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特表2023-544795抗原特異的Ｔ細胞応答を活性化するための多細胞コンジュゲート
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-25
(54)【発明の名称】抗原特異的Ｔ細胞応答を活性化するための多細胞コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20231018BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20231018BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20231018BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231018BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231018BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231018BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231018BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20231018BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20231018BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20231018BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20231018BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231018BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
C12N5/0784
A61K35/15
A61K35/17
A61P37/04
A61P43/00 121
A61P35/00
A61P31/00
A61P31/04
A61P31/12
A61P31/10
A61K45/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521292
(86)(22)【出願日】2021-10-06
(85)【翻訳文提出日】2023-06-05
(86)【国際出願番号】 US2021053805
(87)【国際公開番号】W WO2022076585
(87)【国際公開日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】63/088,056
(32)【優先日】2020-10-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591013274
【氏名又は名称】ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100162422
【弁理士】
【氏名又は名称】志村 将
(72)【発明者】
【氏名】ガンパーズ ジェニー エレン
(72)【発明者】
【氏名】バイウ ダナ カリナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA94X
4B065BA30
4B065CA43
4B065CA44
4C084AA22
4C084NA05
4C084ZB072
4C084ZB091
4C084ZB321
4C084ZB331
4C084ZB351
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087MA02
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB32
4C087ZB33
4C087ZB35
(57)【要約】
本発明は、ｉＮＫＴ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）を含むインビトロ誘導多細胞コンジュゲートを提供する。本発明はまた、多細胞コンジュゲートを作製する方法及び多細胞コンジュゲート及びそれを含む組成物を使用して、抗原に関連する１種又は複数の状態を治療する方法、又は免疫応答を活性化する方法を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞と樹状細胞（ＤＣ）との間の安定なインビトロ誘導多細胞コンジュゲート。
【請求項2】
前記コンジュゲートが、培養物中で少なくとも３０分間維持される、請求項１に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項3】
前記コンジュゲートが、培養物中で少なくとも２４時間維持される、請求項１に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項4】
前記コンジュゲート内の前記ｉＮＫＴ細胞が、適切に再配置されたＴＣＲを発現する、請求項１～３のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項5】
前記コンジュゲート中のｉＮＫＴが、ＣＤ４及びＣＤ３からなる群より選択される１種又は複数のマーカーを発現する、請求項４に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項6】
前記コンジュゲートが、培養物中で少なくとも９６時間維持される、請求項１～５のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項7】
前記ＤＣが、主要組織適合抗原分子Ｉ又はＩＩ（ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩ）を発現する、請求項１～６のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項8】
前記ＤＣが、前記ｉＮＫＴ細胞に対して同種である、請求項１～７のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項9】
前記ＤＣが、前記ｉＮＫＴ細胞に対して自家である、請求項１～８のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項10】
前記多細胞コンジュゲートが、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＮＦγ又はそれらの両方を培地中に分泌する、請求項１～９のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項11】
前記ＤＣ細胞が、その表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ１３７Ｌ（４１ＢＢＬ）、ＣＤ２１５（ＩＬ－１５Ｒα）及びこれらの組み合わせから選択される１種又は複数の分子を発現する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項12】
前記コンジュゲート内のＤＣが、インビトロで少なくとも２４時間にわたり１種又は複数の共刺激分子を発現する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項13】
前記ｉＮＫＴ細胞が、その表面上に、コンジュゲート化後に、好ましくは少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも９６時間にわたり、ＣＤ７０を発現する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項14】
前記多細胞コンジュゲートが、コンジュゲート当り２つ又は３つの細胞を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項15】
前記ＤＣが、抗原をロードされている、請求項１～１４のいずれか１項に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項16】
前記抗原が、腫瘍抗原、病原性抗原及び超抗原から選択される、請求項１５に記載の安定な多細胞コンジュゲート。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の多細胞コンジュゲート及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項18】
インバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫ）Ｔ細胞と樹状細胞（ＤＣ）との間の多細胞コンジュゲートを産生する方法であって、ｉＮＫＴ細胞とＤＣを、安定な多細胞コンジュゲートを形成するのに十分な時間にわたり共培養することを含む、方法。
【請求項19】
ｉＮＫＴ細胞及びＤＣが、１：１～約５：１のｉＮＫＴ：ＤＣの比率で共培養される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ＤＣを、共培養の前に、脂質付加されたヒト血清アルブミン又は１種又は複数のサイトカインと接触させて、前記接触が、前記ＤＣのＤＣ－ｉＮＫＴコンジュゲートをインビトロ培養で形成する能力を高める、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項21】
前記樹状細胞が、（ｉ）単球を、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を含む培地中で、前記単球をＤＣに分化させるのに十分な時間にわたり培養すること
を含む方法により単球から得られる、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記単球を、少なくとも２日間にわたり，（ｉ）中で培養する、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記方法が、（ｉｉ）分化の前に、前記単球を対象の血液試料から単離すること、又は
（ｉｉｉ）前記単球を対象の組織から単離すること、
を更に含む、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
ステップ（ｉｉｉ）が、骨髄から単球を単離することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記単球がドナー対象由来である、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記ＤＣが、（ｉ）ＣＤ３４+造血前駆細胞を、骨髄試料、Ｇ－ＣＳＦ動員末梢血、又は他の組織から、インビトロでＤＣへ分化させること；又は
（ｉｉ）誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をＤＣヘ分化させること、
により生成される、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記ＤＣが、ａ）ＣＤ３４+造血前駆細胞又は誘導多能性幹細胞からＣＤ１ａ-／ＣＤ１４+単球へ、培養により分化させること；
ｂ）ステップ（ａ）のＣＤ１ａ-／ＣＤ１４+単球を単離すること；及び
ｃ）ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を含む培地中で、十分な時間にわたり培養することにより、前記単離した単球をＤＣへ分化させること、
により生成され、増加したＣＤ２０９及び減少したＣＤ１４を示すＤＣが産生される、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
（ａ）前記ｉＰＳＣが、必要としている前記対象から同種である；（ｂ）前記ｉＰＳＣが、限られたＭＨＣ分子を発現するように遺伝子改変される；
（ｃ）前記ｉＰＳＣが、治療される前記対象に適合するＭＨＣ分子を発現する；又は
（ｄ）（ａ）～（ｃ）の組み合わせである、
請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項29】
（ａ）前記ｉＮＫＴ細胞との共培養の前に、前記ＤＣを培養により抗原と接触させること、（ｂ）前記ＤＣを抗原と同時に接触させて、前記ｉＮＫＴ細胞と共培養すること；又は
（ｃ）前記ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートを、コンジュゲート形成後に前記抗原と接触させること、
を更に含む、請求項１８～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記抗原が、腫瘍抗原、病原性抗原及び超抗原から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記方法が、対象から前記ｉＮＫＴ細胞を取得することを更に含む、請求項１８～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記ｉＮＫＴ細胞が、誘導多能性幹細胞から分化される、請求項１８～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記ｉＮＫＴ細胞を取得する方法が、（ａ）（ｉ）末梢血単核球、（ｉｉ）骨髄、又は（ｉｉｉ）リンパ球を含むドナー由来の組織、由来のＣＤ１ｄ四量体+ＣＤ４+ＣＤ３+ｉＮＫＴ細胞を選別すること；及び
（ｂ）前記選別したＣＤ１ｄ四量体+ＣＤ４+ＣＤ３+ｉＮＫＴ細胞を培養により増幅すること、
を含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項34】
前記方法が、前記ステップ（ａ）の選別ステップの前に、対象の血液試料から末梢血単核球を単離すること、を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記方法が、血液試料を遠心処理して、前記末梢血単核球を得ることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
ステップ（ｂ）が、前記選別されたｉＮＫＴ細胞を、コンジュゲート化の前に、培養によりｉＮＫＴ細胞を増殖するための有効量で１種又は複数の刺激剤と共に培養することを含む、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記ＤＣが、前記ｉＮＫＴ細胞に対し同種である、請求項１８～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記方法が、（ａ）ｉＮＫＴ細胞を取得すること；
（ｂ）前記ｉＮＫＴ細胞を培養により増幅すること；
（ｃ）前記増幅されたｉＮＫＴ細胞を貯蔵のために凍結すること；及び
（ｄ）その後に、ＤＣとの共培養の前に、前記凍結したｉＮＫＴ細胞を解凍すること、
を含む、請求項１８～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記ｉＮＫＴ細胞が、（ｉ）ドナー対象から単離すること；又は
（ｉｉ）誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させること、
により得られる、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記方法が、前記培養物から前記多細胞コンジュゲートを選択すること、
を含む、請求項１８～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
抗原に関連する状態の対象を治療する方法であって、有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の多細胞コンジュゲート又は請求項１７に記載の組成物を投与して、前記状態を治療することを含む、方法。
【請求項42】
前記多細胞コンジュゲート中のＤＣが、前記対象への投与の前に、抗原又はそのフラグメントをロードされる、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記多細胞コンジュゲート中のＤＣが、抗原に関連する前記状態の対象から得られる、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項44】
前記状態ががんであり、前記抗原が腫瘍抗原である、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記多細胞コンジュゲートが、がんの対象から得られたＤＣを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記多細胞コンジュゲートが、腫瘍抗原又はそのフラグメントをロードされたＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩを発現するＤＣを含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項47】
前記方法が、前記対象にチェックポイント阻害剤を投与することを更に含む、請求項４１～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記状態が病原体感染症であり、前記多細胞コンジュゲートが少なくとも１種の病原体抗原又はそのフラグメントをロードされたＤＣを含む、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
前記病原体が細菌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記病原体がウィルスである、請求項４８に記載の方法。
【請求項51】
前記病原体が真菌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項52】
前記多細胞コンジュゲートが、インビボで前記対象内の免疫原性部位に移動できる、請求項４１～５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
Ｔ細胞の活性化を必要としている対象においてＴ細胞の活性化をするための方法であって、有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の多細胞コンジュゲート又は請求１７に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、Ｔ細胞を活性化する、方法。
【請求項54】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８+Ｔ細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
対象内の抗原に対する免疫応答を活性化する方法であって、有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の多細胞コンジュゲート又は請求項１７に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、前記対象中の前記抗原に対して免疫応答を活性化する、方法。
【請求項56】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記免疫応答が、ＣＤ４+Ｔ細胞応答である、請求項５５又は５６に記載の方法。
【請求項58】
前記免疫応答が、ＣＤ８+Ｔ細胞応答である、請求項５５又は５６に記載の方法。
【請求項59】
前記免疫応答が、前記対象内の１種又は複数のサイトカインの増大を更に含む、請求項５５～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の多細胞コンジュゲートと、抗原に関連する疾患又は状態の治療に使用するための、又は対象の免疫応答を活性化するための説明書とを含むキット。
【請求項61】
前記多細胞コンジュゲート内の前記ｉＮＫＴ細胞及び前記ＤＣが、相互に同種である、請求項６０に記載のキット。
【請求項62】
がんを治療するためのものである、請求項６１又は６２に記載のキット。
【請求項63】
チェックポイント阻害剤を更に含む、請求項６２に記載のキット。
【請求項64】
前記ｉＮＫＴ細胞、前記ＤＣ又は両方が、前記状態の治療を必要としている対象に対し同種である、請求項６１～６３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項65】
凍結ｉＮＫＴ細胞と、多細胞コンジュゲートを産生するための説明書とを含むキット。
【請求項66】
前記ｉＮＫＴ細胞を培養により増殖させるための培地及び１種又は複数の刺激因子を更に含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項67】
抗原を更に含む、請求項６５又は６６に記載のキット。
【請求項68】
前記説明書が、対象から単球を単離する方法及び前記単球をＤＣに分化させる方法を提供する、請求項６１～６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項69】
凍結された改変ＤＣ集団を更に含み、好ましくは、前記ＤＣが限られたＨＬＡ分子を発現するように改変されている、請求項６５～６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項70】
単球及び／又はＤＣの単離に使用するための１種又は複数の抗体を更に含む、請求項６８又は６９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２０年１０月６日出願の米国特許仮出願第６３／０８８，０５６号に対する優先権を主張する。この仮出願特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府支援研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により認可された研究助成金番号第ＡＩ１３６５００号に基づく政府の支援により行われた。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
本出願は、２０２０年１０月６日出願の米国特許仮出願第６３／０８８，０５６号に対する優先権を主張する。この仮出願特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府支援研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により認可された研究助成金番号第ＡＩ１３６５００号に基づく政府の支援により行われた。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【背景技術】
【0002】
がん及び慢性ウィルス感染症を含む多くの疾患では、免疫系は、抗原特異的Ｔリンパ球が抑制されるためにその疾患を除去できない。現在の臨床的免疫療法は、チェックポイント阻害を用いて抑制経路を遮断すること、又はがん細胞を直接死滅させるために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）細胞などの遺伝子改変細胞溶解性エフェクター細胞を送達することに注力している。ＣＡＲ－Ｔ治療は、患者の細胞を回収し、遺伝子改変し、２～３週間培養して十分な量を生成する必要があるので、煩雑で、時間のかかる治療である。チェックポイント阻害剤療法は、臨床試験でまちまちの結果を示し、更に、抗原特異的ではない。
従って、当該技術分野において、単純、迅速で、効果的な免疫療法に対するニーズは根強くある。
従って、当該技術分野において、単純、迅速で、効果的な免疫療法に対するニーズは根強くある。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞と樹状細胞（ＤＣ）との間のインビトロ培養多細胞コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を提供する。コンジュゲートは、培養により約３０分後に形成され、培養物中で少なくとも２４時間（１日間）、好ましくは少なくとも４８時間（２日間）、より好ましくは少なくとも９６時間（４日間）維持される。
