(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-25
(54)【発明の名称】ＣＬＮ２疾患の眼症状に対する遺伝子療法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/76 20150101AFI20231018BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20231018BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231018BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231018BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20231018BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231018BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20231018BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20231018BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20231018BHJP
【ＦＩ】
A61K35/76
A61P27/02
A61P25/00
A61K48/00
A61K38/48
A61P43/00 105
C12N15/864 100Z
C12N15/57
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521316
(86)(22)【出願日】2021-10-06
(85)【翻訳文提出日】2023-05-10
(86)【国際出願番号】 US2021053802
(87)【国際公開番号】W WO2022076582
(87)【国際公開日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】63/088,911
(32)【優先日】2020-10-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/146,134
(32)【優先日】2021-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
２．ｉＰａｄ
(71)【出願人】
【識別番号】518362720
【氏名又は名称】レジェンクスバイオ インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】クリスティーナ マリア オーンズマン
(72)【発明者】
【氏名】スティーブン ジョセフ パコーラ
(72)【発明者】
【氏名】シェリ ヴァン エベレン
(72)【発明者】
【氏名】パウロ ファラベーラ
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンダー マーストン ベイリー
(72)【発明者】
【氏名】ニコラス アレクサンダー ピアズ サシャ バス
(72)【発明者】
【氏名】クゥイ ヒエ キム
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA33
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA44
4C084DC02
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZC541
4C084ZC542
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA33
4C087ZB21
4C087ZC54
(57)【要約】
例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターなどの組換えウイルスベクターを含む、眼の病態を処置するための、ヒト対象の眼の網膜／硝子体液への治療用産物（例えば治療用タンパク質（例えば、抗体）、治療用ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡ）、及び治療用アプタマー）の送達のための組成物及び方法を記載する。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の処置を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記方法が、前記対象の眼に、キャプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ９であり、前記ベクターゲノムが、ａ．ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）と、
ｂ．プロモーターと、
ｃ．ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２コード配列と、
ｄ．ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含む、前記方法。
【請求項2】
前記ＡＡＶ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ３’ＩＴＲが、ＡＡＶ２由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｃ）の前記コード配列が、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一である、コドン最適化ヒトＣＬＮ２である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
（ｃ）の前記コード配列が、配列番号３である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
前記プロモーターが、ニワトリベータアクチンプロモーターである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記プロモーターが、ＣＢＡプロモーター配列及びサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記ベクターゲノムが、ポリＡを更に含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記ポリＡが、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
イントロンを更に含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記イントロンが、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ－グロブリン、ベータ－グロブリン、コラーゲン、オバルブミン、またはｐ５３由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
エンハンサーを更に含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ベクターゲノムが、約３キロベース～約５．５キロベースのサイズである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記ベクターゲノムが、約４キロベースのサイズである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
２×１０１０ゲノムコピー／眼の前記ｒＡＡＶを投与する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
６×１０１０ゲノムコピー／眼の前記ｒＡＡＶを投与する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記対象が、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、中心網膜厚（ＣＲＴ）におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記対象が、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、外顆粒層（ＯＮＬ）厚におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記対象が、瞳孔計測によって測定される、瞳孔光反射におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記対象が、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、黄斑の厚さ／体積におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記対象が、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、全網膜厚におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記対象が、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、網膜神経線維層におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記対象が、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、内顆粒層におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記対象が、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、光受容体（ＰＲ）＋網膜色素上皮（ＲＰＥ）におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記対象が、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、外側セグメント＋前記ＲＰＥ（ＯＳ＋ＲＰＥ）におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記対象が、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、エリプソイドゾーン（ＥＺ）におけるベースラインからの変化を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記対象が、標準治療を伴う同等の臨床的進行と比較して、網膜劣化の発症の遅延を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記対象が、標準治療を伴う同等の臨床的進行と比較して、視力喪失の発症の遅延を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記方法が、前記対象への前記ｒＡＡＶの投与の３か月以内に、前記対象の前記眼の硝子体液及び／または房水中の検出可能なＴＰＰ１発現レベルをもたらす、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
硝子体液及び／または前記房水中のＴＰＰ１発現の前記レベルが、前記ｒＡＡＶの投与前に検出不能であった、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記対象の血清中のＴＰＰ１発現の前記レベルが、検出不能のままである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項32】
前記対象が、脳室内Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）酵素補充療法を同時に受けている、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記対象が、ヒトである、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権
本出願は、２０２０年１０月７日出願の米国シリアル番号６３／０８８，９１１、及び２０２１年２月５日出願の米国シリアル番号６３／１４６，１３４（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に対する優先権の利益を主張する。
本出願は、２０２０年１０月７日出願の米国シリアル番号６３／０８８，９１１、及び２０２１年２月５日出願の米国シリアル番号６３／１４６，１３４（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に対する優先権の利益を主張する。
【0002】
電子提出した配列表の参照
本出願は、「１２６５６－１４４－２２８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称であり、２０２１年９月３０日に作製され、サイズが４２，７４６バイトである、テキストファイルとして、本出願とともに提出された配列表を参照により組み込む。
本出願は、「１２６５６－１４４－２２８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称であり、２０２１年９月３０日に作製され、サイズが４２，７４６バイトである、テキストファイルとして、本出願とともに提出された配列表を参照により組み込む。
【背景技術】
【0003】
１．背景技術
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、希少かつ遺伝性の神経変性障害の群である。それらは、神経遺伝学的貯蔵疾患の中で最も一般的であると考えられており、患者に見られるセロイド及びリポフスチンに類似した自己蛍光性脂肪色素の蓄積を伴う。ＮＣＬは、異常に増加した筋緊張またはけいれん、失明または視力障害、認知症、筋協調性の欠如、知的障害、運動障害、発作及び不安定な歩行を含む、可変的でありながら進行性の症状に関連している。この疾患の頻度は、１２，５００人当たりおよそ１人である。ＮＣＬには３つの主要なタイプがある：成人（ＫｕｆｓまたはＰａｒｒｙ病）、若年及び後期幼児（Ｊａｎｓｋｙ－Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ病）。神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、元々、それらの発症年齢及び臨床症状によって（本明細書に記載のように）定義された。しかしながら、それ以来、それらはより新しい分子所見に基づいて再分類されており、これは以前に臨床表現型によって示唆されていたよりもはるかに多くの異なる遺伝的バリアントの重複の証拠を提供している。
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、希少かつ遺伝性の神経変性障害の群である。それらは、神経遺伝学的貯蔵疾患の中で最も一般的であると考えられており、患者に見られるセロイド及びリポフスチンに類似した自己蛍光性脂肪色素の蓄積を伴う。ＮＣＬは、異常に増加した筋緊張またはけいれん、失明または視力障害、認知症、筋協調性の欠如、知的障害、運動障害、発作及び不安定な歩行を含む、可変的でありながら進行性の症状に関連している。この疾患の頻度は、１２，５００人当たりおよそ１人である。ＮＣＬには３つの主要なタイプがある：成人（ＫｕｆｓまたはＰａｒｒｙ病）、若年及び後期幼児（Ｊａｎｓｋｙ－Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ病）。神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、元々、それらの発症年齢及び臨床症状によって（本明細書に記載のように）定義された。しかしながら、それ以来、それらはより新しい分子所見に基づいて再分類されており、これは以前に臨床表現型によって示唆されていたよりもはるかに多くの異なる遺伝的バリアントの重複の証拠を提供している。
【0004】
少なくとも２０の遺伝子が、ＮＣＬに関連して同定されている。ＣＬＮ２変異を有するＮＣＬ患者は、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）と呼ばれるペプスタチン非感受性リソソームペプチダーゼが欠損している。ＴＰＰ１は、ポリペプチドのＮ末端からトリペプチドを除去する。変異は、ＣＬＮ２遺伝子の全ての１３エクソンで報告されている。いくつかの変異は、より長期化した経過をもたらす。発症は、通常、後期幼児期であるが、その後の発症が記載されている。ＣＬＮ２には５８を超える変異が記載されている。
【0005】
バッテン病の一形態であるＣＬＮ２疾患は、稀なリソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）であり、推定発生率は、１０万人の出生児当たり０．０７～０．５１である（Ａｕｇｅｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｃｌａｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｍｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｔｔｅｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｐｏｕｐｅｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｓａｎｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｔｅｉｘｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＣＬＮ２疾患は、染色体１１ｑ１５上に位置し、可溶性リソソーム酵素トリペプチジル－ペプチダーゼ－１（ＴＰＰ１）をコードする、ＣＬＮ２遺伝子の変異により引き起こされる致命的な常染色体劣性神経変性ＬＳＤである。ＣＬＮ２遺伝子の変異、及びその後のＴＰＰ１酵素活性の欠乏は、貯蔵物質のリソソーム蓄積、ならびに脳及び網膜の神経変性をもたらす（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｗｌｏｄａｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＣＬＮ２疾患は、２～４歳での早期発症を特徴とし、通常、再発性発作（てんかん）及び協調運動困難（運動失調）を含む初期特徴を有する。この疾患はまた、以前に獲得したスキルの喪失（発達退行）をもたらす。てんかんは、しばしば薬物療法に難治性であり、精神運動機能の全般的な衰退は、小児期中期までの早期死亡前の３歳から５歳の誕生日の間に急速かつ均一である（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３）（Ｎｉｃｋｅｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｗｏｒｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【0006】
古典的な神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ２）疾患に関連する網膜変性は、両側性、進行性、対称性の低下として現れ、中心黄斑部からブルズアイパターンで始まり、末期疾患で末梢網膜に拡大する（Ｏｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１３ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ａｕｇ ２８；８（８）：ｅ７３１２８）。網膜変性は、重要な２年間にわたる光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）における中心網膜厚（ＣＲＴ）の急速な喪失を特徴とする（Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ，２０２０；Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｒｅｔｉｎａ．２０２０；４（７）：７２８－３６）。しかしながら、視覚喪失が遅れているあまり一般的ではない減衰した表現型は、思春期という遅い時期に現れる可能性がある（Ｋｏｈｌｓｃｈｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１９）。
【0007】
組換えＴＰＰ１（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）セルリポナーゼアルファ、ＢｉｏＭａｒｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いた酵素置換療法（ＥＲＴ）は、最近、ＣＬＮ２疾患の処置のために米国（ＵＳ）及び欧州連合（ＥＵ）において承認され、永久植え込みデバイスを介して、側脳室への隔週注入として投与される。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の臨床的利益は、ＦＤＡによって運動機能の安定化に限定されるように指定されたが、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）は、言語スキルにも同様にプラスの影響があると判定した（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＦＤＡ新医薬品承認審査概要、Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）欧州公開医薬品審査報告書［ＥＰＡＲ］、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）は、脳にポートを直接植え込むための専門的な知見を必要とし、脳室内（ＩＣＶ）投与に精通した訓練を受けた専門家によって、医療現場で２週間ごとに４時間の注入中に投与されなければならない。反復注入が必要なのは、部分的にＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の短いＣＳＦ及びリソソーム半減期のためであり、これらはそれぞれ、７時間及び１１．５日と推定されている（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＥＰＡＲ）。したがって、ＣＬＮ２疾患を有する患者の中枢神経系（ＣＮＳ）において、ＥＲＴの反復投与に関連する高い患者負担及び罹患率なしに、耐久性及び長期的なＴＰＰ１酵素活性を提供することができる新しい治療法のための重要な未充足のニーズが残っている。したがって、ＣＬＮ２疾患の処置を必要とする対象においてＴＰＰ１を送達及び発現するのに有用な組成物が必要である。イヌＴＰＰ１（ｒＡＡＶ２．ｃａＴＰＰ１）を発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の１回投与は、主に上皮細胞においてＴＰＰ１の高発現をもたらし、酵素を脳脊髄液中に分泌して臨床的利益をもたらすことが示された。Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｎｏｖ １１；７（３１３）：３１３ｒａ１８０、及びＫＡＴＺ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０１７ Ｆｅｂ ２４（４）：２１５－２２３（これらは参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。しかしながら、ＡＡＶ２は脳実質に浸透せず、ニューロンを標的としないため、新規の神経向性ＡＡＶで達成できるものと比較して期待される利益を限定する。
【0008】
後期幼児神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ２）疾患では、ＣＬＮ２遺伝子の変異は、ＴＰＰ１酵素活性の欠如につながり、中枢神経系及び網膜内の深刻な神経変性をもたらす。膨大な数の眼疾患及び眼に病理学的症状を伴う疾患が、遺伝的改変またはタンパク質制御不全に起因し得る（Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２４（９）：１３１４－１３３１）。ゲノミクス及びプロテオミクスにおける近年の進歩は、かかる眼の疾患または症状の根底にある疾患機序及び／または遺伝的基盤の理解に大きな影響を与えている。遺伝子療法は、ある特定の眼疾患の処置において採用されている（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７６５０号（国際公開第２０１７／１８１０２１Ａ１号）を参照されたい）。
【0009】
ＣＬＮ２疾患の眼症状を処置するために現在承認されている治療法はなく、視力喪失は重要な未充足のニーズを呈している。利用可能な治療選択肢がないため、ＣＬＮ２疾患を有する全ての小児は、視力喪失及び失明への進行に関連する黄斑変性を経験するであろう（Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ，２０２０、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ，２０１７、Ｎｉｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１８）。ＣＬＮ２疾患の処置のためのＥＲＴの開始前及び開始以来、先導的な研究機関は、ＣＬＮ２集団における視力喪失につながる網膜変性の経過を理解するために自然歴データを収集してきた。１）ＥＲＴは、ＣＬＮ２疾患に関連する網膜変性の軌跡を変化させないこと、２）網膜変性の発症は、両眼が同時にかつ同じ程度に影響を受ける両側性であること、及び３）網膜変性は、経時的に、眼間で対称的に進行することが見出されている。
【発明の概要】
【0010】
２．発明の概要
一態様では、ＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の処置を必要とする対象においてそれを行う方法を本明細書に提供し、当該方法は、当該対象の眼に、キャプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９であり、ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、（ｃ）のコード配列は、配列番号２の天然のヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一である、コドン最適化ヒトＣＬＮ２である。一部の実施形態では、（ｃ）のコード配列は、配列番号３である。
一態様では、ＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の処置を必要とする対象においてそれを行う方法を本明細書に提供し、当該方法は、当該対象の眼に、キャプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９であり、ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、（ｃ）のコード配列は、配列番号２の天然のヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一である、コドン最適化ヒトＣＬＮ２である。一部の実施形態では、（ｃ）のコード配列は、配列番号３である。
【0011】
一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータアクチンプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター配列及びサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである。
【0012】
一部の実施形態では、ベクターゲノムは、ポリＡを更に含む。一部の実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である。
【0013】
一部の実施形態では、ベクターゲノムは、イントロンを更に含む。一部の実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ－グロブリン、ベータ－グロブリン、コラーゲン、オバルブミン、またはｐ５３由来である。
【0014】
一部の実施形態では、ベクターゲノムは、エンハンサーを更に含む。一部の実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである。
【0015】
一部の実施形態では、ベクターゲノムは、約３キロベース～約５．５キロベースのサイズである。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、約４キロベースのサイズである。
【0016】
一部の実施形態では、２×１０１０ゲノムコピー／眼のｒＡＡＶを投与する。一部の実施形態では、６×１０１０ゲノムコピー／眼のｒＡＡＶを投与する。
【0017】
一部の実施形態では、対象は、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、中心網膜厚（ＣＲＴ）におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、対象は、瞳孔計測によって測定される、瞳孔光反射におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、対象は、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、黄斑の厚さ／体積におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、対象は、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、外顆粒層（ＯＮＬ）厚におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、対象は、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、全網膜厚におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、対象は、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、内顆粒層におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、対象は、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、光受容体（ＰＲ）＋網膜色素上皮（ＲＰＥ）におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、対象は、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、外側セグメント＋ＲＰＥ（ＯＳ＋ＲＰＥ）におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、対象は、ＳＤ－ＯＣＴによって測定される、エリプソイドゾーン（ＥＺ）におけるベースラインからの変化を有する。
【0018】
一部の実施形態では、対象は、標準治療を伴う同等の臨床的進行と比較して、網膜劣化の発症の遅延を有する。一部の実施形態では、対象は、標準治療を伴う同等の臨床的進行と比較して、視力喪失の発症の遅延を有する。
【0019】
一部の実施形態では、方法は、対象へのｒＡＡＶの投与の３か月以内に、対象の眼の硝子体液及び／または房水中の検出可能なＴＰＰ１発現レベルをもたらす。一部の実施形態では、硝子体液及び／または房水中のＴＰＰ１発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前に検出不能であった。一部の実施形態では、対象の血清中のＴＰＰ１発現レベルは、検出不能のままである。
【0020】
一部の実施形態では、対象は、脳室内Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）酵素置換療法を同時に受けている。
【0021】
一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0022】
３．図面の簡単な説明
【図1A】ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＴＰＰ１ｃｏ．ＲＢＧベクターゲノムの概略表現である。ＩＴＲは、ＡＡＶ２逆方向末端反復を表す。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリベータアクチンプロモーターを表す。ＲＢＧポリＡは、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナルを表す。
【0023】
【図1B】ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターの産生プラスミドのマップを提供する。
【0024】
【図1C】ＡＡＶシスプラスミドコンストラクトのマップを提供する。ＩＴＲ：逆方向末端反復、ＣＭＶ ＩＥプロモーター：サイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＣＢプロモーター：ニワトリβ－アクチンプロモーター ニワトリβ－アクチンイントロン、ｈＣＬＮ２：ヒトＣＬＮ２ ｃＤＮＡ、ウサギグロビンポリＡ：ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル、Ｋａｎ－ｒ：カナマイシン耐性遺伝子。
【0025】
【図1D】ＡＡＶトランスパッケージングプラスミドコンストラクトのマップを提供する。
【0026】
【図1E】アデノウイルスヘルパープラスミドのマップを提供する。
【0027】
【図2】ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸスコアリングフローチャートを提供する。
【0028】
【図3】２～３歳齢未満の対象のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸスコアリングフローチャートを提供する。
【0029】
【図4A】コンストラクトＩの網膜下注射後のカニクイザルの房水及び硝子体液の両方におけるＴＰＰ１濃度を示す。用量は、ＧＣ／眼であり、データは、平均＋／－ＳＥＭとして提示される。
【図4B】コンストラクトＩの網膜下注射後のカニクイザルの房水及び硝子体液の両方におけるＴＰＰ１濃度を示す。用量は、ＧＣ／眼であり、データは、平均＋／－ＳＥＭとして提示される。
【0030】
【図5】コンストラクトＩの網膜下注射後のカニクイザルにおける血清ＴＰＰ１濃度を示す。用量は、ＧＣ／眼であり、データは、平均＋／－ＳＥＭとして提示される。
【0031】
【図6A】カニクイザルへのコンストラクトＩの網膜下注射後に、眼において検出されたベクターＤＮＡを示す。データは、平均及び標準偏差として提示される。
【図6B】カニクイザルへのコンストラクトＩの網膜下注射後に、眼において検出されたベクターＤＮＡを示す。データは、平均及び標準偏差として提示される。
【0032】
【図7A】網膜下注射による４週間後のコンストラクトＩベクターＤＮＡの末梢生体内分布を示す。定量限界下（ＢＬＱ）：５０コピー／μｇのＤＮＡ。データは、平均及び標準偏差として提示される。
【図7B】網膜下注射による１３週間後のコンストラクトＩベクターＤＮＡの末梢生体内分布を示す。定量限界下（ＢＬＱ）：５０コピー／μｇのＤＮＡ。データは、平均及び標準偏差として提示される。
【0033】
【図8】コンストラクトＩ投与後のカニクイザル網膜におけるＴＰＰ１の免疫蛍光染色を示す。ＴＰＰ１に対する免疫蛍光染色、網膜細胞層を示すＮｉｓｓｌ対比染色のストリップ。
【0034】
【図9】ＴＰＰ１免疫反応性の閾値画像分析。示されるデータを、ビヒクルを注射した動物と比較し、１×１０１２ＧＣ／眼の網膜下用量は、このより高い用量でのより高い形質導入レベルを示す、ＴＰＰ１免疫染色の有意に大きい面積（＊＊いずれかのビヒクルに対してｐ＝０．００１３、一元配置分散分析、事後ボンフェローニ）をもたらした。
【0035】
【図10】ＲＧＸ－３８１によるＣＬＮ２患者ＲＰＥの形質導入。ＣＬＮ２ ＲＰＥは、対照ＲＰＥと比較して、ＴＰＰ１発現の非存在を示す。３つの異なる用量の形質導入されたＣＬＮ２ ＲＰＥは、用量依存的な様式で処置の２１日後にＴＰＰ１を発現する。
【0036】
【0037】
【図12】ＲＧＸ－３８１によるＲＯの処理。８８日目に、ＲＧＸ－３８１により処理されたＲＯは、未処置のＣＬＮ２ ＲＯにおいて検出されたＳＣＭＡＳ蓄積を防止した。ＭＯＩ３：感染様式は、３Ｅ＋０６ ＧＣ／細胞であった。
【発明を実施するための形態】
【0038】
４．発明を実施するための形態
バッテン病の処置、特にバッテン病に関連する眼症状の処置のための方法及び組成物を、本明細書に提供する。バッテン病に関連する眼症状には、視力喪失、網膜萎縮及び／または網膜変性が含まれるが、これらに限定されない。かかる組成物には、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ＡＡＶキャプシドを含む当該ｒＡＡＶ、及びその中にパッケージングされたベクターゲノムが含まれ、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、（ｄ）セクション４．１に記載されるようなＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。セクション４．１．８に記載されるような、懸濁細胞培養物を使用して本明細書に記載のｒＡＡＶを製造する方法もまた、本明細書に提供する。組換えＡＡＶを含む組成物、例えば、セクション４．２に記載の組成物も提供される。本明細書、例えば、セクション４．３に記載のように、ＴＰＰ１をコードするベクター（ｒＡＡＶなど）を、それを必要とする対象に送達することを含む、ＣＬＮ２遺伝子の欠損によって引き起こされるバッテン病の眼症状を処置するための方法もまた、本明細書に提供する。
バッテン病の処置、特にバッテン病に関連する眼症状の処置のための方法及び組成物を、本明細書に提供する。バッテン病に関連する眼症状には、視力喪失、網膜萎縮及び／または網膜変性が含まれるが、これらに限定されない。かかる組成物には、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ＡＡＶキャプシドを含む当該ｒＡＡＶ、及びその中にパッケージングされたベクターゲノムが含まれ、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、（ｄ）セクション４．１に記載されるようなＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。セクション４．１．８に記載されるような、懸濁細胞培養物を使用して本明細書に記載のｒＡＡＶを製造する方法もまた、本明細書に提供する。組換えＡＡＶを含む組成物、例えば、セクション４．２に記載の組成物も提供される。本明細書、例えば、セクション４．３に記載のように、ＴＰＰ１をコードするベクター（ｒＡＡＶなど）を、それを必要とする対象に送達することを含む、ＣＬＮ２遺伝子の欠損によって引き起こされるバッテン病の眼症状を処置するための方法もまた、本明細書に提供する。
【0039】
４．１ コンストラクト及び製剤
本明細書に提供する方法において使用するための、治療用産物（例えば、ＴＰＰ１）をコードする組換えウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、標的化ベクター、例えば、網膜色素上皮細胞を標的とするベクターである。
本明細書に提供する方法において使用するための、治療用産物（例えば、ＴＰＰ１）をコードする組換えウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、標的化ベクター、例えば、網膜色素上皮細胞を標的とするベクターである。
【0040】
