知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2023-544817ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム効率化のためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-25
(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム効率化のためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20231018BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20231018BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20231018BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20231018BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20231018BHJP
C12N 15/863 20060101ALI20231018BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20231018BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/09 110
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N15/861 Z
C12N15/863 Z
C12N15/85 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521464
(86)(22)【出願日】2021-10-08
(85)【翻訳文提出日】2023-06-05
(86)【国際出願番号】 KR2021013923
(87)【国際公開番号】W WO2022075813
(87)【国際公開日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】10-2020-0129937
(32)【優先日】2020-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0185528
(32)【優先日】2020-12-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0051552
(32)【優先日】2021-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522127357
【氏名又は名称】ゲンコレ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヨン－サム
(72)【発明者】
【氏名】キム、ド ヨン
(57)【要約】
【要約】
本明細書では従来技術の限界点を克服して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集活性を高めるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡの構造の一部を変形したものである。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはその構成のうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する役割をするスキャフォールド領域の少なくとも一部が変形されたことを特徴とする。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域とは異なることを特徴とする。
本明細書では従来技術の限界点を克服して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集活性を高めるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡの構造の一部を変形したものである。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはその構成のうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する役割をするスキャフォールド領域の少なくとも一部が変形されたことを特徴とする。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域とは異なることを特徴とする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項2】
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；および
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＧＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＧＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＧＡＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３００）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＧＡＡＡＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＧＡＡＡＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１３）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１４）からなる群から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項3】
前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結される、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項4】
前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結される、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項5】
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：エンジニアリングされたスキャフォールド；および
スペーサー、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'で表現される第１配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３３）で表現される第４配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
【請求項6】
前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'である、請求項５に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項7】
前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＧＡＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡ－３'（配列番号４２５）、５'－ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２６）、５'－ＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２７）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２８）からなる群から選択される、請求項５に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項8】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＧＡ－３'、５'－ＡＧＡ－３'、５'－ＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３７）からなる群から選択された第９配列を追加的に含み、前記第９配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されている、請求項５に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項9】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は、５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）、および５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）からなる群から選択された第１０配列、および
５'－Ｕ－３'、５'－ＣＵ－３'、５'－ＡＣＵ－３'、５'－ＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）、５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）、および５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）からなる群から選択された第１１配列を追加的に含み、
前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されており、
前記第３配列の３'末端および前記第４配列の５'末端は前記第１１配列を通じて連結されている、請求項５に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項10】
前記第１０配列が５'－Ａ－３'である場合、前記第１１配列は５'－Ｕ－３'であり、前記第１０配列が５'－ＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'または５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４０）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４４２）であり、
前記第１０配列が５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）である、請求項９に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項11】
前記第１０配列は５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）であり、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）である、請求項１０に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項12】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は、５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１２配列、および
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１３配列を追加的に含み、
この時、前記第６配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１２配列を通じて連結され、
前記リンカーの３'末端および前記第７配列の５'末端は前記第１３配列を通じて連結されている、請求項５に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項13】
前記第１２配列が５'－Ｕ－３'である場合、前記第１３配列は５'－Ａ－３'であり、前記第１２配列が５'－ＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'である、請求項１２に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項14】
次を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次の配列を含む：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列、
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列、
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１４）からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されており、
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列が５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、および前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列が５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合は除外される。
【請求項15】
次を含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項16】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結された、請求項１５に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項17】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結された、請求項１５に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項18】
次を含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
請求項５～請求項１３のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項19】
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項20】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結された、請求項１９に記載のベクター：５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項21】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結された、請求項１９に記載のベクター：５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項22】
前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上である、請求項１９に記載のベクター。
【請求項23】
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
請求項５～請求項１３のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列。
【請求項24】
次を含む、細胞内で標的核酸を編集する方法：Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項25】
次を含む、細胞内で標的核酸を編集する方法：Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；および
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＧＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＧＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＧＡＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３００）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＧＡＡＡＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＧＡＡＡＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１３）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１４）からなる群から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【請求項26】
前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体として細胞内に注入することである、請求項２４または請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むベクターを細胞内に注入することである、請求項２４に記載の方法。
【請求項28】
前記細胞は真核細胞である、請求項２４または請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
次を含む、細胞内で標的核酸を編集する方法：Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および請求項５～請求項１３のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得る。
【請求項31】
請求項１または請求項２のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
【請求項32】
請求項５～請求項１３のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
【請求項33】
請求項１４に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願］
本出願は、２０２０年１０月０８日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１２９９３７号および２０２１年４月２１日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００５１５５２号に対する優先権を主張し、これらの出願それぞれの内容はその全体が参照によって本明細書に含まれる。
本出願は、２０２０年１０月０８日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１２９９３７号および２０２１年４月２１日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００５１５５２号に対する優先権を主張し、これらの出願それぞれの内容はその全体が参照によって本明細書に含まれる。
【0002】
［技術分野］
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムをゲノム編集に使う分野に対する技術を開示する。
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムをゲノム編集に使う分野に対する技術を開示する。
【背景技術】
【0003】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムはＣｌａｓｓ ２、Ｔｙｐｅ Ｖに分類されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））ではじめて古細菌由来のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムに対して明らかになった。その後、後続研究（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．４８、Ｎｏ．９ ５０１７（２０２０））で前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４システムをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムに分類した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは前記Ｃｌａｓｓ ２、Ｔｙｐｅ Ｖに分類されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのうち一つのＳｕｂｔｙｐｅであるＶ－Ｆ１システムに属し、これはＣａｓ１４ａをエフェクタータンパク質として有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムを含む。前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに比べてエフェクタータンパク質の大きさが顕著に小さいという特徴がある。ただし、先行研究（Ｈａｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、ＵＳ ２０２０／０１９０４９４ Ａ１）で明らかになったところでは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムは一本鎖ＤＮＡの切断能力は示すものの、二本鎖ＤＮＡに対しては切断活性がないか、極めて低いためゲノム編集技術に応用するのに限界があった。
【0004】
継続された研究により最近の先行文献（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムでＣａｓ１２ｆ１タンパク質が二量体（ｄｉｍｅｒ）を形成するという事実、およびガイドＲＮＡの構造に対して明らかにした。前記先行文献によってガイドＲＮＡ部分のうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と直接的に相互作用しない、いわゆるｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎがあるということが明らかになったし、さらに他の先行文献（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｆ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０））では前記ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎ部分を除去してｉｎ ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮＡの切断効率を考察したことがある。
【0005】
しかし、前記先行研究は１）細胞内ゲノム編集活性（例えば、ｉｎｄｅｌ発生効率）を示したりこれを高める方案に対する研究ではなく、２）ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを除去した実験はあるが、かえって切断活性が低くなると報告されたし、３）さらに、前記実験はｉｎ ｖｉｔｒｏで進めた実験であって、細胞内ゲノム編集活性を示したり、効率を上げるための変形が何であるかを明らかにするには失敗した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに使われてゲノム編集効率を増加させることができるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供しようとする。
【0007】
本明細書では前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれてゲノム編集効率を増加させることができるエンジニアリングされたスキャフォールド領域を提供しようとする。
【0008】
本明細書では、ゲノム編集効率が増加したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を提供しようとする。
【0009】
本明細書では、ゲノム編集効率が増加したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを提供しようとする。
【0010】
本明細書では前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を暗号化する核酸を有するベクターを提供しようとする。
【0011】
本明細書では前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使ったゲノム編集方法を提供しようとする。
【0012】
本明細書では前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの用途を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
一具現例として、本明細書では次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを開示する：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
【0014】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0015】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0016】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0017】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0018】
前記課題を解決するために、本明細書では次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを開示する：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；および
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；および
【0019】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0020】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0021】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0022】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
【0023】
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＧＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＧＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＧＡＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３００）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＧＡＡＡＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＧＡＡＡＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１３）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１４）からなる群から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0024】
一具現例として、本明細書では次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを開示する：
エンジニアリングされたスキャフォールド；および
スペーサー、
エンジニアリングされたスキャフォールド；および
スペーサー、
【0025】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'で表現される第１配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３３）で表現される第４配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
前記スペーサーは１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'で表現される第１配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３３）で表現される第４配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
【0026】
前記課題を解決するために、本明細書では次を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを開示する：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
【0027】
この時、前記スペーサーは１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次の配列を含む：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列、
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列、
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１４）からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次の配列を含む：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列、
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列、
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１４）からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
【0028】
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されており、
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列が５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、および前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列が５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合は除外されることを特徴とする。
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列が５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、および前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列が５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合は除外されることを特徴とする。
【0029】
一具現例として、本明細書では次を含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を開示する：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
【0030】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0031】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0032】
一具現例として、本明細書では次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクターを開示する：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
【0033】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0034】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0035】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0036】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0037】
一具現例として、本明細書では次を含む、細胞内で標的核酸を編集する方法または標的核酸をターゲッティングする方法を開示する：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集されるかターゲッティングされ得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集されるかターゲッティングされ得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
【0038】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0039】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0040】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
【0041】
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0042】
一具現例として、本明細書では次を含む、細胞内で標的核酸を編集する方法または標的核酸をターゲッティングする方法を開示する：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集されるかまたはターゲッティングされ得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；および
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集されるかまたはターゲッティングされ得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；および
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0043】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0044】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0045】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
【0046】
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＧＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＧＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＧＡＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３００）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＧＡＡＡＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＧＡＡＡＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１３）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１４）からなる群から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【発明の効果】
【0047】
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムをゲノム編集に使う場合、自然界で発見されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使う時と比較して高いゲノム編集効率を示す。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】本明細書で開示するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを例示的に示した模式図である。
【図2】実験例２に開示された実施例のうち、ＤＹ２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ １．１～Ｅｘａｍｐｌｅ １．３に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図3】実験例２に開示された実施例のうち、ＤＹ２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ １．７～Ｅｘａｍｐｌｅ １．９に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図4】実験例２に開示された実施例のうち、ＤＹ２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ １．１１～Ｅｘａｍｐｌｅ １．１３に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図5】実験例２に開示された実施例のうち、ＤＹ１０を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ２．１～Ｅｘａｍｐｌｅ ２．３に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図6】実験例２に開示された実施例のうち、ＤＹ１０を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ２．４～Ｅｘａｍｐｌｅ ２．６に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図7】実験例２に開示された実施例のうち、ＤＹ１０を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ２．７～Ｅｘａｍｐｌｅ ２．９に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図8】実験例２に開示された実施例のうち、ＤＹ１０を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ２．１０～Ｅｘａｍｐｌｅ ２．１３に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図9】実験例２に開示された実施例のうち、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ３．１～Ｅｘａｍｐｌｅ ３．３に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図10】実験例２に開示された実施例のうち、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ３．４～Ｅｘａｍｐｌｅ ３．６に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図11】実験例２に開示された実施例のうち、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ３．７～Ｅｘａｍｐｌｅ ３．９に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図12】実験例２に開示された実施例のうち、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ３．１０～Ｅｘａｍｐｌｅ ３．１３に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【図13】実験例２に開示された実施例のうち、ＤＹ２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ １．１３～Ｅｘａｍｐｌｅ １．１４、ＤＹ１０を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ２．１３～Ｅｘａｍｐｌｅ ２．１４、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ３．１３～Ｅｘａｍｐｌｅ ３．１４に対するｉｎｄｅｌ効率の平均を示したグラフである。この時、ＥｘはＥｘａｍｐｌｅ、ＣｏｍｐはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅを示す略語であり、ＣｏｎｔｒｏｌはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１を処理していない陰性対照群を示す。
【発明を実施するための形態】
【0049】
用語の定義
【0050】
約
本明細書で使われる「約」という用語は参照量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度に変わる量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さを意味する。
本明細書で使われる「約」という用語は参照量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度に変わる量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さを意味する。
【0051】
Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ
本明細書で使われるＡ、Ｔ、Ｃ、ＧおよびＵ記号は当業界の通常の技術者が理解する意味で解釈される。文脈および技術によりＤＮＡまたはＲＮＡ上で塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドで適切に解釈され得る。例えば、塩基を意味する場合はそれぞれアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）自体と解釈され得、ヌクレオシドを意味する場合はそれぞれアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）と解釈され得、配列でヌクレオチドを意味する場合は前記それぞれのヌクレオシドを含むヌクレオチドを意味するものと解釈される。
本明細書で使われるＡ、Ｔ、Ｃ、ＧおよびＵ記号は当業界の通常の技術者が理解する意味で解釈される。文脈および技術によりＤＮＡまたはＲＮＡ上で塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドで適切に解釈され得る。例えば、塩基を意味する場合はそれぞれアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）自体と解釈され得、ヌクレオシドを意味する場合はそれぞれアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）と解釈され得、配列でヌクレオチドを意味する場合は前記それぞれのヌクレオシドを含むヌクレオチドを意味するものと解釈される。
【0052】
作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）
本明細書で使われる「作動可能に連結された」という用語は遺伝子発現において、特定の構成が他の構成と連結されて、意図された方式通りに機能できるように連結されていることを意味する。例えば、プロモーター配列が暗号化配列と作動可能に連結されたとする時、前記プロモーターが前記暗号化配列の細胞内での転写および／または発現に影響を及ぼし得るように連結されたことを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「作動可能に連結された」という用語は遺伝子発現において、特定の構成が他の構成と連結されて、意図された方式通りに機能できるように連結されていることを意味する。例えば、プロモーター配列が暗号化配列と作動可能に連結されたとする時、前記プロモーターが前記暗号化配列の細胞内での転写および／または発現に影響を及ぼし得るように連結されたことを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0053】
標的遺伝子または標的核酸
本明細書で使われる「標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）」または「標的核酸（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」は基本的に、ゲノム編集の対象となる細胞内遺伝子、または核酸を意味する。前記標的遺伝子または標的核酸は混用されて使われ得、互いに同一の対象を指称し得る。前記標的遺伝子または標的核酸は別途に記載されない限り、対象細胞が有する固有な遺伝子または核酸、あるいは外部由来の遺伝子または核酸のすべてを意味し得、編集の対象となることができるのであれば特に制限されない。前記標的遺伝子または標的核酸は標的配列または標的配列の隣接部位を含むことができる。前記標的遺伝子または標的核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）」または「標的核酸（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」は基本的に、ゲノム編集の対象となる細胞内遺伝子、または核酸を意味する。前記標的遺伝子または標的核酸は混用されて使われ得、互いに同一の対象を指称し得る。前記標的遺伝子または標的核酸は別途に記載されない限り、対象細胞が有する固有な遺伝子または核酸、あるいは外部由来の遺伝子または核酸のすべてを意味し得、編集の対象となることができるのであれば特に制限されない。前記標的遺伝子または標的核酸は標的配列または標的配列の隣接部位を含むことができる。前記標的遺伝子または標的核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0054】
標的配列または認識配列
本明細書で使われる「標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「認識配列（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が標的遺伝子または標的核酸を切断するために認識する特定配列を意味する。前記標的配列はその目的により適切に選択され得る。具体的には、「標的配列」は前記前述した標的遺伝子または標的核酸内に含まれた配列であり得、本明細書で提供するガイドＲＮＡ、またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれたスペーサー配列と相補性を有する配列を意味する。一般的に、前記スペーサー配列は標的遺伝子または標的核酸の配列およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質が認識するＰＡＭ配列を考慮して決定される。本明細書で、前記標的配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のガイドＲＮＡと相補的に結合する特定の鎖のみを指称し得、前記特定の鎖部分を含む標的二本鎖全体を指称してもよく、これは文脈により適切に解釈される。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「認識配列（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が標的遺伝子または標的核酸を切断するために認識する特定配列を意味する。前記標的配列はその目的により適切に選択され得る。具体的には、「標的配列」は前記前述した標的遺伝子または標的核酸内に含まれた配列であり得、本明細書で提供するガイドＲＮＡ、またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれたスペーサー配列と相補性を有する配列を意味する。一般的に、前記スペーサー配列は標的遺伝子または標的核酸の配列およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質が認識するＰＡＭ配列を考慮して決定される。本明細書で、前記標的配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のガイドＲＮＡと相補的に結合する特定の鎖のみを指称し得、前記特定の鎖部分を含む標的二本鎖全体を指称してもよく、これは文脈により適切に解釈される。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0055】
ベクター
本明細書で使われる「ベクター」は別途に特定されない限り、遺伝物質を細胞内に運搬できるすべての物質を総称するものである。例えば、ベクターは対象となる遺伝物質、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質を暗号化する核酸、および／またはガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＤＮＡ分子であり得るが、これに制限されるものではない。前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「ベクター」は別途に特定されない限り、遺伝物質を細胞内に運搬できるすべての物質を総称するものである。例えば、ベクターは対象となる遺伝物質、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質を暗号化する核酸、および／またはガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＤＮＡ分子であり得るが、これに制限されるものではない。前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0056】