【0004】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の多細胞コンジュゲート及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、インバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫ）Ｔ細胞と、樹状細胞（ＤＣ）との間の多細胞コンジュゲートを産生する方法を提供し、該方法は、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣを十分な時間にわたり共培養して安定な多細胞コンジュゲートを形成することを含む。
さらなる態様では、本開示は、抗原に関連する状態の対象を治療する方法を提供し、該方法は、有効量の本明細書で記載の多細胞コンジュゲート又は組成物を投与することを含む。
別の態様では、本開示は、本明細書で記載の多細胞コンジュゲート及び抗原に関連する疾患又は状態の治療に使用するための説明書を含むキットを提供する。
さらなる態様では、本開示は、凍結ｉＮＫＴ細胞及び多細胞コンジュゲートを産生する説明書を含むキットを提供する。
別の態様では、本開示は、インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞と樹状細胞（ＤＣ）との間の安定なインビトロ誘導（ｉｎ ｖｉｔｒо‐ｄｅｒｉｖｅｄ）多細胞コンジュゲートを提供し、好ましくは、コンジュゲートは、培養物中で少なくとも３０分間維持される。
別の態様では、本開示は、インバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫ）Ｔ細胞と、樹状細胞（ＤＣ）との間の多細胞コンジュゲートを産生する方法を提供し、該方法は、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣを十分な時間にわたり共培養して安定な多細胞コンジュゲートを形成することを含む。
さらなる態様では、本開示は、抗原に関連する状態の対象を治療する方法を提供し、該方法は、有効量の本明細書で記載の多細胞コンジュゲート又は組成物を投与することを含む。
別の態様では、本開示は、本明細書で記載の多細胞コンジュゲート及び抗原に関連する疾患又は状態の治療に使用するための説明書を含むキットを提供する。
さらなる態様では、本開示は、凍結ｉＮＫＴ細胞及び多細胞コンジュゲートを産生する説明書を含むキットを提供する。
別の態様では、本開示は、インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞と樹状細胞（ＤＣ）との間の安定なインビトロ誘導（ｉｎ ｖｉｔｒо‐ｄｅｒｉｖｅｄ）多細胞コンジュゲートを提供し、好ましくは、コンジュゲートは、培養物中で少なくとも３０分間維持される。
【0005】
さらなる態様では、Ｔ細胞の活性化を必要としている対象に、その方法を提供し、該方法は、有効量の本明細書で記載の多細胞コンジュゲート又は組成物を対象に投与することを含み、Ｔ細胞が活性化される。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８+Ｔ細胞である。
別の態様において、本開示は対象内の抗原に対する免疫応答を活性化する方法を提供し、概方法は、有効量の本明細書で記載の多細胞コンジュゲート又は組成物を対象に投与することを含み、対象の抗原に対する免疫応答が活性化される。
他の実施形態及び態様は、本明細書で記載される。
別の態様において、本開示は対象内の抗原に対する免疫応答を活性化する方法を提供し、概方法は、有効量の本明細書で記載の多細胞コンジュゲート又は組成物を対象に投与することを含み、対象の抗原に対する免疫応答が活性化される。
他の実施形態及び態様は、本明細書で記載される。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1A】ｉＮＫＴ細胞とＤＣの組み合わせは、ヒトＴ細胞の抗原依存性活性化を促進する。末梢血試料を健康な成人対象から採取した。単離単球をインビトロ培養し、実施例に記載のようにＤＣをインビトロで産生した。ＤＣに対して自家であるＴ細胞を同じ試料から単離した。ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞を実施例に示すように生成し、これは、通常、ＤＣに対し同種であるドナーから産生した。ＤＣを、１：１の比率のｉＮＫＴ細胞と同時インキュベートしてコンジュゲートの形成を可能としたか、又は単独で培養した。ＤＣ含有培養物を、エプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ）ウィルス（ＥＢＶ Ａｇ）、毒素性ショック症候群毒素超抗原（ＴＳＳＴ ＳＡｇ）、又は破傷風トキソイド抗原（ＴＴ Ａｇ）を含む、抗原と同時インキュベート、又はモック処理（Ａｇなし）し、次に、ＤＣに対し自家であるＴ細胞と共培養し、それにより、ＤＣは、培養物中の総細胞の２％を構成した。Ｔ細胞増殖性が測定された場合には、Ｔ細胞を蛍光染料（例えば、ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ）で事前標識し、細胞分裂を受けたＴ細胞集団のパーセンテージの分析を可能にした。（Ａ）は、ＥＢＶ抗原をロードしたｉＮＫＴ細胞及びＤＣの組み合わせに対するＣＤ８+（左）及びＣＤ４+（右）Ｔ細胞の増殖性応答の経時的増大を示すプロットである。単独のｉＮＫＴ細胞及びＥＢＶ抗原に応答したＴ細胞増殖性は検出されなかった。
【図1B】（Ｂ）は、ＴＳＳＴ超抗原をロードしたｉＮＫＴ細胞及びＤＣの組み合わせに対するＣＤ８+（左）及びＣＤ４+（右）Ｔ細胞の増殖性応答の経時的増大を示すプロットである。プロットは、ＴＳＳＴ超抗原により特異的に活性化されるサブセットである、Ｖβ２+Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞の応答を示す。
【図1C-D】（Ｃ）は、ＤＣ単独、ｉＮＫＴ細胞とＤＣ混合物、又はリポ多糖活性化ＤＣ単独（＋ＬＰＳ）に２４時間曝露後に、サイトカインインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生するＣＤ４+Ｔ細胞の頻度を示すプロットである。各記号は、独立したＴ細胞活性化実験を表す。ｉＮＫＴは、Ｔ細胞及びＤＣに同種であった。（Ｄ）は、Ｔ細胞活性化を促進するには、少ない頻度のｉＮＫＴ細胞が必要であるに過ぎないことを示すプロットである。Ｔ細胞を、培養物の２％を含む自家ＤＣと共にインキュベートし、ｉＮＫＴ細胞を示した頻度で加え、２４時間後にＩＦＮγ産生Ｔ細胞の頻度を分析した。
【図1E】（Ｅ）結果は、ｉＮＫＴ細胞＋ＤＣのＴ細胞活性化効果には、細胞接触が必要であることを示す。Ｔ細胞及び自家ＤＣをｉＮＫＴ細胞とウェル（下室、接触条件）中で一緒に共培養するか、又はＴ細胞及び自家ＤＣを、トランスウェル膜により分離されたｉＮＫＴ細胞及びＤＣに曝露した（上室、分泌因子のみに曝露）。培養物中に分泌されたＩＦＮγの量をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図2A】培養したヒトｉＮＫＴ細胞と単球由来ＤＣは、強く接着したコンジュゲートを形成する。末梢血試料を健康な成人対象から採取した。単離単球を培養し、単球由来樹状細胞（ＤＣ）を産生した。ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞を末梢血から単離し、培養により増殖させた。ほとんどの場合、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣは、非血縁血液ドナー由来であった（即ち、相互に同種）。（Ａ）ｉＮＫＴ－ＤＣ共培養物中の接着細胞の検出。ｉＮＫＴ細胞及びＤＣを１：１比率で混合し、一緒に２４時間培養した。ｉＮＫＴ＋ＤＣ共培養由来細胞のフローサイトメトリー分析は、接着細胞内の存在を明らかにし（左下段のプロット、別の光散乱特性を有する集団を示す）、ＤＣにより発現されたマーカー（ＤＣ－ＳＩＧＮ）又はｉＮＫＴ細胞により発現されたマーカー（ＣＤ５）の分析は、ＤＣ及びｉＮＫＴ細胞がコンジュゲートを形成したことを示した（右側下段プロット）。
【図2B】（Ｂ）異種接着の実証。ｉＮＫＴ細胞を青紫色蛍光染料（ＣＴＶ）で細胞内標識し、ＤＣをフルオレセイン由来色素（ＣＦＳＥ）で細胞内標識した。蛍光標識ｉＮＫＴ細胞及びＤＣを１：１の比率で一緒に混合し、培地中で２４時間インキュベートした後、（結合が弱い細胞をバラバラにするために）細胞を、カルシウムキレート化剤を含む緩衝液中に激しく再懸濁した。プロットは、単独培養ＤＣ（中央パネル）及び単独培養ｉＮＫＴ細胞（左パネル）と比較した、ｉＮＫＴ＋ＤＣ共培養物のフローサイトメトリー分析結果（右パネル）を示す。右プロットのボックス枠のイベントは、両方の蛍光色を有し、従って、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣの強く結合したコンジュゲートを表す。
【図2C】（Ｃ）は、強く接着した細胞のほぼ全ては、１つのＤＣ及び１つのｉＮＫＴ細胞からなっている。ｉＮＫＴ細胞及びＤＣを１：１比率で混合し、２４時間共培養した。プロットは、示したｉＮＫＴ細胞及びＤＣ組成物を含む３回の反復共培養によるｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートの、イメージングフローサイトメトリーにより評価したパーセントを示すプロットである。
【図2D】（Ｄ）培養物内のコンジュゲートの頻度は、添加される因子により調節できることを示す。ＤＣは、ウシ血清を含む標準培地中で培養されるか、又は結合脂質を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に事前曝露された後、１：１比率でｉＮＫＴ細胞と同時インキュベートされた。プロットは、フローサイトメトリー分析の結果であり、（Ａ）ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートの頻度は、ＤＣがＨＳＡと事前処理される場合に、増大することを示す。
【図2E】（Ｅ）ｉＮＫＴ細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成されたＤＣとコンジュゲートを形成することの実証。ｉＰＳＣを骨髄単球系統に再分化させた後に、ＤＣを産生するように更に分化させた。ｉＰＳＣ由来ＤＣを１：１比率でｉＮＫＴ細胞と共に２４時間培養し、安定に接着した細胞の頻度をフローサイトメトリーにより評価した。
【図3A】ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートのインビトロ及びインビボでの耐久性。（Ａ）ｉＮＫＴ細胞を青紫色蛍光染料（ＣＴＶ）で細胞内標識し、ＤＣをフルオレセイン由来色素（ＣＦＳＥ）で細胞内標識した。蛍光標識ｉＮＫＴ細胞及びＤＣを１：１の比率で一緒に混合し、培地中で示した時間インキュベートした後、ｉＮＫＴコンジュゲート化ＤＣの頻度をフローサイトメトリーで測定した。プロットは、ｉＮＫＴ細胞とコンジュゲート化したＤＣのパーセントは、インビトロで少なくとも９６時間維持されることを示す。
【図3B】（Ｂ）ｉＮＫＴ＋ＤＣ共培養物の蛍光顕微鏡による画像化は、示した量のインキュベーション時間後に、ｉＮＫＴ細胞（赤）及びＤＣ（緑）のコンジュゲートを示す。
【図3C】（Ｃ）免疫不全マウスへの投与後に、ヒトｉＮＫＴ細胞とＤＣの接着対がインビボで検出できることの実証。ＣＴＶ（赤色）及びＣＦＳＥ標識（緑色）ｉＮＫＴ細胞で標識したＤＣを、２４時間培養し、コンジュゲートを生成させた後、混合物を免疫不全マウス系統（ＮＳＧ）に静脈内注入した。注入の２４時間後に組織を収集し、蛍光顕微鏡により接着ｉＮＫＴ－ＤＣ対の証拠を分析した。パネルは、ｉＮＫＴ細胞と密接に結合しているＤＣ（黄色矢印）を含むマウス肺の組織を示す。
【図3D】（Ｄ）注入の２４時間後に収集した、マウス脾臓、肺、及び肝臓組織中で検出された単離ｉＮＫＴ細胞、単離ＤＣ、及びｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートの定量化。
【図4A】ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートによる共刺激分子の発現上昇。ＤＣをｉＮＫＴ細胞、又は合成アジュバントＧＬＡ（グルコピラノシル脂質アジュバント）と共培養、又はモック処理した後、フローサイトメトリー染色を実施して、共刺激分子又は抗原提示分子の細胞表面発現を検出した。（Ａ）プロットは、独立の実験からの集約結果を示す。これは、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート上の示した分子の表面発現をモック処理ＤＣのそれぞれの発現レベルで正規化したものである（即ち、コンジュゲート化により誘導された共刺激マーカー及び抗原提示分子の発現上昇を示す）。示したマーカーの全てが、モック処理ＤＣに比較して、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート上で有意に発現上昇されている。
【図4B】（Ｂ）プロットは、独立の実験からの集約結果を示す。これは、共培養の２４時間後のｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート上の示した分子の表面発現をＧＬＡ処理ＤＣの発現で正規化したものである（即ち、合成アジュバントの効果に比べたコンジュゲート化の効果の比較）。従来の共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３）及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子（ＨＬＡ－ＤＲ）は、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート上で、ＧＬＡ処理ＤＣと類似のレベルで発現されるが、クラスＩ ＭＨＣ分子（ＨＬＡ－ＡＢＣ）及び一連の異常共刺激分子は、ＧＬＡ処理ＤＣ上よりも、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート上で有意により高いレベルで発現される。
【図4C-D】（Ｃ）プロットは、ＰＤ－Ｌ１（抑制分子、別名「チェックポイント」リガンド）の発現レベルは、ＧＬＡ処理ＤＣ上よりも、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート上で約５０％少ないことを示す。（Ｄ）ＤＣ単独、ｉＮＫＴ＋ＤＣ共培養、又はｉＮＫＴ細胞単独からの培養上清のＩＬ－１２ｐ７０（Ｔ細胞によるＴＨ１応答を促進することが知られているサイトカイン）、又はＩＦＮγ（Ｔｈ１サイトカイン）の濃度を試験した。結果は、ｉＮＫＴ－ＤＣ共培養で両サイトカインが分泌されることを示す。
【図5A】ｉＮＫＴ細胞及びＤＣはそれぞれ、コンジュゲートの共刺激プロファイルに寄与する。（Ａ）ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ測定器を用いて分析したｉＮＫＴ＋ＤＣ共培養による蛍光染色コンジュゲート化細胞のイメージングフローサイトメトリー分析は、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣにより発現されたマーカーを示した。ｉＮＫＴはＣＤ７０を発現したが、ＤＣは発現せず、一方、ＤＣは他の共刺激分子を発現したが、ｉＮＫＴ細胞は発現しなかった。
【図5B】（Ｂ）プロットは、２～３週間の培養により増殖させたｉＮＫＴ細胞（培養ｉＮＫＴ細胞）上のレベル又はＤＣにコンジュゲート化したｉＮＫＴ細胞（コンジュゲート化ｉＮＫＴ細胞）に比べて、新たに単離したヒト脾臓（一次ｉＮＫＴ細胞）由来のｉＮＫＴ細胞上に発現したＣＤ７０のレベルを示す。ＣＤ７０は、一次ｉＮＫＴ細胞上に比べて、培養ｉＮＫＴ細胞上で有意に発現上昇しており、いくつかの事例では、ｉＮＫＴ細胞がＤＣとコンジュゲートを形成した場合は、更に発現上昇するように見える。
【図6A】重要な共刺激分子は、コンジュゲート化細胞上で選択的に上方制御され、上方制御発現は、インビトロで少なくとも９６時間維持される。（Ａ）示したマーカーが、同じ培養で、非コンジュゲート化ＤＣ上に比べて、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート上で上方制御されている程度の比較。従来の共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３）は、わずかに増大したが、一方、一連の厳密に調節された共刺激分子（ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、及びＩＬ－１５Ｒα）は、コンジュゲート上で大幅に上方制御される。
【図6B】（Ｂ）プロットは、重要な共刺激分子の上方制御発現は、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート上で、インビトロで少なくとも９６時間維持されることを示す。
【図7A】ｉＮＫＴ＋ＤＣ混合物の抗腫瘍効果。ヒトＴリンパ球による抗腫瘍応答を促進するｉＮＫＴ細胞＋ＤＣの能力を、ヒト化マウスリンパ腫モデルを用いて試験した。ヒト臍帯血単核球（Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、及びＤＣを含む）は、エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ、Ｂ細胞リンパ腫の形成を促進するヒト細胞特異的γ－ヘルペスウィルス）に短時間曝露される。ＥＢＶ暴露細胞は、免疫不全マウスの腹腔内に注入される。これは、３週以内に腹膜腔中でヒトＢ細胞リンパ腫の形成をもたらす。腫瘍は通常、膵臓、肝臓、胆管などの臓器を侵襲する。多くのヒトがんと同様に、Ｔ細胞は抑制され、腫瘍を死滅させることができない。（Ａ）ｉＮＫＴ細胞＋ＤＣは、Ｔリンパ球による特異的殺作用を促進する。ヒトＴ細胞は、２８日後に、腫瘍を発症したマウス（左プロット）、又は非感染臍帯血単核球を注入され、腫瘍がなかったマウスから（ＥＢＶにナイーブ、右プロット）採取された。Ｔ細胞を、自家ＤＣ、又は自家ＤＣ及び同種ｉＮＫＴ細胞と混合し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージング測定器を用いて自家標的細胞の殺傷をインビトロで試験した。プロットは、反復試験試料による標的細胞の経時的特異的溶解を示す（略号及びエラーバーは、平均及び標準偏差である）。
【図7B】（Ｂ）ｉＮＫＴ細胞＋ＤＣの投与は、インビボでの腫瘍除去を促進する。マウスにＥＢＶ処理ヒト臍帯血単核球を注入し、ヒトＢ細胞リンパ腫の形成をインビボで促進した。２５日後、マウスにｉＮＫＴ細胞単独、自家ＤＣ単独、ｉＮＫＴ細胞＋自家ＤＣの１：１混合物を静脈内に注入、又は無菌緩衝液（ビークル）によるモック治療を実施した。６日後、マウスを安楽死させ、全ての目視可能な腫瘍組織を腹膜腔から切り取った。プロットは、腫瘍量を示し、各記号は個別のマウス由来の結果を表す。
【図7C】（Ｃ）ヒトＥＢＶ促進リンパ腫モデルマウスからの膵臓組織の組織学的切片。左の画像は、ビークル処理マウスからの組織を示し、膵臓は、リンパ腫細胞により大きく侵襲されている。右の画像は、マウスの特定のｉＮＫＴ細胞及びＤＣ由来の組織を示し、以前に腫瘍に侵襲されていた可能性の高い膵臓の領域は、リンパ腫細胞が取り除かれたように見える。
【図7D】（Ｄ）３匹のｉＮＫＴ＋ＤＣ処理マウス及び３匹のビークル処理マウスからの脾臓組織のヒト免疫関連遺伝子の発現プロファイルを試験した。ｉＮＫＴ＋ＤＣ混合物を受けたマウス中の種々の遺伝子が有意に発現上昇した（赤色バー）が、一方、これらは、ビークルを受けたマウス中では、下方制御された。ｉＮＫＴ＋ＤＣ混合物を受けたマウス中で、より少ない数の遺伝子が、有意に下方制御された（青色バー）が、ビークルを受けたマウスで発現上昇した。ｉＮＫＴ＋ＤＣでは、発現上昇群は、Ｔ細胞活性化に関連する同義遺伝子であったが、一方、ｉＮＫＴ＋ＤＣ処理後に下方制御された群は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞に関連する遺伝子を含んだ。
【図7E】（Ｅ）ＥＢＶ促進Ｂ細胞リンパ腫担持マウスは、２５日後に、マウス中でＥＢＶ感染Ｂ細胞及びＴ細胞に対し同種（ａｌｌｏ）又は自家（ａｕｔｏｌ）であるＤＣと組み合わせたｉＮＫＴ細胞を静脈内注入された。プロットは、各個別のマウスの腫瘍量を示す。ＮＳは、ｉＮＫＴ細胞及び及び同種ＤＣの投与後に腫瘍量の有意な減少がないことを示す。一方、ｉＮＫＴ細胞及び自家ＤＣの投与は、有意な（Ｐ＝０．００２５）腫瘍量の減少を生じる。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明は、本明細書においては、「多細胞コンジュゲート」、「ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート」又は「コンジュゲート」と呼ばれる、ヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ細胞）と樹状細胞（ＤＣ）との安定で耐久性のある多細胞コンジュゲート（接着対）を調製する方法、及びその調製物に関する。本発明は、ヒトＴ細胞を活性化するために、及び抗原特異的応答及び免疫応答を促進するために、コンジュゲートを用いる方法に更に関する。
【0008】
本明細書で記載の多細胞コンジュゲートは、インビトロで人為的に操作されて、ｉＮＫＴとＤＣ細胞の細胞－細胞接着対が形成される。本明細書記載の方法は、多細胞コンジュゲートが、インビトロ組織培養の培養の約３０分後に形成され、リゾリン脂質を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の培養条件への添加が、コンジュゲートの数を増大させ、これは、インビトロで形成されるコンジュゲートの数の増大を可能にすることを示す。何らかの理論に束縛されるものではないが、より多くのコンジュゲートをインビトロで形成する能力は、インビボ適用に使用される多細胞コンジュゲートの効力に寄与でき、効果的療法に必要な細胞の数を減らすことができる。実施例で更に示すように、これらのコンジュゲートは、培養物中で少なくとも２４時間維持され、培養物中で少なくとも９６時間後に、まだ接着されたままであることが示された。更に、実施形態は、これらの多細胞コンジュゲートが、インビボ投与後に接着したまま残り得ることを示し、投与の少なくとも２４時間後にインビボで検出されることが実証された。これらの多細胞コンジュゲートは、インビボで対象内の投与の部位から活性部位へ移動できる。
【0009】
多細胞コンジュゲート中のＤＣは、本明細書で記載の１種又は複数の共刺激分子及びＨＬＡを発現する。多細胞コンジュゲート中のｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ７０共刺激分子を発現し、これは、一次ｉＮＫＴ細胞上には通常認められない。ｉＮＫＴ細胞とＤＣの組み合わせは、刺激サイトカインを生成し、従って、複数の強力な活性化シグナルをＴ細胞に与えるインビトロ改変複合体を構成する。
【0010】
本明細書で記載の安定な多細胞コンジュゲートは、インビトロ及びインビボの両方で、耐久性のある強い接着性を有するように開発された。用語「安定な」は、「強く接着した」、「堅固な接着」、及びコンジュゲートに対する「耐久性のある」と同義に使用され、一定期間にわたり（例えば、インビトロ培養中）相互に接着したまま残るｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートの能力を意味する。コンジュゲートは、カルシウム及びマグネシウム不含で、２ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液に１０分間～１時間にわたり曝露された後に、及び／又は激しいピペット操作及び遠心分離に付随する剪断力に晒された後に、安定に結合したまま（又は、強く接着したまま）残る。安定なコンジュゲートは、更に、インビトロ及びインビボの両方中で維持できる。コンジュゲートは、インビトロ培養物中で２４～９６時間にわたり、及びインビボ投与後、少なくとも２４時間にわたり、相互に接着したままであり得る。従って、用語の「安定な」は、コンジュゲートとして、少なくとも２４～９６時間にわたり維持されるコンジュゲートの能力を包含する。多細胞コンジュゲートは、実施例で示すように、抗原依存性ＣＤ８+Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞と呼ばれることも多い）及びＣＤ４+Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞と呼ばれることも多い）を活性化する。従って、本開示は、これらの新しく開発したｉＮＫＴ－ＤＣ多細胞コンジュゲートの製造方法及びこれらを含む組成物を提供する。
