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特表2023-544842新規ペプトイド及び慢性疼痛の予防又は治療におけるそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-25
(54)【発明の名称】新規ペプトイド及び慢性疼痛の予防又は治療におけるそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C07K 5/103 20060101AFI20231018BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20231018BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20231018BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20231018BHJP
【ＦＩ】
C07K5/103
C07K7/06
A61K38/07
A61P25/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521558
(86)(22)【出願日】2021-09-30
(85)【翻訳文提出日】2023-04-28
(86)【国際出願番号】 FR2021051694
(87)【国際公開番号】W WO2022074313
(87)【国際公開日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】2010186
(32)【優先日】2020-10-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517124033
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・クレルモン・オーヴェルニュ
(71)【出願人】
【識別番号】504007888
【氏名又は名称】センター ナショナル デ ラ レシェルシェ サイエンティフィーク
(71)【出願人】
【識別番号】522132465
【氏名又は名称】シグマ・クレルモン
(71)【出願人】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】515085211
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ド モンペリエ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ビュセロール，ジェローム
(72)【発明者】
【氏名】ブリネ，エマニュエル
(72)【発明者】
【氏名】タイユフミエール，クロード
(72)【発明者】
【氏名】ロイ，オリビエ
(72)【発明者】
【氏名】ノートン，リオネル
(72)【発明者】
【氏名】アイソーニ，ユセフ
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA16
4C084NA14
4C084ZA08
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA13
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA20
(57)【要約】
本発明は、慢性疼痛、特に末梢神経障害から生じる慢性疼痛の予防及び／又は治療のための新規ペプチド模倣体（又はペプトイド）分子に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の一般式（Ｉ）：【化1】
［式中、
Ｒ１は、独立して、ＣＨ３（Ｌ－Ａｌａ）、ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｖａｌ）、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（Ｌ－Ｉｌｅ）、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｌｅｕ及びＤ－Ｌｅｕ）、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ２（シクロブチル）であり、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２から選択され、
Ｒ４は、以下の：
【化2】
から選択される脂肪族又は芳香族基であり、
Ｒ５は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ４Ｘ（式中、オルト、メタ又はパラ位のＸは独立して、Ｈ、ＯＭｅ、ＣＦ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＮＯ２である）、３－インドリル、３－キノリニルである］のペプトイド。
【請求項2】
以下の式：【化3】
【化4】
のものである、請求項１に記載のペプトイド。
【請求項3】
以下の一般式（ＩＩ）：【化5】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は請求項１で定義したとおりであり、
Ｒ６は、Ｒ３、Ｈ、ＣＯＲ５（式中Ｒ５は上記定義のとおりである）又はＲ７であり、
Ｒ７は、独立して、以下のうちの１つ：
【化6】
である］のペプトイド。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載のペプトイドと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項5】
医薬として使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプトイド又は請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
慢性疼痛の予防又は治療における使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプトイド又は請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記慢性疼痛が神経障害起源のものである、請求項６に記載の使用のためのペプトイド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、慢性疼痛、特に（例えば化学療法によって誘発される）末梢神経障害から生じる慢性疼痛の予防及び／又は治療のための新規ペプチド模倣分子（又はペプトイド、ペプチド－ペプトイドハイブリッド又はペプトマーとも呼ばれる）に関する。
【0002】
以下の説明では、角括弧（［］）での参照は、本文の最後に示される参考文献一覧を指す。
【背景技術】
【0003】
直近技術
慢性疼痛は世界中で１５億人が罹患しており、その者らにとって治療奏功は明らかに不十分である（Ｆｉｎｎｅｒｕｐ ＮＢ ｅｔ ａｌ．，２０１５）［１］。最近の疫学調査は、慢性疼痛は成人の約２０％及び高齢者の５０％が罹患していると推定している（ｖｏｎ Ｈｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）［２］。世界では、疼痛を有する人々の６０％は仕事をする能力が低くなり、２０％が疼痛により仕事を失ったと報告している。同時に、２０１０年に２００億単位の鎮痛薬が販売され、２００５年の１４０億単位から増加した（＋９．３％）。２０１７年には、世界の疼痛市場は６１０億５０００万ドルに達し、２０２３年までに７７１億３０００万ドルに値し、２０１７年から２０２３年まで、４％の年間成長率で成長すると予想されている。
慢性疼痛は世界中で１５億人が罹患しており、その者らにとって治療奏功は明らかに不十分である（Ｆｉｎｎｅｒｕｐ ＮＢ ｅｔ ａｌ．，２０１５）［１］。最近の疫学調査は、慢性疼痛は成人の約２０％及び高齢者の５０％が罹患していると推定している（ｖｏｎ Ｈｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）［２］。世界では、疼痛を有する人々の６０％は仕事をする能力が低くなり、２０％が疼痛により仕事を失ったと報告している。同時に、２０１０年に２００億単位の鎮痛薬が販売され、２００５年の１４０億単位から増加した（＋９．３％）。２０１７年には、世界の疼痛市場は６１０億５０００万ドルに達し、２０２３年までに７７１億３０００万ドルに値し、２０１７年から２０２３年まで、４％の年間成長率で成長すると予想されている。
【0004】
神経障害性疼痛は、全般集団の約７％及び慢性疼痛を有する患者の２５％が罹患している。神経障害性疼痛には２つのタイプ、すなわち、末梢神経障害性疼痛（その起源に応じて、神経叢、根、若しくは幹の領域が関与し得、又は多発性神経障害の状況ではより拡散し得る）及び中枢神経障害性疼痛（感覚経路又は疼痛制御に影響を及ぼす病変）がある。化学療法によって誘発される末梢神経障害は、多くの抗癌剤の頻繁な有害作用であり、この末梢神経障害は、患者の生活の質に対して持続的な作用を有する著しい慢性疼痛を特徴とし、臨床的有効性の低下のリスクを伴う投与量調整をもたらす。より乏しくなりつつある鎮痛薬物類（２０１１年にＤｉ－ａｎｔａｌｖｉｃの撤退）は、古く、多くの場合忍容性の悪い治療を特徴とする。
【0005】
