▶ アール．ジー．シー．シー． ホールディングス アーゲーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-24
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/215 20060101AFI20231017BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20231017BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231017BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231017BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231017BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20231017BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20231017BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20231017BHJP
【ＦＩ】
A61K39/215
A61K39/00 G ZNA
A61P31/14
A61P37/04
A61P43/00 121
A61K35/15
C12N5/0784
C12N15/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521821
(86)(22)【出願日】2021-10-12
(85)【翻訳文提出日】2023-06-06
(86)【国際出願番号】 EP2021078178
(87)【国際公開番号】W WO2022079029
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】20201323.1
(32)【優先日】2020-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21159603.6
(32)【優先日】2021-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521209236
【氏名又は名称】アール．ジー．シー．シー． ホールディングス アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】110002354
【氏名又は名称】弁理士法人平和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パパソティリウ，イオアンニス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AC12
4B065AC14
4B065AC15
4B065AC20
4B065BB19
4B065CA44
4C085AA03
4C085BA71
4C085CC08
4C085CC21
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG04
4C087AA01
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4C087BB44
4C087BB63
4C087MA02
4C087MA66
4C087NA05
4C087ZB09
4C087ZB33
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、ヒト又は動物被験体に３つの別個の用量で順次投与されるべき、３つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドを負荷した活性化自己樹状細胞を含む３つの組成物を含む、ヒト又は動物被験体におけるウイルス性疾患に対するワクチンとして使用される医薬製品に関する。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の組成物、第２の組成物及び第３の組成物を含む医薬製品であって、前記第１、第２及び第３の組成物の各々が、単一のヒト又は動物被験体からの活性化自己樹状細胞の３つの異なる集団のうちの１つを含む、前記医薬製品において、前記３つの集団の各々の前記活性化自己樹状細胞が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はエンベロープタンパク質の異なるペプチドを提示することを特徴とする、医薬製品。
【請求項2】
－ 前記第１の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第１のペプチドで活性化された活性化自己樹状細胞の第１の集団を含み、－ 前記第２の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の第２のペプチドで活性化された活性化自己樹状細胞の第２の集団を含み、前記第２のペプチドは、前記第１のペプチドとは異なり、
－ 前記第３の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第３のペプチドで活性化された活性化自己樹状細胞の第３の集団を含み、前記第３のペプチドは、前記第１のペプチド及び前記第２のペプチドとは異なる、
請求項１記載の医薬製品。
【請求項3】
ワクチンとして使用され、好ましくはヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患に対するワクチンとして使用される、請求項１又は２記載の医薬製品。
【請求項4】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患の治療に使用され、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９の治療に使用され、前記３つの組成物は、前記ヒト又は動物被験体に互いに別々に、３つの異なる時点で順次投与され、前記第１の組成物は、前記ヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの１週目、好ましくは１日目に、好ましくは注射によって投与され、前記第２の組成物は、前記ヒト又は動物被験体に前記ワクチン接種スケジュールの２週目、好ましくは８日目に、好ましくは注射によって投与され、前記第３の組成物は、前記ヒト又は動物被験体に前記ワクチン接種スケジュールの３週目、好ましくは１５日目に、好ましくは注射によって投与され、好ましくは各組成物は、前記ヒト又は動物被験体に部分的に静脈注射によって、及び部分的に皮下注射によって投与される、請求項１又は２記載の医薬製品。
【請求項5】
請求項１又は２記載の医薬製品を含む、ヒト又は動物被験体におけるワクチンとして使用されるパーツキット。
【請求項6】
ヒト又は動物被験体におけるワクチンとして使用され、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患に対するワクチンとして使用され、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンとして使用されるパーツキットであって、前記パーツキットが、第１の組成物、第２の組成物及び第３の組成物を含み、前記第１、第２及び第３の組成物の各々が、単一のヒト又は動物被験体からの活性化自己樹状細胞の３つの異なる集団のうちの１つを含み、前記３つの集団の各々の前記活性化自己樹状細胞が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の異なるペプチドを提示する、パーツキット。
【請求項7】
前記パーツキットが、第１の組成物、第２の組成物及び第３の組成物を含み、－ 前記第１の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第１のペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第１の集団を含み、
－ 前記第２の組成物が、前記第１のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の第２のペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第２の集団を含み、
－ 前記第３の組成物が、前記第１のペプチド及び前記第２のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第３のペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第３の集団を含む、
請求項６記載のパーツキット。
【請求項8】
－ 前記第１の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）を細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第１の集団を含み、－ 前記第２の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）からなる群から選択される１つのペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第２の集団を含み、
－ 前記第３の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）を細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第３の集団を含む、
請求項７記載のパーツキット。
【請求項9】
前記３つの組成物は、前記ヒト又は動物被験体に互いに別々に、３つの異なる時点で順次、好ましくは注射によって、より好ましくは静脈注射と皮下注射との組合せによって投与され、好ましくは各組成物の５０～９０％が静脈注射され、それぞれの組成物の残りの１０～５０％が皮下注射され、より好ましくは約４～５．４ｍｌの各組成物が静脈注射され、さらに０．６～２ｍｌが皮下注射され、最も好ましくは約５ｍｌの各組成物が静脈注射され、約１ｍｌの各組成物が皮下注射される、請求項６～８のいずれか１項記載のパーツキット。
【請求項10】
前記第１の組成物は、前記ヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの１週目、好ましくは１日目に投与され、前記第２の組成物は、前記ヒト又は動物被験体に前記ワクチン接種スケジュールの２週目、好ましくは８日目に投与され、前記第３の組成物は、前記ヒト又は動物被験体に前記ワクチン接種スケジュールの３週目、好ましくは１５日目に投与される、請求項６～９のいずれか１項記載のパーツキット。
【請求項11】
ヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患を治療又は予防する方法であって、以下の工程：－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の第１のペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第１の集団を含む第１の組成物を投与する工程、
－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の第２のペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第２の集団を含む第２の組成物を投与する工程、
－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の第３のペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第３の集団を含む第３の組成物を投与する工程
を含み、
－ 前記第１、第２及び第３の組成物の各々が、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の３つの異なる集団のうちの１つを含み、活性化自己樹状細胞の前記３つの集団の各々において、前記活性化自己樹状細胞が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はエンベロープタンパク質の異なるペプチドを細胞表面に提示する、
ヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患を治療又は予防する方法。
【請求項12】
－ 前記第１の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第１のペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第１の集団を含み、好ましくは前記第１の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）を細胞表面に提示する活性化自己樹状細胞の第１の集団を含み、－ 前記第２の組成物が、前記第１のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の第２のペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第２の集団を含み、好ましくは前記第２の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）からなる群から選択される１つのペプチドを細胞表面に提示する活性化自己樹状細胞の第２の集団を含み、