【0011】
調製物を作成するために、ヒトｉＮＫＴ細胞は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）とインビトロで組み合わされる。Ｔ細胞と接触時に（例えば、対象への投与後に）抗原特異的免疫応答を誘発するためのｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートの能力を促進するために、下記の方法で詳述されるように、ＤＣは、ｉＮＫＴとのコンジュゲート化の前に、その間に、又はその後に、抗原に曝露され、抗原をロードされ得る。一実施形態では、ＤＣは、インビトロで抗原と接触させられ、ロードされたＤＣ（即ち、抗原又はそのフラグメントを提示しているＤＣ）はその後、ｉＮＫＴ細胞と培養されて、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートが形成される。別の実施形態では、ＤＣは、抗原及びｉＮＫＴ細胞と共に同時にインキュベートされて、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートが形成される。別の実施形態では、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、抗原とのインキュベーションの前に形成され、それにより、抗原は、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート内のＤＣ上にロードされる。これらの異なる方法は、既知の抗原を用いたｉＮＫＴ＋ＤＣ細胞の特異的抗原ローディングを可能にする。この抗原ロードｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、対象に投与された場合、対象中で抗原特異的免疫応答、特に抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発できる。Ｉ型又は古典的なＮＫＴ細胞としても知られる、ｉＮＫＴ細胞は、以下に詳述する利用可能な方法を用いて、健康な対象の血液から単離し、組織培養で増殖できる。ＤＣは、以下に詳述する利用可能な方法を用いて、新たに単離した単球を分化させることにより、又は多能性幹細胞又は造血前駆細胞から分化させることにより、組織培養で生成できる。いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート化細胞は、調製中の非コンジュゲート化細胞から更に選択又は分離して、純粋な多細胞コンジュゲート調製物を得ることができる。いくつかの実施形態では、選択又は分離ステップは必須ではない。理由は、本明細書で記載のように、精製ステップなしで対象への使用及び投与のために十分な、インビトロ培養で形成されたコンジュゲートが存在するためである。これらの多細胞コンジュゲート調製物は、限定されないが、がん、病原体感染症などを含む抗原に関連する状態を治療するために使用し得る抗原特異的免疫応答を誘発する。
【0012】
企図される別の実施形態では、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、インビボで、抗原、例えば、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートの抗原を含む部位への局所投与（例えば、腫瘍の内部、骨髄、皮内、感染症部位など）に曝露される場合がある。これは、インビボ由来抗原に特異的な免疫応答を刺激するように、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートによる抗原物質のインサイツ取り込みを可能にする。
【0013】
それらの表面上では、多細胞コンジュゲートは、Ｔリンパ球の効率的活性化に必要な、ＣＤ８０及びＣＤ８６共刺激分子及びＭＨＣ分子などの種々のリガンドを発現し、これらのリガンドは、活性化されなかったＤＣの表面上よりも高いレベルで存在する。更に、コンジュゲートは、合成アジュバント（グルコピラノシル（ｇｌｕｃｏｐｕｒａｎｏｓｙｌ）脂質アジュバント、ＧＬＡ）で処理された非コンジュゲート化ＤＣに比べて、（ｉＮＫＴ細胞上の）共刺激リガンドＣＤ７０及び４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ）、及びＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＣＤ２１５）、又はこれらの組み合わせのより高い発現、及び阻害性リガンドＰＤ－Ｌ１のより低い発現を示す。更に、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、接触依存性方式で、抗原特異的ヒトＴ細胞を活性化する。この抗原特異的Ｔ細胞活性化は、抗原に関連する状態を治療する、例えば、対象中の腫瘍細胞を減らす、抑制する又は除去する。実施例で示すように、エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）誘導Ｂ細胞リンパ腫のヒト化マウスモデルへのコンジュゲートの投与は、腫瘍塊を除去し、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートへの曝露は、インビトロで標的細胞を死滅させるために、ＥＢＶ誘導リンパ腫担持マウス由来のＴ細胞を選択的に生じさせた。
【0014】
本明細書で記載の、及び本明細書の方法により産生された多細胞コンジュゲートは、次記の特性の１つ又は複数を有し得る。多細胞コンジュゲート中のｉＮＫＴ及びＤＣ細胞は、形成後、インビトロで、少なくとも２４時間にわたり、好ましくは少なくとも２日間（４８時間）にわたり、より好ましくは少なくとも４日間（９６時間）にわたり強く結合したまま残る。多細胞コンジュゲートは、２つ～３つの細胞を含むのが好ましく、更に、１つのｉＮＫＴ細胞と１つのＤＣを含むのが好ましい。本明細書で記載の多細胞コンジュゲートは、インビトロで、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも４日間にわたり、コンジュゲート上に１種又は複数の共刺激分子の発現を維持する。多細胞コンジュゲートは、高レベルのＣＤ７０を発現するｉＮＫＴ細胞、及び本明細書で記載の１種又は複数の他の共刺激分子／リガンドを発現しているＤＣを含む。これらのコンジュゲートを生成するために使用されるｉＮＫＴ細胞は、それらの細胞表面上にＣＤ７０をほとんど又は全く発現しない一次ｉＮＫＴ細胞とは異なる。本明細書で記載の多細胞コンジュゲート上の、ＣＤ７０発現及び１種又は複数の共刺激分子（ＣＤ２１５、ＣＤ１３７、ＣＤ２５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）の組み合わせは、対象から単離された細胞上には認められず、本発明の多細胞コンジュゲートに特有である。コンジュゲートは、ｉＮＫＴ細胞とＤＣ細胞の培養物中での約３０分間以上の共培養により形成でき、その後、少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも９６時間にわたり強く結合したまま残る。
【0015】
多細胞コンジュゲート中に使用されるｉＮＫＴ細胞は、それらが、非多形性抗原提示分子であるＣＤ１ｄを認識するので、同種及び自家免疫療法の両用途に好適する。ｉＮＫＴ細胞は、凍結させて、後で使用するために貯蔵できるので、本発明はまた、新規細胞免疫療法を提供し、この場合、コンジュゲーション対応の「既製の」同種ｉＮＫＴ細胞が、単球又は治療が必要な個別の対象由来の他の細胞から必要に応じ生成されるＤＣとのコンジュゲート化のために提供される。あるいは、ｉＮＫＴ細胞は、特異的ＭＨＣ型（即ち、ＨＬＡ型）を発現するように選択又は改変された誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＤＣにコンジュゲート化され、従って、個別の対象から収集された生体物質を必要としない完全に「既製の」試薬を許容し得る。このようにして調製されたｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、以下に詳述のように、１種又は複数の抗原（例えば、腫瘍細胞抗原又は病原性抗原）をロードし、患者のＴ細胞を活性化するための細胞免疫療法剤として投与できる。
【0016】
本発明は、現在の免疫療法に優る利点を提供する。（１）本発明は、Ｔ細胞を活性化し、同時に、チェックポイント阻害戦略がＴ細胞抑制経路を妨害する；従って、２つの手法は、相乗的に作用することが予測される。（２）本発明の治療作用モードは、抗原特異的であり、一方、チェックポイント阻害戦略は抗原特異的ではない；従って、この戦略は、不適切なＴ細胞活性化から生ずる病態をもたらす可能性が少ないと予測される。（３）本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成の場合に必要になるような、レシピエントの細胞の遺伝子改変を必要としない。（４）本発明のｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、ただの数日で調製でき、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療薬量を生成するのに通常必要な数週間より遙かに迅速である。（５）本発明は、比較的少数の対象からの一次細胞しか必要としない。理由は、抗原をロードしたＤＣは、高度に効率的なＴ細胞活性化剤であるためである。
【0017】
多細胞コンジュゲートの産生方法
本開示は、ｉＮＫＴ細胞とＤＣとの間の多細胞コンジュゲートを産生する方法を提供し、該方法は、ｉＮＫＴ及びＤＣを選択的に配合された培地中で、安定な多細胞コンジュゲートを形成するために十分な時間にわたり共培養することを含む。ｉＮＫＴ細胞は、培養物中（例えば、３７℃、５％ＣＯ2）で少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも３０分間、あるいは少なくとも１時間ＤＣと混合され、更に、培養物中に、２日間（４８時間）以上、あるいは、４日間（９６時間）以上、そのままで残すことができる。ｉＮＫＴ細胞及びＤＣは、多細胞コンジュゲートを産生するために、好適な比率、例えば、５：１～１：１のｉＮＫＴ：ＤＣ比率で共培養される。この方法で使用されるｉＮＫＴ細胞は、脂質抗原（α－ガラクトシルセラミド又は種々の関連化学化合物の１つ）をロードした組換え型ＣＤ１ｄ分子の結合により特定される適切に再編成されたＴ細胞受容体の発現により、又は特異的モノクローナル抗体（例えば、クローン６Ｂ１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄで商業的に入手できる、例えば、Ｒｏｕｔ Ｎ，ｅｔ ａｌ．２０１０．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ９７８７．（ＦＣ）も参照されたい））及びＣＤ４共受容体の同時発現により測定して、実質的に純粋な（例えば、９５％超）ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞集団であることが適切である。
本開示は、ｉＮＫＴ細胞とＤＣとの間の多細胞コンジュゲートを産生する方法を提供し、該方法は、ｉＮＫＴ及びＤＣを選択的に配合された培地中で、安定な多細胞コンジュゲートを形成するために十分な時間にわたり共培養することを含む。ｉＮＫＴ細胞は、培養物中（例えば、３７℃、５％ＣＯ2）で少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも３０分間、あるいは少なくとも１時間ＤＣと混合され、更に、培養物中に、２日間（４８時間）以上、あるいは、４日間（９６時間）以上、そのままで残すことができる。ｉＮＫＴ細胞及びＤＣは、多細胞コンジュゲートを産生するために、好適な比率、例えば、５：１～１：１のｉＮＫＴ：ＤＣ比率で共培養される。この方法で使用されるｉＮＫＴ細胞は、脂質抗原（α－ガラクトシルセラミド又は種々の関連化学化合物の１つ）をロードした組換え型ＣＤ１ｄ分子の結合により特定される適切に再編成されたＴ細胞受容体の発現により、又は特異的モノクローナル抗体（例えば、クローン６Ｂ１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄで商業的に入手できる、例えば、Ｒｏｕｔ Ｎ，ｅｔ ａｌ．２０１０．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ９７８７．（ＦＣ）も参照されたい））及びＣＤ４共受容体の同時発現により測定して、実質的に純粋な（例えば、９５％超）ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞集団であることが適切である。
【0018】
いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ細胞集団中で、９５％、９８％、９９％超の細胞がｉＮＫＴ細胞であり、好ましくは、１００％を含む、９９％超がｉＮＫＴ細胞である。好適なｉＮＫＴ細胞集団は、下記で考察される。
この方法で使用されるＤＣはまた、実質的に純粋な集団（９５％超）のＤＣであるのが適切である。ＤＣのキャラクタリゼーションは、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子の発現、１種又は複数のＤＣマーカー又はＤＣ上で見つかる共刺激分子（例えば、ＣＤ２０９、ＣＤ８６、ＣＤ８０など）、及び非ＤＣ上で見つかるマーカーの低発現、例えば、ＣＤ１４（単球マーカー）の低発現を含み得、以下でさらなる詳細を説明する。いくつかの実施形態では、ＤＣは、少なくとも９８％純粋、あるいは、１００％純粋を含む、少なくとも９９％純粋である。
この方法で使用されるＤＣはまた、実質的に純粋な集団（９５％超）のＤＣであるのが適切である。ＤＣのキャラクタリゼーションは、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子の発現、１種又は複数のＤＣマーカー又はＤＣ上で見つかる共刺激分子（例えば、ＣＤ２０９、ＣＤ８６、ＣＤ８０など）、及び非ＤＣ上で見つかるマーカーの低発現、例えば、ＣＤ１４（単球マーカー）の低発現を含み得、以下でさらなる詳細を説明する。いくつかの実施形態では、ＤＣは、少なくとも９８％純粋、あるいは、１００％純粋を含む、少なくとも９９％純粋である。
【0019】
ｉＮＫＴ－細胞コンジュゲートは、好ましくは２つ～３つの細胞を含み、好ましくは、２つの細胞、１つのｉＮＫＴ細胞と１つのＤＣを含む。
ｉＮＫＴ細胞及びＤＣは、安定なコンジュゲートを形成する少なくとも２０％のｉＮＫＴ細胞及びＤＣを生じる条件でコンジュゲート化されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、例えば、サイズにより、又は本明細書で記載の他の方法により、非コンジュゲート細胞から選択される必要があり得る。
ｉＮＫＴ細胞及びＤＣは、安定なコンジュゲートを形成する少なくとも２０％のｉＮＫＴ細胞及びＤＣを生じる条件でコンジュゲート化されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、例えば、サイズにより、又は本明細書で記載の他の方法により、非コンジュゲート細胞から選択される必要があり得る。
【0020】
樹状細胞
ＤＣは、骨髄中に起源に持つ抗原提示骨髄及び形質細胞様白血球の異種集団であり、又はいくつかの事例では、インビボで循環前駆細胞集団（例えば、単球）から分化され得る。ＤＣは、抗原性のタンパク質を捕捉及びプロセッシングした後、ＭＨＣ分子により、それらの表面上に提示するために、タンパク質をペプチドに変換し、それにより、ペプチド抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により認識できる。これは、ＤＣの抗原ロードと呼ばれる（即ち、ＤＣの表面上のＭＨＣ分子上の抗原又はそのフラグメントの提示）。
ＤＣは、骨髄中に起源に持つ抗原提示骨髄及び形質細胞様白血球の異種集団であり、又はいくつかの事例では、インビボで循環前駆細胞集団（例えば、単球）から分化され得る。ＤＣは、抗原性のタンパク質を捕捉及びプロセッシングした後、ＭＨＣ分子により、それらの表面上に提示するために、タンパク質をペプチドに変換し、それにより、ペプチド抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により認識できる。これは、ＤＣの抗原ロードと呼ばれる（即ち、ＤＣの表面上のＭＨＣ分子上の抗原又はそのフラグメントの提示）。
【0021】
１種又は複数の特異的抗原を提示しているＤＣを含むｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、次に、対象内の抗原特異的Ｔ細胞を活性化するために使用できる。好適な抗原は、以下で考察される。ＤＣは、血液又は骨髄（ＢＭ）試料から単球を得た後、それらを特異的サイトカインと共に培養して、単球をＤＣに分化させることにより、インビトロで導き得る。
あるいは、樹状細胞は、当該技術分野において既知の方法による誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血前駆細胞の分化から導き得る。
あるいは、樹状細胞は、当該技術分野において既知の方法による誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血前駆細胞の分化から導き得る。
【0022】
特質上、本明細書で記載の多細胞コンジュゲートで使用するためのＤＣは、本明細書で記載の１種又は複数のＤＣマーカー又は共刺激分子に加えて、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する。好ましくは、一実施形態では、ＤＣは、それらの表面上に、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩマーカーのいずれか又は両方の増大した発現を有し得る。例えば、ＤＣは、増大したＭＨＣ分子及び樹状細胞に関連する１種又は複数のマーカー（例えば、ＣＤ２０９（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、又はＣＤ１ｃ）を発現し、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６共刺激分子の発現を高め、単球及びマクロファージ上で高められているマーカーをほとんど又は全く発現しない（例えば、ＣＤ１４、ＣＤ６８）。更に、ＤＣは、他の白血球のマーカー（例えば、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞））に陰性である。従って、いくつかの実施形態では、樹状細胞は、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ１３７Ｌ（４－１ＢＢＬ）、ＣＤ２１５（ＩＬ－１５Ｒα）及びこれらの組み合わせから選択される１種又は複数の共刺激マーカーを発現し得る。ＤＣ上に発現される他の共刺激分子は、当技術分野において既知であり、本明細書で企図される。ＤＣは、一次リンパ球に比べて、それらのわずかに大きなサイズで知られ、平滑な（高度にざらざらではない）細胞質を有する。それらは細胞表面で複数の突出部（樹状突起）を提示し、極わずかに接着性である（即ち、高度に接着性ではなく、組織培養プレートの表面上に引き延ばされているか、又は水平になっている）。いくつかの実施形態では、ＤＣは、ＣＤ２０９及び低レベルのＣＤ１４を発現する。いくつかの実施形態では、ＤＣは単球由来であり、ＣＤ２０９を発現し得る。
【0023】
本明細書で使用される場合、「主要組織適合抗原又はＭＨＣ」という用語は、Ｔ細胞活性化のために、細胞内由来のペプチドフラグメント及びタンパク質を提示するように機能するＤＣの表面上に見出される分子を意味する。ヒトでは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）遺伝子複合体によりコードされるタンパク質である。従って、本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ」という用語は、ヒトのＨＬＡ分子を包含する（即ち、ＭＨＣ Ｉは、ＨＬＡクラス１（ＨＬＡ Ａ、Ｂ、及びＣ）を包含し、ＭＨＣ ＩＩは、ヒトのＨＬＡ ＤＰ、ＤＱ及びＤＲを包含する）。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＣは、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ヒト細胞上のＨＬＡ Ａ、Ｂ及びＣタンパク質）又はＭＨＣクラスＩＩタンパク質（例えば、ヒト細胞上のＨＬＡ ＤＲ、ＤＰ、ＤＱタンパク質）のいずれか又は両方の増大した細胞表面発現を有する。
【0024】
いくつかの実施形態では、ＤＣは、コンジュゲート化ｉＮＫＴ細胞に対し同種である。他の実施形態では、ＤＣは、コンジュゲート化ｉＮＫＴ細胞に対し自家である。更に他の実施形態では、ＤＣは、治療を必要としている対象に対し自家であり、コンジュゲート化ｉＮＫＴ細胞は、治療を必要としている対象に対し同種である。更に他の実施形態では、ＤＣ及びコンジュゲート化ｉＮＫＴ細胞は、両方とも、治療を必要としている対象に対し同種である。治療される対象に応じて、ＤＣは同種であり得るが、しかし、治療対象に対し、部分的に又は完全にＨＬＡ適合され得る。あるいは、ＤＣがｉＰＳＣ由来である場合、ＤＣは、限定的なＨＬＡアロタイプを発現するように改変され、治療対象に適合するように選択され得る。
【0025】
本発明で使用されるＤＣは、単球由来であり得る。ＤＣは、単球をＤＣに分化させるのに十分な時間にわたり好適な培地中で培養することを含む方法により単球から得ることができる。例えば、単球は、単球をＤＣに分化させるのに十分な量の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ及び組換えＩＬ－４を含む培地中で、培養されるＣＤ１４+単球であり得る。単球のＤＣへの分化は、当技術分野において既知のように、例えば、ＣＤ１４（単球マーカー）の発現の減少、１種又は複数のＤＣマーカーの発現の増大（例えば、ＣＤ２０９、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、又はＣＤ１ｃ発現、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣ ＩＩの上昇）、又は非ＤＣマーカー、例えば、Ｂ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカーなどの発現の欠如、又はこれらの組み合わせにより、特徴付けることができる。単球は、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４の存在下で少なくとも２日間、あるいは、少なくとも３日間培養され得るのが適切である。ＤＣは、当該技術分野において既知の方法、例えば、抗ＤＣ抗体（例えば、抗ＣＤ２０９）、抗ＣＤ８０又はＣＤ８６抗体を用いて、磁気ビーズ又はフローサイトメトリーソーティングにより、及びいくつかの実施例では、他のマーカー（ＣＤ１４-、ＣＤ１９-、ＣＤ３-、ＣＤ５６-など）の欠如により、培養物から更に選別され得る。例えば、ＣＤ２０９+ＣＤ１４-細胞が、培養単球から単離され得る。
【0026】