革新は５０年以上にわたって行き詰まっており、提案されている新薬の大部分は、既存の薬物の単純な再製剤又は組み合わせである。最近のメタアナリシスは、ガバペンチン及びデュロキセチンを除いて、神経障害性疼痛に対する治療が今日まで実際に有効ではなく、有効性スコアは依然として低いことを示している（Ｈｅｒｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）［３］。
【0006】
ＨＣＮイオンチャネルのファミリー（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９８；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｓｅｉｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９）［４－６］は、４つのＨＣＮ １～４メンバーを含んでおり、新規心拍数低下薬及び新規な鎮痛薬の開発のための優れた機会を提供し得る。ＨＣＮチャネルは、疼痛経路に広く分布しており、神経障害性疼痛の発症及び維持において重要な役割を果たす（Ｄｕｎｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）［７，８］。非選択的ＨＣＮブロッカーは、神経障害性疼痛のげっ歯類モデルにおいて疼痛症状を減少させることが示されている（Ｄｅｓｃｏｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｙｏｕｎｇ
ｅｔ ａｌ．，２０１４）［９，１０］。しかし、それらの心臓及び視覚副作用（例えば、汎－ＨＣＮブロッカー）により、神経障害性疼痛を治療するためのそれらの使用の臨床的解釈が限定される。
ｅｔ ａｌ．，２０１４）［９，１０］。しかし、それらの心臓及び視覚副作用（例えば、汎－ＨＣＮブロッカー）により、神経障害性疼痛を治療するためのそれらの使用の臨床的解釈が限定される。
【0007】
興味深いことに、ＨＣＮチャネル機能は、心臓において発現されない補助サブユニットであるＲａｂ８ｂ相互作用タンパク質（ＴＲＩＰ８ｂ）によって厳しく調節される。この細胞質タンパク質は、２つの接触部位を介してＨＣＮチャネルサブユニットのＣ末端に結合する（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）［１１］。更に、ＨＣＮ２のＣ末端を表す６つのアミノ酸ペプチドとの複合体におけるＴＲＩＰ８ｂのテトラトリコペプチド（ＴＰＲ）領域の原子構造が、Ｘ線結晶学によって決定された（Ｂａｎｋｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）［１２］。
【0008】
研究の大部分がＨＣＮチャネルに直接作用する阻害剤を開発することに焦点を当てている現在の状況では、ＴＲＩＰ８ｂ及び／又はＴＲＩＰ８ｂ－ＨＣＮ相互作用を標的とすることにより、心臓及び視覚機能に影響を及ぼすリスクなしに疼痛状態におけるＨＣＮ活性を調節する新しい可能性がもたらされ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の説明
本発明は、ＨＣＮチャネルによって誘発される電流（Ｉｈ）の減少をもたらすＴＲＩＰ８ｂ－ＨＣＮ相互作用の破壊が、オキサリプラチンによって誘発される急性及び慢性末梢神経障害のげっ歯類モデルにおいて鎮痛効果を有し得、ヒトの症候学を忠実に再現するという仮説に基づく。
本発明は、ＨＣＮチャネルによって誘発される電流（Ｉｈ）の減少をもたらすＴＲＩＰ８ｂ－ＨＣＮ相互作用の破壊が、オキサリプラチンによって誘発される急性及び慢性末梢神経障害のげっ歯類モデルにおいて鎮痛効果を有し得、ヒトの症候学を忠実に再現するという仮説に基づく。
【0010】
この戦略の有効性の証明は、ＴＲＩＰ８ｂ－ＨＣＮ相互作用を破壊することができる２０，０００分子ライブラリースクリーニングからの分子であるＮＵＣＣ－５９５３を用いて初めて検証された（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）［１３］。こうして、本発明者らは、オキサリプラチン誘発性急性寒冷過敏症が、ＮＵＣＣ－５９５３の髄腔内（図２）又は全身（図３）注射によって用量依存的に反転することを実証した。歩行運動活性の変化は観察されなかった。準備データはまた、ＮＵＣＣ－５９５３の投与が膜アドレッシングを減少させ、ひいては、神経障害の動物において観察されるＨＣＮ１及び２の活性を減少させることを示した（図５Ｂ）。更に、ＮＵＣＣ－５９５３のｉｎ ｖｉｔｒｏ適用は、心臓細胞におけるＨＣＮ活性化誘発電流に対する作用を示さなかった（ＨＣＮチャネルの非特異的ブロッカーとは対照的、図６）。
【0011】
次いで、本発明者らは、２つのタンパク質の相互作用様式に基づいて、ＴＲＩＰ８ｂ－ＨＣＮ相互作用の特異的ブロッカーを設計することを決めた。しかし、タンパク質－タンパク質相互作用（ｐｐｉ）は、細胞機能の全てのレベルで必須の役割を果たし、それらを紛れもなく治療標的にしており、強力なＰＰＩ阻害剤の設計は依然として現実の課題である。低分子量分子は、広くスクリーニングされているが、大きな表面（＞８００Å）を伴う相互作用と競合するのにはあまり適していない。更に、有効な阻害剤を設計するためには、タンパク質／タンパク質認識セグメントをその生物活性「ホットセグメント」立体構造で模倣できることが重要である。ペプチドは、それにより代謝安定性及び立体構造安定性の問題だけでなく、細胞内標的に到達するための細胞透過の問題も解決することができる条件で、これらの新規な阻害剤を設計するために選択される化合物である。
【0012】
次いで、本発明者らは、タンパク質－タンパク質相互作用を標的とする阻害剤の開発に特に適合され、またペプトマー（すなわち、「ペプトイド」モノマー及び「アミノ酸」モノマーを組み合わせたオリゴマー、Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ １９９７［１７］－すなわちペプチド－ペプトイドハイブリッド）とも呼ばれ得る、ペプトイド（Ｎ置換グリシンオリゴマー）の合成を介するペプチド模倣化学物質に目を向けた。
【0013】
これらは合成ペプチド模倣体であり、そのオリゴマー性は、サイズ及び化学的多様性に関して大きなモジュール性を可能にする。
【0014】
それらは、微細な構造設計を可能にし、ペプチドよりも良好な生物学的利用能（プロテアーゼ耐性、より良好な膜透過性、非免疫原性骨格）を有する。
【0015】
このことから、本発明者らは、ＴＲＩＰ８ｂのＴＰＲドメインとＨＣＮのＣ末端との間の相互作用を標的とし、有害な心臓又は視覚作用なしにオキサリプラチン誘発性急性神経障害のモデルにおいて鎮痛効果を発揮することができる新規なペプトイドを設計した。
【0016】
したがって、本発明は、以下の一般式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１は、独立して、ＣＨ３（Ｌ－Ａｌａ）、ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｖａｌ）、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（Ｌ－Ｉｌｅ）、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｌｅｕ及びＤ－Ｌｅｕ）、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ２（シクロブチル）であり、
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、第一級アミンからの合成中に逐次的に組み込まれるペプトイド単位の側鎖であり、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２から選択される］のペプトイドに関する。アルコール又はアミン官能基を有する側鎖は、保護された形態、すなわちアルコール官能基についてはシリルエーテル及びアミン官能基についてはｔｅｒｔ－ブチルカルバメート（Ｂｏｃ）でオリゴマーに組み込まれており、
Ｒ４は、以下の：
から選択される脂肪族又は芳香族基である。
Ｒ５は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ４Ｘ（式中、オルト、メタ又はパラ位のＸは独立して、Ｈ、ＯＭｅ、ＣＦ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＮＯ２である）、３－インドリル、３－キノリニルである。
【化1】
［式中、
Ｒ１は、独立して、ＣＨ３（Ｌ－Ａｌａ）、ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｖａｌ）、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（Ｌ－Ｉｌｅ）、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｌｅｕ及びＤ－Ｌｅｕ）、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ２（シクロブチル）であり、
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、第一級アミンからの合成中に逐次的に組み込まれるペプトイド単位の側鎖であり、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２から選択される］のペプトイドに関する。アルコール又はアミン官能基を有する側鎖は、保護された形態、すなわちアルコール官能基についてはシリルエーテル及びアミン官能基についてはｔｅｒｔ－ブチルカルバメート（Ｂｏｃ）でオリゴマーに組み込まれており、