－ 前記第３の組成物が、前記第１のペプチド及び前記第２のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第３のペプチドを細胞表面に提示する、前記ヒト又は動物被験体の活性化自己樹状細胞の第３の集団を含み、好ましくは前記第３の組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）を細胞表面に提示する活性化自己樹状細胞の第３の集団を含む、
請求項１１記載の、ヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患を治療する方法。
【請求項13】
前記第１、第２及び第３の組成物を前記ヒト又は動物被験体に互いに別々に、３つの異なる時点で順次投与し、好ましくは前記第１の組成物を前記ヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの１週目、好ましくは１日目に投与し、前記第２の組成物を前記ヒト又は動物被験体に前記ワクチン接種スケジュールの２週目、好ましくは８日目に投与し、前記第３の組成物を前記ヒト又は動物被験体に前記ワクチン接種スケジュールの３週目、好ましくは１５日目に投与する、請求項１１又は１２記載の、ヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患を治療する方法。
【請求項14】
請求項１～４のいずれか１項記載の医薬製品の調製又は請求項５～１０のいずれか１項記載のパーツキットの調製のためのウイルス抗原ペプチド、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド、より好ましくは以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）からなる群から選択されるペプチドを提示するヒト又は動物の自己樹状細胞の集団を得る方法であって、以下の工程：ａ．） 前記ヒト又は動物被験体のＰＢＭＣから単離された単球を培養する工程であって、前記単球を、好ましくは密度勾配遠心分離、又はＮＨ４Ｃｌによる赤血球溶解及び磁気ビーズ単離によって単離する、培養する工程と、
ｂ．） 工程ａ．）の付着単球をＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４とともに、好ましくは１０％熱不活性化ＦＢＳ及び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で、好ましくは６日間培養して、未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、
ｃ．） 工程ｂ．）の前記未成熟樹状細胞を、好ましくは培養６日目に抗原ペプチドにより、好ましくは１０μｇ／ｍｌの最終濃度でパルスするとともに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）の場合、好ましくは４～２４時間、好ましくはβ２ミクログロブリンの存在下にて、好ましくは３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの最終濃度でインキュベートして、前記ウイルス抗原ペプチドを提示する負荷樹状細胞の集団を得る工程と、好ましくは、
ｄ．） 前記負荷樹状細胞をさらに使用するまで凍結保存する工程と、任意に工程ｄ．）の前に、
ｅ．） 前記ウイルス抗原ペプチドを提示する工程ｃ．）の前記負荷樹状細胞をインキュベーション、好ましくは３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間のインキュベーションによってサイトカインカクテルによって成熟させる工程と
を含む、方法。
【請求項15】
薬剤を製造する方法であって、以下の工程：ａ．） ヒト又は動物被験体のＰＢＭＣから単離された単球を培養する工程であって、前記単球を、好ましくは密度勾配遠心分離、又はＮＨ４Ｃｌによる赤血球溶解及び磁気ビーズ単離によって単離する、培養する工程と、
ｂ．） 工程ａ．）の付着単球をＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４とともに、好ましくは１０％熱不活性化ＦＢＳ及び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で、好ましくは６日間培養して、未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、
ｃ．） 工程ｂ．）の前記未成熟樹状細胞を、好ましくは培養６日目に、以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）からなる群から選択される第１の抗原ペプチドにより、好ましくは１０μｇ／ｍｌの最終濃度でパルスするとともに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）の場合、好ましくは４～２４時間、好ましくはβ２ミクログロブリンの存在下にて、好ましくは３～１０μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの最終濃度でインキュベートして、前記ウイルス抗原ペプチドを提示する負荷樹状細胞の集団を得る工程と、
工程ａ．）～ｃ．）を２回繰り返す工程であって、工程ｂ．）により、未成熟樹状細胞の第１、第２及び第３の集団をそれぞれ獲得し、工程ｃ．）において、未成熟樹状細胞の前記第１、第２及び第３の集団をそれぞれ、第１の抗原ペプチドと、それぞれ前記第１の抗原ペプチドとは異なり、それぞれ以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）からなる群から選択される第２及び第３の抗原ペプチドとにより、好ましくは１０μｇ／ｍｌの最終濃度でそれぞれパルスするとともに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）の場合、好ましくは４～２４時間インキュベートし、前記第３の抗原ペプチドは、前記第２の抗原ペプチドとは異なる、繰り返す工程と、
好ましくは、
ｄ．） 工程ｃ．）で得られた前記負荷樹状細胞をさらに使用するまで凍結保存する工程と、任意に工程ｃ．）の後、好ましくは工程ｄ．）の前に、
ｅ．） 前記第１、第２又は第３のウイルス抗原ペプチドを提示する工程ｃ．）の前記負荷樹状細胞をインキュベーション、好ましくは３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間のインキュベーションによってサイトカインカクテルで成熟させる工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞免疫学及び免疫療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒト又は動物被験体において免疫応答を誘導する方法、並びに免疫応答を誘導するための医薬組成物及びかかる組成物を含むパーツキットに関する。さらに、本発明は、医薬組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏで製造する方法、及び医薬組成物又は免疫応答を誘導する方法におけるプライム樹状細胞の使用に関する。本発明は、より具体的には、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対するワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
ウイルス、細菌、真菌及び寄生生物等の病原体は、疾患を引き起こす恐れがある生物であり、一部の病原体は、罹患した宿主における深刻な影響及び犠牲の原因となることが見出されている。
【0003】
ワクチン接種又は抗生物質の投与は、病原体に起因する疾患の予防又は対処に有用であり得る。人体の免疫系は、幾つかの一般的な病原体に対する防御を提供する。病原体は、宿主の免疫系によって認識され得るタンパク質、いわゆる抗原を含む。抗原は、多くの異なる化学的分類に属することがあり、ウイルス又は細菌のタンパク質、脂質、炭水化物又はこれらの組合せ、例えばリポタンパク質又は糖タンパク質に由来し得る。
【0004】
適応免疫系は、２つの主要な免疫機構を含む：第一に、免疫系が感染細胞の外側の自由に循環する病原性抗原に対処する液性免疫では、Ｂ細胞は、ヘルパーＴ細胞及び抗原提示細胞によって、特定の抗原に対する抗体産生形質Ｂ細胞へと分化する。次いで、これらの抗体が病原性抗原に結合して中和するか、又は溶解若しくは食作用を引き起こす。第二に、感染細胞内で起こる細胞性免疫では、病原性抗原が感染細胞の表面又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現する。ヘルパーＴ細胞は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞が感染細胞のＭＨＣ抗原複合体に結合するのを助けるサイトカインを放出し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、身体の他の細胞を高度に特異的に死滅させる能力を有する白血球である細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）へと分化させる。ＣＴＬは、病的細胞上の主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）が提示するペプチドによって刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。ＣＴＬは、刺激後に身体の組織を移行し、特定の抗原を有する標的細胞を見つけて死滅させる。抗原特異的ＣＴＬは増殖し、親細胞と同じ抗原特異性を有する娘細胞を生じる。活性化ＣＴＬの細胞分裂により、体内のこれらの抗原特異的ＣＴＬの総数が増加する。より重要なことには、液性免疫（形質細胞）及び細胞性免疫（ＣＴＬ）の両方からの細胞の一部が、続いてメモリー形質細胞又はメモリーＴ細胞へと分化する。これらは長命の細胞であり、体内を巡回し、その後の同じ病原体による侵入に警戒する。メモリー細胞は、防御免疫又はワクチン接種の基礎となる。
【0005】
樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞の活性化に必要とされるシグナルを出し、免疫系における強力なＡＰＣである。ＡＰＣ上に存在するＭＨＣ Ｉ又はＩＩタンパク質又はペプチドが提示する抗原とＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体との間の相互作用が、免疫応答の特異性に関与する。この相互作用は、Ｔ細胞活性化に必要とされるが、十分ではない。ＡＰＣ及びＴ細胞の受容体－リガンド対の間の相互作用は、エフェクターＴ細胞機能の誘導及びＴ細胞の完全増殖をもたらし得る共刺激シグナルを生成する。
【0006】
Ｔ細胞は、宿主ＭＨＣタンパク質とタンパク質抗原に由来する小ペプチドフラグメントとの間の物理的複合体を認識する抗原特異的受容体であるＴＣＲを有する。ペプチドとＭＨＣ分子との間の相互作用は、高度に特異的である。ＭＨＣ Ｉ分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞にペプチド抗原を提示し、ＭＨＣ ＩＩ分子は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞にペプチドを提示する。結合し得るこれらのペプチドの大きさは、８～１０アミノ酸である。
【0007】
病原体関連抗原の免疫認識は、ＭＨＣ Ｉ分子に結合しているペプチドと相互作用する特定のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球によって行われる。その相互作用のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激は、ＡＰＣ、特にＤＣによるこれらの分子の提示によって行うことができる。「プライミング」又は「パルシング」は、樹状細胞が初めに抗原と接触し、次いでそれぞれの抗原で「プライム」又は「負荷」され、すなわち、そのＭＨＣ Ｉ分子上に抗原ペプチドを提示するｉｎ ｖｉｔｒｏ工程である。これは、その後のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原提示、すなわちＴ細胞活性化に不可欠な工程である。ＡＰＣによって活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞（本願の範囲では、上記活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＴＬと称する）は、標的細胞、すなわち病原体感染細胞上の同じＭＨＣ／ペプチド複合体を認識し、それらを死滅させるように誘発され得る。