単球は、当該技術分野において既知の方法により得られる。一実施形態では、単球は、血液試料から単離され得る；特に単球は、血液試料由来の末梢血単核球から単離できる。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、丸い核を有するいずれかの末梢血細胞、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球である。ＰＢＭＣは、血液試料から当該技術分野において既知の方法により、例えば、フィコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの商標）などの親水性ポリサッカライド、又はＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの商標）を用いて、血液試料を層、特に、血漿の最上層、続いて、ＰＢＭＣの層及び多形核細胞底部画分（即ち、好中球及び好酸球）及び赤血球に分離させる密度勾配遠心分離により、血液試料から単離できる。単球は、限定されないが、例えば、他の細胞型を取り除くためのロゼット遠心分離、接着メッキ（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｐｌａｔｉｎｇ）（単球はプラスチックに接着するが他のリンパ球は接着しない）、及び単球特異的抗体を用いた（例えば、抗ＣＤ１４抗体を用いた）細胞の磁気又は蛍光選別などの当該技術分野において既知の方法によりＰＢＭＣから更に単離できる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４+単球が、磁気選別又はフローサイトメトリーによりＰＢＭＣから単離される。単球はまた、それらの光散乱（前方及び側方散乱）特性に基づいて、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ又はＣＤ１１ｃを用いて染色して、フローサイトメトリー選別より、又は赤血球と望ましくないＰＢＭＣとの間で、当技術分野において既知の、フィコール又はＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いた勾配遠心分離により除去できるロゼットを形成させて、ネガティブ選択することにより単離され得る。いくつかの実施形態では、単球は、ＣＤ１ａ-／ＣＤ１４+単球である。例えば、限定されないが、ＣＤ１ａ-／ＣＤ１４+単球は、例えば、抗ＣＤ１４－Ｉｇ結合磁気マイクロビーズ（ＭＡＣＳ ＣＤ１４ マイクロビーズ、ヒト（１３０－０５０－２０１）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてポジティブ選択により、又はネガティブ枯渇（ＭＡＣＳ単球単離キットＩＩ、ヒト（１３０－９１－１５３）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、単離できる。
【0027】
本明細書で使用されるＤＣは、当該技術分野において既知の成長因子の種々の組み合わせを用いて、単球から分化させることができる。単球を樹状細胞に分化させるために好適な成長因子には、限定されないが、例えば、特に、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、組換えヒトＩＬ－４、及びこれらの組み合わせが挙げられる。ＤＣはまた、ＣＤ３４+造血幹細胞又は前駆細胞（ＨＳＰＣ）から、又は多能性幹細胞、例えば、当該技術分野において既知の方法による胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞から導き得る。前駆体細胞もまた、当技術分野において既知のように、骨髄から単離され、ＤＣに分化させ得る。ＣＤ３４+ＨＳＰＣ由来のＤＣを分化する好適な方法は当技術分野において既知であり、Ｂｅｄｋｅ Ｎ，Ｓｗｉｎｄｌｅ ＥＪ，Ｍｏｌｎａｒ Ｃ，Ｈｏｌｔ ＰＧ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＨ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＧＣ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｒ，Ｈｏｌｇａｔｅ ＳＴ，Ｄａｖｉｅｓ ＤＥ，Ｂｌｕｍｅ Ｃ．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ＣＤ３４+ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０２０ Ｆｅｂ；４７７：１１２７０３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１９．１１２７０３．Ｅｐｕｂ ２０１９ Ｎｏｖ ９．ＰＭＩＤ：３１７１１８８８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６９８３９３６，及びＣｕｒｔｉ Ａ，Ｆｏｇｌｉ Ｍ，Ｒａｔｔａ Ｍ，Ｔｕｒａ Ｓ，Ｌｅｍｏｌｉ ＲＭ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ＦＬＴ３－ｌｉｇａｎｄ ａｒｅ ｓｔｒｉｃｔｌｙ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｓｕｓｔａｉｎ ｔｈｅ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ＣＤ３４＋ＤＲ－ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｊａｎ １５；１６６（２）：８４８－５４．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１６６．２．８４８．ＰＭＩＤ：１１１４５６５９、が挙げられる。これらの文献の内容は、ＤＣを分化する方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。誘導多能性幹細胞からＤＣを分化させる好適な方法は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｃｈｏｉ ＫＤ，Ｖｏｄｙａｎｉｋ Ｍ，Ｓｌｕｋｖｉｎ ＩＩ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．２０１２ Ｊｕｎ １０．Ｉｎ：ＳｔｅｍＢｏｏｋ ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（ＭＡ）：Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；２００８－．ＰＭＩＤ：２３６５８９７１，Ｃｈｏｉ ＫＤ，Ｖｏｄｙａｎｉｋ Ｍ，Ｓｌｕｋｖｉｎ ＩＩ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１１ Ｍａｒ；６（３）：２９６－３１３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１０．１８４．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｆｅｂ １７．ＰＭＩＤ：２１３７２８１１；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０６６０６７，Ｖｏｄｙａｎｉｋ ＭＡ，Ｓｌｕｋｖｉｎ ＩＩ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００７；４０７：２７５－９３．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－５９７４５－５３６－７＿１９．ＰＭＩＤ：１８４５３２６２、並びに米国特許第７，８１１，８２１号、同第８，８４６，３９５号及び同第８，４３５，７８５号、に記載の方法が挙げられる。これらの文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。誘導多能性幹細胞は、対象から導きかれ得、いくつかの実施形態では、対象は、ドナー対象であり得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来ＤＣは、限定的なＨＬＡアロタイプを発現するように更に遺伝子改変され、治療される対象のＨＬＡに適合するように選択される。他の実施形態では、対象は、本明細書で記載の多細胞コンジュゲートを用いて治療される抗原に関連する状態を有し、従って、ＤＣは、治療される対象に対し自家である。
【0028】
単離ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞と共培養及び多細胞コンジュゲートの形成の前に、その間に、その後に、培養物中で抗原と共にインキュベートされるか、又は抗原と接触させられる。一実施形態では、ＤＣは、ｉＮＫＴとのコンジュゲート化の前に、抗原と共にインキュベートされる。別の実施形態では、ＤＣは、抗原及びｉＮＫＴ細胞と共に同時にインキュベートされて、コンジュゲートが形成される。さらなる実施形態では、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートが形成され、続けて、対象に投与される前に、抗原に曝露される。ＤＣは、抗原の由来源をロードされ、ＤＣによるその表面上での、抗原又はそのフラグメントのプロセッシング及び提示を可能にする。ＤＣ表面上のこの抗原の提示により、Ｔ細胞との接触時に、対象の抗原特異的Ｔ細胞集団を活性化できる。用語の抗原の「ロード」は、抗原と接触時に、ＤＣが、ＤＣ表面上で抗原又はそのフラグメントを（主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ又はＩＩ分子への結合を介して）取り込む、プロセッシングする及び発現又は提示する工程を意味する。抗原は、ＤＣにより取り込まれ、プロセッシングできる任意の好適な形態でＤＣ培地に添加され得る。例えば、抗原は、特に、抗原（例えば、腫瘍細胞）、全タンパク質、抗原発現細胞から直接的に導かれた又は組換えで産生された全タンパク質、合成ペプチドもしくは分子を発現する全体又は部分不活化細胞の形態であり得る。いくつかの実施形態では、抗原は、ＤＮＡ／ＲＮＡ構築物を用いて送達され、ペプチド又はＤＣによるタンパク質の合成及び発現を可能にし得る（例えば、ＤＣ内で抗原タンパク質又はペプチドに翻訳できる外来性のポリヌクレオチドを含む改変ＤＣ）。好適な外来性のポリヌクレオチドを導入する方法は、当技術分野において既知であり、これには、限定されないが、ウィルス形質導入、ＤＮＡ／ＲＮＡ遺伝子導入が含まれ、プラスミド、ベクター、又は他のポリヌクレオチド配列の形態であり得る。次に、ＤＣは抗原又はそのフラグメントを、その表面に輸送し、しばらくの間維持されるＭＨＣ分子中にロードし、抗原提示ＤＣを生じる（これは、「抗原ロード」ＤＣとも呼ぶことができる）。培養によりＤＣにロードする方法は、当技術分野において既知であり、当業者により実施できる。使用に好適な抗原は、対象の治療される状態に応じて、使用方法セクションで下記される。
【0029】
ｉＮＫＴ細胞
ｉＮＫＴ細胞は、対象から、例えば、末梢血から単離できる。ｉＮＫＴ細胞は、血液中では希であり、通常、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の約０．０１～１％のみを含む。しかし、本発明で使用されるｉＮＫＴ細胞は、血液又は他の組織、例えば、健康なドナー由来の血液試料から得て、後述のように、エクスビボの組織培養で増殖できる。代替実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、多能性幹細胞から分化させることができる。
ｉＮＫＴ細胞は、対象から、例えば、末梢血から単離できる。ｉＮＫＴ細胞は、血液中では希であり、通常、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の約０．０１～１％のみを含む。しかし、本発明で使用されるｉＮＫＴ細胞は、血液又は他の組織、例えば、健康なドナー由来の血液試料から得て、後述のように、エクスビボの組織培養で増殖できる。代替実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、多能性幹細胞から分化させることができる。
【0030】
ヒトｉＮＫＴ細胞及びＴ細胞ではない特定のリンパ球（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）は、いくつかの細胞表面分子を共有するが、ｉＮＫＴ細胞は、選択的にＴＲＢＶ２５（Ｖβ１１としても知られる）を含むＴＣＲβ鎖と結合したＴＣＲα鎖（ＴＲＡＶ１０－ＴＲＡＪ１８、Ｖα２４－Ｊα１８としても知られる）から構成されるセミインバリアントαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する別のＴ細胞集団である。従来のＴ細胞は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）分子により提示される抗原を認識するが、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ、非多形性ＭＨＣクラスＩ様分子により提示される脂質又は糖脂質抗原を認識する。特質上、ｉＮＫＴ細胞は、一般にＴリンパ球上に認められる１種又は複数のマーカー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５）を発現するが、ＣＤ１９などのＢ細胞マーカーを発現しない。ｉＮＫＴ細胞を特定するのに使用されるマーカーの表面発現を検出するために好適する既知の方法には、限定されないが、フローサイトメトリーが含まれる。ｉＮＫＴ細胞はまた、α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）、糖脂質、及び糖部分の異常な構造を含む関連化合物を認識し、それらにより強力に活性化されることを特徴とする。
【0031】
対象からｉＮＫＴ細胞を得る方法は、当技術分野において既知であり、例えば、ｉＮＫＴ細胞を対象から(血液試料により)単離されたＰＢＭＣ由来のｉＮＫＴ細胞を分離することを含む。ｉＮＫＴ細胞を単離する好適な方法は当技術分野において既知であり、例えば、ｉＮＫＴ細胞により使われるセミインバリアント型のＴＣＲを特異的に認識する抗体で、又はα－ＧａｌＣｅｒ又は関連脂質をロードした組換えＣＤ１ｄ分子で細胞を標識し、ｉＮＫＴ細胞をＰＢＭＣ内の他の細胞から選別（例えば、磁気細胞選別又はフローサイトメトリーセルソーティングにより）することによる方法が既知である。例えば、下記実施例で記載のように、対象から得られたＰＢＭＣ試料を市販で得られるＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、脂質ロード組換えＣＤ１ｄ試薬（例えば、ヒトＣＤ１ｄ ＰＢＳ－５７ ＰＥ、「ＣＤ１ｄ－四量体」と呼ばれる）、又はこれらの組み合わせに対する蛍光標識抗体で標識し、ＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ１ｄ－四量体+ｉＮＫＴ細胞（例えば、ＣＤ４、ＣＤ３、及びＣＤ１ｄ四量体に対し陽性染色細胞）で選別（例えば、フローサイトメトリーにより選別）できる。単離されると、ＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ１ｄ－四量体+ｉＮＫＴ細胞集団は、実質的に純粋な（例えば、９５％超純粋な、好ましくは９８％超純粋な、あるいは、少なくとも９９％純粋な）ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞集団である。
【0032】
単離されると、ｉＮＫＴ細胞は、エクスビボで増殖できる。ｉＮＫＴ細胞をエクスビボで増殖する方法は、当業者に理解されている。例えば、ｉＮＫＴ細胞が対象由来のＰＢＭＣから単離された後、ｉＮＫＴ細胞は、ｉＮＫＴ細胞を活性化して増幅できる１種又は複数の刺激剤の存在下で培養される。ｉＮＫＴ細胞を許容できる好適な刺激剤は、当技術分野において既知である。例えば、一実施形態では、非増殖性フィーダー細胞（ｉＮＫＴ細胞に対して自家又は同種の細胞を含む）及びＩＬ－２を含む培地中のＴ細胞受容体にシグナルを送る薬剤が、ｉＮＫＴ細胞を増殖させる１種又は複数の刺激剤として使用される。例えば、脂質をロードした組換えＣＤ１ｄ分子又は特異的刺激抗体で標識したビーズなどの他の方法が当技術分野において既知である（例えば、Ｅａｓｔ ＪＥ，Ｓｕｎ Ｗ，Ｗｅｂｂ ＴＪ．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ（ａＡＰＣ）ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１２ Ｄｅｃ ２９；（７０）：４３３３．ｄｏｉ：１０．３７９１／４３３３．ＰＭＩＤ：２３２９９３０８，及びＥｘｌｅｙ ＭＡ，Ｈｏｕ Ｒ，Ｓｈａｕｌｏｖ Ａ，Ｔｏｎｔｉ Ｅ，Ｄｅｌｌａｂｏｎａ Ｐ，Ｃａｓｏｒａｔｉ Ｇ，Ａｋｂａｒｉ Ｏ，Ａｋｍａｎ ＨＯ，Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ＥＡ，Ｇｕｍｐｅｒｚ ＪＥ，Ｂｏｙｓｏｎ ＪＥ，Ｂａｌｋ ＳＰ，Ｗｉｌｓｏｎ ＳＢ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ＴＣＲ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ ＣＤＲ３ ｌｏｏｐ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｊｕｎ；３８（６）：１７５６－６６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．２００７３７３８９．ＰＭＩＤ：１８４９３９８７，ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｅｎｔｉｒｅｔｉｅｓ）。企図される別の実施形態は、特に、ＣＤ１ｄ及び共刺激リガンドを発現するように遺伝子操作された非増殖細胞である（例えば、Ｅｘｌｅｙ ＭＡ，Ｈｏｕ Ｒ，Ｓｈａｕｌｏｖ Ａ，Ｔｏｎｔｉ Ｅ，Ｄｅｌｌａｂｏｎａ Ｐ，Ｃａｓｏｒａｔｉ Ｇ，Ａｋｂａｒｉ Ｏ，Ａｋｍａｎ ＨＯ，Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ＥＡ，Ｇｕｍｐｅｒｚ ＪＥ，Ｂｏｙｓｏｎ ＪＥ，Ｂａｌｋ ＳＰ，Ｗｉｌｓｏｎ ＳＢ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ＴＣＲ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ ＣＤＲ３ ｌｏｏｐ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｊｕｎ；３８（６）：１７５６－６６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．２００７３７３８９．ＰＭＩＤ：１８４９３９８７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２８６４５３８などを参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。「非増殖性フィーダー細胞」及びそれらを作製する方法は、当技術分野において既知である。一例では、非増殖性フィーダー細胞は、対象、例えば、健康な成人ドナーから単離されたＰＢＭＣを含み得る。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、ｉＮＫＴ細胞ドナー由来である。フィーダー細胞は、ｉＮＫＴ細胞との培養の前に、当該技術分野において既知の方法により処理され（例えば、共培養の前に照射される）、望ましくない細胞（例えば、フィーダー細胞）の増殖が停止される。フィーダー細胞は、培養成分（例えば、サイトカイン及び他の成長因子、細胞表面リガンド）を提供し、インビトロ培養でｉＮＫＴ細胞増殖を可能にする。フィーダー細胞を調製する好適な方法は、当技術分野において既知であり、例えば、ＰＢＭＣが、Ｘ線照射器又はセシウム照射器などのγ粒子照射器を用いて約７０Ｇｙの電離放射線で照射され、ｉＮＫＴ細胞と共に培養の前に、ＩＬ－２及び活性化化合物（例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、又は特異的抗体）を含む培地中に再懸濁される。他の実施形態では、フィーダー細胞由来の順化培地、又は組換えサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８）を１種又は複数の刺激剤として使用できる。
【0033】
ｉＮＫＴ細胞及び少なくとも１種の刺激剤／因子（例えば、フィーダー細胞、ビーズ、抗体、ＰＨＡなど、及びＩＬ－２）が組織培養プレートに提供され、ｉＮＫＴ細胞が増殖するのに十分な時間にわたり培養される。ｉＮＫＴ細胞の増殖に好適な培養物中のＩＬ－２の濃度は当技術分野において既知であり、例えば、約５Ｕ／ｍｌ～約１０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは約２５Ｕ／ｍｌ～約４００Ｕ／ｍｌ、好ましくは約２００Ｕ／ｍｌである。
【0034】
好ましくは、ｉＮＫＴ細胞が培養され、合成培地、好ましくは、ゼノゲンフリー培地中でコンジュゲートが形成される。いくつかの実施形態では、培地は無血清である。さらなる実施形態では、培地は、無血清及びゼノゲンフリーである。用語「合成」は、培地内の全ての成分が既知の培地を意味する。好適なゼノゲンフリー培地は当技術分野において既知であり、限定されないが、例えば、Ｘ－ＶＩＶＯ－１０（Ｌｏｎｚａ）、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ又はＡＩＭ Ｃ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
【0035】
１種又は複数の刺激剤がｉＮＫＴ／フィーダー培養物に添加される。好適な刺激剤には、限定されないが、例えば、特に、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、ｉＮＫＴ－ＴＣＲ特異的抗体（例えば、６Ｂ１１）、α－ＧａｌＣｅｒ（又はＰＢＳ５７などの他の関連化合物）をロードした組換えＣＤ１ｄ分子、ＣＤ１ｄ及び他の重要な活性化分子を発現する改変細胞株が挙げられる。好適な刺激剤は当該技術分野において既知であり、本発明での使用が企図されるであろう。一実施形態では、次の刺激剤の片方又は両方が、ｉＮＫＴ／フィーダー培養物に添加される：１～５μｇ／ｍｌの最終濃度のフィトヘマグルチニン、又は１０～３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ ｍＡｂ（例えば、クローンＯＫＴ３又はＳＰＶＴ３ｂ）。細胞は、ｉＮＫＴ細胞の増殖を可能にするのに十分な時間にわたり培養される。細胞は、少なくとも２週間、あるいは、少なくとも４週間、あるいは、少なくとも６週間、あるいは、少なくとも８週間培養され得る。ｉＮＫＴ細胞は、培養中に、ｉＮＫＴ細胞の数が増大するように見える限り、培養され得る。更に、ｉＮＫＴ細胞の増殖が遅くなるように見えると、ｉＮＫＴ細胞は、増殖を増大させるために、１種又は複数の刺激剤を再度加えることにより、再刺激され得る。多くのこのような再刺激を一定期間にわたり順次実施することにより、ｉＮＫＴ細胞の培養は、１年を越える期間にわたり増殖させ得る。ｉＮＫＴ細胞は、細胞が組織培養皿上で集密度に達すると、追加の培養液に分割される。ｉＮＫＴ細胞は、０．５ｘ１０6／ｃｍ2（１ｍｌ／ｃｍ2の体積中で）を越える密度に達すると、分割でき、それらが２ｘ１０6／ｃｍ2以上である場合、分割しなければならない。必要に応じ、ｉＮＫＴ細胞は、フローサイトメトリー又は磁気選別により、培養物から更に精製して、汚染細胞を除去し、（１種又は複数のｉＮＫＴ細胞マーカー、例えば、ＣＤ４、ＣＤ３、及び／又はＣＤ１ｄ－四量体（即ち、ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞）の染色により示されるように）実質的に純粋なｉＮＫＴ細胞集団、例えば、９５％超のｉＮＫＴ細胞、好ましくは９８％超、最も好ましくは少なくとも９９％超のｉＮＫＴ細胞を得ることができる。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）対象の血液試料から得た末梢血単核球からＣＤ１ｄ－四量体+ＣＤ４+ＣＤ３+ｉＮＫＴ細胞を選別すること、及び（ｂ）選別したＣＤ１ｄ－四量体+ＣＤ４+ＣＤ３+ｉＮＫＴ細胞を培養により増殖すること、を含む。
【0036】
別の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、単一選別ｉＮＫＴ細胞の増殖（即ち、クローン培養）から生成できる。ｉＮＫＴ細胞の選別方法は、当技術分野において既知であり、本明細書で記載される（例えば、ＦＡＣＳ、磁気選別など）。いくつかの実施形態では、複数のｉＮＫＴクローン培養（即ち、単一細胞由来の集団）が、コンジュゲートの形成で使用する前に、一緒に混合される。