Ｒ４は、以下の：
【化2】
から選択される脂肪族又は芳香族基である。
Ｒ５は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ４Ｘ（式中、オルト、メタ又はパラ位のＸは独立して、Ｈ、ＯＭｅ、ＣＦ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＮＯ２である）、３－インドリル、３－キノリニルである。
【0017】
有利には、Ｒ４は、以下の：
から選択される脂肪族又は芳香族基である。
【化3】
から選択される脂肪族又は芳香族基である。
【0018】
有利には、Ｒ５は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ４Ｘ（式中、オルト、メタ又はパラ位のＸは、独立して、Ｈ、ＯＭｅ、ＣＦ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌである）、３－インドリル、３－キノリニルである。
【0019】
有利には、本発明のペプトイドは、一般式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１は、独立して、ＣＨ３（Ｌ－Ａｌａ）、ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｖａｌ）、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（Ｌ－Ｉｌｅ）、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｌｅｕ及びＤ－Ｌｅｕ）、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ２（シクロブチル）であり、
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、第一級アミンからの合成中に逐次的に組み込まれるペプトイド単位の側鎖であり、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２から選択される］のペプトイドから選択される。アルコール又はアミン官能基を有する側鎖は、保護された形態、すなわちアルコール官能基についてはシリルエーテル及びアミン官能基についてはｔｅｒｔ－ブチルカルバメート（Ｂｏｃ）でオリゴマーに組み込まれており、
Ｒ４は、以下の：
から選択される脂肪族又は芳香族基である。
Ｒ５は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ４Ｘ（式中、オルト、メタ又はパラ位のＸは、独立して、Ｈ、ＯＭｅ、ＣＦ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌである）、３－インドリル、３－キノリニルである。
［式中、
Ｒ１は、独立して、ＣＨ３（Ｌ－Ａｌａ）、ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｖａｌ）、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（Ｌ－Ｉｌｅ）、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｌｅｕ及びＤ－Ｌｅｕ）、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ２（シクロブチル）であり、
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、第一級アミンからの合成中に逐次的に組み込まれるペプトイド単位の側鎖であり、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２から選択される］のペプトイドから選択される。アルコール又はアミン官能基を有する側鎖は、保護された形態、すなわちアルコール官能基についてはシリルエーテル及びアミン官能基についてはｔｅｒｔ－ブチルカルバメート（Ｂｏｃ）でオリゴマーに組み込まれており、
Ｒ４は、以下の：
【化4】
から選択される脂肪族又は芳香族基である。
Ｒ５は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ４Ｘ（式中、オルト、メタ又はパラ位のＸは、独立して、Ｈ、ＯＭｅ、ＣＦ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌである）、３－インドリル、３－キノリニルである。
【0020】
好ましくは、一般式（Ｉ）の本発明のペプトイドは、第２の単位（Ｃ末端から始まる）上に２個の炭素原子を有する。
【0021】
有利には、本発明のペプトイドは、以下の一般式（Ｉ’）：
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、上記定義のとおりである］のペプトイドから選択される。
【化5】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、上記定義のとおりである］のペプトイドから選択される。
【0022】
特定の実施形態によれば、本発明のペプトイドは、以下の式を有する。
【化6】
【化7】
【0023】
本発明はまた、一般式（Ｉ）のペプトイドの合成のための中間体に関し、当該ペプトイドは３単位を含む。当該合成中間体は、以下の一般式（ＩＩ）：
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上記定義のとおりであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｒ３、ＣＯＲ５（式中Ｒ５は上記定義のとおりである）又はＲ７であり、
Ｒ７は、独立して、
のうちの基である］のペプトイドである。
【化8】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上記定義のとおりであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｒ３、ＣＯＲ５（式中Ｒ５は上記定義のとおりである）又はＲ７であり、
Ｒ７は、独立して、
【化9】
のうちの基である］のペプトイドである。
【0024】
特に、本発明は、Ｒ６がＨである式（ＩＩ）のペプトイドに関する。
【0025】
特に、本発明は、Ｒ６がＣＯＲ５である式（ＩＩ）のペプトイドに関する。
【0026】
特に、本発明は、Ｒ６がＲ７である式（ＩＩ）のペプトイドに関する。
【0027】
特に、本発明は、Ｒ６がＲ３である式（ＩＩ）のペプトイドに関する。
【0028】
有利には、本発明によるペプトイドは、以下の一般式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）及び（ＩＩｄ）：
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、上記定義のとおりである］のペプトイドから選択することができる。
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、上記定義のとおりである］のペプトイドから選択することができる。
【0029】
好ましくは、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）又は（ＩＩｄ）の本発明のペプトイドは、第２の単位（Ｃ末端から始まる）上に２個の炭素原子を有する。有利には、ペプトイドは、以下の式（ＩＩ’）、（ＩＩ’ａ）、（ＩＩ’ｂ）、（ＩＩ’ｃ）又は（ＩＩ’ｄ）：
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、上記定義のとおりである］のペプトイドから選択される。
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、上記定義のとおりである］のペプトイドから選択される。
【0030】
本発明はまた、本発明によるペプトイドと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。
【0031】
本発明はまた、医薬として使用するための、本発明によるペプトイド又は医薬組成物に関する。
【0032】
本発明はまた、慢性疼痛、特に神経障害起源の慢性疼痛、より具体的には例えば化学療
法によって誘発される末梢神経障害性疼痛の予防又は治療に使用するための本発明によるペプトイド又は医薬組成物に関する。
法によって誘発される末梢神経障害性疼痛の予防又は治療に使用するための本発明によるペプトイド又は医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】ビヒクル又はオキサリプラチン（６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）投与の４日後のＤＲＧニューロンにおけるＨＣＮ１（Ａ）、ＨＣＮ２（Ｂ）及びＴＲＩＰ８ｂ（Ｃ）タンパク質の発現を示す。ビヒクル若しくはオキサリプラチン（６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）投与の４日後（Ｄ）又はビヒクル若しくはオキサリプラチンの反復投与（週２回、３週間）後（Ｅ）の脊髄の後角におけるＴＲＩＰ８ｂタンパク質発現、Ｎ＝３／群、マン・ホイットニー検定。
