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特表2023-544826ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム効率化のためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-25
(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム効率化のためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20231018BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231018BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20231018BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20231018BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/86 Z
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521490
(86)(22)【出願日】2021-10-08
(85)【翻訳文提出日】2023-06-07
(86)【国際出願番号】 KR2021013933
(87)【国際公開番号】W WO2022075816
(87)【国際公開日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】10-2020-0129937
(32)【優先日】2020-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0185528
(32)【優先日】2020-12-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0044152
(32)【優先日】2021-04-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522127357
【氏名又は名称】ゲンコレ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヨン－サム
(72)【発明者】
【氏名】キム、ド ヨン
(72)【発明者】
【氏名】リー、ジェオン ミ
(72)【発明者】
【氏名】ムン、ス ビン
(57)【要約】
本発明はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムに関する。より具体的には、本発明は標的核酸の切断、編集または変形をさらに効果的に遂行するためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびこれを含んだエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムに関する。また、本発明はエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびこれを含んだエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した標的核酸の切断、編集または変形方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムのための、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）を含むエンジニアリングされたガイドＲＮＡであって、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形され、第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を３'末端から５'末端方向に順に含み、
前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の一部の配列であり、この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）配列を含み、かつ前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の３'末端から少なくとも１個以上のヌクレオチドを含まない配列であり、
前記第２配列は５'－ＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１）配列または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり、
前記第３配列は５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）配列または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり、
前記第４配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり、
前記第５配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であり、
前記ｃｒＲＮＡは野生型ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり、
前記野生型ｃｒＲＮＡは野生型反復配列およびガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含み、
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列および前記ガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含み、
この時、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の一部の配列であり、この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列のうち５'－ＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２）配列を含み、かつ前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の３'末端から少なくとも１個以上のヌクレオチドを含まない配列であり、
この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり、
この時、前記ガイド配列は標的配列と混成化できる配列または標的配列と相補的な結合を形成する配列であり、１５から３０ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列である、
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項2】
前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８０）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８３）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９０）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２）配列であり、
この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵである、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項3】
前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６）配列、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列または５'－ＵＵＡＧ－３'配列であり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列内に含まれた前記５'－ＵＵＡＧ－３'配列は選択的に５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換される、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項4】
前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列は５'－Ａ－３'配列、５'－ＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９）配列、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０）配列、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５１）配列、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２）配列、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３）配列、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４）配列、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５５）配列、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５６）配列、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５７）配列、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５８）配列または５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５９）配列である、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項5】
前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列であり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列は５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１３）配列、５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１４）配列、５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１５）配列、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１６）配列、５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１７）配列、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１８）配列、５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１９）配列、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２０）配列、５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２１）配列、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２２）配列、５'－ＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２３）配列、５'－ＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２４）配列、５'－ＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２５）配列、５'－ＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２６）配列、５'－ＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２７）配列、５'－ＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２８）配列または５'－ＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２）配列であり、
この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵである、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項6】
前記ｃｒＲＮＡはＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を追加でさらに含み、この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は前記ｃｒＲＮＡの３'末端に位置する、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項7】
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり、この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり、前記ａは０から４の整数であり、前記ｄは０から３の整数であり、前記ｅは０から１０の整数である、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項8】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはｄｕａｌガイドＲＮＡまたはｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであって、この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡが前記ｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであるとき、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒ配列を追加でさらに含み、前記ｌｉｎｋｅｒ配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡと前記ｃｒＲＮＡの間に位置する、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項9】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９０）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９２）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０５）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９３）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００）配列を含み、この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵである、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項10】
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９１）配列および前記ガイド配列を含むか、または５'－ＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９４）配列および前記ガイド配列を含み、この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵである、請求項９に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項11】
前記第１配列内に存在する前記５'－ＮＮＮＣＮ－３'配列が５'－ＵＵＵＣＵ－３'配列、５'－ＧＵＵＣＵ－３'配列、５'－ＵＣＵＣＵ－３'配列、５'－ＵＵＧＣＵ－３'配列、５'－ＵＵＵＣＣ－３'配列、５'－ＧＣＵＣＵ－３'配列、５'－ＧＵＵＣＣ－３'配列、５'－ＵＣＧＣＵ－３'配列、５'－ＵＣＵＣＣ－３'配列、５'－ＵＵＧＣＣ－３'配列、５'－ＧＣＧＣＵ－３'配列、５'－ＧＣＵＣＣ－３'配列、５'－ＧＵＧＣＣ－３'配列、５'－ＵＣＧＣＣ－３'配列、５'－ＧＣＧＣＣ－３'配列または５'－ＧＵＧＣＵ－３'配列である、請求項２に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項12】
前記第６配列内に存在する前記５'－ＮＧＮＮＮ－３'配列が５'－ＡＧＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＣＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＣＡＵ－３'配列、５'－ＡＧＣＡＧ－３'配列、５'－ＡＧＣＡＣ－３'配列、５'－ＡＧＣＵＡ－３'配列、５'－ＡＧＣＧＡ－３'配列、５'－ＡＧＣＣＡ－３'配列、５'－ＵＧＣＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＣＵＡ－３'配列、５'－ＵＧＣＧＡ－３'配列、５'－ＵＧＣＣＡ－３'配列、５'－ＧＧＣＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＣＵＡ－３'配列、５'－ＧＧＣＧＡ－３'配列、５'－ＧＧＣＣＡ－３'配列、５'－ＣＧＣＡＡ－３'配列、５'－ＣＧＣＵＡ－３'配列、５'－ＣＧＣＧＡ－３'配列または５'－ＣＧＣＣＡ－３'配列である、請求項５に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項13】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９５）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９６）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０９）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９７）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０７）配列を含む、請求項１１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項14】
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３９）配列および前記ガイド配列を含むか、または５'－ＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９８）配列および前記ガイド配列を含む、請求項１３に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
【請求項15】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムのための、エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むベクターであって、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）を含み、
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形され、第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を３'末端から５'末端方向に順に含み、
前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の一部の配列であり、この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）配列を含み、かつ前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の３'末端から少なくとも１個以上のヌクレオチドを含まない配列であり、
前記第２配列は５'－ＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１）配列または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり、
前記第３配列は５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）配列または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり、
前記第４配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり、
前記第５配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であり、
前記ｃｒＲＮＡは野生型ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり、
前記野生型ｃｒＲＮＡは野生型反復配列およびガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含み、
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列および前記ガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含み、
この時、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の一部の配列であり、この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列のうち５'－ＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２）配列を含み、かつ前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の３'末端から少なくとも１個以上のヌクレオチドを含まない配列であり、
この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり、
この時、前記ガイド配列は標的配列と混成化できる配列または標的配列と相補的な結合を形成する配列であり、１５から３０ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列である、ベクター。
【請求項16】
前記ベクターは前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸のためのプロモーターをさらに含む、請求項１５に記載のベクター。
【請求項17】
前記プロモーターはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーターまたは７ＳＫプロモーターである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項18】
前記ベクターはプラスミド、ＰＣＲアンプリコンまたはウイルスベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項19】
エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物であって、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；およびＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質またはこれを暗号化する核酸を含み、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）を含み、
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形され、第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を３'末端から５'末端方向に順に含み、
前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の一部の配列であり、この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）配列を含み、かつ前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の３'末端から少なくとも１個以上のヌクレオチドを含まない配列であり、
前記第２配列は５'－ＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１）配列または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり、
前記第３配列は５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）配列または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり、
前記第４配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり、
前記第５配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であり、
前記ｃｒＲＮＡは野生型ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり、
前記野生型ｃｒＲＮＡは野生型反復配列およびガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含み、
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列および前記ガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含み、
この時、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の一部の配列であり、この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列のうち５'－ＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２）配列を含み、かつ前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の３'末端から少なくとも１個以上のヌクレオチドを含まない配列であり、
この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり、
この時、前記ガイド配列は標的配列と混成化できる配列または標的配列と相補的な結合を形成する配列であり、１５から３０ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列である、組成物。
【請求項20】
前記組成物は前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質を暗号化する核酸を一つのベクターに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記ベクターは前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸のためのプロモーターおよび前記Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質を暗号化する核酸のためのプロモーターをさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記プロモーターはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲプロモーター、Ａｄ ＭＬＰプロモーター、ＨＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＢＡプロモーターまたはＲＳＶプロモーターである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
前記ベクターはプラスミド、ｍＲＮＡ（転写物）、ＰＣＲアンプリコンまたはウイルスベクターである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項24】
前記組成物は核酸およびタンパク質の混合形態であって、エンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１４ａ１タンパク質が結合されたエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１複合体の形態で含む、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２０年１０月８日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１２９９３７号、２０２０年１２月２９日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１８５５２８号および２０２１年４月５日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００４４１５２号に対する優先権を主張し、これらの出願それぞれの内容はその全体が参照によって本明細書に含まれる。
本出願は、２０２０年１０月８日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１２９９３７号、２０２０年１２月２９日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１８５５２８号および２０２１年４月５日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００４４１５２号に対する優先権を主張し、これらの出願それぞれの内容はその全体が参照によって本明細書に含まれる。
【0002】
本発明はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムに関する。より具体的には、本発明は標的核酸の切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）、編集（ｅｄｉｔｉｎｇ）または変形（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）をさらに効果的に遂行するためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびこれを含んだエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムおよびこの利用に関する。
【背景技術】
【0003】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムはＣｌａｓｓ ２、Ｔｙｐｅ Ｖに分類されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））ではじめて古細菌由来のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムに対して明らかになった。その後、後続研究（Ｔａｕｔｖｙｄａｓ Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８、５０１６－５０２３（２０２０））で前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４システムをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムに分類した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは前記Ｃｌａｓｓ ２、Ｔｙｐｅ Ｖに分類されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのうち一つのバリアントであるＶ－Ｆ１システムに属し、これはＣａｓ１４ａ１をエフェクタータンパク質として有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムを含む。前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに比べてエフェクタータンパク質の大きさが顕著に小さいという特徴がある。ただし、先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、ＵＳ ２０２０／０１９０４９４ Ａ１）で明らかになったところでは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムは二本鎖ＤＮＡ切断活性がないか、極めて低いため（Ｋａｒｖｅｌｉｓ、Ｔ.ｅｔ ａｌ.，ｂｉｏＲｘｉｖ、６５４８９７（２０１９））ゲノム編集技術に応用するのに限界がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の一目的はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を提供することである。
【0005】
本発明の他の目的はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを提供することである。
【0006】
本発明のさらに他の目的はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物を提供することである。
【0007】
本発明のさらに他の目的はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した標的核酸または標的遺伝子を変形する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を含む。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡである。または前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形され、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡである。
【0009】
一具現例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）を含むことができる。
【0010】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｒａｃｒＲＮＡ）は連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡであり得る。
【0011】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を３'末端から５'末端方向に順に含むことができる。
【0012】
この時、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の一部の配列であり得る。前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列の一部の配列は、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり得る。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８０）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８３）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９０）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。一例として、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１またはこれの一部の配列内に存在する５'－ＮＮＮＣＮ－３'配列は５'－ＵＵＵＣＵ－３'配列、５'－ＧＵＵＣＵ－３'配列、５'－ＵＣＵＣＵ－３'配列、５'－ＵＵＧＣＵ－３'配列、５'－ＵＵＵＣＣ－３'配列、５'－ＧＣＵＣＵ－３'配列、５'－ＧＵＵＣＣ－３'配列、５'－ＵＣＧＣＵ－３'配列、５'－ＵＣＵＣＣ－３'配列、５'－ＵＵＧＣＣ－３'配列、５'－ＧＣＧＣＵ－３'配列、５'－ＧＣＵＣＣ－３'配列、５'－ＧＵＧＣＣ－３'配列、５'－ＵＣＧＣＣ－３'配列、５'－ＧＣＧＣＣ－３'配列または５'－ＧＵＧＣＵ－３'配列であり得る。
【0013】
この時、前記第２配列は５'－ＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％、８０％、または９０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0014】
この時、前記第３配列は５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％、８０％、または９０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0015】
この時、前記第４配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列上で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６）配列、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列または５'－ＵＵＡＧ－３'配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は選択的に５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。
【0016】
この時、前記第５配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であり得る。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列は５'－Ａ－３'配列、５'－ＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９）配列、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０）配列、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５１）配列、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２）配列、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３）配列、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４）配列、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５５）配列、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５６）配列、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５７）配列、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５８）配列または５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５９）配列であり得る。
【0017】
前記ｃｒＲＮＡは野生型ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｒＲＮＡ）であり得る。
【0018】
この時、前記野生型ｃｒＲＮＡは野生型反復配列（ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）およびガイド配列（ガイドｓｅｑｕｅｎｃｅ）を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる。前記野生型反復配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２）配列であり得る。
【0019】
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる。
【0020】
この時、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の一部の配列であり得る。前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３配列のうち５'－ＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２）配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。一具体例において、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列であり得る。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列は５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１３）配列、５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１４）配列、５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１５）配列、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１６）配列、５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１７）配列、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１８）配列、５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１９）配列、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２０）配列、５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２１）配列、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２２）配列、５'－ＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２３）配列、５'－ＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２４）配列、５'－ＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２５）配列、５'－ＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２６）配列、５'－ＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２７）配列、５'－ＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２８）配列または５'－ＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。一例として、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列またはこれの一部の配列内に存在する５'－ＮＧＮＮＮ－３'配列は５'－ＡＧＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＣＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＣＡＵ－３'配列、５'－ＡＧＣＡＧ－３'配列、５'－ＡＧＣＡＣ－３'配列、５'－ＡＧＣＵＡ－３'配列、５'－ＡＧＣＧＡ－３'配列、５'－ＡＧＣＣＡ－３'配列、５'－ＵＧＣＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＣＵＡ－３'配列、５'－ＵＧＣＧＡ－３'配列、５'－ＵＧＣＣＡ－３'配列、５'－ＧＧＣＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＣＵＡ－３'配列、５'－ＧＧＣＧＡ－３'配列、５'－ＧＧＣＣＡ－３'配列、５'－ＣＧＣＡＡ－３'配列、５'－ＣＧＣＵＡ－３'配列、５'－ＣＧＣＧＡ－３'配列または５'－ＣＧＣＣＡ－３'配列であり得る。
【0021】
この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％、８０％、または９０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0022】
この時、前記ガイド配列は標的配列と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）できる配列または標的配列と相補的な結合を形成する配列で、１５～３０ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列であり得る。
【0023】
前記ｃｒＲＮＡはＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を追加でさらに含むことができる。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は前記ｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり得る。前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。前記ｄは０～３の整数であり得る。前記ｅは０～１０の整数であり得る。
【0024】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは変形されたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡが独立的な二つの分子で存在するｄｕａｌガイドＲＮＡ；または変形されたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡが連結されて一つの分子で存在するｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡがｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであるとき、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒ配列を追加でさらに含むことができる。この時、前記ｌｉｎｋｅｒ配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡと前記ｃｒＲＮＡの間に位置することができる。
【0025】
一具体例において、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９０）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１）配列を含むことができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９１）配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９５）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６）配列を含むことができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３９）配列およびガイド配列を含むことができる。
【0026】
他の一具体例において、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９２）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０５）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９３）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００）配列を含むことができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９４）配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９６）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０９）配列、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９７）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０７）配列を含むことができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９８）配列およびガイド配列を含むことができる。
【0027】
本発明はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムのためのベクターを提供する。前記ベクターはエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含む。
【0028】
一具現例として、前記ベクターはエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むことができる。
【0029】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含むことができる。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前述したエンジニアリングされたガイドＲＮＡの具現例と同一の構成を有することができる。
【0030】
前記ベクターは前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸のためのプロモーターをさらに含むことができる。この時、前記プロモーターはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーターまたは７ＳＫプロモーターであり得る。
【0031】
前記ベクターはプラスミド、ＰＣＲアンプリコンまたはウイルスベクターであり得る。この時、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、レンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）、アデノ－関連ウイルスベクター（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ；ＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒ）、ワクシニアウイルスベクター（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、ポックスウイルスベクター（ｐｏｘｖｉｒａｌ（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）および単純ヘルペスウイルスベクター（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒａｌ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）で構成された群から選択される少なくとも一つのウイルスベクターであり得る。
【0032】
本発明はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物を提供する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；およびＣａｓ１４ａ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を含む。
【0033】
一具現例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；およびＣａｓ１４ａ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を含むことができる。
【0034】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含むことができる。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前述したエンジニアリングされたガイドＲＮＡの具現例と同一の構成を有することができる。
【0035】
前記組成物はベクター形態であり得る。この時、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸；およびＣａｓ１４ａ１タンパク質を暗号化する核酸を含むことができる。この時、前記ベクターはプラスミド、ｍＲＮＡ（転写物）、ＰＣＲアンプリコンまたはウイルスベクターであり得る。この時、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、レンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）、アデノ－関連ウイルスベクター（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ；ＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒ）、ワクシニアウイルスベクター（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、ポックスウイルスベクター（ｐｏｘｖｉｒａｌ（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）および単純ヘルペスウイルスベクター（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒａｌ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）で構成された群から選択される一つ以上のウイルスベクターであり得る。
【0036】
この時、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸；およびＣａｓ１４ａ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含む一つのベクターを含むことができる。前記ベクターは前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸のためのプロモーターを追加でさらに含むことができ、前記プロモーターはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーターまたは７ＳＫプロモーターであり得る。また、前記ベクターは前記Ｃａｓ１４ａ１タンパク質を暗号化する核酸のためのプロモーターを追加でさらに含むことができ、前記プロモーターはＣＭＶプロモーター、ＬＴＲプロモーター、Ａｄ ＭＬＰプロモーター、ＨＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＢＡプロモーターまたはＲＳＶプロモーターであり得る。または前記組成物は前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含む第１ベクターおよびＣａｓ１４ａ１タンパク質を暗号化する核酸を含む第２ベクターを含むことができる。前記第１ベクターは前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸のためのプロモーターを追加でさらに含むことができ、前記プロモーターはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーターまたは７ＳＫプロモーターであり得る。また、前記第２ベクターは前記Ｃａｓ１４ａ１タンパク質を暗号化する核酸のためのプロモーターを追加でさらに含むことができ、前記プロモーターはＣＭＶプロモーター、ＬＴＲプロモーター、Ａｄ ＭＬＰプロモーター、ＨＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＢＡプロモーターまたはＲＳＶプロモーターであり得る。
【0037】
または前記組成物は核酸およびタンパク質の混合形態であり得る。この時、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１４ａ１タンパク質を含むことができる。前記組成物はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１複合体の形態であるｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＮＰ）形態であり得る。
【0038】
また、本発明はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した対象細胞に存在する標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法を提供する。前記方法は標的核酸または標的遺伝子が存在する対象細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物を処理することを含む。
【0039】
一具現例として、前記方法は標的核酸または標的遺伝子が存在する真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物を処理することを含むことができる。
【0040】
前記真核細胞は酵母（ｙｅａｓｔ）、植物細胞、非ヒト－動物細胞またはヒト細胞であり得る。
【0041】
前記標的核酸または標的遺伝子は標的配列を有する標的鎖を含む二本鎖DNAまたは一本鎖DNAであり得る。
【0042】
前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物は前述した組成物の具現例と同一であり得る。
【0043】
前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたは非ヒト動物生体内で遂行され得る。
【0044】
前記方法は、選択的に前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物を処理した真核細胞を培養することを追加でさらに含むことができる。
【0045】
前記方法を通じて、前記標的核酸または標的遺伝子は前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる変形を含むことができる。この時、前記変形は前記標的核酸または標的遺伝子に少なくとも一つ以上のヌクレオチドの削除、置換および／または挿入であり得る。
【発明の効果】
【0046】
本発明はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムに関する。本明細書によって開示される技術を通じて、エンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびこれを含んだエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを提供することができる。また、エンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびこれを含んだエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した効果的な標的核酸の切断、編集または変形方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および野生型ｃｒＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５）を示し、各領域を表示した。野生型ｔｒａｃｒＲＮＡはｓｔｅｍ形成により領域１（ｒｅｇｉｏｎ １）、領域２（ｒｅｇｉｏｎ ２）、領域３（ｒｅｇｉｏｎ ３）、領域４（ｒｅｇｉｏｎ ４）および領域５（ｒｅｇｉｏｎ ５）に分けて表示した。野生型ｃｒＲＮＡは反復配列（ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑ.）およびガイド配列（ガイドｓｅｑｕｅｎｃｅ；ガイドｓｅｑ.，またはスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））に分けて表示した。この時、前記ガイド配列は標的により配列および配列の長さが変わり、それぞれのＮは独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【図2】エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの構造を簡潔に示す。それぞれの配列を野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に比較マッチングして示した。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列（ｆｉｒｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；１ｓｔ ｓｅｑ.）、第２配列（ｓｅｃｏｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；２ｎｄ ｓｅｑ.）、第３配列（ｔｈｉｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；３ｒｄ ｓｅｑ.）を３'末端から５'末端方向に順に含む。また、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に５'末端に第４配列（ｆｏｕｒｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；４ｔｈ ｓｅｑ.）および／または第５配列（ｆｉｆｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；５ｔｈ ｓｅｑ.）をさらに含むことができる。
【図3】エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの構造を簡潔に示す。それぞれの配列を野生型ｃｒＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５）と比較して示した。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｉ）野生型反復配列の一部およびガイド配列；ｉｉ）野生型反復配列の一部、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列（Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ ｓｅｑ.）；ｉｉｉ）野生型反復配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列；ｉｖ）第６配列（ｓｉｘｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；６ｔｈ ｓｅｑ.）、第７配列（ｓｅｖｅｎｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；７ｔｈ ｓｅｑ.）およびガイド配列；またはｖ）第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記第６配列および第７配列は野生型ｃｒＲＮＡの反復配列と関連する。この時、前記ガイド配列は標的により配列および配列の長さが変わり、それぞれのＮは独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【図4】ｇＲＮＡエンジニアリングの多様な例示に対する一模式図である。この時、前記ガイド配列は標的により配列および配列の長さが変わり得る。それぞれのＮは独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、それぞれのＶはＡ、ＣまたはＧであり得、それぞれのＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。
【図5】ｇＲＮＡエンジニアリングの多様な例示に対する一模式図である。この時、前記ガイド配列は標的により配列および配列の長さが変わり得る。それぞれのＮは独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、それぞれのＶはＡ、ＣまたはＧであり得、それぞれのＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。
【図6】ｇＲＮＡエンジニアリングの多様な例示に対する一模式図である。この時、前記ガイド配列は標的により配列および配列の長さが変わり得る。それぞれのＮは独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、それぞれのＶはＡ、ＣまたはＧであり得、それぞれのＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。
【図7】ｇＲＮＡエンジニアリングの多様な例示に対する一模式図である。この時、前記ガイド配列は標的により配列および配列の長さが変わり得る。それぞれのＮは独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、それぞれのＶはＡ、ＣまたはＧであり得、それぞれのＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。
【図8】ｇＲＮＡエンジニアリングの多様な例示に対する一模式図である。この時、前記ガイド配列は標的により配列および配列の長さが変わり得る。それぞれのＮは独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、それぞれのＶはＡ、ＣまたはＧであり得、それぞれのＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。
【図9】ｇＲＮＡエンジニアリングの多様な例示に対する一模式図である。この時、前記ガイド配列は標的により配列および配列の長さが変わり得る。それぞれのＮは独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、それぞれのＶはＡ、ＣまたはＧであり得、それぞれのＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。
【図10】ｇＲＮＡエンジニアリングの多様な例示に対する一模式図である。この時、前記ガイド配列は標的により配列および配列の長さが変わり得る。それぞれのＮは独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、それぞれのＶはＡ、ＣまたはＧであり得、それぞれのＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。
【図11】野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ内に存在する連続した５個のウリジン配列をそれぞれアデノシン、シチジンまたはグアノシンで置き換えてｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。
【図12】図１１の結果に基づいて１４１番目のウリジンをシチジンで置き換えて固定し、残りの４個のウリジン配列をそれぞれシチジンまたはグアノシンで置き換えてｉｎｄｅｌ（％）を確認した。（ｎ＝３、＊、ｐ＜０.０５）
【図13】図１２の結果に基づいてｔｒａｃｒＲＮＡの変形された配列に対応するｃｒＲＮＡの５'－ＡＣＧＡＡ－３'をそれぞれアデノシン、ウリジン、シチジンまたはグアノシンで置き換えてｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。
【図14】図１３の結果に基づいてｃｒＲＮＡの５'－ＡＣＧＡＡ－３'のうちシチジンとグアノシンをそれぞれアデノシン、ウリジン、シチジンまたはグアノシンで置き換えてｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。（ｎ＝３、＊、ｐ＜０.０５）
【図15】図１４の結果に基づいてｃｒＲＮＡの５'－ＡＧＣＡＡ－３'のうちアデノシンをそれぞれウリジン、シチジンまたはグアノシンで置き換えてｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。（ｎ＝３、ｎ.ｓ.，ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）
【図16】Ｍ１－１を含むエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよび／またはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを利用した場合のｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）とともに使った時にｉｎｄｅｌ（％）が増加することを確認した。（ｎ＝３、＊、ｐ＜０.０５、ｎ.ｓ.，ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）
【図17】Ｍ１－１およびＭ１－２を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。この時、Ｍ１－２はＭＳ１（すなわち、ｓｔｅｍ５を構成する領域）でそれぞれ１３ｎｔ、２５ｎｔおよび３７ｎｔを削除した変形である。（ｎ＝３）
【図18】Ｍ１－１およびＭ２を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。この時、Ｍ２はＭＳ２（すなわち、ｓｔｅｍ２を構成する領域）でそれぞれ６ｎｔ、１３ｎｔおよび２１ｎｔを削除した変形である。（ｎ＝３）
【図19】Ｍ１－１およびＭ３を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。この時、Ｍ３はＭＳ３（すなわち、ｓｔｅｍ１を構成する領域）でそれぞれ７ｎｔ、１４ｎｔおよび２０ｎｔを削除した変形である。（ｎ＝３）
【図20】Ｍ１－１およびＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。（ｎ＝３、ｎ.ｓ.，ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）
【図21】Ｍ１－１およびＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。この時、Ｍ４は前記図２０の結果に基づいてＵ４ＶＵ６で設計し、前記ＶはＡ、ＣまたはＧである。（ｎ＝３、ｎ.ｓ.，ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）
【図22】Ｍ１－１およびＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。
【図23】Ｍ１－１および／またはＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。Ｍ１－１およびＭ４をすべて含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用した時にｉｎｄｅｌ（％）が増加することを確認した。（ｎ＝３、＊、ｐ＜０.０５；＊＊、ｐ＜０.０１；＊＊＊、ｐ＜０.００１.ｎ.ｓ.，ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）
【図24】Ｍ１－１、Ｍ３およびＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。この時、前記エンジニアリングされたｇＲＮＡはＭ１－１およびＭ４を含んでおり、Ｍ３を付加してその効果を比較した。この時、Ｍ３はＭＳ３（すなわち、ｓｔｅｍ１を構成する領域）でそれぞれ１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔおよび２１ｎｔを削除した変形である。（ｎ＝３）
【図25】Ｍ１－１、Ｍ１－２、Ｍ３およびＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。この時、前記エンジニアリングされたｇＲＮＡはＭ１－１、Ｍ３およびＭ４を含んでおり、Ｍ１－２を付加してその効果を比較した。この時、Ｍ１－２はＭＳ１（すなわち、ｓｔｅｍ５を構成する領域）でそれぞれ１０ｂｐ、１２ｂｐおよび１８ｂｐを削除した変形である。（ｎ＝３、ｎ.ｓ.，ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）
【図26】Ｍ１－１、Ｍ１－２、Ｍ３およびＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。この時、前記エンジニアリングされたｇＲＮＡはＭ１－１、Ｍ３およびＭ４を含んでおり、Ｍ１－２を付加してその効果を比較した。この時、Ｍ１－２はＭＳ１（すなわち、ｓｔｅｍ５を構成する領域）でそれぞれ１ｎｔ、３ｎｔ、５ｎｔ、７ｎｔ、９ｎｔ、１１ｎｔ、１３ｎｔ、１５ｎｔ、１７ｎｔ、１９ｎｔ、２１ｎｔ、２３ｎｔ、２５ｎｔ、２７ｎｔ、２９ｎｔ、３１ｎｔ、３３ｎｔ、３５ｎｔおよび３７ｎｔを削除した変形である。（ｎ＝３）
【図27】Ｍ１－１、Ｍ１－２、Ｍ３およびＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを追加変形してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。この時、前記追加変形はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端とエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端をｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列を利用して連結したものである。前記ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡはｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅによってエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に連結されたｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列がｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖａｇｅされ、これによってエンジニアリングされたｇＲＮＡはｄｕａｌ ｇＲＮＡとして作用することができる。（ｎ＝３）
【図28】Ｍ１－１、Ｍ１－２、Ｍ２、Ｍ３および／またはＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを追加変形してｉｎｄｅｌ（％）を確認した結果である。（ｎ＝３）
【図29】Ｍ１－１、Ｍ１－２、Ｍ３およびＭ４を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムであるｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムによるインデルパターンを確認した結果である。
【図30】ｇＲＮＡエンジニアリング（Ｍ１－Ｍ４）の効果の基礎となる分子メカニズムを調査するための実験設計模式図（Ａ）およびこの結果（ＢおよびＣ）である。Ａに対する具体的な説明は以下に記載した実験方法の「８.Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」セクションを参照することができる。ＢおよびＣでｇＲＮＡエンジニアリング（Ｍ１－Ｍ４）により完全な配列を有するｇＲＮＡの発現が急激に増加することを示す。
【図31】ｇＲＮＡエンジニアリング（Ｍ１－Ｍ４）の試験管内の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の分解分析結果である。特に、Ｍ３の有無による二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の分解効果に差があることを示す。
【図32】Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ｆ１で編集できる５'－ＴＴＴＲ－Ｎ２０－ＮＧＧ－３'配列を有する内因性ターゲットをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検索して無作為で選定した８８個の内因性遺伝子座のプロトスペーサー配列を整理した表である。
【図33】Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ｆ１で編集できる５'－ＴＴＴＲ－Ｎ２０－ＮＧＧ－３'配列を有する内因性ターゲットをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検索して無作為で選定した８８個の内因性遺伝子座のプロトスペーサー配列を整理した表である。
【図34】Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ｆ１で編集できる５'－ＴＴＴＲ－Ｎ２０－ＮＧＧ－３'配列を有する内因性ターゲットをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検索して無作為で選定した８８個の内因性遺伝子座のプロトスペーサー配列を整理した表である。
【図35】ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／ＡｓＣａｓ１２ａシステム、ｃａｎｏｎｉｃａｌ（カノニカル） ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムまたはｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムを利用した図３２～３４で選別した８８個の内因性遺伝子座でのインデル（％）を確認した結果である。ＡはＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／ＡｓＣａｓ１２ａシステム、ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムおよびｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムが有するそれぞれのガイドＲＮＡを模式化したものであり、この時、ＤＲはガイドＲＮＡでスペーサー配列を除いた残りの部分である。ＢはそれぞれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用して８８個の内因性遺伝子座でのインデル（％）を確認した結果である。
【図36】前記図３５の結果を多様な方法で整理したものである。Ａは各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる８８個の内因性遺伝子座でのインデル（％）に対するｂｏｘ－ａｎｄ－ｗｈｉｓｋｅｒ ｐｌｏｔであり、青緑色の横線は各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの平均値を示す。Ｂは各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるインデル（％）を細分化して特定インデル範囲当たりの標的数の分布を整理した表である。Ｃは各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって得た標的当たりのインデル（％）に対するｈｅａｔ ｍａｐである。
【図37】ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙ結果である。プロトスペーサー配列であるＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃ２２配列（５'－ＴＴＴＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９０））を含むプラスミドを利用して実験したし、対照群のために前記プラスミドにＡｐａＩ制限酵素サイト（５'－ＧＧＧＣＣＣ－３'）も含む。図面上に表示された配列は５'－ＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣ ＡＧＧＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３７）であり、ＡｐａＩ制限酵素サイトおよびプロトスペーサーはアンダーラインで表示した。
【発明を実施するための形態】
【0048】
用語の定義
本明細書で使われる用語に対する定義は以下の通りである。
本明細書で使われる用語に対する定義は以下の通りである。
【0049】
核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ヌクレオシド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）および塩基（Ｂａｓｅ）
「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」はヌクレオチド単位体で構成された生体分子（または生体高分子）であり、ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とも呼ばれる。核酸はＤＮＡとＲＮＡをすべて含む。
「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は燐酸、五炭糖および塩基（または核塩基）からなる単位体である。ＲＮＡ（リボ核酸）は五炭糖がリボースであり、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は五炭糖がデオキシリボースである。ヌクレオチドは核塩基としてアデニン（ａｄｅｎｉｎｅ；Ａ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ；Ｃ）、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ；Ｔ）およびウラシル（ｕｒａｃｉｌ；Ｕ）のうち選択された一つを有する。この時、アデニン、グアニンおよびシトシンはＲＮＡとＤＮＡに共通的に存在し、チミンはＤＮＡにのみ存在し、ウラシルはＲＮＡにのみ存在する。また、ヌクレオチドは燐酸とヌクレオシドで構成されるとも言える。
この時、「ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」は五炭糖と核塩基からなる。ヌクレオシドは核塩基の種類によってアデノシン、チミジン、シチジン、グアノシンおよびウリジンに分類される。各ヌクレオシドはＵ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｔ（チミジン）、Ｃ（シチジン）およびＧ（グアノシン）で略称される。また、ヌクレオチドはヌクレオシドの種類によってＵ（ウリジン一リン酸）、Ａ（アデノシン一リン酸）、Ｔ（チミジン一リン酸）、Ｃ（シチジン一リン酸）およびＧ（グアノシン一リン酸）で略称される。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」はヌクレオチド単位体で構成された生体分子（または生体高分子）であり、ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とも呼ばれる。核酸はＤＮＡとＲＮＡをすべて含む。
「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は燐酸、五炭糖および塩基（または核塩基）からなる単位体である。ＲＮＡ（リボ核酸）は五炭糖がリボースであり、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は五炭糖がデオキシリボースである。ヌクレオチドは核塩基としてアデニン（ａｄｅｎｉｎｅ；Ａ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ；Ｇ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ；Ｃ）、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ；Ｔ）およびウラシル（ｕｒａｃｉｌ；Ｕ）のうち選択された一つを有する。この時、アデニン、グアニンおよびシトシンはＲＮＡとＤＮＡに共通的に存在し、チミンはＤＮＡにのみ存在し、ウラシルはＲＮＡにのみ存在する。また、ヌクレオチドは燐酸とヌクレオシドで構成されるとも言える。
この時、「ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」は五炭糖と核塩基からなる。ヌクレオシドは核塩基の種類によってアデノシン、チミジン、シチジン、グアノシンおよびウリジンに分類される。各ヌクレオシドはＵ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｔ（チミジン）、Ｃ（シチジン）およびＧ（グアノシン）で略称される。また、ヌクレオチドはヌクレオシドの種類によってＵ（ウリジン一リン酸）、Ａ（アデノシン一リン酸）、Ｔ（チミジン一リン酸）、Ｃ（シチジン一リン酸）およびＧ（グアノシン一リン酸）で略称される。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0050】
本明細書で塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡは塩基の種類によってＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵで略称して記載する。前記略称は文脈により適切に解釈され得る。例えば、５'－ＵＵＵＵＵ－３'配列は連続した５個の塩基（ウラシル）配列、連続した５個のヌクレオシド（ウリジン）配列および／または連続した５個のヌクレオチド（ウリジン一リン酸）配列であり得る。また、核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡの場合、核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡを構成するヌクレオチドはヌクレオシドの種類によってウリジン、アデノシン、チミジン、シチジンおよびグアノシンで略称して記載する。前記略称は文脈により適切に解釈され得る。例えば、連続した４個のウリジン配列を含むＲＮＡは連続した４個のウリジン一リン酸ヌクレオチドを含むＲＮＡと解釈され得る。
【0051】
ＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ
「ＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ」は二つのＲＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の間に相補的な結合（または塩基対間の結合）により形成された二本鎖ＲＮＡ構造を意味する。この時、前記二つのＲＮＡ断片は互いに異なる鎖（ｓｔｒａｎｄ）に存在するか、または一つの鎖（一本鎖）に存在することができる。前記二つのＲＮＡ断片が一本鎖に存在する場合、一本鎖内の一部の領域（すなわち、二つのＲＮＡ断片）は塩基対間の結合を形成してステム－ループ（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）またはヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を形成する。前記ＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは「ＲＮＡ ｓｔｅｍ」または「ｓｔｅｍ」とも呼ばれ、以下でＲＮＡ ｓｔｅｍまたはｓｔｅｍと混用されて使われる。前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
「ＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ」は二つのＲＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の間に相補的な結合（または塩基対間の結合）により形成された二本鎖ＲＮＡ構造を意味する。この時、前記二つのＲＮＡ断片は互いに異なる鎖（ｓｔｒａｎｄ）に存在するか、または一つの鎖（一本鎖）に存在することができる。前記二つのＲＮＡ断片が一本鎖に存在する場合、一本鎖内の一部の領域（すなわち、二つのＲＮＡ断片）は塩基対間の結合を形成してステム－ループ（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）またはヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を形成する。前記ＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは「ＲＮＡ ｓｔｅｍ」または「ｓｔｅｍ」とも呼ばれ、以下でＲＮＡ ｓｔｅｍまたはｓｔｅｍと混用されて使われる。前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0052】
標的核酸（Ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）または標的遺伝子（Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）
「標的核酸（Ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」または「標的遺伝子（Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）」はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム）による編集の対象となる核酸または遺伝子を意味する。前記標的核酸または標的遺伝子は細胞内に存在したり人為的に合成されたりした核酸または遺伝子であり得る。細胞内に存在する場合、前記標的核酸または標的遺伝子は細胞が有する固有な遺伝子または核酸（すなわち、ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、または外部由来の遺伝子または核酸（すなわち、ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）すべてを意味し得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム）による編集の対象となり得るのであれば特に制限されない。前記標的核酸または標的遺伝子は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ－ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄであり得る。前記標的核酸または標的遺伝子は混用され得、互いに同一の対象を指称し得る。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
