特表 2023-544325 ＭＡＮＦを含む神経精神疾患の予防または治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-23

(54)【発明の名称】ＭＡＮＦを含む神経精神疾患の予防または治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/18 20060101AFI20231016BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231016BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231016BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231016BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20231016BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231016BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20231016BHJP

   A61P 25/22 20060101ALI20231016BHJP

   A23L 33/17 20160101ALI20231016BHJP

   C07K 14/48 20060101ALN20231016BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231016BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20231016BHJP

【ＦＩ】

A61K38/18 ZNA

A61K48/00

A61K35/76

A61P25/00

A61P25/18

A61P43/00 107

A61P25/28

A61P25/22

A23L33/17

C07K14/48

C12N15/12

C12N15/86 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023519788

(86)(22)【出願日】2021-09-29

(85)【翻訳文提出日】2023-04-28

(86)【国際出願番号】 KR2021013342

(87)【国際公開番号】W WO2022071752

(87)【国際公開日】2022-04-07

(31)【優先権主張番号】10-2020-0127087

(32)【優先日】2020-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ

２．ＴＷＥＥＮ

３．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517082560

【氏名又は名称】セフォ カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム，ユニィ

(72)【発明者】

【氏名】イ，ヒェンミ

(72)【発明者】

【氏名】クウォン，ヒョクマン

【テーマコード（参考）】

4B018

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B018MD69

4B018ME14

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084DB59

4C084MA52

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA051

4C084ZA151

4C084ZA181

4C084ZB221

4C087AA01

4C087BC83

4C087CA08

4C087CA12

4C087MA52

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA05

4C087ZA15

4C087ZA18

4C087ZB22

4H045AA10

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA21

4H045EA01

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、中脳星状細胞由来の神経成長因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ、ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ
ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＭＡＮＦ）またはこれに由来するペプチドまたはその断片を含む神経精神疾患の予防または治療用組成物に関し、本発明によるＭＡＮＦ投与は、記憶損傷及び自閉症モデルにおいて記憶損傷及び自閉症モデルにおいてコリン性及び／又はギャバ（γ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ＧＡＢＡ）性神経細胞の分化を促進して神経再生を誘導し、記憶力の増進及び情緒不安改善効果を示し、社会的認識、社交性及び社会的性的嗜好度の低下を改善し、自閉症、ＡＤＨＤ、精神遅滞障害、発達障害などの神経精神疾患の予防または治療用組成物として提供できる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）中脳星状細胞由来の神経成長因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＭＡＮＦ）または（ｂ）これに由来するペプチドまたはその断片を有効成分として含む神経精神疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項2】

前記神経精神疾患は、自閉症、ＡＤＨＤ、精神遅滞障害及び発達障害からなる群から選ばれるいずれか１つ以上である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

前記（ａ）ＭＡＮＦまたは（ｂ）ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、ＭＡＮＦのポリペプチド配列またはその断片、前記ポリペプチド配列をコーディングするポリヌクレオチド配列またはその断片、及び前記ポリヌクレオチド配列を含むベクターからなる群から選ばれるいずれかの形態で含まれるものである、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記（ａ）ＭＡＮＦまたは（ｂ）ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、海馬において神経細胞の再生を促進するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記（ａ）ＭＡＮＦまたは（ｂ）ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、海馬において神経細胞の分化を促進するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記（ａ）ＭＡＮＦまたは（ｂ）ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、記憶力を改善するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記（ａ）ＭＡＮＦまたは（ｂ）ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、不安障害を改善するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記（ａ）ＭＡＮＦまたは（ｂ）ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、社交性または社会的認知能力を改善するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物をヒト以外の個体に投与する段階を含む、神経精神疾患の予防または治療方法。

【請求項11】

（ａ）ＭＡＮＦ、または（ｂ）これに由来するペプチドまたはその断片を有効成分として含む神経精神疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。

【請求項12】

（ａ）ＭＡＮＦ、または（ｂ）これに由来するペプチドまたはその断片を有効成分として含む神経精神疾患の予防または改善用飼料組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、中脳星状細胞由来の神経成長因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＭＡＮＦ）またはこれに由来するペプチドまたはその断片を含む神経精神疾患の予防、治療または改善用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

神経精神疾患（ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）とは、脳神経伝達物質の不均衡と遺伝・社会的・環境的要因が複合的に作用して思考や感情、行動に異常が生じた状態を意味し、うつ病、不安障害、統合失調症、依存症、脳電症、自閉症スペクトラム障害（Ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒ；ＡＳＤ；自閉症）、ＡＤＨＤ（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ Ｄｅｆｉｃｉｔ Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、発達障害、精神遅滞障害などが主な神経精神疾患に該当する。この中で自閉症は、父系のストレス、飲酒、高齢妊娠などによる生殖細胞の遺伝子突然変異により発病することが知られている。現在、発病率は１．５％と報告されているが、世界的に発病率が増加する傾向にあり、特に韓国では２．６％まで増加したという報告がある。また、ＡＤＨＤ、精神遅滞障害などの神経精神疾患も増加傾向にあり、これらの疾患は、出産後の初期から３年以内に診断されるので、発病初期に治療が必要であるのが実状である。

【0003】

特に、自閉症、ＡＤＨＤ、統合失調症、脳電症を含む神経精神科疾患は多くの遺伝子の複合的な問題により発生するが、ほとんどの脳疾患において特定の神経細胞の死滅とシナプス形成の問題、それに伴う神経伝達物質の不均衡、抑制性ギャバ（γ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ＧＡＢＡ）不足、シナプス発生の調節とｐｒｕｎｉｎｇなどが原因として注目されており、その根源的治療は、神経再生促進、神経幹細胞の増殖及びギャバ性神経細胞の分化を促進させるものであるが、まだこのような根源的治療のための治療剤は、研究開発されたことがほとんどない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明者らは、脳血管細胞が神経幹細胞に分泌する１６個以上の成長因子の一つである中脳星状細胞由来の神経成長因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＭＡＮＦ）が記憶損傷を伴う自閉症、ＡＤＨＤ、精神遅滞障害、発達障害などの脳疾患に対して改善効果があることを確認することにより、本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の１つの目的は、（ａ）中脳星状細胞由来の神経成長因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＭＡＮＦ）；または（ｂ）これに由来するペプチドまたはその断片；を有効成分として含む神経精神疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。

【0006】

本発明の他の一つの目的は、前記組成物を個体に投与することを含む神経精神疾患の予防または治療方法を提供することである。

【0007】

本発明の他の一つの目的は、（ａ）ＭＡＮＦ、または（ｂ）これに由来するペプチドま
たはその断片を有効成分として含む神経精神疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供することである。

【0008】

本発明の他の一つの目的は、（ａ）ＭＡＮＦ、または（ｂ）これに由来するペプチドまたはその断片を有効成分として含む神経精神疾患の予防または改善用飼料組成物を提供することである。

【発明の効果】

【0009】

本発明による中脳星状細胞由来の神経成長因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＭＡＮＦ）またはこれに由来するペプチドまたはその断片の投与は、記憶損傷及び自閉症モデルにおいてコリン性及び／又はギャバ（γ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ＧＡＢＡ）性神経細胞の分化を促進して神経再生を誘導し、記憶力増進及び不安障害改善効果を示し、社会的認識、社交性及び社会的性的選好度の低下を改善するので、自閉症、ＡＤＨＤ、精神遅滞障害、発達障害などの神経精神疾患の予防または治療用組成物として提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、ＭＡＮＦの神経分化を促進する最適用量を決定するために成熟したニューロンの核をマーキングするＮｅｕＮ抗体、ギャバ性神経細胞をマーキングするＧＡＤ６５／６７（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）とｖＧＡＴ（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）抗体を使用して免疫ブロッティング法で分析した結果である。

【図2】図２は、ＭＡＮＦの神経幹細胞の増殖と初期分化（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進する最適用量を決定するために神経前駆細胞の増殖と初期分化をＴｙｐｅ１神経前駆細胞マーカーであるＳｏｘ２と移動しながら分化を開始するＴｙｐｅ３神経前駆細胞マーカーであるＤＣＸ抗体を使用して免疫ブロッティング法で分析した結果である。

【図3】図３は、ＭＡＮＦによる神経前駆細胞の増殖促進の有無を調べるために増殖する細胞マーカーであるＫｉ６７抗体で染色される細胞と神経前駆細胞マーカーであるｎｅｓｔｉｎ抗体で染色される神経前駆細胞を免疫蛍光染色法で分析した結果である。

【図4】図４は、ＭＡＮＦによる神経前駆細胞の分化促進の有無を調べるため、未成熟神経マーカーＴｕＪ１、成熟神経マーカーＮｅｕＮ抗体を使用して免疫蛍光染色法で分析した結果である。

【図5】図５は、ＭＡＮＦによる神経細胞増殖及び分化効果を証明するため、ＭＡＮＦ受容体ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを作製して神経前駆細胞に処理して増殖するＫｉ６７染色された細胞と分化を開始する神経前駆細胞マーカーであるＤＣＸ抗体を使用して免疫蛍光染色法で分析した結果である。