自然界で発見される
本明細書で「自然界で発見される（ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ）」という用語は、自然界で発見される、人為的に変形されていない対象を意味し、人為的な変形が加えられた「エンジニアリングされた対象」と区分するために使われる。前記「自然界で発見される」遺伝子、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡなどは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ｏｒｉｇｉｎａｌ ｆｏｒｍ）およびｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ（ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）の遺伝子、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡをすべて包括する概念で使われる。前記用語はその他通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈されるべきである。
本明細書で「自然界で発見される（ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ）」という用語は、自然界で発見される、人為的に変形されていない対象を意味し、人為的な変形が加えられた「エンジニアリングされた対象」と区分するために使われる。前記「自然界で発見される」遺伝子、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡなどは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ｏｒｉｇｉｎａｌ ｆｏｒｍ）およびｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ（ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）の遺伝子、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡをすべて包括する概念で使われる。前記用語はその他通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈されるべきである。
【0057】
エンジニアリングされた
本明細書で使われる「エンジニアリングされた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」という用語は、自然界にすでに存在する構成を有する物質、分子などと区分するために使う用語で、前記物質、分子などに人為的な変形が加えられたことを意味する。例えば、「エンジニアリングされたガイドＲＮＡ」の場合、自然界に存在するガイドＲＮＡの構成に人為的な変更が加えられたガイドＲＮＡを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「エンジニアリングされた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」という用語は、自然界にすでに存在する構成を有する物質、分子などと区分するために使う用語で、前記物質、分子などに人為的な変形が加えられたことを意味する。例えば、「エンジニアリングされたガイドＲＮＡ」の場合、自然界に存在するガイドＲＮＡの構成に人為的な変更が加えられたガイドＲＮＡを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0058】
ＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、 ｏｒ Ｓｉｇｎａｌ）
本明細書で「ＮＬＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核外部の物質を核内部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着されて一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。具体的には、前記ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７７）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ－抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２７８）を有するヌクレオプラスミンの二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２７９）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２８０）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２８１）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２８２）；マイオマ（ｍｙｏｍａ）Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２８３）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号２８４）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号２８５）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号２８６）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号２８７）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号２８８）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号２８９）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号２９０）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）重合酵素の配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２９１）；またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号２９２）から由来したＮＬＳ配列であり得るが、これに制限されない。本明細書で使われる「ＮＬＳ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で「ＮＬＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核外部の物質を核内部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着されて一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。具体的には、前記ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７７）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ－抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２７８）を有するヌクレオプラスミンの二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２７９）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２８０）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２８１）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２８２）；マイオマ（ｍｙｏｍａ）Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２８３）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号２８４）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号２８５）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号２８６）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号２８７）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号２８８）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号２８９）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号２９０）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）重合酵素の配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２９１）；またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号２９２）から由来したＮＬＳ配列であり得るが、これに制限されない。本明細書で使われる「ＮＬＳ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0059】
ＮＥＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、 ｏｒ Ｓｉｇｎａｌ）
本明細書で「ＮＥＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核内部の物質を核外部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着されて一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。本明細書で使われる「ＮＥＳ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で「ＮＥＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核内部の物質を核外部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着されて一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。本明細書で使われる「ＮＥＳ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0060】
タグ
本明細書で「タグ」とは、ペプチド、またはタンパク質の輸送、追跡および／または分離精製を容易にするために付加される機能的ドメインを総称するものである。具体的には、前記タグはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグなどのタグタンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＨｃＲＥＤ、ＤｓＲｅｄなどの自家蛍光タンパク質、およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むが、これに制限されるものではない。本明細書で使われる「タグ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で「タグ」とは、ペプチド、またはタンパク質の輸送、追跡および／または分離精製を容易にするために付加される機能的ドメインを総称するものである。具体的には、前記タグはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグなどのタグタンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＨｃＲＥＤ、ＤｓＲｅｄなどの自家蛍光タンパク質、およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むが、これに制限されるものではない。本明細書で使われる「タグ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0061】
背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の構造
【0062】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステム
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムはｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのうちＶ－Ｆサブタイプに属し、これはさらにＶ－Ｆ１～Ｖ－Ｆ３のバリアントに分かれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムは先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））でＣａｓ１４と命名されたエフェクタータンパク質のうち、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、およびＣａｓ１４ｃ変異体を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４システムを含む。この中、Ｃａｓ１４ａエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに分類される（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １８、６７（２０２０））。最近先行研究（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｆ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０））等を通じて前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の構造が明らかになったところ、以下、これについて簡略に叙述する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムはｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのうちＶ－Ｆサブタイプに属し、これはさらにＶ－Ｆ１～Ｖ－Ｆ３のバリアントに分かれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムは先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））でＣａｓ１４と命名されたエフェクタータンパク質のうち、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、およびＣａｓ１４ｃ変異体を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４システムを含む。この中、Ｃａｓ１４ａエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに分類される（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １８、６７（２０２０））。最近先行研究（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｆ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０））等を通じて前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の構造が明らかになったところ、以下、これについて簡略に叙述する。
【0063】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の構造
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は二つの分子が二量体形態でガイドＲＮＡと結合して複合体をなしていることが明らかになった。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はａｍｉｎｏ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ（ＮＴＤ）およびｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍｉｎ（ＣＴＤ）に分かれ、前記二つのドメインがリンカーループ（ｌｉｎｋｅｒ ｌｏｏｐ）を通じて連結されている構造である。前記ＮＴＤはｗｅｄｇｅ（ＷＥＤ）、ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＲＥＣ）、およびｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ（ＺＦ）ドメインで構成され、前記ＣＴＤはさらに他のＺＦドメインおよびＲｕｖＣドメインで構成される。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質二量体の構造は大きくＲＥＣローブ（ＲＥＣ ｌｏｂｅ）およびｎｕｃｌｅａｓｅローブ（ＮＵＣ ｌｏｂｅ）に分けることができる。前記ＲＥＣローブは、二量体を構成する一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメイン、およびＲＥＣドメインと；二量体を構成する他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメイン、およびＲＥＣドメインで構成される。前記ｎｕｃｌｅａｓｅローブは二量体を構成する一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよびＴＮＢドメインと；二量体を構成する他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよびＴＮＢドメインで構成される。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の各ドメインの全部または一部はそれぞれＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのスキャフォールド領域の特定の部分を認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体をなす。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は二つの分子が二量体形態でガイドＲＮＡと結合して複合体をなしていることが明らかになった。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はａｍｉｎｏ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ（ＮＴＤ）およびｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍｉｎ（ＣＴＤ）に分かれ、前記二つのドメインがリンカーループ（ｌｉｎｋｅｒ ｌｏｏｐ）を通じて連結されている構造である。前記ＮＴＤはｗｅｄｇｅ（ＷＥＤ）、ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＲＥＣ）、およびｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ（ＺＦ）ドメインで構成され、前記ＣＴＤはさらに他のＺＦドメインおよびＲｕｖＣドメインで構成される。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質二量体の構造は大きくＲＥＣローブ（ＲＥＣ ｌｏｂｅ）およびｎｕｃｌｅａｓｅローブ（ＮＵＣ ｌｏｂｅ）に分けることができる。前記ＲＥＣローブは、二量体を構成する一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメイン、およびＲＥＣドメインと；二量体を構成する他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメイン、およびＲＥＣドメインで構成される。前記ｎｕｃｌｅａｓｅローブは二量体を構成する一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよびＴＮＢドメインと；二量体を構成する他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよびＴＮＢドメインで構成される。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の各ドメインの全部または一部はそれぞれＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのスキャフォールド領域の特定の部分を認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体をなす。
【0064】
Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの構造
本明細書で、Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは大きく機能的にスペーサー、およびスキャフォールド領域に分けることができる。前記スキャフォールド領域は五つのＳｔｅｍ（Ｓｔｅｍ１～Ｓｔｅｍ５と命名）および一つのｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ（ＰＫ）で構成される。
本明細書で、Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは大きく機能的にスペーサー、およびスキャフォールド領域に分けることができる。前記スキャフォールド領域は五つのＳｔｅｍ（Ｓｔｅｍ１～Ｓｔｅｍ５と命名）および一つのｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ（ＰＫ）で構成される。
【0065】
通常的に、自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡに分かれ、前記ｃｒＲＮＡはさらにｃｒＲＮＡ反復配列部分およびスペーサーに分けることができるということが通常の技術者に広く知られている。前記基準とは別個に、本明細書では前記Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する部分をあわせてスキャフォールド領域と指称する。前記スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの一部を含む領域であって、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する機能をする。これに対する具体的な説明は以下該当段落で記述する。
【0066】
前記Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡの一部（ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｔｉ－ｒｅｐｅａｔ）、およびｃｒＲＮＡ反復部分（ｃｒＲＮＡ ｒｅｐｅａｔ）の一部が相補的に結合してデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）をなしている構造を２個含み、これを便宜上ｃｒＲＮＡ ｒｅｐｅａｔ－ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｔｉ－ｒｅｐｅａｔ（Ｒ：ＡＲ）部分と命名する。前記Ｓｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ２）、およびＰＫ（Ｒ：ＡＲ１）はこのようなｃｒＲＮＡ ｒｅｐｅａｔ－ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｔｉ－ｒｅｐｅａｔデュプレックス構造をなしている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、前記Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのうちＳｔｅｍ１部分、Ｓｔｅｍ２のうち一部、およびＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ２）部分は前記Ｃａｓ１２ｆ１二量体と相互作用しない部分であることが明らかになったし、これをｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎという。
【0067】
背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計
【0068】
ベクター設計概括
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをゲノム編集に使うために、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成を暗号化する配列を有するベクターを細胞内に導入させて、細胞内で前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成が発現するようにする方法が広く利用されている。以下、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内で発現するようにするベクターの構成要素について説明する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをゲノム編集に使うために、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成を暗号化する配列を有するベクターを細胞内に導入させて、細胞内で前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成が発現するようにする方法が広く利用されている。以下、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内で発現するようにするベクターの構成要素について説明する。
【0069】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素を暗号化する核酸
前記ベクターの目的はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成要素を細胞内で発現するようにするものであるので、前記ベクターの配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成要素を暗号化する核酸のうち一つ以上を含むことができる。具体的には、前記ベクターの配列は発現しようとするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに含まれたガイドＲＮＡ、および／またはＣａｓタンパク質を暗号化する核酸配列を含む。この時、前記ベクターの配列は野生型のガイドＲＮＡおよび野生型のＣａｓタンパク質を暗号化する核酸だけでなく、その目的によりエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびコドン最適化されたＣａｓタンパク質を暗号化する核酸またはエンジニアリングされたＣａｓタンパク質を暗号化する核酸を含むことができる。この時、前記各構成要素を暗号化する核酸配列はＤＮＡ配列であり得る。
前記ベクターの目的はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成要素を細胞内で発現するようにするものであるので、前記ベクターの配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成要素を暗号化する核酸のうち一つ以上を含むことができる。具体的には、前記ベクターの配列は発現しようとするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに含まれたガイドＲＮＡ、および／またはＣａｓタンパク質を暗号化する核酸配列を含む。この時、前記ベクターの配列は野生型のガイドＲＮＡおよび野生型のＣａｓタンパク質を暗号化する核酸だけでなく、その目的によりエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびコドン最適化されたＣａｓタンパク質を暗号化する核酸またはエンジニアリングされたＣａｓタンパク質を暗号化する核酸を含むことができる。この時、前記各構成要素を暗号化する核酸配列はＤＮＡ配列であり得る。
【0070】
調節／制御要素
前記構成要素を細胞内で発現させるために、前記ベクターは一つ以上の調節／制御要素を含まなければならない。具体的には、前記調節／制御構成要素はプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、内部リボソーム流入部位（ＩＲＥＳ、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）、スプライスアクセプター、２Ａ配列および／または複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。この時、前記複製起点はｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、および／またはＢＢＶ複製起点であり得るが、これに制限されるものではない。
前記構成要素を細胞内で発現させるために、前記ベクターは一つ以上の調節／制御要素を含まなければならない。具体的には、前記調節／制御構成要素はプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、内部リボソーム流入部位（ＩＲＥＳ、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）、スプライスアクセプター、２Ａ配列および／または複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。この時、前記複製起点はｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、および／またはＢＢＶ複製起点であり得るが、これに制限されるものではない。
【0071】
プロモーター
前記ベクターの発現対象を細胞内で発現させるためには、各構成要素を暗号化する配列にプロモーター配列を作動的に連結させて細胞内で転写因子が活性化できるようにしなければならない。前記プロモーター配列は対応する転写因子、または発現環境により異なって設計することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素を細胞内で適切に発現させ得るものであれば制限されない。前記プロモーター配列はＲＮＡ重合酵素（例えば、ＲＮＡ Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、またはＰｏｌ ＩＩＩ）の活性を促進させるプロモーターであり得る。例えば、前記プロモーターはＳＶ４０初期プロモーター、ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）プロモーター、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅプロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＭＶＩＥ）のようなｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーター、ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ｈｕｍａｎ Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒプロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０、４９７－５００（２００２））、ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｕ６プロモーター（ｅ．ｇ．，Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ｈｕｍａｎ Ｈ１プロモーター（Ｈ１）、および７ＳＫのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。
前記ベクターの発現対象を細胞内で発現させるためには、各構成要素を暗号化する配列にプロモーター配列を作動的に連結させて細胞内で転写因子が活性化できるようにしなければならない。前記プロモーター配列は対応する転写因子、または発現環境により異なって設計することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素を細胞内で適切に発現させ得るものであれば制限されない。前記プロモーター配列はＲＮＡ重合酵素（例えば、ＲＮＡ Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、またはＰｏｌ ＩＩＩ）の活性を促進させるプロモーターであり得る。例えば、前記プロモーターはＳＶ４０初期プロモーター、ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）プロモーター、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅプロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＭＶＩＥ）のようなｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーター、ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ｈｕｍａｎ Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒプロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０、４９７－５００（２００２））、ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｕ６プロモーター（ｅ．ｇ．，Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ｈｕｍａｎ Ｈ１プロモーター（Ｈ１）、および７ＳＫのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。
【0072】
終結信号
前記転写因子の転写活動の終結を誘導する配列を終結信号と称する。前記終結信号は、プロモーター配列の種類によって変わり得る。例えば、前記プロモーターがＵ６、またはＨ１プロモーターの場合、前記プロモーターはチミジン連続配列（例えば、ＴＴＴＴＴＴ（Ｔ６）配列）を終結信号に認識する。
前記転写因子の転写活動の終結を誘導する配列を終結信号と称する。前記終結信号は、プロモーター配列の種類によって変わり得る。例えば、前記プロモーターがＵ６、またはＨ１プロモーターの場合、前記プロモーターはチミジン連続配列（例えば、ＴＴＴＴＴＴ（Ｔ６）配列）を終結信号に認識する。
【0073】
付加発現要素
前記ベクターは野生型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成、および／またはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの他に通常の技術者が必要によって発現させようとする付加発現要素を暗号化する核酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記付加発現要素は、「タグ」段落で説明されたタグのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。例えば、前記付加発現要素は、選別のためのｓｅｌｅｃｔｉｏｎマーカーなどの目的とする追加機能を有することができる遺伝子、例えば、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ）またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
前記ベクターは野生型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成、および／またはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの他に通常の技術者が必要によって発現させようとする付加発現要素を暗号化する核酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記付加発現要素は、「タグ」段落で説明されたタグのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。例えば、前記付加発現要素は、選別のためのｓｅｌｅｃｔｉｏｎマーカーなどの目的とする追加機能を有することができる遺伝子、例えば、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ）またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0074】
発現ベクターの形態
前記発現ベクターは線形、または円形ベクター形態で設計され得る。
前記発現ベクターは線形、または円形ベクター形態で設計され得る。
【0075】
従来技術の限界点
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは相対的に大きさが小さいのでゲノム編集技術に適用する魅力的なシステムであり、最初に報告された以来（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））これに対するいくつかの研究が進行されている（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、ＵＳ ２０２０／０１９０４９４ Ａ１）。しかし、細胞（例えば、真核細胞）内でゲノム編集活性が示されないか、過度に低いためこの活用に妨げとなっている。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは相対的に大きさが小さいのでゲノム編集技術に適用する魅力的なシステムであり、最初に報告された以来（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））これに対するいくつかの研究が進行されている（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、ＵＳ ２０２０／０１９０４９４ Ａ１）。しかし、細胞（例えば、真核細胞）内でゲノム編集活性が示されないか、過度に低いためこの活用に妨げとなっている。
【0076】
継続された研究により最近の先行文献（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムでＣａｓ１２ｆ１タンパク質が二量体（ｄｉｍｅｒ）を形成するという事実、およびガイドＲＮＡの構造に対して明らかにした。前記先行文献によってガイドＲＮＡ部分のうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と直接的に相互作用しない、いわゆるｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎがあるということが明らかになったし、さらに他の先行文献（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｆ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０））では前記ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎ部分を除去してｉｎ ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮＡの切断効率を考察したことがある。しかし、前記先行研究は１）細胞内ゲノム編集活性（例えば、ｉｎｄｅｌ発生効率）を示したりこれを高める方案に対する研究ではなく、２）ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを除去した実験はあるが、かえって切断活性が低くなるものと報告している。３）さらに、前記研究での実験はｉｎ ｖｉｔｒｏで進めた実験であって、細胞内ゲノム編集活性を示したり、効率を上げるための変形が何であるかを明らかにするには失敗した。
【0077】
したがって、依然としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集活性を高めることが重要な課題として残っている。
【0078】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの特徴
【0079】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ概括
本明細書では従来技術の限界点を克服して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集活性を高めるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡの構造の一部を変形したものである。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する役割をするスキャフォールド領域の少なくとも一部が変形されたことを特徴とする。
本明細書では従来技術の限界点を克服して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集活性を高めるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡの構造の一部を変形したものである。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する役割をするスキャフォールド領域の少なくとも一部が変形されたことを特徴とする。
【0080】
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域およびスペーサーを含むことができる。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域とは異なることを特徴とする。
【0081】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの特徴－スキャフォールド領域（ｓｃａｆｆｏｌｄ ｒｅｇｉｏｎ）のうち一つ以上の部分（ｐａｒｔ）が変形される
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡと比較して、そのスキャフォールド領域の一部が変形されたことを特徴とする。スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの一部を含む領域であって、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する機能をする。前記スキャフォールド領域については以下でさらに詳しく説明するであろう。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡと比較して、そのスキャフォールド領域の一部が変形されたことを特徴とする。スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの一部を含む領域であって、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する機能をする。前記スキャフォールド領域については以下でさらに詳しく説明するであろう。
【0082】
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域を含むことができる。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域が変形されたものである。したがって、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域とは異なる配列を有する。一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域のうち一部の領域が除去されたものであり得る。一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域に含まれた特定の部分であって、一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0083】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの効果
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに使う場合、自然界で発見されるガイドＲＮＡを使う場合に比べて細胞内でゲノム編集活性が劇的に向上する効果が示される。本発明者らは実験を通じて、自然界で発見されるガイドＲＮＡにどのような構成を追加しなければならないか、あるいはそのスキャフォールド領域にどのような変形を加えればゲノム編集効率が向上するかを詳細に明らかにした。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使用すれば前述した従来技術の限界点を克服して細胞内で高い効率で遺伝子を編集することができる。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡと長さが同等であるか、より短い長さを有するので、ゲノム編集技術分野で応用可能性が高い。本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの長所（例えば、大きさが非常に小さいという長所）を十分にゲノム編集技術に活用できるようにする。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに使う場合、自然界で発見されるガイドＲＮＡを使う場合に比べて細胞内でゲノム編集活性が劇的に向上する効果が示される。本発明者らは実験を通じて、自然界で発見されるガイドＲＮＡにどのような構成を追加しなければならないか、あるいはそのスキャフォールド領域にどのような変形を加えればゲノム編集効率が向上するかを詳細に明らかにした。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使用すれば前述した従来技術の限界点を克服して細胞内で高い効率で遺伝子を編集することができる。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡと長さが同等であるか、より短い長さを有するので、ゲノム編集技術分野で応用可能性が高い。本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの長所（例えば、大きさが非常に小さいという長所）を十分にゲノム編集技術に活用できるようにする。
【0084】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの用途
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはＣａｓ１２ｆ１タンパク質と共にゲノム編集および／または遺伝子治療剤の用途で使われ得る。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはゲノム編集用組成物を製造するための用途で使うことができる。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはＣａｓ１２ｆ１タンパク質と共にゲノム編集および／または遺伝子治療剤の用途で使われ得る。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはゲノム編集用組成物を製造するための用途で使うことができる。
【0085】
用語の説明－Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ部分を指称する用語
【0086】
Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ部分－概括
自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡに分かれ、前記ｃｒＲＮＡはさらにｃｒＲＮＡ反復配列部分およびスペーサーに分けることができるということが通常の技術者に広く知られている。
自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡに分かれ、前記ｃｒＲＮＡはさらにｃｒＲＮＡ反復配列部分およびスペーサーに分けることができるということが通常の技術者に広く知られている。
【0087】
前記基準とは別個に、本明細書では前記Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する部分をあわせてスキャフォールド領域と指称する。前記スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの一部を含み、必ずしも一分子のＲＮＡを指称するものではない。前記スキャフォールド領域はさらに第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、第５領域、および第６領域に細分化され得る（図１）。前記細分化された領域をｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ上で叙述すると、前記第１領域～第４領域はｔｒａｃｒＲＮＡに含まれ、前記第５領域～前記第６領域はｃｒＲＮＡ、具体的にはｃｒＲＮＡ反復配列部分に含まれる。