一部の態様では、本開示は、使用するための核酸を提供し、核酸は、本明細書に記載のプロモーターまたはエンハンサー－プロモーターに作動可能に連結した治療用産物をコードする。
【0041】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む組換えベクターを本明細書に提供する。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ及びＲＮＡの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡは、プロモーター配列、目的の治療用産物をコードする配列、非翻訳領域、及び終止配列からなる群から選択される配列のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、目的の治療用産物をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。
【0042】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する核酸（例えば、ポリヌクレオチド）及び核酸配列は、例えば、当業者に公知である任意のコドン最適化技術（例えば、Ｑｕａｘ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５９：１４９－１６１による概説を参照されたい）を介して、コドン最適化され得る。
【0043】
４．１．１ 組換えウイルスベクター
組換えウイルスベクターには、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶｒｈ１０）、レンチウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＨＶＪ））、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベースのベクターが含まれる。アルファウイルスベクターには、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）及びシンドビスウイルス（ＳＩＮ）が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えウイルスベクターは、それらがヒトにおいて複製欠損であるように改変される。ある特定の実施形態では、組換えウイルスベクターは、ハイブリッドベクター、例えば、「無力な」アデノウイルスベクターに配置されたＡＡＶベクターである。ある特定の実施形態では、第１のウイルスからのウイルスキャプシド及び第２のウイルスからのウイルスエンベロープタンパク質を含む組換えウイルスベクターを本明細書に提供する。特定の実施形態では、第２のウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。より特定の実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質である。
組換えウイルスベクターには、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶｒｈ１０）、レンチウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＨＶＪ））、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベースのベクターが含まれる。アルファウイルスベクターには、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）及びシンドビスウイルス（ＳＩＮ）が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えウイルスベクターは、それらがヒトにおいて複製欠損であるように改変される。ある特定の実施形態では、組換えウイルスベクターは、ハイブリッドベクター、例えば、「無力な」アデノウイルスベクターに配置されたＡＡＶベクターである。ある特定の実施形態では、第１のウイルスからのウイルスキャプシド及び第２のウイルスからのウイルスエンベロープタンパク質を含む組換えウイルスベクターを本明細書に提供する。特定の実施形態では、第２のウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。より特定の実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質である。
【0044】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えウイルスベクターは、ＡＡＶベースのウイルスベクターである。好ましい実施形態では、本明細書に提供する組換えウイルスベクターは、ＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶ９ベースのウイルスベクターは、網膜細胞に対する向性を保持する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（複製に必要とされる）及び／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子（キャプシドタンパク質の合成に必要とされる）をコードする。複数のＡＡＶ血清型が同定されている。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶの１つまたは複数の血清型からの成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶｒｈ１０のうちの１つまたは複数からのキャプシド成分を含む。好ましい実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶｒｈ１０血清型のうちの１つまたは複数からの成分を含む。
【0045】
具体的な実施形態では、制御エレメントの制御下にあり、ＩＴＲに隣接している、治療用産物の発現のためのカセットを含むウイルスゲノム及びＡＡＶ９キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を有するまたはＡＡＶ９キャプシドタンパク質（配列番号９）のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．９％同一であると同時にＡＡＶ９キャプシドの生物学的機能を保持するウイルスキャプシドを含むＡＡＶ９ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、コードされたＡＡＶ９キャプシドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を伴う配列番号９の配列を有し、ＡＡＶ９キャプシドの生物学的機能を保持している。
【0046】
ＡＡＶ９ベースのウイルスベクターは、本明細書に記載の方法のある特定の実施形態で使用される。ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶキャプシドの作成方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に説かれている。一態様では、治療用産物をコードするＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）ベースのウイルスベクターを本明細書に提供する。
【0047】
ある特定の実施形態では、上記で一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）が使用され得る。ある特定の実施形態では、自己相補性ベクター、例えば、ｓｃＡＡＶが使用され得る（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；及び同第７，４５６，６８３号（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【0048】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法において使用される組換えウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクターである。組換えアデノウイルスは、Ｅ１欠失を伴う、Ｅ３欠失を伴うまたは伴わない、かついずれかの欠失領域に発現カセットが挿入された、第１世代ベクターであることができる。組換えアデノウイルスは、Ｅ２及びＥ４領域の完全または部分的な欠失を含有する、第２世代ベクターであることができる。ヘルパー依存性アデノウイルスは、アデノウイルス逆方向末端反復及びパッケージングシグナル（ｐｈｉ）のみを保持する。治療用産物は、パッケージングシグナル及び３’ＩＴＲ間に挿入され、ゲノムをおよそ３６ｋｂの野生型サイズ付近に維持するためのスタッファー配列を伴うまたは伴わない。アデノウイルスベクターを産生するための例示的なプロトコルは、Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，２００５，“Ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ｌａｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１８－Ｓ２７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
【0049】
４．１．２ 遺伝子発現のプロモーター及び修飾因子
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、治療用産物の送達または発現を調節する構成要素（例えば、「発現制御エレメント」）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、治療用産物の発現を調節する構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、取り込み後に細胞内の治療用産物をコードするポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、例えば、治療用産物をコードするポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を検出または選択するための検出可能または選択可能なマーカーとして使用することができる構成要素を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、治療用産物の送達または発現を調節する構成要素（例えば、「発現制御エレメント」）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、治療用産物の発現を調節する構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、取り込み後に細胞内の治療用産物をコードするポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、例えば、治療用産物をコードするポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を検出または選択するための検出可能または選択可能なマーカーとして使用することができる構成要素を含む。
【0050】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、１つまたは複数のプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。治療有効性に関して望ましいように治療用産物の発現をオン及びオフに切り替え得るように、誘導性プロモーターが好ましくあり得る。かかるプロモーターには、例えば、低酸素誘導性プロモーター及び薬物誘導性プロモーター、例えばラパマイシン及び関連作用物質によって誘導されるプロモーターが含まれる。低酸素誘導性プロモーターには、ＨＩＦ結合部位を伴うプロモーターが含まれ、例えば、Ｓｃｈｏｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ １１７（２３）：ｅ２０７－ｅ２１７及びＫｅｎｎｅｔｈ ａｎｄ Ｒｏｃｈａ，２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．４１４：１９－２９（各々、参照により低酸素誘導性プロモーターの教示に関して組み込まれる）を参照されたい。加えて、コンストラクトにおいて使用され得る低酸素誘導性プロモーターには、エリスロポエチンプロモーター及びＮ－ＷＡＳＰプロモーターが含まれる（エリスロポエチンプロモーターの開示に関しては、Ｔｓｕｃｈｉｙａ，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３９５を、Ｎ－ＷＡＳＰプロモーターの開示に関しては、Ｓａｌｖｉ，２０１７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：１３－２１（両方とも、参照により低酸素誘導性プロモーターの教示に関して組み込まれる）を参照されたい）。あるいは、組換えベクターは、薬物誘導性プロモーター、例えば、ラパマイシン及び関連類似体の投与によって誘導可能なプロモーターを含有し得る（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９４／１８３１７号、同第ＷＯ９６／２０９５１号、同第ＷＯ９６／４１８６５号、同第ＷＯ９９／１０５０８号、同第ＷＯ９９／１０５１０号、同第ＷＯ９９／３６５５３号、及び同第ＷＯ９９／４１２５８号、ならびに米国特許第ＵＳ７，０６７，５２６号（ラパマイシン類似体を開示する）（これらは、参照により薬物誘導性プロモーターの開示に関して本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。誘導性プロモーターはまた、エクジゾンプロモーター、エストロゲン応答性プロモーター、及びテトラサイクリン応答性プロモーター、またはヘテロ二量体リプレッサースイッチを含む公知のプロモーターから選択され得る。Ｓｏｃｈｏｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎ Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５ Ｎｏｖ ２４；５：１７１０５及びＤａｂｅｒ Ｒ，Ｌｅｗｉｓ Ｍ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ａｕｇ ２８；３９１（４）：６６１－７０，Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｎ ２１（両方とも参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0051】
ある特定の実施形態では、プロモーターは、低酸素誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）結合部位を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＨＩＦ－１α結合部位を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＨＩＦ－２α結合部位を含む。ある特定の実施形態では、ＨＩＦ結合部位は、ＲＣＧＴＧモチーフを含む。ＨＩＦ結合部位の位置及び配列に関する詳細については、例えば、Ｓｃｈｏｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１，１１７（２３）：ｅ２０７－ｅ２１７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＨＩＦ転写因子以外の低酸素誘導性転写因子のための結合部位を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、低酸素状態で優先的に翻訳される１つまたは複数のＩＲＥＳ部位を含む。低酸素誘導性遺伝子発現及びそれに関与する因子に関する教示については、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ ａｎｄ Ｒｏｃｈａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，２００８，４１４：１９－２９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0052】
別の実施形態では、プロモーターは、細胞特異的である。「細胞特異的」という用語は、組換えベクターのために選択された特定のプロモーターが、特定の細胞または組織型における最適化されたＴＰＰ１コード配列の発現を指示することができることを意味する。
【0053】
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ユビキタスまたは構成的プロモーターである。
【0054】
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＢ７プロモーターである（Ｄｉｎｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：６４９－６６３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ある特定の実施形態では、ＣＢ７プロモーターは、ベクターによって駆動される治療用産物の発現を増強する他の発現制御エレメント、例えば、（１）ＣＡＧプロモーター；（２）ＣＢＡプロモーター；（３）ＣＭＶプロモーター；（４）１．７ｋｂ赤錐体オプシンプロモーター（ＰＲ１．７プロモーター）；（５）ロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）光受容体－特異的エンハンサー－プロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｒｅｔｉｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；４４：４０７６－４０８５）；（６）ｈＣＡＲｐプロモーター、これはヒト錐体アレスチンプロモーターである；（７）ｈＲＫｐ、これはロドプシンキナーゼプロモーターである；（８）錐体光受容体特異的ヒトアレスチン３（ＡＲＲ３）プロモーター；（９）ロドプシンプロモーター；及び（１０）Ｕ６プロモーター（特に、治療用産物が低分子ＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである場合）を含む。
【0055】
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ｎｔ３３９６～４０６１で配列番号５に示される配列などの、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントを有するハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、ＣＢ７プロモーターである。他の好適なプロモーターとしては、ヒトβ－アクチンプロモーター、ヒト伸長因子－１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０プロモーター、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。例えば、Ｄａｍｄｉｎｄｏｒｊ ｅｔ ａｌ，（Ａｕｇｕｓｔ ２０１４）Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（８）：ｅ１０６４７２を参照されたい。更に他の好適なプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーターが挙げられる（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい）。あるいは、生理学的手がかりに応答するプロモーターを、本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、ベクター、プラスミド、及びウイルスにおいて利用してもよい。一実施形態では、プロモーターは、ＡＡＶベクターのサイズ制限のために、１０００ｂｐ未満の小さいサイズである。別の実施形態では、プロモーターは、４００ｂｐ未満である。他のプロモーターは、当業者によって選択され得る。
【0056】
更なる実施形態では、プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、ファージラムダ（ＰＬ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター応答性プロモーター（ｔｅｔ）システム、長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター（例えば、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＢＩＶ ＬＴＲまたはＨＩＶ ＬＴＲ）、モロニーマウス肉腫ウイルスのＵ３領域プロモーター、グランザイムＡプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（複数可）、ＣＤ３４プロモーター、ＣＤ８プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、ＰＧＫプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター（例えば、ＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０プロモーター）、免疫グロブリンプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｌａｃプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモーター、ＭＮＤプロモーター、またはＭＮＣプロモーターから選択される。そのプロモーター配列は、当業者に公知であるか、または公的に、例えば、文献においてもしくはデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどにおいて入手可能である。
【0057】
ある特定の実施形態では、他の発現制御エレメントには、ニワトリβ－アクチンイントロン及び／またはウサギβ－グロビンポリＡシグナルが含まれる。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、１つまたは複数のエレメントを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のプロモーターエレメントは、互いに対して逆方向または移動させ得る。ある特定の実施形態では、プロモーターのエレメントは、協調的に機能するように配置されている。ある特定の実施形態では、プロモーターのエレメントは、独立して機能するように配置されている。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、ヒトＣＭＶ前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ）の長い末端反復、及びラットインスリンプロモーターからなる群から選択される１つまたは複数のプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、ＡＡＶ、ＭＬＶ、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ－１、及びＨＩＶ－２ ＬＴＲからなる群から選択される１つまたは複数の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、１つまたは複数の組織特異的プロモーター（例えば、網膜色素上皮細胞特異的プロモーター）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、ＲＰＥ６５プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、ＶＭＤ２プロモーターを含む。
【0058】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、プロモーター以外の１つまたは複数の制御エレメントを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、エンハンサーを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、リプレッサーを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、イントロンまたはキメライントロンを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、ポリアデニル化配列を含む。
【0059】
４．１．３ シグナルペプチド
治療用産物が治療用タンパク質である、ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、タンパク質送達を調節する構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、１つまたは複数のシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、本明細書では「リーダー配列」または「リーダーペプチド」も称され得る。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、治療用産物が細胞内で適切なパッケージング（例えば、グリコシル化）を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、治療用産物が細胞内で適切な局在化を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、治療用産物が細胞からの分泌を達成することを可能にする。本明細書に提供する組換えベクター及び治療用産物に関連して使用されるシグナルペプチドの例は、表１に見出され得る。
治療用産物が治療用タンパク質である、ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、タンパク質送達を調節する構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、１つまたは複数のシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、本明細書では「リーダー配列」または「リーダーペプチド」も称され得る。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、治療用産物が細胞内で適切なパッケージング（例えば、グリコシル化）を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、治療用産物が細胞内で適切な局在化を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、治療用産物が細胞からの分泌を達成することを可能にする。本明細書に提供する組換えベクター及び治療用産物に関連して使用されるシグナルペプチドの例は、表１に見出され得る。
【表1】
【0060】
４．１．４ 非翻訳領域
治療用産物が治療用タンパク質である、ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、１つまたは複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、３’及び／または５’ＵＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、所望のタンパク質発現レベルに関して最適化されている。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡの半減期に関して最適化されている。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性に関して最適化されている。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡの二次構造に関して最適化されている。
治療用産物が治療用タンパク質である、ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、１つまたは複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、３’及び／または５’ＵＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、所望のタンパク質発現レベルに関して最適化されている。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡの半減期に関して最適化されている。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性に関して最適化されている。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡの二次構造に関して最適化されている。
【0061】
４．１．５ 逆方向末端反復
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えウイルスベクターは、１つまたは複数の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。ＩＴＲ配列は、組換え治療用産物発現カセットを、組換えウイルスベクターのビリオンにパッケージングするために使用され得る。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２に由来する（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９（１）：３６４－３７９；米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えウイルスベクターは、１つまたは複数の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。ＩＴＲ配列は、組換え治療用産物発現カセットを、組換えウイルスベクターのビリオンにパッケージングするために使用され得る。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２に由来する（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９（１）：３６４－３７９；米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【0062】
４．１．６ 治療用産物
別の態様では、ヒト対象に治療用産物を送達する方法を本明細書に提供する。一部の実施形態では、治療用産物は、ＴＰＰ１である。一部の実施形態では、患者は、限定されないが、視力喪失、網膜萎縮及び／または網膜変性を含む、バッテン病に関連する眼症状を経験している。特定の実施形態では、有効量のＴＰＰ１治療用産物を対象に送達する方法を本明細書に提供し、対象は、バッテン病に関連する眼症状を経験する。
別の態様では、ヒト対象に治療用産物を送達する方法を本明細書に提供する。一部の実施形態では、治療用産物は、ＴＰＰ１である。一部の実施形態では、患者は、限定されないが、視力喪失、網膜萎縮及び／または網膜変性を含む、バッテン病に関連する眼症状を経験している。特定の実施形態では、有効量のＴＰＰ１治療用産物を対象に送達する方法を本明細書に提供し、対象は、バッテン病に関連する眼症状を経験する。
【0063】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、治療用産物は、トリペプチジル－ペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）である。ＣＬＮ２としても知られるＴＰＰ１遺伝子は、トリペプチジル－ペプチダーゼＩ活性を有するリソソームセリンプロテアーゼである、トリペプチジル－ペプチダーゼ１をコードする。また、リソソームプロテイナーゼによって産生される分解産物からトリペプチドを生成し、非置換Ｎ末端を有する基質を必要とする非特異的リソソームペプチダーゼとしても作用すると考えられている。本明細書で使用する場合、「ＴＰＰ１」、「ＣＬＮ２」、及び「トリペプチジル－ペプチダーゼ１」という用語は、コード配列を指すときに互換的に使用される。ヒトトリペプチジル－ペプチダーゼ１をコードする天然核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３９１．３に報告され、ここでは配列番号２に再現される。ヒトトリペプチジル－ペプチダーゼ１の２つのアイソフォームは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔアクセッションＯ１４７７３－１及びＯ１４７７３－２として報告されている（ここでは、配列番号１及び４として再現される）。ＣＬＮ２遺伝子の変異は、後期幼児ＮＣＬ（ＬＩＮＣＬ）疾患に関連している。
【0064】
ある特定の実施形態では、ヒト（ｈ）ＴＰＰ１をコードする最適化ｃＤＮＡは、最適なコドン使用のためにカスタム設計され、合成されてもよい。ある特定の実施形態では、配列番号３として再現されるｈＴＰＰ１ｃｏ ｃＤＮＡは、次いで、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリベータアクチンプロモーターとの間のハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって駆動される、導入遺伝子発現カセットに配置されてもよく、一方、このプロモーターからの転写は、ニワトリベータアクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される（図１Ａ及び１Ｂ）。ある特定の実施形態では、発現カセットのためのポリＡシグナルは、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。
【0065】
一態様では、ヒト（ｈ）ＴＰＰ１をコードするコドン最適化された操作された核酸配列を提供する。ある特定の実施形態では、天然ＴＰＰ１配列（配列番号２）と比較して翻訳を最大化するように設計された、操作されたヒト（ｈ）ＴＰＰ１ ｃＤＮＡを、（配列番号３として）本明細書に提供する。好ましくは、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、全長天然ＴＰＰ１コード配列（配列番号２）に対して、約８０％未満の同一性、好ましくは約７５％の同一性を有する。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、配列番号２の天然ＴＰＰ１コード配列に対して約７４％の同一性を有する。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、ＡＡＶ媒介性送達（例えば、ｒＡＡＶ）後の天然ＴＰＰ１と比較して、改善された翻訳速度を特徴とする。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、配列番号２の全長天然ＴＰＰ１コード配列に対して、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％未満またはそれ以下の同一性を共有する。一実施形態では、コドン最適化核酸配列は、配列番号３のバリアントである。別の実施形態では、コドン最適化核酸配列、配列番号３と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％またはそれ以上の同一性を共有する配列。一実施形態では、コドン最適化核酸配列は、配列番号３である。別の実施形態では、核酸配列は、ヒトでの発現に最適化されたコドンである。他の実施形態では、異なるＴＰＰ１コード配列が選択される。
【0066】
ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または少なくとも約５００～５０００ヌクレオチドの断片にわたり得る、配列同一性比較の長さが所望される。しかしながら、より小さい断片間、例えば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０～２４ヌクレオチド、少なくとも約２８～３２ヌクレオチド、少なくとも約３６以上のヌクレオチドの同一性もまた所望され得る。
【0067】
タンパク質、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、もしくはそれらのペプチド断片、または対応する核酸配列コード配列の全長にわたるアミノ酸配列について、パーセント同一性を容易に決定することができる。好適なアミノ酸断片は、少なくとも約８アミノ酸の長さであってもよく、最大約７００アミノ酸であってもよい。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「アラインメントされた」配列を参照して決定される。「アラインメントされた」配列または「アラインメント」は、参照配列と比較して、欠損または追加の塩基もしくはアミノ酸の補正を含むことが多い、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。
【0068】
同一性は、配列のアラインメントを調製することによって、及び当該技術分野で公知の、または市販されている種々のアルゴリズム及び／またはコンピュータープログラムの使用によって決定され得る［例えば、ＢＬＡＳＴ；ＥｘＰＡＳｙ；ＣｌｕｓｔａｌＯ；ＦＡＳＴＡ；例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する］。アラインメントは、様々な公的にまたは商業的に入手可能な多重配列アラインメントプログラムのうちのいずれかを使用して行われる。配列アラインメントプログラム、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムのうちのいずれかは、デフォルト設定で使用されるが、当業者は、必要に応じてこれらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと少なくとも同一性またはアラインメントのレベルを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
【0069】
核酸配列については、複数の配列アラインメントプログラムも利用可能である。かかるプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ配列アセンブリ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられ、これらは、インターネット上のウェブサーバーを介してアクセス可能である。かかるプログラムの他のソースは、当業者に公知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティも使用される。上記のプログラムに含まれるものを含む、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる、当該技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用して比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリと検索配列との間の最適なオーバーラップ領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧバージョン６．１で提供されるように、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのＮＯＰＡＭ因子）を有するＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。
【0070】