「標的核酸（Ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」または「標的遺伝子（Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）」はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム）による編集の対象となる核酸または遺伝子を意味する。前記標的核酸または標的遺伝子は細胞内に存在したり人為的に合成されたりした核酸または遺伝子であり得る。細胞内に存在する場合、前記標的核酸または標的遺伝子は細胞が有する固有な遺伝子または核酸（すなわち、ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、または外部由来の遺伝子または核酸（すなわち、ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）すべてを意味し得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム）による編集の対象となり得るのであれば特に制限されない。前記標的核酸または標的遺伝子は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ－ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄであり得る。前記標的核酸または標的遺伝子は混用され得、互いに同一の対象を指称し得る。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0053】
標的配列（Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、標的鎖（Ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ）および非標的鎖（Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ）
【0054】
「標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は標的核酸または標的遺伝子内に存在する配列であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム）のガイドＲＮＡによって認識される配列またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム）により変形される対象配列を意味する。具体的には、前記標的配列はガイドＲＮＡに含まれたガイド配列に相補性を有する配列またはガイド配列と相補的に結合する配列を意味する。
【0055】
「標的鎖（ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ）」は標的配列を含む鎖を意味する。標的核酸または標的遺伝子が一本鎖である場合、該当鎖は標的鎖であり得る。または標的核酸または標的遺伝子が二本鎖である場合、前記二本鎖のうち一つは標的鎖であり得、前記標的鎖に相補的な鎖が存在することができる。この時、前記標的鎖に相補的な鎖は「非標的鎖（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ）」と指称される。
【0056】
非標的鎖（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ）はＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列およびプロトスペーサー（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）配列を含む。前記ＰＡＭ配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム）のＣａｓ１２ｆ１（またはＣａｓ１４ａ１）タンパク質が認識する配列である。前記プロトスペーサー配列はＰＡＭ配列の５'末端または３'末端に位置する配列であって、前記プロトスペーサー配列は、標的配列に相補性を有する配列または標的配列と相補的な結合をする配列である。プロトスペーサー配列と標的配列間の相関関係は標的配列とガイド配列間の相関関係と類似している。このような特徴によって、一般的にガイド配列の設計時にプロトスペーサー配列を利用して設計することができる。すなわち、標的配列に相補的に結合するガイド配列を設計時、ガイド配列はプロトスペーサー配列と同一の塩基配列を有するヌクレオチド配列で設計することができる。この時、プロトスペーサー配列の塩基配列のうちＴはＵに代替してガイド配列を設計する。
【0057】
ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は別途に特定されない限り、遺伝物質を細胞内に運搬できるすべての物質を総称するものである。例えば、ベクターは対象となる遺伝物質、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質（Ｃａｓタンパク質）を暗号化する核酸、および／またはガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＤＮＡ分子であり得るが、これに制限されるものではない。前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は別途に特定されない限り、遺伝物質を細胞内に運搬できるすべての物質を総称するものである。例えば、ベクターは対象となる遺伝物質、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質（Ｃａｓタンパク質）を暗号化する核酸、および／またはガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＤＮＡ分子であり得るが、これに制限されるものではない。前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0058】
作動可能に連結された（Ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、特定の構成が他の構成と機能的関係で配置されて前記特定の構成が意図された方式通りに機能できるように他の構成に連結されていることを意味する。例えば、プロモーター配列がＡタンパク質を暗号化する配列と作動可能に連結されたとする時、前記プロモーターが細胞内で前記Ａタンパク質を暗号化する配列を転写および／または発現するようにＡタンパク質を暗号化する配列に連結されたことを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、特定の構成が他の構成と機能的関係で配置されて前記特定の構成が意図された方式通りに機能できるように他の構成に連結されていることを意味する。例えば、プロモーター配列がＡタンパク質を暗号化する配列と作動可能に連結されたとする時、前記プロモーターが細胞内で前記Ａタンパク質を暗号化する配列を転写および／または発現するようにＡタンパク質を暗号化する配列に連結されたことを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0059】
エンジニアリングされた（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）
「エンジニアリングされた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」という用語は、自然界にすでに存在する構成を有する物質、分子などと区分するために使う用語で、前記物質、分子などに人為的な変形が加えられたことを意味する。例えば、「エンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」の場合、自然界に存在するガイドＲＮＡの構成に人為的な変更が加えられたガイドＲＮＡを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
「エンジニアリングされた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」という用語は、自然界にすでに存在する構成を有する物質、分子などと区分するために使う用語で、前記物質、分子などに人為的な変形が加えられたことを意味する。例えば、「エンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」の場合、自然界に存在するガイドＲＮＡの構成に人為的な変更が加えられたガイドＲＮＡを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0060】
ＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｏｒ ｓｉｇｎａｌ）およびＮＥＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｏｒ Ｓｉｇｎａｌ）
「ＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｏｒ Ｓｉｇｎａｌ）」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核外部の物質を核内部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着されて一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。ＮＥＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核内部の物質を核外部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着されて一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。本明細書で使われる「ＮＬＳ「および「ＮＥＳ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
「ＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｏｒ Ｓｉｇｎａｌ）」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核外部の物質を核内部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着されて一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。ＮＥＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核内部の物質を核外部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着されて一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。本明細書で使われる「ＮＬＳ「および「ＮＥＳ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0061】
タグ（Ｔａｇ）
「タグ（ｔａｇ）」とは、ペプチドまたはタンパク質の追跡および／または分離精製を容易にするために付加される機能的ドメインを総称するものである。具体的には、前記タグはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグなどのタグタンパク質；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＨｃＲＥＤ、ＤｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質；およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどのレポータータンパク質（酵素）を含むが、これに制限されるものではない。本明細書で使われる「タグ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
「タグ（ｔａｇ）」とは、ペプチドまたはタンパク質の追跡および／または分離精製を容易にするために付加される機能的ドメインを総称するものである。具体的には、前記タグはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグなどのタグタンパク質；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＨｃＲＥＤ、ＤｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質；およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどのレポータータンパク質（酵素）を含むが、これに制限されるものではない。本明細書で使われる「タグ」という用語は通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0062】
別途に定義されない限り、本明細書で使われるすべての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野の当業者によって通常的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同じ方法および物質が本発明の実行または試験で使われ得るが、適合な方法および物質が以下に記載される。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許およびその他の参考文献は全体が参照として含まれる。追加で、物質、方法および実施例は単に例示的であり、制限されるものと意図されない。
【0063】
以下、本発明を説明する。
【0064】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム）、この限界および解決方案
【0065】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムはＣｌａｓｓ ２、Ｔｙｐｅ Ｖに分類されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））ではじめて古細菌由来のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４システムに対して明らかになった。後続研究（Ｔａｕｔｖｙｄａｓ Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８、５０１６－５０２３（２０２０））で前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４システムをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムに分類した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは前記Ｃｌａｓｓ ２、Ｔｙｐｅ Ｖに分類されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのうち一つのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）のＶ－Ｆ１システムに属し、これはＣａｓ１４ａをエフェクタータンパク質として有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムを含む。
【0066】
本明細書で開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムに関する。本明細書に記載されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムを指称し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムは混用されて使われる。またＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムとも指称される。
【0067】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに比べてエフェクタータンパク質の大きさが顕著に小さいという特徴がある。このような特徴は既存に研究された殆どのＣａｓヌクレアーゼの大きさによるＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）に搭載の難しさおよびこれによる遺伝子治療剤としての適用困難性を解決可能にする。しかし、このような長所にもかかわらず、先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、Ｔａｕｔｖｙｄａｓ Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８、５０１６－５０２３（２０２０））で明らかになったところでは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムは細胞内で二本鎖DNAに対する切断活性を示さないか、切断活性を示してもその効率が非常に低いため、これを積極的にゲノム編集に活用し難いという限界を有している。
【0068】
本明細書で開示するエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびこれを利用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムは、標的核酸または標的遺伝子の編集または変形効率を増加させてこのような問題を解決する。より具体的には、本発明者らは野生型ｔｒａｃｒＲＮＡが有する配列上の問題を解決するためにガイドＲＮＡを人為的に操作した。野生型ｔｒａｃｒＲＮＡは５個の連続したウリジン配列を含んでいる（野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ）は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１））配列を有する。）。野生型ｔｒａｃｒＲＮＡを細胞内でベクターなどを利用して発現させようとする時、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの５個の連続したウリジン配列はこれに対応する５個の連続したチミジン配列でベクター内に含まれることになる。この場合、前記５個の連続したチミジン配列は特定条件で転写終結信号として作用することができる。このような終結信号への作用はｔｒａｃｒＲＮＡの正常な発現を阻害し、また正常なガイドＲＮＡの形成を阻害する。これによって、最終的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムの標的核酸または標的遺伝子の編集または変形効率を減少させることができる。
【0069】
そこで、本発明者らは野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの５個の連続したウリジン配列を人為的に変形したエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡを開発した。また、本発明者らはガイドＲＮＡを構成するｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの長さを減らして最適化した。発現および長さを最適化させた本出願のエンジニアリングされたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ合成費用の削減またはウイルスベクターに挿入時に追加空間（容量）確保などの長所を有するので、遺伝子治療剤の適用に効果的である。また、本出願の最適化されたガイドＲＮＡを利用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムは、標的核酸または標的遺伝子の編集または変形効率を増加させる。
【0070】
以下で、エンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムについて詳しく説明する。
【0071】
＜Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ＞
本明細書によって開示される一態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡに関する。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムの標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形をさらに効果的に遂行されるようにする。特に、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次のような効果を有することができる：
本明細書によって開示される一態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡに関する。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムの標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形をさらに効果的に遂行されるようにする。特に、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次のような効果を有することができる：
【0072】
ガイドＲＮＡの長さ最適化、およびこれに伴うウイルスベクターに挿入時の追加空間（容量）確保
ガイドＲＮＡ長さ最適化による合成費用の削減；
細胞内ｔｒａｃｒＲＮＡの正常な発現；
機能（作動）可能なガイドＲＮＡ発現増加；
ガイドＲＮＡのｓｔａｂｉｌｉｔｙ増加；
ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘのｓｔａｂｉｌｉｔｙ増加；
効果的なガイドＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ形成誘導；
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の切断効率増加；および
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の編集または変形効率増加.
ガイドＲＮＡ長さ最適化による合成費用の削減；
細胞内ｔｒａｃｒＲＮＡの正常な発現；
機能（作動）可能なガイドＲＮＡ発現増加；
ガイドＲＮＡのｓｔａｂｉｌｉｔｙ増加；
ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘのｓｔａｂｉｌｉｔｙ増加；
効果的なガイドＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ形成誘導；
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の切断効率増加；および
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の編集または変形効率増加.
【0073】
より具体的には、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたり、および／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように変形および／またはＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むように変形されたりしたエンジニアリングされたガイドＲＮＡであり、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）を含む。この時、前記ｃｒＲＮＡは野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡである。すなわち、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡを含んだり、またはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含んだりする。
【0074】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まない。または前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まず、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端および／または３'末端の一部のヌクレオチド配列を含まない。
【0075】
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはエンジニアリングされた反復配列を含み、この時、エンジニアリングされた反復配列はｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列より長さが短いように変形されたり一部のヌクレオチド配列が変形されたりした配列である。前記野生型ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を追加でさらに含むことができる。
【0076】
また、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは選択的にｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができる。
【0077】
以下で各構成を詳しく説明する。
【0078】
１．エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｒａｃｒＲＮＡ）
エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）ｔｒａｃｒＲＮＡの一部のヌクレオチド配列が人為的に変形されたりおよび／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたりしたｔｒａｃｒＲＮＡである。
エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）ｔｒａｃｒＲＮＡの一部のヌクレオチド配列が人為的に変形されたりおよび／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたりしたｔｒａｃｒＲＮＡである。
【0079】
より具体的には、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡである。またはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形され、またｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡである。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した４個以下のウリジン配列を含む。または前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まない。
【0080】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは次のグループのうち選択された一つである：
ｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ；
ｉｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形、およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ；
ｉｉｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形、およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ；
ｉｖ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形、およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの中間の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
ｖ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形され、また、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの中間の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形および／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
ｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ；
ｉｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形、およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ；
ｉｉｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形、およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ；
ｉｖ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形、およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの中間の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
ｖ）連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形され、また、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの中間の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形および／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端の一部のヌクレオチド配列を含まないように変形されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【0081】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡと相互作用したりおよび／またはＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）と相互作用したりすることができる。
【0082】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは少なくとも２個以上のＲＮＡ ｓｔｅｍを形成することができる。この時、前記ＲＮＡ ｓｔｅｍはＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質と相互作用することができる。
【0083】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一領域が変形されたものである。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一領域は図１に図示しているｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域のうち一つ以上であり得る。本明細書で、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域はＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する領域を基準として分けて設定する（図１）。
【0084】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列のうち少なくとも３個以上の配列を含む。この時、前記少なくとも３個以上の配列は第１配列、第２配列および第３配列である。この時、前記第１配列、第２配列および第３配列はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置する。または前記第３配列、第２配列および第１配列はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置する。
【0085】
前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域を基準として分けたものであり、前記各配列はＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ形成したりＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ形成に参加したりする。したがって、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは少なくとも二以上のＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを含むことができる（図２）。以下で、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域および各配列について詳細に記述する。
【0086】
Ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域（Ｒｅｇｉｏｎ ｔｏ ｂｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｎ ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ）
【0087】
本明細書の記載されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一領域が変形されたものである。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一領域はｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域のうち一つ以上である。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域はｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ内でＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ形成したりまたはＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ形成に参加したりする領域を基準として分けて設定する。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡは４個のＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓを形成し、１個のＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ形成に参加する。すなわち、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡは総５個のＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ形成に関与する。
【0088】
本明細書で前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域は総５個の領域に分ける。前記５個の領域は変形対象領域１（ｒｅｇｉｏｎ １ ｔｏ ｂｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）、変形対象領域２（ｒｅｇｉｏｎ ２ ｔｏ ｂｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）、変形対象領域３（ｒｅｇｉｏｎ ３ ｔｏ ｂｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）、変形対象領域４（ｒｅｇｉｏｎ ４ ｔｏ ｂｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）および変形対象領域５（ｒｅｇｉｏｎ ５ ｔｏ ｂｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）である。
【0089】
この時、前記変形対象領域１は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端で１３０番目のシチジン（Ｃ）から１６１番目のアデノシン（Ａ）までの領域であり得る。この時、前記変形対象領域２は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端で９１番目のアデノシン（Ａ）から１２９番目のアデノシン（Ａ）までの領域であり得る。この時、前記変形対象領域３は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端で７２番目のグアノシン（Ｇ）から９０番目のアデノシン（Ａ）までの領域であり得る。この時、前記変形対象領域４は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端で２２番目のシチジン（Ｃ）から７１番目のグアノシン（Ｇ）までの領域であり得る。この時、前記変形対象領域５は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端で１番目のシチジン（Ｃ）から２１番目のアデノシン（Ａ）までの領域であり得る（図１）。このようなｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域の設定はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが含む各配列（第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列）を説明するためである。
【0090】
１－１）Ｆｉｒｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｏｎｅ ｓｔｒａｎｄ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ５）－必須配列
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列（ｆｉｒｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。前記第１配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域１に対応する（図２）。前記第１配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡに含まれる必須配列である。前記第１配列はｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合をする配列である。この時、前記第１配列はｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記第１配列とｃｒＲＮＡによって形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム５（ｓｔｅｍ５）と命名される。前記ステム５を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドはＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメインおよび／またはＺＦドメインと相互作用することができる。
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列（ｆｉｒｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。前記第１配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域１に対応する（図２）。前記第１配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡに含まれる必須配列である。前記第１配列はｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合をする配列である。この時、前記第１配列はｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記第１配列とｃｒＲＮＡによって形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム５（ｓｔｅｍ５）と命名される。前記ステム５を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドはＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメインおよび／またはＺＦドメインと相互作用することができる。
【0091】
前記第１配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない。
【0092】
前記第１配列は連続した４個以下のウリジン配列を含む。この時、前記第１配列は連続した４個のウリジン配列を含むことができる。または前記第１配列は連続した３個のウリジン配列を含むことができる。または前記第１配列は連続した二つのウリジン配列を含むことができる。または前記第１配列は１個のウリジン配列を含むことができる。または前記第１配列はウリジン配列を含まなくてもよい。
【0093】
前記第１配列はｃｒＲＮＡと相補的結合を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記第１配列はｃｒＲＮＡと相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。この時、前記第１配列はｃｒＲＮＡと少なくとも一つ以上の相補的結合を形成することができる。
【0094】
前記第１配列はｃｒＲＮＡと少なくとも一つ以上の塩基対を形成（ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）するヌクレオチドを含む。この時、前記第１配列はｃｒＲＮＡと少なくとも一つ以上の塩基対を形成しないヌクレオチドを含むことができる。この時、前記第１配列はｃｒＲＮＡと少なくとも一つ以上の塩基対を形成することができる。
【0095】
前記第１配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置する。
【0096】
前記第１配列は次の配列のうち選択された一つの配列であり得る：
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列；および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの一部の配列。
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；
５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列；および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの一部の配列。
【0097】
この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。
【0098】
この時、前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。
【0099】
この時、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。例えば、前記ｄが３である場合、（Ｎ）３は５'－ＮＮＮ－３'配列を意味し、この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0100】
この時、前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。例えば、前記ａが４である場合、（Ｖ）４は５'－ＶＶＶＶ－３'配列を意味し、この時、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。
【0101】
この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列の５'末端に位置する５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'配列および／または３'末端に位置する５'－ＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）配列は選択的に変形され得る。前記変形は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'配列および／または５'－ＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）配列のうち少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除または他のヌクレオチドで置換されるものであり得る。または前記変形は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'配列および／または５'－ＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）配列に一つ以上のヌクレオチドが挿入されるものであり得る。
【0102】
ｉ）５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列であり得る。
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列であり得る。
【0103】
前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0104】
前記ａは０～４の整数であり得る。
【0105】
一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）配列であり得る。
【0106】
他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）配列であり得る。この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）配列であり得る。
【0107】
さらに他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0108】
他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＡＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0109】
さらに他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0110】
ｉｉ）５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列であり得る。
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列であり得る。
【0111】
前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0112】
前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。
【0113】
前記ａは０～４の整数であり得る。
【0114】
一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記ａが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）配列であり得る。または前記ａが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）配列であり得る。または前記ａが２である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＮＮＮＮＶＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）配列であり得る。または前記ａが３である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＮＮＮＮＶＶＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）配列であり得る。または前記ａが４である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＮＮＮＮＶＶＶＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）配列であり得る。
【0115】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＡＵＧＣＵＡＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0116】
他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記ａが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）配列であり得る。または前記ａが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）配列であり得る。または前記ａが２である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＮＮＮＮＶＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）配列であり得る。または前記ａが３である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＮＮＮＮＶＶＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）配列であり得る。または前記ａが４である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＮＮＮＮＶＶＶＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）配列であり得る。
【0117】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＵＧＣＵＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0118】
さらに他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記ａが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）配列であり得る。または前記ａが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）配列であり得る。または前記ａが２である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＮＮＮＮＶＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）配列であり得る。または前記ａが３である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＮＮＮＮＶＶＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）配列であり得る。または前記ａが４である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＮＮＮＮＶＶＶＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）配列であり得る。
【0119】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＧＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0120】
ｉｉｉ）５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列であり得る。
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列であり得る。
【0121】
前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0122】
前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。
【0123】
前記ｂは０～１の整数であり得る。
【0124】
一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＡＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ｂは０または１の整数であり得る。この時、前記ｂが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＡＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）配列であり得る。または前記ｂが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）配列であり得る。
【0125】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＡＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＡＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＡＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0126】
他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＣＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ｂは０または１の整数であり得る。この時、前記ｂが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＣＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）配列であり得る。または前記ｂが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＣＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）配列であり得る。
【0127】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＣＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＣＵＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＣＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＣＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0128】
さらに他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＧＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ｂは０または１の整数であり得る。この時、前記ｂが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＧＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）配列であり得る。または前記ｂが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＧＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）配列であり得る。
【0129】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0130】
ｉｖ）５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列であり得る。
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列であり得る。
【0131】
前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0132】
前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。
【0133】
前記ｃは０～２の整数であり得る。
【0134】
一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＡＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ｃは０～２の整数であり得る。この時、前記ｃが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＡＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）配列であり得る。または前記ｃが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＡＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）配列であり得る。または前記ｃが２である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）配列であり得る。
【0135】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＡＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＡＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＣＡＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0136】
他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＣＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ｃは０～２の整数であり得る。この時、前記ｃが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＣＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）配列であり得る。または前記ｃが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＣＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）配列であり得る。または前記ｃが２である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＣＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）配列であり得る。
【0137】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＣＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＣＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0138】
さらに他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＧＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ｃは０～２の整数であり得る。この時、前記ｃが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＧＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）配列であり得る。または前記ｃが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＧＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）配列であり得る。または前記ｃが２である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＧＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）配列であり得る。
【0139】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＣＧＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＣＧＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0140】
ｖ）５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列であり得る。
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列であり得る。
【0141】
前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0142】
前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。
【0143】
前記ｄは０～３の整数であり得る。
【0144】
一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＡＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ｄは０～３の整数であり得る。この時、前記ｄが０である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＡＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）配列であり得る。または前記ｄが１である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＡＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４）配列であり得る。または前記ｄが２である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＡＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）配列であり得る。または前記ｄが３である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）配列であり得る。
【0145】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＡＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＡＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0146】
他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ｄは０～３の整数であり得る。この時、前記ｄが０である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）配列であり得る。または前記ｄが１である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）配列であり得る。または前記ｄが２である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）配列であり得る。または前記ｄが３である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）配列であり得る。
【0147】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＣＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＣＵＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0148】
さらに他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＧＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ｄは０～３の整数であり得る。この時、前記ｄが０である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＧＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）配列であり得る。または前記ｄが１である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＧＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）配列であり得る。または前記ｄが２である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＧＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）配列であり得る。または前記ｄが３である場合、第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＧＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）配列であり得る。
【0149】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＧＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＣＧＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0150】
ｖｉ）５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列であり得る。
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列であり得る。
【0151】
前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0152】
前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。
【0153】
前記ａは０～４の整数であり得る。
【0154】
一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記ａが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＡＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９）配列であり得る。または前記ａが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＡＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）配列であり得る。または前記ａが２である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＡＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１）配列であり得る。または前記ａが３である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＡＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）配列であり得る。または前記ａが４である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）配列であり得る。
【0155】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＡＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＡＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＣＡＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0156】
他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記ａが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８）配列であり得る。または前記ａが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）配列であり得る。または前記ａが２である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０）配列であり得る。または前記ａが３である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１）配列であり得る。または前記ａが４である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２）配列であり得る。
【0157】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＣＵＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0158】
さらに他の一具体例において、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＧ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記ａが０である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＧＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７）配列であり得る。または前記ａが１である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＧＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）配列であり得る。または前記ａが２である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＧＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９）配列であり得る。または前記ａが３である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＧＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０）配列であり得る。または前記ａが４である場合、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＧＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１）配列であり得る。
【0159】
例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＧＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＧＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＣＧＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0160】
ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの配列のうち一部の配列
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａ－３'配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列の３'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。
一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａ－３'配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列の３'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。
【0161】
一具体例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）配列の一部の配列であり、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５）配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0162】
他の一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３配列の３'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。
【0163】
一具体例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６６）配列の一部の配列であり、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５）配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７０）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮＣＣＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮＣＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0164】
さらに他の一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４配列の３'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ｂは０～１の整数であり得る。
【0165】
一具体例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７６）配列の一部の配列であり、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５）配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８０）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮＣＣＵＣＵＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮＣＣＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0166】
他の一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５配列の３'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ｃは０～２の整数であり得る。
【0167】
一具体例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５）配列の一部の配列であり、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４）配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮＣＣＵＣＵＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮＣＣＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９２）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0168】
さらに他の一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６配列の３'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ｄは０～３の整数であり得る。
【0169】
一具体例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４）配列の一部の配列であり、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２００）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0170】
他の一具現例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７配列の３'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＶはＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。
【0171】
一具体例として、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３）配列の一部の配列であり、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０４）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶＣＣＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0172】
１－２）Ｓｅｃｏｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｓｔｅｍ４）－必須配列
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第２配列（ｓｅｃｏｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。前記第２配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域２に対応する（図２）。前記第２配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡに含まれる必須配列である。前記第２配列は該当配列内で相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記第２配列内で形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム４（ｓｔｅｍ４）と命名される。前記ステム４を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドはＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲＥＣドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用することができる。
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第２配列（ｓｅｃｏｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。前記第２配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域２に対応する（図２）。前記第２配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡに含まれる必須配列である。前記第２配列は該当配列内で相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記第２配列内で形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム４（ｓｔｅｍ４）と命名される。前記ステム４を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドはＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲＥＣドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用することができる。
【0173】
前記第２配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない。
【0174】
前記第２配列は前記第１配列の５'末端に位置する。
【0175】
前記第２配列は前記第１配列の５'末端と共有結合で連結される。
【0176】
一具現例として、前記第２配列は５'－ＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１）配列であり得る。
【0177】
他の一具現例として、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列と少なくとも７０％以上同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）または類似する（ｓｉｍｉｌａｒ）配列であり得る。または前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または配列類似性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する配列であり得る。
【0178】
さらに他の一具現例として、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列と少なくとも７０％～７５％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも７０％～８５％、少なくとも７０％～９０％、少なくとも７０％～９５％、少なくとも７０％～１００％、少なくとも７５％～８０％、少なくとも７５％～８５％、少なくとも７５％～９０％、少なくとも７５％～９５％または少なくとも７５％～１００％同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）または類似する（ｓｉｍｉｌａｒ）配列であり得る。または前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％～７５％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも７０％～８５％、少なくとも７０％～９０％、少なくとも７０％～９５％、少なくとも７０％～１００％、少なくとも７５％～８０％、少なくとも７５％～８５％、少なくとも７５％～９０％、少なくとも７５％～９５％または少なくとも７５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。または前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列と少なくとも８０％～８５％、少なくとも８０％～９０％、少なくとも８０％～９５％、少なくとも８０％～１００％、少なくとも８５％～９０％、少なくとも８５％～９５％または少なくとも８５％～１００％同一または類似する配列であり得る。または前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも８０％～８５％、少なくとも８０％～９０％、少なくとも８０％～９５％、少なくとも８０％～１００％、少なくとも８５％～９０％、少なくとも８５％～９５％または少なくとも８５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。または前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列と少なくとも９０％～９５％、少なくとも９０％～１００％または少なくとも９５％～１００％同一または類似する配列であり得る。または前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも９０％～９５％、少なくとも９０％～１００％または少なくとも９５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0179】
さらに他の一具現例として、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一または類似する配列であり得る。または前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0180】
１－３）Ｔｈｉｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｓｔｅｍ３）－必須配列
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第３配列（ｔｈｉｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。前記第３配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域３に対応する（図２）。前記第３配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡに含まれる必須配列である。前記第３配列はｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合をする配列である。この時、前記第３配列はｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。また、前記第３配列は該当配列内で相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記ｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合および前記第３配列内の相補的な結合によって形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム３（ｓｔｅｍ３）と命名される。前記ステム３を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドはＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用することができる。
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第３配列（ｔｈｉｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。前記第３配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域３に対応する（図２）。前記第３配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡに含まれる必須配列である。前記第３配列はｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合をする配列である。この時、前記第３配列はｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。また、前記第３配列は該当配列内で相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記ｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合および前記第３配列内の相補的な結合によって形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム３（ｓｔｅｍ３）と命名される。前記ステム３を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドはＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用することができる。
【0181】
前記第３配列はｃｒＲＮＡと相補的結合を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記第３配列はｃｒＲＮＡと相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。この時、前記第３配列はｃｒＲＮＡと少なくとも一つ以上の相補的結合を形成することができる。
【0182】
前記第３配列はｃｒＲＮＡと少なくとも一つ以上の塩基対を形成するヌクレオチドを含む。この時、前記第３配列はｃｒＲＮＡと少なくとも一つ以上の塩基対を形成しないヌクレオチドを含むことができる。この時、前記第３配列はｃｒＲＮＡと少なくとも一つ以上の塩基対を形成することができる。
【0183】
前記第３配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない。
【0184】
前記第３配列は前記第２配列の５'末端に位置する。
【0185】
前記第３配列は前記第２配列の５'末端と共有結合で連結される。
【0186】
一具現例として、前記第３配列は５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）配列であり得る。
【0187】
他の一具現例として、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列と少なくとも７０％以上同一または類似する配列であり得る。または前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0188】