【0088】
以下、叙述される「第ｎ領域」、または「自然界で発見される第ｎ領域」（ｎは１以上６以下の整数）は基本的に自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの各部分を指称する。具体的には、前記「第ｎ領域」は原核細胞内で転写されたガイドＲＮＡの構造、および／または原核細胞システムで実際に作動するガイドＲＮＡ（原核細胞内で転写された形態ではない、活性化した形態）の構造に対応して各領域を指称し得る。エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ内前記分類基準と対応する領域は一般的に「変形された第ｎ領域」～「エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第ｎ領域」と叙述される。
【0089】
ただし、エンジニアリングされたスキャフォールド領域に含まれた第ｎ領域であっても、特に変形されないため自然界で発見される第ｎ領域と同一の場合があり得るが、そのときに限って「第ｎ領域」という用語は混用され得る。この時、前記「第ｎ領域」が指称する対象（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれた領域であるか、自然界で発見されるガイドＲＮＡに含まれた領域であるかどうか）は文脈により適切に解釈されるべきである。
【0090】
ｔｒａｃｒＲＮＡ、 ｃｒＲＮＡ
本明細書で「ｔｒａｃｒＲＮＡ」、「ｃｒＲＮＡ」と記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術分野で通常の技術者が認識できる意味をすべて含む。これは、自然界で発見されるデュアルガイドＲＮＡの各分子を指称する用語で使われるのが一般的であるが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したシングルガイドＲＮＡの各該当部分を指称するのにも使われ得る。別途に叙述しない限り、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡとのみ記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを構成するｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを意味する。
本明細書で「ｔｒａｃｒＲＮＡ」、「ｃｒＲＮＡ」と記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術分野で通常の技術者が認識できる意味をすべて含む。これは、自然界で発見されるデュアルガイドＲＮＡの各分子を指称する用語で使われるのが一般的であるが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したシングルガイドＲＮＡの各該当部分を指称するのにも使われ得る。別途に叙述しない限り、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡとのみ記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを構成するｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを意味する。
【0091】
一具現例として、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）または５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号２）であり得る。一具現例として、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは第１領域、第２領域、第３領域、および第４領域を含む。一具現例として、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、第１領域、第２領域、第３領域、および第４領域が順に連結されたものである。
【0092】
一具現例として、ｃｒＲＮＡの配列はｃｒＲＮＡ反復配列およびスペーサー配列を含む。この時、前記ｃｒＲＮＡ反復配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）または５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４）であり得る。前記ｃｒＲＮＡ反復配列は第５領域、および第６領域を含む。前記スペーサー配列は標的配列により変わり得、一般的に１０～５０個のヌクレオチドを含む。一具現例として、前記ｃｒＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、第５領域、第６領域、およびスペーサーが順に連結されたものである。
【0093】
スキャフォールド領域－概括
本明細書で「スキャフォールド領域」と記載する場合、自然界で発見されるガイドＲＮＡ部分のうちスペーサーを除いた残りの部分をあわせて指称する。具体的には、前記スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡの一部を含む。具体的には、前記ｃｒＲＮＡの一部はｃｒＲＮＡ反復配列部分であり得る。前記スキャフォールド領域は一般的にＣａｓタンパク質と相互作用できる部分と知られている。本明細書では前記スキャフォールド領域を第１領域～第６領域に分けて叙述し、各領域については以下でさらに詳しく説明する。
本明細書で「スキャフォールド領域」と記載する場合、自然界で発見されるガイドＲＮＡ部分のうちスペーサーを除いた残りの部分をあわせて指称する。具体的には、前記スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡの一部を含む。具体的には、前記ｃｒＲＮＡの一部はｃｒＲＮＡ反復配列部分であり得る。前記スキャフォールド領域は一般的にＣａｓタンパク質と相互作用できる部分と知られている。本明細書では前記スキャフォールド領域を第１領域～第６領域に分けて叙述し、各領域については以下でさらに詳しく説明する。
【0094】
スキャフォールド領域１－第１領域
本明細書で「第１領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端を含む領域を指称する。前記第１領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第１領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端を含む領域を指称する。前記第１領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
【0095】
前記第１領域はＳｔｅｍ１部分（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を含む。前記第１領域は前記Ｓｔｅｍ１部分と隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
【0096】
前記第１領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを含む。
【0097】
一具現例として、前記第１領域は配列番号１または２で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から１番目のヌクレオチドから１１番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第１領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）であり得る。
【0098】
スキャフォールド領域２－第２領域
本明細書で「第２領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ内前記第１領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第２領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。この時、前記Ｓｔｅｍ構造は前記第１領域に含まれたＳｔｅｍとは異なるものである。
本明細書で「第２領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ内前記第１領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第２領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。この時、前記Ｓｔｅｍ構造は前記第１領域に含まれたＳｔｅｍとは異なるものである。
【0099】
前記第２領域はＳｔｅｍ２部分（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を含む。前記第２領域は前記Ｓｔｅｍ２部分と隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
【0100】
前記第２領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメイン、および／または二量体をなす他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。前記第２領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを含む。
【0101】
一具現例として、前記第２領域は配列番号１または２で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から２２番目のヌクレオチドから７１番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第２領域の配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号１０）であり得る。
【0102】
スキャフォールド領域３－第３領域
本明細書で「第３領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ内前記第２領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第３領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチド、およびｃｒＲＮＡに含まれた一部のヌクレオチドと相補的な結合を形成しているヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第３領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ内前記第２領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第３領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチド、およびｃｒＲＮＡに含まれた一部のヌクレオチドと相補的な結合を形成しているヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
【0103】
前記第３領域はＳｔｅｍ４部分（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））およびＳｔｅｍ３－ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチド（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を含む。前記第３領域は前記Ｓｔｅｍ４部分および／またはＳｔｅｍ３－ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドと隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
【0104】
前記第３領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、および／またはＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ３－ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドであり得る。
【0105】
前記第３領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよび／または二量体をなす他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲＥＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ４部分に含まれたヌクレオチドであり得る。
【0106】
前記第３領域はｃｒＲＮＡの第６領域に含まれた一つ以上のヌクレオチドと相補的に結合する一つ以上のヌクレオチドを含む。
【0107】
一具現例として、前記第３領域は配列番号１または２で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から７２番目のヌクレオチドから１２７番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第３領域の配列は５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）であり得る。
【0108】
スキャフォールド領域４－第４領域
本明細書で「第４領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの第３領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第４領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でｃｒＲＮＡに含まれた一部のヌクレオチドと相補的な結合を形成できるヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第４領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの第３領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第４領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でｃｒＲＮＡに含まれた一部のヌクレオチドと相補的な結合を形成できるヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
【0109】
前記第４領域はＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））。前記第４領域は前記Ｓｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドと隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
【0110】
前記第４領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、および／またはＺＦドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドであり得る。
【0111】
前記第４領域はｃｒＲＮＡの第５領域に含まれた一つ以上のヌクレオチドと相補的に結合する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。前記第４領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを含む。
【0112】
一具現例として、前記第４領域は配列番号１で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から１２８番目のヌクレオチドから１４０番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第４領域は配列番号２で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から１２８番目のヌクレオチドから１６２番目のヌクレオチドまでを意味し得る。
【0113】
一具現例として、前記第４領域の配列は５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２）または５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号１３）であり得る。
【0114】
スキャフォールド領域５－第５領域
本明細書で「第５領域」と記載する場合、ｃｒＲＮＡ ５'末端を含む領域を指称する。前記第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で前記第４領域の一つ以上のヌクレオチドと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第５領域」と記載する場合、ｃｒＲＮＡ ５'末端を含む領域を指称する。前記第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で前記第４領域の一つ以上のヌクレオチドと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
【0115】
前記第５領域はＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））。前記第５領域は前記Ｓｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドと隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
【0116】
前記第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＲＥＣドメインおよび／またはＺＦドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）中ｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドであり得る。
【0117】
前記第５領域は前記第４領域に含まれた一つ以上のヌクレオチドと相補的に結合する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。前記第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを含む。
【0118】
一具現例として、前記第５領域は配列番号３で表現されるｃｒＲＮＡの５'末端から１番目のヌクレオチドから１０番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第５領域は配列番号４で表現されるｃｒＲＮＡの５'末端から１番目のヌクレオチドから３０番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第５領域の配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１４）または５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）であり得る。
【0119】
スキャフォールド領域６－第６領域
本明細書で「第６領域」と記載する場合、ｃｒＲＮＡ内前記第５領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で前記第３領域の一つ以上のヌクレオチドと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第６領域」と記載する場合、ｃｒＲＮＡ内前記第５領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で前記第３領域の一つ以上のヌクレオチドと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
【0120】
前記第６領域はＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））。前記第６領域は前記ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドと隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
【0121】
前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ３－ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドであり得る。
【0122】
一具現例として、前記第６領域は配列番号３で表現されるｃｒＲＮＡの５'末端から１１番目のヌクレオチドから１７番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第６領域は配列番号４で表現されるｃｒＲＮＡの５'末端から３１番目のヌクレオチドから３７番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第６領域の配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'であり得る。
【0123】
スペーサー
本明細書で「スペーサー」と記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムで標的配列部分と混成化される一つ以上のヌクレオチドを指称する。前記スペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムでガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡの３'末端付近の１０個～５０個の連続したヌクレオチドを指称する。前記スペーサーはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使って編集しようとする標的核酸の標的配列に対応して設計される。換言すると、前記スペーサーは標的核酸の標的配列により多様な配列を有することができる。
本明細書で「スペーサー」と記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムで標的配列部分と混成化される一つ以上のヌクレオチドを指称する。前記スペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムでガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡの３'末端付近の１０個～５０個の連続したヌクレオチドを指称する。前記スペーサーはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使って編集しようとする標的核酸の標的配列に対応して設計される。換言すると、前記スペーサーは標的核酸の標的配列により多様な配列を有することができる。
【0124】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域－概括
【0125】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域概括
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率向上のために導入できるエンジニアリングされたスキャフォールド領域を提供する。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが使われたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率を向上させる。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのスキャフォールド領域（以下、自然界で発見されるスキャフォールド領域）で一ヶ所以上が変形されて、これとは異なる配列および／または構造を有するようになったことが特徴である。
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率向上のために導入できるエンジニアリングされたスキャフォールド領域を提供する。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが使われたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率を向上させる。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのスキャフォールド領域（以下、自然界で発見されるスキャフォールド領域）で一ヶ所以上が変形されて、これとは異なる配列および／または構造を有するようになったことが特徴である。
【0126】
この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の機能は自然界で発見されるスキャフォールド領域と同一であるか、類似の機能を有する。具体的には、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体のＣａｓ１２ｆ１タンパク質二量体と相互作用する機能を有する。
【0127】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の各部分に対応する領域を含む。具体的には、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、第５領域、および第６領域を含み、これは自然界で発見されるスキャフォールド領域に含まれた第１領域～第６領域にそれぞれ対応する。
【0128】
シングルガイドＲＮＡを作るための変形
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは一分子のシングルガイドＲＮＡであり得る。したがって、本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は各領域のうち一つ以上が変形されたものであり、追加的にｔｒａｃｒＲＮＡ第４領域の３'末端およびｃｒＲＮＡ第５領域の５'末端がリンカーを通じて連結されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは一分子のシングルガイドＲＮＡであり得る。したがって、本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は各領域のうち一つ以上が変形されたものであり、追加的にｔｒａｃｒＲＮＡ第４領域の３'末端およびｃｒＲＮＡ第５領域の５'末端がリンカーを通じて連結されたものであり得る。
【0129】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるスキャフォールド領域で一ヶ所以上が変形され、前記第４領域の３'末端および前記第５領域の５'末端がリンカーを通じて連結されたものであり得る。例えば、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
【0130】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形
【0131】
第１領域変形概括
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第１領域が変形されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第１領域が変形されたものであり得る。
【0132】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域を含むことができる。この時、前記変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものである。この時、前記除去されたヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する領域から選択されたヌクレオチドである。
【0133】
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見される第１領域に含まれた一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得、選択的に、前記第１領域以外に他の部分も変形されたものをさらに含むことができる。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第１領域のうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれたヌクレオチドであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第１領域のうちＳｔｅｍ１（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））に属するヌクレオチドであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第１領域のうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないヌクレオチドであり得る。
【0134】
一具現例として、前記変形された第１領域は３'末端方向に５'－Ａ－３'配列を含むことを特徴とする。
【0135】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第１領域が除去されたものであり得る。換言すると、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第１領域と対応する領域を含まなくてもよい。
【0136】
第１領域変形内容－一部のヌクレオチド除去
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0137】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で５'末端の１個～２０個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で５'末端の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で５'末端で直前の文章で選択された二つの数値範囲内連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。例えば、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で５'末端の１個～３個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0138】
一具現例として、前記変形された第１領域は少なくとも一つのヌクレオチドを含み、これは５'－Ａ－３'であり得る。
【0139】
変形された第１領域配列例示
一具現例として、前記変形された第１領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、および５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）から選択されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第１領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、および５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）から選択されたものであり得る。
【0140】
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
【0141】
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、および
配列番号１２が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１４および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、および
配列番号１２が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１４および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0142】
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
【0143】
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１１８）、５'－ＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１１９）、５'－ＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２０）、５'－ＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２１）、５'－ＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２２）、５'－ＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２３）、５'－ＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２４）、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２５）、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２６）、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３６）、および５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３７）からなる群から選択された配列；および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）。
【0144】
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
【0145】
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、および配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、および配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0146】
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、および配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１２、
リンカー、
配列番号１４、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、および配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１２、
リンカー、
配列番号１４、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
【0147】
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６７）、５'－ＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６８）、５'－ＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６９）、５'－ＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７０）、５'－ＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７１）、５'－ＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７２）、５'－ＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７３）、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７４）、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７５）、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８５）、および５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８６）から選択された配列であり得る。
【0148】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形
【0149】
第２領域変形概括
本明細書で提供するエンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第２領域が変形されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第２領域が変形されたものであり得る。
【0150】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域を含むことができる。この時、前記変形された第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものである。この時、前記除去されたヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する領域から選択されたヌクレオチドである。
【0151】
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見される第２領域の一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得、選択的に、前記第２領域他他の部分が変形されたものをさらに含むことができる。一具現例として、前記ヌクレオチドの除去は前記自然界で発見される第２領域のうちＳｔｅｍ構造を形成する部分で起きたものであり、ヌクレオチドが相補的なペア単位で除去されたものであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第２領域のうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれたヌクレオチドであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第２領域のうちＳｔｅｍ２（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））に属するヌクレオチドであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第２領域のうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないヌクレオチドであり得る。
【0152】
一具現例として、前記変形された第２領域は５'末端方向に５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）配列を有することを特徴とする。一具現例として、前記変形された第２領域は３'末端方向に５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧ－３'（配列番号４３３）配列を有することを特徴とする。
【0153】
第２領域変形内容１－一部のヌクレオチド除去
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0154】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で連続または非連続的に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、または２７個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１０配列基準として、５'末端から１２番目～２４番目のヌクレオチド、および／または２７番目～４０番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１０配列基準として、５'末端から１２番目～２４番目のヌクレオチドのうち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１０配列基準として、５'末端から２７番目～３８番目のヌクレオチドのうち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0155】
一具現例として、前記変形された第２領域の配列は少なくとも５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）および５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧ－３'（配列番号４３３）を含むことを特徴とする。この時、前記変形された第２領域の配列は５'末端から３'末端方向に５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）および５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧ－３'（配列番号４３３）が順に連結されていてもよく、適切な中間配列を通じて連結されていてもよい。一例として、前記中間配列は５'－ＵＵＡＧ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＵ－３'、５'－ＡＡＵＵＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵ－３'（配列番号５７）、５'－ＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５８）、５'－ＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５９）、５'－ＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６０）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６１）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６２）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６３）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６４）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６５）、５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４３４）、および５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４３５）からなる群から選択されたものであり得る。
【0156】
第２領域変形内容２－相補的なペア単位除去
前記第２領域の変形はＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれた互いに相補的な結合をする一対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記第２領域の変形はＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれた互いに相補的な結合をする一対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0157】
一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１０配列基準として、５'末端から１２番目～２４番目のヌクレオチド、および２７番目～４０番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0158】
一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１０配列基準として、５'末端から１２番目～２４番目のヌクレオチド、および２７番目～４０番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／または相補的なペアをなさない１個以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0159】
一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１０配列基準として、５'末端から１２番目～２４番目のヌクレオチド、および２７番目～４０番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／またはミスマッチである１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0160】
変形された第２領域配列例示
一具現例として、前記変形された第２領域の配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４８）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４９）からなる群から選択された配列であり得る。
一具現例として、前記変形された第２領域の配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４８）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号４９）からなる群から選択された配列であり得る。
【0161】
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号９、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、および
配列番号１２が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１４および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'末端から３'末端方向に、
配列番号９、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、および
配列番号１２が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１４および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0162】
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
【0163】
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３８）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１４０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１４１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１４２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１４３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１４４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１４５）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１４６）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１４７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１４８）からなる群から選択された配列；および
配列番号３。
配列番号３。
【0164】
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
【0165】
５'末端から３'末端方向に、
配列番号９、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号９、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0166】
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に、配列番号９、配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１から選択された配列、配列番号１１、配列番号１２、リンカー、配列番号１４、および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
【0167】
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
【0168】
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８７）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８８）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９５）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９６）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９８）からなる群から選択されたものであり得る。