コドン最適化コード領域は、様々な異なる方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えば、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して行われ得る。１つのコドン最適化方法は、例えば、米国国際特許公開第２０１５／０１２９２４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。好適に、産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が修飾される。しかしながら、一部の実施形態では、ＯＲＦの断片のみが変更され得る。これらの方法のうちの１つを使用することにより、任意の所与のポリペプチド配列に周波数を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生することができる。
【0071】
コドンへの実際の変更を行うため、または本明細書に記載のように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかの選択肢が利用可能である。かかる修飾または合成は、当業者に周知の標準的及びルーチン分子生物学的操作を使用して行うことができる。１つのアプローチでは、各々が８０～９０ヌクレオチドの長さであり、所望の配列の長さにまたがる一連の相補性オリゴヌクレオチド対が、標準的な方法により合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリング時に、それらが粘着末端を含有する８０～９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、対における各オリゴヌクレオチドは、対における他のオリゴヌクレオチドに相補的な領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基を伸長するように合成される。各オリゴヌクレオチド対の一本鎖末端は、別のオリゴヌクレオチド対の一本鎖末端とアニーリングするように設計されている。オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、次いで、これらの二本鎖断片のうちのおよそ５～６個を、粘着性一本鎖末端を介して一緒にアニーリングさせ、次いで、それらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ）から入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、コンストラクトを標準的な方法によって配列決定する。一緒にライゲーションされた８０～９０塩基対断片のうちの５～６個の断片、すなわち、約５００塩基対の断片からなるこれらのコンストラクトのうちのいくつかを調製し、その結果、所望の配列全体が一連のプラスミドコンストラクトで表される。次いで、これらのプラスミドの挿入物を適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションして、最終コンストラクトを形成する。次いで、最終コンストラクトを標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。追加の方法は、当業者に直ちに明らかになるであろう。加えて、遺伝子合成は、容易に商業的に入手可能である。
【0072】
一実施形態では、ＴＰＰ１をコードする核酸配列は、それに共有結合したタグポリペプチドをコードする核酸を更に含む。タグポリペプチドは、限定されないが、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ－ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチンタグポリペプチド、フラグタグポリペプチド、及びマルトース結合タンパク質タグポリペプチドを含む、公知の「エピトープタグ」から選択されてもよい。
【0073】
別の態様では、ＴＰＰ１をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。一実施形態では、配列は、コドン最適化配列である。別の実施形態では、コドン最適化核酸配列は、ヒトＴＰＰ１をコードする配列番号３である。
【0074】
一部の実施形態では、ＴＰＰ１をコードするヌクレオチド配列は、調節配列（限定されないが、イニシエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列を含む）に作動可能に連結してもよく、これらは、それらが作動可能に連結している核酸配列をコードするタンパク質の転写を誘導、抑制、または他の方法で制御する。一部の実施形態では、ＴＰＰ１をコードするヌクレオチド配列は、国際特許出願公開第２０２０／１０２３６９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているヌクレオチド配列である。
【0075】
４．１．７ コンストラクト
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、以下のエレメントを以下の順序で含む：ａ）構成的または低酸素誘導性プロモーター配列、及びｂ）治療用産物をコードする配列。ある特定の実施形態では、治療用産物をコードする配列は、ＩＲＥＳエレメントによって分離された複数のＯＲＦを含む。ある特定の実施形態では、治療用産物をコードする配列は、Ｆ／Ｆ２Ａ配列によって分離された１つのＯＲＦ内に複数のサブユニットを含む。
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、以下のエレメントを以下の順序で含む：ａ）構成的または低酸素誘導性プロモーター配列、及びｂ）治療用産物をコードする配列。ある特定の実施形態では、治療用産物をコードする配列は、ＩＲＥＳエレメントによって分離された複数のＯＲＦを含む。ある特定の実施形態では、治療用産物をコードする配列は、Ｆ／Ｆ２Ａ配列によって分離された１つのＯＲＦ内に複数のサブユニットを含む。
【0076】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、本明細書に提供する組換えベクターは、以下のエレメントを以下の順序で含む：ａ）第１のＩＴＲ配列、ｂ）第１のリンカー配列、ｃ）構成的または低酸素誘導性プロモーター配列、ｄ）第２のリンカー配列、ｅ）イントロン配列、ｆ）第３のリンカー配列、ｇ）第１のＵＴＲ配列、ｈ）治療用産物をコードする配列、ｉ）第２のＵＴＲ配列、ｊ）第４のリンカー配列、ｋ）ポリＡ配列、ｌ）第５のリンカー配列、及びｍ）第２のＩＴＲ配列。
【0077】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターの６８４１ｂｐ産生プラスミド（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＴＰＰ１ｃｏ．ＲＢＧ）は、ＡＡＶ２由来ＩＴＲに隣接する本明細書に記載のｈＴＰＰ１ｃｏ発現カセット、ならびに選択的マーカーとしてのアンピシリンに対する耐性を用いて構築され得る（図１Ｂ）。ある特定の実施形態では、カナマイシンに耐性を有する同様のＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ産生プラスミドもまた構築され得る。ある特定の実施形態では、両方のプラスミドに由来するベクターは、本明細書に記載のｈＴＰＰ１ｃｏ発現カセットに隣接するＡＡＶ２由来ＩＴＲを有する一本鎖ＤＮＡゲノムであり得る。
【0078】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターは、三重トランスフェクションによって作製され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなり、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＰＦ６８）を含有する賦形剤で製剤化されてもよい。例えば、Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈｉｒｏａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｄｉｓｓ．Ｄｉ－ｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８を参照されたい。ある特定の実施形態では、産生されたベクターのゲノム力価は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を介して決定され得る。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。例示的なＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターが本明細書に記載され、これは、本明細書では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２と称されることがある。
【0079】
一部の実施形態では、組換えベクターは、国際特許出願公開第２０２０／１０２３６９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の組換えベクターである。
【0080】
本明細書で使用する場合、「発現カセット」とは、ＴＰＰ１タンパク質、プロモーターのコード配列を含む核酸分子を指し、そのための他の調節配列を含んでもよく、カセットは、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のキャプシドにパッケージングされてもよい。典型的には、ウイルスベクターを生成するためのかかる発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列に隣接する、本明細書に記載のＣＬＮ２配列を含有する。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、パッケージングシグナルは、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲである。ＡＡＶキャプシドにパッケージングされた場合、発現カセットと併せたＩＴＲは、本明細書では、「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノム」または「ベクターゲノム」と称され得る。一実施形態では、発現カセットは、ＴＰＰ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含む。一実施形態では、カセットは、宿主細胞内でＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列の発現を指示する発現制御配列と作動可能に関連するコドン最適化ＣＬＮ２を提供する。
【0081】
別の実施形態では、ＡＡＶベクターで使用するための発現カセットが提供される。その実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。別の実施形態では、発現カセットは、５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を含む。一実施形態では、５’及び３’ＩＴＲは、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列に隣接し、任意選択で、宿主細胞内でＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列の発現を指示する追加の配列を有する。したがって、本明細書に記載のように、ＡＡＶ発現カセットは、その５’末端で５’ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接し、その３’末端で３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する上記の発現カセットを記載することを意味する。したがって、このｒＡＡＶゲノムは、発現カセットをＡＡＶウイルス粒子、すなわち、ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲにパッケージングするのに必要な最小限の配列を含む。ＡＡＶ ＩＴＲは、本明細書に記載のように、任意のＡＡＶのＩＴＲ配列から得てもよい。これらのＩＴＲは、得られる組換えＡＡＶにおいて用いられるキャプシドと同じＡＡＶ起源のものであってもよく、または異なるＡＡＶ起源のもの（ＡＡＶ擬似型を産生するため）であってもよい。一実施形態では、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列を使用する。しかしながら、他のＡＡＶ源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲ源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ＴＰＰ１コード配列及び任意の調節配列、ならびにＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の構成が好適であり得る。ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮版が記載されており、その中でＤ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲを使用する。次いで、各ｒＡＡＶゲノムを産生プラスミドに導入することができる。
【0082】
一態様では、本明細書に記載の発現カセットのうちのいずれかを含むベクターが提供される。本明細書に記載のように、かかるベクターは、種々の起源のプラスミドであり得、ある特定の実施形態では、本明細書に更に記載の組換え複製欠損ウイルスの生成に有用である。
【0083】
一実施形態では、ベクターは、その記載される発現カセット、例えば、「ネイキッドＤＮＡ」、「ネイキッドプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む非ウイルス性プラスミドであり、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物及び他のポリマー、脂質及び／またはコレステロールベースの核酸コンジュゲート、ならびに本明細書に記載の他のコンストラクトを含む、様々な組成物及びナノ粒子とカップリングされる。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ ７７４－７８７；ウェブ刊行物：２０１１年３月２１日；ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２及びＷＯ２０１２／１７０９３０（全て、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。かかる非ウイルスＴＰＰ１ベクターは、本明細書に記載の経路によって投与され得る。ウイルスベクター、または非ウイルスベクターは、遺伝子導入及び遺伝子療法の用途で使用するための生理学的に許容される担体とともに製剤化することができる。
【0084】
別の実施形態では、ベクターは、記載される発現カセットをその中に含むウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、外因性または異種ＣＬＮ２核酸導入遺伝子を含む。一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、薬物送達またはウイルスベクターの産生のために使用されるプラスミド上に操作され得る。好適なウイルスベクターは、好ましくは複製欠損であり、脳細胞を標的とするものの中から選択される。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、パルボウイルスなどを含むが、これらに限定されない、遺伝子療法に好適な任意のウイルスが挙げられ得る。
【0085】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠損であり得る。「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスキャプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされた合成または組換えウイルス粒子を指し、ウイルスキャプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損であり、すなわち、それらは、子孫ビリオンを生成することができないが、標的細胞を感染させる能力を保持する。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作することができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、子孫ビリオンによる複製及び感染は、複製に必要なウイルス酵素の存在下でなければ起こり得ないため、遺伝子療法での使用は安全であると考えられる。
【0086】
別の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが提供される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド、及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを損なう。
【0087】
ベクターゲノムは、一実施形態では、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするコード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは、本明細書に記載の発現カセットである。一実施形態では、ＣＬＮ２配列は、全長ＴＰＰ１タンパク質をコードする。一実施形態では、ＴＰＰ１配列は、配列番号１のタンパク質配列である。別の実施形態では、コード配列は、配列番号３またはそのバリアントである。
【0088】
ＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、ＡＡＶから当業者に利用可能な技術を使用して容易に単離または操作され得る。かかるＡＡＶは、単離されてもよく、操作されてもよく、または学術的、商業的、もしくは公的なソース（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手されてもよい。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献においてまたは例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースにおいて入手可能であるような公開された配列を参照することにより、合成または他の好適な手段を介して操作されてもよい。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学技術によって操作されてもよく、これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小化するため、安定性及び粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のためなどに最適化することが可能になる。
【0089】
ＡＡＶの断片は、種々のベクター系及び宿主細胞において容易に利用され得る。望ましいＡＡＶ断片の中には、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列が含まれる。かかる断片は、単独で、他のＡＡＶ血清型配列もしくは断片と組み合わせて、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用してもよい。本明細書で使用する場合、人工ＡＡＶ血清型としては、限定されないが、非天然に存在するキャプシドタンパク質を有するＡＡＶが挙げられる。かかる人工キャプシドは、本発明の新規のＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を、別のＡＡＶ血清型（既知または新規）、同じＡＡＶ血清型の非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得ることができる異種配列と組み合わせて、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶ血清型は、限定されないが、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであり得る。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ９ ｃａｐ及び／またはｒｅｐ配列を含有する。米国特許第７，９０６，１１１号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0090】
一実施形態では、配列番号６のアミノ酸配列を特徴とするＡＡＶ９キャプシドを有するＡＡＶベクターを本明細書に提供し、ここでは、古典的な後期幼児神経セロイドリポフスチン症２（ＣＬＮ２）遺伝子をコードする核酸が、それを必要とする患者におけるその発現を指示する調節配列の制御下で提供される。
【0091】
本明細書で使用する場合、「ＡＡＶ９キャプシド」は、配列番号６の異なる長さのタンパク質をもたらす代替スプライスバリアントとして典型的に発現される約６０個の可変タンパク質（ｖｐ）のアセンブリであるＤＮＡｓｅ耐性粒子を特徴とする。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４．１（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。ＵＳ７９０６１１１及びＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。本明細書で使用する場合、「ＡＡＶ９バリアント」は、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、及びＵＳ８，７３４，８０９に記載されるものを含む。アミノ酸配列を配列番号６に再現し、コード配列を配列番号７に再現する。一実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号７によってコードされるキャプシド、またはそれと少なくとも約９０％、９５％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を共有する配列を含む。
【0092】
最大のタンパク質であるｖｐ１は、一般に、配列番号６のアミノ酸配列の全長（配列番号６のａａ１～７３６）である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ９ ｖｐ２タンパク質は、配列番号６の１３８～７３６のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ９ ｖｐ３は、配列番号６の２０３～７３６のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ｖｐ１、２または３タンパク質は、切断（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に１つまたは複数のアミノ酸）であり得、それを有し得る。ＡＡＶ９キャプシドは、約６０個のｖｐタンパク質で構成され、ここで、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３は、組み立てられたキャプシド内に約１ ｖｐ対約１ ｖｐ２対約１０～２０ ｖｐ３タンパク質の比率で存在する。この比率は、使用される産生系に応じて異なる場合がある。ある特定の実施形態では、操作されたＡＡＶ９キャプシドは、ｖｐ２が存在しない場合に生成され得る。
【0093】
ＤＮＡ（ゲノムもしくはｃＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶ９キャプシドをコードする核酸配列を設計することは、当該技術分野における技能の範囲内である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ９ ｖｐ１キャプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号７に提供される。他の実施形態では、配列番号７に対して７０％～９９．９％の同一性の核酸配列を選択して、ＡＡＶ９キャプシドを発現させてもよい。ある特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号７に対して少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。
【0094】
本明細書で使用する場合、ＡＡＶの群に関連するような「クレード」という用語は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、（少なくとも１０００個の複製のうちの）少なくとも７５％のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値により近隣結合アルゴリズムを使用して決定されるように、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指す。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するために使用することができるコンピュータープログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正されたＮｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術及びコンピュータープログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１キャプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定されるクレードのうちの１つ、別のクレードに含まれるか、またはこれらのクレードの外側にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０）：６３８１－６３８８（クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを識別し、新規のＡＡＶ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９の核酸配列を提供する）を参照されたい。ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。ＡＡＶ９は更に、クレードＦ内にあることを特徴とする。他のクレードＦ ＡＡＶとしては、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２が挙げられる。
【0095】
本明細書で使用する場合、ＡＡＶに関連して、バリアントという用語は、アミノ酸または核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を共有するものを含む、公知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味する。別の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、記載されたまたは公知のＡＡＶキャプシド配列からの最大約１０％の変異を含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶキャプシドは、本明細書に提供する、及び／または当該技術分野で公知のＡＡＶキャプシドに対して約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、または約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶキャプシドの同一性パーセントを決定するとき、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のうちのいずれかに対して行われ得る。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、ｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３に対してＡＡＶ９と少なくとも９５％の同一性を共有する。
【0096】
本明細書で使用する場合、「人工ＡＡＶ」は、限定されないが、非天然に存在するキャプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味する。かかる人工キャプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を、異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得ることができる異種配列と組み合わせて、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、限定されないが、シュードタイプＡＡＶ、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであり得る。１つのＡＡＶのキャプシドが異種キャプシドタンパク質に置き換えられる、シュードタイプベクターは、本発明において有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／９及びＡＡＶ２／ｒｈ．１０は、例示的なシュードタイプベクターである。
【0097】
別の実施形態では、自己相補性ＡＡＶが使用される。「自己相補性ＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するように設計された発現カセットを有するプラスミドまたはベクターを指す。感染すると、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、即時の複製及び転写の準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【0098】
更に別の実施形態では、本明細書に記載されるもののうちのいずれかを含む発現カセットは、組換えＡＡＶゲノムを生成するために用いられる。
【0099】
一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、ウイルスベクターを生成するために、及び／または宿主細胞、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどへの送達のために有用な好適な遺伝要素（ベクター）に操作され、これは、その上に担持されるＣＬＮ２配列を転送する。選択されたベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングされたペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含む、任意の好適な方法によって送達され得る。かかるコンストラクトを作製するために使用される方法は、核酸操作の当業者に公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。
【0100】
発現カセットまたはｒＡＡＶゲノムまたは産生プラスミドをビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットと同じコンストラクトにおいてシスで必要な唯一のＡＡＶ成分である。一実施形態では、ＡＡＶベクターを生成するために、複製（ｒｅｐ）及び／またはキャプシド（ｃａｐ）のコード配列をＡＡＶゲノムから除去し、トランスでまたはパッケージング細胞株により供給する。
【0101】
対象への送達に好適なＡＡＶウイルスベクターを産生及び単離するための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。１つの系では、プロデューサー細胞株は、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードするコンストラクト及びｒｅｐ及びｃａｐをコードするコンストラクト（複数可）で一時的にトランスフェクトされる。第２の系では、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードするコンストラクトで、ｒｅｐ及びｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株が、一時的にトランスフェクトされる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞株またはパッケージング細胞株は、本明細書に記載のＡＡＶウイルスベクターが、プロデューサー細胞株またはパッケージング細胞株を懸濁培養において増殖させることによって製造することができるような懸濁細胞株である。これらの系の各々では、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答してＡＡＶビリオンが産生され、汚染ウイルスからｒＡＡＶを分離する必要がある。より最近では、ＡＡＶを回復させるためにヘルパーウイルスによる感染を必要としない系が開発されており、必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた、トランスで、系により供給される。これらの新しい系では、ヘルパー機能は、必要なヘルパー機能をコードするコンストラクトによる細胞の一時的なトランスフェクションにより供給することができるか、または細胞は、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定的に含有するように設計することができ、その発現は、転写レベルまたは転写後レベルで制御することができる。
【0102】
なお別の系では、ＩＴＲ及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に隣接する発現カセットは、バキュロウイルスベースのベクターによる感染により昆虫細胞に導入される。これらの産生系に関するレビューについては、一般に、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９（この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法はまた、以下の米国特許に記載されており、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：第５，１３９，９４１号、第５，７４１，６８３号、第６，０５７，１５２号、第６，２０４，０５９号、第６，２６８，２１３号、第６，４９１，９０７号、第６，６６０，５１４号、第６，９５１，７５３号、第７，０９４，６０４号、第７，１７２，８９３号、第７，２０１，８９８号、第７，２２９，８２３号、及び第７，４３９，０６５号。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，“Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0103】
一態様では、ｒＡＡＶを産生することができる懸濁細胞株を懸濁培養物において増殖させることを含む、本明細書に記載のｒＡＡＶを製造する方法を本明細書に提供する。
【0104】
ある特定の実施形態では、懸濁細胞株は、無血清及び動物成分を含まない培養培地を使用して細胞を懸濁培養に適応させることによって、接着細胞株に由来する。特定の実施形態では、懸濁細胞株は、ＨＥＫ２９３懸濁細胞株である。
【0105】
本発明の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作の当業者に公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、好適な方法の選択は、本発明に対する限定ではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
【0106】
「プラスミド」は、一般に、当業者によく知られている標準的な命名規則に従って、本明細書では、大文字及び／または数字の前及び／または後の小文字のｐによって指定される。本発明に従って使用することができる多くのプラスミド及び他のクローニング及び発現ベクターは、周知であり、当業者に容易に入手可能である。更に、当業者は、本発明での使用に好適な任意の数の他のプラスミドを容易に構築することができる。本発明におけるかかるプラスミド、ならびに他のベクターの特性、構築及び使用は、本開示から当業者に容易に明らかになるであろう。
【0107】
一実施形態では、産生プラスミドは、本明細書に記載されるもの、またはＷＯ２０１２／１５８７５７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものである。様々なプラスミドは、ｒＡＡＶベクターを産生する際の使用について当該技術分野で公知であり、本明細書で有用である。産生プラスミドは、ＡＡＶキャップ及び／またはｒｅｐタンパク質を発現する宿主細胞内で培養される。宿主細胞では、各ｒＡＡＶゲノムが救出され、キャプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質にパッケージングされて、感染性ウイルス粒子を形成する。
【0108】
一態様では、上記の発現カセットを含む産生プラスミドが提供される。一実施形態では、産生プラスミドは、図１Ｂに示されるものである。このプラスミドは、ｒＡＡＶ－ヒトコドン最適化ＴＰＰ１ベクターの生成の実施例において使用される。かかるプラスミドは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列、選択されたプロモーター、ポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含有するものであり、加えて、ニワトリベータ－アクチンイントロンなどのイントロン配列も含有する。例示的な概略図を図１Ａに示す。更なる実施形態では、イントロン配列は、約３キロベース（ｋｂ）～約６ｋｂ、約４．７ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約５．５ｋｂ、または約４．７ｋｂ～５．５ｋｂのサイズのｒＡＡＶベクターゲノムを維持する。ＴＰＰ１コード配列を含む産生プラスミドの例は、配列番号５に見出すことができる。別の実施形態では、産生プラスミドは、最適化されたベクタープラスミド産生効率に修飾される。かかる修飾には、他の中性配列の付加、またはベクタープラスミドのスーパーコイルのレベルを調節するためのラムダスタッファー配列の包含が含まれる。かかる修飾が、本明細書で企図される。他の実施形態では、ターミネーター及び他の配列が、プラスミドに含まれる。
【0109】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ発現カセット、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、ウイルス（ｒＡＡＶなど）、及び／または産生プラスミドは、ＡＡＶ逆方向末端反復配列、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列、及び宿主細胞内でコードされるタンパク質の発現を指示する発現制御配列を含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶ発現カセット、ウイルス、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、及び／または産生プラスミドは、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ、転写後調節エレメントなどのうちの１つまたは複数を更に含む。一実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
【0110】
発現カセット、ベクター及びプラスミドは、例えば、本明細書に記載のコドン最適化を含む、当該技術分野で公知の技術を使用して特定の種に対して最適化することができる他の成分を含む。
【0111】