さらに他の一具現例として、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列と少なくとも７０％～７５％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも７０％～８５％、少なくとも７０％～９０％、少なくとも７０％～９５％、少なくとも７０％～１００％、少なくとも７５％～８０％、少なくとも７５％～８５％、少なくとも７５％～９０％、少なくとも７５％～９５％または少なくとも７５％～１００％同一または類似する配列であり得る。または前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％～７５％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも７０％～８５％、少なくとも７０％～９０％、少なくとも７０％～９５％、少なくとも７０％～１００％、少なくとも７５％～８０％、少なくとも７５％～８５％、少なくとも７５％～９０％、少なくとも７５％～９５％または少なくとも７５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。または前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列と少なくとも８０％～８５％、少なくとも８０％～９０％、少なくとも８０％～９５％、少なくとも８０％～１００％、少なくとも８５％～９０％、少なくとも８５％～９５％または少なくとも８５％～１００％同一または類似する配列であり得る。または前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも８０％～８５％、少なくとも８０％～９０％、少なくとも８０％～９５％、少なくとも８０％～１００％、少なくとも８５％～９０％、少なくとも８５％～９５％または少なくとも８５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。または前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列と少なくとも９０％～９５％、少なくとも９０％～１００％または少なくとも９５％～１００％同一または類似する配列であり得る。または前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも９０％～９５％、少なくとも９０％～１００％または少なくとも９５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0189】
さらに他の一具現例として、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一または類似する配列であり得る。または前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0190】
１－４）Ｆｏｕｒｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｓｔｅｍ２）
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第４配列（ｆｏｕｒｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。前記第４配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域４に対応する（図２）。前記第４配列は多様に変形が可能なヌクレオチド配列であり、１～５０個のヌクレオチド配列（１～５０ｎｔ配列）である。前記第４配列はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの必須配列である第３配列の５'末端に位置する。前記第４配列は該当配列内で相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記第４配列内で形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム２（ｓｔｅｍ２）と命名される。前記ステム２を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドはＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインと相互作用することができる。
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第４配列（ｆｏｕｒｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。前記第４配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域４に対応する（図２）。前記第４配列は多様に変形が可能なヌクレオチド配列であり、１～５０個のヌクレオチド配列（１～５０ｎｔ配列）である。前記第４配列はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの必須配列である第３配列の５'末端に位置する。前記第４配列は該当配列内で相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記第４配列内で形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム２（ｓｔｅｍ２）と命名される。前記ステム２を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドはＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインと相互作用することができる。
【0191】
前記第４配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない。
【0192】
前記第４配列は前記第３配列の５'末端と共有結合で連結される。
【0193】
一具現例として、前記第４配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３）配列であり得る。この時、前記第４配列は該当配列内で相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成することができ、形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは野生型ステム２（ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｓｔｅｍ２）と命名する。
【0194】
他の一具現例として、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列によって形成された野生型ステム２の長さが短くなるように変形された配列であり得る。この時、前記第４配列は前記野生型ステム２より長さが短い変形されたステム２（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｔｅｍ２）を含むかＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成しないことができる。一具体例として、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。例えば、前記第４配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＧＵＵＡＧＵＵＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＡＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＡＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＡＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６）配列、５'－ＣＣＧＣＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７）配列、５'－ＣＣＧＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＡＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８）配列、５'－ＣＧＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＡＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９）配列または５'－ＧＡＡＧＧＵＵＡＧＵＵＡＡＣＡＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０）配列であり得、この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４～２３０配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。他の一具体例として、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。例えば、前記第４配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５）配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６）配列、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列または５'－ＵＵＡＧ－３'配列であり得、この時、前記配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。さらに他の一具体例として、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で任意に選定された一つ以上のヌクレオチド配列が削除された配列であり得る。この時、前記任意に選定された一つ以上のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列内で順序または方向にかかわらず、無作為的に選定された配列であり得、この時、前記任意に選定された一つ以上のヌクレオチド配列が二以上のヌクレオチド配列である場合、連続的な二以上のヌクレオチド配列または非連続的な二以上のヌクレオチド配列であり得る。
【0195】
さらに他の一具現例として、前記第４配列は任意のヌクレオチド配列または任意に配列されたヌクレオチド配列であり得る。この時、前記任意のヌクレオチド配列または任意に配列されたヌクレオチド配列は１～５０ｎｔ配列であり得る。
【0196】
さらに他の一具現例として、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４～２３０のうち選択された配列と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0197】
１－５）Ｆｉｆｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｓｔｅｍ１）
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第５配列（ｆｉｆｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。前記第５配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域５に対応する（図２）。前記第５配列は多様に変形が可能なヌクレオチド配列であり、１～２１個のヌクレオチド配列（１～２１ｎｔ配列）である。前記第５配列は該当配列内で相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記第５配列内で形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム１（ｓｔｅｍ１）と命名される。
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第５配列（ｆｉｆｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。前記第５配列は前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域５に対応する（図２）。前記第５配列は多様に変形が可能なヌクレオチド配列であり、１～２１個のヌクレオチド配列（１～２１ｎｔ配列）である。前記第５配列は該当配列内で相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記第５配列内で形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは本明細書でステム１（ｓｔｅｍ１）と命名される。
【0198】
前記第５配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない。
【0199】
前記第５配列は前記第４配列の５'末端に位置する。
【0200】
前記第５配列は前記第４配列の５'末端と共有結合で連結される。
【0201】
一具現例として、前記第５配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８）配列であり得る。
【0202】
他の一具現例として、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であり得る。一具体例として、前記第５配列は５'－Ａ－３'配列、５'－ＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９）配列、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０）配列、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５１）配列、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２）配列、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３）配列、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４）配列、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５５）配列、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５６）配列、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５７）配列、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５８）配列または５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５９）配列であり得る。
【0203】
さらに他の一具現例として、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列で任意に選定された一つ以上のヌクレオチド配列が削除された配列であり得る。この時、前記任意に選定された一つ以上のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列内で順序または方向にかかわらず、無作為的に選定された配列であり得、この時、前記任意に選定された一つ以上のヌクレオチド配列が二以上のヌクレオチド配列である場合、連続的な二以上のヌクレオチド配列または非連続的な二以上のヌクレオチド配列であり得る。
【0204】
さらに他の一具現例として、前記第５配列は任意のヌクレオチド配列または任意に配列されたヌクレオチド配列であり得る。この時、前記任意のヌクレオチド配列または任意に配列されたヌクレオチド配列は１～２１ｎｔ配列であり得る。
【0205】
さらに他の一具現例として、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８～２５９のうち選択された配列と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0206】
１－６）追加配列（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは追加配列（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を選択的にさらに含むことができる。前記追加配列はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる。前記追加配列は前記第１配列の３'末端に位置することができる。前記追加配列はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる。前記追加配列は前記第５配列の５'末端に位置することができる。
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは追加配列（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を選択的にさらに含むことができる。前記追加配列はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる。前記追加配列は前記第１配列の３'末端に位置することができる。前記追加配列はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる。前記追加配列は前記第５配列の５'末端に位置することができる。
【0207】
前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。
【0208】
一具現例として、前記追加配列は１～５個、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、１～３０個、１～３５個、１～４０個、５～１０個、５～１５個、５～２０個、５～２５個、５～３０個、５～３５個または５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記追加配列は１０～１５個、１０～２０個、１０～２５個、１０～３０個、１０～３５個、１０～４０個、１５～２０個、１５～２５個、１５～３０個、１５～３５個または１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記追加配列は２０～２５個、２０～３０個、２０～３５個、２０～４０個、２５～３０個、２５～３５個または２５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記追加配列は３０～３５個、３０～４０個または３５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0209】
他の一具現例として、前記追加配列は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0210】
前記追加配列は任意のヌクレオチド配列または任意に配列されたヌクレオチド配列であり得る。例えば、前記追加配列は５'－ＡＵＡＡＡＧＧＵＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０）配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0211】
前記追加配列は公知のヌクレオチド配列であり得る。例えば、前記追加配列はｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列であり得る。この時、前記ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列は５'－ＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＡＧＵＡＡＧＣＵＣＧＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１）配列または５'－ＣＵＧＣＵＣＧＡＡＵＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＵＧＣＣＵＧＡＧＵＡＧＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２）配列であり得る。または前記各配列と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0212】
前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0213】
１－７）化学的変形（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
前述したエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に少なくとも一つ以上のヌクレオチドの化学的変形を含むことができる。この時、前記化学的変形はヌクレオチドの塩基および／または糖で発生し得る多様な共有結合の変形であり得、例えば、前記化学的変形はｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、ｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ、ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅ、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ３'ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ（ＭＳ）または２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得、またはＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１に記載された核酸の変形をすべて含むことができるが、これに制限されない。
前述したエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に少なくとも一つ以上のヌクレオチドの化学的変形を含むことができる。この時、前記化学的変形はヌクレオチドの塩基および／または糖で発生し得る多様な共有結合の変形であり得、例えば、前記化学的変形はｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、ｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ、ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅ、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ３'ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ（ＭＳ）または２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得、またはＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１に記載された核酸の変形をすべて含むことができるが、これに制限されない。
【0214】
１－８）エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの例示
前記の説明に基づいて、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの例示を説明する。以下の例示に含まれた構成要素の具体的な説明は前記にて該当構成要素について記載した通りである。以下の例示は単純例示であり、これに制限されない。
前記の説明に基づいて、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの例示を説明する。以下の例示に含まれた構成要素の具体的な説明は前記にて該当構成要素について記載した通りである。以下の例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0215】
一具現例として、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり、連続した４個以下のウリジン配列を含むことができる。
【0216】
一具体例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列および第３配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列および第３配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列、第２配列および第３配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり、連続した４個以下のウリジン配列を含む配列であり得る。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；および５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列は５'－ＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列は５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる（５'－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－［追加配列］－３'）。
【0217】
具体的な例を挙げると、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列および第３配列を含むことができる。この時、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列は５'－ＣＡＮＮＮＣＮＣ－３'配列の他に残りの配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列および第３配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－３'）。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列はｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列であり得る。前記ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２配列であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる。一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６３）配列を含むことができる。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６５）配列を含むことができる。
【0218】
他の一具体例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列および第４配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列および第４配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列および第４配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり、連続した４個以下のウリジン配列を含む配列であり得る。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；および５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる（５'－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－［追加配列］－３'）。
【0219】
具体的な例を挙げると、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列および第４配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列は５'－ＣＡＮＮＮＣＮＣ－３'配列の他に残りの配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列および第４配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－３'）。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列はｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列であり得る。前記ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２配列であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる。一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６）配列を含むことができる。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＵＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣ ＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６８）配列を含むことができる。
【0220】
さらに他の一具体例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり、連続した４個以下のウリジン配列を含む配列であり得る。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；および５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第５配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－［追加配列］－３'）。
【0221】
具体的な例を挙げると、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列は５'－ＣＡＮＮＮＣＮＣ－３'配列の他に残りの配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－３'）。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列はｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列であり得る。前記ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２配列であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる。一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０）配列であり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７１）配列であり得る。
【0222】
他の一具現例として、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まず、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように変形された配列である。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した４個以下のウリジン配列を含むことができ、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列を含まなくてもよい。
【0223】
一具体例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列および第３配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列および第３配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列、第２配列および第３配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり、連続した４個以下のウリジン配列を含む配列であり得る。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列の一部の配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列の一部の配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列の一部の配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列の一部の配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列の一部の配列；および５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列の一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる（５'－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－［追加配列］－３'）。
【0224】
具体的な例を挙げると、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列および第３配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列のうち５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２）配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８０）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８３）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８８）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８９）配列、５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９０）配列または５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列および第３配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２～２９０配列のうち選択された一つの配列］－３'）。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列はｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列であり得る。前記ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２配列であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる。一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１）配列を含むことができる。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９２）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９３）配列を含むことができる。
【0225】
他の一具体例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列および第４配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列および第４配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列および第４配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり、連続した４個以下のウリジン配列を含む配列であり得る。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる（５'－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－［追加配列］－３'）。
【0226】
具体的な例を挙げると、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列および第４配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２～２９０配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４～２１７配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１～２４７配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列および５'－ＵＵＡＧ－３'配列で構成された群から選択された一つの配列であり得、この時、前記選択された一つの配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列および第４配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはこれの一部の配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはこれの一部の配列］－３'）。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列はｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列であり得る。前記ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２配列であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる。一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣ ＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９４）配列または５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＧＡＡＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣ ＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９５）配列を含むことができる。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ ＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９６）配列または５'－ＣＣＧＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ ＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９７）配列を含むことができる。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵ ＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９８）配列または５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵ ＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９９）配列を含むことができる。
【0227】
さらに他の一具体例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり、連続した４個以下のウリジン配列を含む配列であり得る。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－［追加配列］－３'）。
【0228】
具体的な例を挙げると、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列は５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２～２９０配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４～２１７配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１～２４７配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列および５'－ＵＵＡＧ－３'配列で構成された群から選択された一つの配列であり得、この時、前記選択された一つの配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であって、５'－Ａ－３'配列、５'－ＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９～２５９配列で構成された群から選択された一つの配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列またはこれの一部の配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはこれの一部の配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはこれの一部の配列］－３'）。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列はｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列であり得る。前記ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２配列であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる。一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０２）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０３）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０５）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０７）配列、５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０９）配列であり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１０）配列または５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１１）配列であり得る。
【0229】
２.Ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡ ｏｒエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｒＲＮＡ）
【0230】
本出願のｃｒＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）は標的核酸と相互作用する配列とＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質と相互作用する配列（ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用する配列）を含む。前記ｃｒＲＮＡは標的核酸を認識、結合またはターゲッティングすることができ、前記ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡを認識または結合することができる。また、前記ｃｒＲＮＡはＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質を認識または結合することができる。本明細書によって説明されるｃｒＲＮＡは野生型ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡをすべて含む。
【0231】
野生型ｃｒＲＮＡは野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）反復配列（ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）およびガイド配列（ガイドｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。この時、前記野生型反復配列とガイド配列はｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置する。この時、前記野生型反復配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２）配列である。
【0232】
本出願のエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡの一部のヌクレオチド配列が人為的に変形されたり、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたりおよび／または３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加されたｃｒＲＮＡである（図３）。この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは前述したエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとの相互作用を向上させるために変形されたり、またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡ（またはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム）の追加的な機能向上のために変形されたりしたものである。
【0233】
一具現例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を含む。この時、前記第６配列、第７配列およびガイド配列はエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる。
【0234】
一具現例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含む。この時、前記第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる。この時、前記第６配列および第７配列はそれぞれ前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡと結合する領域を基準として分けたものである（図３）。
【0235】
一具現例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは野生型反復配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含む。この時、前記野生型反復配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる。この時、前記野生型反復配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２）配列である。
【0236】
一具現例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは野生型反復配列の一部の配列およびガイド配列を含んだりまたは野生型反復配列の一部の配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含んだりする。この時、前記野生型反復配列の一部の配列およびガイド配列；または野生型反復配列の一部の配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる。この時、前記野生型反復配列の一部の配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の５'末端部で順次的な一部の配列を含まない配列である。
【0237】
以下で、前記第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列について詳細に記述する。
【0238】
２－１）Ｓｉｘｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｓｔｒａｎｄ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ５ ／ ａ ｐａｒｔ ｏｆ Ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
【0239】
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列（ｓｉｘｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。前記第６配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡに含まれる必須配列である。前記第６配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合をする配列である。この時、前記第６配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの前記第１配列と相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。この時、前記第６配列と前記第１配列によって形成されたＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘはステム５（ｓｔｅｍ５）である。前記ステム５を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドはＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメインおよび／またはＺＦドメインと相互作用することができる。
【0240】
前記第６配列は５'－ＡＣＧＡＡ－３'配列を含まない。
【0241】
前記第６配列は前記第１配列と相補的結合を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記第６配列は前記第１配列と相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。すなわち、前記第６配列は前記第１配列と少なくとも一つ以上の相補的結合を形成することができる。
【0242】
前記第６配列は前記第１配列と少なくとも一つ以上の塩基対を形成するヌクレオチドを含む。この時、前記第６配列は前記第１配列と少なくとも一つ以上の塩基対を形成しないヌクレオチドを含むことができる。すなわち、前記第６配列は前記第１配列と少なくとも一つ以上の塩基対を形成することができる。
【0243】
前記第６配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端に位置する。
【0244】
前記第６配列は前述したエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの第１配列により多様に変形された配列であり得る。すなわち、前記第６配列は前記第１配列内に存在するＮおよび／またはＶにより多様に変形された配列であり得る。この時、前記第６配列は前記第１配列に存在する少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含む配列であり得る。
【0245】
前記第６配列は次の配列のうち選択された一つの配列であり得る：
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列；および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３～３１８配列のうち選択された一つの一部の配列。
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列；
５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列；および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３～３１８配列のうち選択された一つの一部の配列。
【0246】
この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。
【0247】
この時、前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。
【0248】
この時、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。例えば、前記ｄが３である場合、（Ｎ）３は５'－ＮＮＮ－３'配列を意味し、この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0249】
この時、前記（Ｂ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｂ）ａのそれぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。例えば、前記ａが４である場合、（Ｂ）４は５'－ＢＢＢＢ－３'配列を意味し、この時、それぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。
【0250】
この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３～３１８配列の５'末端に位置する５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１９）配列および／または３'末端に位置する５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'配列は選択的に変形され得る。前記変形はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１９配列および／または５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'配列のうち少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除または他のヌクレオチドで置換されるものであり得る。または前記変形はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１９配列および／または５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'配列に一つ以上のヌクレオチドが挿入されるものであり得る。
【0251】
前記第６配列はエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの第１配列により前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３～３１８配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、前記第６配列は前記第１配列と有機的な関係を有することができる。前記第６配列は前記第１配列により多様に設計され得る。すなわち、前記第６配列は前記第１配列内に存在するＮおよび／またはＶにより多様に設計され得る。この時、前記第６配列は前記第１配列に存在する少なくとも一つ以上のＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含むことができる。
【0252】
ｉ）５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ａのうち少なくとも一つのＮは前記第１配列の（Ｎ）ａのうち少なくとも一つのＮと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２０）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＵＧＣＣＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２１）配列であり得る（（Ｎ）ａに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ａのうち少なくとも一つのＮは前記第１配列の（Ｎ）ａのうち少なくとも一つのＮと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２０）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＵＧＣＣＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２１）配列であり得る（（Ｎ）ａに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0253】
ｉｉ）５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｂ）ａＮＮＮＮＢのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＡＵＵＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２２）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＧＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２３）配列であり得る（（Ｂ）ａＮＮＮＮＢおよびＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｂ）ａＮＮＮＮＢのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＡＵＵＣＣＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２２）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＧＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２３）配列であり得る（（Ｂ）ａＮＮＮＮＢおよびＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0254】
ｉｉｉ）５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ｂは０～１の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２５）配列であり得る（（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮおよびＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ｂは０～１の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２５）配列であり得る（（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮおよびＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0255】
ｉｖ）５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ｃは０～２の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２６）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２７）配列であり得る（（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮおよびＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ｃは０～２の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２６）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２７）配列であり得る（（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮおよびＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0256】
ｖ）５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ｄは０～３の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２８）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＡＧＧＣＡＧＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２９）配列であり得る（（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮおよびＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ｄは０～３の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２８）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＡＧＧＣＡＧＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２９）配列であり得る（（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮおよびＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0257】
ｖｉ）５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ａＢＮＮＮＮのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＡＵＵＧＡＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＡＧＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１）配列であり得る（（Ｎ）ａＢＮＮＮＮおよびＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
一具現例として、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。この時、前記第６配列の（Ｎ）ａＢＮＮＮＮのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＢは前記第１配列のＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａのうち少なくとも一つのＮおよび／またはＶと相補的な結合を形成することができる。例えば、第１配列が５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＣＡＵＵＧＡＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０）配列である場合、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＡＧＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１）配列であり得る（（Ｎ）ａＢＮＮＮＮおよびＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａに対応するヌクレオチドのうち互いに相補的結合を形成するヌクレオチドはそれぞれアンダーラインで表示する）。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0258】
ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３～３１８配列のうち選択された配列の一部の配列
一具現例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３配列のうち５'－（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３配列の５'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。
一具現例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３配列のうち５'－（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３配列の５'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。
【0259】
一具体例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３２）配列の一部の配列であり、５'－ＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３３）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第６配列は５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３４）配列、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３５）配列、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３６）配列、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３７）配列、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３８）配列、５'－ＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３９）配列、５'－ＡＵＡＧＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４０）配列、５'－ＡＧＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４１）配列または５'－ＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３３）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0260】
他の一具現例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４配列のうち５'－ＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４２）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４配列の５'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記それぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。
【0261】
一具体例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４３）配列の一部の配列であり、５'－ＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４２）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第６配列は５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４４）配列、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４５）配列、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４６）配列、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４７）配列、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４８）配列、５'－ＧＡＡＵＡＧＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４９）配列、５'－ＡＵＡＧＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５０）配列、５'－ＡＧＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５１）配列または５'－ＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0262】
さらに他の一具現例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５配列のうち５'－ＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５２）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５配列の５'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ｂは０～１の整数であり得る。
【0263】
一具体例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５３）配列の一部の配列であり、５'－ＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５２）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第６配列は５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５４）配列、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５５）配列、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５６）配列、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５７）配列、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５８）配列、５'－ＧＡＡＵＡＧＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５９）配列、５'－ＡＵＡＧＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６０）配列、５'－ＡＧＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６１）配列または５'－ＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0264】
他の一具現例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６配列のうち５'－ＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６２）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６配列の５'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ｃは０～２の整数であり得る。
【0265】
一具体例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６３）配列の一部の配列であり、５'－ＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６２）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第６配列は５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６４）配列、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６５）配列、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６６）配列、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６７）配列、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６８）配列、５'－ＧＡＡＵＡＧＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６９）配列、５'－ＡＵＡＧＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７０）配列、５'－ＡＧＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７１）配列または５'－ＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0266】
さらに他の一具現例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７配列のうち５'－ＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７配列の５'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ｄは０～３の整数であり得る。
【0267】
一具体例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３）配列の一部の配列であり、５'－ＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第６配列は５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７４）配列、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７５）配列、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７６）配列、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７７）配列、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７８）配列、５'－ＧＡＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７９）配列、５'－ＡＵＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８０）配列、５'－ＡＧＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８１）配列または５'－ＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0268】
さらに他の一具現例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８配列のうち５'－ＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８２）配列を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８配列の５'末端部で順次的な一部の配列を含まなくてもよい。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり得る。
【0269】
一具体例として、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８３）配列の一部の配列であり、５'－ＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８２）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。例えば、前記第６配列は５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８４）配列、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８５）配列、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８６）配列、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８７）配列、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８８）配列、５'－ＧＡＡＵＡＧＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８９）配列、５'－ＡＵＡＧＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９０）配列、５'－ＡＧＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９１）配列または５'－ＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８２）配列であり得る。この時、前記Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記ＢはＵ、ＣまたはＧであり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0270】
２－２）Ｓｅｖｅｎｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｏｒ Ｓｔｅｍ３）／ ａ ｐａｒｔ ｏｆ Ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第７配列（ｓｅｖｅｎｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。前記第７配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡに含まれる必須配列である。前記第７配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合をする配列である。この時、前記第７配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの前記第３配列の一部の配列と相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第７配列（ｓｅｖｅｎｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。前記第７配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡに含まれる必須配列である。前記第７配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列と相補的な結合をする配列である。この時、前記第７配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの前記第３配列の一部の配列と相補的な結合を通じてＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成する。
【0271】
前記第７配列は前記第３配列と相補的結合を形成する少なくとも一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記第７配列は前記第３配列と相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。すなわち、前記第７配列は前記第３配列と少なくとも一つ以上の相補的結合を形成することができる。
【0272】
前記第７配列は前記第３配列と少なくとも一つ以上の塩基対を形成するヌクレオチドを含む。この時、前記第７配列は前記第３配列と少なくとも一つ以上の塩基対を形成しないヌクレオチドを含むことができる。すなわち、前記第７配列は前記第３配列と少なくとも一つ以上の塩基対を形成することができる。
【0273】
前記第７配列は前記第６配列の３'末端に位置する。
【0274】
前記第７配列は前記第６配列の３'末端と共有結合で連結される。
【0275】
一具現例として、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列であり得る。
【0276】
他の一具現例として、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列と少なくとも７０％以上同一または類似する配列であり得る。または前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0277】
さらに他の一具現例として、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列と少なくとも７０％～８５％、少なくとも７０％～１００％または少なくとも８５％～１００％同一または類似する配列であり得る。または前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも少なくとも７０％～８５％、少なくとも７０％～１００％または少なくとも８５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0278】
さらに他の一具現例として、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一または類似する配列であり得る。または前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0279】
２－３）ガイド配列（ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはガイド配列を含む。ガイド配列は標的核酸を認識（ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ）、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）またはターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）するＲＮＡ配列である。より具体的には、ガイド配列は標的配列と相補的に結合するＲＮＡ配列、標的配列と相補的な結合を形成できるＲＮＡ配列または標的配列に相補性を有するＲＮＡ配列である。またはガイド配列はプロトスペーサー配列と同一または類似するＲＮＡ配列である。この時、プロトスペーサー配列は標的配列と有機的な関係を有し、これに関連した説明は前記用語の定義セクションの「標的配列、標的鎖および非標的鎖」で説明した通りである。ガイド配列は標的配列により変更される配列であって、ガイド配列は標的配列により変わる。また、ガイド配列はＲＮＡ配列であって、標的核酸がＤＮＡである場合に標的配列内に存在するアデノシン（Ａ）に対して、前記ガイド配列は相補的な結合を形成できるウリジン（Ｕ）を含む。または標的核酸がＤＮＡである場合に、プロトスペーサー配列内に存在するチミジン（Ｔ）に対して、前記ガイド配列はチミジン（Ｔ）の代わりにウリジン（Ｕ）を含む。また、前記ガイド配列はスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とも指称され、以下でガイド配列とスペーサー配列は併用されて使われる。
前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはガイド配列を含む。ガイド配列は標的核酸を認識（ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ）、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）またはターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）するＲＮＡ配列である。より具体的には、ガイド配列は標的配列と相補的に結合するＲＮＡ配列、標的配列と相補的な結合を形成できるＲＮＡ配列または標的配列に相補性を有するＲＮＡ配列である。またはガイド配列はプロトスペーサー配列と同一または類似するＲＮＡ配列である。この時、プロトスペーサー配列は標的配列と有機的な関係を有し、これに関連した説明は前記用語の定義セクションの「標的配列、標的鎖および非標的鎖」で説明した通りである。ガイド配列は標的配列により変更される配列であって、ガイド配列は標的配列により変わる。また、ガイド配列はＲＮＡ配列であって、標的核酸がＤＮＡである場合に標的配列内に存在するアデノシン（Ａ）に対して、前記ガイド配列は相補的な結合を形成できるウリジン（Ｕ）を含む。または標的核酸がＤＮＡである場合に、プロトスペーサー配列内に存在するチミジン（Ｔ）に対して、前記ガイド配列はチミジン（Ｔ）の代わりにウリジン（Ｕ）を含む。また、前記ガイド配列はスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とも指称され、以下でガイド配列とスペーサー配列は併用されて使われる。
【0280】
前記ガイド配列は前記野生型反復配列の３'末端に位置する。または前記ガイド配列は前記第７配列の３'末端に位置する。
【0281】
前記ガイド配列は前記野生型反復配列の３'末端と共有結合で連結される。または前記ガイド配列は前記第７配列の３'末端と共有結合で連結される。
【0282】
前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列である。
【0283】
一具現例として、前記ガイド配列は１５～２０個、１５～２５個、１５～３０個、１５～３５個または１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記ガイド配列は２０～２５個、２０～３０個、２０～３５個または２０～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記ガイド配列は２５～３０個、２５～３５個または２５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記ガイド配列は３０～３５個または３０～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記ガイド配列は３５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0284】
他の一具現例として、前記ガイド配列は１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0285】
前記ガイド配列は標的配列と相補的な結合をする配列である。この時、前記相補的な結合は選択的に少なくとも一つ以上のミスマッチング結合を含むことができる。例えば、前記ガイド配列は標的配列と相補的な結合をする配列であり、この時、前記相補的な結合は０～５個のミスマッチング結合を含むことができる。
【0286】
前記ガイド配列は標的配列に対して相補的な配列である。この時、前記相補的な配列は標的配列に対して０～５個のミスマッチされた（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）ヌクレオチド配列を含むことができる。または前記ガイド配列は標的配列に対して少なくとも７０％以上相補的なヌクレオチド配列であり得る。この時、標的配列がＤＮＡである場合に標的配列内に存在するアデノシン（Ａ）に対して、前記ガイド配列は前記アデノシン（Ａ）に相補的な結合を形成できるウリジン（Ｕ）を含むことができる。
【0287】
一具現例として、前記ガイド配列は標的配列に対して少なくとも７０％～７５％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも７０％～８５％、少なくとも７０％～９０％、少なくとも７０％～９５％、少なくとも７０％～１００％、少なくとも７５％～８０％、少なくとも７５％～８５％、少なくとも７５％～９０％、少なくとも７５％～９５％または少なくとも７５％～１００％相補的な配列であり得る。または前記ガイド配列は標的配列に対して少なくとも８０％～８５％、少なくとも８０％～９０％、少なくとも８０％～９５％、少なくとも８０％～１００％、少なくとも８５％～９０％、少なくとも８５％～９５％または少なくとも８５％～１００％相補的な配列であり得る。または前記ガイド配列は標的配列に対して少なくとも９０％～９５％、少なくとも９０％～１００％または少なくとも９５％～１００％相補的な配列であり得る。または前記ガイド配列は標的配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％相補的な配列であり得る。
【0288】
前記ガイド配列はプロトスペーサー配列と同一または類似する配列である。すなわち、前記ガイド配列はプロトスペーサー配列に対して配列同一性または配列類似性を有する配列である。この時、前記配列同一性または配列類似性は少なくとも７０％以上であるものであり得る。この時、プロトスペーサー配列がＤＮＡである場合にプロトスペーサー配列内に存在するチミジン（Ｔ）に対して、前記ガイド配列はチミジン（Ｔ）の代わりにウリジン（Ｕ）を含むことができる。
【0289】
