▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
特表2023-544479微生物核酸による転移性癌の存在およびその由来組織の識別
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-24
(54)【発明の名称】微生物核酸による転移性癌の存在およびその由来組織の識別
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20231017BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20231017BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20231017BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231017BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231017BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20231017BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/686 Z
A61P35/04
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K45/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023511783
(86)(22)【出願日】2021-09-21
(85)【翻訳文提出日】2023-03-27
(86)【国際出願番号】 US2021051261
(87)【国際公開番号】W WO2022061281
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】63/081,075
(32)【優先日】2020-09-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/105,624
(32)【優先日】2020-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＮＳＯＲＦＬＯＷ
(71)【出願人】
【識別番号】508228061
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】プア，グレゴリー ディー．
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ05
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS28
4B063QS36
4B063QX01
4C084AA17
4C084AA20
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZC75
(57)【要約】
組織または血液の中の非ヒト微生物核酸に基づいて、転移性癌を検出し、その由来組織を判定する方法。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法であって、該方法が：（ａ）癌を有する対象の生体試料中に微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在から汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）癌を有する１個体以上の対象の１種類以上の生体試料の微生物存在に対して、該除染微生物存在を比較し、それによって微生物／癌比較データセットを作成すること；
および
（ｄ）該微生物癌比較データセットから該対象の該転移性癌の存在またはその欠如を判定すること、
を含む、方法。
【請求項2】
請求項１の方法であって、ここで判定することが、転移性癌の由来組織を同定することをさらに含む、方法。
【請求項3】
請求項１の方法であって、ここで工程（ｃ）の癌を有する１個体以上の対象が原発腫瘍、転移性腫瘍、またはそれらの任意の組み合わせを含む、方法。
【請求項4】
請求項１の方法であって、ここで該微生物存在が微生物存在量をさらに含む、方法。
【請求項5】
請求項４の方法であって、ここで該微生物存在または存在量が非哺乳動物の生物種である細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、方法。
【請求項6】
請求項４の方法であって、ここで該微生物存在または存在量が、生態学的ショットガンシーケンシング、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、免疫組織化学、インサイチューハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、宿主の全ゲノム配列決定、宿主トランスクリプトミクス配列決定、癌全ゲノム配列決定、癌のトランスクリプトミクス配列決定、またはそれらの任意の組み合わせによって評価される、方法。
【請求項7】
請求項４の方法であって、ここで該微生物存在または存在量が：微生物由来の核酸領域である：
１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９可変ドメイン領域、１８Ｓ ｒＲＮＡの転写される内部スペーサー（ＩＴＳ）領域、またはそれらの任意の組み合わせ、
の増幅によって評価される、
方法。
【請求項8】
請求項４の方法であって、ここで該微生物存在または存在量が、標的微生物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせである核酸の測定によって検出され；ここで標的微生物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせである核酸の該測定が、該対象の哺乳動物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせの測定と同時である、
方法。
【請求項9】
請求項１の方法であって、ここで該転移性癌が：急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ、
を含む、方法。
【請求項10】
請求項１の方法であって、ここで該転移性癌が一癌種を含み、ここで該一癌種が、肺癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、甲状腺癌、またはそれらの任意の組み合わせを含む、方法。
【請求項11】
請求項１の方法であって、ここで該汚染微生物特徴量としては該微生物存在の分類群帰属が挙げられる、方法。
【請求項12】
請求項１の方法であって、ここで工程（ｂ）によって、転移性癌の由来組織を判定する正解率が改善する、方法。
【請求項13】
請求項１の方法であって、ここで工程（ｂ）が省略される、方法。
【請求項14】
請求項１の方法であって；ここで該微生物／癌比較データセットが、哺乳動物特徴量をさらに含み；
ここで該哺乳動物特徴量が：
腫瘍組織の免疫組織化学蛋白質マーカー、腫瘍組織ＤＮＡ、腫瘍組織ＲＮＡ、腫瘍組織メチル化パターン、無細胞腫瘍ＤＮＡ、無細胞腫瘍ＲＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＤＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＲＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡのメチル化パターン、無細胞腫瘍ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、またはそれらの任意の組み合わせ、
を含む、方法。
【請求項15】
請求項１の方法であって、ここで該生体試料が、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む、方法。
【請求項16】
請求項１５の方法であって、ここで該生体試料が全血の１種類以上の構成成分を含み、該構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる、方法。
【請求項17】
対象の転移性癌を治療するために、微生物存在に基づいて治療を行う方法であって、該方法が：（ａ）転移性癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）該除染微生物存在と該対象の転移性癌とを関連付けること；
および
（ｄ）該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連によって判定された該対象の治療を行うこと、
を含む、方法。
【請求項18】
請求項１７の方法であって、ここで該微生物存在が微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または存在量が非哺乳動物の生物種である細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、方法。
【請求項19】
請求項１７の方法であって、ここで該汚染微生物特徴量としては該微生物存在の分類群帰属が挙げられる、方法。
【請求項20】
請求項１７の方法であって、ここで工程（ｂ）が省略される、方法。
【請求項21】
請求項１７の方法であって、ここで該生体試料が組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む、方法。
【請求項22】
請求項２１の方法であって、ここで該生体試料が１種類以上の全血の構成成分を含み、該構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる、方法。
【請求項23】
請求項１７の方法であって、ここで該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない、方法。
【請求項24】
請求項１７の方法であって、ここで該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる、方法。
【請求項25】
請求項１７の方法であって、ここで該転移性癌が：急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ、
を含む、方法。
【請求項26】
請求項１７の方法であって、ここで該治療が、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む、方法。
【請求項27】
請求項２６の方法であって、ここで該アジュバントが抗生物質または抗菌剤である、方法。
【請求項28】
請求項１７の方法であって、ここで該治療が転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである、方法。
【請求項29】
請求項２８の方法であって、ここで該治療が標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、方法。
【請求項30】
請求項１７の方法であって、ここで該治療が該微生物存在の機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む、方法。
【請求項31】
請求項２８の方法であって、ここで該治療が２種類以上の治療種別を含み、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別のうちの少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する、方法。
【請求項32】
請求項１７の方法であって、ここで該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連が、転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、方法。
【請求項33】
対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるコンピューターシステムであって、該コンピューターシステムが：１つ以上のプロセッサー；
および
ソフトウェアを含む持続性コンピューター可読保存媒体であって、ここで該ソフトウェアが実行可能命令を含み、該命令の実行の結果として、該コンピューターシステムの該１つ以上のプロセッサーに：
（ａ）癌を有する該対象の生体試料の１種類以上の核酸分子を取得すること；
（ｂ）該生体試料の１種類以上の核酸の非微生物核酸から微生物核酸を分離すること；
（ｃ）該微生物核酸の微生物存在を識別すること；
（ｄ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在の表を作成すること；
（ｆ）該除染微生物存在の表を機械学習モデルに入力すること；
および
（ｇ）該機械学習モデルから、該転移性癌の存在または非存在を示す出力を受け取ること、
を遂行させる、ソフトウェア、
を含む、コンピューターシステム。
【請求項34】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで該微生物存在が微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または存在量が非哺乳動物の生物種である細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、コンピューターシステム。
【請求項35】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで該除染微生物特徴量が該微生物存在の分類群帰属を含む、方法。
【請求項36】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで工程（ｄ）が省略される、コンピューターシステム。
【請求項37】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで微生物ゲノムおよび非微生物ゲノムの参照データベースに対して１種類以上の核酸分子を整列化させることによって、該微生物および非微生物核酸を分離させる、コンピューターシステム。
【請求項38】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで参照ゲノムデータベースに対して該１種類以上の核酸分子を整列化させることなく、該微生物および非微生物核酸を分離させる、コンピューターシステム。
【請求項39】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで該除染微生物存在の表が哺乳動物特徴量をさらに含み、ここで該哺乳動物特徴量が：腫瘍組織の免疫組織化学蛋白質マーカー、腫瘍組織ＤＮＡ、腫瘍組織ＲＮＡ、腫瘍組織メチル化パターン、無細胞腫瘍ＤＮＡ、無細胞腫瘍ＲＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＤＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＲＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡのメチル化パターン、無細胞腫瘍ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、またはそれらの任意の組み合わせ、
を含む、コンピューターシステム。
【請求項40】
請求項３３のコンピューターシステムであってここで該転移性癌が：急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ、
を含む、コンピューターシステム。
【請求項41】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで該転移性癌が一癌種を含み、ここで該一癌種が：肺癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、甲状腺癌、またはそれらの任意の組み合わせ、
を含む、コンピューターシステム。
【請求項42】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで該生体試料が組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む、コンピューターシステム。
【請求項43】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで該生体試料が全血の構成成分を含み、該構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる、コンピューターシステム。
【請求項44】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで該機械学習モデルが、非転移性癌性組織と転移性癌性組織との間の識別または血液試料間の識別を行うように訓練される、コンピューターシステム。
【請求項45】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで該機械学習モデルが、１種類以上の癌の種類を識別するように訓練される、コンピューターシステム。
【請求項46】
請求項４５のコンピューターシステムであって、ここで該１種類以上の癌の種類が：肺癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、甲状腺癌、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
コンピューターシステム。
【請求項47】
請求項３３のコンピューターシステムであって、ここで該出力が転移性癌の種類、由来組織、またはそれらの任意の組み合わせの表示をさらに含む、コンピューターシステム。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２１日付けおよび２０２０年１０月２６日付けで出願された、それぞれ米国仮出願第６３／０８１，０７５および６３／１０５，６２４号に基づく優先権を主張するものである。その優先出願の開示内容全体が参照として本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２０年９月２１日付けおよび２０２０年１０月２６日付けで出願された、それぞれ米国仮出願第６３／０８１，０７５および６３／１０５，６２４号に基づく優先権を主張するものである。その優先出願の開示内容全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【0002】
米国連邦政府による研究助成についての説明
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された研究助成金番号：Ｆ３０ＣＡ２４３４８０の下で政府援助によってなされたものである。連邦政府は本発明において一定の権利を有している。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された研究助成金番号：Ｆ３０ＣＡ２４３４８０の下で政府援助によってなされたものである。連邦政府は本発明において一定の権利を有している。
【0003】
本発明は、組織生検および液体生検に存在する非ヒト微生物核酸によって、転移性癌の存在および／またはその由来組織を同定することに関するものである。本発明の少なくとも一つの実施態様においては、複数種の転移性癌間および複数種の転移性癌内の識別を行う診断モデルとして、機械学習（ＭＬ）モデルを訓練する。
【背景技術】
【0004】
細菌、ウイルス、真菌、古細菌、およびファージの微生物叢が、発癌において重要な役割を果たすことを示す証拠がますます増えつつある。実際に、全癌細胞のうちの２０％もの癌が、微生物因子に直接的に起因すると推定されている。その潜在的機構は免疫系に対する微生物の影響によるものであり、これは、複数ある機構の中で特に、炎症を増大させたり低下させたりする微生物の能力、ならびに対象の免疫細胞の機能を操作する微生物の能力によるものであると多くの研究者達は考えている。
【0005】
１種類以上の特定細菌を定着させたノトバイオートマウスモデルを用いた研究データによれば、微生物叢が、多様な機構（炎症を調節する、ＤＮＡ損傷を誘導する、および発癌または腫瘍抑制に関与する代謝産物を産生することなど）によって発癌感受性および癌の進行を変化させ得ると考えられる。発癌および癌の進行に加えて、癌治療に対する応答を予測することも、微生物叢の利用によって可能となり、あるいは「従来の」化学治療（例えば、ゲムシタビン）およびさらに「革新的な」免疫治療（例えば、ＰＤ－１阻害）を含む癌治療を改善するように微生物叢を操作することも可能であることを示唆する新たな証拠が現れつつある。
【0006】
文献の多くは、宿主腸管内微生物叢の組成または機能および癌に対するその影響を調べることに焦点を置いているが、文献に示される最近の例では、原発腫瘍組織内または原発腫瘍を有する患者の血液内の癌関連微生物叢を調べている（ＰＭＩＤ：３２２１４２４４、３２４６７３８６、２９５６７８２９、３１５７８５２２）。原発腫瘍関連微生物叢に研究上の関心が寄せられることが多いのだが、その理由は、腫瘍形成に対して、それらが潜在的に因果関係を有すること、および単一原発腫瘍の複数の転移性対応物と比べて、単一原発腫瘍自体に対するアクセスが容易であることによる。
【0007】
しかし、大部分の癌死は原発腫瘍によるものではなく、むしろ転移によるものである；また、癌関連微生物叢と転移性癌との間の関係については、ほとんど全くと言っていいほど知られていない。本分野におけるこのような乖離に対処できるならば、転移性癌の存在および／または転移性癌の由来組織の早期検出によって患者の実質的病的状態および死亡を防ぐ、新しい種類の癌診断法に到達できるであろう。さらに、転移性癌の由来組織の正確な識別は、患者の臨床治療を如何に成すべきかの指針を与える重要なものである。不自然な例に思われるかもしれないが、患者の脳に発見される転移性肺癌の場合には、患者の脳に由来する脳腫瘍（すなわち、原発腫瘍）とは異なる臨床管理が成されるであろう。したがって、転移性癌の由来組織の診断を改善する方法はまた、実施処置の最適種類または最適投薬および患者の予後に影響を与えるのである。
【0008】
歴史的には、転移性癌の由来組織を同定するプロセスは、転移性組織の生検から取得するヒト分子情報に依存するものであった：免疫組織化学（ＩＨＣ）蛋白質染色、ヒトＤＮＡの配列決定（例えば、特定の原発腫瘍の種類に関連することが公知の変異を識別する）、ＤＮＡ配列の修飾（例えば、エピゲノム）、またはヒトＲＮＡの配列決定（例えば、特定の原発腫瘍の種類に関連する遺伝子発現パターンを識別する）。しかし、これらの方法が転移性腫瘍の由来組織の局在を特定する正解率は限定的であった。例えば、Ｗｅｉｓｓら（ＰＭＩＤ：２３２８７００２）が正解率を報告しており、ＩＨＣ法を用いた場合にはたったの６９％の正解率しかなく、また同一試料を９２種類の遺伝子発現シグニチャー用いて調べた時には僅か７９％であった。これらの結果は、由来組織を同定する場合に、失敗率が患者の転移性癌の２０％超であることを意味し、圧倒的大多数の癌死が全て転移によるものである場合には、この失敗率は顕著なものであると言わざるを得ない。このような低正解率は、それら原発腫瘍組織の元々の細胞マーカーが如何に多くの転移性腫瘍で消失しているのかを反映するものであり、ヒト情報を用いてその由来を明確かつ迅速に識別することが困難になり、また臨床的に侵襲性、高額、かつ緊急性の、患者の原発腫瘍探しに駆り立てることになるのである。
【0009】
癌関連微生物に関する技術分野の現在の科学的状況については、以下が公知である：
（ｉ）多くの癌関連微生物が原発腫瘍癌細胞および隣接免疫細胞の細胞内に存在する（ＰＭＩＤ：３２４６７３８６）；
（ｉｉ）原発腫瘍は実質的に全て癌種特異的微生物叢を含む（ＰＭＩＤ：３２２１４２４４）；
および
（ｉｉｉ）結腸癌の場合には、癌細胞が原発腫瘍から転移すれば細胞内微生物も癌細胞内に存在したまま一緒に移動することがある（ＰＭＩＤ：２９１７０２８０）。
（ｉ）多くの癌関連微生物が原発腫瘍癌細胞および隣接免疫細胞の細胞内に存在する（ＰＭＩＤ：３２４６７３８６）；
（ｉｉ）原発腫瘍は実質的に全て癌種特異的微生物叢を含む（ＰＭＩＤ：３２２１４２４４）；
および
（ｉｉｉ）結腸癌の場合には、癌細胞が原発腫瘍から転移すれば細胞内微生物も癌細胞内に存在したまま一緒に移動することがある（ＰＭＩＤ：２９１７０２８０）。
【0010】
一方、現在まだ分かっておらず、なおかつ決定的に重要な事柄は以下である：
（ｉ）転移の微生物叢がそれらの由来組織を忠実に反映するか否か、または転移の新しい身体部位（原発腫瘍と比較して）は、その微生物組成または微生物機能を破壊するか否か；
（ｉｉ）癌の全種類、特に、結腸癌以外のものが、原発腫瘍とその転移との間で、同じ細胞内微生物（または細胞外微生物）を共有するか否かであり、このことは微生物情報に依存する、転移の汎癌診断アプローチの実用可能性に影響を与えるものである；
（ｉｉｉ）血液中に転移の微生物叢が検出され得るか否か、もし可能であれば、そのような情報が由来癌組織に関する情報として有益であるのだろうか。
（ｉ）転移の微生物叢がそれらの由来組織を忠実に反映するか否か、または転移の新しい身体部位（原発腫瘍と比較して）は、その微生物組成または微生物機能を破壊するか否か；
（ｉｉ）癌の全種類、特に、結腸癌以外のものが、原発腫瘍とその転移との間で、同じ細胞内微生物（または細胞外微生物）を共有するか否かであり、このことは微生物情報に依存する、転移の汎癌診断アプローチの実用可能性に影響を与えるものである；
（ｉｉｉ）血液中に転移の微生物叢が検出され得るか否か、もし可能であれば、そのような情報が由来癌組織に関する情報として有益であるのだろうか。
【0011】
以前、ＷＯ２０２００９３０４０Ａ１では、患者の組織および血液における非ヒト微生物核酸を用いて原発腫瘍の新規癌診断法を開発することに焦点が置かれた。さらには、ＵＳ２０１８０２９１４６３Ａ１、ＷＯ２０１８２００８１３Ａ１、およびＷＯ２０１８０３１５４５Ａ１では、原発腫瘍試料（転移ではない、また血液でも、その他の体液でもない）における事前選択（「バイアスのある」）微生物の集団を検出するマイクロアレイ技術について説明している。ＵＳ２０１８０２２３３３８では、頭頸部癌の同定および診断における原発腫瘍組織の微生物叢または唾液微生物叢の利用について説明している。ＵＳ２０１８０２５８４９５Ａ１では、結腸癌検出における原発腫瘍組織の微生物叢または糞便微生物叢の利用、結腸癌に関連するある種の変異、および対応する微生物の回収および増幅を行うキットについて説明している。
【発明の概要】
【0012】
本発明の開示は、少なくとも一つの実施態様において、転移性癌の存在またはその欠如、その由来組織、およびヒト組織の生検または血液由来試料に由来する非ヒト起源の核酸を用いるのみの特定治療法に対する応答可能性について、正確に診断または判定する方法を提供する。
【0013】
実施態様においては、本発明は、血液由来組織を用いて、転移性癌の存在および／または種類に関連する微生物存在または存在量（「シグニチャー」）のパターンを広範に作成する方法を提供する。次いで、ヒトにおいて転移性癌の存在および／または転移性癌の由来組織を診断する目的でこれらのシグニチャーを利用することができる。
【0014】
実施態様においては、本発明は、転移性腫瘍組織を用いて、転移性癌の由来組織に関連する微生物存在または存在量のパターンを広範に作成する方法を提供する。次いで、ヒトにおいて転移性癌の存在および／または転移性癌の由来組織を診断する目的でこれらのシグニチャーを利用することができる。
【0015】
実施態様においては、本発明は、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、これは以下を含む：
癌を有する対象の生体試料中に微生物存在を検出すること；
該微生物存在から汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
癌を有する１個体以上の対象から１つ以上の生体試料の微生物存在に対して除染微生物存在を比較し、それによって微生物／癌比較データセットを取得すること；
および
該微生物癌比較データセットから対象の転移性癌の存在またはその欠如を判定すること。
癌を有する対象の生体試料中に微生物存在を検出すること；
該微生物存在から汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
癌を有する１個体以上の対象から１つ以上の生体試料の微生物存在に対して除染微生物存在を比較し、それによって微生物／癌比較データセットを取得すること；
および
該微生物癌比較データセットから対象の転移性癌の存在またはその欠如を判定すること。
【0016】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該微生物癌比較データセットから対象の転移性癌の存在またはその欠如を判定することは、転移性癌の由来組織を同定することを含む。
【0017】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該微生物存在は微生物存在量をさらに含む。該微生物存在または存在量は、例えば、以下の非哺乳動物の生物種を含むのであってもよい：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0018】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該微生物存在または存在量は、生態学的ショットガンシーケンシング、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、免疫組織化学、インサイチューハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、宿主の全ゲノム配列決定、宿主トランスクリプトミクス配列決定、癌全ゲノム配列決定、癌のトランスクリプトミクス配列決定、またはそれらの任意の組み合わせによって測定される。
【0019】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該微生物存在または存在量は、以下の微生物由来核酸領域を増幅することによって測定される：１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９可変ドメイン領域、１８Ｓ ｒＲＮＡの転写される内部スペーサー（ＩＴＳ）領域、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0020】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該微生物存在または存在量は、微生物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする核酸測定によって検出され、ここで該微生物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする核酸測定は、対象の哺乳動物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせの測定と同時に行われる。
【0021】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0022】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該転移性癌は一癌種を含み、ここで該一癌種としては以下が挙げられる：肺癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、甲状腺癌、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0023】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該汚染微生物特徴量としては該微生物存在の分類群帰属が挙げられる。
【0024】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで汚染微生物特徴量を除去することは任意選択的であり、必ずしも必要とするものではない。
【0025】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで微生物／癌比較データセットを作成するために用いられる該比較の生体試料は、１種類以上の原発腫瘍、転移性腫瘍、またはそれらの任意の組み合わせを有する対象に由来する。
【0026】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該微生物／癌比較データセットは哺乳動物特徴量をさらに含み、ここで該哺乳動物特徴量としては以下が挙げられる：
腫瘍組織の免疫組織化学蛋白質マーカー、腫瘍組織ＤＮＡ、腫瘍組織ＲＮＡ、腫瘍組織メチル化パターン、無細胞腫瘍ＤＮＡ、無細胞腫瘍ＲＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＤＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＲＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡのメチル化パターン、無細胞腫瘍ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、またはそれらの任意の組み合わせ。
腫瘍組織の免疫組織化学蛋白質マーカー、腫瘍組織ＤＮＡ、腫瘍組織ＲＮＡ、腫瘍組織メチル化パターン、無細胞腫瘍ＤＮＡ、無細胞腫瘍ＲＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＤＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＲＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡのメチル化パターン、無細胞腫瘍ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0027】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象において転移性癌の存在またはその欠如を判定する方法を提供するが、ここで該生体試料としては、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。該生体試料は、全血の１種類以上の構成成分をさらに含むのであってもよく、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0028】
実施態様においては、本発明は、微生物存在に基づいて対象の転移性癌の治療を目的として治療を行う方法を提供するが、該治療は以下を含む：
癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
該除染微生物存在と対象に存在する転移性癌とを関連付けること；
および
該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連によって判定された該対象の治療を行うこと。
癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
該除染微生物存在と対象に存在する転移性癌とを関連付けること；
および
該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連によって判定された該対象の治療を行うこと。
【0029】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該微生物存在は、微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または存在量としては、以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0030】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該汚染微生物特徴量としては微生物存在の分類群帰属が挙げられる。
【0031】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去することは、任意選択的工程であり、該関連は検出した微生物存在と対象に存在する転移性癌との間の関連として取得するのであってもよい。
【0032】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該生体試料としては、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。該生体試料は、全血の１種類以上の構成成分をさらに含むのであってもよく、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0033】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない。
【0034】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0035】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0036】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該治療は、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む。該アジュバントは、例えば、抗生物質または抗菌剤であってもよい。
【0037】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該治療は転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである。該治療は標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含むものであってもよい。
【0038】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該治療は微生物存在に機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む。該治療は、２種類以上の治療種別をさらに含むのであってもよく、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別の少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する。
【0039】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、微生物存在に基づいて対象の転移性癌を治療することを目的として治療を行う方法を提供するが、ここで該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連は、該転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0040】
実施態様においては、本発明は、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、該システムは、１つ以上のプロセッサー；およびソフトウェアを含む持続性コンピューター可読保存媒体を含み；ここで該ソフトウェアは、実行の結果として、該コンピューターシステムの１つ以上のプロセッサーに以下を行わせる実行可能命令を含む：癌を有する対象の生体試料における１種類以上の核酸分子に関連する第１のデータを取得すること；該生体試料の１種類以上の核酸に関する第１のデータの非微生物核酸から微生物核酸を分離し、それによって第２のデータを判定すること；該第２のデータに基づいて、該微生物核酸の微生物存在を識別すること；該第２のデータから微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在の表を作成すること；該除染微生物存在の表を機械学習モデルに入力すること；および該転移性癌の存在または非存在を示す出力を機械学習モデルから受け取ること。実施態様においては、本発明は、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該システムはＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００機器を含む。該Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００機器は、該Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００機器が生成したデータにアクセスまたは処理することが可能な１種類以上のコンピューターシステムにアクセス可能なネットワーク記憶場所に、（例えば、ネットワーク接続によって）通信可能に接続されていてもよい。
【0041】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該微生物存在は微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または存在量は以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0042】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該システムは、該転移性癌の由来組織をさらに判定する。
【0043】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該除染微生物特徴量は微生物存在の分類群帰属を含む。
【0044】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで、汚染微生物特徴量を除去することは任意選択的である。
【0045】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで微生物ゲノムおよび非微生物ゲノムの参照データベースに対して１種類以上の核酸分子を整列化させることにより、該微生物核酸と非微生物核酸とを分離する。
