特表 2023-544508 精子の健康状態を評価し、生殖補助医療に用いられる精子を判別する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-24

(54)【発明の名称】精子の健康状態を評価し、生殖補助医療に用いられる精子を判別する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20231017BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20231017BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20231017BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20231017BHJP

   A61P 15/08 20060101ALN20231017BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N21/64 Z

G01N33/48 M

C12Q1/02

A61P15/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023517871

(86)(22)【出願日】2021-09-20

(85)【翻訳文提出日】2023-04-13

(86)【国際出願番号】 EP2021075820

(87)【国際公開番号】W WO2022058592

(87)【国際公開日】2022-03-24

(31)【優先権主張番号】2014788.0

(32)【優先日】2020-09-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】514073617

【氏名又は名称】ザ プロボースト，フェローズ，ファンデーション スカラーズ，アンド ジ アザー メンバーズ オブ ボード，オブ ザ カレッジ オブ ザ ホーリー アンド アンディバイデッド トリニティ オブ クイーン エリザベス ニア ダブリン

(74)【代理人】

【識別番号】110001069

【氏名又は名称】弁理士法人京都国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヴィンセント ケリー

(72)【発明者】

【氏名】ジル ブローニング

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム ヤゴ―

【テーマコード（参考）】

2G043

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G043AA03

2G043BA16

2G043CA03

2G043EA01

2G045AA25

2G045CB14

2G045DA36

4B063QA05

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QR48

4B063QS33

4B063QX01

(57)【要約】

本発明は、精子の健康状態を評価し、生殖補助医療に用いられる精子を判別する方法であって、患者からの生体試料、好ましくは精液試料を提供し、該試料中のバイオマーカーの定量的なレベルを測定し、該バイオマーカーの定量的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することによる方法において、前記バイオマーカーが膜結合性の終末糖化産物受容体（ｍＲＡＧＥ）であるものに関する。
【選択図】 図１０ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

精子の健康状態を評価する体外受精の方法において、
（ａ）患者からの生体試料を提供する手順、
（ｂ）該試料中のバイオマーカーの定量的又は定性的なレベルを測定する手順、及び、
（ｃ）前記バイオマーカーの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価する手順、
を備え、前記バイオマーカーが膜結合性の終末糖化産物受容体（ｍＲＡＧＥ）である方法。

【請求項2】

前記評価する手順（ｃ）が、前記試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥの存在又は不存在を評価することで患者がｍＲＡＧＥ陰性であるかｍＲＡＧＥ陽性であるかを定めることを備えている、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ｍＲＡＧＥ陽性は、精子の健康状態が悪いこと、精子に異常があること、精子の運動性が低いこと、及び不妊の１つ以上を示しており、ｍＲＡＧＥ陰性は精子が正常であること及び精子の健康状態が良いことの１つ以上を示している、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥの存在が患者をｍＲＡＧＥ陽性であると定め、前記試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥの不存在が患者をｍＲＡＧＥ陰性であると定める、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

前記評価する手順（ｃ）が、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量を定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量と比較することを備えている、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量が、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも１倍外れている、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量が、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも１倍外れていれば、患者がｍＲＡＧＥ陽性であると定め、及び／又は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量が、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量から少なくとも１倍外れていれば、患者がｍＲＡＧＥ陰性であると定める、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の平均蛍光強度の値が、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の平均蛍光強度の値から少なくとも１０倍外れていれば、患者がｍＲＡＧＥ陽性であると定める、及び／又は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の平均蛍光強度の値が、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の平均蛍光強度の値から少なくとも１０倍外れていれば、患者がｍＲＡＧＥ陰性であると定める、請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

精子の健康状態を評価する前記方法が更に、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように精子の運動性をＩＭ、ＮＰ又はＰＲと評定する手順を備え、その際、ＩＭと分類された精子は精子の健康状態が悪いことを示しており、ＮＰと分類された精子及び／又はＰＲと分類された精子は精子の健康状態が良いことを示している、請求項１～８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

ｍＲＡＧＥ陽性の精子の量がＰＲ精子の量と逆の相関関係がある、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

精子の健康状態を評価する前記方法が更に精子の形態を評定する手順を備え、その際、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であるときに正常と分類され、また、精子は、正常からの逸脱があるときに異常と分類され、それは精子の健康状態が悪いことを示している、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

精子の健康状態を評価する前記方法が更にミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）を評定する手順を備え、その際、定量可能なレベルのＭＭＰはｍＲＡＧＥ陽性の精子を示し、定量可能なレベルのＭＭＰの不存在はｍＲＡＧＥ陰性の精子を示している、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

精子の健康状態を評価する前記方法が更に細胞透過性を評定する手順を備え、その際、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも２倍の細胞透過性の低下があることは精子の健康状態が悪いことを示している、及び／又は、精子の健康状態を評価する前記方法が更にアポトーシス及びネクローシスを評定する手順を備え、その際、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも２倍のアポトーシス及びネクローシスの増加があることは精子の健康状態が悪いことを示している、及び／又は、精子の健康状態を評価する前記方法が更にＤＮＡ断片化を評定する手順を備え、その際、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも２倍のＤＮＡ断片化の増加があることは精子の健康状態が悪いことを示している、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

精子の健康状態を評価する前記方法が更に密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）及び精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて前記試料を処理する手順を備えている、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記ＤＧＣ法及びスイムアップ法の結果、
（ａ）ｍＲＡＧＥ陽性の精子にｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも２倍の減少、及び／又は、
（ｂ）ＰＲ精子に少なくとも２倍の増加、及び／又は、
（ｃ）精子に少なくとも２倍の細胞透過性の低下、及び／又は、
（ｄ）アポトーシスの精子に少なくとも２倍の減少
が生じ、それは、子宮腔内受精（ＩＵＩ）、卵細胞質内注入法（ＩＣＳＩ）及び体外受精（ＩＶＦ）のうち１つ以上を含む生殖補助医療に用いられる（ＡＲＴ）に用いることができる精子を示している、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記患者が糖尿病でないこと、喫煙していないこと、及び、肥満ではないことの１つ以上である、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

不妊を診断する方法である、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、精子の健康状態を評価し、生殖補助医療に用いられる精子を判別する方法であって、患者からの生体試料、好ましくは精液試料を提供し、該試料中のバイオマーカーの定量的なレベルを測定し、該バイオマーカーの定量的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することによる方法において、前記バイオマーカーが膜結合性の終末糖化産物受容体（membrane-bound receptor for advanced glycation end products: mRAGE）であるものに関する。

【背景技術】

【0002】

不妊は再生産年齢の男女の約１５％に影響を及ぼし、症例の約３０～４０％は男性側の要因による不妊に帰することができる。男性不妊は、精索静脈瘤、遺伝子変化、全身性疾患、精液指標の変化等、様々な事情により生じ得る。しかし、男性不妊に対する最大の単独の寄与因子は酸化的ストレスによる精子の損傷とそれによるＤＮＡ断片化であり、症例の３０％から８０％を占めるものと推定される。ＤＮＡ断片化は精子の品質に影響するだけでなく、胚の品質、着床率及び流産率に悪影響を及ぼすことも分かっている。

【0003】

現在行われている男性不妊の調査には精液試料の物理的特性の評価（体積、粘性、ｐＨ及び色）と顕微鏡による試料中の精子の評価（濃度、運動性、形態及び活性）が含まれる。これらの検査により精液試料中の精子の母集団の健康状態を機能的及び物理的に読み取ることができる。精子の分子的な健康状態、受精率、及びＤＮＡの完全性に関する追加情報を提供するため、精子のＤＮＡ中の二本鎖の切断を評定することが推奨される。検査には、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（terminal deoxynucleotidyl transferase: TdT）の媒介によるデオキシウリジン三リン酸（deoxyuridine triphosphate: dUTP）ニック末端標識（TUNEL）分析、コメット分析、又は精子クロマチン分散（sperm chromatin dispersion: SCD）分析が含まれる。残念ながらこれらの検査は、費用がかかる、時間がかかる、侵襲性である、そして精子の健康状態を十分に伝えないという理由から、男性不妊の調査には含まれないことが多い。

【0004】

精子のＤＮＡ損傷の度合い及び精子の品質と関連している細胞外マーカーがあれば、損傷した精子を生殖補助医療（assisted reproductive techniques: ART）の前に判別して除去する上で非常に役に立つであろう。過去３０年にわたり、より高性能のマーカーを発見するために多大な努力が成されてきた。主に、ＤＮＡ断片化、酸化的ＤＮＡ損傷、酸化的ストレス、ミトコンドリア機能、及び精子細胞死の細胞内マーカーが発見されている。しかし、これらには侵襲性の内部標識処置が必要であり、後には生命力のない精子が残る。本研究では精子細胞の健康状態の細胞外マーカーを評価する。

【0005】

終末糖化産物受容体（Receptor for Advanced Glycation End products: RAGE）は自然免疫系の中心的なシグナル伝達分子であり、ＭＨＣクラスIIIの遺伝子座にコードされた細胞表面パターン認識受容体のクラスに属する。この受容体は膜結合性（完全長）、可溶性又は分泌性タンパク質として非常に多くの形で存在する。可溶性ＲＡＧＥ（sRAGE）は、膜結合性／完全長ＲＡＧＥ（mRAGE/fl-RAGE）のタンパク質分解性開裂、及び選択的ｍＲＮＡスプライシングのいずれでも産生される。可溶性アイソフォームは細胞外ドメインを含むが膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインはない。

【0006】

ＲＡＧＥは神経変性、アテローム性動脈硬化、循環器疾患、変形性関節症、糖尿病などの重い慢性病理の主要な誘引として長く認められている。正常な状態ではＲＡＧＥの発現は非常に低い。しかし、病気の間は、終末糖化産物（advanced glycation end products: AGE）、高移動度群ボックス１（high mobility group box-1: HMGB1）、S100/カルグラヌリン（S100/calgranulins）、ホスファチジルセリン（phosphatidylserine）、Ｃ３等、多数の異なるリガンドにより細胞表面でＲＡＧＥの産生が盛んに誘発される。加えて、ＲＡＧＥの発現は免疫活性化又は感染の後では一層高められ、多くのＲＡＧＥリガンドが、ＲＡＧＥ依存性炎症反応の開始と拡大にとって極めて重要である可能性が高い単球、マクロファージ、好中球及び白血球によって分泌される。ヒト精子の先体帽（精子頭部内の核ＤＮＡへの直接アクセス点）における膜結合性受容体の位置は、核ＤＮＡの損傷を生じさせて悪化させる役割を果たすことに関与している。