【0008】
したがって、免疫療法は、抗原を提示する細胞を認識し、死滅させるように被験体自身の免疫系を活性化する。ヒト疾患の治療のための成功戦略の開発には、病原性状態の制御に関与する免疫細胞の応答の理解が必要とされる。免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージ等の非特異的エフェクター細胞、γδＴ細胞のような抗原認識の多様性が限られたエフェクター細胞、並びに抗体産生Ｂ細胞及びαβＴ細胞等の抗原認識に膨大な多様性を有する高度に特異的なエフェクター細胞であり得る。
【0009】
エピトープの同定は多くの場合、既知のタンパク質データベースに基づき、病原体タンパク質から重複ペプチドライブラリーを導出し、試験することを含む。病原体関連エピトープを予測するアルゴリズムの開発及び改良、並びに自己免疫疾患又は感染症に対する感受性と関連するＭＨＣタンパク質の好ましいペプチド結合特性の定義は、免疫原性の高いエピトープの選択にとって重要なツールであった。
【0010】
免疫応答を誘導し、それを長期間維持するための抗原の投与が課題であった。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、例えば特許文献１に開示されているように、例えばＭＨＣ Ｉ分子に合成ペプチドを外部から（ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで）負荷して、ＣＴＬ応答を誘発することができる。同様に、ＭＨＣ ＩＩ分子に合成ペプチドを外部から負荷して、形質細胞へのＢ細胞の分化及び抗体生成を誘発することもできる。
【0011】
現在のＣｏｖｉｄ－１９パンデミックのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するワクチンを見出すことが急務となっている。本発明は、樹状細胞上に提示されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のそれぞれ１つのペプチドを３つの用量にて３つの異なる時点で順次投与することを含むワクチンを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【特許文献1】欧州特許出願公開第１４４８２２９号明細書
【発明の概要】
【0013】
本発明は、最終的にメモリー細胞の形成、すなわちメモリー形質細胞及びセントラル／エフェクターメモリーＴ細胞の両方の形成をもたらす、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特定のペプチドを認識するように免疫細胞を刺激することによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンに関する。ワクチンは、単核細胞から生成された活性化自己樹状細胞（ＤＣ）の３つの集団を含有する。活性化のために、ＤＣの各集団を異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドによってｉｎ ｖｉｔｒｏで「パルス」する。このため、このＤＣベースのワクチンは、３つの用量で投与され、用量１は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドで活性化された活性化自己ＤＣを含み、１週目に投与される。用量２は、４つの異なるペプチドの群から選択された第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドで活性化された活性化自己ＤＣを含み、２週目に投与される。用量３は、第３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドで活性化された活性化自己ＤＣを含み、３週目に投与される。
【0014】
本発明は、第１の組成物、第２の組成物及び第３の組成物を含む医薬製品であって、第１、第２及び第３の組成物の各々が、単一のヒト又は動物被験体からの活性化自己ＤＣの３つの異なる集団のうちの１つを含む、医薬製品に関する。３つの集団の各々の活性化自己ＤＣは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はエンベロープタンパク質の異なるペプチドを提示する。
【0015】
第１の好ましい実施形態によると、第１の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第１のペプチドで活性化された活性化自己ＤＣの第１の集団を含む。それぞれの医薬製品の第２の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の第２のペプチドで活性化された活性化自己ＤＣの第２の集団を含み、第２のペプチドは、第１のペプチドとは異なる。それぞれの医薬製品の第３の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第３のペプチドで活性化された活性化自己ＤＣの第３の集団を含み、第３のペプチドは、第１のペプチド及び第２のペプチドとは異なる。
【0016】
本発明は、さらに、ワクチンとして使用され、好ましくはヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患に対するワクチンとして使用される、上述の医薬製品に関する。
【0017】
本発明は、さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患の治療に使用され、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９の治療に使用され、上記の３つの組成物が、ヒト又は動物被験体に互いに別々に、３つの異なる時点で順次投与される、医薬製品に関する。好ましくは、第１の組成物は、ヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの１週目、好ましくは１日目に、好ましくは注射によって投与され、第２の組成物は、ヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの２週目、好ましくは８日目に、好ましくは注射によって投与され、第３の組成物は、ヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの３週目、好ましくは１５日目に、好ましくは注射によって投与される。有利には、各組成物は、ヒト又は動物被験体に部分的に静脈注射によって、及び部分的に皮下注射によって投与される。これは、注射すべきそれぞれの組成物を含む、投与すべきそれぞれの用量の一部が最初に静脈注射され、それぞれの組成物を含むそれぞれの用量の残りが皮下注射されると解釈すべきである。
【0018】
本発明は、上記の医薬製品を含む、ヒト又は動物被験体におけるワクチンとして使用されるパーツキットにさらに関する。
【0019】
上記パーツキットは、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患に対するワクチンとして使用され、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンとして使用されることが意図される。上記パーツキットは、第１の組成物、第２の組成物及び第３の組成物を含み、第１、第２及び第３の組成物の各々が、単一のヒト又は動物被験体からの活性化自己ＤＣの３つの異なる集団のうちの１つを含み、３つの集団の各々の活性化自己ＤＣが、好ましくは１つ以上の細胞表面分子、好ましくはＭＨＣ複合体上に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の異なるペプチドを提示する。
【0020】
本発明のさらに好ましい実施形態によるパーツキットは、第１の組成物、第２の組成物及び第３の組成物を含み、
－ 第１の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第１のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第１の集団を含み、
－ 第２の組成物は、第１のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の第２のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第２の集団を含み、
－ 第３の組成物は、第１のペプチド及び第２のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第３のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第３の集団を含む。
－ 第１の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第１のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第１の集団を含み、
－ 第２の組成物は、第１のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の第２のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第２の集団を含み、
－ 第３の組成物は、第１のペプチド及び第２のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第３のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第３の集団を含む。
【0021】
好ましくは、第１の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）を細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第１の集団を含む。
【0022】
第２の組成物は、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）からなる群から選択される１つのペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第２の集団を含む。
【0023】
第３の組成物は、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）を細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第３の集団を含む。
【0024】
用量／組成物の投与順序を変更することもできる。
【0025】
本発明のさらに好ましい実施形態によるパーツキットの３つの組成物は、ヒト又は動物被験体に互いに別々に、３つの異なる時点で順次投与される。好ましくは、３つの組成物は、ヒト又は動物被験体に注射によって、より好ましくは静脈注射と皮下注射との組合せによって投与される。好ましくは、各用量／組成物の５０～９０％が静脈注射され、それぞれの用量／組成物の残りの１０～５０％が皮下注射される。
【0026】
好ましくは、第１の組成物は、ヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの１週目、好ましくは１日目に投与され、第２の組成物は、同じヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの２週目、好ましくは８日目に投与され、第３の組成物は、同じヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの３週目、好ましくは１５日目に投与される。
【0027】
本発明は、さらに、ヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患を治療又は予防する方法であって、以下の工程：
－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の第１のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第１の集団を含む第１の組成物を投与する工程、
－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の第２のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第２の集団を含む第２の組成物を投与する工程、
－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の第３のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第３の集団を含む第３の組成物を投与する工程
を含み、