【0046】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで参照ゲノムデータベースに対して該１種類以上の核酸分子を整列化させることなく、該微生物核酸と非微生物核酸とを分離する。
【0047】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該除染微生物存在の表は哺乳動物特徴量をさらに含み、ここで該哺乳動物特徴量としては以下が挙げられる：
腫瘍組織の免疫組織化学蛋白質マーカー、腫瘍組織ＤＮＡ、腫瘍組織ＲＮＡ、腫瘍組織メチル化パターン、無細胞腫瘍ＤＮＡ、無細胞腫瘍ＲＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＤＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＲＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡのメチル化パターン、無細胞腫瘍ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、またはそれらの任意の組み合わせ。
腫瘍組織の免疫組織化学蛋白質マーカー、腫瘍組織ＤＮＡ、腫瘍組織ＲＮＡ、腫瘍組織メチル化パターン、無細胞腫瘍ＤＮＡ、無細胞腫瘍ＲＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＤＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＲＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡのメチル化パターン、無細胞腫瘍ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0048】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように対象における転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0049】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該転移性癌は一癌種を含み、ここで該一癌種は、肺癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、甲状腺癌、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0050】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該生体試料は、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0051】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該生体試料は全血の構成成分を含み、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0052】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該機械学習モデルが、非転移性癌性組織と転移性癌性組織との間の識別または血液試料間の識別を行うように訓練される。
【0053】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで１種類以上の癌種を区別するように該機械学習モデルが訓練される。該１種類以上の癌種としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0054】
実施態様においては、本発明は、上記／下記のように、対象の転移性癌の存在または非存在を判定するように構成されるシステムを提供するが、ここで該出力は、該転移性癌の種類、由来組織、またはそれらの任意の組み合わせの表示をさらに含む。
【0055】
実施態様においては、本発明は、対象において転移性癌を広く診断する方法を提供するが、該方法は以下を含む：
対象の組織試料または血液試料中の微生物存在または存在量を検出すること；
検出した微生物存在または存在量が、転移が非存在なものから取得した１種類以上の正常組織試料の微生物存在または存在量とは異なることを判定すること；
および該検出した微生物存在または存在量を、転移性癌に関する公知の微生物存在または存在量と相関させ、それによって該転移性癌を診断すること。
対象の組織試料または血液試料中の微生物存在または存在量を検出すること；
検出した微生物存在または存在量が、転移が非存在なものから取得した１種類以上の正常組織試料の微生物存在または存在量とは異なることを判定すること；
および該検出した微生物存在または存在量を、転移性癌に関する公知の微生物存在または存在量と相関させ、それによって該転移性癌を診断すること。
【0056】
実施態様においては、本発明は、対象において転移性癌の由来組織を広く診断する方法を提供するが、該方法は以下を含む：
転移性癌を有する対象の組織試料または血液試料における微生物存在または存在量を検出すること；
検出した微生物存在または存在量が、以前に試験した原発腫瘍を有する対象の集団における微生物存在または存在量と類似であるか、あるいはそれと異なることを判定すること；
および
転移性癌の検出した微生物存在または存在量を最も類似した原発腫瘍の種類と相関させ、それによって該転移性癌の由来組織を診断すること。
転移性癌を有する対象の組織試料または血液試料における微生物存在または存在量を検出すること；
検出した微生物存在または存在量が、以前に試験した原発腫瘍を有する対象の集団における微生物存在または存在量と類似であるか、あるいはそれと異なることを判定すること；
および
転移性癌の検出した微生物存在または存在量を最も類似した原発腫瘍の種類と相関させ、それによって該転移性癌の由来組織を診断すること。
【0057】
実施態様においては、本発明は、対象の転移性癌の由来組織を診断する方法を提供するが、該方法は以下を含む：
対象の液体生検における微生物存在または存在量を検出すること；
検出した微生物存在または存在量が、健常対象および／または原発腫瘍を有する対象の集団の１つ以上の液体生検における微生物存在または存在量と類似であるか、あるいはそれと異なることを判定すること；
および
検出した微生物存在または存在量を、このコホートにおける最も類似した液体生検に相関させ、それによって該転移性癌の存在または非存在を診断し、もし存在する場合にはその由来組織を診断すること。
対象の液体生検における微生物存在または存在量を検出すること；
検出した微生物存在または存在量が、健常対象および／または原発腫瘍を有する対象の集団の１つ以上の液体生検における微生物存在または存在量と類似であるか、あるいはそれと異なることを判定すること；
および
検出した微生物存在または存在量を、このコホートにおける最も類似した液体生検に相関させ、それによって該転移性癌の存在または非存在を診断し、もし存在する場合にはその由来組織を診断すること。
【0058】
実施態様においては、本発明は、転移性癌の身体中の存在位置を診断する方法を提供するが、ここで該由来する位置は、骨（肉腫）、副腎、膀胱、脳、乳房、子宮頸部、胆のう、結腸、食道、頸部（頭頸部扁平上皮細胞癌）、腎臓、肝臓、肺、リンパ節（びまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫）、皮膚、卵巣、前立腺、直腸、胃、甲状腺、および子宮であり、ここで該対象はヒトである。
【0059】
実施態様においては、本発明は、転移性癌を診断する方法を提供するが、ここで該癌は、副腎皮質癌、膀胱癌、脳腫瘍（低悪性度の神経膠腫；膠芽細胞腫）、乳癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌（嫌色素性細胞；腎明細胞腎癌；乳頭細胞癌）、肝臓癌、肺癌（腺癌；扁平上皮細胞癌）、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、黒色腫（皮膚黒色腫、ぶどう膜黒色腫）、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌（甲状腺癌、胸腺腫）、および子宮癌であり、ここで該対象はヒトである。
【0060】
実施態様においては、本発明は、非ヒト特徴量を用いてヒト転移性癌の分子特徴量を予測する方法を提供するが、ここで該分子特徴量はヒト変異であり、ここで該非ヒト特徴量は、微生物存在または存在量である。
【0061】
実施態様においては、本発明は、対象が転移性癌についての特定治療に応答するか、あるいは応答しないかを予測する方法を提供するが、ここで該対象はヒトであり、ここで該治療は免疫療法であり、ここで該免疫療法はＰＤ－１阻害（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ）である。
【0062】
実施態様においては、本発明は、転移性癌を診断する方法を提供するが、該方法は、該疾患について取得した非ヒト特徴量または該転移性癌が由来すると同定した組織に基づいて対象の該転移性癌を治療することをさらに含み、ここで該対象はヒトであり、ここで該非ヒト特徴量は微生物存在または存在量である。
【0063】
実施態様においては、本発明は、転移性癌を診断する方法を提供するが、該方法は、その非ヒト特徴量に基づいて、該対象の転移性癌を治療するための新規の治療を設計することをさらに含み、ここで該非ヒト特徴量は微生物特徴量であり、ここで該対象はヒトである。
【0064】
実施態様においては、本発明は、転移性癌を診断する方法を提供するが、該方法はさらに、その非ヒト特徴量に基づいて、対象における癌のより早期のステージから癌を識別し、ここで該非ヒト特徴量は微生物特徴量であり、ここで該対象はヒトである。
【0065】
実施態様においては、以下のもののうちの１種類以上を用いて、該転移性癌に関連する非ヒト特徴量を標的とし、および活用するように、新規の治療を設計するのであってもよい：
低分子、ホルモン治療、生物製剤、工学的に改変した宿主由来細胞種、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、およびバクテリオファージ。
低分子、ホルモン治療、生物製剤、工学的に改変した宿主由来細胞種、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、およびバクテリオファージ。
【0066】
実施態様においては、本発明は、転移性癌を診断する方法を提供するが、該方法は、原発腫瘍がいつ転移するか、および／または該疾患がいつ治療に応答するかを示すために、その非ヒト特徴量を長期観察することをさらに含み、ここで該対象はヒトである。
【0067】
実施態様においては、本発明は、転移性癌組織または血液試料における微生物存在または存在量を測定し、それによって転移性癌および／またはその由来組織の診断が可能となるキットを提供する。
【0068】
実施態様においては、本発明は、転移性癌組織または血液試料における微生物存在または存在量を分析し、およびこの微生物存在または存在量に機械学習を応用し、それによって転移性癌および／またはその由来組織の診断を行うコンピューターシステムを提供する。
【0069】
実施態様においては、本発明は、機械学習アーキテクチャーに基づく診断モデルを利用する。
【0070】
実施態様においては、本発明は、正規化機械学習アーキテクチャーに基づく診断モデルを利用する。
【0071】
実施態様においては、本発明は、機械学習アーキテクチャーと連繋することに基づく診断モデルを利用する。
【0072】
実施態様においては、本発明は、特定の非ヒト特徴量を汚染物（「ノイズ」）として識別し、選択的に除去するが、その他の非ヒト特徴量は非汚染物（「シグナル」）として選択的に保持し、ここで非ヒト特徴量は微生物特徴量である。
【0073】
実施態様においては、本発明は、転移性癌を診断する方法を提供するが、ここで該微生物は、細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物の、および／またはファージ起源、またはそれらの任意の組み合わせである。
【0074】
実施態様においては、本発明は、転移性癌を診断する方法を提供するが、ここで微生物存在または存在量の情報のみの場合に比べてより良好な予測性能を有する診断モデルを作成する目的で、該微生物存在または存在量についての情報を、該対象および／または該対象の転移性癌に関する情報と組み合わせる；ここで該対象はヒトである。
【0075】
実施態様においては、該診断モデルは、以下のソースのうちの１種類以上の微生物存在または存在量に関する情報と組み合わせて、対象についての情報を利用する：
腫瘍組織の免疫組織化学蛋白質マーカー、腫瘍組織ＤＮＡ、腫瘍組織ＲＮＡ、腫瘍組織メチル化パターン、無細胞腫瘍ＤＮＡ、無細胞腫瘍ＲＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＤＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＲＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡのメチル化パターン、無細胞腫瘍ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡのメチル化パターン、または腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン。
腫瘍組織の免疫組織化学蛋白質マーカー、腫瘍組織ＤＮＡ、腫瘍組織ＲＮＡ、腫瘍組織メチル化パターン、無細胞腫瘍ＤＮＡ、無細胞腫瘍ＲＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＤＮＡ、エクソソーム由来腫瘍ＲＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡ、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡ、無細胞腫瘍ＤＮＡのメチル化パターン、無細胞腫瘍ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＤＮＡのメチル化パターン、または腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン、腫瘍細胞由来の循環ＲＮＡのメチル化パターン。
【0076】
実施態様においては、微生物存在または存在量を、以下の方法で検出する：
生態学的ショットガンシーケンシング、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、免疫組織化学、インサイチューハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、宿主の全ゲノム配列決定、宿主トランスクリプトミクス配列決定、癌全ゲノム配列決定、癌のトランスクリプトミクス配列決定、またはそれらの任意の組み合わせ；
および／またはここで微生物由来の以下の核酸領域のうちの１種類以上の増幅を用いて微生物存在または存在量を検出する：
１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、またはＶ９可変ドメイン領域；または１８Ｓ ｒＲＮＡの転写される内部スペーサー（ＩＴＳ）領域；
および／またはここで微生物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする核酸測定によって微生物存在または存在量を検出するが、ここで微生物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする該測定は、宿主ＤＮＡ、宿主ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせの測定と同時に行われる。
生態学的ショットガンシーケンシング、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、免疫組織化学、インサイチューハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、宿主の全ゲノム配列決定、宿主トランスクリプトミクス配列決定、癌全ゲノム配列決定、癌のトランスクリプトミクス配列決定、またはそれらの任意の組み合わせ；
および／またはここで微生物由来の以下の核酸領域のうちの１種類以上の増幅を用いて微生物存在または存在量を検出する：
１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、またはＶ９可変ドメイン領域；または１８Ｓ ｒＲＮＡの転写される内部スペーサー（ＩＴＳ）領域；
および／またはここで微生物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする核酸測定によって微生物存在または存在量を検出するが、ここで微生物のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする該測定は、宿主ＤＮＡ、宿主ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせの測定と同時に行われる。
【0077】
実施態様においては、以下の方法のうちの１種類以上によって、宿主の転移性癌組織における微生物の存在または非存在の空間的分布を測定する：
該腫瘍組織および／またはその微小環境のマルチサンプリング、免疫組織化学、インサイチューハイブリダイゼーション、デジタル空間ゲノム、デジタル空間トランスクリプトミクス、またはそれらの任意の組み合わせ。
該腫瘍組織および／またはその微小環境のマルチサンプリング、免疫組織化学、インサイチューハイブリダイゼーション、デジタル空間ゲノム、デジタル空間トランスクリプトミクス、またはそれらの任意の組み合わせ。
【0078】
実施態様においては、該微生物核酸を宿主の核酸と同時に検出し、次いで識別を行う。
【0079】
実施態様においては、組み合わせ核酸プールの測定（例えば、シーケンシング）前に、該対象の核酸を選択的に枯渇させ、該微生物核酸を選択的に保持するが、ここで該対象はヒトである。
【0080】
実施態様においては、組み合わせ核酸プールの測定（例えば、シーケンシング）前に、該微生物核酸を選択的に対象であるが、ここで該対象はヒトである。
【0081】
実施態様においては、微生物ゲノムおよび非微生物ゲノムの参照データベースに対して該核酸を整列化させることによって、該微生物核酸と該非微生物核酸を分離する。
【0082】
実施態様においては、参照ゲノムデータベースに対して該核酸を整列化させることなく、微生物酸と非微生物核酸とを分離する。
【0083】
実施態様においては、本発明は、血液、血液構成成分（例えば、血漿）、または組織生検である生体試料を提供するが、ここで該転移性組織生検は悪性または非悪性、またはそれらの任意の組み合わせである。
【0084】
実施態様においては、本発明は、液体生検である生体試料を提供する；該液体生検としては、血漿、尿、唾液、または涙、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
【0085】
実施態様においては、該対象の微生物叢の他の身体位置における微生物の存在または存在量を測定することによって、該転移性癌の微生物存在または存在量を推定するが、ここで該対象はヒトである。
【0086】
実施態様においては、該対象の生体試料における微生物の存在または存在量は同時に、該転移性癌の存在および該転移性癌の由来組織に関する情報として有益である。
【0087】
いくつかの実施態様においては、対象の転移性癌を治療する少なくとも７０％の治療効力を有する治療を決定する方法が本開示に記載されるが、該方法は以下を含む：
（ａ）転移性癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）該除染微生物存在と対象の転移性癌とを関連付けること；
および
（ｄ）該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連に基づいて、該対象の転移性癌を治療する少なくとも７０％の治療効力を有する治療を決定すること。いくつかの実施態様においては、該治療は少なくとも８０％または少なくとも９０％の治療効力を含む。いくつかの実施態様においては、該治療応答は、正の応答者、非応答者、有害応答者、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該微生物存在は微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または該微生物存在量は以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該汚染微生物特徴量としては、該微生物存在の分類群帰属が挙げられる。いくつかの実施態様においては、工程（ｂ）が省略される。いくつかの実施態様においては、該生体試料は、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該生体試料は１種類以上の全血の構成成分を含み、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない。いくつかの実施態様においては、該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該治療は、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む。いくつかの実施態様においては、該アジュバントは抗生物質または抗菌剤である。いくつかの実施態様においては、該治療は転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである。いくつかの実施態様においては、該治療は標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該治療は該微生物存在の機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む。いくつかの実施態様においては、該治療は２種類以上の治療種別を含み、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別のうちの少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する。いくつかの実施態様においては、該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連は、該転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
（ａ）転移性癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）該除染微生物存在と対象の転移性癌とを関連付けること；
および
（ｄ）該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連に基づいて、該対象の転移性癌を治療する少なくとも７０％の治療効力を有する治療を決定すること。いくつかの実施態様においては、該治療は少なくとも８０％または少なくとも９０％の治療効力を含む。いくつかの実施態様においては、該治療応答は、正の応答者、非応答者、有害応答者、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該微生物存在は微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または該微生物存在量は以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該汚染微生物特徴量としては、該微生物存在の分類群帰属が挙げられる。いくつかの実施態様においては、工程（ｂ）が省略される。いくつかの実施態様においては、該生体試料は、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該生体試料は１種類以上の全血の構成成分を含み、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない。いくつかの実施態様においては、該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該治療は、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む。いくつかの実施態様においては、該アジュバントは抗生物質または抗菌剤である。いくつかの実施態様においては、該治療は転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである。いくつかの実施態様においては、該治療は標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該治療は該微生物存在の機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む。いくつかの実施態様においては、該治療は２種類以上の治療種別を含み、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別のうちの少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する。いくつかの実施態様においては、該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連は、該転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0088】
いくつかの実施態様においては、対象の転移性癌の治療応答を予測する方法が本開示に記載されるが、該方法は以下を含む：
（ａ）転移性癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）該除染微生物存在と対象の転移性癌とを関連付けること；
および
（ｄ）該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連に基づいて、該対象の転移性癌の治療応答を予測すること。いくつかの実施態様においては、該治療応答は、正の応答者、非応答者、有害応答者、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該微生物存在は微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または該微生物存在量は以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該汚染微生物特徴量としては、該微生物存在の分類群帰属が挙げられる。いくつかの実施態様においては、工程（ｂ）が省略される。いくつかの実施態様においては、該生体試料は、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該生体試料は１種類以上の全血の構成成分を含み、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない。いくつかの実施態様においては、該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該治療は、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む。いくつかの実施態様においては、該アジュバントは抗生物質または抗菌剤である。いくつかの実施態様においては、該治療は転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである。いくつかの実施態様においては、該治療は、標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該治療は該微生物存在の機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む。いくつかの実施態様においては、該治療は２種類以上の治療種別を含み、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別のうちの少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する。いくつかの実施態様においては、該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連は、該転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
（ａ）転移性癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）該除染微生物存在と対象の転移性癌とを関連付けること；
および
（ｄ）該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連に基づいて、該対象の転移性癌の治療応答を予測すること。いくつかの実施態様においては、該治療応答は、正の応答者、非応答者、有害応答者、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該微生物存在は微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または該微生物存在量は以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該汚染微生物特徴量としては、該微生物存在の分類群帰属が挙げられる。いくつかの実施態様においては、工程（ｂ）が省略される。いくつかの実施態様においては、該生体試料は、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該生体試料は１種類以上の全血の構成成分を含み、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない。いくつかの実施態様においては、該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該治療は、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む。いくつかの実施態様においては、該アジュバントは抗生物質または抗菌剤である。いくつかの実施態様においては、該治療は転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである。いくつかの実施態様においては、該治療は、標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該治療は該微生物存在の機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む。いくつかの実施態様においては、該治療は２種類以上の治療種別を含み、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別のうちの少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する。いくつかの実施態様においては、該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連は、該転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0089】
いくつかの実施態様においては、対象の転移性癌の治療経過中に措置を判断する方法が本開示に記載されるが、該方法は以下を含む：
（ａ）転移性癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）該除染微生物存在と対象の転移性癌とを関連付けること；
および
（ｄ）該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連に基づいて、該対象の転移性癌の治療経過中に措置を判断すること。いくつかの実施態様においては、該作用は該対象における転移性癌の治療を中止、開始、または休止することを含む。いくつかの実施態様においては、該微生物存在は微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または該微生物存在量は以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該汚染微生物特徴量としては、該微生物存在の分類群帰属が挙げられる。いくつかの実施態様においては、工程（ｂ）が省略される。いくつかの実施態様においては、該生体試料は、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該生体試料は１種類以上の全血の構成成分を含み、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない。いくつかの実施態様においては、該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該治療は、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む。いくつかの実施態様においては、該アジュバントは抗生物質または抗菌剤である。いくつかの実施態様においては、該治療は転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである。いくつかの実施態様においては、該治療は標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該治療は該微生物存在の機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む。いくつかの実施態様においては、該治療は２種類以上の治療種別を含み、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別のうちの少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する。いくつかの実施態様においては、該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連は、該転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
（ａ）転移性癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）該除染微生物存在と対象の転移性癌とを関連付けること；
および
（ｄ）該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連に基づいて、該対象の転移性癌の治療経過中に措置を判断すること。いくつかの実施態様においては、該作用は該対象における転移性癌の治療を中止、開始、または休止することを含む。いくつかの実施態様においては、該微生物存在は微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または該微生物存在量は以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該汚染微生物特徴量としては、該微生物存在の分類群帰属が挙げられる。いくつかの実施態様においては、工程（ｂ）が省略される。いくつかの実施態様においては、該生体試料は、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該生体試料は１種類以上の全血の構成成分を含み、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない。いくつかの実施態様においては、該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該治療は、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む。いくつかの実施態様においては、該アジュバントは抗生物質または抗菌剤である。いくつかの実施態様においては、該治療は転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである。いくつかの実施態様においては、該治療は標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該治療は該微生物存在の機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む。いくつかの実施態様においては、該治療は２種類以上の治療種別を含み、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別のうちの少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する。いくつかの実施態様においては、該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連は、該転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0090】
いくつかの実施態様においては、対象の転移性癌を治療することを目的として治療法を創出する方法が本開示に記載されるが、該方法は以下を含む：
（ａ）転移性癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）該除染微生物存在と対象の転移性癌とを関連付けること；
および
（ｄ）該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連に基づいて、該対象の転移性癌を治療することを目的として治療法を創出すること。いくつかの実施態様においては、該微生物存在は微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または該微生物存在量は以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該汚染微生物特徴量としては、該微生物存在の分類群帰属が挙げられる。いくつかの実施態様においては、工程（ｂ）が省略される。いくつかの実施態様においては、該生体試料は、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該生体試料は１種類以上の全血の構成成分を含み、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない。いくつかの実施態様においては、該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該治療は、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む。いくつかの実施態様においては、該アジュバントは抗生物質または抗菌剤である。いくつかの実施態様においては、該治療は転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである。いくつかの実施態様においては、該治療は標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該治療は該微生物存在の機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む。いくつかの実施態様においては、該治療は２種類以上の治療種別を含み、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別のうちの少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する。いくつかの実施態様においては、該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連は、該転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
（ａ）転移性癌を有する対象の生体試料における微生物存在を検出すること；
（ｂ）該微生物存在の汚染微生物特徴量を除去し、それによって除染微生物存在を取得すること；
（ｃ）該除染微生物存在と対象の転移性癌とを関連付けること；
および
（ｄ）該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連に基づいて、該対象の転移性癌を治療することを目的として治療法を創出すること。いくつかの実施態様においては、該微生物存在は微生物存在量をさらに含み、ここで該微生物存在または該微生物存在量は以下の非哺乳動物の生物種を含む：細菌、真菌、ウイルス、古細菌、原生動物、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該汚染微生物特徴量としては、該微生物存在の分類群帰属が挙げられる。いくつかの実施態様においては、工程（ｂ）が省略される。いくつかの実施態様においては、該生体試料は、組織試料、液体生検、全血生検、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該生体試料は１種類以上の全血の構成成分を含み、その構成成分としては、血漿、白血球、赤血球、血小板、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該治療は該除染微生物存在によって代謝を受けることがなく、また不活性化状態になることもない。いくつかの実施態様においては、該治療としては、低分子、ホルモン療法、生物学的、工学的に改変した宿主由来細胞の１種類または複数種類、プロバイオティクス、工学的に改変した細菌、天然であるが選択的なウイルス、工学的に改変したウイルス、バクテリオファージ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該転移性癌としては以下が挙げられる：
