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特表2023-544735抗ＡＡＶ抗体を検出する方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-25

(54)【発明の名称】抗ＡＡＶ抗体を検出する方法

(51)【国際特許分類】

G01N 33/53 20060101AFI20231018BHJP

G01N 33/543 20060101ALI20231018BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N

G01N33/543 501A

G01N33/543 575

G01N33/543 541A

G01N33/543 541B

G01N33/543 545A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023520106

(86)(22)【出願日】2021-10-01

(85)【翻訳文提出日】2023-04-28

(86)【国際出願番号】 US2021053245

(87)【国際公開番号】W WO2022072888

(87)【国際公開日】2022-04-07

(31)【優先権主張番号】63/086,165

(32)【優先日】2020-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508241200

【氏名又は名称】サンガモセラピューティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本健策

(72)【発明者】

【氏名】フー，ジン

(72)【発明者】

【氏名】ルー，ヤンメイ

(57)【要約】

本開示は、対象における抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体の検出のためのスクリーニングアッセイ及び確認アッセイを含む、治療前及び治療後の総抗体レベルに関連する総抗体アッセイに関する。本開示はまた、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）ベクターを含む遺伝子療法で対象を治療する方法に関する。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試験対象における抗アデノ随伴ウイルス（抗ＡＡＶ）抗体を検出する方法であって、
（ａ）前記試験対象から得られた試験試料を提供することと、
（ｂ）前記試験試料を試験ＡＡＶカプシドと接触させることであって、前記試験ＡＡＶカプシドが、試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｃ）前記試験試料が接触した固定化試験ＡＡＶカプシドを試験二次抗体と接触させることであって、前記試験二次抗体が試験検出可能標識を含む、接触させることと、
（ｄ）前記試験検出可能標識を検出することと、
を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された前記標識がカットポイント係数以上である場合、前記試験対象は抗ＡＡＶ抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された前記標識が前記カットポイント係数未満である場合、前記試験対象は抗ＡＡＶ抗体を含まない、方法。

【請求項2】

前記カットポイント係数が、
（１）複数の参照対象から得られた参照試料を提供することであって、前記参照対象のそれぞれが中和抗ＡＡＶ抗体アッセイに対して陰性であった、提供することと、
（２）各参照試料を参照ＡＡＶカプシドと接触させることであって、前記参照ＡＡＶカプシドが参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（３）各参照試料が接触した固定化参照ＡＡＶカプシドを参照二次抗体と接触させることであって、前記参照二次抗体が参照検出可能標識を含む、接触させることと、
（４）各参照試料について前記参照検出可能標識を検出することと、
（５）外れ値参照試料を除去することと、
（６）前記外れ値が除去された参照試料を使用して前記カットポイント係数を決定することと、を含む方法により決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記外れ値参照試料が、基準［Ｑ１－１．５＊（Ｑ３－Ｑ１），Ｑ３＋１．５＊（Ｑ３－Ｑ１）］を使用して除去される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記カットポイント係数が、９５％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいている、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

前記カットポイント係数が、９５％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいている、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項6】

前記カットポイント係数が、非パラメトリック方法に基づいている、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項7】

前記抗ＡＡＶ抗体が、抗ＡＡＶ６抗体であり、前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ６カプシドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記試験試料が、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

各参照試料が、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に、前記固定化ＡＡＶカプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｄ）の前に、前記試料が接触した固定化ＡＡＶカプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記試験検出可能標識及び前記参照検出可能標識が、独立して、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記試験対象が、ヒトである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記試料が前記試験対象から得られる前に、前記試験対象にＡＡＶベクターが投与された、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

試験対象における抗アデノ随伴ウイルス（抗ＡＡＶ）抗体を検出する方法であって、
（ａ）前記試験対象から得られた第１の試験試料及び第２の試験試料を提供することと、
（ｂ）前記第２の試験試料を試験可溶性ＡＡＶカプシドと接触させることと、
（ｃ）前記第１の試験試料を第１の試験固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、前記第１の試験固定化ＡＡＶカプシドが、第１の試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｄ）前記第２の試験試料及び前記可溶性試験ＡＡＶカプシドの混合物を第２の試験固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、前記第２の試験固定化ＡＡＶカプシドが、第２の試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｅ）前記第１の試験試料が接触した第１の試験固定化ＡＡＶカプシドを第１の試験二次抗体と接触させることであって、前記第１の試験二次抗体が第１の試験検出可能標識を含む、接触させることと、
（ｆ）前記混合物が接触した第２の試験固定化ＡＡＶカプシドを第２の試験二次抗体と接触させることであって、前記第２の試験二次抗体が第２の試験検出可能標識を含み、前記第２の試験二次抗体が前記第１の二次抗体と同じであり、前記第１の試験検出可能標識が前記第２の試験検出可能標識と同じである、接触させることと、
（ｇ）前記第１及び第２の試験検出可能標識を検出することと、
を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較してカットポイントパーセンテージ以上減少する場合、前記対象は抗ＡＡＶ抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較してカットポイント未満減少する場合、前記対象は抗ＡＡＶ抗体を含まない、方法。

【請求項16】

前記カットポイントが、
（１）複数の参照対象から得られた第１及び第２の参照試料を提供することであって、前記参照対象のそれぞれが中和抗ＡＡＶ抗体アッセイに対して陰性であった、提供することと、
（２）各参照対象について、前記第２の参照試料を参照可溶性ＡＡＶカプシドと接触させることと、
（３）各参照対象について、前記第１の参照試料を、第１の参照固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、前記第１の参照固定化ＡＡＶカプシドが、第１の参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（４）各参照対象について、前記第２の参照試料及び前記参照可溶性ＡＡＶカプシドの混合物を第２の参照固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、前記第２の参照固定化ＡＡＶカプシドが、第２の参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（５）各参照対象について、前記第１の参照試料が接触した第１の固定化ＡＡＶカプシドを第１の二次抗体と接触させることであって、前記第１の二次抗体が第１の参照検出可能標識を含む、接触させることと、
（６）各参照対象について、前記混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶカプシドを、第２の二次抗体と接触させることであって、前記第２の二次抗体が、第２の参照検出可能標識を含み、前記第２の二次抗体が、前記第１の二次抗体と同じであり、前記第１の参照検出可能標識が、前記第２の参照検出可能標識と同じである、接触させることと、
（７）各参照対象について、前記第１及び第２の参照検出可能標識を検出することと、
（８）外れ値参照試料を除去することと、
（９）前記外れ値が除去された参照試料を使用して前記カットポイントパーセンテージを決定することと、を含む方法により決定される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記外れ値参照試料が、基準［Ｑ１－１．５＊（Ｑ３－Ｑ１），Ｑ３＋１．５＊（Ｑ３－Ｑ１）］を使用して除去される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記カットポイントパーセンテージが、９９％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいている、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

前記カットポイントパーセンテージが、９９％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいている、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項20】

前記カットポイントパーセンテージが、非パラメトリック方法に基づいている、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項21】

前記抗ＡＡＶ抗体が、抗ＡＡＶ６抗体であり、前記可溶性ＡＡＶカプシドが、可溶性ＡＡＶ６カプシドであり、前記第１の固定化ＡＡＶカプシドが、第１の固定化ＡＡＶ６カプシドであり、前記第２の固定化ＡＡＶカプシドが、第２の固定化ＡＡＶ６カプシドである、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記第１及び第２の試験試料が、それぞれ、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

各第１及び第２の参照試料が、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｅ）の前に、前記第１の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、請求項１５～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

ステップ（ｄ）の後及びステップ（ｆ）の前に、前記第２の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

ステップ（ｅ）の後及びステップ（ｇ）の前に、前記試料が接触した第１の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

ステップ（ｆ）の後及びステップ（ｇ）の前に、前記混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記第１及び第２の試験検出可能標識が、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記第１及び第２の参照検出可能標識が、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記試験対象が、ヒトである、請求項１５～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記試料が前記試験対象から得られる前に、前記試験対象にＡＡＶベクターが投与された、請求項１５～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記試験可溶性ＡＡＶカプシドが、７．５Ｅ１０～１５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である、請求項１５～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

遺伝子療法を必要とする試験対象を治療する方法であって、前記試験対象が抗アデノ随伴ウイルス（抗ＡＡＶ）抗体を含まない場合にのみ、前記試験対象に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、
前記試験対象における任意の抗ＡＡＶ抗体が、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法によって検出される、方法。

【請求項34】

前記試験対象が、遺伝障害に罹患している、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記試験対象が、神経障害に罹患している、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記障害が、血友病Ａ及びＢ、ファブリー病、鎌状赤血球症、ベータサラセミア、ムコ多糖症Ｉ及びＩＩ型、フェニルケトン尿症、グリコーゲン貯蔵病１ａ型、ＧＬＵＴ１欠乏症症候群、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳからなる群から選択される、請求項３４又は３５に記載の方法。

【請求項37】

前記障害が、ファブリー病である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記試験対象が、以前にＡＡＶ６ベクターを投与されていなかった、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１日に出願された米国仮出願第６３／０８６，１６５号からの優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法を施すのに最も一般的に使用されるベクターの１つである。ｒＡＡＶベクターの使用には多くの利点があるが、対象において少量の抗ＡＡＶでさえ、その有効性を大幅に低下させることができる。ＡＡＶは天然に存在するウイルスであるため、抗ＡＡＶ抗体の集団には非ゼロベースラインが存在し、総抗体ツールのばらつきを引き起こし、処置前スクリーニング及び処置後モニタリングのための正確なカットポイントを評価することが困難である。

【0003】

ウイルス遺伝子送達に使用されるＡＡＶのいくつかの血清型があり、ヒト及び非ヒト試料の両方に見出される。これらの血清型は、それらのカプシドのアミノ酸配列において多様である（Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．，２００８；ｖｏｌ．１６（６）：１０７３－８０）。したがって、１つのＡＡＶ血清型に曝露された対象は、そのＡＡＶ血清型に対する抗体を発症し得る。それらの抗ＡＡＶ抗体は、他の血清型のＡＡＶに結合する場合もあれば、しない場合もある。したがって、抗ＡＡＶ抗体レベルの免疫原性分析は、十分な治療有効性を確保するために既存の免疫を持たない患者の登録、及び安全性を評価するための治療誘導抗体応答の検出にとって重要である。
抗ＡＡＶ抗体は、中和抗体又は非中和抗体であり得る。中和抗体及び非中和抗体の両方が、ＡＡＶベースの遺伝子療法の有効性及び安全性に影響を及ぼし得る。例えば、中和抗体は、取り込みを阻害し、エンドソーム及び核輸送の調節に影響を及ぼし、カプシド処理に影響し、遺伝子放出を抑制し得る。非中和抗体は、安全性に悪影響を及ぼすことに加えて、ＡＡＶベクターのクリアランスにおいて役割を果たし得る。したがって、中和抗体及び非中和抗体の両方の存在を検出する試験を有することが重要である。中和抗体アッセイは、抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）ベクターについて当技術分野で既知であるが、中和抗体及び非中和抗体の両方を検出するアッセイの必要性が当技術分野で残されており、すなわち、全抗体アッセイの必要性が残されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．，２００８；ｖｏｌ．１６（６）：１０７３－８０

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示は、対象における中和及び非中和抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体の検出に関する。本開示は、より高い感度及び低減された偽陽性率での患者試料中の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体のより正確な検出のための、スクリーニングアッセイ及び確認アッセイを含む最適化された総抗体アッセイを提供する。本開示はまた、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）ウイルスベクターを使用する治療方法に関する。

【0006】

本開示の第１の態様は、スクリーニングアッセイを使用して、対象における抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）試験対象から得られた試験試料を提供することと、（ｂ）試験試料をＡＡＶカプシドと接触させることであって、ＡＡＶカプシドが固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｃ）試験試料と接触した固定化ＡＡＶカプシドを試験二次抗体と接触させることであって、試験二次抗体が試験検出可能標識を含む、接触させることと、（ｄ）試験検出可能標識を検出することとを含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識がカットポイント係数以上である場合、試験対象は抗ＡＡＶ抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識がカットポイント係数未満である場合、試験対象は抗ＡＡＶ抗体を含まない。

【0007】

【0008】

いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体であり、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６カプシドである。

【0009】

いくつかの実施形態において、試験試料は、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。いくつかの実施形態において、各参照試料は、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。

【0010】

いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に、固定化ＡＡＶカプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｄ）の前に、試料が接触した固定化ＡＡＶカプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、試験検出可能標識及び参照検出可能標識は、独立して、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0012】

いくつかの実施形態において、試験対象はヒトである。いくつかの実施形態において、試料が対象から得られる前に、試験対象にＡＡＶベクターが投与された。

【0013】

いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象から得られた試料を提供することと、（ｂ）試料をＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドが固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｃ）試料と接触した固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを二次抗体と接触させることであって、二次抗体が検出可能標識を含む、接触させることと、（ｄ）標識を検出することとを含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識が１．５以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識が１．５未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。

【0014】

いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が１．６以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．６未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が１．７以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が１．７３以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７３未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が１．７５以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７５未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。

【0015】

いくつかの実施形態において、試料は、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。

【0016】

【0017】

いくつかの実施形態において、検出可能標識は、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、比色標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼである。