－ 第１、第２及び第３の組成物の各々が、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの３つの異なる集団のうちの１つを含み、活性化自己ＤＣの３つの集団の各々において、活性化自己ＤＣが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はエンベロープタンパク質の異なるペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患を治療又は予防する方法に関する。
－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の第１のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第１の集団を含む第１の組成物を投与する工程、
－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の第２のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第２の集団を含む第２の組成物を投与する工程、
－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の第３のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第３の集団を含む第３の組成物を投与する工程
を含み、
－ 第１、第２及び第３の組成物の各々が、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの３つの異なる集団のうちの１つを含み、活性化自己ＤＣの３つの集団の各々において、活性化自己ＤＣが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はエンベロープタンパク質の異なるペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患を治療又は予防する方法に関する。
【0028】
ヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患を治療する好ましい方法では、
－ 第１の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第１のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第１の集団を含み、好ましくは、第１の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）を細胞表面に提示する活性化自己ＤＣの第１の集団を含み、
－ 第２の組成物は、第１のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の第２のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第２の集団を含み、好ましくは第２の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）からなる群から選択される１つのペプチドを細胞表面に提示する活性化自己ＤＣの第２の集団を含み、
－ 第３の組成物は、第１のペプチド及び第２のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第３のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第３の集団を含み、好ましくは第３の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）を細胞表面に提示する活性化自己ＤＣの第３の集団を含む。
－ 第１の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第１のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第１の集団を含み、好ましくは、第１の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）を細胞表面に提示する活性化自己ＤＣの第１の集団を含み、
－ 第２の組成物は、第１のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質の第２のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第２の集団を含み、好ましくは第２の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）からなる群から選択される１つのペプチドを細胞表面に提示する活性化自己ＤＣの第２の集団を含み、
－ 第３の組成物は、第１のペプチド及び第２のペプチドとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の第３のペプチドを細胞表面に提示する、ヒト又は動物被験体の活性化自己ＤＣの第３の集団を含み、好ましくは第３の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）を細胞表面に提示する活性化自己ＤＣの第３の集団を含む。
【0029】
ヒト又は動物被験体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患を治療するさらに好ましい方法によると、第１、第２及び第３の組成物が、ヒト又は動物被験体、すなわち同じヒト又は動物被験体に互いに別々に、３つの異なる時点で順次投与される。好ましくは、第１の組成物は、ヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの１週目、好ましくは１日目に投与され、第２の組成物は、同じヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの２週目、好ましくは８日目に投与され、第３の組成物は、同じヒト又は動物被験体にワクチン接種スケジュールの３週目、好ましくは１５日目に投与される。
【0030】
本発明は、さらに、ウイルス抗原ペプチド、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドを提示するヒト又は動物の自己樹状細胞（ＤＣ）の集団を得る方法に関する。好ましくは、それぞれのペプチドは、上記の医薬製品の調製又は上記のパーツキットの調製のために、以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）からなる群から選択され、以下の工程：
ａ．） ヒト又は動物被験体のＰＢＭＣから単離された単球を培養する工程であって、前記単球を、好ましくは密度勾配遠心分離、例えばＢｉｏｃｏｌｌ／Ｆｉｃｏｌｌ分離、又はＮＨ４Ｃｌによる赤血球溶解及び磁気ビーズ単離（単球濃縮キット）によって単離する、培養する工程と、
ｂ．） 工程ａ．）の付着単球をＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４とともに、好ましくは１０％熱不活性化ＦＢＳ及び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で、好ましくは６日間培養して、未成熟ＤＣの集団を得る工程と、
ｃ．） 工程ｂ．）の未成熟ＤＣを、好ましくは培養６日目に抗原ペプチドにより、好ましくは１０μｇ／ｍｌの最終濃度でパルスするとともに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）の場合、好ましくは４～２４時間、好ましくはβ２ミクログロブリンの存在下にて、好ましくは３～１０μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの最終濃度でインキュベートして、ウイルス抗原ペプチドを提示する負荷樹状細胞の集団を得る工程と、好ましくは、
ｄ．） 負荷ＤＣをさらに使用するまで凍結保存する工程と、任意に工程ｃ．）の後、好ましくは工程ｄ．）の前に、
ｅ．） ウイルス抗原ペプチドを提示する工程ｃ．）の負荷ＤＣをサイトカインカクテルとのインキュベーション、好ましくは３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間のインキュベーションによってＭＨＣ Ｉまで成熟させる工程と
を含む、方法にさらに関する。
ａ．） ヒト又は動物被験体のＰＢＭＣから単離された単球を培養する工程であって、前記単球を、好ましくは密度勾配遠心分離、例えばＢｉｏｃｏｌｌ／Ｆｉｃｏｌｌ分離、又はＮＨ４Ｃｌによる赤血球溶解及び磁気ビーズ単離（単球濃縮キット）によって単離する、培養する工程と、
ｂ．） 工程ａ．）の付着単球をＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４とともに、好ましくは１０％熱不活性化ＦＢＳ及び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で、好ましくは６日間培養して、未成熟ＤＣの集団を得る工程と、
ｃ．） 工程ｂ．）の未成熟ＤＣを、好ましくは培養６日目に抗原ペプチドにより、好ましくは１０μｇ／ｍｌの最終濃度でパルスするとともに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）の場合、好ましくは４～２４時間、好ましくはβ２ミクログロブリンの存在下にて、好ましくは３～１０μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの最終濃度でインキュベートして、ウイルス抗原ペプチドを提示する負荷樹状細胞の集団を得る工程と、好ましくは、
ｄ．） 負荷ＤＣをさらに使用するまで凍結保存する工程と、任意に工程ｃ．）の後、好ましくは工程ｄ．）の前に、
ｅ．） ウイルス抗原ペプチドを提示する工程ｃ．）の負荷ＤＣをサイトカインカクテルとのインキュベーション、好ましくは３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間のインキュベーションによってＭＨＣ Ｉまで成熟させる工程と
を含む、方法にさらに関する。
【0031】
工程ｃ．）で得られた負荷ＤＣがＭＨＣ Ｉ上にウイルス抗原ペプチドを提示する場合、任意の工程ｅ．）において、成熟させる工程を、好ましくはＩＬ－６、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－６、ＩＬ－１β、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦ－α、及びＰＧＥ２、好ましくは１０－６Ｍの濃度のＰＧＥ２を含むサイトカインカクテルによって行う。この場合、負荷ＤＣが被験体の体内のＴ細胞を活性化して、ＣＴＬへと変化させ、これが感染細胞を死滅させる。
【0032】
工程ｃ．）で得られた負荷ＤＣがＭＨＣ ＩＩ上にウイルス抗原ペプチドを提示する場合、任意の工程ｅ．）において、成熟させる工程を、好ましくはＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－α、ｓＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－６、ＩＬ－２１、ＩＬ－１０及び抗ヒトＩｇＭを含むサイトカインカクテルによって行う。この場合、好ましくは以下の濃度範囲：１～２００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ、１～２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４、１～２００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－α、１～１００μｇ／ｍｌのｓＣＤ４０Ｌ、１～２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、１～２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１、１～２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１０、１～１００μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＭが用いられる。この場合、負荷ＤＣがＴヘルパー細胞を活性化し、これがＢ細胞を活性化して、抗体分泌形質細胞へと変化させる。
【0033】
好ましくは、負荷ＤＣが本発明による医薬製品に含まれ、未成熟形態で、すなわち工程ｃ．）の後、又は凍結保存が所望若しくは必要とされる場合には工程ｄ．）の後に注射される。この場合、負荷ＤＣの成熟は、ワクチン接種されたヒト又は動物被験体の体内で行われる。代替的には、負荷ＤＣが本発明による医薬製品に含まれ、上記の工程ｅ．）で説明される成熟プロセスを経た後に成熟形態で注射される。
【0034】
負荷樹状細胞を含む３つの組成物を含むワクチン又はパーツキットの製造において、ウイルス抗原ペプチドを提示するヒト又は動物の自己樹状細胞の集団を得る上記の方法、すなわち、負荷樹状細胞の集団を得る方法は、工程ｂ．）において選択された個々のペプチドを用いて別個に行われ、これにより自己負荷樹状細胞の３つの別個の組成物が得られ、３つの組成物のそれぞれにおいて、負荷ＤＣが異なるペプチドを提示する。