【図6】図６は、ギャバ（γ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ、ＧＡＢＡ）性神経細胞マーカーであるＧＡＤ（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）遺伝子プロモーターに蛍光タンパク質であるＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を組換えたプラスミドを１次培養した神経前駆細胞に導入し、ＭＡＮＦのギャバ性神経細胞分化促進効果を証明した結果である。

【図7】図７は、記憶損傷及び自閉症動物モデルにＭＡＮＦ発現ベクター（ＭＡＮＦ－ＡＡＶ）を導入したヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈＭＳＣ）を脳移植する過程を示す模式図である。

【図8】図８は、海馬にＭＡＮＦ－ＡＡＶが導入されたｈＭＳＣを移植した（ＰＬＧＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ）記憶損傷及び自閉症モデルを対象に記憶能力を測定するＹ字型迷路実験（Ａ）、受動回避実験（ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｔｅｓｔ）（Ｂ）、モリス水迷路実験（Ｍｏｒｉｓ Ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）（Ｃ）、不安障害を測定する高架式十字迷路実験（Ｄ）及び開放空間行動検査（Ｅ）を行った結果である。

【図9】図９は、海馬にＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣが移植された記憶損傷及び自閉症モデルを対象に社会性能力（Ｓｏｃｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定する社会的オープンフィールド（Ｓｏｃｉａｌ Ｏｐｅｎ Ｆｉｅｌｄ）検査を行った結果である。

【図10】図１０は、海馬にＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣが移植された記憶損傷及び自閉症モデルを対象に社会性（セッションＩ）を測定する３つの部屋測定法を使用して行動実験した結果である。

【図11】図１１は、海馬にＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣが移植された記憶損傷及び自閉症モデルを対象に社会的認識（セッションＩＩ）を測定する３つの部屋測定法を使用して行動実験した結果である。

【図12】図１２は、海馬にＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣが移植された記憶損傷及び自閉症モデルを対象に性的選好度（セッションＩＩＩ）を測定する３つの部屋測定法を使用して行動実験した結果である。

【図13】図１３は、行動実験後、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣを移植した記憶損傷及び自閉症モデルの脳組織においてＴＵＮＥＬ染色を通じて脳神経細胞の死滅を染色した結果である。

【図14】図１４は、行動実験後、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣを移植した記憶損傷及び自閉症モデルの脳組織において神経幹細胞（Ｓｏｘ２＋）の増殖（ＢｒｄＵ＋、Ｋｉ６７）と移動（ＤＣＸ）の有無を免疫蛍光染色法で分析した結果である。

【図15】図１５は、行動実験後、ＭＡＮＦ投与された記憶損傷及び自閉症モデルの脳組織において新たに増殖してＢｒｄＵ染色された神経前駆細胞が成熟した神経細胞（ＮｅｕＮ）、希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）（ＣＮＰａｓｅ）、ギャバ性神経細胞（ＧＡＤ）への分化促進の有無を調査した結果である。

【図16】図１６は、行動実験後、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣを移植した記憶損傷及び自閉症モデルの脳組織において不安と社会性行動領域である背側海馬（ｖｅｎｔｒａｌ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）部位を染色してギャバ性神経細胞とコリン性神経細胞の分化促進を示した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明をさらに詳細に説明する。一方、本発明で開示されるそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されてもよい。すなわち、本発明に開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。また、後述する下記の具体的な説明によって本発明の範疇が制限されるとは言えない。また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを使用し本発明に記載された本発明の特定の態様に対する多数の等価物を認知または確認しうる。また、このような等価物は、本発明に含まれることが意図される。

【0012】

前記目的を達成するための本発明の一態様は、（ａ）中脳星状細胞由来の神経成長因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＭＡＮＦ）。または（ｂ）これに由来するペプチドまたはその断片を有効成分として含む神経精神疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。

【0013】

本発明において、用語の「神経精神疾患（ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、脳神経伝達物質の不均衡と遺伝・社会的・環境的要因が複合的に作用して思考と感情、行動に異常が生じた状態を意味し、神経精神疾患に属するうつ病、不安障害、統合失調症、依存症、脳電症、自閉症スペクトラム障害（Ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒ；ＡＳＤ；自閉症）、ＡＤＨＤ（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ Ｄｅｆｉｃｉｔ Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、発達障害、精神遅滞障害などが主な神経精神疾患に該当する。

【0014】

本発明において、前記神経精神疾患は、自閉症、ＡＤＨＤ、精神遅滞障害及び発達障害からなる群から選ばれるいずれか１つ以上であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0015】

また、本発明において、前記神経精神疾患は、記憶損傷を伴うものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0016】

本発明において、用語の「中脳星状細胞由来の神経成長因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＭＡＮＦ）は、脳血管細胞が神経幹細胞に分泌する１６個以上の成長因子のうち１つであり、中脳成長因子と混用して使用されてもよい。

【0017】

前記ＭＡＮＦは、配列番号１のアミノ酸配列を有するか、または配列番号１のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１で記載されるアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されるものではない。前記配列番号１の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）でその配列を確認しうる。

【0018】

具体的に、前記ＭＡＮＦは、配列番号１及び／又は前記配列番号１と少なくとも７０％以上の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）または同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列を有してもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記ＭＡＮＦに相応する機能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するＭＡＮＦも本出願の範囲内に含まれることは自明である。

【0019】

すなわち、本出願において「特定の配列番号で記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチド」、「特定の配列番号で記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質またはポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一または相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も本出願で使用できることは自明である。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、これと同一または相応する活性を有する場合であれば、「配列番号１のアミノ酸配列として含むポリペプチド」に属することは自明である。

【0020】

本発明において、用語の「ＭＡＮＦ由来のペプチド」は、ＭＡＮＦを構成するペプチドの中から選ばれるどのようなペプチドでも制限なく含まれてもよく、具体的に、前記ＭＡＮＦ由来のペプチドは、２つ以上の連続するアミノ酸を含むものであってよく、その断片も含まれてもよい。

【0021】

本発明において、（ａ）ＭＡＮＦまたは（ｂ）ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、ＭＡＮＦのポリペプチド配列またはその断片、前記ポリペプチド配列をコーディングするポリヌクレオチド配列またはその断片、及び前記ポリヌクレオチド配列を含むベクターからなる群から選ばれるいずれかの形態で前記組成物に含まれるものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0022】

本発明において、前記ＭＡＮＦをコーディングする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコーディングする塩基配列を含んでもよく、より具体的には、配列番号２の塩基配列を含むか、有するか、またはなるものであってもよいが、これに制限されるものではない。前記配列番号２の塩基配列は、公知のデータベースであるジェンバンクから得られる。

【0023】

本発明において、用語の「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドモノマー（ｍｏｎｏ
ｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）で、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であって、より具体的には、前記変異体をコーディングするポリヌクレオチド断片を意味する。前記ポリヌクレオチドは、機能を果たすことができるポリヌクレオチド集合体の場合、遺伝子として記載されてもよい。本出願において、ポリヌクレオチドと遺伝子は混用されてもよい。

【0024】

具体的に、本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、または前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われてもよい。具体的に、配列番号１のアミノ酸配列からなるＭＡＮＦをコーディングするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含んでもよい。

【0025】

また、公知の遺伝子配列から調製できるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳しい条件下でハイブリッド化し、配列番号１のアミノ酸配列からなるＭＡＮＦをコーディングする配列であれば、制限なく含まれてもよい。前記「厳しい条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。このような条件は、当該技術分野でよく知られている。例えば、相同性または同一性の高い遺伝子同士で４０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士をハイブリッド化し、それより相同性または同一性の低い遺伝子同士でハイブリダイズしない条件、または通常の使用していたハイブリッド化（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１ΥＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１ΥＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１ΥＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。

【0026】

混成化とは、たとえ混成化の厳格度によって塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語の「相補的」とは、互いに混成化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに対して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、さらに実質的に類似した核酸配列だけでなく、全体の配列に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。

【0027】

具体的に、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を使用し、上述の条件を使用して探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適宜調節されてもよい。

【0028】

ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳格度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当技術分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ、９．５０－９．５１、１１．７－１１．８参照）。

【0029】

本出願において、用語の「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」及び「同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列に関連する程度を意味し、百分率で表されてもよい。用語の相同性及び同一性とは、よく相互交換的に使用されてもよい。

【0030】

保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、使用されるプログラムによって確立されたデフォルトギャップペナルティとともに使用されてもよい。実質的に、相同
性を有するか（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、または同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）の配列は、中間または高い厳格な条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で一般的に配列の全体または全体－長さの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上でハイブリッドされてもよい。ハイブリッド化は、ポリヌクレオチドにおいてコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。

【0031】

前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に対する相同性または同一性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）]、またはＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｎｍｏｌ．，１８３，６３，１９９０）を使用して決定してもよい。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。また、任意のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、定義された厳しい条件下で使用された混成化実験によって配列を比較することにより確認することができ、定義された適切な混成化条件は、当技術分野内であり、当業者によく知られた方法（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）として決定されてもよい。