【0007】

本研究ではｍＲＡＧＥを低品質の精子の診断バイオマーカーとして記述する。糖尿病ではなく、肥満でもなく、喫煙もしない男性から採取した精子上でｍＲＡＧＥの発現を分析することにより、これらの条件において高められるＲＡＧＥ及びそのリガンドの、精子の健康状態への作用を排除した。精子上の細胞レベルでのｍＲＡＧＥの発現を定量的に評定するためにフローサイトメトリーを用い、精子の運動性を評価するためにコンピュータ支援精子分析（computer-assisted sperm analysis: CASA）を用いた。ｍＲＡＧＥ並びにミトコンドリア膜電位（mitochondrial membrane potential: MMP）、細胞透過性、運動性、形態、アポトーシス及びＤＮＡ断片化を細胞レベルで分析することにより、直接的な関係を示す非常に強力な証拠がもたらされる。

【0008】

精子上のｍＲＡＧＥの発現はミトコンドリア機能障害、細胞死、ＤＮＡ断片化、及び不動精子と関連していることが観察された。加えて、従来の手法（密度勾配遠心分離と直接スイムアップ）を用いて精子を精製することにより、ｍＲＡＧＥ発現精子を除去することができた。そうなると、後は精子の健康状態を評価するための、信頼できる、低侵襲の細胞外マーカーが必要である。ＲＡＧＥは膜結合性であるため、損傷した精子を除去するための手段としてそれを用いることも可能である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の第１の態様により、精子の健康状態を評価する方法が提供される。該方法は、
（ａ）患者からの生体試料を提供する手順、
（ｂ）該試料中のバイオマーカーの定量的又は定性的なレベルを測定する手順、及び、
（ｃ）前記バイオマーカーの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価する手順、
を含み、前記バイオマーカーは膜結合性の終末糖化産物受容体（ｍＲＡＧＥ）である。

【0010】

精子の健康状態を評価する前記方法は体外受精の方法であってもよい。

【0011】

ｍＲＡＧＥは細胞の膜に結合されていてもよい。

【0012】

ｍＲＡＧＥは精子の膜に結合されていてもよい。

【0013】

ｍＲＡＧＥは精子頭部の膜に結合されていてもよい。

【0014】

ｍＲＡＧＥは精子頭部の赤道域の膜に結合されていてもよい。

【0015】

ｍＲＡＧＥは膜貫通受容体であってもよい。

【0016】

ｍＲＡＧＥは３つの細胞外ドメインを備えていてもよい。

【0017】

ｍＲＡＧＥは、１つのＶ型Ｉｇドメイン及び２つのＣ型Ｉｇドメイン（Ｃ１及びＣ２）という３つの細胞外ドメインを備えていてもよい。

【0018】

ｍＲＡＧＥは、１つのＶ型Ｉｇドメイン及び２つのＣ型Ｉｇドメイン（Ｃ１及びＣ２）という３つの細胞外ドメイン、並びに１つの膜貫通ドメインを備えていてもよい。

【0019】

ｍＲＡＧＥは、１つのＶ型Ｉｇドメイン及び２つのＣ型Ｉｇドメイン（Ｃ１及びＣ２）という３つの細胞外ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、並びに１つの細胞質尾部を備えていてもよい。

【0020】

ｍＲＡＧＥは、完全長ＲＡＧＥ（ｆｌ－ＲＡＧＥ）であってもよい。

【0021】

前記生体試料は精液試料であることが好ましい。

【0022】

前記バイオマーカーは遺伝子であってもよい。前記バイオマーカーは核酸であってもよい。前記バイオマーカーはデオキシリボ核酸であってもよい。前記バイオマーカーはリボ核酸であってもよい。前記バイオマーカーはタンパク質であってもよい。前記バイオマーカーはペプチドであってもよい。

【0023】

精子の健康状態を評価するための前記バイオマーカーはＧｅｎＢａｎｋアクセッションバージョン番号がＡＱＹ７６６５２である遺伝子であってもよい。

【0024】

精子の健康状態を評価するための前記バイオマーカーはＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤがＱ１５１０９であるタンパク質であることが好ましい。

【0025】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的なレベルを測定することを含むことが好ましい。

【0026】

前記測定する手順（ｂ）は、任意の定量分析技術により精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的なレベルを測定することを含んでいてもよい。

【0027】

前記測定する手順（ｂ）は、細胞に基づく分析により精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含んでいてもよい。

【0028】

前記測定する手順（ｂ）は、フローサイトメトリーにより精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含んでいてもよい。

【0029】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、ＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0030】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、ｓＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0031】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、ｍＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0032】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、マウス抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0033】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、ウサギ抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0034】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、ネズミ抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0035】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、ヒツジ抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0036】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、モノクローナルウサギ抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0037】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、モノクローナルネズミ抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0038】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、モノクローナルヒツジ抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0039】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、モノクローナルマウス抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0040】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、モノクローナルマウス抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体ＡＦ６４７を用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0041】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、ＤＮＡアプタマーを用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0042】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、ＲＮＡアプタマーを用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0043】

前記測定する手順（ｂ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルを測定することを含み、ペプチドアプタマーを用いて決定されている、というようにしてもよい。

【0044】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含んでいてもよい。

【0045】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥが存在することがｍＲＡＧＥ陽性と定義されている、というようにしてもよい。

【0046】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥの存在又は不存在を評価することで患者がｍＲＡＧＥ陰性であるかｍＲＡＧＥ陽性であるかを定めることを含んでいてもよい。

【0047】

前記精液試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥの存在が患者をｍＲＡＧＥ陽性であると定め、前記精液試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥの不存在が患者をｍＲＡＧＥ陰性であると定める、というようにしてもよい。

【0048】

前記評価する手順（ｃ）は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量を定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量と比較することを含んでいてもよい。

【0049】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも１倍外れている、というようにしてもよい。

【0050】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも２倍外れている、というようにしてもよい。

【0051】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも３倍外れている、というようにしてもよい。

【0052】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも４倍外れている、というようにしてもよい。

【0053】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも５倍外れている、というようにしてもよい。

【0054】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも６倍外れている、というようにしてもよい。

【0055】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも７倍外れている、というようにしてもよい。

【0056】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも８倍外れている、というようにしてもよい。

【0057】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも９倍外れている、というようにしてもよい。

【0058】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の量は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現していない精子の量から少なくとも１０倍外れている、というようにしてもよい。

【0059】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の割合を評価することを含んでいてもよい。

【0060】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の割合を評価することで、患者をｍＲＡＧＥ陰性又はｍＲＡＧＥ陽性と定めることを含んでいてもよい。

【0061】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の割合を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陰性は、平均蛍光強度（ＭＦＩ、幾何平均）値がｍＲＡＧＥ陽性の精子細胞に比べて１０倍未満であることと定義されている、というようにしてもよい。

【0062】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の割合を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は、平均蛍光強度（ＭＦＩ、幾何平均）値がｍＲＡＧＥ陰性の精子細胞に比べて少なくとも１０倍高いことと定義されている、というようにしてもよい。

【0063】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の割合を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は、平均蛍光強度（ＭＦＩ、幾何平均）値がｍＲＡＧＥ陰性の精子細胞に比べて少なくとも２０倍高いことと定義されている、というようにしてもよい。

【0064】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上における定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを発現している精子の割合を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は、平均蛍光強度（ＭＦＩ、幾何平均）値がｍＲＡＧＥ陰性の精子細胞に比べて少なくとも３０倍高いことと定義されている、というようにしてもよい。

【0065】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを表している平均蛍光強度の値は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを表していない平均蛍光強度の値から、１０倍未満だけ外れている、というようにしてもよい。

【0066】

定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを表している平均蛍光強度の値は、定量可能なレベルのｍＲＡＧＥを表していない平均蛍光強度の値から、少なくとも１０倍外れている、というようにしてもよい。

【0067】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0068】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陰性は精子が健康で繁殖力を持つことを示している、というようにしてもよい。

【0069】

更に、前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は精子に異常があることを示している、というようにしてもよい。

【0070】

更に、前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陰性は精子が正常であることを示している、というようにしてもよい。

【0071】

更に、前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陰性は精子の健康状態が良いことを示している、というようにしてもよい。

【0072】

更に、前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陰性は精子が正常であること及び精子の健康状態が良いことの１つ以上を示している、というようにしてもよい。

【0073】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は精子の健康状態が悪いこと及び精子に異常があることの１つ以上を示している、というようにしてもよい。

【0074】

更に、前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は精子の運動性が低いことを示している、というようにしてもよい。

【0075】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は、精子の健康状態が悪いこと、精子に異常があること及び精子の運動性が低いことの１つ以上を示している、というようにしてもよい。

【0076】

更に、前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は不妊を示している、というようにしてもよい。

【0077】

前記評価する手順（ｃ）は、精液試料からの精子細胞上のｍＲＡＧＥの定量的又は定性的なレベルに基づいて精子の健康状態を評価することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性は、精子の健康状態が悪いこと、精子に異常があること、精子の運動性が低いこと、及び不妊の１つ以上を示している、というようにしてもよい。

【0078】

精子の健康状態を評価する前記方法において、前記患者は哺乳類であってもよい。

【0079】

精子の健康状態を評価する前記方法において、前記患者はヒト以外のものであってもよい。

【0080】

精子の健康状態を評価する前記方法において、前記患者は、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ及びクマ等、ヒト以外の動物であってもよい。

【0081】

精子の健康状態を評価する前記方法において、前記患者はヒトであることが好ましい。

【0082】

精子の健康状態を評価する前記方法において、前記患者は糖尿病ではないヒトであってもよい。

【0083】

精子の健康状態を評価する前記方法において、前記患者は、糖尿病ではなく喫煙もしないヒトであってもよい。

【0084】

精子の健康状態を評価する前記方法において、前記患者は、糖尿病ではなく、喫煙もせず、肥満でもないヒトであってもよい。

【0085】

精子の健康状態を評価する前記方法において、前記患者は糖尿病ではなく、喫煙もせず、肥満でもない（ＢＭＩ＜２９．９）ヒトであってもよい。

【0086】

精子の健康状態を評価する前記方法において、前記患者は糖尿病ではなく、喫煙もせず、肥満でもない（ＢＭＩ＜２９．９）男性であってもよい。

【0087】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含んでいてもよい。

【0088】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、前記精子は不動（ＩＭ）、非前進運動（ＮＰ）又は前進運動（ＰＲ）に分類される、というようにしてもよい。

【0089】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ＩＭに分類された精子は運動しない、というようにしてもよい。

【0090】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ＩＭに分類された精子は運動せず、これは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0091】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ＩＭに分類された精子は運動せず、これは精子の健康状態が悪いこと及び精子の運動性が低いことを示している、というようにしてもよい。

【0092】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、ＩＭに分類された精子は運動しない、というようにしてもよい。