急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、低悪性度の脳神経膠腫、浸潤性乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌、胆管癌、結腸腺癌、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、中皮腫、漿液性卵巣嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、胸腺腫、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌、ぶどう膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施態様においては、該治療は、該転移性癌に対する一次治療の効力を改善する目的で、該一次治療と組み合わせて投与するアジュバントを含む。いくつかの実施態様においては、該アジュバントは抗生物質または抗菌剤である。いくつかの実施態様においては、該治療は転移性癌または転移性癌の環境に関連する微生物構成要素あるいは抗原に基づくものである。いくつかの実施態様においては、該治療は標的微生物抗原に対する養子細胞移植、微生物抗原に対する癌ワクチン、微生物抗原に対するモノクローナル抗体、少なくとも部分的に微生物抗原を標的とするように設計した抗体／薬剤複合体、少なくとも部分的に１種類以上の微生物抗原を標的とするように設計した多価抗体、その抗体断片、その抗体誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、該治療は該微生物存在の機能的または生物学的に類似の微生物クラスを標的とする抗生物質を含む。いくつかの実施態様においては、該治療は２種類以上の治療種別を含み、ここで治療効力を増強する目的において、該２種類以上の治療種別を組み合わせ、該２種類以上の治療種別のうちの少なくとも１種類が、該転移性癌または該転移性癌環境に関連する微生物存在または存在量を利用する。いくつかの実施態様においては、該除染微生物存在と該転移性癌との間の関連は、該転移性癌の由来、種類、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0091】
【図1】１８個体の対象において、その組織微生物叢に基づき転移性乳癌および転移性甲状腺癌組織試料を識別し、それによって由来する原発腫瘍を診断する（転移性癌はその由来組織に基づいて命名されるので）、ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ（１サンプルのみをテストセットにとり、他のサンプルを訓練データとする）相互検証（ＬＯＯＣＶ）を機械学習の結果示す。
【図2】５５９個体の対象に由来する血液内微生物ＤＮＡを用い、転移性癌を非転移性癌に対して予測する分析を示す。
【図3】１５個体の対象に由来する血液の微生物ＤＮＡを用いた、転移性黒色腫と他の転移性癌種との間の識別を示す。図３において「他の転移性癌種」という表現で示されている試料は、乳癌（２試料）、転移性甲状腺癌（２試料）、および転移性食道癌（１試料）を含む。様々な実施態様においては、充分な数を試験するために、これらの癌種および／またはその他の組み合わせのものを組み合わせるのであってもよい。
【図4-1】微生物検出パイプラインによって同定した全シーケンシングリードの比率（％）およびＫｒａｋｅｎによるＴＣＧＡデータセットを属レベルで分類したものを示すロリポッププロットである。ＬＡＭＬ、急性骨髄性白血病；ＰＡＡＤ、膵臓腺癌；ＧＢＭ、多形性膠芽腫；ＰＲＡＤ、前立腺腺癌；ＥＳＣＡ、食道癌；ＴＣＧＴ、精巣生殖細胞腫瘍；ＢＲＣＡ、浸潤性乳癌；ＴＨＣＡ、甲状腺癌；ＫＩＣＨ、色素嫌性腎癌；ＴＨＹＭ、胸腺腫；ＲＥＡＤ、直腸腺癌；ＳＡＲＣ、肉腫；ＵＶＭ、ぶどう膜黒色腫；ＣＨＯＬ、胆管癌；ＡＣＣ、副腎皮質癌；ＵＣＥＣ、子宮体部内膜癌；ＬＵＳＣ、肺扁平上皮細胞癌；ＰＣＰＧ、褐色細胞腫および傍神経節腫；ＢＬＣＡ、膀胱尿路上皮癌；ＵＣＳ、子宮癌肉腫；ＬＧＧ、低悪性度の脳神経膠腫（図４ａ）。全ての癌種に含まれる試料総数は１７，６２５である。図４ｂは、品質管理処理および残りの試料数を示すコンソート（ＣＯＮＳＯＲＴ）型の図を示している。ＦＦＰＥ、ホルマリン固定パラフィン包埋。図４ｃは、Ｖｏｏｍ正規化データの主成分分析を示す（ＰＣＡ）；癌微生物叢試料をシーケンシングセンター毎に色分けした。図４ｄは、Ｖｏｏｍ－ＳＮＭデータのＰＣＡを示す。
【図4-2】図４ｅは、分類学的カウント生データ、Ｖｏｏｍ正規化データ、およびＶｏｏｍ－ＳＮＭデータの分散主成分分析を示す。図４ｆ～ｈは、グレースケール／赤色（高）からグレースケール／青色（低）までの分類器の性能測評価指標（ＡＵＲＯＣ（ＲＯＣ）およびＡＵＰＲ（ＰＲ））のヒートマップを示す；ＴＣＧＡ原発腫瘍間の識別（図４ｆ）；腫瘍と正常試料との間の識別（図４ｇ）；およびステージＩとステージＩＶの癌の間の識別（図４ｈ）。「ＮＡ」は、モデル訓練に関していずれのＭＬクラスでも利用可能な試料が充分ではない（例えば、２０未満）ことを示している。
【図5】少なくとも一つの実施態様にしたがうＴＣＧＡ癌微生物叢データセット内のウイルスリードおよび細菌リードの生態学的検証を示す。図５ａは、ＨＭＰ２データセットについて訓練を行ったＳｏｕｒｃｅ Ｔｒａｃｋｅｒ２を用いた、ＣＯＡＤ患者（ｎ＝７０）の固形組織正常試料に関する平均的な身体部位帰属を示す。図５ｂは、フゾバクテリウム属の複数菌種に関連する通常の消化管（ＧＩ）癌についての、フゾバクテリウム属の識別的存在量を表す。ＢＤＮ、正常に由来する血液；ＳＴＮ、固形組織正常；ＰＴ、原発腫瘍。図５ｃは、群化ＧＩ癌（ｎ＝８：ＣＯＡＤ、ＲＥＡＤ、ＣＨＯＬ、ＬＩＨＣ、ＰＡＡＤ、ＨＮＳＣ、ＥＳＣＡ、ＳＴＡＤ；略語については、図８ａを参照のこと）および非ＧＩ癌（ｎ＝２４）におけるフゾバクテリウム属の識別的存在量を示す（「方法」を参照のこと）。図５ｄ～ｅは、ＣＥＳＣ（図５ｄ）またはＨＮＳＣ（図５ｅ）を有するＨＰＶ感染患者（ＴＣＧＡにおいて、そのような臨床的記載が含まれている）についての正規化ＨＰＶ存在量を示す。ＩＳＨ、インサイチューハイブリダイゼーション；ＩＨＣ、免疫組織化学。図５ｆは、ＬＩＨＣ患者におけるオルソヘパドナウイルスの正規化存在量を示す（臨床的判定リスク要因：ＨｅｐＢ、Ｂ型肝炎感染前；ＥｔＯＨ、大量のアルコール摂取；ＨｅｐＣ、Ｃ型肝炎感染前）。図５ｇは、ＳＴＡＤの包括的分子サブタイプにおけるＥＢＶの正規化存在量を示す：ＣＩＮ、染色体不安定性；ＧＳ、安定なゲノム；ＭＳＩ、不安定マイクロサテライト；ＥＢＶ、ＥＢウイルス感染試料。すべてのパネルにおいて、血液由来正常データおよび／または固形組織正常データを比較陰性対照として示している；３つ以上の比較では、多重検定補正と共に両側マン＝ホイットニーＵ検定を用いた；ボックスプロットは、中央値を示す（直線）、第一四分位数および第三四分位数（四角）、および１．５×四分位範囲（ＩＱＲ、ヒゲ）。グレースケール／青色の数は、各群のサンプルサイズを表している。
【図6】癌「液体」生検の補完的診断アプローチとして、血液のｍｂＤＮＡを利用した癌識別の分類器性能を示す。図６ａは、血液ｍｂＤＮＡを用いて１癌種を残り全ての癌種に対して予測する、図４ｆ～ｈに類似するモデル性能ヒートマップを示す（ＴＣＧＡ試験のＩＤを右側に示す（図８ａ））；各ＭＬ少数クラスが適格性を有するためには、少なくとも２０試料が必要である。図６ｂは、血液ｍｂＤＮＡを用いた、ステージＩａ～ＩＩｃ癌についての１癌種を残り全ての癌種に対して予測するＭＬモデルの性能を示す。図６ｃ～ｄは、検出可能な原発腫瘍ゲノム変化を有していない患者の血液ｍｂＤＮＡを用いた、ＭＬモデル性能を示す（Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０（図６ｃ）およびＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ液体（図６ｄ）ｃｔＤＮＡアッセイによる）。ＦＤ、完全データ；ＬＣＲ、シーケンシングセンターで、汚染の可能性の高い混入物が除外されている；ＡＰＣＲ、シーケンシングセンターで、全推定汚染物が除外されている；ＰＣＣＲ、除外されたプレート／センター汚染物；ＭＳＦ、シーケンシングセンターで最も厳格なフィルタリング。各比較の性能を評価するために含めた試料の数は、ｃａｎｃｅｒｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ＣａｎｃｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ＿ＤａｔａＢｒｏｗｓｅｒのデータブラウザー混同行列に示されている。
【図7-1】血漿由来無細胞ｍｂＤＮＡを用いた、癌種と健常対照との間の識別に関するＭＬモデルの性能を示す。図７ａは、検証試験における分析試料の人口構成。全ての患者が複数亜種の高悪性度（ステージＩＩＩ～ＩＶ）癌を有しており、ＰＣ群、ＬＣ群、およびＳＫＣＭ群を形成した。図７ｂは、非癌健常対照（ｎ＝６９）から群化癌試料（ｎ＝１００）を識別するブートストラップ処理性能推定値を示す。異なる訓練／試験分割部分（７０％訓練／３０％試験）で５００反復後のＲＯＣ（ｔｏｐ）およびＰＲ（ｂｏｔｔｏｍ）曲線データのラスター化密度プロット。
【図7-2】図７ｃ～ｈは、２クラス間でのｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ（１サンプルのみをテストセットにとり、他のサンプルを訓練データとする）（ＬＯＯ）反復ＭＬ性能を示す：前立腺癌（ＰＣ）対対照（Ｃｔｒｌ；図７ｃ）；肺癌（ＬＣ）対対照（図７ｄ）；黒色腫（ＳＫＣＭ）対対照（図７ｅ）；ＰＣ対ＬＣ（図７ｆ）、ＬＣ対ＳＫＣＭ（図７ｇ）；およびＰＣ対ＳＫＣＭ（図７ｈ）。
【図7-3】図７ｉ～ｋは、種別間（図７ｉ）および混成癌患者と健常対照個体との間（それぞれ、図７ｊおよび図７ｋ）での識別に関するマルチクラス（ｎ＝３または４）ＬＯＯ反復ＭＬ性能を示す。全体的なＬＯＯ ＭＬ性能を、１対残り全てを比較する性能の平均として算出した（混同行列の下に示す）。
【図8-1】ＴＣＧＡ癌微生物叢の概要を連続的に示したものである。図８ａは、ＴＣＧＡ試験の略語の表を示す。図８ｂは、Ｖｏｏｍ正規化データのＰＣＡを示すものであるが、ここでグレースケール／カラーは試料のシーケンシングプラットフォームを表し、各点は癌微生物叢の試料を表す。図８ｃは、シーケンシングプラットフォームと表示されていることからも分かるように、連続的なＶｏｏｍ－ＳＮＭ教師あり正規化後のデータのＰＣＡを表す。図８ｄは、Ｖｏｏｍ正規化データのＰＣＡを示すが、ここでグレースケール／カラーは試料の実験的方略を表し、各点は癌微生物叢の試料を表す。図８ｅは、実験的方略と表示されていることからもわかるように、連続的なＶｏｏｍ－ＳＮＭ教師あり正規化後のデータのＰＣＡを表している。
【図8-2】図８ｆ～ｇは、メタデータ品質管理（図４ｂ）後、ＴＣＧＡにおける全癌種にわたり所定の試料種別内で試料量によって正規化した微生物リードカウントを表す；これらは、論文で分析した３種類の主要な試料種別（図８ｆ）および残りの試料種別（図８ｇ）を含む。ＡＮＰ、追加の新規原発腫瘍；ＡＭ、追加の転移性腫瘍；ＭＭ、転移性腫瘍；ＲＴ、再発性腫瘍。生データおよび正規化データのＰＣＡについては、ｎ＝１７，６２５。
【図9-1】微生物存在量を用いた、癌のＴＣＧＡ種別間および種別内での識別性能評価指標を示す。図９ａ～ｆは、図４ｆ～ｈにおけるヒートマップからの例を示している。グレースケール／カラー勾配（上部）は、ＲＯＣ曲線およびＰＲ曲線上のいずれかの点における確率閾値を表す。挿入図の混同行列は５０％確率閾値カットオフを用いた場合のものであり、ＲＯＣ曲線およびＰＲ曲線上の対応する点における感度、特異度、性化率、再現率、陽性予測値率、陰性予測値率などを算出するために利用できる。
【図9-2】図９ｇ～ｈは、１癌種対残り全ての様式で、少数クラスのサイズの関数として癌種間の識別を行う場合の、モデル性能、具体的には、ＡＵＲＯＣ（図９ｇ）およびＡＵＰＲ（図９ｈ）の線形回帰を示す。原発腫瘍に検出された微生物を用いたモデルの性能を、最大サンプル数（ｎ＝１３，８８３）および比較する癌種（ｎ＝３２）と共に示している。ＡＵＲＯＣおよびＡＵＰＲは、［０，１］のドメインおよび２０から１，２３８試料の間で変化する少数クラスサイズを有するので、後者はｌｏｇ１０スケールで回帰する。挿入図の仮説検定および関連するＰ値は、従属変数と独立変数との間に関連性がないゼロ仮説に基づくものである（勾配の両側仮説検定）。各比較の性能を評価するために含めた試料の数は、ｃａｎｃｅｒｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ＣａｎｃｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ＿ＤａｔａＢｒｏｗｓｅｒのデータブラウザー混同行列に示されている。
【図10-1】ＭＬモデルパイプラインの内部検証を示す。図１０ａは、ＴＣＧＡ微生物カウント生データの２つの独立した半分を示すが、これらは正規化し、腫瘍微生物のＤＮＡおよびＲＮＡを用いて１癌種を残り全ての癌種に対して予測するモデルの訓練に用いたものである；次いで、各モデルを他の半分の正規化データに当てはめた。このヒートマップでは、完全データセットの５０％／５０％分割部分での訓練および試験に対して比較を行った、これらのモデルの性能を比較するものである（分割部分１：ｎ＝８，８１４試料；分割部分２：ｎ＝８，８１１試料；全試料：ｎ＝１７，６２５）。図１０ｂ～ｃは、１癌種を残り全癌種に対して予測するために、完全Ｖｏｏｍ－ＳＮＭデータを、複数のシーケンシングセンターにわたる原発腫瘍ＲＮＡ試料（ｎ＝１１，７４１）でサブセットとする場合のモデル性能比較を示す（図１０ｂ、ＡＵＲＯＣ；図１０ｃ、ＡＵＰＲ）。
【図10-2】図１０ｄ～ｅは、１癌種を残り全癌種に対して予測するために、完全Ｖｏｏｍ－ＳＮＭデータを、複数のシーケンシングセンターにわたる原発腫瘍ＤＮＡ試料（ｎ＝２，１４２）でサブセットとする場合のモデル性能比較を示す（図１０ｄ、ＡＵＲＯＣ；図１０ｅ、ＡＵＰＲ）。図１０ｆ～ｇは、原発腫瘍ＲＮＡ試料を用いて１癌種を残り全癌種に対して予測するために、完全Ｖｏｏｍ－ＳＮＭデータを、ＲＮＡ－ｓｅｑのみを行ったＵＮＣの試料（ｎ＝９，７２６）でサブセットとする場合のモデル性能比較を表す（図１０ｆ、ＡＵＲＯＣ；図１０ｇ、ＡＵＰＲ）。図１０ｈ～ｉは、原発腫瘍ＤＮＡ試料を用いて１癌種を残り全癌種に対して予測するために、完全Ｖｏｏｍ－ＳＮＭデータを、ＨＭＳの試料（ｎ＝８９８）でサブセットとする場合のモデル性能比較を示す（図１０ｈ、ＡＵＲＯＣ；図１０ｉ、ＡＵＰＲ）。図１０ｂ～ｉは、一般化線型モデルを示す；標準誤差を灰色で表す；点線の対角線は完全線形関係を表す；サンプルサイズについては、１３，８８３原発腫瘍試料が完全Ｖｏｏｍ－ＳＮＭデータセットに含まれる。
【図11-1】Ｋｒａｋｅｎに基づくＴＣＧＡ癌微生物叢プロファイルおよびそれらのＭＬ性能の直交検証を示す。図１１ａ～ｈは、４種類のＴＣＧＡ癌（ＣＥＳＣ、ｎ＝１４２（ＤＮＡ）およびｎ＝３０９（ＲＮＡ）；ＳＴＡＤ、ｎ＝３２２（ＤＮＡ）およびｎ＝７７０（ＲＮＡ）；ＬＵＡＤ、ｎ＝３５１（ＤＮＡ）およびｎ＝６００（ＲＮＡ）；ならびにＯＶ、ｎ＝１８９（ＤＮＡ）およびｎ＝８５０（ＲＮＡ））を示す；これら癌の種別については、Ｋｒａｋｅｎ分類帰属後に、腫瘍微生物のＤＮＡおよびＲＮＡを用いた直接的ゲノム整列（ＢＷＡ）によって、さらなるフィルタリングを行った。正規化し、ＢＷＡフィルタリングを行ったデータ、および整合化し、独立に正規化したＫｒａｋｅｎデータの間で、以下についてＭＬ性能比較を行った：すなわち、原発腫瘍微生物を用いた１癌種を残りの全癌種に対して識別（図１１ａ、ＡＵＲＯＣ；図１１ｂ、ＡＵＰＲ）；腫瘍を正常に対して識別（図１１ｃ、ＡＵＲＯＣ；図１１ｄ、ＡＵＰＲ）；原発腫瘍微生物を用いて、ステージＩ腫瘍をステージＩＶ腫瘍に対して識別（図１１ｅ、ＡＵＲＯＣ；図１１ｆ、ＡＵＰＲ）；および血液由来微生物を用いて、１癌種を残りの全癌種に対して識別（図１１ｇ、ＡＵＲＯＣ；図１１ｈ、ＡＵＰＲ）（「方法」を参照のこと）。
【図11-2】図１１ｉは、ＢＷＡふるい分けデータとＫｒａｋｅｎ全データとの間の分類群カウントのＶｅｎｎ図を示す。図１１ｊ～ｔは、異なるデータベースを利用するＳＨＯＧＵＮとよぶ直交微生物検出パイプラインを示す；Ｖｏｏｍ－ＳＮＭで正規化したＴＣＧＡ試料のサブセット（ｎ＝全１３，５１７試料）であって、そのＫｒａｋｅｎ対応物に類似するサブセットについてＳＨＯＧＵＮ処理を行い、この処理データを下流ＭＬ分析に用いた。図１１ｊは、ＳＨＯＧＵＮに基づく微生物分類群（Ｓ）およびＫｒａｋｅｎに基づく微生物分類群（Ｋ）のＶｅｎｎ図である。ＳＨＯＧＵＮデータベースはウイルスを含まないが、Ｋｒａｋｅｎデータベースはウイルスを含むことに留意されたい。図１１ｋ～ｌは、Ｖｏｏｍ正規化ＳＨＯＧＵＮデータのＰＣＡ（図１１ｋ）およびＶｏｏｍ－ＳＮＭ（図１１ｌ）正規化ＳＨＯＧＵＮデータを示す；シーケンシングセンターに応じたグレースケール／カラー表示となっている。
【図11-3】図１１ｍ～ｔは、同一の７０％／３０％分割部分を用い、ＳＨＯＧＵＮデータおよび整合化Ｋｒａｋｅｎデータについて訓練および試験したモデル間で、以下に関して行ったＭＬ性能比較を示す：すなわち、原発腫瘍微生物を用いて、１癌種を残りの全癌種に対して識別（図１１ｍ、ＡＵＲＯＣ；図１１ｎ、ＡＵＰＲ）；腫瘍を対正常に対して識別（図１１ｏ、ＡＵＲＯＣ；図１１ｐ、ＡＵＰＲ）；原発腫瘍微生物を用いて、ステージＩ腫瘍をステージＩＶ腫瘍に対して識別（図１１ｑ、ＡＵＲＯＣ；図１１ｒ、ＡＵＰＲ）；および血液由来微生物を用い、１癌種を残りの全癌種に対して識別（図１１ｓ、ＡＵＲＯＣ；図１１ｔ、ＡＵＰＲ）。公正な比較では、整合化Ｋｒａｋｅｎデータは、Ｋｒａｋｅｎカウント生データから全ウイルス帰属を除去し、ＳＨＯＧＵＮで分析した同一のＴＣＧＡ１３，５１７試料をサブセットとして取得したものである；次いで、ＳＨＯＧＵＮデータ（「方法」を参照のこと）の場合と同じ方法で、これらの整合化Ｋｒａｋｅｎデータを独立にＶｏｏｍ－ＳＮＭによって正規化してから、下流ＭＬパイプラインに送った。全ＭＬ性能に関して、各クラスが適格性を有するためには、２０試料以上を必要とした。回帰サブ図に関して、点線の対角線は完璧な性能に相当することを示すものである；一般化線形モデルを標準誤差リボン付きで示している。
【図12】汎癌微生物存在量、ならびにＴＣＧＡ癌微生物叢プロファイリングおよびＭＬモデル検査に関するインタラクティブなウェブサイトを示す。図１２ａは、フゾバクテリウム属の汎癌正規化存在量を示すが、試料種別毎の癌種にわたる微生物存在量について一元配置分散分析（クラスカル＝ウォリス）検定を行ったものである。サンプルサイズはグレースケール／青色の挿入図であり、ボックスプロットは、中央値を示す（直線）、第一四分位数および第三四分位数（四角）、および１．５×四分位範囲（ＩＱＲ、ヒゲ）；ＴＣＧＡ試験の略語が下部のリストに示されており、また図８ａにおいて定義されている。図１２ｂは、ＴＣＧＡ－ＣＯＡＤ固形組織の正常試料（ｎ＝７０）およびＴＣＧＡＳＫＣＭ原発腫瘍試料（ｎ＝１２２）について、ＨＭＰ２データに基づくものとして、糞便の影響に関するＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒ２の結果を示している。ＴＣＧＡ－ＳＫＣＭ（補足表４）については、１つの固形組織正常試料のみしか利用できなかったので、代わりに、予想される皮膚微生物叢の最良の代替として原発腫瘍を用いた。結腸試料は皮膚よりもより大きな糞便寄与を有するはずであると予想されるので、片側マン＝ホイットニーＵ検定を用いた。ＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒ２は、各ソース（すなわち、ＨＭＰ２）の各シンク（すなわち、ＣＯＡＤ試料、ＳＫＣＭ試料）に対する平均分率的寄与を出力するので、各バープロットの中心値はこれらの値の平均値であり、誤差棒は標準誤差を表す。サンプルサイズを下部にグレースケール／青色で示す。図１２ｃは、アルファパピローマウイルスの汎癌正規化存在量を示すが、試料種別毎の癌種にわたる微生物存在量について一元配置分散分析（クラスカル＝ウォリス）検定を行ったものである。サンプルサイズはグレースケール／青色の挿入図；ボックスプロットは、中央値を示す（直線）、第一四分位数および第三四分位数（四角）、および１．５×四分位範囲（ＩＱＲ、ヒゲ）；ＴＣＧＡ試験の略語が下部のリストに示されており、また図８ａにおいて定義されている。ＨＰＶ感染について患者の臨床的検査を行ったＴＣＧＡ試験を、陰性群および陽性群に分割する。図１２ｄは、Ｋｒａｋｅｎに基づくデータを用いてアルファパピローマウイルスで正規化した微生物存在量のプロットを表示するインタラクティブなウェブサイトのスクリーンショットを示す。そのウェブサイトの別タブにおいて、ＳＨＯＧＵＮに基づく正規化微生物存在量を用いたプロットが利用可能である（左側）。図１２ｅは、ＭＬモデル検査のインタラクティブなウェブサイトについてのスクリーンショットを表す。データの種類（例えば、除去した全ての汚染と考えられる混入物）、癌の種類（例えば、浸潤性乳癌）、および目的とする比較（例えば、腫瘍対正常）の選択によって、ＲＯＣ曲線およびＰＲ曲線ならびに（５０％の確率カットオフ閾値を用いて）混同行列およびランク付けモデル特徴量のリストが自動的に更新される。ウェブサイトは、ｃａｎｃｅｒｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ＣａｎｃｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ＿ＤａｔａＢｒｏｗｓｅｒでアクセス可能である。
【図13-1】癌微生物叢のデータに関する結果、利点、および制約と共に除染アプローチについて示している。図１３ａは、汚染源の評価、軽減、除去および／またはシミュレーションのために用いる様々なアプローチを示す。図１３ｂは、様々なレベルで除染を行った後に、ＴＣＧＡにおいて残った分類群または微生物リードの割合を示す。シーケンシングセンターについての除染によって、いずれか１か所のシーケンシングセンター（ｎ＝８バッチ）において汚染と同定した全ての分類群が除外された；プレート／センターの組み合わせについての除染では、１０種類超のＴＣＧＡ試料を含むいずれかの単一シーケンシングプレート（ｎ＝３５１バッチ）において汚染と同定した全ての分類群が除外された。
【図13-2】図１３ｃ～ｆは、以下に関する身体部位帰属の予測を示す：汚染物の可能性のあるものを除染したデータセット（図１３ｃ）、プレート／センター除染データセット（図１３ｄ）、全ての推定汚染物を除外したデータセット（図１３ｅ）、および最も厳格なフィルタリングデータセット（図１３ｆ）。図１３ｇ～ｌは、上記の４種類の除染データセット（下部に示されるように、それぞれ異なるグレースケール／カラーで表示されている）を用いて再生成したモデルおよび付随する性能値（ＡＵＲＯＣおよびＡＵＰＲ）を示す。除染データセットについて訓練および試験したモデルから取得したＡＵＲＯＣおよびＡＵＰＲの値を、完全データセットのＡＵＲＯＣまたはＡＵＰＲの値に対してプロットした（図４ｆ～ｈ）。破線の対角線は完全線形関係を表す。一般化直鎖状モデルを対応するデータセットのＡＵＲＯＣおよびＡＵＰＲの値にフィットさせた；直線フィットの標準誤差については網掛け領域で示されている。全図を通してＣＯＡＤ（ｎ＝全１，００６試料）モデル性能を判定した。
【図14-1】試料種別当たりの平均リードの割合に対する除染効果を示す。主要な各試料種別（原発腫瘍（図１４ａ）、固形組織正常（図１４ｂ）、血液由来正常（図１４ｃ））の総リードカウント（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を合計し、各試料種別内の試料の総数で割り算した。次いで、各癌種について、この（試料種別当たりの）正規化リードカウントを、全試料種別を通じて合計した正規化リードカウントで割り算することにより、平均リード／試料種別／癌種の割合の推定値を得た。図内の説明に記載されるように、これを５つのデータセット全てについて反復し、混入除去が試料および／または癌の特定種類に識別的影響を与えたのか否かについて評価を行った；示される相対的安定性比率（％）は、識別的汚染がないことを示唆するであろう。本論文でさらなる除染またはＭＬ（例えば、さらなる転移病変；ｎ＝４試料種別；図８ｇ）による分析を行わなかった少数試料種別については、本明細書においては提示していない。所定の癌種について１試料種別のみしか存在しない特殊な場合（ＡＣＣ、ＭＥＳＯ、ＵＣＳの原発腫瘍）においては、バーはいずれも、正規化リードの１００％が１つの試料種別に由来するものだということを示しており、留意されたい。調べた癌試料の総数は１７，６２５である。
【図14-2】試料種別当たりの平均リードの割合に対する除染効果を示す。主要な各試料種別（原発腫瘍（図１４ａ）、固形組織正常（図１４ｂ）、血液由来正常（図１４ｃ））の総リードカウント（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を合計し、各試料種別内の試料の総数で割り算した。次いで、各癌種について、この（試料種別当たりの）正規化リードカウントを、全試料種別を通じて合計した正規化リードカウントで割り算することにより、平均リード／試料種別／癌種の割合の推定値を得た。図内の説明に記載されるように、これを５つのデータセット全てについて反復し、混入除去が試料および／または癌の特定種類に識別的影響を与えたのか否かについて評価を行った；示される相対的安定性比率（％）は、識別的汚染がないことを示唆するであろう。本論文でさらなる除染またはＭＬ（例えば、さらなる転移病変；ｎ＝４試料種別；図８ｇ）による分析を行わなかった少数試料種別については、本明細書においては提示していない。所定の癌種について１試料種別のみしか存在しない特殊な場合（ＡＣＣ、ＭＥＳＯ、ＵＣＳの原発腫瘍）においては、バーはいずれも、正規化リードの１００％が１つの試料種別に由来するものだということを示しており、留意されたい。調べた癌試料の総数は１７，６２５である。
【図14-3】試料種別当たりの平均リードの割合に対する除染効果を示す。主要な各試料種別（原発腫瘍（図１４ａ）、固形組織正常（図１４ｂ）、血液由来正常（図１４ｃ））の総リードカウント（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を合計し、各試料種別内の試料の総数で割り算した。次いで、各癌種について、この（試料種別当たりの）正規化リードカウントを、全試料種別を通じて合計した正規化リードカウントで割り算することにより、平均リード／試料種別／癌種の割合の推定値を得た。図内の説明に記載されるように、これを５つのデータセット全てについて反復し、混入除去が試料および／または癌の特定種類に識別的影響を与えたのか否かについて評価を行った；示される相対的安定性比率（％）は、識別的汚染がないことを示唆するであろう。本論文でさらなる除染またはＭＬ（例えば、さらなる転移病変；ｎ＝４試料種別；図８ｇ）による分析を行わなかった少数試料種別については、本明細書においては提示していない。所定の癌種について１試料種別のみしか存在しない特殊な場合（ＡＣＣ、ＭＥＳＯ、ＵＣＳの原発腫瘍）においては、バーはいずれも、正規化リードの１００％が１つの試料種別に由来するものだということを示しており、留意されたい。調べた癌試料の総数は１７，６２５である。
【図15-1】下流ＭＬモデルに混入させた擬似汚染物の寄与の測定、および宿主を基盤とする市販ｃｔＤＮＡアッセイの、ＴＣＧＡの患者での理論的感度を示す。図１５ａ～ｂは、原発腫瘍微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを用いて（図１５ａ）、または血液由来ｍｂＤＮＡを用いて（図１５ｂ）、４種類の除染データセット全て（図１３ｂ）において、１癌種を残りの全癌種に対して識別するように訓練したモデルについて用いた全分類群の算出特徴量重要度スコアを表す。除染および正規化パイプラインの前にこれらの除染データセットに擬似汚染物を混入させてから、それらの性能を評価した（「方法」を参照のこと）；表示モデルの試験セット性能については、それぞれ図１３ｇ～ｈおよび図６ａに示されている。正確予測に対する寄与率（％）を推定するモデルにおいて、該モデルが利用する混入擬似汚染物の特徴量重要度スコアは、予め全特徴量重要度スコアの合計で割り算したものであった；（１００のうち）そのスコアが高ければ高いほど、そのモデルは生物学的に信頼性が劣る結果となる。ゼロは、モデルによる予測を行う際に混入させた擬似汚染物を全く利用していないことを意味し；プレート／センター除染データによって生成したいずれのモデルも特徴量として混入させた擬似汚染物を含まないことに留意されたい。各比較の性能を評価するために含めた試料の数は、ｃａｎｃｅｒｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ＣａｎｃｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ＿ＤａｔａＢｒｏｗｓｅｒのデータブラウザー混同行列に示されている。
【図15-2】図１５ｃ～ｄは、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ Ｌｉｑｕｉｄ ｃｔＤＮＡコード遺伝子（図１５ｃ）またはＧｕａｒｄａｎｔ３６０ ｃｔＤＮＡコード遺伝子（図１５ｄ）で１種類以上のゲノム変化を有する患者の、ＴＣＧＡ試験における分布（％）を示す。調べた試料の数および生データについては、ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇから入手可能である。図１５ｅは、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅおよびＧｕａｒｄａｎｔ３６０ ｃｔＤＮＡアッセイのコード遺伝子のリストおよび調べたそれらの変化（「方法」にリストに示されているソース）を含む表を示す。
【図16-1】健常個体と複数種類の癌との間の実環境血漿由来無細胞微生物ＤＮＡ分析を示す。図１６ａは、実環境検証試験を実験的に実施するために用いたＴＣＧＡの識別シミュレーションを示す（図７；「方法」を参照のこと）。各層化サンプルサイズの中心値は１０反復した性能の平均である；誤差棒は標準誤差を表す。
【図16-2】図１６ｂは、陽性対照細菌（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ）単培養物、陰性対照ブランク、およびＫｒａｋｅｎおよびＳＨＯＧＵＮに基づくデータを用いたヒト試料種別における、アリイビブリオ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ）属存在量の値（生リードカウント）についての評価を表す。図１６ｃは、細菌単培養物の希釈物におけるアリイビブリオ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ）属の存在量を示す（生リードカウント）。図１６ｄは、癌を有していない健常対照個体（Ｃｔｒｌ）および肺癌（ＬＣ）、前立腺癌（ＰＣ）、または黒色腫（ＳＫＣＭ）を有する群化患者における年齢分布を示す。
【図16-3】図１６ｅは、患者の性別分布を示し、挿入図はＰｅａｒｓｏｎのχ２検定（片側臨界域）である。図１６ｆは、用いた異なるデータベースであるＫｒａｋｅｎとＳＨＯＧＵＮとの間の分類群帰属に関するＶｅｎｎ図を示す。図１６ｇは、癌のない健常個体におけるＫｒａｋｅｎ（グレースケール／ピンク色）またはＳＨＯＧＵＮ（グレースケール／水色）の微生物カウント生データを用いた宿主年齢の反復ＬＯＯ ＭＬ回帰を示す。全試料にわたって評価した平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示している。図１６ｈ～ｊは、無細胞微生物ＤＮＡを用いて健常個体と癌を有する群化患者との識別を行うＭＬの性能への、Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ前の年齢交換（図１６ｈ）、性別交換（図１６ｉ）、および年齢性別交換（図１６ｊ）の効果を示す。各比較には１００回の交換を用いた（「方法」を参照のこと）。図１６ｋは、ＳＫＣＭコホートサイズ（ｎ＝１６試料）を適合化するための前立腺癌（ＰＣ）、肺癌（ＬＣ）、黒色腫（ＳＫＣＭ）、および対照群の反復サブサンプリングを示す；適合化後に、サブサンプリングした健常対照に対する各サブサンプリングした癌種の対合ＭＬのｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ（１サンプルのみをテストセットにとり、他のサンプルを訓練データとする）（ＬＯＯ）を実施した。１００回の交換反復を用いて識別性能分布および標準誤差を推定した（「方法」を参照のこと）。図１６ｂ～ｃについては、ｌｏｇ１０スケールおよび０．５擬似カウント下限（点線）であることに留意されたい。図１６ｂ～ｄ、ｈ～ｋについては、３つ以上の比較検定を行う場合の仮説検定は、多重検定補正付き両側マン＝ホイットニーＵ検定である；ボックスプロットは、中央値を示す（直線）、第一四分位数および第三四分位数（四角）、および１．５×四分位範囲（ＩＱＲ、ヒゲ）。ボックスプロットおよびバープロットは全て、サンプルサイズを下部にグレースケール／青色で示す。
【図17-1】無細胞微生物ＤＮＡを用いて癌種と癌を有していない健常個体との間の識別を行う場合の、ＳＨＯＧＵＮに基づくＭＬの性能を示す。図１７ａは、癌を有していない健常対照個体（ｎ＝６９）から群化癌患者（ｎ＝１００）を識別するブートストラップ処理性能推定値を示す。異なる訓練／試験の分割部分（７０％訓練／３０％試験）の５００回反復によるＲＯＣ曲線データおよびＰＲ曲線データがラスター化密度プロットに示されている；平均値および９５％ＣＩ推定値が示される。
【図17-2】図１７ｂ～ｇは、以下の２クラス間のＬＯＯ反復ＭＬ性能を示す：前立腺癌（ＰＣ）対対照（図１７ｂ）；肺癌（ＬＣ）対対照（図１７ｃ）；黒色腫（ＳＫＣＭ）対対照（図１７ｄ）、ＰＣ対ＬＣ（図１７ｅ）、ＬＣ対ＳＫＣＭ（図１７ｆ）、およびＰＣ対ＳＫＣＭ（図１７ｇ）。
【図17-3】図１７ｈ～ｊは、癌種間、ならびに患癌者と癌のない健常対照個体との間の識別を行うマルチクラス（ｎ＝３または４）、ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ（ＬＯＯ）反復ＭＬ性能を示す。１対残り全てのＡＵＲＯＣ値およびＡＵＰＲ値から算出した平均のＡＵＲＯＣおよびＡＵＰＲを混同行列の下に示す。図１７ｈは、試験した３種類の癌の間のＬＯＯ ＭＬ性能を示す。図１７ｉは、少数クラスに少なくとも２０試料を含む場合（すなわち、ＴＣＧＡ分析に用いたカットオフ、図４ｆ～ｈ）の３つの試料種別間のＬＯＯ ＭＬ性能を示す。図１７ｊは、試験した全４種類の試料種別間のＬＯＯ ＭＬ性能を示す。混同行列プロットを含む全サブ図に関しては、サンプルサイズが小型であることから、代替として単一またはブートストラップ訓練／試験の分割部分のＬＯＯ ＭＬを用いた；これらの混同行列はまた各比較に用いた試料の数を反映する。
【図18】本開示の１種類以上の例示的実施態様にしたがって１種類以上の技術（例えば、方法）のうちのいずれを実施してもよい計算装置またはコンピューターシステムの例を表すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【0092】
本明細書において言及される刊行物、特許、および特許出願は全てが、あたかも個別かつ具体的に参照として挿入されているが如く本明細書に参照として組み入れられるのである。
【0093】
他で特段に定義されるのでない限り、本明細書中のすべての技術的用語および科学的用語および頭字語も、本発明の技術分野における当業者に通常理解されるものと同一の意味を有するものである。本明細書に記載の方法および材料に類似する、あるいは同等のいずれの方法および材料も本発明の実施に用いることが可能ではあるが、例示的な方法、デバイス、および材料を本明細書に説明する。
【0094】
様々な実施態様の実施においては、特段に明記されるのでない限り、当該技術分野の技能に含まれる分子生物学（診断技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学および免疫学の従来技術を利用する。そのような技術は、以下のような文献において詳細に説明されている：
「分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．）」 （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）； 「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（編集Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ、１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（編集Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７）； 「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」 （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社）；「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（編集Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、およびその定期的更新版）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（編集Ｍｕｌｌｉｓら、１９９４）；レミントンの薬剤化学と実際第２０版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ ｅｄ．） （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）；および「レミントンの薬剤化学と実際第２２版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２２ｔｈ ｅｄ．）」（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１２）。
「分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．）」 （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）； 「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（編集Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ、１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（編集Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７）； 「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」 （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社）；「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（編集Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、およびその定期的更新版）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（編集Ｍｕｌｌｉｓら、１９９４）；レミントンの薬剤化学と実際第２０版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ ｅｄ．） （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）；および「レミントンの薬剤化学と実際第２２版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２２ｔｈ ｅｄ．）」（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１２）。
【0095】
少なくとも一実施態様においては、転移性癌を有する対象の組織または血液の微生物叢に基づいて、転移の由来組織の検出および判定を行う方法を提供する。実施態様においては、本発明は、以下を含む微生物核酸を用い、組織または血液における微生物叢に基づいて、転移の由来組織を判定する方法を提供する：
（ａ）患者の生検試料（固形組織または血液を含む）から転移性癌組織試料を取得すること；
（ｂ）例えば、ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳ ＤＮＡミニプレップキットによって、癌組織試料から核酸を抽出すること；
（ｃ）ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキットを用いることなどによって抽出した核酸から核酸シーケンシングライブラリーを調製すること；
（ｄ）Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００機器などによる次世代シーケンシングを用いて、該核酸ライブラリー（ＮＧＳ）をシーケンシングすること；
（ｅ）ＳＨＯＧＵＮアルゴリズム（ＰＭＩＤ：３０４４３６０２）を用いることなどにより、該試料についての微生物存在量の表を取得することを目的として、公知の微生物ゲノムに対して出力核酸シーケンシングリードを整列化させること；
および
（ｆ）勾配ブースティング分類木を用いて転移性癌の由来組織の判定結果または予測結果を得るために、該微生物存在量の表を機械学習アルゴリズムに入力すること。
（ａ）患者の生検試料（固形組織または血液を含む）から転移性癌組織試料を取得すること；
（ｂ）例えば、ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳ ＤＮＡミニプレップキットによって、癌組織試料から核酸を抽出すること；
（ｃ）ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキットを用いることなどによって抽出した核酸から核酸シーケンシングライブラリーを調製すること；
（ｄ）Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００機器などによる次世代シーケンシングを用いて、該核酸ライブラリー（ＮＧＳ）をシーケンシングすること；
（ｅ）ＳＨＯＧＵＮアルゴリズム（ＰＭＩＤ：３０４４３６０２）を用いることなどにより、該試料についての微生物存在量の表を取得することを目的として、公知の微生物ゲノムに対して出力核酸シーケンシングリードを整列化させること；
および
（ｆ）勾配ブースティング分類木を用いて転移性癌の由来組織の判定結果または予測結果を得るために、該微生物存在量の表を機械学習アルゴリズムに入力すること。
【0096】
少なくとも一実施態様においては、核酸を提供するが、該核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。実施態様においては、該工程は微生物のＤＮＡまたはＲＮＡに着目して利用することができる。他の代替としては、転移の由来組織をより正確に診断することを目的とした、微生物のＤＮＡおよびＲＮＡと宿主のＤＮＡおよびＲＮＡとの組み合わせが挙げられる。