一具現例として、前記ガイド配列はプロトスペーサー配列と少なくとも７０％～７５％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも７０％～８５％、少なくとも７０％～９０％、少なくとも７０％～９５％、少なくとも７０％～１００％、少なくとも７５％～８０％、少なくとも７５％～８５％、少なくとも７５％～９０％、少なくとも７５％～９５％または少なくとも７５％～１００％同一または類似する配列であり得る。または前記ガイド配列はプロトスペーサー配列と少なくとも８０％～８５％、少なくとも８０％～９０％、少なくとも８０％～９５％、少なくとも８０％～１００％、少なくとも８５％～９０％、少なくとも８５％～９５％または少なくとも８５％～１００％同一または類似する配列であり得る。または前記ガイド配列はプロトスペーサー配列と少なくとも９０％～９５％、少なくとも９０％～１００％または少なくとも９５％～１００％同一または類似する配列であり得る。または前記ガイド配列はプロトスペーサー配列と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一または類似する配列であり得る。
【0290】
他の一具現例として、前記ガイド配列はプロトスペーサー配列に少なくとも７０％～７５％、少なくとも７０％～８０％、少なくとも７０％～８５％、少なくとも７０％～９０％、少なくとも７０％～９５％、少なくとも７０％～１００％、少なくとも７５％～８０％、少なくとも７５％～８５％、少なくとも７５％～９０％、少なくとも７５％～９５％または少なくとも７５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。または前記ガイド配列はプロトスペーサー配列に少なくとも８０％～８５％、少なくとも８０％～９０％、少なくとも８０％～９５％、少なくとも８０％～１００％、少なくとも８５％～９０％、少なくとも８５％～９５％または少なくとも８５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。または前記ガイド配列はプロトスペーサー配列に少なくとも９０％～９５％、少なくとも９０％～１００％または少なくとも９５％～１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。または前記ガイド配列はプロトスペーサー配列に少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性または配列類似性を有する配列であり得る。
【0291】
２－４）Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を選択的にさらに含むことができる。Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの３'末端に付加されるウリジン（Ｕ）が豊富な配列である。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はエンジニアリングされたガイドＲＮＡ（またはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム）を利用した標的遺伝子（標的核酸）エディティング効率を上げる役割をすると本発明者の以前の研究で報告した（ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／０１４９６１）。
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を選択的にさらに含むことができる。Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの３'末端に付加されるウリジン（Ｕ）が豊富な配列である。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はエンジニアリングされたガイドＲＮＡ（またはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム）を利用した標的遺伝子（標的核酸）エディティング効率を上げる役割をすると本発明者の以前の研究で報告した（ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／０１４９６１）。
【0292】
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり得る。
【0293】
この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。
【0294】
この時、前記ａは０～４の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり、前記ｅは０～１０の整数であり得る。
【0295】
一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＵ）ｄＵｅ－３'配列、すなわち、Ｕｘ配列であり得る。この時、前記ｘは０～２２の整数であり得る。例えば、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＵ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵＵまたはＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９２）であり得る。
【0296】
他の一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＡ）ｄＵｅ－３'配列であり得る。例えば、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＵＡＵ、ＵＵＡＵＵＡＵ、ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ、ＵＵＵＡＵＵＵＵＵまたはＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９３）であり得る。
【0297】
さらに他の一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＧ）ｄＵｅ－３'配列であり得る。例えば、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＵＵＧ、ＵＵＵＧＵ、ＵＵＧＵＵＧＵ、ＵＵＵＵＧＵＵＵＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９４）またはＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９５）であり得る。
【0298】
他の一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＣ）ｄＵｅ－３'配列であり得る。例えば、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＣＵＵＵＵＵ、ＵＣＵＣＵＵＵ、ＵＵＣＵＵ、ＵＵＵＣＵ、ＵＵＵＵＣＵＵＵＵまたはＵＵＵＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９６）であり得る。
【0299】
さらに他の一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－ＵａＡＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＣＵｅ－３'配列または５'－ＵａＧＵａＧＵｅ－３'配列であり得る。例えば、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＵＵＡＵＵＵＡＵＵ、ＵＵＵＣＵＡＵＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９７）、ＵＧＵＣＵ、ＵＵＡＵＧＵＵＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９８）またはＵＣＵＵＵＵＧＵＵであり得る。
【0300】
さらに他の一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－ＵａＡＵａＡＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＡＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＡＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＣＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＣＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＣＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＧＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＧＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＡＵａＧＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＡＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＡＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＡＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＣＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＣＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＣＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＧＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＧＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＣＵａＧＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＡＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＡＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＡＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＣＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＣＵａＣＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＣＵａＧＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＧＵａＡＵｅ－３'配列、５'－ＵａＧＵａＧＵａＣＵｅ－３'配列または５'－ＵａＧＵａＧＵａＧＵｅ－３'配列であり得る。例えば、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＵＵＵＡＵＵＣＵＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９９）、ＵＵＣＵＣＵＵＵＣＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４００）、ＵＧＵＵＡＵＵＵＡＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０１）、ＵＵＵＣＵＵＵＡＵＧＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０２）、ＵＡＵＵＵＧＵＵＵＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０３）またはＵＵＣＵＵＧＵＵＵＵＡＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０４）であり得る。
【0301】
２－５）追加配列（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
【0302】
前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよび／またはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡは追加配列（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を選択的にさらに含むことができる。前記追加配列はｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよび／またはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる。前記追加配列は前記野生型反復配列またはエンジニアリングされた反復配列の５'末端に位置することができる。前記追加配列は前記第６配列の５'末端に位置することができる。
【0303】
前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。
【0304】
一具現例として、前記追加配列は１～５個、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、１～３０個、１～３５個、１～４０個、５～１０個、５～１５個、５～２０個、５～２５個、５～３０個、５～３５個または５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記追加配列は１０～１５個、１０～２０個、１０～２５個、１０～３０個、１０～３５個、１０～４０個、１５～２０個、１５～２５個、１５～３０個、１５～３５個または１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記追加配列は２０～２５個、２０～３０個、２０～３５個、２０～４０個、２５～３０個、２５～３５個または２５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。または前記追加配列は３０～３５個、３０～４０個または３５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0305】
他の一具現例として、前記追加配列は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0306】
前記追加配列は任意のヌクレオチド配列または任意に配列されたヌクレオチド配列であり得る。
【0307】
前記追加配列は公知のヌクレオチド配列であり得る。例えば、前記追加配列はｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列であり得る。この時、前記ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２配列であり得る。前記例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0308】
２－６）化学的変形（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
前述したｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に少なくとも一つ以上のヌクレオチドの化学的変形を含むことができる。この時、前記化学的変形はヌクレオチドの塩基および／または糖で発生し得る多様な共有結合の変形であり得、例えば、前記化学的変形はｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、ｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ、ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅ、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ３'ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ（ＭＳ）または２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得、またはＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１に記載された核酸の変形をすべて含むことができるが、これに制限されない。
前述したｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に少なくとも一つ以上のヌクレオチドの化学的変形を含むことができる。この時、前記化学的変形はヌクレオチドの塩基および／または糖で発生し得る多様な共有結合の変形であり得、例えば、前記化学的変形はｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、ｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ、ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅ、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ３'ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ（ＭＳ）または２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得、またはＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１に記載された核酸の変形をすべて含むことができるが、これに制限されない。
【0309】
２－７）ｃｒＲＮＡの例示（エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの例示）
前記の説明に基づいて、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの例示を説明する。以下の例示に含まれた構成要素の具体的な説明は前記にて該当構成要素について記載した通りである。以下の例示は単純例示であり、これに制限されない。
前記の説明に基づいて、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの例示を説明する。以下の例示に含まれた構成要素の具体的な説明は前記にて該当構成要素について記載した通りである。以下の例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0310】
一具現例として、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２）配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列とガイド配列はｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列］－［ガイド配列］－３'）。一例として、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0311】
一具現例として、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡの３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加されたｃｒＲＮＡであり得る。
【0312】
一具体例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２）配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり得る。この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり、前記ｅは０～１０の整数であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる（５'－［追加配列］－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。
【0313】
例えば、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－ＵＵＵＵ－３'配列、５'－ＵＵＵＵＡＵＵ－３'配列または５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０６）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0314】
他の一具現例として、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）ｃｒＲＮＡの一部のヌクレオチド配列が人為的に変形された配列であり得る。
【0315】
一具体例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列と比較して少なくとも一つ以上のヌクレオチドが他の配列で置換された配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記第６配列、第７配列およびガイド配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－３'）。この時、前記第６配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列；および５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｂ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｂ）ａのそれぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる（５'－［追加配列］－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－３'）。
【0316】
例えば、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記第６配列は５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８）配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列は５'－ＧＮＧＮＮＮＵＧ－３'配列の他に残りの配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ガイド配列］－３'）。一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０９）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１０）配列を含むことができる。
【0317】
さらに他の一具現例として、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）ｃｒＲＮＡの一部のヌクレオチド配列が人為的に変形されたり、および／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたりした配列であり得る。
【0318】
一具体例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列のうち一部のヌクレオチド配列が削除された配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列およびガイド配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列］－［ガイド配列］－３'）。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の５'末端部一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる（５'－［追加配列］－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列］－［ガイド配列］－３'）。一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１１）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0319】
他の一具体例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列と比較して少なくとも一つ以上のヌクレオチドが他の配列で置換され、ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列のうち一部のヌクレオチド配列が削除された配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記第６配列、第７配列およびガイド配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－３'）。この時、前記第６配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３～３１８配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｂ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｂ）ａのそれぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる（５'－［追加配列］－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－３'）。
【0320】
例えば、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記第６配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列のうち５'－ＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列は５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１３）配列、５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１４）配列、５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１５）配列、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１６）配列、５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１７）配列、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１８）配列、５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１９）配列、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２０）配列、５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２１）配列、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２２）配列、５'－ＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２３）配列、５'－ＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２４）配列、５'－ＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２５）配列、５'－ＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２６）配列、５'－ＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２７）配列、５'－ＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２８）配列または５'－ＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２）配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列またはこれの一部の配列］－［５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ガイド配列］－３'）。一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２９）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３０）配列を含むことができる。
【0321】
他の一具現例として、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）ｃｒＲＮＡの一部のヌクレオチド配列が人為的に変形されたり、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたり、および／または３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加された配列であり得る。
【0322】
一具体例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列のうち一部のヌクレオチド配列が削除され、３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加された配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の５'末端部一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり得る。この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり、前記ｅは０～１０の整数であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる（５'－［追加配列］－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３１）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0323】
他の一具体例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列と比較して少なくとも一つ以上のヌクレオチドが他の配列で置換され、３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加された配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。この時、前記第６配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列；および５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｂ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｂ）ａのそれぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり得る。この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり、前記ｅは０～１０の整数であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる（５'－［追加配列］－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。
【0324】
例えば、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記第６配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列は５'－ＧＮＧＮＮＮＵＧ－３'配列の他に残りの配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－ＵＵＵＵ－３'配列、５'－ＵＵＵＵＡＵＵ－３'配列または５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３２）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３３）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３４）配列を含むことができる。
【0325】
さらに他の一具体例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列と比較して少なくとも一つ以上のヌクレオチドが他の配列で置換されたり、ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列のうち一部のヌクレオチド配列が削除されたり、および／または３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加された配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。この時、前記第６配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３～３１８配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｂ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｂ）ａのそれぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり得る。この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり、前記ｅは０～１０の整数であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的に追加配列をさらに含むことができる。この時、前記追加配列は１～４０個のヌクレオチド配列（１～４０ｎｔ配列）であり得る。前記追加配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端に位置することができる（５'－［追加配列］－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。
【0326】
例えば、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記第６配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列のうち５'－ＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２～４２８配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－ＵＵＵＵ－３'配列、５'－ＵＵＵＵＡＵＵ－３'配列または５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列］－［５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列またはこれに少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３５）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。他の一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３６）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４５）配列を含むことができる。
【0327】
３.エンジニアリングされたガイドＲＮＡ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）
エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）とｃｒＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）を含む。この時、前記ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ関連説明は前記の通りである。
エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）とｃｒＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ）を含む。この時、前記ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ関連説明は前記の通りである。
【0328】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡまたはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。
【0329】
以下で、エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡおよびエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡについて詳しく説明する。
【0330】
３－１）ＤｕａｌガイドＲＮＡ
エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡは二つのＲＮＡ分子であり、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡそれぞれを別個のＲＮＡ分子で含む。すなわち、前記エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡがそれぞれ独立的に存在する。
エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡは二つのＲＮＡ分子であり、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡそれぞれを別個のＲＮＡ分子で含む。すなわち、前記エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡがそれぞれ独立的に存在する。
【0331】
この時、前記ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり得る。
【0332】
この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ関連説明は前記の通りである。
【0333】
３－２）ＳｉｎｇｌｅガイドＲＮＡ
エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡは一つのＲＮＡ分子であり、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）およびｃｒＲＮＡを含む。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ、ｌｉｎｋｅｒおよびｃｒＲＮＡが連結された一つのＲＮＡ分子である。
エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡは一つのＲＮＡ分子であり、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）およびｃｒＲＮＡを含む。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ、ｌｉｎｋｅｒおよびｃｒＲＮＡが連結された一つのＲＮＡ分子である。
【0334】
エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡは５'－［エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ］－［ｌｉｎｋｅｒ］－［ｃｒＲＮＡ］－３'配列であり得る。
【0335】
この時、前記ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり得る。
【0336】
この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ関連説明は前記の通りである。
【0337】
この時、前記ｌｉｎｋｅｒは前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを連結する役割をする。すなわち、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡがｌｉｎｋｅｒを通じて連結された一つのＲＮＡ分子である。
【0338】
前記ｌｉｎｋｅｒはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよび／またはｃｒＲＮＡの機能に影響を与えない配列であり得る。または前記ｌｉｎｋｅｒはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよび／またはｃｒＲＮＡとＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成しない配列であり得る。
【0339】
前記ｌｉｎｋｅｒは１～３０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0340】
一具現例として、前記ｌｉｎｋｅｒは１～５個、５～１０個、１０～１５個、１５～２０個、２０個～２５個または２５～３０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0341】
他の一具現例として、前記ｌｉｎｋｅｒは１～３０個、５～３０個、１０～３０個、１５～３０個、２０～３０個または２５～３０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0342】
さらに他の一具現例として、前記ｌｉｎｋｅｒは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ １７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のヌクレオチド配列であり得る。例えば、前記ｌｉｎｋｅｒは５'－ＧＡＡＡ－３'配列であり得るが、これに制限されたのではない。
【0343】
３－３）エンジニアリングされたガイドＲＮＡの例示
前記の説明に基づいて、エンジニアリングされたガイドＲＮＡの例示を説明する。以下の例示に含まれた構成要素の具体的な説明は前記にて該当構成要素について記載した通りである。以下の例示は単純例示であり、これに制限されない。
前記の説明に基づいて、エンジニアリングされたガイドＲＮＡの例示を説明する。以下の例示に含まれた構成要素の具体的な説明は前記にて該当構成要素について記載した通りである。以下の例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0344】
本出願で、エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含むことができる。この時、前記ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記「１－８）エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの例示」セクションに記載された例示のうち一つであり得る。前記ｃｒＲＮＡは「２－７）ｃｒＲＮＡの例示」セクションに記載された例示のうち一つであり得る。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡをそれぞれ別個のＲＮＡ分子で含むことができる。または前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。
【0345】
他の一具現例として、エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡを含むことができる。
【0346】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した４個以下のウリジン配列を含むことができる。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的にｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように追加で変形されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列を含まなくてもよい。
【0347】
一具体例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは、
【0348】
（ｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まず、連続した４個以下のウリジン配列を含むエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよび（ｉｉ）ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡを含む。
【0349】
この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；および５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列とガイド配列はｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列］－［ガイド配列］－３'）。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡをそれぞれ別個のＲＮＡ分子で含むことができる。または前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。
【0350】
例えば、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは以下で説明するエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡを含むことができる。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列は５'－ＣＡＮＮＮＣＮＣ－３'配列の他に残りの配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列とガイド配列が５'末端から３'末端方向に順に位置することができる。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡまたはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡである５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９）配列およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡである５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５）配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡ ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３７）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡである５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０）配列およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡ ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３８）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0351】
他の一具体例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは
【0352】
（ｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まず、連続した４個以下のウリジン配列を含み、選択的にｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列を含まないエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよび（ｉｉ）ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡを含む。
【0353】
この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列とガイド配列はｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列］－［ガイド配列］－３'）。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡをそれぞれ別個のＲＮＡ分子で含むことができる。または前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。
【0354】
例えば、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは以下で説明するエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡを含むことができる。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２～２９０配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４～２１７配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１～２４７配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列および５'－ＵＵＡＧ－３'配列で構成された群から選択された一つの配列であり得、この時、前記選択された一つの配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であって、５'－Ａ－３'配列、５'－ＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９～２５９配列で構成された群から選択された一つの配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列とガイド配列が５'末端から３'末端方向に順に位置することができる。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡまたはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡである５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１）配列およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡである５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４）配列およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡである５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６）配列およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡである５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８）配列およびｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0355】
さらに他の一具現例として、エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含むことができる。
【0356】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した４個以下のウリジン配列を含むことができる。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的にｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように追加で変形されたものであり得る。例えば、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列を含まなくてもよい。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡより反復の長さが短いように変形されたり、および／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡの３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加されたりしたものであり得る。
【0357】
一具体例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは、
【0358】
（ｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まず、連続した４個以下のウリジン配列を含み、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列を含まないエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよび（ｉｉ）ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列、Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含む。
【0359】
この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。
【0360】
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり得る。この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり、前記ｅは０～１０の整数であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡをそれぞれ別個のＲＮＡ分子で含むことができる。または前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。
【0361】
例えば、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは以下で説明するエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含むことができる。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２～２９０配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４～２１７配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１～２４７配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列および５'－ＵＵＡＧ－３'配列で構成された群から選択された一つの配列であり得、この時、前記選択された一つの配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であって、５'－Ａ－３'配列、５'－ＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９～２５９配列で構成された群から選択された一つの配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－ＵＵＵＵ－３'配列、５'－ＵＵＵＵＡＵＵ－３'配列または５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡまたはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡである５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７）配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４５）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡ ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡ ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0362】
他の一具体例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは、
【0363】
（ｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まず、連続した４個以下のウリジン配列を含み、選択的にｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列を含まないエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよび（ｉｉ）ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列のうち一部のヌクレオチド配列が削除されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含む。
【0364】
この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。
【0365】
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列のうち一部のヌクレオチド配列が削除された配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列およびガイド配列を含むことができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列をさらに含むことができる。この時、前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の一部の配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の５'末端部一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり得る。この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり、前記ｅは０～１０の整数であり得る。前記ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列およびガイド配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列］－［ガイド配列］－３'）。この時、選択的にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列をさらに含む場合、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの３'末端に位置することができる（５'－［ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列の一部の配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ］－３'）。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡをそれぞれ別個のＲＮＡ分子で含むことができる。または前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。
【0366】
例えば、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは以下で説明するエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含むことができる。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２～２９０配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４～２１７配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１～２４７配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列および５'－ＵＵＡＧ－３'配列で構成された群から選択された一つの配列であり得、この時、前記選択された一つの配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であって、５'－Ａ－３'配列、５'－ＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９～２５９配列で構成された群から選択された一つの配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の一部の配列およびガイド配列を含むことができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列をさらに含むことができる。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の５'末端部一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－ＵＵＵＵ－３'配列、５'－ＵＵＵＵＡＵＵ－３'配列または５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２配列の一部の配列およびガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができ、Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列をさらに含む場合、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は３'末端に含まれ得る。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡまたはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡである５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０５）配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡである５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１１）配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４９）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０５配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡである５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３１）配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５０）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０７）配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３１配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵ ＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５１）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡである５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０９）配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３１配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0367】
さらに他の一具現例として、次のエンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含むことができる。
【0368】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した４個以下のウリジン配列を含むことができる。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは選択的にｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように追加で変形されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列を含まなくてもよい。
【0369】
本具現例で、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは野生型ｃｒＲＮＡの一部のヌクレオチド配列が人為的に変形されたり、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたり、および／または３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加されたものであり得る。
【0370】
一具体例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは
【0371】
（ｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まず、連続した４個以下のウリジン配列を含み、選択的にｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列を含まないエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよび（ｉｉ）ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列と比較して少なくとも一つ以上のヌクレオチドが他の配列で置換されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含む。
【0372】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列と比較して少なくとも一つ以上のヌクレオチドが他の配列で置換されたものであり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的にｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列のうち一部のヌクレオチド配列が削除されたものであり得る。
【0373】
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記第６配列、第７配列およびガイド配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－３'）。この時、前記第６配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３～３１８配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｂ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｂ）ａのそれぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡをそれぞれ別個のＲＮＡ分子で含むことができる。または前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。
【0374】
例えば、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは以下で説明するエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含むことができる。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２～２９０配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４～２１７配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１～２４７配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列および５'－ＵＵＡＧ－３'配列で構成された群から選択された一つの配列であり得、この時、前記選択された一つの配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であって、５'－Ａ－３'配列、５'－ＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９～２５９配列で構成された群から選択された一つの配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を含むことができる。この時、前記第６配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列のうち５'－ＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２～４２８配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列およびガイド配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡまたはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡである５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０９）配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５３）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０９配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５４）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡである５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１０）配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５５）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１０配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５６）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０９配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡ ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５７）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１０配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡ ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５８）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0375】
他の一具体例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは
【0376】
（ｉ）連続した５個以上のウリジン配列を含まず、連続した４個以下のウリジン配列を含み、選択的にｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの一部の配列を含まないエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよび（ｉｉ）ｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列と比較して少なくとも一つ以上のヌクレオチドが他の配列で置換され、３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含む。
【0377】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列は前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端から５'末端方向に順に位置することができる（５'－［第５配列］－［第４配列］－［第３配列］－［第２配列］－［第１配列］－３'）。この時、前記第１配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＶＮＮＮＮ（Ｖ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＶＮＮＮ（Ｎ）ｂＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＶＮＮ（Ｎ）ｃＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＶＮ（Ｎ）ｄＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）配列；５'－ＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＮＶ（Ｎ）ａＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｖ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｖ）ａのそれぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。
【0378】
前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列と比較して少なくとも一つ以上のヌクレオチドが他の配列で置換され、３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加されたものであり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは選択的にｗｉｌｄｔｙｐｅ反復配列のうち一部のヌクレオチド配列が削除されたものであり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に順に位置することができる（５'－［第６配列］－［第７配列］－［ガイド配列］－［Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列］－３'）。この時、前記第６配列は次の配列のうち選択された少なくとも一つの配列であり得る：５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｂ）ａＮＮＮＮＢＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｂＮＮＮＢＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｃＮＮＢＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ｄＮＢＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７）配列；５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧ（Ｎ）ａＢＮＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８）配列；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３～３１８配列のうち選択された一つの一部の配列。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、それぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｂは０～１の整数であり、前記ｃは０～２の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり得る。前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄで、前記ａ、ｃおよびｄが０または１でない整数の場合、前記（Ｎ）ａ、（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｄのＮはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。前記（Ｂ）ａで、前記ａが０または１でない整数の場合、前記（Ｂ）ａのそれぞれのＢは独立的にＵ、ＣまたはＧであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－（ＵａＮ）ｄＵｅ－３'配列、５'－ＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列または５'－ＵａＶＵａＶＵａＶＵｅ－３'配列であり得る。この時、前記ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得、前記それぞれのＶは独立的にＡ、ＣまたはＧであり得る。前記ａは０～４の整数であり、前記ｄは０～３の整数であり、前記ｅは０～１０の整数であり得る。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡをそれぞれ別個のＲＮＡ分子で含むことができる。または前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。
【0379】
例えば、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは以下で説明するエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを含むことができる。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは以下で説明する第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列を含むことができる。この時、前記第１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２配列を含み、かつ３'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２～２９０配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第２配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第３配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記第４配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列は前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列で相補的結合を形成する少なくとも一対以上のヌクレオチドおよび／または相補的結合を形成しない少なくとも一つ以上のヌクレオチドが削除された配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４～２１７配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１～２４７配列、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＵＧ－３'配列、５'－ＣＵＵＡＧＧ－３'配列および５'－ＵＵＡＧ－３'配列で構成された群から選択された一つの配列であり得、この時、前記選択された一つの配列内に含まれた５'－ＵＵＡＧ－３'配列は５'－ＧＡＡＡ－３'配列で置換され得る。この時、前記第５配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８配列の３'末端部で順次的な一部の配列であって、５'－Ａ－３'配列、５'－ＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'配列およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９～２５９配列で構成された群から選択された一つの配列であり得る。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは前記第１配列、第２配列、第３配列、第４配列および第５配列が３'末端から５'末端方向に順に位置することができる。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むことができる。この時、前記第６配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列のうち５'－ＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２）配列を含み、かつ５'末端部の一部の配列を含まない配列であり得る。この時、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８配列の一部の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２～４２８配列のうち選択された一つの配列であり得る。この時、Ｎはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。この時、前記第７配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列または５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'配列に少なくとも７０％以上の配列同一性を有する配列であり得る。この時、前記ガイド配列は１５～４０個のヌクレオチド配列であり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は５'－ＵＵＵＵ－３'配列、５'－ＵＵＵＵＡＵＵ－３'配列または５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'配列であり得る。前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは第６配列、第７配列、ガイド配列およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を５'末端から３'末端方向に順に含むことができる。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｄｕａｌガイドＲＮＡまたはエンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡはｌｉｎｋｅｒをさらに含むことができ、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡとエンジニアリングされたｃｒＲＮＡはｌｉｎｋｅｒを通じて連結されていてもよい。一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡである５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３２）配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣ ＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５９）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３２配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６０）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡである５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３３）配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣ ＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６１）配列を含むことができる。また、一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３３配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡ ＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６２）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３２配列を含むことができる。他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＮＮＮＣＮＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＮＧＮＮＮＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡ ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６３）配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０配列およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３３配列を含むことができる。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡ ＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＵＧＣＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡ ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＵＵＵ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６４）配列を含むことができる。この時、前記ＮはそれぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり得る。
【0380】
４.エンジニアリングされたガイドＲＮＡの用途
【0381】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）とともにエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを構成することができる。
【0382】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質と結合してエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１複合体）をなすことができる。
【0383】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムの標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形のための用途で使われ得、これをさらに効果的に遂行されるようにすることができる。
【0384】
＜Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｓｙｓｔｅｍ＞
本明細書によって開示される他の一態様はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムに関する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質が正常に発現しおよび／または正常に作動するようにするすべての形態を含む。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形をさらに効果的に遂行されるようにする。特に、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは次のような効果を伴うことができる：
本明細書によって開示される他の一態様はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムに関する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質が正常に発現しおよび／または正常に作動するようにするすべての形態を含む。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形をさらに効果的に遂行されるようにする。特に、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは次のような効果を伴うことができる：
【0385】
ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘのｓｔａｂｉｌｉｔｙ増加；
【0386】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の切断効率増加；および
【0387】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の編集または変形効率増加.