【図2】ビヒクル又はＮＵＣＣ５９５３（０．２μｇ、１μｇ又は５μｇ、髄腔内）で処置したＯＩＰＮ（オキサリプラチン誘発性神経障害モデルマウス）（ｎ＝８）における、（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時閾値（秒）の平均±ＳＥＭの時間的推移及び（Ｃ）用量依存的鎮痛作用の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｖｓ。群、二元配置分散分析（Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図3】ビヒクル、ＮＵＣＣ５９５３（４ｍｇ／ｋｇ、皮下）又はデュロキセチン（３０ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝８）における、（Ａ）試験デザイン、（Ｂ）足浸漬潜時（秒）の平均±ＳＥＭの時間的推移及び（Ｃ）用量依存的鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、ｓｅｃ．ｍｉｎ）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図4】ビヒクル又はＮＵＣＣ５９５３（４ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置し、速度を速めながら（１０分かけて４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで）ロータロッド試験に供したマウスの転倒までの潜時（Ａ）及び転倒する速度（Ｂ）を示すヒストグラムを表す。
【図5】ビヒクル（Ｖ）、オキサリプラチン（Ｏ）、又はオキサリプラチン＋ＮＵＣＣ５９５３（５ｎｍｏｌ、髄腔内）（Ｎ）で処置した動物由来のＤＲＧにおけるＨＣＮ１、ＨＣＮ２、及びＴＲＩＰ８ｂの（Ａ）試験設計、（Ｂ）細胞内（膜）発現を表す。
【図6】イバブラジン（ＶＩＡ）とは対照的に、Ｉｆ電流振幅に対するＮＵＣＣ５９５３の作用の欠如を表す。
【図7】マウスの心拍数（ＨＲ）を表す：（Ａ）ベースライン値、（Ｂ）ＮＵＣＣ５９５３（４ｍｇ／ｋｇ、皮下）の注射後３０分間の平均心拍数、及び（Ｃ）３０分の終わりの平均値。値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図8】ＳＮＬペプチドと相互作用するＴＲＩＰ８ｂの分子動力学を表す。
【図9】ビヒクル又はペプトイドＹＣ５５（０．２、１又は５μｇ、髄腔内）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝８）における、（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時（秒）の平均±ＳＥＭの時間的推移、及び（Ｃ）用量依存的鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析（Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図10】ビヒクル又はペプトイドＹＣ５５（２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝８）における、（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時閾値（秒）の平均±ＳＥＭの時間的推移及び（Ｃ）用量依存的鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析（Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図11】ビヒクル、ＹＣ５５（２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ、皮下）、又はバリウム（２．５ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置し、速度を速めたロータロッド試験（１０分かけて４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで）に供したマウスの転倒までの潜時（Ａ）及び転倒する速度（Ｂ）を示すヒストグラムを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１所与の分子について、投与３０分後のＴ（■）対Ｔ０（□）のスチューデントｔ検定。
【図12】ビヒクル又はペプトイドＹＣ５５（０．２、１又は５μｇ、髄腔内）で処置したＰＴＸラット（ｎ＝７～９）の（Ａ）試験設計、（Ｂ）機械的閾値（ｇ）及び足浸漬潜時閾値（秒）の平均±ＳＥＭの時間的推移、並びに（Ｃ）曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ事後検定
【図13】ビヒクル（●）又はペプトイドＹＣ５５（■）（５μｇ、髄腔内）で処置した神経障害性ラット（ｎ＝７～９）の足浸漬潜時閾値（秒単位）の（Ａ）試験設計、（Ｂ）平均±ＳＥＭの時間的推移を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図14】ビヒクル又はペプトイドＭＰ２０８、ＭＰ４０５、若しくはＹＣ５５（５μｇ、髄腔内）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝７～９）の（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時閾値（秒単位）の平均±ＳＥＭの時間的推移、及び（Ｃ）鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析（Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図15】ビヒクル又はペプトイドＭＰ３７６、ＭＰ３５４、若しくはＭＰ３４１（１０ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝７～９）の（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時閾値（秒）の平均±ＳＥＭの時間的推移、及び（Ｃ）鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析（Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図16】ビヒクル又はペプトイドＬＦ１０８、ＬＦ３０６、若しくはＬＦ１８８（５μｇ、髄腔内）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝７～９）の（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時閾値（秒単位）の平均±ＳＥＭの時間的推移、及び（Ｃ）鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析（Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図17】ビヒクル又はペプトイドＬＦ２９５、ＬＦ４００、若しくはＬＦ３２９（５μｇ、髄腔内）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝７～９）の（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時閾値（秒単位）の平均±ＳＥＭの時間的推移及び（Ｃ）鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析（Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図18】ビヒクル又はペプトイドＬＦ１２６、ＬＦ２６１若しくはＬＦ２７５（５μｇ、髄腔内）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝７～９）の（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時閾値（秒単位）の平均±ＳＥＭの時間的推移、及び（Ｃ）鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析（Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図19】ビヒクル又はペプトイドＬＦ２２２、ＬＦ２３９、若しくはＬＦ１７６（５μｇ、髄腔内）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝７～９）の（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時閾値（秒単位）の平均±ＳＥＭの時間的推移及び（Ｃ）鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析（Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【図20】ビヒクル又はペプトイドＬＦ３６９（５μｇ、髄腔内）で処置したＯＩＰＮマウス（ｎ＝７～９）の（Ａ）試験設計、（Ｂ）足浸漬潜時閾値（秒）の平均±ＳＥＭの時間的推移及び（Ｃ）鎮痛効果の曲線下面積（ＡＵＣ、秒．分）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ビヒクル群、二元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ事後検定。