【0032】

本出願において用語の「ベクター」とは、適切な宿主内で目的とするタンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列を目的タンパク質を発現させるのに適した調節配列に作動可能に連結された形態で含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記発現調節配列は、転写を開始可能なプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列、転写及び解毒の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムに関係なく複製されるか、または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。

【0033】

本出願で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能であり、遺伝子治療用として使用できるものであれば特に限定されず、当業界で公知のベクターを用いてもよい。例えば、遺伝子治療用として通常使用されるベクターの例としては、天然状態、または組換え状態のウイルスベクターまたは非ウイルス性ベクターが挙げられる。具体例として、ウイルスベクターとしては、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、アデノ付属ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）、腫瘍溶解性ウイルス（ＯｎｃｏｌｙｔＩｃ Ｖｉｒｕｓ）及びヘルペスシンプレックスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ）ベクターなどを使用してもよく、非ウイルス性ベクターとしては、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）とリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などがある。具体的に、本出願で使用可能なベクターは、遺伝子治療用ウイルスベクターとしてＡＡＶベクターであってもよいが、これに特に制限されるものではなく、公知の遺伝子治療用ウイルスベクターを使用してもよい。

【0034】

前記遺伝子治療用ウイルスベクターは、ウイルス感染時に一度だけ感染し、ウイルスを増殖させることができないベクターであるため、周辺細胞が感染せず、安全にヒトの治療用として使用され、その中でもＡＡＶは、ヒトに臨床的に治療に使用する際に最も安定した形態のベクターとして認められており、現在、世界的に遺伝子治療臨床で最も多く使用
されているベクターである。本出願では、ペプチド形態のウイルスベクターも含まれてもよく、ＭＡＮＦ配列の一部を含むＭＡＮＦ由来のペプチド形態のウイルスベクターまたはウイルスベクターを含む様々なＤＮＡベクターの形態を制限なく含んでもよい。

【0035】

本出願において用語の「形質転換」とは、目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換えベクターが宿主細胞内に導入され、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコーディングするタンパク質が発現されることを意味する。

【0036】

また、前記で用語の「作動可能に連結」されたものとは、本出願の目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列または発現調節領域と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知の遺伝子組換え技術を用いて製造してもよく、部位－特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当業界の切断及び連結酵素などを使用して作製してもよいが、これに制限されるものではない。

【0037】

本発明において、前記「目的タンパク質」は、ＭＡＮＦまたはこれに由来するペプチドまたはその断片であってもよい。

【0038】

本発明のＭＡＮＦ、ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、ＭＡＮＦのポリペプチド配列またはその断片、前記ポリペプチド配列をコーディングするポリヌクレオチド配列またはその断片、または前記ポリヌクレオチド配列を含むベクターの形態で薬学的組成物に含まれることにより、前記組成物が投与された個体内のＭＡＮＦのレベルを増加させて神経精神疾患の予防または治療効果を示すことができる。

【0039】

本発明において、用語の「予防」は、前記組成物の投与によって神経精神疾患を抑制するか、または発病を遅延させるすべての行為を意味する。

【0040】

本発明において、用語の「治療」とは、前記組成物の投与によって神経精神疾患による症状が好転するか、または有利に変化されるすべての行為を意味する。

【0041】

本発明のＭＡＮＦ、ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片を有効成分として含む薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。このとき、前記組成物に含まれる有効成分の含量は、特にこれに制限されるものではないが、組成物の総重量に対して０．０００１重量％～１０重量％で、好ましくは、０．００１重量％～１重量％を含んでもよい。

【0042】

前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内容液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選ばれるいずれか１つの剤形を有してもよく、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調製される。経口投与用固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使用される。経口投与用液状製剤としては、懸濁剤、内容液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキドパラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与用製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてもよい。

【0043】

本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与してもよい。

【0044】

本発明において、用語の「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野においてによく知られている要素によって決定されてもよい。本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてもよい。そして、単一または多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されてもよい。本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路及び期間に応じて異なるが、好ましい効果のために、本発明の薬学的組成物は、１日当たり０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは、０．００１～１０ｍｇ／ｋｇで投与することが好ましい。投与は、１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記組成物は、マウス、家畜、ヒトなどの様々な哺乳動物に様々な経路で投与してもよく、投与方式は、当業界の通常の方法であれば制限なく含まれ、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜、または脳血管内注射により投与されてもよい。

【0045】

また、本発明の薬学的組成物は、ヒトに適用される医薬品だけでなく、動物医薬品の形態で使用されてもよい。

【0046】

本発明のＭＡＮＦ、ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、海馬において神経細胞の再生を促進しうる。

【0047】

本発明のＭＡＮＦ、ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、神経細胞の分化を促進するものであってもよい。

【0048】

具体的に、本発明のＭＡＮＦ、ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、コリン性神経細胞及び／又はギャバ（γ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ＧＡＢＡ）性神経細胞の分化を促進して神経細胞の再生を促進するものであってもよい。

【0049】

本発明では、イボテン酸（Ｉｂｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ、ＩＢＯ）によって誘導される記憶損傷及び自閉症モデルを作製した。

【0050】

前記ＩＢＯは、マウスの脳内に注入時、線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）、海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）の形成、黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ）及び梨状皮質（ｐｉｒｉｆｏｒｍ ｃｏｒｔｅｘ）のニューロンを損傷させる化合物であり、具体的な実験では、これをｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ ｃｏｒｔｅｘ内の３つの部位に注入投与することにより、海馬の背側と腹側に神経損傷を誘導し、記憶損傷及び自閉症を誘導しうる（Ｍｉｙｕｋｉ Ｓａｄａｍａｔｓｕ，ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ａｎｏｍａｌｉｅｓ ２００６；４６，１－９，Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ａｕｔｉｓｍ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）。

【0051】

したがって、本発明の記憶損傷及び自閉症モデルは、ＩＢＯが投与されることにより、
不安と社会性行動領域である腹側海馬（ｖｅｎｔｒａｌ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）部位のコリン性神経細胞の分化が減少したが、本発明の一具現例では、ＭＡＮＦ投与時にコリン性神経細胞の分化が増加した（図１６）。

【0052】

一方、注意力行動欠乏障害、脳卒中、統合失調症、自閉症などの疾病は、興奮性細胞とギャバ性神経細胞の不均衡によって現れることが知られており、これを改善するために信号伝達体系が複雑な興奮性信号伝達物質よりも抑制性信号伝達物質であるギャバの生成または分化を促進することが必要である。ギャバ性神経細胞への分化に関与する遺伝子の中で、ＧＡＤ（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）遺伝子は、グルタメートの脱カルボキシル化を触媒する酵素で、この過程を通じて抑制性神経伝達物質であるギャバを合成することが知られている。

【0053】

そこで、本発明の他の一具現例では、ＭＡＮＦが１次神経前駆細胞の神経細胞分化過程でギャバ性神経細胞への分化を促進するかを確認した結果、１次神経前駆細胞分化過程でＭＡＮＦを３０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理したとき、ＮｅｕＮの数は大きな変化がなかったが、Ｃｏｎ群に比べてＧＦＰ陽性細胞が増加し、ＭＡＮＦが神経細胞分化過程においてギャバ性神経細胞への分化を促進することを示した（図６）。

【0054】

本発明のＭＡＮＦ、ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、記憶力を改善するものであってもよい。

【0055】

本発明の一具現例において、ＩＢＯが投与された記憶損傷及び自閉症モデルを対象にＹ字型迷路測定法、受動回避検査とモリス水迷路検査を通じて記憶能力を測定した結果、すべて記憶力向上を示した（図８Ａ－Ｃ）。

【0056】

本発明のＭＡＮＦ、ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、不安障害を改善するものであってもよい。

【0057】

本発明の一具現例において、ＩＢＯが投与された記憶損傷及び自閉症モデルを対象に高架式十字迷路実験及び開放空間行動検査を通じて不安行動を測定した結果、ＭＡＮＦ投与群がＩＢＯ群または陽性対照群に比べて不安行動が減少し（図８Ｄ－Ｅ）、不安障害が改善された。

【0058】

本発明のＭＡＮＦ、ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片は、社交性または社会的認知能力を改善するものであってもよい。

【0059】

本発明の一具現例において、ＩＢＯが投与された記憶損傷及び自閉症モデルを対象に行動実験を通じて、ＭＡＮＦ投与による社会的行動、社会的認識、社交性及び社会的性的選好度の回復の有無を調査した結果、ＭＡＮＦ投与群がＩＢＯ群または陽性対照群に比べて社会的行動、社会的認識、社交性及び社会的性的選好度が回復することが分かった（図９－１２）。

【0060】

本発明の他の一具現例において、前記行動実験後の記憶損傷及び自閉症モデルの脳組織を分析した結果、ＩＢＯ投与群では、細胞死が有意に増加したが、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群は、ＩＢＯ投与群及びＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群に比べて細胞死が著しく抑制され、ＭＡＮＦは、記憶損傷及び自閉症モデルにおいて脳神経細胞の死滅を抑制し、生存を増加させることが分かる（図１３）。

