0182】
任意の実施形態では、免疫刺激性ＴＬＲ４アゴニストは、任意選択的に、他の免疫調節成分、例えば、スクアレン水中油型エマルジョン（ＳＥ）（例えば、ＭＦ５９、ＡＳ０３）、サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ７、ＱＳ２１、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ、Ｉｓｃｏｍ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘなど）、アルミニウム塩、他のＴＬＲのための活性化因子（例えば、イミダゾキノリン、フラゲリン、ｄｓＲＮＡ類似体、ＴＬＲ９アゴニスト、例えばＣｐＧ、など）などと組み合わせることができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｅｄ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１９：１５９７－１６０８（２０１３）を参照されたい）。
【0183】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるワクチン組成物のアジュバントは、ＴＬＲ４アゴニストの組み合わせ、例えば、ＳＥと組み合わせたＧＬＡ（すなわち、ＧＬＡ－ＳＥ）である。任意の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストとの組み合わせにおける、例えば、サポニンの組み合わせでのＧＬＡ（例えば、ＧＬＳ－ＱＳ２１）、本明細書に開示されるワクチン組成物のアジュバント。任意の実施形態では、前述のアジュバントはリポソームとして製剤化され得る。したがって、例示的なアジュバントは、合成ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、ＭＰＬ［ＧＬＡ］）及びサポニン（例えば、ＱＳ２１）を含み、リポソームとして製剤化されたＧＬＡ－ＬＳＱも含む。
【0184】
本明細書に記載されるワクチン組成物で使用するための追加の例示的なアジュバントは、リピドＡ類似体又は誘導体を含み、並びに例えばＳＬＡ－ＳＥ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、スクアレンオイル／水エマルジョン）、ＳＬＡ－Ｎａｎｏａｌｕｍ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、アルミニウム塩）、ＧＬＡ－Ｎａｎｏａｌｕｍ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、アルミニウム塩）、ＳＬＡ－ＡＦ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、水性懸濁液）、ＧＬＡ－ＡＦ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、水性懸濁液）、ＳＬＡ－ａｌｕｍ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、アルミニウム塩）、ＧＬＡ－ａｌｕｍ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、アルミニウム塩）、ＡＳ０１（ＭＰＬ、ＱＳ２１、リポソーム）、ＡＳ０２（ＭＰＬ、ＱＳ２１、油／水エマルジョン）、ＡＳ２５（ＭＰＬ、油／水エマルジョン）、ＡＳ０４（ＭＰＬ、アルミニウム塩）、及びＡＳ１５（ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧ、リポソーム）が挙げられる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／１５３５４１、ＷＯ２０１０／１４１８６１、ＷＯ２０１３／１１９８５６、ＷＯ２０１９／０５１１４９、ＷＯ２０１３／１１９８５６、ＷＯ２００６／１１６４２３、米国特許第４，９８７，２３７号、米国特許第４，４３６，７２７号、米国特許第４，８７７，６１１号、米国特許第４，８６６，０３４号、米国特許第４，９１２，０９４号、米国特許第４，９８７，２３７号、米国特許第５，１９１，０７２号、米国特許第５，５９３，９６９号、米国特許第６，７５９，２４１号、米国特許第９，０１７，６９８号、米国特許第９，１４９，５２１号、米国特許第９，１４９，５２２号、米国特許第９，４１５，０９７号、米国特許第９，４１５，１０１号、米国特許第９，５０４，７４３号、Ｒｅｅｄ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１９：１５９７－１６０８（２０１３）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，４２：４６４０－４６４９（１９９９）、及びＵｌｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ，１９９５，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｅｄｓ．；Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，４９５－５２４を参照されたい。
【0185】
任意の実施形態では、ワクチン組成物のＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢタンパク質又はそのポリペプチドは、免疫原性担体分子にコンジュゲートされてもよい。好適な免疫原性担体分子としては、限定されるものではないが、ウシ血清アルブミン、鶏卵オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、サイログロブリン、肺炎球菌莢膜多糖、ＣＲＭ１９７、及び髄膜炎菌外膜タンパク質が挙げられる。
【0186】
ワクチン組成物は、血清型３３６多糖抗原、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、フィブリノゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、エラスチン結合タンパク質と、ＭＨＣ類似タンパク質、多糖類細胞内接着性（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、ベータ溶血素、デルタ溶血素、パントン－バレンタインロイコシジン、ロイコシジンＭ、表皮剥脱毒素Ａ、表皮剥脱性毒素Ｂ、Ｖ８プロテアーゼ、ヒアルロン酸リアーゼ、リパーゼ、スタフィロキナーゼ、エンテロトキシン、エンテロトキシンスーパー抗原ＳＥＡ、エンテロトキシンスーパー抗原ＳＡＢ、毒素性ショック症候群毒素－１、ポリ－Ｎ－スクシニルベータ－１→６グルコサミン、カタラーゼ、ベータラクタマーゼ、テイコ酸、ペプチドグリカン、ペニシリン結合タンパク質、走化性阻害タンパク質、補体阻害剤、Ｓｂｉ、タイプ５抗原、タイプ８抗原、及びリポテイコ酸からなる群から選択される追加の１つ以上のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原を更に含む。本明細書に記載されるワクチン組成物への含有に適した他のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原としては、限定されるものではないが、ＣＰ５、ＣＰ８、Ｅａｐ、Ｅｂｈ、Ｅｍｐ、ＥｓａＢ、ＥｓａＣ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＡＢ（融合）、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＭｎｔＣ、ｒＴＳＳＴ－１、ｒＴＳＳＴ－１ｖ、ＴＳＳＴ－１、ＳａｓＦ、ｖＷｂｐ、ｖＷｈビトロネクチン結合タンパク質、Ａａａ、Ａａｐ、Ａｎｔ、オートリシングルコサミニダーゼ、オートリシンアミダーゼ、Ｃａｎ、コラーゲン結合タンパク質、Ｃｓａ１Ａ、ＥＦＢ、エラスチン結合タンパク質、ＥＰＢ、ＦｂｐＡ、フィブリノゲン結合タンパク質、フィブロネクチン結合タンパク質、ＦｈｕＤ、ＦｈｕＤ２、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＧｅｈＤ、ＨａｒＡ、ＨＢＰ、免疫優性ＡＢＣトランスポーター、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ラミニン受容体、リパーゼＧｅｈＤ、ＭＡＰ、Ｍｇ２＋トランスポーター、ＭＨＣ ＩＩ類似体、ＭＲＰＩＩ、ＮＰａｓｅ、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＫ、ＳＢＩ、ＳＥＡエキソトキシン、ＳＥＢエキソトキシン、ｍＳＥＢ、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣトランスポーター、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＳｓａＡ、ＳＳＰ－１、ＳＳＰ－２、Ｓｔａ００６、及びＳｔａ０１１が挙げられる。
【0187】
任意の実施形態では、ワクチン組成物は、例えば、注射装置（例えば、シリンジ又は注入ポンプ）を介して注射され得る注射剤として製剤化される。注射は、例えば、筋肉内、腹腔内、硝子体内、又は静脈内に送達され得る。
【0188】
本開示のワクチン組成物は、非経口投与のために製剤化されてもよい。組成物の溶液、懸濁液、又はエマルジョンは、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及び油中のそれらの混合物中で調製されてもよい。例示的な油は、石油、動物、植物、又は合成起源のものであり、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、又は鉱油である。一般的に、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、並びにプロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射可能な溶液に好ましい液体担体である。保存及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。
【0189】
注射可能な使用に適した医薬ワクチン組成物は、滅菌水溶液又は分散液、並びに滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は、滅菌されなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造及び保管の条件下で安定しなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、これらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。
【0190】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるワクチン組成物は、固体製剤、例えば、そのまま使用できる、又は医師若しくは患者が使用する前に溶媒及び／又は希釈剤を添加する、凍結乾燥又は噴霧乾燥組成物である。固体剤形は、錠剤、例えば、圧縮錠剤、及び／又はコーティング錠、並びにカプセル（例えば、硬又は軟ゼラチンカプセル）を含み得る。ワクチン組成物はまた、例えば、サシェ、糖剤、粉末、顆粒、トローチ、又は再構成のための粉末の形態であってもよい。
【0191】
ワクチン組成物の剤形は、水溶性又は分散性の担体を含み得る場合、即時放出であってもよく、又は消化管内又は皮膚下での剤形の溶解速度を調節する水不溶性ポリマーを含み得る場合、遅延放出、徐放、又は調節放出であってもよい。
【0192】
他の実施形態では、ワクチン組成物は、鼻腔内、頬側内、又は舌下に送達され得る。
【0193】
ワクチン組成物の水性製剤中のｐＨは、ｐＨ３～ｐＨ１０との間とすることができる。一実施形態では、ワクチン組成物のｐＨは、約７．０～約９．５である。別の実施形態では、ワクチン組成物のｐＨは約３．０～約７．０である。
【0194】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチン組成物の使用
本開示の別の態様は、対象におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の発症を防止又は阻害するための、本明細書に記載されるワクチン組成物の使用に関する。一実施形態では、本開示は、対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を生成する方法であって、当該対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する当該免疫応答を生成するのに有効な条件下で、本明細書に記載されるワクチン組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。別の実施形態は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染を治療又は予防を必要とする対象において、それを治療又は予防する方法であって、本明細書に開示されるような有効量のワクチン組成物を投与することを伴う方法を対象とする。別の実施形態は、本明細書に開示されるような有効量のワクチン組成物を投与することを含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの除菌又はコロニー形成若しくは再コロニー形成の防止を必要とする対象における、それを防止する方法を対象とする。この態様によれば、本明細書に記載される方法は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの短期的かつ持続的なコロニー形成又は再コロニー形成の防止を必要とする対象においてそれを防止するのに好適である。
本開示の別の態様は、対象におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の発症を防止又は阻害するための、本明細書に記載されるワクチン組成物の使用に関する。一実施形態では、本開示は、対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を生成する方法であって、当該対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する当該免疫応答を生成するのに有効な条件下で、本明細書に記載されるワクチン組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。別の実施形態は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染を治療又は予防を必要とする対象において、それを治療又は予防する方法であって、本明細書に開示されるような有効量のワクチン組成物を投与することを伴う方法を対象とする。別の実施形態は、本明細書に開示されるような有効量のワクチン組成物を投与することを含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの除菌又はコロニー形成若しくは再コロニー形成の防止を必要とする対象における、それを防止する方法を対象とする。この態様によれば、本明細書に記載される方法は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの短期的かつ持続的なコロニー形成又は再コロニー形成の防止を必要とする対象においてそれを防止するのに好適である。