【0037】
いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、凍結培地中で、約１～２０ｘ１０6細胞／ｍｌの濃度の一定分量で凍結され、多細胞コンジュゲートの作製で使用するための解凍まで、－８０℃で貯蔵される。好適な凍結培地は当技術分野において既知であり、市販で入手でき、例えば、特にＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０凍結培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）、Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、又は臨床クレードＣＴＳ Ｓｙｎｔｈ－ａ－Ｆｒｅｅｚｅ（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
ｉＮＫＴ細胞は、培養、増殖、及びその後、多細胞コンジュゲートが作製される時点まで凍結できる。
ｉＮＫＴ細胞は、培養、増殖、及びその後、多細胞コンジュゲートが作製される時点まで凍結できる。
【0038】
多細胞コンジュゲート及び組成物
多細胞コンジュゲートは、ヒトｉＮＫＴ細胞（健康な対象の血液から単離され、組織培養で増殖された）をヒトＤＣ（例えば、新たに単離した単球を組織培養でＤＣに分化させることにより生成される）と組み合わされることにより調製される。いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣは、少なくとも２０％の細胞が２つ又は３つの細胞を含むコンジュゲートとして強く接着するような条件で培養される。他の実施形態では、培養物は、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣを含むダブレット又はダブレットとトリプレットによって選択又は選別され、純粋なコンジュゲート調製物を得るこことができる。上述のＤＣは、コンジュゲート化の前に、その間に、又はその後に、１種又は複数の抗原をロードされ得る。好ましい実施形態では、ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞及び抗原と同時にインキュベートされる。例えば、一実施形態では、方法は、（ａ）対象からｉＮＫＴ細胞を得ること；（ｂ）ｉＮＫＴ細胞を培養で増殖すること；（ｃ）増殖させたｉＮＫＴ細胞を貯蔵するために凍結すること；（ｄ）第２の対象から単球を収集すること；（ｅ）ＤＣへの分化を誘導する条件を用いてインビトロで単球を培養すること；（ｆ）凍結ｉＮＫＴ細胞を解凍すること；及び（ｇ）解凍したｉＮＫＴ細胞をＤＣ、及び多細胞ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートを形成するのに十分な比率の抗原と共培養すること、を含む。別の実施形態では、方法は、（ａ）対象からｉＮＫＴ細胞を得ること；（ｂ）ｉＮＫＴ細胞を培養で増殖すること；（ｃ）増殖させたｉＮＫＴ細胞を貯蔵するために凍結すること；（ｄ）対象から単球を収集すること；（ｅ）ＤＣへの分化を誘導する条件を用いてインビトロで単球を培養すること；（ｆ）ＤＣを抗原と接触させること；（ｇ）凍結ｉＮＫＴ細胞を解凍すること；及び（ｈ）解凍したｉＮＫＴ細胞を多細胞ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートを形成するのに十分な比率の、抗原に接触させたＤＣと共培養すること、を含む。
多細胞コンジュゲートは、ヒトｉＮＫＴ細胞（健康な対象の血液から単離され、組織培養で増殖された）をヒトＤＣ（例えば、新たに単離した単球を組織培養でＤＣに分化させることにより生成される）と組み合わされることにより調製される。いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣは、少なくとも２０％の細胞が２つ又は３つの細胞を含むコンジュゲートとして強く接着するような条件で培養される。他の実施形態では、培養物は、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣを含むダブレット又はダブレットとトリプレットによって選択又は選別され、純粋なコンジュゲート調製物を得るこことができる。上述のＤＣは、コンジュゲート化の前に、その間に、又はその後に、１種又は複数の抗原をロードされ得る。好ましい実施形態では、ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞及び抗原と同時にインキュベートされる。例えば、一実施形態では、方法は、（ａ）対象からｉＮＫＴ細胞を得ること；（ｂ）ｉＮＫＴ細胞を培養で増殖すること；（ｃ）増殖させたｉＮＫＴ細胞を貯蔵するために凍結すること；（ｄ）第２の対象から単球を収集すること；（ｅ）ＤＣへの分化を誘導する条件を用いてインビトロで単球を培養すること；（ｆ）凍結ｉＮＫＴ細胞を解凍すること；及び（ｇ）解凍したｉＮＫＴ細胞をＤＣ、及び多細胞ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートを形成するのに十分な比率の抗原と共培養すること、を含む。別の実施形態では、方法は、（ａ）対象からｉＮＫＴ細胞を得ること；（ｂ）ｉＮＫＴ細胞を培養で増殖すること；（ｃ）増殖させたｉＮＫＴ細胞を貯蔵するために凍結すること；（ｄ）対象から単球を収集すること；（ｅ）ＤＣへの分化を誘導する条件を用いてインビトロで単球を培養すること；（ｆ）ＤＣを抗原と接触させること；（ｇ）凍結ｉＮＫＴ細胞を解凍すること；及び（ｈ）解凍したｉＮＫＴ細胞を多細胞ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートを形成するのに十分な比率の、抗原に接触させたＤＣと共培養すること、を含む。
【0039】
別の実施形態では、ヒトＤＣ（例えば、組織培養により、新たに単離した単球をＤＣに分化させることにより生成されたＤＣ）が、ｉＮＫＴ細胞とインキュベーションの前に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はサイトカインを含む培地に曝露される。このＤＣの前処理ステップは、ｉＮＫＴ細胞との共培養中に生成される多細胞コンジュゲートの量を増大させることができる。例えば、限定されないが、方法は、リゾリン脂質を含む結合脂質を含む高度に精製された又は組換えヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を使用し得るか、又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、又はインターフェロンγ（ＩＦＮγ）などのサイトカインを使用し得る。ＤＣは、ｉＮＫＴコンジュゲート化の前に、ＨＳＡ又はサイトカインの存在下で、十分な時間にわたり培養され、それにより、プレインキュベーションステップは、形成される多細胞コンジュゲート量を増大させる。一方法では、ＤＣは、無血清培地（例えば、Ｘ－ＶＩＶＯ－１０（Ｌｏｎｚａ）、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ又はＡＩＭ Ｃ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ））中で１～８時間培養された後、ＨＳＡが培地に添加され、ｉＮＫＴ細胞と混合される前に、ＤＣは更に１～８時間培養される。別の方法では、ＤＣがｉＮＫＴ細胞と組み合わされる前に、１～８時間にわたり、ＴＮＦα、ＩＬ－１β、及び／又はＩＦＮγなどのサイトカインがＤＣ培養物に添加される。例えば、ｉＮＫＴ細胞とのインキュベーション後、記載方法による培養物中のＤＣの少なくとも２０％、あるいは、少なくとも４０％、あるいは、少なくとも６０％超が多細胞コンジュゲート内に存在する。この方法は、コンジュゲートのためのさらなる精製又は単離ステップの必要なしに、細胞調製物が使用できる十分な多細胞コンジュゲートを産生する。この場合でも、上述のＤＣは、コンジュゲート化の前に、その間に、又はその後に、抗原をロードされる。好ましい実施形態では、ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞と同時に抗原とインキュベートされる。例えば、一実施形態では、方法は、（ａ）対象からｉＮＫＴ細胞を得ること；（ｂ）ｉＮＫＴ細胞を培養で増殖すること；（ｃ）増殖させたｉＮＫＴ細胞を貯蔵するために凍結すること；（ｄ）第２の対象から単球を収集すること；（ｅ）ＤＣへの分化を誘導する条件を用いてインビトロで単球を培養すること；（ｆ）凍結ｉＮＫＴ細胞を解凍すること；（ｇ）ＤＣを無血清培地及びＨＳＡ及び／又は添加したサイトカインで処理すること；及び（ｈ）解凍したｉＮＫＴ細胞を前処理したＤＣ、及びｉＮＫＴ＋ＤＣ細胞の多細胞コンジュゲートを形成するのに十分な比率の抗原と共培養すること、を含む。この方法は、多細胞コンジュゲートの使用前に、追加の単離又は分離ステップを必要としないのが好ましい。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、ｉＮＫＴとＤＣのコンジュゲート化の間、培地中に残される。他の実施形態では、ＨＳＡは、コンジュゲート化の間に培地中に供給されない。
【0040】
いくつかの実施形態では、多細胞コンジュゲートは、培養によりｉＮＫＴ及びＤＣ細胞がコンジュゲートを形成する（例えば、培養物の２０％超がコンジュゲートである、あるいは、培養物中の細胞の４０％超、あるいは、培養物中の細胞の５０％がコンジュゲートである）条件下で形成される。何らかの理論に拘泥する物ではないが、いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、培養での非コンジュゲート化細胞の単離の必要なしに、本明細書で更に記載される治療方法で使用され得る。
【0041】
さらなる実施形態では、上記方法は、培養物から多細胞コンジュゲートを選択又は選別するステップを更に含み得る。一実施形態では、コンジュゲートは、フローサイトメトリーでそれらの光散乱により選択され得る。多細胞コンジュゲートを選別する他の方法は、当技術分野において既知である。例えば、多細胞コンジュゲートをそれらが形成された培養物から選別する好適な方法には、限定されないが、例えば、ｉＮＫＴ及びＤＣ発現マーカーを用いたフローサイトメトリーセルソーティングが挙げられる。更に、好ましい方法は、抗体の使用（及び種々のフルオロフォアで事前標識されているＮＫＴ細胞とＤＣの使用）を回避すべきであろう。別の実施形態では、多細胞コンジュゲートは、特定のサイズを越える（例えば、４つ以上の細胞を含む）細胞凝集体から分離し、更に未変化の樹状細胞以下のサイズの物質を除去すべきであろう。
【0042】
ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、接触依存性方式で、抗原特異的ヒトＴ細胞を活性化する。これは、次に、抗原特異的免疫応答、特に、それを必要としている対象の抗原特異的Ｔ細胞応答を活性化する能力を可能にする。実施例では、発明者らは、エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）誘導ヒトＢ細胞リンパ腫のヒト化マウスモデルへのｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートの投与が、腫瘍塊を除去し、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートへの曝露がＴ細胞による標的細胞殺傷をインビトロで促進することを示した。従って、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは適切な抗原由来源（例えば、腫瘍細胞抗原又は病原性（例えば、ウィルス、細菌性、真菌）抗原）をロードでき、多細胞免疫療法剤として投与して、対象内の特異的Ｔ細胞集団を活性化し、抗原関連状態の治療及び回復を支援できる。
【0043】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の多細胞コンジュゲートは、サイトカインＩＬ－１２ｐ７０を、他の因子と一緒に培地中に分泌する。別の実施形態では、多細胞コンジュゲートは、サイトカインＩＦＮγを、培地中に発現する。コンジュゲートのＤＣ及びｉＮＫＴ細胞はそれぞれ、コンジュゲート化後に、それらの表面上に特定のマーカーを発現し、いくつかの実施形態では、それらの非コンジュゲート化対応物と比べて、特定のマーカー又は刺激因子を上方制御又は下方制御し得る。例えば、多細胞コンジュゲートの細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ１３７Ｌ（４－１ＢＢＬ）、ＣＤ２１５（ＩＬ－１５Ｒα）又はこれらの組み合わせをその表面上に発現できる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、非コンジュゲート化ＤＣに比べて、共刺激リガンドＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２１５又はこれらの組み合わせの高レベルの細胞表面発現、及び阻害性リガンドＰＤ－Ｌ１のより低い発現を示した。例えば、一実施形態では、コンジュゲートのｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ７０を発現し、コンジュゲートのＤＣは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２１５又はこれらの組み合わせから選択される１種又は複数のマーカーを発現する。細胞表面発現のレベルは、当該技術分野において既知の方法により、例えば、フローサイトメトリー分析、免疫蛍光顕微鏡、及び当業者により実施される他の好適な方法により測定できる。
【0044】
同じものを含む多細胞コンジュゲート及び組成物は、対象で免疫応答を誘発するために使用できる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４+Ｔ細胞応答が誘発される。他の実施形態では、ＣＤ８+Ｔ細胞応答が誘発される。さらなる実施形態では、多細胞コンジュゲート及びその組成物は、対象内の１種又は複数の免疫活性化サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＮＦγなどの発現を高めるために使用される。多細胞コンジュゲート及びその組成物はまた、炎症促進性サイトカインの発現を調節するために使用できる。医薬組成物等の組成物は、本発明の多細胞コンジュゲート調製物を含む。多細胞コンジュゲートに加えて、このような組成物は、薬学的に許容可能な担体を含み得る。用語「薬学的に許容可能な」は、規制当局（例えば、連邦又は州政府当局）により対象への投与用として承認された組成物を意味し得る。用語「担体」は、医薬組成物が一緒に投与できる希釈剤、賦形剤、又はビークルを意味し得る。薬学的に許容可能な担体は、当技術分野において既知であり、限定されないが、例えば、特に、希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、リポソーム、ナノ粒子が挙げられる。薬学的に許容可能な担体は、貯蔵及び対象への送達のために多細胞コンジュゲートの生存率を維持するのが適切である。更に、このような薬学的に許容可能な担体は、水性又は非水性溶媒中の、溶液、懸濁液、及び乳剤であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注入可能な有機エステルである。好適な水性溶媒担体としては、等張性溶液、アルコール性／水性溶液、乳剤あるいは懸濁液が挙げられ、生理食塩水及び緩衝化媒体を含む。水単独は、好適な生理学的に許容可能な担体として企図されない。いくつかの実施形態では、対象への投与のために生理学的に許容可能な追加の成分が、細胞生存率を保ち、本発明のコンジュゲートを維持するために添加され得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの追加の薬学的に許容可能な物質を適切な生理学的条件に対する必要性に応じて含み得る。
【0045】
組成物は、従来のよく知られた、多細胞コンジュゲートの生存率を維持する滅菌技術により滅菌できる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。製剤は、投与方法に従って選択する必要がある。緩衝液としては、限定されないが、リン酸塩、クエン酸及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；血清、アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びブドウ糖、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はツイーン（商標）ブランド界面活性物質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）界面活性物質などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。薬学的に許容可能な担体は、限定されないが、０．０１～０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液又は０．９％の生理食塩水を含み得る。他の好適な薬学的に許容可能な担体も企図されている。
【0046】
いくつかの実施形態では、組成物は、多細胞コンジュゲート及び１種又は複数のチェックポイント阻害剤を含む。好適なチェックポイント阻害剤としては、例えば、限定されないが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、及びＣＳＦ－１Ｒ、並びにこのようなチェックポイント阻害剤の組み合わせを含むＴ細胞免疫チェックポイント受容体の遮断ができる薬剤が挙げられるがこれらに限定されない。チェックポイント阻害を行う薬剤は、小さい化学物質又はポリマー、抗体、抗体フラグメント、単鎖抗体又は限定されないが、二重特異的抗体及びディアボディを含む他の抗体構築物であってよい。本発明により使用され得る免疫チェックポイント阻害薬としては、限定されないが、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、及び／又は抗ＴＩＭ－３抗体が挙げられる。米国で承認されたチェックポイント阻害剤には、アテゾリズマブ、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、及びニボルマブが挙げられる。第３相臨床試験中の他のものには、チスレリズマブが含まれる。阻害剤は、抗体である必要はないが、小分子又は他のポリマーであり得る。阻害剤が抗体の場合、それは、ポリクローナル、モノクローナル、フラグメント、単鎖、又は他の抗体バリアント構築物であり得る。阻害剤は、限定されないが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、及びＢ－７リガンドファミリーを含む当該技術分野において既知のいずれかの免疫チェックポイントを標的にし得る。単一標的免疫チェックポイントのための阻害剤、又は異なる免疫チェックポイントに対する異なる阻害剤の組み合わせを使用し得る。好ましくは、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１又はＣＴＬＡ－４阻害剤チェックポイント阻害剤である。
【0047】
チェックポイント阻害剤は市販で入手でき、当該技術分野において既知である。例えば、特に、抗ＣＴＬ４抗体のトレメリムマブは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）から入手可能であり、米国特許第６６８２７３６号及び欧州特許１１４１０２８に記載されている；アテゾリズマブは、抗ＰＤ－Ｌ１であり、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｈｅ）から入手可能であり、米国特許第８２１７１４９号に記載されている；抗ＣＴＬＡ－４であるイピリムマブは、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏから入手可能であり、特に、米国特許第７６０５２３８号、同第６９８４７２０号、同第５８１１０９７号、及び欧州特許１２１２４２２に記載されている；抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブは、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏから入手可能であり、米国特許第８９５２１３６号、同第８３５４５５０９号、同第８９００５８７号、及び欧州特許２１７０９５９に記載されている；抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブは、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏから入手可能であり、米国特許第７５９５０４８号、同第８７２８４７４号、同第９０７３９９４号、同第９０６７９９９号、同第８００８４４９号及び同第８７７９１０５号に記載されている；チスレリズマブは、ＢｅｉＧｅｎｅから入手可能であり、米国特許第８７３５５５３号に記載されている。
【0048】
いくつかの実施形態では、下記で更に記載のように、この組成物は、がんの治療に使用するためのものである。組成物は、以降でより詳細に記載されるように、がんの治療のために、多細胞コンジュゲート単独、又は多細胞コンジュゲート及び１種又は複数のチェックポイント阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、他の免疫療法剤と併せて投与され得る。例えば、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、除去するためにがん細胞を標的にするように設計された、ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法剤、ＮＫ細胞ベース免疫療法剤、又は抗体媒介免疫療法剤と併せて投与され得る。好適な免疫療法剤は、当技術分野において既知であり、例えば、標的化がん療法剤は、免疫系Ｂ細胞の表面上にあるＣＤ２０に対するキメラモノクローナル抗体であるリツキシマブであり、特定のタイプのがん（例えば、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍など）を治療するために使用される。別の実施形態では、コンジュゲートは、免疫応答を活性化するように設計されている他の生物学的製剤（例えば、ＩＬ－１５などのサイトカイン、又はＩ型もしくはＩＩＩ型インターフェロン）又は手法（例えば、特定の照射プロトコル）と組み合わせて投与され得る。
【0049】
治療方法
本明細書で記載の多細胞コンジュゲート（及びそれらを含む組成物）は、ヒト抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化を必要としている対象でそれを行うために使用できる。ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、Ｔリンパ球を活性化することが知られている多種多様のリガンドの細胞表面発現レベルを高めたので、これは、多細胞コンジュゲートが標的にする特異的抗原に対してＴ細胞活性化を高めることを可能にする。本明細書で記載の多細胞コンジュゲートは、実施例で示されるように、接触依存性方式で、抗原特異的ヒトＴ細胞を活性化できる。このような多細胞コンジュゲートのマウス腫瘍モデルへの投与は、腫瘍塊を除去し、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートへの曝露がＴ細胞による標的細胞殺傷をインビトロで促進することを示した。ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、抗原に関連する状態を治療するために特異的抗原に対して、同種又は自家方式で使用できる。例えば、治療を必要としている対象由来の同種ｉＮＫＴ細胞を増殖し、更に後で行われる自家ＤＣとのコンジュゲート化のために凍結できる。いくつかの実施形態では、多細胞コンジュゲート及びその組成物は、対象内のＣＤ４+Ｔ細胞を活性化する方法で使用できる。別の実施形態では、多細胞コンジュゲート及びその組成物は、抗原依存性方式でＣＤ８+Ｔ細胞を活性化するために使用できる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８+及び／又はＣＤ４+Ｔ細胞は、抗腫瘍効果を生じ、腫瘍の細胞成長及び増殖を阻害又は低減できる。