【0061】

また、本発明のさらに他の一具現例において、前記行動実験後の記憶損傷及び自閉症モデルの脳組織を分析した結果、ＭＡＮＦ投与群は、神経幹細胞（Ｓｏｘ２＋）の増殖（Ｂ
ｒｄＵ＋、Ｋｉ６７）と移動（ＤＣＸ）を促進して神経再生を増進させ（図１４）、新しく増殖したＢｒｄＵ染色された神経前駆細胞の成熟した神経細胞（ＮｅｕＮ）、希突起神経膠（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）（ＣＮＰａｓｅ）、ギャバ性神経細胞（ＧＡＤ）への分化が増加した（図１５）。

【0062】

このように、本発明は、ＭＡＮＦが記憶損傷及び自閉症モデルにおいて記憶損傷及び自閉症モデルにおいてコリン性及び／又はギャバ性神経細胞の分化を促進して神経再生を誘導し、記憶力の増進及び不安障害改善効果を示し、社会的認識、社交性及び社会的性的選好度の低下を改善することにより、神経精神疾患、特に自閉症、ＡＤＨＤ、精神遅滞障害、発達障害などの神経精神疾患の予防または治療に効果があることを最初に明らかにしたことに意義がある。

【0063】

また、ＭＡＮＦに由来するペプチドまたはその断片も、前述したようにＭＡＮＦと同じ効果を示すことができる。

【0064】

本発明の他の一態様は、本発明の薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、神経精神疾患の予防または治療方法を提供することである。

【0065】

ここで使用される用語は、前述の通りである。

【0066】

本発明において、用語の「個体」とは、神経精神疾患が発病したか、または発病し得るヒトを除くすべての動物を意味し、本発明の薬学的組成物を神経精神疾患の疑いのある個体に投与することにより、個体を効率的に治療しうる。

【0067】

本発明において、用語の「投与」とは、任意の適切な方法で神経精神疾患の疑いのある個体に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、投与経路は、目的組織に到達できる限り、経口または非経口の様々な経路を介して投与されてもよい。

【0068】

本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与してもよく、これについては前述の通りである。

【0069】

本発明の薬学的組成物は、神経精神疾患を予防または治療目的とする個体であれば特に限定されず、いかなる個体にも適用可能である。例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの非ヒト動物、鳥類及び魚類などにすべて使用されてもよく、前記薬学的組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内に投与されてもよく、局所治療のため、必要に応じて病変内の投与を含む適切な方法によって投与されてもよい。本発明の前記薬学的組成物の好ましい投与量は、個体の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適宜選ばれてもよい。例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与されてもよいが、これに制限されるものではない。

【0070】

本発明のさらに他の一態様は、（ａ）ＭＡＮＦ、または（ｂ）これに由来するペプチドまたはその断片を有効成分として含む神経精神疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供することである。

【0071】

ここで使用される用語は、前述の通りである。

【0072】

本発明において、用語の「改善」とは、前記組成物を用いて神経精神疾患の疑い及び発明個体の症状が好転するか、または有益となるすべての行為をいう。

【0073】

本発明の食品組成物は、食品学的に許容可能な塩を含んでもよく、前記食品学的に許容可能な塩は、食品学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成される酸付加塩または塩基によって形成される金属塩が有用である。一例として、遊離酸としては無機酸と有機酸を使用してもよい。無機酸としては塩酸、硫酸、臭素酸、亜硫酸またはリン酸などを使用してもよく、有機酸としてはクエン酸、酢酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸などを使用してもよい。また、金属塩としては、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を使用してもよい。しかし、これに制限されるものではない。

【0074】

本発明の食品組成物は、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセル又は液剤などの形態を含み、前記組成物を添加できる食品としては、例えば、各種食品類、例えば、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがある。

【0075】

本発明の食品組成物に含まれる成分としては、必須成分として有効成分を含有するほか、他の成分には特に制限はなく、通常の食品のように様々な生薬抽出物、食品補助添加剤または天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。前記食品組成物において有効成分の含量は、使用目的（予防、改善または治療的処置）に応じて適切に決定されてもよい。このとき、前記組成物に含まれる有効成分の含量は、特にこれに制限されるものではないが、組成物総重量に対して０．０００１重量％～１０重量％で、好ましくは、０．００１重量％～１重量％を含んでもよい。

【0076】

また、前記食品補助添加剤は、当業界で通常の食品補助添加剤、例えば、香味剤、風味剤、着色剤、充填剤、安定剤などを含んでもよい。

【0077】

前記天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など、ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロースなど、及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述のほか、香味剤として天然香味剤（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルヒジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパラタムなど）を有利に使用してもよい。

【0078】

前記の他、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有してもよい。その他に、天然フルーツジュース及びフルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。このような成分は独立して、または組み合わせて使用してもよい。

【0079】

本発明において、前記健康補助食品は、健康機能食品及び健康食品などを含んでもよい。

【0080】

前記健康機能（性）食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）とは、特定保健用食品（ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｕｓｅ、ＦｏＳＨＵ）と同じ用語で、栄養供給の他にも生体調節機能が効率的に現れるように加工された医学、医療効果の高い食品を意味する。ここで「機能（性）」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節するか、または生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。

【0081】

本発明の食品組成物を含む食品は、当業界で通常使用される方法により製造可能であり
、前記製造時には、当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造してもよい。また、前記食品の剤形も食品として認められる剤形であれば、制限なく製造してもよい。本発明の食品組成物は、様々な形態の剤形として製造されてもよく、一般薬品とは異なり、食品を原料として薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがないという長所があり、携帯性に優れている。

【0082】

本発明の他の一態様は、（ａ）ＭＡＮＦ、または（ｂ）これに由来するペプチドまたはその断片を有効成分として含む神経精神疾患の予防または改善用飼料組成物を提供することである。

【0083】

ここで使用される用語は、前述の通りである。

【0084】

本発明において、用語の「飼料」とは、動物が食べ、摂取し、消化させるための、またはこれに適した任意の天然または人工規定食、一食など、または前記一食の成分を意味する。

【0085】

前記飼料の種類は、特に制限されず、当技術分野で通常使用される飼料を使用してもよい。前記飼料の非制限的な例としては、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、澱粉類、ユウガオ類または穀物副産物類などの植物性飼料、タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類または食物などの動物性飼料が挙げられる。これらは単独で使用するか、または２種以上を混合して使用してもよいが、これに制限されるものではない。

【0086】

本発明の飼料組成物は、哺乳類、家禽類、魚類及び甲殻類を含む多数の動物食餌、すなわち飼料に適用してもよい。具体的に、商業用として重要なブタ、ウシ、ヤギなどの哺乳類、ゾウ、ラクダなどの動物園の動物、イヌ、ネコなどの家畜に使用してもよい。商業的に重要な家禽類には、トリ、アヒル、ガチョウなどが含まれ、マスやエビなどの商業的に飼育される魚類及び甲殻類を含んでもよい。

【0087】

本発明の飼料組成物は、投与のためにＭＡＮＦ、ＭＡＮＦ由来のペプチドまたはその断片の他に、さらにクエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸などの有機酸、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、重合リン酸塩などのリン酸塩、ポリフェノール、カテチン、トコフェロール、ビタミンＣ、緑茶抽出物、キトサン、タンニン酸などの天然抗酸化剤のうち１種以上を混合して使用してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤または潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、カプセル、顆粒または錠剤として製剤化してもよい。

【0088】

また、本発明の飼料組成物は、補助成分としてアミノ酸、無機塩類、ビタミン、抗酸化剤、抗真菌剤、抗菌剤などの各種補助剤及び粉砕又は破砕された小麦、大麦、トウモロコシなどの植物性タンパク質飼料、血粉、肉粉、魚粉などの動物性タンパク質飼料、動物性脂肪及び植物性脂肪などの主成分の他にも栄養補助剤、成長促進剤、消化吸収促進剤、疾病予防剤と併用してもよい。

【0089】

前記飼料用組成物は、飼料添加剤を含んでもよい。本発明の飼料添加剤は、飼料管理法上の補助飼料に相当する。

【0090】

本発明の飼料組成物を飼料添加物として使用する場合、前記飼料組成物をそのまま添加するか、または他の成分と併用してよく、通常の方法によって適宜使用されてもよい。飼料組成物の投与形態は、非毒性制約上、許容可能な担体と組み合わせて直ちに放出または徐放性剤形として製造してもよい。このような食用担体は、トウモロコシデンプン、ラク
トース、スクロース、プロピレングリコールであってもよい。固体型担体の場合には錠剤、散剤、トローチ剤などの投与形態であってもよく、液体型担体の場合にはシロップ剤、液体懸濁液剤、エマルジョン剤、溶液剤などの投与形態であってもよい。また、投与剤は、保存剤、潤滑剤、溶液促進剤、安定化剤を含有してもよく、他の疾患の予防、治療または改善上有用な物質を含有してもよい。