【0097】
少なくとも一実施態様においては、非微生物核酸であって、公知の微生物ゲノムに対して核酸シーケンシングリードを整列化させる前に除去される非微生物核酸を提供する。
【0098】
少なくとも一実施態様においては、汚染微生物核酸であって、公知の微生物ゲノムに対して核酸シーケンシングリードを整列化させる前に除去される汚染微生物核酸を提供する。
【0099】
少なくとも一実施態様においては、核酸シーケンシングリードを公知の微生物ゲノムに対して整列化させた後であって、微生物存在量の表を機械学習アルゴリズムに入力する前に、汚染微生物核酸が除去することを提供する。
【0100】
少なくとも一つの実施態様においては、公知の微生物ゲノムに対して出力核酸シーケンシングリードを整列化させる場合に、微生物の存在または非存在に関する情報を生成するが、ここで該微生物の存在または非存在に関する情報はその後に機械学習に用いるものである。
【0101】
少なくとも一実施態様においては、該対象のいずれかの組織から核酸を抽出し得ることを提供するが、そのような組織としては、固形組織、腫瘍、血液、液体生検、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。したがって、循環血液、循環血液の構成成分（例えば、血漿、白血球、血小板）、またはそれらの任意の組み合わせから該核酸を抽出してもよい。
【0102】
少なくとも一つの実施態様においては、転移性癌の由来組織の判定に基づいて、対象の予後を判定する、対象の予防処置を行う、および／または対象を治療する方法をさらに提供するが、ここで該方法は、該転移に適応する有効量の治療組成物を該対象に投与すること、または該転移を適応とする治療プロトコルを実施することを含む。
【0103】
定義
本発明の理解を容易にするために、本明細書中で用いられる複数の用語および略語を以下に定義する。
本発明の理解を容易にするために、本明細書中で用いられる複数の用語および略語を以下に定義する。
【0104】
本明細書中の用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｓ）」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」または他の任意のそれらの変形は、非排他的包含を含むことを意図するのであって、他でそうでないことを明示的に示すのでない限り、列挙要素のいかなる限定も受けるものではない。例えば、リストされる要素（例えば、成分、特徴量、または工程）「を含む」融合蛋白質、医薬組成物、および／または方法は、それらの要素（または成分または工程）のみに必ずしも限定されるものではなく、リストに明示的に示されてはいない他の要素（または成分または工程）または該融合蛋白質、医薬組成物および／または方法に固有の他の要素（または成分または工程）を含むのであってもよい。
【0105】
本明細書において、移行部「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」および「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特定されないいかなる要素、工程、および成分も除外するものである。例えば、請求項において用いられる「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、その請求項を、通常それに関連する不純物（すなわち、所定の成分に含まれる不純物）を除けば、該請求項において具体的に列挙される該成分、該材料、または工程に限定するのである。表現「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」が、請求項の序文の直後ではなく、請求項の要部に用いられる場合には、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という表現は、その部分に明記される要素（または成分または工程）にのみ限定するものである；他の要素（または成分）はその請求項から全体的に除外されるのである。
【0106】
本明細書において、移行部「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「本質的に～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、文字通り開示されたものに加えて、材料、工程、特徴量、成分、または要素を含む融合蛋白質、医薬組成物、および／または方法を規定する目的で用いられるが、これらの付加的な材料、工程、特徴量、成分、または要素が、請求項に係る発明の基本的かつ新規の特徴には実質的に影響しない場合に、このような表現が用いられるのである。この用語「本質的にから成る」は、「を含む」と「から成る」との間の中間的位置を占めるものである。
【0107】
本発明またはその好ましい実施態様の要素を導入する場合には、冠詞の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、該要素のうちの１つ以上が存在する意味を意図する。用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であることを意図し、リストに示されている要素以外の付加的要素が存在してもよいことを意味する。
【0108】
用語「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」が２種類以上の項目のリスト中で用いられる場合には、列挙された項目のいずれか１種類を単独で、または列挙された項目のうちのいずれか１種類以上のものと組み合わせて用いることが可能であることを意味する。例えば、「Ａおよび／またはＢ」という表現は、ＡおよびＢのいずれか、ＡおよびＢの両方、すなわちＡ単独、Ｂ単独またはＡとＢの組み合わせの意味を意図する。「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」という表現は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＢとＣの組み合わせ、またはＡ、Ｂ、およびＣの組み合わせの意味を意図する。
【0109】
本明細書に記載される発明の局面および実施態様は、局面および実施態様「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および／または「本質的に」局面および実施態様「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むものであることを理解されたい。
【0110】
範囲に関する言及は単に便宜的かつ簡便さを目的とするものであって、本発明の範囲についての柔軟性のない限定であると見なすべきでないことを理解されたい。したがって、ある範囲についての記載は、具体的に開示される全ての可能な小範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有するものと見なすべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、および６などの、具体的に開示される小範囲を有するものと見なすべきである。範囲の幅にかかわらず、これがあてはまる。値または範囲はまた、本明細書において、「約（ａｂｏｕｔ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」一特定値～、および／または「約（ａｂｏｕｔ）」別の一特定値までと表現することがある。そのような値または範囲を表現する場合には、本開示のその他の実施態様は、一特定値から、および／または別の特定値までの列挙される特定値を含む。同様に、先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」を用いることによって、値を概算値として表現する場合には、特定値は別の一実施態様を形成することを理解されたい。それによって開示された複数の値が存在し、各値はまた特定値それ自体に加えて、その特定値の「約（ａｂｏｕｔ）」として本明細書に開示されることが、さらに理解されるであろう。実施態様において、「約（ａｂｏｕｔ）」は、例えば、列挙値の１０％以内、列挙値の５％以内、または列挙値の２％以内を意図する目的で用いることができる。
【0111】
本明細書中の「患者」または「対象」は、診断または治療するヒト対象または動物対象を指す。
【0112】
本明細書中の用語「医薬組成物」は、薬学的に許容され得る組成物を指すが、ここで該組成物は薬学的活性剤を含み、いくつかの実施態様においては薬学的に許容され得る担体をさらに含む。いくつかの実施態様においては、該医薬組成物は薬学的活性剤および担体の組み合わせであってもよい。
【0113】
本明細書中の用語「薬学的に許容可能な」は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているものであること、または米国薬局方、その他の一般的に認められている薬局方のリストに記載されているものであることを意味し、それに加えて動物、より具体的には、ヒトおよび／または非ヒト哺乳動物においての利用が安全であるその他の製剤を意味する。
【0114】
本明細書中の用語「薬学的に許容され得る担体」は、脱メチル化化合物と共に投与する賦形剤、希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または媒体を指す。そのような担体は水および油脂類などの滅菌液体であってもよく、このようなものとしては、石油、動物、野菜または合成に由来する油脂類が挙げられる（落花生油、大豆油、ミネラルオイル、ごま油など、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など）。ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類などの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）など；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節する薬剤もまた、担体であり得る。担体と組み合わせて組成物を調製する方法は、当業者には公知である。いくつかの実施態様においては、「薬学的に許容され得る担体」という表現は、医薬投与に適合する任意およびすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、等浸透圧剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性である物質に関するそのような媒体および薬剤の利用は、当該技術分野において公知の事柄である。例えば、レミントンの薬剤化学と実際第２０版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ ｅｄ．）（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）を参照のこと。いずれかの従来型の媒体または薬剤が活性化合物に対して不適合であるというような場合を除けば、該組成物において、そのような利用が検討される。
【0115】
本明細書中の「治療的有効量」は、疾患および病状に関連する症状を治療または改善する、あるいは何らかの様式で軽減するのに充分な、薬学的活性化合物の量を指す。ある方法に関連して用いられる場合には、その方法は、疾患および病状に関連する症状を治療または改善する、あるいは何らかの様式で軽減するのに充分効果的である。例えば、疾患に関しての有効量は、発症を防止または予防するのに充分な量である；あるいは、疾患病状が既に始まっている場合には、該疾患を軽減する、改善する、安定化させる、退行させる、または該疾患の進行を緩徐にする、あるいは該疾患の病理的帰結を軽減するのに充分な量である。いずれの場合にも、有効量は単回用量で投与してもよく、または分割用量で投与してもよい。
【0116】
本明細書中の用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、患者の疾患に関連する症状を少なくとも改善することを含むが、ここで「改善」は広義で用いられ、あるパラメーター（例えば、治療中の疾患または病態に関連する症状）の度合いが少なくとも低下することを指す。したがって、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」はまた、疾患、障害、または病態、または少なくともそれに関連する症状の完全な防止（例えば、それらが起こることを防いだ）であり、それによって患者がもはやその病態、または少なくともその病態を特徴付ける症状から脱却した状況をも含むものである。
【0117】
本明細書中の用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、他で特定しない限り、疾患または障害、または１種類以上のその症状の、発症、再発または蔓延の予防を指す。特定の実施態様においては、これらの用語は、特に、本明細書に記載される疾患または障害のリスクのある対象において、症状の発症前に、１種類以上の他のさらなる活性物質を含むまたは含まない、本明細書に記載の化合物または製剤による治療またはその投与を行うことを指す。この用語は、特定疾患の症状の防止または軽減を含む。特定の実施態様においては、疾患の家族歴を有する対象が予防的レジメンの潜在的候補である。特定の実施態様においては、反復症状の病歴を有する対象もまた予防の潜在的候補である。これに関して、用語「予防」は用語「予防的処置」の同義語として用いられることもある。
【0118】
本明細書中の化合物の「予防有効量」は、他で特定しない限り、疾患または障害を予防する、あるいはその再発を予防するのに充分な量である。予防有効量の化合物は、単独または１種類以上の他の物質と組み合わせた場合に、該疾患の予防において予防的利点を提供する量の治療剤を意味する。用語「予防有効量」は、予防を全体的に改善する量、あるいは他の予防薬の予防的効力を増強する量を含み得る。
【0119】
「増幅」は、標的核酸またはその相補物、またはその断片を複数コピー取得する任意の公知の処置法を指す。複数コピーを、単位複製配列または増幅産物といってもよい。断片について言及する場合の増幅は、完全標的核酸またはその相補鎖よりも短いものを含む増幅核酸の生産を指し、例えば、標的核酸にハイブリダイズし標的核酸内部の位置から重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを用いることによって作成される。公知の増幅法としては、例えば、レプリカーゼ媒介性増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅または転写関連増幅が挙げられる。増幅は出発分子の厳密な複製にのみ限定されるものではない。例えば、逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲを用いて試料中のＲＮＡから複数のｃＤＮＡ分子を生成することは増幅の一形態である。さらに、転写過程において単一ＤＮＡ分子から複数のＲＮＡ分子が生成することも増幅の一形態である。増幅中に、例えば、標識プライマーを用いて、あるいは標識ヌクレオチドを取り込ませることによって増幅産物を標識することができる。
【0120】
「単位複製配列」または「増幅産物」は、標的核酸またはその領域に相補的または相同的である増幅処理中に生成した核酸分子を指す。単位複製配列は二本鎖のことも一本鎖のこともあり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの両方を含み得る。単位複製配列を生成させる方法は当業者にとって公知である。
【0121】
「コドン」は、核酸の遺伝子暗号単位を共に形成する３つのヌクレオチドの配列を指す。
【0122】
「目的のコドン」は、診断的または治療的な意義（例えば、ウイルス遺伝子型／サブタイプまたは薬剤耐性に関連する対立遺伝子）を有する標的核酸中の特定のコドンを指す。
【0123】
「相補的」または「その相補物」は、一連の相補的塩基間で標準的な塩基対形成（水素結合）をすることにより、連続核酸塩基配列が別の塩基配列にハイブリダイズ可能であることを意味する。相補的配列は、標準塩基対形成（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕの対合）を用いることによって、オリゴマー配列中の各位置において、その標的配列に対し完全に相補的（すなわち、核酸二重鎖にミスマッチが全く存在しない）であってもよく、あるいは配列が塩基対形成において相補的ではない１か所以上の位置を含む（例えば、核酸二重鎖中に少なくとも１つのミスマッチ塩基または非マッチ塩基が存在する）のであってもよく、そのような配列は充分相補的である；その理由は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、該全オリゴマー配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズすることが可能（すなわち、部分的に相補的）だからである。オリゴマー中の連続塩基は典型的には、意図する標的配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくは完全に相補的である。
【0124】
「～するように構成される」または「～するように設計される」は、参照オリゴヌクレオチドの核酸配列構成の実際的な配置を表す。例えば、標的核酸から特定単位複製配列を生成するように構成されるプライマーは、標的核酸またはその領域にハイブリダイズする核酸配列を有し、単位複製配列を生成する増幅反応に用いることができる。またさらなる例としては、標的核酸またはその領域に特異的にハイブリダイズするように構成されるオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を有する。
【0125】
「下流」は、核酸配列に沿って、配列転写または配列読み出しの方向に離れている（離れる）ことを意味する。
【0126】
「上流」は、核酸配列に沿って、配列転写または配列読み出しとは逆方向に離れている（離れる）ことを意味する。
【0127】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は一般的に、標的核酸配列のコピー数を指数関数的に増加させる、核酸変性、プライマー対の反対側の鎖（順方向および逆方向）へのアニーリング、およびプライマー伸長の複数サイクルを用いるプロセスを指す。ＲＴ－ＰＣＲとよばれる変法においては、ｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作成するために逆転写酵素（ＲＴ）を用い、次いでそのｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅して、複数コピーのＤＮＡを作成する。当業者にとって公知である、ＰＣＲの代替が複数存在する。
【0128】
「位置」は、核酸配列中の特定の１アミノ酸または複数アミノ酸を指す。
【0129】
「プライマー」は、酵素的に伸長可能なオリゴヌクレオチド、一般的に、標的核酸の相補的プライマー特異的部分に逆平行にハイブリダイズするように設計した規定配列を指す。プライマーは、好適な核酸合成条件下に置かれた場合に、鋳型依存性にヌクレオチド重合を開始することが可能であり、それによって標的核酸に相補的な核酸が得られる（例えば、標的にアニールさせたプライマーは、ヌクレオチドおよびＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼの存在下で好適な温度およびｐＨにおいて、伸長させることができる）。好適な反応の条件および試薬は当業者にとって公知である。プライマーは、典型的には増幅で最大効率を得るために一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合には、該プライマーは一般的には、伸長産物の調製に用いる前に、まずその鎖の分離処理を行う。該プライマーは、一般的に誘導剤（例えば、ポリメラーゼ）の存在下で伸長産物の合成開始にとって充分長い。特異的な長さおよび配列は、必要とするＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的の複雑度、ならびに温度およびイオン強度などのプライマーを利用する際の条件に依存するであろう。好ましくは、該プライマーは約５～１００ヌクレオチドである。すなわち、プライマーはその長さが、例えば、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ヌクレオチドである。プライマーは、プライマー伸長を起こすために鋳型に対して１００％相補的である必要はない；１００％未満の相補性を有するプライマーでも、ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ伸長が充分起こり得る。プライマーは、必要に応じて標識することができる。プライマーに標識を用いる場合には、任意の好適な標識を用いることができ、例えば、分光学、光化学、生化学、免疫化学、化学、または他の検出手段によって検出することができる。したがって、標識プライマーは、標的配列の選択的検出が可能となるハイブリダイゼーションを促進する条件下において、核酸中の標的配列または増幅核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴマーを指す。
【0130】
プライマー核酸は、必要に応じ、（例えば、分光学、光化学、生化学、免疫化学、化学、または他の技術によって）検出可能な標識を導入することによって標識することができる。有用な標識の例としては、放射性同位体；蛍光色素；高電子密度試薬；酵素（ＥＬＩＳＡに通常用いられるような酵素）；ビオチンまたはハプテン；および抗血清またはモノクローナル抗体が利用できる蛋白質が挙げられる。これらの標識およびその他の標識のうちの多くは、本明細書中でさらに説明されており、および／または当該技術分野で公知である。当業者であれば、特定の実施態様において、プライマー核酸をプローブ核酸として用いることも可能であることを理解するであろう。
【0131】
「領域」は、核酸の一部分を指し、ここで該一部分は核酸全体よりも短い。
【0132】
「目的の領域」は、増幅および検出される遺伝子型および／またはサブタイプに関連する少なくとも１つの単一ヌクレオチド置換突然変異を有する全てのコドン位置を含む標的核酸の特異的配列を指し、また、増幅および検出されるマーカー位置が存在するのであれば、そのような全てのマーカー位置に関連する少なくとも１つの単一ヌクレオチド置換突然変異を有する全てのコドン位置を含む標的核酸の特異的配列をも指す。
【0133】
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素を指す。公知の逆転写酵素はいずれもＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを創り出す能力をも有する；したがって、これらはＲＮＡ依存性かつＤＮＡ依存性の両方の依存性を示すＤＮＡポリメラーゼである。ＲＴはさらにＲＮＡｓｅ Ｈ活性を有することもある。ＲＮＡ鋳型およびＤＮＡ鋳型の両方において、合成開始にはプライマーが必要となる。
【0134】
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例としては、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、またはバクテリオファージＴ４、Ｐｈｉ－２９、Ｍ２、Ｔ５のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌またはバクテリオファージから単離した天然酵素であってもよく、あるいは組換え技術によって発現させてもよい；あるいは、修飾されていてもよく、あるいは特定の望ましい特性（例えば、熱安定性、または各種の改変鋳型からＤＮＡ鎖を認識または合成する能力）を有するように、工学的に改変した「進化」形態であってもよい。公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはいずれも、合成を開始するために相補的プライマーを必要とする。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、好適な条件下でＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成することもあるのは、公知の事柄である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはまた、典型的にはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【0135】
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「転写酵素」は、通常二本鎖であるプロモーター配列を有する二本鎖または部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から複数ＲＮＡコピーを合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写物」）は５′から３′の方向で合成されるが、それはプロモーターの直ぐ下流にある特定位置から開始する。転写酵素の例としては、大腸菌ならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【0136】
核酸の「配列」は、核酸におけるヌクレオチドの並び順と種類を指す。配列は、典型的には５′から３′の方向で読み取られる。２種類以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関する、用語「同一である（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」％は、最大対応となるように比較し整列化した場合、例えば、当業者が利用可能な配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて評価した場合に、または当業者が目視検査で評価した場合に、同一である２種類以上の配列または副配列を指す、あるいはアミノ酸残基またはヌクレオチドのうちの同一なものを特定割合（％）で有する２種類以上の配列または副配列を指す。配列同一性（％）および配列類似性を判定するための好適なアルゴリズムの例としてはＢＬＡＳＴプログラムが挙げられるが、これは以下の参考文献に記載がある：
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）「基本的な局所整列探索ツール（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）」Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈら、（１９９３）「データベースの類似性検索による蛋白質コード領域の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ）」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎら、（１９９６）「ネットワークＢＬＡＳＴサーバーのアプリケーション（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ）」Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７） 「ギャップありＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：新世代の蛋白質データベース検索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２；およびＺｈａｎｇら、（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：インタラクティブまたは自動化された配列分析および注釈付けのための新規ネットワークＢＬＡＳＴアプリケーション（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ： Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９－６５６；これらの参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。他にも多くの最適整列化アルゴリズムが当該技術分野において公知であり、配列同一性（％）の判定に任意選択的に利用される。
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）「基本的な局所整列探索ツール（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）」Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈら、（１９９３）「データベースの類似性検索による蛋白質コード領域の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ）」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎら、（１９９６）「ネットワークＢＬＡＳＴサーバーのアプリケーション（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ）」Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７） 「ギャップありＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：新世代の蛋白質データベース検索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２；およびＺｈａｎｇら、（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：インタラクティブまたは自動化された配列分析および注釈付けのための新規ネットワークＢＬＡＳＴアプリケーション（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ： Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９－６５６；これらの参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。他にも多くの最適整列化アルゴリズムが当該技術分野において公知であり、配列同一性（％）の判定に任意選択的に利用される。
【0137】
「標識」は、（共有結合または非共有結合によって）ある分子に付加された部分または付加され得る部分を指し、該部分は、該分子または標識分子が相互作用する（例えば、ハイブリダイズするなど）他の分子に関する情報（例えば、該分子に関する記述的情報、該分子に関する情報の同定など）を提供する、あるいは提供し得る。標識の例としては、蛍光標識（例えば、消光剤または吸収剤が挙げられる）、微弱蛍光標識、非蛍光標識、発色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどが挙げられる）などが挙げられる。
【0138】
「リンカー」は、別の部分（例えば、核酸、オリゴヌクレオチドプローブ、プライマー核酸、単位複製配列、固体支持体など）に化合物または置換基を共有結合または非共有結合で付加する化学的部分を指す。例えば、固体支持体（例えば、直鎖状またはその他のロジックプローブアレイ）にオリゴヌクレオチドプローブを付加するために、任意選択的にリンカーを用いる。さらなる例としては、任意選択的にリンカーによって、オリゴヌクレオチドプローブ、プライマー核酸などに標識（例えば、蛍光色素、放射性同位体など）を付加する。リンカーは、典型的には少なくとも二官能性化学的部分であり、特定の実施態様においては、物質または化合物を、例えば、固体支持体から放出するために、例えば、加熱、酵素、化学物質、電磁放射などによって切断され得る開裂可能付加部分を含む。リンカーを慎重に選べば、化合物の安定性およびアッセイ法に合った適切な条件下で実施される開裂が可能となる。一般に、リンカーは、例えば、化学種を一緒に連結する、またはそのような分子種間の最小距離を保つ、あるいはその他の空間関係を保つなど以外には、特異的生物学的活性を有していない。しかし、立体構造、正味の電荷、疎水性などの、連結される化学種の一部の性質に影響を与えるように、リンカーの構成要素を選択するのであってもよい。リンカーの例としては、例えば、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド類、オリゴエチレングリセロール類、オリゴアクリルアミド類、アルキル鎖などが挙げられる。リンカー分子のさらなる説明については、例えば、以下のような文献に記載がある：
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「生物共役化結合技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９６）；Ｌｙｔｔｌｅら、（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４（１４）：２７９３；Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏら、（２００１） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０：３６９；Ｄｏｒｏｎｉｎａら、（２００１） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０：１００７；Ｔｒａｗｉｃｋら、（２００１） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １２：９００；Ｏｌｅｊｎｉｋら、（１９９８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２９１：１３５；およびＰｌｊｅｖａｌｊｃｉｃら、（２００３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２５（１２）：３４８６；これらの参考文献はいずれも参照として本明細書に組み入れられる。
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「生物共役化結合技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９６）；Ｌｙｔｔｌｅら、（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４（１４）：２７９３；Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏら、（２００１） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０：３６９；Ｄｏｒｏｎｉｎａら、（２００１） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０：１００７；Ｔｒａｗｉｃｋら、（２００１） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １２：９００；Ｏｌｅｊｎｉｋら、（１９９８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２９１：１３５；およびＰｌｊｅｖａｌｊｃｉｃら、（２００３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２５（１２）：３４８６；これらの参考文献はいずれも参照として本明細書に組み入れられる。
【0139】
「断片」は、全長核酸より少ない数のヌクレオチドを含む連続する核酸の小片を指す。
【0140】
「ハイブリダイゼーション」、「アニーリング」、「選択的に結合する」または「選択的結合」は、１核酸の他の核酸（典型的には、逆平行核酸）との間の塩基対合相互作用を指し、それによって二本鎖形成またはその他の高次構造の形成（すなわち、ハイブリダイゼーション複合体）が起こる。逆平行核酸分子間の主要相互作用は、典型的には塩基特異的である（例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃ）。ハイブリダイゼーションを達成するために、２種類の核酸がそれらの全長にわたって１００％の相補性を有する必要はない。核酸は、詳細に特徴付けられた各種の物理化学的力（水素結合、溶媒排除、塩基のスタッキングなど）によってハイブリダイズするのである。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針が、以下の参考文献に記載されている：
Ｔｉｊｓｓｅｎ、（１９９３）「生化学および分子生物学における実験室技術－核酸プローブによるハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ）」Ｉ部２章、「ハイブリダイゼーション原理の概要と核酸プローブアッセイの戦略（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ）」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ編集、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｉ巻、ＩＩ巻、およびＩＩＩ巻、１９９７；これらの参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
Ｔｉｊｓｓｅｎ、（１９９３）「生化学および分子生物学における実験室技術－核酸プローブによるハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ）」Ｉ部２章、「ハイブリダイゼーション原理の概要と核酸プローブアッセイの戦略（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ）」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ編集、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｉ巻、ＩＩ巻、およびＩＩＩ巻、１９９７；これらの参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【0141】
実施例
本試験は、１１癌種に由来する５００超の転移性癌組織試料の予備的分析に基づくものであった。図１は、転移性乳癌および転移性甲状腺癌をその組織微生物叢によって識別する機械学習の結果を示しており、微生物の特徴量によって由来としての原発腫瘍の識別が可能であることを示唆している（その理由は、転移性癌はその起源となる組織に基づいて命名されるということである）。少なくとも一つの実施態様においては、乳癌および甲状腺癌の転移に関するＫｒａｋｅｎ Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ変換データは、より大型のＴＣＧＡ Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ補正データセット（ｎ＝１７，６２５）のサブセット（ｎ＝１８）であった。ＴＣＧＡは５１１例の黒色腫転移を含み、乳癌（ＢＲＣＡ）および甲状腺癌（ＴＨＣＡ）からはそれぞれ９例ずつ、および他の８つの癌種から１～２試料を含むものであった。本明細書では、均衡クラスを有する具体例としてＢＲＣＡおよびＴＨＣＡを用いた。
本試験は、１１癌種に由来する５００超の転移性癌組織試料の予備的分析に基づくものであった。図１は、転移性乳癌および転移性甲状腺癌をその組織微生物叢によって識別する機械学習の結果を示しており、微生物の特徴量によって由来としての原発腫瘍の識別が可能であることを示唆している（その理由は、転移性癌はその起源となる組織に基づいて命名されるということである）。少なくとも一つの実施態様においては、乳癌および甲状腺癌の転移に関するＫｒａｋｅｎ Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ変換データは、より大型のＴＣＧＡ Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ補正データセット（ｎ＝１７，６２５）のサブセット（ｎ＝１８）であった。ＴＣＧＡは５１１例の黒色腫転移を含み、乳癌（ＢＲＣＡ）および甲状腺癌（ＴＨＣＡ）からはそれぞれ９例ずつ、および他の８つの癌種から１～２試料を含むものであった。本明細書では、均衡クラスを有する具体例としてＢＲＣＡおよびＴＨＣＡを用いた。
【0142】
少なくとも一つの実施態様においては、本明細書に記載のような機械学習モデルまたは機械学習アルゴリズムは、微生物存在量を決定することを必要としない；むしろ、分類帰属化アルゴリズムを用いる前に、そのような工程を実施するのである。すなわち、そのような実施態様においては、試料がどの特定癌種に属するのかを判定するために、機械学習アルゴリズムが微生物の重要度をランク付けするのである。様々な実施態様において、Ｋｒａｋｅｎは分類群帰属化アルゴリズムであり（ＰＭＩＤ：２４５８０８０７）、機械学習アルゴリズムは勾配ブースティングである（「確率勾配ブースティング（Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ＆ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ３ ８．４（２００２）： ３６７－３７８）；これらの参考文献は、それぞれその内容全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【0143】