【0093】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、ＩＭに分類された精子は精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0094】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ＮＰに分類された精子は、運動はするものの略直線的な方向には運動しない、というようにしてもよい。

【0095】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、ＮＰに分類された精子は、運動はするものの略直線的な方向には運動しない、というようにしてもよい。

【0096】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ＰＲに分類された精子は略直線的な方向に運動する、というようにしてもよい。

【0097】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、ＰＲに分類された精子は略直線的な方向に運動する、というようにしてもよい。

【0098】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、精液試料中でＰＲに分類された精子の少なくとも１０％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0099】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、精液試料中でＰＲに分類された精子の少なくとも２０％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0100】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、精液試料中でＰＲに分類された精子の少なくとも３０％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0101】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、精液試料中でＰＲに分類された精子の少なくとも３２％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0102】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精液試料中でＰＲに分類された精子の少なくとも３２％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0103】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、精液試料中でＮＰに分類された精子とＰＲに分類された精子とを合わせたものの少なくとも１０％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0104】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、精液試料中でＮＰに分類された精子とＰＲに分類された精子とを合わせたものの少なくとも２０％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0105】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、精液試料中でＮＰに分類された精子とＰＲに分類された精子とを合わせたものの少なくとも３０％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0106】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、精液試料中でＮＰに分類された精子とＰＲに分類された精子とを合わせたものの少なくとも４０％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0107】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精液試料中でＮＰに分類された精子とＰＲに分類された精子とを合わせたものの少なくとも４０％は正常とみなされる、というようにしてもよい。

【0108】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の運動性を評定することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性の精子の割合はＰＲ精子の割合と逆の相関関係があり、５μｍ／秒以上の空間ゲインを持つ精子をＰＲ精子と定義する、というようにしてもよい。

【0109】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含んでいてもよい。

【0110】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、精子は正常又は異常と分類される、というようにしてもよい。

【0111】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子は正常又は異常と分類される、というようにしてもよい。

【0112】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であるときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0113】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であるときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0114】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があるときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0115】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があるときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0116】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があり、該先体部に大きな空胞がなく、２個以上の小さな空胞がなく、該空胞が精子頭部の２０％より大きな割合を占めないときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0117】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があり、該先体部に大きな空胞がなく、２個以上の小さな空胞がなく、該空胞が精子頭部の２０％より大きな割合を占めないときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0118】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があり、該先体部に大きな空胞がなく、２個以上の小さな空胞がなく、該空胞が精子頭部の２０％より大きな割合を占めておらず、精子の中片部が細長く、整っており、精子頭部と略同じ長さであるときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0119】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があり、該先体部に大きな空胞がなく、２個以上の小さな空胞がなく、該空胞が精子頭部の２０％より大きな割合を占めておらず、精子の中片部が細長く、整っており、精子頭部と略同じ長さであるときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0120】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があり、該先体部に大きな空胞がなく、２個以上の小さな空胞がなく、該空胞が精子頭部の２０％より大きな割合を占めておらず、精子の中片部が細長く、整っており、精子頭部と略同じ長さであり、精子の中片部の長軸が精子頭部の長軸と一直線になっているときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0121】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があり、該先体部に大きな空胞がなく、２個以上の小さな空胞がなく、該空胞が精子頭部の２０％より大きな割合を占めておらず、精子の中片部が細長く、整っており、精子頭部と略同じ長さであり、精子の中片部の長軸が精子頭部の長軸と一直線になっているときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0122】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があり、該先体部に大きな空胞がなく、２個以上の小さな空胞がなく、該空胞が精子頭部の２０％より大きな割合を占めておらず、精子の中片部が細長く、整っており、精子頭部と略同じ長さであり、精子の中片部の長軸が精子頭部の長軸と一直線になっており、主部がその長さに沿って太さが一定であり、中片部よりも細く、約４５μｍの長さであるときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0123】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子は、精子頭部が滑らかで、整った輪郭を持ち、略卵形であり、且つ、精子頭部領域の４０～７０％を占める明瞭な先体部があり、該先体部に大きな空胞がなく、２個以上の小さな空胞がなく、該空胞が精子頭部の２０％より大きな割合を占めておらず、精子の中片部が細長く、整っており、精子頭部と略同じ長さであり、精子の中片部の長軸が精子頭部の長軸と一直線になっており、主部がその長さに沿って太さが一定であり、中片部よりも細く、約４５μｍの長さであるときに正常と分類される、というようにしてもよい。

【0124】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、精子は正常からの逸脱があるときに異常と分類される、というようにしてもよい。

【0125】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子は正常からの逸脱があるときに異常と分類される、というようにしてもよい。

【0126】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、精子は正常からの逸脱があるときに異常と分類され、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0127】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に精子の形態を評定することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子は正常からの逸脱があるときに異常と分類され、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0128】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）を評定する手順を含んでいてもよい。

【0129】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定される、というようにしてもよい。

【0130】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、その際、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓは低ＭＭＰの細胞を染色しない、というようにしてもよい。

【0131】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、その際、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓは低ＭＭＰの細胞を染色せず、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0132】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、その際、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓは低ＭＭＰの細胞を染色せず、該低ＭＭＰは平均蛍光強度（ＭＦＩ、幾何平均）値がｍＲＡＧＥ陰性の精子細胞に比べて１０倍以下と定義されており、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0133】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、その際、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓは高ＭＭＰの細胞を染色する、というようにしてもよい。

【0134】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、その際、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓは高ＭＭＰの細胞を染色し、それは精子の健康状態が良いことを示している、というようにしてもよい。

【0135】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には低ＭＭＰの精子の増加が見られる、というようにしてもよい。

【0136】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には低ＭＭＰの精子の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0137】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陰性の精子には高ＭＭＰの精子の増加が見られる、というようにしてもよい。

【0138】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陰性の精子には高ＭＭＰの精子の増加が見られ、それは精子の健康状態が良いことを示している、というようにしてもよい。

【0139】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陰性の精子には、ｍＲＡＧＥ陽性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の増加が見られる、というようにしてもよい。

【0140】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陰性の精子には、ＲＡＧＥ陽性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも２倍の増加が見られる、というようにしてもよい。

【0141】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陰性の精子には、ＲＡＧＥ陽性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも２倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が良いことを示している、というようにしてもよい。

【0142】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陰性の精子には、ＲＡＧＥ陽性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも５倍の増加が見られる、というようにしてもよい。

【0143】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陰性の精子には、ＲＡＧＥ陽性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも５倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が良いことを示している、というようにしてもよい。

【0144】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陰性の精子には、ｍＲＡＧＥ陽性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも１０倍の増加が見られる、というようにしてもよい。

【0145】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陰性の精子には、ｍＲＡＧＥ陽性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも１０倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が良いことを示している、というようにしてもよい。

【0146】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも２倍の減少が見られる、というようにしてもよい。

【0147】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも２倍の減少が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0148】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも５倍の減少が見られる、というようにしてもよい。

【0149】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも５倍の減少が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0150】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも１０倍の減少が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0151】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＭＭＰを評定する手順を含み、その際、ＭＭＰはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、高ＭＭＰの精子の少なくとも１０倍の減少が見られる、というようにしてもよい。

【0152】

定量可能なレベルのＭＭＰはｍＲＡＧＥ陰性の精子を示し、定量可能なレベルのＭＭＰの不存在はｍＲＡＧＥ陽性の精子を示している、というようにしてもよい。

【0153】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に細胞透過性を評定する手順を含んでいてもよい。

【0154】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に細胞透過性を評定することを含み、その際、細胞透過性はＤＡＰＩで染色することにより評定される、というようにしてもよい。

【0155】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に細胞透過性を評定することを含み、その際、細胞透過性はＤＡＰＩで染色することにより評定され、ＤＡＰＩによる染色で陽性になることは生命力のない細胞を表す、というようにしてもよい。

【0156】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に細胞透過性を評定することを含み、その際、細胞透過性はＤＡＰＩで染色することにより評定され、ＤＡＰＩによる染色で陽性になることは生命力のない細胞を表し、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には生命力のない細胞の増加が見られる、というようにしてもよい。

【0157】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に細胞透過性を評定することを含み、その際、細胞透過性はＤＡＰＩで染色することにより評定され、ＤＡＰＩによる染色で陽性になることは生命力のない細胞を表し、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には生命力のない細胞の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0158】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に細胞透過性を評定することを含み、その際、細胞透過性はＤＡＰＩで染色することにより評定され、ＤＡＰＩによる染色で陽性になることは生命力のない細胞を表し、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、生命力のない細胞の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0159】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に細胞透過性を評定することを含み、その際、細胞透過性はＤＡＰＩで染色することにより評定され、ＤＡＰＩによる染色で陽性になることは生命力のない細胞を表し、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、生命力のない細胞の少なくとも２倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0160】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に細胞透過性を評定することを含み、その際、細胞透過性はＤＡＰＩで染色することにより評定され、ＤＡＰＩによる染色で陽性になることは生命力のない細胞を表し、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、生命力のない細胞の少なくとも３倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0161】

ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、透過性のない細胞の少なくとも２倍の減少が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0162】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定する手順を含んでいてもよい。

【0163】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、その際、アポトーシスはＡｎｎｅｘｉｎ Ｖで染色することにより評定される、というようにしてもよい。

【0164】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、その際、アポトーシスはＡｎｎｅｘｉｎ Ｖで染色することにより評定され、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖによる染色で陽性になることは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0165】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、その際、アポトーシスはＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせで染色することにより評定される、というようにしてもよい。

【0166】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、その際、アポトーシスは、アポトーシスとネクローシスを同時に評定できるようにするためにＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせで染色することにより評定される、というようにしてもよい。

【0167】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、その際、アポトーシスは、アポトーシスとネクローシスを同時に評定できるようにするためにＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせで染色することにより評定され、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせによる染色で陽性になることは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0168】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、その際、アポトーシスは、アポトーシスとネクローシスを同時に評定できるようにするためにＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にはアポトーシスとネクローシスの増加が見られる、というようにしてもよい。

【0169】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、その際、アポトーシスは、アポトーシスとネクローシスを同時に評定できるようにするためにＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にはアポトーシスとネクローシスの増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0170】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、その際、アポトーシスは、アポトーシスとネクローシスを同時に評定できるようにするためにＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にはｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べてアポトーシスとネクローシスの増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0171】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、その際、アポトーシスは、アポトーシスとネクローシスを同時に評定できるようにするためにＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にはｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べてアポトーシスとネクローシスの少なくとも２倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0172】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、アポトーシスは、アポトーシスとネクローシスを同時に評定できるようにするためにＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせで染色することにより評価され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にはｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べてアポトーシスとネクローシスの少なくとも４倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0173】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にアポトーシスを評定することを含み、アポトーシスは、アポトーシスとネクローシスを同時に評定できるようにするためにＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＤＡＰＩの組み合わせで染色することにより評定され、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にはｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べてアポトーシスとネクローシスの少なくとも４倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0174】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＤＮＡ断片化を評定する手順を含んでいてもよい。