他の実施形態では、本明細書に記載の発現カセット、ベクター、プラスミド及びウイルスは、他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；ＴＡＴＡ配列；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；イントロン；タンパク質安定性を向上させる配列；及び必要に応じて、コードされる産物の分泌を向上させる配列を含有する。発現カセットまたはベクターは、本明細書に記載のエレメントのうちのいずれも含有しないか、いずれかを１つまたは複数含有することができる。
【0112】
好適なポリＡ配列の例としては、例えば、合成ポリＡ、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来のものが挙げられる。更なる実施形態では、ポリＡは、配列番号５のｎｔ３３～１５９の核酸配列を有する。
【0113】
好適なエンハンサーの例としては、数ある中で、例えば、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、アルファフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／アルファ１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥが挙げられる。
【0114】
一実施形態では、正しい開始コドンからの翻訳を増強するために、ＴＰＰ１コード配列の上流にＫｏｚａｋ配列が含まれる。別の実施形態では、ＣＢＡエクソン１及びイントロンは、発現カセットに含まれる。一実施形態では、ＴＰＰ１コード配列は、ハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下に置かれる。このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、近位ニワトリβアクチンプロモーター、及びイントロン１配列に隣接するＣＢＡエクソン１からなる。
【0115】
別の実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ－グロブリン、ベータ－グロブリン、コラーゲン、オバルブミン、ｐ５３、またはそれらの断片から選択される。
【0116】
一実施形態では、発現カセット、ベクター、プラスミド及びウイルスは、５’ＩＴＲ、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡエクソン１及びイントロン、ヒトコドン最適化ＣＬＮ２配列、ウサギグロビンポリＡ及び３’ＩＴＲを含有する。更なる実施形態では、発現カセットは、配列番号８のｎｔ１～４０２０を含む。なお更に別の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号５のｎｔ３１９９～ｎｔ３３２８の核酸配列を有し、３’ＩＴＲは、配列番号５のｎｔ２４８～ｎｔ３７７の核酸配列を有する。更なる実施形態では、産生プラスミドは、図１Ｃ～１Ｅにも示される、配列番号５の配列を有する。
【0117】
４．１．８ ベクターの製造及び試験
本明細書に提供する組換えベクター（例えば、組換えウイルスベクター）は、宿主細胞を使用して製造され得る。本明細書に提供する組換えベクターは、哺乳動物宿主細胞、例えば、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、２９３、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞を使用して製造され得る。本明細書に提供する組換えベクターは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスターからの宿主細胞を使用して製造され得る。他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、バッテン病のためにインビボで処置されている対象の脳細胞を指すことが意図される。かかる宿主細胞としては、脳室系の上皮内層である上衣を含むＣＮＳの上皮細胞が挙げられる。他の宿主細胞としては、ニューロン、アストロサイト、オリゴエデンドロサイト、及びミクログリアが挙げられる。
本明細書に提供する組換えベクター（例えば、組換えウイルスベクター）は、宿主細胞を使用して製造され得る。本明細書に提供する組換えベクターは、哺乳動物宿主細胞、例えば、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、２９３、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞を使用して製造され得る。本明細書に提供する組換えベクターは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスターからの宿主細胞を使用して製造され得る。他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、バッテン病のためにインビボで処置されている対象の脳細胞を指すことが意図される。かかる宿主細胞としては、脳室系の上皮内層である上衣を含むＣＮＳの上皮細胞が挙げられる。他の宿主細胞としては、ニューロン、アストロサイト、オリゴエデンドロサイト、及びミクログリアが挙げられる。
【0118】
組換えウイルスベクターについては、宿主細胞は、治療用産物及び関連するエレメント（すなわち、ベクターゲノム）、ならびに宿主細胞においてウイルスを産生する手段、例えば、複製及びキャプシド遺伝子（例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をコードする配列を用いて安定に形質転換される。ＡＡＶ８キャプシドを伴う組換えＡＡＶベクターの産生方法については、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の発明を実施するための形態のセクションＩＶを参照されたい。当該ベクターのゲノムコピー力価は、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析によって決定し得る。ビリオンは、例えば、ＣｓＣｌ２沈降法によって回収し得る。
【0119】
インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイを使用して、本明細書に記載のベクターからの治療用産物発現を測定することができる、ゆえに、例えば、ベクターの効力を示すことができる。例えば、ヒト胚性網膜細胞に由来する細胞株であるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株（Ｌｏｎｚａ）、または網膜色素上皮細胞、例えば、網膜色素上皮細胞株ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）を使用して、治療用産物発現を評価することができる。一度発現すると、発現された治療用産物の特徴を決定することができ、これには翻訳後修飾パターンの決定が含まれる。加えて、細胞発現治療用産物の翻訳後修飾から生じる利益は、当該技術分野で公知のアッセイを使用して決定することができる。
【0120】
４．２ 組成物
本明細書に記載の治療用産物をコードする組換えベクター及び好適な担体を含む組成物を記載する。好適な担体（例えば、脈絡膜上、網膜下、強膜近傍、硝子体内、結膜下、及び／または網膜内投与用）は、当業者によって容易に選択されるであろう。
本明細書に記載の治療用産物をコードする組換えベクター及び好適な担体を含む組成物を記載する。好適な担体（例えば、脈絡膜上、網膜下、強膜近傍、硝子体内、結膜下、及び／または網膜内投与用）は、当業者によって容易に選択されるであろう。
【0121】
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、リン酸カリウム一塩基性、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、スクロース、及び界面活性剤を含む薬学的組成物を提供する。
【0122】
一部の実施形態では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、イオン性塩賦形剤または緩衝剤、スクロース、及びポロキサマー１８８を含む薬学的組成物を提供する。一部の実施形態では、イオン性塩賦形剤または緩衝剤は、リン酸カリウム一塩基性、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム六水和物、リン酸ナトリウム一塩基性一水和物、トロメタミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、アミノ酸、ヒスチジン、塩酸ヒスチジン（ヒスチジン－ＨＣｌ）、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム６－水和物、硫酸カルシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウムからなる群からなる１つまたは複数の成分であり得る。
【0123】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約６０ｍＭ～１１５ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約６０ｍＭ～１００ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約６５ｍＭ～９５ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約７０ｍＭ～９０ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約７５ｍＭ～８５ｍＭのイオン強度を有する。
【0124】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約３０ｍＭ～１００ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約３５ｍＭ～９５ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約４０ｍＭ～９０ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約４５ｍＭ～８５ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約５０ｍＭ～８０ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約５５ｍＭ～７５ｍＭのイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約６０ｍＭ～７０ｍＭのイオン強度を有する。
【0125】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、６０ｍＭ～１１５ｍＭの範囲のイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、６０ｍＭ～１００ｍＭの範囲のイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、６５ｍＭ～９５ｍＭの範囲のイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、７０ｍＭ～９０ｍＭの範囲のイオン強度を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、７５ｍＭ～８５ｍＭの範囲のイオン強度を有する。
【0126】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、３０ｍＭ～１００ｍＭのイオン強度範囲を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、３５ｍＭ～９５ｍＭのイオン強度範囲を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、４０ｍＭ～９０ｍＭのイオン強度範囲を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、４５ｍＭ～８５ｍＭのイオン強度範囲を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、５０ｍＭ～８０ｍＭのイオン強度範囲を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、５５ｍＭ～７５ｍＭのイオン強度範囲を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、６０ｍＭ～７０ｍＭのイオン強度範囲を有する。
【0127】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、０．２ｇ／Ｌの濃度で塩化カリウムを含む。
【0128】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、０．２ｇ／Ｌの濃度でリン酸カリウム一塩基性を含む。
【0129】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、５．８４ｇ／Ｌの濃度で塩化ナトリウムを含み、
【0130】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、１．１５ｇ／Ｌの濃度でリン酸ナトリウム二塩基性無水物を含む。
【0131】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、３％（重量／体積、３０ｇ／Ｌ）～１８％（重量／体積、１８０ｇ／Ｌ）の濃度のスクロースを含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、４％（重量／体積、４０ｇ／Ｌ）の濃度のスクロースを含む。
【0132】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。
【0133】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、０．０００５％（重量／体積、０．００５ｇ／Ｌ）～０．０５％（重量／体積、０．５ｇ／Ｌ）の濃度のポロキサマー１８８を含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。
【0134】
一部の実施形態では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、イオン性塩賦形剤または緩衝剤、スクロース、及び界面活性剤を含む薬学的組成物を提供する。一部の実施形態では、イオン性塩賦形剤または緩衝剤は、リン酸カリウム一塩基性、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム六水和物、リン酸ナトリウム一塩基性一水和物、トロメタミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、アミノ酸、ヒスチジン、塩酸ヒスチジン（ヒスチジン－ＨＣｌ）、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム６－水和物、硫酸カルシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウムからなる群からなる１つまたは複数の成分であり得る。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー１８８、ポリソルベート２０、及びポリソルベート８０からなる群からの１つまたは複数の成分であり得る。
【0135】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、０．０００５％（重量／体積、０．０５ｇ／Ｌ）～０．０５％（重量／体積、０．５ｇ／Ｌ）の濃度のポリソルベート２０を含む。
【0136】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、０．０００５％（重量／体積、０．０５ｇ／Ｌ）～０．０５％（重量／体積、０．５ｇ／Ｌ）の濃度のポリソルベート８０を含む。
【0137】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物のｐＨは、約７．４である。
【0138】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物のｐＨは、約６．０～９．０である。
【0139】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物のｐＨは、７．４である。
【0140】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物のｐＨは、６．０～９．０である。
【0141】
本明細書で使用する場合、及び別段の指定がない限り、「約」という用語は、所与の値または範囲のプラスまたはマイナス１０％以内を意味する。
【0142】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、疎水性コーティングされたガラスバイアルにある。
【0143】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）バイアルにある。
【0144】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、Ｄａｉｋｙｏ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ（登録商標）（ＣＺ）バイアルにある。
【0145】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、ＴｏｐＬｙｏでコーティングされたバイアルにある。
【0146】
ある特定の実施形態では、（ａ）組換えＡＡＶ、（ｂ）０．２ｇ／Ｌの濃度の塩化カリウム、（ｃ）０．２ｇ／Ｌの濃度のリン酸カリウム一塩基性、（ｄ）５．８４ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、（ｅ）１．１５ｇ／Ｌの濃度のリン酸ナトリウム二塩基性無水物、（ｆ）４重量／体積％（４０ｇ／Ｌ）の濃度のスクロース、（ｇ）０．００１重量／体積％（０．０１ｇ／Ｌ）の濃度のポロキサマー１８８、及び（ｈ）水からなる薬学的組成物を本明細書に開示し、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ９である。
【0147】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物のベクターゲノム濃度（ＶＧＣ）は、約３×１０９ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１０ＧＣ／ｍＬ、約１．２×１０１０ＧＣ／ｍＬ、約１．６×１０１０ＧＣ／ｍＬ、約４×１０１０ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１０ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約２×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約２．４×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約２．５×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約６．２×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約２×１０１３ＧＣ／ｍＬまたは約３×１０１３ＧＣ／ｍＬである。
【0148】
ある特定の実施形態では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、リン酸カリウム一塩基性、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、スクロース、及びポロキサマー１８８を含む薬学的組成物または製剤を提供する。一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ９由来の成分を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド、及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。
【0149】
好ましい実施形態では、導入遺伝子を送達するために使用されるＡＡＶは、ヒト網膜細胞または光受容体細胞に対して向性を有するべきである。かかるＡＡＶは、非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含むことができ、特にＡＡＶ９キャプシドを有するものが好ましい。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトは、コンストラクトＩであり、コンストラクトＩは、以下の構成要素：ＡＡＶキャプシド、及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。
【0150】
一部の実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）目的の導入遺伝子をコードするＡＡＶキャプシドパッケージングベクター、（ｂ）０．２ｇ／Ｌの濃度の塩化カリウム、（ｃ）０．２ｇ／Ｌの濃度のリン酸カリウム一塩基性、（ｄ）５．８４ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、（ｅ）１．１５ｇ／Ｌの濃度のリン酸ナトリウム二塩基性無水物、（ｆ）４重量／体積％（４０ｇ／Ｌ）の濃度のスクロース、（ｇ）０．００１重量／体積％（０．０１ｇ／Ｌ）の濃度のポロキサマー１８８、及び（ｈ）水からなり、目的の導入遺伝子は、目的のＲＮＡまたは目的のタンパク質、例えば、ヒトＴＰＰ１をコードする。
【0151】
一部の実施形態では、薬学的組成物は、液体組成物である。一部の実施形態では、薬学的組成物は、凍結組成物である。一部の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示される液体組成物からの凍結乾燥組成物である。一部の実施形態では、薬学的組成物は、再構成された凍結乾燥製剤である。
【0152】
一部の実施形態では、薬学的組成物は、約１％～約７％の残留水分含有量を含む凍結乾燥組成物である。一部の実施形態では、薬学的組成物は、約２％～約６％の残留水分含有量を含む凍結乾燥組成物である。一部の実施形態では、薬学的組成物は、約３％～約４％の残留水分含有量を含む凍結乾燥組成物である。一部の実施形態では、薬学的組成物は、約５％の残留水分含有量を含む凍結乾燥組成物である。
【0153】
ある特定の態様では、対象における疾患を処置または予防する方法であって、対象に薬学的組成物を投与することを含む方法を本明細書に開示する。一部の実施形態では、本明細書に提供する薬学的組成物は、１つ、２つまたはそれ以上の投与経路による投与に好適である（例えば、脈絡膜上及び網膜下投与に好適である）。
【0154】
提供される方法は、導入遺伝子をコードする組換えＡＡＶを含む薬学的組成物の産生において使用するのに好適である。一部の実施形態では、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするｒＡＡＶウイルスベクターを本明細書に提供する。一部の実施形態では、ＴＰＰ１をコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターを本明細書に提供する。一部の実施形態では、ＣＬＮ２をコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターを本明細書に提供する。
【0155】
ある特定の態様では、対象における疾患を処置または予防する方法であって、対象に、薬学的組成物を静脈内投与、皮下投与、筋肉注射、脈絡膜上注射（例えば、マイクロニードルを有するマイクロインジェクターなどの脈絡膜上薬物送達デバイスを介した）、経硝子体アプローチ（外科的手順）を介した網膜下注射、脈絡膜上腔を介した網膜下投与（例えば、脈絡膜上腔に挿入し、後極に向かって通すことができるカテーテルを含む網膜下薬物送達デバイスを介した外科的手順であって、小さな針が網膜下腔に注射する）、及び／または後強膜近傍デポー手順（例えば、チップを挿入し、強膜表面に対して直接並置で維持することができるカニューレを備える強膜近傍薬物送達デバイスを介した）によって投与することを含む方法を本明細書に開示する。
【0156】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する薬学的組成物は、静脈内投与、皮下投与、筋肉注射、脈絡膜上注射（例えば、マイクロニードルを有するマイクロインジェクターなどの脈絡膜上薬物送達デバイスを介した）、経硝子体アプローチ（外科的手順）を介した網膜下注射、脈絡膜上腔を介した網膜下投与（例えば、脈絡膜上腔に挿入し、後極に向かって通すことができるカテーテルを含む網膜下薬物送達デバイスを介した外科的手順であって、小さな針が網膜下腔に注射する）、及び／または後強膜近傍デポー手順（例えば、チップを挿入し、強膜表面に対して直接並置で維持することができるカニューレを備える強膜近傍薬物送達デバイスを介した）に好適である。
【0157】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、静脈内投与、皮下投与、筋肉注射、脈絡膜上注射（例えば、マイクロニードルを有するマイクロインジェクターなどの脈絡膜上薬物送達デバイスを介した）、経硝子体アプローチ（外科的手順）を介した網膜下注射、脈絡膜上腔を介した網膜下投与（例えば、脈絡膜上腔に挿入し、後極に向かって通すことができるカテーテルを含む網膜下薬物送達デバイスを介した外科的手順であって、小さな針が網膜下腔に注射する）、及び／または後強膜近傍デポー手順（例えば、チップを挿入し、強膜表面に対して直接並置で維持することができるカニューレを備える強膜近傍薬物送達デバイスを介した）に好適な所望の粘度を有する。
【0158】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、静脈内投与、皮下投与、筋肉注射、脈絡膜上注射（例えば、マイクロニードルを有するマイクロインジェクターなどの脈絡膜上薬物送達デバイスを介した）、経硝子体アプローチ（外科的手順）を介した網膜下注射、脈絡膜上腔を介した網膜下投与（例えば、脈絡膜上腔に挿入し、後極に向かって通すことができるカテーテルを含む網膜下薬物送達デバイスを介した外科的手順であって、小さな針が網膜下腔に注射する）、及び／または後強膜近傍デポー手順（例えば、チップを挿入し、強膜表面に対して直接並置で維持することができるカニューレを備える強膜近傍薬物送達デバイスを介した）に好適な所望の密度を有する。
【0159】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、静脈内投与、皮下投与、筋肉注射、脈絡膜上注射（例えば、マイクロニードルを有するマイクロインジェクターなどの脈絡膜上薬物送達デバイスを介した）、経硝子体アプローチ（外科的手順）を介した網膜下注射、脈絡膜上腔を介した網膜下投与（例えば、脈絡膜上腔に挿入し、後極に向かって通すことができるカテーテルを含む網膜下薬物送達デバイスを介した外科的手順であって、小さな針が網膜下腔に注射する）、及び／または後強膜近傍デポー手順（例えば、チップを挿入し、強膜表面に対して直接並置で維持することができるカニューレを備える強膜近傍薬物送達デバイスを介した）に好適な所望の浸透圧を有する。特定の実施形態では、網膜下投与のための所望の浸透圧は、１６０ ４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。他の特定の実施形態では、脈絡膜上投与の所望の浸透圧は、６００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ未満である。
【0160】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約１００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約１３０～４７０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約１６０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約２００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約２４０～３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約２８０～３００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約２９５～３９５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、６００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ未満の浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／Ｌ～６６０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧範囲を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約２００ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約２５０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約３００ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約３５０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約４００ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約４５０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約５００ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約５５０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約６００ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約６５０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、約６６０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。
【0161】
導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、ヒト網膜細胞または光受容体細胞に対して向性を有するべきである。かかるベクターは、非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶ」）を含むことができるが、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または「ネイキッドＤＮＡ」コンストラクトと称される非ウイルス発現ベクターを含むがこれらに限定されない他のウイルスベクターを使用してもよい。
【0162】
ある特定の実施形態では、遺伝子療法コンストラクトは、製剤緩衝液中のＡＡＶベクター活性成分の凍結滅菌単回使用溶液として供給される。特定の実施形態では、網膜下投与に好適な薬学的組成物には、生理学的に適合性の水性緩衝液、界面活性剤及び任意選択の賦形剤を含む、製剤緩衝液中の組換えベクターの懸濁液が含まれる。特定の実施形態では、コンストラクトは、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水及び０．００１％ポロキサマー１８８（ｐＨ＝７．４）中で製剤化される。
【0163】
４．３ 遺伝子療法
一態様では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防する方法であって、それを必要とする対象の眼に、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む方法を本明細書に提供し、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、網膜下に投与する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、脈絡膜上に投与する。
一態様では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防する方法であって、それを必要とする対象の眼に、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む方法を本明細書に提供し、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、網膜下に投与する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、脈絡膜上に投与する。
【0164】
一態様では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を網膜下投与することを含む方法を本明細書に提供し、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含み、この方法は、当該ヒト患者の眼に硝子体切除を行うことを含まない。ある特定の実施形態では、投与工程は、当該ヒト対象の眼の網膜下腔に、当該ヒト対象の眼の脈絡膜上腔を介して組換えウイルスベクター治療用産物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、投与工程は、脈絡膜上腔に挿入でき、脈絡膜上腔を後極に向かって通すことができ、後極で細針を網膜下腔に注射するカテーテルを含む、網膜下薬物送達デバイスの使用によるものである。ある特定の実施形態では、投与工程は、網膜下薬物送達デバイスのカテーテルを脈絡膜上腔に挿入すること及び脈絡膜上腔を通すことを含む。
【0165】
別の態様では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を網膜下投与することを含む方法を本明細書に提供し、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含み、この方法は、当該ヒト患者の眼に硝子体切除を行うことを含む。ある特定の実施形態では、硝子体切除は、部分硝子体切除である。
【0166】
別の態様では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を脈絡膜上投与することを含む方法を本明細書に提供し、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、投与工程は、組換えウイルスベクターを、脈絡膜上腔に、脈絡膜上薬物送達デバイスを使用して注射することによるものである。ある特定の実施形態では、脈絡膜上薬物送達デバイスは、マイクロインジェクターである。
【0167】
別の態様では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防する方法であって、それを必要とする対象の強膜の外表面に、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む方法を本明細書に提供し、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、投与工程は、カニューレの先端を強膜表面に挿入し、強膜表面に直接並置させることができるカニューレを含む強膜近傍薬物送達デバイスの使用によるものである。ある特定の実施形態では、投与工程は、カニューレの先端を強膜表面に挿入すること及び強膜表面に直接並置させることを含む。
【0168】
別の態様では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を硝子体内投与することを含む方法を本明細書に提供し、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、投与工程は、組換えウイルスベクターを、硝子体腔に、硝子体内薬物送達デバイスを使用して、注射することによるものである。ある特定の実施形態では、硝子体内薬物送達デバイスは、マイクロインジェクターである。
【0169】
別の態様では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防する方法であって、それを必要とする対象の眼の硝子体腔に、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む方法を本明細書に提供し、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、投与工程は、組換えウイルスベクターを、硝子体腔に、硝子体内薬物送達デバイスを使用して、注射することによるものである。ある特定の実施形態では、硝子体内薬物送達デバイスは、マイクロインジェクターである。
【0170】
一態様では、ＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防するための硝子体切除を伴う網膜下投与の方法であって、処置を必要とするヒト対象の眼の網膜下腔に、ｒＡＡＶを投与することを含む方法を本明細書に提供し、この方法は、当該ヒト患者の眼に硝子体切除を行うことを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、硝子体切除は、部分硝子体切除である。
【0171】
一態様では、ＣＬＮ２バッテン病の眼症状を処置及び／または予防するための網膜下投与の方法であって、処置を必要とするヒト対象の後眼部に位置する視神経乳頭、中心窩及び黄斑の周囲の網膜下腔に、ｒＡＡＶを投与することを含む方法を本明細書に提供し、この方法は、当該ヒト患者の眼に硝子体切除を行うことを含まず、ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、注射工程は、経硝子体注射によるものである。ある特定の実施形態では、経硝子体投与の方法は、眼全体にわたって治療用産物の均一な発現をもたらす（例えば、注射部位での発現レベルの変動は、眼の他の領域での発現レベルと比較して５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満である）。ある特定の実施形態では、経硝子体注射は、上眼側または下眼側を介して強膜に鋭針を挿入し、鋭針を硝子体に完全に通過させて、組換えウイルスベクターを反対側の網膜下腔に注射することを含む。ある特定の実施形態では、針は、２時または１０時の位置にて挿入される。ある特定の実施形態では、経硝子体注射は、套管針を強膜に挿入し、カニューレを套管針に挿入して、硝子体を通して、組換えウイルスベクターを反対側の網膜下腔に注射することを含む。
【0172】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、投与工程は、治療有効量のｒＡＡＶを当該ヒト対象の網膜に送達する。
【0173】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶゲノムによってコードされたタンパク質（例えば、ＴＰＰ１）は、当該ヒト対象のヒト網膜細胞によって産生される。
【0174】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶゲノムによってコードされたタンパク質（例えば、ＴＰＰ１）は、当該ヒト対象の外境界膜におけるヒト光受容体細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、及び／または網膜色素上皮細胞によって産生される。
【0175】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、ヒト光受容体細胞は、錐体細胞及び／または桿体細胞である。