【0195】
これらの方法は、本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれか１つを、それを必要とする対象、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの曝露又は感染のリスクがある対象に投与することを含む。一実施形態では、ワクチン組成物は、上記のＬｕｋＡバリアントポリペプチド（すなわち、配列番号１又は２のバリアント）、及び野生型ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを含む。別の実施形態では、ワクチン組成物は、上記の野生型ＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチド、及びＬｕｋＢバリアントポリペプチド（すなわち、配列番号１５又は１６のバリアント）を含む。別の実施形態では、ワクチン組成物は、上記のＬｕｋＡバリアントポリペプチド及びＬｕｋＢバリアントポリペプチドを含む。本開示のこの態様による治療に適した対象は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を発症するリスクがある対象である。
【0196】
本開示のこの態様によれば、予防有効量のワクチン組成物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する免疫応答を生成させるために対象に投与される。予防的有効量は、液性（すなわち、抗体媒介性）及び細胞性（Ｔ細胞）の免疫応答を生成又は誘発するために必要な量である。誘発された体液性応答は、そのような応答の非存在下でそうでなければ発症するであろうＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症を予防するか又はその程度を少なくとも低減するのに十分である。好ましくは、本明細書に記載されるワクチン組成物の予防有効量の投与は、対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する中和免疫応答を誘導する。対象において効果的な免疫応答を果たすために、組成物は、上記に記載される１つ以上の追加のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原又はアジュバントを更に含有してもよい。代替的な実施形態では、アジュバントは、本開示の組成物の投与前、投与後、又は投与と同時のいずれかで、組成物とは別に対象に投与される。
【0197】
本開示のこの態様の目的のために、標的の「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを包含する。対象におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染及びＳ．ａｕｒｅｕｓコロニー形成を予防、阻害、又は重症度を低減する目的でワクチン組成物を投与することに関連して、標的対象は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに感染されるリスクがある任意の対象を包含する。特に感受性の高い対象には、免疫不全の幼児、若年者、成人、及び高齢者が含まれる。しかしながら、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染のリスクがある任意の幼児、若年者、成人、又は高齢者は、本明細書に記載される方法及びワクチン組成物に従って治療することができる。特に適切な対象には、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）又はメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）による感染のリスクがある対象が含まれる。他の適切な対象としては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に起因する状態、すなわちＳ．ａｕｒｅｕｓ関連状態、例えば、皮膚創傷及び感染症、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、敗血症、敗血症性関節炎、心筋炎、心内膜炎、及び毒素性ショック症候群など、を有し得るか、又は発症するリスクを有し得る対象が挙げられる。
【0198】
任意の実施形態では、対象は、少なくとも、又は最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８５、又は９０歳（又はそこから導き出せる任意の範囲）である。特定の実施形態では、ヒト対象などの本明細書に記述される対象又は患者は、小児対象である。小児対象は、１８歳未満と定義される対象である。任意の実施形態では、小児対象ｔは、２歳以下である。任意の実施形態では、小児対象は、１歳未満である。任意の実施形態では、小児対象は、６ヵ月未満である。任意の実施形態では、小児対象は、２ヵ月以下である。任意の実施形態では、ヒト患者は、６５歳以上である。任意の実施形態では、ヒト患者は、医療従事者である。任意の実施形態では、患者は、外科的処置を受ける患者である。
【0199】
ワクチン組成物を、堅牢な免疫応答を誘導するのに有効な条件下で投与する場合、多数の他の因子も考慮され得る。これらの因子には、例えば、限定されないが、組成物中の活性薬剤の濃度、投与の様式及び投与頻度、並びに年齢、体重、並びに全体的な健康及び免疫状態などの対象の詳細が含まれる。一般的なガイダンスは、例えば、医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の刊行物及びＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）に見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。臨床医は、所望の又は必要な予防効果、例えば、所望の抗体力価を提供する投与量に達するまで、本明細書に記載されるワクチン組成物を投与することができる。予防的応答の進行は、従来のアッセイによって容易にモニターすることができる。
【0200】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるワクチン組成物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに感染するリスクがある、又は関連する状態を発症するリスクがある対象において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症の発生を予防、遅延、又は阻害するために予防的に投与される。本開示の任意の実施形態では、ワクチン組成物の予防的投与は、個体におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を完全に予防するのに有効である。他の実施形態では、予防的投与は、このような投与がなければ発症するであろう感染の全範囲を予防し、すなわち、個体におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症を実質的に予防又は阻害するのに有効である。
【0201】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染を防止するための予防的組成物の使用の状況において、組成物の投与量は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＬｕｋＡＢ媒介性細胞傷害を中和することができる抗体力価を生成するのに十分であり、多くの症状の低減、少なくとも１つの症状の重症度の減少、又は少なくとも１つの症状の更なる進行の遅延、又は感染の完全な緩和さえ達成することができるものである。
【0202】
本明細書に記載されるワクチン組成物の予防有効量は、アジュバントが共投与されるかどうかに依存し、アジュバントの非存在下では高い投与量が必要となる。投与のためのバリアントＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢの量は、患者当たり１μｇ～５００μｇから変化し得る。任意の実施形態では、５、１０、２０、２５、５０、又は１００μｇが、各ヒト注射に使用される。場合によっては、１回の注射当たり１～５０ｍｇの高用量が使用される。典型的には、各ヒト注射に約１０、２０、３０、４０、又は５０ｍｇが使用される。注射のタイミングは、年に１回から１０年に１回まで大きく変動し得る。一般に、有効投与量は、対象から体液試料、一般には血清試料を得て、当技術分野で周知であり、測定される特定の抗原に容易に適合できる方法を使用して、ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、又はＬｕｋＡＢに対して開発された抗体の力価を決定することによってモニターすることができる。理想的には、最初の投与前に試料を採取し、各免疫化後にその後の試料を採取して力価を決定する。一般に、１：１００の血清希釈で、対照又は「バックグラウンド」レベルよりも少なくとも４倍高い検出可能な力価を提供する用量又は投与スケジュールが望ましいが、ここで、バックグラウンドは、対照血清に対して又はＥＬＩＳＡアッセイのプレートバックグラウンドに対して定義される。
【0203】
本開示のワクチン組成物は、予防的治療のための非経口、局所的、静脈内、経口、腹腔内、鼻腔内、又は筋肉内手段によって投与することができる。
【0204】
本開示のワクチン組成物は、非経口投与のために製剤化されてもよい。組成物の溶液、懸濁液、又はエマルジョンは、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及び油中のそれらの混合物中で調製されてもよい。例示的な油は、石油、動物、植物、又は合成起源のものであり、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、又は鉱油である。一般的に、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、並びにプロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射可能な溶液に好ましい液体担体である。保存及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。
【0205】
注射可能な使用に適した医薬ワクチン製剤は、滅菌水溶液又は分散液、並びに滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は、滅菌されなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造及び保管の条件下で安定しなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、これらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。
【0206】
実施形態
本開示は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
本開示は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
【0207】
実施形態１は、配列番号２５のバリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）ポリペプチドであり、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、及びＶａｌ１９３に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。
【0208】
実施形態２は、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のＧｌｕ３２３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を更に含む、実施形態１に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0209】
実施形態３は、Ｇｌｕ３２３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、グルタミン酸からアラニンへの（Ｇｌｕ３２３Ａｌａ）置換を含む、実施形態２に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0210】
実施形態４は、Ｌｙｓ８３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、リジンからメチオニンへの（Ｌｙｓ８３Ｍｅｔ）置換を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0211】
実施形態５は、Ｓｅｒ１４１に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、セリンからアラニンへの（Ｓｅｒ１４１Ａｌａ）置換を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0212】
実施形態６は、Ｖａｌ１１３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、バリンからイソロイシンへの（Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ）置換を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0213】
実施形態７は、Ｖａｌ１９３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、バリンからイソロイシンへの（Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ）置換を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0214】
実施形態８は、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ１４１、Ｖａｌ１１３、Ｖａｌ１９３及びＧｌｕ３２３に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、実施形態２～７のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0215】
実施形態９は、アミノ酸置換が、Ｌｙｓ８３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１４１Ａｌａ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９３Ｉｌｅ及びＧｌｕ３２３Ａｌａを含む、実施形態８に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0216】