【0018】

いくつかの実施形態において、固体支持体は、培養プレートのウェルである。

【0019】

いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、試料が対象から得られる前に、対象にＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターが投与された。

【0020】

いくつかの実施形態において、陰性対照は、事前にスクリーニングされた陰性試料である。いくつかの実施形態において、陰性対照は、中和抗体アッセイにおいて陰性であった。

【0021】

本開示の第２の態様は、確認アッセイを使用して、対象における抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出する方法を提供する。

【0022】

いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）試験対象から得られた第１の試験試料及び第２の試験試料を提供することと、（ｂ）第２の試験試料を試験可溶性ＡＡＶカプシドと接触させることと、（ｃ）第１の試験試料を第１の試験固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第１の試験固定化ＡＡＶカプシドが、第１の試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｄ）第２の試験試料及び試験可溶性ＡＡＶカプシドの混合物を第２の試験固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第２の試験固定化ＡＡＶカプシドが、第２の試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｅ）第１の試験試料が接触した第１の試験固定化ＡＡＶカプシドを第１の試験二次抗体と接触させることであって、第１の試験二次抗体が第１の試験検出可能標識を含む、接触させることと、（ｆ）混合物が接触した第２の試験固定化ＡＡＶカプシドを第２の試験二次抗体と接触させることであって、第２の試験二次抗体が、第２の試験検出可能標識を含み、第２の試験二次抗体が、第１の試験二次抗体と同じであり、第１の試験検出可能標識が、第２の試験検出可能標識と同じである、接触させることと、（ｇ）第１及び第２の試験検出可能標識を検出することと、を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較してカットポイントパーセンテージ以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較してカットポイント未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ抗体を含まない。

【0023】

いくつかの実施形態において、カットポイントは、（１）複数の参照対象から得られた第１及び第２の参照試料を提供することであって、参照対象のそれぞれが中和抗ＡＡＶ抗体アッセイに対して陰性であった、提供することと、（２）各参照対象について、第２の参照試料を参照可溶性ＡＡＶカプシドと接触させることと、（３）各参照対象について、第１の参照試料を、第１の参照固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第１の参照固定化ＡＡＶカプシドが、第１の参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、（４）各参照対象について、第２の参照試料及び参照可溶性ＡＡＶカプシドの混合物を第２の参照固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第２の参照固定化ＡＡＶカプシドが、第２の参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、（５）各参照対象について、第１の参照試料が接触した第１の固定化ＡＡＶカプシドを第１の二次抗体と接触させることであって、第１の二次抗体が第１の参照検出可能標識を含む、接触させることと、（６）各参照対象について、混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶカプシドを、第２の二次抗体と接触させることであって、第２の二次抗体が、第２の参照検出可能標識を含み、第２の二次抗体が、第１の二次抗体と同じであり、第１の参照検出可能標識が、第２の参照検出可能標識と同じである、接触させることと、（７）各参照対象について、第１及び第２の参照検出可能標識を検出することと、（８）外れ値参照試料を除去することと、（９）外れ値が除去された参照試料を使用してカットポイントパーセンテージを決定することと、を含む方法により決定される。

【0024】

いくつかの実施形態において、外れ値参照試料は、基準［Ｑ１－１．５＊（Ｑ３－Ｑ１），Ｑ３＋１．５＊（Ｑ３－Ｑ１）］を使用して除去される。いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージは、９９％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいている。いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージは、９９％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいている。いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージは、非パラメトリック方法に基づいている。

【0025】

いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体であり、可溶性ＡＡＶカプシドは、可溶性ＡＡＶ６カプシドであり、第１の固定化ＡＡＶカプシドは、第１の固定化ＡＡＶ６カプシドであり、第２の固定化ＡＡＶカプシドは、第２の固定化ＡＡＶ６カプシドである。

【0026】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験試料は、それぞれ、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。いくつかの実施形態において、各第１及び第２の参照試料は、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｅ）の前に、第１の固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｄ）の後及びステップ（ｆ）の前に、第２の固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）の後及びステップ（ｇ）の前に、試料が接触した第１の固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｆ）の後及びステップ（ｇ）の前に、混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。

【0028】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0029】

いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、試料が試料から得られる前に、対象にＡＡＶベクターが投与された。

【0030】

いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶカプシドは、７．５Ｅ１０～１５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。

【0031】

いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象から得られた第１の試料及び第２の試料を提供することと、（ｂ）第２の試料を可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドと接触させることと、（ｃ）第１の試料を第１の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、第１の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドが、第１の固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｄ）第２の試料及び可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドの混合物を第２の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、第２の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドが、第２の固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｅ）第１の試料が接触した第１の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを第１の二次抗体と接触させることであって、第１の二次抗体が第１の検出可能標識を含む、接触させることと、（ｆ）混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを第２の二次抗体と接触させることであって、第２の二次抗体が、第２の検出可能標識を含み、第２の二次抗体が、第１の二次抗体と同じであり、第２の検出可能標識が、第２の検出可能標識と同じである、接触させることと、（ｇ）第１及び第２の標識を検出することと、を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２０％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２０％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。

【0032】

いくつかの実施形態において、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２２％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２２％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．１％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．１％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．５％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．５％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。

【0033】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料は、それぞれ、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｅ）の前に、第１の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｄ）の後及びステップ（ｆ）の前に、第２の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）の後及びステップ（ｇ）の前に、試料が接触した第１の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｆ）の後及びステップ（ｇ）の前に、混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％ｔｗｅｅｎを含む。

【0035】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ比色標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ西洋ワサビペルオキシダーゼである。

【0036】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の固体支持体は、それぞれ独立して、培養プレートのウェルである。

【0037】

いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料が対象から得られる前に、対象にＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターが投与された。

【0038】

いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、７．５Ｅ１０～１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。

【0039】

本開示の第３の態様は、遺伝子療法を必要とする対象（例えば試験対象）を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象（例えば試験対象）を提供することと、対象（例えば試験対象）が抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない場合にのみ、対象（例えば試験対象）に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ、例えばｒＡＡＶ６）ベクターを投与することとを含む。いくつかの実施形態において、対象（例えば試験対象）における任意の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体が、本明細書に開示されるアッセイ方法のいずれかによって検出される。

【0040】

いくつかの実施形態において、対象（例えば試験対象）は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象（例えば試験対象）は、ヒト又は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象（例えば試験対象）は、ヒトである。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、対象（例えば試験対象）は、以前にＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターを投与されていない。

【0041】

いくつかの実施形態において、対象（例えば試験対象）は、遺伝障害に罹患している。いくつかの実施形態において、対象（例えば試験対象）は、神経障害に罹患している。いくつかの実施形態において、障害は、血友病Ａ及びＢ、ファブリー病、鎌状赤血球症、ベータサラセミア、ムコ多糖症Ｉ及びＩＩ型、フェニルケトン尿症、グリコーゲン貯蔵病１ａ型、ＧＬＵＴ１欠乏症症候群、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、障害は、ファブリー病である。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】例示的なＡＡＶ抗体検出アッセイのグラフィック描写を示す図である。パネルＡは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＡＡＶベクターを使用した例示的なＡＡＶ中和活性アッセイのグラフィック描写を示す。パネルＢは、固定化ＡＡＶカプシドを使用した例示的なＡＡＶスクリーニングアッセイのグラフィック描写を示す。パネルＣは、固定化及び可溶性ＡＡＶカプシドの両方を使用した例示的なＡＡＶ確認アッセイのグラフィック描写を示す。

【図2】ＡＡＶ６中和活性アッセイについて陰性として事前にスクリーニングされた試料を使用したＡＡＶ６スクリーニングアッセイの結果を示す図である。血清試料（ｎ＝３８）を光学密度（ＯＤ）によってグラフ化した。正規化応答を計算するために使用される陰性対照を、これらの試料のサブセットからプールした。同じ事前スクリーニング法を他の個体に対して実行して、カットポイント決定のためのドナー試料を選択した。

【図3】カットポイントを決定するための方法の概略図である。パネルＡは、外れ値除去に使用されるボックスプロットの図を示す。提供された計算を用い、四分位数（Ｑ）１及びＱ３を使用して外れ値を計算した。パネルＢは、全抗体アッセイ（スクリーニングアッセイ（偽陽性率（ＦＰＲ）５％）及び確認アッセイ（ＦＰＲ１％））における抗薬物抗体（ＡＤＡ）のカットポイントを決定するために使用する正規化応答のグラフを示す。カットポイントを決定するためのパラメトリック計算は次のとおりである。平均＋１．６４５×ＳＤ（５％ＦＰＲ）又は平均＋２．３３×ＳＤ（１％ＦＰＲ）。ＳＤ：標準偏差。

【図4-1】事前スクリーニングなしの１００個の血清試料のボックスプロット図である。パネルＡは、１、２、又は３ラウンドの外れ値除去を伴うカットポイント係数を示す。３ラウンドの外れ値除去の後、７０個の試料を最終カットポイント係数計算でプロットし、これにより、スクリーニングアッセイの最終カットポイント係数が２．６１に決定された。外れ値除去戦略は、カットポイント係数計算に影響を与えた。パネルＢは、確認アッセイにおける１００個のランダム血清試料からのデータのボックスプロット図を示す。外れ値は特定されなかった。スクリーニングアッセイで特定された外れ値を除去した後、カットポイントパーセンテージは、４３．１％阻害であると決定された。

【図4-2】同上。

【図5A】中和活性アッセイによって事前スクリーニングされた血清試料からのデータのボックスプロット及び分布を示す図である。パネルＡは、中和活性アッセイを使用して事前スクリーニングされ、抗ＡＡＶ６中和抗体について陰性であると決定された２１１個の血清試料（「事前スクリーニングされた陰性血清試料」）を使用した、スクリーニングアッセイのボックスプロット計算及び対数変換された正規化応答プロットを示す。スクリーニングアッセイのカットポイント係数は、１．７３として計算された。パネルＢは、２１１個の事前スクリーニングされた陰性血清試料を使用した確認アッセイのボックスプロット及びプロットを提供する。確認アッセイのカットポイントパーセンテージは、２４．５％阻害であると計算された。

【図5B】同上。

【図6】陽性対照スクリーニングの結果を示す図である。パネルＡは、光学密度（ＯＤ）によってグラフ化された６３人の無作為のヒト対象からの血清試料を使用したスクリーニングアッセイの結果を示す。矢印は、最も高い信号を有する５つの試料を特定している。パネルＢは、最も高い陽性シグナルを有する５つの試料の滴定を使用したスクリーニングアッセイを示す。矢印で特定された、最も低い濃度（すなわち最も高い希釈）で最も高いＯＤを有する試料、ＰＣ－２を選択して、陽性対照を生成した。

【図7】全抗体アッセイの感度決定を示す図である。パネルＡは、タンパク質Ａ／Ｇ及びＡＡＶ６結合磁気ビーズをそれぞれ使用して血清試料ＰＣ－２から単離したＩｇＧ抗体（上パネル）又は抗ＡＡＶ６特異的抗体のいずれかによる滴定を使用したスクリーニングアッセイの感度決定を示す。全ＩｇＧ抗体を使用したアッセイ感度は、１５．４μｇ／ｍＬと決定され、抗ＡＡＶ６特異的抗体を使用したアッセイ感度は、０．２４１μｇ／ｍＬと決定された。パネルＢは、タンパク質Ａ／Ｇ及びＡＡＶ６結合磁気ビーズをそれぞれ使用して血清試料ＰＣ－２から単離したＩｇＧ抗体（上パネル）又は抗ＡＡＶ６特異的抗体のいずれかによる滴定を使用した確認アッセイの感度決定を示す。全ＩｇＧ抗体を使用したアッセイ感度は、５．８５μｇ／ｍＬと決定され、抗ＡＡＶ６特異的抗体を使用したアッセイ感度は、０．０７３４μｇ／ｍＬと決定された。

【図8】スクリーニングアッセイ対中和抗体アッセイのプロットを示す図である。パネルＡは、１００人の無作為な健常対象のパネルにおける抗ＡＡＶ６抗体の検出のための、無作為な血清試料から得られたカットポイント係数を使用した全抗体（ＴＡｂ）スクリーニングアッセイ（ＣＰＦ＝２．６）と、中和抗体（ＮＡｂ）アッセイ（ＣＰＦ＝０．３）との比較を示す。楕円は、ＴＡｂスクリーニングアッセイにおける偽陰性を示す。パネルＢは、１００人の無作為な健常対象のパネルにおける抗ＡＡＶ６抗体の検出のための、事前にスクリーニングされた陰性試料から得られたカットポイント係数を使用した全抗体（ＴＡｂ）スクリーニングアッセイ（ＣＰＦ＝１．７５）と、中和抗体（ＮＡｂ）アッセイ（ＣＰＦ＝０．３）との比較を示す。偽陰性結果は特定されなかった。パネルＣは、１００人の無作為な健常対象のパネルにおける抗ＡＡＶ６抗体の検出のための、事前にスクリーニングされた陰性試料から得られたカットポイントパーセンテージ（ＣＰＰ＝２４．５％阻害）を使用した確認アッセイ（Ｔａｂ％阻害）と、中和抗体（ＮＡｂ）アッセイ（ＣＰＦ＝０．３、すなわち３０％ＲＬＵ）との比較を示す。偽陰性結果は特定されなかった。