【0176】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、網膜神経節細胞は、ミゼット細胞、パラソル細胞、二層化細胞、巨大網膜神経節細胞、感光性神経節細胞、及び／またはミュラーグリアである。
【0177】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、組換えウイルスベクターは、ｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ９、またはｒＡＡＶ５ベクター）である。
【0178】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、組換えウイルスベクターは、ｒＡＡＶ９ベクターである。
【0179】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、眼への送達は、眼の網膜、脈絡膜、及び／または硝子体液への送達を含む。
治療有効量の組換えベクター（すなわち、組換えウイルスベクターまたはＤＮＡ発現コンストラクト）を、眼の病態を有するヒト対象に投与するための方法を記載する。一部の実施形態では、組換えベクターは、コンストラクトＩであり、コンストラクトＩは、以下の構成要素：ＡＡＶキャプシド、及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、５’及び／または３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータアクチンプロモーターである。一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、限定されないが、視力喪失、網膜萎縮、及び網膜変性を含む、バッテン病の眼症状の処置のためのものである。
治療有効量の組換えベクター（すなわち、組換えウイルスベクターまたはＤＮＡ発現コンストラクト）を、眼の病態を有するヒト対象に投与するための方法を記載する。一部の実施形態では、組換えベクターは、コンストラクトＩであり、コンストラクトＩは、以下の構成要素：ＡＡＶキャプシド、及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、５’及び／または３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータアクチンプロモーターである。一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、限定されないが、視力喪失、網膜萎縮、及び網膜変性を含む、バッテン病の眼症状の処置のためのものである。
【0180】
特に、治療有効量の組換えベクター（すなわち、組換えウイルスベクターまたはＤＮＡ発現コンストラクト）を、ヒト対象に、以下のアプローチのうちの１つを介して投与するための方法を記載する：（１）硝子体切除を伴わない網膜下投与（例えば、脈絡膜上腔を介したまたは周囲注射を介した網膜下腔への投与）、（２）脈絡膜上投与、（３）強膜の外側の腔への投与（すなわち、強膜近傍投与）、（４）硝子体切除を伴う網膜下投与、（５）硝子体内投与、及び（６）結膜下投与。
【0181】
ある特定の実施形態では、網膜下または脈絡膜上腔への送達は、国際公開第２０１６／０４２１６２号、同第２０１７／０４６３５８号、同第２０１７／１５８３６５号、及び同第２０１７／１５８３６６号（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載及び開示されている方法及び／またはデバイスを使用して行うことができる。
【0182】
４．３．１ 標的患者集団
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、本明細書に提供する方法は、バッテン病に関連する眼症状を有する患者への投与のためのものである。バッテン病に関連する眼症状には、進行性視力喪失、網膜萎縮及び／または網膜変性が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、本明細書に提供する方法は、バッテン病に関連する眼症状を有する患者への投与のためのものである。バッテン病に関連する眼症状には、進行性視力喪失、網膜萎縮及び／または網膜変性が含まれるが、これらに限定されない。
【0183】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、ヒト対象は、≦２０／２０及び≧２０／４００であるＢＣＶＡを有する。別の特定の実施形態では、ヒト対象は、≦２０／６３及び≧２０／４００であるＢＣＶＡを有する。
【0184】
一部の実施形態では、ヒト対象は、二対立遺伝子ＣＬＮ２変異を有する。
【0185】
一部の実施形態では、ヒト対象は、低下した白血球ＴＰＰ１活性を有する。
【0186】
一部の実施形態では、ヒト対象は、ＣＬＮ２疾患と一致する臨床徴候もしくは症状（例えば、発達遅延、発達低下、発作、視力喪失、または他の徴候症状）を有し、及び／または対象は、確認されたＣＬＮ２診断を有する兄姉を有する。
【0187】
一部の実施形態では、ヒト対象は、脳室内Ｂｒｉｎｅｕｒａ酵素補充療法を受けたことがあるか、または受けている。
【0188】
一部の実施形態では、ヒト対象は、片眼または両眼において約２１０μｍまたは約２１０μｍ未満のＣＲＴを有する。一部の実施形態では、ヒト対象は、片眼または両眼において約１４０μｍまたは約１４０μｍを超えるＣＲＴを有する。
【0189】
一部の実施形態では、ヒト対象は、ＣＬＮ２疾患が兄弟姉妹におけるＣＬＮ２疾患の家族歴に起因して無症候性患者で診断された場合、罹患した兄弟姉妹における視力喪失の発症は、８４か月齢前またはその付近で生じる。
【0190】
一部の実施形態では、ヒト対象は、片眼または両眼において約１４０μｍまたは約１４０μｍ未満のＣＲＴ、及び５を超えるワイル・コーネル眼科重症度スコアを有する。
【0191】
一部の実施形態では、ヒト対象は、顕著なレンズまたは角膜混濁、緑内障、弱視、及び／または肉眼的網膜解剖学的異常を有しない。
【0192】
一部の実施形態では、ヒト対象は、右眼と左眼との間のＣＲＴ測定のスクリーニングにおいて１０μｍを超える差異を有しない。
【0193】
一部の実施形態では、ヒト対象は、以前のグレード３または４の過敏症反応、例えば、気管支けいれん及び静脈内処置を必要とする低血圧、心機能障害、脳室内Ｂｒｉｎｅｕｒａ注入に対するアナフィラキシーを有しない。
【0194】
一部の実施形態では、ヒト対象は、以下の範囲の屈折異常（近視≧－２．００、遠視≧＋４．００、乱視≧＋１．５０）または顕著な不同視を有しない。
【0195】
一部の実施形態では、ヒト対象は、任意の種類の事前の眼内注射、例えば、適応外使用の硝子体内Ｂｒｉｎｅｕｒａを受けていない。
【0196】
一部の実施形態では、ヒト対象は、例えば、コンストラクトＩ処置を開始する前の６か月以内に眼科手術を受けていない。
【0197】
一部の実施形態では、ヒト対象は、以前に骨髄移植を受けたことがない。
【0198】
一部の実施形態では、ヒト対象は、コンストラクトＩ処置を開始する前の３０日以内に、以下の薬剤を使用していない：ゲムフィブロジル、ミコフェノール酸塩、プレドニゾン、またはＮＣＬ（喘息の適応症を含まない）を処置するという意図された目的のための他のステロイド、フルピルチン。
【0199】
一部の実施形態では、ヒト対象は、全身性免疫抑制に対する禁忌を有しない。
【0200】
一部の実施形態では、ヒト対象は、別のＣＬＮ遺伝子に変異を有しない。
【0201】
一部の実施形態では、ヒト対象は、眼内手術に対する禁忌（例えば、重度の凝血障害）を有しない。
【0202】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、女性である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、男性である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、小児である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、１か月齢、２か月齢、３か月齢、４か月齢、５か月齢、６か月齢、７か月齢、８か月齢、９か月齢、１０か月齢、１１か月齢、１歳齢、１．５歳齢、２歳齢、２．５歳齢、３歳齢、３．５歳齢、４歳齢、４．５歳齢、または５歳齢である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、１．５か月齢、２か月齢、３か月齢、４か月齢、５か月齢、６か月齢、７か月齢、８か月齢、９か月齢、１０か月齢、１１か月齢、１歳齢、１．５歳齢、２歳齢、２．５歳齢、３歳齢、３．５歳齢、４歳齢、４．５歳齢未満、または５歳齢未満である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、１～２か月齢、２～３か月齢、３～４か月齢、４～５か月齢、５～６か月齢、６～７か月齢、７～８か月齢、８～９か月齢、９～１０か月齢、１０～１１か月齢、１１か月齢～１歳齢、１～１．５歳齢、１．５～２歳齢、２～２．５歳齢、２．５～３歳齢、３～３．５歳齢、３．５～４歳齢、４～４．５歳齢未満、または４．５～５歳齢である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、６か月齢～５歳齢である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、１８歳齢以上のヒト成人である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、１８歳未満のヒト小児である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置される対象は、８４か月未満のヒト小児である。
【0203】
４．３．２ 投与量及び投与様式
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、治療有効用量の組換えベクターは、（１）硝子体切除を伴わずに網膜下腔に（例えば、脈絡膜上腔を介してまたは周囲注射を介して）投与される、（２）脈絡膜上腔に投与される（３）強膜の外側の腔に投与される（すなわち、強膜近傍投与）、（４）硝子体切除を介して網膜下腔へ投与される、または（５）硝子体腔へ投与され、容量は、投与方法に応じて、５０～１００μｌまたは１００～５００μｌ、好ましくは１００～３００μｌの範囲、最も好ましくは、２５０μｌである。ある特定の実施形態では、治療有効用量の組換えベクターは、１００μｌ以下の容量で、例えば、５０～１００μｌの容量で脈絡膜上投与される。ある特定の実施形態では、治療有効用量の組換えベクターは、強膜の外側表面に、（例えば、後強膜近傍デポー手順によって）５００μｌ以下の容量で、例えば、１０～２０μｌ、２０～５０μｌ、５０～１００μｌ、１００～２００μｌ、２００～３００μｌ、３００～４００μｌ、または４００～５００μｌの容量で投与される。ある特定の実施形態では、治療有効用量の組換えベクターは、周囲注射を介して網膜下腔に、５０～１００μｌまたは１００～５００μｌ、好ましくは１００～３００μｌ、及び最も好ましくは、２００μｌの容量で投与される。
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、治療有効用量の組換えベクターは、（１）硝子体切除を伴わずに網膜下腔に（例えば、脈絡膜上腔を介してまたは周囲注射を介して）投与される、（２）脈絡膜上腔に投与される（３）強膜の外側の腔に投与される（すなわち、強膜近傍投与）、（４）硝子体切除を介して網膜下腔へ投与される、または（５）硝子体腔へ投与され、容量は、投与方法に応じて、５０～１００μｌまたは１００～５００μｌ、好ましくは１００～３００μｌの範囲、最も好ましくは、２５０μｌである。ある特定の実施形態では、治療有効用量の組換えベクターは、１００μｌ以下の容量で、例えば、５０～１００μｌの容量で脈絡膜上投与される。ある特定の実施形態では、治療有効用量の組換えベクターは、強膜の外側表面に、（例えば、後強膜近傍デポー手順によって）５００μｌ以下の容量で、例えば、１０～２０μｌ、２０～５０μｌ、５０～１００μｌ、１００～２００μｌ、２００～３００μｌ、３００～４００μｌ、または４００～５００μｌの容量で投与される。ある特定の実施形態では、治療有効用量の組換えベクターは、周囲注射を介して網膜下腔に、５０～１００μｌまたは１００～５００μｌ、好ましくは１００～３００μｌ、及び最も好ましくは、２００μｌの容量で投与される。
【0204】
特定の実施形態では、治療有効用量の組換えベクターは、２００μＬの容量で網膜下に投与される。
【0205】
ある特定の実施形態では、眼投与に関する本明細書に記載の任意の投与経路に使用できる、Ａｌｔａｖｉｚによって製造された、微小容量インジェクター送達システム（例えば、国際特許出願公開第２０１３／１７７２１５号、米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号、及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号を参照されたい）を本明細書に記載する。微小容量インジェクター送達システムは、高力送達及び改善された精度を提供するガス駆動モジュールを含み得、これは米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号に記載されるとおりである。加えて、微小容量インジェクター送達システムは、一定の用量率を提供するための油圧ドライブ、及びガス駆動モジュール、ひいては流体送達を制御するための低力作動レバーを含み得る。
【0206】
ある特定の実施形態では、微小容量インジェクターに使用できる微小容量インジェクター送達システムは、用量ガイダンスを備えた微小容量インジェクターであり、例えば、脈絡膜上針（例えば、Ｃｌｅａｒｓｉｄｅ（登録商標）針）、網膜下針、硝子体内針、強膜近傍針、結膜下針、及び／または網膜内針とともに使用することができる。微小容量インジェクターを使用する利点は、以下を含む：（ａ）より制御された送達（例えば、正確な注射流量制御及び用量ガイダンスを有するため）、（ｂ）外科医１人、片手、指１本の操作；（ｃ）１０μＬの増分投与量の空圧駆動；（ｄ）硝子体切除機からの離別；（ｅ）４００μＬシリンジ用量；（ｆ）デジタル的にガイドされた送達；（ｇ）デジタル的に記録された送達；及び（ｈ）制限の少ない先端（例えば、ＭｅｄＯｎｅ ３８ｇ針及びＤｏｒｃ ４１ｇ針を網膜下送達に使用できる一方で、Ｃｌｅａｒｓｉｄｅ（登録商標）針及びＶｉｓｉｏｎｉｓｔｉ ＯＹアダプターを網膜下送達に使用することができる）。
【0207】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、組換えベクターは、脈絡膜上に（例えば、脈絡膜上注射によって）投与される。特定の実施形態では、脈絡膜上投与（例えば、脈絡膜上腔への注射）は、脈絡膜上薬物送達デバイスを使用して行われる。脈絡膜上薬物送達デバイスは、眼の脈絡膜上腔への薬物の投与を伴う、脈絡膜上投与手順においてしばしば使用される（例えば、Ｈａｒｉｐｒａｓａｄ，２０１６，Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ １３：２０－２３、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，２０１４，Ｒｅｔｉｎａ Ｔｏｄａｙ ９（５）：８２－８７、Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。本明細書に記載の本発明に従う脈絡膜上腔に組換えベクターを堆積させるために使用することができる脈絡膜上薬物送達デバイスは、Ｃｌｅａｒｓｉｄｅ（登録商標）Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．により製造された脈絡膜上薬物送達デバイス（例えば、Ｈａｒｉｐｒａｓａｄ，２０１６，Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ １３：２０～２３を参照されたい）及びＭｅｄＯｎｅ脈絡膜上カテーテルを含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って使用することができる脈絡膜上薬物送達デバイスは、眼投与に関する本明細書に記載の任意の投与経路に使用できる、Ａｌｔａｖｉｚによって製造された、微小容量インジェクター送達システムを含む（例えば、国際特許出願公開第２０１３／１７７２１５号、米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号、及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号を参照されたい）。微小容量インジェクター送達システムは、高力送達及び改善された精度を提供するガス駆動モジュールを含み得、これは米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号に記載されるとおりである。加えて、微小容量インジェクター送達システムは、一定の用量率を提供するための油圧ドライブ、及びガス駆動モジュール、ひいては流体送達を制御するための低力作動レバーを含み得る。現在利用可能な脈絡膜上腔（ＳＣＳ）送達のための技術が存在する。前臨床的には、ＳＣ注射は、強膜フラップ技術、カテーテル、及び標準的な皮下注射針、ならびにマイクロニードルで達成されている。中空穴７５０ｕｍ長のマイクロニードル（Ｃｌｅａｒｓｉｄｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を部分に挿入することができ、臨床治験において有望性を示している。力計測技術を用いて設計されたマイクロニードルを、Ｃｈｉｔｎｉｓらによって記載されるように、ＳＣ注射に利用することができる（Ｃｈｉｔｎｉｓ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｓｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｔｉｓｓｕｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ３，６２１－６３１（２０１９）。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１９－０３５０－２）。Ｏｘｕｌａｒ Ｌｉｍｉｔｅｄは、脈絡膜上腔に照明されたカニューレを前進させる送達システム（Ｏｘｕｌｕｍｉｓ）を開発している。Ｏｒｂｉｔデバイス（ジャイロスコープ）は、柔軟なカニューレによる脈絡膜上腔のカニューレ挿入を可能にする特別に設計されたシステムである。カニューレ内のマイクロニードルを網膜下腔に前進させて、標的用量送達を可能にする。ＳＣＳへの眼内アクセスは、最小侵襲性緑内障手術（ＭＩＧＳ）デバイスとして機能する、マイクロステントを使用して達成することもできる。例としては、ＣｙＰａｓｓ（登録商標）マイクロステント（Ａｌｃｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳ）及びｉＳｔｅｎｔ（登録商標）（Ｇｌａｕｋｏｓ）が挙げられ、これらは、前房からＳＣＳに導管を提供して、フィルタリングブレブを形成することなく房水を排出するために外科的に植え込まれる。脈絡膜上送達のために企図される他のデバイスとしては、英国特許公開第ＧＢ２５３１９１０Ａ号及び米国特許第１０，９１２，８８３Ｂ２号に記載されるものが挙げられる。
【0208】
微小容量インジェクターは、用量ガイダンスを備えた微小容量インジェクターであり、例えば、脈絡膜上針（例えば、Ｃｌｅａｒｓｉｄｅ（登録商標）針）または網膜下針とともに使用することができる。微小容量インジェクターを使用する利点は、以下を含む：（ａ）より制御された送達（例えば、正確な注射流量制御及び用量ガイダンスを有するため）、（ｂ）外科医１人、片手、指１本の操作；（ｃ）１０μＬの増分投与量の空圧駆動；（ｄ）硝子体切除機からの離別；（ｅ）４００μＬシリンジ用量；（ｆ）デジタル的にガイドされた送達；（ｇ）デジタル的に記録された送達；及び（ｈ）制限の少ない先端（例えば、ＭｅｄＯｎｅ ３８ｇ針及びＤｏｒｃ ４１ｇ針は網膜下送達に使用できる一方で、Ｃｌｅａｒｓｉｄｅ（登録商標）針及びＶｉｓｉｏｎｉｓｔｉ ＯＹアダプターを、脈絡膜上送達に使用することができる）。別の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って使用することができる脈絡膜上薬物送達デバイスは、Ｖｉｓｉｏｎｉｓｔｉ ＯＹによって製造されたアダプター（好ましくは、更に針ガイド）を備えた通常の長さの皮下注射針を含むツールであり、このアダプターは、通常の長さの皮下注射針を、アダプターから露出している針先端の長さを制御することにより、脈絡膜上針へと変える（例えば、米国意匠特許第Ｄ８７８，５７５号；及び国際特許出願公開第２０１６／０８３６６９号を参照されたい）。特定の実施形態では、脈絡膜上薬物送達デバイスは、１ミリメートルの３０ゲージ針を備えたシリンジである。このデバイスを使用する注射中に、針が強膜の基部を貫通し、薬物を含有する液体が脈絡膜上腔に入り、脈絡膜上腔の拡張につながる。その結果、注射中に触覚的及び視覚的なフィードバックが得られる。注射後、液体は後方に流れ、脈絡膜及び網膜で主に吸収される。これにより、全網膜細胞層及び脈絡膜細胞から治療用産物が産生される。このタイプのデバイス及び手順を使用すると、合併症のリスクが低く、迅速で診療室内で簡単に処置することが可能になる。１００μｌの最大容量を、脈絡膜上腔に注射することができる。
【0209】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、組換えベクターは、硝子体切除を介して網膜下に投与される。硝子体切除を介した網膜下投与は、訓練を受けた網膜外科医によって行われる外科的手順であり、局所麻酔下の対象での硝子体切除、及び網膜への遺伝子療法の網膜下注射を伴う（例えば、Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｈｕｍ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ ２８（１）：９９－１１１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【0210】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、組換えベクターは、硝子体切除を伴わずに網膜下に投与される。
【0211】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、硝子体切除を伴わない網膜下投与は、網膜下薬物送達デバイスの使用により脈絡膜上腔を介して行われる。ある特定の実施形態では、網膜下薬物送達デバイスは、網膜下腔に薬物を送達するための外科的手順中に、後眼部周辺の脈絡膜上腔に挿入される及び脈絡膜上腔を通すカテーテルである。この手順は、硝子体を無傷のままにすることができるため、合併症のリスクが少なくなり（遺伝子療法撤退、ならびに網膜剥離及び黄斑円孔などの合併症のリスクが少なくなり）、硝子体切除を伴わないと、結果として生じるブレブがより拡散的に広がって、網膜のより多くの表面領域がより少ない容量で形質導入されることを可能にし得る。この手順の後に白内障が誘発されるリスクは最小限に抑えられ、これは若年患者にとって望ましい。更に、この手順は、標準的な経硝子体アプローチよりも安全に中心窩の下にブレブを送達することができ、これは、形質導入の標的細胞が黄斑にある中心視に影響する遺伝性網膜疾患の患者にとって望ましい。この手順は、他の送達経路（例えば脈絡膜上及び硝子体内）に影響を与え得る、全身循環中に存在するＡＡＶに対する中和抗体（Ｎａｂ）を有する患者にとっても好ましい。加えて、この方法は、標準的な経硝子体アプローチよりも網膜切開部位からの放出が少ないブレブを作製することが示されている。元々Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって、今はＯｒｂｉｔ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．によって製造されている網膜下薬物送達デバイス（例えば、Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｔｈｅ Ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｓｐａｃｅ：Ｊａｎｓｓｅｎ Ｔｒｉａｌ．Ｉｎ：Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｈａｍ、国際特許出願公開第２０１６／０４０６３５Ａ１号を参照されたい）を、かかる目的のために使用することができる。
【0212】
別の特定の実施形態では、硝子体切除を伴わない網膜下投与は、網膜への周囲注射（すなわち、後眼部に位置する視神経乳頭、中心窩及び黄斑の周囲）を介して行われる。これは、経硝子体注射によって達成することができる。
【0213】
一実施形態では、鋭針を、上眼側または下眼側（例えば、２時または１０時の位置）を介して強膜に挿入し、硝子体に完全に通過させて、反対側の網膜に注射する。別の実施形態では、套管針を強膜に挿入して、網膜下カニューレを眼に挿入することを可能にする。カニューレを套管針に挿入し、所望の注射領域まで硝子体を通す。いずれの実施形態でも、組換えベクターを、網膜下腔に注射し、眼の反対側の内面上に組換えベクターを含有するブレブを形成する。注射の成功は、ドーム形状の網膜剥離／網膜ブレブの出現によって確認される。
【0214】
自己照明レンズを、経硝子体投与の光源として使用し得る（例えば、Ｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ｌａｓｅｒｓ ３５：７６－７７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。あるいは、必要に応じて、１つまたは複数の套管針を光（または注入）用に配置することもできる。更に別の実施形態では、網膜下注射を視覚化するために、套管針を介して光ファイバーシャンデリアを利用することができる。
【0215】
ある特定の実施形態では、網膜下または脈絡膜上腔への送達は、国際公開第ＷＯ２０１６／０４２１６２号、同第ＷＯ２０１７／０４６３５８号、同第ＷＯ２０１７／１５８３６５号、及び同第ＷＯ２０１７／１５８３６６号（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載及び開示されている方法及び／またはデバイスを使用して行うことができる。
【0216】
１回、２回、またはそれ以上の周囲注射を行って、組換えベクターを投与することができる。このようにして、組換えベクターを含有する１つ、２つ、またはそれ以上のブレブを、視神経乳頭、中心窩及び黄斑の周囲の網膜下腔に作成することができる。驚くべきことに、組換えベクターの投与は、周囲注射ブレブに限定されているが、このアプローチを使用すると、網膜全体での治療用産物の発現を検出することができる。
【0217】
特定の実施形態では、硝子体内投与は、眼投与に関する本明細書に記載の任意の投与経路に使用できる、Ａｌｔａｖｉｚによって製造された、微小容量インジェクター送達システムを含む硝子体内薬物送達デバイス（例えば、国際特許出願公開第２０１３／１７７２１５号）、米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号、及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号を参照されたい）を用いて行われる。微小容量インジェクター送達システムは、高力送達及び改善された精度を提供するガス駆動モジュールを含み得、これは米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号に記載されるとおりである。加えて、微小容量インジェクター送達システムは、一定の用量率を提供するための油圧ドライブ、及びガス駆動モジュール、ひいては流体送達を制御するための低力作動レバーを含み得る。微小容量インジェクターは、用量ガイダンスを備えた微小容量インジェクターであり、例えば、硝子体内針とともに使用することができる。微小容量インジェクターを使用する利点は、以下を含む：（ａ）より制御された送達（例えば、正確な注射流量制御及び用量ガイダンスを有するため）、（ｂ）外科医１人、片手、指１本の操作；（ｃ）１０μＬの増分投与量の空圧駆動；（ｄ）硝子体切除機からの離別；（ｅ）４００μＬシリンジ用量；（ｆ）デジタル的にガイドされた送達；（ｇ）デジタル的に記録された送達；及び（ｈ）制限の少ない先端（例えば、ＭｅｄＯｎｅ ３８ｇ針及びＤｏｒｃ ４１ｇ針は網膜下送達に使用できる一方で、Ｃｌｅａｒｓｉｄｅ（登録商標）針及びＶｉｓｉｏｎｉｓｔｉ ＯＹアダプターを、網膜下送達に使用できる）。
【0218】
ある特定の実施形態では、周囲注射は、眼全体にわたる治療用産物の均一な発現をもたらす（例えば、注射部位での発現レベルの変動は、眼の他の領域での発現レベルと比較して５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満である）。眼全体にわたる治療用産物の発現は、そのような目的のために当該技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、眼もしくは網膜のホールマウント免疫蛍光染色によって、または凍結眼切片上の免疫蛍光染色によって測定することができる。
【0219】
経硝子体注射により網膜下腔ではなく硝子体の組換えベクターが失われる事象では、任意選択の硝子体切除を行って、硝子体に注射された組換えベクターを除去することができる。次に、硝子体切除を伴う網膜下注射を行って、２５０μｌの組換えベクターを網膜下腔に送達することができる。あるいは、いくらかの注射された組換えベクターが硝子体へと堆積し、硝子体から組換えベクターを除去するための硝子体切除が行われない場合、固定化された（例えば、共有結合した）抗ＡＡＶ抗体（例えば、抗ＡＡＶ９抗体）を伴うカテーテルを、硝子体へと挿入して、硝子体から過剰な組換えベクターを捕捉及び除去することができる。
【0220】
特定の実施形態では、網膜下投与は、眼投与に関する本明細書に記載の任意の投与経路に使用できる、Ａｌｔａｖｉｚによって製造された、微小容量インジェクター送達システムを含む網膜下薬物送達デバイス（例えば、国際特許出願公開第２０１３／１７７２１５号、米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号、及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号を参照されたい）を用いて行われる。微小容量インジェクター送達システムは、高力送達及び改善された精度を提供するガス駆動モジュールを含み得、これは米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号に記載されるとおりである。加えて、微小容量インジェクター送達システムは、一定の用量率を提供するための油圧ドライブ、及びガス駆動モジュール、ひいては流体送達を制御するための低力作動レバーを含み得る。微小容量インジェクターは、用量ガイダンスを備えた微小容量インジェクターであり、例えば、網膜下針とともに使用することができる。微小容量インジェクターを使用する利点は、以下を含む：（ａ）より制御された送達（例えば、正確な注射流量制御及び用量ガイダンスを有するため）、（ｂ）外科医１人、片手、指１本の操作；（ｃ）１０μＬの増分投与量の空圧駆動；（ｄ）硝子体切除機からの離別；（ｅ）４００μＬシリンジ用量；（ｆ）デジタル的にガイドされた送達；（ｇ）デジタル的に記録された送達；及び（ｈ）制限の少ない先端（例えば、ＭｅｄＯｎｅ ３８ｇ針及びＤｏｒｃ ４１ｇ針は網膜下送達に使用できる一方で、Ｃｌｅａｒｓｉｄｅ（登録商標）針及びＶｉｓｉｏｎｉｓｔｉ ＯＹアダプターを、脈絡膜上送達に使用することができる）。
【0221】
ある特定の実施形態では、組換えベクターは、強膜の外側表面に投与される（例えば、カニューレの先端を強膜表面に挿入し、強膜表面に直接並置させることができるカニューレを含む強膜近傍薬物送達デバイスの使用による）。特定の実施形態では、強膜の外側表面への投与は、薬物を鈍端湾曲カニューレに引き込み、次いで、眼球を穿刺することなく強膜の外側表面と直接接触するように送達する、後強膜近傍デポー手順を使用して行われる。特に、露出強膜に小さな切開を作製した後、カニューレの先端を挿入する。カニューレシャフトの湾曲部分を挿入し、カニューレの先端を強膜表面に直接並置した状態に保つ。カニューレを完全に挿入した後、滅菌綿棒でカニューレシャフトの上部及び側面に沿って軽い圧力を維持しながら、薬物をゆっくりと注射する。この送達方法は、眼内感染及び網膜剥離のリスク、治療剤を眼に直接注射することに関連することが多い副作用を回避する。
【0222】
特定の実施形態では、強膜近傍投与は、眼投与に関する本明細書に記載の任意の投与経路に使用できる、Ａｌｔａｖｉｚによって製造された、微小容量インジェクター送達システムを含む強膜近傍薬物送達デバイス（例えば、国際特許出願公開第２０１３／１７７２１５号、米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号、及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号を参照されたい）を用いて行われる。微小容量インジェクター送達システムは、高力送達及び改善された精度を提供するガス駆動モジュールを含み得、これは米国特許出願公開第２０１９／０１７５８２５号及び米国特許出願公開第２０１９／０１６７９０６号に記載されるとおりである。加えて、微小容量インジェクター送達システムは、一定の用量率を提供するための油圧ドライブ、及びガス駆動モジュール、ひいては流体送達を制御するための低力作動レバーを含み得る。微小容量インジェクターは、用量ガイダンスを備えた微小容量インジェクターであり、例えば、強膜近傍針とともに使用することができる。微小容量インジェクターを使用する利点は、以下を含む：（ａ）より制御された送達（例えば、正確な注射流量制御及び用量ガイダンスを有するため）、（ｂ）外科医１人、片手、指１本の操作；（ｃ）１０μＬの増分投与量の空圧駆動；（ｄ）硝子体切除機からの離別；（ｅ）４００μＬシリンジ用量；（ｆ）デジタル的にガイドされた送達；（ｇ）デジタル的に記録された送達；及び（ｈ）制限の少ない先端。
【0223】
ある特定の実施形態では、赤外線熱カメラを使用して、体温よりも低温である溶液の投与後の眼表面の熱プロファイルの変化を検出して、眼表面の熱プロファイルの変化を検出することができ、これにより例えば、ＳＣＳ内での溶液の広がりを視覚化することが可能になり、投与が成功裏に完了したか否かを潜在的に判断できる。これは、ある特定の実施形態では、投与される組換えベクターを含有する製剤が最初に凍結され、室温（６８～７２°Ｆ）にされ、短時間（例えば、少なくとも３０分）解凍されてから投与されるためであり、ゆえに、製剤は、注射の時点ではヒトの眼（約９２°Ｆ）よりも低温（場合によっては室温よりも低温）である。薬剤は、典型的には、解凍の４時間以内に使用し、最も温かくても溶液は室温であろう。好ましい実施形態では、手順は、赤外線ビデオでビデオ化される。
【0224】
赤外線熱カメラは、温度の小さな変化を検出できる。それらはレンズを通して赤外線エネルギーを捉え、そのエネルギーを電子信号に変換する。赤外光は、エネルギーを熱画像に変換する赤外線センサーアレイに焦点を合わせる。赤外線熱カメラは、本明細書に記載の任意の投与経路、例えば、脈絡膜上投与、網膜下投与、結膜下投与、硝子体内投与、または脈絡膜上腔への低速注入カテーテルを使用した投与を含む、眼への任意の投与方法に使用することができる。特定の実施形態では、赤外線熱カメラは、ＦＬＩＲ Ｔ５３０赤外線熱カメラである。ＦＬＩＲ Ｔ５３０赤外線熱カメラは、±３．６°Ｆの精度でわずかな温度差を捉えることができる。カメラは、７６，８００ピクセルの赤外線解像度を有する。カメラは更に、より小さな視野を捉える２４°レンズを利用する。高い赤外線解像度と組み合わせたより小さな視野は、操作者がイメージングしているもののより詳細な熱プロファイルに寄与する。ただし、わずかな温度変化を捉えるための異なる能力及び精度を有し、異なる赤外線解像度、及び／または異なる度のレンズを備えた他の赤外線カメラを使用することができる。
【0225】
特定の実施形態では、赤外線熱カメラは、ＦＬＩＲ Ｔ４２０赤外線熱カメラである。特定の実施形態では、赤外線熱カメラは、ＦＬＩＲ Ｔ４４０赤外線熱カメラである。特定の実施形態では、赤外線熱カメラは、Ｆｌｕｋｅ Ｔｉ４００赤外線熱カメラである。特定の実施形態では、赤外線熱カメラは、ＦＬＩＲＥ６０赤外線熱カメラである。特定の実施形態では、赤外線熱カメラの赤外線解像度は、７５，０００ピクセル以上である。特定の実施形態では、赤外線熱カメラの熱感度は、３０℃で０．０５℃以下である。特定の実施形態では、赤外線熱カメラの視野（ＦＯＶ）は、２５°×２５°以下である。
【0226】
ある特定の実施形態では、鉄フィルターを赤外線熱カメラとともに使用して、眼表面の熱プロファイルにおける変化を検出する。好ましい実施形態では、鉄フィルターの使用は、疑似カラー画像を生成することができ、最も暖かいまたは高温の部分は白く着色され、中間の温度は赤色及び黄色であり、最も冷たいまたは低温の部分は黒色である。ある特定の実施形態では、他のタイプのフィルターを使用して、熱プロファイルの疑似カラー画像を生成することもできる。
【0227】
各投与方法に関する熱プロファイルは、異なり得る。例えば、一実施形態では、脈絡膜上注射の成功は、（ａ）暗い色のゆっくりとした広い放射状の広がり、（ｂ）最初の非常に暗い色、及び（ｃ）注射物のより明るい色への緩やかな変化、すなわち、より明るい色によって示される温度勾配を特徴とすることができる。一実施形態では、脈絡膜上注射の失敗は、（ａ）暗い色の広がりがないこと、及び（ｂ）分布を伴わず注射部位に局在する色のわずかな変化を特徴とすることができる。ある特定の実施形態では、小さな局所的な温度低下は、カニューレ（低温）が眼組織（高温）に接触することに起因する。一実施形態では、硝子体内注射の成功は、（ａ）暗い色の広がりがないこと、（ｂ）注射部位に局在する非常に暗い色への最初の変化、及び（ｃ）より暗い色への眼全体の緩やか及び均一な変化を特徴とすることができる。一実施形態では、眼球外流出は、（ａ）眼の外面の外側での急速な流れ、（ｂ）最初の非常に暗い色、及び（ｃ）より明るい色への急速な変化を特徴とすることができる。
【0228】
治療用産物が継続的に生産されるため（構成的プロモーターの制御下で、または低酸素誘導性プロモーターを使用する場合は低酸素状態によって誘導される）、低濃度の維持が効果的であり得る。硝子体液濃度は、硝子体液または前房から収集した液体の患者試料において直接測定することができる、あるいは治療用産物の患者の血清濃度を測定することにより推定及び／またはモニターすることができる－治療用産物への全身曝露対硝子体曝露の比率は、約１：９０，０００である。（例えば、Ｘｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５４：１６２１頁の１６１６－１６２４及び１６２３頁の表５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において報告されたラニビズマブの房水及び血清濃度を参照されたい。
【0229】