癌微生物叢の体系的特徴付けは、ヒトの主要な疾患の診断に非ヒト微生物由来分子を活用する技術を開発する機会を提供するものである。一部の種類の癌では微生物の実質的な寄与を示す最近の実証があるが、その実証の後に、治療ナイーブ患者由来の３３種類の癌のＴＣＧＡ（全１８，１１６試料）の全ゲノムおよび全トランスクリプトームの配列決定試験を微生物リードに関して再検査し、主要な癌種における、あるいは主要な癌種間の、組織および血液の固有微生物シグニチャーを、本明細書に記載の技術を用いて明らかにした。ステージＩａ～ＩＩｃの癌患者ならびに２種類の商業グレードの無細胞腫瘍ＤＮＡプラットフォームにおいて現時点で判定されるゲノム変化は全く含まない癌の患者に適用した場合には、全配列データのうちの最大９２．３％を廃棄する非常に厳密な除染分析の利用にもかかわらず、これらのＴＣＧＡ血液シグニチャーは依然として予測的に有益であった。さらに、本明細書に記載の技術を用いるならば、血漿由来の無細胞微生物核酸を用いるだけで、癌のない健常個体（ｎ＝６９）の試料と複数種類の癌（前立腺、肺、および黒色腫；全体で１００試料）の患者の試料との間の識別が可能であった。この潜在的微生物叢に基づく腫瘍学診断ツールは、さらなる検証を必要とする。
【0144】
癌は古典的にはヒトゲノムの疾患であると見なされている。しかし、最近の研究で、ある種の癌には微生物叢が実質的寄与をすることが分かっている。特に、消化管の癌に対する糞便微生物叢の寄与。しかし、異なる種類の癌に対する微生物寄与の度合いおよび診断上の意義については未知である。癌ゲノムプロジェクトにおいては処理実施管理が実施されることは滅多にないので、採集中、処理中、およびシーケンシング中の試料汚染の可能性によってこれらの研究が制限を受けることになる。微生物シグニチャーへの汚染物の寄与を最小化するために最近開発されたツールを使用することにより、様々な実施態様において、微生物叢を基盤とする診断法の合理的開発が可能になるであろう。
【0145】
癌関連微生物叢の特徴付けを目的として、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ；ｎ＝４、８３１）および全トランスクリプトーム配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ；ｎ＝１３，２８５）に関する研究のＴＣＧＡ一覧から得た３３種の癌、１万人に及ぶ患者の１８，１１６試料から取得した微生物リードを調査した。他の好適なデータセットを利用するのであってもよいが、それらは本開示の範囲内にあると見なされる。微生物リードは、以前にアドホック分析（胃腺癌におけるＥＢＶおよび子宮頸癌におけるＨＰＶを含む）で同定され、小規模の試料サブセットにおいて体系的な研究が成されている（例えば、１９種の癌の４，４３３ＴＣＧＡ試料のウイルス叢および９種の癌にわたる１，８８０ＴＣＧＡ試料のバクテリオーム）。ほとんどのＴＣＧＡシーケンシングデータは、微生物については未検索状態である。本明細書に記載されるように、技術的変動および混入汚染を体系的に評価し軽減する２種類の直交微生物検出パイプラインを用いて網羅的癌微生物叢データセットを作成した。癌種間および／または癌のステージ間の識別を行い、またそれらの性能を比較する微生物シグニチャーを同定するために、機械学習（ＭＬ）技術を利用した。
【0146】
本明細書に記載される機械学習モデルを用いて同定するのであってもよい癌種および／または癌のステージの非網羅的リストは以下を含む：
急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ）；副腎皮質癌（ＡＣＣ）；膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）；低悪性度の脳神経膠腫（ＬＧＧ）；浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）；子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌（ＣＥＳＣ）；胆管癌（ＣＨＯＬ）；結腸腺癌（ＣＯＡＤ）；リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）；食道癌（ＥＳＣＡ）；多形性膠芽腫（ＧＢＭ）；頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣ）；色素嫌性腎癌（ＫＩＣＨ）；明細胞腎癌（ＫＩＲＣ）；乳頭状腎細胞癌（ＫＩＲＰ）；肝細胞癌（ＬＩＨＣ）；肺腺癌（ＬＵＡＤ）；肺扁平上皮細胞癌（ＬＵＳＣ）；中皮腫（ＭＥＳＯ）；漿液性卵巣嚢胞腺癌（ＯＶ）；膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）；褐色細胞腫および傍神経節腫（ＰＣＰＧ）；前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）；直腸腺癌（ＲＥＡＤ）；肉腫（ＳＡＲＣ）；皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）；胃腺癌（ＳＴＡＤ）；精巣生殖細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）；甲状腺癌（ＴＨＣＡ）；胸腺腫（ＴＨＹＭ）；子宮癌肉腫（ＵＣＥＣ）；子宮体部内膜癌（ＵＣＳ）；ぶどう膜黒色腫（ＵＶＭ）。
急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ）；副腎皮質癌（ＡＣＣ）；膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）；低悪性度の脳神経膠腫（ＬＧＧ）；浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）；子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸管腺癌（ＣＥＳＣ）；胆管癌（ＣＨＯＬ）；結腸腺癌（ＣＯＡＤ）；リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）；食道癌（ＥＳＣＡ）；多形性膠芽腫（ＧＢＭ）；頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣ）；色素嫌性腎癌（ＫＩＣＨ）；明細胞腎癌（ＫＩＲＣ）；乳頭状腎細胞癌（ＫＩＲＰ）；肝細胞癌（ＬＩＨＣ）；肺腺癌（ＬＵＡＤ）；肺扁平上皮細胞癌（ＬＵＳＣ）；中皮腫（ＭＥＳＯ）；漿液性卵巣嚢胞腺癌（ＯＶ）；膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）；褐色細胞腫および傍神経節腫（ＰＣＰＧ）；前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）；直腸腺癌（ＲＥＡＤ）；肉腫（ＳＡＲＣ）；皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）；胃腺癌（ＳＴＡＤ）；精巣生殖細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）；甲状腺癌（ＴＨＣＡ）；胸腺腫（ＴＨＹＭ）；子宮癌肉腫（ＵＣＥＣ）；子宮体部内膜癌（ＵＣＳ）；ぶどう膜黒色腫（ＵＶＭ）。
【0147】
ＴＣＧＡ処理では微生物汚染の管理は行わず、また健常個体は除外するので、代表的微生物学プロトコルを用いて、偶発的微生物汚染を含む可能性が最も高いＴＣＧＡ試料種別の血液について、さらなる分析を実施した。多様な実施態様において、臨床的に利用可能な無細胞腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）アッセイに対する血漿由来微生物ＤＮＡの整合的ベンチマーク評価シグニチャーに焦点を当てた。前立腺癌、肺癌、または皮膚癌の個体（ｎ＝計１００）ならびに癌もＨＩＶも有していない健常対照参加者（ｎ＝６９）の血漿試料についてのメタゲノムディープシーケンシングは、正常対癌および癌対癌の識別に無細胞微生物プロファイルが利用可能であることを示唆した。これらの知見は、癌を検出およびモニターする既存のｃｔＤＮＡアッセイを補完し得る、微生物叢に基づく新しい種類の癌診断ツールを示唆するものである。
【0148】
様々な実施態様にしたがう癌種間および癌種内並びに癌のステージ間および癌のステージ内の識別を行うために、正規化データを用いて、確率勾配ブースティングＭＬモデルを訓練した。これらモデルの性能は、以下の識別に関して強力であった：（ｉ）１癌種対残りの全癌種（ｎ＝３２種類の癌）、および（ｉｉ）腫瘍対正常（ｎ＝１５種類の癌）（図４ｆ～ｇ、図９ａ～ｆ；全ての性能評価指標は、ｃａｎｃｅｒｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ＣａｎｃｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ＿ＤａｔａＢｒｏｗｓｅｒに掲載されている）。癌種間の感度および特異度の差は部分的にはクラスサイズの差異によるものであろう；その理由は、少数クラスとＡＵＲＯＣ（受信者操作特性曲線下面積；Ｐ＝０．０２３１）値との間の１癌種対残りの全癌種の比較に有意な線型関係が存在するからである（勾配の両側仮説検定；図９ｇ～ｈ）。癌微生物不均一性もまたこの識別性能に寄与すると思われる。結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、ＳＴＡＤ、および明細胞腎癌（ＫＩＲＣ）、のステージＩ腫瘍とステージＩＶ腫瘍（ｎ＝８種類の癌）との間の、微生物モデルによる組織に基づく識別については良好であったが、他方、試験した他の５種類の癌（図４ｈ）における識別も、中間的段階の識別も良好というわけではなかった（データ非提示）。これらの結果は、微生物群の構成動態学が、あらゆる癌種で宿主組織によって規定されるような癌の病期に相関するものではないことを示唆する。
【0149】
データセットを通じてのそのような技術の一般化可能性を評価するため、無作為ＴＣＧＡ微生物生カウントを２バッチに選別し、それぞれについて全処理を独立に反復し、それぞれを独立に訓練したモデルを、該データのもう一方の半分について試験した；その結果、非常に類似した性能が認められた（図１０ａ）。個々の方法論（ＷＧＳまたはＲＮＡ－ｓｅｑ）あるいはＷＧＳまたはＲＮＡ－ｓｅｑのいずれかを実施したシーケンシングセンターを調べた場合には、またはゲノム整列ふるい分けＫｒａｋｅｎデータのみを用い多場合には、識別微生物シグニチャーが保持された。
【0150】
さらなる検証を行うために、ＳＨＯＧＵＮを用いた；これは、Ｋｒａｋｅｎに基づく分析において癌の全分析種別（ｎ＝３２）、試料種別（ｎ＝７）、シーケンシングプラットフォーム（ｎ＝６）、およびシーケンシングセンター（ｎ＝８）を網羅する１３，５１７ＴＣＧＡ試料（ＷＧＳ、ｎ＝３，４３４；ＲＮＡ－ｓｅｑ、ｎ＝１０，０８３）についての、系統発生的に基づく、縮小した細菌のみのデータベースを用いた、整列化に基づく微生物分類パイプラインである。ＳＨＯＧＵＮに基づくデータは、用いた基本データベースが非同一で小規模であるにもかかわらず、Ｋｒａｋｅｎに基づくデータにおいて同定したバッチ効果を再現した（図１１ｊ～ｌ）。このデータおよびＫｒａｋｅｎに基づくデータ（「方法」を参照のこと）の対応するサブセットを、独立に正規化およびＭＬパイプラインに入力したが、データセット間で識別能に大きな差異は認められなかった（図１１ｍ～ｔ）。それと共に、この結果は、微生物常在叢が各癌種に固有であること、ならびに微生物プロファイルのみに基づいて癌を識別する正規化およびモデル訓練のアプローチがより広範に応用可能であることを示している。
【0151】
微生物プロファイルの生物学的妥当性
この微生物シグニチャーの強力な識別を前提として、生態学的に予想される結果および／または臨床的に試験される結果を用いて、それらの生物学的妥当性の証拠を検討した。癌関連微生物が生態学的に予想されるもの（すなわち、「天然の」臓器特異的共生群の一部）であるか否かについて評価するために、ＣＯＡＤコホートの７０固形組織正常試料および１２２皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）原発腫瘍（「方法」を参照のこと）から、身体部位の寄与を推定することを目的として、本明細書に記載される微生物検出および正規化のパイプラインで処理済みの、「ヒト微生物叢プロジェクト２（ＨＭＰ２）」のプロジェクトにおける８身体部位にわたり、２１７試料のデータに基づいて、ベイズ微生物ソーストラッキングアルゴリズムを訓練した。糞便はＣＯＡＤプロファイルに対してみの公知の主要な身体部位寄与因子であり（平均値±標準誤差の分率的寄与、２０．１７±２．５５％；図５ａ）、ＳＫＣＭプロファイルに対しては寄与因子とはならなかった（片側マン＝ホイットニーＵ検定、Ｐ＝０．００１４；図１２ｂ）；このことは、群落の一部が局所的ソースを有することを示唆している。
この微生物シグニチャーの強力な識別を前提として、生態学的に予想される結果および／または臨床的に試験される結果を用いて、それらの生物学的妥当性の証拠を検討した。癌関連微生物が生態学的に予想されるもの（すなわち、「天然の」臓器特異的共生群の一部）であるか否かについて評価するために、ＣＯＡＤコホートの７０固形組織正常試料および１２２皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）原発腫瘍（「方法」を参照のこと）から、身体部位の寄与を推定することを目的として、本明細書に記載される微生物検出および正規化のパイプラインで処理済みの、「ヒト微生物叢プロジェクト２（ＨＭＰ２）」のプロジェクトにおける８身体部位にわたり、２１７試料のデータに基づいて、ベイズ微生物ソーストラッキングアルゴリズムを訓練した。糞便はＣＯＡＤプロファイルに対してみの公知の主要な身体部位寄与因子であり（平均値±標準誤差の分率的寄与、２０．１７±２．５５％；図５ａ）、ＳＫＣＭプロファイルに対しては寄与因子とはならなかった（片側マン＝ホイットニーＵ検定、Ｐ＝０．００１４；図１２ｂ）；このことは、群落の一部が局所的ソースを有することを示唆している。
【0152】
フゾバクテリウム属の複数菌種は消化管の腫瘍の発生および進行に重要であり、フゾバクテリウム属は固形組織正常試料（すべてのＰ?８．５×１０?３）および特に血液由来正常試料（すべてのＰ?３．３×１０?１１；図５ｂ）に比較して原発腫瘍で過剰であった。ＴＣＧＡ（ｎ＝８）における広義の全ての消化管（ＧＩ）癌を、原発腫瘍組織（Ｐ＜２．２×１０?１６）の非ＧＩ癌（ｎ＝２４）および隣接固形組織正常試料（Ｐ＝０．０３１；図５ｃ、図１２ａ）の両方に対して比較した場合に、汎癌分析によってもフゾバクテリウム属が過剰であることが示された。ＴＣＧＡのＳＴＡＤに関する以前の研究と同様に、ヘリコバクター・ピロリについては、原発腫瘍と隣接固形組織正常試料との間で何らの差異も検出されなかった（Ｐ＝０．７２、データ非提示；すべて検定は両側マン＝ホイットニーＵ検定であった）。
【0153】
ＴＣＧＡの臨床的注釈に記載されているウイルス感染が確認され、ＴＣＧＡでウイルス叢を調べた研究に対し、微生物検出パイプラインを用いて比較を行った；この比較に用いたのは、以下の異なる２種類の生物情報学的パイプラインであった：
（ｉ）デノボメタゲノムアセンブリ法および（ｉｉ）リードによる方法（ＰａｔｈＳｅｑアルゴリズム）。ＣＥＳＣおよび頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣ）の試料において臨床検査でＨＰＶ感染に「陽性」または「陰性」となった個体の原発腫瘍間には、アルファパピローマウイルス属を識別する識別的存在量が存在していた（すべてのＰ?３×１０?９、両側マン＝ホイットニーＵ検定；図５ｄ～ｅ）。陰性対照として用いたＣＥＳＣ患者の血液由来正常試料では統計的差異がなく（Ｐ＝０．９９、両側マン＝ホイットニーＵ検定）、その他の全癌種および試料種別にわたる比較では、アルファパピローマウイルスについての特異的過剰が保たれていた（図１２ｃ）。Ｂ型肝炎の既往歴のある肝細胞癌（ＬＩＨＣ）患者では、アルコール摂取およびＣ型肝炎（ヘパシウイルス属）の既往歴のあるＬＩＨＣ患者と比較した場合に、原発腫瘍および隣接固形組織正常試料の両方にＨＢＶ属（オルソヘパドナウイルス）の特異的過剰が認められた（図５ｆ；原発腫瘍Ｐ?２．８×１０?７；固形組織正常Ｐ?０．０１１）；陰性対照として用いた血液由来正常試料では、統計的差異がなかった（Ｐ?０．４４；すべて検定は両側マン＝ホイットニーＵ検定であった）。以前の報告とも整合するが、ＳＴＡＤ分子サブタイプに帰属する患者と比較した場合に、ＥＢＶ感染原発腫瘍においてはＥＢＶ属（リンフォクリプトウイルス）が特異的過剰であった（図５ｇ；Ｐ?２．２×１０?１６）。陰性対照として用いた固形組織の正常試料および血液由来正常試料には、統計的差異が認められなかった（血液、Ｐ?０．５２；組織、?０．０９６；すべて検定は両側マン＝ホイットニーＵ検定であった）。
（ｉ）デノボメタゲノムアセンブリ法および（ｉｉ）リードによる方法（ＰａｔｈＳｅｑアルゴリズム）。ＣＥＳＣおよび頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣ）の試料において臨床検査でＨＰＶ感染に「陽性」または「陰性」となった個体の原発腫瘍間には、アルファパピローマウイルス属を識別する識別的存在量が存在していた（すべてのＰ?３×１０?９、両側マン＝ホイットニーＵ検定；図５ｄ～ｅ）。陰性対照として用いたＣＥＳＣ患者の血液由来正常試料では統計的差異がなく（Ｐ＝０．９９、両側マン＝ホイットニーＵ検定）、その他の全癌種および試料種別にわたる比較では、アルファパピローマウイルスについての特異的過剰が保たれていた（図１２ｃ）。Ｂ型肝炎の既往歴のある肝細胞癌（ＬＩＨＣ）患者では、アルコール摂取およびＣ型肝炎（ヘパシウイルス属）の既往歴のあるＬＩＨＣ患者と比較した場合に、原発腫瘍および隣接固形組織正常試料の両方にＨＢＶ属（オルソヘパドナウイルス）の特異的過剰が認められた（図５ｆ；原発腫瘍Ｐ?２．８×１０?７；固形組織正常Ｐ?０．０１１）；陰性対照として用いた血液由来正常試料では、統計的差異がなかった（Ｐ?０．４４；すべて検定は両側マン＝ホイットニーＵ検定であった）。以前の報告とも整合するが、ＳＴＡＤ分子サブタイプに帰属する患者と比較した場合に、ＥＢＶ感染原発腫瘍においてはＥＢＶ属（リンフォクリプトウイルス）が特異的過剰であった（図５ｇ；Ｐ?２．２×１０?１６）。陰性対照として用いた固形組織の正常試料および血液由来正常試料には、統計的差異が認められなかった（血液、Ｐ?０．５２；組織、?０．０９６；すべて検定は両側マン＝ホイットニーＵ検定であった）。
【0154】
これらのデータは、１癌種対残りの全癌種の識別を行うモデルによって提供される特徴量重要度の情報に一貫性がある。つまり、公知の微生物「ドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）」または「片利共生生物（ｃｏｍｍｅｎｓａｌ）」を伴う癌によって、モデルが生態学的に妥当であることの初めての証拠が提供されたことになる；例えば、アルファパピローマウイルス属はＣＥＳＣ腫瘍を同定する最も重要な特徴量であった；ＣＯＡＤ腫瘍に関しては、フィーカリバクテリウム属；ＬＩＨＣ腫瘍に関しては、オルソヘパドナウイルス属が２番目に最も重要な特徴量であった（肝毒性のミクロキスティス属の次）。総合すると、これらの知見は、上記の結果をさらに多くの試料および微生物に拡大することによって、ウイルスおよび細菌のデータの生物情報学的正規化アプローチの生態学的検証が成されることになる。
【0155】
混入汚染の評価および軽減
様々な実施態様において、予想される癌関連微生物を最も良好に特徴付けるために汚染の潜在的効果を評価し軽減することが重要であろう。以前の研究では、複数癌種について通常の低リード存在量に基づき、ＴＣＧＡにおいて６種類の汚染（表皮ブドウ球菌、アクネ菌、ラルストニア属の複数菌種、マイコバクテリウム属、シュードモナス菌、およびアシネトバクター属）を同定したが、最近の研究によって、被検試料濃度に逆相関する頻度であって、ロバスト統計フレームワークを用いて検出可能頻度を、外部汚染物がより一貫して有することが明らかにされている。
様々な実施態様において、予想される癌関連微生物を最も良好に特徴付けるために汚染の潜在的効果を評価し軽減することが重要であろう。以前の研究では、複数癌種について通常の低リード存在量に基づき、ＴＣＧＡにおいて６種類の汚染（表皮ブドウ球菌、アクネ菌、ラルストニア属の複数菌種、マイコバクテリウム属、シュードモナス菌、およびアシネトバクター属）を同定したが、最近の研究によって、被検試料濃度に逆相関する頻度であって、ロバスト統計フレームワークを用いて検出可能頻度を、外部汚染物がより一貫して有することが明らかにされている。
【0156】
後者のアプローチに基づいて、ＴＣＧＡ試料処理中に計算したＤＮＡ濃度およびＲＮＡ濃度（ｎ＝１７，６２５）ならびに分類リード分率（ｎ＝１，９９３）を用いて、推定混入物を識別し、また「陰性ブランク」試薬に典型的に含まれる属の除去を行った（ｎ＝９４属；「方法」を参照のこと）。図１３ａは、外科的切除から生物情報学的処理までのアプローチの概要を示すものである；５種類の擬似汚染物を生データセットに混入させてから、除染、教師あり正規化、およびＭＬを通じてその追跡を行った。公知の技術的変動を前提として（図４ｃ～ｅ）、シーケンシングセンター（ｎ＝８）によるバッチで試料を処理し、センターでの汚染物と見なされる分類群を除染した。これによって、試薬「ブラックリスト」の１９．１％（ｎ＝１８属）を含む２８３推定汚染物を同定した。これら２つのリストを組み合わせた（ｎ＝３７７属）後に、病原性共生生物属または複合的証拠（ｍｉｘｅｄ－ｅｖｉｄｅｎｃｅ）を示す属（病原体および通常の混入物の両方；例えば、マイコバクテリウム属）については再び許容するため、文献の用手的再調査を行った。これによって２つのデータセットが得られた：一方は、除去された汚染の可能性が高い混入物であり、他方は除去された全推定混入物であった。第３の「最も厳密なフィルタリング」データセットを作成したが、これは、より厳密なフィルタリングスキーマを用いて総リードの約９２％を廃棄したものである（「方法」を参照のこと；図１３ｂ）。最後に、試料をセンター毎に個別のシーケンシングプレートに群分けし、前述の試薬ブラックリストに加えて（総計４９７属）、「プレート／センター」バッチで同定した全推定混入物を除去した（ｎ＝３５１；「方法」を参照のこと）。除染は、試験している試料または癌種に識別的影響を与えることはなかったと思われる（図１４ａ～ｃ）。
【0157】
少なくともいくつかの実施態様においては、インシリコ除染は、癌試料について実施する代表的な微生物学的処置の代替とはならない；そのような微生物学的処置としては、滅菌処理、無菌であることが保証された試薬、開始から終了までの処理試薬の陰性ブランク、および「陽性」対照としての複数試料プールが挙げられる。本明細書に記載されるインシリコツールは最先端を反映するものではあるが、汚染物または交差汚染物の過剰「スパイク」を検出するように設計されているわけではない。これら後者の汚染物は、数多くのセンターおよび多年にわたって収集した癌の種別間および種別内で均一な識別シグナルを生成させるものではないのだが、特に小規模試験においては、対照試験でない限り、生物学的結論が限定的となることがある。
【0158】
少なくともいくつかの実施態様においては、厳密な除染によるリスクは、片利共生性の組織特異的微生物常在叢を反映する実シグナルおよびそれに付随する癌予測微生物プロファイルが消失することである。この懸念を検証するために、ＣＯＡＤ固形組織正常試料（ｎ＝７０）を身体部位帰属（％）について再計算してもよく、逐次的に厳密化した除染によって付随組織認識が改善され続け、その後に改善が認められなくなることが分かった（図１３ｃ～ｆ）。
【0159】
図４ｆ～ｈに示すＭＬモデルを再計算して、各除染アプローチの前後でそれらの性能を比較した（図１３ｇ～ｌ）。大部分のモデルでは混入させた擬似汚染物に依存しなかったが（図１５ａ）、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）および中皮腫（ＭＥＳＯ）のモデル（利用可能試料が極少ない）は例外的であると思われ信頼性を欠く可能性がある。予想通り、組織の種類に関する情報が有益である（例えば、ＣＯＡＤ対他の全ての癌種）比較の場合には、厳密な除染によって一般的に性能が低下したが、組織内比較（例えば、腫瘍対正常）では多くの場合、等しく良好であるか、あるいはより良好であった。これらの結果は、特定の比較では、厳密なフィルタリングが望ましいこともあるが、除染に対する普遍的アプローチが生物学的に有益な結果を阻む可能性があることを示唆する。
【0160】
血液中の微生物ＤＮＡを用いた予測
血液の微生物ＤＮＡ（ｍｂＤＮＡ）が癌の臨床的情報（血液障壁壊またはリンパ破壊（例えば、ＣＯＡＤ）を特徴付けるものを含む）を与え得る多くの証拠が存在するが、当該技術分野の現在の状況に基づいて、これが如何に広範に当てはまるのかは定かではない。ＴＣＧＡ血液試料のＷＧＳデータを用いて、完全データセットおよび４種類の除染データセットにＭＬ方略を応用し、その結果、微生物分類アルゴリズムおよび分類に用いたデータベースに関係なく、血液内ｍｂＤＮＡでは、かなり多くの癌種間の識別が可能であり（図６ａ）、あるいはゲノム整列ふるい分けＫｒａｋｅｎデータのみを用いてかなり多くの癌種間の識別が可能である（図１１ｇ、図１１ｈ、図１１ｓ、および図１１ｔ）ことが明らかになった。後ろ向き分析から、予測について混入擬似汚染物を含むモデルはほとんどないことが明らかになった（図１５ｂ）；これを含んでいたモデル（ＣＥＳＣ、ＫＩＲＰ、ＬＩＨＣ）はより信頼性の低いと思われる。
血液の微生物ＤＮＡ（ｍｂＤＮＡ）が癌の臨床的情報（血液障壁壊またはリンパ破壊（例えば、ＣＯＡＤ）を特徴付けるものを含む）を与え得る多くの証拠が存在するが、当該技術分野の現在の状況に基づいて、これが如何に広範に当てはまるのかは定かではない。ＴＣＧＡ血液試料のＷＧＳデータを用いて、完全データセットおよび４種類の除染データセットにＭＬ方略を応用し、その結果、微生物分類アルゴリズムおよび分類に用いたデータベースに関係なく、血液内ｍｂＤＮＡでは、かなり多くの癌種間の識別が可能であり（図６ａ）、あるいはゲノム整列ふるい分けＫｒａｋｅｎデータのみを用いてかなり多くの癌種間の識別が可能である（図１１ｇ、図１１ｈ、図１１ｓ、および図１１ｔ）ことが明らかになった。後ろ向き分析から、予測について混入擬似汚染物を含むモデルはほとんどないことが明らかになった（図１５ｂ）；これを含んでいたモデル（ＣＥＳＣ、ＫＩＲＰ、ＬＩＨＣ）はより信頼性の低いと思われる。
【0161】
これらの知見に基づき、ｃｔＤＮＡアッセイが失敗する状況下（ステージＩａ～ＩＩｃの癌および検出可能ゲノム変化のない腫瘍）に注目して、既存のｃｔＤＮＡアッセイに対しＭＬモデルのベンチマーク評価を行った。ステージＩＩＩ癌またはステージＩＶ癌の患者から全ての血液正常試料を除去した後に、新規ＭＬモデルを構築した；その結果、それらのモデルが、血液ｍｂＤＮＡを用いて癌種間を良好に識別し得ることが明らかになった（図６ｂ）。Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０およびＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ液体アッセイの遺伝子リストをさらに用いて、フィルタリングで１種類以上の標的修飾を有するＴＣＧＡ患者（約７０％；図１５ｃ～ｅ）を除外した；その結果、同一ＭＬアプローチは、残りのほとんどの癌種を良好に識別することが明らかになった（図６ｃ～ｄ）。
【0162】
これらの分析は、ｃｔＤＮＡアッセイでは全血ではなく血漿を用いること、および血液区分間のｍｂＤＮＡ分布が未知であることによって、制約を受けるものである。ｍｂＤＮＡが生きている微生物に由来するのか、あるいは死んだ微生物に由来するのかを区別することは不可能である；その理由はＲＮＡデータが利用不可能だからである；あるいはｍｂＤＮＡが無細胞であるのか宿主白血球中に存在するのかを区別することは不可能である；その理由はＴＣＧＡの標準的操作法（ＳＯＰ）を実施した場合には、全血も可能であり、またまたはバフィーコート抽出も可能だからである（「方法」を参照のこと）。１次試料および場合によっては適合消化管上皮を検査することなく、血液ｍｂＤＮＡの由来を知ることもまた不可能である；その理由は、特定種類の癌では、予想外の様式でｍｂＤＮＡが「漏出」することもある（例えば、白血病における消化管細菌の翻訳）。モデル性能に対する除染の効果は癌種によって変化したので、一連の理想的除染というものが存在する可能性は高いのだが、フィルタリングが以下の事柄によって制限されたのである：
（ｉ）一次試料にアクセスできないこと；
（ｉｉ）属レベルの分類的分離能；
および
（ｉｉｉ）どの非ＴＣＧＡ試料が並行処理されたのかが分からないこと。
（ｉ）一次試料にアクセスできないこと；
（ｉｉ）属レベルの分類的分離能；
および
（ｉｉｉ）どの非ＴＣＧＡ試料が並行処理されたのかが分からないこと。
【0163】
血液の微生物シグニチャーの検証
血漿を基盤とするｃｔＤＮＡアッセイのベンチマーク評価を行い、これらの結果の実環境有用性を証明する目的で、低バイオマス試験の代表的な微生物学的対照を用いながら、健常個体と複数癌種とを識別をする血漿由来無細胞ｍｂＤＮＡシグニチャーを用いて検証試験を行った。血漿は、ＴＣＧＡでは試験されていない全血の特有のサブセットであり、直接的比較可能性が限定されるが、保存安定性（例えば、凍結可能である性質）、バイオレポジトリー利用可能性、および生物学的解釈（すなわち、非生存材料）の点において重要な利点を有する。癌もＨＩＶも有していない６９個体および以下の３種類の高悪性度（ステージＩＩＩ～ＩＶ）癌のいずれかを有する１００人の患者をコホートに含めた：
（前立腺癌（ｎ＝５９；ＰＣ）；肺癌（ｎ＝２５；ＬＣ）、および黒色腫（ｎ＝１６；ＳＫＣＭ）（図７ａ）。効果量を推定する先行文献が存在しなかったので、最小サンプルサイズを推定するために、ブロード研究所およびＨＭＳで適合する癌種のＴＣＧＡ血液試料について独立したシミュレーションを用いた（図１６；「方法」を参照のこと）。広範な対照と共にこれらの血漿試料から無細胞ＤＮＡを抽出し（図１６ｂ～ｃ）、全メタゲノム配列決定のための処理を行ったのであるが、これは限定したユーザーチームにより、単一ライブラリー調製法を用い、単一バッチにて、１回のディープシーケンシングの実行で実施した。様々な実施態様において、技術としては、ヒトリード除去を実施すること、Ｋｒａｋｅｎによる残りのリードの分類、ＤＮＡ濃度および陰性ブランクの両方を用いた厳密な除染、およびＶｏｏｍ－ＳＮＭを含むものであった。人口構成比較および交換分析によって、年齢および性別に関する正規化の必要性が示唆された（図１６ｄ～ｅ、ｈ～ｊ；「方法」を参照のこと）；また、直接的な年齢退行化を実施したところ、腸管内菌叢に類似する平均絶対誤差を示した（図１６ｇ）。ＴＣＧＡ分析に用いた同一ＭＬプロトコルの「ブートストラッピング」では、健常対照個体と群化癌患者の間で一般的可能で強力な識別を示した（図７ｂ；「方法」を参照のこと）。用いたサンプルサイズが小規模であったため、正規化データにｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ（１サンプルのみをテストセットにとり、他のサンプルを訓練データとする）（ＬＯＯ）反復ＭＬを実施したところ、健常試料および癌種（最少ＳＫＣＭコホートを除く）の２者間およびそれらの間での対比較およびマルチクラス比較において高識別性能であることが分かった（図７ｃ～ｋ）。したがって、ＳＫＣＭコホートサイズにマッチするようにＰＣ群とＬＣ群をサブサンプリングし、サブサンプリングした健常対照に対する各癌種の対合的ＬＯＯ識別を実施した（図１６ｋ；「方法」を参照のこと）。ＰＣコホートおよびＬＣコホートは依然、ＳＫＣＭとして同一コホートサイズに分離可能であり（平均（９５％信頼区間（ＣＩ））ＡＵＲＯＣ＝０．８９１（０．８７９～０．９０３）；平均（９５％ＣＩ）ＡＵＰＲ＝０．８２７（０．８１５～０．８３９）；１００反復）、これにより、ＳＫＣＭ性能の普遍的欠陥が明らかになった。この欠陥には何らかの生物学的な基盤があるのかもしれない；その理由は、ＳＫＣＭは試験した５種類のデータセットのうち４種類についてＴＣＧＡ血液識別で２番目に性能が悪いものであった（図６ａ）；ただし、これにはさらなる確認が必要である。Ｋｒａｋｅｎによる微生物帰属が正しいことを確認するために、ＳＨＯＧＵＮおよびその分離データベースの細菌帰属を用いる、全ての生物情報学的工程、正規化工程、およびＭＬ工程を反復してみたが、それは非常に統一性のある性能を示した（図１７）。微生物データベースが改善すれば、ｃｆＤＮＡシグニチャーに関する分類群帰属の洗練化が期待される。検出した血漿微生物存在量は、ｃａｎｃｅｒｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ＣａｎｃｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ＿ＤａｔａＢｒｏｗｓｅｒで検索することができる（図１２ｄ～ｅ）。
血漿を基盤とするｃｔＤＮＡアッセイのベンチマーク評価を行い、これらの結果の実環境有用性を証明する目的で、低バイオマス試験の代表的な微生物学的対照を用いながら、健常個体と複数癌種とを識別をする血漿由来無細胞ｍｂＤＮＡシグニチャーを用いて検証試験を行った。血漿は、ＴＣＧＡでは試験されていない全血の特有のサブセットであり、直接的比較可能性が限定されるが、保存安定性（例えば、凍結可能である性質）、バイオレポジトリー利用可能性、および生物学的解釈（すなわち、非生存材料）の点において重要な利点を有する。癌もＨＩＶも有していない６９個体および以下の３種類の高悪性度（ステージＩＩＩ～ＩＶ）癌のいずれかを有する１００人の患者をコホートに含めた：
（前立腺癌（ｎ＝５９；ＰＣ）；肺癌（ｎ＝２５；ＬＣ）、および黒色腫（ｎ＝１６；ＳＫＣＭ）（図７ａ）。効果量を推定する先行文献が存在しなかったので、最小サンプルサイズを推定するために、ブロード研究所およびＨＭＳで適合する癌種のＴＣＧＡ血液試料について独立したシミュレーションを用いた（図１６；「方法」を参照のこと）。広範な対照と共にこれらの血漿試料から無細胞ＤＮＡを抽出し（図１６ｂ～ｃ）、全メタゲノム配列決定のための処理を行ったのであるが、これは限定したユーザーチームにより、単一ライブラリー調製法を用い、単一バッチにて、１回のディープシーケンシングの実行で実施した。様々な実施態様において、技術としては、ヒトリード除去を実施すること、Ｋｒａｋｅｎによる残りのリードの分類、ＤＮＡ濃度および陰性ブランクの両方を用いた厳密な除染、およびＶｏｏｍ－ＳＮＭを含むものであった。人口構成比較および交換分析によって、年齢および性別に関する正規化の必要性が示唆された（図１６ｄ～ｅ、ｈ～ｊ；「方法」を参照のこと）；また、直接的な年齢退行化を実施したところ、腸管内菌叢に類似する平均絶対誤差を示した（図１６ｇ）。ＴＣＧＡ分析に用いた同一ＭＬプロトコルの「ブートストラッピング」では、健常対照個体と群化癌患者の間で一般的可能で強力な識別を示した（図７ｂ；「方法」を参照のこと）。用いたサンプルサイズが小規模であったため、正規化データにｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ（１サンプルのみをテストセットにとり、他のサンプルを訓練データとする）（ＬＯＯ）反復ＭＬを実施したところ、健常試料および癌種（最少ＳＫＣＭコホートを除く）の２者間およびそれらの間での対比較およびマルチクラス比較において高識別性能であることが分かった（図７ｃ～ｋ）。したがって、ＳＫＣＭコホートサイズにマッチするようにＰＣ群とＬＣ群をサブサンプリングし、サブサンプリングした健常対照に対する各癌種の対合的ＬＯＯ識別を実施した（図１６ｋ；「方法」を参照のこと）。ＰＣコホートおよびＬＣコホートは依然、ＳＫＣＭとして同一コホートサイズに分離可能であり（平均（９５％信頼区間（ＣＩ））ＡＵＲＯＣ＝０．８９１（０．８７９～０．９０３）；平均（９５％ＣＩ）ＡＵＰＲ＝０．８２７（０．８１５～０．８３９）；１００反復）、これにより、ＳＫＣＭ性能の普遍的欠陥が明らかになった。この欠陥には何らかの生物学的な基盤があるのかもしれない；その理由は、ＳＫＣＭは試験した５種類のデータセットのうち４種類についてＴＣＧＡ血液識別で２番目に性能が悪いものであった（図６ａ）；ただし、これにはさらなる確認が必要である。Ｋｒａｋｅｎによる微生物帰属が正しいことを確認するために、ＳＨＯＧＵＮおよびその分離データベースの細菌帰属を用いる、全ての生物情報学的工程、正規化工程、およびＭＬ工程を反復してみたが、それは非常に統一性のある性能を示した（図１７）。微生物データベースが改善すれば、ｃｆＤＮＡシグニチャーに関する分類群帰属の洗練化が期待される。検出した血漿微生物存在量は、ｃａｎｃｅｒｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ＣａｎｃｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ＿ＤａｔａＢｒｏｗｓｅｒで検索することができる（図１２ｄ～ｅ）。
【0164】
総合すると、上記のデータは多様な癌種と特異的微生物叢との間に一般的な関連性が存在することを示唆する。低悪性度腫瘍ステージの血液ｍｂＤＮＡおよび市販のｃｔＤＮＡアッセイで検出可能なゲノム変化の全くない患者の血液ｍｂＤＮＡを用いた場合を含み、これらの微生物プロファイルは、ほとんどの癌種内および癌種間の識別するようである。これらの結果は、全データの９０％超が除去されることもあるような、広範な内部検証チェックおよび除染を行った後であっても、多くの場合、依然として正しい。ＴＣＧＡよりも広範な内部混入および外部混入に関する対照を選択しながらも、血漿中の無細胞ｍｂＤＮＡのみを用いた場合に、健常対照個体と複数癌種患者における識別性能が高いことは、広く利用可能な試料を用いた臨床的に妥当な後ろ向き試験が実施可能でかつ一般化可能なものであることを示唆している。これらの結果は、微生物叢に基づく新しいクラスの癌診断ツールが患者に実質的な将来価値を提供し得るものであることを示唆するのである。
【0165】
ヒト情報に基づいて６９％～７９％の正解率で由来転移組織を診断する従来法（ＰＭＩＤ：２３２８７００２）と比較すれば、本発明は微生物情報に基づき少なくとも約９４％の正解率を提供する。宿主情報と微生物情報を組み合わせることによって、この正解率を９５％～１００％の正解率など、さらに上昇させることが可能であると予測される。この正解率は本発明者が以前に報告したデータセット（ＰＭＩＤ：３２２１４２４４）を用いて決定した；この報告は腫瘍内微生物叢または血液由来微生物叢に基づいて、転移性癌の種類を分離しうるか否かについて検索したものである。このデータセットは、微生物のＤＮＡおよびＲＮＡを調べる目的で収集した複数の既知転移性癌種別（例えば、乳癌、甲状腺癌、黒色腫）の試料によるものであり、微生物のＤＮＡおよびＲＮＡのみを用いて癌種を識別する識別性能の特徴付けに機械学習を利用したのである。
【0166】
本明細書に記載の機械学習法は、本発明者が開発し以前に報告したものであり（ＰＭＩＤ：３２２１４２４４）、またＰＣＴ出願ＷＯ２０２００９３０４０Ａ１によって公開したものである；これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。例として、腫瘍内微生物核酸のみを用いて乳癌転移を甲状腺癌転移と比較した；その結果、高い識別性能を示した（ＲＯＣ曲線下面積＝０．８８９、ＰＲ曲線下面積＝０．９４３、正解率＝９４．４％）。実質的に、本発明の一実施態様は微生物情報を用いた転移性癌の由来組織の診断を提供する。その他の実施態様においては、本発明は、転移性腫瘍を有する宿主から原発腫瘍を有する宿主を識別する分析を提供し、それによって転移の存在を診断する。
【0167】
方法
ＴＣＧＡデータアクセッション
全ＴＣＧＡ配列データは、ＳｅｖｅｎＢｒｉｄｇｅｓによって支援される癌ゲノミックスクラウド（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｌｏｕｄ（ＣＧＣ））でアクセスした。ＴＣＧＡのＳＯＰはＮＣＩ生物試料研究データベース（Ｂｉｏｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ）でアクセスした。分子サブタイプを含む適合化患者のメタデータは、ＴＣＧＡ変異Ｒパッケージから、ＳｅｖｅｎＢｒｉｄｇｅｓおよびシステムバイオロジー研究所（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＩＳＢ））の両者を経由してＣＧＣにアクセスした；あるいは、それぞれのＴＣＧＡ公開物の補足データから直接取得した。全てのＴＣＧＡ患者についてのゲノム変化状態を検索要求してｃＢｉｏＰｏｒｔａｌでダウンロードした。市販のｃｔＤＮＡアッセイの遺伝子パネルは、Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０アッセイおよびＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ液体アッセイに関する会社白書からアクセスした。ＴＣＧＡメタデータのアクセッションおよび階層形式からフラットテーブルへの変換については、ＳｅｖｅｎＢｒｉｄｇｅｓのメタデータ・オントロジーに検索要求し、可能であればデータ整理を行った；オントロジーに保存されていない情報については、直近にリリースされたそのメタデータに、ＩＳＢ ＣＧＣ Ｒプログラム言語ＡＰＩを利用してアクセスした。
ＴＣＧＡデータアクセッション
全ＴＣＧＡ配列データは、ＳｅｖｅｎＢｒｉｄｇｅｓによって支援される癌ゲノミックスクラウド（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｌｏｕｄ（ＣＧＣ））でアクセスした。ＴＣＧＡのＳＯＰはＮＣＩ生物試料研究データベース（Ｂｉｏｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ）でアクセスした。分子サブタイプを含む適合化患者のメタデータは、ＴＣＧＡ変異Ｒパッケージから、ＳｅｖｅｎＢｒｉｄｇｅｓおよびシステムバイオロジー研究所（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＩＳＢ））の両者を経由してＣＧＣにアクセスした；あるいは、それぞれのＴＣＧＡ公開物の補足データから直接取得した。全てのＴＣＧＡ患者についてのゲノム変化状態を検索要求してｃＢｉｏＰｏｒｔａｌでダウンロードした。市販のｃｔＤＮＡアッセイの遺伝子パネルは、Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０アッセイおよびＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ液体アッセイに関する会社白書からアクセスした。ＴＣＧＡメタデータのアクセッションおよび階層形式からフラットテーブルへの変換については、ＳｅｖｅｎＢｒｉｄｇｅｓのメタデータ・オントロジーに検索要求し、可能であればデータ整理を行った；オントロジーに保存されていない情報については、直近にリリースされたそのメタデータに、ＩＳＢ ＣＧＣ Ｒプログラム言語ＡＰＩを利用してアクセスした。