実施形態１０は、当該バリアントが、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ及びＧｌｕ３２０Ａｌａに対応するアミノ酸置換を含む、配列番号１のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントである、実施形態１に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0217】
実施形態１１は、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0218】
実施形態１２は、当該バリアントが、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ、Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ及びＧｌｕ３２１Ａｌａに対応するアミノ酸置換を含む、配列番号２のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントである、実施形態１に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0219】
実施形態１３は、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0220】
実施形態１４は、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９及びＧｌｙ１５６に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を更に含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0221】
実施形態１５は、Ｔｙｒ７４に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、チロシンからシステインへの（Ｔｙｒ７４Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態１４に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0222】
実施形態１６は、Ａｓｐ１４０に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、アスパラギンからシステインへの（Ａｓｐ１４０Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態１４又は実施形態１５に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0223】
実施形態１７は、Ｇｌｙ１４９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、グリシンからシステインへの（Ｇｌｙ１４９Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0224】
実施形態１８は、Ｇｌｙ１５６に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、グリシンからシステインへの（Ｇｌｙ１５６Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0225】
実施形態１９は、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｙｒ７４、Ａｓｐ１４０、Ｇｌｙ１４９及びＧｌｙ１５６に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである
【0226】
実施形態２０は、当該バリアントが、配列番号１のＬｙｓ８０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３８Ａｌａ、Ｖａｌ１１０Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９０Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２０Ａｌａ、Ｔｙｒ７１Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４６Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５３Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む、配列番号１のＣＣ８ ＬｕｋＡバリアントである、実施形態１４に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0227】
実施形態２１は、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態２０に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0228】
実施形態２２は、当該バリアントが、配列番号２のＬｙｓ８１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１３９Ａｌａ，Ｖａｌ１１１Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３２１Ａｌａ、Ｔｙｒ７２Ｃｙｓ、Ａｓｐ１３８Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４７Ｃｙｓ、及びＧｌｙ１５４Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む、配列番号２のＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアントである、実施形態１４に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0229】
実施形態２３は、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態２２に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0230】
実施形態２４は、当該ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸残基Ｔｈｒ２４９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を更に含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0231】
実施形態２５は、Ｔｈｒ２４９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、トレオニンからバリンへの（Ｔｈｒ２４９Ｖａｌ）置換を含む、実施形態２４に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0232】
実施形態２６は、当該バリアントＬｕｋＡタンパク質が、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態２５に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである
【0233】
実施形態２７は、アミノ末端シグナル配列を更に含む、実施形態１～２６のいずれか１つのＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0234】
実施形態２８は、アミノ末端シグナル配列が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、実施形態２７に記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0235】
実施形態２９は、アミノ末端精製配列を更に含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドである。
【0236】
実施形態３０は、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチドをコードする核酸分子である。
【0237】
実施形態３１は、実施形態３０に記載の核酸分子を含む発現ベクターである。
【0238】
実施形態３２は、実施形態３１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞である。
【0239】
実施形態３３は、配列番号３９のバリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであり、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸残基Ｖａｌ５３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。
【0240】
実施形態３４は、Ｖａｌ５３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、バリンからロイシンへの（Ｖａｌ５３Ｌｅｕ）置換を含む、実施形態３３に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0241】
実施形態３５は、当該バリアントが、配列番号１５のＶａｌ５３Ｌｅｕに対応するアミノ酸置換を含む、配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントである、実施形態３３に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0242】
実施形態３６は、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、実施形態３５に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0243】
実施形態３７は、当該バリアントが、配列番号１６のＶａｌ５３Ｌｅｕに対応するアミノ酸置換を含む、配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントである、実施形態３３に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0244】
実施形態３８は、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、実施形態３７に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0245】
実施形態３９は、当該バリアントが、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を更に含む、実施形態３３又は実施形態３４に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0246】
実施形態４０は、Ｇｌｕ４５に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、グルタミン酸からシステインへの（Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態３９に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0247】
実施形態４１は、Ｇｌｕ１０９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、グルタミン酸からシステインへの（Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態３９又は実施形態４０に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0248】
実施形態４２は、Ｔｈｒ１２１に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、トレオニンからシステインへの（Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0249】
実施形態４３は、Ａｒｇ１５４に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、アルギニンからシステインへの（Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態３９～４２のいずれか１つに記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0250】
実施形態４４は、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、実施形態３９～４３のいずれか１つに記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0251】
実施形態４５は、当該バリアントが、配列番号１５のＶａｌ５３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ及びＡｒｇ１５４Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントである、実施形態３９に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0252】
実施形態４６は、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、実施形態４５に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0253】
実施形態４７は、当該バリアントが、配列番号１６のＶａｌ５３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２３Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５５Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントである、実施形態３９に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0254】
実施形態４８は、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態４７に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0255】
実施形態４９は、配列番号３９のバリアントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであり、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸残基Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。