【発明を実施するための形態】
【0034】
鎮痛剤の分野における治療の革新が停滞している状況において、本発明のペプトイド及びそれらの治療可能性は、抗癌薬によって誘発される神経障害性疼痛に罹患している患者の生活の質及び場合によりその患者らの生存の改善に対して著しい影響を及ぼし得る。更に、ＨＣＮチャネルはまた、様々な神経障害性及び炎症性の疼痛状態の病因に関与するので、本発明のペプトイドにより、様々な型の慢性疼痛に対してより広範に活性である新しいクラスの鎮痛薬のための道が敷かれる。
【実施例】
【0035】
実施例１：材料及び方法
動物
実験を、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）によって提供された２０～２４ｇの雄Ｃ５７Ｂｌ／６ＪＲｊマウス又は１５０～１７５ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに対して行い、１２時間の明／暗サイクルで維持し、適宜給餌及び給水を行った。行動実験を、所与の試験について同じ実験者によって静かな部屋で盲検的に実施し、動物の不快感を最小限に抑えるか又は回避するように細心の注意を払った。全ての動物飼育手順は、地元の飼育倫理委員会によって承認され、実験を、欧州共同体によって提供された動物飼育の管理及び使用に関するガイドライン（Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ
２０１０／６３／ＥＵ）に従って実施した。
動物
実験を、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）によって提供された２０～２４ｇの雄Ｃ５７Ｂｌ／６ＪＲｊマウス又は１５０～１７５ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに対して行い、１２時間の明／暗サイクルで維持し、適宜給餌及び給水を行った。行動実験を、所与の試験について同じ実験者によって静かな部屋で盲検的に実施し、動物の不快感を最小限に抑えるか又は回避するように細心の注意を払った。全ての動物飼育手順は、地元の飼育倫理委員会によって承認され、実験を、欧州共同体によって提供された動物飼育の管理及び使用に関するガイドライン（Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ
２０１０／６３／ＥＵ）に従って実施した。
【0036】
行動試験
Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験：機械的感受性を、０．０７ｇ、０．６ｇ又は１．４ｇの較正Ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを用いて評価した。後足の足の裏の表面に対して垂直に、剛性が増加する順にフィラメントを５回適用し、それらが曲がるまで押した。所与のフィラメント力に対する応答数を計数した。
Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験：機械的感受性を、０．０７ｇ、０．６ｇ又は１．４ｇの較正Ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを用いて評価した。後足の足の裏の表面に対して垂直に、剛性が増加する順にフィラメントを５回適用し、それらが曲がるまで押した。所与のフィラメント力に対する応答数を計数した。
【0037】
浸漬試験：収縮が観察されるまで、尾又は足を１０℃又は４６℃に設定した水浴中に浸漬した（カットオフ時間：３０秒）。逃避潜時の２回の別々の測定の平均を計算した（Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｎｉｍｅｇｅｅｒｓ＆Ｄｏｎｙ，１９６３）［１４］。
【0038】
ラットにおける足圧試験：ラットを、Ｒａｎｄａｌｌ及びＳｅｌｉｔｔｏ（１９５７）［１５］によって以前に記載された足圧試験に供した。疼痛の徴候（鳴き出し閾値）が得られるまで（カットオフは７５０ｇであった）、ラットの右後足に圧力を高めて加えることによって、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ鎮痛計（Ａｐｅｌｅｘ、プローブ先端直径１ｍｍ、重量３０ｇ）を用いて、グラム単位で表される侵害受容閾値を測定した。処置の前に、ラットを足の圧力にさらすことなく取り扱うことによって、ラットを試験に慣れさせた。次いで、２つの連続した安定鳴き出し閾値を得た後、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、及び１２０分後に治療効果を評価した。結果は、鳴き出し閾値としてグラム単位で表される。全体的な効果を調査するために、鎮痛効果の時間的推移曲線下面積（ＡＵＣ、ｇ．分）を、台形法を使用して、各時点での個々のスコアから計算した。データを、二元配置分散分析、続いてボンフェローニ検定によって分析し、その際、効果の時間的推移を試験した。一元配置分散分析、続いてＳｔｕｄｅｎｔ Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ検定を使用して、ＣＳＡによって決定された異なる処置の効果を分析した。統計的有意性のレベルをｐ＜０．０５に設定した。
【0039】
ロータロッド試験：ロータロッド試験（Ｂｉｏｓｅｂ）のために、動物を最初に固定シリンダー上に１０分間留まるように慣らした後、４ｒｐｍの回転速度で更に１０分間に切り替えた。訓練直後に動物に薬物を与え、３０分後に試験を行った。試験は、５分間にわたって回転を４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで線型的に速めながら、動物が転倒するまでの潜時を測定することからなっていた。３回の試行にわたる２つの最も近い値の平均を計算し
た。
た。
【0040】
Ｉｎ ｖｉｖｏ心拍数記録：ＥＣＧ遠隔測定記録を、以前に公開されたように（Ｍｅｓｉｒｃａら、２０１４年）［２７］、胸郭上に配置された対のワイヤ電極を有する、皮下パウチ内のＴＡ１０ＥＡ－Ｆ２０遠隔測定送信機（ＤＳＩ）を使用して実施した。
【0041】
動物疼痛モデル
マウスにおけるオキサリプラチン誘発性急性神経障害：マウスに、最初の行動評価の直後に、５％グルコースに溶解した６ｍｇ／ｋｇオキサリプラチンを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ピーク痛覚過敏に達するのに必要な時間に対応する、薬物投与の９０時間後（Ｄｅｓｃｏｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）［９］に、低温感受性及び機械的感受性の第２の評価を行った。
マウスにおけるオキサリプラチン誘発性急性神経障害：マウスに、最初の行動評価の直後に、５％グルコースに溶解した６ｍｇ／ｋｇオキサリプラチンを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ピーク痛覚過敏に達するのに必要な時間に対応する、薬物投与の９０時間後（Ｄｅｓｃｏｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）［９］に、低温感受性及び機械的感受性の第２の評価を行った。
【0042】
ラットにおける急性パクリタキセル誘発性神経障害：ラットにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；溶媒）又は１ｍｇ／ｋｇ／１ｍＬのパクリタキセル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を０日目（Ｄ０）、２日目（Ｄ２）、４日目（Ｄ４）、及び７日目（Ｄ７）に腹腔内注射した。最初のパクリタキセル注射の日（Ｄ０）並びにパクリタキセル注射後１０日目（Ｄ１０）及び１４日目（Ｄ１４）に、行動試験を行った。
【0043】
ラットにおける脊髄神経結紮誘発神経障害：Ｋｉｍ及びＣｈｕｎｇ（１９９２）［１６］の手順に従って、ラットを仰臥位に置き、１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン及び７５ｍｇ／ｋｇのケタミン（ｉ．ｐ）で麻酔した。次いで、脊椎の左側の毛を剃り、皮膚を露出させた。皮膚を脊椎に平行に切り、傍脊椎筋を分離した。Ｌ５脊髄神経が露出するまで、Ｌ５横骨端を除去した。Ｌ５神経を単離し、絹糸で結紮した。最後に、筋肉及び皮膚切開部を縫合し、創傷をヨードフォア及び７５％のエチルアルコールで消毒した。偽群において、ラットは、神経結紮を伴わない同じ外科手術を受けた。
【0044】
Ｅｘ ｖｉｖｏ試験
ＲＮＡ単離及び定量：腰椎セグメントＬ４～Ｌ６からのＤＲＧ対を切除し、プールした。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬）（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の指示書に従って使用して、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ品質をＡｇｉｌｅｎｔ