【0168】
専用ワークフローを作成する目的で、生物情報学ツールを、ＣＧＣプラットフォーム（例えば、ｓａｍｔｏｏｌｓ、ＢＷＡ）から直接的にロードするか、あるいは異なるＤｏｃｋｅｒコンテナにアップロードして実行した。これらのワークフローでは、試料ＢＡＭファイルを入力して、各試料内のどのＤＮＡリードまたはＲＮＡリードが微生物のものであるかをラベル付けする。
【0169】
公知のヒト参照ゲノム（未加工ＢＡＭファイルのマッピング情報に基づく）に対して整列化されなかった配列リードは、Ｋｒａｋｅｎアルゴリズムを用いて、全ての公知の細菌、古細菌およびウイルスの微生物ゲノムに対してマップした。ＲｅｐｏＰｈｌａｎを用いて、総計７１，７８２微生物ゲノムをダウンロードした；そのうち、５，５０３がウイルスであり、６６，２７９が細菌または古細菌であった。先行文献に基づき、質的スコアが０．８またはそれより良好であるものについて細菌および古細菌のゲノムをふるい分けした；その結果、細菌および古細菌のゲノムのうち５４，４７１が残り、その後の分析に用いたが、ウイルスゲノムを合わせて総計が５９，９７４微生物ゲノムであった。
【0170】
上記に説明されるように、Ｋｒａｋｅｎアルゴリズムでは、各シーケンシングリードをｋマー（例えば、デフォルトでは３１マー）に分解し、各ｋマーを微生物ｋマーのデータベースに完全マッチさせる；該アルゴリズムを実行する前に、上記の５９，９７４微生物ゲノムから、この構築を行った。所定のリードに関するｋマーの完全マッチセットは、次に、そのリードの最も下位の共通祖先を属レベルに最も正確に推定上の分類群に帰属させる（本明細書中に提示のデータはこの属レベルに集約させるのである）。マッチングと分類の演算は、直接的ゲノム整列化の実行よりも数桁速い。疑陽性に対する予防策として、またパイプラインの適切なベンチマーク評価を実施するために、４種類の癌（ＳＴＡＤ、ＣＥＳＣ、ＯＶおよびＬＵＡＤ）を選択し、Ｋｒａｋｅｎで微生物として分類したリードを、ＢＷＡを用いて５９，９７４微生物ゲノムに整列化した；これは、コンピューター的にはよりコストのかかるものであるが、より高い特異性と分類的分解能（すなわち、種レベルおよび株レベルの分解能）を有する結果が得られる。直接的に整列化したこれら４種類の癌は、以下を含むものであった：
推定陽性ウイルス対照（ＨＰＶについて）としてＣＥＳＣ；
推定陽性細菌対照（ピロリ菌について）としてＳＴＡＤ；
および文献に含まれる微生物シグニチャー、および／または質量分析法により利用可能なプロテオーム情報（データ非提示）の微生物シグニチャーに基づく他の２種類（ＬＵＡＤ、ＯＶ）。Ｋｒａｋｅｎで属レベルまたはそれより低いレベルに分類されたリードの９８．９１％（様々な知見の基盤となる）はまた、ＢＷＡによって微生物データ（細菌、古細菌、ウイルス）に対して整列化されることが明らかになった；また疑陽性率については１．０９％であった；このことは、属レベルの、Ｋｒａｋｅｎでラベル付けした汎癌微生物リードが将来の分析に充分利用可能であることを示唆している。
推定陽性ウイルス対照（ＨＰＶについて）としてＣＥＳＣ；
推定陽性細菌対照（ピロリ菌について）としてＳＴＡＤ；
および文献に含まれる微生物シグニチャー、および／または質量分析法により利用可能なプロテオーム情報（データ非提示）の微生物シグニチャーに基づく他の２種類（ＬＵＡＤ、ＯＶ）。Ｋｒａｋｅｎで属レベルまたはそれより低いレベルに分類されたリードの９８．９１％（様々な知見の基盤となる）はまた、ＢＷＡによって微生物データ（細菌、古細菌、ウイルス）に対して整列化されることが明らかになった；また疑陽性率については１．０９％であった；このことは、属レベルの、Ｋｒａｋｅｎでラベル付けした汎癌微生物リードが将来の分析に充分利用可能であることを示唆している。
【0171】
ＳＨＯＧＵＮ ＴＣＧＡの生物情報学的処理
異なる分類識別アルゴリズムを用いた癌種識別の頑健性を評価する目的で、以前に報告された浅いショットガン分類帰属アプローチを利用し、またＴＣＧＡ試料に「Ｗｅｂ ｏｆ Ｌｉｆｅ」（ＷｏＬ；ＰＭＩＤ：３１７９２２１８；ｎ＝１０，５７５の細菌と古細菌のゲノム）とよばれる別の系統発生中心のデータベースを用いた。ＳＨＯＧＵＮは、Ｋｒａｋｅｎが利用するようなｋマーによる超高速アプローチではなく、コンピューターによる集中的直接的ゲノム整列化を分類学的帰属に利用している。ＴＣＧＡ試料の処理時間を短縮するために、Ｋｒａｋｅｎによって微生物由来と分類されたリードを、ＳＨＯＧＵＮ整列化関数の入力に用いた；このＳＨＯＧＵＮ整列化関数では、分類プロファイルを生成するＷｏＬデータベースに対してリードをマップするＢｏｗｔｉｅ２が用いられた。総計１３，５１７試料（ＷＧＳ：ｎ＝３，４３４；ＲＮＡ－ｓｅｑ：ｎ＝１０，０８３）の処理を行ったが、これはＫｒａｋｅｎ分析で試験するＴＣＧＡ全種類の癌（ｎ＝３２）、試料種別（ｎ＝７）、シーケンシングセンター（ｎ＝８）およびシーケンシングプラットフォーム（ｎ＝６）を網羅しており、ＳＨＯＧＵＮで再分析したＫｒａｋｅｎ分析の全試料を有するＴＣＧＡの２１癌種（ｎ＝９，４４４試料）を含むものであった。次いで、ＱＩＩＭＥ２を用いてプロファイルを属レベルに分離した。１，０２４個のインテルＩｖｙ－ｂｒｉｄｇｅコンピュートコアならびに３８４個のＡＭＤコンピュートコア、および１２ＴＢの総ＲＡＭを有するローカルコンピュートクラスター上で、コンピューター実時間でおおよそ５か月の期間をかけて、分析を実施した。用いた単一癌種当たりの典型的なジョブ依頼では、約３０コアおよび約２５０ＧＢのＲＡＭを使用した。
異なる分類識別アルゴリズムを用いた癌種識別の頑健性を評価する目的で、以前に報告された浅いショットガン分類帰属アプローチを利用し、またＴＣＧＡ試料に「Ｗｅｂ ｏｆ Ｌｉｆｅ」（ＷｏＬ；ＰＭＩＤ：３１７９２２１８；ｎ＝１０，５７５の細菌と古細菌のゲノム）とよばれる別の系統発生中心のデータベースを用いた。ＳＨＯＧＵＮは、Ｋｒａｋｅｎが利用するようなｋマーによる超高速アプローチではなく、コンピューターによる集中的直接的ゲノム整列化を分類学的帰属に利用している。ＴＣＧＡ試料の処理時間を短縮するために、Ｋｒａｋｅｎによって微生物由来と分類されたリードを、ＳＨＯＧＵＮ整列化関数の入力に用いた；このＳＨＯＧＵＮ整列化関数では、分類プロファイルを生成するＷｏＬデータベースに対してリードをマップするＢｏｗｔｉｅ２が用いられた。総計１３，５１７試料（ＷＧＳ：ｎ＝３，４３４；ＲＮＡ－ｓｅｑ：ｎ＝１０，０８３）の処理を行ったが、これはＫｒａｋｅｎ分析で試験するＴＣＧＡ全種類の癌（ｎ＝３２）、試料種別（ｎ＝７）、シーケンシングセンター（ｎ＝８）およびシーケンシングプラットフォーム（ｎ＝６）を網羅しており、ＳＨＯＧＵＮで再分析したＫｒａｋｅｎ分析の全試料を有するＴＣＧＡの２１癌種（ｎ＝９，４４４試料）を含むものであった。次いで、ＱＩＩＭＥ２を用いてプロファイルを属レベルに分離した。１，０２４個のインテルＩｖｙ－ｂｒｉｄｇｅコンピュートコアならびに３８４個のＡＭＤコンピュートコア、および１２ＴＢの総ＲＡＭを有するローカルコンピュートクラスター上で、コンピューター実時間でおおよそ５か月の期間をかけて、分析を実施した。用いた単一癌種当たりの典型的なジョブ依頼では、約３０コアおよび約２５０ＧＢのＲＡＭを使用した。
【0172】
ＴＣＧＡの技術的変動の定量測定と正規化
ＴＣＧＡシーケンシングセンター（ｎ＝８）間、シーケンシングプラットフォーム（ｎ＝６）間、実験的方略（ＷＧＳ対ＲＮＡ－ｓｅｑ）間の技術的変動、および可能性のある汚染が結果にどのような混乱を与え得るのかを知るために、生物学的変数に帰属させるシグナルを維持または増強させながら、バッチ効果を定量し除去するパイプラインを開発した。簡単に説明すると、メタデータが低品質である試料をフィルタリングで除外した（すなわち、欠落した人種または民族、ＩＣＤ１０国際疾病分類コード、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析物の量、またはＦＦＰＥステータス情報）；Ｖｏｏｍアルゴリズムを用いて、離散分類群カウントデータを、ほぼ正常に分布するログ－カウント・パー・ミリオン（ｌｏｇ－ｃｏｕｎｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ：発現量を全マッピング数で補正した値のＬｏｇ値）（ｌｏｇ－ｃｐｍ）データに変換し、これによってデータの異分散性をモデル化して除去するのである；および最後に、生物学的効果を保持しながら有意なバッチ効果を全て除去するために、そのデータの教師あり正規化（ＳＮＭ）を実施した。Ｖｏｏｍは従来からｌｉｍｍａと組み合わせて、離散的カウントデータの差分発現量（存在量）分析に用いられているが、ここでは「マイクロアレイ様」データへのアルゴリズム的変換に利用した；これによって、その後にＳＮＭが可能となる。ＶｏｏｍおよびＳＮＭのモデル行列は等価であり、両者間の予想される生物学的差異により、標的生物学的変数（ｎ＝７；例えば、原発腫瘍組織）として試料種別を用いて構築した；これに関するシグナルはＳＮＭ実施中に保持されるはずである；逆に、ＳＮＭ実施中に低減されるべき技術的共変量として、以下をモデル化した：シーケンシングセンター（ｎ＝８）、シーケンシングプラットフォーム（ｎ＝６）、実験的方略（ｎ＝２）、組織取得場所（ｎ＝１９１）、およびＦＦＰＥステータス（ｎ＝２；イエスかノー）。特定癌種とシーケンシングセンターとの間の完全交絡（すなわち、ある種類の癌が単一のＴＣＧＡ実施場所のみでシーケンシングされた）のため、疾患の種類を標的生物学的変数としてモデル化することは可能ではない。Ｖｏｏｍ変換では、ｌｉｍｍａのユーザーガイドに記載されるように、変化していない特徴量については除外（ｆｉｌｔｅｒＢｙＥｘｐｒ（）関数；ｅｄｇｅＲ）しながら、ほとんどのデータ（「完全データセット」、「除去した汚染物である可能性のある」データ、「プレート／センター除染」データ、および「除去した全推定汚染物」データ）にｅｄｇｅＲパッケージによるＭ値（ＴＭＭ）正規化の荷重トリム平均を用いた。他の場合（「最も厳密にフィルタリングした」データ、「ＳＨＯＧＵＮ ＴＣＧＡデータ」、「ＳＨＯＧＵＮ ＴＣＧＡデータにマッチさせたＫｒａｋｅｎ ＴＣＧＡデータ」および両方の血漿微生物叢データセット）には、分位点正規化を用いた；その理由は、厳密にふるい分けしＴＭＭ正規化した特徴量欠落データには、下流ＳＮＭ補正が不適合だからであり、これらのデータセットはすでに有意な低減がなされている、あるいは低特徴量カウントのものである。「最も厳密なフィルタリングを行った」データを除く、全分位点正規化データセットを、他の分位点正規化データセットに対して比較した。Ｖｏｏｍ調整データのＳＮＭ補正前後に、主成分を計算し、分散主成分分析（ＰＶＣＡ）によって、カウント生データ、Ｖｏｏｍ補正データ、およびＶｏｏｍ－ＳＮＭ正規化データの間で、これらの変化を定量した。ＰＶＣＡの数学的基礎についてはＮＩＥＨＳに詳細な説明があり、その推奨が６０％～９０％なので、それに基づいて調節可能な１パラメーターを８０％に設定した。
ＴＣＧＡシーケンシングセンター（ｎ＝８）間、シーケンシングプラットフォーム（ｎ＝６）間、実験的方略（ＷＧＳ対ＲＮＡ－ｓｅｑ）間の技術的変動、および可能性のある汚染が結果にどのような混乱を与え得るのかを知るために、生物学的変数に帰属させるシグナルを維持または増強させながら、バッチ効果を定量し除去するパイプラインを開発した。簡単に説明すると、メタデータが低品質である試料をフィルタリングで除外した（すなわち、欠落した人種または民族、ＩＣＤ１０国際疾病分類コード、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析物の量、またはＦＦＰＥステータス情報）；Ｖｏｏｍアルゴリズムを用いて、離散分類群カウントデータを、ほぼ正常に分布するログ－カウント・パー・ミリオン（ｌｏｇ－ｃｏｕｎｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ：発現量を全マッピング数で補正した値のＬｏｇ値）（ｌｏｇ－ｃｐｍ）データに変換し、これによってデータの異分散性をモデル化して除去するのである；および最後に、生物学的効果を保持しながら有意なバッチ効果を全て除去するために、そのデータの教師あり正規化（ＳＮＭ）を実施した。Ｖｏｏｍは従来からｌｉｍｍａと組み合わせて、離散的カウントデータの差分発現量（存在量）分析に用いられているが、ここでは「マイクロアレイ様」データへのアルゴリズム的変換に利用した；これによって、その後にＳＮＭが可能となる。ＶｏｏｍおよびＳＮＭのモデル行列は等価であり、両者間の予想される生物学的差異により、標的生物学的変数（ｎ＝７；例えば、原発腫瘍組織）として試料種別を用いて構築した；これに関するシグナルはＳＮＭ実施中に保持されるはずである；逆に、ＳＮＭ実施中に低減されるべき技術的共変量として、以下をモデル化した：シーケンシングセンター（ｎ＝８）、シーケンシングプラットフォーム（ｎ＝６）、実験的方略（ｎ＝２）、組織取得場所（ｎ＝１９１）、およびＦＦＰＥステータス（ｎ＝２；イエスかノー）。特定癌種とシーケンシングセンターとの間の完全交絡（すなわち、ある種類の癌が単一のＴＣＧＡ実施場所のみでシーケンシングされた）のため、疾患の種類を標的生物学的変数としてモデル化することは可能ではない。Ｖｏｏｍ変換では、ｌｉｍｍａのユーザーガイドに記載されるように、変化していない特徴量については除外（ｆｉｌｔｅｒＢｙＥｘｐｒ（）関数；ｅｄｇｅＲ）しながら、ほとんどのデータ（「完全データセット」、「除去した汚染物である可能性のある」データ、「プレート／センター除染」データ、および「除去した全推定汚染物」データ）にｅｄｇｅＲパッケージによるＭ値（ＴＭＭ）正規化の荷重トリム平均を用いた。他の場合（「最も厳密にフィルタリングした」データ、「ＳＨＯＧＵＮ ＴＣＧＡデータ」、「ＳＨＯＧＵＮ ＴＣＧＡデータにマッチさせたＫｒａｋｅｎ ＴＣＧＡデータ」および両方の血漿微生物叢データセット）には、分位点正規化を用いた；その理由は、厳密にふるい分けしＴＭＭ正規化した特徴量欠落データには、下流ＳＮＭ補正が不適合だからであり、これらのデータセットはすでに有意な低減がなされている、あるいは低特徴量カウントのものである。「最も厳密なフィルタリングを行った」データを除く、全分位点正規化データセットを、他の分位点正規化データセットに対して比較した。Ｖｏｏｍ調整データのＳＮＭ補正前後に、主成分を計算し、分散主成分分析（ＰＶＣＡ）によって、カウント生データ、Ｖｏｏｍ補正データ、およびＶｏｏｍ－ＳＮＭ正規化データの間で、これらの変化を定量した。ＰＶＣＡの数学的基礎についてはＮＩＥＨＳに詳細な説明があり、その推奨が６０％～９０％なので、それに基づいて調節可能な１パラメーターを８０％に設定した。
【0173】
汚染に対する懸念に対処するため、検証分析としてＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒ２を用いる
８か所の身体部位を拭き取り採取した総計２１７試料についての、ＮＩＨのＨＭＰ２プロジェクトのショットガンシーケンシングデータをダウンロードし、分類学的帰属を得るために、上記と同一のＴＣＧＡ Ｋｒａｋｅｎ微生物検出パイプラインを実行した（同一微生物データベース（ｎ＝５９，９７４の細菌、古細菌、およびウイルスのメタゲノムに対して実行することを含む）。ＴＣＧＡ癌微生物叢データ毎に、ＨＭＰ２データを属レベルにまとめ、次いでこれを利用してベイズソーストラッキングモデル（ＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒ２）の訓練を行った。ＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒに関する専門用語を用いるならば、これらのＨＭＰ２試料が「ソース」として働き、他方、Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ－正規化試料は「受信側（シンク（ｓｉｎｋ））」となるものであった；また、ＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒアルゴリズムを用いて、各受信側に帰属可能な各ソースの割合を算出した。一般用語で言えば、各Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ正規化した癌微生物叢試料に帰属可能なＨＭＰ２データから、ベイズモデルを用いて身体部位の割合を推定した。以下の３項を実施した後に、ＴＣＧＡ ＣＯＡＤコホートの固形組織正常試料（ｎ＝７０）および原発腫瘍ＳＫＣＭ試料（ｎ＝１２２）に、このモデルを当てはめた：
（ｉ）癌微生物叢データセットの属をＨＭＰ２の属と交差させること；
（ｉｉ）ｌｏｇ２（ｃｐｍ）正規化値を相対スケールの存在量に変換すること（ＨＭＰ２データには９１７，４５０リードが含まれるので、おおよそ百万の総リードとなるように１０６で基準化する）；
および
（ｉｉｉ）そのデータをＢＩＯＭ表フォーマットに変換すること。皮膚微生物叢の最良の代替として、ＳＫＣＭ原発腫瘍試料を、固形組織正常試料の代わりに選択した；その理由は、ＳＫＣＭにはたった一つの隣接固形組織正常試料しか利用できるものが無かったからである。両方の実行に、ＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒ２のデフォルト設定を用いた。各受信側に対する各ソースの平均の分率的寄与に関して、出力の計算を行った；次いで、これらの値の平均および標準誤差を算出した。ＣＯＡＤ試料およびＳＫＣＭ試料（図１２ｂ）に対する糞便の影響間の統計学的差異は片側マンホイットニーＵ検定を用いて算出した。４種類の除染データセットについて、上記のプロトコルを反復し図１３ｃ～ｆを作成した。
８か所の身体部位を拭き取り採取した総計２１７試料についての、ＮＩＨのＨＭＰ２プロジェクトのショットガンシーケンシングデータをダウンロードし、分類学的帰属を得るために、上記と同一のＴＣＧＡ Ｋｒａｋｅｎ微生物検出パイプラインを実行した（同一微生物データベース（ｎ＝５９，９７４の細菌、古細菌、およびウイルスのメタゲノムに対して実行することを含む）。ＴＣＧＡ癌微生物叢データ毎に、ＨＭＰ２データを属レベルにまとめ、次いでこれを利用してベイズソーストラッキングモデル（ＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒ２）の訓練を行った。ＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒに関する専門用語を用いるならば、これらのＨＭＰ２試料が「ソース」として働き、他方、Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ－正規化試料は「受信側（シンク（ｓｉｎｋ））」となるものであった；また、ＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒアルゴリズムを用いて、各受信側に帰属可能な各ソースの割合を算出した。一般用語で言えば、各Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ正規化した癌微生物叢試料に帰属可能なＨＭＰ２データから、ベイズモデルを用いて身体部位の割合を推定した。以下の３項を実施した後に、ＴＣＧＡ ＣＯＡＤコホートの固形組織正常試料（ｎ＝７０）および原発腫瘍ＳＫＣＭ試料（ｎ＝１２２）に、このモデルを当てはめた：
（ｉ）癌微生物叢データセットの属をＨＭＰ２の属と交差させること；
（ｉｉ）ｌｏｇ２（ｃｐｍ）正規化値を相対スケールの存在量に変換すること（ＨＭＰ２データには９１７，４５０リードが含まれるので、おおよそ百万の総リードとなるように１０６で基準化する）；
および
（ｉｉｉ）そのデータをＢＩＯＭ表フォーマットに変換すること。皮膚微生物叢の最良の代替として、ＳＫＣＭ原発腫瘍試料を、固形組織正常試料の代わりに選択した；その理由は、ＳＫＣＭにはたった一つの隣接固形組織正常試料しか利用できるものが無かったからである。両方の実行に、ＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒ２のデフォルト設定を用いた。各受信側に対する各ソースの平均の分率的寄与に関して、出力の計算を行った；次いで、これらの値の平均および標準誤差を算出した。ＣＯＡＤ試料およびＳＫＣＭ試料（図１２ｂ）に対する糞便の影響間の統計学的差異は片側マンホイットニーＵ検定を用いて算出した。４種類の除染データセットについて、上記のプロトコルを反復し図１３ｃ～ｆを作成した。
【0174】
ＴＣＧＡ ＭＬベンチマーク評価および一般化可能性
ベンチマーク評価および一般化可能性評価として、ＴＣＧＡを（シーケンシングセンター、試料種別、および疾患の種類にわたって）半分に分割してＫｒａｋｅｎに基づく、属レベルの微生物カウント生データの２つの層化データ（分割部分＃１：ｎ＝８，８１４；分割部分＃２、ｎ＝８，８１１）とし、その両方に対して個別にＶｏｏｍ－ＳＮＭプロトコルを実行した；正規化した各半分について別々のＭＬモデルを構築し、次いで、互いの正規化データについてこれらの調整ＭＬモデルを試験した。次に、これらのモデル性能を、完全Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ正規化データセット（ｎ＝１７，６３５試料）で構築した第３のＭＬモデルであって、５０％／５０％の訓練分割部分および試験分割部分を用いた第３のＭＬモデルに対して比較を行った。それぞれ５０％を提供した試験セットＡＵＲＯＣおよびＡＵＰＲを用いて３種類のアプローチ全てについて最終性能を比較した。さらなる内部検証として、以下のものを用いて、１癌種を残り全癌種に対して予測するモデルを構築した：
（ｉ）ＲＮＡ試料；
または
（ｉｉ）ＤＮＡ試料；
ならびに
（ｉｉｉ）ＲＮＡ－ｓｅｑ（ＵＮＣ）
または
（ｉｖ）ＤＮＡ－ｓｅｑ（ＨＭＳ）
のみを実施した１か所のシーケンシングセンターに由来する試料；
（図１０）。
ベンチマーク評価および一般化可能性評価として、ＴＣＧＡを（シーケンシングセンター、試料種別、および疾患の種類にわたって）半分に分割してＫｒａｋｅｎに基づく、属レベルの微生物カウント生データの２つの層化データ（分割部分＃１：ｎ＝８，８１４；分割部分＃２、ｎ＝８，８１１）とし、その両方に対して個別にＶｏｏｍ－ＳＮＭプロトコルを実行した；正規化した各半分について別々のＭＬモデルを構築し、次いで、互いの正規化データについてこれらの調整ＭＬモデルを試験した。次に、これらのモデル性能を、完全Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ正規化データセット（ｎ＝１７，６３５試料）で構築した第３のＭＬモデルであって、５０％／５０％の訓練分割部分および試験分割部分を用いた第３のＭＬモデルに対して比較を行った。それぞれ５０％を提供した試験セットＡＵＲＯＣおよびＡＵＰＲを用いて３種類のアプローチ全てについて最終性能を比較した。さらなる内部検証として、以下のものを用いて、１癌種を残り全癌種に対して予測するモデルを構築した：
（ｉ）ＲＮＡ試料；
または
（ｉｉ）ＤＮＡ試料；
ならびに
（ｉｉｉ）ＲＮＡ－ｓｅｑ（ＵＮＣ）
または
（ｉｖ）ＤＮＡ－ｓｅｑ（ＨＭＳ）
のみを実施した１か所のシーケンシングセンターに由来する試料；
（図１０）。
【0175】
ＴＣＧＡの除染分析
大まかに言えば、次世代シーケンシングデータに影響を与える推定汚染には２種類の汚染がある：
すなわち、外部からの汚染（例えば、試薬、研究者または対象の身体、環境などに起因する汚染）および内部汚染（すなわち、処理中またはシーケンシング中の試料間で起こる交差混入）である。少なくとも一つの実施態様においては、除染アプローチは全体として、以下を試みることである：
（ｉ）予測能および／またはモデル信頼性の欠如に対する汚染の寄与を推定するために、汚染をシミュレーションすること；
（ｉｉ）外部からの汚染を可能な限り低減すること；
および
（ｉｉｉ）実用的な陽性対照および陰性対照を用いて内部汚染度を評価すること。最近の報告に記載されるように、全ＴＣＧＡ試料（ｎ＝１７，６２５）についての被検試料濃度を用い、またＴＣＧＡにおいて用いられたキットと同様のシーケンシングキット内の試薬に由来する微生物のブラックリストを用いることによって、外部からの汚染を同定し除去した。原試料へのアクセスなしに、また他のどの試料（特に、非癌試料）が同時に処理されたのかを知ることなく、内部汚染物を識別することは特に困難である。したがって、明確な交差汚染物であると同定し除去した内部汚染のみを示すならば、それはエボラウイルス属に帰属させた４リード（ブロード研究所の１つのＴＣＧＡ－ＬＧＧ試料に由来する２リードおよびＨＭＳの１つのＴＣＧＡ－ＨＮＳＣ試料に由来する２リード）であり、ＴＣＧＡ試験の収集期間（２００６～２０１６）にこれら同一のシーケンシングセンターで同時に行われた２０１４年の西アフリカでの感染大流行に関する研究に由来するものであることはほとんど確実であろう；また、マールブルグウイルス属に帰属させた４リード（ブロード研究所の２種類のＴＣＧＡ－ＯＶ試料に由来する）もおそらくは、類似の起源であるか、または疑陽性（すなわち、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスはいずれもフィロウイルス科である）であろう。このような処置は、目下の生物学事象に関連するはずがない微生物の帰属を除去するという以前に報告した研究に沿うものである。そのような交差汚染物、特に極度に低い存在量の交差汚染物が、数多くのセンターおよび複数年の期間にわたって収集した癌の種別間および種別内を識別する均一な識別シグナルを生起するというようなことはさらに可能性の低いことである。他の可能な交差汚染物については、それらを識別して除去するよりも、生態学的に予想される群落の（上記の）ベイズ分析を用いて、それらの寄与を推定した。
大まかに言えば、次世代シーケンシングデータに影響を与える推定汚染には２種類の汚染がある：
すなわち、外部からの汚染（例えば、試薬、研究者または対象の身体、環境などに起因する汚染）および内部汚染（すなわち、処理中またはシーケンシング中の試料間で起こる交差混入）である。少なくとも一つの実施態様においては、除染アプローチは全体として、以下を試みることである：
（ｉ）予測能および／またはモデル信頼性の欠如に対する汚染の寄与を推定するために、汚染をシミュレーションすること；
（ｉｉ）外部からの汚染を可能な限り低減すること；
および
（ｉｉｉ）実用的な陽性対照および陰性対照を用いて内部汚染度を評価すること。最近の報告に記載されるように、全ＴＣＧＡ試料（ｎ＝１７，６２５）についての被検試料濃度を用い、またＴＣＧＡにおいて用いられたキットと同様のシーケンシングキット内の試薬に由来する微生物のブラックリストを用いることによって、外部からの汚染を同定し除去した。原試料へのアクセスなしに、また他のどの試料（特に、非癌試料）が同時に処理されたのかを知ることなく、内部汚染物を識別することは特に困難である。したがって、明確な交差汚染物であると同定し除去した内部汚染のみを示すならば、それはエボラウイルス属に帰属させた４リード（ブロード研究所の１つのＴＣＧＡ－ＬＧＧ試料に由来する２リードおよびＨＭＳの１つのＴＣＧＡ－ＨＮＳＣ試料に由来する２リード）であり、ＴＣＧＡ試験の収集期間（２００６～２０１６）にこれら同一のシーケンシングセンターで同時に行われた２０１４年の西アフリカでの感染大流行に関する研究に由来するものであることはほとんど確実であろう；また、マールブルグウイルス属に帰属させた４リード（ブロード研究所の２種類のＴＣＧＡ－ＯＶ試料に由来する）もおそらくは、類似の起源であるか、または疑陽性（すなわち、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスはいずれもフィロウイルス科である）であろう。このような処置は、目下の生物学事象に関連するはずがない微生物の帰属を除去するという以前に報告した研究に沿うものである。そのような交差汚染物、特に極度に低い存在量の交差汚染物が、数多くのセンターおよび複数年の期間にわたって収集した癌の種別間および種別内を識別する均一な識別シグナルを生起するというようなことはさらに可能性の低いことである。他の可能な交差汚染物については、それらを識別して除去するよりも、生態学的に予想される群落の（上記の）ベイズ分析を用いて、それらの寄与を推定した。
【0176】
まず、５種類の擬似汚染物を生データセットに混入させ（図１３ａ、上部右側）、除染、ＳＮＭ、およびＭＬを通じてそれら擬似汚染物を追跡した。これは以下を含むものであった：
（１）ＨＭＳの全試料にわたる１，０００リード；
（２）ＨＭＳ、ベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ワシントン大学医科大学院（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、およびカナダのマイケルスミスゲノム科学センター（Ｃａｎａｄａ’ｓ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ）の全試料にわたる１，０００リード；
（３）すべてのシーケンシングセンターの全試料にわたる１，０００リード；
（４）ＨＭＳの無作為選択１００試料に混入させた１０６リード；
および
（５）すべてのシーケンシングセンターの無作為選択１，０００試料に混入させた１０６リード。全試料および全分類群にわたる平均の生リードカウントは１，４８１．２０であり、１，０００リードを含む擬似汚染物は「低レベル」バックグラウンドであると見なすことができるが、１０６リードの擬似汚染物は「高存在量」スパイクであると考えられる。擬似汚染物が訓練後下流ＭＬモデルに存在するのであれば、３種類の解釈があり得る：
特徴量重要度スコアによって擬似混入の予測寄与度（％）を評価し、無視し得るものであるか否かを決定する；
擬似汚染物よりも低いランクのモデル特徴量はいずれも除去する；
あるいは、
最も保守的には、モデル全体について信頼性を欠くものであるという警告を出す。
（１）ＨＭＳの全試料にわたる１，０００リード；
（２）ＨＭＳ、ベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ワシントン大学医科大学院（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、およびカナダのマイケルスミスゲノム科学センター（Ｃａｎａｄａ’ｓ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ）の全試料にわたる１，０００リード；
（３）すべてのシーケンシングセンターの全試料にわたる１，０００リード；
（４）ＨＭＳの無作為選択１００試料に混入させた１０６リード；
および
（５）すべてのシーケンシングセンターの無作為選択１，０００試料に混入させた１０６リード。全試料および全分類群にわたる平均の生リードカウントは１，４８１．２０であり、１，０００リードを含む擬似汚染物は「低レベル」バックグラウンドであると見なすことができるが、１０６リードの擬似汚染物は「高存在量」スパイクであると考えられる。擬似汚染物が訓練後下流ＭＬモデルに存在するのであれば、３種類の解釈があり得る：
特徴量重要度スコアによって擬似混入の予測寄与度（％）を評価し、無視し得るものであるか否かを決定する；
擬似汚染物よりも低いランクのモデル特徴量はいずれも除去する；
あるいは、
最も保守的には、モデル全体について信頼性を欠くものであるという警告を出す。
【0177】
ＴＣＧＡは、試料処理中に陰性ブランク試薬試験チューブを全く含んでいなかったので、本明細書に記載される技術においては、用いた類似の試薬および／またはライブラリー作成キットの属レベル微生物ブラックリストを対形式で作成することを試みた。ＴＣＧＡ ＳＯＰでは、組織のＤＮＡ抽出およびＲＮＡ抽出ならびに血液のＤＮＡ抽出については、主にＱＩＡＧＥＮ製品（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いていた：組織のＤＮＡ抽出およびＲＮＡ抽出はＤＮＡ／ＲＮＡ ＡｌｌＰｒｅｐキット、ならびに血液のＤＮＡ抽出はＱｉａＡｍｐ血液ミディキットであった。Ｓａｌｔｅｒとその共同研究者は、４年間の「陰性ブランク」シーケンシングおよび３か所の網羅的シーケンシングセンターにわたって取得した、メタゲノム実験におけるＤＮＡ抽出キット（ＴＣＧＡの血液抽出に用いたものと同一のシリカ膜によるＤＮＡ精製を利用したＱｉａＡｍｐキットを含む）の同様のリスト（ｎ＝９４属）について報告している。混入物の配列は、一般的に被検試料濃度に逆相関することが多いという事実に基づいて、推定外部汚染をさらに同定した。ロバスト統計フレームワークによって最近この原理１６が検証されたので、ＴＣＧＡに記録された試料ＤＮＡまたは試料ＲＮＡの濃度を、推定汚染物識別手段として利用する機会が提供されることになったのである。このフレームワークの主要な２つの仮定は：（ｉ）これらの汚染物は試料間において均一量で混入すること；および（ｉｉ）汚染物ＤＮＡまたは汚染物ＲＮＡの量は真の試料のＤＮＡまたはＲＮＡ（微生物または宿主）に比べて少量であること。次いで、付属のｄｅｃｏｎｔａｍ Ｒパッケージ（ｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｅｎｊｊｎｅｂ／ｄｅｃｏｎｔａｍ）を用いてフィルタリングを行ったが、この際に、推奨されるハイパーパラメーター閾値（Ｐ＊＝０．１）およびより厳密なアプローチ（Ｐ＊＝０．５）を用いた。以下に留意されたい：Ｐ＊＝０．５が、汚染物モデルまたは非汚染物モデルがその分布によりよくフィットする場合には、分類群が「汚染物である」または「汚染物ではない」として分類されることを意味する。カウント生データに対する実質的なばらつきがシーケンシングセンターに起因するものであったということが分かったので、それに対応するバッチでデータの処理を行った；それによって、次の段階として、いずれのセンターにおいても汚染物と識別した分類群をすべてのセンターに関して除外した（すなわち、ｄｅｃｏｎｔａｍでｂａｔｃｈ．ｃｏｍｂｉｎｅ＝「最小」）。次いで、汚染物推定リスト（Ｐ＊＝０．１：ｎ＝２８３属；Ｐ＊＝０．５：ｎ＝１，８１８属）を微生物ブラックリスト（ｎ＝９４属）と組み合わせ／交差させ、完全データセットから除外した。より小規模になった組み合わせ汚染物リスト（ｎ＝３７７）の用手的文献調査を行い、その結果、潜在的に病原体または片利共生生物である８９属を再び許容とした。これによって３種類の新規データセットが得られた：すなわち、「除去された汚染の可能性が高い混入物」、「除去された全推定汚染物」、および「最も厳密なフィルタリング」である。さらなる保守的方法として、ＴＣＧＡ試料バーコード（例えば、ＮＣＩの参照文献、ｓ：／／ｄｏｃｓ．ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ／ｐａｇｅｓ／ＴＣＧＡ＿Ｂａｒｃｏｄｅ／に示されるようなＴＣＧＡ－０２－０００１－０１Ｃ－０１Ｄ－０１８２－０１）と抽出したシーケンシングプレート／シーケンシングセンターの組み合わせ全てを取得した；それらは、バーコードの最後の２セットの整数によって区別されているのである（すなわち、この例では、センター０１のプレート０１８２、または０１８２－０１）。所定の分類群が汚染物として分類されるか否かを判定するために、ｄｅｃｏｎｔａｍは１バッチの全試料における分類リード分率と被検物質濃度との間の線形回帰と等価な計算を行うので、１バッチとしての適切性を確保するためには、プレート／センターの組み合わせ当たり１０試料（この場合、総計３５１のプレート／センターのバッチとなる）を超える試料数が必要であった。Ｐ＊＝０．１を用いた（デフォルト値）；また、上記と同様に、３５１バッチのうちいずれかの１バッチにおいて分類群を汚染物と同定した場合には（ｂａｔｃｈ．ｃｏｍｂｉｎｅ＝「最小」）、それをデータセットから除外した（ｎ＝４２１分類群：除外した分類群）。微生物ブラックリストと交差させたのちに、総計４９７属を除外した。これによって４番目の除染データセットが提供され、次いでそれら全てを上記のＳＮＭおよびＭＬパイプラインと同一のもので処理した。
【0178】
ＢＷＡ、ＳＨＯＧＵＮ、およびＫｒａｋｅｎのデー間のＭＬ性能比較
Ｋｒａｋｅｎに基づく帰属化（ｎ＝５９，９７４微生物ゲノム（細菌、古細菌およびウイルス））のために、用いた同一データベースに対してＢＷＡフィルタリングを適用した。次いで、実験的方略と試料カウントが減ったシーケンシングセンターとの間の交絡のため、ＤＮＡデータおよびＲＮＡデータを個別に正規化したことを除き、Ｖｏｏｍ－ＳＮＭによるＫｒａｋｅｎデータと同じ方法で、フィルタリングＢＷＡ微生物カウントデータをバッチ補正した。次いで、ＢＷＡ処理しＢＷＡデータと同じ方法で正規化した試料に対して、Ｋｒａｋｅｎに基づく生データ試料をマッチさせた。その結果、総計４種類の正規化データセットが得られた：すなわち、ＤＮＡ ＢＷＡデータ；ＲＮＡ ＢＷＡデータ；Ｋｒａｋｅｎサブセット化ＤＮＡデータ；およびＫｒａｋｅｎサブセット化ＲＮＡデータである。次いで、全４種類の正規化データセットをＭＬに入力して、それらの性能を互いに比較した（図１１ａ～ｈ）。
Ｋｒａｋｅｎに基づく帰属化（ｎ＝５９，９７４微生物ゲノム（細菌、古細菌およびウイルス））のために、用いた同一データベースに対してＢＷＡフィルタリングを適用した。次いで、実験的方略と試料カウントが減ったシーケンシングセンターとの間の交絡のため、ＤＮＡデータおよびＲＮＡデータを個別に正規化したことを除き、Ｖｏｏｍ－ＳＮＭによるＫｒａｋｅｎデータと同じ方法で、フィルタリングＢＷＡ微生物カウントデータをバッチ補正した。次いで、ＢＷＡ処理しＢＷＡデータと同じ方法で正規化した試料に対して、Ｋｒａｋｅｎに基づく生データ試料をマッチさせた。その結果、総計４種類の正規化データセットが得られた：すなわち、ＤＮＡ ＢＷＡデータ；ＲＮＡ ＢＷＡデータ；Ｋｒａｋｅｎサブセット化ＤＮＡデータ；およびＫｒａｋｅｎサブセット化ＲＮＡデータである。次いで、全４種類の正規化データセットをＭＬに入力して、それらの性能を互いに比較した（図１１ａ～ｈ）。
【0179】
ＳＨＯＧＵＮ分類帰属に用いた「Ｗｅｂ ｏｆ Ｌｉｆｅ」データベースはウイルスを含まなかった；また、Ｋｒａｋｅｎで評価した全てのＴＣＧＡ試料のサブセット（１３，５１７試料対１７，６２５試料）をＳＨＯＧＵＮで処理した。すなわち、それらの下流ＭＬ性能間の公正な比較を行うために、同定ウイルスを全て除去してＳＨＯＧＵＮで処理した同一試料と整合化を図り、Ｋｒａｋｅｎカウント生データのサブセット化を行った。次いで、癌種間および癌種内の識別を行うＭＬパイプラインに入力する前に、両データセットをＶｏｏｍ（分位点正規化を用いた）およびＳＮＭアルゴリズム（上記の主たるＴＣＧＡ分析におけるのと同一の生物学的変数および技術的変数を用いた）で同様に正規化した。
【0180】
相補性診断分析
低悪性度の癌に対する血液ｍｂＤＮＡの適用可能性を評価する場合には、ステージＩａ～ｃおよびステージＩＩａ～ｃに分類される腫瘍を有する全患者を一緒にまとめて群化し、残りのその他のものは全て取り除いた。Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０およびＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ液体ｃｔＤＮＡアッセイに対する比較では、それらのコード遺伝子パネルで評価した場合に、少なくとも１種類のゲノム変化を有することが判明したＴＣＧＡ患者は全て除外した；このような除外は、変異がパッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ）であるかドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）であるかにかかわらず行われた。残った患者を上記のようなＭＬ分析に用いた。
低悪性度の癌に対する血液ｍｂＤＮＡの適用可能性を評価する場合には、ステージＩａ～ｃおよびステージＩＩａ～ｃに分類される腫瘍を有する全患者を一緒にまとめて群化し、残りのその他のものは全て取り除いた。Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０およびＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ液体ｃｔＤＮＡアッセイに対する比較では、それらのコード遺伝子パネルで評価した場合に、少なくとも１種類のゲノム変化を有することが判明したＴＣＧＡ患者は全て除外した；このような除外は、変異がパッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ）であるかドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）であるかにかかわらず行われた。残った患者を上記のようなＭＬ分析に用いた。
【0181】
検証試験に必要なサンプルサイズを推定するＴＣＧＡシミュレーション
前立腺癌、肺癌、および皮膚癌（黒色腫）の試料であって、その識別に必要な試料の数を推定するために、２か所の異なるシーケンシングセンター（ブロード研究所、ＨＭＳ）において１種類のプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ）ですべて配列決定を行ったＴＣＧＡ血液試料について実験的シミュレーションを実施した。最初に、Ｋｒａｋｅｎによる微生物カウントデータを用い、次いでＳＨＯＧＵＮによる微生物カウントデータでシミュレーションを反復した。これは、検証試験に予想される実環境実験条件をほぼ厳密に模倣するものであった。
前立腺癌、肺癌、および皮膚癌（黒色腫）の試料であって、その識別に必要な試料の数を推定するために、２か所の異なるシーケンシングセンター（ブロード研究所、ＨＭＳ）において１種類のプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ）ですべて配列決定を行ったＴＣＧＡ血液試料について実験的シミュレーションを実施した。最初に、Ｋｒａｋｅｎによる微生物カウントデータを用い、次いでＳＨＯＧＵＮによる微生物カウントデータでシミュレーションを反復した。これは、検証試験に予想される実環境実験条件をほぼ厳密に模倣するものであった。
【0182】
まず、ブロード研究所とＨＭＳにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ機器で配列決定を行ったＴＣＧＡ ＰＲＡＤ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、およびＳＫＣＭの全ての血液試料について、微生物カウントのＫｒａｋｅｎ生データからサブセット化した（ブロード研究所：ｎ＝９９；ＨＭＳ：ｎ＝２８８）。用いた肺癌試料は混合起源であったので、ＬＵＡＤ血液試料とＬＵＳＣ血液試料とを一緒に組み合わせて単一の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）包括的疾患タイプ（ｕｍｂｒｅｌｌａ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ）とした；しかしながら、この措置はブロード研究所の試料にのみ行った；その理由は、ＨＭＳの血液由来肺癌試料が全てＬＵＡＤ起源だったからである。これにより、残った試料群は以下であった：