【0169】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールドで第３領域はＤＮＡ切断活性に核心的な影響を及ぼすＳｔｅｍ４部分を含む領域である。したがって、前記エンジニアリングされたスキャフォールドの第３領域は自然界で発見されるスキャフォールドの第３領域と同一であるか、前記第３領域の機能が損傷しない限度内で変形されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールドで第３領域はＤＮＡ切断活性に核心的な影響を及ぼすＳｔｅｍ４部分を含む領域である。したがって、前記エンジニアリングされたスキャフォールドの第３領域は自然界で発見されるスキャフォールドの第３領域と同一であるか、前記第３領域の機能が損傷しない限度内で変形されたものであり得る。
【0170】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形
【0171】
第４領域および第５領域変形概括
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第４領域および第５領域が変形されたものであり得る。前記第４領域および第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で互いに混成化されてＳｔｅｍを構成する部分を含むので、該当部分がともに変形されてエンジニアリングされたスキャフォールド領域を構成することができる。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第４領域および第５領域が変形されたものであり得る。前記第４領域および第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で互いに混成化されてＳｔｅｍを構成する部分を含むので、該当部分がともに変形されてエンジニアリングされたスキャフォールド領域を構成することができる。
【0172】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および／または変形された第５領域を含むことができる。
【0173】
変形された第４領域は自然界で発見されるスキャフォールドの第４領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたことを特徴とする。変形された第５領域は自然界で発見されるスキャフォールドの第５領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたことを特徴とする。
【0174】
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第４領域および／または第５領域の一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0175】
一具現例として、前記変形された第４領域は５'末端方向に５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'配列を有することを特徴とする。一具現例として、前記変形された第５領域は３'末端方向に５'－ＧＧＡ－３'配列を有することを特徴とする。
【0176】
第４領域および第５領域変形内容１－一部のヌクレオチド除去
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第４領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第４領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第５領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第４領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第４領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第５領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0177】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第４領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域で連続または非連続的に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0178】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第４領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域で連続的にまたは非連続的に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個または２８個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0179】
一具現例として、前記変形された第４領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域で、配列番号１２配列基準として、５'末端から７番目～１３番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第４領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域で、配列番号１３配列基準として、５'末端から７番目～３４番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0180】
一具現例として、前記変形された第４領域の配列は少なくとも５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'を含むことを特徴とする。
【0181】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第５領域で連続または非連続的に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0182】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第５領域で連続または非連続的に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、または２７個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0183】
一具現例として、前記変形された第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第５領域で、配列番号１４配列基準として、５'末端から１番目～７番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第５領域で、配列番号１５配列基準として、５'末端から１番目～２７番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0184】
一具現例として、前記変形された第５領域の配列は少なくとも５'－ＧＧＡ－３'を含むことを特徴とする。
【0185】
第４領域および第５領域変形内容２－相補的なペア単位除去
前記第４領域および第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２複合体内で互いに相補的に結合してＳｔｅｍをなすものと知られている。前述した第４領域および第５領域の変形はこのようなＳｔｅｍを構成する一つ以上のヌクレオチドを対象とするので、前記第４領域および第５領域の変形はＳｔｅｍを構成するヌクレオチドを相補的なペア単位で除去するものであり得る。
前記第４領域および第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２複合体内で互いに相補的に結合してＳｔｅｍをなすものと知られている。前述した第４領域および第５領域の変形はこのようなＳｔｅｍを構成する一つ以上のヌクレオチドを対象とするので、前記第４領域および第５領域の変形はＳｔｅｍを構成するヌクレオチドを相補的なペア単位で除去するものであり得る。
【0186】
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１２配列基準として７番目～１３番目のヌクレオチド、および配列番号１４配列基準として１番目～７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0187】
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１２配列基準として７番目～１３番目のヌクレオチドおよび、配列番号１４配列基準として１番目～７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／または相補的なペアをなさない１個以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0188】
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１２配列基準として７番目～１３番目のヌクレオチドおよび、配列番号１４配列基準として１番目～７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／またはミスマッチである１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0189】
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１３配列基準として７番目～３４番目のヌクレオチドおよび、配列番号１５配列基準として１番目～２７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0190】
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１３配列基準として７番目～３４番目のヌクレオチドおよび、配列番号１５配列基準として１番目～２７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／または相補的なペアをなさない１個以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0191】
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１３配列基準として７番目～３４番目のヌクレオチドおよび、配列番号１５配列基準として１番目～２７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／またはミスマッチである１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
【0192】
変形された第４領域および第５領域配列例示
一具現例として、前記変形された第４領域の配列は５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）からなる群から選択されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域の配列は５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）からなる群から選択されたものであり得る。
【0193】
一具現例として、前記変形された第４領域の配列は５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号６９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵ－３'（配列番号７０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵ－３'（配列番号７１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣ－３'（配列番号７２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣ－３'（配列番号７３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵ－３'（配列番号７４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣ－３'（配列番号７５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵ－３'（配列番号７６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣ－３'（配列番号７７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣ－３'（配列番号７８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'（配列番号７９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（配列番号８０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'（配列番号８１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（配列番号８２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'（配列番号８３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（配列番号８４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（配列番号８５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（配列番号８６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（配列番号８７）、５'－ＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（配列番号８８）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'（配列番号８９）からなる群から選択されたものであり得る。
【0194】
一具現例として、前記変形された第５領域の配列は５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'から選択されたものであり得る。
【0195】
一具現例として、前記変形された第５領域の配列は５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９０）、５'－ＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９１）、５'－ＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９２）、５'－ＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９３）、５'－ＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９４）、５'－ＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９５）、５'－ＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９６）、５'－ＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９７）、５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９８）、５'－ＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９９）、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１００）、５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０１）、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０２）、５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０３）、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０４）、５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０５）、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０６）、５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０７）、５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０８）、および５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０９）からなる群から選択されたものであり得る。
【0196】
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
【0197】
５'末端から３'末端方向に、
配列番号９、
配列番号１０、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～６８からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号９、
配列番号１０、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～６８からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0198】
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
【0199】
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１４９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵ－３'（配列番号１５０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'（配列番号１５１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'（配列番号１５２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号１５３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号１５４）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号１５５）からなる群から選択された配列；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'からなる群から選択された配列。
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'からなる群から選択された配列。
【0200】
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
【0201】
５'末端から３'末端方向に、
配列番号９、
配列番号１０、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～８９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、配列番号９０～１０９からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号９、
配列番号１０、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～８９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、配列番号９０～１０９からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0202】
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号９、
配列番号１０、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号９、
配列番号１０、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
【0203】
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１９９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２００）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０４）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０５）からなる群から選択されたものであり得る。
【0204】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域５－第６領域変形
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールドで第６領域はＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む領域である。前述したように、前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。前記エンジニアリングされたスキャフォールドの第６領域は自然界で発見されるスキャフォールドの第６領域と同一であるか、前記第６領域の機能が損傷しない限度内で変形されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールドで第６領域はＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む領域である。前述したように、前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。前記エンジニアリングされたスキャフォールドの第６領域は自然界で発見されるスキャフォールドの第６領域と同一であるか、前記第６領域の機能が損傷しない限度内で変形されたものであり得る。
【0205】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域６－各変形の組み合わせ
【0206】
各変形の組み合わせ概括
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域に前述した各領域別変形が一つ以上組み合わせられたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域に前述した各領域別変形が一つ以上組み合わせられたものであり得る。
【0207】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、および変形された第２領域を含むことができる。
【0208】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
【0209】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
【0210】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域、および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
【0211】
この時、前記変形された領域は前述した各領域の変形段落で説明された通りである。
【0212】
各変形の組み合わせ１－第１領域変形＋第２領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域および変形された第２領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域および変形された第２領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
【0213】
一具現例として、第１領域および第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
【0214】
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、および
配列番号１２が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１４および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、および
配列番号１２が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１４および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0215】
一具現例として、第１領域および第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
【0216】
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１５６）；および
５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）。
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１５６）；および
５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）。
【0217】
一具現例として、第１領域および第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、
リンカー、
配列番号１４、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、
リンカー、
配列番号１４、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
【0218】
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
【0219】
一具現例として、第１領域および第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０６）であり得る。
【0220】
各変形の組み合わせ２－第１領域変形＋第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
【0221】
一具現例として、第１領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
【0222】
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～６８からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～６８からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0223】
一具現例として、第１領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
【0224】
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５７）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６０）。
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５７）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６０）。
【0225】
一具現例として、第１領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１１０～１１６から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１１０～１１６から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
【0226】
一具現例として、第１領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０７）であり得る。
【0227】
各変形の組み合わせ３－第２領域変形＋第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
【0228】
一具現例として、第２領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
【0229】
５'末端から３'末端方向に、
配列番号９、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～６８からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号９、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～６８からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0230】
一具現例として、第２領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５８）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６０）。
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５８）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６０）。
【0231】
一具現例として、第２領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
配列番号９、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１１０～１１６から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号９、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１１０～１１６から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
【0232】
一具現例として、第２領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０８）であり得る。
【0233】
各変形の組み合わせ４－第１領域変形＋第２領域変形＋第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
【0234】
一具現例として、第１領域、第２領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
【0235】
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～６８からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６６～６８からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
【0236】
一具現例として、第１領域、第２領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５９）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６０）。
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５９）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６０）。
【0237】
一具現例として、第１領域、第２領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１１０～１１６から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１６～２６からなる群から選択された配列、
配列番号３８～配列番号４９、および配列番号４３０～配列番号４３１からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１１０～１１６から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
【0238】
一具現例として、第１領域、第２領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０９）であり得る。
【0239】
各変形の組み合わせ５－第３領域、および第６領域の追加的な変形
前述したように、第３領域および第６領域もその機能が損傷しない範囲内で変形され得るので、本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は前述した第１領域、第２領域、第４領域、および／または第５領域の変形以外に、第３領域および／または第６領域が追加的に変形されたものであり得る。
前述したように、第３領域および第６領域もその機能が損傷しない範囲内で変形され得るので、本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は前述した第１領域、第２領域、第４領域、および／または第５領域の変形以外に、第３領域および／または第６領域が追加的に変形されたものであり得る。
【0240】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域７－相同性ある配列を含む
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」、および「エンジニアリングされたスキャフォールド領域５－各変形の組み合わせ」段落で叙述されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域（以下、前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域）の配列と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する配列を含む。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」、および「エンジニアリングされたスキャフォールド領域５－各変形の組み合わせ」段落で叙述されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域（以下、前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域）の配列と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する配列を含む。
【0241】
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列のうちいずれか一つと１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、または５０％の配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または配列相同性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する配列であり得る。一具現例として、前記スキャフォールド配列は前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列のうちいずれか一つと直前の文章で選択された二つの数値範囲内の％で一致する配列であり得る。例えば、前記スキャフォールド配列は前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列のうちいずれか一つと９０％～１００％一致する配列であり得る。
【0242】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ
【0243】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ概括
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集効率を上げるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド、およびスペーサーを含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールドは前述した「エンジニアリングされたスキャフォールド領域」で説明されたもののうちいずれか一つであり得る。
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集効率を上げるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド、およびスペーサーを含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールドは前述した「エンジニアリングされたスキャフォールド領域」で説明されたもののうちいずれか一つであり得る。
【0244】
シングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡ
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはシングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡであり得る。前記デュアルガイドＲＮＡはガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの独立的な二つの分子ＲＮＡで構成されたものを意味する。前記シングルガイドＲＮＡは（エンジニアリングされた）ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端および（エンジニアリングされた）ｃｒＲＮＡの５'末端がリンカーを通じて連結されて一つの分子を形成したものを意味する。
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはシングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡであり得る。前記デュアルガイドＲＮＡはガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの独立的な二つの分子ＲＮＡで構成されたものを意味する。前記シングルガイドＲＮＡは（エンジニアリングされた）ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端および（エンジニアリングされた）ｃｒＲＮＡの５'末端がリンカーを通じて連結されて一つの分子を形成したものを意味する。
【0245】
換言すると、前記デュアルガイドＲＮＡで、エンジニアリングされたスキャフォールドに含まれた第４領域の３'末端および第５領域の５'末端がリンカーを通じて連結されたものを意味する。この時、エンジニアリングされたスキャフォールドの各領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域」段落で説明された変形、およびその具体的な配列をすべて含むことができる。
【0246】
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示１
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
【0247】
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。
【0248】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は５'末端から３'末端方向に、自然界で発見されるスキャフォールド領域と対応する第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、リンカー、第５領域、第６領域が順に連結されたものであり、自然界で発見されるスキャフォールド領域と比較して第１領域、第２領域、第４領域、および第５領域から選択された一つ以上の領域が変形されたものである。
【0249】
一例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第１領域が変形された場合、前記変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記除去されたヌクレオチドは前記第１領域のうちＳｔｅｍ１（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））に属するヌクレオチドであり得る。この時、前記変形された第１領域の配列は５'－Ａ－３'を含むことを特徴とする。
【0250】
さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第２領域が変形された場合、前記変形された第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記ヌクレオチドの除去は前記第２領域のうちＳｔｅｍ２構造（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を形成する部分で起きたものであり、互いに相補的なペアをなすヌクレオチドがペア単位で除去されたものであり得る。この時、前記変形された第２領域の配列は少なくとも５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）および５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧ－３'（配列番号４３３）を含むことを特徴とする。さらに具体的には、前記変形された第２領域の配列は５'末端から３'末端方向に５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）および５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧ－３'（配列番号４３３）が順に連結されていてもよく、適切な中間配列を通じて連結されていてもよい。一例として、前記中間配列は５'－ＵＵＡＧ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＵ－３'、５'－ＡＡＵＵＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵ－３'（配列番号５７）、５'－ＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５８）、５'－ＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５９）、５'－ＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６０）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６１）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６２）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６３）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６４）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６５）、５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４３４）、および５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４３５）からなる群から選択されたものであり得る。
【0251】
さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第４領域および第５領域が変形された場合、前記変形された第４領域および第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第４領域および／または第５領域の一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記ヌクレオチドの除去は前記第４領域および第５領域のうちＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）構造（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を形成する部分で起きたものであり、互いに相補的なペアをなすヌクレオチドがペア単位で除去されたものであり得る。この時、前記変形された第４領域の配列は少なくとも５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'を含むことを特徴とする。この時、前記変形された第５領域の配列は少なくとも５'－ＧＧＡ－３'を含むことを特徴とする。
【0252】
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示２
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
【0253】
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。
【0254】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0255】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0256】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0257】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
【0258】
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；
【0259】
および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'、
この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とする。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'、
この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とする。
【0260】
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示３
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
【0261】
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個のヌクレオチドの長さを有することができる。
【0262】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0263】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0264】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0265】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
【0266】
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＧＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＧＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＧＡＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３００）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＧＡＡＡＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＧＡＡＡＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１３）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１４）からなる群から選択された配列；および
【0267】
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'、
【0268】
この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とする。
【0269】
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示４
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
【0270】
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個のヌクレオチドの長さを有することができる。
【0271】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0272】
５'－Ａ－３'で表現される第１配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧ－３'（配列番号４３３）で表現される第４配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
一例として、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧ－３'（配列番号４３３）で表現される第４配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