２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって評価し、８超のＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）を有する試料を更なる分析のために保持した。逆転写を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供されるプロトコルに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を用いて行った。リアルタイム定量的ＰＣＲのために、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡキット（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して増幅を行い、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌｐｌｅｘサーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いてリアルタイムでＤＮＡの量を測定した。各三連におけるｃＤＮＡの相対量を、標準濃度曲線を用いて平均し、ＧＵＳ遺伝子ｃＤＮＡに対して正規化した。
ＲＮＡ単離及び定量：腰椎セグメントＬ４～Ｌ６からのＤＲＧ対を切除し、プールした。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬）（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の指示書に従って使用して、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ品質をＡｇｉｌｅｎｔ
２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって評価し、８超のＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）を有する試料を更なる分析のために保持した。逆転写を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供されるプロトコルに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を用いて行った。リアルタイム定量的ＰＣＲのために、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡキット（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して増幅を行い、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌｐｌｅｘサーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いてリアルタイムでＤＮＡの量を測定した。各三連におけるｃＤＮＡの相対量を、標準濃度曲線を用いて平均し、ＧＵＳ遺伝子ｃＤＮＡに対して正規化した。
【0045】
増幅条件は以下のとおりであった：９５℃で７分間のプレインキュベーション、続いて、９５℃で２０秒間及びプライマー対の特異的ハイブリダイゼーション温度で２０秒間、続いて７２℃で２０秒間を５０サイクル。
【0046】
ＲＮＡ配列決定：本発明者らは、オキサリプラチン（３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）又はビヒクルで週２回３週間処置したマウス由来のＬ４－Ｌ５－Ｌ６ ＤＲＧに対するＲＮＡ配列決定分析を使用した。実験の最後（Ｄ２１）に、マウスを麻酔して殺し、Ｌ４－Ｌ５－Ｌ６ ＤＲＧを迅速に採取し、液体窒素中で凍結し、使用するまで－８０℃で保存した。Ｌ４－Ｌ５－Ｌ６ ＤＲＧからの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ
Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、リボソームＲＮＡを、Ｒｉｂｏ－０ Ｐｌｕｓ ｒＲＮＡ枯渇キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して除去した。Ｔａｋｅ３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（Ｅｐｏｃｈ，ＢｉｏＴｅｋ，ＵＳＡ）を使用してＲＮＡ濃度を決定した。ＲＮＡの完全性をキャピラリー電気泳動装置（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標））によって分析し、Ｆａｓｔｅｒｉｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆａｓｔｅｒｉｓ．ｃｏｍ）をＲＮＡ配列決定に使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑプロトコルを使用してライブラリーを調製し、ＨｉＳｅｑ ２５００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＳＢＳベースの配列決定を行った。分析を様々なステップで行った。スプライス部位マッピング（ＴｏｐＨａｔ２）、計数（ＨＴＳｅｑ－ｃｏｕｎｔ）、フィルタリング、正規化（ｅｄｇｅＲ、ＤＥＳｅｑ及びＤＥＳｅｑ２）並びに差次的解析（ｅｄｇｅＲ、ＤＥＳｅｑ及びＤＥＳｅｑ２）を、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｂｅｒｔｉｎ及びＹｏａｎ Ｒｅｎａｕｄ（ＧＲＥｄ、Ｃｌｅｒｍｏｎｔ－Ｆｅｒｒａｎｄ）によって行った。
Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、リボソームＲＮＡを、Ｒｉｂｏ－０ Ｐｌｕｓ ｒＲＮＡ枯渇キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して除去した。Ｔａｋｅ３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（Ｅｐｏｃｈ，ＢｉｏＴｅｋ，ＵＳＡ）を使用してＲＮＡ濃度を決定した。ＲＮＡの完全性をキャピラリー電気泳動装置（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標））によって分析し、Ｆａｓｔｅｒｉｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆａｓｔｅｒｉｓ．ｃｏｍ）をＲＮＡ配列決定に使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑプロトコルを使用してライブラリーを調製し、ＨｉＳｅｑ ２５００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＳＢＳベースの配列決定を行った。分析を様々なステップで行った。スプライス部位マッピング（ＴｏｐＨａｔ２）、計数（ＨＴＳｅｑ－ｃｏｕｎｔ）、フィルタリング、正規化（ｅｄｇｅＲ、ＤＥＳｅｑ及びＤＥＳｅｑ２）並びに差次的解析（ｅｄｇｅＲ、ＤＥＳｅｑ及びＤＥＳｅｑ２）を、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｂｅｒｔｉｎ及びＹｏａｎ Ｒｅｎａｕｄ（ＧＲＥｄ、Ｃｌｅｒｍｏｎｔ－Ｆｅｒｒａｎｄ）によって行った。
【0047】
膜分画：組織を、プロテアーゼ阻害剤を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、３２０ｍＭスクロース、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ）中、４℃でホノジナイズし、超音波処理し、４℃で１５分間、１０００ｇで遠心分離した。ペレットを廃棄した。オルガネラスピンについては、上清を４℃で１０分間、１５，０００ｇで遠心分離し、オルガネラペレットを保持した。細胞質スピンについては、上清を４℃で１時間、１００，０００ｇで遠心分離した。細胞質画分は上清中にあり、膜画分はペレット中にあった。次いで、膜ペレットをＳＢ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、１Ｍ ＫＩ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、４℃）に再懸濁し、４℃で１時間、１００，０００ｇで遠心分離して、弱く結合した膜タンパク質を除去した。次いで、膜画分を、Ｔｒｉｔｏｎ（１％）及びプロテアーゼ阻害剤を含有するＲＢ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ）中に再懸濁した。氷浴で超音波処理した後、続いて膜画分を４℃で２時間穏やかに撹拌した。可溶化した膜画分を、４℃で１時間、１００，０００ｇで遠心分離した。膜画分は上清中にあった。
【0048】