【図9】スクリーニングアッセイ及び確認アッセイの選択性を示す図である。パネルＡは、スクリーニングアッセイの選択性を裏付けている。１０個の事前スクリーニングされた陰性試料を、２０μｇ／ｍＬ及び４０μｇ／ｍＬの総ＩｇＧ陽性対照でスパイクした。スクリーニングアッセイは、事前スクリーニングされた陰性試料中で抗ＡＡＶ６抗体を検出しなかったが、スパイクされた全ての試料中で抗ＡＡＶ６抗体を検出した。ＮＲ＝正規化応答である。パネルＢは、確認アッセイの選択性を裏付けている。１０個の事前スクリーニングされた陰性試料を、２０μｇ／ｍＬ及び４０μｇ／ｍＬの総ＩｇＧ陽性対照でスパイクした。確認アッセイは、全てのスパイクされた試料中で抗ＡＡＶ６抗体を検出した。

【発明を実施するための形態】

【0043】

１．一般的な技術
本明細書で別途定義されない限り、本出願で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載される、薬理学、細胞及び組織培養、分析化学、生化学、合成有機化学、医薬及び製薬化学、分子生物学、細胞及びがん生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学に関連して使用される、及びそれらにおいて実行される実験室手順の技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。標準的な技術は、化学合成及び化学分析に使用される。矛盾する場合には、本明細書が、定義を含めて優先される。

【0044】

本開示の実践は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を使用し、これらは当技術分野の範囲内である。そのような技術は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＮｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒａｎｄＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－１９９８）Ｊ．ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄ．ｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（２００２）、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９８）、Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（２００３）、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，１９９９）などの文献において十分に説明されている。

【0045】

酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、当技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実行される。

【0046】

本明細書及び実施形態全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語句、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられている整数又は整数の群を包含することを意味するが、任意の他の整数又は整数の群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含むが、これらに限定されない」を意味するために使用される。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含むが、これらに限定されない」は、互換的に使用される。

【0047】

本明細書において、実施形態が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語で説明される場合、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」及び／又は「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」という用語で説明される別様の類似の実施形態もまた提供されることが理解される。

【0048】

「例えば（ｅ．ｇ．）」又は「例えば（ｆｏｒｅｘａｍｐｌｅ）」という用語に続く任意の例は、網羅的又は限定的であることを意味するものではない。

【0049】

文脈によって別段に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0050】

冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法上の目的語の１つ又は２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指すように使用される。一例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。本明細書で使用される場合、本開示の組成物における、又は本開示の方法に使用される成分、パラメータ、計算、又は測定値の量を修飾する「約」及び「およそ」という用語は、例えば、現実の世界において単離されたポリペプチド又は医薬組成物を作製するために使用される典型的な測定及び液体取り扱い手順、これらの手順における不慮の誤差、組成物を作製又は方法を実行するために使用される成分の製造、供給源、又は純度の違いなどを介して、本開示の組成物又は方法の化学的又は物理的属性に実質的な影響を及ぼすことなく発生し得る数値の変化を指す。そのような変動は、ある桁の範囲内、典型的には所与の値又は範囲の１０％以内、より典型的には更に所与の値又は範囲の５％以内であり得る。本明細書における値又はパラメータの「約」への言及は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（及びそれを説明する）。例えば、「約Ｘ」を指す説明は、「Ｘ」の説明を含む。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。

【0051】

本開示の広範な範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似値ではあるが、特定の例で示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、任意の数値は、本質的に、それぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。更に、本明細書で開示される全ての範囲は、その中に含まれるありとあらゆる部分範囲を包含すると理解されるべきである。例えば、「１～１０」と述べられた範囲は、最小値１と最大値１０との間（これらの値を含む）のありとあらゆる部分範囲、すなわち、最小値１以上、例えば１～６．１で始まり、最大値１０以下、例えば５．５～１０で終わる全ての部分範囲を含むとみなされるべきである。

【0052】

本発明の態様又は実施形態が、マーカッシュ群又は代替の他の群分けの観点から説明される場合、本開示は、全体として列挙される群全体だけでなく、個々の群の各メンバー、及び主要群の全ての可能な部分群、及び群のメンバーのうちの１つ以上が存在しない主要群も包含する。本開示はまた、本発明の実施形態における群のメンバーのうちの１つ以上の明示的な除外を想定している。

【0053】

本明細書では例示的な方法及び材料が記載されているが、本明細書に記載の方法及び材料に類似又はそれらと同等の方法及び材料もまた、本開示の実践又は試験に使用することができる。材料、方法、及び例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

【0054】

２．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願で使用される全ての科学用語及び技術用語は、本開示が関与する先行技術の一般的な知識を有する人々によって一般的に理解される。一般に、これらの用語は、分子生物学、免疫学、細胞培養、及び分析生化学に関連する技術と関連して使用され、当技術分野で周知であり、一般的に使用されている。したがって、提供される指定及び定義は、用語の矛盾を減らすために行われる。

【0055】

「確認アッセイ」という用語は、本明細書で使用される場合、競合アッセイを指す。例えば、図１Ｃを参照されたい。例えば、患者から得られた試料は、試料が固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシド（又はその一部）に接触する前に、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシド（又はその一部）とインキュベートされ得る。可溶性分子は、試料中の任意の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体への結合について、固定化分子と競合する。そのような競合は、アッセイ中の捕捉された抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体の数、ひいては捕捉された抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を介して固定化分子に結合した二次抗体の数を低減し、二次抗体からの全体的なシグナルを低減する。そのようなシグナルの低減は、本明細書では「パーセント阻害」と称される。

【0056】

「カットポイント係数」及び「ＣＰＦ」という用語は、本明細書で使用される場合、全抗体スクリーニングアッセイ又は試料中の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体の検出のためのスクリーニングアッセイにおける閾値シグナルを指す。閾値シグナル以上のシグナルは、抗体が検出されたことを示す。閾値シグナル未満のシグナルは、抗体が検出されていないことを示す。いくつかの実施形態において、シグナルは、例えば陰性対照に正規化された正規化値である。そのような実施形態において、特定のアッセイについて「カットポイント」シグナルが計算され得る。例えば、光学密度（ＯＤ）を測定するアッセイにおいて、「カットポイントＯＤ」は、ＣＰＦに陰性対照からの平均ＯＤシグナルを乗じることによって決定され得る。ＣＰＦは、パラメトリック方法、ロバストなパラメトリック方法、又は非パラメトリック方法を使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、ＣＰＦは、パラメトリック方法を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＣＰＦは、ロバストなパラメトリック方法を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＣＰＦは、非パラメトリック方法を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＣＰＦは、それぞれが中和抗ＡＡＶ抗体アッセイについて陰性であった、集団参照対象から得られた試料から決定される。

【0057】

「カットポイントパーセンテージ」及び「ＣＰＰ」という用語は、本明細書で使用される場合、試料中の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体の検出のための確認アッセイにおける閾値パーセント阻害を指す。閾値シグナル以上のパーセント阻害は、抗体が検出されたことを示す。閾値シグナル未満のパーセント阻害は、抗体が検出されていないことを示す。ＣＰＰは、パラメトリック方法、ロバストなパラメトリック方法、又は非パラメトリック方法を使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、パラメトリック方法を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、ロバストなパラメトリック方法を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、非パラメトリック方法を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、それぞれが中和抗ＡＡＶ抗体アッセイについて陰性であった、集団参照対象から得られた試料から決定される。

【0058】

「検出抗体」及び「二次抗体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体に結合し、試料中のその抗体の検出を可能にする抗体を指す。したがって、検出抗体は、典型的には、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能標識にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、検出抗体は、抗ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、検出抗体は、試料が得られた対象の種由来の抗体に特異的に結合する。例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体は、ヒト対象から得られた試料中の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体に結合するための検出抗体を使用し得る。

【0059】

「非パラメトリック方法」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＰＦ又はＣＰＰを決定する方法を指す。非パラメトリック方法は、シャピロ－ウィルクＰ＜０．０５及び歪み＞１又は＜－１を有する集団に対して使用される。非パラメトリック方法に基づくスクリーニングアッセイのＣＰＦは９５パーセンタイルであり、非パラメトリック方法に基づく確認アッセイのＣＰＰは９９パーセンタイルである。

【0060】

「正規化応答」及び「ＮＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、試料からのシグナルと、アッセイで使用される標準からのシグナルとの比率を指す。いくつかの実施形態において、標準は陰性対照である。例えば、各試料からのシグナルは、アッセイによって定義されるように、陰性対照からの平均シグナルによって除され得る。いくつかの実施形態において、スクリーニングアッセイに対する正規化応答は、以下のように計算される。

【数1】

【0061】

「光学密度」及び「ＯＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、濃度の尺度を指し、試料が光を吸収又は反射する程度によって定義される。したがって、試料の光学密度（ＯＤ）を標準曲線と比較して、所与の成分の濃度を決定することができる。標準曲線は、例えば、陽性対照の連続希釈を使用して生成され得る。いくつかの実施形態において、検出可能標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの比色標識）からのシグナルは、光学密度によって測定される。

【0062】

「パラメトリック方法」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＰＦ又はＣＰＰを決定する方法を指す。パラメトリック方法は、シャピロ－ウィルクＰ＞０．０５を有する集団に対して使用される。いくつかの実施形態において、ＣＰＦ又はＣＰＰは、９５％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいており、平均＋（１．６４５×ＳＤ）に等しい。いくつかの実施形態において、ＣＰＦ又はＣＰＰは、９９％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいており、平均＋（２．３３×ＳＤ）に等しい。ＳＤ：標準偏差。

【0063】

「パーセント阻害」という用語は、本明細書で使用される場合、確認アッセイにおける可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを含む試料中のシグナルの低減を指す。パーセント阻害は、以下の式によって計算することができる。

【数2】

応答は、正規化又は未処理であり得る。いくつかの実施形態において、パーセント阻害は、小数点として表すことができる。例えば、３０％阻害は、０．３阻害とも称され得る。小数点で表す場合、パーセンテージ記号（％）は省略される。

【0064】

「ロバストなパラメトリック方法」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＰＦ又はＣＰＰを決定する方法を指す。ロバストなパラメトリック方法は、シャピロ－ウィルクＰ＜０．０５及び－１＜歪み＜１を有する集団に対して使用される。いくつかの実施形態において、ＣＰＦ又はＣＰＰは、９５％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいており、中央値＋（１．６４５×（１．４８３×ＭＡＤ））に等しい。ＭＡＤ：絶対偏差の中央値。いくつかの実施形態において、ＣＰＦ又はＣＰＰは、９９％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいており、中央値＋（２．３３×ＳＤ）に等しい。ＳＤ：標準偏差。

【0065】

「試料」という用語は、本明細書で使用される場合、抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出するために使用することができる対象から得られる任意の組織又は流体を指す。対象から得られた試料は、試験の前に改変することができ、依然として本明細書において「試料」とみなされる。例えば、血液のバイアルが対象から得られる場合、血液の血清部分が血液の他の成分から単離され得る。本開示において、そのような単離された血清は、患者から得られた試料とみなされる。同様に、単一の試料を患者から得て、次いで２つ以上の試料に分割してもよい。各試料は、依然として、対象から入手されたものとみなされる。例えば、確認アッセイにおいて、単一の血清試料を対象から得て、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドによって接触されない第１の試料と、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドによって接触される第２の試料に分割してもよい。第１の試料及び第２の試料は両方とも、対象から得られた試料とみなされる。

【0066】

「スクリーニングアッセイ」及び「全抗体スクリーニングアッセイ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体の存在を検出するための抗体試験を指す。例えば、図１Ｂを参照されたい。スクリーニングアッセイは、典型的には、固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシド（又はその一部）を利用して、試料中の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を捕捉する。次いで、捕捉された抗体は、検出可能標識にコンジュゲートされた二次抗体を使用して検出することができる。例えば、スクリーニングアッセイは、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を使用するＥＬＩＳＡであってもよい。スクリーニングアッセイは、典型的には、カットポイント係数に従って解釈される。

【0067】

「対象」、「患者」、及び「個体」という用語は、本明細書において互換的に使用され、抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体検出、陰性対照としての使用、及び／又は陽性対照生成のために試料が採取されるヒト又は非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態において、対象は、遺伝子療法を必要とする。いくつかの実施形態において、対象は、ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターでの治療を必要とする。いくつかの実施形態において、対象は、ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターによる治療を受けている。いくつかの実施形態において、対象は、ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターによる治療を受けていない。これらの用語には、ヒト、非ヒト霊長類（例えばサル）、及び実験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ブタなど）などの哺乳動物が含まれる。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。

【0068】

「総抗体アッセイ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体が中和抗体であるか、又は非中和抗体であるかにかかわらず、試料中の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体の存在を検出するために使用される試験を指す。本明細書に開示されるスクリーニングアッセイ及び確認アッセイは、総抗体アッセイである。