【実施例】

【0091】

発明の実施のための形態

【0092】

以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

【0093】

実施例１．神経細胞分化過程において中脳星状細胞由来の神経成長因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒＩｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＭＡＮＦ）の最適用量調査

【0094】

神経前駆細胞において分化マーカー発現を促進するＭＡＮＦの最適用量（ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｏｚｅ）を決定するため、成熟したニューロンの核をマーキングするＮｅｕＮ抗体、ギャバ性神経細胞をマーキングするＧＡＤ６５／６７（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）とｖＧＡＴ（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いて免疫ブロッティング実験を行った。

【0095】

具体的に、海馬由来の神経幹細胞は、Ｅ１６マウス胚の脳から分離した。海馬の隆起は、解剖顕微鏡の下で無菌状態の細いピンセットを使用してＥ１６マウスの胚前脳から細かく切断した。これらの組織を集めてＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋－ｆｒｅｅＨＢＳＳ（インビトロジェン）溶液からピペットを使用して機械的に分離し、１５μｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（ｐｏｌｙ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）と１μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、シグマ）で予めコーティングされた３５ｍｍの培養ディッシュに１９，０００細胞／ｃｍ^２で植えた。細胞は３日間、５％ＣＯ_２の条件下で１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加された血清のないＮ２培地（増殖用培地）を使用して培養した。以後、０．０５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）／ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｄｉａｍｉｎｅ－ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を使用して細胞を剥がし、免疫染色のためには、１２ｍｍのガラスカバーガラス（ベルコ）に、免疫ブロッティングのためには、１００ｍｍのディッシュに神経前駆細胞を植え、１日間ｂＦＧＦを含む増殖用Ｎ２培地で培養した。以後、増殖条件では、ｂＦＧＦを続けて含む培地にＭＡＮＦを表示した濃度で処理し、２～３日間培養し、分化条件では、ｂＦＧＦを含まない分化用培地にＭＡＮＦを添加して３～７日間培養した。対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）には、ＭＡＮＦの代わりに生理食塩水を同体積で添加した。

【0096】

前記で培養した神経幹細胞を分化３～７日後に培地をすべて除去し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で１回洗浄した。次に、プロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）が添加された溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて細胞をすべて溶解した。前記溶解物を１０％のゲルに同体積でローディングした後、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に移し、２％ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳＴまたは５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ ＴＢＳＴで常温で１時間ブロッキングした。１次抗体は、ｒｂ－ＧＡＤ６５／６７（１：１０００）、ｍｏ－ＮｅｕＮ（１：１０００）、ｍｏ－Ｖｇａｔ（１：７００）、ｍｏ－ａｃｔｉｎ（１：２０００）を使用し、２％ＢＳＡ Ｉｎ ＴＢＳＴ１次抗体を希釈して４℃で１６時間反応させた後、１×ＴＢＳＴで洗浄した。２次抗体は、ｍｏ－ＨＲＰ（１：５０００）、ｒｂ－ＨＲＰ（１：５０００）を使用し、２％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ ＴＢＳＴまたは２％ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳＴに２次抗体を希釈して１時間反応した後、フィルムに現像した。対照群抗体は、ｍｏ－ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，０５－６６１，１：２０００）、ｍｏ－ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ，ＳＣ－４７７７８，１：２０００）を使用した。

【0097】

その結果、ＭＡＮＦを１０－５０ｎｇ／ｍｌ処理したとき、３０ｎｇでＮｅｕＮは１．６倍増加し、ＧＡＤ６５／６７とｖＧＡＴタンパク質量は約２．５倍増加し、ＮｅｕＮ、ＧＡＤ６５／６７、ｖＧＡＴタンパク質はすべて３０ｎｇ／ｍｌの濃度で最も増加した（図１）。

【0098】

次に、増殖する神経前駆細胞についてＴｙｐｅ１神経前駆細胞マーカーであるＳｏｘ２（ｍｏ－Ｓｏｘ２：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，ＭＡＢ２０１８，１：１０００）、Ｔｙｐｅ３分化を開始する移動する神経前駆細胞マーカーであるＤＣＸ（ｇｏａｔ－ＤＣＸ：Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ，ＳＣ－８０６６，１：１０００）を免疫ブロッティングした結果、ＭＡＮＦを２０～５００ｎｇ／ｍｌで添加したとき、すべて同様に増加する傾向を示した（図２）。具体的に、２０ｎｇ／ｍｌでＳｏｘ２とＤＣＸがすべて大きく増加した。

【0099】

そこで、以下の実施例では、前記実験結果から導き出されたＭＡＮＦの最適容量である３０ｎｇ／ｍｌ濃度を使用して実験した。

【0100】

実施例２．ＭＡＮＦの神経細胞増殖及び分化促進効果の調査

【0101】

２－１．免疫染色技術による神経細胞増殖及び分化過程におけるＭＡＮＦの効果

【0102】

ＭＡＮＦによる神経前駆細胞の増殖促進の有無を調べるため、１次培養した神経前駆細胞にＭＡＮＦを処理した後、Ｋｉ６７抗体で増殖する細胞、Ｎｅｓｔｉｎ抗体で神経前駆細胞、ＴｕＪ１で未成熟神経細胞、ＮｅｕＮ抗体で成熟した神経細胞を蛍光染色した。

【0103】

具体的に、前記実施例１と同じ方法で神経前駆細胞を培養し、培地をすべて除去した後、ＰＢＳで１回洗浄した。４％ＰＦＡ（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）ｉｎ ＰＢＳで１５分間固定した後、再びＰＢＳで２回洗浄した。細胞が付着したカバースリップをＰＢＳＴで洗浄した後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００－ＰＢＳＴを入れて１０分間反応させた。再び２％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴまたは５％正常血清（Ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ：Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ、０１７－０００－１２１、Ｎｏｒｍａｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ：Ｓｉｇｍａ、Ｈ０１４６）でブロッキングし、１次抗体としてｒｂ－Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ、ＡＢ１５５８０、１：５００）、ｍｏ－ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３７７Ｂ、１：５００）、ｍｏ－Ｔｕｊ１（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８６６０、１：３０００）、ｍｏ－Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１８０４、１：５００）、ｍｏ－Ｎｅｓｔｉｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３５３、１：２００）を２％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳに入れて４℃で一晩反応させた。翌日、これをＰＢＳＴで洗浄した後、２次抗体でｍｏ－Ａｌｅｘａ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ２１２０２，１：７００），ｍｏ－Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ，７１５－１６５－１５１，１：５００），ｒｂ－Ａｌｅｘａ ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ、７１１－５４６－１５２、１：７００）をＰＢＳＴに入れて常温で１時間反応させた。ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で細胞核を染色し、スライドに載せて共焦点レーザー顕微鏡でスキャンし、写真を撮った。前記方法は、Ｈｅｏ ＳＲ ｅｔ ａｌ．（２００９）及びＨａｎ ＡＭ ｔ ａｌ．（２０１２）を参考した。

【0104】

細胞数の確認及びデータ分析のため、ＤＡＰＩでマーカーされた細胞核数を数え、各分化マーカーで染色された細胞数を数えて各分化マーカーの数を細胞核数として百分率で表した。このとき、形状と位置が正確に一致し、神経細胞の形状をしている細胞数を数えた。例えば、ＮｅｕＮ細胞数の測定は、核の形で丸い形をしており、ＤＡＰＩと染色が重なる細胞数を数え、スライドの端部に現れる非特異的な信号は含まれていない。データ分析は、一元配置分散分析（Ａｎｏｖａ）を通じて対照群と実験群を比較した。資料の統計学的意義は、ｐ＜０．０５であった。

【0105】

その結果、対照群に比べてＫｉ６７染色される増殖する細胞とｎｅｓｔｉｎ染色される神経前駆細胞が有意に増加した（図３）。未成熟神経細胞（ＴｕＪ１）と成熟した神経細胞（ＮｅｕＮ）も増加したが、統計的に有意ではなかった（図４）。

【0106】

２－２．ｓｉＲＮＡ ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎによる神経細胞増殖過程におけるＭＡＮＦの効果

【0107】

ＭＡＮＦの神経幹細胞の増殖効果を証明するためにＭＡＮＦ受容体ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを作製し、１次培養した神経前駆細胞（Ａ）と白マウス海馬に注入して（Ｂ）ＤＣＸとＫｉ６７発現細胞を調査した。

【0108】

具体的に、前記実施例１と同じ方法で神経前駆細胞を培養し、３日後にトリプシン処理し、細胞を集めてｓｉＲＮＡを処理した後、カバースリップあたり８×１０^４で細胞をシーディングした。３種類のＭＡＮＦ受容体同型タンパク質（ｉｓｏｆｏｒｍ）に対するｓｉＲＮＡを１０、３０ｎＭずつ、計３０、９０ｎＭで処理した。ここで使用されるｓｉＲＮＡは、以下の通りである：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅとＭＡＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＵＡＧＡＧＵＧＵＡＣＧＧＵＡＧＡＣＡＣ（配列番号４））、ＭＡＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＡＵＧＧＵＧＵＵＡＧＡＧＵＧＵＡＧＵＣ（配列番号５）：ＭＡＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＡＵＣＧＧＡＡＧＡＧＧＵＵＣＡＵＧＡＣ（配列番号６））。ｓｉＲＮＡ処理後、１．５日目の日に固定して染色を行った。