本明細書で記載の多細胞コンジュゲート（及びそれらを含む組成物）は、ヒト抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化を必要としている対象でそれを行うために使用できる。ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、Ｔリンパ球を活性化することが知られている多種多様のリガンドの細胞表面発現レベルを高めたので、これは、多細胞コンジュゲートが標的にする特異的抗原に対してＴ細胞活性化を高めることを可能にする。本明細書で記載の多細胞コンジュゲートは、実施例で示されるように、接触依存性方式で、抗原特異的ヒトＴ細胞を活性化できる。このような多細胞コンジュゲートのマウス腫瘍モデルへの投与は、腫瘍塊を除去し、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートへの曝露がＴ細胞による標的細胞殺傷をインビトロで促進することを示した。ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、抗原に関連する状態を治療するために特異的抗原に対して、同種又は自家方式で使用できる。例えば、治療を必要としている対象由来の同種ｉＮＫＴ細胞を増殖し、更に後で行われる自家ＤＣとのコンジュゲート化のために凍結できる。いくつかの実施形態では、多細胞コンジュゲート及びその組成物は、対象内のＣＤ４+Ｔ細胞を活性化する方法で使用できる。別の実施形態では、多細胞コンジュゲート及びその組成物は、抗原依存性方式でＣＤ８+Ｔ細胞を活性化するために使用できる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８+及び／又はＣＤ４+Ｔ細胞は、抗腫瘍効果を生じ、腫瘍の細胞成長及び増殖を阻害又は低減できる。
【0050】
本開示は、培養ｉＮＫＴ細胞（例えば、「既製の」ｉＮＫＴ細胞）を生成することを含む、抗原に関連する状態を治療する方法及びキット、並びに同種ｉＮＫＴ細胞を、治療を必要としている患者から新たに生成された単球由来ＤＣとコンジュゲート化するために使用する方法を提供する。例えば、多細胞コンジュゲートは、ｉＮＫＴ細胞にコンジュゲート化された適切な抗原由来源（例えば、腫瘍細胞抗原又は病原体抗原）をロードしたＤＣから作製され、多細胞コンジュゲート（即ち、細胞免疫療法剤）として投与されて、患者のＴ細胞を抗原に対して活性化させ得る。
【0051】
従って、一実施形態では、本開示は、抗原に関連する状態の対象を治療する方法を提供する。方法は、有効量の本明細書で記載の多細胞コンジュゲートを、状態を治療するために投与することを含む。上述のように、多細胞コンジュゲートは、状態に関連する抗原をロードしたＤＣを含む。本明細書で使用される場合、「抗原に関連する状態」という用語は、１種又は複数の特異的抗原が関連する特徴である状態又は疾患を意味し、１種又は複数の抗原に対する細胞性免疫応答（特に、Ｔ細胞応答）が疾患又は状態の低減、抑制又は除去をもたらす。「抗原」という用語は、身体中の免疫応答を誘導する分子を意味する。用語「抗原」は、用語「免疫原」と同じ意味で使用できる。特に、本発明での使用に好適する抗原は、細胞性免疫応答、特に、Ｔ細胞応答を誘発できる抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書で更に記載される、超抗原であり得る。
【0052】
いくつかの実施形態では、抗原は改変された超抗原又はそのフラグメントである。超抗原は、免疫反応を免疫調節できる微生物タンパク質又は合成タンパク質である。超抗原は通常、細菌、ウィルス及びマイコプラズマなどの微生物から導かれる。免疫系に対するそれらの効果は、抗原に直接接触しない抗原提示細胞上のＭＨＣ分子の外側部分及びＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の部分の両方に対するそれらの結合を介して得られる。いくつかの事例では、超抗原は、免疫活性化を調節する微生物由来のタンパク質を模倣する合成ペプチドである。好適な超抗原は、特に、連鎖球菌性発熱性外毒素（ＳＰＥ）、ブドウ状球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、及び毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）から導かれ得る。これらは、当該技術分野においてよく知られている。超抗原は、当該技術分野においてよく知られており、限定されないが、Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｈｅｒｍａｎ Ａ，Ｋａｐｐｌｅｒ ＪＷ，Ｍａｒｒａｃｋ Ｐ，Ｐｕｌｌｅｎ ＡＭ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；９：７４５－７２．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｉｙ．０９．０４０１９１．００３５２５．ＰＭＩＤ：１８３２８７５；Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ａ Ｃｒｕｚｉｐａｉｎ Ｄｏｍａｉｎ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ａｎｔｏｎｏｇｌｏｕ ＭＢ，Ｓａｎｃｈｅｚ Ａｌｂｅｒｔｉ Ａ，Ｒｅｄｏｌｆｉ ＤＭ，Ｂｉｖｏｎａ ＡＥ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｌｙｎｃｈ ＭＪ，Ｎｏｌｉ Ｔｒｕａｎｔ Ｓ，Ｓａｒｒａｔｅａ ＭＢ，Ｉａｎｎａｎｔｕｏｎｏ Ｌｏｐｅｚ ＬＶ，Ｍａｌｃｈｉｏｄｉ ＥＬ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＭＭ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０ Ｊｕｎ ３０；１１：１２７９．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．０１２７９．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０２０．ＰＭＩＤ：３２６９５１０５、に記載の超抗原又はこれらで見つかるものから導かれる。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0053】
上述のように、ＤＣは、抗原の由来源と接触させられるか、又はそれをロードされる。このようにロードしたＤＣは、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートを介して投与される場合、Ｔ細胞の抗原特異的集団を、コンジュゲート内のＤＣにロードされた抗原に応じて、活性化できる。
【0054】
この段階で使用される抗原は、治療される疾患に依存する。関連抗原は、特に、全不活化腫瘍細胞、全タンパク質（例えば、腫瘍細胞から直接導かれたか、又は組換えで産生された全タンパク質）、合成ペプチド又は分子の形態でＤＣ培地に添加できる。ＤＣは、これらの抗原、即ち、タンパク質を、それらがＤＣのＭＨＣ分子中に細胞内ロードするペプチド中に取り込み、プロセッシングした後、これらは、細胞表面に輸送される。ＤＣ表面上に輸送されると、抗原をロードしたＭＨＣ分子は、Ｔ細胞と接触時に、抗原特異的Ｔ細胞と相互作用し、そのＴ細胞応答を活性化できる。全細胞又は全タンパク質を抗原由来源として使用する利点は、その個別のＤＣの特定のＭＨＣ分子（即ち、ＭＨＣクラスＩＩ分子）を介してロードできる特異的ペプチド配列を特定する必要がないことである。全タンパク質が、ＤＣ内で細胞内プロセッシングされ、その後、適切な抗原フラグメントがＭＨＣ分子を介してＤＣ表面上に発現され得る。他の実施形態では、ＭＨＣ分子上に提示できることが知られているペプチドは使用できる。一実施形態では、ＤＣと接触させられた又はそれとインキュベートされた抗原は、取り込まれ、ＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩ分子上での発現のためにプロセッシングされ、これは、次に、抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を活性化できる。
【0055】
別の実施形態では、ＤＣとインキュベートされた抗原は、取り込まれ、ＤＣ上のＭＨＣクラスＩ分子により提示され（「交差提示」として知られる工程）、これは、次に、抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化を可能にする。別の実施形態では、合成ペプチドは、特異的ＭＨＣクラスＩ分子に結合する既知の抗原エピトープを含むＤＣとインキュベートでき、次に、ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化を可能にする。別の実施形態では、ペプチド又はタンパク質抗原は、外来性ポリヌクレオチド配列（例えば、プラスミド、ウィルスベクターなど）により、又はＤＮＡ又はＲＮＡ形質導入もしくは遺伝子導入を介して、細胞中で発現され得、これは、ＤＣ表面上のＭＨＣ／ＨＬＡ分子中の抗原の合成、プロセッシング及び発現を可能にする。
【0056】
いくつかの実施形態では、状態はがんであり、抗原は腫瘍抗原である。特に、いくつかの実施形態では、多細胞コンジュゲートは、がんの患者から取得されたＤＣを含む。いくつかの実施形態では、多細胞コンジュゲートは、腫瘍抗原又はそのフラグメントに結合したＭＨＣ ＩＩ又はＭＨＣ Ｉを発現しているＤＣを含む。
一実施形態では、抗原に関連する状態は、がん又は腫瘍である（例えば、抗原は腫瘍抗原又はがん抗原である）。腫瘍抗原は、腫瘍細胞により産生される抗原である。これらの抗原は、時として、腫瘍細胞のみにより発現され、正常な非腫瘍細胞によっては決して発現されることがなく、従って、腫瘍特異的抗原と呼ばれる。いくつかの事例では、腫瘍特異的抗原は、腫瘍特異的変異に起因する。いくつかの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞及び正常細胞により提示されるが、腫瘍細胞上で発現上昇した量で見られる抗原である。腫瘍特異的抗原及び腫瘍関連抗原の両方は、本発明で使用するために企図されている。
一実施形態では、抗原に関連する状態は、がん又は腫瘍である（例えば、抗原は腫瘍抗原又はがん抗原である）。腫瘍抗原は、腫瘍細胞により産生される抗原である。これらの抗原は、時として、腫瘍細胞のみにより発現され、正常な非腫瘍細胞によっては決して発現されることがなく、従って、腫瘍特異的抗原と呼ばれる。いくつかの事例では、腫瘍特異的抗原は、腫瘍特異的変異に起因する。いくつかの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞及び正常細胞により提示されるが、腫瘍細胞上で発現上昇した量で見られる抗原である。腫瘍特異的抗原及び腫瘍関連抗原の両方は、本発明で使用するために企図されている。
【0057】
腫瘍に選択的に関連付けられる腫瘍抗原は、次の３つの主要分類に分けられる：ｉ）特定の患者の個別の体細胞変異に由来する、及び患者間で希にしか共有されない新抗原（即ち、患者特異的腫瘍抗原）；ｉｉ）特異的タイプの腫瘍により特徴的に発現されるタンパク質（即ち、共通の腫瘍特異的抗原）；ｉｉｉ）発がんウィルス由来のウィルスタンパク質。本発明は、１種又は複数の腫瘍抗原を使用することが企図されている。患者特異的腫瘍抗原（新抗原）は、患者自身のがん細胞由来の物質にＤＣを曝露することにより、最も効率的に送達され得る。がん細胞は、生検を介して得られ、ＤＣへの曝露の前に、照射又は他の方法により死滅させられる。ＤＣは、腫瘍細胞、又は腫瘍細胞から生成された総タンパク質抽出物に直接曝露される。あるいは、特異的新抗原は、ゲノム又は質量分光分析、及び合成により産生された対応するタンパク質／ペプチドにより特定され得る。
【0058】
共通の腫瘍抗原には、複数のタイプのがんにより発現される特徴がはっきりした、及び多くの異なる患者に共通の腫瘍関連抗原が含まれ、これらには、ＮＹ－ＥＳＯ－１などのがん精巣抗原、及び黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーのメンバー（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ３）が挙げられる。更に、ある特定の型の腫瘍（例えば、乳がん、造血器悪性腫瘍）を有する非血縁個体で発現される腫瘍特異的抗原が特定されている。
【0059】
多数の腫瘍抗原が当技術分野において既知であり、限定されないが、例えば、次記が挙げられる：（ｉ）ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１並びにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ及びＭＡＧＥファミリーポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、及びＭＡＧＥ－１２（これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳、胃腸、及び膀胱腫瘍に対処するために使用できる）などのがん－精巣抗原、（ｉｉ）変異抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍、例えば、結腸直腸、肺、頭頸部がんに関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がん及び結腸直腸がんに関連）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連）、カスパーゼ８（例えば、頭頸部がんに関連）、ＣＩＡ０２０５（例えば、膀胱がんに関連）、ＨＬＡ－Ａ２－Ｒ１７０１、βカテニン（例えば、黒色腫に関連）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連）、ＢＣＲ－ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ０２０５、ＣＤＣ－２７、及びＬＤＬＲ－ＦＵＴ、（ｉｉｉ）過剰発現抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんに関連）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病に関連）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連）、ＷＴ１（例えば、種々の白血病に関連）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんに関連）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんに関連）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（例えば、乳、結腸、肺及び卵巣がんに関連）、αフェトプロテイン（例えば、肝細胞腫に関連）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんに関連）、ガストリン（例えば、膵臓及び胃がんに関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ－１（例えば、乳及び卵巣がんに関連）、Ｇ－２５０（例えば、腎細胞癌に関連）、ｐ５３（例えば、乳、結腸がんに関連）、及び癌胎児抗原（例えば、乳がん、肺がん、及び結腸直腸がんなどの胃腸管のがんに関連）、（ｉｖ）共通抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質－１／ＴＲＰ１及びチロシナーゼ関連タンパク質－２／ＴＲＰ２（例えば、メラノーマに関連）などのメラノーマ－メラノサイト分化抗原、（ｖ）例えば、前立腺がんに関連する、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ－Ｐ１、ＰＳＭ－Ｐ１、ＰＳＭ－Ｐ２などの前立腺関連抗原、（ｖｉ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫に関連する）、並びに（ｉ）シアリルＴｎ及びシアリルＬｅx（例えば、乳及び結腸直腸がんに関連）並びに種々のムチンなどの糖タンパク質；糖タンパク質は、担体タンパク質に結合され得る（例えば、ＭＵＣ－１は、ＫＬＨに結合され得る）；（ｉｉ）リポポリペプチド（例えば、脂質部分に結合したＭＵＣ－１）；（ｉｉｉ）ポリサッカライド（例えば、Ｇｌｏｂｏ Ｈ合成六糖類）、これは、担体タンパク質に結合され得る（例えば、ＫＬＨに）、（ｉｖ）ＧＭ２、ＧＭ１２、ＧＤ２、ＧＤ３などのガングリオシド（例えば、脳、肺がん、黒色腫に関連）、を含むポリペプチド及びサッカライド含有抗原などの他の腫瘍抗原など。当技術分野において既知の追加の腫瘍抗原には、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、Ｈ－Ｒａｓ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、エプスタイン・バーウィルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６及びＥ７を含むヒトパピローマヒトパピローマ（ＨＰＶ）抗原、Ｂ及びＣ型肝炎ウィルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ向性ウィルス抗原、ＴＳＰ－１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｍｎ－２３Ｈ１、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１ Ｔｇｐ７２、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３（ＣＡ ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質／シクロフィリンＣ－関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが挙げられる。
【0060】
別の実施形態では、対象は、がん又は腫瘍の患者であり、方法は、多細胞コンジュゲート及びチェックポイント阻害剤をがんの患者に投与することを含む。好適なチェックポイント阻害剤としては、例えば、限定されないが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、及びＣＳＦ－１Ｒ、並びにこのようなチェックポイント阻害剤の組み合わせを含むＴ細胞免疫チェックポイント受容体の遮断ができる薬剤が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害薬には、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、及び／又は抗ＴＩＭ－３抗体が挙げられる。好適な阻害剤には、例えば、特に、トレメリムマブ、アテゾリズマブ、イピリムマブ（ｉｐｉｌｕｍｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ、及びニボルマブ、チスレリズマブが挙げられる。阻害剤は、抗体である必要はないが、小分子又は他のポリマーであり得る。好ましい実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤などである。好適なＰＤ－１阻害剤には、限定されないが、例えば、特に、抗ＰＤ－１抗体、例えば、ペムブロリズマブ（キイトルーダ）、ニボルマブ（オプジーボ）、及びセミプリマブ（リブタヨ）が挙げられる。好適な抗ＰＤ－Ｌ１阻害剤には、例えば、限定されないが、特に、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンチオ）、及びデュルバルマブ（イミフィンジ）を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が挙げられるがこれに限定されない。
【0061】
「がん」又は「腫瘍」は、固形及び非固形腫瘍を含む細胞のなんらかの異常な増殖又は無制御成長を意味している。本発明の方法は、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む、なんらかのがん、なんらかのその転移、及びなんらかのその化学療法残留増殖（ｃｈｅｍｏ－ｒｅｓｉｄｕａｌ ｇｒｏｗｔｈ）を治療するために使用できる。本明細書で記載の多細胞コンジュゲート及び組成物、方法及びキットにより治療可能な適合性がんとしては、限定されないが、リンパ腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠芽腫、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、結腸直腸がん、子宮頸がん（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌、唾液腺癌腫、中皮腫、腎臓がん、外陰がん、膵臓がん、甲状腺がん、肝癌、皮膚がん、黒色腫、脳がん、神経芽腫、骨髄腫、様々なタイプの頭頸部がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、及び末梢性神経上皮腫が挙げられる。本開示の組成物及び方法はまた、非ホジキンリンパ腫、白血病などの非固形腫瘍がんを治療するためにも利用できる。
【0062】
用語「転移」、「転移腫瘍」又は「二次腫瘍」は、二次的部位、例えば、原発腫瘍組織の外側に伝播したがん細胞を意味する。二次的部位には、限定されないが、リンパ系、皮膚、遠隔臓器（例えば、肝臓、胃、膵臓、脳など）等が挙げられる。
【0063】
本開示はまた、がんの対象のがん細胞増殖を低減又は抑制する方法を提供し、該方法は、有効量の本明細書で記載の多細胞コンジュゲート又は組成物を投与して、がん細胞増殖を低減又は抑制することを含み、多細胞コンジュゲートは、腫瘍抗原をロードしたＤＣを含む。抗原特異的多細胞コンジュゲートを得る好適な方法は、本明細書で記載される。
【0064】
本発明では、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象の疾患、状態又は障害との戦いの管理及び世話をすることを表す。治療は、症状又は合併症の発症を減らす、防止する、良くする及び／又は改善して、症状もしくは合併症を軽減、又は疾患、状態、もしくは障害を低減もしくは除去する本明細書で記載の多細胞コンジュゲート又は組成物の投与を含む。
【0065】
例えば、対象のがんの治療は、がん増殖の低減、抑制、遅延化又は防止；腫瘍体積の低減；及び／又は腫瘍の転移の防止、抑制、遅延化もしく低減を含む。対象のがんの治療はまた、対象中の腫瘍細胞の数の低減を含む。用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、次記の少なくとも１つにより特徴付け得る：（ａ）がん及びがん細胞の増殖の低減、遅延化又は抑制、これには、転移性がん細胞の増殖の遅延化又は抑制を含む；（ｂ）腫瘍のさらなる増殖の防止；（ｃ）対象中のがん細胞の転移の低減又は防止；及び（ｄ）がんの少なくとも１つの症状の低減又は改善。いくつかの実施形態では、最適有効量は、定型実験を用いて、当業者により容易に決定できる。
【0066】
いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法は、ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートで治療後に調節される免疫遺伝子の変化を生ずる抗腫瘍がん効果を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象の免疫応答を調節する方法を提供し、該方法は、多細胞コンジュゲート又はその組成物を、免疫学的な機能を決定する遺伝子の発現の上方制御及び／又は下方制御することにより示されるように、免疫応答を調節するのに十分な量で、対象に投与することを含む。一例は、図７Ｄで示され、ヒト免疫遺伝子発現の調節が、ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートのＥＢＶ誘導ヒトＢ細胞リンパ腫担持マウスに投与後に起こる。この例で示されるように、ｉＮＫＴ－ＤＣ治療後、キナーゼ（ＰＩＫ３アイソフォーム、ＭＡＰＫ１、ＡＫＴ３）などのシグナル伝達分子及びカルシウムチャネル調節因子ＳＴＩＭ１、転写因子（ＮＦＡＴ３Ｃ、ＦＯＸＯ３、ＫＬＦ２）、及びＴ細胞活性化及び輸送を調節する細胞表面受容体（ＣＤ２８、ＩＴＧＡＬ、Ｓ１ＰＲ１）を含む、Ｔ細胞活性化に付随する同義遺伝子が、発現上昇された。このようにｉＮＫＴ－ＤＣ治療後に下方制御された遺伝子には、ＩＬ－１０、ＦｃＲＬ１、及びＣＤ２２を含む、ＥＢＶ感染Ｂ細胞に関連する遺伝子が含まれた。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の多細胞コンジュゲート及び組成物は、免疫細胞遺伝子の発現を変えるために使用でき、方法は、十分な量の本明細書で記載の多細胞コンジュゲート又は組成物を投与することを含む。
【0067】
別の実施形態では、方法は、改変超抗原のように機能し、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲート上に発現したＭＨＣ分子との間で架橋を形成することにより、Ｔリンパの球サブセットを特異的に活性化する化合物を使用する。この実施形態では、ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞とのコンジュゲート化の前に、その間に、又はその後に、合成ペプチド又はポリペプチドとインキュベートされる。合成ＴＣＲ－ＭＨＣ架橋を有する多細胞コンジュゲートは、その後、対象に投与され、それにより、対象中で見出されたＴ細胞のサブセットの活性化を可能にする。
【0068】
別の実施形態では、抗原に関連する状態は、病原体感染症である。方法は、病原体感染症を治療するために、有効量の多細胞コンジュゲート又は多細胞コンジュゲートを含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、多細胞コンジュゲートのＤＣは、構築物の形成及び対象への投与の前に、少なくとも１種の病原体抗原と接触させられる。用語「病原体感染症の治療」は、病原体の増殖の低減、抑制又は防止、及び／又は病原体感染症の１種又は複数の症状の低減又は抑制を含む。
【0069】
病原体感染症は、病原体により引き起こされる疾患である。用語「病原体」は、感染性微生物又は病原体、例えば、ウィルス、細菌、原生動物、又は真菌（ｆｕｎｇｕｓ）を意味する。好ましい実施形態では、病原体感染症はウィルス感染症である。別の実施形態では、感染症は細菌感染症である。
病原体抗原は、病原体に関連する抗原、例えば、ウィルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原及び真菌抗原である。
病原体抗原は、病原体に関連する抗原、例えば、ウィルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原及び真菌抗原である。
【0070】
いくつかの実施形態では、病原体感染症はがんをもたらし、例えば、多数のウィルスが異なるがんに関連し、最も良く特徴がわかっている２種は、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）及びエプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）である。ＨＰＶは、頸部、肛門、及び頭頸部がんに関連している。最も広範に存在するＨＰＶの発がん性の株は、ＨＰＶ－１６であり、この株のＥ７タンパク質は、腫瘍関連抗原として明確に特徴づけられている。ＥＢＶは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、上咽頭癌、及び胃がんに関連している。Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原として明確に特徴づけられるＥＢＶタンパク質には、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２Ａが挙げられる。
【0071】
好適な細菌性抗原には、例えば、細菌から単離、精製又は導かれたタンパク質、ポリサッカライド、リポ多糖、及び外膜小胞が挙げられる。加えて、細菌性抗原には、細菌性溶解物及び及び不活化細菌配合物が含まれ得る。細菌抗原はまた、組換え発現により産生され得る。細菌性抗原は、そのライフサイクルの少なくとも１つの段階で、細菌の表面上に曝露されるエピトープを含むのが好ましい。好適な細菌性抗原としては、限定されないが、例えば、特に、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、化膿性連鎖球菌（グループＡ連鎖球菌）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、破傷風菌（破傷風）（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ジフテリア菌（ジフテリア）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、インフルエンザ菌Ｂ型（Ｈｉｂ）（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（グループＢ連鎖球菌）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の１種又は複数から誘導される抗原が挙げられる。
【0072】
好適なウィルス抗原には、例えば、不活化（又は死滅）ウィルス、弱毒化ウィルス、分割ウィルス配合物、精製サブユニット配合物、ウィルスから単離、精製又は導かれたウィルスタンパク質及びウィルス様粒子（ＶＬＰ）が挙げられる。あるいは、ウィルス抗原は、組換えで発現され得る。ウィルス抗原は、そのライフサイクルの少なくとも１つの段階中で、ウィルスの表面上に曝露される、及び／又はウィルス産生細胞上で発現されるエピトープを含むのが好ましい。好適なウィルス抗原には、限定されないが、特に、オルソミクソウィルス（インフルエンザ）、ニューモウィルス（ＲＳＶ）、パラミクソウィルス（ＰＩＶ及びおたふくかぜ）、モルビリウィルス（はしか）、トガウィルス（風疹）、エンテロウィルス（ポリオ）、ヘルペスウィルス、ＨＢＶ、コロナウィルス（ＳＡＲＳ）、及び水痘帯状疱疹ウィルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）、パピローマウィルス（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖａｖｉｒｕｓ）（例えば、ＨＰＶ）、ＨＩＶのファミリーの１種又は複数から導かれる抗原が挙げられる。
【0073】
別の病原体抗原には、病原性真菌由来の真菌抗原が含まれる。好適な病原性真菌には、限定されないが、例えば、特に、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・シドウイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉｉ）、アスペルギルス・フラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ブラストシゾミセス・カピタツス（Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・エノラーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｏｌａｓｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・クセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｕｓｅｉ）、カンジダ・パラクエセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｗｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・シュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、クラドスポリム・カリオニイ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ゲオトリクム・クラバタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｌａｖａｔｕｍ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ピシウムン・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、ピチロスポルム・オバーレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅ）、サッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、サッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、スケドスポリウム・アピオスペルム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ）、スポロトリクス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコスポロン・ベイゲリ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、マラセチア属菌種（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐｐ．）、フォンセセア属菌種（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐｐ．）、ワンギエラ属菌種（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、スポロトリクス属菌種（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐｐ．）、バシジオボラス属菌種（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、コニディオボルス属菌種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、リゾプス属菌種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．）、ムコール属菌種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．）、アブシディア属菌種（Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｐ．）、モルチエレラ属菌種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、クニンガメラ属菌種（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｐ．）、サクセネア属菌種（Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｓｐｐ．）、アルタナリア属菌種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ．）、クルブラリア属菌種（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、ヘルミントスポリウム属菌種（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、フサリウム属菌種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、アスペルギルス属菌種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ペニシリウム属菌種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、モノリニア属菌種（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ ｓｐｐ．）、リゾクトニア属菌種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ．）、ペシロマイセス属菌種（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ピソマイセス属菌種（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、及びクラドスポリウム属菌種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、エピデルモフィトン・フロッコーサム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ）、ミクロスポルム・オドウィニ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｕｄｏｕｉｎｉ）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ）、ミクロスポルム・ディストルツム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ）、ミクロスポルム・エクイヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｅｑｕｉｎｕｍ）、ミクロスポルム・ジプスム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍ）、ミクロスポルム・ナヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｎａｎｕｍ）、トリコフィトン・コンセントリクム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）、トリコフィトン・エクイヌム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ）、トリコフィトン・ガリネ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ）、トリコフィトン・ジプセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｙｐｓｅｕｍ）、トリコフィトン・メグニニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｇｎｉｎｉ）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、トリコフィトン・キンケアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・シェーンレイニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ）、トリコフィトン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、トリコフィトン・ベルコスム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、トリコフィトン・ビオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、及び／又はトリコフィトン・ファビホルメ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｆａｖｉｆｏｒｍｅ）を含む皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）が挙げられる。
【0074】
「投与」は、多細胞コンジュゲート又は組成物を身体中に、好ましくは体循環中に導入するための任意の手段を意味している。例には、経口、頬側、舌下、肺、経皮、経粘膜、並びに皮下、腹腔内、静脈内、及び筋肉注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【0075】
本発明の多細胞コンジュゲート又は医薬組成物のがんの治療に好ましい投与方法は、静脈内投与によるものである。投与はまた、多細胞コンジュゲート又は組成物を局所的ながんへの導入、例えば、限定されないが、局所治療又は腫瘍部位への注入（例えば、腫瘍内投与（固形腫瘍）、骨髄への投与（ＡＭＬなどの場合）など）、又はリンパ節及び他の免疫調節部位に達するように全身的な導入を含む。
【0076】
病原性感染を治療するための本発明の多細胞コンジュゲート又は医薬組成物の好ましい投与方法には、病原体感染部位への静脈内投与又は局所投与が含まれる。例えば、肺炎の場合、肺への局所投与は、吸入又は洗浄を介することが企図され得る。
【0077】
用語「有効量」又は「治療有効量」は、有益な、又は望ましい生物学的及び／又は臨床成績をもたらすのに十分な量を意味する。例えば、このような結果は、がん細胞（薬剤耐性がん細胞又は治療抵抗性がん細胞を含む）の増殖の低減、抑制もしくは防止；がん細胞の転移又はがん細胞もしくは転移の侵襲を低減、抑制もしくは防止；又はがんもしくはその転移の少なくとも１つの症状、又は生体系のいずれか他の望ましい変化を低減、緩和、抑制もしくは防止できる。病原体感染症の場合、結果は、特に、病原体の増殖及び蔓延を低減、抑制又は防止、病原体感染症の１種又は複数の症状を低減又は防止できる。
【0078】
「効果的治療」は、有益な効果、例えば、疾患又は状態の少なくとも１種の症状の改善をもたらす治療を意味する。有益な効果は、ベースラインに対する改善、即ち、方法による療法の開始前になされた測定又は観察に対する改善の形態を取ることができる。がんの場合、有益な効果はまた、がん細胞のさらなる増殖の低減、抑制もしくは防止の形態；がん細胞の転移もしくはがん細胞もしくは転移の侵襲の低減、抑制又は防止の形態；又はがんもしくはその転移の少なくとも１つの症状の低減、緩和、抑制もしくは防止の形態を取ることもできる。このような効果的治療は、例えば、患者の疼痛を減らし、がん細胞のサイズもしくは数を減らし、細胞の転移を減らすもしくは防止し、又はがんもしくは転移細胞の増殖を遅らせ得る。
【0079】
「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトを意味している。対象は治療を必要としているヒトであるのが適切である。しかし、本発明では、獣医学による使用も意図されている。「哺乳動物」は、限定されないが、ヒト、チンパンジー及び他の類人猿並びにサル種などの非ヒト霊長類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ及びブタなどの家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）；ウサギ、イヌ及びネコなどの愛玩動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）；ラット、マウス、及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などの哺乳綱のいずれかのメンバーを意味する。用語「対象」は特定の年齢又は性別を表すものではない。好ましい実施形態では、対象はヒトである。好ましい実施形態では、対象は、抗原に関連する疾患又は状態を有する。一実施形態では、ヒトはがんを有する。別の実施形態では、ヒトは病原体感染症を有する。
【0080】
キット
さらなる実施形態では、本開示は、本明細書記載の方法を実施するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、本明細書で記載の多細胞コンジュゲート及び使用説明書を含む。キットは、抗原に関連する状態を治療するために使用し得る。
さらなる実施形態では、本開示は、本明細書記載の方法を実施するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、本明細書で記載の多細胞コンジュゲート及び使用説明書を含む。キットは、抗原に関連する状態を治療するために使用し得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、多細胞コンジュゲートを形成するための凍結ｉＮＫＴ細胞及び使用説明資料を含むキットが想定されている。いくつかの実施形態では、既製の凍結ｉＮＫＴ細胞集団を用いて、多細胞コンジュゲートを用いた治療を必要としている対象由来のＤＣと共に多細胞コンジュゲートを形成できる。使用説明資料は、治療を必要としている対象由来の血液試料から単球を単離し、単球をＤＣに分化させる際の説明書を提供し得る。ＰＢＭＣから及び血液から単球を単離する方法は、当技術分野において既知であり、上記されている。更に、キットは、抗原又はｉＮＫＴ細胞とコンジュゲート化の前に、ＤＣ細胞を抗原とインキュベートすることによりＤＣ細胞に抗原をロードするための説明書を含み得る。
【0082】
別の実施形態では、キットは、凍結同種ｉＮＫＴ細胞及び本明細書で記載の多細胞コンジュゲートを作製するための説明書を含む。キットは、抗原、血液試料から単球を単離するための説明書を更に含み得る。単球をＤＣに分化させる方法に関する追加の説明書が提供され得る。キットは、本明細書で記載の多細胞コンジュゲートの増殖、単離及び産生のための培地及び追加の成分、例えば、刺激因子、成長因子、抗体などを更に含み得るのが適切である。別の実施形態では、キットは、ＤＣに抗原をロードする際の説明書、及び／又はＤＣへのロードのための抗原の選択及び使用のための説明書を更に含み得る。
【0083】
別の実施形態では、キットは、がんの治療のための本明細書で記載の多細胞コンジュゲート又は組成物、及び使用説明書を含む。キットは、多細胞コンジュゲート又はこれを含む組成物と組み合わせて使用するためのチェックポイント阻害剤を更に含み得る。
【0084】
発明概念から逸脱することなく、既に記載されたものに加えて、多くの追加の変更が可能であることは、当業者には明らかなはずである。本開示の解釈において、全ての用語は、文脈に適合させて可能な限り最も広くなるように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語尾変化は、非排他的に、要素、成分、又はステップを言及するとして解釈されるべきであり、したがって言及された要素、成分、又はステップは、明示的に言及されない他の要素、成分、又はステップと組み合わせられ得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として言及される実施形態はまた、これらの要素「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」としても企図されている。この用語は、「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」は、特許調査手順マニュアル（ＭＰＥＰ）及び関連連邦巡回控訴裁判所（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔ）の解釈に準拠して解釈されるべきである。「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句は、指定された材料又はステップに対する請求項及び請求発明の基礎的で新しい特徴に実質的には影響を及ぼさない材料又はステップに限定するものである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲に指定されていない要素、ステップ、又は成分を除外する閉鎖型用語である。例えば、配列に関して、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、配列番号でリストとされた配列を意味し、その一部としてその配列番号を含み得るより大きな配列を意味しない。
【0085】
本明細書で言及する全ての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先される。