【0256】
実施形態５０は、Ｇｌｕ４５に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、グルタミン酸からシステインへの（Ｇｌｕ４５Ｃｙｓ）置換を含み、Ｔｈｒ１２１に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、トレオニンからシステインへの（Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態４９に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0257】
実施形態５１は、Ｇｌｕ１０９に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、グルタミン酸からシステインへの（Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ）置換を含み、Ａｒｇ１５４に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換が、アルギニンからシステインへの（Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ）置換を含む、実施形態４９又は実施形態５０に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0258】
実施形態５２は、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸Ｇｌｕ４５、Ｇｌｕ１０９、Ｔｈｒ１２１、及びＡｒｇ１５４に対応する各アミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、実施形態４９～５１のいずれか１つに記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0259】
実施形態５３は、当該バリアントが、配列番号１５のＧｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１０９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２１Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５４Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１５のＣＣ８ ＬｕｋＢバリアントである、実施形態５２に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0260】
実施形態５４は、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施形態５３に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0261】
実施形態５５は、当該バリアントが、配列番号１６のＧｌｕ４５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１２３Ｃｙｓ、及びＡｒｇ１５５Ｃｙｓに対応するアミノ酸置換を含む配列番号１６のＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアントである、実施形態５２に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0262】
実施形態５６は、当該ＬｕｋＢバリアントポリペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、実施形態５５に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0263】
実施形態５７は、アミノ末端シグナル配列を更に含む、実施形態３３～５６のいずれか１つに記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0264】
実施形態５８は、アミノ末端シグナル配列が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、実施形態５７に記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである
【0265】
実施形態５９は、アミノ末端精製タグを更に含む、実施形態３３～５８のいずれか１つに記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドである。
【0266】
実施形態６０は、実施形態３３～５９のいずれか１つに記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドをコードする核酸分子である。
【0267】
実施形態６１は、実施形態６０に記載の核酸分子を含む発現ベクターである。
【0268】
実施形態６２は、実施形態６０に記載の核酸分子に作動可能に連結された実施形態３０の核酸分子を含む発現ベクターである。
【0269】
実施形態６３は、配列番号５９（ＣＣ４５ ＬｕｋＢ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５５（ＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態６２に記載の発現ベクターである。
【0270】
実施形態６４は、配列番号６１（ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５５（ＣＣ４５ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態６２に記載の発現ベクターである。
【0271】
実施形態６５は、配列番号５８（ＣＣ８ ＬｕｋＢ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５４（ＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態６２に記載の発現ベクターである。
【0272】
実施形態６６は、配列番号６１（ＣＣ４５ ＬｕｋＢバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５４（ＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態６２に記載の発現ベクターである。
【0273】
実施形態６７は、配列番号６０（ＣＣ８ ＬｕｋＢバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号５４（ＣＣ８ ＬｕｋＡバリアント）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態６２に記載の発現ベクターである。
【0274】
実施形態６８は、実施形態６１～６７のいずれか１つに記載の発現ベクターを含む宿主細胞である。
【0275】
実施形態６９は、実施形態６１～６７のいずれか１つに記載の発現ベクターを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物である。
【0276】
実施形態７０は、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の１つ以上のバリアントＬｕｋＡバリアントポリペプチドを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物である。
【0277】
実施形態７１は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号１のバリアントである、実施形態７０に記載のワクチン組成物である。
【0278】
実施形態７２は、ロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する、当該ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを更に含む、実施形態７０又は実施形態７１に記載のワクチン組成物である。
【0279】
実施形態７３は、ロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する、当該ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを更に含む、実施形態７０又は実施形態７１に記載のワクチン組成物である。
【0280】
実施形態７４は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｌｙｓ８０、Ｓｅｒ１３８、Ｖａｌ１１０、Ｖａｌ１９０、及びＧｌｕ３２０Ａｌａに対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、実施形態７３に記載のワクチン組成物である。
【0281】
実施形態７５は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0282】
実施形態７６は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、アミノ酸配列配列番号３を含み、ＬｕｋＢポリペプチドが配列番号１８のアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0283】
実施形態７７は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0284】
実施形態７８は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0285】
実施形態７９は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２のバリアントである、実施形態７０に記載のワクチン組成物である。
【0286】
実施形態８０は、ロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する当該ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを更に含む、実施形態７９に記載のワクチン組成物である。
【0287】
実施形態８１は、ロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する当該ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを更に含む、実施形態７９に記載のワクチン組成物である。
【0288】
実施形態８２は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基Ｌｙｓ８１、Ｓｅｒ１３９、Ｖａｌ１１１、Ｖａｌ１９１、及びＧｌｕ３２１Ａｌａに対応する１つ以上のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、実施形態７９～８１のいずれか１つに記載のワクチン組成物である。
【0289】
実施形態８３は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８２に記載のワクチン組成物である。
【0290】
実施形態８４は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、アミノ酸配列配列番号４を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、実施形態８２に記載のワクチン組成物である。
【0291】
実施形態８５は、実施形態３３～５６のいずれか１つに記載の１つ以上のバリアントＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物である。
【0292】
実施形態８６は、ロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号１（ＣＣ８）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する当該ＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドを更に含む、実施形態８５に記載のワクチン組成物である。
【0293】
実施形態８７は、ロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）タンパク質又はポリペプチドであって、配列番号２（ＣＣ４５）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する当該ＬｕｋＡタンパク質又はポリペプチドを更に含む、実施形態８５に記載のワクチン組成物である。
【0294】
実施形態８８は、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のＬｕｋＡバリアントポリペプチド、及び実施形態３３～５６のいずれか１つに記載のＬｕｋＢバリアントポリペプチドを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓワクチン組成物である。
【0295】
実施形態８９は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0296】
実施形態９０は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0297】
実施形態９１は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0298】
実施形態９２は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0299】
実施形態９３は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0300】
実施形態９４は、ＬｕｋＡバリアントポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＬｕｋＢタンパク質又はポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、実施形態７４に記載のワクチン組成物である。
【0301】
実施形態９５は、アジュバントを更に含む、実施形態６４～６９～９４のいずれか１つに記載のワクチン組成物である。
【0302】
実施形態９６は、１つ以上の追加のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原を更に含む、実施形態６９～９４のいずれか１つに記載のワクチン組成物である。
【0303】
実施形態９７は、対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を生成する方法であって、当該方法が、当該対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する当該免疫応答を生成するのに有効な条件下で、実施形態６９～９４のいずれか１つのワクチン組成物を対象に投与することを含む、方法である。