【0035】
したがって、本発明は、さらに、薬剤を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．） ヒト又は動物被験体のＰＢＭＣから単離された単球を培養する工程であって、前記単球を、好ましくは密度勾配遠心分離（例えばＢｉｏｃｏｌｌ／Ｆｉｃｏｌｌ分離）、又はＮＨ４Ｃｌによる赤血球溶解及び磁気ビーズ単離（単球濃縮キット）によって単離する、培養する工程と、
ｂ．） 工程ａ．）の付着単球をＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４とともに、好ましくは１０％熱不活性化ＦＢＳ及び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で、好ましくは６日間培養して、未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、
ｃ．） 工程ｂ．）の未成熟樹状細胞を、好ましくは培養６日目に、以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）からなる群から選択される第１の抗原ペプチドにより、好ましくは１０μｇ／ｍｌの最終濃度でパルスするとともに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）の場合、好ましくは４～２４時間、好ましくはβ２ミクログロブリンの存在下にて、好ましくは３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの最終濃度でインキュベートして、ウイルス抗原ペプチドを提示する負荷樹状細胞の集団を得る工程と、
負荷樹状細胞の第２及び第３の集団を生成するために、工程ａ．）～ｃ．）をいずれの場合にも異なるペプチドで２回繰り返す工程であって、工程ｂ．）により、未成熟樹状細胞の第１、第２及び第３の集団をそれぞれ獲得し、工程ｃ．）において、未成熟樹状細胞の第１、第２及び第３の集団をそれぞれ、第１の抗原ペプチドと、第２及び第３の抗原ペプチドであって、それぞれ第１の抗原ペプチドとは異なるとともに互いに異なり、第１、第２及び第３の抗原ペプチドはそれぞれ、以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）からなる群から選択される、第２及び第３の抗原ペプチドとにより、好ましくは１０μｇ／ｍｌの最終濃度でそれぞれパルスする、繰り返す工程と
を含む、方法に関する。
ａ．） ヒト又は動物被験体のＰＢＭＣから単離された単球を培養する工程であって、前記単球を、好ましくは密度勾配遠心分離（例えばＢｉｏｃｏｌｌ／Ｆｉｃｏｌｌ分離）、又はＮＨ４Ｃｌによる赤血球溶解及び磁気ビーズ単離（単球濃縮キット）によって単離する、培養する工程と、
ｂ．） 工程ａ．）の付着単球をＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４とともに、好ましくは１０％熱不活性化ＦＢＳ及び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で、好ましくは６日間培養して、未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、
ｃ．） 工程ｂ．）の未成熟樹状細胞を、好ましくは培養６日目に、以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）からなる群から選択される第１の抗原ペプチドにより、好ましくは１０μｇ／ｍｌの最終濃度でパルスするとともに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）の場合、好ましくは４～２４時間、好ましくはβ２ミクログロブリンの存在下にて、好ましくは３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの最終濃度でインキュベートして、ウイルス抗原ペプチドを提示する負荷樹状細胞の集団を得る工程と、
負荷樹状細胞の第２及び第３の集団を生成するために、工程ａ．）～ｃ．）をいずれの場合にも異なるペプチドで２回繰り返す工程であって、工程ｂ．）により、未成熟樹状細胞の第１、第２及び第３の集団をそれぞれ獲得し、工程ｃ．）において、未成熟樹状細胞の第１、第２及び第３の集団をそれぞれ、第１の抗原ペプチドと、第２及び第３の抗原ペプチドであって、それぞれ第１の抗原ペプチドとは異なるとともに互いに異なり、第１、第２及び第３の抗原ペプチドはそれぞれ、以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）からなる群から選択される、第２及び第３の抗原ペプチドとにより、好ましくは１０μｇ／ｍｌの最終濃度でそれぞれパルスする、繰り返す工程と
を含む、方法に関する。
【0036】
工程ｃ．）に続いて、いずれの場合にも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）の場合、好ましくは４～２４時間のインキュベーションを行う。
【0037】
好ましくは、工程ｃ．）及び必要に応じてその後のインキュベーションに続いて、
ｄ．）工程ｃ．）で得られた負荷樹状細胞をさらに使用するまで凍結保存する工程と、任意に工程ｄ．）の前に、
ｅ．）第１、第２又は第３のウイルス抗原ペプチドをそれぞれ提示する工程ｃ．）の負荷樹状細胞をインキュベーション、好ましくは３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間のインキュベーションによって、好ましくはＩＬ－６、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－６、ＩＬ－１β、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦ－α、及びＰＧＥ２、好ましくは１０－６Ｍの濃度のＰＧＥ２を含むサイトカインカクテルで成熟させる工程と
を行う。
ｄ．）工程ｃ．）で得られた負荷樹状細胞をさらに使用するまで凍結保存する工程と、任意に工程ｄ．）の前に、
ｅ．）第１、第２又は第３のウイルス抗原ペプチドをそれぞれ提示する工程ｃ．）の負荷樹状細胞をインキュベーション、好ましくは３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間のインキュベーションによって、好ましくはＩＬ－６、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－６、ＩＬ－１β、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦ－α、及びＰＧＥ２、好ましくは１０－６Ｍの濃度のＰＧＥ２を含むサイトカインカクテルで成熟させる工程と
を行う。
【0038】
本願の文脈における「ワクチン」又は「ワクチン治療」という用語は、特定のワクチン接種スケジュールに従った後に免疫応答、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性疾患に対する免疫応答がヒト又は動物被験体の体内で活性化される予防的治療と解釈すべきである。本発明による医薬製品を含む本発明のワクチンによって、免疫応答の発生が誘発される。被験体が既に免疫応答を生じているが、ウイルスの排除には不十分な応答である場合、この応答を本発明のワクチンによって増大させることができる。
【0039】
「１／２／３週目」という用語は、それぞれ、好ましくは第１のペプチド（配列番号１）を負荷したＤＣを含むワクチンの用量１をワクチン接種スケジュールの１日目に投与することと解釈すべきである。用量１の約１週間後、好ましくはワクチン接種スケジュールの８日目に、４つのペプチド（配列番号２～５）の群から選択される第２のペプチドを負荷したＤＣを含む用量２を同じ被験体に投与し、用量２の約１週間後、好ましくはワクチン接種スケジュールの１５日目に、第３のペプチド（配列番号６）を負荷したＤＣを含む用量３を投与する。しかしながら、投与日の間の時間は、個々の被験体の免疫系の状態に応じて変化させることができる。用量１～３の投与の順序も、例えば用量１－２－３、１－３－２、２－１－３、２－３－１、３－１－２又は３－２－１のように変更することができる。
【0040】
「プライム／パルス／負荷／活性化された樹状細胞」という用語は、細胞表面分子、すなわちＭＨＣ Ｉ／ＩＩ上にそれぞれのペプチドを提示する樹状細胞と解釈すべきである。
【0041】
本発明の更なる実施形態は、従属請求項に記載される。
【0042】
以下、図面を参照して本発明の好ましい実施形態を説明するが、図面は本発明の現在の好ましい実施形態を説明するためのものであり、これを限定するためのものではない。図面において、
図１～図１１は、組成物１、すなわち用量１の投与後３８日目（Ｄ３８）、７６日目（Ｄ７６）、１２０日目（Ｄ１２０）、１８０日目（Ｄ１８０）、２６０日目（Ｄ２６０）及び３６５日目（Ｄ３６５）の多数のワクチン接種者の分析の結果を示す。ノンパラメトリック検定には、対数値を用いた。図１～図２及び図３～図４は、それぞれ形質細胞及びメモリー形質細胞（非特異的液性免疫）の分析に関する。図５は、血清ＩｇＧによって測定されるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ペプチド特異的液性免疫に関する。図６～図１１は、それぞれ分泌されたＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦ－αによって測定されるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ペプチド特異的細胞性免疫に関する。
図１～図１１は、組成物１、すなわち用量１の投与後３８日目（Ｄ３８）、７６日目（Ｄ７６）、１２０日目（Ｄ１２０）、１８０日目（Ｄ１８０）、２６０日目（Ｄ２６０）及び３６５日目（Ｄ３６５）の多数のワクチン接種者の分析の結果を示す。ノンパラメトリック検定には、対数値を用いた。図１～図２及び図３～図４は、それぞれ形質細胞及びメモリー形質細胞（非特異的液性免疫）の分析に関する。図５は、血清ＩｇＧによって測定されるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ペプチド特異的液性免疫に関する。図６～図１１は、それぞれ分泌されたＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦ－αによって測定されるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ペプチド特異的細胞性免疫に関する。
【0043】
図１２は、非感染／ワクチン非接種者において分泌されたＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦ－αによって測定されるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ペプチド特異的細胞性免疫に関する。
【0044】
図１３は、ワクチン接種者及びワクチン非接種者におけるＣＤ４及びＣＤ８細胞の細胞内ＩＦＮ－γによって測定されるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ペプチド特異的細胞性及び液性免疫に関する。
【0045】
図１４は、１人の感染者、本発明に従ってワクチン接種を受けた、それぞれ３８日目及び１８０日目に決定した２人の個体、及び２人の非感染者に使用した３つのペプチドに特異的なＣＤ８陽性細胞、３つのペプチドに特異的なメモリー形質細胞及び３つのペプチドに特異的なメモリーＴ細胞によって測定されるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ペプチド特異的細胞性及び液性免疫に関する。
【0046】
図１５は、ワクチン接種者及びワクチン非接種者の唾液中の３つのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ペプチドに対するＩｇＡレベルに関する。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】Ｄ０と比較した、用量１の投与後のＤ３８，Ｄ７６，Ｄ１２０，Ｄ１８０，Ｄ２６０及びＤ３６５での形質細胞の差の中央値の統計的有意性を示す図である。比較はペアワイズ（ウィルコクソンの符号付きノンパラメトリック検定、ｐ＜０．０５）とした。
【図2】Ｄ０と比較した、用量１の投与後のＤ３８及びＤ７６での形質細胞の平均差の統計的有意性を示す図である。比較は多重（フリードマンのノンパラメトリック検定ｐ＝０．０００８９、テューキー－クレーマー基準、Ｄ３８ ｐ＝０．００８６；Ｄ７６ ｐ＝０．００１５）とした。
【図3】０日目と比較した、用量１の投与後のそれぞれＤ３８，Ｄ７６，Ｄ１２０，Ｄ１８０，Ｄ２６０及びＤ３６５でのメモリー形質細胞の差の中央値の統計的有意性を示す図である。比較はペアワイズ（ウィルコクソンの符号付きノンパラメトリック検定、ｐ＜０．０５）とした。