【0388】
より具体的には、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは
【0389】
エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；および
【0390】
Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質またはこれを暗号化する核酸
【0391】
を含む。
【0392】
以下で各構成を詳しく説明する。
【0393】
１．エンジニアリングされたガイドＲＮＡ
本明細書によって開示されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは標的核酸または標的遺伝子に存在する標的配列を認識するエンジニアリングされたガイドＲＮＡを含む。一般的に一つのエンジニアリングされたガイドＲＮＡは一つの標的配列を認識することができる。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前述した「＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
本明細書によって開示されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは標的核酸または標的遺伝子に存在する標的配列を認識するエンジニアリングされたガイドＲＮＡを含む。一般的に一つのエンジニアリングされたガイドＲＮＡは一つの標的配列を認識することができる。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前述した「＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0394】
また、エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを転写するためにエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡであり得る。
【0395】
２.Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムの主なタンパク質構成要素であり、先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６２、８３９－８４２（２０１８））でＣａｓ１４と命名されたエフェクタータンパク質のうち一つであり、Ｃａｓ１４ａ１タンパク質とも呼ばれる。本明細書で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ａ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質と混用されて使われる。本明細書によって開示されるＣａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質（野生型Ｃａｓ１４ａ１タンパク質）であり得る。またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の変異体（ｖａｒｉａｎｔ）であり得、この時、前記変異体は「Ｃａｓ１２ｆ１変異体（Ｃａｓ１２ｆ１ ｖａｒｉａｎｔ）」または「Ｃａｓ１４ａ１変異体（Ｃａｓ１４ａ１ ｖａｒｉａｎｔ）」と指称する。前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有する変異体、機能の一部又は全部が変形された変異体および／または追加的な機能が付加された変異体であり得る。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の意味は文脈により適切に解釈され得、特別な場合でない限り最も広い意味で解釈される。以下でＣａｓ１２ｆ１タンパク質について詳しく説明する。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムの主なタンパク質構成要素であり、先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６２、８３９－８４２（２０１８））でＣａｓ１４と命名されたエフェクタータンパク質のうち一つであり、Ｃａｓ１４ａ１タンパク質とも呼ばれる。本明細書で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ａ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質と混用されて使われる。本明細書によって開示されるＣａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質（野生型Ｃａｓ１４ａ１タンパク質）であり得る。またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の変異体（ｖａｒｉａｎｔ）であり得、この時、前記変異体は「Ｃａｓ１２ｆ１変異体（Ｃａｓ１２ｆ１ ｖａｒｉａｎｔ）」または「Ｃａｓ１４ａ１変異体（Ｃａｓ１４ａ１ ｖａｒｉａｎｔ）」と指称する。前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有する変異体、機能の一部又は全部が変形された変異体および／または追加的な機能が付加された変異体であり得る。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の意味は文脈により適切に解釈され得、特別な場合でない限り最も広い意味で解釈される。以下でＣａｓ１２ｆ１タンパク質について詳しく説明する。
【0396】
２－１）Ｗｉｌｄｔｙｐｅ Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｐｒｏｔｅｉｎ
前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸または標的遺伝子の二本鎖または一本鎖を切断することができる。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸または標的遺伝子内に存在するＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）配列を認識することができる。この時、ＰＡＭ配列は前記Ｃａｓ１４ａ１タンパク質により定められる固有の配列である。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のためのＰＡＭ配列はＴ－ｒｉｃｈ配列であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のためのＰＡＭ配列は５'－ＴＴＴＲ－３'配列であり得る。この時、前記ＲはＡまたはＧであり得る。例えば、前記ＰＡＭ配列は５'－ＴＴＴＡ－３'または５'－ＴＴＴＧ－３'配列であり得る。
前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸または標的遺伝子の二本鎖または一本鎖を切断することができる。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸または標的遺伝子内に存在するＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）配列を認識することができる。この時、ＰＡＭ配列は前記Ｃａｓ１４ａ１タンパク質により定められる固有の配列である。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のためのＰＡＭ配列はＴ－ｒｉｃｈ配列であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のためのＰＡＭ配列は５'－ＴＴＴＲ－３'配列であり得る。この時、前記ＲはＡまたはＧであり得る。例えば、前記ＰＡＭ配列は５'－ＴＴＴＡ－３'または５'－ＴＴＴＧ－３'配列であり得る。
【0397】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ファミリー（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）；ＵＳ ２０２０／０１７２８８６ Ａ１）から由来したものであり得る。
【0398】
他の一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｒｃｈａｅｏｎ由来のＣａｓ１４ａ１タンパク質（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）；ＵＳ ２０２０／０１７２８８６ Ａ１）であり得る。例えば、前記Ｃａｓ１４ａ１タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列であり得る。
【0399】
【表1】
【0400】
２－２）Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｖａｒｉａｎｔ－Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｍｕｔａｎｔ
前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１２ｆ１変異体であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも一つ以上のアミノ酸が変形されたものであり得る。この時、前記変形は削除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）および／または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）であり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は「Ｃａｓ１２ｆ１突然変異（Ｃａｓ１２ｆ１ ｍｕｔａｎｔ）」または「Ｃａｓ１４ａ１突然変異（Ｃａｓ１４ａ１ ｍｕｔａｎｔ）」と指称する。
前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１２ｆ１変異体であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも一つ以上のアミノ酸が変形されたものであり得る。この時、前記変形は削除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）および／または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）であり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は「Ｃａｓ１２ｆ１突然変異（Ｃａｓ１２ｆ１ ｍｕｔａｎｔ）」または「Ｃａｓ１４ａ１突然変異（Ｃａｓ１４ａ１ ｍｕｔａｎｔ）」と指称する。
【0401】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも一つ以上のアミノ酸が削除されたものであり得る。例えば、前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に含まれたＲｕｖＣドメイン内少なくとも一つ以上のアミノ酸が削除されたものであり得る。または前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に含まれたＰＡＭを認識するドメイン内少なくとも一つ以上のアミノ酸が削除されたものであり得る。または前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列のうち少なくとも一つ以上のアミノ酸が削除されたものであり得る。
【0402】
他の一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであり得る。この時、前記置換は一つのアミノ酸が一つの他のアミノ酸で置換されたものであり得る。または前記置換は一つのアミノ酸が多数個の他のアミノ酸で置換されたものであり得る。または前記置換は多数個のアミノ酸が一つの他のアミノ酸で置換されたものであり得る。または前記置換は多数個のアミノ酸が多数個の他のアミノ酸で置換されたことであり得、この時、置換されるアミノ酸の数と置き換えるアミノ酸の数は互いに同一または異なり得る。例えば、前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に含まれたＲｕｖＣドメイン内少なくとも一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであり得る。または前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に含まれたＰＡＭを認識するドメイン内少なくとも一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであり得る。または前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列のうち少なくとも一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであり得る。
【0403】
前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有する変異体または機能の一部又は全部が変形された変異体であり得る。例えば、前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断するように変更されたものであり得る。または前記Ｃａｓ１２ｆ１突然変異は５'－ＴＴＴＡ－３'または５'－ＴＴＴＧ－３'でない他のＰＡＭ配列を認識するように変形されたものであり得る。
【0404】
２－３）Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｖａｒｉａｎｔ－Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ
前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１２ｆ１変異体であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１突然変異に追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質が付加された変異体であり得る。この時、前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質が付加された変異体は「Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質」または「Ｃａｓ１４ａ１融合タンパク質」と指称される。前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１突然変異のＮ末端、Ｃ末端および／またはアミノ酸配列内に付加され得る。前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一または異なる機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質であり得る。例えば、前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質はメチラーゼ（ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、デメチラーゼ（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、転写促進（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）活性、転写阻害（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）活性、転写放出因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ）活性、ヒストン変形（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）活性、ＲＮＡ切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）活性または核酸結合（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）活性を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質であり得、またはタンパク質（ペプチド含む）の分離精製のためのタグ（ｔａｇ）またはレポータータンパク質であり得るが、これに制限されない。または前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質は逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはデアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり得る。
前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１２ｆ１変異体であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１突然変異に追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質が付加された変異体であり得る。この時、前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質が付加された変異体は「Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質」または「Ｃａｓ１４ａ１融合タンパク質」と指称される。前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１突然変異のＮ末端、Ｃ末端および／またはアミノ酸配列内に付加され得る。前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一または異なる機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質であり得る。例えば、前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質はメチラーゼ（ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、デメチラーゼ（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、転写促進（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）活性、転写阻害（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）活性、転写放出因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ）活性、ヒストン変形（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）活性、ＲＮＡ切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）活性または核酸結合（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）活性を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質であり得、またはタンパク質（ペプチド含む）の分離精製のためのタグ（ｔａｇ）またはレポータータンパク質であり得るが、これに制限されない。または前記追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質は逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはデアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり得る。
【0405】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質およびデアミナーゼを含むことができる。この時、前記デアミナーゼはシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、シチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）またはアデニンデアミナーゼ（ａｄｅｎｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は選択的に追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質をさらに含むことができる。一具体例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６６アミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６７アミノ酸配列であり得る。他の一具体例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６８アミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６９アミノ酸配列であり得る。
【0406】
他の一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を含むことができる。この時、前記逆転写酵素はＭｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素またはこの変異体であり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は選択的に追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質をさらに含むことができる。一具体例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７０アミノ酸配列であり得る。
【0407】
前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能および追加的な機能を有する変異体であり得る。または前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の機能の一部又は全部の変形および追加的な機能を有する変異体であり得る。例えば、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断することができ、切断しない鎖に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）またはプライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）ができるように変更されたものであり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質はＣａｓ１２ｆ１突然変異およびデアミナーゼを含むことができ、この場合、前記ベースエディティングはデアミナーゼによるものであり得る。または前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質はＣａｓ１２ｆ１突然変異および逆転写酵素を含むことができ、この場合、前記プライムエディティングは逆転写酵素によるものであり得る。
【0408】
２－４）Ｃａｓ２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｖａｒｉａｎｔが含むその他付加要素
【0409】
前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１２ｆ１変異体であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質、Ｃａｓ１２ｆ１突然変異またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質に選択的にＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはＮＥＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）がさらに含まれたものであり得る。前記ＮＬＳおよびＮＥＳは細胞内または外でＣａｓ１２ｆ１タンパク質の位置決定のためのシグナルペプチドであって、通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。例えば、前記ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７１）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ－抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７２）を有するヌクレオプラスミンの二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７３）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７４）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７５）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７６）；マイオマ（ｍｙｏｍａ）Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７７）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７８）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７９）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８０）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８１）およびＰＫＱＫＫＲＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８２）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８３）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８４）；ヒトポリ(ADP-リボース)重合酵素の配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８５）；またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８６）から由来したＮＬＳ配列であり得るが、これに制限されない。
【0410】
例えば、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質にＮＬＳが付加されたものであり得る。一具体例において、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３８アミノ酸配列であり得る（ＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＫＮＴＩＴＫＴＬＫＬＲＩＶＲＰＹＮＳＡＥＶＥＫＩＶＡＤＥＫＮＮＲＥＫＩＡＬＥＫＮＫＤＫＶＫＥＡＣＳＫＨＬＫＶＡＡＹＣＴＴＱＶＥＲＮＡＣＬＦＣＫＡＲＫＬＤＤＫＦＹＱＫＬ ＲＧＱＦＰＤＡＶＦＷＱＥＩＳＥＩＦＲＱＬＱＫＱＡＡＥＩＹＮＱＳＬＩＥＬＹＹＥＩＦＩＫＧＫＧＩＡＮＡＳＳＶＥＨＹＬＳＤＶＣＹＴＲＡＡＥＬＦＫＮＡＡＩＡＳＧＬＲＳＫＩＫＳＮＦＲＬＫＥＬＫＮＭＫＳＧＬＰＴＴ ＫＳＤＮＦＰＩＰＬＶＫＱＫＧＧＱＹＴＧＦＥＩＳＮＨＮＳＤＦＩＩＫＩＰＦＧＲＷＱＶＫＫＥＩＤＫＹＲＰＷＥＫＦＤＦＥＱＶＱＫＳＰＫＰＩＳＬＬＬＳＴＱＲＲＫＲＮＫＧＷＳＫＤＥＧＴＥＡＥＩＫＫＶＭＮＧＤＹＱＴ ＳＹＩＥＶＫＲＧＳＫＩＧＥＫＳＡＷＭＬＮＬＳＩＤＶＰＫＩＤＫＧＶＤＰＳＩＩＧＧＩＤＶＧＶＫＳＰＬＶＣＡＩＮＮＡＦＳＲＹＳＩＳＤＮＤＬＦＨＦＮＫＫＭＦＡＲＲＲＩＬＬＫＫＮＲＨＫＲＡＧＨＧＡＫＮＫＬＫＰＩ ＴＩＬＴＥＫＳＥＲＦＲＫＫＬＩＥＲＷＡＣＥＩＡＤＦＦＩＫＮＫＶＧＴＶＱＭＥＮＬＥＳＭＫＲＫＥＤＳＹＦＮＩＲＬＲＧＦＷＰＹＡＥＭＱＮＫＩＥＦＫＬＫＱＹＧＩＥＩＲＫＶＡＰＮＮＴＳＫＴＣＳＫＣＧＨＬＮＮＹＦ ＮＦＥＹＲＫＫＮＫＦＰＨＦＫＣＥＫＣＮＦＫＥＮＡＤＹＮＡＡＬＮＩＳＮＰＫＬＫＳＴＫＥＥＰＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３８））。
【0411】
また、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質、Ｃａｓ１２ｆ１突然変異またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質に選択的にタグがさらに含まれたものであり得る。前記タグはＣａｓ１２ｆ１タンパク質の分離精製および／または追跡のための機能的ドメイン、ペプチドまたはタンパク質で、前記の用語の定義のうち「タグ」セクションに例示されたもののうち一つであり得るが、これに制限されない。
【0412】
２－５）Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｐｒｏｔｅｉｎ
【0413】
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸またはＣａｓ１２ｆ１変異体を暗号化する核酸であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を導入しようとする対象に合わせてコドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたものであり得る。
【0414】
「コドン最適化」は固有配列の少なくとも一つのコドンを対象細胞の遺伝子にさらに頻繁にまたは最も頻繁に使われるコドンに代替しながら、固有アミノ酸配列を維持することによって関心対象細胞での発現の増進のために核酸配列を変形させる過程を意味する。多様な種は特定アミノ酸の特定コドンに対する特定偏向を有し、コドン偏向（有機体間のコドン使用の差）はたびたびｍＲＮＡの翻訳の効率と相互関連され、これは翻訳されるコドンの特性および特定ｔＲＮＡ分子の利用可能性によって左右されるものと思われる。細胞で選択されたｔＲＮＡの優勢は一般的にペプチド合成に最も頻繁に使われるコドンを反映したものである。したがって、遺伝子はコドン最適化に基づいて与えられた有機体で最適な遺伝子発現のためにカスタマイズされ得る。
【0415】
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸はヒトコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸であり得る。例えば、前記ヒトコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８７配列であり得る。
【0416】
【表2】
【0417】
３.Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）ｃｏｍｐｌｅｘ（ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘ）
本明細書によって開示されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘ形態で提供され得る。前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含む。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよび二つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含む（Ｓａｔｏｒｕ Ｎ.Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、８１、１－１３、（２０２１））。前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはエンジニアリングされたガイドＲＮＡとＣａｓ１２ｆ１タンパク質の間の相互作用によって形成されたｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＮＰ）であり得る。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはエンジニアリングされたガイドＲＮＡと一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質の間の相互作用によって形成されたｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＮＰ）またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡと二つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質の間の相互作用によって形成されたＲＮＰであり得る（Ｓａｔｏｒｕ Ｎ.Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、８１、１－１３、（２０２１））。前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは「エンジニアリングされたガイドＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質複合体」、「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」または「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１複合体」と指称され、前記用語は本明細書で混用されて使われる。以下の例示に含まれた構成要素の具体的な説明は前記にて該当構成要素について記載した通りである。以下の例示は単純例示であり、これに制限されない。
本明細書によって開示されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘ形態で提供され得る。前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含む。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよび二つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含む（Ｓａｔｏｒｕ Ｎ.Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、８１、１－１３、（２０２１））。前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはエンジニアリングされたガイドＲＮＡとＣａｓ１２ｆ１タンパク質の間の相互作用によって形成されたｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＮＰ）であり得る。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはエンジニアリングされたガイドＲＮＡと一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質の間の相互作用によって形成されたｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＮＰ）またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡと二つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質の間の相互作用によって形成されたＲＮＰであり得る（Ｓａｔｏｒｕ Ｎ.Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、８１、１－１３、（２０２１））。前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは「エンジニアリングされたガイドＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質複合体」、「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」または「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１複合体」と指称され、前記用語は本明細書で混用されて使われる。以下の例示に含まれた構成要素の具体的な説明は前記にて該当構成要素について記載した通りである。以下の例示は単純例示であり、これに制限されない。
【0418】
一具現例として、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡが結合して形成されたＲＮＰであり得る。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは二つの野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡを含むことができる。この時、前記野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列であり得る。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含み、この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたものまたは連続した５個以上のウリジン配列を含まず、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり得る。または前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まず、かつｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端に位置した１～２４個のヌクレオチド配列および／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置した１～２８個のヌクレオチド配列を含まない配列であり得る。この時、前記ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり得る。
【0419】
一具体例として、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡが結合して形成されたＲＮＰであり得る。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは二つの野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡを含むことができる。この時、前記野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列であり得る。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前記「３－３）エンジニアリングされたガイドＲＮＡの例示」セクションに記載された例示のうち一つであり得る。
【0420】
他の一具現例として、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはＣａｓ１２ｆ１変異体およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡが結合して形成されたＲＮＰであり得る。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは二つのＣａｓ１２ｆ１変異体およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡを含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体はＣａｓ１２ｆ１突然変異またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質であり得る。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含み、この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたものまたは連続した５個以上のウリジン配列を含まず、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり得る。または前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まず、かつｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端に位置した１～２４個のヌクレオチド配列および／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置した１～２８個のヌクレオチド配列を含まない配列であり得る。この時、前記ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり得る。
【0421】
一具体例として、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはＣａｓ１２ｆ１変異体およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡが結合して形成されたＲＮＰであり得る。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは二つのＣａｓ１２ｆ１変異体およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡを含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列のうち少なくとも一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＣａｓ１４ａ１突然変異であり得る。この時、前記二つのＣａｓ１２ｆ１変異体は同一または異なり得る。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前記「３－３）エンジニアリングされたガイドＲＮＡの例示」セクションに記載された例示のうち一つであり得る。
【0422】
他の一具体例として、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘはＣａｓ１２ｆ１変異体およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡが結合して形成されたＲＮＰであり得る。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは二つのＣａｓ１２ｆ１変異体およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡを含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１突然変異に追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質が付加されたＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６６アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６７アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６８アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６９アミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７０アミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。この時、前記二つのＣａｓ１２ｆ１変異体は同一または異なり得る。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前記「３－３）エンジニアリングされたガイドＲＮＡの例示」セクションに記載された例示のうち一つであり得る。
【0423】
さらに他の一具現例として、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質、Ｃａｓ１２ｆ１変異体およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡが結合して形成されたＲＮＰであり得る。この時、前記野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列であり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体はＣａｓ１２ｆ１突然変異またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質であり得る。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含み、この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形されたものまたは連続した５個以上のウリジン配列を含まず、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡより長さが短いように変形されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列であり得る。または前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡは連続した５個以上のウリジン配列を含まず、かつｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端に位置した１～２４個のヌクレオチド配列および／またはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端に位置した１～２８個のヌクレオチド配列を含まない配列であり得る。この時、前記ｃｒＲＮＡはｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡであり得る。
【0424】
一具体例として、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質、Ｃａｓ１２ｆ１変異体およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡが結合して形成されたＲＮＰであり得る。この時、前記野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列であり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列のうち少なくとも一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＣａｓ１２ｆ１突然変異であり得る。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前記「３－３）エンジニアリングされたガイドＲＮＡの例示」セクションに記載された例示のうち一つであり得る。
【0425】
他の一具体例として、前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｏｍｐｌｅｘは野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質、Ｃａｓ１２ｆ１変異体およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡが結合して形成されたＲＮＰであり得る。この時、前記野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６５アミノ酸配列であり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１変異体は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１突然変異に追加的な機能を有するドメイン、ペプチドまたはタンパク質が付加されたＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６６アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６７アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６８アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６９アミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７０アミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前記「３－３）エンジニアリングされたガイドＲＮＡの例示」セクションに記載された例示のうち一つであり得る。
【0426】
４.エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムの用途
前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形のための用途で使うことができ、これをさらに効果的に遂行されるようにすることができる。
前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形のための用途で使うことができ、これをさらに効果的に遂行されるようにすることができる。
【0427】
一具現例として、前記用途はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１複合体が対象細胞内で標的核酸または標的遺伝子と接触することを含むことができる。
【0428】
他の一具現例として、前記用途はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１複合体が対象細胞内で標的核酸または標的遺伝子と接触するように誘導することを含むことができる。この時、前記誘導は前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１複合体が細胞内で標的核酸と接触するようにする方法であれば特に制限されない。例えば、前記誘導はエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１４ａ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達するものであり得る。
【0429】
＜Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｓｙｓｔｅｍ＞
本明細書によって開示されるさらに他の一態様はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した標的の変形に関する。より具体的には、前記態様はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物およびこれを利用した方法によって標的核酸または標的遺伝子を変形させることに関する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物およびこれを利用した方法は標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形をさらに効果的に遂行されるようにする。特に、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物の利用は次のような効果を伴うことができる：
ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘのｓｔａｂｉｌｉｔｙ増加；
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の切断効率増加；および
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の編集または変形効率増加.
本明細書によって開示されるさらに他の一態様はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した標的の変形に関する。より具体的には、前記態様はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物およびこれを利用した方法によって標的核酸または標的遺伝子を変形させることに関する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物およびこれを利用した方法は標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形をさらに効果的に遂行されるようにする。特に、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物の利用は次のような効果を伴うことができる：
ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘのｓｔａｂｉｌｉｔｙ増加；
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の切断効率増加；および
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的核酸の編集または変形効率増加.