【0069】

３．スクリーニングアッセイを用いた抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体の検出
本開示の第１の態様は、スクリーニングアッセイを使用して、対象の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）試験対象から得られた試験試料を提供することと、（ｂ）試験試料をＡＡＶカプシドと接触させることであって、ＡＡＶカプシドが固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｃ）試験試料と接触した固定化ＡＡＶカプシドを試験二次抗体と接触させることであって、試験二次抗体が試験検出可能標識を含む、接触させることと、（ｄ）試験検出可能標識を検出することとを含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識がカットポイント係数以上である場合、試験対象は抗ＡＡＶ抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識がカットポイント係数未満である場合、試験対象は抗ＡＡＶ抗体を含まない。

【0070】

いくつかの実施形態において、カットポイント係数は、（１）複数の参照対象から得られた参照試料を提供することであって、参照対象のそれぞれが中和抗ＡＡＶ抗体アッセイに対して陰性であった（すなわち陰性として事前にスクリーニングされた）、提供することと、（２）各参照試料をＡＡＶカプシドと接触させることであって、ＡＡＶカプシドが固体支持体上に固定されている、接触させることと、（３）各参照試料が接触した固定化ＡＡＶカプシドを参照二次抗体と接触させることであって、参照二次抗体が参照検出可能標識を含む、接触させることと、（４）各参照試料について、参照検出可能標識を検出することと、（５）外れ値参照試料を除去することと、（６）外れ値が除去された参照試料を使用してカットポイント係数を決定することと、を含む方法により決定される。いくつかの実施形態において、外れ値参照試料は、基準［Ｑ１－１．５＊（Ｑ３－Ｑ１），Ｑ３＋１．５＊（Ｑ３－Ｑ１）］を使用して除去される。いくつかの実施形態において、カットポイント係数を決定するための事前にスクリーニングされた陰性対象の使用は、カットポイント係数を決定するための無作為な対象の使用と比較して、少なくとも１つ少ない外れ値除去のラウンドをもたらす。いくつかの実施形態において、カットポイント係数は、９５％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいている（すなわち平均＋（１．６４５×ＳＤ）に等しい）。いくつかの実施形態において、カットポイント係数は、９９％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいている（すなわち平均＋（２．３３×ＳＤ）に等しい）。いくつかの実施形態において、カットポイント係数は、９５％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいている（すなわち中央値＋（１．６４５×（１．４８３×ＭＡＤ））に等しい）。いくつかの実施形態において、カットポイント係数は、９９％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいている（すなわち中央値＋（２．３３×ＳＤ）に等しい）。いくつかの実施形態において、カットポイント係数は、非パラメトリック方法（すなわち９５パーセンタイル）に基づいている。

【0071】

いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体であり、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６カプシドである。

【0072】

【0073】

いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に、試験固定化ＡＡＶカプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｄ）の前に、試料が接触した試験固定化ＡＡＶカプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。洗浄緩衝液は、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでもよい。Ｔｗｅｅｎ２０は、ポリソルベート２０とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、洗浄は、３回繰り返される。いくつかの実施形態において、洗浄は、プレートウォッシャーを使用して行われる。いくつかの実施形態において、洗浄は、室温で行われる。

【0074】

いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（２）の後及びステップ（３）の前に、参照固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（３）の後及びステップ（４）の前に、試料が接触した参照固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。洗浄緩衝液は、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでもよい。Ｔｗｅｅｎ２０は、ポリソルベート２０とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、洗浄は、３回繰り返される。いくつかの実施形態において、洗浄は、プレートウォッシャーを使用して行われる。いくつかの実施形態において、洗浄は、室温で行われる。

【0075】

いくつかの実施形態において、試験検出可能標識及び参照検出可能標識は、独立して、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、蛍光発生標識である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、染料である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、比色標識である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、放射性標識である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、発光標識である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、化学発光標識である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、磁性粒子である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、金属粒子である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、荷電粒子である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、イオン溶液である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、胞子である。いくつかの実施形態において、試験検出可能標識は、酵素標識である。

【0076】

いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、蛍光発生標識である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、染料である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、比色標識である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、放射性標識である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、発光標識である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、化学発光標識である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、磁性粒子である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、金属粒子である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、荷電粒子である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、イオン溶液である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、胞子である。いくつかの実施形態において、参照検出可能標識は、酵素標識である。

【0077】

いくつかの実施形態において、試験対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、試験対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、試験対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、試験対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、試験対象は、サルである。いくつかの実施形態において、試験対象は、実験動物である。いくつかの実施形態において、試験対象は、ブタである。いくつかの実施形態において、試験対象は、ラットである。いくつかの実施形態において、試験対象は、マウスである。いくつかの実施形態において、試験対象は、ネコである。いくつかの実施形態において、試験対象は、イヌである。いくつかの実施形態において、試験対象は、モルモットである。いくつかの実施形態において、試料が対象から得られる前に、試験対象にＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターが投与された。

【0078】

いくつかの実施形態において、参照対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、参照対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、参照対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、参照対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、参照対象は、サルである。いくつかの実施形態において、参照対象は、実験動物である。いくつかの実施形態において、参照対象は、ブタである。いくつかの実施形態において、参照対象は、ラットである。いくつかの実施形態において、参照対象は、マウスである。いくつかの実施形態において、参照対象は、ネコである。いくつかの実施形態において、参照対象は、イヌである。いくつかの実施形態において、参照対象は、モルモットである。いくつかの実施形態において、試験対象及び参照試験対象は、同じ種である。

【0079】

当業者は、試験二次抗体が、試験対象によって産生される抗体に特異的に結合するべきであることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ヒト抗体である。同様に、いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗サル抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ブタ抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ラット抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗マウス抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ネコ抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗イヌ抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗モルモット抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ＩｇＭ抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ＩｇＥ抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ＩｇＡ抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態において、試験二次抗体は、抗ヒトＩｇＧである。

【0080】

当業者は、参照二次抗体が、参照対象によって産生される抗体に特異的に結合するべきであることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ヒト抗体である。同様に、いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗サル抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ブタ抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ラット抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗マウス抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ネコ抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗イヌ抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗モルモット抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ＩｇＭ抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ＩｇＥ抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ＩｇＡ抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態において、参照二次抗体は、抗ヒトＩｇＧである。いくつかの実施形態において、試験二次抗体及び参照二次抗体は、同じである。

【0081】

いくつかの実施形態において、試験固体支持体は、培養プレートのウェルである。いくつかの実施形態において、参照固体支持体は、培養プレートのウェルである。

【0082】

いくつかの実施形態において、試験固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、試験固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態において、参照固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、参照固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。

【0083】

任意の抗ＡＡＶ抗体が、本明細書に開示される方法のいずれかによって検出され得る。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１抗体、抗ＡＡＶ２抗体、抗ＡＡＶ３Ｂ抗体、抗ＡＡＶ３抗体、抗ＡＡＶ４抗体、抗ＡＡＶ５抗体、抗ＡＡＶ６抗体、抗ＡＡＶ７抗体、抗ＡＡＶ８抗体、抗ＡＡＶ９抗体、抗ＡＡＶ１０抗体、抗ＡＡＶ１１抗体、抗ＡＡＶｒｈ１０抗体、抗ＡＡＶｒｈ３９抗体、及び抗ＡＡＶｒｈ７４抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体である。いくつかの実施形態において、試験ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ３９カプシド、及びＡＡＶｒｈ７４カプシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、試験ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６カプシドである。当業者は、試験ＡＡＶカプシドが、検出されている抗ＡＡＶ抗体に対応するべきであることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、参照ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ３９カプシド、及びＡＡＶｒｈ７４カプシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、参照ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６カプシドである。いくつかの実施形態において、試験ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶカプシドと同じである。

【0084】

いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象から得られた試料を提供することと、（ｂ）試料をＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドが固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｃ）試料と接触した固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを二次抗体と接触させることであって、二次抗体が検出可能標識を含む、接触させることと、（ｄ）標識を検出することとを含み、標識が、１．５以上の陰性対照に対する正規化応答で検出された場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、標識が、１．５未満の陰性対照に対する正規化応答で検出された場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。

【0085】

いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が約１．６以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が約１．６未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が約１．７以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が約１．７未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が約１．７３以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が約１．７３未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が約１．７５以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が約１．７５未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。

【0086】

いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が１．５以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．５未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が１．６以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．６未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が１．７以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が１．７３以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７３未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、陰性対照に対する正規化応答が１．７５以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７５未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。

【0087】

いくつかの実施形態において、試料は、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。いくつかの実施形態において、試料は、血清を含む。いくつかの実施形態において、試料は、血漿を含む。いくつかの実施形態において、試料は、唾液を含む。いくつかの実施形態において、試料は、脳脊髄液を含む。いくつかの実施形態において、試料は、眼液を含む。

【0088】

いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に、固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｄ）の前に、試料が接触した固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。洗浄緩衝液は、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでもよい。Ｔｗｅｅｎ２０は、ポリソルベート２０とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、洗浄は、３回繰り返される。いくつかの実施形態において、洗浄は、プレートウォッシャーを使用して行われる。いくつかの実施形態において、洗浄は、室温で行われる。

【0089】

いくつかの実施形態において、検出可能標識は、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼである。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、蛍光発生標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、染料である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、比色標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、放射性標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、発光標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、化学発光標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、磁性粒子である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、金属粒子である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、荷電粒子である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、イオン溶液である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、胞子である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、酵素標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、本明細書に列挙される検出可能標識のいずれかの組み合わせを含む。

【0090】

いくつかの実施形態において、固体支持体は、培養プレートのウェルである。

【0091】

いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象は、サルである。いくつかの実施形態において、対象は、実験動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ブタである。いくつかの実施形態において、対象は、ラットである。いくつかの実施形態において、対象は、マウスである。いくつかの実施形態において、対象は、ネコである。いくつかの実施形態において、対象は、イヌである。いくつかの実施形態において、対象は、モルモットである。いくつかの実施形態において、試料が対象から得られる前に、対象にＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターが投与された。

【0092】

当業者は、二次抗体が、対象によって産生される抗体に特異的に結合するべきであることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ヒト抗体である。同様に、いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗サル抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ブタ抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ラット抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗マウス抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ネコ抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗イヌ抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗モルモット抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ＩｇＭ抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ＩｇＥ抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ＩｇＡ抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧである。

【0093】

いくつかの実施形態において、固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。

【0094】

任意の抗ＡＡＶ抗体が、本明細書に開示される方法によって検出され得る。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１抗体、抗ＡＡＶ２抗体、抗ＡＡＶ３Ｂ抗体、抗ＡＡＶ３抗体、抗ＡＡＶ４抗体、抗ＡＡＶ５抗体、抗ＡＡＶ６抗体、抗ＡＡＶ７抗体、抗ＡＡＶ８抗体、抗ＡＡＶ９抗体、抗ＡＡＶ１０抗体、抗ＡＡＶ１１抗体、抗ＡＡＶｒｈ１０抗体、抗ＡＡＶｒｈ３９抗体、及び抗ＡＡＶｒｈ７４抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ３９カプシド、及びＡＡＶｒｈ７４カプシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６カプシドである。当業者は、ＡＡＶカプシドが、検出されている抗ＡＡＶ抗体に対応するべきであることを認識するであろう。

【0095】

本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、陰性対照は、事前にスクリーニングされた陰性試料である。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、陰性対照は、中和抗体アッセイにおいて陰性であった。例えば、図１Ａを参照されたい。

【0096】

本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、スクリーニングアッセイは、ＥＬＩＳＡである。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡは、以下のステップを含む。
１．１００μＬ／ウェルの希釈ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシド（１．５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬ）、４℃でＥＬＩＳＡプレートを一晩コーティングする
２．Ｔｗｅｅｎ２０を含む３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水でプレートを３回洗浄する。
３．２００μＬの試料緩衝液を全てのウェルに添加し、室温で２～３時間インキュベートする。
４．Ｔｗｅｅｎ２０を含む３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水でプレートを３回洗浄する。
５．１００μＬの試料を添加し、室温で２時間インキュベートする。
６．Ｔｗｅｅｎ２０を含む３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水でプレートを６回洗浄する。
７．１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、０．８ｍｇ／ｍｌ１：４０ｋ希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートする。
８．Ｔｗｅｅｎ２０を含む３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水でプレートを３回洗浄する。
９．１００μＬの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のを添加し、室温で１５分間インキュベートする。
１０．１００μＬの停止溶液を添加し、４５０／６５０ｎｍでプレートを読み取る。
いくつかの実施形態において、試料緩衝液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水中の０．５％ウシ血清アルブミンである。

【0097】

４．確認アッセイを用いた抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体の検出
本開示の第２の態様は、確認アッセイを使用して、対象における抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出する方法を提供する。

【0098】

いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）試験対象から得られた第１の試験試料及び第２の試験試料を提供することと、（ｂ）第２の試験試料を試験可溶性ＡＡＶカプシドと接触させることと、（ｃ）第１の試験試料を第１の試験固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第１の試験固定化ＡＡＶカプシドが、第１の試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｄ）第２の試験試料及び試験可溶性ＡＡＶカプシドの混合物を第２の試験固定化ＡＡＶカプシドと接触させることとであって、第２の試験固定化ＡＡＶカプシドが、第２の試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、（ｅ）第１の試験試料が接触した第１の試験固定化ＡＡＶカプシドを第１の試験二次抗体と接触させることであって、第１の試験二次抗体が第１の試験検出可能標識を含む、接触させることと、（ｆ）混合物が接触した第２の試験固定化ＡＡＶカプシドを第２の試験二次抗体と接触させることであって、第２の試験二次抗体が、第２の試験検出可能標識を含み、第２の試験二次抗体が、第１の試験二次抗体と同じであり、第１の試験検出可能標識が、第２の試験検出可能標識と同じである、接触させることと、（ｇ）第１及び第２の試験検出可能標識を検出することと、を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較してカットポイントパーセンテージ以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較してカットポイント未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ抗体を含まない。