一例として、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
【0273】
さらに他の例として、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＧＡＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡ－３'（配列番号４２５）、５'－ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２６）、５'－ＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２７）、５'－ＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２８）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号４２９）からなる群から選択されたものであり得る。
【0274】
前記具現例の一具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＧＡ－３'、５'－ＡＧＡ－３'、５'－ＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３７）からなる群から選択された第９配列を追加的に含むことができる。この時、前記第９配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていてもよい。
【0275】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）、５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４０）、および５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）からなる群から選択された第１０配列を追加的に含むことができる。この時、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていてもよい。
【0276】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＣＵ－３'、５'－ＡＣＵ－３'、５'－ＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）、５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）、５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）、５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４４２）、および５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）からなる群から選択された第１１配列を追加的に含むことができる。この時、前記第３配列の３'末端および前記第４配列の５'末端は前記第１１配列を通じて連結されていてもよい。
【0277】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）、５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４０）、および５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）からなる群から選択された第１０配列および５'－Ｕ－３'、５'－ＣＵ－３'、５'－ＡＣＵ－３'、５'－ＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）、５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）、５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）、５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４４２）、および５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）からなる群から選択された第１１配列を追加的に含むことができる。この時、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されており、前記第３配列の３'末端および前記第４配列の５'末端は前記第１１配列を通じて連結されていてもよい。
【0278】
一例として、前記第１０配列が５'－Ａ－３'である場合、前記第１１配列は５'－Ｕ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'または５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４０）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４４２）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）であり得る。
【0279】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１２配列を追加的に含むことができる。この時、前記第６配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１２配列を通じて連結されていてもよい。
【0280】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１３配列を追加的に含むことができる。この時、前記リンカーの３'末端および前記第７配列の５'末端は前記第１３配列を通じて連結されていてもよい。
【0281】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１２配列、および５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１３配列を追加的に含むことができる。この時、前記第６配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１２配列を通じて連結されて、前記リンカーの３'末端および前記第７配列の５'末端は前記第１３配列を通じて連結されていてもよい。
【0282】
一例として、前記第１２配列が５'－Ｕ－３'である場合、前記第１３配列は５'－Ａ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。
【0283】
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示５
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されたものであり得る。
【0284】
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個のヌクレオチドの長さを有することができる。
【0285】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0286】
５'－Ａ－３'で表現される第１配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧ－３'（配列番号４３３）で表現される第４配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧ－３'（配列番号４３３）で表現される第４配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
【0287】
一例として、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
【0288】
さらに他の例として、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＧＡＡＡＧＵ－３'、５'－ＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵ－３'（配列番号３１６）、５'－ＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧ－３'（配列番号３１７）、５'－ＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣ－３'（配列番号３１８）、５'－ＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡ－３'（配列番号３１９）、５'－ＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧ－３'（配列番号３２０）、５'－ＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡ－３'（配列番号３２１）、５'－ＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡ－３'（配列番号３２２）、５'－ＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣ－３'（配列番号３２３）、５'－ＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣ－３'（配列番号３２４）、５'－ＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣ－３'（配列番号３２５）、５'－ＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧ－３'（配列番号３２６）、５'－ＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡ－３'（配列番号３２７）、５'－ＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡ－３'（配列番号３２８）、５'－ＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵ－３'（配列番号３２９）、５'－ＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡ－３'（配列番号３３０）、５'－ＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ－３'（配列番号３３１）、５'－ＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡ－３'（配列番号３３２）、５'－ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣ－３'（配列番号３３３）、５'－ＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧ－３'（配列番号３３４）、５'－ＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡ－３'（配列番号３３５）、５'－ＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡ－３'（配列番号３３６）、５'－ＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵ－３'（配列番号３３７）、５'－ＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧ－３'（配列番号３３８）、５'－ＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡ－３'（配列番号３３９）、５'－ＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３４０）、５'－ＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡ－３'（配列番号３４１）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３４２）からなる群から選択されたものであり得る。
【0289】
前記具現例の一具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＧＡ－３'、５'－ＡＧＡ－３'、５'－ＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３７）からなる群から選択された第９配列を追加的に含むことができる。この時、前記第９配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていてもよい。
【0290】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）、５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４０）、および５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）からなる群から選択された第１０配列を追加的に含むことができる。この時、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていてもよい。
【0291】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＣＵ－３'、５'－ＡＣＵ－３'、５'－ＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）、５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）、５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）、５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４４２）、および５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）からなる群から選択された第１１配列を追加的に含むことができる。この時、前記第３配列の３'末端および前記第４配列の５'末端は前記第１１配列を通じて連結されていてもよい。
【0292】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）、５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４０）、および５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）からなる群から選択された第１０配列および５'－Ｕ－３'、５'－ＣＵ－３'、５'－ＡＣＵ－３'、５'－ＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）、５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）、５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）、５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４４２）、および５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）からなる群から選択された第１１配列を追加的に含むことができる。この時、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されており、前記第３配列の３'末端および前記第４配列の５'末端は前記第１１配列を通じて連結されていてもよい。
【0293】
一例として、前記第１０配列が５'－Ａ－３'である場合、前記第１１配列は５'－Ｕ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'または５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４０）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４４２）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）であり得る。
【0294】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣ－３'（配列番号３４３）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣ－３'（配列番号３４４）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵ－３'（配列番号３４５）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣ－３'（配列番号３４６）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵ－３'（配列番号３４７）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣ－３'（配列番号３４８）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣ－３'（配列番号３４９）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'（配列番号３５０）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（配列番号３５１）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'（配列番号３５２）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（配列番号３５３）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'（配列番号３５４）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（配列番号３５５）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（配列番号３５７）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（配列番号３５８）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（配列番号３５９）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'（配列番号３６０）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号３６１）からなる群から選択された第１２配列を追加的に含むことができる。この時、前記第６配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１２配列を通じて連結されていてもよい。
【0295】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６２）、５'－ＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６３）、５'－ＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６４）、５'－ＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６５）、５'－ＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６６）、５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６７）、５'－ＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６８）、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６９）、５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７０）、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７１）、５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７２）、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７３）、５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７４）、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７５）、５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７６）、５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７７）、５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７８）、および５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７９）からなる群から選択された第１３配列を追加的に含むことができる。この時、前記リンカーの３'末端および前記第７配列の５'末端は前記第１３配列を通じて連結されていてもよい。
【0296】
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣ－３'（配列番号３４３）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣ－３'（配列番号３４４）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵ－３'（配列番号３４５）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣ－３'（配列番号３４６）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵ－３'（配列番号３４７）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣ－３'（配列番号３４８）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣ－３'（配列番号３４９）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'（配列番号３５０）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（配列番号３５１）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'（配列番号３５２）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（配列番号３５３）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'（配列番号３５４）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（配列番号３５５）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（配列番号３５７）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（配列番号３５８）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（配列番号３５９）、５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'（配列番号３６０）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号３６１）からなる群から選択された第１２配列、および５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６２）、５'－ＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６３）、５'－ＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６４）、５'－ＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６５）、５'－ＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６６）、５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６７）、５'－ＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６８）、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３６９）、５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７０）、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７１）、５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７２）、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７３）、５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７４）、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７５）、５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７６）、５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７７）、５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７８）、および５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号３７９）からなる群から選択された第１３配列を追加的に含むことができる。この時、前記第６配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１２配列を通じて連結されて、前記リンカーの３'末端および前記第７配列の５'末端は前記第１３配列を通じて連結されていてもよい。
【0297】
一例として、前記第１２配列が５'－Ｕ－３'である場合、前記第１３配列は５'－Ａ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'、または５'－ＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。
【0298】
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ配列例示
一具現例として、前記エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡは配列番号２１０～２５８、配列番号３８１～３９３、配列番号３９６～配列番号４０７、配列番号４０９～配列番号４２１、および配列番号４３６～配列番号４３９からなる群から選択された配列を有することができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡは配列番号２１０～２５８、配列番号３８１～３９３、配列番号３９６～配列番号４０７、配列番号４０９～配列番号４２１、および配列番号４３６～配列番号４３９からなる群から選択された配列を有することができる。
【0299】
エンジニアリングされたデュアルガイドＲＮＡ例示１
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを含む。
【0300】
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個のヌクレオチドの長さを有することができる。
【0301】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次の配列を含む：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列、
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列、
【0302】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列、
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）、および
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）、および
【0303】
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１４）からなる群から選択された配列、および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１４）からなる群から選択された配列、および
【0304】
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されている。
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されている。
【0305】
この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と異なり、および／または前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と異なる。
【0306】
一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は配列番号１と同一であり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は配列番号３と異なり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は配列番号１と異なり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は配列番号３と同一であり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は配列番号１と異なり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は配列番号３と異なり得る。
【0307】
一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１４）を含むことができる。
【0308】
エンジニアリングされたデュアルガイドＲＮＡ例示２
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを含む。
【0309】
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個のヌクレオチドの長さを有することができる。
【0310】
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次の配列を含む：
【0311】
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列、
【0312】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列、
【0313】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）、および
【0314】
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号６９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵ－３'（配列番号７０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵ－３'（配列番号７１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣ－３'（配列番号７２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣ－３'（配列番号７３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵ－３'（配列番号７４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣ－３'（配列番号７５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵ－３'（配列番号７６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣ－３'（配列番号７７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣ－３'（配列番号７８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'（配列番号７９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（配列番号８０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'（配列番号８１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（配列番号８２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'（配列番号８３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（配列番号８４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（配列番号８５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（配列番号８６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（配列番号８７）、５'－ＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（配列番号８８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'（配列番号８９）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号１３）からなる群から選択された配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
【0315】
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９０）、５'－ＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９１）、５'－ＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９２）、５'－ＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９３）、５'－ＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９４）、５'－ＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９５）、５'－ＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９６）、５'－ＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９７）、５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９８）、５'－ＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９９）、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１００）、５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０１）、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０２）、５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０３）、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０４）、５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０５）、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０６）、５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０７）、５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０８）、５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０９）、および５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
【0316】
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されている。
【0317】
この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号２）と異なり、および／または前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４）と異なる。
【0318】
一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は配列番号２と同一であり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は配列番号４と異なり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は配列番号２と異なり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は配列番号４と同一であり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は配列番号２と異なり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は配列番号４と異なり得る。
【0319】
一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号６９）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９０）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵ－３'（配列番号７０）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９１）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵ－３'（配列番号７１）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９２）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣ－３'（配列番号７２）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９３）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣ－３'（配列番号７３）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９４）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵ－３'（配列番号７４）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９５）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣ－３'（配列番号７５）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９６）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵ－３'（配列番号７６）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９７）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣ－３'（配列番号７７）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９８）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣ－３'（配列番号７８）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９９）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'（配列番号７９）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１００）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（配列番号８０）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０１）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'（配列番号８１）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０２）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（配列番号８２）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０３）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'（配列番号８３）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０４）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（配列番号８４）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０５）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（配列番号８５）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０６）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（配列番号８６）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０７）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（配列番号８７）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０８）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（配列番号８８）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０９）を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'（配列番号８９）または５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号１３）を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）を含むことができる。
【0320】
エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体
【0321】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体概括
本明細書ではエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を提供する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む。この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものである。
本明細書ではエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を提供する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む。この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものである。
【0322】
一具現例として、本明細書ではＣａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を提供する。この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたもののうちいずれか一つであり得る。
【0323】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－概括
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質が含まれる。基本的に、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に対してヒトコドン－最適化されたＣａｓ１２ｆ１配列であり得る。また、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することができる。しかし、特に限定しない限り、本明細書で「Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質」とする時、これは野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質だけでなく、変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質～Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質も包括して意味し得る。また、自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することだけでなく、前記機能の全部または一部が変形されたこと、前記機能の全部または一部が喪失されたこと、および／または追加的な機能が付加されたものをあわせて称することができる。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の意味は文脈により適切に解釈され得、特別な場合でない限り最も広い意味で解釈される。以下、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の構成、または機能について詳しく説明する。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質が含まれる。基本的に、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に対してヒトコドン－最適化されたＣａｓ１２ｆ１配列であり得る。また、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することができる。しかし、特に限定しない限り、本明細書で「Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質」とする時、これは野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質だけでなく、変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質～Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質も包括して意味し得る。また、自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することだけでなく、前記機能の全部または一部が変形されたこと、前記機能の全部または一部が喪失されたこと、および／または追加的な機能が付加されたものをあわせて称することができる。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の意味は文脈により適切に解釈され得、特別な場合でない限り最も広い意味で解釈される。以下、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の構成、または機能について詳しく説明する。
【0324】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。
【0325】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ファミリー（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））から由来したものであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｒｃｈａｅｏｎ由来のＣａｓ１４ａタンパク質（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））であり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ａ１タンパク質であり得る。