【図4】Ｄ０と比較した、用量１の投与後のＤ３８及びＤ７６でのメモリー形質細胞の平均差の統計的有意性を示す図である。比較は多重（フリードマンのノンパラメトリック検定ｐ＝０．００４５、テューキー－クレーマー基準、Ｄ３８ ｐ＝０．０４９５；Ｄ７６ ｐ＝０．００４４）とした。
【図5】用量１の投与後のＤ３８，Ｄ７６，Ｄ１２０，Ｄ１８０，Ｄ２６０及びＤ３６５でのＤＣのパルシングに使用した３つのペプチドに対する血清ＩｇＧレベルの増加の統計的有意性を示す表である（対応のあるｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【図6】少なくとも１つのペプチド、同時に全てのペプチド、ペプチド１、ペプチド２及びペプチド６のそれぞれについての各時点でのＩＦＮ－γ分泌の増加を示す図である。
【図7a】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＦＮ－γ分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図7b】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＦＮ－γ分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図7c】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＦＮ－γ分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図7d】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＦＮ－γ分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図7e】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＦＮ－γ分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図7f】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＦＮ－γ分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図8】少なくとも１つのペプチド、同時に全てのペプチド、ペプチド１、ペプチド２及びペプチド６のそれぞれについての各時点でのＩＬ－２分泌の増加を示す図である。
【図9a】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＬ－２分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図9b】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＬ－２分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図9c】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＬ－２分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図9d】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＬ－２分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図9e】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＬ－２分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図9f】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＩＬ－２分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図10】少なくとも１つのペプチド、同時に全てのペプチド、ペプチド１、ペプチド２及びペプチド６のそれぞれについての各時点でのＴＮＦ－α分泌の増加を示す図である。
【図11a】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＴＮＦ－α分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図11b】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＴＮＦ－α分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図11c】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＴＮＦ－α分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図11d】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＴＮＦ－α分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図11e】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＴＮＦ－α分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図11f】フリードマンのノンパラメトリック検定（多重比較、テューキー－クレーマー基準、ｐ＜０．０５）に基づく、非処理の細胞と各ペプチドで処理した細胞との間の同じ個体に由来する細胞のＴＮＦ－α分泌の統計的平均差のｐ値を示す図である。
【図12a】ＩＬ－２分泌に関してＤＣのパルシングに使用した３つのペプチドに対する細胞媒介性免疫が統計的に増加した非感染／ワクチン非接種者の割合を示す表である。
【図12b】ＩＦＮ－γ分泌に関してＤＣのパルシングに使用した３つのペプチドに対する細胞媒介性免疫が統計的に増加した非感染／ワクチン非接種者のパーセンテージを示す表である。
【図12c】ＴＮＦ－α分泌に関してＤＣのパルシングに使用した３つのペプチドに対する細胞媒介性免疫が統計的に増加した非感染／ワクチン非接種者のパーセンテージを示す表である。
【図13】ワクチン接種者とワクチン非接種者との間のＣＤ４陽性細胞の細胞内ＩＦＮ－γ及びＣＤ８陽性細胞の細胞内ＩＦＮ－γの差を示す図である。
【図14】パルシングに使用したＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ペプチドに対する免疫の特異性を示す表である。使用した３つのペプチドに特異的なＣＤ８陽性細胞、使用した３つのペプチドに特異的なメモリー形質細胞及び使用した３つのペプチドに特異的なメモリーＴ細胞を１人の感染者、本発明に従ってワクチン接種を受けた、それぞれ３８日目及び１８０日目に決定した２人の個体、及び２人の非感染者において決定した。
【図15a】ワクチン接種者及びワクチン非接種者の唾液において決定されたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的ＩｇＡの差を示す図である。
【図15b】ワクチン接種者及びワクチン非接種者の唾液において決定されたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的ＩｇＡの差を示す図である。
【図15c】ワクチン接種者及びワクチン非接種者の唾液において決定されたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的ＩｇＡの差を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0048】
ペプチドは、免疫系を活性化する能力に応じて選択した。ペプチドの配列設計のために、多数の一般公開されているＴ細胞エピトープ予測ツールを使用した。これらのツールは、Sanchez-Trincado et al, 2017 (J.L. Sanchez-Trincado, M. Gomez-Perosanz, P. A. Reche, “Fundamentals and Methods for T- and B-Cell Epitope Prediction”, Journal of Immunology Research, vol. 2017, Article ID 2680160)に従って選択した。
【0049】
１週目に投与すべきＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）を含む第１の組成物を含むワクチンの用量１、及び３週目に投与すべきＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）を含む第３の組成物を含むワクチンの用量３は、細胞性、すなわちＣＴＬ媒介性免疫を活性化するように設計した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）からなる群から選択される１つのペプチドを含む第２の組成物を含むワクチンの用量２は、液性、すなわち抗体媒介性免疫を活性化するように設計した。用量２の４つのペプチドは全て、免疫原性決定に用いられるアルゴリズムによってＭＨＣ ＩＩを介した免疫の活性化に免疫原性であることが見出された。
【0050】
樹状細胞の生成
実施例１：
初期サンプルは、ヒト被験体の５０ｍｌの末梢血からなるものであった。４０ｍｌの全血をＮＨ４Ｃｌで溶解した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄した。上清を捨て、細胞ペレットを、単球の選択に特異的な抗体とコンジュゲートした磁気ビーズを含む、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｅｔ（５５８４５４、BD）の１００μｌのＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌに再懸濁した。細胞を１５分間インキュベートした。インキュベーション期間後に細胞ペレットを５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、５分間、２００×ｇの遠心分離によって洗浄した。なお、「×ｇ」は重力の倍数（相対遠心力（ＲＣＦ）の単位）を表す。上清を捨て、細胞ペレットを同じＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｅｔの１００μｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｌｕｓとともにインキュベートした。次いで、細胞ペレットを３０分間インキュベートした。インキュベーション期間後に１ｍｌのＰＢＳを添加し、チューブをエッペンドルフチューブ用の磁気分離ラックに１０分間置いた。インキュベーション後に上清、すなわち単核細胞を含有する陰性画分を回収し、１０ｍｌのＰＢＳに添加し、２００×ｇで５分間の遠心分離によって洗浄した。上清を捨て、１０％ＦＢＳ、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４、好ましくは１～２００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び１～２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を添加した１５ｍｌのＲＰＭＩに細胞ペレットを再懸濁した。細胞を含有する１５ｍｌの培地を３つのＴ－２５培養フラスコ（別個のペプチドのうちの１つを用いた各用量の生成／活性化につき１つ）に３７℃、５％ＣＯ２で６日間分けておいた。培養期間の途中で培地を補充した。
実施例１：
初期サンプルは、ヒト被験体の５０ｍｌの末梢血からなるものであった。４０ｍｌの全血をＮＨ４Ｃｌで溶解した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄した。上清を捨て、細胞ペレットを、単球の選択に特異的な抗体とコンジュゲートした磁気ビーズを含む、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｅｔ（５５８４５４、BD）の１００μｌのＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌに再懸濁した。細胞を１５分間インキュベートした。インキュベーション期間後に細胞ペレットを５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、５分間、２００×ｇの遠心分離によって洗浄した。なお、「×ｇ」は重力の倍数（相対遠心力（ＲＣＦ）の単位）を表す。上清を捨て、細胞ペレットを同じＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｅｔの１００μｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｌｕｓとともにインキュベートした。次いで、細胞ペレットを３０分間インキュベートした。インキュベーション期間後に１ｍｌのＰＢＳを添加し、チューブをエッペンドルフチューブ用の磁気分離ラックに１０分間置いた。インキュベーション後に上清、すなわち単核細胞を含有する陰性画分を回収し、１０ｍｌのＰＢＳに添加し、２００×ｇで５分間の遠心分離によって洗浄した。上清を捨て、１０％ＦＢＳ、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４、好ましくは１～２００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び１～２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を添加した１５ｍｌのＲＰＭＩに細胞ペレットを再懸濁した。細胞を含有する１５ｍｌの培地を３つのＴ－２５培養フラスコ（別個のペプチドのうちの１つを用いた各用量の生成／活性化につき１つ）に３７℃、５％ＣＯ２で６日間分けておいた。培養期間の途中で培地を補充した。