【0109】

その結果、対照群としてｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＲＮＡを処理した場合（ｓｉｃｏｎ）に対してｓｉＲＮＡを処理した場合には、増殖するＫｉ６７染色された細胞と分化する神経細胞マーカーであるＤＣＸが染色された細胞数が有意に減少し、ＭＡＮＦが神経幹細胞の増殖と分化を促進することを証明した（図５Ａ）。

【0110】

ＭＡＮＦ受容体ｓｉＲＮＡを白マウス海馬のｈｉｌｌｕｓ部位に注入し、１．５日後にマウスの脳組織を得てＫｉ６７、ＤＣＸ抗体で染色した結果、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＲＮＡ注入群に比べてｓｉＲＮＡ注入群においてＫｉ６７、ＤＣＸ染色された細胞数がそれぞれ約５０％が減少した（図５Ｂ）。

【0111】

実施例３．ＭＡＮＦのギャバ（γ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ＧＡＢＡ）性神経細胞分化促進効果の調査

【0112】

ＭＡＮＦによる１次神経前駆細胞のギャバ性神経細胞への分化を効率的に調べるため、ヒトＧＡＤ遺伝子のプロモーター部位に蛍光タンパク質であるＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を組換え、目視で簡便かつ効果的にギャバ性神経細胞への分化の有無を観察及び検出できるプラスミド（ＧＡＤ－ＧＦＰ）を使用した。前記プロモーターの活性が増加する場合、ギャバ性神経細胞への分化が促進され、プロモーターの活性増加の有無は、これに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現量により
モニタリングが可能であり、レポーター遺伝子の発現量が増加する場合、ギャバ性神経細胞への分化が促進されることが分かる。また、前記プロモーターに結合する転写因子を使用してギャバ性神経細胞の分化を容易に観察しうる。

【0113】

具体的に、１次神経前駆細胞培養後３日後に０．０５％トリプシンで細胞をディッシュから分離し、ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ後、すべての群にＧＡＤ－ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクションした。細胞を２４ウェルプレートにシーディングし、１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含むＮ２培地で２４時間培養した。ｂＦＧＦのない分化用Ｎ２培地にＭＡＮＦを３０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理し、３日と５日後に固定して染色した。

【0114】

その結果、ＭＡＮＦを３０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理したとき、ＮｅｕＮ染色された細胞の数は、３日後１０％から５日後に５０％に増加したが、ＭＡＮＦ処理群ではそれ以上増加はなく、Ｃｏｎ群に比べてＧＦＰ陽性細胞が増加し、ＭＡＮＦが神経細胞分化の過程においてギャバ性神経細胞への分化を促進することが分かる（図６）。

【0115】

実施例４．ＭＡＮＦ発現組換え－ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）ベクターの作製

【0116】

ＡＡＶ２（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ２）ベクターにＭＡＮＦ遺伝子（配列番号２）を挿入してＭＡＮＦ発現ベクター（ＭＡＮＦ－ＡＡＶ）を作製し、これを組換えウイルスで製造及び増幅して１０^{１２－１３}ｖｇ／ｍｌで濃縮した後、ヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｈＭＳＣ）にＭＯＩ １０^４で処理した。ヒト間葉系幹細胞は、カトリック大学で製造した骨髄由来ＭＳＣ細胞株を使用し、１０％ＦＢＳ培地またはＭＳＣ ＧＭ（Ｃａｍｂｒｉｘ）培地を使用して培養した。

【0117】

また、対照群としてＡＡＶ２ベクターにＧＦＰ遺伝子（配列番号３）を挿入したＧＦＰ発現ベクター（ＧＦＰ－ＡＡＶ）を含む組換えＧＦＰ－ＡＡＶを対照群ウイルスで作製し、１０^{１２－１３}ｖｇ／ｍｌに濃縮した後、ＭＳＣをＭＯＩ １０^４で処理した。

【0118】

前記ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣは、脳に注入する前にトリプシン処理して培養ディッシュから分離した後、トリプシン阻害剤（３００ｍｇ／６０ｍｌ Ｎ２ ｍｅｄｉａ）を処理した。ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅを使用して生細胞数を正確に数えた後、７．５×１０^４／μｌに合わせて注入培地（０．７％ｐ／ｓ、２０ｍｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、０．５％ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｓａｌｉｎｅ）に懸濁して脳に２ｕｌを注入した。

【0119】

実施例５．イボテン酸（Ｉｂｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ，ＩＢＯ）により誘導される記憶損傷及び自閉症モデルの作製

【0120】

６週齢のオスのスプラグ－ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）マウス（２００～２５０ｇ）は、オリエント動物飼育センター（京畿道のチャールズリバー研究所）から購入した。マウスは、社会的ストレスを避けるため、１ケージあたり２～３匹ずつランダムに収容した。飼育条件は、一定の温度範囲（２３±２℃）、湿度（６０±１０％）、及び１２時間の明暗周期を維持し、水と飼料に自由に接近できるようにした。

【0121】

前記マウスの内嗅皮質に、内嗅皮質から入力される神経信号を受信する歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ、ＤＧ）の顆粒細胞と海馬ピラミッド細胞を破壊するＩＢＯを投与して記憶損傷及び自閉症モデルを作製した。具体的に、マウスをエキテンシン（ｅｑｕｉｔｅｎｓｉｎ）（３５０ｍＭペントバルビタールナトリウム（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ）、２５０ｍＭ塩素水和物（ｃｈｌｏｒａｌ ｈｙｄｒａｔｅ）、８５
ｍＭ ＭｇＳＯ及び４０％プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）を含む１０％エタノール）で麻酔させた。定位装置（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の切歯棒（ＩｎｃＩｓｏｒ ｂａｒ）を耳間線（Ｉｎｔｅｒａｕｒａｌ ｌｉｎｅ）の下の３．４ｍｍに配置し、注射針の角度を矢状面（ｓａｇｉｔｔａｌ）の中央から右側に１０位置に固定した。定位装置を使用してマウスにＩＢＯ（１ｍｇ／ｍｌ）１．５ｕｌを内嗅皮質（ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ ｃｏｒｔｅｘ）に注入した。ＩＢＯは１番目、ＡＰ：－８．４、ＭＬ：－４．８、ＤＶ：－４．６、２番目、ＡＰ；－８．４、ＭＬ：－４．８、ＤＶ：２．３；３番目、ＡＰ：－８．８、ＭＬ：－３．６５、ＤＶ：－３．４の３つの位置に注入された（図７）。

【0122】

前記２～３回のＩＢＯ注入後、ランダムにＩＢＯ投与群（陰性対照群）、対照群としてＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群（ＧＦＰ－ＡＡＶ）、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群（ＰＬＧＦ－ＡＡＶ）に各群を分類した。１週間の休憩期間が提供された。正常マウスからなるＣｏｎ群（Ｃｏｎｔｒｏｌ、陽性対照群）にはいかなる薬物も投与せず、ＩＢＯ投与群には食塩水（ｓａｌｉｎｅ）を投与し、ＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群には前記実施例４の方法でＧＦＰ－ＡＡＶを導入したＭＳＣを投与し（ＧＦＰ－ＡＡＶ）、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群には前記実施例４の方法でＭＡＮＦ－ＡＡＶを導入したＭＳＣを投与した（ＭＡＮＦ－ＡＡＶ）。

【0123】

実施例６．ＭＡＮＦ投与による記憶能力増進及び不安障害改善効果の調査

【0124】

前記実施例５のように作製したＩＢＯが投与された記憶損傷及び自閉症モデルを対象として、ＭＡＮＦ投与による記憶能力増進及び不安障害改善効果を調査した。

【0125】

６－１．Ｙ字型迷路実験

【0126】

Ｙ字型迷路実験は、行動実験のうち最初に行った（Ｃｏｎ群ｎ＝８、ＩＢＯ投与群ｎ＝７、ＧＦＰ－ＡＡＶ投与群ｎ＝８、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ投与群ｎ＝７）。実験方法は、Ｈｅｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）に記載された内容によって行った。天井に照明とＣａｍを設置し、カーテンで周囲を覆った状態で、各ａｒｍの先端にｖｉｓｕａｌ ｃｕｅを設置したＹ字型迷路でマウスが各ａｒｍに入ることをチェックした（８、１０、１２分チェック）。成功確率を数式化する式は、３つずつそれぞれ異なるａｒｍに入った回数をａｒｍに入った合計回数－２で割って％化してデータ化した。すべての結果は、ＡＮＯＶＡ ｔｅｓｔを用いて統計処理した。