【0430】
以下で、組成物およびこれを利用した方法について詳しく説明する。
【0431】
１．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
本明細書で開示する組成物はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含むことができる。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは前述した「＜エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
本明細書で開示する組成物はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含むことができる。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは前述した「＜エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0432】
より具体的には、前記組成物は
【0433】
エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；および
【0434】
Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質またはこれを暗号化する核酸
【0435】
を含むことができる。
【0436】
この時、前記組成物は選択的に一つ以上のエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸をさらに含むことができる。この場合、前記組成物は多数のエンジニアリングされたガイドＲＮＡを含むことができ、多数のエンジニアリングされたガイドＲＮＡはそれぞれ互いに異なる標的配列を認識することができる。
【0437】
この時、前記組成物は選択的に一つ以上のＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質またはこれを暗号化する核酸をさらに含むことができる。この場合、前記組成物は互いに異なるアミノ酸配列を有する二以上のＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質を含むことができる。この時、前記互いに異なるアミノ酸配列を有する二以上のＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質およびＣａｓ１４ａ１変異体であり得る。
【0438】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前述した「＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。また、前記Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質は前述した「２.Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｐｒｏｔｅｉｎ」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0439】
前記組成物は核酸形態であり得る。または前記組成物は核酸およびタンパク質が混合された形態であり得る。以下で組成物の形態について詳しく説明する。
【0440】
１－１）核酸形態
前記組成物は核酸形態であり得る。前記核酸形態はＤＮＡ、ＲＮＡまたはこの混合形態であり得る。前記核酸形態はベクター形態であり得る。この時、前記ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。
前記組成物は核酸形態であり得る。前記核酸形態はＤＮＡ、ＲＮＡまたはこの混合形態であり得る。前記核酸形態はベクター形態であり得る。この時、前記ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。
【0441】
また、前記核酸の形態は円形または線形であり得る。
【0442】
また、前記核酸の形態は二本鎖または一本鎖であり得る。
【0443】
ａ）Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ
前記組成物はウイルスベクター形態であり得る。例えば、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、レンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）、アデノ－関連ウイルスベクター（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ；ＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒ）、ワクシニアウイルスベクター（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、ポックスウイルスベクター（ｐｏｘｖｉｒａｌ（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）および単純ヘルペスウイルスベクター（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒａｌ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）で構成された群から選択される一つ以上のウイルスベクターであり得る。
前記組成物はウイルスベクター形態であり得る。例えば、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、レンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）、アデノ－関連ウイルスベクター（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ；ＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒ）、ワクシニアウイルスベクター（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）、ポックスウイルスベクター（ｐｏｘｖｉｒａｌ（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）および単純ヘルペスウイルスベクター（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒａｌ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）ｖｅｃｔｏｒ）で構成された群から選択される一つ以上のウイルスベクターであり得る。
【0444】
一具現例として、前記組成物はウイルスベクター形態であり得る。すなわち、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）タンパク質を暗号化する核酸をウイルスベクター形態で含むことができる。この時、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含む第１ウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む第２ウイルスベクターを含むことができる。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含むウイルスベクターを含むことができる。一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含むアデノ－関連ウイルスベクターを含むことができる。
【0445】
他の具現例として、前記組成物が多数個のエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む場合、前記組成物は多数個のエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸をすべて含む第１ウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む第２ウイルスベクターを含むことができる。または前記組成物は多数個のエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含む一つのウイルスベクター形態であり得る。または前記組成物は一つのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むウイルスベクターが多数個（エンジニアリングされたガイドＲＮＡの数だけ）で含まれ得る。
【0446】
さらに他の具現例として、前記組成物がエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および二以上のＣａｓ１２ｆ１タンパク質（例えば、第１ Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および第２ Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質）を暗号化する核酸を含む場合、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含む第１ウイルスベクター、第１ Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む第２ウイルスベクターおよび第２ Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む第３ウイルスベクターを含むことができる。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および二以上のＣａｓ１２ｆ１タンパク質（例えば、第１ Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および第２ Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質）を暗号化する核酸をすべて含む一つのウイルスベクター形態であり得る。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および第１ Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む第１ウイルスベクターおよび第２ Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む第２ウイルスベクターを含むことができる。
【0447】
ｂ）Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ
前記組成物は非ウイルスベクター形態であり得る。この場合、前記組成物のエンジニアリングされたガイドＲＮＡはＲＮＡ形態またはこれを暗号化する核酸形態であり得る。
前記組成物は非ウイルスベクター形態であり得る。この場合、前記組成物のエンジニアリングされたガイドＲＮＡはＲＮＡ形態またはこれを暗号化する核酸形態であり得る。
【0448】
前記非ウイルスベクターはプラスミド、ファージ、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡ（転写物）またはＰＣＲアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）であり得るが、これに制限されるものではない。例えば、前記プラスミドはｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、およびｐＵＣ１９からなる群から選択されたものであり得る。例えば、前記ファージはλｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、およびＭ１３からなる群から選択されたものであり得る。
【0449】
一具現例として、前記組成物は非ウイルスベクター形態であり得る。すなわち、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を非ウイルスベクター形態で含むことができる。この時、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含む第１非ウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む第２非ウイルスベクターを含むことができる。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含む非ウイルスベクターを含むことができる。一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含むプラスミドを含むことができる。他の一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するｍＲＮＡを含むことができる。さらに他の具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むネイキッドＤＮＡを含むことができる。
【0450】
他の具現例として、前記組成物は非ウイルスベクター形態であり得る。すなわち、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を非ウイルスベクター形態で含むことができる。一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するｍＲＮＡを含むことができる。他の一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むプラスミドを含むことができる。
【0451】
ｃ）ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター混合
前記組成物はウイルスベクターおよび非ウイルスベクター混合形態であり得る。前記ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターに関する説明は前記の通りである。この場合、前記組成物のエンジニアリングされたガイドＲＮＡはＲＮＡ形態またはこれを暗号化する核酸形態であり得る。
前記組成物はウイルスベクターおよび非ウイルスベクター混合形態であり得る。前記ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターに関する説明は前記の通りである。この場合、前記組成物のエンジニアリングされたガイドＲＮＡはＲＮＡ形態またはこれを暗号化する核酸形態であり得る。
【0452】
一具現例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む非ウイルスベクターを含むことができる。一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むアデノ－関連ウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するｍＲＮＡを含むことができる。他の一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むレンチウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むプラスミドを含むことができる。
【0453】
他の一具現例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含む非ウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むウイルスベクターを含むことができる。一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むアデノ－関連ウイルスベクターを含むことができる。他の一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むプラスミドおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むレンチウイルスベクターを含むことができる。
【0454】
さらに他の一具現例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むウイルスベクターを含むことができる。一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むアデノ－関連ウイルスベクターを含むことができる。
【0455】
他の一具現例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む非ウイルスベクターを含むことができる。一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するｍＲＮＡを含むことができる。他の具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むプラスミドを含むことができる。
【0456】
ｄ）その他－ベクターの追加構成
前述したベクターは選択的に調節／制御構成要素、プロモーターおよび／または付加発現要素をさらに含むことができる。
前述したベクターは選択的に調節／制御構成要素、プロモーターおよび／または付加発現要素をさらに含むことができる。
【0457】
＜調節／制御構成要素＞
前記ベクターは選択的に調節／制御構成要素を含むことができる。この時、前記調節／制御構成要素はベクターに含まれた各構成要素を暗号化する配列（すなわち、エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および／またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸）に作動可能に連結され得る。前記調節／制御構成要素はエンハンサー、イントロン、終結信号、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、内部リボソーム流入部位（ＩＲＥＳ、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）、スプライスアクセプター、２Ａ配列および／または複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）であり得るが、これに制限されるものではない。この時、前記複製起点はｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、および／またはＢＢＶ複製起点であり得るが、これに制限されるものではない。
前記ベクターは選択的に調節／制御構成要素を含むことができる。この時、前記調節／制御構成要素はベクターに含まれた各構成要素を暗号化する配列（すなわち、エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および／またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸）に作動可能に連結され得る。前記調節／制御構成要素はエンハンサー、イントロン、終結信号、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、内部リボソーム流入部位（ＩＲＥＳ、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）、スプライスアクセプター、２Ａ配列および／または複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）であり得るが、これに制限されるものではない。この時、前記複製起点はｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、および／またはＢＢＶ複製起点であり得るが、これに制限されるものではない。
【0458】
＜プロモーター＞
前記ベクターは選択的にプロモーターを含むことができる。この時、前記プロモーターはベクターに含まれた各構成要素を暗号化する配列（すなわち、エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および／またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸）に作動可能に連結され得る。前記プロモーターはベクターに含まれた各構成要素を暗号化する配列（すなわち、エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および／またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸）を適切に発現させ得るものであれば制限されない。一具現例として、前記プロモーター配列はＲＮＡ重合酵素（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、またはｐｏｌ ＩＩＩ）の転写を促進させるプロモーターであり得る。例えば、前記プロモーターはＳＶ４０初期プロモーター、ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）プロモーター、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅプロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＭＶＩＥ）のようなｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーター、ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ＣＢＡプロモーター、ｈｕｍａｎ Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒプロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０、４９７－５００（２００２））、ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｕ６プロモーター（ｅ.ｇ.，Ｘｉａ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、７ＳＫプロモーターおよびｈｕｍａｎ Ｈ１プロモーター（Ｈ１）のうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。
前記ベクターは選択的にプロモーターを含むことができる。この時、前記プロモーターはベクターに含まれた各構成要素を暗号化する配列（すなわち、エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および／またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸）に作動可能に連結され得る。前記プロモーターはベクターに含まれた各構成要素を暗号化する配列（すなわち、エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および／またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸）を適切に発現させ得るものであれば制限されない。一具現例として、前記プロモーター配列はＲＮＡ重合酵素（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、またはｐｏｌ ＩＩＩ）の転写を促進させるプロモーターであり得る。例えば、前記プロモーターはＳＶ４０初期プロモーター、ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）プロモーター、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅプロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＭＶＩＥ）のようなｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーター、ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ＣＢＡプロモーター、ｈｕｍａｎ Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒプロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０、４９７－５００（２００２））、ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｕ６プロモーター（ｅ.ｇ.，Ｘｉａ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、７ＳＫプロモーターおよびｈｕｍａｎ Ｈ１プロモーター（Ｈ１）のうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。
【0459】
＜付加発現要素＞
前記ベクターは選択的に付加発現要素を含むことができる。前記ベクターはエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および／またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸の他に通常の技術者が必要によって発現させようとする付加発現要素を暗号化する核酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記付加発現要素は、前記の用語の定義のうち「タグ」セクションで説明されたタグのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。例えば、前記付加発現要素は、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ）またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子；またはアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）またはクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
前記ベクターは選択的に付加発現要素を含むことができる。前記ベクターはエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸および／またはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸の他に通常の技術者が必要によって発現させようとする付加発現要素を暗号化する核酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記付加発現要素は、前記の用語の定義のうち「タグ」セクションで説明されたタグのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。例えば、前記付加発現要素は、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ）またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子；またはアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）またはクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0460】
１－２）核酸およびタンパク質の混合形態
前記組成物は核酸およびタンパク質の混合形態であり得る。この時、前記核酸は前記「１－１）核酸形態」に記載した通りである。この場合、前記組成物はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含む。この時、前記組成物は二つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができ、前記二つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質は同一のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ｆ１タンパク質または互いに異なるアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。
前記組成物は核酸およびタンパク質の混合形態であり得る。この時、前記核酸は前記「１－１）核酸形態」に記載した通りである。この場合、前記組成物はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含む。この時、前記組成物は二つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができ、前記二つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質は同一のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ｆ１タンパク質または互いに異なるアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。
【0461】
一具現例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むアデノ－関連ウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。
【0462】
他の一具現例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含む非ウイルスベクターおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むプラスミドおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。他の一具体例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。
【0463】
さらに他の一具現例として、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。この場合、前記組成物はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の形態であるＲＮＰ形態であり得る。もし多数のエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含む組成物の場合、前記組成物は多数個のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を含むことができ、多数個のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はそれぞれ互いに異なる標的配列を認知することができる。
【0464】
１－３）Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎの用途
前記組成物はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形のための用途で使うことができ、これをさらに効果的に遂行されるようにすることができる。
前記組成物はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した標的核酸または標的遺伝子の切断、編集または変形のための用途で使うことができ、これをさらに効果的に遂行されるようにすることができる。
【0465】
２.Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａ ｔａｒｇｅｔ ｕｓｉｎｇエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム
本明細書で開示する方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した方法に関する。より具体的には、前記方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物を対象体および／または対象細胞に導入（または送達）して対象体および／または対象細胞内に存在する標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法に関する。または前記方法はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを対象体および／または対象細胞に導入（または送達）して対象体および／または対象細胞内に存在する標的核酸または標的遺伝子を標的する方法に関する。この時、対象体は植物、動物またはこれの一部組織であり、前記動物はヒトまたは非ヒト動物であり得る。この時、対象細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。この時、前記真核細胞は酵母（ｙｅａｓｔ）、植物細胞、動物細胞、および／またはヒト細胞であり得るが、これに制限されない。前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたは生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で遂行され得る。この時、前記生体内はヒト生体内または非ヒト動物生体内であり得る。
本明細書で開示する方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを利用した方法に関する。より具体的には、前記方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを含む組成物を対象体および／または対象細胞に導入（または送達）して対象体および／または対象細胞内に存在する標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法に関する。または前記方法はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを対象体および／または対象細胞に導入（または送達）して対象体および／または対象細胞内に存在する標的核酸または標的遺伝子を標的する方法に関する。この時、対象体は植物、動物またはこれの一部組織であり、前記動物はヒトまたは非ヒト動物であり得る。この時、対象細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。この時、前記真核細胞は酵母（ｙｅａｓｔ）、植物細胞、動物細胞、および／またはヒト細胞であり得るが、これに制限されない。前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたは生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で遂行され得る。この時、前記生体内はヒト生体内または非ヒト動物生体内であり得る。
【0466】
前記方法はエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを対象体および／または対象細胞に導入（または送達、処理）することを含む方法であり得る。前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前述した「＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。また、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは前述した「＜エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0467】
以下で、前記方法の具現例を利用して詳しく説明する。
【0468】
２－１）Ｍｅｔｈｏｄ例示（１）
一具現例として、前記方法は真核細胞に組成物を処理することを含む標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法であり得る。
一具現例として、前記方法は真核細胞に組成物を処理することを含む標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法であり得る。
【0469】
この時、前記組成物は
エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；および
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸
を含むことができる。
エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；および
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸
を含むことができる。
【0470】
前記組成物は前述した「１.Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。また、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前述した「＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。また、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は前述した＜エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム＞中の「２.Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｐｒｏｔｅｉｎ」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0471】
前記組成物はウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはこの混合形態であり得る。または前記組成物は核酸およびタンパク質の混合形態であり得る。前記ウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはこの混合形態は前述した「１－１）核酸形態」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。また、前記核酸およびタンパク質の混合形態は前述した「１－２）核酸およびタンパク質の混合形態」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0472】
一具体例において、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むウイルスベクター形態であり得る。この時、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ－関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターで構成された群から選択される一つ以上であり得る。この時、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含む一つのウイルスベクターを含むことができる。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をそれぞれ含む二つのウイルスベクターを含むことができる。
【0473】
他の一具体例において、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む非ウイルスベクター形態であり得る。この時、前記非ウイルスベクターはプラスミドであり得る。この時、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含む一つのプラスミドを含むことができる。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をそれぞれ含む二つのプラスミドを含むことができる。
【0474】
さらに他の一具体例において、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するｍＲＮＡを含むことができる。
【0475】
さらに他の一具体例において、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）複合体を含むことができる。
【0476】
前記真核細胞は標的核酸または標的遺伝子を含むことができる。前記真核細胞は酵母（ｙｅａｓｔ）、植物細胞、動物細胞、および／またはヒト細胞であり得るが、これに制限されない。
【0477】
前記真核細胞に組成物を処理することは真核細胞でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムが導入されるためのものであり得る。または前記真核細胞に組成物を処理することは真核細胞に存在する標的核酸または標的遺伝子にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを接触させるためのものであり得る。
【0478】
前記真核細胞に組成物を処理することは電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、磁気注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ナノパーティクル方法および／または一時的な細胞圧縮またはスクイージング方法を利用したものであり得る。または前記真核細胞に組成物を処理することは陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ、脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、燐酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染、ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染、および／またはナノパーティクル－媒介核酸送達（Ｐａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ.，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ.２０１２ Ｓｅｐ １３.ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９.ｄｏｉ：１０.１０１６／ｊ.ａｄｄｒ.２０１２.０９.０２３参照）を利用したものであり得るが、これに制限されるものではない。
【0479】
前記方法は選択的に真核細胞を培養することをさらに含むことができる。この場合、前記培養は組成物を処理した後に真核細胞を培養するものであり得る。
【0480】
２－２.Ｍｅｔｈｏｄ例示（２）
他の一具現例として、前記方法は真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを処理することを含む標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法であり得る。
他の一具現例として、前記方法は真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを処理することを含む標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法であり得る。
【0481】
この時、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは
エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；および
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸
を含むことができる。
エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；および
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸
を含むことができる。
【0482】
前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは前述した「＜エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システム＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0483】
前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはこの混合形態であり得る。または前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムは核酸およびタンパク質の混合形態であり得る。前記ウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはこの混合形態は前述した「１－１）核酸形態」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。また、前記核酸およびタンパク質の混合形態は前述した「１－２）核酸およびタンパク質の混合形態」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0484】
一具体例において、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するｍＲＮＡを含むことができる。
【0485】
他の一具体例において、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。
【0486】
さらに他の一具体例において、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムはエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）複合体を含むことができる。
【0487】
前記真核細胞は標的核酸または標的遺伝子を含むことができる。前記真核細胞は酵母（ｙｅａｓｔ）、植物細胞、動物細胞、および／またはヒト細胞であり得るが、これに制限されない。
【0488】
前記真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを処理することは真核細胞でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）複合体を形成するためのものであり得る。または前記真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを処理することは真核細胞に存在する標的核酸または標的遺伝子にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）複合体を接触させるためのものであり得る。
【0489】
前記真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを処理することは電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、磁気注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ナノパーティクル方法および／または一時的な細胞圧縮またはスクイージング方法を利用したものであり得る。または前記真核細胞に組成物を処理することは陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ、脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、燐酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染、ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染、および／またはナノパーティクル－媒介核酸送達（Ｐａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ.，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ.２０１２ Ｓｅｐ １３.ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９.ｄｏｉ：１０.１０１６／ｊ.ａｄｄｒ.２０１２.０９.０２３参照）を利用したものであり得るが、これに制限されるものではない。
【0490】
前記真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを処理することはエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を同時に処理するものであり得る。または前記真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを処理することはエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を順次処理するものであり得る。
【0491】
前記方法は選択的に真核細胞を培養することをさらに含むことができる。この場合、前記培養は組成物を処理した後に真核細胞を培養するものであり得る。
【0492】
２－３.Ｍｅｔｈｏｄ例示（３）
さらに他の一具現例として、前記方法は真核細胞にエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を処理することを含む標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法であり得る。
さらに他の一具現例として、前記方法は真核細胞にエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を処理することを含む標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法であり得る。
【0493】
この時、前記真核細胞はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を含む細胞であり得る。また、前記真核細胞は標的核酸または標的遺伝子を含むことができる。前記真核細胞は酵母（ｙｅａｓｔ）、植物細胞、動物細胞、および／またはヒト細胞であり得るが、これに制限されない。
【0494】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前述した「＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0495】
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸はウイルスベクターまたは非ウイルスベクター形態であり得る。前記ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター形態は前述した「１－１）核酸形態」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0496】
一具体例において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコン形態であり得る。
【0497】
他の一具体例において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むアデノ関連ウイルスベクター形態であり得る。
【0498】
前記真核細胞にエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を処理することは真核細胞でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を形成するためのものであり得る。または前記真核細胞にエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を処理することは真核細胞に存在する標的核酸または標的遺伝子にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を接触させるためのものであり得る。
【0499】
前記真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを処理することは電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、磁気注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ナノパーティクル方法および／または一時的な細胞圧縮またはスクイージング方法を利用したものであり得る。または前記真核細胞にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを処理することは陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ、脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、燐酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染、ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染、および／またはナノパーティクル－媒介核酸送達（Ｐａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ.，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ.２０１２ Ｓｅｐ １３.ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９.ｄｏｉ：１０.１０１６／ｊ.ａｄｄｒ.２０１２.０９.０２３参照）を利用したものであり得るが、これに制限されるものではない。
【0500】
前記方法は選択的に真核細胞を培養することをさらに含むことができる。この場合、前記培養は組成物を処理した後に真核細胞を培養するものであり得る。
【0501】
２－４.Ｍｅｔｈｏｄ例示（４）
一具現例として、前記方法は対象体に組成物を導入（注入）することを含む標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法であり得る。
一具現例として、前記方法は対象体に組成物を導入（注入）することを含む標的核酸または標的遺伝子を変形させる方法であり得る。
【0502】
この時、前記組成物は
エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；および
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸
を含むことができる。
エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸；および
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸
を含むことができる。
【0503】
前記組成物は前述した「１.Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。また、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは前述した「＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ＞」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。また、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は前述した＜エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム＞中の「２.Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）ｐｒｏｔｅｉｎ」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0504】
前記組成物はウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはこの混合形態であり得る。または前記組成物は核酸およびタンパク質の混合形態であり得る。前記ウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはこの混合形態は前述した「１－１）核酸形態」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。また、前記核酸およびタンパク質の混合形態は前述した「１－２）核酸およびタンパク質の混合形態」セクションに記載した通りであり、前記セクションに説明された各構成と同一の特徴および構造を有する。
【0505】
一具体例において、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含むウイルスベクター形態であり得る。この時、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ－関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターで構成された群から選択される一つ以上であり得る。この時、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含む一つのウイルスベクターを含むことができる。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をそれぞれ含む二つのウイルスベクターを含むことができる。
【0506】
他の一具体例において、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を含む非ウイルスベクター形態であり得る。この時、前記非ウイルスベクターはプラスミドであり得る。この時、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をすべて含む一つのプラスミドを含むことができる。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸をそれぞれ含む二つのプラスミドを含むことができる。
【0507】
さらに他の一具体例において、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するｍＲＮＡを含むことができる。
【0508】
さらに他の一具体例において、前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＰＣＲアンプリコンおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。または前記組成物はエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）複合体を含むことができる。
【0509】
前記対象体は標的核酸または標的遺伝子を含んだゲノムを有することができる。前記対象体は植物、非ヒト動物、ヒトまたはこれの一部組織であり得るが、これに制限されない。
【0510】
前記対象体に組成物を導入（注入）することは対象体に存在する標的核酸または標的遺伝子にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを接触させるためのものであり得る。
【0511】
前記対象体に組成物を導入（注入）することは微細注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、磁気注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ナノパーティクル方法および／または一時的な細胞圧縮またはスクイージング方法を利用したものであり得る。または前記対象体に組成物を導入（注入）することは陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ、脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、燐酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染、ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染、および／またはナノパーティクル－媒介核酸送達（Ｐａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ.，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ.２０１２ Ｓｅｐ １３.ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９.ｄｏｉ：１０.１０１６／ｊ.ａｄｄｒ.２０１２.０９.０２３参照）を利用したものであり得るが、これに制限されるものではない。
【0512】
３.Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ
本明細書で開示する組成物および方法を通じて標的遺伝子または標的核酸を変形させることができる。より具体的には、標的遺伝子または標的核酸はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａｉ）システムによって変形され得る。この時、前記変形はｉ）エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的遺伝子または標的核酸の切断または損傷およびｉｉ）切断された（または損傷した）標的遺伝子または標的核酸の修繕または修復をすべて含むことができる。この時、前記変形は標的遺伝子または標的核酸配列の除去または置換であり得る。または前記変形は標的遺伝子または標的核酸に追加的な核酸配列の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）であり得る。または前記変形は、標的遺伝子または標的核酸の一部が配列除去されて追加配列挿入されるインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ；ｉｎｄｅｌ）であり得る。以下で前記変形について詳しく説明する。
本明細書で開示する組成物および方法を通じて標的遺伝子または標的核酸を変形させることができる。より具体的には、標的遺伝子または標的核酸はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａｉ）システムによって変形され得る。この時、前記変形はｉ）エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムによる標的遺伝子または標的核酸の切断または損傷およびｉｉ）切断された（または損傷した）標的遺伝子または標的核酸の修繕または修復をすべて含むことができる。この時、前記変形は標的遺伝子または標的核酸配列の除去または置換であり得る。または前記変形は標的遺伝子または標的核酸に追加的な核酸配列の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）であり得る。または前記変形は、標的遺伝子または標的核酸の一部が配列除去されて追加配列挿入されるインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ；ｉｎｄｅｌ）であり得る。以下で前記変形について詳しく説明する。
【0513】
３－１）削除（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ）
本明細書で提供する方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸配列の全部または一部が除去され得る。前記除去は前記標的遺伝子または前記標的核酸内の一部の塩基配列を除去することを意味する。一具現例として、前記方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および第２エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を標的遺伝子または標的核酸を含む細胞内に導入することを含む。これによって、前記標的遺伝子または標的核酸内に特定配列部分の除去が起きる。
本明細書で提供する方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸配列の全部または一部が除去され得る。前記除去は前記標的遺伝子または前記標的核酸内の一部の塩基配列を除去することを意味する。一具現例として、前記方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および第２エンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を標的遺伝子または標的核酸を含む細胞内に導入することを含む。これによって、前記標的遺伝子または標的核酸内に特定配列部分の除去が起きる。
【0514】
３－２）挿入（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）
本明細書で提供する方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ノックイン（ｋｎｏｃｋｉｎ）が発生し得る。前記ノックインは標的遺伝子または標的核酸配列内に追加的な核酸配列を挿入することを意味する。前記ノックインが起きるためには、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムの他に前記追加的な核酸配列を含むドナーがさらに必要である。細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムが標的遺伝子または標的核酸を切断する場合、前記切断された標的遺伝子または標的核酸の修復が起きることになる。この場合、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒｉｎｇ、ＨＤＲ）を利用して修復することができ、この時、前記ドナーが前記修復過程に関与して前記追加的な核酸配列を標的遺伝子または標的核酸内に挿入する。一具現例として、前記方法は対象細胞内にドナーを送達することを追加的に含むことができる。この時、前記ドナーは追加対象核酸を含み、前記ドナーによって前記標的遺伝子または前記標的核酸内前記追加対象核酸の挿入が誘導される。この時、前記ドナーを対象細胞内に送達する時、前述したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを処理する方法のうち一つの方法が使われ得る。