ウェスタンブロット：３匹のマウスからのＬ４～Ｌ６ ＤＲＧをプールし、トリトン（１％）及びプロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液中でホノジナイズした。ホモジネートを４℃で２０分間、１８，０００ｇで遠心分離し、上清を回収した。５０μｇの総タンパク質を、７．５％ゲル上のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。一次抗体を、ニトロセルロース膜に移し、ＢＳＡ（５％）で飽和させた後、ＨＣＮ１及びＨＣＮ２（Ｎｅｕｒｏｍａｂ）については１／５００、ＴＲＩＰ８ｂ（Ｎｅｕｒｏｍａｂ）については１／１０００、アクチン （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）については１／５０００の希釈で使用した。ＴＢＳＴで３回連続して洗浄した後、対応するＨＲＰ結合二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を１：１０，０００希釈でインキュベートし、化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で検出した。
【0049】
パッチクランプ記録：電気生理学的実験を、以前に記載されたように（Ｍａｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）［２８］、単離されたペースメーカー心臓細胞に対して行った。Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ａ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ ＵＳＡ）を用いて、ＨＣＮチャネルによって生成されたＩｆ電流を記録した。約５ｍＭΩの抵抗の記録電極を、ｍＭ／Ｌ：Ｋ＋－アスパラギン酸塩、１３０ｍＭ／Ｌ；ＮａＣｌ、１０ｍＭ／Ｌ；ＡＴＰ－Ｎａ＋塩、２ｍＭ／Ｌ；クレアチンリン酸、６．６ｍＭ／Ｌ；ＧＴＰ－Ｍｇ２＋、０．１ｍＭ／Ｌ；ＣａＣｌ２、０．０４ｍＭ／Ｌ（ＰＣａ＝７）；Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ、１０ｍＭ／Ｌ；（ＫＯＨでｐＨ＝７．２）を含有する細胞内溶液で充填した。ＩＫ１電流
を遮断するために５ｍＭ ＢａＣｌ２を含有する、Ｔｙｒｏｄｅ細胞外溶液を使用した。Ｉｆ電流振幅及び動態に対するＮＵＣＣ５９５３（５μＭ）の作用を、イバブラジン（３μＭ）の作用と、両方とも細胞外溶液中で希釈して比較した。データ取得を、ｐＣｌａｍｐソフトウェア（ｖｅｒ．９，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を使用して行った。
を遮断するために５ｍＭ ＢａＣｌ２を含有する、Ｔｙｒｏｄｅ細胞外溶液を使用した。Ｉｆ電流振幅及び動態に対するＮＵＣＣ５９５３（５μＭ）の作用を、イバブラジン（３μＭ）の作用と、両方とも細胞外溶液中で希釈して比較した。データ取得を、ｐＣｌａｍｐソフトウェア（ｖｅｒ．９，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を使用して行った。
【0050】
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
蛍光偏光アッセイ：蛍光偏光（ＦＰ）に基づくアッセイを使用して、公開されているように（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）［１３］、ＨＣＮとＴＲＩＰ８ｂ尾部との間の相互作用を破壊することができる化合物を特定した。
蛍光偏光アッセイ：蛍光偏光（ＦＰ）に基づくアッセイを使用して、公開されているように（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）［１３］、ＨＣＮとＴＲＩＰ８ｂ尾部との間の相互作用を破壊することができる化合物を特定した。
【0051】
実施例２：結果
初めて、ＴＲＩＰ８ｂ ｍＲＮＡの存在（ＤＲＧマウスから得られたＲＮＡｓｅｑデータは、スプライスバリアント２～５：ＮＭ＿０１１６３５１６、ＮＭ＿０１１６３５１７、ＮＭ＿０１２８９５０５、ＮＭ＿０１３１０４６０の存在（ＦＰＫＭ＞１）を示した）、並びにマウスのＤＲＧ及びＴＧニューロンにおけるタンパク質が観察された。加えて、ＨＣＮ１－２チャネル及びＴＲＩＰ８ｂの転写物及びタンパク質発現は、対照と比較してオキサリプラチン処置動物の末梢ニューロンにおいて有意に増加し、これは、ＯＩＰＮ（オキサリプラチン誘発性神経障害モデルマウス）の発生における２つのタンパク質の関与を示唆する（図１ Ａ～Ｃ）。オキサリプラチン対ビヒクルの単回投与で（図１Ｄ）又は反復投与後（図１Ｅ）に処置した動物の脊髄におけるＴＲＩＰ８ｂタンパク質発現の分析は、オキサリプラチンの作用下でのＴＲＩＰ８ｂタンパク質の明らかな増加を示す。
初めて、ＴＲＩＰ８ｂ ｍＲＮＡの存在（ＤＲＧマウスから得られたＲＮＡｓｅｑデータは、スプライスバリアント２～５：ＮＭ＿０１１６３５１６、ＮＭ＿０１１６３５１７、ＮＭ＿０１２８９５０５、ＮＭ＿０１３１０４６０の存在（ＦＰＫＭ＞１）を示した）、並びにマウスのＤＲＧ及びＴＧニューロンにおけるタンパク質が観察された。加えて、ＨＣＮ１－２チャネル及びＴＲＩＰ８ｂの転写物及びタンパク質発現は、対照と比較してオキサリプラチン処置動物の末梢ニューロンにおいて有意に増加し、これは、ＯＩＰＮ（オキサリプラチン誘発性神経障害モデルマウス）の発生における２つのタンパク質の関与を示唆する（図１ Ａ～Ｃ）。オキサリプラチン対ビヒクルの単回投与で（図１Ｄ）又は反復投与後（図１Ｅ）に処置した動物の脊髄におけるＴＲＩＰ８ｂタンパク質発現の分析は、オキサリプラチンの作用下でのＴＲＩＰ８ｂタンパク質の明らかな増加を示す。
【0052】
ＴＲＩＰ８ｂ－ＨＣＮ相互作用を破壊することができる分子であるＮＵＣＣ５９５３（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）［１３］を使用して、オキサリプラチン誘発性急性寒冷過敏症が、髄腔内（０．２）；１５μｇ／マウス；図２）又は全身的（４ｍｇ／ｋｇ；図３）のいずれかで用量依存的に逆転され得ることが示された。
【0053】
ＮＵＣＣ５９５３（４ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与してマウスを処置した場合、ロータロッド試験において歩行運動活性の変化は観察されなかった（図４）。
【0054】
同時に、準備データはまた、ＮＵＣ５９５３の投与が、ＯＩＰＮ動物由来のＤＲＧニューロンの膜画分におけるＨＣＮ１及び２並びにＴＲＩＰ８ｂタンパク質の過剰発現を減少させることを示唆している（図５）。
【0055】
単離された心臓ペースメーカー細胞に対するパッチクランプ実験は、汎－ＨＣＮブロッカーであるイバブラジンとは対照的に、Ｉｆ電流振幅に対するＮＵＣＣ５９５３の作用を示さなかった（図６）。
【0056】
鎮痛用量（４ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で投与した場合、ＮＵＣＣ５９５３は心拍数にｉｎ
ｖｉｖｏで影響を及ぼさない（図７）。結果は、平均心拍数が、ＮＵＣＣ５９５３注射前（Ａ）、注射時（Ｂ）及び注射３０分後（Ｃ）の３匹のマウスにおいて変化しないことを示す。
ｖｉｖｏで影響を及ぼさない（図７）。結果は、平均心拍数が、ＮＵＣＣ５９５３注射前（Ａ）、注射時（Ｂ）及び注射３０分後（Ｃ）の３匹のマウスにおいて変化しないことを示す。
【0057】
実施例３：ペプチド模倣体の設計
ペプチド模倣体の設計
四量体ペプチド模倣体
ＨＣＮ２チャネルのカルボキシ末端の配列を模倣するペプチド模倣化合物を設計し、合成した。これらのペプチド模倣体の設計は、タンパク質データベース（ｐｄｂ：４ ＥＱＦ）において入手可能な、ＨＣＮ２のＣ末端領域とのＴＲＩＰ８ｂの共結晶の広範なＸ線
構造試験に基づいた。この構造を完成させ、改良するための準備モデリング作業を行った。欠損部分を、ＴＲＩＰ８ｂと３０～６０％の範囲の配列同一性を示す異なるＰＥＸ５構造（ＰＤＢ：１ＦＣＨ、３Ｒ９Ａ、４ＫＸＫ、４ＫＹＯ、２Ｊ９Ｑ、２Ｃ０Ｍ及び２Ｃ０Ｌ）からの配列相同性によってモデル化した。得られたモデルにより、ＨＣＮ－ＴＲＩＰ８ｂ複合体の形成に関与する残基間の接触を特定した。特に、本試験は、ＴＲＩＰ８ｂのＴＰＲドメインにおける２つの疎水性ポケットを特定するものであり、この２つの疎水性ポケットは、このタンパク質ドメインに対するリガンドの良好な親和性に必須である（図８）。
ペプチド模倣体の設計
四量体ペプチド模倣体
ＨＣＮ２チャネルのカルボキシ末端の配列を模倣するペプチド模倣化合物を設計し、合成した。これらのペプチド模倣体の設計は、タンパク質データベース（ｐｄｂ：４ ＥＱＦ）において入手可能な、ＨＣＮ２のＣ末端領域とのＴＲＩＰ８ｂの共結晶の広範なＸ線
構造試験に基づいた。この構造を完成させ、改良するための準備モデリング作業を行った。欠損部分を、ＴＲＩＰ８ｂと３０～６０％の範囲の配列同一性を示す異なるＰＥＸ５構造（ＰＤＢ：１ＦＣＨ、３Ｒ９Ａ、４ＫＸＫ、４ＫＹＯ、２Ｊ９Ｑ、２Ｃ０Ｍ及び２Ｃ０Ｌ）からの配列相同性によってモデル化した。得られたモデルにより、ＨＣＮ－ＴＲＩＰ８ｂ複合体の形成に関与する残基間の接触を特定した。特に、本試験は、ＴＲＩＰ８ｂのＴＰＲドメインにおける２つの疎水性ポケットを特定するものであり、この２つの疎水性ポケットは、このタンパク質ドメインに対するリガンドの良好な親和性に必須である（図８）。
【0058】