【0051】
実施例２：
実施例１の樹状細胞の生成の代わりに、採取したばかりの血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＥＤＴＡの入ったバキュテナーに単離した。密度勾配遠心分離（例えばＢｉｏｃｏｌｌ又はＦｉｃｏｌｌ分離）を用いてＰＢＭＣを単離した。１０％ＦＢＳ及び２００ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＲＰＭＩに細胞ペレットを再懸濁し、単球が付着するまで２時間放置した。残りの細胞を捨て、付着した細胞を１０％ＦＢＳ、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４、好ましくは１～２００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び好ましくは１～２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を添加した１０ｍｌの新鮮ＲＰＭＩ（例えばＲＰＭＩ １６４０）の存在下で培養した。
実施例１の樹状細胞の生成の代わりに、採取したばかりの血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＥＤＴＡの入ったバキュテナーに単離した。密度勾配遠心分離（例えばＢｉｏｃｏｌｌ又はＦｉｃｏｌｌ分離）を用いてＰＢＭＣを単離した。１０％ＦＢＳ及び２００ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＲＰＭＩに細胞ペレットを再懸濁し、単球が付着するまで２時間放置した。残りの細胞を捨て、付着した細胞を１０％ＦＢＳ、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４、好ましくは１～２００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び好ましくは１～２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を添加した１０ｍｌの新鮮ＲＰＭＩ（例えばＲＰＭＩ １６４０）の存在下で培養した。
【0052】
実施例１と同様に、細胞を含有する１５ｍｌの培地を３つのＴ－２５培養フラスコ（別個のペプチドのうちの１つを用いた各用量の生成／活性化につき１つ）に３７℃、５％ＣＯ２で６日間分けておいた。培養期間の途中で培地を補充した。
【0053】
ＤＣのパルシング
６日後に、上記実施例１又は実施例２に記載の方法の１つに従ってＤＣを単離し、培養した後、以下のペプチドのうちの１つを１０μｇ／ｍｌ添加して４～２４時間パルスした。
６日後に、上記実施例１又は実施例２に記載の方法の１つに従ってＤＣを単離し、培養した後、以下のペプチドのうちの１つを１０μｇ／ｍｌ添加して４～２４時間パルスした。
【0054】
ペプチド１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（８４～９２）ＬＰＦＮＤＧＶＹＦペプチド（配列番号１）
ペプチド２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）
ペプチド３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）
ペプチド４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）
ペプチド５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）
ペプチド６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）
ペプチド２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（３２６～３４０）ＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥペプチド（配列番号２）
ペプチド３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（７１８～７２６）ＦＴＩＳＶＴＴＥＩペプチド（配列番号３）
ペプチド４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（４４９～４６３）ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号４）
ペプチド５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（２～１０）ＹＳＦＶＳＥＥＴＧペプチド（配列番号５）
ペプチド６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１１８５～１２００）ＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬペプチド（配列番号６）
【0055】
ペプチド１は、ワクチンの用量１の調製におけるＤＣのパルシングに使用されことになっている。ペプチド２は、ワクチンの用量２の調製におけるＤＣのパルシングに選択し、ペプチド６は、ワクチンの用量３の調製におけるＤＣのパルシングに使用した。
【0056】
ペプチド１及び６の場合、いずれの場合も１～１０μｇ／ｍｌのｂ２ミクログロブリンをパルシング工程のためにＤＣに添加した。これは、ペプチド１及び６が、それぞれＤＣの細胞表面上のＭＨＣ Ｉ複合体によって提示され、Ｔ細胞の活性化（細胞性免疫）をもたらすという事実のためである。ペプチド２，３，４及び５は、ＤＣのＭＨＣ ＩＩ複合体によって提示され、Ｂ細胞の活性化（液性免疫）をもたらす。ミクログロブリンは、ＭＨＣ Ｉ複合体によって提示されるペプチドにのみ添加した。
【0057】
パルスされたＤＣは未成熟のままであり、すなわち、成熟は注射後にｉｎ ｖｉｖｏで起こる。
【0058】
パルシング後に、各フラスコからＤＣを回収し、さらに使用するまで凍結保存した。
【0059】
ワクチンの用量１／２／３の注射
使用、すなわち注射のために、選択された第１、第２又は第３の用量のＤＣを融解し、ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを注射前に６ｍｌの０．４５％ＮａＣｌに再懸濁した。このため、各用量は６ｍｌの容量を有していた。この容量のうち、いずれの場合も、各用量につき１ｍｌのそれぞれの組成物をヒト被験体（個体１～１０）に皮下注射し、組成物の注射容量の残りの５ｍｌを続いて同じそれぞれの被験体に静脈注射した。
使用、すなわち注射のために、選択された第１、第２又は第３の用量のＤＣを融解し、ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを注射前に６ｍｌの０．４５％ＮａＣｌに再懸濁した。このため、各用量は６ｍｌの容量を有していた。この容量のうち、いずれの場合も、各用量につき１ｍｌのそれぞれの組成物をヒト被験体（個体１～１０）に皮下注射し、組成物の注射容量の残りの５ｍｌを続いて同じそれぞれの被験体に静脈注射した。
【0060】
活性化自己ＤＣの集団を含む１つの組成物をそれぞれ含むワクチンの３つ全ての用量を、いずれの場合も投与用量の間に約１週間空けて同じヒト被験体に注射した。
【0061】
フォローアップ
初回注射の３８日目、７６日目、１８０日目、２６０日目及び３６４日目（約１ヶ月後、２～３ヶ月後、６ヶ月後、８．５ヶ月後及び１２ヶ月後）にフォローアップ血液サンプルを採取し、免疫を評価した。指定の時点で採取した血液サンプルの分析により、ワクチン接種後の免疫状態に関する情報が得られる。実施した試験は以下を含む。
初回注射の３８日目、７６日目、１８０日目、２６０日目及び３６４日目（約１ヶ月後、２～３ヶ月後、６ヶ月後、８．５ヶ月後及び１２ヶ月後）にフォローアップ血液サンプルを採取し、免疫を評価した。指定の時点で採取した血液サンプルの分析により、ワクチン接種後の免疫状態に関する情報が得られる。実施した試験は以下を含む。
【0062】
１．） ５ｍｌの全血をＲＢＣ溶解のためにＮＨ４Ｃｌで処理した。細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳで５分間、２００×ｇで洗浄した。細胞ペレットを１．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、１００μｌの懸濁液を１１本のフローサイトメトリーチューブのそれぞれに添加した。細胞を以下の抗体：ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１９７、ＣＤ４５ＲＯで染色した。上記のチューブの分析から未成熟Ｂ細胞、形質細胞、メモリー形質細胞、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、ＩｇＧ陽性細胞及びＩｇＭ陽性細胞のパーセンテージを決定することができる。
【0063】
２．） ５ｍｌの全血をＲＢＣ溶解のためにＮＨ４Ｃｌで処理した。細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳで５分間、２００×ｇで洗浄した。１０％ＦＢＳを添加した８ｍｌのＲＰＭＩに細胞ペレットを再懸濁した。細胞含有培地を、それぞれ２ｍｌの細胞懸濁液が入った４つのウェルに添加した。ウェル１には何も添加しなかった。ウェル２には１０μｇ／ｍｌのペプチド用量１を添加した。ウェル３には１０μｇ／ｍｌのペプチド用量２を添加した。ウェル４には１０μｇ／ｍｌのペプチド用量３を添加した。細胞をインキュベーター内で一晩放置した。翌日、上清を回収し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを決定した。簡潔に述べると、９６ウェルプレートを一次抗体（ＩＬ－２ eBioscienceの１４－７０２９－８１、ＴＮＦ－ａ Invitrogenの１４－７３４８－８５、ＩＦＮ－ｇ InvitrogenのＢＭＳ１０１８）で被覆し、一晩放置して付着させた。翌日、非特異的結合部位をブロッキング液でブロックした後、４つのウェルの上清を添加し、一晩放置した。翌日、ウェルを洗浄し、二次ビオチン化抗体を添加した（ＩＬ－２ eBioscienceの１３－７０２８－８５、ＴＮＦ－ａ eBioscienceの１３－７３４９－８５、ＩＦＮ－ｇ Mabtechの３４２０－６－２５０）。１時間のインキュベーション後にウェルをＰＢＳで５回洗浄し、１００μｌのＴＭＢを１０分間又は発色するまで添加した。１００μｌの停止バッファーの添加によって反応を停止させた。吸光度は、ｕＱｕａｎｔマイクロプレート分光光度計を用いて４５０ｎｍで決定した。
【0064】
３．） ５ｍｌの全血を血清分離のために遠心分離した。血清を回収し、－２０℃で保管した。さらに、単離した血清から、ＤＣのパルシングに使用したペプチドに特異的なＩｇＧ及びＩｇＭの存在を決定した。これは、２μｇ／ｍｌのペプチドを１００μｌ／ウェル用いるペプチドベースＥＬＩＳＡを用いて達成した。２４時間のインキュベーション後にウェルをＰＢＳで５回洗浄し、比較のために、それぞれの現在のフォローアップ及び以前の日付のフォローアップからの１００μｌの血清とともにインキュベートした（例えばＤ０対Ｄ３８、Ｄ３８対Ｄ７６、Ｄ７６対Ｄ１８０、Ｄ１８０対Ｄ２６０、Ｄ２６０対Ｄ３６５）。データを統計的結果のために正規化した。２４時間後にウェルをＰＢＳで５回洗浄し、ＨＲＰ又は抗ヒトＩｇＭ抗体とコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。１時間のインキュベーション後にウェルをＰＢＳで５回洗浄し、１００μｌのＴＭＢを１０分間又は発色するまで添加した。１００μｌの停止バッファーの添加によって反応を停止させた。吸光度は、ｕＱｕａｎｔマイクロプレート分光光度計を用いて４５０ｎｍで決定した。
【0065】