本明細書で提供する方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ノックイン（ｋｎｏｃｋｉｎ）が発生し得る。前記ノックインは標的遺伝子または標的核酸配列内に追加的な核酸配列を挿入することを意味する。前記ノックインが起きるためには、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムの他に前記追加的な核酸配列を含むドナーがさらに必要である。細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムが標的遺伝子または標的核酸を切断する場合、前記切断された標的遺伝子または標的核酸の修復が起きることになる。この場合、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒｉｎｇ、ＨＤＲ）を利用して修復することができ、この時、前記ドナーが前記修復過程に関与して前記追加的な核酸配列を標的遺伝子または標的核酸内に挿入する。一具現例として、前記方法は対象細胞内にドナーを送達することを追加的に含むことができる。この時、前記ドナーは追加対象核酸を含み、前記ドナーによって前記標的遺伝子または前記標的核酸内前記追加対象核酸の挿入が誘導される。この時、前記ドナーを対象細胞内に送達する時、前述したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）システムを処理する方法のうち一つの方法が使われ得る。
【0515】
３－３）挿入および削除（またはインデル、Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ（Ｉｎｄｅｌ））
本明細書で提供する方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内インデル（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ；ｉｎｄｅｌ）が発生し得る。前記インデルは非－相同性末端－結合（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）により発生し得る。一般的に、ＮＨＥＪは二本鎖の破損（例えば、切断）により形成された２個の適合性末端が頻繁な接触を繰り返してＤＮＡ内二本鎖破損を修復または修繕する方法である。ＮＨＥＪを利用した損傷した遺伝子または核酸の修復はＮＨＥＪ修繕部位に核酸配列の一部挿入および／または欠失（挿入欠失）を招く。このような挿入および／または欠失はリーディングフレームを変更させ、フレームシフトされた転写体ｍＲＮＡを作り出し、結果的にナンセンス－媒介崩壊（ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ）を起こすか正常なタンパク質を合成するのに失敗することによって本来の機能を喪失することになる。したがって、標的遺伝子または標的核酸配列内インデルが起きれば、該当遺伝子または核酸が不活性化され得る。一具現例として、前記方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上の塩基が欠失および／または追加され得る。
本明細書で提供する方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内インデル（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ；ｉｎｄｅｌ）が発生し得る。前記インデルは非－相同性末端－結合（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）により発生し得る。一般的に、ＮＨＥＪは二本鎖の破損（例えば、切断）により形成された２個の適合性末端が頻繁な接触を繰り返してＤＮＡ内二本鎖破損を修復または修繕する方法である。ＮＨＥＪを利用した損傷した遺伝子または核酸の修復はＮＨＥＪ修繕部位に核酸配列の一部挿入および／または欠失（挿入欠失）を招く。このような挿入および／または欠失はリーディングフレームを変更させ、フレームシフトされた転写体ｍＲＮＡを作り出し、結果的にナンセンス－媒介崩壊（ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ）を起こすか正常なタンパク質を合成するのに失敗することによって本来の機能を喪失することになる。したがって、標的遺伝子または標的核酸配列内インデルが起きれば、該当遺伝子または核酸が不活性化され得る。一具現例として、前記方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上の塩基が欠失および／または追加され得る。
【0516】
３－４）置換（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または塩基編集（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）
本明細書で提供する方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ベースエディティングが起き得る。これは標的遺伝子または標的核酸内任意のヌクレオチドが欠失および／または挿入されるインデルとは異なり、核酸内一つ以上の特定塩基を意図通りに変更することを意味する。換言すると、標的遺伝子または標的核酸内の特定位置で、予め意図した点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こすことである。一具現例として、前記方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上の塩基が他の塩基で置換され得る。
本明細書で提供する方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ベースエディティングが起き得る。これは標的遺伝子または標的核酸内任意のヌクレオチドが欠失および／または挿入されるインデルとは異なり、核酸内一つ以上の特定塩基を意図通りに変更することを意味する。換言すると、標的遺伝子または標的核酸内の特定位置で、予め意図した点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こすことである。一具現例として、前記方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上の塩基が他の塩基で置換され得る。
【0517】
３－５）標的変形による表現型（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ）
標的核酸または標的遺伝子の変形はノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）、ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）、ノックイン（ｋｎｏｃｋｉｎ）の効果を招くことができる。「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」は標的遺伝子または標的核酸を不活性化させることを意味し、「標的遺伝子または標的核酸の不活性化」は標的遺伝子または標的核酸の転写および／または翻訳できない状態を意味する。ノックアウトを通じて疾病を誘発する遺伝子または非正常的機能を有する遺伝子の転写および翻訳を抑制してタンパク質の発現を防ぐことができる。「ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）」は標的遺伝子または標的核酸の転写および／または翻訳を減少させたり標的タンパク質の発現が減少したりすることを意味する。ノックダウンを通じて過発現される遺伝子またはタンパク質の発現を調節して疾病の発生を防いだり疾病を治療したりすることができる。「ノックイン（ｋｎｏｃｋｉｎ）」は標的遺伝子または標的核酸に特定核酸または遺伝子を挿入することを意味し、この時、「特定核酸または遺伝子」は挿入しようとするまたは発現させることを所望する遺伝子または核酸を意味する。ノックインを通じて疾病を誘発する突然変異遺伝子を正しく校正したり、正常遺伝子を挿入して正常遺伝子の発現を誘導したりして疾病治療に利用することができる。
標的核酸または標的遺伝子の変形はノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）、ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）、ノックイン（ｋｎｏｃｋｉｎ）の効果を招くことができる。「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」は標的遺伝子または標的核酸を不活性化させることを意味し、「標的遺伝子または標的核酸の不活性化」は標的遺伝子または標的核酸の転写および／または翻訳できない状態を意味する。ノックアウトを通じて疾病を誘発する遺伝子または非正常的機能を有する遺伝子の転写および翻訳を抑制してタンパク質の発現を防ぐことができる。「ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）」は標的遺伝子または標的核酸の転写および／または翻訳を減少させたり標的タンパク質の発現が減少したりすることを意味する。ノックダウンを通じて過発現される遺伝子またはタンパク質の発現を調節して疾病の発生を防いだり疾病を治療したりすることができる。「ノックイン（ｋｎｏｃｋｉｎ）」は標的遺伝子または標的核酸に特定核酸または遺伝子を挿入することを意味し、この時、「特定核酸または遺伝子」は挿入しようとするまたは発現させることを所望する遺伝子または核酸を意味する。ノックインを通じて疾病を誘発する突然変異遺伝子を正しく校正したり、正常遺伝子を挿入して正常遺伝子の発現を誘導したりして疾病治療に利用することができる。
【0518】
以下、実施例を通じて本発明を詳細に説明しようとする。
【0519】
これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは本発明が属した技術分野で通常の知識を有する者において自明であろう。
【実施例】
【0520】
［実験方法］
１．Ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）のヒトコドン最適化配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８７）を適用してｃｈｉｃｋｅｎ ｂ－ａｃｔｉｎプロモーター、５'末端および３'末端の両側にｎｕｃｌｅａｒ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ配列およびＴ２Ａ－ｌｉｎｋｅｄ ｅＧＦＰを含むオリゴヌクレオチド（Ｂｉｏｎｉｃｓ）を合成した。ガイドＲＮＡのためのテンプレートＤＮＡを合成してｐＴｗｉｓｔ Ａｍｐプラスミドベクター（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に複製した。必要な場合、複製されたベクターはＵ６－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを使ってｇＲＮＡ－ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃｏｎのためのテンプレートとして使われた。ｄｕａｌガイドＲＮＡの構成のために、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを暗号化するオリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使ってｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２.０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングされた。エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａｓ１システム＿３.０（ｇｅＣａｓ１４ａ＿３.０）ベクターはＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）のヒトコドン最適化オリゴヌクレオチドおよびＣａｓ１４ａ１のためのエンジニアリングされたｇＲＮＡ配列で構成される。ＳｐＣａｓ９の場合、ＳｐＣａｓ９のヒトコドン最適化オリゴヌクレオチドおよびＳｐＣａｓ９のためのｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）はｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＥＧＦＰ（ＰＸ４５８）Ｖ２.０（Ａｄｄｇｅｎｅ）をバックボーンプラスミドとして使ってＧｉｂｓｏｎアセンブリした。
１．Ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
Ｃａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）のヒトコドン最適化配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８７）を適用してｃｈｉｃｋｅｎ ｂ－ａｃｔｉｎプロモーター、５'末端および３'末端の両側にｎｕｃｌｅａｒ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ配列およびＴ２Ａ－ｌｉｎｋｅｄ ｅＧＦＰを含むオリゴヌクレオチド（Ｂｉｏｎｉｃｓ）を合成した。ガイドＲＮＡのためのテンプレートＤＮＡを合成してｐＴｗｉｓｔ Ａｍｐプラスミドベクター（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に複製した。必要な場合、複製されたベクターはＵ６－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを使ってｇＲＮＡ－ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃｏｎのためのテンプレートとして使われた。ｄｕａｌガイドＲＮＡの構成のために、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを暗号化するオリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使ってｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２.０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングされた。エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａｓ１システム＿３.０（ｇｅＣａｓ１４ａ＿３.０）ベクターはＣａｓ１２ｆ１（Ｃａｓ１４ａ１）のヒトコドン最適化オリゴヌクレオチドおよびＣａｓ１４ａ１のためのエンジニアリングされたｇＲＮＡ配列で構成される。ＳｐＣａｓ９の場合、ＳｐＣａｓ９のヒトコドン最適化オリゴヌクレオチドおよびＳｐＣａｓ９のためのｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）はｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＥＧＦＰ（ＰＸ４５８）Ｖ２.０（Ａｄｄｇｅｎｅ）をバックボーンプラスミドとして使ってＧｉｂｓｏｎアセンブリした。
【0521】
２.ガイドＲＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｇＲＮＡの内部変形（ｉ.ｓｔｅｍ５を構成するヌクレオチド配列の変形、以下で前記ｉ変形をｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ １（Ｍ１）と記載する、この時、ｓｔｅｍ５を構成するｔｒａｃｒＲＮＡおよび／またはｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列の変形はＭ１－１で、ｓｔｅｍ５を構成するヌクレオチド配列の削除変形はＭ１－２で記載する；およびｉｉ.ｓｔｅｍ２を構成するヌクレオチド配列の変形、以下で前記ｉｉ変形をｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２（Ｍ２）と記載する）はＡｐｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を使って線形化されたｇＲＮＡエンコーディングベクターに変形された配列を運搬する合成オリゴヌクレオチド（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）をクローニングして遂行された。ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端変形（ｓｔｅｍ１を構成するヌクレオチド配列の変形、以下で前記変形をｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３（Ｍ３）と記載する）はＵ６プロモーター領域を標的とする逆方向プライマーとｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域を標的とする正方向プライマーを使ってｃａｎｏｎｉｃａｌまたはエンジニアリングされたテンプレートプラスミドベクターのＰＣＲ増幅によって遂行された。ＰＣＲ増幅はＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を利用して遂行されたし、ＰＣＲ産物はＫＬＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使ってｌｉｇａｔｉｏｎさせた。ｌｉｇａｔｉｏｎされた生成物を使ってＤＨ５αＥ.ｃｏｌｉ細胞を形質転換させた。突然変異誘発はＳａｎｇｅｒシーケンシング分析によって確認された。変形されたプラスミドベクターはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦ ｋｉｔ（ＭＮ）を使って精製された。精製されたプラスミド１μｇをＴ７ ＲＮＡ重合酵素（ＮＥＢ）およびＮＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使ってｍＲＮＡ合成のためのテンプレートとして使った。ガイドＲＮＡはＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使って精製して液体窒素に保管する前にｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｖｉａｌに分注した。
ｇＲＮＡの内部変形（ｉ.ｓｔｅｍ５を構成するヌクレオチド配列の変形、以下で前記ｉ変形をｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ １（Ｍ１）と記載する、この時、ｓｔｅｍ５を構成するｔｒａｃｒＲＮＡおよび／またはｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列の変形はＭ１－１で、ｓｔｅｍ５を構成するヌクレオチド配列の削除変形はＭ１－２で記載する；およびｉｉ.ｓｔｅｍ２を構成するヌクレオチド配列の変形、以下で前記ｉｉ変形をｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２（Ｍ２）と記載する）はＡｐｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を使って線形化されたｇＲＮＡエンコーディングベクターに変形された配列を運搬する合成オリゴヌクレオチド（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）をクローニングして遂行された。ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端変形（ｓｔｅｍ１を構成するヌクレオチド配列の変形、以下で前記変形をｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３（Ｍ３）と記載する）はＵ６プロモーター領域を標的とする逆方向プライマーとｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域を標的とする正方向プライマーを使ってｃａｎｏｎｉｃａｌまたはエンジニアリングされたテンプレートプラスミドベクターのＰＣＲ増幅によって遂行された。ＰＣＲ増幅はＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を利用して遂行されたし、ＰＣＲ産物はＫＬＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使ってｌｉｇａｔｉｏｎさせた。ｌｉｇａｔｉｏｎされた生成物を使ってＤＨ５αＥ.ｃｏｌｉ細胞を形質転換させた。突然変異誘発はＳａｎｇｅｒシーケンシング分析によって確認された。変形されたプラスミドベクターはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦ ｋｉｔ（ＭＮ）を使って精製された。精製されたプラスミド１μｇをＴ７ ＲＮＡ重合酵素（ＮＥＢ）およびＮＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使ってｍＲＮＡ合成のためのテンプレートとして使った。ガイドＲＮＡはＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使って精製して液体窒素に保管する前にｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｖｉａｌに分注した。
【0522】
ｃｒＲＮＡの３'末端変形（Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ付加、以下で前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ付加変形をｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４（Ｍ４）と記載する）は塩基配列変形されたプライマーとｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇＲＮＡプラスミドベクターがある状態でＰｆｕ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ５（Ｂｉｏｆａｃｔ）を使って遂行された。ＰＣＲアンプリコンはＨｉＧｅｎｅＴＭ Ｇｅｌ＆ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（Ｂｉｏｆａｃｔ）を使って精製した。
【0523】
３.Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）を５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１０％ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭで培養した。細胞形質感染はｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎまたはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ方法を通じて遂行された。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎのために、２－５μｇのＣａｓ１４ａ１、ＡｓＣｐｆ１またはＳｐＣａｓ９を暗号化する核酸を含むプラスミドベクターを２－５μｇのｇＲＮＡ暗号化するＤＮＡとともにＮｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って４ Ｘ １０５ ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞で形質感染させた。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ条件は次の通りである：１，３００Ｖ、１０ｍＡ、３パルス。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎのために、６－１５μＬ ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を２－５μｇのＣａｓ１４ａ１暗号化する核酸を含むプラスミドベクターおよび１.５－５μｇのＰＣＲアンプリコンと１５分の間混合した。混合物（３００μＬ）を１.５ｍｌ ＤＭＥＭ培地に添加し、ここで１ Ｘ １０６細胞を形質感染１日前にプレーティングし、細胞を混合物の存在下で７２－９６時間の間培養させた。培養後、細胞を収穫し、ＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ったりＭａｘｗｅｌｌＴＭ ＲＳＣ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使ったりしてｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを準備した。形質感染に対する標的の情報は下の表３に整理した。
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）を５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１０％ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭで培養した。細胞形質感染はｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎまたはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ方法を通じて遂行された。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎのために、２－５μｇのＣａｓ１４ａ１、ＡｓＣｐｆ１またはＳｐＣａｓ９を暗号化する核酸を含むプラスミドベクターを２－５μｇのｇＲＮＡ暗号化するＤＮＡとともにＮｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って４ Ｘ １０５ ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞で形質感染させた。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ条件は次の通りである：１，３００Ｖ、１０ｍＡ、３パルス。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎのために、６－１５μＬ ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を２－５μｇのＣａｓ１４ａ１暗号化する核酸を含むプラスミドベクターおよび１.５－５μｇのＰＣＲアンプリコンと１５分の間混合した。混合物（３００μＬ）を１.５ｍｌ ＤＭＥＭ培地に添加し、ここで１ Ｘ １０６細胞を形質感染１日前にプレーティングし、細胞を混合物の存在下で７２－９６時間の間培養させた。培養後、細胞を収穫し、ＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ったりＭａｘｗｅｌｌＴＭ ＲＳＣ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使ったりしてｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを準備した。形質感染に対する標的の情報は下の表３に整理した。
【0524】
【表3】
【0525】
ａＬｉｓｔｅｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８ ｐａｔｃｈ ｒｅｌｅａｓｅ １１（ＧＲＣｈ３８.ｐ１１）。
【0526】
４.Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｄｅｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞でｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを分離した。Ｔａｒｇｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒは合成されたし、製造業者の指針によりＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）がある状態でｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－含有領域を増幅するのに使われた。生成されたＰＣＲアンプリコンはＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＨＴ ｄｕａｌ ｉｎｄｅｘにラベリングされた。最終ＰＣＲ産物はＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ １００を使って１５０－ｂｐ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇした。Ｉｎｄｅｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙはＭＡＵＮＤ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ.ｃｏｍ／ｉｂｓ－ｃｇｅ／ｍａｕｎｄ）により計算された。
ＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞でｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを分離した。Ｔａｒｇｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒは合成されたし、製造業者の指針によりＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）がある状態でｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－含有領域を増幅するのに使われた。生成されたＰＣＲアンプリコンはＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＨＴ ｄｕａｌ ｉｎｄｅｘにラベリングされた。最終ＰＣＲ産物はＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ １００を使って１５０－ｂｐ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇした。Ｉｎｄｅｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙはＭＡＵＮＤ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ.ｃｏｍ／ｉｂｓ－ｃｇｅ／ｍａｕｎｄ）により計算された。
【0527】
５.Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃａｓ１４ａ１
Ｃａｓ１２ｆ１遺伝子は変形されたｐＭＡＬ－ｃ２ｘプラスミドベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングされたし、前記ベクター構築物を使ってＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ.ｃｏｌｉ細胞を形質転換した。Ｅ.ｃｏｌｉ形質転換体コロニーは０.７の光学密度に到達するまでＬＢ ｂｒｏｔｈで３７℃で成長させた。前記細胞を０.１ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅの存在下で３０℃で一晩中培養した後、３０分の間３，５００ｇで遠心分離して収集した。収集された細胞を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭβ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５％グリセロールに再懸濁させた。Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅは超音波処理し、１５，０００ｇで３０分の間遠心分離した後、０.４５μｍ注射器フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じて濾過して準備した。ｃｌｅａｒｅｄ ｌｙｓａｔｅをＦＰＬＣ精製システム（ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使ってＮｉ２＋－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎにロードした。Ｎｉ２＋－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎに結合された分画は８０－４００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｇｒａｄｉｅｎｔｓから２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７.５）に溶出された。溶出されたタンパク質は１ｍｇのＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅで６時間の間処理された。切断されたタンパク質は０.１５－１.６ Ｍ ＮａＣｌの線形勾配でＨｅｐａｒｉｎ ｃｏｌｕｍｎで精製された。組換えＣａｓ１４ａ１タンパク質は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭβ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５％グリセロールに対して透析された。透析されたタンパク質を０.５－１.２Ｍ ＮａＣｌの線形勾配でｍｏｎｏＳ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再び精製した。選択された分画をプルリンハで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭβ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５％グリセロールに対して透析した。収得されたタンパク質の濃度はｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎを標準として使ってｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ－ｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで電気球形的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）測定された。
Ｃａｓ１２ｆ１遺伝子は変形されたｐＭＡＬ－ｃ２ｘプラスミドベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングされたし、前記ベクター構築物を使ってＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ.ｃｏｌｉ細胞を形質転換した。Ｅ.ｃｏｌｉ形質転換体コロニーは０.７の光学密度に到達するまでＬＢ ｂｒｏｔｈで３７℃で成長させた。前記細胞を０.１ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅの存在下で３０℃で一晩中培養した後、３０分の間３，５００ｇで遠心分離して収集した。収集された細胞を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭβ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５％グリセロールに再懸濁させた。Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅは超音波処理し、１５，０００ｇで３０分の間遠心分離した後、０.４５μｍ注射器フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じて濾過して準備した。ｃｌｅａｒｅｄ ｌｙｓａｔｅをＦＰＬＣ精製システム（ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使ってＮｉ２＋－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎにロードした。Ｎｉ２＋－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎに結合された分画は８０－４００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｇｒａｄｉｅｎｔｓから２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７.５）に溶出された。溶出されたタンパク質は１ｍｇのＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅで６時間の間処理された。切断されたタンパク質は０.１５－１.６ Ｍ ＮａＣｌの線形勾配でＨｅｐａｒｉｎ ｃｏｌｕｍｎで精製された。組換えＣａｓ１４ａ１タンパク質は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭβ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５％グリセロールに対して透析された。透析されたタンパク質を０.５－１.２Ｍ ＮａＣｌの線形勾配でｍｏｎｏＳ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再び精製した。選択された分画をプルリンハで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭβ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５％グリセロールに対して透析した。収得されたタンパク質の濃度はｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎを標準として使ってｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ－ｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで電気球形的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）測定された。
【0528】
６.Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｄｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑ ｍｅｔｈｏｄ
Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ分析はＤｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑ方法を通じて遂行された。簡単に説明すると、ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡをＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から分離し、分離したｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡに１０μｇ Ｃａｓ１２ｆ１またはＡｓＣａｓ１２ａ組換えタンパク質と９００ｎＭエンジニアリングされたガイドＲＮＡを室温で２時間の間事前インキュベーションして形成されたｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘを処理した。ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡの分解（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）は１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７.９）を含む反応バッファーで３７℃で８時間の間遂行された。分解されたｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡはＲＮａｓｅ Ａ（５０μｇ／ｍｌ）で処理した後、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って精製した。精製されたｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡはＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使って３０ｘ～４０ｘのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｐｔｈで全体ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＷＧＳ）に適用された。ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｃｏｒｅは方程式によりＷＧＳデータを使って全体ゲノムにわたって各ヌクレオチド位置に割り当てられた。２.５のカットオフ値はオンターゲットシーケンスで６個以下の不一致基準が追加されたＤｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ.ｃｏｍ／ｃｈｉｚｋｓｈ／ｄｉｇｅｎｏｍｅ－ｔｏｏｌｋｉｔ２）を使って潜在的なオフターゲットをスクリーニングするために割り当てられた。選別された潜在的なオフ－ターゲットはＨＥＫ２９３－Ｔ細胞へのガイドＲＮＡとともにＣａｓ１４ａ１を処理した後、ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析によって検証された。
Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ分析はＤｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑ方法を通じて遂行された。簡単に説明すると、ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡをＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から分離し、分離したｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡに１０μｇ Ｃａｓ１２ｆ１またはＡｓＣａｓ１２ａ組換えタンパク質と９００ｎＭエンジニアリングされたガイドＲＮＡを室温で２時間の間事前インキュベーションして形成されたｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘを処理した。ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡの分解（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）は１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７.９）を含む反応バッファーで３７℃で８時間の間遂行された。分解されたｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡはＲＮａｓｅ Ａ（５０μｇ／ｍｌ）で処理した後、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って精製した。精製されたｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡはＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使って３０ｘ～４０ｘのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｐｔｈで全体ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＷＧＳ）に適用された。ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｃｏｒｅは方程式によりＷＧＳデータを使って全体ゲノムにわたって各ヌクレオチド位置に割り当てられた。２.５のカットオフ値はオンターゲットシーケンスで６個以下の不一致基準が追加されたＤｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ.ｃｏｍ／ｃｈｉｚｋｓｈ／ｄｉｇｅｎｏｍｅ－ｔｏｏｌｋｉｔ２）を使って潜在的なオフターゲットをスクリーニングするために割り当てられた。選別された潜在的なオフ－ターゲットはＨＥＫ２９３－Ｔ細胞へのガイドＲＮＡとともにＣａｓ１４ａ１を処理した後、ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析によって検証された。
【0529】
７.Ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ
ガイドＲＮＡまたはｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡはそれぞれＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から抽出された。ガイドＲＮＡの定量化のために、ｃＤＮＡ合成にｃｒＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒを使ったし、合成されたｃＤＮＡは定量的リアルタイムＰＣＲを鋳型として使った。エクソン欠失はｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って分析された。
ガイドＲＮＡまたはｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡはそれぞれＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から抽出された。ガイドＲＮＡの定量化のために、ｃＤＮＡ合成にｃｒＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒを使ったし、合成されたｃＤＮＡは定量的リアルタイムＰＣＲを鋳型として使った。エクソン欠失はｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って分析された。
【0530】
８.Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ＣａｎｏｎｉｃａｌまたはエンジニアリングされたｇＲＮＡを暗号化するＰＣＲアンプリコン（３μｇ）をＮｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使ってＨＥＫ２９３－Ｔ細胞で形質感染させ、形質感染２日後に細胞を収穫した。収穫した細胞からｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｍｉＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＡＳ１４６０）を使って総ＲＮＡを収得した。収得したＲＮＡを５μｇのＲＮＡ製剤をＥ.ｃｏｌｉ Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ、Ｍ０２７６）とともに３７℃で３０分の間培養してポリアデニル化させた。ＲＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＮＥＢ、Ｔ２０５０）で精製した。５００μｇのｐｏｌｙ（Ａ）－ｔａｉｌｅｄ ＲＮＡを３'末端にＴ６配列とアダプタ配列を送達するＲＴ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒの存在下でＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って逆転写させた。ガイドＲＮＡはアダプタおよびｇＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒを使ってＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルから分離した。
ＣａｎｏｎｉｃａｌまたはエンジニアリングされたｇＲＮＡを暗号化するＰＣＲアンプリコン（３μｇ）をＮｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使ってＨＥＫ２９３－Ｔ細胞で形質感染させ、形質感染２日後に細胞を収穫した。収穫した細胞からｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｍｉＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＡＳ１４６０）を使って総ＲＮＡを収得した。収得したＲＮＡを５μｇのＲＮＡ製剤をＥ.ｃｏｌｉ Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ、Ｍ０２７６）とともに３７℃で３０分の間培養してポリアデニル化させた。ＲＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＮＥＢ、Ｔ２０５０）で精製した。５００μｇのｐｏｌｙ（Ａ）－ｔａｉｌｅｄ ＲＮＡを３'末端にＴ６配列とアダプタ配列を送達するＲＴ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒの存在下でＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って逆転写させた。ガイドＲＮＡはアダプタおよびｇＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒを使ってＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルから分離した。
【0531】
９.Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ヒトコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１遺伝子およびｓｇＲＮＡ配列は逆末端反復を有するＡＡＶベクタープラスミドにクローニングされた。前記Ｃａｓ１２ｆ１遺伝子はｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌおよび自己切断Ｔ２Ａ配列を通じてｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｅＧＦＰ）遺伝子と連結される。Ｃａｓ１２ｆ１およびｓｇＲＮＡ転写はそれぞれｃｈｉｃｋｅｎβ－ａｃｔｉｎプロモーターおよびＵ６プロモーターによって誘導された。ｒＡＡＶ２ベクターを生産するために、ｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１またはｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ｓｇＲＮＡ－ＳａＣａｓ９；ｐＡＡＶＥＤ２／９；およびヘルパープラスミドをＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に形質注入した。前記形質注入されたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を２％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭで培養した。ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）とＰＥＩ ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎおよびＨＥＫ－２９３Ｔ細胞で同一のモル比でプラスミドを使った三重－形質注入（ｔｒｉｐｌｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を使って組換えｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｓｔｏｃｋを生成した。７２時間のインキュベーション後、細胞を溶解させてｐａｒｔｉｃｌｅをｉｏｄｉｘａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ｓｔｅｐ－ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎを利用して精製した。ベクターゲノムの数は定量的ＰＣＲによって決定された。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞は定量的ＰＣＲによって決定された通り、１、５、１０、５０および１００の異なる感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）でｒＡＡＶ２－Ｃａｓ１２ｆ１－ｓｇＲＮＡまたはｒＡＡＶ２－ＳａＣａｓ９－ｓｇＲＮＡに感染された。形質導入された細胞は２％ＦＢＳがあるＤＭＥＭで２週まで維持された。他のｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓでｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡの分離のために細胞を収集した。
ヒトコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１遺伝子およびｓｇＲＮＡ配列は逆末端反復を有するＡＡＶベクタープラスミドにクローニングされた。前記Ｃａｓ１２ｆ１遺伝子はｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌおよび自己切断Ｔ２Ａ配列を通じてｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｅＧＦＰ）遺伝子と連結される。Ｃａｓ１２ｆ１およびｓｇＲＮＡ転写はそれぞれｃｈｉｃｋｅｎβ－ａｃｔｉｎプロモーターおよびＵ６プロモーターによって誘導された。ｒＡＡＶ２ベクターを生産するために、ｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｆ１またはｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ｓｇＲＮＡ－ＳａＣａｓ９；ｐＡＡＶＥＤ２／９；およびヘルパープラスミドをＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に形質注入した。前記形質注入されたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を２％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭで培養した。ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）とＰＥＩ ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎおよびＨＥＫ－２９３Ｔ細胞で同一のモル比でプラスミドを使った三重－形質注入（ｔｒｉｐｌｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を使って組換えｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｓｔｏｃｋを生成した。７２時間のインキュベーション後、細胞を溶解させてｐａｒｔｉｃｌｅをｉｏｄｉｘａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ｓｔｅｐ－ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎを利用して精製した。ベクターゲノムの数は定量的ＰＣＲによって決定された。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞は定量的ＰＣＲによって決定された通り、１、５、１０、５０および１００の異なる感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）でｒＡＡＶ２－Ｃａｓ１２ｆ１－ｓｇＲＮＡまたはｒＡＡＶ２－ＳａＣａｓ９－ｓｇＲＮＡに感染された。形質導入された細胞は２％ＦＢＳがあるＤＭＥＭで２週まで維持された。他のｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓでｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡの分離のために細胞を収集した。
【0532】
１０.Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ－ｔｅｓｔによる統計的有意性検証がＳｉｇｍａ Ｐｌｏｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ.１４.０）により遂行された。０.０５未満のｐ－ｖａｌｕｅが表れる場合、統計的に有意義なものと見なしたし、ｐ－ｖａｌｕｅは各図面に図示されている。ボックスプロット（ｂｏｘ ｐｌｏｔ）および点プロット（ｄｏｔ ｐｌｏｔ）でデータポイントは全体値の範囲を示し、各ボックスは４分位の範囲（２５－７５ ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）にまたがっている。中位値および平均値はそれぞれ黒色および赤色の平行線で表示された。すべての点プロット（ｄｏｔ ｐｌｏｔ）およびバープロット（ｂａｒ ｐｌｏｔ）データのエラーバーはＳｉｇｍａｐｌｏｔ（ｖ.４１.０）を使って図示されたし、各データの標準偏差値を意味する。統計的方法に基づいてサンプルの大きさを予め決定してはいない。Ｃａｓ類型に対するブラインド情報で大規模検証が遂行された。
ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ－ｔｅｓｔによる統計的有意性検証がＳｉｇｍａ Ｐｌｏｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ.１４.０）により遂行された。０.０５未満のｐ－ｖａｌｕｅが表れる場合、統計的に有意義なものと見なしたし、ｐ－ｖａｌｕｅは各図面に図示されている。ボックスプロット（ｂｏｘ ｐｌｏｔ）および点プロット（ｄｏｔ ｐｌｏｔ）でデータポイントは全体値の範囲を示し、各ボックスは４分位の範囲（２５－７５ ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）にまたがっている。中位値および平均値はそれぞれ黒色および赤色の平行線で表示された。すべての点プロット（ｄｏｔ ｐｌｏｔ）およびバープロット（ｂａｒ ｐｌｏｔ）データのエラーバーはＳｉｇｍａｐｌｏｔ（ｖ.４１.０）を使って図示されたし、各データの標準偏差値を意味する。統計的方法に基づいてサンプルの大きさを予め決定してはいない。Ｃａｓ類型に対するブラインド情報で大規模検証が遂行された。
【実施例1】
【0533】
＜ガイドＲＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＞
先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、Ｔａｕｔｖｙｄａｓ Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８、５０１６－５０２３（２０２０））を通じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムが一本鎖DNA（ｓｓＤＮＡ）を切断するもののように報告されたし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム自体が真核細胞のゲノム編集に適していないかもしれないと仮定した。このような問題を認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを真核細胞に適用するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムのためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を最適化する研究を遂行した。
先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、Ｔａｕｔｖｙｄａｓ Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８、５０１６－５０２３（２０２０））を通じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムが一本鎖DNA（ｓｓＤＮＡ）を切断するもののように報告されたし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム自体が真核細胞のゲノム編集に適していないかもしれないと仮定した。このような問題を認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを真核細胞に適用するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムのためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を最適化する研究を遂行した。
【0534】
ｇＲＮＡエンジニアリングはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムのｇＲＮＡを構成するｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ全体に亘って４個の変形部位（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ；ＭＳ）を次のように指定した（図２）：
１）ＭＳ１－ｔｒａｃｒＲＮＡのｐｅｎｔａ－ｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅ（ＵＵＵＵＵ）配列を含むｓｔｅｍ５を構成する領域（ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域１に対応する）およびこれに対応するｃｒＲＮＡの領域；
２）ＭＳ２－ｓｔｅｍ２を構成するｔｒａｃｒＲＮＡの内部領域（ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域４に対応する）；
３）ＭＳ３－ｓｔｅｍ１を構成するｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域（ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域５に対応する）；および
４）ＭＳ４－ｃｒＲＮＡの３'末端領域.
ｇＲＮＡエンジニアリングはＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３およびＭＳ４でそれぞれ個別的に遂行するか多様な組み合わせで遂行して非常に効率的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ａ１システムを導き出した。安定したｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ複合体の形成のために一部のエンジニアリングされたガイドＲＮＡの場合、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡをｌｉｎｋｅｒであるＧＡＡＡ配列に連結した単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）として使った。
１）ＭＳ１－ｔｒａｃｒＲＮＡのｐｅｎｔａ－ｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅ（ＵＵＵＵＵ）配列を含むｓｔｅｍ５を構成する領域（ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域１に対応する）およびこれに対応するｃｒＲＮＡの領域；
２）ＭＳ２－ｓｔｅｍ２を構成するｔｒａｃｒＲＮＡの内部領域（ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域４に対応する）；
３）ＭＳ３－ｓｔｅｍ１を構成するｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域（ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡの変形対象領域５に対応する）；および
４）ＭＳ４－ｃｒＲＮＡの３'末端領域.
ｇＲＮＡエンジニアリングはＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３およびＭＳ４でそれぞれ個別的に遂行するか多様な組み合わせで遂行して非常に効率的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ａ１システムを導き出した。安定したｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ複合体の形成のために一部のエンジニアリングされたガイドＲＮＡの場合、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡをｌｉｎｋｅｒであるＧＡＡＡ配列に連結した単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅガイドＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）として使った。
【実施例2】
【0535】
＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ＭＳ１）＞
先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）により報告されたＣａｓ１４ａ１に対するｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇＲＮＡ配列を綿密に調査した。その結果、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）が真核細胞で正常に転写し難い不適切な配列を含んでいることを確認した。ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に１３８番目から１４２番目の位置に内部ＵＵＵＵＵ（Ｕ５）配列を含む（図１）。したがって、ｔｒａｃｒＲＮＡを転写するためにｔｒａｃｒＲＮＡを暗号化する核酸は連続する５個のチミジン（Ｔ５）配列を含むことになる。この時、連続する５個のチミジン（Ｔ５）配列はＵ６プロモーターの下で終結配列として作用し得、これによってｔｒａｃｒＲＮＡが正常に転写できず不完全なｔｒａｃｒＲＮＡが生成される可能性が高い。したがって、本発明者はｔｒａｃｒＲＮＡのｐｅｎｔａ－ｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅ（ＵＵＵＵＵ）配列を含むｓｔｅｍ５を構成する領域（ＭＳ１）をｇＲＮＡエンジニアリングのためのホットスポットと見なした。
先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）により報告されたＣａｓ１４ａ１に対するｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇＲＮＡ配列を綿密に調査した。その結果、ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）が真核細胞で正常に転写し難い不適切な配列を含んでいることを確認した。ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｔｒａｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から３'末端方向に１３８番目から１４２番目の位置に内部ＵＵＵＵＵ（Ｕ５）配列を含む（図１）。したがって、ｔｒａｃｒＲＮＡを転写するためにｔｒａｃｒＲＮＡを暗号化する核酸は連続する５個のチミジン（Ｔ５）配列を含むことになる。この時、連続する５個のチミジン（Ｔ５）配列はＵ６プロモーターの下で終結配列として作用し得、これによってｔｒａｃｒＲＮＡが正常に転写できず不完全なｔｒａｃｒＲＮＡが生成される可能性が高い。したがって、本発明者はｔｒａｃｒＲＮＡのｐｅｎｔａ－ｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅ（ＵＵＵＵＵ）配列を含むｓｔｅｍ５を構成する領域（ＭＳ１）をｇＲＮＡエンジニアリングのためのホットスポットと見なした。
【0536】
［実施例２－１］
＜エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）：ｔｒａｃｒＲＮＡのｐｅｎｔａ－ｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅ（ＵＵＵＵＵ）配列を含むｓｔｅｍ５を構成する領域変形＞
以下で、ｔｒａｃｒＲＮＡ内にＵＵＵＵＵ（Ｕ５）配列を含む領域が変形された場合、Ｍ１－１またはＭＳ１エンジニアリングで表示した。すなわち、連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡはＭ１－１変形を含むエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）で表示した。また、前述した詳細な説明に基づき、ＭＳ１エンジニアリングによって生成されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）は前記１.エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの説明中の「１－１）第１配列」セクションに記載された第１配列（連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列）を有することができる（図４のＡ）。
＜エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）：ｔｒａｃｒＲＮＡのｐｅｎｔａ－ｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅ（ＵＵＵＵＵ）配列を含むｓｔｅｍ５を構成する領域変形＞
以下で、ｔｒａｃｒＲＮＡ内にＵＵＵＵＵ（Ｕ５）配列を含む領域が変形された場合、Ｍ１－１またはＭＳ１エンジニアリングで表示した。すなわち、連続した５個以上のウリジン配列を含まないように変形された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡはＭ１－１変形を含むエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）で表示した。また、前述した詳細な説明に基づき、ＭＳ１エンジニアリングによって生成されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）は前記１.エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの説明中の「１－１）第１配列」セクションに記載された第１配列（連続した５個以上のウリジン配列を含まない配列）を有することができる（図４のＡ）。
【0537】
終結信号として作用できる連続した５個以上のウリジン配列を除去するためにそれぞれのウリジン（Ｕ）をウリジン以外の他のヌクレオチド（Ａ、ＣまたはＧ）で置き換えてエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡを生成した（表４）。生成されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡを利用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞で内因性標的（Ｔａｒｇｅｔ １）に対するインデル効率を調査した。Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析結果、それぞれの置換が少なくとも４倍のインデル効率の増加をもたらしたし、特に、１４１番目のウリジン（Ｕ１４１）がシチジン（Ｃ）で置換された時にインデル効率が約５０倍程度に顕著に増加することを確認した（図１１）。シチジンは終結信号を除去するだけでなくその位置に構造的に適合するように作用したと推測される。
【0538】
【表4】
【0539】
また、追加的な置換によって効果を確認するために、１４１番目のＵをＣで固定し、残りのウリジンを図１２に基づいて多様に置き換えて組み合わせた１６通りのエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡを比較した（表５）。比較分析した結果、殆どのエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡはＵＵＵＵＵを含むｃａｎｏｎｉｃａｌ ｔｒａｃｒＲＮＡ（すなわち、野生型ｔａｒｃｒＲＮＡ）より高いインデル効率を示した。特に、ｔｒａｃｒＲＮＡでＵＵＵＵＵ配列を「ＧＵＧＣＵ」配列で代替した場合、インデル効率がさらに増加することが明らかになった（図１２）。
【0540】
【表5】
【0541】
［実施例２－２］
＜エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）：エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）に対応するｃｒＲＮＡの変形＞
また、インデル効率を最大化するために、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）に対応するｃｒＲＮＡを操作した。以下で、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）により変形されるｃｒＲＮＡはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）で表示した（図４のＡ）。また、前述した詳細な説明に基づき、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（ＭＳ１－１）は前記２.Ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡ ｏｒエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの説明中の「２－１）第６配列」セクションに記載された第６配列（５'－ＡＣＧＡＡ－３'配列を含まない配列）を有することができる。
＜エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）：エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）に対応するｃｒＲＮＡの変形＞
また、インデル効率を最大化するために、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）に対応するｃｒＲＮＡを操作した。以下で、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）により変形されるｃｒＲＮＡはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）で表示した（図４のＡ）。また、前述した詳細な説明に基づき、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（ＭＳ１－１）は前記２.Ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃｒＲＮＡ ｏｒエンジニアリングされたｃｒＲＮＡの説明中の「２－１）第６配列」セクションに記載された第６配列（５'－ＡＣＧＡＡ－３'配列を含まない配列）を有することができる。
【0542】
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）の５'－ＧＵＧＣＵ－３'配列に対応するｃｒＲＮＡの最適な配列を探すために、前記ｔｒａｃｒＲＮＡの操作方法と類似する方法を利用して多様な配列への置換による効果を分析した。前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）の５'－ＧＵＧＣＵ－３'配列に対応するｃｒＲＮＡの５'－ＡＣＧＡＡ－３'配列のそれぞれのヌクレオチドを多様なヌクレオチドで置き換えて多様に組み合わせてエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを生成した。生成されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを利用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞で３個の標的遺伝子に対するインデル効率を確認した結果、５'－ＡＧＣＡＡ－３'配列がｔｒａｃｒＲＮＡの５'－ＧＵＧＣＵ－３'配列に対する最適な対応配列であることを確認した（図１３～１５）。
【0543】
また、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で３個の標的遺伝子でＭＳ１変形を含んだエンジニアリングされたｇＲＮＡの効果を確認した。その結果、ｃｒＲＮＡの単独変形（すなわち、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）は５'－ＡＧＣＡＡ－３'配列を含み、すなわち、５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＧＣＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３９）を含む）はＣａｓ１２ｆ１によるインデル活性に影響を与えなかったのであるが、ｔｒａｃｒＲＮＡの単独変形（すなわち、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）は５'－ＧＵＧＣＵ－３'配列を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０配列である）はすべての標的遺伝子に対してインデル効率を顕著に増加させた。また、前記ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを共に変形させた結果、ｔｒａｃｒＲＮＡを単独変形した場合よりインデル効率がさらに増加した（図１６）。
【0544】
簡単に整理すると、前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡのｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ結果、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）は５'－ＵＵＵＵＵ－３'配列の代わりに５'－ＧＵＧＣＵ－３'配列を含み、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）は５'－ＡＣＧＡＡ－３'配列の代わりに５'－ＡＧＣＡＡ－３'配列を含む場合、インデル効果が最大化されることを確認した。以下で、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）を含むエンジニアリングされたｇＲＮＡはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ－１）で表示した。
【0545】
［実施例２－３］
＜エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－２）ａｎｄエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－２）：Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｓｔｅｍ５＞
前記の実施例２－１および２－３によって生成されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）を追加で操作した。Ｃａｓ１４ａ１のためのｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡで構成されて長い配列を有する。そこで、本発明者はｉｎｄｅｌ効率を減少させないようにしつつ、ｇＲＮＡの長さを減らすためにｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ相補的に結合する領域、すなわち、ｓｔｅｍ５を構成する領域（ＭＳ１）を追加変形した。これは今後の臨床適用を考慮したものであり、長さが２００ｎｔ以上のｓｇＲＮＡの化学的合成は臨床環境で負担となり得る。以下で、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ相補的に結合する領域、すなわち、ｓｔｅｍ５を構成する領域に一部の塩基対配列を削除する場合、Ｍ１－２で表示した。すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端およびｃｒＲＮＡの５'末端に存在する相補的に結合する配列が全体または一部が削除された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－２）で表示し、ｃｒＲＮＡはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－２）で表示するか、またはエンジニアリングされたｓｇＲＮＡ（Ｍ１－２）で表示する。また、ＭＳ１の変形をすべて含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１およびＭ１－２をすべて含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１）で表示する（図４のＢ）。
＜エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－２）ａｎｄエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－２）：Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｓｔｅｍ５＞
前記の実施例２－１および２－３によって生成されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）を追加で操作した。Ｃａｓ１４ａ１のためのｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡで構成されて長い配列を有する。そこで、本発明者はｉｎｄｅｌ効率を減少させないようにしつつ、ｇＲＮＡの長さを減らすためにｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ相補的に結合する領域、すなわち、ｓｔｅｍ５を構成する領域（ＭＳ１）を追加変形した。これは今後の臨床適用を考慮したものであり、長さが２００ｎｔ以上のｓｇＲＮＡの化学的合成は臨床環境で負担となり得る。以下で、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ相補的に結合する領域、すなわち、ｓｔｅｍ５を構成する領域に一部の塩基対配列を削除する場合、Ｍ１－２で表示した。すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端およびｃｒＲＮＡの５'末端に存在する相補的に結合する配列が全体または一部が削除された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－２）で表示し、ｃｒＲＮＡはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－２）で表示するか、またはエンジニアリングされたｓｇＲＮＡ（Ｍ１－２）で表示する。また、ＭＳ１の変形をすべて含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１およびＭ１－２をすべて含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１）で表示する（図４のＢ）。
【0546】
インデル効率に及ぼす影響を確認するために、多様な長さのｓｔｅｍ５（ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ相補的に結合する領域）を有するｓｇＲＮＡを生成してテストした（表６、図１７）。その結果、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ相補的に結合する領域が削除されたｓｇＲＮＡは略インデル効率が維持された。
【0547】
【表6】
【実施例3】
【0548】
＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ＭＳ１ ａｎｄ ＭＳ２）：Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｓｔｅｍ２（エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ２））＞
Ｃａｓ１４ａ１は他のｃｌａｓｓ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｅｔｅｍに比べてｔｒａｃｒＲＮＡの大きな大きさによって非常に長いｇＲＮＡを有する。そこで、本発明者はＣａｓ１２ｆ１のコンパクトな大きさを考慮する時、全体ｔｒａｃｒＲＮＡ配列がＣａｓ１２ｆ１との相互作用に参加する可能性が低いという仮設を立てた。この仮設を確認するために、ｔｒａｃｒＲＮＡのｓｔｅｍ２を構成する領域（ＭＳ２）を追加変形した。これは今後の臨床適用を考慮したものであり、長さが２００ｎｔ以上のｓｇＲＮＡの化学的合成は臨床環境で負担となり得る。以下で、ｓｔｅｍ２を構成する領域に一部の塩基対配列を削除する場合、Ｍ２でまたはＭＳ２エンジニアリングで表示した。すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端およびｃｒＲＮＡの５'末端に存在する相補的に結合する配列が全体または一部が削除された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ２）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ２）で表示する。また、ＭＳ１の一部変形を含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１を含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／２）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１－１／２）で表示する。また、ＭＳ１の変形をすべて含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１およびＭ１－２を含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１／２）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１／２）で表示する（図５）。
Ｃａｓ１４ａ１は他のｃｌａｓｓ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｅｔｅｍに比べてｔｒａｃｒＲＮＡの大きな大きさによって非常に長いｇＲＮＡを有する。そこで、本発明者はＣａｓ１２ｆ１のコンパクトな大きさを考慮する時、全体ｔｒａｃｒＲＮＡ配列がＣａｓ１２ｆ１との相互作用に参加する可能性が低いという仮設を立てた。この仮設を確認するために、ｔｒａｃｒＲＮＡのｓｔｅｍ２を構成する領域（ＭＳ２）を追加変形した。これは今後の臨床適用を考慮したものであり、長さが２００ｎｔ以上のｓｇＲＮＡの化学的合成は臨床環境で負担となり得る。以下で、ｓｔｅｍ２を構成する領域に一部の塩基対配列を削除する場合、Ｍ２でまたはＭＳ２エンジニアリングで表示した。すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端およびｃｒＲＮＡの５'末端に存在する相補的に結合する配列が全体または一部が削除された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ２）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ２）で表示する。また、ＭＳ１の一部変形を含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１を含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／２）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１－１／２）で表示する。また、ＭＳ１の変形をすべて含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１およびＭ１－２を含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１／２）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１／２）で表示する（図５）。
【0549】
インデル効率に及ぼす影響を確認するために、多様な長さのｓｔｅｍ２を有するｓｇＲＮＡを生成してテストした（表７、図１８）。その結果、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ相補的に結合する領域が削除されたｓｇＲＮＡは略インデル効率が維持された。
【0550】
【表7】
【実施例4】
【0551】
＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ＭＳ１ ａｎｄ ＭＳ３）：５'－Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｒＲＮＡ（エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ３））＞
Ｃａｓ１４ａ１は他のｃｌａｓｓ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｅｔｅｍに比べてｔｒａｃｒＲＮＡの大きな大きさによって非常に長いｇＲＮＡを有する。そこで、本発明者はＣａｓ１２ｆ１のコンパクトな大きさを考慮する時、全体ｔｒａｃｒＲＮＡ配列がＣａｓ１２ｆ１との相互作用に参加する可能性が低いという仮設を立てた。この仮設を確認するために、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域（ｓｔｅｍ１を構成するｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域）を削除するようにｔｒａｃｒＲＮＡを設計した。以下で、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端に一部の配列を削除する場合、Ｍ３またはＭＳ３エンジニアリングで表示した。すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端に一部の配列が削除された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡはＭＳ３変形を含むエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ３）で表示した。また、ＭＳ１の一部変形を含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１を含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／３）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１－１／３）で表示する。また、ＭＳ１の変形をすべて含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１およびＭ１－２を含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１／３）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１／３）で表示する（図６）。
Ｃａｓ１４ａ１は他のｃｌａｓｓ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｅｔｅｍに比べてｔｒａｃｒＲＮＡの大きな大きさによって非常に長いｇＲＮＡを有する。そこで、本発明者はＣａｓ１２ｆ１のコンパクトな大きさを考慮する時、全体ｔｒａｃｒＲＮＡ配列がＣａｓ１２ｆ１との相互作用に参加する可能性が低いという仮設を立てた。この仮設を確認するために、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域（ｓｔｅｍ１を構成するｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域）を削除するようにｔｒａｃｒＲＮＡを設計した。以下で、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端に一部の配列を削除する場合、Ｍ３またはＭＳ３エンジニアリングで表示した。すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端に一部の配列が削除された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡはＭＳ３変形を含むエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ３）で表示した。また、ＭＳ１の一部変形を含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１を含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／３）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１－１／３）で表示する。また、ＭＳ１の変形をすべて含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１およびＭ１－２を含んだ場合、エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１／３）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１／３）で表示する（図６）。
【0552】
ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域を削除するように設計したエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／３）を利用して実験した結果（表８）、２０ｎｔが削除されたｔｒａｃｒＲＮＡを利用した場合、インデル効率が顕著に増加することを確認した（図１９）。
【0553】
【表8】
【実施例5】
【0554】
＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ＭＳ１ ａｎｄ ＭＳ４）：Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ３'－ｐｏｌｙ－ｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｓ ｉｎ ｃｒＲＮＡ（エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ４））＞
以前の研究でｃｒＲＮＡにＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を付加する変形を通じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの向上したインデル効率を確認したところがある（ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／０１４９６１参考）。これに基づいてｃｒＲＮＡの３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を付加する変形を設計した。ｃｒＲＮＡの３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含む場合、Ｍ４またはＭＳ４エンジニアリングで表示した。すなわち、ｃｒＲＮＡの３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加された場合、ｃｒＲＮＡはＭＳ４変形を含むエンジニアリングされたｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ４）で表示した。また、ＭＳ１の一部変形を含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１を含んだ場合、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／４）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１－１／４）で表示する。また、ＭＳ１の変形をすべて含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１およびＭ１－２を含んだ場合、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１／４）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１／４）で表示する（図７）。
以前の研究でｃｒＲＮＡにＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を付加する変形を通じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの向上したインデル効率を確認したところがある（ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／０１４９６１参考）。これに基づいてｃｒＲＮＡの３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を付加する変形を設計した。ｃｒＲＮＡの３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含む場合、Ｍ４またはＭＳ４エンジニアリングで表示した。すなわち、ｃｒＲＮＡの３'末端にＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加された場合、ｃｒＲＮＡはＭＳ４変形を含むエンジニアリングされたｃｒＲＮＡまたはエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ４）で表示した。また、ＭＳ１の一部変形を含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１を含んだ場合、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／４）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１－１／４）で表示する。また、ＭＳ１の変形をすべて含んだ場合、すなわち、Ｍ１－１およびＭ１－２を含んだ場合、エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１／４）で表示するか、またはエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１／４）で表示する（図７）。
【0555】
実施例２のエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）とともにＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列が付加されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／４）を含んだエンジニアリングされたｇＲＮＡ（Ｍ１－１／４）のインデル効率を確認した。
【0556】
エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／４）のために、Ｃａｓ１２ｆ１のためのエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）の３'末端に多様な長さのＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を含むように設計した。この時、ｃｒＲＮＡを暗号化する核酸の３'末端にチミジンの長さを段階的に増やして多様な長さのＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を有するエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／４）を設計した（表９）。特に、チミジンが５個以上である場合、さらにインデル効率が増加した（図２０）。この時、Ｔ４Ａ、Ｔ４ＡＴなど連続したチミジン配列の中間にＡはＵ６プロモーター下で終結信号として作用する連続する５個のチミジン（Ｔ５）配列を除去するためで設計されたし、またＡの代わりにＣまたはＧをＴＴＴＴ後に付加してその効果を確認した（図２１）。
【0557】
【表9】
【0558】
その結果、チミジンの長さが増加するほどインデル効率が増加することを確認した。特に、Ｕ４ＡＵ４を含んだエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／４）とエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１）を共に利用した場合、それぞれを単独で変形したものより大きいシナジー効果を示したし、Ｔａｒｇｅｔ １に対して最大１，１４８倍までインデル効率が大きく向上することを確認した（図２２および図２３）。
【実施例6】
【0559】
＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ＭＳ１、ＭＳ３ ａｎｄ ＭＳ４）＞
前記の実施例に基づいてＭＳ１エンジニアリング、ＭＳ３エンジニアリングおよびＭＳ４エンジニアリングを含んだエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／３）（表９）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／４）（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１６］－［ガイド配列］－［Ｕ４ＡＵ４］－３'）を設計した。これを利用して実験した結果、３個のターゲットでいずれも高いインデル効率を確認した。特に、単独変形（Ｍ１－１）や二つの組み合わせ変形（Ｍ１－１／３またはＭ１－１／４）より３個の組み合わせ変形（Ｍ１－１／３／４）の場合、約３～６倍のインデル効率がさらに増加した。
前記の実施例に基づいてＭＳ１エンジニアリング、ＭＳ３エンジニアリングおよびＭＳ４エンジニアリングを含んだエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／３）（表９）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／４）（５'－［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１６］－［ガイド配列］－［Ｕ４ＡＵ４］－３'）を設計した。これを利用して実験した結果、３個のターゲットでいずれも高いインデル効率を確認した。特に、単独変形（Ｍ１－１）や二つの組み合わせ変形（Ｍ１－１／３またはＭ１－１／４）より３個の組み合わせ変形（Ｍ１－１／３／４）の場合、約３～６倍のインデル効率がさらに増加した。
【0560】
このような効果を確認した後、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端領域に削除配列を最適化するために、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端長さを－１２～－２１範囲内で微細調整して３個の標的に対するインデル効果を比較した（表１０）。その結果、ｔｒａｃｒＲＮＡ５'末端の１８ｎｔから２１ｎｔまでの範囲に削除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）することがインデル効率に最も効果的であることを確認した（図２４）。特に、５'末端に２０ｎｔ配列が削除された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｔｒａｃｒＲＮＡが最も効果的であった。
【0561】
【表10】
【実施例7】
【0562】
＜エンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ＭＳ１、ＭＳ３ ａｎｄ ＭＳ４）＞
前記の実施例に基づいてＭＳ１エンジニアリング、ＭＳ３エンジニアリングおよびＭＳ４エンジニアリングを含んだエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１／３）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１／４）を設計した。
前記の実施例に基づいてＭＳ１エンジニアリング、ＭＳ３エンジニアリングおよびＭＳ４エンジニアリングを含んだエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１／３）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１／４）を設計した。
【0563】
前記実施例６によって３個の組み合わせ変形（Ｍ１－１／３／４）の場合、インデル効率が増加することを確認した。しかし、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端削除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）にもＣａｓ１４ａ１のためのｇＲＮＡは依然として長い配列を有する。そこで、本発明者はｇＲＮＡの長さを最適化するためのＭ１－２変形をさらに含むように追加設計した（表１１）。エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１／３）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１／４）を含むエンジニアリングされたｓｇＲＮＡ（Ｍ１／３／４）を利用した場合、実施例６でエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／３）およびエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ（Ｍ１－１／４）を利用したインデル効率と類似または若干増加したインデル効率が確認された（図２５）。
【0564】
【表11】
【0565】
このような結果に基づいてＣａｓ１４ａ１との相互作用に影響を与えないようにしつつ、最適な長さを有するｓｇＲＮＡを探すために追加的なスクリーニングを遂行した。ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ相補的に結合する領域（ｓｔｅｍ５）の全体範囲に亘って１ｂｐずつ差を有するように多様なｓｇＲＮＡを設計しテストした（表１２、図２６）。
【0566】
【表12】
【0567】
一方、ｓｇＲＮＡのｌｉｎｋｅｒ配列を利用した追加変形を試みた。一般的にｓｇＲＮＡのためにリンカーとしてＧＡＡＡを利用する。この場合、ｇＲＮＡは一つのＲＮＡ分子で作動する。反面ＧＡＡＡ配列をｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ配列に代替する場合、発現段階でｓｇＲＮＡが生成されるがｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅによって自己切断（ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖａｇｅ）されてｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡにオーバーハングがある二重ガイドＲＮＡが生成される。すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡとｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅの結合は３'－ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｔｒａｃｒＲＮＡと５'－ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｃｒＲＮＡを生成することができる（図２７）。または反対に、ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ配列を反対方向に統合すると、５'－ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｔｒａｃｒＲＮＡおよび３'－ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｃｒＲＮＡが生成される。このようなｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ配列の特性を利用したｇＲＮＡ構造変形をテストしてゲノム編集をさらに向上させることができるかどうかを調査した。その結果、ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ配列を有するように設計されたｇＲＮＡのうちいずれも総２５ｎｔ－ｔｒｕｃａｔｅｄ ｓｇＲＮＡ（すなわち、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの場合それぞれ１２ｎｔおよび１３ｎｔ切断）に比べて増加した効率を示さなかった（図２７）。
【実施例8】
【0568】
多様なエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３および／またはＭＳ４
前記にて実施した実施例２～５で確認した多様なｇＲＮＡエンジニアリングに基づき、ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３およびＭＳ４エンジニアリングを多様に組み合わせて多様なエンジニアリングされたｇＲＮＡを設計してその効果を確認した（図４～１０および表１３）。その結果、多様なｇＲＡＮのエンジニアリングはインデル効率を向上させた（図２８）。特に、Ｍ１／３／４組み合わせおよびＭ１／２／３／４組み合わせでエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムが最も優秀なゲノム編集性能を示した。以下では、Ｍ１／３／４組み合わせでエンジニアリングされたｇＲＮＡを含むエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムはｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムで表示した。また、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムを利用したインデルパターンを確認した（図２９）。総合すると、広範囲なｇＲＮＡエンジニアリングを通じて強力でさらにコンパクトなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを開発したし、これを利用して真核細胞で既存ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（すなわち、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム）で達成できなかった高効率のゲノム編集を可能にした。
前記にて実施した実施例２～５で確認した多様なｇＲＮＡエンジニアリングに基づき、ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３およびＭＳ４エンジニアリングを多様に組み合わせて多様なエンジニアリングされたｇＲＮＡを設計してその効果を確認した（図４～１０および表１３）。その結果、多様なｇＲＡＮのエンジニアリングはインデル効率を向上させた（図２８）。特に、Ｍ１／３／４組み合わせおよびＭ１／２／３／４組み合わせでエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムが最も優秀なゲノム編集性能を示した。以下では、Ｍ１／３／４組み合わせでエンジニアリングされたｇＲＮＡを含むエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムはｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムで表示した。また、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムを利用したインデルパターンを確認した（図２９）。総合すると、広範囲なｇＲＮＡエンジニアリングを通じて強力でさらにコンパクトなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを開発したし、これを利用して真核細胞で既存ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（すなわち、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム）で達成できなかった高効率のゲノム編集を可能にした。
【0569】
【表13】
【実施例9】
【0570】
＜ｇＲＮＡエンジニアリングによる効果＞
また、本発明者は増加したインデル効率に対するｇＲＮＡエンジニアリング（Ｍ１－Ｍ４）の効果の基礎となる分子メカニズムを調査した。その結果、予想通り、Ｍ１－１は標的ＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって評価されたように、完全な配列でｇＲＮＡの発現を急激に増加させることを確認した（図３０）。対照的にＭ３とＭ４はｇＲＮＡ発現の変化と関連がなかった。Ｍ４に関連してＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は効率的なＲＮＰ形成を誘導した。しかし、Ｍ３の効果に対する具体的な情報を確認することができなかった。ただし、試験管内の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の分解分析を通じて、ＭＳ３エンジニアリングが追加されたエンジニアリングされたｇＲＮＡの場合、二本鎖切断がさらによく発生することを確認することができた。まだ具体的なメカニズムは分からないが、ＭＳ３エンジニアリングによってｇＲＮＡの５'末端に一部の配列が除去されることにより、Ｃａｓ１２ｆ１の標的鎖に対する接近性が増加したものと予測され、ＭＳ３エンジニアリングにより野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの標的鎖に対する低い切断効率を向上させたものと思われる（図３１）。換言すると、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは標的鎖の低効率切断によって主に一本鎖のみ切断するｎｉｃｋを生成して顕著に低いインデル効率を有する。しかし、ＭＳ３エンジニアリングをした場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの切断パターンを変更することなく標的鎖の切断を顕著に増加させて結果的に二本鎖切断による顕著に増加したインデル効果を示した。
また、本発明者は増加したインデル効率に対するｇＲＮＡエンジニアリング（Ｍ１－Ｍ４）の効果の基礎となる分子メカニズムを調査した。その結果、予想通り、Ｍ１－１は標的ＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって評価されたように、完全な配列でｇＲＮＡの発現を急激に増加させることを確認した（図３０）。対照的にＭ３とＭ４はｇＲＮＡ発現の変化と関連がなかった。Ｍ４に関連してＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は効率的なＲＮＰ形成を誘導した。しかし、Ｍ３の効果に対する具体的な情報を確認することができなかった。ただし、試験管内の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の分解分析を通じて、ＭＳ３エンジニアリングが追加されたエンジニアリングされたｇＲＮＡの場合、二本鎖切断がさらによく発生することを確認することができた。まだ具体的なメカニズムは分からないが、ＭＳ３エンジニアリングによってｇＲＮＡの５'末端に一部の配列が除去されることにより、Ｃａｓ１２ｆ１の標的鎖に対する接近性が増加したものと予測され、ＭＳ３エンジニアリングにより野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの標的鎖に対する低い切断効率を向上させたものと思われる（図３１）。換言すると、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは標的鎖の低効率切断によって主に一本鎖のみ切断するｎｉｃｋを生成して顕著に低いインデル効率を有する。しかし、ＭＳ３エンジニアリングをした場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの切断パターンを変更することなく標的鎖の切断を顕著に増加させて結果的に二本鎖切断による顕著に増加したインデル効果を示した。
【実施例10】
【0571】
＜Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１ ａｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｏｒ＞
前記にて実施したｇＲＮＡエンジニアリングは３個の内因性標的に対してのみインデル効率の変化をモニタリングして具現されたので、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（以下で、ｇｅＣａｓ１４ａ１システムと混用して使う）が広範囲な標的に対するゲノム編集が可能であるかどうかを実験した。このために、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ｆ１で編集できるｉｎ ｓｉｌｉｃｏとして５'－ＴＴＴＲ－Ｎ２０－ＮＧＧ－３'配列を有する内因性ターゲットを検索して８８個の内因性遺伝子座を無作為で選択した（図３２～３４）。ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／ＡｓＣａｓ１２ａシステム、ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムまたはｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムを利用したＨＥＫ２９３－Ｔ細胞で形質感染後、ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析を通じて選別した８８個の内因性遺伝子座でのインデル効率を確認した（図３５）。その結果、ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムが標的の９１％（８０／８８）がインデル効率が０.１％未満と示された。しかし、ｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムは広範囲な標的に対するインデル効率を大きく向上させた（図３５）。ｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムの平均効率はＡｓＣａｓ１２ａ（ｐ＞ ０.０５）の効率と略同じであったしＳｐＣａｓ９の効率より若干低かった。
前記にて実施したｇＲＮＡエンジニアリングは３個の内因性標的に対してのみインデル効率の変化をモニタリングして具現されたので、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム（以下で、ｇｅＣａｓ１４ａ１システムと混用して使う）が広範囲な標的に対するゲノム編集が可能であるかどうかを実験した。このために、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ｆ１で編集できるｉｎ ｓｉｌｉｃｏとして５'－ＴＴＴＲ－Ｎ２０－ＮＧＧ－３'配列を有する内因性ターゲットを検索して８８個の内因性遺伝子座を無作為で選択した（図３２～３４）。ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／ＡｓＣａｓ１２ａシステム、ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムまたはｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムを利用したＨＥＫ２９３－Ｔ細胞で形質感染後、ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析を通じて選別した８８個の内因性遺伝子座でのインデル効率を確認した（図３５）。その結果、ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システムが標的の９１％（８０／８８）がインデル効率が０.１％未満と示された。しかし、ｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムは広範囲な標的に対するインデル効率を大きく向上させた（図３５）。ｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムの平均効率はＡｓＣａｓ１２ａ（ｐ＞ ０.０５）の効率と略同じであったしＳｐＣａｓ９の効率より若干低かった。
【0572】
このような大規模分析に対するｂｏｘ－ａｎｄ－ｗｈｉｓｋｅｒプロット（図３６）を通じて次のような結論を導き出した：１）ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａ１システム自体はヒト細胞で平均インデル効率が０.１％未満であり、ゲノム編集ツールへの使用が困難；２）ｇＲＮＡエンジニアリングによるインデル効率の平均増加は５４０倍である；３）ｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムは真核細胞でＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９システムおよびＣＲＩＳＰＲ／ＡｓＣａｓ１２ａシステムと共にゲノム編集ツールとして使うことができる、特にＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９システムおよびＣＲＩＳＰＲ／ＡｓＣａｓ１２ａシステムに比べてｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムがさらに高い効率を示した標的（２６％、２３／８８）があった；４）ｇｅＣａｓ１４ａ１＿３.０システムはＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９システムおよびＣＲＩＳＰＲ／ＡｓＣａｓ１２ａシステムとは異なってＧａｕｓｓｉａｎ分布を示さなかったし、かえって標的が全体範囲のｉｎｄｅｌ効率にさらに均一に分布されている（図３６）。
【実施例11】
【0573】
Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇＲＮＡおよびエンジニアリングされたｇＲＮＡのｃｌｅａｖａｇｅ ｐａｔｔｅｒｎ比較
ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇＲＮＡおよびエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ（ＴＳ）とｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ（ＮＴＳ）のｃｌｅａｖａｇｅ ｐａｔｔｅｒｎをＮＧＳで分析した。その結果、ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇＲＮＡはＮＴＳのｃｌｅａｖａｇｅが相対的によくならないことを確認した。それに反し、エンジニアリングされたｇＲＮＡの場合、ｇＲＮＡがｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇされながらＮＴＳのｃｌｅａｖａｇｅがますます増加することを確認した。また、ＴＳのｃｌｅａｖａｇｅも少しずつ増加することも確認した。このような結果を通じて、エンジニアリングされたｇＲＮＡがＮＴＳとＴＳで発生するｃｌｅａｖａｇｅ差を減らすためｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅを高めるものと理解され得る（図３７）。
ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇＲＮＡおよびエンジニアリングされたｇＲＮＡを利用してｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ（ＴＳ）とｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ（ＮＴＳ）のｃｌｅａｖａｇｅ ｐａｔｔｅｒｎをＮＧＳで分析した。その結果、ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇＲＮＡはＮＴＳのｃｌｅａｖａｇｅが相対的によくならないことを確認した。それに反し、エンジニアリングされたｇＲＮＡの場合、ｇＲＮＡがｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇされながらＮＴＳのｃｌｅａｖａｇｅがますます増加することを確認した。また、ＴＳのｃｌｅａｖａｇｅも少しずつ増加することも確認した。このような結果を通じて、エンジニアリングされたｇＲＮＡがＮＴＳとＴＳで発生するｃｌｅａｖａｇｅ差を減らすためｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅを高めるものと理解され得る（図３７）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
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【図21】
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【図35】
【図36】
【図37】
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【国際調査報告】