【0304】
実施形態９８は、対象においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を生成する方法で使用する、実施形態６６～９４のいずれか１つに記載のワクチン組成物である。
【実施例】
【0305】
以下の実施例は、本開示の実施形態を説明するために提供されるが、その範囲を限定することを決して意図するものではない。
【0306】
実施例１－例示的なＬｕｋＡバリアントポリペプチド、ＬｕｋＢバリアントポリペプチド、及び安定ＬｕｋＡＢ複合体
ＬｕｋＡＢヘテロ二量体タンパク質の発現については、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１にクローニングされたｌｕｋＡ構築物、及びｐＥＴＤｕｅｔ－１にクローニングされたｌｕｋＢ構築物と同時形質転換した。形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンで、それぞれｐＥＴＤｕｅｔ－１及びｐＣＤＦＤｕｅｔ－１を選択するために、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉブロス中、３７℃、１９０ｒｐｍで振とうしながら一晩培養した。発現のため、培養物がＯＤ６００＝２に達するまで１９０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で一晩培養した培養液の１：５０希釈液を新鮮なＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地に接種した。次いで、イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシドの最終濃度１ｍＭまでの添加を介して発現を誘導し、誘導を３７℃で更に５時間継続した。ＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢにおけるシステイン置換の対を含むＬｕｋＡＢヘテロ二量体の発現は、ジスルフィド結合形成を支持するために、Ｅ．ｃｏｌｉＯｒｉｇａｍｉ ２（ＤＥ３）細胞の細胞質で発現された。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の周辺質でのＬｕｋＡ単量体の発現は、ｐＤ８６１－ＣＨでのｌｕｋＡ構築物の形質転換を介して行われ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（３０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加）で最終濃度の４ｍＭのラムノースを使用して、３７℃で４時間誘導された。細胞質及び周辺質発現構築物の両方を誘導した後、細胞を４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して採取し、次いで溶解緩衝液（９４％のＢｕｇｂｕｓｔｅｒ［ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］＋６％の５Ｍ ＮａＣｌ＋０．４％の４Ｍ イミダゾール＋プロテアーゼ阻害剤カクテル［ＰｒｏｔｅａｓｅＡｒｒｅｓｔ、Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］）中に再懸濁した。室温で２０分間溶解した後、可溶化液を氷上で４５分間インキュベートし、次いで１６１００×ｇ、４℃で３５分間遠心分離した。タンパク質を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５Ｍ ＦＰＬＣ及びＨｉｓＴｒａｐカラムを使用して、ＬｕｋＡのＮ末端で６ｘＨｉｓ－ｔａｇを介して精製し、イミダゾール勾配（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ中、５０～５００ｍＭのイミダゾール）を使用して溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定された精製タンパク質を含有する画分をプールし、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％のグリセロール中、４℃で一晩透析した。精製されたタンパク質は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を介して定量化された。
ＬｕｋＡＢヘテロ二量体タンパク質の発現については、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１にクローニングされたｌｕｋＡ構築物、及びｐＥＴＤｕｅｔ－１にクローニングされたｌｕｋＢ構築物と同時形質転換した。形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンで、それぞれｐＥＴＤｕｅｔ－１及びｐＣＤＦＤｕｅｔ－１を選択するために、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉブロス中、３７℃、１９０ｒｐｍで振とうしながら一晩培養した。発現のため、培養物がＯＤ６００＝２に達するまで１９０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で一晩培養した培養液の１：５０希釈液を新鮮なＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地に接種した。次いで、イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシドの最終濃度１ｍＭまでの添加を介して発現を誘導し、誘導を３７℃で更に５時間継続した。ＬｕｋＡ及び／又はＬｕｋＢにおけるシステイン置換の対を含むＬｕｋＡＢヘテロ二量体の発現は、ジスルフィド結合形成を支持するために、Ｅ．ｃｏｌｉＯｒｉｇａｍｉ ２（ＤＥ３）細胞の細胞質で発現された。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の周辺質でのＬｕｋＡ単量体の発現は、ｐＤ８６１－ＣＨでのｌｕｋＡ構築物の形質転換を介して行われ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（３０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加）で最終濃度の４ｍＭのラムノースを使用して、３７℃で４時間誘導された。細胞質及び周辺質発現構築物の両方を誘導した後、細胞を４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して採取し、次いで溶解緩衝液（９４％のＢｕｇｂｕｓｔｅｒ［ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］＋６％の５Ｍ ＮａＣｌ＋０．４％の４Ｍ イミダゾール＋プロテアーゼ阻害剤カクテル［ＰｒｏｔｅａｓｅＡｒｒｅｓｔ、Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］）中に再懸濁した。室温で２０分間溶解した後、可溶化液を氷上で４５分間インキュベートし、次いで１６１００×ｇ、４℃で３５分間遠心分離した。タンパク質を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５Ｍ ＦＰＬＣ及びＨｉｓＴｒａｐカラムを使用して、ＬｕｋＡのＮ末端で６ｘＨｉｓ－ｔａｇを介して精製し、イミダゾール勾配（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ中、５０～５００ｍＭのイミダゾール）を使用して溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定された精製タンパク質を含有する画分をプールし、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％のグリセロール中、４℃で一晩透析した。精製されたタンパク質は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を介して定量化された。
【表4】
【0307】
実施例２－野生型、ＬｕｋＡ、及びＬｕｋＡＢトキソイドの細胞傷害性
ＬｕｋＡＢトキソイドタンパク質の細胞傷害性（表４に定義）を、前単球細胞株ＴＨＰ－１又は新たに単離された初代ヒト多形核白血球（ｈＰＭＮ）のいずれかを使用して、野生型ＬｕｋＡＢ毒素と比較して評価した。
ＬｕｋＡＢトキソイドタンパク質の細胞傷害性（表４に定義）を、前単球細胞株ＴＨＰ－１又は新たに単離された初代ヒト多形核白血球（ｈＰＭＮ）のいずれかを使用して、野生型ＬｕｋＡＢ毒素と比較して評価した。
【0308】
ＴＨＰ－１細胞は、細胞傷害性を試験する前に、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で分化させた。ＴＨＰ－１細胞傷害性アッセイについては、５０μＬ ＲＰＭＩ中の合計１×１０５個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＬｕｋＡＢ毒素及びトキソイドタンパク質を、タンパク質の標準濃度に調整し、氷冷ＲＰＭＩ培地中で段階希釈し、各々５０μＬの体積を適切なウェルに添加した。ＲＰＭＩのみの陰性対照に加えて、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を陽性対照として０．１％の最終濃度に加えた。プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で２時間インキュベートし、その後、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、膜完全性のマーカーとして機能する細胞質酵素乳酸デヒドロゲナーゼの放出を評価した。
【0309】
分化ＴＨＰ－１細胞に対するＬｕｋＡ及びＬｕｋＡＢトキソイドの細胞傷害性を、以下の表５に提供する。ＣＣ８及びＣＣ４５ ＬｕｋＡＢ野生型毒素の両方が、０．３１３μｇ／ｍＬと低い毒素濃度で細胞集団の３０％以上を殺傷したため、分化ＴＨＰ－１細胞は、野生型毒素に対して感受性があった。ＬｕｋＡ（デルタ１０）のＣ末端における最終１０アミノ酸残基の欠失は、ＣＣ８デルタ１０毒素の細胞傷害性が４０μｇ／ｍＬで５％未満の細胞死に低減したが、分化ＴＨＰ－１細胞に対するＣＣ４５デルタ１０毒素の細胞傷害性は低減しなかった。ＬｕｋＡ単量体のいずれも、分化ＴＨＰ－１細胞に対して細胞傷害を示さなかった。ＬｕｋＡが、ＬｕｋＢの非存在下では活性な細孔複合体を形成しないはずであるため、この結果は予想されたものであった。ＲＡＲＰＲ－３３、ＲＡＲＰＲ－３４、及びＲＡＲＰＲ－１５を含むＬｕｋＡＢ二量体トキソイドの各々は、分化したＴＨＰ－１細胞に対する細胞傷害性の顕著な低下を示し、最高試験濃度４０μｇ／ｍＬで試験されたトキソイドの各々について、１％以下の細胞死を示した。
【表5】
【0310】
ｈＰＭＮについては、中毒前に、全ての毒素を２．５μｇ／ｍＬ（サブユニット当たり）に正規化し、次いで、２０μＬの毒素を９６ウェルプレートの上部ウェルにピペット注入し、１０μＬの１Ｘ ＰＢＳ中で２倍に段階希釈した。ＰＭＮを単離し、９０μＬのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化した。次いで、９０μＬのＰＭＮを各ウェルにピペット注入し、毒素－ＰＭＮ混合物を３７℃＋５％ＣＯ２のインキュベーターで１時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。
【0311】
ヒト初代ＰＭＮ細胞に対するＬｕｋＡ単量体及びＬｕｋＡＢ二量体トキソイドの細胞傷害性を、以下の表６に提供する。野生型ＣＣ８及びＣＣ４５毒素は、それぞれ０．３１３μｇ／ｍＬ及び１．２５μｇ／ｍＬの毒素濃度で、初代ヒトＰＭＮの９０％超の殺傷を示した。比較すると、ＬｕｋＡＢトキソイド及びＬｕｋＡ単量体の各々は、これらの細胞に対する細胞傷害性が大幅に低下した。ＣＣ８ ＬｕｋＡ中の１０個のＣ末端残基の欠失は、分化ＴＨＰ－１細胞に対する細胞傷害性を本質的に排除したが、この毒素は、ｈＰＭＮに対する細胞傷害性を保持し、５μｇ／ｍＬ以上の濃度で２０％超の殺傷が観察された。ＣＣ８及びＣＣ４５ ＬｕｋＡ単量体は、活性細孔複合体の形成に重要なＬｕｋＢ構成要素を欠くトキソイドに予想されるように、ｈＰＭＮに対する細胞傷害性をほとんど示されなかった。ＬｕｋＡＢ二量体トキソイドの各々は、ＣＣ８及びＣＣ４５野生型ＬｕｋＡＢ毒素と比較して、ｈＰＭＮ細胞に対する細胞傷害性が顕著に低下した。ＲＡＲＰＲ－３３ ＬｕｋＡＢトキソイド、並びに関連するトキソイドＲＡＲＰＲ－３２及び－３４は、ＣＣ８デルタ１０よりも少ない細胞傷害性を示し、ＲＡＲＰＲ－３３は、最高試験濃度２０μｇ／ｍＬで細胞集団の１５％しか殺傷しなかった。
【表6】
【0312】
実施例３－ＲＡＲＰＲ－３３ ＬｕｋＡＢ毒素及びＷＴ ＬｕｋＡＢ毒素の他のバリアントの細胞傷害性。
ＲＡＲＰＲ－３３並びにＷＴ ＬｕｋＡＢ毒素及びＬｕｋＡ単量体の異なるバリアントの細胞傷害性及び免疫原性を評価するために、追加の実験を実施した。免疫原性試験にマウスを使用した。
ＲＡＲＰＲ－３３並びにＷＴ ＬｕｋＡＢ毒素及びＬｕｋＡ単量体の異なるバリアントの細胞傷害性及び免疫原性を評価するために、追加の実験を実施した。免疫原性試験にマウスを使用した。
【0313】
ＬｕｋＡＢ毒素、トキソイド、及び単量体の細胞傷害性を、ヒトＰＭＮで評価した。中毒の前に、全ての毒素を１００μｇ／ｍＬ（サブユニット当たり）に正規化し、次いで２０μＬの毒素を９６ウェルプレートの上部ウェルにピペット注入し、１０μＬの１Ｘ ＰＢＳ中で２倍に段階希釈した。ＰＭＮを異なるドナーから単離し、９０μＬのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化した。９０μＬのＰＭＮを各ウェルにピペット注入し、毒素－ＰＭＮ混合物を３７℃＋５％ＣＯ２のインキュベーターで１時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。死細胞のパーセンテージは、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引きし、１００％死に設定されるＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００処理細胞に対して正規化することによって計算された。
【0314】
ヒト初代ＰＭＮ細胞に対するＬｕｋＡ単量体及びＬｕｋＡＢ毒素の細胞傷害性を図３に提供する。野生型ＬｕｋＡＢ ＣＣ８及びＣＣ４５毒素は、それぞれ２．５μｇ／ｍＬ及び５μｇ／ｍＬの毒素濃度で、初代ヒトＰＭＮの９０％超の殺傷を示した。また、２．５μｇ／ｍＬでのＬｕｋＡＢハイブリッド毒素ＣＣ８／ＣＣ４５及びＣＣ４５／ＣＣ８についても、最大殺傷が観察された。比較すると、ＬｕｋＡＢトキソイド及びＬｕｋＡ単量体は、これらの細胞に対する細胞傷害性が大幅に低下した。ＣＣ８ ＬｕｋＡ中の１０個のＣ末端残基の欠失は、ｈＰＭＮに対する細胞傷害性を保持し、５μｇ／ｍＬ以上の濃度で２０％超の殺傷が観察された。ＣＣ８及びＣＣ４５ ＬｕｋＡ単量体、並びにこれらの単量体の組み合わせは、ｈＰＭＮに対する細胞傷害性をほとんど示さなかった。ＲＡＲＰＲ－３３のＬｕｋＡＢトキソイドは、ＣＣ８Δ１０Ｃよりも少ない細胞傷害性を示し、ＲＡＲＰＲ－３３は、最高試験濃度２０μｇ／ｍＬで細胞集団の１５％しか殺傷しなかった。