【0175】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＡｐｏＢｒｄＵ末端デオキシヌクレオチド転移酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）分析でＤＮＡ断片化を評定することを含んでいてもよい。

【0176】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＡｐｏＢｒｄＵ末端デオキシヌクレオチド転移酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）分析でＤＮＡ断片化を評定することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性の精子にはＤＮＡ断片化の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0177】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＡｐｏＢｒｄＵ末端デオキシヌクレオチド転移酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）分析でＤＮＡ断片化を評定することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、ＤＮＡ断片化の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0178】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＡｐｏＢｒｄＵ末端デオキシヌクレオチド転移酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）分析でＤＮＡ断片化を評定することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、ＤＮＡ断片化の少なくとも２倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0179】

精子の健康状態を評価する前記方法は更にＡｐｏＢｒｄＵ末端デオキシヌクレオチド転移酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）分析でＤＮＡ断片化を評定することを含み、その際、ｍＲＡＧＥ陽性の精子には、ｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて、ＤＮＡ断片化の少なくとも３倍の増加が見られ、それは精子の健康状態が悪いことを示している、というようにしてもよい。

【0180】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別する手順を含んでいてもよい。

【0181】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、子宮腔内受精（ＩＵＩ）を含む生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含んでいてもよい。

【0182】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、子宮腔内受精（ＩＵＩ）と卵細胞質内注入法（ＩＣＳＩ）のうち１つ以上を含む生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含んでいてもよい。

【0183】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、子宮腔内受精（ＩＵＩ）、卵細胞質内注入法（ＩＣＳＩ）及び体外受精（ＩＶＦ）のうち１つ以上を含む生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含んでいてもよい。

【0184】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、子宮腔内受精（ＩＵＩ）、卵細胞質内注入法（ＩＣＳＩ）、体外受精（ＩＶＦ）及び人工授精（ＡＩ）のうち１つ以上を含む生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含んでいてもよい。

【0185】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、精液試料が処理される、というようにしてもよい。

【0186】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、分離技術を用いて精液試料が処理される、というようにしてもよい。

【0187】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）を含む分離技術を用いて精液試料が処理される、というようにしてもよい。

【0188】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、精子スイムアップ法を含む分離技術を用いて精液試料が処理される、というようにしてもよい。

【0189】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、ヒト精液の検査及び処理のための世界保健機関（ＷＨＯ）実験マニュアル（第５版、２０１０年）で定義されているように、精子スイムアップ法を含む分離技術を用いて精液試料が処理される、というようにしてもよい。

【0190】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理される、というようにしてもよい。

【0191】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法は精子の密度に基づいて該精子を分離する、というようにしてもよい。

【0192】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法では、形態が正常な精子は異常な精子よりも密度が高いため精子の密度に基づいて該精子を分離する、というようにしてもよい。

【0193】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法では、形態が正常な精子は異常な精子よりも密度が高いため精子の密度に基づいて該精子を分離し、スイムアップ法では精子の運動性を頼りにする、というようにしてもよい。

【0194】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法では、形態が正常な精子は異常な精子よりも密度が高いため精子の密度に基づいて該精子を分離し、スイムアップ法では精子の運動性を頼りにしてＩＭ精子及びＮＰ精子からＰＲ精子を分離する、というようにしてもよい。

【0195】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、ｍＲＡＧＥ陽性の精子が減少する、というようにしてもよい。

【0196】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、スイムアップ法の結果、ｍＲＡＧＥ陽性の精子が減少する、というようにしてもよい。

【0197】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、ｍＲＡＧＥ陽性の精子が減少する、というようにしてもよい。

【0198】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、ｍＲＡＧＥ陽性の精子が減少し、それは精子の健康状態が良いことを示している、というようにしてもよい。

【0199】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、ｍＲＡＧＥ陽性の精子がｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも２倍減少する、というようにしてもよい。

【0200】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、ｍＲＡＧＥ陽性の精子がｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも２倍減少し、スイムアップ法の結果、ｍＲＡＧＥ陽性の精子がｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも２倍減少する、というようにしてもよい。

【0201】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、処理されたｍＲＡＧＥ陽性の精子が、処理されたｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも２倍減少し、スイムアップ法の結果、処理されたｍＲＡＧＥ陽性の精子が、処理されたｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも２倍減少する、というようにしてもよい。

【0202】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、処理されたｍＲＡＧＥ陽性の精子が、処理されたｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも３倍減少し、スイムアップ法の結果、処理されたｍＲＡＧＥ陽性の精子が、処理されたｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも３倍減少する、というようにしてもよい。

【0203】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、処理されたｍＲＡＧＥ陽性の精子が、処理されたｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも４倍減少し、スイムアップ法の結果、処理されたｍＲＡＧＥ陽性の精子が、処理されたｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも４倍減少する、というようにしてもよい。

【0204】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、処理されたｍＲＡＧＥ陽性の精子が、処理されたｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも４倍減少し、スイムアップ法の結果、処理されたｍＲＡＧＥ陽性の精子が、処理されたｍＲＡＧＥ陰性の精子に比べて少なくとも５倍減少する、というようにしてもよい。

【0205】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、ＰＲ精子が増加する、というようにしてもよい。

【0206】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、スイムアップ法の結果、ＰＲ精子が増加する、というようにしてもよい。

【0207】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、ＰＲ精子が増加する、というようにしてもよい。

【0208】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、ＰＲ精子が少なくとも２倍増加する、というようにしてもよい。

【0209】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、処理されたＰＲ精子が未処理の精子に比べて少なくとも２倍増加し、スイムアップ法の結果、処理されたＰＲ精子が未処理の精子に比べて少なくとも２倍増加する、というようにしてもよい。

【0210】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、処理されたＰＲ精子が未処理の精子に比べて少なくとも３倍増加し、スイムアップ法の結果、処理されたＰＲ精子が未処理の精子に比べて少なくとも３倍増加する、というようにしてもよい。

【0211】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、処理されたＰＲ精子が未処理の精子に比べて少なくとも３．５倍増加し、スイムアップ法の結果、処理されたＰＲ精子が未処理の精子に比べて少なくとも３．４倍増加する、というようにしてもよい。

【0212】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、精子の細胞透過性が低下する、というようにしてもよい。

【0213】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、スイムアップ法の結果、精子の細胞透過性が低下する、というようにしてもよい。

【0214】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、精子の細胞透過性が低下する、というようにしてもよい。

【0215】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、精子の細胞透過性が少なくとも２倍低下する、というようにしてもよい。

【0216】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、精子の細胞透過性が少なくとも２．７５倍低下する、というようにしてもよい。

【0217】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、アポトーシスの精子が減少する、というようにしてもよい。

【0218】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、スイムアップ法の結果、アポトーシスの精子が減少する、というようにしてもよい。

【0219】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、アポトーシスの精子が減少する、というようにしてもよい。

【0220】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、アポトーシスの精子が少なくとも２倍減少する、というようにしてもよい。

【0221】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、処理されたアポトーシスの精子が未処理の精子に比べて少なくとも２倍減少する、というようにしてもよい。

【0222】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）と精子スイムアップ法のうち１つ以上を含む分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、処理されたアポトーシスの精子が未処理の精子に比べて少なくとも２．７５倍減少する、というようにしてもよい。

【0223】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）や精子スイムアップ法等の分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法の結果、精子のＭＭＰが増加する、というようにしてもよい。

【0224】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）や精子スイムアップ法等の分離技術を用いて精液試料が処理され、スイムアップ法の結果、精子のＭＭＰが増加する、というようにしてもよい。

【0225】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）や精子スイムアップ法等の分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、精子のＭＭＰが増加する、というようにしてもよい。

【0226】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）や精子スイムアップ法等の分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、精子のＭＭＰが少なくとも１．５倍増加する、というようにしてもよい。

【0227】

精子の健康状態を評価する前記方法は更に、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別することを含み、その際、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）や精子スイムアップ法等の分離技術を用いて精液試料が処理され、ＤＧＣ法とスイムアップ法の結果、処理された精子のＭＭＰが未処理の精子に比べて少なくとも１．５倍増加する、というようにしてもよい。

【0228】

前記方法は不妊の診断方法であってもよい。

【0229】

前記方法は不妊の診断方法であり、精子の健康状態が悪いことは不妊を示している、というようにしてもよい。

【0230】

前記不妊の診断方法において、前記患者は哺乳類であってもよい。

【0231】

前記不妊の診断方法において、前記患者はヒト以外のものであってもよい。

【0232】

前記不妊の診断方法において、前記患者は、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ及びクマ等、ヒト以外の動物であってもよい。

【0233】

前記不妊の診断方法において、前記患者はヒトであることが好ましい。

【0234】

前記不妊の診断方法において、前記患者は糖尿病ではないヒトであってもよい。

【0235】

前記不妊の診断方法において、前記患者は糖尿病ではなく、喫煙もしないヒトであってもよい。

【0236】

前記不妊の診断方法において、前記患者は糖尿病ではなく、喫煙もせず、肥満でもないヒトであってもよい。

【0237】

前記不妊の診断方法において、前記患者は糖尿病ではなく、喫煙もせず、肥満でもない（ＢＭＩ＜２９．９の）ヒトであってもよい。

【0238】

前記不妊の診断方法において、前記患者は糖尿病ではなく、喫煙もせず、肥満でもない（ＢＭＩ＜２９．９の）男性であってもよい。

【0239】

前記方法は不妊の診断方法であり、該方法は、患者からの生体試料を提供すること、該試料中のバイオマーカーの定量的なレベルを測定すること、及び、前記バイオマーカーの定量的なレベルに基づいて不妊を診断することを含み、前記バイオマーカーは膜結合性の終末糖化産物受容体（ｍＲＡＧＥ）である、というようにしてもよい。

【0240】

好ましくは、前記方法は不妊の診断方法であり、該方法は、患者からの精液試料を提供すること、該試料中のバイオマーカーの定量的なレベルを測定すること、及び、前記バイオマーカーの定量的なレベルに基づいて不妊を診断することを含み、前記バイオマーカーは膜結合性の終末糖化産物受容体（ｍＲＡＧＥ）である。

【0241】

本発明の別の態様により、不妊の治療方法が提供される。該方法は、
（ａ）患者からの生体試料を提供する手順、
（ｂ）該試料中の膜結合性の終末糖化産物受容体（ｍＲＡＧＥ）の定量的なレベルの存在又は不存在を測定して前記患者をｍＲＡＧＥ陰性又はｍＲＡＧＥ陽性と定める手順、及び、
（ｃ）ｍＲＡＧＥ陰性の試料を選択して卵子を受精させることにより不妊を治療する手順
を含む。