【0099】

いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージは、（１）複数の参照対象から得られた第１及び第２の参照試料を提供することであって、参照対象のそれぞれが中和抗ＡＡＶ抗体アッセイに対して陰性であった、提供することと、（２）各参照対象について、第２の参照試料を参照可溶性ＡＡＶカプシドと接触させることと、（３）各参照対象について、第１の参照試料を、第１の参照固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第１の参照固定化ＡＡＶカプシドが、第１の参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、（４）各参照対象について、第２の参照試料及び参照可溶性ＡＡＶカプシドの混合物を第２の参照固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第２の参照固定化ＡＡＶカプシドが、第２の参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、（５）各参照対象について、第１の参照試料が接触した第１の固定化ＡＡＶカプシドを第１の二次抗体と接触させることであって、第１の二次抗体が第１の参照検出可能標識を含む、接触させることと、（６）各参照対象について、混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶカプシドを、第２の二次抗体と接触させることであって、第２の二次抗体が、第２の参照検出可能標識を含み、第２の二次抗体が、第１の二次抗体と同じであり、第１の参照検出可能標識が、第２の参照検出可能標識と同じである、接触させることと、（７）各参照対象について、第１及び第２の参照検出可能標識を検出することと、（８）外れ値参照試料を除去することと、（９）外れ値が除去された参照試料を使用してカットポイントパーセンテージを決定することと、を含む方法により決定される。

【0100】

いくつかの実施形態において、外れ値参照試料は、基準［Ｑ１－１．５＊（Ｑ３－Ｑ１），Ｑ３＋１．５＊（Ｑ３－Ｑ１）］を使用して除去される。いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージを決定するための事前にスクリーニングされた陰性対象の使用は、カットポイントパーセンテージを決定するための無作為な対象の使用と比較して、少なくとも１つ少ない外れ値除去のラウンドをもたらす。いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージは、９５％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいている（すなわち平均＋（１．６４５×ＳＤ）に等しい）。いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージは、９９％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいている（すなわち平均＋（２．３３×ＳＤ）に等しい）。いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージは、９５％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいている（すなわち中央値＋（１．６４５×（１．４８３×ＭＡＤ））に等しい）。いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージは、９９％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいている（すなわち中央値＋（２．３３×ＳＤ）に等しい）。いくつかの実施形態において、カットポイントパーセンテージは、非パラメトリック方法（すなわち９９パーセンタイル）に基づいている。

【0101】

いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体であり、試験可溶性ＡＡＶカプシドは、可溶性試験ＡＡＶ６カプシドであり、第１の試験固定化ＡＡＶカプシドは、第１の試験固定化ＡＡＶ６カプシドであり、第２の試験固定化ＡＡＶカプシドは、第２の試験固定化ＡＡＶ６カプシドである。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体であり、参照可溶性ＡＡＶカプシドは、可溶性参照ＡＡＶ６カプシドであり、第１の参照固定化ＡＡＶカプシドは、第１の参照固定化ＡＡＶ６カプシドであり、第２の参照固定化ＡＡＶカプシドは、第２の参照固定化ＡＡＶ６カプシドである。

【0102】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験試料は、それぞれ、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験試料は、それぞれ血清を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験試料は、それぞれ血漿を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験試料は、それぞれ唾液を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験試料は、それぞれ脳脊髄液を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験試料は、それぞれ眼液を含む。

【0103】

いくつかの実施形態において、各第１及び第２の参照試料は、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照試料は、それぞれ血清を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照試料は、それぞれ血漿を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照試料は、それぞれ唾液を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照試料は、それぞれ脳脊髄液を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照試料は、それぞれ眼液を含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｅ）の前に、第１の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｄ）の後及びステップ（ｆ）の前に、第２の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）の後及びステップ（ｇ）の前に、試料が接触した第１の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｆ）の後及びステップ（ｇ）の前に、混合物が接触した第２の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。洗浄緩衝液は、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでもよい。Ｔｗｅｅｎ２０は、ポリソルベート２０とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、洗浄は、３回繰り返される。いくつかの実施形態において、洗浄は、プレートウォッシャーを使用して行われる。いくつかの実施形態において、洗浄は、室温で行われる。

【0105】

いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（３）の後及びステップ（５）の前に、第１の参照固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（４）の後及びステップ（６）の前に、第２の参照固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（５）の後及びステップ（７）の前に、試料が接触した第１の参照固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（６）の後及びステップ（８）の前に、混合物が接触した第２の参照固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。洗浄緩衝液は、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでもよい。Ｔｗｅｅｎ２０は、ポリソルベート２０とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、洗浄は、３回繰り返される。いくつかの実施形態において、洗浄は、プレートウォッシャーを使用して行われる。いくつかの実施形態において、洗浄は、室温で行われる。

【0106】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、蛍光発生標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、染料である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、比色標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、放射性標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、発光標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、化学発光標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、磁性粒子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、金属粒子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、荷電粒子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、イオン溶液である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、胞子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験検出可能標識は、酵素標識である。

【0107】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、蛍光発生標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、染料である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、比色標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、放射性標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、発光標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、化学発光標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、磁性粒子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、金属粒子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、荷電粒子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、イオン溶液である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、胞子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照検出可能標識は、酵素標識である。

【0108】

【0109】

【0110】

当業者は、第１及び第２の試験二次抗体が、試験対象によって産生される抗体に特異的に結合するべきであることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ヒト抗体である。同様に、いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗サル抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ブタ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ラット抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗マウス抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ネコ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗イヌ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗モルモット抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ＩｇＭ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ＩｇＥ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ＩｇＡ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、同じである。

【0111】

当業者は、第１及び第２の参照二次抗体が、参照対象によって産生される抗体に特異的に結合するべきであることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ヒト抗体である。同様に、いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗サル抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ブタ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ラット抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗マウス抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ネコ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗イヌ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗モルモット抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ＩｇＭ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ＩｇＥ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ＩｇＡ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の参照二次抗体は、同じである。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験二次抗体は、第１及び第２の参照二次抗体と同じである。

【0112】

いくつかの実施形態において、第１の試験固体支持体は、培養プレートのウェルである。いくつかの実施形態において、第２の試験固体支持体は、培養プレートのウェルである。いくつかの実施形態において、第１の参照固体支持体は、培養プレートのウェルである。いくつかの実施形態において、第２の参照固体支持体は、培養プレートのウェルである。

【0113】

いくつかの実施形態において、第１の試験固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の試験固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態において、第１の第２の試験固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第２の試験固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態において、第１の参照固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の参照固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態において、第２の参照固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第２の参照固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。

【0114】

任意の抗ＡＡＶ抗体が、本明細書に開示される方法のいずれかによって検出され得る。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１抗体、抗ＡＡＶ２抗体、抗ＡＡＶ３Ｂ抗体、抗ＡＡＶ３抗体、抗ＡＡＶ４抗体、抗ＡＡＶ５抗体、抗ＡＡＶ６抗体、抗ＡＡＶ７抗体、抗ＡＡＶ８抗体、抗ＡＡＶ９抗体、抗ＡＡＶ１０抗体、抗ＡＡＶ１１抗体、抗ＡＡＶｒｈ１０抗体、抗ＡＡＶｒｈ３９抗体、及び抗ＡＡＶｒｈ７４抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体である。いくつかの実施形態において、第１の試験ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ３９カプシド、及びＡＡＶｒｈ７４カプシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の試験ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６カプシドである。当業者は、第１の試験ＡＡＶカプシドが、検出されている抗ＡＡＶ抗体に対応するべきであることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、第２の試験ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ３９カプシド、及びＡＡＶｒｈ７４カプシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の試験ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６カプシドである。当業者は、第２の試験ＡＡＶカプシドが、検出されている抗ＡＡＶ抗体に対応するべきであることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、第１の試験ＡＡＶカプシドは、第２の試験ＡＡＶカプシドと同じである。

【0115】

いくつかの実施形態において、第１の参照ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ３９カプシド、及びＡＡＶｒｈ７４カプシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の参照ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６カプシドである。いくつかの実施形態において、第２の参照ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ３９カプシド、及びＡＡＶｒｈ７４カプシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の参照ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６カプシドである。いくつかの実施形態において、第１の参照ＡＡＶカプシドは、第２の参照ＡＡＶカプシドと同じである。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試験ＡＡＶカプシドは、第１及び第２の参照ＡＡＶカプシドと同じである。

【0116】

いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約７．５Ｅ１０～１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約７．５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約８Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約９Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．０Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．１Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．２Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．３Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．４Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。

【0117】

いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、７．５Ｅ１０～１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、７．５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、８Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、９Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．０Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．１Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．２Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．３Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．４Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、試験可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。
いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約７．５Ｅ１０～１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約７．５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約８Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約９Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．０Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．１Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．２Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．３Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．４Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。

【0118】

いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、７．５Ｅ１０～１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、７．５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、８Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、９Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．０Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．１Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．２Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．３Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．４Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、参照可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。

【0119】

【0120】

いくつかの実施形態において、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して約２２％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して約２２％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して約２４％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して約２４％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して約２４．１％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して約２４．１％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。いくつかの実施形態において、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して約２４．５％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して約２４．５％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない。

【0121】

【0122】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料は、それぞれ、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む。第１の試料は、第２の試料と同じであってもよい。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料は、それぞれ血清を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料は、それぞれ血漿を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料は、それぞれ唾液を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料は、それぞれ脳脊髄液を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料は、それぞれ眼液を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料は、共通の試料から得られる。

【0123】

いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｅ）の前に、第１の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｄ）の後及びステップ（ｆ）の前に、第２の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）の後及びステップ（ｇ）の前に、試料が接触した第１の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｆ）の後及びステップ（ｇ）の前に、混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む。洗浄緩衝液は、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでもよい。いくつかの実施形態において、洗浄は、３回繰り返される。いくつかの実施形態において、洗浄は、プレートウォッシャーを使用して行われる。いくつかの実施形態において、洗浄は、室温で行われる。

【0124】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の検出可能標識は、第２の検出可能標識と同じである。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ西洋ワサビペルオキシダーゼである。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ蛍光標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ蛍光発生標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ染料である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ比色標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ放射性標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ発光標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ化学発光標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ磁性粒子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ金属粒子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ荷電粒子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれイオン溶液である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ胞子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ酵素標識である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能標識は、それぞれ、本明細書に列挙される検出可能標識のいずれかの組み合わせを含む。

【0125】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の固体支持体は、それぞれ培養プレートのウェルである。

【0126】

いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象は、サルである。いくつかの実施形態において、対象は、実験動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ブタである。いくつかの実施形態において、対象は、ラットである。いくつかの実施形態において、対象は、マウスである。いくつかの実施形態において、対象は、ネコである。いくつかの実施形態において、対象は、イヌである。いくつかの実施形態において、対象は、モルモットである。いくつかの実施形態において、第１及び第２の試料が対象から得られる前に、対象にＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターが投与された。

【0127】

当業者は、第１及び第２の二次抗体が、対象によって産生される抗体に特異的に結合するべきであることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗ＩｇＭ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗ＩｇＥ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗ＩｇＡ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗ＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗ヒトＩｇＧ抗体である。同様に、いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗サル抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗ブタ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗ラット抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗マウス抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗ネコ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗イヌ抗体である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の二次抗体は、それぞれ抗モルモット抗体である。

【0128】

いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約７．５Ｅ１０～１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約７．５Ｅ１０の濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約８Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約９Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．０Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．１Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．２Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．３Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．４Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、約１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。

【0129】

いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、７．５Ｅ１０～１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、７．５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、８Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、９Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．０Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．１Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．２Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．３Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．４Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である。

【0130】

いくつかの実施形態において、第１の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態において、第２の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第２の固定化ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドは、ポリヌクレオチドを含まない。

【0131】

いくつかの実施形態において、確認アッセイは、ＥＬＩＳＡである。いくつかの実施形態において、チャレンジＥＬＩＳＡは、以下のステップを含む。
１．１００μＬ／ウェルの希釈ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシド（１．５ｅ１０ｃｐ／ｍＬ）、４℃でＥＬＩＳＡプレートを一晩コーティングする
２．Ｔｗｅｅｎ２０を含む３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水でプレートを３回洗浄する。
３．２００μＬの試料緩衝液を全てのウェルに添加し、室温で２～３時間インキュベートする。
４．Ｔｗｅｅｎ２０を含む３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水でプレートを３回洗浄する。
５．対象から得られた２つの試料のうちの１つに、７．５ｅ１０ｃｐ／ｍｌの可溶性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）カプシドを添加する。
６．１００μＬの試料を添加し、室温で２時間インキュベートする。
７．Ｔｗｅｅｎ２０を含む３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水でプレートを６回洗浄する。
８．１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、０．８ｍｇ／ｍｌ１：４０ｋ希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートする。
９．Ｔｗｅｅｎ２０を含む３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水でプレートを３回洗浄する。
１０．１００μＬの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のを添加し、室温で１５分間インキュベートする。
１１．１００μＬの停止溶液を添加し、４５０／６５０ｎｍでプレートを読み取る。
いくつかの実施形態において、試料緩衝液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水中の０．５％ウシ血清アルブミンである。