【0315】
実施例４－マウスにおける免疫原性。
異なるＬｕｋＡＢバリアントの免疫原性を決定するため、Ｅｎｖｉｇｏ Ｈｓｄ：ＮＤ４（４週齢）マウス（ｎ＝５／抗原）に、５０μｌのアジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄと混合した５０μｌの１０％グリセロール１Ｘ ＴＢＳ中の２０μｇのＬｕｋＡＢを皮下投与した。５匹のマウスのコホートはまた、同体積の１０％グリセロール１Ｘ ＴＢＳ及びＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄからなるモック免疫も受けた。同じ抗原－アジュバントカクテルを２週間間隔で２回ブーストした後、心臓穿刺を介してマウスから採血し、血清を得た。
異なるＬｕｋＡＢバリアントの免疫原性を決定するため、Ｅｎｖｉｇｏ Ｈｓｄ：ＮＤ４（４週齢）マウス（ｎ＝５／抗原）に、５０μｌのアジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄと混合した５０μｌの１０％グリセロール１Ｘ ＴＢＳ中の２０μｇのＬｕｋＡＢを皮下投与した。５匹のマウスのコホートはまた、同体積の１０％グリセロール１Ｘ ＴＢＳ及びＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄからなるモック免疫も受けた。同じ抗原－アジュバントカクテルを２週間間隔で２回ブーストした後、心臓穿刺を介してマウスから採血し、血清を得た。
【0316】
抗ＬｕｋＡＢ抗体力価を決定するために、ＥＬＩＳＡを実施した。ＷＴ ＬｕｋＡＢ ＣＣ８又はＣＣ４５を、１Ｘ ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３４５５）で１００μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、次いで２００μｌのブロッキング緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ中２．５％の乳状液）で１時間ブロックした。血清のブロッキング緩衝液への１：５００から始まる５倍段階希釈液を生成し、ロッカー上で１時間インキュベートさせた。次いで、プレートを再び３回洗浄し、ブロッキング緩衝液で１：５，０００に希釈したマウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｂｉｏｒａｄ）抗体を加え、室温で１時間インキュベートさせた。結合していない二次抗体を、洗浄緩衝液での３回連続洗浄で洗い流した。室温に戻したＴＭＢ（１００μｌ）を各ウェルに加え、蓋をして２５分間インキュベートした。反応の完了後、等量の２Ｎ硫酸を各反応ウェルに添加して、反応を停止させた。次いで、４５０ｎｍの吸光度でＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーでプレートを読み取った。図４Ａ及び４Ｂに図示されるヒートマップは、二重測定の平均吸光度値を示し、黒は高い吸光度及びコーティング抗原に結合している抗体を表し、白は低い吸光度及び結合している抗体がないことを表す。
【0317】
ＲＡＲＰＲ－３３は、堅牢な抗ＣＣ８及び抗ＣＣ４５ ＬｕｋＡＢ ＩｇＧ抗体力価を誘発した。（図４Ａ及び図４Ｂ）。ＲＡＲＰＲ－３３免疫化は、ＣＣ８ ＷＴ毒素、ＣＣ８／ＣＣ４５ハイブリッド毒素及びＣＣ８Δ１０Ｃトキソイドによる免疫と同等の抗ＣＣ８ ＩｇＧ応答を誘発した。個々のＣＣ８ ＬｕｋＡ単量体によって誘導された抗ＣＣ８ ＬｕｋＡＢ ＩｇＧ力価は、ＣＣ８ ＬｕｋＡＢ毒素又はＣＣ８／ＣＣ４５ハイブリッド毒素、ＣＣ４５／ＣＣ８ハイブリッド毒素、及びＲＡＲＰＲ ３３ハイブリッド抗原によって誘導されたものほど高くはなかった（図４Ａ）。
【0318】
ＲＡＲＰＲ－３３免疫マウスにおける抗ＣＣ４５ ＬｕｋＡＢ力価は、ＣＣ８／ＣＣ４５ ＷＴハイブリッド抗原によって誘発された力価よりも高く、ＣＣ４５ ＷＴ抗原によって誘発された力価と同等であった。ＣＣ８及びＣＣ４５ ＬｕｋＡ単量体を組み合わせることにより、ＣＣ８及びＣＣ４５ ＬｕｋＡＢの両方に対する抗体力価が誘発された（図４Ｂ）。しかしながら、ＣＣ８及びＣＣ４５ ＬｕｋＡ単量体を組み合わせることにより誘発されたこれらの抗ＣＣ８及び抗ＣＣ４５ ＬｕｋＡＢ力価は、ＲＡＲＰＲ３３によって誘発されたものほど高くはなかった。個々のＣＣ４５ ＬｕｋＡ単量体は、非常に高い抗ＣＣ４５ ＬｕｋＡＢ力価を誘発する。これは、ＣＣ４５／ＣＣ８ハイブリッドによって誘発されるレベルと類似しており、ＲＡＲＰＲ－３３又はＣＣ４５ ＷＴ毒素によって誘発されるレベルよりもわずかに低いに過ぎない。これらの結果は、ＲＡＲＰＲ－３３免疫化によりＬｕｋＡＢ ＣＣ８及びＣＣ４５の両方に対する抗体応答が高い大きさで誘導されることを示している。
【0319】
実験５－毒素細胞傷害性の抗体介在性中和
毒素細胞傷害性の抗体介在性中和を、実施例４で上述したように免疫したマウスから得られた血清で評価した。熱不活性化プール血清をＰＢＳ中４０％血清に正規化し、次いで、２０μＬの血清を９６ウェルプレートの上部ウェルにピペット注入し、１０μＬの１Ｘ ＰＢＳで２倍に段階希釈した。ＬＤ９０のＬｕｋＡＢ毒素クローン複合体配列バリアントの各々を、室温で１５分間、プレートに添加した（１０μＬ／ウェル）。次いで、８０μＬのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化された新たに単離されたヒト初代多形核白血球（ｈＰＭＮ）を、血清－毒素混合物に添加し、３７℃＋５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。抗体中和データを図５に提示する。
毒素細胞傷害性の抗体介在性中和を、実施例４で上述したように免疫したマウスから得られた血清で評価した。熱不活性化プール血清をＰＢＳ中４０％血清に正規化し、次いで、２０μＬの血清を９６ウェルプレートの上部ウェルにピペット注入し、１０μＬの１Ｘ ＰＢＳで２倍に段階希釈した。ＬＤ９０のＬｕｋＡＢ毒素クローン複合体配列バリアントの各々を、室温で１５分間、プレートに添加した（１０μＬ／ウェル）。次いで、８０μＬのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化された新たに単離されたヒト初代多形核白血球（ｈＰＭＮ）を、血清－毒素混合物に添加し、３７℃＋５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。抗体中和データを図５に提示する。
【0320】
ＲＡＲＰＲ－３３免疫化マウス由来の血清は、全ての抗原の中で最も強力で広くＬｕｋＡＢ中和能力を示した（図５）。ＲＡＲＰＲ３３免疫化マウス由来の血清は、０．２５％という低い血清で試験された全ての１１のＬｕｋＡＢバリアントの細胞傷害効果を強く中和し、ほとんどのＬｕｋＡＢバリアントはまた、０．０６３～０．１２５％という低い血清でも保護を提供した（図５）。個々のＣＣ８及びＣＣ４５ ＬｕｋＡ単量体による免疫化は、抗原骨格に高度に偏ったＬｕｋＡＢ中和能力を有する血清をもたらした（図５）。ＣＣ８ ＬｕｋＡ単量体とＣＣ４５ ＬｕｋＡの組み合わせが、各免疫化に対して各単量体２０μｇ（総タンパク質４０μｇ）で投与されると、広範で強力なＬｕｋＡＢ中和能力有する血清が得られ、０．５％という低い血清で試験した１１個のＬｕｋＡＢバリアント全てを中和した（図５）が、これはＲＡＲＰＲ－３３免疫化マウスからの血清で観察されたものよりも低い。
【0321】
組み合わせて、実施例３～５に提示されたデータは、ＲＡＲＰＲ－３３のＣＣ８／ＣＣ４５ ＬｕｋＡＢ骨格に組み込まれる減弱及び安定化変異により、ＣＣ８／ＣＣ４５ ＷＴ ＬｕｋＡＢハイブリッドの広範な免疫原性効果を改善する（図４及び図５）と同時に、ＣＣ８／ＣＣ４５ ＷＴ ＬｕｋＡＢ毒素と比較してＲＡＲＰＲ－３３を高度に減弱させる（図３）ことを示す。
【0322】
実施例６－抗血清毒素中和
毒素細胞傷害性の抗体介在性中和を、野生型ＬｕｋＡＢ、野生型ＬｕｋＡＢハイブリッド（すなわち、ＣＣ８ ＬｕｋＡ／ＣＣ４５ ＬｕｋＢ及びＣＣ４５ ＬｕｋＡ／ＣＣ８ ＬｕｋＢ）、ＬｕｋＡ単量体、又はＬｕｋＡＢトキソイドで免疫したマウスから得られた血清で評価した。熱不活化されたプール血清をＰＢＳ中４０％の血清に正規化し、次いで、２０μＬの血清を９６ウェルプレートの上部ウェルにピペット注入し、１０μＬの１Ｘ ＰＢＳで２倍に段階希釈した。次いで、ＬＤ９０のＬｕｋＡＢ毒素クローン複合体配列バリアントの各々を、２％、１％、又は０．５％の血清のいずれかを含有するプレート（１０μＬ／ウェル）のウェルに室温で１５分間添加した。次いで、異なるドナーからの新たに単離されたヒト初代多形核白血球（ｈＰＭＮ）を、８０μＬのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化し、血清－毒素混合物に添加し、３７℃＋５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。抗体中和データを、図６Ａ（２％抗体血清）、図６Ｂ（１％抗体血清、及び図６Ｃ（０．５％抗体血清）の表に提示する。
毒素細胞傷害性の抗体介在性中和を、野生型ＬｕｋＡＢ、野生型ＬｕｋＡＢハイブリッド（すなわち、ＣＣ８ ＬｕｋＡ／ＣＣ４５ ＬｕｋＢ及びＣＣ４５ ＬｕｋＡ／ＣＣ８ ＬｕｋＢ）、ＬｕｋＡ単量体、又はＬｕｋＡＢトキソイドで免疫したマウスから得られた血清で評価した。熱不活化されたプール血清をＰＢＳ中４０％の血清に正規化し、次いで、２０μＬの血清を９６ウェルプレートの上部ウェルにピペット注入し、１０μＬの１Ｘ ＰＢＳで２倍に段階希釈した。次いで、ＬＤ９０のＬｕｋＡＢ毒素クローン複合体配列バリアントの各々を、２％、１％、又は０．５％の血清のいずれかを含有するプレート（１０μＬ／ウェル）のウェルに室温で１５分間添加した。次いで、異なるドナーからの新たに単離されたヒト初代多形核白血球（ｈＰＭＮ）を、８０μＬのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化し、血清－毒素混合物に添加し、３７℃＋５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。抗体中和データを、図６Ａ（２％抗体血清）、図６Ｂ（１％抗体血清、及び図６Ｃ（０．５％抗体血清）の表に提示する。
【0323】
野生型ＣＣ８及びＣＣ４５ ＬｕｋＡＢによる免疫化は、免疫化抗原の配列組成を反映するパターンで、ＬｕｋＡＢ毒素の天然に存在する配列バリアントを中和した抗体を誘発した。ＣＣ８ ＬｕｋＡＢ毒素によって誘導される抗体は、ＣＣ８、ＣＣ１、ＣＣ５、及び他のＳ．ａｕｒｅｕｓ系統に由来する毒素を強力に中和したが、ＣＣ３０、ＣＣ４５又はＳＴ２２ＡＳ．ａｕｒｅｕｓに由来する毒素の完全な中和は提供しなかった。同様に、ＣＣ４５ ＬｕｋＡＢ毒素を用いた免疫化は、ＣＣ３０、ＣＣ４５又はＳＴ２２Ａ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ系統に由来する毒素を強力に中和する抗体を誘発したが、他の系統に由来する毒素は誘発しなかった。
【0324】
非天然ハイブリッドＬｕｋＡＢである、ＣＣ４５ ＬｕｋＢと組み合わせたＣＣ８ ＬｕｋＡ又はＣＣ８ ＬｕｋＢと組み合わせたＣＣ４５ ＬｕｋＡのいずれかでのマウスの免疫化は、天然に存在する二量体の組み合わせと比較して、ＬｕｋＡＢ配列バリアントのより広範な中和を示した抗体を誘発した。非天然のハイブリッド二量体のうち、ＣＣ８ ＬｕｋＡ及びＣＣ４５ ＬｕｋＢは、反対の組み合わせよりもわずかに良好な中和プロファイルを示し、このパターンは、ＬｕｋＡの最後から２番目の残基にＧｌｕからＡｌａへの置換を保有するタンパク質中に保持されていた（Ｅ３２３Ａ）。野生型毒素に対して誘発された抗体について観察されたように、ＬｕｋＡ単量体は、その配列組成を示す中和パターンを示した抗体を誘発した。ＣＣ８ ＬｕｋＡ及びＣＣ４５ ＬｕｋＡ単量体の組み合わせ（ＲＡＲＰＲ－３１＋ＣＣ４５ ＬｕｋＡ Ｗ９７）は、広範な中和パターンを示した抗体を誘発したが、１％又は０．５％の血清での中和レベルの低下によって明らかなように、二量体抗原と比較して中和の効力が低下した。
【0325】
二量体トキソイドのうち、ＲＡＲＰＲ－１５、ＲＡＲＰＲ－３３、及びＲＡＲＰＲ－３４は、試験された全てのＬｕｋＡＢ配列バリアントに対して広範な中和抗体応答を示した。非天然の野生型二量体の組み合わせも、広範な中和プロファイルを示したが、中和応答の効力は、いくつかのトキソイドについて観察されたものよりも劣っていた。ハイブリッド野生型及びトキソイド抗原の両方は、２％（図６Ａ）及び１％（図６Ｂ）血清で試験したときに広範な中和プロファイルを示したが、０．５％血清で試験した場合、トキソイドに対する応答の効力の改善が明らかであった（図６Ｃ）。この最低試験濃度では、ＲＡＲＰＲ－１５、ＲＡＲＰＲ－３２、ＲＡＲＰＲ－３３、及びＲＡＲＰＲ－３４はそれぞれ広範な中和応答を示した。ＲＡＲＰＲ－３３は特に、広範な中和応答を保持する血清を誘発したが、ハイブリッド野生型抗原及びＥ３２３Ａトキソイドは、０．５％の血清で広範な保護応答を誘発できなかった。また、ＣＣ３０、ＣＣ４５、及びＳＴ２２Ａ ＬｕｋＡＢ毒素でのみ高いレベルの中和が観察されたため、最低試験濃度のＣＣ４５トキソイドＲＡＲＰＲ－１５によって誘発された中和パターンは、その配列組成を反映していた。ハイブリッド二量体トキソイドＲＡＲＰＲ－３３は、強力で広範な中和免疫応答を誘発した。
【0326】
実施例７－高濃度でのＲＡＲＰＲ－３３の細胞傷害性。
方法：
細胞傷害性アッセイ：各それぞれのＬｕｋＡＢタンパク質複合体の細胞傷害性を評価するために、新たに単離した初代ヒト多型核白血球（ＰＭＮ）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ毒素で中毒させた。ＰＭＮを異なるドナーから単離し、５０μｌのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化した。ＰＢＳ中の５０μｌの毒素を細胞に添加し、毒素－ＰＭＮ混合物を３７℃＋５％ＣＯ２のインキュベーターで１時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。死細胞％は、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引いて、１００％死に設定されるＴｒｉｔｏｎＸ処理細胞に対して正規化することによって計算される。
方法：
細胞傷害性アッセイ：各それぞれのＬｕｋＡＢタンパク質複合体の細胞傷害性を評価するために、新たに単離した初代ヒト多型核白血球（ＰＭＮ）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ毒素で中毒させた。ＰＭＮを異なるドナーから単離し、５０μｌのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化した。ＰＢＳ中の５０μｌの毒素を細胞に添加し、毒素－ＰＭＮ混合物を３７℃＋５％ＣＯ２のインキュベーターで１時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。死細胞％は、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引いて、１００％死に設定されるＴｒｉｔｏｎＸ処理細胞に対して正規化することによって計算される。