【0242】

前記不妊の治療方法は、
（ａ）生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別する手順、及び、
（ｂ）前記ＡＲＴに用いることができる精子を選択して卵子を受精させることにより不妊を治療する手順
を含んでいてもよい。

【0243】

前記不妊の治療方法は、
（ａ）患者からの精液試料を提供することにより、生殖補助医療（ＡＲＴ）に用いることができる精子を判別する手順、
（ｂ）前記精液試料中の膜結合性の終末糖化産物受容体（ｍＲＡＧＥ）の定量的なレベルの存在又は不存在を測定して前記患者をｍＲＡＧＥ陰性又はｍＲＡＧＥ陽性と定める手順、及び、
（ｃ）ｍＲＡＧＥ陰性の精子を選択し、該選択した精子を用いて卵子を受精させることにより不妊を治療する手順
を含んでいてもよい。

【0244】

これより、添付の図面及び以下の非限定的な例を参照しながら、本発明の実施形態について説明する。

【図面の簡単な説明】

【0245】

【図1】ヒト精子の細胞膜の先体及び赤道域にＲＡＧＥが見つかったことを示す図。

【図2】膜のＲＡＧＥタンパクの発現と精子細胞の健康状態の分子マーカーを分析するためのフローサイトメトリーのゲート方法を示す図。

【図3】フローサイトメトリーによる精子の分子的な健康状態の分析の検証を示す図。

【図4】フローサイトメトリーと、洗浄済み精子からＰＲ運動精子を分離するための直接スイムアップ標本分析のＣＡＳＡ評価とを示す図。

【図5】糖尿病ではなく、喫煙もせず、肥満でもない男性の母集団からの精子においてＲＡＧＥの発現がガウス分布に従うことを示す図。

【図6a】ＲＡＧＥが、不動精子の母集団と関係のある精子上に安定的に発現されたタンパク質であることを示す図。

【図6b】ＲＡＧＥが、不動精子の母集団と関係のある精子上に安定的に発現されたタンパク質であることを示す図。

【図6c】ＲＡＧＥが、不動精子の母集団と関係のある精子上に安定的に発現されたタンパク質であることを示す図。

【図6d】ＲＡＧＥが、不動精子の母集団と関係のある精子上に安定的に発現されたタンパク質であることを示す図。

【図6e】ＲＡＧＥが、不動精子の母集団と関係のある精子上に安定的に発現されたタンパク質であることを示す図。

【図6f】ＲＡＧＥが、不動精子の母集団と関係のある精子上に安定的に発現されたタンパク質であることを示す図。

【図7a】洗浄及び精製された精子中の精子細胞の健康状態のフローサイトメトリー定量化を示す図。

【図7b】洗浄及び精製された精子中の精子細胞の健康状態のフローサイトメトリー定量化を示す図。

【図8】ヒト精子上のＲＡＧＥの発現が、ミトコンドリア膜電位が低い精子、透過性細胞膜を持つ死滅しつつある及び死滅した精子と関係していることを示す図。

【図8c】ヒト精子上のＲＡＧＥの発現が、ミトコンドリア膜電位が低い精子、透過性細胞膜を持つ死滅しつつある及び死滅した精子と関係していることを示す図。

【図9】ヒト精子におけるＲＡＧＥの発現がＤＮＡ断片化の度合いと関連していることを示す図。

【図10】ヒト精子における精子の健康状態とＲＡＧＥタンパク質の発現の評価を示す図。

【図10c】ヒト精子における精子の健康状態とＲＡＧＥタンパク質の発現の評価を示す図。

【図11】未処理のヒト精子及び処理されたヒト精子におけるＲＡＧＥタンパク質の発現と精子の細胞の健康状態の評価を示す図。

【図11d】未処理のヒト精子及び処理されたヒト精子におけるＲＡＧＥタンパク質の発現と精子の細胞の健康状態の評価を示す図。

【図12】ＤＧＣ法又はスイムアップ法による処理後のＲＡＧＥタンパク質の発現と精子の運動性の相関関係の評価を示す図。

【図12c】ＤＧＣ法又はスイムアップ法による処理後のＲＡＧＥタンパク質の発現と精子の運動性の相関関係の評価を示す図。

【図13】２つの運動性評定法及びそれらの方法と精子の形態との相関関係の評価を示す図。

【図14】ｍＲＡＧＥタンパク質の発現、精子の健康状態、及び精子の形態の評価を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0246】

材料及び方法

【0247】

倫理審査による承認

【0248】

本研究は、メリソン不妊治療クリニック（Merrion Fertility Clinic）にて治療を受けていた複数の匿名の患者からの精液試料を用いて、提供者の許可、並びに、ダブリン大学トリニティ・カレッジの医学部研究倫理委員会及びホレスストリートの国立産科病院倫理委員会から倫理審査による承認を得た上で実施された。本研究はダブリン大学トリニティ・カレッジのトリニティ生体医科学研究所において実施された。

【0249】

調査対象母集団及び参加者

【0250】

２０１７年８月から２０１８年７月までの間にメリソン不妊治療クリニックで治療を受けていた男性らに本研究への参加を呼び掛け、全参加者から書面による同意を得た。治験対象患者基準は、妊性評定を受けていた正常精液の患者から採取した試料とした。除外基準は、１型又は２型糖尿病の参加者、喫煙者、及び／又は、ＢＭＩ＞２９．９の個人から採取した試料とした。

【0251】

試料の採取及び分析

【0252】

２～５日間の性的禁欲後に精液試料を採取した。試料は無菌のプラスチック容器（Starstedt社、75-562-105）に採取し、３７℃で３０分間、液化させた。射精から１時間以内に精液分析を行った。全ての試料を従来の分析にかけ、世界保健機関（ＷＨＯ）の勧告（ＷＨＯ、第５版）に従って、精液体積（ｍｌ）、精子濃度（×１０^６／ｍｌ）、精子の形態及び運動性を求めた。

【0253】

精子の形態の評定

【0254】

精子の形態の評定は単純な正常／異常の分類を用いて行った。厳しいＫｒｕｇｅｒ（Tygerberg）基準に従って染色前のスライド（TestSimplet、Waldeck社）を用いた。簡単に言うと、精液の小滴をカバースリップの中央に添加し、スライドの染色前の領域の上へ慎重に配置し、室温で１５分間培養した。油の小滴をカバースリップの中央に配置し、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ４００顕微鏡に取り付けた１００倍の油浸漬型レンズを用いて形態を評定した。約２００個の精子を評定し、正常（スコア＞４％正常）又は異常（スコア＜４％正常）な形状の割合を求めた。

【0255】

精子の運動性の評定

【0256】

精子の運動性の評定は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｔｈｏｒｎｅ社のソフトウェアとＺｅｉｓｓ社の顕微鏡を用いたＣＡＳＡにより、ＷＨＯと各メーカーの指針に従って行った。簡単に言うと、精液試料をパスツールピペットで再懸濁させ、精子洗浄媒体３に対して１の割合で希釈した。３μｌの希釈精液をＣＡＳＡ顕微鏡のスライドに添加し、予備加熱したステージ（３７℃）上に配置し、画面上でドリフトが見られなくなるまで沈下させた。運動性の評定は、未処理の試料についてはスライド毎に少なくとも１０００個、処理した試料については少なくとも３００個の精子細胞の軌跡を捕らえることにより評価した。細胞の総数（×１０^６／ｍｌ）、不動精子（ＩＭ）、非前進運動精子（ＮＰ）及び前進運動精子（ＰＲ）の割合、並びに精子の平均経路速度（ＶＡＰ）を試料毎に記録した。

【0257】

精子の洗浄

【0258】

１５００×ｇの遠心分離により室温で１分間、精子を０．５ｍｌの精子洗浄媒体（Irvine Scientific社、9983）中に流し込むという操作を２回繰り返すことにより精漿を除去した。最終的な精子ペレットを、その後の実験に先立って０．１ｍｌの精子洗浄媒体に再懸濁させた。この試料を以下では「洗浄済み精子」と呼ぶ。

【0259】

精子の調製

【0260】

密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）又は直接スイムアップにより精液試料を精製した。ＤＧＣにはｐｕｒｅｓｐｅｒｍ ４０／８０ Ｎｉｄａｃｏｎ ＰＳ４０－１００／ＰＳ８０－１００を分離媒体として用いた。１．５ｍｌの４０％下層分離媒体を１５ｍｌのファルコン試験管に添加した後、１．５ｍｌの８０％上層分離媒体を添加した。最低１ｍｌの精液試料を勾配に乗せ、室温で２０分間、４００×ｇで遠心分離した。約２．５ｍｌの上層を無菌のパスツールピペットで静かに除去し、精子ペレットを２ｍｌの精子洗浄媒体で２回洗浄し、室温で５分間、３８０×ｇで遠心分離した。運動性の高い精製された精子を含んでいるこの洗浄済みペレットを０．５ｍｌの精子洗浄媒体中に再懸濁させた。直接スイムアップのために、最低１ｍｌの精漿を２ｍｌの精子洗浄媒体に入れて室温で５分間、３８０×ｇで遠心分離することにより、２回洗浄した。洗浄された精子ペレットを静かに再懸濁させ、１ｍｌの多用途処理培地（Irvine Scientific社、90166）の下で層状にし、３７℃で予備平衡させ、室温で３０分間培養した。運動性の高い精製された精子を含んでいる最上層を約０．８ｍｌ、取り出した。

【0261】

精子細胞の健康状態の定量的な評定

【0262】

ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）、細胞透過性、及び細胞死は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓ（ThermoFisher社）、ＤＡＰＩ（4′,6-diamidino-2-phenylindole; ThermoFisher社）及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＰｅＣｙ７（ThermoFisher社）をそれぞれ用いて測定した。簡単に言うと、精漿から採取した１×１０^６個の精子を０．５ｍｌの精子洗浄媒体に流し込んだ後、１％のＦＢＳを含む０．５ｍｌのＰＢＳに２ステップで流し込んだ。ＭＭＰは、６．２５ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓ（Invitrogen; M7512）と共に３７℃で１５分間培養することにより評価した。細胞透過性は、遮光状態で、１％のＦＢＳを含む０．１ｍｌのＰＢＳ中で３５ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Invitrogen, D1306）と共に３７℃で５分間培養することにより評価した。フローサイトメトリー分析の前に１％のＦＢＳを含む０．５ｍｌのＰＢＳで試料を２回洗浄した。１×１０^６個の精子を０．５ｍｌの１倍のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ結合バッファに流し込んだ後、０．１ｍｌの１倍の結合バッファ中で５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＰＥ－Ｃｙ７（Invitrogen; 8007-72）を使用し、室温で１５分間培養して、アポトーシスとネクローシスを評価した。