【0132】

任意の抗ＡＡＶ抗体が、本明細書に開示される方法によって検出され得る。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１抗体、抗ＡＡＶ２抗体、抗ＡＡＶ３Ｂ抗体、抗ＡＡＶ３抗体、抗ＡＡＶ４抗体、抗ＡＡＶ５抗体、抗ＡＡＶ６抗体、抗ＡＡＶ７抗体、抗ＡＡＶ８抗体、抗ＡＡＶ９抗体、抗ＡＡＶ１０抗体、抗ＡＡＶ１１抗体、抗ＡＡＶｒｈ１０抗体、抗ＡＡＶｒｈ３９抗体、及び抗ＡＡＶｒｈ７４抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体である。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶカプシド、第１の固定化ＡＡＶカプシド、及び第２の固定化ＡＡＶカプシドは、それぞれ、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ３９カプシド、及びＡＡＶｒｈ７４カプシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、可溶性ＡＡＶカプシド、第１の固定化ＡＡＶカプシド、及び第２の固定化ＡＡＶカプシドは、それぞれＡＡＶ６カプシドである。当業者は、可溶性ＡＡＶカプシド、第１の固定化ＡＡＶカプシド、及び第２の固定化ＡＡＶカプシドが同じであるべきであり、検出されている抗ＡＡＶ抗体に対応するべきであることを認識するであろう。

【0133】

５．治療方法
本開示の第３の態様は、遺伝子療法を必要とする対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象を提供することと、対象が抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない場合にのみ、対象に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ、例えばｒＡＡＶ６）ベクターを投与することとを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、対象が抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない場合にのみ、対象に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ、例えばｒＡＡＶ６）ベクターを投与することを含む。任意のｒＡＡＶベクターは、本明細書に開示される方法に従って投与され得る。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ１ベクター、ｒＡＡＶ２ベクター、ｒＡＡＶ３Ｂベクター、ｒＡＡＶ３ベクター、ｒＡＡＶ４ベクター、ｒＡＡＶ５ベクター、ｒＡＡＶ６ベクター、ｒＡＡＶ７ベクター、ｒＡＡＶ８ベクター、ｒＡＡＶ９ベクター、ｒＡＡＶ１０ベクター、ｒＡＡＶ１１ベクター、ｒＡＡＶｒｈ１０ベクター、ｒＡＡＶｒｈ３９ベクター、及びｒＡＡＶｒｈ７４ベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ６ベクターである。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１抗体、抗ＡＡＶ２抗体、抗ＡＡＶ３Ｂ抗体、抗ＡＡＶ３抗体、抗ＡＡＶ４抗体、抗ＡＡＶ５抗体、抗ＡＡＶ６抗体、抗ＡＡＶ７抗体、抗ＡＡＶ８抗体、抗ＡＡＶ９抗体、抗ＡＡＶ１０抗体、抗ＡＡＶ１１抗体、抗ＡＡＶｒｈ１０抗体、抗ＡＡＶｒｈ３９抗体、及び抗ＡＡＶｒｈ７４抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６抗体である。当業者は、対象が、投与されているｒＡＡＶベクターに対応する抗ＡＡＶ抗体に対して陰性であるべきであることを認識するであろう。

【0134】

いくつかの実施形態において、対象における任意の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体は、本明細書に開示される全抗体アッセイ（例えば、スクリーニングアッセイ又は確認アッセイ）を使用して、抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出する方法のいずれかを用いて検出される。いくつかの実施形態において、対象における任意の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体は、本明細書に開示されるスクリーニングアッセイを使用して、抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出する方法のいずれかを用いて検出される。そのような実施形態において、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）ベクターは、スクリーニングアッセイの対象にのみ投与され、対象における抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出しない（例えば、スクリーニングの正規化された応答は、カットポイント係数未満である）。

【0135】

いくつかの実施形態において、対象における任意の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体は、本明細書に開示される確認アッセイを使用して、抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出する方法のいずれかを用いて検出される。そのような実施形態において、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）ベクターは、確認アッセイの対象にのみ投与され、対象における抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出しない（すなわち、確認アッセイにおけるパーセント阻害は、カットポイントパーセンテージ未満である）。

【0136】

いくつかの実施形態において、対象は、遺伝障害に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、神経障害に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）ベクターを投与される。いくつかの実施形態において、遺伝障害は、リソソーム蓄積症である。いくつかの実施形態において、障害は、血友病Ａ及びＢ、ファブリー病、鎌状赤血球症、ベータサラセミア、ムコ多糖症Ｉ及びＩＩ型、フェニルケトン尿症、グリコーゲン貯蔵病１ａ型、ＧＬＵＴ１欠乏症症候群、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａに罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ｂに罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、鎌状赤血球症に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、ベータサラセミアに罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、ムコ多糖症Ｉ型に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、ムコ多糖症ＩＩ型に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、フェニルケトン尿症に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、グリコーゲン貯蔵病１ａ型に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、ＧＬＵＴ１欠乏症症候群に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、ファブリー病に罹患している。

【0137】

いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象は、サルである。いくつかの実施形態において、対象は、実験動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ブタである。いくつかの実施形態において、対象は、ラットである。いくつかの実施形態において、対象は、マウスである。いくつかの実施形態において、対象は、ネコである。いくつかの実施形態において、対象は、イヌである。いくつかの実施形態において、対象は、モルモットである。いくつかの実施形態において、対象は、ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）ベクターを以前に受けていない。