【0327】
ＬＤＨアッセイ：各々のＬｕｋＡＢタンパク質複合体が細胞溶解を引き起こす可能性があるかどうかを評価するために、異なるドナーからの新たに単離された初代ヒト多型核白血球（ＰＭＮ）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＬｕｋＡＢ毒素で中毒させ及びＬＤＨ放出を測定した。ＷＴ毒素をＰＢＳで２倍に段階希釈し、５～０．００２４μｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験した。ＬｕｋＡＢトキソイドをＰＢＳで希釈し、２．５、２、１、１．５、及び０．５ｍｇ／ｍｌで試験した。ＰＭＮを単離し、５０μｌのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化した。次いで、５０μｌのＰＭＮを各ウェルにピペット注入し、ウェル当たり５０μｌの希釈毒素を添加した。毒素－ＰＭＮ混合物を、３７℃＋５％ＣＯ２のインキュベーターで２時間インキュベートした。ＬＤＨ放出を評価するために、プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで、２５μｌの上清を各ウェルから取り出し、９６ウェルブラッククリアボトムプレートに移した。２５μｌのＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ均質膜完全性試薬（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）をブラッククリアボトム９６ウェルプレートに添加し、混合物を暗所で１０分間室温でインキュベートした。細胞溶解を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して５６０ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの発光波長で蛍光を記録することによって評価した。死細胞％は、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引いて、１００％死に設定されたＴｒｉｔｏｎＸ処理細胞に対して正規化することによって計算された。
【0328】
結果：
以前の実施例では、ｈＰＭＮに対するＬｕｋＡＢトキソイドＲＡＲＰＲ－３３の細胞傷害性を、最大２０μｇ／ｍｌの濃度まで決定した。次に、高濃度（最大２．５ｍｇ／ｍｌ）のＲＡＲＰＲ－３３の存在下で、ヒトＰＭＮの細胞傷害性をモニターした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ測定に基づくヒトＰＭＮ（４～６ドナー）の最大細胞傷害性は、約０．１５６μｇ／ｍｌ毒素による１時間の中毒時に、ＷＴ ＬｕｋＡＢ ＣＣ８、ＣＣ４５及びＣＣ８／ＣＣ４５毒素について観察された（図７Ａ）。ＲＡＲＰＲ－３３及びＣＣ８ ＬｕｋＡ単量体について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒで測定された死細胞のパーセンテージは、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で約１０％であった（図７Ｂ）。最大２．５ｍｇ／ｍｌのＲＡＲＰＲ－３３又はＣＣ８ ＬｕｋＡ単量体の濃度でＰＭＮをインキュベーションしても、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ測定によって決定された死細胞のパーセンテージは、更に増加しなかった。
以前の実施例では、ｈＰＭＮに対するＬｕｋＡＢトキソイドＲＡＲＰＲ－３３の細胞傷害性を、最大２０μｇ／ｍｌの濃度まで決定した。次に、高濃度（最大２．５ｍｇ／ｍｌ）のＲＡＲＰＲ－３３の存在下で、ヒトＰＭＮの細胞傷害性をモニターした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ測定に基づくヒトＰＭＮ（４～６ドナー）の最大細胞傷害性は、約０．１５６μｇ／ｍｌ毒素による１時間の中毒時に、ＷＴ ＬｕｋＡＢ ＣＣ８、ＣＣ４５及びＣＣ８／ＣＣ４５毒素について観察された（図７Ａ）。ＲＡＲＰＲ－３３及びＣＣ８ ＬｕｋＡ単量体について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒで測定された死細胞のパーセンテージは、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で約１０％であった（図７Ｂ）。最大２．５ｍｇ／ｍｌのＲＡＲＰＲ－３３又はＣＣ８ ＬｕｋＡ単量体の濃度でＰＭＮをインキュベーションしても、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ測定によって決定された死細胞のパーセンテージは、更に増加しなかった。
【0329】
ＬＤ１５値は、１５％の細胞死を誘導する抗原の濃度を示す。ＬＤ１５は、線形回帰を使用して決定された。ＣＣ８ ＷＴ ＬｕｋＡＢについては、ＬＤ１５は０．０１３μｇ／ｍｌであり、ＣＣ４５ ＷＴ ＬｕｋＡＢについては、ＬＤ１５は０．００４μｇ／ｍｌであり、ＣＣ８／ＣＣ４５ ＬｕｋＡＢハイブリッドについては、ＬＤ１５は０．００２μｇ／ｍｌであった。ＬｕｋＡＢ ＲＡＲＰＲ－３３のＬＤ１５は２．５ｍｇ／ｍｌであった。ＬＤ１５の値を、ＲＡＲＰＲ－３３のＬＤ１５濃度を、野生型抗原のＬＤ１５濃度で割ることによって比較した。これらの観察結果に基づくと、ＬｕｋＡＢ ＲＡＲＰＲ－３３毒性は、ＬｕｋＡＢ ＣＣ８ ＷＴよりも＞１９２，３０８倍低く、ＬｕｋＡＢ ＣＣ４５ ＷＴよりも＞６２５，０００倍低く、及びＬｕｋＡＢ ＣＣ８／ＣＣ４５ハイブリッドよりも＞１，２５０，０００倍低い。
【0330】
更に、ＬＤＨアッセイを実施して、異なるＷＴ毒素、ＣＣ８ ＬｕｋＡ単量体、又はＲＡＲＰＲ－３３との２時間のインキュベーション後の形質膜損傷を評価した。ヒトＰＭＮの細胞傷害性は、ＷＴ毒素、ＣＣ８ ＷＴ、ＣＣ４５ ＷＴ、又はＣＣ８／ＣＣ４５毒素ハイブリッドへの２時間の曝露後に誘導された（図７Ｃ）。ＬＤＨによって決定された最大の細胞死は、０．６２５μｇ／ｍｌ毒素の濃度で観察された。対照的に、最大２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＡＲＰＲ－３３又はＣＣ８ ＬｕｋＡ単量体への２時間の曝露後に、ヒトＰＭＮの形質膜損傷は観察されなかった（図７Ｄ）。これらのデータは、ＲＡＲＰＲ－３３が解毒され、最大２．５ｍｇ／ｍｌの濃度でヒトＰＭＮの細胞死を誘発できないことを示す。ＲＡＲＰＲ－３３のＣＣ８／ＣＣ４５ ＬｕｋＡＢ骨格に組み込まれた変異は、ＣＣ８／ＣＣ４５ ＷＴ ＬｕｋＡＢ毒素と比較して、細胞傷害性を大幅に減弱した。
【0331】
実施例８：ＲＡＲＰＲ－３３とＤ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドとの比較
ＬｕｋＡがＤ３９Ａ変異を有し、ＬｕｋＢがＲ２３Ｅ点変異を有する、ＣＣ８骨格に基づくＬｕｋＡＢトキソイドが生成された。この「Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイド」は、Ｋａｉｌａｓａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｔｏｘｏｉｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ ＡＢ（ＬｕｋＡＢ），”Ｔｏｘｉｎｓ １１（６）：（２０１９）に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このトキソイドは、ＬｕｋＡＢ ＣＣ８骨格上で生成され、ＷＴ ＣＣ８ ＬｕｋＡＢ毒素と比較して、毒性が＞３６，０００倍減弱されていると記載されていた。細胞傷害性を、ＰＭＮ様であるように分化したＨＬ－６０細胞株を使用して決定した。本実験では、Ｄ３９Ａ／Ｒ２３ＥトキソイドとＲＡＲＰＲ－３３との間で比較を行った。ヒト多形核白血球（ＰＭＮ）に対する細胞傷害性を決定し、免疫化時に広範囲に毒素中和抗体を誘導する能力を評価した。
ＬｕｋＡがＤ３９Ａ変異を有し、ＬｕｋＢがＲ２３Ｅ点変異を有する、ＣＣ８骨格に基づくＬｕｋＡＢトキソイドが生成された。この「Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイド」は、Ｋａｉｌａｓａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｔｏｘｏｉｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ ＡＢ（ＬｕｋＡＢ），”Ｔｏｘｉｎｓ １１（６）：（２０１９）に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このトキソイドは、ＬｕｋＡＢ ＣＣ８骨格上で生成され、ＷＴ ＣＣ８ ＬｕｋＡＢ毒素と比較して、毒性が＞３６，０００倍減弱されていると記載されていた。細胞傷害性を、ＰＭＮ様であるように分化したＨＬ－６０細胞株を使用して決定した。本実験では、Ｄ３９Ａ／Ｒ２３ＥトキソイドとＲＡＲＰＲ－３３との間で比較を行った。ヒト多形核白血球（ＰＭＮ）に対する細胞傷害性を決定し、免疫化時に広範囲に毒素中和抗体を誘導する能力を評価した。
【0332】
方法：
細胞傷害性アッセイ：各々のＬｕｋＡＢタンパク質複合体の細胞傷害性を評価するために、異なるドナーからの新たに単離された初代ヒト多型核白血球（ＰＭＮ）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ毒素で中毒させた。ＰＭＮを単離し、５０μｌのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化した。細胞に、ＰＢＳ中の５０μｌの毒素を添加し、毒素－ＰＭＮ混合物を３７℃＋５％ＣＯ２のインキュベーターで２時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。死細胞のパーセンテージは、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引いて、１００％死に設定されるＴｒｉｔｏｎＸ処理細胞に対して正規化することによって計算される。
細胞傷害性アッセイ：各々のＬｕｋＡＢタンパク質複合体の細胞傷害性を評価するために、異なるドナーからの新たに単離された初代ヒト多型核白血球（ＰＭＮ）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ毒素で中毒させた。ＰＭＮを単離し、５０μｌのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化した。細胞に、ＰＢＳ中の５０μｌの毒素を添加し、毒素－ＰＭＮ混合物を３７℃＋５％ＣＯ２のインキュベーターで２時間インキュベートした。毒性を評価するために、１０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに加え、混合物を３７℃、５％ ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。ＰＭＮ生存率を、４９２ｎｍの吸光度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して評価した。死細胞のパーセンテージは、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引いて、１００％死に設定されるＴｒｉｔｏｎＸ処理細胞に対して正規化することによって計算される。
【0333】
ＬＤＨアッセイ：それぞれのＬｕｋＡＢタンパク質複合体が細胞溶解を引き起こすかどうかを評価するために、異なるドナーからの新たに単離された初代ヒト多型核白血球（ＰＭＮ）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＬｕｋＡＢ毒素で中毒させ及びＬＤＨ放出を測定した。ＷＴ毒素をＰＢＳで２倍に段階希釈し、０．５μｇ／ｍｌ～０．０００２４μｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験した。ＬｕｋＡＢトキソイドをＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌ～０．０３１２５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度に希釈し、試験した。ＰＭＮを単離し、５０μｌのＲＰＭＩ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）当たり２００，０００個の細胞に正規化した。次に、ＰＭＮ（５０μｌ）を各ウェルにピペット注入し、ウェル当たり５０μｌの希釈毒素を添加した。毒素－ＰＭＮ混合物を、３７℃＋５％ＣＯ２のインキュベーターで２時間インキュベートした。ＬＤＨ放出を評価するために、プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで、２５μｌの上清を各ウェルから取り出し、９６ウェルブラッククリアボトムプレートに移した。２５μｌのＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ均質膜完全性試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をブラッククリアボトム９６ウェルプレートに添加し、混合物を暗所で１０分間室温でインキュベートした。細胞溶解を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用して５６０ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの発光波長で蛍光を記録することによって評価した。死細胞のパーセンテージは、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引いて、１００％死に設定されたＴｒｉｔｏｎＸ処理細胞に対して正規化することによって計算された。
【0334】
マウスの免疫化。Ｅｎｖｉｇｏ Ｈｓｄ：ＮＤ４（４週齢）マウス（ｎ＝５／抗原）に、５０μｌのアジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄと混合した５０μｌの１０％グリセロール１Ｘ ＴＢＳ中の、２０μｇのＬｕｋＡＢを皮下投与した。同じ抗原／アジュバントカクテルを２回ブーストした後、心臓穿刺を介してマウスから採血し、毒素中和試験用に血清を得た。
【0335】