【0263】

ＲＡＧＥタンパク質の発現の定量的な評定

【0264】

ＲＡＧＥタンパク質の発現はモノクローナルマウス抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体ＡＦ６４７（Santa Cruz社; 80652）を用いて測定した。簡単に言うと、１％のＦＢＳを含むＰＢＳに１×１０^６個の精子を流し込んだ後、遮光状態で、２μｇ／ｍｌのＲＡＧＥ抗体と共に３７℃で１時間培養した。１％のＦＢＳを含む０．５ｍｌのＰＢＳで試料を２回洗浄した後、フローサイトメトリー分析を行った。

【0265】

ＤＮＡ断片化の定量的な評定

【0266】

ＤＮＡ断片化は、ＡｐｏＢｒｄＵ末端デオキシヌクレオチド転移酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）分析を使用し、メーカーの指針（Invitrogen; A23210）を若干修正したものに従って測定した。簡単に言えば、１％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で洗浄した後、５×１０^６個の洗浄済み精子細胞を４％のＰＦＡで３０分間で固定し、１％のＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。固定された細胞を、氷上で２分間、ＰＢＳ中の０．１ｍｌの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、１％クエン酸ナトリウム中で培養し、キット同梱の洗浄バッファ０．５ｍｌで２回洗浄することにより、透過性にした。固定され、透過性にされた細胞をＴｄＴ ＴＵＮＥＬ反応（ＴｄＴ酵素、ＢｒｄＵ、反応バッファ）と共に３７℃で１時間培養し、０．５ｍｌのすすぎバッファで２回洗浄し、マウス抗ＢｒｄＵ－ＡＦ４８８抗体（Invitrogen）と共に室温で３０分間培養した。１％のＦＢＳを含む０．５ｍｌのＰＢＳで細胞を２回洗浄し、キット同梱のＲＮａｓｅＡバッファ中で１０μｌのＰＩで対比染色した。

【0267】

フローサイトメトリーによる精子細胞の健康状態の分析

【0268】

フローサイトメトリーによるデータ収集のため、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータを用いて、２００事象／秒の流速で試料毎に最低１００００例の単事象を記録した。４５０／５０帯域通過フィルタでＤＡＰＩを、６１０／２０フィルタでＣＭＸ Ｒｏｓを、７８０／６０フィルタでＰＥ－Ｃｙ７、６７０／１４フィルタでＡＦ６４７を、そして５３０／３０フィルタでＡＦ４８８をそれぞれ測定した。ＦＳＣ－ＡとＳＳＣ－Ａを用いて火炎状域において精子をゲートすることで精子以外の破片や細胞を除去した。ＦＳＣ－ＡとＦＳＣ－Ｗのドットプロットを用いてダブレットを省いた。ＦＳＣ－Ａに対して矩形ゲートを用いて各蛍光体を選択してゲートすることで陰性と陽性の母集団を選択した。象限プロットを用いてアポトーシス及びネクローシスの精子細胞を分析した。

【0269】

ＲＡＧＥとミトコンドリア局在の共焦点分析

【0270】

精子上のＲＡＧＥとミトコンドリア局在を顕微鏡で評価するため、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８ Ｇａｔｅｄ ＳＴＥＤ共焦点顕微鏡を用いて各スライドを観察した。ＲＡＧＥ局在の分析のため、１×１０^６個の洗浄済みで未処理のヒト精子細胞を４μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＲＡＧＥ一次抗体（Santa Cruz社; sc-80652）と共に３７℃で１時間培養した後、２μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＡＦ６４７二次抗体（ThermoFisher社; A28181）と共に３７℃で３０分間培養した。ミトコンドリア局在のため、１×１０^６個の（ＤＧＣによる）精製済みヒト精子細胞を０．５μＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓと共に３７℃で１５分間培養した。染色された細胞を０．５ｍｌの４％ＰＦＡ ｐＨ７．２で室温にて２０分間で固定し、７０ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩと共に培養した。染色された精子細胞２０μｌをポリエルリジン製顕微鏡スライド上に添加して３７℃で空気乾燥させた後、封入剤とカバースリップを加えることによりスライドを用意した。

【0271】

統計解析

【0272】

Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェア（GraphPad社）を用いて統計解析を行った。形態とｍＲＡＧＥタンパク質の発現とを対応なしパラメトリックｔ検定で比較した。運動性とｍＲＡＧＥタンパク質の発現とを対応ありパラメトリックｔ検定で比較した。フローサイトメトリーマーカーを対応ありパラメトリックｔ検定で比較した。全てのデータが正規分布しているものと仮定した。各値は±ＳＤで表している。Ｐ値が０．０５未満であれば統計的に有意とみなされる。ＲＡＧＥタンパク質の発現と運動性との相関関係を分析するためにピアソンの相関検定を行った。未処理の試料と処理済み試料の全体にわたってフローサイトメトリーマーカーの発現を比較するため、両側Ｐ値を用いて一元配置分散分析を行った。Ｐ値が０．０５未満であれば統計的に有意とみなされる。

【0273】

実施例１

【0274】

ヒト精子細胞の先体部及び赤道膜域にｍＲＡＧＥが存在

【0275】

ＲＡＧＥは非常に多くの形（膜結合性、可溶性又は分泌性）で存在するが、ヒト精子上での膜結合性ＲＡＧＥ（ｍＲＡＧＥ）の検出が本研究にとって重要であった。

【0276】

図１（ａ）は、フローサイトメトリーによりモノクローナルＲＡＧＥ抗体を用いて分析した、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞とトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｍＲＡＧＥ陽性の蛍光を示す棒グラフである（ｎ＝２ 生物的複製、ＳＤ）。図１（ｂ）は、モノクローナルマウス抗ヒトＲＡＧＥ一次抗体とマウス抗ＨＲＰ二次抗体を用いた、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞とトランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの全タンパク質溶解物、細胞質ゾルのタンパク質溶解物、及び膜タンパク質溶解物におけるＲＡＧＥの発現のウエスタンブロット分析である。図１（ｃ）はヒト精子細胞上での先体部及び赤道域におけるｍＲＡＧＥ局在を示す、グレースケール化された共焦点画像である。

【0277】

要約すると、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞モデルを用いて、多数の抗体をスクリーニングしてフローサイトメトリーでｍＲＡＧＥを検出し（図１（ａ））、ウエスタンブロットでｍＲＡＧＥの検出を示した（図１（ｂ））。マウス抗ヒトｍＲＡＧＥ抗体でも精子細胞頭部の赤道中片部と先体部におけるｍＲＡＧＥを検出できた（図１（ｃ））。

【0278】

実施例２

【0279】

ｍＲＡＧＥタンパク質の発現と精子細胞の健康状態の分子マーカーとを分析するためのフローサイトメトリーのゲート方法、並びにフローサイトメトリーによる精子の分子的な健康状態の分析の検証

【0280】

図２はフローサイトメトリーによりヒト精子試料中のｍＲＡＧＥタンパク質の発現と精子の健康状態とを分析するためのゲート方法のドットプロットを示しており、（i）は精子細胞の母集団の周囲に描かれた多角形ゲート、（ii）はダブレットを省いて単一細胞の周囲に描かれた矩形ゲート、（iii）はｍＲＡＧＥ陽性及び陰性の単一細胞の母集団の周囲にそれぞれ描かれた矩形ゲート、（iv）はＤＡＰＩ陰性、薄暗い（dim）及び明るい（bright）単一細胞の母集団の周囲にそれぞれ描かれた矩形ゲート、（v）はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ陽性（高ＭＭＰ）及び陰性（低ＭＭＰ）の単一細胞の母集団の周囲にそれぞれ描かれた矩形ゲート、（vi）はアポトーシスとネクローシスを分析する象限プロットであって、Ｑ１はＡｎＶ－ＤＡＰＩ＋（ネクローシス）、Ｑ２はＡｎＶ＋ＤＡＰＩ＋（アポトーシス）、Ｑ３はＡｎＶ＋ＤＡＰＩ－（初期アポトーシス）、Ｑ４はＡｎＶ－ＤＡＰＩ－（生体）である。

【0281】

図３はフローサイトメトリーによる精子の分子的な健康状態の分析の検証を示している。図３（ａ）はＤＡＰＩの濃度を増大させながら培養したヒト精子の線グラフである（ｎ＝３）。更なる検討のために選択された最終的な濃度を囲み領域で示している。図３（ｂ）は３５ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩと共に培養された未固定及び固定されたヒト精子中の核染色を示す棒グラフである。図３（ｃ）はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓの濃度を増大させながら培養したヒト精子の線グラフである（ｎ＝３）。更なる検討のために選択された最終的な濃度を囲み領域で示している。図３（ｄ）はミトコンドリアの電子伝達鎖（ＥＴＣ）の阻害剤（ＦＣＣＰ、ロテノン及びマロネート）が存在する又は存在しない場合におけるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸ Ｒｏｓ陽性のヒト精子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。図３（ｅ）はＴＵＮＥＬ分析のためのヒト精子のゲート方法を示す代表的なドットプロット（上図）と、それに対応する、図示したようなＴＵＮＥＬ陰性及び陽性のコントロール反応（下図）に対するフローサイトメトリーのドットプロットである。図３（ｆ）はヒト精子中のＤＮＡ断片化を分析するための、陰性（－ＴｄＴ酵素）及び陽性（＋ＤＮａｓｅＩ）のコントロール反応中のＴＵＮＥＬ陽性精子を示す棒グラフである。

【0282】

実施例３

【0283】

フローサイトメトリーと、洗浄済み精子からＰＲ運動精子を分離するための直接スイムアップ標本分析のＣＡＳＡ評価

【0284】

フローサイトメトリーと、洗浄済み精子からＰＲ運動精子を分離するための直接スイムアップ標本分析のＣＡＳＡ評価。図４（ａ）はｍＲＡＧＥタンパク質の発現、図４（ｂ）はＰＲ運動性、図４（ｃ）は細胞透過性、図４（ｄ）はＭＭＰ、そして図４（ｅ）はアポトーシス、の割合を、洗浄済み精子中と、直接スイムアップ準備中に得られたペレット試料及び上澄み試料中との間で比較したもの（ｎ＝８；％平均±ＳＥＭ）。一元配置分散分析で、****はP < 0.0001、**はP < 0.005、*はP < 0.05である。