ある特定の実施形態では、投与量は、患者の眼に投与される（例えば、脈絡膜上、網膜下、硝子体内、強膜近傍、結膜下、及び／または網膜内に投与される）ゲノムコピー／ｍｌまたはゲノムコピーの数によって測定される。ある特定の実施形態では、１×１０９ゲノムコピー／ｍｌ～１×１０１５ゲノムコピー／ｍｌを投与する。特定の実施形態では、１×１０９ゲノムコピー／ｍｌ～１×１０１０ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１０ゲノムコピー／ｍｌ～１×１０１１ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１０～５×１０１１ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１１ゲノムコピー／ｍｌ～１×１０１２ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１２ゲノムコピー／ｍｌ～１×１０１３ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１３ゲノムコピー／ｍｌ～１×１０１４ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１４ゲノムコピー／ｍｌ～１×１０１５ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０９ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１０ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１１ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１２ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１３ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１４ゲノムコピー／ｍｌを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１５ゲノムコピー／ｍｌを投与する。ある特定の実施形態では、１×１０９～１×１０１５ゲノムコピーを投与する。特定の実施形態では、１×１０９～１×１０１０ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１０～１×１０１１ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１０～５×１０１１ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１１～１×１０１２ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１２～１×１０１３ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１３～１×１０１４ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１３～１×１０１４ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０１４～１×１０１５ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０９ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１０ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１１ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１２ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１３ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１４ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、約１×１０１５ゲノムコピーを投与する。ある特定の実施形態では、約３．０×１０１３ゲノムコピー／眼を投与する。ある特定の実施形態では、最大約３．０×１０１３ゲノムコピー／眼を投与する。
【0230】
ある特定の実施形態では、約２．０×１０１０ゲノムコピー／眼を投与する。ある特定の実施形態では、約６．０×１０１０ゲノムコピー／眼を投与する。
【0231】
ある特定の実施形態では、約１．０×１０１０～２．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約２．０×１０１０～３．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約３．０×１０１０～４．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約４．０×１０１０～５．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約５．０×１０１０～６．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約６．０×１０１０～７．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約７．０×１０１０～８．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約８．０×１０１０～９．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約９．０×１０１０～１．０×１０１１ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約１．０×１０１１～２．０×１０１１ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。
【0232】
ある特定の特定の実施形態では、約２．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。ある特定の特定の実施形態では、約６．０×１０１０ゲノムコピー／眼を、網膜下注射によって投与する。一部の実施形態では、網膜下注射の注射量は、２００μＬである。
【0233】
ある特定の実施形態では、約２×１０１０～３×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約３×１０１０～４×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約４×１０１０～５×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約５×１０１０～６×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約６×１０１０～７×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約７×１０１０～８×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約８×１０１０～９×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約９×１０１０～１×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約１×１０１１～２×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約２×１０１１～３×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約３×１０１１～４×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約４×１０１１～５×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約５×１０１１～６×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約６×１０１１～７×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約７×１０１１～８×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約８×１０１１～９×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約９×１０１１～１×１０１２ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。
【0234】
ある特定の実施形態では、約２×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約３×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約４×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約５×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約６×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約７×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約８×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約９×１０１０ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約１×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約１．５×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約２×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約２．５×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。ある特定の実施形態では、約３×１０１１ゲノムコピー／眼を、脈絡膜上注射によって投与する。
【0235】
ある特定の実施形態では、単回脈絡膜上注射を投与する。ある特定の実施形態では、二回脈絡膜上注射を投与する。ある特定の実施形態では、脈絡膜上注射の注射量は、１００μｌである。
【0236】
本明細書で使用する場合、及び別段の指定がない限り、「約」という用語は、所与の値または範囲のプラスまたはマイナス１０％以内を意味する。ある特定の実施形態では、「約」という用語は、列挙された正確な数を包含する。
【0237】
４．３．３ 試料採取及び有効性のモニタリング
ある特定の実施形態では、ヒト対象がＣＮＳ及び眼の両方に疾患症状を有する場合（例えば、ヒト対象がバッテン病を有する場合）、本明細書に提供する方法は、本明細書に記載の組換えベクター（すなわち、組換えウイルスベクターまたはＤＮＡ発現コンストラクト）を、ヒト対象に、中枢神経系（ＣＮＳ）送達経路及び眼送達経路（例えば、本明細書に記載の眼送達経路）の両方を介して投与することを含む。ある特定の実施形態では、眼送達経路は、以下：（１）硝子体切除を伴わない網膜下投与（例えば、脈絡膜上腔を介したまたは周囲注射を介した網膜下腔への投与）、（２）脈絡膜上投与、（３）強膜の外側の腔への投与（すなわち、強膜近傍投与）、（４）硝子体切除を伴う網膜下投与、（５）硝子体内投与、及び（６）硝子体内投与のうちの１つから選択される。ある特定の実施形態では、ＣＮＳ送達経路は、以下：脳室内（ＩＣＶ）送達、大槽内（ＩＣ）送達、または腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）送達のうちの１つから選択される。
ある特定の実施形態では、ヒト対象がＣＮＳ及び眼の両方に疾患症状を有する場合（例えば、ヒト対象がバッテン病を有する場合）、本明細書に提供する方法は、本明細書に記載の組換えベクター（すなわち、組換えウイルスベクターまたはＤＮＡ発現コンストラクト）を、ヒト対象に、中枢神経系（ＣＮＳ）送達経路及び眼送達経路（例えば、本明細書に記載の眼送達経路）の両方を介して投与することを含む。ある特定の実施形態では、眼送達経路は、以下：（１）硝子体切除を伴わない網膜下投与（例えば、脈絡膜上腔を介したまたは周囲注射を介した網膜下腔への投与）、（２）脈絡膜上投与、（３）強膜の外側の腔への投与（すなわち、強膜近傍投与）、（４）硝子体切除を伴う網膜下投与、（５）硝子体内投与、及び（６）硝子体内投与のうちの１つから選択される。ある特定の実施形態では、ＣＮＳ送達経路は、以下：脳室内（ＩＣＶ）送達、大槽内（ＩＣ）送達、または腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）送達のうちの１つから選択される。
【0238】
視覚障害に対する本明細書に提供する方法の効果は、ＢＣＶＡ（最良矯正視力）、眼内圧、細隙灯生体顕微鏡検査、及び／または倒像眼底検査によって測定され得る。
【0239】
特定の実施形態では、視覚障害に対する本明細書に提供する方法の効果は、本明細書に記載の方法によって処置されるヒト患者の眼が、処置後（例えば、処置後４６～５０週または９８～１０２週）に、４３文字を超えるＢＣＶＡを達成するか否かによって測定され得る。４３文字のＢＣＶＡは、２０／１６０近似スネレン等価視力に相当する。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法によって処置されるヒト患者の眼は、処置後（例えば、処置後４６～５０週または９８～１０２週）に、４３文字を超えるＢＣＶＡを達成する。
【0240】
特定の実施形態では、視覚障害に対する本明細書に提供する方法の効果は、本明細書に記載の方法によって処置されるヒト患者の眼が、処置後（例えば、処置後４６～５０週または９８～１０２週）に、８４文字を超えるＢＣＶＡを達成するか否かによって測定され得る。８４文字のＢＣＶＡは、２０／２０近似スネレン等価視力に相当する。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法によって処置されるヒト患者の眼は、処置後（例えば、処置後４６～５０週または９８～１０２週）に、８４文字を超えるＢＣＶＡを達成する。
【0241】
眼／網膜への物理的変化に対する本明細書に提供する方法の効果は、ＳＤ－ＯＣＴ（ＳＤ－光コヒーレンストモグラフィー）によって測定され得る。
【0242】
有効性は、網膜電図検査（ＥＲＧ）によって測定して、モニターし得る。
【0243】
本明細書に提供する方法の効果は、視覚喪失、感染、炎症及び他の安全性事象、例えば網膜剥離の兆候を測定することによってモニターし得る。
【0244】
網膜厚をモニターして、本明細書に提供する方法の有効性を決定し得る。いずれの特定の理論にも拘束されないが、網膜の厚さを臨床的読み出しとして使用してよく、網膜厚における減少が大きい、または網膜の肥厚までの時間がより長いと、処置はより有効である。網膜機能は、例えば、ＥＲＧによって決定され得る。ＥＲＧは、ヒトでの使用がＦＤＡによって承認された網膜機能の非侵襲的電気生理的検査であり、これは、眼の光感受性細胞（桿体及び錐体）、及びにそれが接続している神経節細胞、特に、その閃光刺激への応答を検査する。網膜厚は、例えば、ＳＤ－ＯＣＴによって決定され得る。ＳＤ－ＯＣＴは、低コヒーレンス干渉法を使用して、目的の物体から反射される後方散乱光のエコー時間遅延及び振幅を決定する三次元画像化技術である。ＯＣＴを使用して、３から１５μｍの軸方向分解能で組織試料（例えば、網膜）の層をスキャンすることができ、ＳＤ－ＯＣＴは、その技術の以前の型よりも軸方向分解能及びスキャン速度を改善する（Ｓｃｈｕｍａｎ，２００８，Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｏｐｔｈａｍｏｌ．Ｓｏｃ．１０６：４２６－４５８）。
【0245】
本明細書に提供する方法の効果は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ視覚機能質問票、Ｒａｓｃｈスコア版（ＮＥＩ－ＶＦＱ－２８－Ｒ）（複合スコア、活動制限ドメインスコア、及び社会生活－精神的機能ドメインスコア）におけるベースラインからの変化によっても測定され得る。本明細書に提供する方法の効果は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ視覚機能質問票２５項目版（ＮＥＩ－ＶＦＱ－２５）（複合スコア及び心の健康サブスケールスコア）におけるベースラインからの変化によっても測定され得る。本明細書に提供する方法の効果は、黄斑疾患治療満足度質問票（ＭａｃＴＳＱ）（複合スコア；安全性、有効性、及び不快ドメインスコア；ならびに情報提供及び利便性ドメインスコア）におけるベースラインからの変化によっても測定され得る。
【0246】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法の有効性は、約４週、１２週、６か月、１２か月、２４か月、３６か月、または他の所望の時点での視覚における改善によって反映される。特定の実施形態では、視覚における改善は、ＢＣＶＡにおける増加、例えば、１文字、２文字、３文字、４文字、５文字、６文字、７文字、８文字、９文字、１０文字、１１文字、もしくは１２文字、またはそれ以上の増加を特徴とする。特定の実施形態では、視覚における改善は、ベースラインからの視力における５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の増加を特徴とする。
【0247】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法の有効性は、約４週、１２週、６か月、１２か月、２４か月、３６か月、または他の所望の時点での中心網膜厚（ＣＲＴ）または外顆粒層厚（ＯＬＮ）における低減、例えば、ベースラインからの中心網膜厚における５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の減少によって反映される。
【0248】
特定の実施形態では、処置後の眼に炎症はない、または処置後の眼に炎症はほとんどない（例えば、炎症レベルの増加は、ベースラインから１０％、５％、２％、１％またはそれ未満である）。
【0249】
視覚障害に対する本明細書に提供する方法の効果は、視運動性眼振（ＯＫＮ）によって測定され得る。
理論に拘束されないが、この視力スクリーニングは、ＯＫＮ不随意反射の原理を使用して、患者の眼が動く標的を追跡できるか否かを客観的に評価する。ＯＫＮを使用することにより、検査員及び患者間での口頭でのコミュニケーションは必要とされない。そのため、ＯＫＮを使用して、言語習得前及び／または言語を用いない患者の視力を測定することができる。ある特定の実施形態では、ＯＫＮを使用して、１か月齢、２か月齢、３か月齢、４か月齢、５か月齢、６か月齢、７か月齢、８か月齢、９か月齢、１０か月齢、１１か月齢、１歳齢、１．５歳齢、２歳齢、２．５歳齢、３歳齢、３．５歳齢、４歳齢、４．５歳齢、または５歳齢である患者の視力を測定する。ある特定の実施形態では、ｉＰａｄを使用して、患者がｉＰａｄ上で動きを見ている際のＯＫＮ反射の検出を通して視力を測定する。
理論に拘束されないが、この視力スクリーニングは、ＯＫＮ不随意反射の原理を使用して、患者の眼が動く標的を追跡できるか否かを客観的に評価する。ＯＫＮを使用することにより、検査員及び患者間での口頭でのコミュニケーションは必要とされない。そのため、ＯＫＮを使用して、言語習得前及び／または言語を用いない患者の視力を測定することができる。ある特定の実施形態では、ＯＫＮを使用して、１．５か月齢、２か月齢、３か月齢、４か月齢、５か月齢、６か月齢、７か月齢、８か月齢、９か月齢、１０か月齢、１１か月齢、１歳齢、１．５歳齢、２歳齢、２．５歳齢、３歳齢、３．５歳齢、４歳齢、４．５歳齢、または５歳齢未満である患者の視力を測定する。別の特定の実施形態では、ＯＫＮを使用して、１～２か月齢、２～３か月齢、３～４か月齢、４～５か月齢、５～６か月齢、６～７か月齢、７～８か月齢、８～９か月齢、９～１０か月齢、１０～１１か月齢、１１か月齢～１歳齢、１～１．５歳齢、１．５～２歳齢、２～２．５歳齢、２．５～３歳齢、３～３．５歳齢、３．５～４歳齢、４～４．５歳齢、または４．５～５歳齢である患者の視力を測定する。別の特定の実施形態では、ＯＫＮを使用して、６か月齢～５歳齢である患者の視力を測定する。ある特定の実施形態では、ｉＰａｄを使用して、患者がｉＰａｄ上で動きを見ている際のＯＫＮ反射の検出を通して視力を測定する。
理論に拘束されないが、この視力スクリーニングは、ＯＫＮ不随意反射の原理を使用して、患者の眼が動く標的を追跡できるか否かを客観的に評価する。ＯＫＮを使用することにより、検査員及び患者間での口頭でのコミュニケーションは必要とされない。そのため、ＯＫＮを使用して、言語習得前及び／または言語を用いない患者の視力を測定することができる。ある特定の実施形態では、ＯＫＮを使用して、１か月齢、２か月齢、３か月齢、４か月齢、５か月齢、６か月齢、７か月齢、８か月齢、９か月齢、１０か月齢、１１か月齢、１歳齢、１．５歳齢、２歳齢、２．５歳齢、３歳齢、３．５歳齢、４歳齢、４．５歳齢、または５歳齢である患者の視力を測定する。ある特定の実施形態では、ｉＰａｄを使用して、患者がｉＰａｄ上で動きを見ている際のＯＫＮ反射の検出を通して視力を測定する。
理論に拘束されないが、この視力スクリーニングは、ＯＫＮ不随意反射の原理を使用して、患者の眼が動く標的を追跡できるか否かを客観的に評価する。ＯＫＮを使用することにより、検査員及び患者間での口頭でのコミュニケーションは必要とされない。そのため、ＯＫＮを使用して、言語習得前及び／または言語を用いない患者の視力を測定することができる。ある特定の実施形態では、ＯＫＮを使用して、１．５か月齢、２か月齢、３か月齢、４か月齢、５か月齢、６か月齢、７か月齢、８か月齢、９か月齢、１０か月齢、１１か月齢、１歳齢、１．５歳齢、２歳齢、２．５歳齢、３歳齢、３．５歳齢、４歳齢、４．５歳齢、または５歳齢未満である患者の視力を測定する。別の特定の実施形態では、ＯＫＮを使用して、１～２か月齢、２～３か月齢、３～４か月齢、４～５か月齢、５～６か月齢、６～７か月齢、７～８か月齢、８～９か月齢、９～１０か月齢、１０～１１か月齢、１１か月齢～１歳齢、１～１．５歳齢、１．５～２歳齢、２～２．５歳齢、２．５～３歳齢、３～３．５歳齢、３．５～４歳齢、４～４．５歳齢、または４．５～５歳齢である患者の視力を測定する。別の特定の実施形態では、ＯＫＮを使用して、６か月齢～５歳齢である患者の視力を測定する。ある特定の実施形態では、ｉＰａｄを使用して、患者がｉＰａｄ上で動きを見ている際のＯＫＮ反射の検出を通して視力を測定する。
【0250】
ある特定の実施形態では、視力は、バッテン－ＣＬＮ２関連視覚喪失を呈する患者において、患者を、トリペプチジル－ペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）をコードするＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ９を用いて処置する前にＯＫＮを測定することによって評価される。具体的には、バッテン－ＣＬＮ２関連視覚喪失を呈する患者は、上記の年齢である、及び／または上記の年齢範囲内である。ある特定の実施形態では、視力は、バッテン－ＣＬＮ２関連視覚喪失を呈する最大で５歳齢までの患者において、患者を、トリペプチジル－ペプチダーゼ１をコードするＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ９を用いて処置した後にＯＫＮを測定することによって評価される。ある特定の実施形態では、ＯＫＮに基づく視力評価は、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた処置後に視力が低減しないことを決定する。ある特定の実施形態では、ＯＫＮに基づく視力評価は、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた処置後の患者において視力が、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％ ４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％改善することを決定する。ある特定の実施形態では、ＯＫＮに基づく視力評価は、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた処置後の患者において視力が更に悪化しないことを決定する。
ある特定の実施形態では、視力は、バッテン－ＣＬＮ２関連視覚喪失を呈する患者において、患者を、ＴＰＰ１をコードするＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ９を用いて処置する前にＯＫＮを測定することによって評価される。具体的には、バッテン－ＣＬＮ２関連視覚喪失を呈する患者は、上記の年齢である、及び／または上記の年齢範囲内である。ある特定の実施形態では、視力は、バッテン－ＣＬＮ２関連視覚喪失を呈する最大で５歳齢までの患者において、患者を、トリペプチジル－ペプチダーゼ１をコードするＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ９を用いて処置した後にＯＫＮを測定することによって評価される。ある特定の実施形態では、ＯＫＮに基づく視力評価は、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた処置後に視力が低減しないことを決定する。ある特定の実施形態では、ＯＫＮに基づく視力評価は、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた処置後の患者において視力が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％ ４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも１００％改善することを決定する。ある特定の実施形態では、ＯＫＮに基づく視力評価は、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた処置後の患者において視力が更に悪化しないことを決定する。
ヒト患者が小児である場合、視覚機能は、視運動性眼振（ＯＫＮ）ベースのアプローチまたは修正されたＯＫＮベースのアプローチを使用して評価することができる。
ある特定の実施形態では、視力は、バッテン－ＣＬＮ２関連視覚喪失を呈する患者において、患者を、ＴＰＰ１をコードするＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ９を用いて処置する前にＯＫＮを測定することによって評価される。具体的には、バッテン－ＣＬＮ２関連視覚喪失を呈する患者は、上記の年齢である、及び／または上記の年齢範囲内である。ある特定の実施形態では、視力は、バッテン－ＣＬＮ２関連視覚喪失を呈する最大で５歳齢までの患者において、患者を、トリペプチジル－ペプチダーゼ１をコードするＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ９を用いて処置した後にＯＫＮを測定することによって評価される。ある特定の実施形態では、ＯＫＮに基づく視力評価は、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた処置後に視力が低減しないことを決定する。ある特定の実施形態では、ＯＫＮに基づく視力評価は、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた処置後の患者において視力が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％ ４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも１００％改善することを決定する。ある特定の実施形態では、ＯＫＮに基づく視力評価は、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた処置後の患者において視力が更に悪化しないことを決定する。
ヒト患者が小児である場合、視覚機能は、視運動性眼振（ＯＫＮ）ベースのアプローチまたは修正されたＯＫＮベースのアプローチを使用して評価することができる。
【0251】
本明細書に提供する方法の効果はまた、瞳孔計測により経時的に測定される、瞳孔光反射における変化、例えば、ベースラインから約１～２、２～４、４～６、８～１０、１０～１２、１２～１４、１２～１６、１６～１８、１８～２０、２０～２２、２２～２４か月、または約１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、もしくは２４か月での、ベースラインからの瞳孔光反射における５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の変化によっても測定され得る。
【0252】
本明細書に提供する方法の効果はまた、ＳＤ－ＯＣＴにより経時的に測定される、黄斑の厚さ及び／または体積における変化、例えば、ベースラインから約１～２、２～４、４～６、８～１０、１０～１２、１２～１４、１２～１６、１６～１８、１８～２０、２０～２２、２２～２４か月、または約１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、もしくは２４か月での、ベースラインからの黄斑の厚さ及び／または体積における５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の変化によっても測定され得る。
【0253】
本明細書に提供する方法の効果は、網膜劣化の加速された低下段階（例えば、２１０μｍ ＣＲＴに到達する）までの時間における変化、例えば、網膜劣化の加速された低下段階までの時間、またはＣＲＴにおける３０μｍ喪失までもしくは約１１０μｍ未満のＣＲＴまでの時間における５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上の変化（例えば、ＣＲＴにおける３０μｍ喪失までまたは約１１０μｍ未満のＣＲＴまで約１～２、２～４、４～６、８～１０、１０～１２、１２～１４、１２～１６、１６～１８、１８～２０、２０～２２、２２～２４か月、または約１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、もしくは２４か月）によっても測定され得る。
【0254】
本明細書に提供する方法の効果はまた、ＳＤ－ＯＣＴ解剖学的マーカー、例えば、傍中心窩エリプソイドゾーン、ＥＬＭ、ＲＮＦＬ、全網膜圧、内顆粒層、外顆粒層（ＯＮＬ）、光受容体（ＰＲ）＋網膜色素上皮（ＲＰＥ）、外側セグメント＋ＲＰＥ（ＯＳ＋ＲＰＥ）、及び／またはエリプソイドゾーン（ＥＺ）における経時的な変化、例えば、ベースラインから約１～２、２～４、４～６、８～１０、１０～１２、１２～１４、１２～１６、１６～１８、１８～２０、２０～２２、２２～２４か月、または約１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、もしくは２４か月での、ＳＤ－ＯＣＴ解剖学的マーカー、例えば、傍中心窩エリプソイドゾーン、ＥＬＭ、ＲＮＦＬ、全網膜圧、内顆粒層、外顆粒層（ＯＮＬ）、光受容体（ＰＲ）＋網膜色素上皮（ＲＰＥ）、外側セグメント＋ＲＰＥ（ＯＳ＋ＲＰＥ）、及び／またはエリプソイドゾーン（ＥＺ）におけるベースラインからの５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の変化によっても測定され得る。
【0255】
本明細書に提供する方法の効果はまた、修正したＷＣＢＳにより経時的に測定される、眼底写真上の眼底の様子における経時的な変化、例えば、ベースラインから約１～２、２～４、４～６、８～１０、１０～１２、１２～１４、１２～１６、１６～１８、１８～２０、２０～２２、２２～２４か月、または約１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、もしくは２４か月での、ベースラインからの修正したＷＣＢＳにより測定される、眼底写真上の眼底の様子における５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の経時的な変化によっても測定され得る。
【0256】
本明細書に提供する方法の効果はまた、ＰｅｄＥｙｅＱを使用して経時的に測定される、介護者により報告された視覚的転帰における経時的な変化、例えば、ベースラインから約１～２、２～４、４～６、８～１０、１０～１２、１２～１４、１２～１６、１６～１８、１８～２０、２０～２２、２２～２４か月、または約１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、もしくは２４か月での、ベースラインからの修正したＷＣＢＳにより測定される、ＰｅｄＥｙｅＱを使用して経時的に評価される、介護者により報告された視覚的転帰における５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の経時的な変化によっても測定され得る。
【0257】
本明細書に提供する方法の効果はまた、ＶＡＢｓ ＩＩＩ及びＭＳＥＬ－視覚的受容を使用して経時的に評価される、認知能力に基づく適応行動における経時的な変化、例えば、ベースラインから約１～２、２～４、４～６、８～１０、１０～１２、１２～１４、１２～１６、１６～１８、１８～２０、２０～２２、２２～２４か月、または約１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、もしくは２４か月での、ベースラインからのＶＡＢｓ ＩＩＩ及びＭＳＥＬ－視覚的受容を使用して経時的に評価される、認知能力に基づく適応行動における５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の経時的な変化によっても測定され得る。
【0258】
本明細書に提供される方法の効果はまた、処置された眼及び対照眼を使用したハンブルクスケール運動機能スコアにおける経時的な変化、例えば、約１～２、２～４、４～６、８～１０、１０～１２、１２～１４、１２～１６、１６～１８、１８～２０、２０～２２、２２～２４か月、または約１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、または２４か月での、ベースラインからの修正したＷＣＢＳによって測定される、処置された眼及び対照眼を使用したハンブルクスケール運動機能スコアの５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の経時的な変化によっても測定され得る。
【0259】
別の態様では、ベクター排出は、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、涙液、血清または尿などの生体液中のベクターＤＮＡを測定することによって決定され得る。一部の実施形態では、ベクター遺伝子コピーは、ベクターの投与後の任意の時点で、生体液（例えば、涙液、血清または尿）中で検出可能ではない。一部の実施形態では、１０００未満、５００未満、１００未満、５０未満または１０未満のベクター遺伝子コピー／５μＬは、投与後の任意の時点で、生体液（例えば、涙液、血清または尿）中の定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって検出可能である。特定の実施形態では、２１０ベクター遺伝子コピー／５μＬ以下が、血清中で検出可能である。一部の実施形態では、１０００未満、５００未満、１００未満、５０未満または１０未満のベクター遺伝子コピー／５μＬが、投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４週までに、生体液（例えば、涙液、血清または尿）中の定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって検出可能である。特定の実施形態では、ベクター遺伝子コピーは、ベクターの投与後１４週までに血清中で検出可能ではない。
【0260】
別の態様では、導入遺伝子（例えば、コンストラクトＩによってコードされる導入遺伝子、またはＴＰＰ１）の発現レベルは、コンストラクトＩが投与された対象の血清及び／またはＣＳＦ中の導入遺伝子産物を測定することによってモニターされ得る。導入遺伝子産物（例えば、ＴＰＰ１）の発現レベルはまた、コンストラクトＩが投与された対象の眼（例えば、房水及び／または硝子体液）においてモニターされ得る。導入遺伝子発現は、限定されないが、ウエスタンブロッティング、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）プラットフォームを使用して実装される電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイ、及びＥＬＩＳＡを含む、当該技術分野で公知の任意の好適なアッセイによって測定され得る。
【0261】
一部の実施形態では、眼内のＴＰＰ１の発現レベルは、眼の異なる領域間で変化してもよく、例えば、高レベルのベクターＤＮＡは、ブレブの領域で網膜及び脈絡膜／ＲＰＥ（側頭、注射による）ならびに上、下及び鼻の象限において検出されてもよく、一方、低レベルは、視神経、視交叉及び後頭葉において検出されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に提供するｒＡＡＶ（例えば、コンストラクトＩ）は、視覚経路に沿って限定された順行性向性を示す。
【0262】
一部の実施形態では、対象への本明細書に提供するｒＡＡＶ（例えば、コンストラクトＩ）の投与は、対象へのｒＡＡＶの投与の約３か月、約６か月、約９か月、約１２か月、約１５か月、約１８か月、約２１か月、または約２４か月以内に、対象の眼の硝子体液及び／または房水における検出可能な（例えば、本明細書に記載の方法、または当該技術分野で公知の方法を使用して検出可能な）ＴＰＰ１発現レベルをもたらし、ｒＡＡＶの投与前に、硝子体液及び／または房水におけるＴＰＰ１発現のレベルが検出不能であった。一部の実施形態では、対象への本明細書に提供するｒＡＡＶ（例えば、コンストラクトＩ）の投与は、対象へのｒＡＡＶの投与の約３か月、約６か月、約９か月、約１２か月、約１５か月、約１８か月、約２１か月、または約２４か月以内に、対象の眼の硝子体液及び／または房水における検出可能な（例えば、本明細書に記載の方法、または当該技術分野で公知の方法を使用して検出可能な）ＴＰＰ１発現レベルをもたらし、ｒＡＡＶの投与前に、硝子体液及び／または房水におけるＴＰＰ１発現のレベルが検出不能であり、対象の血清におけるＴＰＰ１発現レベルは、検出不能（例えば、本明細書に記載の方法または当該技術分野で公知の方法を使用して検出不能）のままである。一部の実施形態では、ＴＰＰ１は、免疫蛍光アッセイを使用して検出可能または検出不能である。一部の実施形態では、ＴＰＰ１は、免疫染色アッセイを使用して検出可能または検出不能である。
【0263】
一部の実施形態では、対象への本明細書に提供するｒＡＡＶ（例えば、コンストラクトＩ）の投与は、ｒＡＡＶの投与前のＴＰＰ１発現レベルと比較して、対象へのｒＡＡＶの投与の約３か月、約６か月、約９か月、約１２か月、約１５か月、約１８か月、約２１か月、または約２４か月以内に対象の眼の硝子体液及び／または房水におけるＴＰＰ１発現レベルの増加（例えば、約１００倍～約５００倍、約５００倍～約１０００倍、約１０００倍～約１５００倍、約１５００倍～約２０００倍、約２０００倍～約２５００倍、約２５００倍～約３０００倍、約３０００倍～約４０００倍、約４０００倍～約５０００倍、約５０００倍～約１０，０００倍、約１０，０００倍～約１５，０００倍、約１５，０００～約２０，０００倍、または約２０，０００倍超の増加）をもたらす。一部の実施形態では、対象への本明細書に提供するｒＡＡＶ（例えば、コンストラクトＩ）の投与は、ｒＡＡＶの投与前のＴＰＰ１発現レベルと比較して、対象へのｒＡＡＶの投与の約３か月、約６か月、約９か月、約１２か月、約１５か月、約１８か月、約２１か月、または約２４か月以内に対象の眼の硝子体液及び／または房水におけるＴＰＰ１発現レベルの増加（例えば、約１００倍～約５００倍、約５００倍～約１０００倍、約１０００倍～約１５００倍、約１５００倍～約２０００倍、約２０００倍～約２５００倍、約２５００倍～約３０００倍、約３０００倍～約４０００倍、約４０００倍～約５０００倍、約５０００倍～約１０，０００倍、約１０，０００倍～約１５，０００倍、約１５，０００～約２０，０００倍、または約２０，０００倍超の増加）をもたらし、対象の血清におけるＴＰＰ１発現レベルは、投与前のＴＰＰ１発現レベルと比較してほぼ一定のままである（例えば、約１０％以内のままである）。一部の実施形態では、ＴＰＰ１発現は、免疫蛍光アッセイを使用して測定される。一部の実施形態では、ＴＰＰ１発現は、免疫染色アッセイを使用して検出可能または検出不能である。
【0264】