【0138】

６．付番された実施形態
本開示の特定の実施形態は、以下の番号を付けた段落に示される。
Ａ１．試験対象における抗アデノ随伴ウイルス（抗ＡＡＶ）抗体を検出する方法であって、
（ａ）試験対象から得られた試験試料を提供することと、
（ｂ）試験試料を試験ＡＡＶカプシドと接触させることであって、試験ＡＡＶカプシドが、試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｃ）試験試料が接触した固定化試験ＡＡＶカプシドを試験二次抗体と接触させることであって、試験二次抗体が試験検出可能標識を含む、接触させることと、
（ｄ）試験検出可能標識を検出することと、
を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識がカットポイント係数以上である場合、試験対象は抗ＡＡＶ抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識がカットポイント係数未満である場合、試験対象は抗ＡＡＶ抗体を含まない、方法。
Ａ２．カットポイント係数が、
（１）複数の参照対象から得られた参照試料を提供することであって、参照対象のそれぞれが中和抗ＡＡＶ抗体アッセイに対して陰性であった、提供することと、
（２）各参照試料を参照ＡＡＶカプシドと接触させることであって、参照ＡＡＶカプシドが参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（３）各参照試料が接触した固定化参照ＡＡＶカプシドを参照二次抗体と接触させることであって、参照二次抗体が参照検出可能標識を含む、接触させることと、
（４）各参照試料について参照検出可能標識を検出することと、
（５）外れ値参照試料を除去することと、
（６）外れ値が除去された参照試料を使用してカットポイント係数を決定することと、を含む方法により決定される、実施形態Ａ１に記載の方法。
Ａ３．外れ値参照試料が、基準［Ｑ１－１．５＊（Ｑ３－Ｑ１），Ｑ３＋１．５＊（Ｑ３－Ｑ１）］を使用して除去される、実施形態Ａ２に記載の方法。
Ａ４．カットポイント係数が、９５％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいている、実施形態Ａ２又はＡ３に記載の方法。
Ａ５．カットポイント係数が、９５％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいている、実施形態Ａ２又はＡ３に記載の方法。
Ａ６．カットポイント係数が、非パラメトリック方法に基づいている、実施形態Ａ２又はＡ３に記載の方法。
Ａ７．抗ＡＡＶ抗体が、抗ＡＡＶ６抗体であり、ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ６カプシドである、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ８．試験試料が、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、実施形態Ａ１～Ａ７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ９．各参照試料が、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１０．ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に、固定化ＡＡＶカプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ａ１～Ａ９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１１．ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｄ）の前に、試料が接触した固定化ＡＡＶカプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ａ１～Ａ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１２．試験検出可能標識及び参照検出可能標識が、独立して、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ａ１～Ａ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１３．試験対象が、ヒトである、実施形態Ａ１～Ａ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１４．試料が試験対象から得られる前に、試験対象にＡＡＶベクターが投与された、実施形態Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１５．試験対象における抗アデノ随伴ウイルス（抗ＡＡＶ）抗体を検出する方法であって、
（ａ）試験対象から得られた第１の試験試料及び第２の試験試料を提供することと、
（ｂ）第２の試験試料を試験可溶性ＡＡＶカプシドと接触させることと、
（ｃ）第１の試験試料を第１の試験固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第１の試験固定化ＡＡＶカプシドが、第１の試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｄ）第２の試験試料及び可溶性試験ＡＡＶカプシドの混合物を第２の試験固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第２の試験固定化ＡＡＶカプシドが、第２の試験固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｅ）第１の試験試料が接触した第１の試験固定化ＡＡＶカプシドを第１の試験二次抗体と接触させることであって、第１の試験二次抗体が第１の試験検出可能標識を含む、接触させることと、
（ｆ）混合物が接触した第２の試験固定化ＡＡＶカプシドを第２の試験二次抗体と接触させることであって、第２の試験二次抗体が第２の試験検出可能標識を含み、第２の試験二次抗体が第１の二次抗体と同じであり、第１の試験検出可能標識が第２の試験検出可能標識と同じである、接触させることと、
（ｇ）第１及び第２の試験検出可能標識を検出することと、
を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較してカットポイントパーセンテージ以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較してカットポイント未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ抗体を含まない、方法。
Ａ１６．カットポイントが、
（１）複数の参照対象から得られた第１及び第２の参照試料を提供することであって、参照対象のそれぞれが中和抗ＡＡＶ抗体アッセイに対して陰性であった、提供することと、
（２）各参照対象について、第２の参照試料を参照可溶性ＡＡＶカプシドと接触させることと、
（３）各参照対象について、第１の参照試料を、第１の参照固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第１の参照固定化ＡＡＶカプシドが、第１の参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（４）各参照対象について、第２の参照試料及び参照可溶性ＡＡＶカプシドの混合物を第２の参照固定化ＡＡＶカプシドと接触させることであって、第２の参照固定化ＡＡＶカプシドが、第２の参照固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（５）各参照対象について、第１の参照試料が接触した第１の固定化ＡＡＶカプシドを第１の二次抗体と接触させることであって、第１の二次抗体が第１の参照検出可能標識を含む、接触させることと、
（６）各参照対象について、混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶカプシドを、第２の二次抗体と接触させることであって、第２の二次抗体が、第２の参照検出可能標識を含み、第２の二次抗体が、第１の二次抗体と同じであり、第１の参照検出可能標識が、第２の参照検出可能標識と同じである、接触させることと、
（７）各参照対象について、第１及び第２の参照検出可能標識を検出することと、
（８）外れ値参照試料を除去することと、
（９）外れ値が除去された参照試料を使用してカットポイントパーセンテージを決定することと、を含む方法により決定される、実施形態Ａ１５に記載の方法。
Ａ１７．外れ値参照試料が、基準［Ｑ１－１．５＊（Ｑ３－Ｑ１），Ｑ３＋１．５＊（Ｑ３－Ｑ１）］を使用して除去される、実施形態Ａ１６に記載の方法。
Ａ１８．カットポイントパーセンテージが、９９％信頼区間を有するパラメトリック方法に基づいている、実施形態Ａ１６又はＡ１７に記載の方法。
Ａ１９．カットポイントパーセンテージが、９９％信頼区間を有するロバストなパラメトリック方法に基づいている、実施形態Ａ１６又はＡ１７に記載の方法。
Ａ２０．カットポイントパーセンテージが、非パラメトリック方法に基づいている、実施形態Ａ１６又はＡ１７に記載の方法。
Ａ２１．抗ＡＡＶ抗体が、抗ＡＡＶ６抗体であり、可溶性ＡＡＶカプシドが、可溶性ＡＡＶ６カプシドであり、第１の固定化ＡＡＶカプシドが、第１の固定化ＡＡＶ６カプシドであり、第２の固定化ＡＡＶカプシドが、第２の固定化ＡＡＶ６カプシドである、実施形態Ａ１５～Ａ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２２．第１及び第２の試験試料が、それぞれ、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、実施形態Ａ１５～Ａ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２３．各第１及び第２の参照試料が、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、実施形態Ａ１５～Ａ２２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２４．ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｅ）の前に、第１の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ａ１５～Ａ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２５．ステップ（ｄ）の後及びステップ（ｆ）の前に、第２の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ａ１５～Ａ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２６．ステップ（ｅ）の後及びステップ（ｇ）の前に、試料が接触した第１の試験固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ａ１５～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２７．ステップ（ｆ）の後及びステップ（ｇ）の前に、混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ６カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ａ１５～Ａ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２８．第１及び第２の試験検出可能標識が、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ａ１５～Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２９．第１及び第２の参照検出可能標識が、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ａ１５～Ａ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３０．対象が、ヒトである、実施形態Ａ１５～Ａ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３１．試料が試験対象から得られる前に、試験対象にＡＡＶベクターが投与された、実施形態Ａ１５～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３２．試験可溶性ＡＡＶカプシドが、７．５Ｅ１０～１５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である、実施形態Ａ１５～Ａ３１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３３．遺伝子療法を必要とする試験対象を治療する方法であって、試験対象が抗ＡＡＶ抗体を含まない場合にのみ、試験対象に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、
試験対象における任意の抗ＡＡＶ抗体が、実施形態Ａ１～Ａ３２のいずれか１つに記載の方法によって検出される、方法。
Ａ３４．試験対象が、遺伝障害に罹患している、実施形態Ａ３３に記載の方法。
Ａ３５．試験対象が、神経障害に罹患している、実施形態Ａ３３に記載の方法。
Ａ３６．障害が、血友病Ａ及びＢ、ファブリー病、鎌状赤血球症、ベータサラセミア、ムコ多糖症Ｉ及びＩＩ型、フェニルケトン尿症、グリコーゲン貯蔵病１ａ型、ＧＬＵＴ１欠乏症症候群、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳからなる群から選択される、実施形態Ａ３４又はＡ３５に記載の方法。
Ａ３７．障害が、ファブリー病である、実施形態Ａ３６に記載の方法。
Ａ３８．試験対象が、以前にＡＡＶ６ベクターを投与されていなかった、実施形態Ａ３３～Ａ３７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１．対象における抗アデノ随伴ウイルス（抗ＡＡＶ；例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出する方法であって、
（ａ）対象から得られた試料を提供することと、
（ｂ）試料をＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドが、固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｃ）試料が接触した固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを二次抗体と接触させることであって、二次抗体が検出可能標識を含む、接触させることと、
（ｄ）標識を検出することと、
を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識が１．５以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識が１．５未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、方法。
Ｂ２．陰性対照に対する正規化応答が１．６以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．６未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３．陰性対照に対する正規化応答が１．７以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ４．陰性対照に対する正規化応答が１．７３以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７３未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５．陰性対照に対する正規化応答が１．７５以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７５未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ６．試料が、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７．ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に、固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ８．洗浄緩衝液が、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、実施形態Ｂ７に記載の方法。
Ｂ９．ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｄ）の前に、試料が接触した固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ１～Ｂ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１０．洗浄緩衝液が、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、実施形態Ｂ９に記載の方法。
Ｂ１１．検出可能標識が、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ｂ１～Ｂ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１２．検出可能標識が、比色標識である、実施形態Ｂ１１に記載の方法。
Ｂ１３．検出可能標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼである、実施形態Ｂ１２に記載の方法。
Ｂ１４．固体支持体が、培養プレートのウェルである、実施形態Ｂ１～Ｂ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１５．対象が、哺乳動物である、実施形態Ｂ１～Ｂ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１６．対象が、ヒトである、実施形態Ｂ１５に記載の方法。
Ｂ１７．二次抗体が、抗ヒトＩｇＧ抗体である、実施形態Ｂ１６に記載の方法。
Ｂ１８．試料が対象から得られる前に、対象にＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）ベクターが投与された、実施形態Ｂ１～Ｂ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１９．陰性対照が、事前にスクリーニングされた陰性試料である、実施形態Ｂ１～Ｂ１８に記載の方法。
Ｂ２０．陰性対照が、中和抗体アッセイで事前にスクリーニングされた、実施形態Ｂ１９に記載の方法。
Ｂ２１．対象における抗アデノ随伴ウイルス（抗ＡＡＶ；例えば抗ＡＡＶ６）抗体を検出する方法であって、
（ａ）対象から得られた第１の試料及び第２の試料を提供することと、
（ｂ）第２の試料を可溶性ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドと接触させることと、
（ｃ）第１の試料を第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドが、第１の固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｄ）第２の試料及び可溶性ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドの混合物を第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドが、第２の固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｅ）第１の試料が接触した第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを第１の二次抗体と接触させることであって、第１の二次抗体が第１の検出可能標識を含む、接触させることと、
（ｆ）混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを、第２の二次抗体と接触させることであって、第２の二次抗体が、第２の検出可能標識を含み、第２の二次抗体が、第１の二次抗体と同じであり、第２の検出可能標識が、第２の検出可能標識と同じである、接触させることと、
（ｇ）第１及び第２の標識を検出することと、
を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２０％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２０％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、方法。
Ｂ２２．検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２２％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２２％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ２１に記載の方法。
Ｂ２３．検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ２１に記載の方法。
Ｂ２４．検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．１％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．１％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ２１に記載の方法。
Ｂ２５．検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．５％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．５％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ２１に記載の方法。
Ｂ２６．第１及び第２の試料が、それぞれ、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、実施形態Ｂ２１～Ｂ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２７．ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｅ）の前に、第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ２１～Ｂ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２８．ステップ（ｄ）の後及びステップ（ｆ）の前に、第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ２１～Ｂ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２９．洗浄緩衝液が、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、実施形態Ｂ２７又はＢ２８に記載の方法。
Ｂ３０．ステップ（ｅ）の後及びステップ（ｇ）の前に、試料が接触した第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ２１～Ｂ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３１．ステップ（ｆ）の後及びステップ（ｇ）の前に、混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ２１～Ｂ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３２．洗浄緩衝液が、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、実施形態Ｂ３０又はＢ３１に記載の方法。
Ｂ３３．第１及び第２の検出可能標識が、それぞれ、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ｂ２１～Ｂ３２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３４．第１及び第２の検出可能標識が、それぞれ比色標識である、実施形態Ｂ３３に記載の方法。
Ｂ３５．第１及び第２の検出可能標識が、それぞれ西洋ワサビペルオキシダーゼである、実施形態Ｂ３４に記載の方法。
Ｂ３６．第１及び第２の固体支持体が、それぞれ培養プレートのウェルである、実施形態Ｂ２１～Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３７．対象が、哺乳動物である、実施形態Ｂ２１～Ｂ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３８．対象が、ヒトである、実施形態Ｂ３７に記載の方法。
Ｂ３９．二次抗体が、抗ヒトＩｇＧ抗体である、実施形態Ｂ３８に記載の方法。
Ｂ４０．試料が試料から得られる前に、対象にＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）ベクターが投与された、実施形態Ｂ２１～Ｂ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４１．可溶性ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドが、７．５Ｅ１０～１５Ｅ１０ｃｐ／ｍＬの濃度である、実施形態Ｂ２１～Ｂ４０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４２．遺伝子療法を必要とする対象を治療する方法であって、対象が抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない場合にのみ、対象に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ、例えばｒＡＡＶ６）ベクターを投与することを含み、
対象における任意の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体は、
（ａ）対象から得られた試料を提供することと、
（ｂ）試料をＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドが、固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｃ）試料が接触した固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを二次抗体と接触させることであって、二次抗体が検出可能標識を含む、接触させることと、
（ｄ）標識を検出することと、
を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識が１．５以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答で検出された標識が１．５未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、方法により検出される、治療する方法。
Ｂ４３．陰性対照に対する正規化応答が１．６以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．６未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ４２に記載の方法。
Ｂ４４．陰性対照に対する正規化応答が１．７以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ４２に記載の方法。
Ｂ４５．陰性対照に対する正規化応答が１．７３以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７３未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ４２に記載の方法。
Ｂ４６．陰性対照に対する正規化応答が１．７５以上である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、陰性対照に対する正規化応答が１．７５未満である場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ４２に記載の方法。
Ｂ４７．試料が、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、実施形態Ｂ４２～Ｂ４６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４８．ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に、固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ４２～Ｂ４７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４９．洗浄緩衝液が、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、実施形態Ｂ４８に記載の方法。
Ｂ５０．ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｄ）の前に、試料が接触した固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ４２～Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５１．洗浄緩衝液が、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、実施形態Ｂ５０に記載の方法。
Ｂ５２．検出可能標識が、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ｂ４２～Ｂ５１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５３．検出可能標識が、比色標識である、実施形態Ｂ５２に記載の方法。
Ｂ５４．検出可能標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼである、実施形態Ｂ５３に記載の方法。
Ｂ５５．固体支持体が、培養プレートのウェルである、実施形態Ｂ４２～Ｂ５４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５６．対象が、哺乳動物である、実施形態Ｂ４２～Ｂ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５７．対象が、ヒトである、実施形態Ｂ５６に記載の方法。
Ｂ５８．二次抗体が、抗ヒトＩｇＧ抗体である、実施形態Ｂ５７に記載の方法。
Ｂ５９．陰性対照が、所定の陰性試料である、実施形態Ｂ４２～Ｂ５８に記載の方法。
Ｂ６０．遺伝子療法を必要とする対象を治療する方法であって、対象が抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない場合にのみ、対象に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ、例えばｒＡＡＶ６）ベクターを投与することを含み、
対象における任意の抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体は、
（ａ）対象から得られた第１の試料及び第２の試料を提供することと、
（ｂ）第２の試料を可溶性ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドと接触させることと、
（ｃ）第１の試料を第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドが、第１の固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｄ）第２の試料及び可溶性ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドの混合物を第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドと接触させることであって、第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドが、第２の固体支持体上に固定されている、接触させることと、
（ｅ）第１の試料が接触した第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを第１の二次抗体と接触させることであって、第１の二次抗体が第１の検出可能標識を含む、接触させることと、
（ｆ）混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを、第２の二次抗体と接触させることであって、第２の二次抗体が、第２の検出可能標識を含み、第２の二次抗体が、第１の二次抗体と同じであり、第２の検出可能標識が、第２の検出可能標識と同じである、接触させることと、
（ｇ）第１及び第２の標識を検出することと、
を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２０％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２０％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、方法により検出される、治療する方法。
Ｂ６１．検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２２％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２２％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ６０に記載の方法。
Ｂ６２．検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ６０に記載の方法。
Ｂ６３．検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．１％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．１％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ６０に記載の方法。
Ｂ６４．検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．５％以上減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含み、検出された第２の標識の量が、検出された第１の標識の量と比較して２４．５％未満減少する場合、対象は抗ＡＡＶ（例えば抗ＡＡＶ６）抗体を含まない、実施形態Ｂ６０に記載の方法。
Ｂ６５．第１及び第２の試料が、それぞれ、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、及び眼液からなる群から選択される流体を含む、実施形態Ｂ６０～Ｂ６４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６６．ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｅ）の前に、第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ６０～Ｂ６５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６７．ステップ（ｄ）の後及びステップ（ｆ）の前に、第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ６０～Ｂ６６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６８．洗浄緩衝液が、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、実施形態Ｂ６６又はＢ６７に記載の方法。
Ｂ６９．ステップ（ｅ）の後及びステップ（ｇ）の前に、試料が接触した第１の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ６０～Ｂ６８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７０．ステップ（ｆ）の後及びステップ（ｇ）の前に、混合物が接触した第２の固定化ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドを洗浄緩衝液と接触させるステップを更に含む、実施形態Ｂ６０～Ｂ６９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７１．洗浄緩衝液が、１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、実施形態Ｂ６９又はＢ７０に記載の方法。
Ｂ７２．第１及び第２の検出可能標識が、それぞれ、蛍光標識、蛍光発生標識、染料、比色標識、放射性標識、発光標識、化学発光標識、磁性粒子、金属粒子、荷電粒子、イオン溶液、胞子及び酵素標識又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ｂ６０～Ｂ７１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７３．第１及び第２の検出可能標識が、それぞれ比色標識である、実施形態Ｂ７２に記載の方法。
Ｂ７４．第１及び第２の検出可能標識が、それぞれ西洋ワサビペルオキシダーゼである、実施形態Ｂ７３に記載の方法。
Ｂ７５．第１及び第２の固体支持体が、それぞれ培養プレートのウェルである、実施形態Ｂ６０～Ｂ７４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７６．対象が、哺乳動物である、実施形態Ｂ６０～Ｂ７５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７７．対象が、ヒトである、実施形態Ｂ７６に記載の方法。
Ｂ７８．二次抗体が、抗ヒトＩｇＧ抗体である、実施形態Ｂ７７に記載の方法。
Ｂ７９．可溶性ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ６）カプシドが、７．５Ｅ１０～１．５Ｅ１１ｃｐ／ｍＬの濃度である、実施形態Ｂ６０～Ｂ７８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ８０．対象が、遺伝障害に罹患している、実施形態Ｂ４２～Ｂ７９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ８１．対象が、神経障害に罹患している、実施形態Ｂ４２～Ｂ７９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ８２．障害が、血友病Ａ及びＢ、ファブリー病、鎌状赤血球症、ベータサラセミア、ムコ多糖症Ｉ及びＩＩ型、フェニルケトン尿症、グリコーゲン貯蔵病１ａ型、ＧＬＵＴ１欠乏症症候群、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳからなる群から選択される、実施形態Ｂ８０又はＢ８１に記載の方法。
Ｂ８３．障害が、ファブリー病である、実施形態Ｂ８２に記載の方法。
Ｂ８４．対象が、以前にＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ６）ベクターを投与されていなかった、実施形態Ｂ４２～Ｂ８３のいずれか１つに記載の方法。