【0285】

実施例４

【0286】

糖尿病でなく、喫煙もせず、肥満でもない男性の母集団から採取した精子においてｍＲＡＧＥの発現はガウス分布に従う。

【0287】

図５はフローサイトメトリーにより測定された、ｎ＝６０個の洗浄済み精子試料におけるｍＲＡＧＥの発現の頻度分布のヒストグラムを示している。

【0288】

全体として、ヒト精子上でのｍＲＡＧＥの発現は、糖尿病、喫煙又は肥満といった医学的な又は「自ら招いた」状態がなければ、不妊治療クリニックで治療を受けている患者の母集団において正規分布していることが分かった。

【0289】

実施例５

【0290】

ｍＲＡＧＥは、不動精子の母集団と関係のある精子上に安定的に発現されたタンパク質である。

【0291】

図６ａは経時的に（０～７２ｈ）測定され、ＣＡＳＡとＦＣにより分析された、ＤＧＣ精製済み精子中の不動精子とｍＲＡＧＥの発現の割合を示す線グラフである（ｎ＝６ ％平均±ＳＥＭ）。図６ｂはＤＧＣ精製済み精子中のｍＲＡＧＥの発現を経時的に（０～７２ｈ）示すドットプロットである。図６ｃは洗浄及び精製された精子試料中のＰＲ運動性の割合の比較である（ｎ＝１５；％平均±ＳＥＭ）。一元配置分散分析で、****はP < 0.0001である。図６ｄは洗浄及び精製された精子試料中のｍＲＡＧＥタンパク質の発現の割合の比較である（ｎ＝１５；％平均±ＳＥＭ）。一元配置分散分析で、****はP < 0.0001である。図６ｅは洗浄され、ＤＧＣ及び直接スイムアップ法で精製された精子試料中のｍＲＡＧＥの発現を示すドットプロットである。図６ｆは洗浄済み精子中のＩＭ精子の％合計とｍＲＡＧＥタンパク質の発現の割合との相関関係の評価である（ｎ＝３５）。ピアソンの相関のＲ^２値をグラフ中に示し、９５％信頼区間内のエラーバーを破線で示している。

【0292】

経時的な分析により、ｍＲＡＧＥの発現は時間が経っても大きく変わらない（４．６％±１．３（ＳＤ）から１４．７％±７．３）のに対し、精製した試料中のＩＭ精子の割合は７２時間の間に７．７±１．９％（ＳＤ）から９１．３±５．１％（ＳＤ）に増加することが観察された（図６ａ及び図６ｂ、P < 0.0001）。これは精子上でのｍＲＡＧＥの発現は個人の健康状態に直接関係しており、精液試料の採取の後で変化しないことを示唆するものであろう。特に、ＰＲ精子の割合は、どちらの手法についても、平均で、洗浄済み試料中の２０．５±１０．９％（ＳＤ）から、精製した試料中では６９．１±１１．９％まで増加した（図６ｃ、P < 0.0001）。対照的に、ｍＲＡＧＥ発現精子の割合は、平均で、洗浄済み試料中の２２．１±１０．１％（ＳＤ）から、精製した試料中では５．５±４．８％（ＳＤ）まで減少した（図６ｄ及び図６ｅ、P < 0.0001）。より大きな試料群においては、ｍＲＡＧＥの発現が精子の運動性の低さと関連していることも観察された（図６ｆ）。これは正常な精子と異常な精子を細胞レベルで区別するためにｍＲＡＧＥの発現を利用できる可能性があることを示唆している。このデータは精製された試料中のｍＲＡＧＥの不存在がＰＲ精子及び細胞の健康状態の改善と関連していることを示している。

【0293】

実施例６

【0294】

洗浄及び精製された精子中の精子細胞の健康状態のフローサイトメトリー定量化

【0295】

図７ａは洗浄済み、ＤＧＣ及びスイムアップ標本における細胞透過性、アポトーシス細胞及びＭＭＰの割合の比較を示している（ｎ＝１５；％平均±ＳＥＭ）。一元配置分散分析で、****はP < 0.0001である。図７ｂは、洗浄済み精子中並びにＤＧＣ及びスイムアップ標本中のＤＡＰＩ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＸＲｏｓ及びＡｎｎｅｘｉｎＶの蛍光を示す典型的なドットプロットを示している。

【0296】

フローサイトメトリーによる精子細胞の健康状態の各分子パラメータの同時解析の結果、精製した試料中では洗浄済み試料に比べて精子のミトコンドリア機能、（アポトーシス及びネクローシスによる）細胞死のレベル、及び膜の完全性が大きく改善することが判明した（図７ａ及び図７ｂ、P < 0.0001）。

【0297】

実施例７

【0298】

ヒト精子上のｍＲＡＧＥの発現は、ミトコンドリア膜電位が低い精子、透過性細胞膜を持つ死滅しつつある及び死滅した精子と関係している。

【0299】

図８（ａ）は、洗浄済み精子中のｍＲＡＧＥ陽性及び陰性の各サブグループと、ｍＲＡＧＥ陽性及び陰性の精子の各サブグループにおけるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（ＭＭＰ）、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＤＡＰＩ（アポトーシス又はネクローシス）及びＤＡＰＩ（細胞透過性）の蛍光とを示す典型的なドットプロットである。図８（ｂ）は、ｍＲＡＧＥ陽性及び陰性の各サブグループにおけるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ陽性の精子、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＤＡＰＩ陽性又は陰性の精子、及びＤＡＰＩ陽性の精子の割合の比較を示している（ｎ＝３５；％平均±ＳＥＭ）。対応ありｔ検定で、****はP < 0.0001である。図８ｃは洗浄済み試料における精子の健康状態のマーカーとｍＲＡＧＥタンパク質の発現との相関関係の評価を示している（ｎ＝３５）。ピアソンの相関のＲ^２値をグラフ中に示し、９５％信頼区間内のエラーバーを破線で示している。****はP < 0.0001、**はP < 0.005、*はP < 0.05である。

【0300】

ＤＮＡの完全性、ミトコンドリア機能、及び細胞死のレベルを全て用いて精子の分子的な健康状態を分析した。上のデータをみると、精製した試料中では細胞の健康状態が改善し、ｍＲＡＧＥ発現精子が減少していた。より大きな試料群においては、フローサイトメトリーにより、ｍＲＡＧＥ陰性の母集団に比べてｍＲＡＧＥ陽性の母集団中でミトコンドリア機能の低下（１０倍）、アポトーシス（６倍）とネクローシス（２．５倍）のレベルの上昇、そして膜の完全性の低下（３倍）が見られたことから、精子上のｍＲＡＧＥの発現が不健康な精子と関係していることが観察された（図８及び図８ｃ、P < 0.0001）。このデータは不健康な精子の診断バイオマーカーとしてのｍＲＡＧＥの使用を支持している。

【0301】

要約すると、生成されたデータは、（i）死滅した又は死滅しつつある細胞、（ii）ミトコンドリア膜電位の低い精子細胞、（iii）アポトーシスにより死滅しつつある精子細胞、及び（iv）ネクローシスにより死滅しつつある精子細胞において、ｍＲＡＧＥタンパク質の発現が高くなることを裏付けている。それは、ｍＲＡＧＥ膜受容体が不健康な精子細胞の細胞表面マーカーに役割を果たすことを示唆するものであろう。

【0302】

実施例８

【0303】

ヒト精子におけるｍＲＡＧＥの発現はＤＮＡ断片化の度合いと関連している。

【0304】

図９（ａ）はｍＲＡＧＥ陽性及び陰性の各サブグループにおけるＴＵＮＥＬ陽性の精子の割合の比較を示している（ｎ＝８；％平均±ＳＥＭ）。対応ありｔ検定で、***はP < 0.005である。図９（ｂ）はＴＵＮＥＬ陽性の精子の割合とｍＲＡＧＥ陽性の精子の割合の相関関係の評価を示している（ｎ＝８）。ピアソンの相関のＲ^２値を示しており、９５％信頼区間内のエラーバーを破線で示している。

【0305】

糖尿病でない男性において、ＴＵＮＥＬ分析により解析されたＤＮＡ断片化のレベルはｍＲＡＧＥ陰性の精子中に比べてｍＲＡＧＥ陽性の精子中の方が有意に高い（２．５倍）ことが観察された（図９（ａ）、P < 0.001）。また、データは、精子上のｍＲＡＧＥの発現が精子のＤＮＡ損傷と関連しており（図９（ｂ）、P < 0.05）、ＤＮＡの完全性及び精子細胞の健康状態の間接的なマーカーとして利用できる可能性があることを示している。

【0306】

実施例９

【0307】

ヒト精子における精子の健康状態とｍＲＡＧＥタンパク質の発現の評価

【0308】

未処理の精子におけるｍＲＡＧＥ陽性及びｍＲＡＧＥ陰性の細胞の母集団中の精子細胞の健康状態の評価。マウス抗ヒトｍＲＡＧＥ ＡＦ６４７抗体でｍＲＡＧＥタンパク質の発現を評価した。ＤＡＰＩで細胞透過性を評価した。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭ ＲｏｓでＭＭＰを評価した。ＡｎｎｅｘｉｎＶとＤＡＰＩでアポトーシス／ネクローシスを評価した。ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータを用いてフローサイトメトリーデータを得た。図１０（ａ）はｍＲＡＧＥ陽性及び陰性の精子の母集団を、対応するＤＡＰＩ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ及びＡｎｎｅｘｉ Ｖで染色した精子のサブ母集団と共に示す代表的なドットプロット（ｎ＝１）である。図１０（ｂ）はＲＡＧＥ陽性及び陰性の精子の母集団における細胞透過性（ＤＡＰＩ陽性の細胞）とＭＭＰ（低ＭＭＰの細胞）の評価である（ｎ＝３５；％平均±ＳＥＭ）。対応ありｔ検定で、****はP<0.0001である。図１０ｃはＲＡＧＥ陽性及び陰性の精子の母集団におけるアポトーシス、初期アポトーシス、及びネクローシスの精子細胞の評価である（ｎ＝３５；％平均±ＳＥＭ）。対応ありｔ検定で、****はP<0.0001である。

【0309】

フローサイトメトリーのドットプロットを分析すると、ｍＲＡＧＥ陽性及び陰性の細胞の母集団において細胞透過性、ＭＭＰ並びにアポトーシス及びネクローシスに明らかな違いがあった（図１０（ａ））。統計解析の結果、ｍＲＡＧＥ陰性の細胞の母集団に比べてｍＲＡＧＥ陽性の細胞の母集団では、ＤＡＰＩ染色する、生命力のないことを表す細胞が３倍増加していることが判明した（図１０（ｂ）、P<0.0001）。また、ｍＲＡＧＥ陽性の細胞の母集団に比べてｍＲＡＧＥ陰性の細胞の母集団では高ＭＭＰの細胞に１０倍の増加が見られた（図１０（ｂ）、P<0.0001）。また、ｍＲＡＧＥ陽性の細胞の母集団ではｍＲＡＧＥ陰性の細胞の母集団に比べてアポトーシス及びネクローシスの細胞にそれぞれ６倍及び２．５倍の増加が見られた（図１０ｃ、P<0.0001）。