【0326】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体は変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。前記変形されたＣａｓ１２ｆ１は野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質配列で少なくとも一部の配列が変形されたものを意味する。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の変形は個別のアミノ酸単位からなるものであり得、タンパク質の機能的ドメイン単位からなるものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体は変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。前記変形されたＣａｓ１２ｆ１は野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質配列で少なくとも一部の配列が変形されたものを意味する。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の変形は個別のアミノ酸単位からなるものであり得、タンパク質の機能的ドメイン単位からなるものであり得る。
【0327】
一具現例として、前記タンパク質の変形は野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質配列で一つ以上のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および／またはドメインが個別的に置換、除去、および／または付加されたものであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に含まれたＲｕｖＣドメイン内一つ以上のアミノ酸、ペプチド、および／またはポリペプチドが置換、除去、および／または付加されたものであり得る。
【0328】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は野生型、または変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質に追加的なアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および／またはドメインが融合されたタンパク質を意味する。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は野生型、または変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質に追加的なアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および／またはドメインが融合されたタンパク質を意味する。
【0329】
一具現例として、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質にベースエディター、および／または逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）が融合されたものであり得る。一具現例として、前記ベースエディターはａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、および／またはｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅであり得る。一具現例として、前記逆転写酵素はＭｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素、および／またはその変異体であり得る。この時、前記逆転写酵素が融合されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質はプライムエディターとして機能することができる。
【0330】
一具現例として、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質に、細胞内の遺伝子発現過程に関与できる多様な酵素が融合されたものであり得る。この時、前記酵素が融合されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は細胞内遺伝子の発現に多様な量的、質的変化を招き得る。一具現例として、前記酵素はＶＰ６４、ＤＮＭＴ、ＴＥＴ、ＫＲＡＢ、ＤＨＡＣ、ＬＳＤ、および／またはｐ３００であり得る。
【0331】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－機能の変更
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体に含まれたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することができる。本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体に含まれたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質と比較する時、機能が変更されたものであり得る。具体的には、前記変更は全部または一部の機能の変形、全部または一部の機能の喪失、および／または付加的な機能の追加であり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は当業界の通常の技術者がＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質に適用できる変更であれば、特に制限されない。この時、前記変更は公知の技術を利用したものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体に含まれたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することができる。本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体に含まれたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質と比較する時、機能が変更されたものであり得る。具体的には、前記変更は全部または一部の機能の変形、全部または一部の機能の喪失、および／または付加的な機能の追加であり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は当業界の通常の技術者がＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質に適用できる変更であれば、特に制限されない。この時、前記変更は公知の技術を利用したものであり得る。
【0332】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断するように変更されたものであり得る。ひいては、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断することができ、切断しない鎖に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）またはプライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）をできるように変更されたものであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断できないように変更されたものであり得る。ひいては、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断できず、標的核酸に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、プライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、または遺伝子発現調節機能ができるように変更されたものであり得る。
【0333】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－その他変形例示
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、またはＮＥＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。具体的には、前記ＮＬＳは「用語の定義」のうちＮＬＳ段落に例示されたもののうちいずれか一つであり得るが、これに制限されるものではない。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はタグを含むことができる。具体的には、前記タグは「用語の定義」のうちタグ段落に例示されたもののうちいずれか一つであり得るが、これに制限されるものではない。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、またはＮＥＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。具体的には、前記ＮＬＳは「用語の定義」のうちＮＬＳ段落に例示されたもののうちいずれか一つであり得るが、これに制限されるものではない。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はタグを含むことができる。具体的には、前記タグは「用語の定義」のうちタグ段落に例示されたもののうちいずれか一つであり得るが、これに制限されるものではない。
【0334】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－ＰＡＭ配列
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子、または標的核酸を切断するためには二つの条件が必要である。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子、または標的核酸を切断するためには二つの条件が必要である。
【0335】
第１に、標的遺伝子、または標的核酸内にＣａｓ１２ｆ１タンパク質が認識できる一定の長さの塩基配列（ヌクレオチド配列）がなければならない。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質によって認識される一定の長さの塩基配列（ヌクレオチド配列）をＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）配列という。前記ＰＡＭ配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質により定められる固有の配列である。第２に、前記一定の長さのＰＡＭ配列周辺にガイドＲＮＡに含まれたスペーサー配列と相補的に結合できる配列がなければならない。
【0336】
このような二つの条件が満足されて、１）Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質が前記一定の長さのＰＡＭ配列を認識し、２）前記スペーサー配列部分が前記ＰＡＭ配列周辺の配列部分と相補的に結合する場合、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質／ガイドＲＮＡ複合体（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体）は標的遺伝子、または標的核酸を切断する。したがって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の標的配列を決定する時、前記ＰＡＭ配列と隣接した配列内で前記標的配列を決定しなければならないという制約が伴う。
【0337】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－ＰＡＭ配列例示
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列はＴ－ｒｉｃｈ配列であり得る。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列はＴ－ｒｉｃｈ配列であり得る。
【0338】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＨＴＮであり得る。この時、前記Ｎはデオキシチミジン（Ｔ）、デオキシアデノシン（Ａ）、デオキシシチジン（Ｃ）、またはデオキシグアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記Ｈはデオキシチミジン（Ｔ）、デオキシアデノシン（Ａ）、およびデオキシシチジン（Ｃ）のうち一つである。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＴＴＮであり得る。この時、前記Ｎはデオキシチミジン（Ｔ）、デオキシアデノシン（Ａ）、デオキシシチジン（Ｃ）、またはデオキシグアノシン（Ｇ）のうち一つである。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＴＴＡ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＣ、またはＴＴＴＧであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＡＴＡ、ＴＡＴＴ、ＴＡＴＣ、またはＴＡＴＧであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＣＴＡ、ＴＣＴＴ、ＴＣＴＣ、またはＴＣＴＧであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＴＴＡまたはＴＴＴＧであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列とは異なるものであり得る。
【0339】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－配列例示
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２５９～配列番号２６６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有することができる。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２５９～配列番号２６６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有することができる。
【0340】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列はヒトコドン－最適化された配列であり得る。
【0341】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列は配列番号２６７～配列番号２７６からなる群から選択されたＤＮＡ配列であり得る。
【0342】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ
本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を構成するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものと同一の特徴および構造を有する。
本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を構成するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものと同一の特徴および構造を有する。
【0343】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体－構成例示
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２５９～配列番号２６２で選択されたアミノ酸配列を有し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは配列番号２１０～２５８、配列番号３８１～３９３、配列番号３９６～配列番号４０７、および配列番号４０９～配列番号４２１からなる群から選択された配列を有することができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが結合してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を形成することができる。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２５９～配列番号２６２で選択されたアミノ酸配列を有し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは配列番号２１０～２５８、配列番号３８１～３９３、配列番号３９６～配列番号４０７、および配列番号４０９～配列番号４２１からなる群から選択された配列を有することができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが結合してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を形成することができる。
【0344】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２６３～配列番号２６６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは配列番号２１０～２５８、配列番号３８１～３９３、配列番号３９６～配列番号４０７、および配列番号４０９～配列番号４２１からなる群から選択された配列を有することができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが結合してなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はベースエディティング機能を有することができる。
【0345】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現させるためのベクター
ベクター概括
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素を発現させるためのベクターを提供する。前記ベクターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現させるように構成される。前記ベクターの配列は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素のうち一つを暗号化する核酸配列を含んだり、二以上の構成要素を暗号化する核酸配列を含むことができる。前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む。前記ベクターの配列は一つ以上のプロモーター配列を含む。前記プロモーターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列と作動的に連結されて、細胞内で前記核酸配列の転写が促進されるようにする。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質と同一の特徴および構成を有する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと同一の特徴および構成を有する。
ベクター概括
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素を発現させるためのベクターを提供する。前記ベクターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現させるように構成される。前記ベクターの配列は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素のうち一つを暗号化する核酸配列を含んだり、二以上の構成要素を暗号化する核酸配列を含むことができる。前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む。前記ベクターの配列は一つ以上のプロモーター配列を含む。前記プロモーターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列と作動的に連結されて、細胞内で前記核酸配列の転写が促進されるようにする。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質と同一の特徴および構成を有する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと同一の特徴および構成を有する。
【0346】
前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含むことができる。一具現例として、前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列、およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列を含むことができる。前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を細胞内で発現させるためのプロモーター配列、およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を細胞内で発現させるためのプロモーター配列を含み、前記プロモーターは各発現対象と作動的に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）されている。一具現例として、前記ベクターの配列は前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列、および前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列を含むことができる。
【0347】
前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および二以上の互いに異なるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含むことができる。一具現例として、前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列、第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第３配列を含むことができる。ひいては、前記ベクターの配列は前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列、前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、前記第３配列と作動可能に連結された第３プロモーター配列を含むことができる。
【0348】
前記ベクターで、各構成要素を暗号化する核酸配列はＤＮＡ配列であり得る。
【0349】
発現対象－Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質
前記ベクターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を発現するように構成されたものであり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたものと同一の構成および特徴を有する。
前記ベクターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を発現するように構成されたものであり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたものと同一の構成および特徴を有する。
【0350】
一具現例として、前記ベクターは野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質を発現するように構成されたものであり得る。この時、前記野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ａ１であり得る。一具現例として、前記ベクターは標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断するように変更されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を発現するように構成されたものであり得る。ひいては、前記変更されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断することができ、切断しない鎖に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）またはプライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）をできるように変更されたものであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断できないように変更されたものであり得る。ひいては、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断できず、標的核酸に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、プライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、または遺伝子発現調節機能ができるように変更されたものであり得る。
【0351】
発現対象－エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ
前記ベクターはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現するように構成されたものであり得る。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明したエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと同一の特徴および構成を有する。前記ベクターは二以上の互いに異なるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現するように構成されたものであり得る。
前記ベクターはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現するように構成されたものであり得る。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明したエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと同一の特徴および構成を有する。前記ベクターは二以上の互いに異なるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現するように構成されたものであり得る。
【0352】
発現対象－付加構成要素
前記ベクターは前述した発現対象の他に、ＮＬＳ、タグタンパク質などの付加構成要素を発現するように構成されたものであり得る。一具現例として、前記付加構成要素は前記Ｃａｓ１２ｆ１、変形されたＣａｓ１２ｆ１、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡとは独立的に発現することができる。さらに他の具現例として、前記付加構成要素は前記Ｃａｓ１２ｆ１、変形されたＣａｓ１２ｆ１、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと連結されて発現することができる。この時、前記付加構成要素はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを発現させようとする時に一般的に発現させる構成要素であり得、公知技術を参照することができる。前記付加構成要素は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションで説明された構成要素のうち一つ以上であり得る。
前記ベクターは前述した発現対象の他に、ＮＬＳ、タグタンパク質などの付加構成要素を発現するように構成されたものであり得る。一具現例として、前記付加構成要素は前記Ｃａｓ１２ｆ１、変形されたＣａｓ１２ｆ１、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡとは独立的に発現することができる。さらに他の具現例として、前記付加構成要素は前記Ｃａｓ１２ｆ１、変形されたＣａｓ１２ｆ１、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと連結されて発現することができる。この時、前記付加構成要素はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを発現させようとする時に一般的に発現させる構成要素であり得、公知技術を参照することができる。前記付加構成要素は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションで説明された構成要素のうち一つ以上であり得る。
【0353】
ベクター構成－Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質発現配列
前記ベクター配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたものと同一の構成および特徴を有する。
前記ベクター配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたものと同一の構成および特徴を有する。
【0354】
一具現例として、前記ベクターの配列は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列を含むことができる。この時、前記野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ａ１であり得る。一具現例として、前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するヒトコドン最適化された核酸配列を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するヒトコドン最適化された核酸配列はＣａｓ１４ａ１タンパク質を暗号化するヒトコドン最適化された核酸配列であり得る。一具現例として、前記ベクターの配列は変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質を暗号化する配列を含むことができる。一具現例として、前記ベクターの配列は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断することができ、切断しない鎖に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）またはプライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）をできるように変更されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列を含むことができる。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断できず、標的核酸に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、プライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、または遺伝子発現調節機能ができるように変更されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列を含むことができる。
【0355】
ベクター構成－エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ発現配列
一具現例として、前記ベクターの配列はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列を含むことができる。例えば、前記ベクターの配列は配列番号２１０～配列番号２５８、配列番号３８１～配列番号３９３、配列番号３９５～配列番号４０７、配列番号４０９～配列番号４２１、および配列番号４３６～配列番号４３９からなる群から選択された配列を含むことができる。
一具現例として、前記ベクターの配列はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列を含むことができる。例えば、前記ベクターの配列は配列番号２１０～配列番号２５８、配列番号３８１～配列番号３９３、配列番号３９５～配列番号４０７、配列番号４０９～配列番号４２１、および配列番号４３６～配列番号４３９からなる群から選択された配列を含むことができる。
【0356】
一具現例として、前記ベクターの配列は二以上の互いに異なるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列を含むことができる。例えば、前記ベクターの配列は配列番号２１０～配列番号２５８、配列番号３８１～配列番号３９３、配列番号３９５～配列番号４０７、配列番号４０９～配列番号４２１、および配列番号４３６～配列番号４３９からなる群からそれぞれ選択された第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列、および第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列を含むことができる。
【0357】
ベクター構成－プロモーター配列
前記ベクター配列は各構成要素を暗号化する配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。具体的には、前記プロモーター配列は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションのうちプロモーター部分に開示されたプロモーターのうち一つであり得るが、これに制限されない。
前記ベクター配列は各構成要素を暗号化する配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。具体的には、前記プロモーター配列は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションのうちプロモーター部分に開示されたプロモーターのうち一つであり得るが、これに制限されない。
【0358】
一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列、およびプロモーター配列を含むことができる。この時、前記プロモーター配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列と作動可能に連結されたものである。一具現例として、前記ベクター配列はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列、およびプロモーター配列を含むことができる。この時、前記プロモーター配列は前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列と作動可能に連結されたものである。一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列、およびプロモーター配列を含むことができる。この時、前記プロモーター配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列、および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列と作動的に連結されて、前記プロモーター配列によって活性化した転写因子が前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現させる。
【0359】
ベクター構成－二以上のプロモーター配列を含む可能
一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する第１配列、第１プロモーター配列、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する第２配列、および第２プロモーター配列を含むことができる。この時、前記第１プロモーター配列は前記第１配列と作動的に連結され、前記第２プロモーター配列は前記第２配列と作動的に連結され、前記第１プロモーター配列によって前記第１配列の転写が誘導され、前記第２プロモーター配列によって前記第２配列の転写が誘導される。この時、前記第１プロモーターおよび前記第２プロモーターは同一の種類のプロモーターであり得る。この時、前記第１プロモーターおよび前記第２プロモーターは異なる種類のプロモーターであり得る。
一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する第１配列、第１プロモーター配列、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する第２配列、および第２プロモーター配列を含むことができる。この時、前記第１プロモーター配列は前記第１配列と作動的に連結され、前記第２プロモーター配列は前記第２配列と作動的に連結され、前記第１プロモーター配列によって前記第１配列の転写が誘導され、前記第２プロモーター配列によって前記第２配列の転写が誘導される。この時、前記第１プロモーターおよび前記第２プロモーターは同一の種類のプロモーターであり得る。この時、前記第１プロモーターおよび前記第２プロモーターは異なる種類のプロモーターであり得る。
【0360】
一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する第１配列、第１プロモーター配列、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する第２配列、第２プロモーター配列、第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する第３配列、および第３プロモーター配列を含むことができる。この時、前記第１プロモーター配列は前記第１配列と作動的に連結され、前記第２プロモーター配列は前記第２配列と作動的に連結され、前記第３プロモーター配列は前記第３配列と作動的に連結され、前記第１プロモーター配列によって前記第１配列の転写が誘導され、前記第２プロモーター配列によって前記第２配列の転写が誘導され、前記第３プロモーター配列によって前記第３配列の転写が誘導される。この時、前記第２プロモーターおよび前記第３プロモーターは同一の種類のプロモーターであり得る。具体的には、前記第２プロモーター配列および前記第３プロモーター配列はＵ６プロモーター配列であり得るが、これに制限されるものではない。この時、前記第２プロモーターおよび前記第３プロモーターは異なる種類のプロモーターであり得る。具体的には、前記第２プロモーターはＵ６プロモーター配列、前記第３プロモーターはＨ１プロモーター配列であり得るが、これに制限されるものではない。
【0361】
ベクター構成－終結信号
前記ベクターは前記プロモーター配列と作動可能に連結された終結信号を含むことができる。この時、前記終結信号は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションの終結信号部分で開示された終結信号のうち一つであり得るが、これに制限されない。前記終結信号は、プロモーター配列の種類によって変わり得る。
前記ベクターは前記プロモーター配列と作動可能に連結された終結信号を含むことができる。この時、前記終結信号は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションの終結信号部分で開示された終結信号のうち一つであり得るが、これに制限されない。前記終結信号は、プロモーター配列の種類によって変わり得る。
【0362】
一具現例として、前記ベクター配列がＵ６プロモーター配列を含む場合、前記Ｕ６プロモーター配列と作動可能に連結された、チミジン連続配列が終結信号として作用することができる。一具現例として、前記チミジン連続配列は５個以上のチミジンが連続に連結された配列であり得る。一具現例として、前記ベクター配列がＨ１プロモーター配列を含む場合、前記Ｈ１プロモーター配列と作動可能に連結された、チミジン連続配列が終結信号として作用することができる。一具現例として、前記チミジン連続配列は５個以上のチミジンが連続に連結された配列であり得る。
【0363】
ベクター構成－その他構成
前記ベクター配列は前記構成の他に、目的により必要な構成要素を含むことができる。
前記ベクター配列は前記構成の他に、目的により必要な構成要素を含むことができる。
【0364】
一具現例として、前記ベクター配列は調節／制御構成要素の配列、および／または付加構成要素の配列を含むことができる。一具現例として、前記付加構成要素は形質注入された細胞を非形質注入細胞から区別するための目的で付加されたものであり得る。この時、前記調節／制御構成要素の配列および付加構成要素は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションに開示されたもののうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。
【0365】
ベクターの種類－ウイルスベクター
前記ベクターはウイルスベクターであり得る。
前記ベクターはウイルスベクターであり得る。
【0366】
一具現例として、前記ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であり得る。一具現例として、前記ウイルスベクターはアデノ－関連ウイルスであり得る。
【0367】
ベクターの種類－非ウイルスベクター
前記ベクターは非ウイルスベクターであり得る。一具現例として、前記非ウイルスベクターはプラスミド、ファージ、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、およびｍＲＮＡで構成された群から選択される１以上であり得る。一具現例として、前記プラスミドはｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧ１７９６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、およびｐＵＣ１９からなる群から選択されたものであり得る。一具現例として、前記ファージはλｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、およびＭ１３からなる群から選択されたものであり得る。一具現例として、前記ベクターはＰＣＲアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）であり得る。
前記ベクターは非ウイルスベクターであり得る。一具現例として、前記非ウイルスベクターはプラスミド、ファージ、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、およびｍＲＮＡで構成された群から選択される１以上であり得る。一具現例として、前記プラスミドはｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧ１７９６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、およびｐＵＣ１９からなる群から選択されたものであり得る。一具現例として、前記ファージはλｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、およびＭ１３からなる群から選択されたものであり得る。一具現例として、前記ベクターはＰＣＲアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）であり得る。
【0368】
ベクター形態－円形または線形ベクター
前記ベクターは円形または線形形態であり得る。前記ベクターが線形ベクターである場合、前記線形ベクター配列が終結信号を別途に含まなくても、その３'末端でＲＮＡ転写が終結する。これと比較して、前記ベクターが円形ベクターである場合、前記円形ベクター配列が終結信号を別途に含まないのであれば、ＲＮＡ転写が終結しなくなる。したがって、前記ベクターとして円形ベクターを使う場合、意図した対象を発現するためには各プロモーター配列に関連した転写因子に対応する終結信号が含まれなければならない。
前記ベクターは円形または線形形態であり得る。前記ベクターが線形ベクターである場合、前記線形ベクター配列が終結信号を別途に含まなくても、その３'末端でＲＮＡ転写が終結する。これと比較して、前記ベクターが円形ベクターである場合、前記円形ベクター配列が終結信号を別途に含まないのであれば、ＲＮＡ転写が終結しなくなる。したがって、前記ベクターとして円形ベクターを使う場合、意図した対象を発現するためには各プロモーター配列に関連した転写因子に対応する終結信号が含まれなければならない。
【0369】
一具現例として、前記ベクターは線形ベクターであり得る。一具現例として、前記ベクターは線形のアンプリコンであり得る。一具現例として、前記ベクターは配列番号２６７～配列番号２７６から選択された配列および配列番号２１０～２５８、配列番号３８１～３９３、配列番号３９６～配列番号４０７、および配列番号４０９～配列番号４２１からなる群から選択された配列を含む線形ベクターであり得る。一具現例として、前記ベクターは円形ベクターであり得る。一具現例として、前記ベクターは配列番号２６７～配列番号２７６から選択された配列、および配列番号２１０～２５８、配列番号３８１～３９３、配列番号３９６～配列番号４０７、および配列番号４０９～配列番号４２１からなる群から選択された配列を含む円形ベクターであり得る。
【0370】
ベクター－配列例示
一具現例として、前記ベクターの配列は配列番号２６７～配列番号２７６から選択された配列、および配列番号２１０～２５８、配列番号３８１～３９３、配列番号３９６～配列番号４０７、および配列番号４０９～配列番号４２１からなる群から選択された配列を含むことができる。
一具現例として、前記ベクターの配列は配列番号２６７～配列番号２７６から選択された配列、および配列番号２１０～２５８、配列番号３８１～３９３、配列番号３９６～配列番号４０７、および配列番号４０９～配列番号４２１からなる群から選択された配列を含むことができる。
【0371】
核酸の化学的な変形
本明細書ではエンジニアリングされたｃｒＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素を発現させるためのベクターなどの核酸を含むか、核酸からなる構成要素を提供する。この時、前記構成要素で「核酸」とは、自然界に存在するＤＮＡ、またはＲＮＡであり得、前記構成核酸の一部又は全部に化学的変形が起きた、変形された核酸であり得る。一具現例として、前記構成核酸は自然界に存在するＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。一具現例として、前記構成核酸は一つ以上のヌクレオチドが化学的に変形されたものであり得る。この時、前記化学的変形は当業者に知られている核酸の変形をすべて含む。具体的には、前記化学的変形は（ＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１）に記載された核酸の変形をすべて含むことができるが、これに制限されるものではない。
本明細書ではエンジニアリングされたｃｒＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素を発現させるためのベクターなどの核酸を含むか、核酸からなる構成要素を提供する。この時、前記構成要素で「核酸」とは、自然界に存在するＤＮＡ、またはＲＮＡであり得、前記構成核酸の一部又は全部に化学的変形が起きた、変形された核酸であり得る。一具現例として、前記構成核酸は自然界に存在するＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。一具現例として、前記構成核酸は一つ以上のヌクレオチドが化学的に変形されたものであり得る。この時、前記化学的変形は当業者に知られている核酸の変形をすべて含む。具体的には、前記化学的変形は（ＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１）に記載された核酸の変形をすべて含むことができるが、これに制限されるものではない。
【0372】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを利用したゲノム編集方法
【0373】
ゲノム編集方法概括
本明細書ではエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを利用して対象細胞内の標的遺伝子、または標的核酸を編集する方法を提供する。前記標的遺伝子、または標的核酸は標的配列を含む。前記標的核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質、またはそれぞれを暗号化する核酸を標的遺伝子、または標的核酸を含んでいる対象細胞内に送達することを含む。その結果、前記対象細胞内にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が注入されたり、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の形成が誘導され、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって標的遺伝子が編集される。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものと同一の特徴および構造を有する。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」セクションで説明されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／または変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の特徴および構成を有する。