【実施例】

【0139】

実施例１
中和抗体アッセイ
アッセイの感度及び選択性を更に増加させるために、ＡＡＶ６中和抗体（ＮＡｂ）活性アッセイを使用して、陰性対照（ＮＣ）試料を選択した。例えば、図１Ａを参照されたい。簡潔に述べると、試料血清の連続希釈液を、ルシフェラーゼ遺伝子を保有するＡＡＶ６ベースのレポーターベクターとともにインキュベートし、血清中の任意の中和抗体をレポーターベクターに結合させた。１時間後、試料を９６ウェルプレートに移し、＿ＨＴ１０８０＿細胞とともにインキュベートした。２２時間後、全てのウェルをマイクロプレートリーダー上で読み取り、ルシフェラーゼ発現を決定した。各血清希釈液の中和のパーセンテージを、陰性対照に正規化した後に計算した。各試料を重複して実行し、各プレートには、陽性対照（血清を含まないがＡＡＶ６ルシフェラーゼベクターを有するウェル）、陰性対照（細胞培養培地のみを有するウェル）、及び陰性対照試料血清が含まれた。

【0140】

スクリーニングアッセイ（ＯＤ＝０．１）中の低濃度の血清試料を陰性対照（ＮＣ）試料として選択した（図２）。

【0141】

実施例２
ヒト血清の抗ＡＡＶ６抗体のスクリーニングアッセイ
本明細書に記載の手順を使用して、ヒト血清中の抗ＡＡＶ６総抗体の存在を評価した。高結合容易洗浄マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３３６９）を、１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で希釈した１００μＬ／ウェルのＡＡＶ６カプシド（１．５ｅ１０ｃｐ／ｍＬ；Ｓａｎｇａｍｏ、ＲＥＣ－０００８４１－１３０１７８）でコーティングし、密封し、２～８℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを室温で最低１５分間インキュベートした後、プレートシーラントを除去し、プレートを３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。過剰な液体を除去した後、２００μＬ／ウェルのアッセイ希釈剤（洗浄緩衝液中の０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を添加してプレートをブロックし、プレートをプレートシーラーでカバーし、２～３時間穏やかに攪拌しながら室温でインキュベートした。プレートシーラントを除去した後、プレートを３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄し、過剰な液体を除去した。

【0142】

プレートを最低２時間ブロックした後、陰性対照（プールした血清、Ｓａｎｇａｍｏ、１６５０－２８）、陽性力価対照の連続希釈液（陰性対照血清中の陽性源抗体５００μｇ／ｍＬ、Ｓａｎｇａｍｏ１７３２－５）、及び血清試験試料を含む１００μＬ／ウェルの対照をプレートに加えた。プレートをカバーし、穏やかに攪拌しながら室温で２時間±１０分間インキュベートした。プレートシーラントを除去した後、プレートを洗浄緩衝液で３００μＬ／ウェルで６回洗浄し、過剰な液体を除去した。抗ＡＡＶ６抗体を検出するために、１００μＬ／ウェルの希釈抗ヒトＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート検出抗体（１：４０，０００）を添加した。次いで、プレートをプレートシーラーでカバーし、攪拌しながら室温で１時間±５分間インキュベートした。プレートを３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回洗浄し、過剰な液体を除去した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）２部キット（ＫＰＬ、キット番号５０－７６－００、Ａ：５１２０－００４９、Ｂ：５１２０－００３８）を使用して吸光度プレートリーダーでＨＲＰの存在を検出したが、ここで等しい部の溶液Ａ（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質）及び溶液Ｂ（ペルオキシダーゼ溶液Ｂ）を組み合わせ、組み合わせた溶液１００μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレートを攪拌しながら室温で１５分±２分間インキュベートして発色させ、１００μＬ／ウェルの停止溶液（１ＭＨ_３ＰＯ_４；Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ、カタログ番号ＳＬＴＰ－１０００－０１）を添加して色反応を終了させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＩ３Ｘプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて、プレートを４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの波長で読み取った。
全ての試料を以下のようにＮＣに正規化した。

【数3】

【0143】

実施例３
確認アッセイ
対象試料中の抗ＡＡＶ６抗体の特異性を確認するために、確認アッセイを行った。簡潔に述べると、血清試料を可溶性ＡＡＶ６カプシド（７．５ｅ１０ｃｐ／ｍＬ又は１．５ｅ１１ｃｐ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で試験したことを除いて、実施例２に記載のＥＬＩＳＡアッセイを行った。阻害パーセントは以下のように計算した。

【数4】

【0144】

実施例４
無作為な試料を使用したカットポイントの決定
抗ＡＡＶ６抗体に対する健康なドナーにおける高い血清陽性率によって、陽性の場合と陰性の場合との明確な分離が可能ではない。更に、これらの試料からのスクリーニングアッセイデータは、正規分布しておらず、カットポイント係数（ＣＰＦ）に影響を及ぼし得る数ラウンドの外れ値除去を必要とする。実施例２のＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ及び実施例３の確認アッセイを、１０２個の無作為な健常試料を使用して行った。中和抗体アッセイを使用してスクリーニングした場合（事前に０．３、すなわち（３０％活性）であると決定されたＣＰ；０．３以下のＮＲを有する試料は陽性であり、０．３を超えるＮＲを有する試料は陰性である）、５８個の試料は陰性であり、４４個の試料は陽性であった。ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイからの正規化応答を、ＪＭＰｖ１３（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して箱ひげプロットでグラフ化し、分位数（Ｑ）１及び３に基づいて外れ値を決定した（図３Ａ）。外れ値は、以下の基準を使用して除去した。
［Ｑ１－１．５＊（Ｑ３－Ｑ１），Ｑ３＋１．５＊（Ｑ３－Ｑ１）］

【0145】

上述のスクリーニングアッセイのためのボックスプロットを使用した３ラウンドの外れ値除去の後、最終カットポイント計算に７０個の試料を使用した。ログ変換後、ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイの５％の偽陽性率（ＦＰＲ）及び確認アッセイの１％のＦＰＲを有するカットポイント係数（ＣＰＦ）のパラメトリック計算は、以下のとおりであった（図３Ｂを参照されたい）：
ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ＝平均＋１．６４５ＸＳＤ（５％ＦＰＲ））
チャレンジアッセイ＝平均＋２．３３ＸＳＤ（１％ＦＰＲ）
ランダム試料について、ＣＰＦは、ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイでは２．６であると決定され（図４Ａ）、ＣＰＰは、確認アッセイでは４３．１％阻害であると決定された（図４Ｂ）。カットポイント以上の値を有する試料は陽性であり、カットポイント未満の値を有する試料は陰性であった。

【0146】

実施例５
事前にスクリーニングされた陰性試料を使用したカットポイントの決定
ＮＡｂアッセイ（ＣＰ＝０．３）を使用して試料を事前にスクリーニングして、陰性試料を特定した。実施例２のＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ及び実施例３の確認アッセイを、１０４個の事前にスクリーニングされた陰性試料を使用して行った。実施例４に記載のように、ＪＭＰｖ１３を使用して外れ値を除去し、ログ変換を行ったが、ここで、ボックスプロットを使用して１ラウンドの外れ値除去がスクリーニングアッセイに行われ、１ラウンドが確認アッセイに行われ、したがって最終ＣＰ計算に９９個の試料を使用した。３ラウンドの外れ値除去を利用し、３２個の外れ値を除去した実施例４の無作為な試料と比較して、事前にスクリーニングされた試料の使用は、より良いデータセットをもたらし、これは１ラウンドの外れ値除去のみを利用し、５個の外れ値を除去した。実際に、実施例４の無作為な試料からの３ラウンドの外れ値除去後であっても、分布は正規ではなかった。図４Ａを参照されたい。対照的に、事前にスクリーニングされた試料を用いた１ラウンドの外れ値除去は、正規分布を提供した。事前にスクリーニングされた陰性試料を使用したＣＰＦ及びＣＰＰを、実施例４に示すように計算した。スクリーニングアッセイにおける事前にスクリーニングされた陰性試料のＣＰＦ（５％ＦＰＲ）は１．７５であり、確認アッセイにおける事前にスクリーニングされた陰性試料のＣＰＰ（１％ＦＰＲ）は２４．１％であった（図５）。

【0147】

実施例２のＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ及び実施例３の確認アッセイを、追加の２１１個の事前にスクリーニングされた陰性試料を使用して繰り返した。反復実験では、スクリーニングアッセイにおける事前にスクリーニングされた陰性試料のＣＰＦ（５％ＦＰＲ）は１．７３であり、確認アッセイにおける事前にスクリーニングされた陰性試料のＣＰＰ（１％ＦＰＲ）は２４．５％であった。

【0148】

実施例６
アッセイ感度の決定
精製された陽性対照抗ＡＡＶ６抗体を生成するために、実施例１の中和抗体アッセイを用いて抗ＡＡＶ６抗体に対して陽性として予めスクリーニングした６３個の個々の血清試料を、実施例２に記載のように、ＥＬＩＳＡによって抗ＡＡＶ６抗体についてスクリーニングした（図５Ａ及びＢを参照されたい）。これらの６３個のうち、最も高い光学密度（ＯＤ）を有する５個を選択し、陽性対照（ＰＣ）－１－５として標識し、滴定した（図６Ａ）。滴定曲線上の全ての濃度にわたって最も高いシグナルを有する試料、ＰＣ－２（図６Ｂ）を、タンパク質Ａ／Ｇスピンキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、８９９５０）を使用した全ＩｇＧの精製及びＡＡＶ６磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＮＨＳ活性化磁気ビーズ；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、８８８２７）を使用したＡＡＶ６特異的抗体の親和性精製に選択した。アッセイ感度を評価するために、実施例２のＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ及び実施例３の確認アッセイ（図７Ａ）を使用して、総ＩｇＧ抗体対照及び親和性精製抗ＡＡＶ６抗体の連続希釈液を評価した。親和性精製抗ＡＡＶ６抗体は、総ＩｇＧ抗体対照と比較して、感度を６４倍超向上させた（図７Ｂ）。例えば、実施例２のＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイにおけるＣＰＦでの抗体濃度は、全ＩｇＧ抗体対照では１５．４μｇ／ｍｌであったが、親和性精製抗ＡＡＶ６対照では０．２４μｇ／ｍｌのみであった。同様に、実施例３の確認アッセイにおけるＣＰＰでの抗体濃度は、総ＩｇＧ抗体対照では５．８５μｇ／ｍｌであったが、親和性精製抗ＡＡＶ６対照では０．０７３μｇ／ｍｌであった。

【0149】

実施例７
アッセイ特異性の確認
この最適化されたＣＰＦの有効性を決定するために、実施例１の中和抗体アッセイ（ＣＰ＝０．３）及び実施例２のＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイを使用して１００個の試料を評価した。中和抗体アッセイの結果（ＣＰＦ＝０．３、すなわち３０％正規化ＲＬＵ）を、無作為な健常試料から決定したＣＰＦを用いたＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイの結果（ＣＰＦ＝２．６）、事前にスクリーニングされた陰性試料を用いて決定したＣＰＦを用いたＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイの結果（ＣＰＦ＝１．７３）、及び（図８Ａ～８Ｃを参照されたい）と比較した。ＣＰＦ＝２．６（無作為な健常対象）を用いて評価した場合、ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイにより、８つの偽陰性が得られた（図８Ａ、左下の象限）。ＣＰＦ＝１．７５（事前にスクリーニングされた陰性対象）を使用すると、ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ結果は、中和抗体アッセイ結果とより良好に相関し、偽陰性結果は排除された（図８Ｂ、左下の象限）。同様に、ＣＰＰ＝２４．１％阻害（事前にスクリーニングされた陰性対象）を使用すると、確認アッセイ結果は、ほぼ完全に中和抗体アッセイ結果と相関し、偽陰性結果は見られなかった（図８Ｃ）。

【0150】

更に、実施例２のＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ及び実施例３の確認アッセイを、実施例６で精製された陽性対照抗体の存在下及び非存在下で、実施例１の中和抗体アッセイに対して事前に陰性としてスクリーニングされた試料を使用して行った。具体的には、２０μｇ／ｍＬ又は４０μｇ／ｍＬの陽性対照抗体を、１０個の陰性の個々の血清試料に添加した（図９Ａ及び９Ｂを参照されたい）。ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイでは、ＣＰＦ＝１．７３を使用すると、陽性対照抗体を欠く全ての試料は陰性であり、陽性対照抗体でスパイクされた全ての試料は陽性であった（図９Ａ）。同様に、確認アッセイでは、ＣＰ＝２４．１％阻害を使用すると、陽性対照を欠く全ての試料は陰性であり、陽性対照でスパイクされた全ての試料は陽性であった（図９Ｂ）。これらの結果は、抗ＡＡＶ６抗体の検出のための、ＣＰＦ及びＣＰＰそれぞれの特異性を裏付けている。

【0151】

上記の実施例は、本発明の方法の実施形態を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に与えるために提供され、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。当業者に明らかである、本開示を実施するための上述の形態の修正は、本開示の範囲内であることが意図される。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関連する当業者の技術レベルを示す。本明細書で引用される全ての参考文献は、各参考文献が参照によりその全体が個別に組み込まれた場合と同じ程度に、参照により組み込まれる。

【0152】

全ての見出し及びセクションの指定は、明確化及び参照の目的でのみ使用されており、決して限定的であるとみなされるべきではない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の本開示の趣旨及び範囲に従って、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。

【0153】

本開示の多くの修正及び変形は、当業者に明らかであるように、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態及び実施例は、例としてのみ提供される。

【図1】