【0086】
本発明の他の特徴及び利点は、本発明の好ましい実施形態の説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。別に定めのない限り、全ての技術及び化学的用語は、本発明が属する当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているのと類似又は同等の方法及び材料を、本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。更に、材料、方法、及び実施例は、例示としてのみの目的のために示されており、限定する意図はない。
【実施例】
【0087】
実施例１
我々は、ＤＣの存在下で、抗原をロードした樹状細胞（ＤＣ）により、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）が、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を促進できることを見出した。ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞は、健康な成人対象の末梢血から選別され、高度に純粋な培養物を生成するために、インビトロで増殖された。ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞ドナーに遺伝的に関連しない（即ち、ｉＮＫＴ細胞に同種の）健康な成人対象から採取された末梢血試料から単離された単球から導かれた。ＤＣを、１：１の比率のｉＮＫＴ細胞と共インキュベートしてコンジュゲートの形成を可能としたか、又は単独で培養した。ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲート又はＤＣ単独含有培養物を、エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ Ａｇ）、毒素性ショック症候群毒素超抗原（ＴＳＳＴ ＳＡｇ）、又は破傷風トキソイド抗原（ＴＴ Ａｇ）を含む、抗原と同時インキュベート、又はモック処理（Ａｇなし）した。次に、それらを、ＤＣに対し自家であるＴ細胞と共培養し、それにより、ＤＣは、培養物中の総細胞の２％を構成した。
我々は、ＤＣの存在下で、抗原をロードした樹状細胞（ＤＣ）により、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）が、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を促進できることを見出した。ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞は、健康な成人対象の末梢血から選別され、高度に純粋な培養物を生成するために、インビトロで増殖された。ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞ドナーに遺伝的に関連しない（即ち、ｉＮＫＴ細胞に同種の）健康な成人対象から採取された末梢血試料から単離された単球から導かれた。ＤＣを、１：１の比率のｉＮＫＴ細胞と共インキュベートしてコンジュゲートの形成を可能としたか、又は単独で培養した。ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲート又はＤＣ単独含有培養物を、エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ Ａｇ）、毒素性ショック症候群毒素超抗原（ＴＳＳＴ ＳＡｇ）、又は破傷風トキソイド抗原（ＴＴ Ａｇ）を含む、抗原と同時インキュベート、又はモック処理（Ａｇなし）した。次に、それらを、ＤＣに対し自家であるＴ細胞と共培養し、それにより、ＤＣは、培養物中の総細胞の２％を構成した。
【0088】
抗原ロードｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートのＴ細胞増殖性を活性化する能力を調査するために、我々は、細胞分裂を受けた細胞のパーセントの測定を可能にする蛍光染料でＴ細胞を標識した。図１Ａ及び図１Ｂに示すように、ＥＢＶ抗原をロードしたｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートへの曝露は、ＥＢＶ抗原をロードした単独ＤＣに曝露したＴ細胞に比べて、分裂Ｔ細胞の頻度の増大をもたらした。同様に、ＴＳＳＴ超抗原で事前標識したｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートへの曝露は、ＴＳＳＴ超抗原に結合するＴＣＲ型含有Ｔ細胞サブセットにより、ＴＳＳＴ標識単独ＤＣに曝露したものより大きな増殖をもたらした。抗原担持ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートへの曝露により誘導された増殖の増大は、ＣＤ８+及びＣＤ４+Ｔ細胞の両方で観察された。
【0089】
抗原ロードｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートのＴ細胞によるサイトカイン産生を活性化する能力を試験するために、ＤＣに破傷風トキソイド抗原を適用するか、又はモック処理し、同種ｉＮＫＴ細胞及び自家Ｔ細胞と混合した。２４～４８時間の共培養後、細胞内サイトカイン染色を細胞混合物に対し実施し、試料をフローサイトメトリーで分析して、サイトカインＩＦＮγを産生し始めたＣＤ４+Ｔ細胞（ｉＮＫＴ細胞を除く）の頻度を決定した。図１Ｃに示すように、抗原処理ＤＣ含有培養物にｉＮＫＴ細胞が添加されると、細胞内ＩＦＮγ含有ＣＤ４+Ｔ細胞の数の増大が観察され、ｉＮＫＴ細胞がＣＤ４+Ｔ細胞のＤＣによる抗原依存性活性化を促進することを示す。ｉＮＫＴ細胞の効果は、ＤＣをリポ多糖類（ＬＰＳ、免疫応答を開始するシグナルを提供することが既知のトール様受容体リガンド）と少なくとも同程度に強力であり、ｉＮＫＴ細胞は培養物の単に０．２５％だけを含むことが必要であるように見えた（図１Ｄ）。
【0090】
ｉＮＫＴの細胞刺激効果は、物理的接触を必要とするかどうかを判定するために、ＤＣをｉＮＫＴ細胞及びＴ細胞と共に、それらを同じウェル中に入れて、又はトランスウェル膜により分離して、共培養した。ＩＦＮγ分泌の定量化により、高められたＴ細胞活性化は、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣが相互に接触できる場合、及びＴ細胞がｉＮＫＴ細胞及びＤＣの両方に接触できる場合にのみ観察されることが明らかになった（図１Ｅ）。ＤＣ又はＴ細胞がｉＮＫＴ分泌因子にのみ暴露された場合は、高められたＴ細胞活性化が観察されず、ｉＮＫＴ細胞のアジュバント活性効果は接触依存性であることを示している。
【0091】
この活性化の機序を調べるために、ｉＮＫＴ細胞をＤＣと共に培養した。意外にも、フローサイトメトリー分析は、ｉＮＫＴ細胞と対形成したＤＣの強く接着したコンジュゲート化集団の存在を明らかにした（図２Ａ及び図２Ｂ）。ほとんどのコンジュゲート（＞８０％）は、１つのｉＮＫＴ細胞及び１つのＤＣを含み、１０％未満が合計４つ以上の細胞を含んだ（図２Ｃ）。ｉＮＫＴ細胞との共インキュベーションの前の、リゾリン脂質を含む結合脂質含有の、高度に精製されたヒト血清アルブミンへのＤＣの事前曝露は、より高い頻度のｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートを生じた（図２Ｄ）。コンジュゲートはまた、ｉＮＫＴ細胞と、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から再分化されたＤＣとの間でも観察された（図２Ｅ）。
【0092】
図３Ａ及び図３Ｂに示すように、ｉＮＫＴ細胞及びＤＣのコンジュゲートは、培養物中で少なくとも９６時間にわたり強く接着したまま残る。免疫不全マウスの静脈内に注入された２４時間後のマウス組織中で、密接して結合したｉＮＫＴ細胞とＤＣ（明白なコンジュゲート）が観察された（図３Ｃ及び図３Ｄ）。
【0093】
ｉＮＫＴ細胞とＤＣのコンジュゲートは、Ｔリンパ球を活性化することが知られている多種多様のリガンドの細胞表面発現レベルを高めたことを示している（図４Ａ）。更に、合成アジュバント（グルコピラノシル（ｇｌｕｃｏｐｕｒａｎｏｓｙｌ）脂質アジュバント、ＧＬＡ）で処理されたＤＣに比べて、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートは、ＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ＿ＡＢＣ）、共刺激リガンドＣＤ７０、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ１３７Ｌ（４１ＢＢＬ）、ＣＤ２１５（ＩＬ－１５Ｒα）のより高い発現、及び阻害性リガンドＰＤ－Ｌ１のより低い発現を示す（図４Ｂ及び図４Ｃ）。この共刺激分子セットは、ＤＣコンジュゲート化ｉＮＫＴ細胞上で選択的に上方制御され、ｉＮＫＴ細胞に曝露されたがコンジュゲートを形成しなかったＤＣ上でわずかな上方制御を示し、コンジュゲート上の上方制御発現は、インビトロで少なくとも９６時間維持される（図６）。Ｔ細胞による抗腫瘍及び抗ウィルス応答を促進することが既知の分泌されたＩＬ－１２ｐ７０及びＩＦＮγ、サイトカインは、ｉＮＫＴ細胞とＤＣの共培養で増大した（図４Ｄ）。
【0094】
イメージングフローサイトメーターを用いたさらなる分析により、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ７０を発現し、ＤＣは、他の共刺激性受容体を発現する成分であるので、ｉＮＫＴ細胞とＤＣの両方が、コンジュゲートの共刺激プロファイルに寄与することが明らかになった（図５Ａ）。更に、ＣＤ７０は、インビトロ培養中にｉＮＫＴ細胞上で発現上昇され、一次ｉＮＫＴ細胞は、直のエクスビボでは、ほとんどＣＤ７０発現を示さない（図５Ｂ）。
【0095】
ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートがＴ細胞を活性化して自家腫瘍の攻撃に使用可能かどうかを試験するために、ヒト臍帯血単核球（Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、及びＤＣを含む）を、エプスタイン・バールウィルス、Ｂ細胞リンパ腫の形成を促進することが知られているヒトＢ細胞特異的γ－ヘルペスウィルスに短時間曝露し、細胞を免疫不全マウスの腹腔内に注入した。ＥＢＶ誘導リンパ腫担持マウスから採取したヒトＴ細胞をｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートに曝露することにより、標的細胞の高められた殺作用を生じ、一方、ＥＢＶナイーブＴ細胞をｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートに曝露した場合には、標的細胞殺傷は高められなかった（図７Ａ）。ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートの投与がインビボでヒト腫瘍の除去を促進するかどうかを試験するために、ＥＢＶ誘導Ｂ細胞リンパ腫担持マウスにｉＮＫＴ細胞単独、ＤＣ単独、ｉＮＫＴ＋ＤＣを注入するか、又はモック治療した。６日後の腫瘍量の検査により、ｉＮＫＴ＋ＤＣ混合物の投与が腫瘍量の低減に繋がり、一方ｉＮＫＴ細胞単独、又はＤＣ単独の同じ投与は、モック治療マウスと類似の腫瘍量であることが明らかとなった（図７Ｂ）。ビークル治療マウス由来の膵臓組織の組織学的分析は、リンパ腫瘍の存在と一致する広範なリンパ球性の浸潤を明らかにしたが、一方、ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートを投与されたマウス由来の膵臓組織は、リンパ球性浸潤が除去されたように見える領域を示した（図７Ｃ）。脾臓組織を３匹のｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートを投与されたＥＢＶリンパ腫担持マウス、及び３匹のビークル治療されたＥＢＶリンパ腫担持マウスから採取し、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ免疫プロファイリング分析に供し、約７００個のヒト免疫関連遺伝子の発現レベルを評価した。この分析により、ビークル治療マウスに比べて、ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートを投与されたマウス中で有意に発現上昇された４９個の遺伝子、及びビークル治療マウスに比べて、ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートを投与されたマウス中で有意に下方制御された１１個の遺伝子が明らかになった（図７Ｄ）。この分析により、ｉＮＫＴ－ＤＣ治療後、キナーゼ（ＰＩＫ３アイソフォーム、ＭＡＰＫ１、ＡＫＴ３）などのシグナル伝達分子及びカルシウムチャネル調節因子ＳＴＩＭ１、転写因子（ＮＦＡＴ３Ｃ、ＦＯＸＯ３、ＫＬＦ２）、及びＴ細胞活性化及び輸送を調節する細胞表面受容体（ＣＤ２８、ＩＴＧＡＬ、Ｓ１ＰＲ１）を含む、Ｔ細胞活性化に付随する同義遺伝子が、発現上昇されることが明らかになった。ｉＮＫＴ－ＤＣ治療後に下方制御された遺伝子には、ＩＬ－１０、ＦＣＲＬ１、及びＣＤ２２を含む、ＥＢＶ感染Ｂ細胞に関連する遺伝子が含まれた。Ｔ細胞及びＥＢＶ感染Ｂリンパ腫細胞に対し自家であるＤＣと対形成したｉＮＫＴ細胞の投与の有意な抗腫瘍効果とは対照的に、Ｔ細胞及びＢ細胞に対し同種であるｉＮＫＴ細胞及びＤＣの投与は有意な抗腫瘍効果がなく（図７Ｅ）、ｉＮＫＴ－ＤＣコンジュゲートが自家Ｔ細胞により特異的応答を活性化することを裏付けた。
【0096】
材料及び方法：
ｉＮＫＴ細胞の単離：末梢血（１５～５０ｍｌ）を健康な成人ドナーからヘパリン処理チューブ（１０～３０ ＵＳＰヘパリン／ｍｌ血液）中に採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、製造業者のプロトコルに従って密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単離し、１％のウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含む無菌リン酸塩緩衝生理食塩水中に懸濁させる。ＰＢＭＣを、市販のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９に対する蛍光標識抗体、及び脂質ロードＣＤ１ｄ四量体試薬（例えば、ヒトＣＤ１ｄ ＰＢＳ－５７ＰＥ（Ｅｍｏｒｙ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＮＩＨ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙから））を用いて、４℃で３０分間にわたり標識する。細胞を遠心分離（３００ｇで１０分）によりペレット化し、無菌ＰＢＳ／ＢＳＡ中にそれらを再懸濁することにより、非結合染色試薬を洗い流す。ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞（ＣＤ４、ＣＤ３、及びＣＤ１ｄ四量体に対し陽性細胞）をフローサイトメトリーで５０％ウシ仔ウシ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地の溶液中に選別する。
ｉＮＫＴ細胞の単離：末梢血（１５～５０ｍｌ）を健康な成人ドナーからヘパリン処理チューブ（１０～３０ ＵＳＰヘパリン／ｍｌ血液）中に採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、製造業者のプロトコルに従って密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単離し、１％のウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含む無菌リン酸塩緩衝生理食塩水中に懸濁させる。ＰＢＭＣを、市販のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９に対する蛍光標識抗体、及び脂質ロードＣＤ１ｄ四量体試薬（例えば、ヒトＣＤ１ｄ ＰＢＳ－５７ＰＥ（Ｅｍｏｒｙ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＮＩＨ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙから））を用いて、４℃で３０分間にわたり標識する。細胞を遠心分離（３００ｇで１０分）によりペレット化し、無菌ＰＢＳ／ＢＳＡ中にそれらを再懸濁することにより、非結合染色試薬を洗い流す。ＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞（ＣＤ４、ＣＤ３、及びＣＤ１ｄ四量体に対し陽性細胞）をフローサイトメトリーで５０％ウシ仔ウシ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地の溶液中に選別する。
【0097】
ｉＮＫＴ細胞の増殖及び貯蔵：ＰＢＭＣを健康な成人ドナーから単離し、「フィーダー」細胞として使用する。注意すべきは、これらの細胞は、ｉＮＫＴ細胞を単離するために使用した対象と同じ人由来である必要なないことである。フィーダーＰＢＭＣは、Ｘ線照射器を用いて、７０Ｇｙの電離放射線を照射され、次の処方に従って調製される無菌成長培地中に懸濁される：１０％の加熱不活性化ウシ胎仔血清、５％の加熱不活性化した仔ウシ血清（化学的に定義された／補充された）、３％のプールされたヒトＡＢ血清、１％のＬ－グルタミン（２ｍＭの最終濃度）、１％のＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｏ（１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンの最終濃度）、２００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２で希釈されたＲＰＭＩ１６４０培地、（成長培地の最終グルコース濃度は約８．９ｍＭでなければならない）。成長培地中に懸濁された照射フィーダーＰＢＭＣを１ｘ１０6細胞／ｍｌの濃度で無菌ポリスチレン組織培養プレートに加える。選別されたｉＮＫＴ細胞を５ｘ１０3～５ｘ１０5細胞／ｍｌの最終濃度まで加える。次の刺激剤の片方又は両方をウェルに加える：１～５μｇ／ｍｌの最終濃度のフィトヘマグルチニン（成人ＰＢＭＣ由来のポリクローナルＴ細胞を用いて事前の用量設定実験により決定される）、１０～３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ ｍＡｂ（例えば、クローンＯＫＴ３又はＳＰＶＴ３ｂ）。細胞を加湿インキュベーター中で、５％ＣＯ2下、３７℃で培養し、１～２日毎に培地の酸性化の証拠として目視で、及び光学顕微鏡検で増殖の徴候を監視する。酸性化が明らかになると（黄色）、２５～５０％の培養上清を新鮮培地と交換し、細胞を再懸濁し、新鮮培地で希釈し、十分な増殖が起こった場合はいつでも、新しいウェルに分割する。十分なｉＮＫＴ細胞増殖が起こり、培養物の増殖を損なうことなく分析が可能になると（通常、２～３週間後）、約５～１０ｘ１０4細胞を取り出し、フローサイトメトリーにより試験して、ＣＤ３、ＣＤ４に対する抗体、及び脂質ロードＣＤ１ｄ四量体試薬又はｉＮＫＴ細胞のＴ細胞受容体の特異的な抗体（クローン６Ｂ１１）を用いて培養物の純度を確定する。必要に応じて、培養物をフローサイトメトリー又は磁性選別を用いて更に精製し、汚染細胞を除去する（通常、９９％以上のＣＤ４+ｉＮＫＴ細胞を含む培養物のみがコンジュゲートを生成するために使用される）。ｉＮＫＴ細胞の十分な増殖が起こり、増殖速度が約３～４日毎に二倍にまでおそくなった後（通常、培養の４～６週後）に、ｉＮＫＴ細胞の一定分量を５～２０ｘ１０6細胞／ｍｌの濃度で、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０凍結培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて凍結する。
【0098】
単球由来樹状細胞の生成：末梢血（５～５０ｍｌ）をヘパリン処理チューブ（１０～３０ ＵＳＰヘパリン／ｍｌ血液）中に採取する。注意すべきは、特定の状況（例えば、造血幹細胞移植を受けた患者）では、ＤＣドナーは、異なる人である可能性があるが、ほとんどの場合、この試料は、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート免疫療法を最終的に受けるはずの人から採取されるであろう。ＰＢＭＣは、密度勾配遠心分離により単離され、単球は、ＣＤ１４被覆ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｃｏｒｐ．又はＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造業者のプロトコルに従って、ポジティブ選択磁性選別により単離される。精製ＣＤ１４+単球を次の処方に従って調製した培地中に懸濁させる：ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％のウシ胎仔血清、１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、３００ Ｕ／ｍｌの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ、２００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－４。細胞を、無菌ポリスチレン組織培養プレートに０．５～１ｘ１０6細胞／ｍｌで加え、加湿インキュベーターを用い、５％ＣＯ2下、３７℃で培養する。樹状細胞（ＤＣ）表現型への分化は通常、培養の２日以内に明らかになり始めるが、我々は通常、分化培地中で３日間インキュベートした細胞からコンジュゲートを生成する。成功裡の分化及び得られた培養物の純度を、ＣＤ１４、ＣＤ２０９（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ８３、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６に対する蛍光標識抗体を用いて、フローサイトメトリー分析により検証する。未成熟ＤＣは、ＣＤ２０９発現細胞として特定され、ＣＤ１４がわずかに検出できるか、又は検出できず、他のマーカーを欠いている。必要に応じて、培養物を磁性又はフローサイトメトリーソーティング選別により更に精製できる。
【0099】
ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートの生成：コンジュゲート化の前に、ｉＮＫＴ細胞を１～２日間解凍し、上記のｉＮＫＴ細胞成長培地中で培養する。ＤＣを関連抗原の由来源に曝露する。ｉＮＫＴ細胞及びＤＣを、ＤＣ当り１～５ｉＮＫＴ細胞の比率で混合し、１０％のウシ胎仔血清、１００ ＩＵのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、加湿インキュベーター中で、５％ＣＯ2下、３７℃で１～２４時間、共培養する。本明細書で開示のほとんどの実験では、２４時間の共培養を用いて、コンジュゲートを生成した。しかし、我々は、コンジュゲート形成は、１時間内に起こり、コンジュゲートは、培養物中で少なくとも９６時間存続するように見える。フローサイトメトリー分析を実施して、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲート形成及び重要な共刺激分子（例えば、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現上昇を検証する。これらの実験では、我々は、有効性を評価するために、未分離のｉＮＫＴ＋ＤＣ混合物を使用した。しかし、我々は、免疫療法試薬を生成するために、ｉＮＫＴ＋ＤＣコンジュゲートを使用する前に、フローサイトメトリーソーティングにより単離するであろう。
【図1A】
【図1B】
【図1C-D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C-D】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【国際調査報告】