本明細書ではエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを利用して対象細胞内の標的遺伝子、または標的核酸を編集する方法を提供する。前記標的遺伝子、または標的核酸は標的配列を含む。前記標的核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質、またはそれぞれを暗号化する核酸を標的遺伝子、または標的核酸を含んでいる対象細胞内に送達することを含む。その結果、前記対象細胞内にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が注入されたり、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の形成が誘導され、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって標的遺伝子が編集される。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものと同一の特徴および構造を有する。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」セクションで説明されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／または変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の特徴および構成を有する。
【0374】
一具現例として、前記ゲノム編集方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。
【0375】
この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを含む。
【0376】
この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は前述した「エンジニアリングされたスキャフォールド領域」段落のうちいずれか一つで叙述されたものと同一の特徴および構造を有する。一例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は配列番号１８６～１６７からなる群から選択された配列で表現され得る。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は配列番号１８７～１９８からなる群から選択された配列で表現され得る。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は配列番号１９９～２０５からなる群から選択された配列で表現され得る。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は配列番号２０６～２０９からなる群から選択された配列で表現され得る。
【0377】
この時、前記スペーサー配列は前記対象細胞内に含まれた標的遺伝子、または標的核酸と相補的に結合することができる。
【0378】
対象細胞
一具現例として、前記対象細胞は原核細胞であり得る。一具現例として、前記対象細胞は真核細胞であり得る。具体的には、前記真核細胞は植物細胞、動物細胞、および／またはヒト細胞であり得るが、これに制限されない。
一具現例として、前記対象細胞は原核細胞であり得る。一具現例として、前記対象細胞は真核細胞であり得る。具体的には、前記真核細胞は植物細胞、動物細胞、および／またはヒト細胞であり得るが、これに制限されない。
【0379】
標的配列決定
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で編集しようとする標的遺伝子、または標的核酸、および標的配列はゲノム編集の目的、対象細胞環境、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質が認識するＰＡＭ配列、および／またはその他の変数を考慮して決定することができる。この時、適切な長さの標的配列を決定できるのであれば、その方法は特に制限されず、公知の技術を活用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で編集しようとする標的遺伝子、または標的核酸、および標的配列はゲノム編集の目的、対象細胞環境、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質が認識するＰＡＭ配列、および／またはその他の変数を考慮して決定することができる。この時、適切な長さの標的配列を決定できるのであれば、その方法は特に制限されず、公知の技術を活用することができる。
【0380】
標的配列によるスペーサー配列決定
前記標的配列が決定されると、これに対応するスペーサー配列を設計する。前記スペーサー配列は前記標的配列と相補的に結合できる配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的遺伝子と相補的に結合できる配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸と相補的に結合できるように設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸の標的鎖配列に含まれた標的配列と相補的な配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸の非標的鎖配列に含まれたプロトスペーサーのＤＮＡ配列に相応するＲＮＡ配列で設計される。具体的には、前記スペーサー配列は、前記プロトスペーサー配列と同一のヌクレオチド配列を有するものの、前記ヌクレオチド配列に含まれたチミジンそれぞれがすべてウリジンで置換された配列で設計される。
前記標的配列が決定されると、これに対応するスペーサー配列を設計する。前記スペーサー配列は前記標的配列と相補的に結合できる配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的遺伝子と相補的に結合できる配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸と相補的に結合できるように設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸の標的鎖配列に含まれた標的配列と相補的な配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸の非標的鎖配列に含まれたプロトスペーサーのＤＮＡ配列に相応するＲＮＡ配列で設計される。具体的には、前記スペーサー配列は、前記プロトスペーサー配列と同一のヌクレオチド配列を有するものの、前記ヌクレオチド配列に含まれたチミジンそれぞれがすべてウリジンで置換された配列で設計される。
【0381】
一具現例として、前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個または５０個のヌクレオチドの長さを有する。好ましくは１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のヌクレオチドの長さを有する。
【0382】
標的配列とスペーサー配列の相補性
一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列であり得る。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と直前の文章で選択された数値範囲内相補的な配列であり得る。例えば、前記スペーサー配列は前記標的配列と６０％～９０％相補的な配列であり得る。さらに他の例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と９０％～１００％相補的な配列であり得る。
一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列であり得る。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と直前の文章で選択された数値範囲内相補的な配列であり得る。例えば、前記スペーサー配列は前記標的配列と６０％～９０％相補的な配列であり得る。さらに他の例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と９０％～１００％相補的な配列であり得る。
【0383】
標的配列とスペーサー配列間のミスマッチ個数
一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のミスマッチを有する相補的な配列であり得る。一具現例として、前記スペーサー配列は直前の文章で選択された数値範囲内のミスマッチを有することができる。例えば、前記スペーサー配列は前記標的配列と０個、１個、２個、３個、４個、または５個のミスマッチを有することができる。さらに他の例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と六つ～１０個のミスマッチを有することができる。
一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のミスマッチを有する相補的な配列であり得る。一具現例として、前記スペーサー配列は直前の文章で選択された数値範囲内のミスマッチを有することができる。例えば、前記スペーサー配列は前記標的配列と０個、１個、２個、３個、４個、または５個のミスマッチを有することができる。さらに他の例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と六つ～１０個のミスマッチを有することができる。
【0384】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体利用
本明細書で提供するゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的特異的に遺伝子、または核酸を切断する活性を有するという点を利用する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」セクションで説明されたエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体と同一の特徴および構成を有する。
本明細書で提供するゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的特異的に遺伝子、または核酸を切断する活性を有するという点を利用する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」セクションで説明されたエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体と同一の特徴および構成を有する。
【0385】
ＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体各構成要素の細胞内送達
本明細書で提供するゲノム編集方法は、対象細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸と接触することを包含する。したがって、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が前記標的遺伝子、または標的核酸と接触することを誘導するために、前記ゲノム編集方法は前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の各構成要素を対象細胞内に送達することを含む。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は多様な送達形態で、多様な送達方法を利用して対象細胞内に送達され得る。
本明細書で提供するゲノム編集方法は、対象細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸と接触することを包含する。したがって、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が前記標的遺伝子、または標的核酸と接触することを誘導するために、前記ゲノム編集方法は前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の各構成要素を対象細胞内に送達することを含む。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は多様な送達形態で、多様な送達方法を利用して対象細胞内に送達され得る。
【0386】
送達形態－ＲＮＰ
前記送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したリボヌクレオプロテイン粒子（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＲＮＰ）を利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を対象細胞内に注入することを含むことができる。
前記送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したリボヌクレオプロテイン粒子（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＲＮＰ）を利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を対象細胞内に注入することを含むことができる。
【0387】
送達形態－非ウイルスベクター
さらに他の送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む非ウイルスベクターを利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む非ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記非ウイルスベクターはプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、またはｍＲＮＡであり得るが、これに制限されるものではない。さらに他の具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第１非ウイルスベクター、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第２非ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記第１非ウイルスベクターおよび前記第２非ウイルスベクターはそれぞれプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、およびｍＲＮＡからなる群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。
さらに他の送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む非ウイルスベクターを利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む非ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記非ウイルスベクターはプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、またはｍＲＮＡであり得るが、これに制限されるものではない。さらに他の具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第１非ウイルスベクター、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第２非ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記第１非ウイルスベクターおよび前記第２非ウイルスベクターはそれぞれプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、およびｍＲＮＡからなる群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。
【0388】
送達形態－ウイルスベクター
さらに他の送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むウイルスベクターを利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。一具現例として、前記ウイルスベクターはアデノ－関連ウイルスであり得る。
さらに他の送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むウイルスベクターを利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。一具現例として、前記ウイルスベクターはアデノ－関連ウイルスであり得る。
【0389】
さらに他の具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第１ウイルスベクター、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第２ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターはそれぞれレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。
【0390】
送達方法－一般的な送達手段
前記送達方法は、細胞内にエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を適切な送達形態で細胞内に送達できるものであれば特に制限されない。一具現例として、前記送達方法は電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、磁気注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、および／または一時的な細胞圧縮またはスクイージングであり得る。
前記送達方法は、細胞内にエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を適切な送達形態で細胞内に送達できるものであれば特に制限されない。一具現例として、前記送達方法は電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、磁気注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、および／または一時的な細胞圧縮またはスクイージングであり得る。
【0391】
送達方法－ナノパーティクル
前記送達方法は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに含まれた少なくとも一つの構成要素をナノパーティクルを利用して送達することもできる。この時、前記送達方法は当業界の通常の技術者が適切に選択できる公知の方法であり得る。例えば、前記ナノパーティクル送達方法は（ＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１）に開示された方法であり得るが、これに制限されるものではない。
前記送達方法は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに含まれた少なくとも一つの構成要素をナノパーティクルを利用して送達することもできる。この時、前記送達方法は当業界の通常の技術者が適切に選択できる公知の方法であり得る。例えば、前記ナノパーティクル送達方法は（ＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１）に開示された方法であり得るが、これに制限されるものではない。
【0392】
一具現例として、前記送達方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸をナノパーティクルを利用して送達することもできる。一具現例として、前記送達方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および／または第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸をナノパーティクルを利用して送達することもできる。この時、前記送達方法は陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ、脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、燐酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染、ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染、および／またはナノパーティクル－媒介核酸送達（Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ２０１２ Ｓｅｐ １３． ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３参照）であり得るが、これに制限されるものではない。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素はＲＮＰ、非ウイルスベクター、および／またはウイルスベクター形態であり得る。例えば、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素は各構成要素を暗号化するｍＲＮＡ形態であり得るが、これに制限されるものではない。
【0393】
送達形態および方法－組み合わせ可能
前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内送達することを含むが、この時、前記構成の送達形態および／または送達方法は互いに同一または異なり得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸は第１送達形態で送達し、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は第２送達形態で送達することを含むことができる。この時、前記第１送達形態および前記第２送達形態はそれぞれ前述した送達形態のうちいずれか一つであり得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸は第１送達方法で送達し、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は第２送達方法で送達することを含むことができる。この時、前記第１送達方法および前記第２送達方法はそれぞれ前述した送達方法のうちいずれか一つであり得る。
前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内送達することを含むが、この時、前記構成の送達形態および／または送達方法は互いに同一または異なり得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸は第１送達形態で送達し、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は第２送達形態で送達することを含むことができる。この時、前記第１送達形態および前記第２送達形態はそれぞれ前述した送達形態のうちいずれか一つであり得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸は第１送達方法で送達し、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は第２送達方法で送達することを含むことができる。この時、前記第１送達方法および前記第２送達方法はそれぞれ前述した送達方法のうちいずれか一つであり得る。
【0394】
送達順序
前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内送達することを含むが、この時、前記構成が細胞内に同時に送達されたりまたは時間差を置いて順次送達され得る。
前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内送達することを含むが、この時、前記構成が細胞内に同時に送達されたりまたは時間差を置いて順次送達され得る。
【0395】
一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を同時に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達した後、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達した後、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を細胞内に送達した後、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを細胞内に送達することを含むことができる。
【0396】
複数のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸送達
本明細書で提供するゲノム編集方法は、対象細胞内にＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および二以上のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を送達することを含むことができる。前記方法を通じて、互いに異なる配列を標的な二以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内に導入されたり、対象細胞内で形成され得る。その結果、細胞内に含まれた互いに異なる二以上の標的遺伝子、または標的核酸が編集され得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を標的遺伝子または標的核酸を含んでいる対象細胞内に送達することを含む。この時、前記各構成要素は前述した送達形態および送達方法のうち一つ以上を使って細胞内に送達され得る。この時、二以上の構成要素が細胞内に同時に送達され得、または順次送達され得る。
本明細書で提供するゲノム編集方法は、対象細胞内にＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および二以上のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を送達することを含むことができる。前記方法を通じて、互いに異なる配列を標的な二以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内に導入されたり、対象細胞内で形成され得る。その結果、細胞内に含まれた互いに異なる二以上の標的遺伝子、または標的核酸が編集され得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を標的遺伝子または標的核酸を含んでいる対象細胞内に送達することを含む。この時、前記各構成要素は前述した送達形態および送達方法のうち一つ以上を使って細胞内に送達され得る。この時、二以上の構成要素が細胞内に同時に送達され得、または順次送達され得る。
【0397】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的核酸と接触
本明細書で提供するゲノム編集方法で、標的遺伝子、または標的核酸の編集は対象細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸と接触しながらなされる。したがって、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で接触するようにするか、接触を誘導することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で標的核酸と接触することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で標的核酸と接触するように誘導することを含むことができる。この時、前記柔道は前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が細胞内で標的核酸と接触するようにする方法であれば特に制限されない。一具現例として、前記柔道はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達することもできる。
本明細書で提供するゲノム編集方法で、標的遺伝子、または標的核酸の編集は対象細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸と接触しながらなされる。したがって、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で接触するようにするか、接触を誘導することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で標的核酸と接触することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で標的核酸と接触するように誘導することを含むことができる。この時、前記柔道は前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が細胞内で標的核酸と接触するようにする方法であれば特に制限されない。一具現例として、前記柔道はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達することもできる。
【0398】
ゲノム編集結果－インデル（ｉｎｄｅｌ）
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸にインデルが発生し得る。この時、前記インデルは標的配列部分および／またはプロトスペーサー配列部分の内部および／または外部で起き得る。前記インデルは、ゲノム編集前に核酸のヌクレオチド配列から一部のヌクレオチドが途中で欠失したり、任意のヌクレオチドが挿入されたり、および／または前記挿入と欠失が混入された変異を称する。一般的に、標的遺伝子または標的核酸配列私のインデルが起きれば、該当遺伝子または核酸が不活性化する。一具現例として、前記ゲノム編集方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上のヌクレオチドが欠失および／または追加され得る。
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸にインデルが発生し得る。この時、前記インデルは標的配列部分および／またはプロトスペーサー配列部分の内部および／または外部で起き得る。前記インデルは、ゲノム編集前に核酸のヌクレオチド配列から一部のヌクレオチドが途中で欠失したり、任意のヌクレオチドが挿入されたり、および／または前記挿入と欠失が混入された変異を称する。一般的に、標的遺伝子または標的核酸配列私のインデルが起きれば、該当遺伝子または核酸が不活性化する。一具現例として、前記ゲノム編集方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上のヌクレオチドが欠失および／または追加され得る。
【0399】
ゲノム編集結果－ベースエディティング（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ベースエディティングが起き得る。これは標的遺伝子または標的核酸内任意のヌクレオチドが欠失、または追加されるインデルとは異なり、核酸内一つ以上の特定ヌクレオチドを意図通りに変更することを意味する。換言すると、標的遺伝子または標的核酸内の特定位置で、予め意図した点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こすことである。一具現例として、前記ゲノム編集方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換され得る。
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ベースエディティングが起き得る。これは標的遺伝子または標的核酸内任意のヌクレオチドが欠失、または追加されるインデルとは異なり、核酸内一つ以上の特定ヌクレオチドを意図通りに変更することを意味する。換言すると、標的遺伝子または標的核酸内の特定位置で、予め意図した点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こすことである。一具現例として、前記ゲノム編集方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換され得る。
【0400】
ゲノム編集結果－挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ノックインが発生し得る。前記ノックインは標的遺伝子または標的核酸配列内に追加的な核酸配列を挿入することを意味する。前記ノックインが起きるためには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の他に前記追加的な核酸配列を含むドナーがさらに必要である。細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸を切断する場合、前記切断された標的遺伝子または標的核酸の修復が起きることになる。この時、前記ドナーが前記修復過程に関与して前記追加的な核酸配列が標的遺伝子または標的核酸内に挿入されるようにする。一具現例として、前記ゲノム編集方法は対象細胞内にドナーを導入することを追加的に含むことができる。例えば、前記ドナーは細胞内ゲノムに挿入するための外来ＤＮＡ（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、前記ドナーによって前記標的遺伝子または前記標的核酸内前記外来ＤＮＡ配列の挿入が誘導される。この時、前記ドナーを対象細胞内に送達する時、前述した送達形態および／または送達方法が使われ得る。
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ノックインが発生し得る。前記ノックインは標的遺伝子または標的核酸配列内に追加的な核酸配列を挿入することを意味する。前記ノックインが起きるためには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の他に前記追加的な核酸配列を含むドナーがさらに必要である。細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸を切断する場合、前記切断された標的遺伝子または標的核酸の修復が起きることになる。この時、前記ドナーが前記修復過程に関与して前記追加的な核酸配列が標的遺伝子または標的核酸内に挿入されるようにする。一具現例として、前記ゲノム編集方法は対象細胞内にドナーを導入することを追加的に含むことができる。例えば、前記ドナーは細胞内ゲノムに挿入するための外来ＤＮＡ（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、前記ドナーによって前記標的遺伝子または前記標的核酸内前記外来ＤＮＡ配列の挿入が誘導される。この時、前記ドナーを対象細胞内に送達する時、前述した送達形態および／または送達方法が使われ得る。
【0401】
ゲノム編集結果－除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸配列の全部または一部を除去することができる。前記除去は前記標的遺伝子または前記標的核酸内の一部の塩基配列（ヌクレオチド配列）を一定の長さ以上除去することを意味する。前記除去は前述したインデル効果と比較して、遺伝子の特定領域、例えば、第１エクソン領域を全体的に除去（ｒｅｍｏｖａｌ）できる効果を意味する。
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸配列の全部または一部を除去することができる。前記除去は前記標的遺伝子または前記標的核酸内の一部の塩基配列（ヌクレオチド配列）を一定の長さ以上除去することを意味する。前記除去は前述したインデル効果と比較して、遺伝子の特定領域、例えば、第１エクソン領域を全体的に除去（ｒｅｍｏｖａｌ）できる効果を意味する。
【0402】
一具現例として、前記ゲノム編集方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を標的遺伝子または標的核酸を含む細胞内に導入することを含む。これによって、前記ゲノム編集結果標的遺伝子または標的核酸内に特定配列部分の除去が起きる。
【0403】
ゲノム編集方法例示
一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したリボヌクレオプロテイン粒子形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を真核細胞内に送達することを含むことができる。この時、前記送達は電気穿孔法、またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎを利用したものであり得る。
一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したリボヌクレオプロテイン粒子形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を真核細胞内に送達することを含むことができる。この時、前記送達は電気穿孔法、またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎを利用したものであり得る。
【0404】
一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を真核細胞内に送達することを含むことができる。この時、前記送達は電気穿孔法、またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎを利用したものであり得る。
【0405】
一具現例として、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むアデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを真核細胞内に送達することを含むことができる。
【0406】
一具現例として、前記ゲノム編集方法は第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列、第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むアデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを真核細胞内に送達することを含むことができる。
【0407】
発明の可能な実施例
【0408】
実施例１、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ａ、ＭＦ
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
【0409】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0410】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0411】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0412】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0413】
実施例２、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ａ、ＷＴ
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
【0414】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；および
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
スペーサー；および
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0415】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0416】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0417】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
【0418】
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＧＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＧＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＧＡＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３００）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＧＡＡＡＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＧＡＡＡＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１３）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１４）からなる群から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0419】
実施例３、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．０
実施例１において、前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
実施例１において、前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
【0420】
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0421】
実施例４、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．１
実施例１において、前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例１において、前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0422】
実施例５、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド；および
スペーサー、
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド；および
スペーサー、
【0423】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：５'－Ａ－３'で表現される第１配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３３）で表現される第４配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：５'－Ａ－３'で表現される第１配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣ－３'（配列番号４３２）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３３）で表現される第４配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
【0424】
実施例６、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、Ｌｉｎｋｅｒ
実施例５において、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例５において、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【0425】
実施例７、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、Ｌｉｎｋｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ
実施例５において、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＧＡＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡ－３'（配列番号４２５）、５'－ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２６）、５'－ＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２７）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２８）からなる群から選択されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例５において、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＧＡＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡ－３'（配列番号４２５）、５'－ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２６）、５'－ＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２７）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号４２８）からなる群から選択されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【0426】
実施例８、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、＋ １ｓｔ ｒｅｇｉｏｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ
実施例５において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＧＡ－３'、５'－ＡＧＡ－３'、５'－ＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３７）からなる群から選択された第９配列を追加的に含み、前記第９配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例５において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＧＡ－３'、５'－ＡＧＡ－３'、５'－ＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３７）からなる群から選択された第９配列を追加的に含み、前記第９配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【0427】
実施例９、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、＋ ２ｎｄ ｒｅｇｉｏｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ
実施例５において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）、および５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）からなる群から選択された第１０配列、および
５'－Ｕ－３'、５'－ＣＵ－３'、５'－ＡＣＵ－３'、５'－ＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）、５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）、および５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）からなる群から選択された第１１配列を追加的に含み、
前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されており、
前記第３配列の３'末端および前記第４配列の５'末端は前記第１１配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例５において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）、および５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）からなる群から選択された第１０配列、および
５'－Ｕ－３'、５'－ＣＵ－３'、５'－ＡＣＵ－３'、５'－ＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）、５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）、および５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）からなる群から選択された第１１配列を追加的に含み、
前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されており、
前記第３配列の３'末端および前記第４配列の５'末端は前記第１１配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【0428】
実施例１０、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、＋ ２ｎｄ ｒｅｇｉｏｎ ｅｘａｍｐｌｅｓ
実施例９において、
前記第１０配列が５'－Ａ－３'である場合、前記第１１配列は５'－Ｕ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'または５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４０）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４４２）であり得る。
実施例９において、