一部の実施形態では、対象への本明細書で提供するｒＡＡＶ（例えば、コンストラクトＩ）の投与は、対象の網膜におけるＴＰＰ１発現、例えば、網膜色素上皮及び／または光受容体外側セグメントにおける発現、またはその割合、または網膜の全深さにわたる発現をもたらす。一部の実施形態では、ＴＰＰ１発現は、ニューロンに限定され得る。
【0265】
導入遺伝子産物レベルは、処置された眼の前房からの硝子体液及び／または房水の患者試料において測定することができる。あるいは、硝子体液濃度は、導入遺伝子産物の患者の血清濃度を測定することにより推定及び／またはモニターすることができる－導入遺伝子産物への全身曝露対硝子体曝露の比率は、約１：９０，０００である。（例えば、Ｘｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５４：１６２１頁の１６１６－１６２４及び１６２３頁の表５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において報告されたラニビズマブの房水及び血清濃度を参照されたい。
【0266】
コンストラクトＩに対する免疫原性を評価することができ、抗導入遺伝子産物抗体（房水、血清、及びＣＳＦ）、抗ＡＡＶ９抗体（血清、ＣＳＦ）、ならびに酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ；全血）を介してＡＡＶ９及びコンストラクトＩ導入遺伝子産物に対するＴ細胞反応性として評価される。
【0267】
一部の実施形態では、疾患の進行は、小児患者へのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸの投与によって評価され得る。一部の実施形態では、疾患の進行は、成人患者へのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸの投与によって評価され得る。一部の実施形態では、ＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の処置を必要とする対象においてそれを行う方法を本明細書に提供し、当該方法は、当該対象の眼に、キャプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９であり、ベクターゲノムは、
ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）と、
プロモーターと、
ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２コード配列と、
ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含み、
この方法は、ベクターの投与中及び／または投与後の当該患者のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評定における変化、またはその欠如をモニターすることを更に含む。一部の実施形態では、対象は、＋１ポイント、＋２ポイント、＋３ポイント、＋４ポイント、＋５ポイント、または＋６ポイントのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評定におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、この方法は、対象におけるＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の進行を遅延させるか、または停止させ、１か月以上、２か月以上、３か月以上、６か月以上、１年以上、または２年以上の期間にわたる対象のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評定における遅延した減少及び／またはその維持によって決定される。
ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）と、
プロモーターと、
ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２コード配列と、
ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含み、
この方法は、ベクターの投与中及び／または投与後の当該患者のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評定における変化、またはその欠如をモニターすることを更に含む。一部の実施形態では、対象は、＋１ポイント、＋２ポイント、＋３ポイント、＋４ポイント、＋５ポイント、または＋６ポイントのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評定におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、この方法は、対象におけるＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の進行を遅延させるか、または停止させ、１か月以上、２か月以上、３か月以上、６か月以上、１年以上、または２年以上の期間にわたる対象のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評定における遅延した減少及び／またはその維持によって決定される。
【0268】
一部の実施形態では、疾患の進行は、小児患者へのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸの投与によって評価され得る。一部の実施形態では、ＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の処置を必要とする対象においてそれを行う方法を本明細書に提供し、当該方法は、当該対象の眼に、キャプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９であり、ベクターゲノムは、
ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）と、
プロモーターと、
ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２コード配列と、
ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含み、
この方法は、ベクターの投与中及び／または投与後の当該患者のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ評定における変化、またはその欠如をモニターすることを更に含む。一部の実施形態では、対象は、＋１ポイント、＋２ポイント、＋３ポイント、＋４ポイント、＋５ポイント、または＋６ポイントのそれらのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ評定におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、この方法は、対象におけるＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の進行を遅延させるか、または停止させ、１か月以上、２か月以上、３か月以上、６か月以上、１年以上、または２年以上の期間にわたる対象のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ評定における遅延した減少及び／またはその維持によって決定される。
ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）と、
プロモーターと、
ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２コード配列と、
ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含み、
この方法は、ベクターの投与中及び／または投与後の当該患者のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ評定における変化、またはその欠如をモニターすることを更に含む。一部の実施形態では、対象は、＋１ポイント、＋２ポイント、＋３ポイント、＋４ポイント、＋５ポイント、または＋６ポイントのそれらのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ評定におけるベースラインからの変化を有する。一部の実施形態では、この方法は、対象におけるＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の進行を遅延させるか、または停止させ、１か月以上、２か月以上、３か月以上、６か月以上、１年以上、または２年以上の期間にわたる対象のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ評定における遅延した減少及び／またはその維持によって決定される。
【0269】
４．４ 本明細書に記載の処置方法に使用される処置システム、デバイス、または装置
本明細書に記載の処置方法に使用される処置システム、デバイス、及び装置も本明細書に提供し、これらは、以下：ボトル、チューブ、光源、マイクロインジェクター、及びフットペダルのうちの１つまたは複数を含み得る。ある特定の実施形態では、光源は、自己照明コンタクトレンズであり、これを使用して、後眼部にベクターを堆積させ、特に、視神経乳頭、中心窩及び／または黄斑の損傷を回避することができる（例えば、Ｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ ｌａｓｅｒｓ．３５．７６－７７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ある特定の実施形態では、自己照明コンタクトレンズを、網膜下注射を可視化するために周囲注射中に利用する（例えば、Ｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ ｌａｓｅｒｓ．３５．７６－７７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ある特定の実施形態では、光ファイバーシャンデリアは、網膜下注射を可視化するための第２の套管針を介して利用される。
本明細書に記載の処置方法に使用される処置システム、デバイス、及び装置も本明細書に提供し、これらは、以下：ボトル、チューブ、光源、マイクロインジェクター、及びフットペダルのうちの１つまたは複数を含み得る。ある特定の実施形態では、光源は、自己照明コンタクトレンズであり、これを使用して、後眼部にベクターを堆積させ、特に、視神経乳頭、中心窩及び／または黄斑の損傷を回避することができる（例えば、Ｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ ｌａｓｅｒｓ．３５．７６－７７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ある特定の実施形態では、自己照明コンタクトレンズを、網膜下注射を可視化するために周囲注射中に利用する（例えば、Ｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ ｌａｓｅｒｓ．３５．７６－７７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ある特定の実施形態では、光ファイバーシャンデリアは、網膜下注射を可視化するための第２の套管針を介して利用される。
【0270】
４．５ 併用療法
本明細書に提供する方法は、１つまたは複数の追加の治療法と組み合わせてよい。
本明細書に提供する方法は、１つまたは複数の追加の治療法と組み合わせてよい。
【0271】
追加の治療法は、遺伝子療法処置の前、同時、または後に施してよい。一部の実施形態では、追加の治療法は、組換えＴＰＰ１（例えば、Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）セルリポナーゼアルファ）を用いた酵素置換療法（ＥＲＴ）である。
５．配列
５．配列
【表2】
【実施例】
【0272】
６．実施例
このセクション（すなわち、セクション６）の実施例は、限定ではなく、例示として提供される。
このセクション（すなわち、セクション６）の実施例は、限定ではなく、例示として提供される。
【0273】
６．１ 実施例１：ヒト対象を処置し、コンストラクトＩによる処置の有効性を評価するためのプロトコル
本実施例は、コンストラクトＩ処置の有効性の評価を可能にするための、ヒト対象の処置のための例示的なプロトコルを提供する。コンストラクトＩは、約もしくは少なくとも約２×１０１０ＧＣ／眼または約もしくは少なくとも約６×１０１０ＧＣ／眼の用量で投与されてもよい。コンストラクトＩは、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ～約３．０×１０１１ＧＣ／ｍＬの濃度で、２００μＬの容量で網膜下に投与されてもよい。
本実施例は、コンストラクトＩ処置の有効性の評価を可能にするための、ヒト対象の処置のための例示的なプロトコルを提供する。コンストラクトＩは、約もしくは少なくとも約２×１０１０ＧＣ／眼または約もしくは少なくとも約６×１０１０ＧＣ／眼の用量で投与されてもよい。コンストラクトＩは、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ～約３．０×１０１１ＧＣ／ｍＬの濃度で、２００μＬの容量で網膜下に投与されてもよい。
【0274】
６．１．１ 患者集団
この実施例に記載の方法に従って処置される患者は、二対立遺伝子ＣＬＮ２変異を有し、白血球ＴＰＰ１活性が低下している。患者はまた、ＣＬＮ２疾患と一致する臨床的徴候または症状（例えば、発達遅延、発達低下、発作、視力喪失、もしくは他の徴候症状）を示すか、または確認されたＣＬＮ２診断を有する兄姉を有する。
この実施例に記載の方法に従って処置される患者は、二対立遺伝子ＣＬＮ２変異を有し、白血球ＴＰＰ１活性が低下している。患者はまた、ＣＬＮ２疾患と一致する臨床的徴候または症状（例えば、発達遅延、発達低下、発作、視力喪失、もしくは他の徴候症状）を示すか、または確認されたＣＬＮ２診断を有する兄姉を有する。
【0275】
患者は、脳室内Ｂｒｉｎｅｕｒａ酵素補充療法を受けている。患者は更に、両眼においてベースラインで≦２１０μｍのＣＲＴ、及びベースラインで≧１４０μｍのＣＲＴを有し、最大８４か月齢である。あるいは、患者は症状が出る前であり、両眼においてベースラインで＞２１０μｍのＣＲＴを有する場合があり、１２～４８か月齢である。ＣＬＮ２疾患が兄弟姉妹のＣＬＮ２疾患の家族歴に起因して無症候性患者において診断された場合、罹患した兄弟姉妹の視力喪失の発症は、８４か月以下でなければならない。患者はまた、両眼においてベースラインで＜１４０μｍのＣＲＴ、及びワイル・コーネル眼科重症度スコア＜５（年齢制限なし）を有する場合がある。
【0276】
患者は、ＯＫＮベースのＶＡ検査で測定可能な視力（ＶＡ）を有する。
【0277】
患者は、プレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ／日で７日間（すなわち、－３日目～４日目）、最大用量４０ｍｇ／日）を、コンストラクトＩ処置と同時に受けることができる。７日後（術前３日、手術日、術後３日）、患者は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日の減少用量を受け、最大用量２０ｍｇ／日を更に１０日間（すなわち、５日目～１４日目）受けることができる。
【0278】
患者は、ＣＬＮ２バッテン病の処置のために２週間ごとに脳室内Ｂｒｉｎｅｕｒａ酵素補充療法を受けている可能性がある。
【0279】
６．１．２ 有効性エンドポイント
有効性の一次エンドポイントは、３６０日目にＳＤ－ＯＣＴによって測定したＣＲＴにおけるベースラインからの変化である。他の有効性エンドポイントは、以下を含む：
・血清及び尿中でＰＣＲによって検出されたＡＡＶ９、
・３６０日目（またはそれ以上）にＯＫＮによって測定される、ＶＡにおけるベースラインからの変化、
・３６０日目（またはそれ以上）にＳＤ－ＯＣＴによって測定される、中心１ｍｍのＯＮＬ厚におけるベースラインからの変化、
・３６０日目にＳＤ－ＯＣＴによって測定される、測定値におけるベースラインからの変化及び経時的な網膜層の出現、
・３６０日目に経時的な瞳孔計測によって測定される、瞳孔光反射におけるベースラインからの変化、
・３６０日目にＳＤ－ＯＣＴによって測定される、黄斑の厚さ／体積におけるベースラインからの変化、
・２１０μｍ ＣＲＴに到達すると定義される網膜変性症の加速減少期までの時間、ＣＲＴ≦２１０μｍから３０μｍの損失までの時間、
・３６０日目にＳＤ－ＯＣＴによって測定される、ＣＲＴにおけるベースラインからの変化、
・ＳＤ－ＯＣＴ解剖学的マーカー、例えば、傍中心窩エリプソイドゾーン、ＥＬＭ、ＲＮＦＬ、
・修正したＷＣＢＳによって測定される、経時的な眼底写真の眼底外観におけるベースラインからの変化、
・３６０日目のＦＡＦにおけるベースラインからの変化、ＣＲＴ≦１１０μｍとして定義される末期疾患までの時間、
・ＰｅｄＥｙｅＱを使用して評価される、介護者報告の視覚転帰におけるベースラインからの経時的な変化、
・ＶＡＢ ＩＩＩ及びＭＳＥＬ－Ｖｉｓｕａｌ Ｒｅｃｅｐｔｉｏｎを使用して評価される、認知能力に基づく適応行動におけるベースラインからの経時的な変化、
・処置した眼及び対照眼を使用したハンブルクスケール運動機能スコアにおけるベースラインからの変化、
・処置した眼及び対照眼を使用した修正ハンブルクスケール運動機能スコアにおけるベースラインからの変化。
有効性の一次エンドポイントは、３６０日目にＳＤ－ＯＣＴによって測定したＣＲＴにおけるベースラインからの変化である。他の有効性エンドポイントは、以下を含む：
・血清及び尿中でＰＣＲによって検出されたＡＡＶ９、
・３６０日目（またはそれ以上）にＯＫＮによって測定される、ＶＡにおけるベースラインからの変化、
・３６０日目（またはそれ以上）にＳＤ－ＯＣＴによって測定される、中心１ｍｍのＯＮＬ厚におけるベースラインからの変化、
・３６０日目にＳＤ－ＯＣＴによって測定される、測定値におけるベースラインからの変化及び経時的な網膜層の出現、
・３６０日目に経時的な瞳孔計測によって測定される、瞳孔光反射におけるベースラインからの変化、
・３６０日目にＳＤ－ＯＣＴによって測定される、黄斑の厚さ／体積におけるベースラインからの変化、
・２１０μｍ ＣＲＴに到達すると定義される網膜変性症の加速減少期までの時間、ＣＲＴ≦２１０μｍから３０μｍの損失までの時間、
・３６０日目にＳＤ－ＯＣＴによって測定される、ＣＲＴにおけるベースラインからの変化、
・ＳＤ－ＯＣＴ解剖学的マーカー、例えば、傍中心窩エリプソイドゾーン、ＥＬＭ、ＲＮＦＬ、
・修正したＷＣＢＳによって測定される、経時的な眼底写真の眼底外観におけるベースラインからの変化、
・３６０日目のＦＡＦにおけるベースラインからの変化、ＣＲＴ≦１１０μｍとして定義される末期疾患までの時間、
・ＰｅｄＥｙｅＱを使用して評価される、介護者報告の視覚転帰におけるベースラインからの経時的な変化、
・ＶＡＢ ＩＩＩ及びＭＳＥＬ－Ｖｉｓｕａｌ Ｒｅｃｅｐｔｉｏｎを使用して評価される、認知能力に基づく適応行動におけるベースラインからの経時的な変化、
・処置した眼及び対照眼を使用したハンブルクスケール運動機能スコアにおけるベースラインからの変化、
・処置した眼及び対照眼を使用した修正ハンブルクスケール運動機能スコアにおけるベースラインからの変化。
【0280】
６．１．３ 薬力学的エンドポイント
房水、血清及びＣＳＦにおけるＴＰＰ１のレベルもまた評価される。ＡＡＶ９濃度は、ＣＳＦで測定される。ＡＡＶ９に対する抗体は、血清及びＣＳＦ中で測定されてもよく、コンストラクトＩ（ＴＰＰ１）の導入遺伝子産物に対する抗体は、血清、ＣＳＦ及び房水中で測定されてもよい。ＡＡＶ９及びコンストラクトＩ ＴＰに対するＴ細胞反応性を、全血を用いたＥＬＩＳＰＯＴを使用してＰＢＭＣで試験する。
房水、血清及びＣＳＦにおけるＴＰＰ１のレベルもまた評価される。ＡＡＶ９濃度は、ＣＳＦで測定される。ＡＡＶ９に対する抗体は、血清及びＣＳＦ中で測定されてもよく、コンストラクトＩ（ＴＰＰ１）の導入遺伝子産物に対する抗体は、血清、ＣＳＦ及び房水中で測定されてもよい。ＡＡＶ９及びコンストラクトＩ ＴＰに対するＴ細胞反応性を、全血を用いたＥＬＩＳＰＯＴを使用してＰＢＭＣで試験する。
【0281】
６．１．４ 有効性評価
コンストラクトＩによる処置の有効性は、様々なアッセイを使用して評価することができる。例えば、網膜イメージングは、ハイデルベルク・スペクトラリスモジュールイメージングシステムを使用するスペクトラルドメイン光干渉断層計（ＳＤ－ＯＣＴ）（両眼黄斑及び視神経乳頭）を使用して実施することができる。
コンストラクトＩによる処置の有効性は、様々なアッセイを使用して評価することができる。例えば、網膜イメージングは、ハイデルベルク・スペクトラリスモジュールイメージングシステムを使用するスペクトラルドメイン光干渉断層計（ＳＤ－ＯＣＴ）（両眼黄斑及び視神経乳頭）を使用して実施することができる。
【0282】
処置した眼及び対照眼の軸方向長は、Ａ－スキャン超音波検査を使用して行うことができる。視運動性眼振検査（ＯＫＮ検査）による視力を実施してもよい。
【0283】
研究眼の眼底自発蛍光は、Ｆｌｅｘ Ｍｏｄｕｌｅを有するハイデルベルク・スペクトラリスＯＣＴ器具を使用して行うことができる。
【0284】
研究眼のマルチカラー眼底イメージングは、Ｆｌｅｘ Ｍｏｄｕｌｅを有するハイデルベルク・スペクトラリスＯＣＴ器具を使用して行ってもよい。
【0285】
瞳孔測定を伴う瞳孔光反射を実施することができる。
【0286】
ＰｅｄＥｙｅＱを使用して、１７歳までの小児の眼関連の生活の質及び機能的視力に対する小児期の眼疾患の効果を評価することができる（Ｈａｔｔ ｅｔ ａｌ，２０１９，Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００：２０１－１７）。ＰｅｄＥｙｅＱには、小児、代理人、親用の複数のバージョンがあり、０～４歳、５～１１歳の年齢層に合わせて調整することができる。各年齢別代理人質問票は、５歳以上の患者のみを対象とした３つの一般的なドメイン（機能的視力、眼／視力が苦になる、社会的）及び２つのドメイン（フラストレーション／心配、及び眼のケア）からなる。各ドメインは、５～１０項目からなる。介護者は、「決してない」、「時々」、または「常に」の各項目に対する回答を選択することができ、それぞれ２、１、または０のスコアに対応する。各ドメインは、独立して、ドメインの全ての完了した項目の平均Ｒａｓｃｈ較正値によってスコアリングすることができる。ドメインスコアは、０～１００のスケールに変換することができ、０が考えられる最悪とみなされ、１００が生活の質または機能的視力の考えられる最良の尺度とみなされる。
【0287】
Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動スケール（ＶＡＢＳ）－ＩＩＩ（Ｓｐａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ．３ｒｄ ｅｄ．Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ：Ｐｅａｒｓｏｎ）は、幼児期から９０歳までの個体における神経認知に基づく適応行動を評価するために使用され得る。コミュニケーション、日常生活スキル、社会化、及び運動スキルの４つのドメインは、７歳未満の小児に適しているため、評価することができる。各ドメインの項目は、個体が各適応スキル／行動を示す頻度に基づいて、２から０までのスコアを付けられ、２はほとんど常に、０は決してないに対応する。個々の項目を集計し、次いで、平均が１００、標準偏差が１５の標準的な年齢適合ベル曲線と比較される集成値として計算する。小児のスコアがどのパーセンタイルに達するかに応じて、彼らの全体的な適応行動能力は、低い、中程度に低い、適度、中程度に高い、または高いとして記録することができる。
【0288】
Ｍｕｌｌｅｎの早期学習スケール（ＭＳＥＬ）は、認知発達の尺度として一般的に使用される標準化された評価である（Ｍｕｌｌｅｎ，１９９５，Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｌｅａｒｎｉｎｇ（ＡＧＳ ｅｄ．）．Ｃｉｒｃｌｅ Ｐｉｎｅｓ，ＭＮ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｎｃ．）。ＭＳＥＬは、（ａ）粗大運動、（ｂ）微細運動、（ｃ）視覚的受容（または非言語的問題解決）、（ｄ）受容的言語、及び（ｅ）表現的言語スキルを測定する５つのサブスケールで構成されている。各サブスケールを標準化して、標準スコア、パーセンタイル、及び年齢当量スコアを計算することができる。
【0289】
ＭＳＥＬは、視覚処理及び問題解決に対する処置の潜在的な効果を測定するための臨床転帰評価として本研究で使用するために適合されている（すなわち、ＭＳＥＬ－視覚的受容）。標準的な視覚的受容サブスケールに加えて、視覚的受容ドメインの修正版（最初の７つの項目）を評価してもよく、すなわち、認知及び微細運動の器用さへの依存を最小限に抑えながら、固視及び追跡に重点を置いてもよい。例としては、三角形を固視して追跡すること、動いているブルズアイを１８０度追跡すること、及び落下したスプーンを探すことが挙げられる。
【0290】
ＣＬＮ２臨床評定スケール（ＣＲＳ）は、個体の運動機能、言語、発作、及び視力の経時的な変化を評価するために、ＣＬＮ２疾患に対して特異的に開発された。元の１２ポイントハンブルクスケール（Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ，２００２，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１１２（４）：３４７－５４）は、遡及的にも前向きにも患者を評価するために開発された。これは、最大の縦断的自然歴データ収集に使用されている（Ｎｉｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｌａｎｃｅｔ Ｃｈｉｌｄ Ａｄｏｌｅｓｃ Ｈｅａｌｔｈ．２（８）：５８２－５９０．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ２３５２－４６４２（１８）３０１７９－２．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｊｕｌ ２）。２０１８年には、スケールの運動ドメイン及び言語ドメインに対する更新が公開され（Ｗｙｒｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｊ Ｉｎｂｏｒｎ Ｅｒｒｏｒｓ Ｍｅｔａｂ Ｓｃｒｅｅｎ．６：１－７）、これにより運動及び言語スコアのスケール文言は、臨床治験における前向きデータ収集に使用されるために、より詳細な定義を与える。運動ドメイン及び言語ドメインは、合わせて０～６ポイントのスコアを形成する。各ドメインの最高スコアは、通常または最大能力に対応する３ポイントであるが、０のスコアは、そのドメインに能力が残っていないことを示す。これらのスケールは、Ｂｒｉｎｅｕｒａの臨床的有効性を評価するために使用される６点運動－言語スケールなどの臨床研究で以前に使用されている（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７８（２０）：１８９８－１９０７）。運動機能スケールは、元のハンブルクスケール及び２０１８年の修正版の両方を使用して評価することができる。患者は、ＯＤ（右目）スコア及びＯＳ（左目）スコアが記録されるように、各眼を閉塞して１回、各検査を２回行うことができる。合計で、２つのスケールについて４つのスコアを記録することができる。
【0291】
６．１．５ 安全性評価
コンストラクトＩの投与の安全性は、例えば、眼科検査、身体検査バイタルサイン評価、または臨床安全性実験室評価（例えば、血清化学、血液学的測定及び尿分析を含む）により評価され得る。
コンストラクトＩの投与の安全性は、例えば、眼科検査、身体検査バイタルサイン評価、または臨床安全性実験室評価（例えば、血清化学、血液学的測定及び尿分析を含む）により評価され得る。
【0292】
６．１．６ ベクター排出
ベクター導入遺伝子は、排出（標的細胞に感染せず、糞便または体液を介して身体から除去されたベクターの放出）、動員（導入遺伝子複製及び標的細胞からの移行）、または生殖系伝達（精液を介した子孫への遺伝子伝達）から意図しないレシピエントに拡散する可能性を有する。ベクター排出は、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、涙液、血清または尿などの生体液中のベクターＤＮＡを測定することによって決定され得る。
ベクター導入遺伝子は、排出（標的細胞に感染せず、糞便または体液を介して身体から除去されたベクターの放出）、動員（導入遺伝子複製及び標的細胞からの移行）、または生殖系伝達（精液を介した子孫への遺伝子伝達）から意図しないレシピエントに拡散する可能性を有する。ベクター排出は、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、涙液、血清または尿などの生体液中のベクターＤＮＡを測定することによって決定され得る。
【0293】
ＡＡＶ９ベクター濃度の測定のために、血液（血清）、尿、及び涙液の試料採取を、コンストラクトＩ患者に対して行ってもよい。
【0294】
これらの生体液で収集された排出データは、標的患者集団におけるコンストラクトＩの排出プロファイルを提供することができ、未処置個体への伝播の可能性を推定するために使用され得る。排出は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して測定することができる。
【0295】
６．２ 実施例２：カニクイザルへのコンストラクトＩの網膜下注射は、眼における超生理学的レベルのＴＰＰ１をもたらす
後期幼児神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ２）疾患では、ＣＬＮ２遺伝子の変異は、ＴＰＰ１酵素活性の欠如につながり、中枢神経系及び網膜内の深刻な神経変性をもたらす。ＣＬＮ２疾患の眼症状を処置するために現在承認されている治療法はなく、視力喪失は重要な未充足のニーズを呈している。この研究の目的は、網膜下注射によりコンストラクトＩを投与し、ＣＬＮ２疾患の眼症状を予防するのに十分なレベルのＴＰＰ１酵素を産生することであった。ＣＬＮ２疾患のマウスモデルは、網膜病理学を明らかに示さないため、コンストラクトＩの薬力学、生体内分布、免疫原性及び毒性をカニクイザルにおいて評価した。カニクイザルの群（４～５／群）に、コンストラクトＩを≧１×１０１０ＧＣ／眼の用量で網膜下注射（１００μＬ）によって投与し、血清、房水及び硝子体液中の導入遺伝子発現（ＴＰＰ１濃度）及び生体内分布を最大１３週間評価した。ＴＰＰ１濃度の増加は、房水及び硝子体液中で見られたが、血清中では見られなかった。導入遺伝子発現は３か月間持続したが、一部の眼では血清抗ＴＰＰ１抗体の発生により、ＴＰＰ１濃度が部分的に減少した。眼では、網膜及び脈絡膜／ＲＰＥにおいて、ブレブ（側頭）及び非ブレブ（上、下及び鼻の象限）の両方の領域で高レベルのベクターＤＮＡが観察された。ベクターＤＮＡはまた、視神経、視交叉及び後頭葉にも低レベルで存在したが、他の脳領域には存在せず、順行性向性を示唆した。免疫染色は、ＴＰＰ１タンパク質が網膜の広範囲の領域に存在し、主に光受容体内に存在するが、他の細胞層にも少ない程度で存在することを示した。１×１０１０ＧＣ／眼では、ＴＰＰ１濃度は、未処置の動物よりも１５０倍（房水）及び２００倍（硝子体液）高かった。これは、コンストラクトＩの網膜下注射が、ＣＬＮ２患者に見られる網膜変性を減衰させるのに十分なレベルのＴＰＰ１を提供し得ることを実証する。
後期幼児神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ２）疾患では、ＣＬＮ２遺伝子の変異は、ＴＰＰ１酵素活性の欠如につながり、中枢神経系及び網膜内の深刻な神経変性をもたらす。ＣＬＮ２疾患の眼症状を処置するために現在承認されている治療法はなく、視力喪失は重要な未充足のニーズを呈している。この研究の目的は、網膜下注射によりコンストラクトＩを投与し、ＣＬＮ２疾患の眼症状を予防するのに十分なレベルのＴＰＰ１酵素を産生することであった。ＣＬＮ２疾患のマウスモデルは、網膜病理学を明らかに示さないため、コンストラクトＩの薬力学、生体内分布、免疫原性及び毒性をカニクイザルにおいて評価した。カニクイザルの群（４～５／群）に、コンストラクトＩを≧１×１０１０ＧＣ／眼の用量で網膜下注射（１００μＬ）によって投与し、血清、房水及び硝子体液中の導入遺伝子発現（ＴＰＰ１濃度）及び生体内分布を最大１３週間評価した。ＴＰＰ１濃度の増加は、房水及び硝子体液中で見られたが、血清中では見られなかった。導入遺伝子発現は３か月間持続したが、一部の眼では血清抗ＴＰＰ１抗体の発生により、ＴＰＰ１濃度が部分的に減少した。眼では、網膜及び脈絡膜／ＲＰＥにおいて、ブレブ（側頭）及び非ブレブ（上、下及び鼻の象限）の両方の領域で高レベルのベクターＤＮＡが観察された。ベクターＤＮＡはまた、視神経、視交叉及び後頭葉にも低レベルで存在したが、他の脳領域には存在せず、順行性向性を示唆した。免疫染色は、ＴＰＰ１タンパク質が網膜の広範囲の領域に存在し、主に光受容体内に存在するが、他の細胞層にも少ない程度で存在することを示した。１×１０１０ＧＣ／眼では、ＴＰＰ１濃度は、未処置の動物よりも１５０倍（房水）及び２００倍（硝子体液）高かった。これは、コンストラクトＩの網膜下注射が、ＣＬＮ２患者に見られる網膜変性を減衰させるのに十分なレベルのＴＰＰ１を提供し得ることを実証する。
【0296】
６．３ 実施例３：カニクイザルへのコンストラクトＩの網膜下注射は、眼における超生理学的レベルのＴＰＰ１をもたらす
本研究の目的は、ヒトＣＬＮ２（ｈＣＬＮ２）発現カセットを含有する血清型９（ＡＡＶ９）の組換えアデノ随伴ウイルスであるコンストラクトＩの網膜下注射後のカニクイザルの網膜におけるヒトＴＰＰ１のレベルを評価することであった。
本研究の目的は、ヒトＣＬＮ２（ｈＣＬＮ２）発現カセットを含有する血清型９（ＡＡＶ９）の組換えアデノ随伴ウイルスであるコンストラクトＩの網膜下注射後のカニクイザルの網膜におけるヒトＴＰＰ１のレベルを評価することであった。
【0297】
６．３．１ 方法
若いカニクイザルの群（ｎ＝５／群、約２～３歳齢）に、コンストラクトＩの単回網膜下注射（１００μＬ）を、０（ビヒクル）または＞１×１０１０ＧＣ／眼の用量で両眼に投与した。動物を、投与後４週間（２／群）または１３週間（３／群）のいずれかで安楽死させた。本研究では、房水、硝子体液（末端試料）及び血清中のＴＰＰ１濃度、血清中の免疫原性（抗ＡＡＶ９中和抗体［ＮＡｂ］及び抗ＴＰＰ１抗体）、生体内分布（ベクターＤＮＡ）ならびにＴＰＰ１免疫染色の評価が含まれた。
若いカニクイザルの群（ｎ＝５／群、約２～３歳齢）に、コンストラクトＩの単回網膜下注射（１００μＬ）を、０（ビヒクル）または＞１×１０１０ＧＣ／眼の用量で両眼に投与した。動物を、投与後４週間（２／群）または１３週間（３／群）のいずれかで安楽死させた。本研究では、房水、硝子体液（末端試料）及び血清中のＴＰＰ１濃度、血清中の免疫原性（抗ＡＡＶ９中和抗体［ＮＡｂ］及び抗ＴＰＰ１抗体）、生体内分布（ベクターＤＮＡ）ならびにＴＰＰ１免疫染色の評価が含まれた。
【0298】
ＴＰＰ１濃度は、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）プラットフォームを使用して実装される電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイによって決定した。
【0299】
６．３．２ 結果
一部のコンストラクトＩで処置した動物は、投与前にＮＡｂが陽性であり、コンストラクトＩの投与後に薬力学または生体内分布に顕著な効果をもたらさなかった。
一部のコンストラクトＩで処置した動物は、投与前にＮＡｂが陽性であり、コンストラクトＩの投与後に薬力学または生体内分布に顕著な効果をもたらさなかった。
【0300】
健常なカニクイザルの眼へのコンストラクトＩの網膜下注射は、研究の経過にわたって房水における、ならびに３か月後の硝子体液（末端試料のみ）におけるＴＰＰ１濃度の増加をもたらした（図４Ａ及び４Ｂ）。これは、血清には反映されず、研究を通して対照動物と同等のままであった（図５）。コンストラクトＩで処置した動物からの末端試料は、抗ＴＰＰ１抗体の発生率の増加を示し、これは一部の動物では、水性ＴＰＰ１濃度の減少をもたらした可能性がある。
【0301】
高レベルのベクターＤＮＡが、網膜及び脈絡膜／ＲＰＥにおいて、ブレブの領域（側頭）ならびに上、下及び鼻の象限で検出された（図６Ａ及び６Ｂ）。
【0302】
ベクターＤＮＡは、≧１×１０１１ＧＣ／眼で、視神経、視交叉及び後頭葉において低レベルで検出され、視覚経路に沿った限定された順行性向性を示唆した（図７Ａ及び７Ｂ）。
【0303】
ＴＰＰ１免疫反応性は、網膜の広範囲の領域内で観察された。＞１×１０１０ＧＣ／眼では、網膜色素上皮、光受容体外側セグメントの一部、及び水平細胞またはアマクリン細胞の時折の標識のみに強力なＴＰＰ１免疫反応性が存在した（１×１０１１ＧＣ／眼でより明らかであった）。１×１０１２ＧＣ／眼では好対照で、網膜の深さ全体にわたって強力なＴＰＰ１免疫反応性が観察された（図８）。１×１０１２ＧＣ／眼では、ＴＰＰ１免疫染色は、網膜神経節細胞及び他の２つの用量のいずれよりもはるかに高い割合の光受容体細胞を含む、存在する全てのタイプのニューロンを標識するように見えた。用量にかかわらず、網膜内のＴＰＰ１免疫反応性は、網膜下ベクター堆積物が配置された場所に隣接していても、ミュラーグリア細胞の明らかな染色を伴わないニューロンに限定されているように見えた。
【0304】
ＴＰＰ１染色網膜の％面積は、ビヒクルで処置した動物に存在するものよりも、コンストラクトＩで処置した動物において大きかった（図９）。
【0305】
６．３．３ 結論：
１×１０１０ＧＣ／眼の用量は、未処置のカニクイザルにおけるＴＰＰ１の濃度よりもおよそ１７０倍（房水）及び２００倍（硝子体液）高いＴＰＰ１濃度をもたらした。
１×１０１０ＧＣ／眼の用量は、未処置のカニクイザルにおけるＴＰＰ１の濃度よりもおよそ１７０倍（房水）及び２００倍（硝子体液）高いＴＰＰ１濃度をもたらした。
【0306】
免疫染色は、網膜色素上皮内及びある割合の光受容体の外側セグメントにおいて強力なＴＰＰ１免疫反応性を示し、１×１０１０ＧＣ／眼では、水平細胞またはアマクリン細胞であると推定される時折の標識のみを伴う。
【0307】
カニクイザルにおいて生成されたデータは、コンストラクトＩの網膜下注射が、ＣＬＮ２患者に見られる網膜変性を減衰させるのに十分なレベルのＴＰＰ１を提供し得ることを実証する。
【0308】
６．４ 実施例４：カニクイザルへのコンストラクトＩの網膜下注射は、好ましい安全性レベルにつながる
本研究の目的は、カニクイザルにおける３か月の毒性研究によって、ヒトＣＬＮ２（ｈＣＬＮ２）発現カセットを含有する血清型９（ＡＡＶ９）の組換えアデノ随伴ウイルスであるコンストラクトＩの安全性を評価することであった。毒性研究の標準エンドポイントに加えて、この研究には眼の生理学的変化の評価が含まれていた。幼若毒性、生殖毒性、及び遺伝毒性もまた、ＣＬＮ２疾患の小児における高い未充足の臨床ニーズを考慮して議論された。
本研究の目的は、カニクイザルにおける３か月の毒性研究によって、ヒトＣＬＮ２（ｈＣＬＮ２）発現カセットを含有する血清型９（ＡＡＶ９）の組換えアデノ随伴ウイルスであるコンストラクトＩの安全性を評価することであった。毒性研究の標準エンドポイントに加えて、この研究には眼の生理学的変化の評価が含まれていた。幼若毒性、生殖毒性、及び遺伝毒性もまた、ＣＬＮ２疾患の小児における高い未充足の臨床ニーズを考慮して議論された。
【0309】
６．４．１ 方法
カニクイザルの群に、１×１０１０～１×１０１３ＧＣ／眼の範囲の用量での網膜下注射によってコンストラクトＩを投与した。血清中のトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）濃度、房水及び硝子体液、ならびに生体内分布を評価して、導入遺伝子発現を確認した。研究中の眼は、直接及び間接眼底検査、ＯＣＴ、網膜電図、眼底写真、及び組織病理学によって検査した。効果を、最大３か月にわたって評価した。２～３歳の若いカニクイザルを研究に含めた。