毒素中和アッセイ。免疫したマウスの血清を各群からプールし、５５℃の水浴中で３０分間、熱不活化した。次に、プールした熱不活化血清をＰＢＳで４０％に希釈した。次いで、４０％のストックを、９６ウェルプレート中の１０μｌのＰＢＳで２倍に段階希釈することによって、血清の更なる希釈を達成した。毒素（１０μｌ）を、０．１５６μｇ／ｍｌ毒素（ＬＤ９０）の最終濃度で血清ウェルに添加した。ＲＰＭＩ＋０．１％のＨＳＡ＋１０ｍＭのＨＥＰＥＳ中の２００，０００個の細胞の濃度で８０μｌのｈＰＭＮを各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃＋５％ＣＯ２のインキュベーターで１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒをこの中毒体に添加し、１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを４９２ｎｍの吸光度でプレートリーダーで読み取った。死細胞のパーセンテージは、バックグラウンド（健康な細胞＋ＰＢＳ）を差し引いて、１００％死に設定されるＴｒｉｔｏｎＸ処理細胞に対して正規化することによって計算された。
【0336】
結果：
Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドの細胞傷害性は、最大約１２μｇ／ｍｌまで試験されることが報告されている。ここでは、ＲＡＲＰＲ－３３及びＤ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドの細胞傷害性を、１ｍｇ／ｍｌの濃度までヒトＰＭＮで決定した。更に、ＷＴ ＬｕｋＡＢ ＣＣ８、ＣＣ４５、及びＣＣ８／ＣＣ４５を比較のために試験した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ測定値に基づくヒトＰＭＮの最大細胞傷害性は、約０．０２μｇ／ｍｌのＷＴ ＬｕｋＡＢ ＣＣ８／ＣＣ４５、約０．０３μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢ ＣＣ８、及び０．１２５μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢ ＣＣ４５による、１時間の中毒時に観察された（図８Ａ）。５ドナーの平均を示す。Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドでは、１ｍｇ／ｍｌでのインキュベーション時に約２２％の細胞傷害性が観察された。ＲＡＲＰＲ－３３の場合、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒで測定した死細胞のパーセンテージは、１ｍｇ／ｍｌの濃度で約３％であった（図８Ｂ）。
Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドの細胞傷害性は、最大約１２μｇ／ｍｌまで試験されることが報告されている。ここでは、ＲＡＲＰＲ－３３及びＤ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドの細胞傷害性を、１ｍｇ／ｍｌの濃度までヒトＰＭＮで決定した。更に、ＷＴ ＬｕｋＡＢ ＣＣ８、ＣＣ４５、及びＣＣ８／ＣＣ４５を比較のために試験した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ測定値に基づくヒトＰＭＮの最大細胞傷害性は、約０．０２μｇ／ｍｌのＷＴ ＬｕｋＡＢ ＣＣ８／ＣＣ４５、約０．０３μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢ ＣＣ８、及び０．１２５μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢ ＣＣ４５による、１時間の中毒時に観察された（図８Ａ）。５ドナーの平均を示す。Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドでは、１ｍｇ／ｍｌでのインキュベーション時に約２２％の細胞傷害性が観察された。ＲＡＲＰＲ－３３の場合、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒで測定した死細胞のパーセンテージは、１ｍｇ／ｍｌの濃度で約３％であった（図８Ｂ）。
【0337】
更に、ＬＤＨアッセイを実施して、異なるＷＴ毒素、Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイド及びＲＡＲＰＲ－３３との２時間のインキュベーション後の血漿膜損傷を評価した。ヒトＰＭＮの細胞傷害性は、ＷＴ毒素、ＣＣ８ ＷＴ、ＣＣ４５ ＷＴ、及びＣＣ８／ＣＣ４５毒素ハイブリッドの組み合わせへの曝露の２時間後に誘導された（図８Ｃ）。ＬＤＨによって決定された最大の細胞死は、０．２５μｇ／ｍｌ毒素の濃度で観察された。最大１ｍｇ／ｍｌのＤ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドの濃度でのヒトＰＭＮの２時間の曝露では、約８％の細胞死が観察された。同様の濃度のＲＡＲＰＲ－３３とともにヒトＰＭＮをインキュベートした場合、形質膜損傷は観察されず、細胞死がないことが示された（図８Ｄ）。これらの結果は、ＲＡＲＰＲ－３３がアッセイにおける検出限界未満まで減弱化され、Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドよりも減弱化されていることを示す。
【0338】
ＲＡＲＰＲ－３３又はＤ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドで免疫化したマウス由来の血清を、毒素中和アッセイで試験し、ヒトＰＭＮの毒素誘導性細胞死を防ぐ血清の能力を評価した。１６の異なるＬｕｋＡＢ毒素に対する中和を、４ドナーから単離されたＰＭＮで試験した。
【0339】
ＲＡＲＰＲ３３免疫化マウスからの０．１２５％の血清の存在下で、試験された１６のＬｕｋＡＢバリアント全ての細胞傷害性効果を中和した（図９）。類似の血清濃度では、Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイド免疫化マウス由来の血清は、ＲＡＲＰＲ－３３免疫化マウス由来の血清と同程度に、ＬｕｋＡＢ ＣＣ８の細胞傷害性効果に対して保護するのみあった。他の全ての毒素に対して、Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイド免疫化マウス由来の血清では、保護が観察されないか又ははるかに低い保護が観察された。これらの結果は、ＲＡＲＰＲ－３３免疫化が、Ｄ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドでの免疫化よりもはるかに広範な毒素中和応答を誘導したことを示す。
【0340】
実施例９：ＬｕｋＡＢトキソイドの熱安定化
野生型タンパク質と比較したＬｕｋＡＢトキソイドの安定性を、固有のトリプトファン又はチロシン蛍光を使用した熱変性実験により評価し、フォールドした状態からアンフォールドした状態へのタンパク質の移行の中間点に対応する融解温度（Ｔｍ）を推定した。ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒのＰｒｏｍｅｔｈｉｕｓＮＴ．Ｐｌｅｘ装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して熱安定性を評価した。熱変性測定が、０．３～１ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料（２０ｕＬ、緩衝液：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１０％グリセロール）について行われ、各試料に対し２回の繰り返しで実行する。Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮａｎｏＤＳＦユーザーインターフェース（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｓｃａｎタブ）を使用して、実行の実験パラメータを設定した。典型的な試料の熱走査は、１．０℃／分の速度で２０℃～９５℃の範囲で行われる。試料に使用されたのと同じ緩衝液中の標準ｍＡｂ（ＣＮＴＯ５８２５又はＮＩＳＴ）を対照として含め、実行を２回繰り返した。熱融解プロファイルを、ベンダーソフトウェアＰＲ．ＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌを用いて分析し、タンパク質の５０％がアンフォールドする温度（Ｔｍ）を決定した。
野生型タンパク質と比較したＬｕｋＡＢトキソイドの安定性を、固有のトリプトファン又はチロシン蛍光を使用した熱変性実験により評価し、フォールドした状態からアンフォールドした状態へのタンパク質の移行の中間点に対応する融解温度（Ｔｍ）を推定した。ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒのＰｒｏｍｅｔｈｉｕｓＮＴ．Ｐｌｅｘ装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して熱安定性を評価した。熱変性測定が、０．３～１ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料（２０ｕＬ、緩衝液：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１０％グリセロール）について行われ、各試料に対し２回の繰り返しで実行する。Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮａｎｏＤＳＦユーザーインターフェース（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｓｃａｎタブ）を使用して、実行の実験パラメータを設定した。典型的な試料の熱走査は、１．０℃／分の速度で２０℃～９５℃の範囲で行われる。試料に使用されたのと同じ緩衝液中の標準ｍＡｂ（ＣＮＴＯ５８２５又はＮＩＳＴ）を対照として含め、実行を２回繰り返した。熱融解プロファイルを、ベンダーソフトウェアＰＲ．ＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌを用いて分析し、タンパク質の５０％がアンフォールドする温度（Ｔｍ）を決定した。
【0341】
表７Ａ及び７Ｂは、ｎａｎｏＤＳＦによって評価されたＬｕｋＡ及びＬｕｋＡＢトキソイドタンパク質の熱安定性を示す。タンパク質アンフォールディングの開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ）及びタンパク質アンフォールディングの遷移の中間点の温度（Ｔｍ１）を、安定化置換（ΔＴｍ）あり及びなしで同等の構築物間のＴｍの差とともに提示する
【表7】
【表8】
【0342】
結果：熱安定性解析（表７Ａ）により、ＣＣ４５ ＬｕｋＡＥ３２１Ａ／ＣＣ４５ ＬｕｋＢタンパク質が、ＣＣ８ ＬｕｋＡＥ３２１Ａ／ＣＣ４５ ＬｕｋＢハイブリッドタンパク質のＴｍよりも３℃高いＴｍ値を示したことが明らかになった。ＣＣ４５ ＬｕｋＢｗｔと組み合わせて、ＣＣ４５ ＬｕｋＡにおける個々の置換は、０～０．４℃のＴｍの控えめな増加をもたらした。ＬｕｋＢにおけるＶａｌ５３Ｌｅｕ置換は、Ｔｍの０．５℃の増加をもたらした。ハイブリッドＬｕｋＡＢトキソイドはＣＣ８ ＬｕｋＡバックグラウンドを含んでいたため、個々のアミノ酸置換を、野生型ＣＣ４５ ＬｕｋＢと組み合わせたＣＣ８ ＬｕｋＡで試験した（表７Ｂ）。ＣＣ４５ ＬｕｋＡで見られるように、ＣＣ８ ＬｕｋＡにおける個々の置換もまた、野生型ＬｕｋＡＢよりもＴｍ値を増加させた。ＬｕｋＡ（ＲＡＲＰＲ－１５）における置換の組み合わせは、ＣＣ４５ ＬｕｋＡＥ３２１Ａ／ＣＣ４５ ＬｕｋＢタンパク質よりも１．６℃高いＴｍ値を生成し、ＬｕｋＢＶａｌ５３ＬｅｕとのＣＣ８ ＬｕｋＡ置換の組み合わせ（ＲＡＲＰＲ－３３）は、ＣＣ８ ＬｕｋＡＥ３２１Ａ／ＣＣ４５ ＬｕｋＢハイブリッドよりも４℃高いＴｍ値をもたらした。ＲＡＲＰＲ－３３の熱安定性の増加は、両方のデータセットで観察された（表７Ａ及び表７Ｂ）。ｎａｎｏＤＳＦは、５０℃未満でアンフォールディングするタンパク質に対してある程度のばらつきを生じ得るが、各セット内で実行された対照を使用して決定されたΔＴｍは、それぞれ４．０℃及び４．１℃でデータセットにわたって一貫していた。ＬｕｋＡ単量体は、置換の組み合わせ及びシステイン置換の対の両方を含み、≧５８℃の高いＴｍ値を示し、ジスルフィド結合が熱安定性の増加に更に寄与していることを示す。
【0343】
実施例１～９の考察：
本明細書に記載される安定的なＬｕｋＡＢバリアントヘテロ二量体トキソイドは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチン抗原候補として非常に適したものにするいくつかの特徴を有する。
本明細書に記載される安定的なＬｕｋＡＢバリアントヘテロ二量体トキソイドは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチン抗原候補として非常に適したものにするいくつかの特徴を有する。
【0344】
第１に、ＲＡＲＰＲ－３０、ＲＡＲＰＲ－３１、ＲＡＲＰＲ－３２、ＲＡＲＰＲ－３３、ＲＡＲＰＲ－３４、及びＲＡＲＰＲ－１５を含む、本明細書に記載されるＬｕｋＡ単量体及びＬｕｋＡＢ二量体トキソイドは、野生型毒素及び他の既知のトキソイド（すなわち、ＣＣ８デルタ１０及びＣＣ４５デルタ１０トキソイド）と比較して、分化ヒトＴＨＰ－１及びヒトＰＭＮに対する細胞傷害性の顕著な低下を示した。最大２．５ｍｇ／ｍｌの濃度でさえ、ＲＡＲＰＲ－３３は非細胞傷害性のままであり、その完全な弱毒化を示した。
【0345】
第２に、ＬｕｋＡ及びＬｕｋＢバリアントタンパク質に導入された置換の組み合わせは、単一の置換のみを含有する対応するトキソイドと比較して、ヘテロ二量体ＲＡＲＰＲ複合体の熱安定性を大幅に強化した。特に、ＬｕｋＡ（ＲＡＲＰＲ－１５）における置換の組み合わせは、ＣＣ４５ ＬｕｋＡＥ３２１Ａ／ＣＣ４５ ＬｕｋＢタンパク質よりも１．６℃高いＴｍ値を生成し、ＣＣ８ ＬｕｋＢＶａｌ５３ＬｅｕとのＣＣ８ ＬｕｋＡ置換の組み合わせ（ＲＡＲＰＲ－３３）は、ＣＣ８ ＬｕｋＡＥ３２１Ａ／ＣＣ４５ ＬｕｋＢハイブリッドよりも４℃高いＴｍ値をもたらした。
【0346】
弱毒化された細胞傷害性及び強化された熱安定性に加えて、本明細書に記載されるＬｕｋＡＢ ＲＡＲＰＲトキソイド、特にＲＡＲＰＲ－１５、ＲＡＲＰＲ－３３、及びＲＡＲＰＲ－３４は、野生型ＣＣ４５及びＣＣ８毒素、野生型ハイブリッド毒素、並びにＥ３２３Ａトキソイド及びＤ３９Ａ／Ｒ２３Ｅトキソイドを含むトキソイドよりも同等の又はより広範な毒素中和応答及びより高い力価の中和抗体を誘導した。
【0347】
要約すると、減弱された細胞傷害性、改善された熱安定性、堅牢な免疫原性、及び広く中和された抗体プロファイルにより、本明細書に記載されるＬｕｋＡＢ ＲＡＲＰＲトキソイドは理想的なワクチン抗原候補となる。
【0348】
本明細書では好ましい実施形態が詳細に示され、記載されているが、本開示の趣旨から逸脱することなく、様々な修正、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは、以下の特許請求の範囲に定義される本開示の範囲内にあるとみなされることが、当業者には明らかである。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】