ＨＭＳの試料は：６６ＬＵＡＤ、１０４ＰＲＡＤ、１１８ＳＫＣＭであり；
ブロード研究所の試料は：４２ＮＳＣＬＣ（２４ＬＵＡＤ、１８ＬＵＳＣ）、１７ＰＲＡＤ、４０ＳＫＣＭであった。次いで、ＨＭＳおよびブロード研究所の各カウント生データセットを、Ｖｏｏｍ（分位点正規化を用いて）およびＳＮＭアルゴリズムで独立に正規化を行ったのであるが、その際、目的の生物学的変数として疾患の種類を用い、また技術的変数として組織ソース部位を用いた：単一のシーケンシングセンター、単一のデータ種、およびまたは単一のプラットフォームを選択したため、他の技術的因子は全て除外されたのである。
ＨＭＳの試料は：６６ＬＵＡＤ、１０４ＰＲＡＤ、１１８ＳＫＣＭであり；
ブロード研究所の試料は：４２ＮＳＣＬＣ（２４ＬＵＡＤ、１８ＬＵＳＣ）、１７ＰＲＡＤ、４０ＳＫＣＭであった。次いで、ＨＭＳおよびブロード研究所の各カウント生データセットを、Ｖｏｏｍ（分位点正規化を用いて）およびＳＮＭアルゴリズムで独立に正規化を行ったのであるが、その際、目的の生物学的変数として疾患の種類を用い、また技術的変数として組織ソース部位を用いた：単一のシーケンシングセンター、単一のデータ種、およびまたは単一のプラットフォームを選択したため、他の技術的因子は全て除外されたのである。
【0183】
正規化データセットのシミュレーションは、以下のように実施した：
（１）層化無作為抽出では、３つのクラスから等しい数の試料を選択した；
（２）３クラスのサブサンプルのうち１試料を除外した；
（３）一定確率で予測を行うために、サブサンプルの残りの試料全てを用いてＭＬモデルを構築し、そのＭＬモデルを除外試料に適用した；
（４）全試料が処理されるまで工程２～３を反復した；
（５）観察したクラスのリストおよび確率を伴う予測クラスのリストを用いて、マルチクラス性能評価指標を推定した；
（６）マルチクラス性能評価指標の標準誤差を推定するために、同一サンプルサイズの別の層化無作為標本を選択し、工程２～５をさらに９回反復した（総計１０回）；
（７）５試料毎の刻み幅で個々のクラスサンプルサイズを５～４０として、工程１～６を反復した。層化サンプリングサイズが１クラスの試料数よりも大きい場合には、そのクラスの全試料を用いた。まとめると、これによって、多癌識別を良好に実施するために必要とする試料数の推定値が提供されたのである（図１６ａ）。実験的性能推定値（平均ＡＵＲＯＣ、平均ＡＵＰＲ）は、癌のクラス毎に少なくとも１５試料あれば充分なはずだということを示唆する。健常対照について理想的サンプルサイズを推定することは不可能であるということに留意されたい；その理由は、ＴＣＧＡが健常対照を含まなかったからである。
（１）層化無作為抽出では、３つのクラスから等しい数の試料を選択した；
（２）３クラスのサブサンプルのうち１試料を除外した；
（３）一定確率で予測を行うために、サブサンプルの残りの試料全てを用いてＭＬモデルを構築し、そのＭＬモデルを除外試料に適用した；
（４）全試料が処理されるまで工程２～３を反復した；
（５）観察したクラスのリストおよび確率を伴う予測クラスのリストを用いて、マルチクラス性能評価指標を推定した；
（６）マルチクラス性能評価指標の標準誤差を推定するために、同一サンプルサイズの別の層化無作為標本を選択し、工程２～５をさらに９回反復した（総計１０回）；
（７）５試料毎の刻み幅で個々のクラスサンプルサイズを５～４０として、工程１～６を反復した。層化サンプリングサイズが１クラスの試料数よりも大きい場合には、そのクラスの全試料を用いた。まとめると、これによって、多癌識別を良好に実施するために必要とする試料数の推定値が提供されたのである（図１６ａ）。実験的性能推定値（平均ＡＵＲＯＣ、平均ＡＵＰＲ）は、癌のクラス毎に少なくとも１５試料あれば充分なはずだということを示唆する。健常対照について理想的サンプルサイズを推定することは不可能であるということに留意されたい；その理由は、ＴＣＧＡが健常対照を含まなかったからである。
【0184】
臨床的コホート選択およびＩＲＢプロトコル番号
１６９患者のバイオバンクに保存された凍結血漿試料を、この試験の一部として分析した；これらは全て、カリフォルニア大学サンディエゴ校のものであった。いずれの試験もカリフォルニア大学サンディエゴ校の施設内倫理委員会（ＩＲＢ）によって承認されたものであり、それぞれのＩＲＢ承認プロトコルの下で、患者は試料供与および試験に関して書面によるインフォームド・コンセントを提出している。全前立腺癌血漿試料（ｎ＝５９）がＩＲＢプロトコル１３１５５０によって管理された。全肺癌および全黒色腫血漿試料がＩＲＢプロトコル１５０３４８によって管理された。癌もＨＩＶも有していない健常対照の対象（ｎ＝６９）は全て、ＩＲＢプロトコル番号：１３０２９６、０９１０５４、１７２０９２、１５１０５７、および１８２０６４によって管理された。
１６９患者のバイオバンクに保存された凍結血漿試料を、この試験の一部として分析した；これらは全て、カリフォルニア大学サンディエゴ校のものであった。いずれの試験もカリフォルニア大学サンディエゴ校の施設内倫理委員会（ＩＲＢ）によって承認されたものであり、それぞれのＩＲＢ承認プロトコルの下で、患者は試料供与および試験に関して書面によるインフォームド・コンセントを提出している。全前立腺癌血漿試料（ｎ＝５９）がＩＲＢプロトコル１３１５５０によって管理された。全肺癌および全黒色腫血漿試料がＩＲＢプロトコル１５０３４８によって管理された。癌もＨＩＶも有していない健常対照の対象（ｎ＝６９）は全て、ＩＲＢプロトコル番号：１３０２９６、０９１０５４、１７２０９２、１５１０５７、および１８２０６４によって管理された。
【0185】
血漿由来、無細胞微生物ＤＮＡ試料の処理、およびシーケンシング
ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造元の指示にしたがい、各試料の血漿（容積２５０μｌ）から全循環ＤＮＡ抽出した後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩ常磁性体ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製を行った。標準Ｉｌｌｕｍｉｎａ指標付きアダプター（ＩＤＴ）を含むＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏシステム）を用いて、記載のように、精製ｃｆＤＮＡからシーケンシングライブラリーを調製した。Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（高感度ＤＮＡキット）を用いて試料ライブラリーの特徴付けを行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたｑＰＣＲで定量した。ＮｏｖａＳｅｑ ６０００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で両末端２×１５０ｂｐのシーケンシング（Ｓ４フローセル）を行い、シーケンシングの４レーン全てについて試料をプールした。
ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造元の指示にしたがい、各試料の血漿（容積２５０μｌ）から全循環ＤＮＡ抽出した後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩ常磁性体ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製を行った。標準Ｉｌｌｕｍｉｎａ指標付きアダプター（ＩＤＴ）を含むＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏシステム）を用いて、記載のように、精製ｃｆＤＮＡからシーケンシングライブラリーを調製した。Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（高感度ＤＮＡキット）を用いて試料ライブラリーの特徴付けを行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたｑＰＣＲで定量した。ＮｏｖａＳｅｑ ６０００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で両末端２×１５０ｂｐのシーケンシング（Ｓ４フローセル）を行い、シーケンシングの４レーン全てについて試料をプールした。
【0186】
血漿微生物叢試料の生物情報学的処理
ＮｏｖａＳｅｑ ６０００による全試料の１回のシーケンシング実行で、総計２１，６００，１４１，２６４リードが生成した。そのうち、１９，０４６，６１１，３６０リードがヒト試料に帰属し（すなわち、陰性対照および陽性対照を除去した）、総リードの２．１８６％を非ヒトとして分類した。シーケンシング生データを逆多重化し、Ａｔｒｏｐｏｓを用いてアダプタートリミングを行った。追加で、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを用いて、以下の設定で質的フィルタリングを行った：
ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ：ＴｒｕＳｅｑ３－ＰＥ－２．ｆａ：２：３０：７、ＭＩＮＬＥＮ：５０、ＴＲＡＩＬＩＮＧ：２０、ＡＶＧＱＵＡＬ：２０、ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：２０：２０。リードの５′末端から後ろに続くＧの並びを除去する目的で、Ｇのみの並びから成る付加的アダプター配列を標準ＴｒｕＳｅｑ３アダプターに付加した。高速局所パラメーターセットによるＢｏｗｔｉｅ２を用いてリード対のいずれか一方がヒトゲノム（１０００ゲノムプロジェクトの主要対立遺伝子ＳＮＰレファレンス）にマップされた場合には、そのリード対を廃棄した。次いで、ＦＬＡＳＨを用いて両末端リードの重ね合わせを行った；用いたＦＬＡＳＨのパラメーターは、最小重複：２０、最大重複：１５０、ミスマッチ率：０．０１であった。
ＮｏｖａＳｅｑ ６０００による全試料の１回のシーケンシング実行で、総計２１，６００，１４１，２６４リードが生成した。そのうち、１９，０４６，６１１，３６０リードがヒト試料に帰属し（すなわち、陰性対照および陽性対照を除去した）、総リードの２．１８６％を非ヒトとして分類した。シーケンシング生データを逆多重化し、Ａｔｒｏｐｏｓを用いてアダプタートリミングを行った。追加で、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを用いて、以下の設定で質的フィルタリングを行った：
ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ：ＴｒｕＳｅｑ３－ＰＥ－２．ｆａ：２：３０：７、ＭＩＮＬＥＮ：５０、ＴＲＡＩＬＩＮＧ：２０、ＡＶＧＱＵＡＬ：２０、ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：２０：２０。リードの５′末端から後ろに続くＧの並びを除去する目的で、Ｇのみの並びから成る付加的アダプター配列を標準ＴｒｕＳｅｑ３アダプターに付加した。高速局所パラメーターセットによるＢｏｗｔｉｅ２を用いてリード対のいずれか一方がヒトゲノム（１０００ゲノムプロジェクトの主要対立遺伝子ＳＮＰレファレンス）にマップされた場合には、そのリード対を廃棄した。次いで、ＦＬＡＳＨを用いて両末端リードの重ね合わせを行った；用いたＦＬＡＳＨのパラメーターは、最小重複：２０、最大重複：１５０、ミスマッチ率：０．０１であった。
【0187】
次いで、フィルタリングし重ね合わせたリードを処理した；この処理は、同一ワークフローおよび上記に詳細が記載されるデータベース（ｎ＝５９，９７４微生物ゲノム）を用いてＫｒａｋｅｎによる処理、あるいは本明細書において詳細に説明されるようなＳＨＯＧＵＮによる処理のいずれかであった。個々の血漿微生物叢試料についてサンプル処理を行った（すなわち、実施の４つのシーケンシングフローセルにわたって試料をプールした場合には、試料当たりレーン当たりで処理した）。ＫｒａｋｅｎまたはＳＨＯＧＵＮで試料当たりレーン当たりの分類群帰属を行った後に、階層性クラスターリング処理後の各試料についてレーンを一括してまとめた微生物カウントは、フローセルのレーンによってよりもむしろ試料ＩＤによる一貫性のある群分けを示した。ＳＨＯＧＵＮによるデータについては、重ね合わせの成功したリードおよび非合わせリードの両方を、ＳＨＯＧＵＮ整列化関数の入力として用い、Ｂｏｗｔｉｅ２によりＷｏＬデータベースに対してリードをマップして分類プロファイルを作成した；次いで、ＱＩＩＭＥ２を用いてプロファイルを属レベルに分離した。次に、各試料の分類プロファイルをフィルタリングして、相対的存在量が０．０１％未満である分類群を全て除去した。
【0188】
血漿微生物叢の技術的検証およびデータ除染
シーケンシング実行および生物情報学的微生物検出パイプラインの性能を評価するために、混入ウェルならびにシーケンシングプレートに含めたアリイビブリオ・フィシェリ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）（属：Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ）の実験的段階的希釈物を、他の試料種別に対する識別的存在量について、および個別に希釈物の存在量のｌｏｇ－変化倍数について調べた。ＫｒａｋｅｎおよびＳＨＯＧＵＮによる分類群帰属の両方について、これら技術的陽性対照を図１６ｂ～ｃにプロットした。
シーケンシング実行および生物情報学的微生物検出パイプラインの性能を評価するために、混入ウェルならびにシーケンシングプレートに含めたアリイビブリオ・フィシェリ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）（属：Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ）の実験的段階的希釈物を、他の試料種別に対する識別的存在量について、および個別に希釈物の存在量のｌｏｇ－変化倍数について調べた。ＫｒａｋｅｎおよびＳＨＯＧＵＮによる分類群帰属の両方について、これら技術的陽性対照を図１６ｂ～ｃにプロットした。
【0189】
３種類の陰性ブランク対照をシーケンシングプレートに含めた：
（１）シーケンシングのためのＤＮＡ抽出工程の試薬を含むＤＮＡ抽出ブランク；
（２）シーケンシングのためのライブラリー調製工程の試薬を含むＤＮＡライブラリー調製ブランク；
および
（３）水を添加した空の対照ウェル（ライブラリー調製時にもその同じ水がその試薬に添加されている）、その空の対照ウェルははね飛んだ、および／またはエアロゾル化した微生物核酸を含む可能性もある。ＴＣＧＡ分析において実施したのと同様に、再びｄｅｃｏｎｔａｍを用いて血漿微生物データの除染を行った；ただし、陰性ブランク対照および全試料のＤＮＡ濃度の両方（後者については、空の対照ウェルは除外）にアクセスしたことがＴＣＧＡ分析とは異なる。保守的な方法として、ｄｅｃｏｎｔａｍでは、Ｐ＊＝０．５のハイパーパラメーター値を選択した；これは、「蔓延率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）」（すなわち、ブランクに基づく）および「頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）」（すなわち、濃度に基づく）の両方の除染モードに対して選択されたものである；このハイパーパラメーター値は、全データの９０％超を廃棄する、ＴＣＧＡの最も厳密な除染に等価なものである。蔓延率モードでは、Ｐ＊＝０．５の時に、生物学的対照よりも陰性対照において汚染物としてより蔓延している分類群にフラグを立てる；頻度モードでは、Ｐ＊＝０．５の時に、モデル（すなわち、回帰モデル）が、リード分率およびＤＮＡ濃度を用いた非汚染分布よりも汚染分布によりフィットする分類群にフラグを立てる。Ｋｒａｋｅｎカウントデータの場合に、蔓延率モードでは、２１分類群を除外し、頻度モードでは１，２６１分類群を除外した（元々の帰属数は１，７５３であり、これから除外された数である）；ＳＨＯＧＵＮカウントデータの場合に、蔓延率モードでは、５７分類群を除外し、頻度モードでは、２４４分類群を除外した（元々の帰属数は１，１８１であり、これから除外された数である）。ＫｒａｋｅｎおよびＳＨＯＧＵＮの両方の除染データを下流正規化およびＭＬパイプラインに入力した。
（１）シーケンシングのためのＤＮＡ抽出工程の試薬を含むＤＮＡ抽出ブランク；
（２）シーケンシングのためのライブラリー調製工程の試薬を含むＤＮＡライブラリー調製ブランク；
および
（３）水を添加した空の対照ウェル（ライブラリー調製時にもその同じ水がその試薬に添加されている）、その空の対照ウェルははね飛んだ、および／またはエアロゾル化した微生物核酸を含む可能性もある。ＴＣＧＡ分析において実施したのと同様に、再びｄｅｃｏｎｔａｍを用いて血漿微生物データの除染を行った；ただし、陰性ブランク対照および全試料のＤＮＡ濃度の両方（後者については、空の対照ウェルは除外）にアクセスしたことがＴＣＧＡ分析とは異なる。保守的な方法として、ｄｅｃｏｎｔａｍでは、Ｐ＊＝０．５のハイパーパラメーター値を選択した；これは、「蔓延率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）」（すなわち、ブランクに基づく）および「頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）」（すなわち、濃度に基づく）の両方の除染モードに対して選択されたものである；このハイパーパラメーター値は、全データの９０％超を廃棄する、ＴＣＧＡの最も厳密な除染に等価なものである。蔓延率モードでは、Ｐ＊＝０．５の時に、生物学的対照よりも陰性対照において汚染物としてより蔓延している分類群にフラグを立てる；頻度モードでは、Ｐ＊＝０．５の時に、モデル（すなわち、回帰モデル）が、リード分率およびＤＮＡ濃度を用いた非汚染分布よりも汚染分布によりフィットする分類群にフラグを立てる。Ｋｒａｋｅｎカウントデータの場合に、蔓延率モードでは、２１分類群を除外し、頻度モードでは１，２６１分類群を除外した（元々の帰属数は１，７５３であり、これから除外された数である）；ＳＨＯＧＵＮカウントデータの場合に、蔓延率モードでは、５７分類群を除外し、頻度モードでは、２４４分類群を除外した（元々の帰属数は１，１８１であり、これから除外された数である）。ＫｒａｋｅｎおよびＳＨＯＧＵＮの両方の除染データを下流正規化およびＭＬパイプラインに入力した。
【0190】
血漿微生物叢データの正規化、交換試験、およびＭＬ
微生物カウント生データを用い年齢を予測する試みを、ＧＢＭ ＭＬモデル（ＴＣＧＡに関して上記で説明されているものと同一のアーキテクチャー）およびｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ（ＬＯＯ）反復ＭＬを用いて実施した（図１６ｇ）。
微生物カウント生データを用い年齢を予測する試みを、ＧＢＭ ＭＬモデル（ＴＣＧＡに関して上記で説明されているものと同一のアーキテクチャー）およびｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ（ＬＯＯ）反復ＭＬを用いて実施した（図１６ｇ）。
【0191】
このコホートにおいて年齢と性別に関する正規化を行うことの重要性を確認する目的で、各因子につき１００回反復を行い、次いで両方の因子について同時に１００回反復を行う交換分析を実施した（図１６ｈ～ｊ）。簡単に説明すると、以下の４工程を実施した：
（１）全試料において、無作為に年齢および／または性別のラベルを交換する工程；
（２）疾患の種類を目的の生物学的変数として用い、また交換した年齢および／または性別を技術的要素として用いて、生データにＶｏｏｍ－ＳＮＭを実行する工程；
（３）７０％／３０％の訓練／試験の分割部分を用いて群化癌試料を健常対照から識別するためのＭＬ分析を実施する工程（固定乱数シードを用い、また２クラス性能推定値（ＡＵＲＯＣ、ＡＵＰＲ）を取得する内部４重交差検証を用いる）；
および
（４）ゼロ性能分布を得るために工程１～３を総計１００回反復する。次いで、正確な固定年齢および／または固定性別の帰属を用いて、工程３において乱数シードを無作為選択しながら、工程２～３を総計１００回実行した。最後に、両側マン＝ホイットニーＵ検定を用いて、有意性に関し、この性能分布を直接的そのゼロ分布に対して比較した。これらの試験はいずれも非常に有意（全て、Ｐ?１．５×１０?１３）であったので、疾患の種類については目的の生物学的変数として保持しながら、年齢および性別を技術的要素としてＶｏｏｍ－ＳＮＭに組み込んだ。ＴＣＧＡ癌シミュレーション（上記）の場合と同様に、病理学的亜種にかかわらず、正規化において肺癌試料の全てを統一的疾患種としてまとめたことに、留意されたい。陰性ブランク対照および陽性モノカルチャー対照は全て、Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ前に除去した。
（１）全試料において、無作為に年齢および／または性別のラベルを交換する工程；
（２）疾患の種類を目的の生物学的変数として用い、また交換した年齢および／または性別を技術的要素として用いて、生データにＶｏｏｍ－ＳＮＭを実行する工程；
（３）７０％／３０％の訓練／試験の分割部分を用いて群化癌試料を健常対照から識別するためのＭＬ分析を実施する工程（固定乱数シードを用い、また２クラス性能推定値（ＡＵＲＯＣ、ＡＵＰＲ）を取得する内部４重交差検証を用いる）；
および
（４）ゼロ性能分布を得るために工程１～３を総計１００回反復する。次いで、正確な固定年齢および／または固定性別の帰属を用いて、工程３において乱数シードを無作為選択しながら、工程２～３を総計１００回実行した。最後に、両側マン＝ホイットニーＵ検定を用いて、有意性に関し、この性能分布を直接的そのゼロ分布に対して比較した。これらの試験はいずれも非常に有意（全て、Ｐ?１．５×１０?１３）であったので、疾患の種類については目的の生物学的変数として保持しながら、年齢および性別を技術的要素としてＶｏｏｍ－ＳＮＭに組み込んだ。ＴＣＧＡ癌シミュレーション（上記）の場合と同様に、病理学的亜種にかかわらず、正規化において肺癌試料の全てを統一的疾患種としてまとめたことに、留意されたい。陰性ブランク対照および陽性モノカルチャー対照は全て、Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ前に除去した。
【0192】
ＴＣＧＡ試料について上記で説明したのと全く同一の方法で、Ｖｏｏｍ－ＳＮＭ正規化した血漿微生物叢試料についてＭＬを実施した；ただし、サンプリングスキーマに関してはこの限りではない；その理由は、サンプルサイズが桁違いに小規模であったためである。第１に、健常対群化癌の識別についての一般化を評価するために、７０％／３０％の訓練／試験の分割部分を用いて、５００回反復訓練の４重交差検証による「ブートストラッピング」を実施した。訓練／試験の分割部分はいずれも（すなわち、反復毎に）ユニークである置換サンプリングを許容した；しかしながら、いかなる場合においても、試料が同時に訓練の状態かつ試験の状態の両方になることは許容されなかった。総計５００回の反復から得られた性能評価指標の要約統計量によって、ＡＵＲＯＣ分布およびＡＵＰＲ分布ならびに信頼区間（Ｃｉｓ）が推定された（図７ｂ、図１７ａ）。第２に、健常対照と個々の癌種との２者間およびそれ以上の間の対識別およびマルチクラス識別を、ＬＯＯ ＭＬによって実施した。言い換えると、１試料を反復的に脱落させて、残りの試料について、ハイパーパラメーターを調整する４重交差検証で、モデルの反復訓練を行い、モデルが提供する確率で脱落試料についての予測を反復的に行った。ＡＵＲＯＣ測定量およびＡＵＰＲ測定量を推定するために、ＰＲＲＯＣ Ｒパッケージを用いて、上記で説明したような方法で、全試料について実際のクラスの最終リストを、予測されたクラスおよびそれらの確率のリストと比較した。１対残り全ての比較の平均を取ることにより、ｃａｒｅｔ ＲパッケージのｍｕｌｔｉＣｌａｓｓＳｕｍｍａｒｙ（）関数によってレポートされるようなマルチクラス性能を推定した。
【0193】
より小型の試料サイズが黒色腫コホート性能（図１６ｋ）に如何なる寄与を与えるのかを評価する反復サブサンプリングを、以下のように実施した：
（１）１６試料ずつの単一癌種および健常対照（総計３２）の層化無作為抽出を実施する；
（２）ＬＯＯ反復ＭＬを実施し、これら３２試料について健常対癌の識別性能を評価する；
（３）性能の標準誤差を推定するために、工程１～２を１００回反復する；
（４）３種類の癌のそれぞれについて、工程１～３を反復する。識別に対するサンプルサイズ低下の影響を評価するために、ＰＣコホートおよびＬＣコホートの反復サブサンプリングについても同一処理を行う。コホートサイズを他のサンプルサイズと比較することが目的なので、各層化サブサンプリングにおいて全黒色腫コホートを用いたことに留意されたい。
（１）１６試料ずつの単一癌種および健常対照（総計３２）の層化無作為抽出を実施する；
（２）ＬＯＯ反復ＭＬを実施し、これら３２試料について健常対癌の識別性能を評価する；
（３）性能の標準誤差を推定するために、工程１～２を１００回反復する；
（４）３種類の癌のそれぞれについて、工程１～３を反復する。識別に対するサンプルサイズ低下の影響を評価するために、ＰＣコホートおよびＬＣコホートの反復サブサンプリングについても同一処理を行う。コホートサイズを他のサンプルサイズと比較することが目的なので、各層化サブサンプリングにおいて全黒色腫コホートを用いたことに留意されたい。
【0194】
統計分析
統計分析はいずれもＲバージョン３．４．３を用いて行った。ｇｇｐｕｂｒパッケージ（ｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｓｓａｍｂａｒａ／ｇｇｐｕｂｒ）によって、群間のノンパラメトリック統計検定を実施し、必要に応じて多重仮説検定補正を行った。Ｒでは、２．２×１０?１６未満のＰ値を正確に算出することは不可能であるため、リストにはこの値未満のＰ値を＜２．２×１０?１６と表示しているが、それはＰ値の範囲を意味するものではないことに留意されたい。測定値は異なる試料に由来するものであり、試料を反復測定してはいない。検証試験のサンプルサイズ推定値はＴＣＧＡ血液試料を用いた実験的シミュレーションによるものであり、ＭＬおよびマルチクラス性能の推定を実施するＧＢＭパッケージ、Ｃａｒｅｔパッケージ、およびＭＬｍｅｔｒｉｃｓパッケージ（ｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｙａｎｙａｃｈｅｎ／ＭＬｍｅｔｒｉｃｓ）に依存する。他のマルチクラス性能推定値に関してはいずれもＣａｒｅｔパッケージおよびＭＬｍｅｔｒｉｃｓパッケージを用いて算出した。
統計分析はいずれもＲバージョン３．４．３を用いて行った。ｇｇｐｕｂｒパッケージ（ｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｓｓａｍｂａｒａ／ｇｇｐｕｂｒ）によって、群間のノンパラメトリック統計検定を実施し、必要に応じて多重仮説検定補正を行った。Ｒでは、２．２×１０?１６未満のＰ値を正確に算出することは不可能であるため、リストにはこの値未満のＰ値を＜２．２×１０?１６と表示しているが、それはＰ値の範囲を意味するものではないことに留意されたい。測定値は異なる試料に由来するものであり、試料を反復測定してはいない。検証試験のサンプルサイズ推定値はＴＣＧＡ血液試料を用いた実験的シミュレーションによるものであり、ＭＬおよびマルチクラス性能の推定を実施するＧＢＭパッケージ、Ｃａｒｅｔパッケージ、およびＭＬｍｅｔｒｉｃｓパッケージ（ｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｙａｎｙａｃｈｅｎ／ＭＬｍｅｔｒｉｃｓ）に依存する。他のマルチクラス性能推定値に関してはいずれもＣａｒｅｔパッケージおよびＭＬｍｅｔｒｉｃｓパッケージを用いて算出した。
【0195】
機械学習モデルを用いた訓練と推論
機械学習モデルを用いた訓練および推論（例えば、予測）には、少なくとも一つの実施態様にしたがうニューラルネットワークなどの各種技術を利用することができる。少なくとも一つの実施態様においては、学習データセットを用いて、非訓練ニューラルネットワークを訓練する。非訓練ニューラルネットワークの初期荷重パラメーターは、最初に事前設定した値、ランダム数などに設定するのであってもよい。少なくとも一つの実施態様においては、訓練データセットを用いてニューラルネットワークを訓練するために、訓練フレームワークを用い、ニューラルネットワークの１種類以上の荷重を更新する。訓練フレームワークはいずれの好適な訓練フレームワークであってもよく、そのような訓練フレームワークとしては、ＰｙＴｏｒｃｈフレームワーク、ＴｅｎｓｏｒＦｌｏｗ、Ｂｏｏｓｔ、Ｃａｆｆｅ、マイクロソフト・コグニティブ・ツールキット（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｔｏｏｌｋｉｔ）／ＣＮＴＫ、ＭＸＮｅｔ、Ｃｈａｉｎｅｒ、Ｋｅｒａｓ、Ｄｅｅｐｌｅａｒｎｉｎｇ４ｊ、または他の訓練フレームワークなどが挙げられる。少なくとも一つの実施態様においては、訓練フレームワークは非訓練ニューラルネットワークの訓練を行い、訓練したニューラルネットワークを生成するために本明細書に記載される処理リソースを利用する訓練が可能となる。少なくとも一つの実施態様においては、荷重は無作為に選択されるのであってもよく、あるいはディープビリーフネットワークを用いて予備トレーニングするのであってもよい。少なくとも一つの実施態様においては、訓練は、教師あり、部分的に教師あり、または教師なしの方法のいずれかで実施するのであってもよい。
機械学習モデルを用いた訓練および推論（例えば、予測）には、少なくとも一つの実施態様にしたがうニューラルネットワークなどの各種技術を利用することができる。少なくとも一つの実施態様においては、学習データセットを用いて、非訓練ニューラルネットワークを訓練する。非訓練ニューラルネットワークの初期荷重パラメーターは、最初に事前設定した値、ランダム数などに設定するのであってもよい。少なくとも一つの実施態様においては、訓練データセットを用いてニューラルネットワークを訓練するために、訓練フレームワークを用い、ニューラルネットワークの１種類以上の荷重を更新する。訓練フレームワークはいずれの好適な訓練フレームワークであってもよく、そのような訓練フレームワークとしては、ＰｙＴｏｒｃｈフレームワーク、ＴｅｎｓｏｒＦｌｏｗ、Ｂｏｏｓｔ、Ｃａｆｆｅ、マイクロソフト・コグニティブ・ツールキット（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｔｏｏｌｋｉｔ）／ＣＮＴＫ、ＭＸＮｅｔ、Ｃｈａｉｎｅｒ、Ｋｅｒａｓ、Ｄｅｅｐｌｅａｒｎｉｎｇ４ｊ、または他の訓練フレームワークなどが挙げられる。少なくとも一つの実施態様においては、訓練フレームワークは非訓練ニューラルネットワークの訓練を行い、訓練したニューラルネットワークを生成するために本明細書に記載される処理リソースを利用する訓練が可能となる。少なくとも一つの実施態様においては、荷重は無作為に選択されるのであってもよく、あるいはディープビリーフネットワークを用いて予備トレーニングするのであってもよい。少なくとも一つの実施態様においては、訓練は、教師あり、部分的に教師あり、または教師なしの方法のいずれかで実施するのであってもよい。
【0196】
少なくとも一つの実施態様においては、非訓練ニューラルネットワークの訓練を、教師あり学習を用いて実施するが、ここで訓練データセットは入力に対する所望の出力（例えば、由来組織の予測）と対にした入力（例えば、微生物プロファイル）を含み、あるいはここで訓練データセットは既知の出力を有する入力を含み、ニューラルネットワークの出力を用手的に等級付けする。少なくとも一つの実施態様においては、非訓練ニューラルネットワークの訓練を、教師ありの方式を用いて実施し、学習データセットからの入力を処理して、その結果得られた出力を、予想される出力または所望の出力のセットに対して比較する。少なくとも一つの実施態様においては、非訓練ニューラルネットワークによって誤差が逆伝播する。少なくとも一つの実施態様においては、訓練過程において非訓練ニューラルネットワークを制御する荷重を、訓練フレームワークが調整する。少なくとも一つの実施態様においては、訓練フレームワークは、非訓練ニューラルネットワークがモデル（新規のデータセットなどの入力データに基づく結果における場合などの、正確な答えの生成に好適な訓練ニューラルネットワークなど）に向かってどの程度良好に収束するかをモニターするツールを含む。少なくとも一つの実施態様においては、訓練フレームワークは、損失関数および確率的勾配降下法などの調整アルゴリズムを用いて非訓練ニューラルネットワークの出力を精緻化するために荷重を調整しながら、非訓練ニューラルネットワークを反復訓練する。少なくとも一つの実施態様においては、訓練フレームワークは、非訓練ニューラルネットワークが所望の正解率に到達するまで、非訓練ニューラルネットワークを訓練する。少なくとも一つの実施態様においては、次いで、機械学習演算を繰り返し実行するように、訓練したニューラルネットワークを設定することができる。
【0197】
少なくとも一つの実施態様においては、教師なし学習を用いて非訓練ニューラルネットワークを訓練するが、ここで非訓練ニューラルネットワークは非標識データを用いてそれ自体の訓練を試みる。少なくとも一つの実施態様においては、教師なし学習訓練データセットは、関連する出力データも「グラウンドトゥルース」も全く含まない入力データデータを含むであろう。少なくとも一つの実施態様においては、非訓練ニューラルネットワークは、訓練データセット内の群分けを学習することが可能であり、個々の入力がどのような未訓練データセットに関連するのかを評価することができる。少なくとも一つの実施態様においては、新規データセットの次元性低下に有用な演算実施が可能な訓練ニューラルネットワークにおいて自己組織化マップの生成に、教師なし訓練を用いることができる。少なくとも一つの実施態様においては、新規データセットの正常パターンから外れる、新規データセットのデータ点の識別を可能にする異常検出を実施する目的においても、教師なし訓練を用いることが可能である。
【0198】
少なくとも一つの実施態様においては、訓練データセットにおいて、ラベル付けしたデータとラベル付けしていないデータの混合を含む技術である半教師あり学習を用いるのであってもよい。少なくとも一つの実施態様においては、漸次的学習（転移学習技術によってなど）を実施する目的で、訓練フレームワークを利用するのであってもよい。少なくとも一つの実施態様においては、漸次的学習は、訓練ニューラルネットワークが、初期訓練中に訓練ニューラルネットワーク内で教育した知識を忘却することなく新規データセットを適合させることを可能にする。
【0199】
図１８は、本開示の１種類以上の例示的な実施態様にしたがう、１種類以上の技術（例えば、方法）を実施してもよい計算装置またはコンピューターシステム１８００の例を表すブロック図である。
【0200】
例えば、図１８の計算システム１８００は１種類以上のプロセッサー１８０２～１８０６を含んでいてもよい。プロセッサー１８０２～１８０６は、プロセッサーバス１８１２と直接やり取りするために、１種類以上の内部レベルのキャッシュ（非提示）およびバスコントローラー（例えば、バスコントローラー１８２２）またはバスインターフェイスユニット（例えば、Ｉ／Ｏインターフェイス１８２０）を含んでいてもよい。
【0201】
プロセッサーバス１８１２はホストバスまたはフロントサイドバスとしても知られているが、プロセッサー１８０２～１８０６をシステムインターフェイス１８２４に連結するために用いるのであってもよい。システム１８００の他の要素をプロセッサーバス１８１２と連結するために、システムインターフェイス１８２４はプロセッサーバス１８１２に連結するのであってもよい。例えば、メインメモリー１８１６をプロセッサーバス１８１２にインターフェイス接続するために、システムインターフェイス１８２４はメモリーコントローラー１８１８を含むのであってもよい。メインメモリー１８１６は典型的には、１種類以上のメモリーカードおよび制御回路（非提示）を含む。１種類以上のＩ／Ｏブリッジ１８２５またはＩ／Ｏデバイス１８３０をプロセッサーバス１８１２にインターフェイス接続するために、システムインターフェイス１８２４または入力／出力（Ｉ／Ｏ）インターフェイス１８２０を含むのであってもよい。示されているように、１種類以上のＩ／Ｏコントローラーおよび／またはＩ／Ｏデバイスを、Ｉ／Ｏバス１８２６（Ｉ／Ｏコントローラー１８２８およびＩ／Ｏデバイス１８３０など）に連結してもよい。
【0202】
Ｉ／Ｏデバイス１８３０はまた、プロセッサー１８０２～１８０６と情報のやり取りをする、および／またはプロセッサー１８０２～１８０６に対してコマンドの選択をする、英数字キーおよびその他のキーを含む英数字入力デバイスなどの入力デバイス（非提示）を含んでいてもよい。他の種類のユーザー入力デバイスとしては、プロセッサー１８０２～１８０６に方向情報を送信する、およびコマンドの選択をする、および表示デバイス上のカーソルの動きを制御する、マウス、トラックボール、またはカーソル方向キーなどのカーソル制御が挙げられる。
【0203】
システム１８００は、メインメモリー１８１６とよばれるダイナミック記憶デバイス、またはプロセッサーバス１８１２に接続した、情報およびプロセッサー１８０２～１８０６によって実行される命令を格納するランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）または他のコンピューター可読デバイスを含んでいてもよい。メインメモリー１８１６はまた、プロセッサー１８０２～１８０６による命令を実行中のテンポラリ変数または他の中間情報を格納する目的で用いられるのであってもよい。システム１８００は、プロセッサーバス１８１２に接続した、静的情報およびプロセッサー１８０２～１８０６の命令を格納する読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）および／または他の静的保存デバイスを含んでいてもよい。しかしながら、図１８に概説したシステムは、本開示の局面にしたがって用いるのであってもよい、あるいは構成されるのであってもよいコンピューターシステムの可能な一例に過ぎない。
【0204】
一実施態様においては、上記の技術は、メインメモリー１８１６に含まれる１種類以上の命令の１つ以上の並びを実行するプロセッサー１８０４に応答するコンピューターシステム１８００によって実施されるのであってもよい。これらの命令は、別の機械可読媒体（記憶装置など）からメインメモリー１８１６に読み込まれるのであってもよい。メインメモリー１８１６に含まれるこれら命令の並びの実行によって、本明細書に記載の処理工程を、プロセッサー１８０２～１８０６が実施するのであってもよい。別の実施態様においては、ソフトウェアの命令の代わりに、あるいはソフトウェアの命令と組み合わせて回路を利用するのであってもよい。したがって、本開示の実施態様はハードウエア要素とソフトウェア要素の両方を含むものであってもよい。
【0205】
一実施態様においては、プロセッサー１８０２～１８０６は、ニューラルネットワークおよび他の機械学習技術を可能にし得るテンソル・プロセッシング・ユニット（ＴＰＵ）および／または他の人工知能アクセラレーターアプリケーション特異的集積回路（ＡＳＩＣ）を含むものであってもよい。少なくとも一つの実施態様においては、機械学習モジュール１８３２は、訓練および／または推論のステージを含んでいてもよい、本明細書に記載の機械学習技術を実施するソフトウェアおよび／またはハードウエアを指す。例えば、機械学習モジュール１８３２は、転移性癌のステージの異なる種類および／または転移性癌のステージを識別するように訓練されるのであってもよい。
【0206】
ソフトウェアおよび／またはファームウェアにおいて、各種の実施態様が完全にまたは部分的に実装されるのであってもよい。このソフトウェアおよび／またはファームウェアは、持続性コンピューター可読保存媒体内または媒体上に含まれる命令の形態を取るのであってもよい。次いで、本明細書に記載の演算の実行を可能にするために、これらの命令が１つ以上のプロセッサーによって読み込まれ実行されるのであってもよい。これらの命令は任意の好適な形態を取るのであってもよく、そのような形態としては、ソースコード、コンパイルしたコード、解釈されたコード、実行可能コード、静的コード、ダイナミックコードなどが挙げられるが、これらにのみに限定されるものではない。そのようなコンピューター可読媒体としては、１つ以上のコンピューターによって読み込むことが可能な形態の情報を格納する任意の有形持続性媒体が含まれ、そのような媒体としては：
読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）；ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）；磁気ディスク保存媒体；光学的保存媒体；フラッシュメモリーなどが挙げられるが、これらにのみに限定されるものではない。
読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）；ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）；磁気ディスク保存媒体；光学的保存媒体；フラッシュメモリーなどが挙げられるが、これらにのみに限定されるものではない。
【0207】