【0127】

６－２．受動回避実験（ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｔｅｓｔ）

【0128】

前記実施例６－１の各群と同数のマウスを対象に、Ｈｅｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）に記載された方法により行った。この実験は、シャトルルームとともに半自動のシステムからなっている。これらのマウスは、光が点灯したときにアクリルドアを通って暗い部屋に入って光を避けるように訓練された。この訓練は、３～４日間、マウスが２０秒以内に暗い部屋に入るまで１日３回繰り返した（適応）。すべてのマウスは、最後の訓練日の２０秒以内に暗い部屋に入る訓練に成功した。訓練最終日に適応訓練を行った後、マウスは明るい部屋に置かれ、暗い部屋に入ったときにドアを手で閉じ、電気ショック（１ｍＡ、３００ｇ基準）を焼き網を通じて３秒間足に与えた。正確に適応訓練の２４時間後、マウスは、再び明るい部屋に置かれ、暗い部屋に入る待ち時間（ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）を７２０秒間測定した（監禁実験）。

【0129】

６－３．モリス水迷路実験（Ｍｏｒｉｓ Ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）

【0130】

前記実施例６－１の各群と同数のマウスを対象に丸くて錆びておらず、内面が白いプール（直径１６０ｃｍ；高さ６０ｃｍ）でモリス水迷路実験を行った。プールは、深さ５０ｃｍで水（２３．０±１．０℃を維持）を満たし、目に見えないプラットホーム（１５ｃｍ、丸くて白い）は、水面の１．０ｃｍの下に隠れており、北東象限の中央に置かれた。それぞれのマウスは、隠されたプラットフォームを探すように４日間１日１回訓練を行った。訓練は、マウスをランダムに４つの象限のうち１つのプールの壁に対向するように水の中に置いて開始した。それぞれの訓練の間、マウスを最大６０秒間プラットフォームを探すようにし、プラットフォームを探した後、１分間休息させた。４つの象限テストの平均時間は、訓練日の群当たり、脱出待機時間として定義した。最終実験は、プラットフォームを除去した後、マウスが６０秒間プラットフォームがあった場所での滞在時間を測定した（プローブ試験：ｐｒｏｂｅ ｔｒｉａｌ）。水泳時間と訓練の長さは、ビデオカメラを通じて追跡及び記録した。追跡は、白い背景の黒い点で示されたマウスの軌跡に沿って行った。キャプチャーされたビデオ写真は、ビデオ追跡システム（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ水中迷路プログラム、Ｎｏｌｄｕｓ情報技術、ワーゲニンゲン、オランダ）で分析した。分析された情報は、ターゲット象限で泳いだ時間と除去されたプラットフォームを探すため、仮想のプラットフォームを渡る回数が含まれた。

【0131】

実施例６－１～６－３の実験結果、図８Ａ－Ｃに示すように、ＭＡＮＦ投与した動物は、記憶能力を測定するＹ字型迷路測定法、受動回避検査とモリス水中迷路検査においてすべて記憶力向上を示した。

【0132】

６－４．高架式十字迷路実験

【0133】

前記実施例６－１の各群と同数のマウスを対象に不安行動を測定するため、空中に高く浮び上がっており、十字型迷路の２つのｃｌｏｓｅｄ ａｒｍと２つのｏｐｅｎ ａｒｍから構成された行動実験装置を使用した。十字型迷路の中間でｏｐｅｎ ａｒｍの方向を見るように置かれたマウスは、１０分間自由に迷路を探索した。マウスの不安障害は、露出しているｏｐｅｎ ａｒｍを避け、ｃｌｏｓｅｄ ａｒｍに留まる傾向として検証した。ビデオ追跡システム（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＥＰＭプログラム、Ｎｏｌｄｕｓ情報技術、ワーゲニンゲン、オランダ）で分析した。

【0134】

その結果、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ投与群においてＩＢＯ投与群に比べてｏｐｅｎ ａｒｍで過ごした時間が増加し、不安障害が改善されたことが分かる（図８Ｄ）。

【0135】

６－５．開放空間行動検査

【0136】

前記実施例６－１の各群と同数のマウスを対象に不安行動を測定するため、黒アクリルから構成された１００ｃｍ＊１００ｃｍの空間に２０ｃｍ＊２０ｃｍの正方形を底に分けて空間を分け、中央９マスを中央ゾーン（Ｃｅｎｔｅｒ ｚｏｎｅ）に設定し、その他の地域をエッジゾーン（Ｂｏｒｄｅｒ ｚｏｎｅ）に設定した。中央９マスには少し明るい光を当てて、相対的に明るい中央ゾーンと暗いエッジゾーンにいる時間を測定した。

【0137】

その結果、ＩＢＯ群では中央にいる時間が減少したが、ＭＡＮＦ群ではＩＢＯ群に比べて確実に中央にいる時間が増加し、ＭＳＣ群に比べても増加して対照群（Ｃｏｎ）に類似したレベルで不安障害が解消された（図８Ｅ）。

【0138】

実施例７．ＭＡＮＦ投与による社会的オープンフィールド（Ｓｏｃｉａｌ ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ）における社会的行動回復の調査

【0139】

前記実施例５のように作製したＩＢＯが投与された記憶損傷及び自閉症モデルの社会性
能力（Ｓｏｃｉａｂｉｌｉｔｙ）の欠陥と、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣを投与したとき、これらの欠陥が回復できるかどうかを行動実験を通じて測定した。

【0140】

具体的に、社会的オープンフィールド（Ｓｏｃｉａｌ ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ）で社交性を実験した。マウスを３０分間記録環境に適応させた後、１０分間黒アクリルから構成された社会的オープンフィールドに適応させた。知らないマウスを嗅覚と最小限の接触を許容する円筒型ケージに入れ、競技場の端の中央に配置した。試験対象のマウスの動きを１０分間記録し、ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ３．１プログラムで分析した。そして、知らないマウスが置かれた円筒の周辺１０ｃｍを設定し、社交性を示した範囲を分析した。

【0141】

その結果、目的領域で過ごす時間と対象個体に関心を示す時間（ｓｎｉｆｆｌｉｎｇ）は、ＩＢＯ投与群とＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群において類似して正常マウスより短く、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群では著しく長くなったので（図９）、ＭＡＮＦ投与は、社会的行動を回復させる結果を示した。

【0142】

実施例８．ＭＡＮＦ投与による３つの部屋における社会的行動回復の調査

【0143】

実施例５のようにＩＢＯが投与された記憶損傷及び自閉症モデルにＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣを投与したとき、社会的認識、社交性及び社会的性的選好度が回復するかどうかを察し見るために３つの部屋実験を行った。

【0144】

具体的に、実験場所は透明なアクリルの壁からなり、小さなドアのある３つの部屋から構成され、各部屋は、長さ５０ｃｍ×幅１００ｃｍ×高さ５０ｃｍであった。円筒型ケージを通じて試験対象マウスの知らないマウスに対する嗅覚及び最小接触を許容した。試験前に、試験対象のマウスは中央の部屋に配置され、両側のドアを閉めて５分間適応させた。テストは、下記セッションＩ、ＩＩ、及びＩＩＩに分けて行った。

【0145】

＜セッションＩ＞誰もいない（ｎｏｎｅ）ｖｓ知らないマウス（ｓｔｒａｎｇｅｒ）

【0146】

社交性を測定するため、２つの円筒型ケージを各エッジルームに配置するが、一方は知らないマウスがおり、もう一方は空とした。試験対象のマウスは、中間の部屋に配置され、３つの部屋で自由に移動し、１０分間２つのケージに接近できた。マウスの動きを記録し、ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ３．１プログラムを通じて何もいない、及び知らないマウス１領域で分析した。

【0147】

＜セッションＩＩ＞見慣れたマウス（ｆａｍｉｌｉａｒ）ｖｓ知らないマウス（ｓｔｒａｎｇｅｒ）

【0148】

新しい対象に対して新しい社会性を構築し、すでに社会性を形成した対象に対する社会的認識を分析するため、セッションＩで新しいケージに新しいマウス（知らないマウス）を追加した。試験対象のマウスが３つの部屋にすべて接近できるように、２つのドアをすべて開けた後、試験対象のマウスを中間の部屋に配置し、１０分間自由に動けるようにした。マウスの動きを記録し、ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ３．１プログラムを通じて見慣れたマウス及び知らないマウス領域で分析した。

【0149】

＜セッションＩＩＩ＞性的選好度

【0150】

雌マウスに対する接触を分析して性的選好と社会的認識の程度を測定するため、雌及び雄マウスを各部屋の円筒型ケージに配置し、被験対象のマウスがより頻繁に接触するケージ及び時間を測定した。マウスの動きを記録し、ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ３．１プログラ
ムを通じてセッション別に各ケージに対する接近時間及び頻度で分析した。

【0151】

その結果、図１０に示すようにセッションＩで空き領域と知らないマウスを含む領域に分けて各領域で過ごした時間で分析した結果、目的領域で過ごした時間は、ＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群がＩＢＯ投与群よりより短く、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群では、ＩＢＯ投与群またはＧＦＰ－ＡＡＶ投与群に比べて顕著に長くなることを確認した。一方、対象マウスのない空き区域で過ごした時間は、ＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群で最も長く、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群は、正常群に類似したレベルに回復した。