４．） １３人のワクチン接種者及び１１人のワクチン非接種者（対照）からの５ｍｌの全血をＲＢＣ溶解のためにＮＨ４Ｃｌで処理した。細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳで５分間、２００×ｇで洗浄した。細胞ペレットを３本のチューブに分けた。チューブ１は、ペプチドを添加せずにインキュベートし、チューブ２及び３は、１０μｇ／ｍｌの３つのペプチド１、２及び６の全ての混合物とともにインキュベートした。２時間のインキュベーション後にチューブをＰＢＳで洗浄し、細胞外抗体を添加した。より具体的には、チューブ１には抗体を添加しなかった。チューブ２にはＣＤ３／ＣＤ４抗体（Beckman CoulterのＡ０７７３３）を添加した。チューブ３にはＣＤ３／ＣＤ８抗体（Beckman CoulterのＡ０７７３４）を添加した。細胞を抗体とともに３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を固定し、透過処理した。ＩＦＮ－γ－ビオチン抗体（Mabtechの３４２０－６－２５０）を添加した。３０分後に細胞をＰＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン－ＰＥ／Ｃｙ５（Biolegend、４０５２０５）を３０分間添加した。次いで、細胞を再び洗浄し、細胞内ＩＦＮ－γ決定を含むＣＤ４及びＣＤ８細胞のフローサイトメトリー分析のためにＰＢＳに再懸濁した。
【0066】
５．） ３人のワクチン接種者及び３人のワクチン非接種者から唾液を採取し、３つのペプチドに対するＩｇＡの存在について試験した。これは、２μｇ／ｍｌのペプチドを１００μｌ／ウェル用いるペプチドベースＥＬＩＳＡを用いて達成した。２４時間のインキュベーション後にウェルをＰＢＳで５回洗浄し、１００μｌの唾液とともにインキュベートした。２４時間後にウェルをＰＢＳで５回洗浄し、抗ヒトＩｇＡ－ＨＲＰとともにインキュベートした。１時間のインキュベーション後にウェルをＰＢＳで５回洗浄し、１００μｌのＴＭＢを１０分間又は発色するまで添加した。１００μｌの停止バッファーの添加によって反応を停止させた。吸光度は、ｕＱｕａｎｔマイクロプレート分光光度計を用いて４５０ｎｍで決定した。
【0067】
６．） １人のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染者、２人のワクチン接種者（それぞれ第１の用量の投与後、１人は３８日目に決定され、もう１人は１８０日目に決定された）、及び２人のワクチン非接種の非感染「健常」ボランティアからの全血を、テキサスレッド蛍光色素とコンジュゲートした３ペプチドミックスとともに２時間インキュベートした。次いで、コンジュゲートしたペプチドを特異的に認識するＣＴＬ、形質メモリー及びメモリーＴ細胞をフローサイトメトリーによって決定した。より具体的には、細胞をペプチド陽性ＣＴＬの検出についてはＣＤ３／ＣＤ８（Beckman CoulterのＡ０７７３４）、又はペプチド陽性メモリー形質細胞についてはＣＤ１９（eBioscienceの１１－０１９９－４２）及びＣＤ２７（Biolegendの３０２８３８）、ペプチド陽性メモリーＴ細胞についてはＣＤ４５ＲＯ（Biolegendの３０４２０）とともにインキュベートした。
【0068】
フォローアップの分析：
図１に上記の試験１．）の結果を示し、形質細胞はＤ０と比較して全ての時点で有意に増加している。より具体的には、Ｄ３８では、６１／８３人で形質細胞が増加していた（７３．４９％の増加）。Ｄ７６では、３９／５８人で形質細胞が増加していた（６７．２４％の増加）。Ｄ１２０では、２８／４０人で形質細胞が増加していた（７０．００％の増加）。Ｄ１８０では、１８／２６人で形質細胞が増加していた（６９．００％の増加）。Ｄ２６０では、８／８人で形質細胞が増加していた（１００％の増加）。Ｄ３６５では、６／６人で形質細胞が増加していた（１００％の増加）。結果から非特異的液性免疫の増加が示される。
図１に上記の試験１．）の結果を示し、形質細胞はＤ０と比較して全ての時点で有意に増加している。より具体的には、Ｄ３８では、６１／８３人で形質細胞が増加していた（７３．４９％の増加）。Ｄ７６では、３９／５８人で形質細胞が増加していた（６７．２４％の増加）。Ｄ１２０では、２８／４０人で形質細胞が増加していた（７０．００％の増加）。Ｄ１８０では、１８／２６人で形質細胞が増加していた（６９．００％の増加）。Ｄ２６０では、８／８人で形質細胞が増加していた（１００％の増加）。Ｄ３６５では、６／６人で形質細胞が増加していた（１００％の増加）。結果から非特異的液性免疫の増加が示される。
【0069】
製品が投与された集団全体のうち、４８人でＤ３８及びＤ７６についての分析が完了した。これらの個体では、Ｄ３８及びＤ７６の両方の平均差を考慮に入れた多重比較を行った。Ｄ０と比較してＤ３８及びＤ７６で形質細胞が統計的に増加していることが見出された（図２）。上述の試験１．）のこれらの結果から非特異的液性免疫の増加が示される。
【0070】
試験１．）の更なる結果を反映する図３では、用量１投与後のＤ３８，Ｄ７６及びＤ１２０でメモリー形質細胞が有意に増加していることが分かる。より具体的には、Ｄ３８では、６０／８３人でメモリー形質細胞が増加していた（７２．２９％の増加）。Ｄ７６では、３９／５８人でメモリー形質細胞が増加していた（６７．２４％の増加）。Ｄ１２０では、２９／４０人でメモリー形質細胞が増加していた（７２．５％の増加）。結果からＤ１２０までの非特異的液性免疫の増加が示される。Ｄ１８０，Ｄ２６０及びＤ３６５での増加は、統計的に有意ではなく、時間とともに消失する免疫の指標である。
【0071】
製品が投与された集団全体のうち、４８人でＤ３８及びＤ７６についての分析が完了した。これらの個体では、Ｄ３８及びＤ７６の両方を考慮に入れた多重比較を行った。Ｄ０と比較してＤ３８及びＤ７６でメモリー形質細胞が統計的に増加していることが見出された（図４）。結果から非特異的液性免疫の増加が示される。
【0072】
上記の試験３．）の結果を反映する図５に示されるように、Ｄ３８及びＤ７６でＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的液性免疫が増加した。より具体的には、３つ全てのペプチドについて、ＩｇＧレベルはＤ０と比較してＤ３８で有意に増加し、ペプチド１及び６については、０日目と比較して７６日目で統計的増加が認められた。結果からＤ７６までのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的液性免疫の増加が示される。Ｄ１２０，Ｄ１８０，Ｄ２６０及びＤ３６５での増加は、統計的に有意ではなかった。
【0073】
図６～図１１は、試験２．）の更なる結果を反映している。図６は、使用したペプチドでＰＢＭＣをチャレンジした後にＩＦＮ－γ分泌の増加を示した個体のパーセントを示す。これはＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的細胞性免疫の測定である。結果は少なくとも１つのペプチド（２列目）、全てのペプチド（３列目）、及び３つのペプチドのうちのそれぞれ１つ（４列目のペプチド１、５列目のペプチド２、６列目のペプチド６）に対するＩＦＮ－γ分泌のパーセンテージを示す。
【0074】
図７ａ～図７ｆから分かるように、Ｄ３８でのペプチド１、Ｄ１２０を除く全ての時点でのペプチド２、及びＤ３６５を除く全ての時点でのペプチド６についてＩＦＮ－γ分泌の有意な増加が観察された。結果からＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的細胞性免疫の増加が示される。
【0075】
図８は、使用したペプチドでＰＢＭＣをチャレンジした後にＩＬ－２分泌が増加した個体のパーセンテージを示す。これはＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的細胞性免疫の測定である。結果は少なくとも１つのペプチド（２列目）、全てのペプチド（３列目）、及び３つのペプチドのうちのそれぞれ１つ（４列目のペプチド１、５列目のペプチド２、６列目のペプチド６）に対するＩＬ－２分泌のパーセンテージを示す。
【0076】
図９ａ～図９ｆから分かるように、Ｄ３８，Ｄ７６及びＤ１２０でのペプチド１、Ｄ３８，Ｄ７６，Ｄ１２０，Ｄ１８０でのペプチド２、並びにＤ３６５を除く全ての時点でのペプチド６についてＩＬ－２分泌の有意な増加が観察された。これらの結果からＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的細胞性免疫の増加が示される。
【0077】
図１０は、使用したペプチドでＰＢＭＣをチャレンジした後にＴＮＦ－α分泌が増加した個体のパーセンテージを示す。これはＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的細胞性免疫の測定である。結果は、少なくとも１つのペプチド（２列目）、全てのペプチド（３列目）、及び３つのペプチドのうちのそれぞれ１つ（４列目のペプチド１、５列目のペプチド２、６列目のペプチド６）に対するＴＮＦ－α分泌のパーセンテージを示す。
【0078】
図１１ａ～図１１ｆから分かるように、Ｄ１８０でのペプチド１、Ｄ３８，Ｄ７６，Ｄ１２０，Ｄ１８０でのペプチド２、及びＤ３６５を除く全ての時点でのペプチド６についてＴＮＦ－α分泌の有意な増加が観察された。これらの結果からＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的細胞性免疫の増加が示される。
【0079】
図１２に示す表は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する細胞媒介性免疫の決定が、それぞれＩＬ－２、ＩＦＮ－ガンマ及びＴＮＦ－アルファの測定によって、どの程度特異的であるかを示している。図１２ａに示す表は、３つのペプチド１，２及び６がいずれも、ＩＬ－２決定によると非感染ボランティアにおいて有意でない細胞媒介性免疫を引き起こさなかったことを示している。図１２ｂに示す表は、ペプチド１及び２が、ＩＦＮ－γ決定によると非感染ボランティアにおいて有意でない細胞媒介性免疫を引き起こさなかったことを示している。ペプチド６は、非感染者においてＩＦＮ－γ分泌を誘導した。図１２ｃに示す表は、３つのペプチド１，２及び６がいずれも、ＴＮＦ－α決定によると非感染ボランティアにおいて有意でない細胞媒介性免疫を引き起こさなかったことを示している。
【0080】
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的細胞性及び液性免疫をフローサイトメトリーによる細胞内ＩＦＮ－γの決定によって測定した。１０人のワクチン接種者及び９人のワクチン非接種者からのＰＢＭＣを、パルシングに使用した３つのペプチドとともにインキュベートした。次いで、ＣＤ４及びＣＤ８細胞の両方で細胞内ＩＦＮ－γを染色し、決定した。上述の試験４．）の結果を反映する図１３に示されるように、ワクチン接種者では、ＣＤ４及びＣＤ８細胞の両方でＩＦＮ－γのレベルが増加し、３つのペプチドに対する細胞性及び液性の両方の活性化が示されることが見出された。
【0081】
上記の試験６．）の結果を反映する図１４に示す表は、３つのペプチドに対して活性化したＣＤ８陽性細胞、メモリー形質細胞及びＴ細胞の決定による、ＩＳＴ－１２製剤に使用される３つのペプチドに対する免疫応答の特異性を示している。３つのペプチドのミックスにテキサスレッド蛍光色素をコンジュゲートした。１人のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染者、２人のワクチン接種者（それぞれ第１の用量の投与後、１人は３８日目に決定され、もう１人は１８０日目に決定された）、及び２人のワクチン非接種の非感染「健常」ボランティアからの全血を蛍光ペプチドミックスとともに２時間インキュベートした。次いで、コンジュゲートしたペプチドを特異的に認識するＣＴＬ、形質メモリー及びメモリーＴ細胞を決定した。ワクチン接種者では、使用した３つのペプチドに特異的な形質メモリー細胞のレベルが増加していることが見出された。感染者は、液性メモリー免疫を獲得するのに十分な時間がなかった。２人のワクチン非接種の非感染ボランティアでは、使用した３つのペプチドに特異的な形質メモリー細胞のレベルが非常に低かった。しかしながら、感染者及び２人のワクチン接種者では、２人のワクチン非接種の非感染ボランティアと比較して、使用した３つのペプチドに特異的なメモリーＴ細胞のレベルが増加していた。
【0082】
上記の試験５．）の結果を反映する図１５ａ～図１５ｃの箱ひげ図に示されるように、ワクチン接種者では、ワクチン非接種者と比較して唾液中の使用した３つのペプチドに特異的なＩｇＡのレベルが統計的に有意に増加していた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図7f】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図9e】
【図9f】
【図10】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図11e】
【図11f】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図13】
【図14】
【図15a】
【図15b】
【図15c】
【配列表】
【国際調査報告】