【0310】

実施例１０

【0311】

未処理及び処理済みのヒト精子におけるｍＲＡＧＥタンパク質の発現並びに精子細胞の健康状態の評価

【0312】

次の実験一式は、運動性の高い精子を未処理の精液試料から分離した後でｍＲＡＧＥタンパク質の発現に違いがあるかを判定するために計画された。前進運動性の高い精子は全精子の母集団からスイムアップ精製法及び／又はＤＧＣ精製により分離できる。

【0313】

図１１（ａ）は未処理（混ぜ物なし）の精子並びにＤＧＣ及びスイムアップにより処理された精子中のｍＲＡＧＥ陽性及び陰性の精子の母集団を示す代表的なドットプロット（ｎ＝１）を示している。図１１（ｂ）は未処理の精子並びにＤＧＣ及びスイムアップによる処理染みの精子においてｍＲＡＧＥを発現した精子細胞（ｍＲＡＧＥ陽性の精子細胞）の評価を示している（ｎ＝１５；％平均±ＳＥＭ）。処理方法毎に、対応する未処理（混ぜ物なし）の画分を含めている。対応あり一元配置分散分析で、****はP<0.0001である。図１１（ｃ）は未処理の精子並びにＤＧＣ及びスイムアップによる処理染みの精子における前進運動性の評価を示している（ｎ＝１５；％平均±ＳＥＭ）。処理方法毎に、対応する未処理（混ぜ物なし）の画分を含めている。対応あり一元配置分散分析で、****はP<0.0001である。図１１ｄは未処理の精子並びにＤＧＣ及びスイムアップによる処理染みの精子における細胞透過性（ＤＡＰＩ陽性の細胞）、高ＭＭＰの細胞及びアポトーシスの精子の評価を示している（ｎ＝１５；％平均±ＳＥＭ）。処理方法毎に、対応する未処理（混ぜ物なし）の画分を含めている。対応あり一元配置分散分析で、****はP<0.0001である。

【0314】

ＤＧＣ及びスイムアップで精製された精子においてはＲＡＧＥタンパク質の発現に５倍及び４倍の減少が見られた（図１１（ｂ）；P<0.0001）。同時に、ＤＧＣ及びスイムアップで精製された精子においては前進運動精子の３．５倍及び３．４倍の増加が見られた（図１１（ｃ）；P<0.0001）。これと共に、ＤＧＣ及びスイムアップで精製された精子においては平均で、細胞透過性障害の２．７５倍の減少、アポトーシスの精子の２．７５倍の減少、そしてＭＭＰの１．５倍の増加が見られた（図１１ｄ；P<0.0001）。

【0315】

要約すると、ここで論じた２つの方法で精製された精子はどちらも、高い前進運動性と活力を持ち、非透過性の細胞膜と高活性のミトコンドリアを有する精子となった。加えて、精製された画分におけるｍＲＡＧＥタンパク質の発現の減少は、ｍＲＡＧＥ発現精子が精製処理の間に除去されることを示唆するものであろう。

【0316】

実施例１１

【0317】

ＤＧＣ又はスイムアップ法による処理後のｍＲＡＧＥタンパク質の発現と精子の運動性の相関関係の評価

【0318】

図１２（ａ）は、ＤＧＣ及びスイムアップ処理法の後に存在するｍＲＡＧＥ発現精子（ｍＲＡＧＥ陽性の細胞）と不動細胞の相関関係の評価を示している（ｎ＝１５；％平均±ＳＥＭ）。図１２（ｂ）は、ＤＧＣ及びスイムアップ処理法の後に存在するｍＲＡＧＥ非発現精子（ｍＲＡＧＥ陰性の細胞）と運動性の細胞の相関関係の評価を示している（ｎ＝１５）。図１２ｃは、ＤＧＣ又はスイムアップ処理法の後に存在するｍＲＡＧＥ非発現精子（ｍＲＡＧＥ陰性の細胞）と前進性の精子の相関関係の評価を示している（ｎ＝１５）。ピアソンの相関のＲ^２値をグラフに示しており、９５％信頼区間内のエラーバーを破線で示している。****はP < 0.0001である。

【0319】

データを更に分析し、処理済み試料のｍＲＡＧＥタンパク質の発現と精子の運動性を分析して相関プロットを生成したところ、ｍＲＡＧＥタンパク質の発現と精子の運動性の間に統計的に有意な相関関係があることが判明した。統計的に有意な相関関係は、ｍＲＡＧＥ陽性の細胞と不動精子との間（図１２（ａ）；Ｒ^２＞0.84）、ｍＲＡＧＥ陰性の細胞と運動精子との間（図１２（ｂ）；Ｒ^２＞0.82）、及びｍＲＡＧＥ陰性の細胞と前進運動精子との間（図１２ｃ；Ｒ^２＞0.39）で観察された。

【0320】

このデータは、スイムアップ及びＤＧＣ精製法の結果、ｍＲＡＧＥ発現精子が極めて少ない、前進性の高い精子の画分が得られることを裏付けている。精製された画分内に残留しているｍＲＡＧＥ発現精子は、処理事象の後に低い割合で残っている動きのない／遅い精子と関係がある可能性がある。

【0321】

要するに、これらの実験の結果は、ｍＲＡＧＥタンパク質の発現は動きのない精子と関連しており、逆に、ｍＲＡＧＥを発現していない精子細胞は運動性が高い健康な精子である、ということを示している。

【0322】

実施例１２

【0323】

２つの運動性評定方法及びそれらと精子の形態との相関関係の評価

【0324】

ＣＡＳＡ及び人力による運動性評定という２つの精子運動性評定方法、並びに未処理の精液試料における正常な形態と異常な形態との相関関係の評価。精子の形態はＴｅｓｔ－Ｓｉｍｐｌｅｔスライドと厳しいＫｒｕｇｅｒ基準を用いて評価した。ＣＡＳＡによる運動性評定はＨａｍｉｌｔｏｎ Ｔｈｏｒｎｅ社のＣＡＳＡソフトウェアを用いて行った。人力による精子の運動性評定と形態評定はメリソン不妊治療クリニックにおいてその定例業務の精液分析手続きの一部として行った。図１３（ａ）は正常な形態及び異常な形態の患者においてＣＡＳＡにより測定した精子の運動性（動きのない精子、運動精子、前進性の精子）である（ｎ＝３５；平均 ＳＥＭ）。対応なしｔ検定で、***はP<0.0005、**はP<0.005である。図１３（ｂ）は正常な形態及び異常な形態の患者において人力による運動性評定により測定した精子の運動性（動きのない精子、運動精子、前進性の精子）である（ｎ＝３５；平均 ＳＥＭ）。対応なしｔ検定で、***はP<0.0005である。

【0325】

異常な形態の精子試料において、ＣＡＳＡ（図１３（ａ））及び人力（図１３（ｂ））の方法により測定された動きのない精子について統計的に有意な増加が観察された（それぞれP = 0.0048及びP = 0.0007）。相応する結果が全運動性及び前進運動性を精子の形態と比較したときに観察された（図１３（ａ）と（ｂ）；Ｐ値は０．００３０～０．００７の範囲）。２つの運動性評定方法の間には統計的な有意性に違いがあるものの、２つのグループ間の傾向は似ている。このデータは、運動性と形態は互いに関連しており、精子の健康状態を示すものである、という既に知られている現象を証明している。

【0326】

実施例１３

【0327】

ＲＡＧＥタンパク質の発現、精子の健康状態、及び精子の形態の評価

【0328】

図１４（ａ）は正常な形態及び異常な形態の患者におけるＲＡＧＥタンパク質の発現、細胞透過性（ＤＡＰＩ陽性の細胞）、及びＭＭＰ（低ＭＭＰの細胞）の評価を示している（ｎ＝３５；％平均±ＳＥＭ）。対応なしｔ検定で、***はP<0.0005、*はP<0.005である。図１４（ｂ）は正常な形態及び異常な形態の患者におけるアポトーシスの細胞、初期アポトーシスの細胞、及びネクローシスの細胞の評価を示している（ｎ＝３５；％平均±ＳＥＭ）。

【0329】

続いてフローサイトメトリーのデータと形態のデータを対応ありｔ検定で分析したところ、正常な形態と異常な形態の患者においてＲＡＧＥタンパク質の発現とＭＭＰの間に統計的に有意な差があることが判明した（図１４（ａ）；それぞれP=0.0002及びP=0.0236）。このデータは先に測定されたデータを補完するとともに、ｍＲＡＧＥタンパク質の発現が不健康で動きのない精子と関係しているという我々の仮説を更に裏付けており、今度は新たに形態的に異常な精子との関係を明らかにしている。

【0330】

実施例１４

【0331】

ｍＲＡＧＥ陽性及びｍＲＡＧＥ陰性の精子細胞の定量化とミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）

【0332】

表１は処理済みと未処理の実験からの混ぜ物なしの試料の比較を示している（Ｎ＝１５）。ｍＲＡＧＥ陽性とｍＲＡＧＥ陰性の精子細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ、幾何平均）を比較分析し、高ＭＭＰと低ＭＭＰの精子細胞におけるＭＦＩを比較分析した。

【0333】

表１はｍＲＡＧＥ及びｍＲＡＧＥである精子細胞の割合を示している。また、ｍＲＡＧＥ陽性とｍＲＡＧＥ陰性の精子細胞のＭＦＩ（幾何平均）も示している。また、ｍＲＡＧＥ陽性とｍＲＡＧＥ陰性の精子細胞のＭＦＩ間の倍数差も示している。ｍＲＡＧＥ陽性とｍＲＡＧＥ陰性の精子細胞間のＭＦＩの平均倍数差は２１．１％±１３．８％である。

【0334】

表１は高ＭＭＰと低ＭＭＰの精子細胞の割合を示している。また、高ＭＭＰと低ＭＭＰの精子細胞のＭＦＩ（幾何平均）も示している。また、高ＭＭＰと低ＭＭＰの精子細胞のＭＦＩ間の倍数差も示している。高ＭＭＰと低ＭＭＰの細胞間のＭＦＩの平均倍数差は２５．３％±１０．１％である。

【0335】

【表1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図6e】

【図6f】

【図7a】

【図7b】

【図8】

【図8c】

【図9】

【図10】

【図10c】

【図11】

【図11d】

【図12】

【図12c】

【図13】

【図14】

【国際調査報告】