カニクイザルの群に、１×１０１０～１×１０１３ＧＣ／眼の範囲の用量での網膜下注射によってコンストラクトＩを投与した。血清中のトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）濃度、房水及び硝子体液、ならびに生体内分布を評価して、導入遺伝子発現を確認した。研究中の眼は、直接及び間接眼底検査、ＯＣＴ、網膜電図、眼底写真、及び組織病理学によって検査した。効果を、最大３か月にわたって評価した。２～３歳の若いカニクイザルを研究に含めた。
【0310】
６．４．２ 結果
カニクイザルへのコンストラクトＩの網膜下注射は、ＴＰＰ１の生体内分布の上昇及び持続レベルを示し、この研究では、正常な導入遺伝子発現を示した。
カニクイザルへのコンストラクトＩの網膜下注射は、ＴＰＰ１の生体内分布の上昇及び持続レベルを示し、この研究では、正常な導入遺伝子発現を示した。
【0311】
結果は、１×１０１０ＧＣ／眼の用量が、この研究の無観察有害作用レベル（ＮＯＡＥＬ）であることを示唆した。有害作用または所見には、眼の炎症、ＯＣＴ及び眼底写真所見、ならびに視覚機能の低下が含まれた。
【0312】
雄及び／または雌カニクイザルへの１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、または１×１０１３ＧＣ／眼のコンストラクトＩの網膜下投与は、用量≧１×１０１１ＧＣ／眼での有害所見に関連していた。１×１０１１または１×１０１２ＧＣ／眼の用量では、水性細胞、硝子体混濁、または硝子体細胞において観察された眼の炎症は、最高用量で観察されたものよりも重症度が低かった。また、より低い用量（例えば、１×１０１１または１×１０１２ＧＣ／眼）で観察された眼の炎症は、全身及び／または局所抗炎症療法に良好に応答した。
【0313】
１×１０１０ＧＣ／眼で観察された時折の硝子体細胞の炎症は、有害作用とはみなされなかった。１×１０１０ＧＣ／眼では、２２日目までに時折の硝子体細胞の炎症の重症度が低下したが、一部の眼では３か月間持続した。１匹の動物は、重度の水性細胞、中程度に重度のフレア、及び中程度に重度の硝子体混濁を伴うより重度の炎症を示した。しかしながら、これは１５日目にのみ片眼で観察され、局所抗炎症療法が適用された。１×１０１０ＧＣ／眼用量では、眼底カラー写真、ＥＲＧ、または視覚誘発電位に対するベクター関連の影響は観察されなかったため、顕微鏡評価に関する研究の最後に、片眼において最小限の単核細胞浸潤が観察されたにもかかわらず、硝子体細胞の炎症が視覚機能への影響と相関しなかったことが実証された。これは、１×１０１０ＧＣ／眼での時折の硝子体細胞の炎症が、視覚機能に影響を及ぼさず、軽度のレベル内で制御され得ることを示唆した。
【0314】
カニクイザルでは、３か月の毒性研究を通じて、神経行動、呼吸器、または顕微鏡的（心血管）変化は観察されなかった。
【0315】
１×１０１０ＧＣ／眼用量での生殖器系への影響を示唆する所見はなかった。ベクターＤＮＡは、１×１０１０ＧＣ／眼の用量までの全ての動物の精巣または卵巣において検出されなかった。対照的に、ベクターＤＮＡは、同じ用量下で、２９日目及び９２日目の眼組織において主に検出された。この区別は、１×１０１０ＧＣ／眼が、その中の検出不能なベクターＤＮＡレベルのために生殖系にとって安全であり得ることを支持する。
【0316】
用量≧１×１０１１ＧＣ／眼での非常に低いコピー数でのベクターＤＮＡの存在は、生殖系への影響を示唆しなかった。１×１０１１ＧＣを網膜下に投与した１匹の雄及び１．０×１０１２ＧＣ／眼を網膜下に投与した１匹の雄において、ベクターＤＮＡは、９２日目に、それぞれ３４０及び１０９コピー／μｇのＤＮＡである非常に低いレベルで精巣において検出された。１×１０１２ＧＣ／眼で脈絡膜上腔（ＳＣＳ）に投与された１匹の雌では、２９日目に卵巣において３４４コピー／μｇのＤＮＡが検出された。精巣及び卵巣における顕微鏡的な変化は観察されなかった。生殖系におけるかかる変化の欠如は、非常に低いＤＮＡコピーが、研究における最高用量までの用量が≧１×１０１１ＧＣ／眼であっても、有害作用とみなされ得ないことを示唆する。
【0317】
コンストラクトＩは、遺伝毒性のリスクが低い場合がある。入手可能な科学文献及び臨床データは、ＡＡＶベクターの統合が観察されていないことを報告している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１９，１８：３５８－３７８）。野生型ＡＡＶの統合機構がなければ、コンストラクトＩは、形質導入細胞内で複製することができない。最近承認されたＡＡＶ９、ｏｎａｓｅｍｎｏｇｅｎｅ ａｂｅｐａｒｖｏｖｅｃ－ｘｉｏｉ（ＺＯＬＧＥＮＳＭＡ ＵＳＰＩ，２０１９）は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が挿入変異原性のリスクが低いことを支持している。
【0318】
コンストラクトＩを用いた免疫毒性研究は、免疫応答によって評価され得る。この研究では、体液性応答は、ＡＡＶ９キャプシドに対する抗体、及び導入遺伝子産物、すなわち、カニクイザルにおける抗ＴＰＰ１抗体に対して指向された抗体の検出によってモニターされた。
【0319】
コンストラクトＩの幼若毒性は、２～３歳のカニクイザルにおいて評価することができる。欧州医薬品庁のガイドラインによると、この年齢範囲はおそらく思春期前のサルを対象としているため、評価には妊娠年齢が含まれている（ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＳＷＰ／１６９２１５／２００５）。
【0320】
６．４．３ 結論
１×１０１０ＧＣ／眼の用量レベルは、この実施例では、カニクイザルへのコンストラクトＩの網膜下投与のためのＮＯＡＥＬであった。臨床研究では、２×１０１０ＧＣ／眼の開始用量レベルをＮＯＡＥＬとして実施してもよい。１×１０１１または１×１０１２ＧＣ／眼の用量で観察された眼の炎症は、全身性及び／または局所抗炎症療法に良好に応答した。
１×１０１０ＧＣ／眼の用量レベルは、この実施例では、カニクイザルへのコンストラクトＩの網膜下投与のためのＮＯＡＥＬであった。臨床研究では、２×１０１０ＧＣ／眼の開始用量レベルをＮＯＡＥＬとして実施してもよい。１×１０１１または１×１０１２ＧＣ／眼の用量で観察された眼の炎症は、全身性及び／または局所抗炎症療法に良好に応答した。
【0321】
カニクイザルにおける３か月の毒性研究から生成されたデータは、コンストラクトＩの網膜下投与が好ましい安全性プロファイルを提供し得ることを実証する。コンストラクトＩのＳＲまたはＳＣＳ投与後、神経行動、呼吸器、または顕微鏡的変化は記載されなかった。特定の幼若毒性、生殖毒性、または遺伝毒性は観察されなかった。
【0322】
６．５ 実施例５：ＣＬＮ２疾患の網膜チップモデルにおけるコンストラクトＩの評価
本研究の目的は、網膜チップ（ＲｏＣ）モデルにおいてヒト誘導多能性幹細胞株（ｈｉＰＳＣ）網膜オルガノイド（ＲＯ）とｈｉＰＳＣ ＲＰＥとを組み合わせることによって、ＣＬＮ２疾患におけるヒト網膜の生理学的に関連する三次元インビトロモデルを開発することであった。この新規の生体模倣プラットフォームにより、増強された内側及び外側のセグメントの形成及び保存、ＲＰＥと光受容体との間の直接的な相互作用、ならびに正確に制御可能な血管系のような灌流が可能になる。動物モデルでは不可能であるか、またはＣＬＮ２の小児では理解されない疾患表現型を特性評価することと同様に、このモデルは、コンストラクトＩの作用機序及び潜在的な有益性に対する支持を提供する。
本研究の目的は、網膜チップ（ＲｏＣ）モデルにおいてヒト誘導多能性幹細胞株（ｈｉＰＳＣ）網膜オルガノイド（ＲＯ）とｈｉＰＳＣ ＲＰＥとを組み合わせることによって、ＣＬＮ２疾患におけるヒト網膜の生理学的に関連する三次元インビトロモデルを開発することであった。この新規の生体模倣プラットフォームにより、増強された内側及び外側のセグメントの形成及び保存、ＲＰＥと光受容体との間の直接的な相互作用、ならびに正確に制御可能な血管系のような灌流が可能になる。動物モデルでは不可能であるか、またはＣＬＮ２の小児では理解されない疾患表現型を特性評価することと同様に、このモデルは、コンストラクトＩの作用機序及び潜在的な有益性に対する支持を提供する。
【0323】
６．５．１ 方法
ＣＬＮ２疾患からの死亡前の小児から収集された皮膚線維芽細胞を、ヒト誘導多能性幹細胞株に再プログラムし、Ａｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅＬｉｆｅ ２０１９，８，ｅ４６１８８（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＲＰＥ及び網膜オルガノイド（ＲＯ）に分化した。
ＣＬＮ２疾患からの死亡前の小児から収集された皮膚線維芽細胞を、ヒト誘導多能性幹細胞株に再プログラムし、Ａｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅＬｉｆｅ ２０１９，８，ｅ４６１８８（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＲＰＥ及び網膜オルガノイド（ＲＯ）に分化した。
【0324】
６．５．２ 結果
対照ＲＰＥとは異なり、ＣＬＮ２ ＲＰＥは、ＴＰＰ１を発現しない。ＴＰＰ１発現の回復を、コンストラクトＩによる形質導入の２１日後のＣＬＮ２ ＲＰＥに示した（図１０）。
対照ＲＰＥとは異なり、ＣＬＮ２ ＲＰＥは、ＴＰＰ１を発現しない。ＴＰＰ１発現の回復を、コンストラクトＩによる形質導入の２１日後のＣＬＮ２ ＲＰＥに示した（図１０）。
【0325】
ＲＰＥの単離後、ＲＯを更に成熟させた。光受容体マーカーであるリカバリンは、分化の２００日目に陽性であり、８０日目に非存在であった。対照株では、ＴＰＰ１発現は、２００日目のＲＯにおいて、主に光受容体の領域においてのみ検出され、ＴＰＰ１発現の空間的及び時間的特異性を示唆した。興味深いことに、ＣＬＮ２で同定された蓄積された基質のうちの１つであるＡＴＰシンターゼサブユニットＣ（ＳＣＭＡＳ）は、対照ＲＯでＴＰＰ１発現が検出される光受容体の領域において、２００日目にのみＣＬＮ２ ＲＯ中に存在した（図１１）。
【0326】
ＳＣＭＡＳ蓄積の検出前の８８日目のコンストラクトＩによるＣＬＮ２ ＲＯの処置は、未処置のＣＬＮ２ ＲＯとは対照的に、予防ＳＣＭＡＳ蓄積とともにＴＰＰ１発現を示し、早期介入がＲＯにおける貯蔵物質の蓄積を遅らせるかまたは防止することができることを示唆した（図１２）。
【0327】
６．５．３ 結論
コンストラクトＩを用いてヒトＣＬＮ２ ＲＰＥにおいて生成されたデータは、ヒトＣＬＮ２ ＲＰＥ及びＲＯがＴＰＰ１を欠くことを示し、コンストラクトＩを用いた処置は、処置後にＴＰＰ１の発現を回復することができる。更に、ＣＬＮ２ ＲＯを未処置のまま放置すると、ＣＬＮ２疾患の特徴であるＳＣＭＡＳの蓄積があり、これは、コンストラクトＩによる前処置によって防止された。このデータは、コンストラクトＩによるＲＯ（光受容体を含む）の形質導入が、ＣＬＮ２変性に関連するリソソーム貯蔵物質の蓄積を防止することを示す。
コンストラクトＩを用いてヒトＣＬＮ２ ＲＰＥにおいて生成されたデータは、ヒトＣＬＮ２ ＲＰＥ及びＲＯがＴＰＰ１を欠くことを示し、コンストラクトＩを用いた処置は、処置後にＴＰＰ１の発現を回復することができる。更に、ＣＬＮ２ ＲＯを未処置のまま放置すると、ＣＬＮ２疾患の特徴であるＳＣＭＡＳの蓄積があり、これは、コンストラクトＩによる前処置によって防止された。このデータは、コンストラクトＩによるＲＯ（光受容体を含む）の形質導入が、ＣＬＮ２変性に関連するリソソーム貯蔵物質の蓄積を防止することを示す。
【0328】
６．６ 実施例６：ＣＬＮ２疾患の網膜チップモデルにおけるコンストラクトＩの評価のためのプロトコル
本研究の目的は、ヒトＣＬＮ２（ｈＣＬＮ２）発現カセットを含有する血清型９（ＡＡＶ９）の組換えアデノ随伴ウイルスであるコンストラクトＩの、網膜チップモデルを使用してヒト対象におけるＣＬＮ２の眼症状を処置する際の有効性を評価することである。
本研究の目的は、ヒトＣＬＮ２（ｈＣＬＮ２）発現カセットを含有する血清型９（ＡＡＶ９）の組換えアデノ随伴ウイルスであるコンストラクトＩの、網膜チップモデルを使用してヒト対象におけるＣＬＮ２の眼症状を処置する際の有効性を評価することである。
【0329】
６．６．１ 患者及び対照ｉＰＳＣの網膜オルガノイド（ＲＯ）への分化
４つのヒト誘導多能性幹細胞株（ｉＰＳＣ、２人のＣＬＮ２患者）及び２つの対照株を解凍し、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３，５，４０４７及びＡｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅＬｉｆｅ ２０１９，８，ｅ４６１８８（各々、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の網膜分化プロトコルに従って網膜オルガノイド（ＲＯ）に分化させる。ＲＯは、最小３～６か月間培養される。分化したＲＯから、色素沈着したＲＰＥ細胞塊を手作業で切離することによって採取する。これらのＲＰＥ細胞を分離し、接着培養する。全ての利用可能な株からのＲＰＥ細胞を、使用時まで培養または凍結する。
４つのヒト誘導多能性幹細胞株（ｉＰＳＣ、２人のＣＬＮ２患者）及び２つの対照株を解凍し、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３，５，４０４７及びＡｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅＬｉｆｅ ２０１９，８，ｅ４６１８８（各々、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の網膜分化プロトコルに従って網膜オルガノイド（ＲＯ）に分化させる。ＲＯは、最小３～６か月間培養される。分化したＲＯから、色素沈着したＲＰＥ細胞塊を手作業で切離することによって採取する。これらのＲＰＥ細胞を分離し、接着培養する。全ての利用可能な株からのＲＰＥ細胞を、使用時まで培養または凍結する。
【0330】
６．６．２ コンストラクトＩによる網膜オルガノイドの処置
セクション６．６．１で産生された利用可能な株の８０日目のＲＯは、内部品質基準（例えば、セグメントの形成、上皮線状痕、大きな壊死領域の非存在）に従って選択される。
セクション６．６．１で産生された利用可能な株の８０日目のＲＯは、内部品質基準（例えば、セグメントの形成、上皮線状痕、大きな壊死領域の非存在）に従って選択される。
【0331】
選択したオルガノイドを、例えば、９６ウェルフォーマットに入れ、コンストラクトＩに供する。このために、３つの異なる濃度を利用可能な患者株に適用する。更に、１つの濃度の空のＡＡＶを１つの患者株に適用して、ＴＰＰ１遺伝子発現効果の特異性を評価する。細胞に対する治療法の効果は、コンストラクトＩの最初の添加の５週間後にモニターする。エンドポイント法は、ｑＰＣＲを介したＲＮＡ分析（条件当たり４つの生物学的複製）及び免疫細胞化学を介したタンパク質分析（条件当たり１０試料）を含む。ＲＯは、異なる網膜細胞型マーカー、リソソームマーカー（例えば、ＬＡＭＰ１またはＬＡＭＰ２）、ＴＰＰ１発現及びミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットＣ（ＳＣＭＡＳ）について染色される。
【0332】
前述の手順を、１２０日目にＲＯで繰り返す。
【0333】
６．６．３ コンストラクトＩによる網膜チップの処置
網膜チップ（ＲｏＣ）実験では、全ての利用可能な株からの８０日目及び１２０日目のＲＯは、セクション６．６．２に適用されるのと同じ基準で選択される。セクション６．６．１において産生された利用可能な株のＲＰＥは、内部品質基準（継代、培養時間、色素沈着、六角形の細胞形状及び一般的な外観）に従って選択される。３つの異なる濃度のコンストラクトＩならびにビヒクル対照が、利用可能な患者株に適用される。ＲｏＣに対する治療法の効果は、コンストラクトＩの最初の添加の５週間後にモニターする。エンドポイント法は、ｑＰＣＲを介したＲＮＡ分析、及び凍結切片作製を介したタンパク質分析、続いて免疫細胞化学（条件当たり８試料）を含む。異なる網膜細胞型マーカー、リソソームマーカー（例えば、ＬＡＭＰ１またはＬＡＭＰ２）、ＴＰＰ１発現及びＳＣＭＡＳについて、ＲｏＣを染色する。
網膜チップ（ＲｏＣ）実験では、全ての利用可能な株からの８０日目及び１２０日目のＲＯは、セクション６．６．２に適用されるのと同じ基準で選択される。セクション６．６．１において産生された利用可能な株のＲＰＥは、内部品質基準（継代、培養時間、色素沈着、六角形の細胞形状及び一般的な外観）に従って選択される。３つの異なる濃度のコンストラクトＩならびにビヒクル対照が、利用可能な患者株に適用される。ＲｏＣに対する治療法の効果は、コンストラクトＩの最初の添加の５週間後にモニターする。エンドポイント法は、ｑＰＣＲを介したＲＮＡ分析、及び凍結切片作製を介したタンパク質分析、続いて免疫細胞化学（条件当たり８試料）を含む。異なる網膜細胞型マーカー、リソソームマーカー（例えば、ＬＡＭＰ１またはＬＡＭＰ２）、ＴＰＰ１発現及びＳＣＭＡＳについて、ＲｏＣを染色する。
【0334】
６．７ 実施例７：コンストラクトＩを用いたヒトＲＰＥオルガノイドの処置及びＳＣＭＡＳ蓄積の調査のためのプロトコル
本研究の目的は、ヒトＲＰＥオルガノイドをコンストラクトＩで処置し、ＲＰＥオルガノイド及び網膜オルガノイドにおけるフローサイトメトリー、単細胞ＲＮＡ配列決定、及び高分解能共焦点顕微鏡検査によってＳＣＭＡＳ蓄積を調査することである。
本研究の目的は、ヒトＲＰＥオルガノイドをコンストラクトＩで処置し、ＲＰＥオルガノイド及び網膜オルガノイドにおけるフローサイトメトリー、単細胞ＲＮＡ配列決定、及び高分解能共焦点顕微鏡検査によってＳＣＭＡＳ蓄積を調査することである。
【0335】
６．７．１ 患者及び対照のｉＰＳＣの網膜オルガノイド（ＲＯ）への分化
４つのヒトｉＰＳＣ株、２つの患者株及び２つの対照株を解凍し、セクション６．６．１のように網膜オルガノイド（ＲＯ）に分化させる。分化したＲＯから、色素沈着したＲＰＥ細胞塊を手作業で切離することによって採取する。これらのＲＰＥ細胞を懸濁液中で培養して、ＲＰＥオルガノイドを形成する。
４つのヒトｉＰＳＣ株、２つの患者株及び２つの対照株を解凍し、セクション６．６．１のように網膜オルガノイド（ＲＯ）に分化させる。分化したＲＯから、色素沈着したＲＰＥ細胞塊を手作業で切離することによって採取する。これらのＲＰＥ細胞を懸濁液中で培養して、ＲＰＥオルガノイドを形成する。
【0336】
６．７．２ ＴＰＰ１遺伝子療法による網膜色素上皮細胞オルガノイド（ＲＰＥｏｒｇ）の処置
我々のデータによれば、限られた期間に単層上で培養された接着性ＲＰＥ細胞は、ＡＴＰ－Ｃ堆積物などの疾患表現型を再現するための正確なモデルを表すものではない。一方、ＲＰＥｏｒｇは、それらの３Ｄ構造及び長期培養により、ＴＰＰ１変異効果及びＡＴＰ－Ｃ蓄積を研究するための固体モデルであることが示され、ＲＰＥ細胞におけるＴＰＰ１遺伝子療法の効果を評価するための興味深いプラットフォームとなった。この目的のために、セクション６．７．１で産生された利用可能な株の＞１５０日目（表現型の発症）でのＲＰＥｏｒｇは、内部品質基準（例えば、均一な色素沈着、非ＲＰＥ領域の非存在）に従って選択される。選択したＲＰＥｏｒｇを、例えば、９６ウェルフォーマットに入れ、コンストラクトＩでの処置に供する。細胞に対する治療法の効果は、コンストラクトＩの最初の添加の５週間後にモニターする。エンドポイント法は、ｑＰＣＲを介したＲＮＡ分析（条件当たり４つの生物学的複製）及び免疫細胞化学を介したタンパク質分析（条件当たり１０試料）を含む。ＴＰＰ１発現、ＳＣＭＡＳ及びリソソームマーカー（例えば、ＬＡＭＰ１またはＬＡＭＰ２）についてＲＯを染色する。
我々のデータによれば、限られた期間に単層上で培養された接着性ＲＰＥ細胞は、ＡＴＰ－Ｃ堆積物などの疾患表現型を再現するための正確なモデルを表すものではない。一方、ＲＰＥｏｒｇは、それらの３Ｄ構造及び長期培養により、ＴＰＰ１変異効果及びＡＴＰ－Ｃ蓄積を研究するための固体モデルであることが示され、ＲＰＥ細胞におけるＴＰＰ１遺伝子療法の効果を評価するための興味深いプラットフォームとなった。この目的のために、セクション６．７．１で産生された利用可能な株の＞１５０日目（表現型の発症）でのＲＰＥｏｒｇは、内部品質基準（例えば、均一な色素沈着、非ＲＰＥ領域の非存在）に従って選択される。選択したＲＰＥｏｒｇを、例えば、９６ウェルフォーマットに入れ、コンストラクトＩでの処置に供する。細胞に対する治療法の効果は、コンストラクトＩの最初の添加の５週間後にモニターする。エンドポイント法は、ｑＰＣＲを介したＲＮＡ分析（条件当たり４つの生物学的複製）及び免疫細胞化学を介したタンパク質分析（条件当たり１０試料）を含む。ＴＰＰ１発現、ＳＣＭＡＳ及びリソソームマーカー（例えば、ＬＡＭＰ１またはＬＡＭＰ２）についてＲＯを染色する。
【0337】
６．７．３ ＲＰＥｏｒｇに対するＴＰＰ１変異及びＴＰＰ１遺伝子療法効果の分析
＞１５０日目における２つの対照株、２つの患者株及びある濃度のＴＰＰ１遺伝子療法（例えば、コンストラクトＩ）で処置した２つの患者株からのＲＰＥｏｒｇを、ＡＡＶ処置の５週間後に選択し、解離し、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ）を受ける。ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ評価は、ＳＣＭＡＳ蓄積を含むがこれらに限定されない、遺伝子発現に対するＴＰＰ１変異の効果を決定する。最後に、分析は、ＲＰＥ細胞シグナル伝達、生存及びアポトーシスに対するＴＰＰ１遺伝子療法（例えば、コンストラクトＩ）の結果を特定する。
＞１５０日目における２つの対照株、２つの患者株及びある濃度のＴＰＰ１遺伝子療法（例えば、コンストラクトＩ）で処置した２つの患者株からのＲＰＥｏｒｇを、ＡＡＶ処置の５週間後に選択し、解離し、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ）を受ける。ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ評価は、ＳＣＭＡＳ蓄積を含むがこれらに限定されない、遺伝子発現に対するＴＰＰ１変異の効果を決定する。最後に、分析は、ＲＰＥ細胞シグナル伝達、生存及びアポトーシスに対するＴＰＰ１遺伝子療法（例えば、コンストラクトＩ）の結果を特定する。
【0338】
６．７．４ ＲＯに対するＴＰＰ１変異及びＴＰＰ１遺伝子療法の効果に関する細胞型特異的分析
１２０日目における２つの対照株、２つの患者株及びある濃度のＴＰＰ１遺伝子療法（例えば、コンストラクトＩ）で処置した２つの患者株からのＲＯを、ＡＡＶ処置の５週間後に選択し、解離し、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ）を受ける。この分析は、ＴＰＰ１を発現する網膜細胞型（対照株）、及びＴＰＰ１遺伝子療法によってより効率的に感染される細胞型（患者株）を評価する。更に、ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ評価は、ＳＣＭＡＳ蓄積を含むがこれらに限定されない、遺伝子発現に対するＴＰＰ１変異の効果を決定する。最後に、分析は、細胞シグナル伝達、生存及びアポトーシスに対するＴＰＰ１遺伝子療法の結果を特定する。
１２０日目における２つの対照株、２つの患者株及びある濃度のＴＰＰ１遺伝子療法（例えば、コンストラクトＩ）で処置した２つの患者株からのＲＯを、ＡＡＶ処置の５週間後に選択し、解離し、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ）を受ける。この分析は、ＴＰＰ１を発現する網膜細胞型（対照株）、及びＴＰＰ１遺伝子療法によってより効率的に感染される細胞型（患者株）を評価する。更に、ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ評価は、ＳＣＭＡＳ蓄積を含むがこれらに限定されない、遺伝子発現に対するＴＰＰ１変異の効果を決定する。最後に、分析は、細胞シグナル伝達、生存及びアポトーシスに対するＴＰＰ１遺伝子療法の結果を特定する。
【0339】
６．７．５ ＳＣＭＡＳ蓄積の調査
ＳＣＭＡＳ堆積物の影響を受ける網膜細胞型を同定し、ＴＰＰ１発現／非存在とＳＣＭＡＳとの間の相関を強調するために、ＳＣＭＡＳ、ＴＰＰ１及び各網膜細胞型（ロッド、コーン、ミュラーグリア、水平細胞、アマクリン細胞、双極細胞）についての１つの特異的抗体で染色した後、フローサイトメトリー（ＦＣ）によってＲＯを分析する。
ＳＣＭＡＳ堆積物の影響を受ける網膜細胞型を同定し、ＴＰＰ１発現／非存在とＳＣＭＡＳとの間の相関を強調するために、ＳＣＭＡＳ、ＴＰＰ１及び各網膜細胞型（ロッド、コーン、ミュラーグリア、水平細胞、アマクリン細胞、双極細胞）についての１つの特異的抗体で染色した後、フローサイトメトリー（ＦＣ）によってＲＯを分析する。
【0340】
この目的のために、これらの抗体のＦＣ検出のためのプロトコルが最初に確立される。その後、１２０日目における２つの対照株、２つの患者株及びある濃度のＴＰＰ１遺伝子療法（例えば、コンストラクトＩ）で処置した２つの患者株からの３～５つのＲＯを、ＡＡＶ処置の５週間後に選択し、解離し、ＡＴＰ－Ｃ、ＴＰＰ１、及び各網膜細胞型についての１つの特異的抗体で染色した後にフローサイトメトリー分析を受ける。
【0341】
最後に、ＳＣＭＡＳ蓄積を示す網膜細胞の種類を、高分解能共焦点顕微鏡によって更に分析する。この目的のために、＞１５５日における２つの対照株及び２つの患者株からの３～５つのＲＯを、ＳＣＭＡＳ沈着形態及び細胞局在化の評価のために、ＳＣＭＡＳ及び個々のマーカーまたは網膜サブタイプについて染色する。
【0342】
６．８ 実施例８：拡張されたＣＬＮ２臨床評定スケール運動（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ）は、歩行機能の評価を改善する。
後期幼児神経セロイドリポフスチン症２（ＣＬＮ２）疾患では、疾患の急速な進行は、元々ハンブルクＣＬＮ２スケールを使用して定量化された。その後、ハンブルクモータードメインをＣＬＮ２臨床評価スケール運動（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｍ）に適合させ、セリポナーゼアルファ心室内酵素置換療法（ＥＲＴ）に対する治療応答と比較して、自然疾患経過における運動機能の喪失を定量化するために使用した。ＣＬＮ２疾患の障害には、運動失調、緊張低下、過緊張、及び虚弱が含まれる。しかしながら、小児では、小児の疾患進行が遅いため、ＥＲＴ上で進化する表現型は知覚されにくい。
後期幼児神経セロイドリポフスチン症２（ＣＬＮ２）疾患では、疾患の急速な進行は、元々ハンブルクＣＬＮ２スケールを使用して定量化された。その後、ハンブルクモータードメインをＣＬＮ２臨床評価スケール運動（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｍ）に適合させ、セリポナーゼアルファ心室内酵素置換療法（ＥＲＴ）に対する治療応答と比較して、自然疾患経過における運動機能の喪失を定量化するために使用した。ＣＬＮ２疾患の障害には、運動失調、緊張低下、過緊張、及び虚弱が含まれる。しかしながら、小児では、小児の疾患進行が遅いため、ＥＲＴ上で進化する表現型は知覚されにくい。
【0343】
この研究の目的は、ＣＬＮ２－ＣＲＳ－ＭＸと呼ばれるより広範かつより粒度の高い測定を提供して、ＣＬＮ２疾患の障害が歩行能力に及ぼす影響を評価することであった。
【0344】
６．８．１ 方法
項目の導出は、目的の主要なＣＬＮ２疾患概念の特定に基づいていた。
項目の導出は、目的の主要なＣＬＮ２疾患概念の特定に基づいていた。
【0345】
主要な概念は、的を絞った文献レビュー、臨床医専門家インタビュー、２つのバーチャル介護者フォーカスグループ、及び６人のＣＬＮ２臨床医専門家との１年間の進行中の隔週会議から特定された。
【0346】
臨床医のインタビュー及び介護者フォーカスグループでは、特に運動機能に関連するＣＬＮ２の主な症状及び影響、ＥＲＴ処置及びＥＲＴ未処置の患者における疾患進行の差異、及びＣＬＮ２ ＣＲＳにおける運動機能評価の粒度を改善して臨床治験での治療効果を評価するためにより有用にする方法について議論した。
【0347】
反復開発プロセスには、パイロットアプリケーション及び多数の項目改訂が含まれた。追跡マトリックスを使用して、全てのスケール反復及び変更の根拠を文書化した。
【0348】
評定者間の信頼性、すなわち、臨床医間の合意のレベルは、４人の評定者間の合意のパーセントとして計算された。
【0349】
評価は一次臨床医によって投与され、スコアリングされ、観察者臨床医によっても独立してスコアリングされた。
【0350】
各評価はビデオ撮影され、２人の追加の臨床医によって独立してスコアリングされた。
【0351】
生後２０か月～１６歳（平均７．８歳）の３０人の患者は、各々ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸスケールで４人の臨床医によってスコアリングされた。現在は、全員がＥＲＴを受けている。
【0352】
６．８．２ 結果
この研究では、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸスケールの詳細な管理、スコアリング、及びトレーニングマニュアルが開発された。
この研究では、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸスケールの詳細な管理、スコアリング、及びトレーニングマニュアルが開発された。
【0353】
この研究では、症状の進行を決定するための典型的な歩行タスクが開発された。一般に、臨床医及び介護者は、歩行に有害な影響を与える症状の著しい進行によってＣＬＮ２疾患を特性評価した。体幹緊張低下、四肢過緊張及び運動失調は、運動機能に影響を及ぼす症状が一般的に報告されていた。症状が悪化するにつれて、患者がもはや歩くことができなくなるまで、援助、例えば、バランスのために片手、両手または胴体を握ることの必要性の増加が報告された。本研究では、臨床医は、元のＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｍの１０歩歩行タスクを、歩行距離を延ばし、安全に停止する能力を考慮し、方向の変化を評価し、歩行に必要な支援のレベルを測定する歩行タスクに拡張することを支持した。
【0354】
【0355】
評定者間の合意では、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸの臨床医間の合意レベルは１．０であり、完全／完璧な合意を示す（Ｌａｎｄｉｓ，ＪＲ，Ｋｏｃｈ，ＧＧ．Ａｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｋａｐｐａ－ｔｙｐｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｊｏｒｉｔｙ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｂｓｅｒｖｅｒｓ，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，１９７７．Ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｒａｎｇｅ ０．８１－０．９９を参照されたい）。
【0356】
６．８．３ 結論
ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸは、より高い粒度、改善された項目関連性を提供し、歩行能力に対するＣＬＮ２疾患の影響の測定における応答選択肢の数を増加させた。
ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸは、より高い粒度、改善された項目関連性を提供し、歩行能力に対するＣＬＮ２疾患の影響の測定における応答選択肢の数を増加させた。
【0357】
このスケールは、ＣＬＮ２を有する小児向けに設計されたが、同様の疾患障害とともに存在する他の神経筋または神経変性障害に関連する可能性がある。
【0358】
６．９ 実施例９：拡張されたＣＬＮ２臨床評定スケール言語（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ）は、言語機能の評価を改善する
ＥＲＴでの治療応答と比較した自然なＣＬＮ２疾患経過における言語機能の喪失を、ＣＬＮ２臨床評価スケール言語（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｌ）を使用して定量化した。しかしながら、ＥＲＴ処置における小児に疾患の進行及び表現型の進化は遅く、知覚されにくい。本研究の目的は、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸと呼ばれるより広範かつより粒度の高い測定を提供し、表現言語及び非言語コミュニケーション能力の変化を捕捉することであった。
ＥＲＴでの治療応答と比較した自然なＣＬＮ２疾患経過における言語機能の喪失を、ＣＬＮ２臨床評価スケール言語（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｌ）を使用して定量化した。しかしながら、ＥＲＴ処置における小児に疾患の進行及び表現型の進化は遅く、知覚されにくい。本研究の目的は、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸと呼ばれるより広範かつより粒度の高い測定を提供し、表現言語及び非言語コミュニケーション能力の変化を捕捉することであった。
【0359】
６．９．１ 方法
項目の導出は、目的の主要なＣＬＮ２疾患概念の特定に基づいていた。
項目の導出は、目的の主要なＣＬＮ２疾患概念の特定に基づいていた。
【0360】
主要なＣＬＮ２疾患概念は、的を絞った文献レビュー［資料において特定されない］、臨床医専門家インタビュー、２つのバーチャル介護者フォーカスグループ、及び６人のＣＬＮ２臨床医専門家との１年間の進行中の隔週会議から特定された。
【0361】
臨床医のインタビュー及び介護者フォーカスグループでは、特に言語機能に関連するＣＬＮ２の主な症状及び影響、ＥＲＴ処置及びＥＲＴ未処置の患者における疾患進行の差異、及びＣＬＮ２ ＣＲＳにおける言語機能評価の粒度を改善して臨床治験での治療効果を評価するためにより有用にする方法について議論した。
【0362】
反復開発プロセスには、パイロットアプリケーション及び多数の項目改訂が含まれた。追跡マトリックスを使用して、全てのスケール反復及び変更の根拠を文書化した。
【0363】
評定者間の信頼性、すなわち、臨床医間の合意のレベルは、４人の評定者間の合意のパーセントとして計算された。
【0364】
評価は一次臨床医によって投与され、スコアリングされ、観察者臨床医によっても独立してスコアリングされた。
【0365】
各評価はビデオ撮影され、２人の追加の臨床医によって独立してスコアリングされた。
【0366】
生後２０か月～１６歳（平均７．８歳）の３０人の患者は、各々ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸで４人の臨床医によりスコアリングされた。現在は、全員がＥＲＴを受けている。
【0367】
６．９．２ 結果
この研究では、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸの詳細な管理、スコアリング、及びトレーニングマニュアルが開発された。このマニュアルには、表現言語及び非言語コミュニケーション能力を決定するためのプロンプトの使用に関する具体的なガイダンスが含まれる。
この研究では、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸの詳細な管理、スコアリング、及びトレーニングマニュアルが開発された。このマニュアルには、表現言語及び非言語コミュニケーション能力を決定するためのプロンプトの使用に関する具体的なガイダンスが含まれる。
【0368】
ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸは、喃語、語彙及びフレーズの発達、ならびに理解できない発声及びジェスチャーを含む、要求及び必要性を伝える小児の表現言語能力を測定した。一般に、臨床医及び介護者は、ＣＬＮ２を有する小児が、日常活動に影響を及ぼす進行性言語喪失を経験することを報告した。彼らは、２～３．５歳の年齢範囲で２０～１００単語のピーク単語数を報告し、ＣＬＮ２を有する小児は、単一の単語及び２単語フレーズ、理解できない発声及びジェスチャーを含む、一連のコミュニケーション戦略を使用したことを報告した。本研究では、臨床医は、年齢により機能的期待を区別し、より多くの応答選択肢を含み、語彙及びフレーズの発達、発声及びジェスチャーを考慮した言語のための拡張されたＣＬＮ２ ＣＲＳの開発を支持した。
【0369】
評定基準の概要及び元のＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｌとの比較を表３及び４に提供する。スコアリングフローチャートは、各ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ年齢カテゴリー（１～２歳未満、２～３歳未満及び３歳以上）について作成した。図３は、例として２～３歳未満のフローチャートを示す。
【表4】
【表5】
【0370】
評定者間の合意では、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸの臨床医間の合意レベルは０．９３３であり、完全／完璧な合意を示す（Ｌａｎｄｉｓ，ＪＲ，Ｋｏｃｈ，ＧＧ．Ａｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｋａｐｐａ－ｔｙｐｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｊｏｒｉｔｙ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｂｓｅｒｖｅｒｓ，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，１９７７．Ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｒａｎｇｅ ０．８１－０．９９を参照されたい）。
【0371】
６．９．３ 結論
ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸは、より高い粒度を提供し、項目の関連性を改善し、表現言語及び非言語的コミュニケーション能力に対するＣＬＮ２疾患の影響の測定における応答選択肢の数を増加させた。
ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸは、より高い粒度を提供し、項目の関連性を改善し、表現言語及び非言語的コミュニケーション能力に対するＣＬＮ２疾患の影響の測定における応答選択肢の数を増加させた。
【0372】
このスケールは、ＣＬＮ２を有する小児向けに特異的に設計されたが、同様の疾患障害とともに存在する他の神経筋または神経変性障害に関連する可能性がある。
【0373】
等価物
本発明を、その特定の実施形態を参照しながら詳細に説明しているが、機能的に等価である変更が、本発明の範囲内であることは理解されるだろう。実際、本明細書に示す及び記載するものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。当業者は、単に慣習的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本発明を、その特定の実施形態を参照しながら詳細に説明しているが、機能的に等価である変更が、本発明の範囲内であることは理解されるだろう。実際、本明細書に示す及び記載するものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。当業者は、単に慣習的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【0374】
本明細書で言及されている刊行物、特許及び特許出願はいずれも、個々の刊行物、特許及び特許出願が参照によりその全体が本明細書に組み込まれることが具体的及び個々に記された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】