機械可読媒体としては、機械（例えば、コンピューター）によって可読性である形態（例えば、ソフトウェア、処理アプリケーション）の情報を格納または伝達する任意のメカニズムが挙げられる。そのような媒体は、不揮発性媒体および揮発性媒体の形態を取るのであってもよいが、これらのみに限定されるものではない；そのような媒体としては、コンピュータープログラム製品、１種類以上のデータベース管理製品、ウェブサーバー製品、アプリケーションサーバー製品、および／または他の付加的ソフトウェア要素を含むような、取り出し可能データ保存媒体、取り出しのできないデータ保存媒体、および／または有線または無線ネットワークアーキテクチャーを介して利用が可能となる外部保存デバイスを挙げることができる。取り出し可能データ保存媒体の例としては、コンパクトディスク読込専用メモリー（ＣＤ－ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）読込専用メモリー（ＤＶＤ－ＲＯＭ）、光磁気ディスク、フラッシュドライブなどが挙げられる。取り出しできないデータ保存媒体の例としては、内部磁気ハードディスク、半導体素子（ＳＳＤ）などが挙げられる。１種類以上のメモリーデバイス（非提示）としては、揮発性メモリー（例えば、ダイナミックランダムアクセスメモリー（ＤＲＡＭ）、スタティックランダムアクセスメモリー（ＳＲＡＭ）など）および／または不揮発性メモリー（例えば、読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）、フラッシュメモリーなど）を挙げることができる。
【0208】
本明細書に記載される技術に準拠するシステムおよび方法を実現するメカニズムを含むコンピュータープログラムは、メインメモリー１８１６（機械可読媒体ともよぶことができる）に存在するのであってもよい。機械可読媒体が、本開示の演算のうちの任意の１種類以上を、機械が実施するための命令を格納可能またはコード可能な任意の有形持続性媒体、あるいはそのような命令によって利用される、またはそのような命令に関連するデータ構造物および／またはデータモジュールを格納可能またはコード可能な任意の有形持続性媒体を含むものであってもよいことは、理解されるであろう。機械可読媒体は、１種類以上の実行可能命令またはデータ構造物を保存する、単一媒体または複数媒体（例えば、集中データベースまたは分散型データベース、および／または関連するキャッシュおよびサーバー）を含むのであってもよい。
【0209】
以下の参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。
参考文献
Ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｒｅ ｈｅｒｅｂｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：
Ｂｕｌｌｍａｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８， １４４３-１４４８ （２０１７）．
Ｄｅｊｅａ， Ｃ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｈａｒｂｏｒ ｃｏｌｏｎｉｃ ｂｉｏｆｉｌｍｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９， ５９２-５９７ （２０１８）．
Ｇｅｌｌｅｒ， Ｌ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７， １１５６-１１６０ （２０１７）．
Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９， ９７-１０３ （２０１８）．
Ｊｉｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｐｒｏｍｏｔｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｖｉａ γδ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ １７６， ９９８-１０１３．ｅ１６ （２０１９）．
Ｍａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｖｉａ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０， ｅａａｎ５９３１ （２０１８）．
Ｍａｔｓｏｎ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｏｍｍｅｎｓａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９， １０４-１０８ （２０１８）．
Ｍｅｉｓｅｌ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｉｇｎａｌｓ ｄｒｉｖｅ ｐｒｅ－ｌｅｕｋａｅｍｉｃ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｔｅｔ２－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｈｏｓｔ． Ｎａｔｕｒｅ ５５７， ５８０-５８４ （２０１８）．
Ｒｏｕｔｙ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＰＤ－１－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇａｉｎｓｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９， ９１-９７ （２０１８）．
Ｙｅ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｓｕｂｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｓ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｏ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３４， ６５９-６７３．ｅ６ （２０１８）．
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｊｅｃｔ． Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ４５， １１１３-１１２０ （２０１３）．
Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ． ＆ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｒ． Ａ． Ｔｈｅ ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｅｌｌ １００， ５７-７０ （２０００）．
Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ． ＆ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｒ． Ａ． Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ： ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ １４４， ６４６-６７４ （２０１１）．
Ｓａｌｔｅｒ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｃａｎ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｍｐａｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ． ＢＭＣ Ｂｉｏｌ． １２， ８７ （２０１４）．
Ｇｌａｓｓｉｎｇ， Ａ．， Ｄｏｗｄ， Ｓ． Ｅ．， Ｇａｌａｎｄｉｕｋ， Ｓ．， Ｄａｖｉｓ， Ｂ． ＆ Ｃｈｉｏｄｉｎｉ， Ｒ． Ｊ． Ｉｎｈｅｒｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｍａｙ ａｆｆｅｃｔ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ｌｏｗ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｉｏｍａｓｓ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｇｕｔ Ｐａｔｈｏｇ． ８， ２４ （２０１６）．
Ｄａｖｉｓ， Ｎ． Ｍ．， Ｐｒｏｃｔｏｒ， Ｄ． Ｍ．， Ｈｏｌｍｅｓ， Ｓ． Ｐ．， Ｒｅｌｍａｎ， Ｄ． Ａ． ＆ Ｃａｌｌａｈａｎ， Ｂ． Ｊ． Ｓｉｍｐｌｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍａｒｋｅｒ－ｇｅｎｅ ａｎｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄａｔａ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ６， ２２６ （２０１８）．
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｋ． Ｍ．， Ｃｒａｂｔｒｅｅ， Ｊ．， Ｍａｔｔｉｃｋ， Ｊ． Ｓ． Ａ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｋ． Ｅ． ＆ Ｄｕｎｎｉｎｇ Ｈｏｔｏｐｐ， Ｊ． Ｃ． Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ－ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｕｂｌｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ５， ９ （２０１７）．
Ｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｏｗ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｍａｓｓ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｓｔｕｄｉｅｓ： ｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７， １０５-１１７ （２０１９）．
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｎａｔｕｒｅ ５１３， ２０２-２０９ （２０１４）．
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ５４３， ３７８-３８４ （２０１７）．
Ｔａｎｇ， Ｋ．－Ｗ．， Ａｌａｅｉ－Ｍａｈａｂａｄｉ， Ｂ．， Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ， Ｔ．， Ｌｉｎｄｈ， Ｍ． ＆ Ｌａｒｓｓｏｎ， Ｅ． Ｔｈｅ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ４， ２５１３ （２０１３）．
Ｍｉｎｉｃｈ， Ｊ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ＫａｔｈａｒｏＳｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ｌｏｗ ｂｉｏｍａｓｓ ｓａｍｐｌｅｓ． ｍＳｙｓｔｅｍｓ ３， ｅ００２１８－１７ （２０１８）．
Ｗｏｏｄ， Ｄ． Ｅ． ＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ， Ｓ． Ｌ． Ｋｒａｋｅｎ： ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｅｘａｃｔ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １５， Ｒ４６ （２０１４）．
Ｚｈａｎｇ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｓｅｒｏｕｓ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｅｌｌ １６６， ７５５-７６５ （２０１６）．
Ｃｈｏｉ， Ｊ．－Ｈ．， Ｈｏｎｇ， Ｓ．－Ｅ． ＆ Ｗｏｏ， Ｈ． Ｇ． Ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂａｔｃｈ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８， ２１１ （２０１７）．
Ｌａｕｓｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄａｔａｓｅｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｆｏｒｍ． １２， １９３-２０１ （２０１３）．
Ｌａｗ， Ｃ． Ｗ．， Ｃｈｅｎ， Ｙ．， Ｓｈｉ， Ｗ． ＆ Ｓｍｙｔｈ， Ｇ． Ｋ． ｖｏｏｍ： ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔｓ ｕｎｌｏｃｋ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｒｅａｄ ｃｏｕｎｔｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １５， Ｒ２９ （２０１４）．
Ｍｅｃｈａｍ， Ｂ． Ｈ．， Ｎｅｌｓｏｎ， Ｐ． Ｓ． ＆ Ｓｔｏｒｅｙ， Ｊ． Ｄ． Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６， １３０８-１３１５ （２０１０）．
Ｂｏｅｄｉｇｈｅｉｍｅｒ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｓｅｌｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｆｒｏｍ ｔｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｔｕｄｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｉｍａｌｓ ａｃｒｏｓｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９， ２８５ （２００８）．
Ｓｃｈｅｒｅｒ， Ａ． Ｂａｔｃｈ Ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ Ｎｏｉｓｅ ｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ： Ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ （Ｗｉｌｅｙ， ２００９）．
Ｈｉｌｌｍａｎｎ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｈａｌｌｏｗ ｓｈｏｔｇｕｎ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ． ｍＳｙｓｔｅｍｓ ３， ｅ０００６９－１８ （２０１８）．
Ｋｎｉｇｈｔｓ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｂａｙｅｓｉａｎ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ－ｗｉｄｅ ｃｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｏｕｒｃｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８， ７６１-７６３ （２０１１）．
Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ＨＭＰ （ｉＨＭＰ） Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ： ｄｙｎａｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ－ｈｏｓｔ ｏｍｉｃｓ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １６， ２７６-２８９ （２０１４）．
Ｙａｍａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｉｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２２， ５５７４-５５８１ （２０１６）．
Ｈｓｉｅｈ， Ｙ．－Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｎｄ Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ８， １５８ （２０１８）．
Ｋｏｓｔｉｃ， Ａ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． ＰａｔｈＳｅｑ： ｓｏｆｔｗａｒｅ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｂｙ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２９， ３９３-３９６ （２０１１）．
Ｓｖｉｒｃｅｖ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｊ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｓｃｉ． Ｈｅａｌｔｈ Ｃ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌ． Ｒｅｖ． ２８， ３９-５９ （２０１０）．
Ｊｅｒｖｉｓ－Ｂａｒｄｙ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｒｉｖｉｎｇ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｓｔ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｄａｔａ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ３， １９ （２０１５）．
Ｋｗｏｎｇ， Ｔ． Ｎ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ ｆｒｏｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５５， ３８３-３９０．ｅ８ （２０１８）．
Ｂｌａｕｗｋａｍｐ， Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４， ６６３-６７４ （２０１９）．
Ｈｏｎｇ， Ｄ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ： ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｌａｓｍａ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ＤＮＡ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｄｉａｇｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ９２， ２１０-２１３ （２０１８）．
Ｂｕｒｎｈａｍ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｕｒｉｎａｒｙ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎａｌｙｔｅ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ９， ２４１２ （２０１８）．
Ｄｅ Ｖｌａｍｉｎｃｋ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｖｉｒｏｍｅ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｅｌｌ １５５， １１７８-１１８７ （２０１３）．
Ｈｕａｎｇ， Ｙ．－Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈｙ ｆｅｍａｌｅｓ． ＢＭＣ Ｍｅｄ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１ （Ｓｕｐｐｌ． １）， １６ （２０１８）．
Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ． Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． ６， ２２４ｒａ２４ （２０１４）．
Ｃｌａｒｋ， Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． ２０， ６８６-７０２ （２０１８）．
Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｌｅａｄｅｒｂｏａｒｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｌｏｎｇ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２０， ２２６ （２０１９）．
Ｈｕａｎｇ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ， ｏｒａｌ， ａｎｄ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅ． ｍＳｙｓｔｅｍｓ ５， ｅ００６３０－１９ （２０２０）．
Ｚｈｕ， Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ １０，５７５ ｇｅｎｏｍｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｏｍａｉｎｓ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ａｒｃｈａｅａ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０， ５４７７ （２０１９）．
Ｃｈｉｕ， Ｋ．－Ｐ． ＆ Ｙｕ， Ａ． Ｌ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄｂｏｒｎｅ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｅ－ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． ＰｅｅｒＪ ７， ｅ７４２６ （２０１９）．
Ｌａｕ， Ｊ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｌｏｕｄ： ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ， ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ， ａｎｄ ｄｅｍｏｃｒａｔｉｚｅｄ-ａ ｎｅｗ ｐａｒａｄｉｇｍ ｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７７， ｅ３-ｅ６ （２０１７）．
Ｈｏａｄｌｅｙ， Ｋ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ－ｏｆ－ｏｒｉｇｉｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｄｏｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １０，０００ ｔｕｍｏｒｓ ｆｒｏｍ ３３ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｅｌｌ １７３， ２９１-３０４．ｅ６ （２０１８）．
Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＩＳＢ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｌｏｕｄ： ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｃｌｏｕｄ－ｂａｓｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７７， ｅ７-ｅ１０ （２０１７）．
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Ｋｗｏｎｇ， Ｔ． Ｎ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ ｆｒｏｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５５， ３８３-３９０．ｅ８ （２０１８）．
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Ｈｏｎｇ， Ｄ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ： ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｌａｓｍａ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ＤＮＡ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｄｉａｇｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ９２， ２１０-２１３ （２０１８）．
Ｂｕｒｎｈａｍ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｕｒｉｎａｒｙ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎａｌｙｔｅ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ９， ２４１２ （２０１８）．
Ｄｅ Ｖｌａｍｉｎｃｋ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｖｉｒｏｍｅ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｅｌｌ １５５， １１７８-１１８７ （２０１３）．
Ｈｕａｎｇ， Ｙ．－Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈｙ ｆｅｍａｌｅｓ． ＢＭＣ Ｍｅｄ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１ （Ｓｕｐｐｌ． １）， １６ （２０１８）．
Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ． Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． ６， ２２４ｒａ２４ （２０１４）．
Ｃｌａｒｋ， Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． ２０， ６８６-７０２ （２０１８）．
Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｌｅａｄｅｒｂｏａｒｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｌｏｎｇ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２０， ２２６ （２０１９）．
Ｈｕａｎｇ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ， ｏｒａｌ， ａｎｄ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅ． ｍＳｙｓｔｅｍｓ ５， ｅ００６３０－１９ （２０２０）．
Ｚｈｕ， Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ １０，５７５ ｇｅｎｏｍｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｏｍａｉｎｓ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ａｒｃｈａｅａ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０， ５４７７ （２０１９）．
Ｃｈｉｕ， Ｋ．－Ｐ． ＆ Ｙｕ， Ａ． Ｌ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄｂｏｒｎｅ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｅ－ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． ＰｅｅｒＪ ７， ｅ７４２６ （２０１９）．
Ｌａｕ， Ｊ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｌｏｕｄ： ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ， ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ， ａｎｄ ｄｅｍｏｃｒａｔｉｚｅｄ-ａ ｎｅｗ ｐａｒａｄｉｇｍ ｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７７， ｅ３-ｅ６ （２０１７）．
Ｈｏａｄｌｅｙ， Ｋ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ－ｏｆ－ｏｒｉｇｉｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｄｏｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １０，０００ ｔｕｍｏｒｓ ｆｒｏｍ ３３ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｅｌｌ １７３， ２９１-３０４．ｅ６ （２０１８）．
Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＩＳＢ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｌｏｕｄ： ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｃｌｏｕｄ－ｂａｓｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７７， ｅ７-ｅ１０ （２０１７）．
Ｅｌｌｒｏｔｔ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃａｌａｂｌｅ ｏｐｅｎ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃａｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｅｘｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ． ６， ２７１-２８１．ｅ７ （２０１８）．
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｒｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４９０， ６１-７０ （２０１２）．
Ｃｅｒａｍｉ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃＢｉｏ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｐｏｒｔａｌ： ａｎ ｏｐｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄａｔａ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ２， ４０１-４０４ （２０１２）．
Ｇａｏ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ． Ｓｃｉ． Ｓｉｇｎａｌ． ６， ｐｌ１ （２０１３）．
Ｌａｎｄ， Ｍ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ ｆｏｒ ３２，０００ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｓｔａｎｄ． Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｃｉ． ９， ２０ （２０１４）．
Ｌｉ， Ｈ． ＆ Ｄｕｒｂｉｎ， Ｒ． Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５， １７５４-１７６０ （２００９）．
Ｇｒｅａｔｈｏｕｓｅ， Ｋ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎｄ ＴＰ５３ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １９， １２３ （２０１８）．
Ｓｈａｎｍｕｇｈａｐｒｉｙａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｅｔｉｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ３１， ２３１１-２３１７ （２０１２）．
Ｂａｎｅｒｊｅｅ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｂｉｏｍｅ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８， ３６２２５-３６２４５ （２０１７）．
Ｌａｎｇｍｅａｄ， Ｂ． ＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ， Ｓ． Ｌ． Ｆａｓｔ ｇａｐｐｅｄ－ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｗｔｉｅ ２． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ９， ３５７-３５９ （２０１２）．
Ｂｏｌｙｅｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ， ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ， ｓｃａｌａｂｌｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｄａｔａ ｓｃｉｅｎｃｅ ｕｓｉｎｇ ＱＩＩＭＥ ２． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３７， ８５２-８５７ （２０１９）．
Ｒｉｔｃｈｉｅ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． ｌｉｍｍａ ｐｏｗｅｒｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４３， ｅ４７ （２０１５）．
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｍ． Ｄ．， ＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｄ． Ｊ． ＆ Ｓｍｙｔｈ， Ｇ． Ｋ． ｅｄｇｅＲ： ａ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｇｉｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６， １３９-１４０ （２０１０）．
ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ （ＢＩＯＭ） ｆｏｒｍａｔ ｏｒ： ｈｏｗ Ｉ ｌｅａｒｎｅｄ ｔｏ ｓｔｏｐ ｗｏｒｒｙｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｖｅ ｔｈｅ ｏｍｅ－ｏｍｅ． １， ２０４７－２１７Ｘ－１－７ （２０１２）．
Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｊ． Ｈ． Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｂｏｏｓｔｉｎｇ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｓｔａｔ． Ｄａｔａ Ａｎａｌ． ３８， ３６７-３７８ （２００２）．
Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｊ． Ｈ． Ｇｒｅｅｄｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ： ａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ． Ａｎｎ． Ｓｔａｔ． ２９， １１８９-１２３２ （２００１）．
Ｋｕｈｎ， Ｍ． Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ Ｒ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｒｅｔ ｐａｃｋａｇｅ． Ｊ． Ｓｔａｔ． Ｓｏｆｔｗ． ２８， １-２６ （２００８）．
Ｇｒａｕ， Ｊ．， Ｇｒｏｓｓｅ， Ｉ． ＆ Ｋｅｉｌｗａｇｅｎ， Ｊ． ＰＲＲＯＣ： ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｎｄ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅｓ ｉｎ Ｒ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３１， ２５９５-２５９７ （２０１５）．
Ｇｉｒｅ， Ｓ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｅｓ Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ２０１４ ｏｕｔｂｒｅａｋ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５， １３６９-１３７２ （２０１４）．
Ｍａｔｒａｎｇａ， Ｃ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｕｎｂｉａｓｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｌａｓｓａ ａｎｄ
Ｅｂｏｌａ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １５， ５１９ （２０１４）．
Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｖｏｉｄｉｎｇ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｆｅａｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｗａｙ ａｎｄ ｃｏｎｑｕｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｌａｔｙｐｕｓ． ｍＳｙｓｔｅｍｓ １， ｅ０００５０－１６ （２０１６）．
Ｄｉｄｉｏｎ， Ｊ． Ｐ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｍ． ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｆ． Ｓ． Ａｔｒｏｐｏｓ： ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ａｎｄ ｓｐｅｅｄｙ ｔｒｉｍｍｉｎｇ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｓ． ＰｅｅｒＪ ５， ｅ３７２０ （２０１７）．
Ｂｏｌｇｅｒ， Ａ． Ｍ．， Ｌｏｈｓｅ， Ｍ． ＆ Ｕｓａｄｅｌ， Ｂ． Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ： ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｒｉｍｍｅｒ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０， ２１１４-２１２０ （２０１４）．
Ｔｈｅ １０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ａ ｇｌｏｂａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ５２６， ６８-７４ （２０１５）．
Ｍａｇｏ?， Ｔ． ＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ， Ｓ． Ｌ． ＦＬＡＳＨ： ｆａｓｔ ｌｅｎｇｔｈ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７， ２９５７-２９６３ （２０１１）．
Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｑｉｉｔａ： ｒａｐｉｄ， ｗｅｂ－ｅｎａｂｌｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５， ７９６－７９８ （２０１８）．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15-1】
【図15-2】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18】
【国際調査報告】