【0152】

図１１に示すように、セッションＩＩで１つの部屋で見慣れたマウスと、他の部屋で知らないマウスを認識し、新しい対象と社交性を形成することにより、マウスが既に社交性をいかによく形成しているかを調査した結果、知らないマウスの区域で過ごした時間は、正常群に比べてＩＢＯ投与群では有意に減少し、ＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群は、ＩＢＯ投与群よりも短かったが，ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群では、ＩＢＯ投与群に類似した程度に長くなる傾向があったが、有意ではなく、ＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群に比べて著しく長くなった。

【0153】

また、図１２に示すように、セッションＩＩＩで社会的性選好度を確認した結果、雌マウス区域で過ごした時間は、ＩＢＯ投与群で減少傾向を示したが、ＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群及びＰＬＧＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群は、両方とも正常群に類似したレベルに回復した。一方、雄マウス区域で過ごした時間は、ＩＢＯ投与群を除いてはＣｏｎ群、ＧＦＰ－ＡＡＶ投与群及びＭＡＮＦ－ＡＡＶ投与群においてすべて類似したレベルで短かった。

【0154】

これにより、ＭＡＮＦ投与は、社会的認識、社交性及び社会的性的選好度を回復させることが分かる。

【0155】

実施例９．免疫学的組織染色実験

【0156】

前記実施例８の行動実験後、免疫組織化学分析のために各群当たり４匹以上のマウス脳組織を得て脳切片を免疫染色した。

【0157】

９－１．免疫組織化学分析－ＴＵＮＥＬ

【0158】

実験方法は、Ｈｅｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）に記述したものを修正して使用した。マウスを４％ＰＦＡ ｉｎ ＰＢＳで軽心灌流（ｐｅｒｆｕｓｅｄ）し、４時間４％ ＰＦＡ ｉｎ ＰＢＳに浸して固定した後、脳組織を３０％スクロース Ｉｎ ＰＢＳで非冷凍化した後、最適な切断温度（ＯＣＴ）混合物で凍結して－８０℃で保管した。脳組織切片を３５μｍ厚さの冠状面を通じて冷たいところで切断した。脳組織切片は、貯蔵溶液（３０％グリセロール、３０％エチレングリコール ｉｎ ＰＢＳ）に浸して４℃で保管した。

【0159】

以後、脳神経細胞の死滅の程度を分析するため、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。保管した脳片を４％パラホルムアルデヒドを使用して常温で１０分固定した後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ，１１６８４７９５９１０）のプロトコルによって湿度を維持した３７℃恒温器で１時間酵素反応を行った。以後、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞核は１μｇ／ｍｌのプロピジウムヨージド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、シグマ、Ｐ４８６４、１：３０００）でマーキングして細胞死を分析した。

【0160】

その結果、図１３に示すように、４週間に比べて８週間後、ＩＢＯ投与群では、細胞死
が有意に増加した後に減少しなかったが、ＡＡＶ－ＭＡＮＦ－ｈＭＳＣ投与群は、ＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ群よりもさらに減少し、８週後には大幅に減少し、有意性が大きくなった。これは、ＭＡＮＦは記憶損傷及び自閉症モデルにおいて脳神経細胞の死を抑制し、生存を増加させるものと見られる。

【0161】

９－２．免疫組織化学分析－ＢｒｄＵ、ＳＯＸ２、ＤＣＸ、ＮｅｕＮ、ｖＧｌｕＴ１、ＧＡＤ６７、ＣＮＰａｓｅ

【0162】

前記実施例９－１の免疫染色と同じ方法で保管された脳組織をＰＢＳを使用して２回洗浄し、０．５％トリトンＸ－Ｉ００で２０分間透過し、３７℃で３０分間２Ｎ ＨＣｌで培養した。その後、１５％標準血清、３％ウシ血清アルブミン（ｂｉｏ－ＷＯＲＬＤ、ダブリン、ＯＨ、ＵＳＡ）及び０．１％トリトンＸ－１００で２時間自由に浮いている状態でブロッキングした。前記組織を１６時間４℃で１次抗体であるＢｒｄＵ（Ａｂｃａｍ，１：７００）抗体とＳＯＸ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，ＭＡＢ２０１８，１：２０００），ＤＣＸ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，ｓｃ８０６６，１：１０００），ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＢ３７７Ｂ，１：７００）、ＣＮＰａｓｅ（Ａｂｃａｍ，ａｂ６３１９，１：７００）、ｖＧｌｕＴ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ５５０２、１：７００）、ＧＡＤ６７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＢ５４０６，１：２０００）を使用して二重染色した。２次抗体としては、ｍｏ－Ａｌｅｘａ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ２１２０２，１：７００），ｍｏ－Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ，７１５－１６５－１５１，１：５００），ｒｂ－Ａｌｅｘａ ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ，７１１－５４６－１５２，１：７００）、ｒａｔ－Ａｌｅｘａ ４８８（Ａｂｃａｍ、ａｂ６３２６、１：７００）などを使用した。免疫染色した組織は、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０、ＬＳＭ８００カルザイス、オーバーコーヘン、ドイツ）でスキャンした。

【0163】

二重（ｄｏｕｂｌｅ）、トリプル（ｔｒｉｐｌｅ）撮影したスライドでＤＡＰＩでマーキングされた細胞数を計数し、各分化マーカーであるＮｅｕＮ、ＣＮＰａｓｅ、ＧＡＤ、ｖＧｌｕＴ１を蛍光でマーキングしてマーキングされたそれぞれの細胞数を計数して各実験動物の海馬内の分化マーカーの数を示した。このとき、形状と位置が正確に一致し、細胞の形状である２次抗体でマーキングされた数を計数した。

【0164】

その結果、図１４に示すように、ＭＡＮＦは、神経幹細胞（Ｓｏｘ２＋）の増殖（ＢｒｄＵ＋、Ｋｉ６７）と移動（ＤＣＸ）を促進して神経再生を増進した。

【0165】

図１５に示すように、ＭＡＮＦ投与された記憶損傷及び自閉症モデルマウス組織では、新しく増殖した（ＢｒｄＵ染色された）神経前駆細胞の成熟した神経細胞（ＮｅｕＮ）、希突起神経膠（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）（ＣＮＰａｓｅ）、ギャバ性神経細胞（ＧＡＤ）への分化が増加した。

【0166】

実施例１０．ＭＡＮＦ投与による腹側（ｖｅｎｔｒａｌ）海馬のコリン性ニューロン（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の変化調査

【0167】

前記実施例５のように作製したＩＢＯが投与された記憶損傷及び自閉症モデルを対象に免疫染色を用いてＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣを投与したとき、コリン性ニューロンの変化を調査した。

【0168】

具体的に、マウスを４％ＰＦＡ ｉｎ ＰＢＳで灌流し、脳を摘出した。脳を４℃で４時間固定した後、４℃で４８時間、３０％スクロースを含むＰＢＳを用いて脱水した。次に脳をブロック状に冷凍し、最適温度の化合物を使用して－８０℃で保管した。組織を３０μｍ厚さの冠状切片に作製し、貯蔵溶液（３０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、３０％エチレングリコール（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）を含むＰＢＳ）で４℃で保管した。以後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００－ＰＢＳに２０分間透過させ、１０％一般血清と３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００－ＰＢＳで１時間室温で遮断した後、ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ１４４p、１：２００）の１次抗体を使用して免疫染色及び計数した。前記免疫染色は、背側海馬（ｖｅｎｔｒａｌ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｒｅｇａｎｓ、ｖＨＰ）でそれぞれの脳切片ＡＰ－４．０～－５．２ｍｍで０．３ｍｍごとに行われた。

【0169】

その結果、図１６に示すように、背側海馬ＣＡ３のＣｈＡＴ陽性細胞の数は、ＩＢＯ投与群で最も低く、ＧＦＰ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群で多少回復したが、ＭＡＮＦ－ＡＡＶ－ｈＭＳＣ投与群では、正常マウスに類似したレベルでコリンニューロンの数が回復し、ギャバ性神経細胞の有意性は低いが、多少増加した。また、背側海馬（ｖｅｎｔｒａｌ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）は、情緒不安と社会性行動に関連した領域であり、背側、この部位のギャバ性神経細胞とコリン性神経細胞の分化が増加したため、ＭＡＮＦ投与によりコリン性及びギャバ性神経細胞が再生されるものと見られる。

【0170】

前記実施例の結果によって、ＭＡＮＦ投与は、記憶損傷及び自閉症モデルにおいてコリン性及び／又はギャバ性神経細胞の分化を促進して神経再生を誘導し、記憶力増進及び不安障害改善効果を示し、社会的認識、社交性及び社会的性的選好度の低下を改善し、自閉症、ＡＤＨＤ、精神遅滞障害、発達障害などの神経精神疾患の予防または治療用組成物として提供されてもよい。

【0171】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関して、上述した実施例は、あらゆる面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明より後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、及びその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】