前記第１０配列が５'－Ａ－３'である場合、前記第１１配列は５'－Ｕ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'または５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'である場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５４）であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５２）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５３）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）であり、
前記第１０配列が５'－ＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４０）である場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵ－３'（配列番号４４２）であり得る。
【0429】
前記第１０配列が５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）である場合、 前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）であることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【0430】
実施例１１、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、ｖ４．０
実施例１０において、前記第１０配列は５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）であり、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）であることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１０において、前記第１０配列は５'－ＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号４４１）であり、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧ－３'（配列番号４４３）であることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【0431】
実施例１２、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、＋ ４ｔｈ＆５ｔｈ ｒｅｇｉｏｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ
実施例５において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は、
５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１２配列、および
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１３配列を追加的に含み、
この時、前記第６配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１２配列を通じて連結され、
前記リンカーの３'末端および前記第７配列の５'末端は前記第１３配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例５において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は、
５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１２配列、および
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１３配列を追加的に含み、
この時、前記第６配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１２配列を通じて連結され、
前記リンカーの３'末端および前記第７配列の５'末端は前記第１３配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【0432】
実施例１３、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、４ｔｈ＆５ｔｈ ｒｅｇｉｏｎ ｅｘａｍｐｌｅｓ
実施例１２において、
前記第１２配列が５'－Ｕ－３'である場合、前記第１３配列は５'－Ａ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'であることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１２において、
前記第１２配列が５'－Ｕ－３'である場合、前記第１３配列は５'－Ａ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'である場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'であることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【0433】
実施例１４、ｄｕａｌ ｇＲＮＡ
次を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次の配列を含む：
次を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
この時、前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次の配列を含む：
【0434】
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列、
【0435】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列、
【0436】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）、および
【0437】
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６８）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
【0438】
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１４）からなる群から選択された配列、および
【0439】
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されており、
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列が５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、および前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列が５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合は除外されることを特徴とする。
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されており、
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列が５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、および前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列が５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合は除外されることを特徴とする。
【0440】
実施例１５、ｃｏｍｐｌｅｘ、ｖｅｒ．Ａ
次を含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
次を含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
【0441】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0442】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0443】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0444】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
【0445】
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0446】
実施例１６、ｃｏｍｐｌｅｘ、ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．０
実施例１５において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例１５において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0447】
実施例１７、ｃｏｍｐｌｅｘ、ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．１
実施例１５において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例１５において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0448】
実施例１８、ｃｏｍｐｌｅｘ、ｖｅｒ．Ｂ
次を含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
実施例５～実施例１３のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
次を含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
実施例５～実施例１３のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【0449】
実施例１９、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ａ
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
【0450】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0451】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0452】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0453】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
【0454】
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0455】
実施例２０、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．０
実施例１９において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするベクター：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例１９において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするベクター：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0456】
実施例２１、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．１
実施例１９において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするベクター：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例１９において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするベクター：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0457】
実施例２２、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ａ、ｖｉｒａｌ ｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ
実施例１９において、前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とするベクター。
実施例１９において、前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とするベクター。
【0458】
実施例２３、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ｂ
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
実施例５～実施例１３のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列。
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
実施例５～実施例１３のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列。
【0459】
実施例２４、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ＭＦ
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；
【0460】
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0461】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0462】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0463】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0464】
実施例２５、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ＷＴ
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
【0465】
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；および
スペーサー；および
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
スペーサー；および
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３１５）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
【0466】
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１６）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号９）からなる群から選択された配列；
【0467】
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
【0468】
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１１）；
【0469】
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＧＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＧＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＧＡＡＡＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号２９９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３００）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＧＡＡＡＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３０９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＧＡＡＡＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１３）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号３１４）からなる群から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
【0470】
実施例２６、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ＲＮＰ
実施例２４または実施例２５のうちいずれか一項において、前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でとして細胞内に注入することである方法．
実施例２４または実施例２５のうちいずれか一項において、前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でとして細胞内に注入することである方法．
【0471】
実施例２７、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ
実施例２４において、前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むベクターを細胞内に注入することである方法．
実施例２４において、前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むベクターを細胞内に注入することである方法．
【0472】
実施例２８、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ
実施例２４または実施例２５のうちいずれか一項において、前記細胞は真核細胞であることを特徴とする方法．
実施例２４または実施例２５のうちいずれか一項において、前記細胞は真核細胞であることを特徴とする方法．
【0473】
実施例２９、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ
実施例２７において、前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とするベクター。
実施例２７において、前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とするベクター。
【0474】
実施例３０、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ｂ
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および実施例５～実施例１３のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得る。
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および実施例５～実施例１３のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得る。
【0475】
実施例３１、ｓｇＲＮＡ、ｖｅｒ．Ａ、ＤＮＡ
実施例１または実施例２のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
実施例１または実施例２のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
【0476】
実施例３２、ｓｇＲＮＡ、ｖｅｒ．Ｂ、ＤＮＡ
実施例５～実施例１３のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
実施例５～実施例１３のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
【0477】
実施例３３、ｄｕａｌ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ＤＮＡ
実施例１４のエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
実施例１４のエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
【0478】
以下、実験例および実施例を通じて本明細書が提供する発明についてさらに詳細に説明する。これら実施例は単に本明細書によって開示される内容を例示するためのものであって、本明細書によって開示される内容の範囲がこれら実施例によって制限されるものと解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者において自明であろう。
【0479】
実験例１実験材料準備
【0480】
実験例１．１プラスミドベクター設計および製造
ヒト細胞で発現するために、Ｃａｓ１２ｆ１遺伝子をコドン－最適化させたし、前記最適化された配列がベクター製造のために合成された。最終的にＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列にはｃｈｉｃｋｅｎβ－ａｃｔｉｎプロモーター、５'－および３'－末端の核位置信号配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、自己切断Ｔ２Ａペプチドに連結されたｅＧＦＰをエンコーディングする配列が含まれた。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のアミノ酸配列およびこれを暗号化するＤＮＡ配列を［表１］に示した。
ヒト細胞で発現するために、Ｃａｓ１２ｆ１遺伝子をコドン－最適化させたし、前記最適化された配列がベクター製造のために合成された。最終的にＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列にはｃｈｉｃｋｅｎβ－ａｃｔｉｎプロモーター、５'－および３'－末端の核位置信号配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、自己切断Ｔ２Ａペプチドに連結されたｅＧＦＰをエンコーディングする配列が含まれた。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のアミノ酸配列およびこれを暗号化するＤＮＡ配列を［表１］に示した。
【0481】
【表1】
【0482】
（エンジニアリングされた）Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する鋳型ＤＮＡが合成されたし、ｐＴｗｉｓｔ Ａｍｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にクローニングされた。必要な場合、前記ベクターはＵ６－相補的ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－相補的ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを使って、前記ガイドＲＮＡ暗号化配列の増幅のための鋳型として使われた。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを使って、前記コドン－最適化されたＣａｓ１２ｆ１遺伝子を含むベクターにエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化するオリゴヌクレオチドをクローニングすることにより、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに対するベクターを製造した。
【0483】
実験例１．２ Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡエンジニアリング
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのエンジニアリングされたスキャフォールド領域のうち第２領域、第４領域および第５領域の変形はＡｐｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を使って線形化されたガイドＲＮＡ－暗号化ベクターに変形された配列（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を送達する合成オリゴヌクレオチドをクローニングして遂行された。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのエンジニアリングされたスキャフォールド領域のうち第１領域の変形は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端部分を標的とするｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＵ６プロモーター領域を標的とするｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを使ってカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）、またはエンジニアリングされた鋳型プラスミドベクターのＰＣＲ増幅によって遂行された。前記ＰＣＲ増幅はＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）により遂行されたし、ＰＣＲ産物はＫＬＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使って結紮された（ｌｉｇａｔｅｄ）。前記結紮された（ｌｉｇａｔｅｄ）ＰＣＲ産物はＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）された。Ｓａｎｇｅｒシーケンシング分析によってＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓが確認された。変形されたプラスミドベクターはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦ ｋｉｔ（ＭＮ）を使って精製された。精製されたプラスミド１マイクログラムがＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）およびＮＴＰｓ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使ったｍＲＮＡ合成の鋳型として使われた。前記製造されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使って精製し、極低温バイアル（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｖｉａｌｓ）に分注して液体窒素に保管した。
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのエンジニアリングされたスキャフォールド領域のうち第２領域、第４領域および第５領域の変形はＡｐｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を使って線形化されたガイドＲＮＡ－暗号化ベクターに変形された配列（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を送達する合成オリゴヌクレオチドをクローニングして遂行された。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのエンジニアリングされたスキャフォールド領域のうち第１領域の変形は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端部分を標的とするｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＵ６プロモーター領域を標的とするｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを使ってカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）、またはエンジニアリングされた鋳型プラスミドベクターのＰＣＲ増幅によって遂行された。前記ＰＣＲ増幅はＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）により遂行されたし、ＰＣＲ産物はＫＬＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使って結紮された（ｌｉｇａｔｅｄ）。前記結紮された（ｌｉｇａｔｅｄ）ＰＣＲ産物はＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）された。Ｓａｎｇｅｒシーケンシング分析によってＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓが確認された。変形されたプラスミドベクターはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦ ｋｉｔ（ＭＮ）を使って精製された。精製されたプラスミド１マイクログラムがＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）およびＮＴＰｓ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使ったｍＲＮＡ合成の鋳型として使われた。前記製造されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使って精製し、極低温バイアル（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｖｉａｌｓ）に分注して液体窒素に保管した。
【0484】
実験例１．３細胞培養および形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞（ＬｅｎｔＸ－２９３Ｔ、Ｔａｋａｒａ）が１０％の熱－不活性化されたｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）およびペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地で、５％ＣＯ２条件下で培養された。細胞形質注入は電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎで遂行された。電気穿孔法の場合、実験例１．２で製造されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するプラスミドベクターおよびガイドＲＮＡ（およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡ）を暗号化するＤＮＡ各２－５μｇをＮｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って４Ｘ１０５ ＨＥＫ－２９３ Ｔ細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。前記電気穿孔法は１３００Ｖ、１０ｍＡ、３ｐｕｌｓｅ条件下で遂行した。ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎのために、６－１５μＬ ＦｕＧｅｎｅ試薬を（Ｐｒｏｍｅｇａ）２－５μｇのＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するプラスミドベクターおよび１．５－５μｇのＰＣＲアンプリコンと１５分の間混合した。前記混合物（３００μＬ）が形質注入１日前に１Ｘ１０６個の細胞がプレーティングされた１．５ｍｌ ＤＭＥＭ培地に添加された。前記細胞を前記混合物の存在下で１～１０日間培養させた。培養後、前記細胞が収集されたし、前記細胞のゲノムＤＮＡがＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ったり、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って手作業で分離された。
ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞（ＬｅｎｔＸ－２９３Ｔ、Ｔａｋａｒａ）が１０％の熱－不活性化されたｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）およびペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地で、５％ＣＯ２条件下で培養された。細胞形質注入は電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎで遂行された。電気穿孔法の場合、実験例１．２で製造されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するプラスミドベクターおよびガイドＲＮＡ（およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡ）を暗号化するＤＮＡ各２－５μｇをＮｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って４Ｘ１０５ ＨＥＫ－２９３ Ｔ細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。前記電気穿孔法は１３００Ｖ、１０ｍＡ、３ｐｕｌｓｅ条件下で遂行した。ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎのために、６－１５μＬ ＦｕＧｅｎｅ試薬を（Ｐｒｏｍｅｇａ）２－５μｇのＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するプラスミドベクターおよび１．５－５μｇのＰＣＲアンプリコンと１５分の間混合した。前記混合物（３００μＬ）が形質注入１日前に１Ｘ１０６個の細胞がプレーティングされた１．５ｍｌ ＤＭＥＭ培地に添加された。前記細胞を前記混合物の存在下で１～１０日間培養させた。培養後、前記細胞が収集されたし、前記細胞のゲノムＤＮＡがＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ったり、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って手作業で分離された。
【0485】
実験例１．４細胞内インデル効率測定
ＨＥＫ－２９３ Ｔ細胞から分離されたゲノムＤＮＡのうち、プロトスペーサーを含む領域を標的－特異的プライマーを使ってＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下でＰＣＲを遂行した。前記増幅方法はメーカーの指示に従った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＨＴ ｄｕａｌ ｉｎｄｅｘｅｓを含む前記増幅の結果物であるＰＣＲアンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ １００を使って１５０－ｂｐペアエンドシーケンシングを遂行した。インデル頻度はＭＡＵＮＤを使って計算された。前記ＭＡＵＮＤはｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｉｂｓｃｇｅ／ｍａｕｎｄで提供される。
ＨＥＫ－２９３ Ｔ細胞から分離されたゲノムＤＮＡのうち、プロトスペーサーを含む領域を標的－特異的プライマーを使ってＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下でＰＣＲを遂行した。前記増幅方法はメーカーの指示に従った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＨＴ ｄｕａｌ ｉｎｄｅｘｅｓを含む前記増幅の結果物であるＰＣＲアンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ １００を使って１５０－ｂｐペアエンドシーケンシングを遂行した。インデル頻度はＭＡＵＮＤを使って計算された。前記ＭＡＵＮＤはｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｉｂｓｃｇｅ／ｍａｕｎｄで提供される。
【0486】
実験例１．５ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＭａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｍｉＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってガイドＲＮＡ（またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡ）またはゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出した。ガイドＲＮＡを定量化するために、ＲＮＡ特異的プライマーをｌｉｇａｔｉｏｎし、ｃｒＲＮＡ－特異的プライマーを使ってｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡは鋳型であって、定量的ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲに使われた。ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲはＫＡＦＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２Ｘ）Ｋｉｔ（ＫＡＰＡｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って分析された。
ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＭａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｍｉＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってガイドＲＮＡ（またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡ）またはゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出した。ガイドＲＮＡを定量化するために、ＲＮＡ特異的プライマーをｌｉｇａｔｉｏｎし、ｃｒＲＮＡ－特異的プライマーを使ってｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡは鋳型であって、定量的ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲに使われた。ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲはＫＡＦＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２Ｘ）Ｋｉｔ（ＫＡＰＡｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って分析された。
【0487】
実験例１．６統計分析
各実験例別実験は３回ずつ遂行したし、各値の平均値を分析に使った。
各実験例別実験は３回ずつ遂行したし、各値の平均値を分析に使った。
【0488】
実験例２エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率比較
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使ったエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率を測定するために、実験例１．１～１．２によって各実施例を製造した。実験に使った標的配列は次の［表２］に示した。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使ったエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率を測定するために、実験例１．１～１．２によって各実施例を製造した。実験に使った標的配列は次の［表２］に示した。
【0489】
【表2】
【0490】
各実施例別エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの配列は次の［表３］～［表８］に示した。
【0491】
【表03】
【0492】
【表4】
【0493】
【表5】
【0494】
【表6】
【0495】
【表7】
【0496】
【表8】
【0497】
この時、各標的配列別に、
１）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１は自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ ｔｒａｃｒＲＮＡおよび自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ ｃｒＲＮＡを５'－ＧＡＡＡ－３'で連結させたシングルガイドＲＮＡ、
２）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１～ｎ．３は変形された第１領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
３）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．４～ｎ．６は変形された第２領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
４）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．７～ｎ．９は変形された第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
５）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１０は変形された第１領域および第２領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
６）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１１は変形された第１領域および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
７）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１２は変形された第２領域および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
８）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１３およびＥｘａｍｐｌｅ ｎ．１４は変形された第１領域、第２領域、および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを示す。
１）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１は自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ ｔｒａｃｒＲＮＡおよび自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ ｃｒＲＮＡを５'－ＧＡＡＡ－３'で連結させたシングルガイドＲＮＡ、
２）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１～ｎ．３は変形された第１領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
３）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．４～ｎ．６は変形された第２領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
４）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．７～ｎ．９は変形された第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
５）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１０は変形された第１領域および第２領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
６）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１１は変形された第１領域および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
７）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１２は変形された第２領域および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
８）Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１３およびＥｘａｍｐｌｅ ｎ．１４は変形された第１領域、第２領域、および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、およびスペーサーを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを示す。
【0498】
この時、ｎは標的配列別に、１、２、または３であり、ｎが１である場合Ｔａｒｇｅｔ １（ＤＹ２）、ｎが２である場合、Ｔａｒｇｅｔ ２（ＤＹ１０）、ｎが３である場合、Ｔａｒｇｅｔ３（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２）を示す。
【0499】
前記実施例別に製造されたベクターを実験例１．３によってＨＥＫ２９３ Ｔ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、実験例１．４～１．５によってインデル発生効率を測定した。これを実験例１．６によって分析した結果が図２～図１３に示されている。
【0500】
図２～図４はＤＹ２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ １．１～Ｅｘａｍｐｌｅ １．１３に対する平均ｉｎｄｅｌ効率、図５～図８はＤＹ１０を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ２．１～Ｅｘａｍｐｌｅ ２．１３に対する平均ｉｎｄｅｌ効率、図９～図１２はＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ３．１～Ｅｘａｍｐｌｅ ３．１３に対する平均ｉｎｄｅｌ効率、図１３は、ＤＹ２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ １．１３～Ｅｘａｍｐｌｅ １．１４、ＤＹ１０を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ２．１３～Ｅｘａｍｐｌｅ ２．１４、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２を標的とするＥｘａｍｐｌｅ ３．１３～Ｅｘａｍｐｌｅ ３．１４に対する平均ｉｎｄｅｌ効率をそれぞれ示す。
【0501】
実験結果、本明細書で開示するエンジニアリングされたスキャフォールド領域を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡをゲノム編集に使う場合、自然界で発見されるスキャフォールド領域を有するＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、および前記自然界で発見されるスキャフォールド領域のｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡ反復配列部分を５'－ＧＡＡＡ－３'リンカーに連結したガイドＲＮＡをゲノム編集に使う時より全般的にゲノム編集効率が向上することが分かる。また、各領域別変形を組み合わせた場合（ｅ．ｇ． Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１０～Ｅｘａｍｐｌｅ ｎ．１４）、各領域別組み合わせがシナジーを起こしてゲノム編集効率がさらに向上することが分かる。
【産業上の利用可能性】
【0502】
本明細書ではゲノム編集技術に使用できるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを提供し、特に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域を導入してゲノム編集効率を向上させたエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを提供する。本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムをゲノム編集に使う場合、自然界で発見されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使うのと比較して高いゲノム編集効率を示し、真核細胞遺伝子を編集する用途で使うことができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】