ＴＲＩＰ８ｂの疎水性ポケット１により、リガンドのＣ末端残基を固定する側鎖が得られる。リガンドと、ＨＣＮのＣＮＢＤドメインに対する結合部位として特定されたＴＲＩＰ８ｂの中央領域付近に位置する疎水性ポケット２との効果的な相互作用もまた、阻害剤の親和性を増強する。これらの疎水性ポケットを標的とすることができる様々な側鎖を有するいくつかの４残基ペプチド－ペプトイドハイブリッドオリゴマーを設計し、分子動力学（ＭＤ）によって評価した。
【0059】
構造に基づく設計により、ＴＲＩＰ８ｂのＳＮＬペプチド結合部位（ＴＰＲドメイン）で相互作用するペプチド模倣リガンドが特定された。これらのリガンドは、上記のＬＦ１０８の式又は以下の一般式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、上記定義のとおりである］によって表される式を有する。
【化19】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、上記定義のとおりである］によって表される式を有する。
【0060】
この化合物は、ペプチド－ペプトイドハイブリッドオリゴマー（ペプトマー）であるＯｓｔｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）［１７］。これらは、配列のＣ末端に配置されたα－アミノ酸を含む４つの残基、及び３つの連続したペプトイド残基を含む。第３の残基（Ｎ末端から）は、β－ペプトイド単位又はα－ペプトイド単位のいずれかである。概して「ペプトイド」と呼ばれるα－ペプトイドは、Ｎ－置換グリシンオリゴマーを指す（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）［１８］。ペプチドと比較して、側鎖は、α－炭素原子ではなくアミド結合の窒素原子に結合している。β－ペプトイドは、Ｎ－置換β－アミノプロピオン酸単位から構成されるオリゴマーである（Ｈｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）［１９］。したがって、β－ペプトイド残基は、α－ペプトイド残基と比較して骨格中に追加のメチレン基を含有する。ペプトイドは、生物活性化合物の開発に有利な特徴を有する。それらは、各々の新規な単位が２ステップで構築される、段階を踏む「サブモノマー」アプローチを使用して、固相合成に適している（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）［２０］。ペプトイドは、多種多様な側鎖、タンパク質構成側鎖及び非天然側鎖の両方を組み込み得る（Ｃｕｌｆ ｅｔ ａｌ．，２０１０）［２１］。「サブモノマー」合成では、単純な出発分子、例えば、α－単位の構築のためにはブロモ酢酸及び第一級アミン、並びにβ－ペプトイド単位の構築のためには塩化アクリロイル及び第一級アミンを使用する。側鎖が組み込まれる第一級アミンは、何百もが市販
されているか、又は適切な場合にはそれらの使用前に調製することができる。Ｎ，Ｎ－二置換アミド（第三級アミド）に基づくペプトイド骨格は、プロテアーゼに耐性であることが示されている（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）［２２］。第三級アミド結合の存在はまた、それらに、より良好な細胞透過性を与え（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｖｏｌｌｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）［２３、２４］、いくつかの試験では、ペプトイドがペプチドよりも免疫原性が低いことを示す傾向がある（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｃｈｏｎｇｓｉｒｉｗａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８）［２５、２６］。
されているか、又は適切な場合にはそれらの使用前に調製することができる。Ｎ，Ｎ－二置換アミド（第三級アミド）に基づくペプトイド骨格は、プロテアーゼに耐性であることが示されている（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）［２２］。第三級アミド結合の存在はまた、それらに、より良好な細胞透過性を与え（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｖｏｌｌｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）［２３、２４］、いくつかの試験では、ペプトイドがペプチドよりも免疫原性が低いことを示す傾向がある（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｃｈｏｎｇｓｉｒｉｗａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８）［２５、２６］。
【0061】
合成を、２－クロロトリチルクロライド（２－ＣＴＣ）樹脂上で行い、切断後にペプトマーのＣ末端にカルボン酸をもたらした。支持体上に固定化された第１の残基であるα－アミノ酸は、ＳＮＬペプチドのＣ末端に対応するＬ－ロイシンをはじめとする、疎水性タンパク質構成アミノ酸の群から主に選択された。α－アミノ酸を、保護されたＮ－Ｆｍｏｃ形態で樹脂上に固定化した。Ｆｍｏｃ基の除去後、ペプトイド残基による鎖伸長を、「サブモノマー化学」アプローチによって達成した。既知のプロトコルを実施したが、β－ペプトイドモノマーの合成にはいくつかの技術的調整が必要であった。Ｎ末端をアシル化した後、酸性条件下でヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を用いて切断し、ジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて側鎖を脱保護した。
【0062】
粗ペプトマー化合物をＬＣ－ＭＳによって分析し、次いで２１４ｎｍ及び２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いてＣ１８フラッシュクロマトグラフィーカートリッジで精製した。純粋な画分を回収し、凍結乾燥した。純粋な化合物を、Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ（登録商標）Ｃ４カラム（５μｍ、３００Å、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）での逆相ＨＰＬＣによって分析した。以下の表２に、化合物のＨＲＭＳ及びＨＰＬＣデータを示す。
ａＬＣＭＳ。ＵＨＰＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣ鎖（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｋｉｎｅｔｅｘ ＥＶＯ Ｃ１８カラム（１００×２．１ｍｍ、１．７μｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、流量：０．４５ｍＬ／分、カラムオーブン：３０℃、Ｈ２Ｏ勾配（０．１％ギ酸／ＡＣＮ（０．１％ギ酸）：ｔ＝０分９５：５；ｔ＝７．５分１：９９、ｔ＝８．５分１：９９；ｔ＝９分９５：５；ｔ＝１１分９５：５。
ｂＨＰＬＣ。Ｓｅｒｉｅｓ １１００ Ａｇｉｌｅｎｔ鎖、Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ（登録商標）Ｃ４カラム（５μｍ、３００Å、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）、流速０．５ｍＬ／分。Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ勾配（０．１％ＴＦＡ）：ｔ＝０分９５：５；ｔ＝５分９５：５；ｔ＝２５分５：９５；ｔ＝３５分５：９５、ｔ＝４０分９５：５、ｔ＝５０分９５：５。
ｃＵＶ ２１４ｎｍ検出。
【表1】
ａＬＣＭＳ。ＵＨＰＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣ鎖（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｋｉｎｅｔｅｘ ＥＶＯ Ｃ１８カラム（１００×２．１ｍｍ、１．７μｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、流量：０．４５ｍＬ／分、カラムオーブン：３０℃、Ｈ２Ｏ勾配（０．１％ギ酸／ＡＣＮ（０．１％ギ酸）：ｔ＝０分９５：５；ｔ＝７．５分１：９９、ｔ＝８．５分１：９９；ｔ＝９分９５：５；ｔ＝１１分９５：５。
ｂＨＰＬＣ。Ｓｅｒｉｅｓ １１００ Ａｇｉｌｅｎｔ鎖、Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ（登録商標）Ｃ４カラム（５μｍ、３００Å、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）、流速０．５ｍＬ／分。Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ勾配（０．１％ＴＦＡ）：ｔ＝０分９５：５；ｔ＝５分９５：５；ｔ＝２５分５：９５；ｔ＝３５分５：９５、ｔ＝４０分９５：５、ｔ＝５０分９５：５。
ｃＵＶ ２１４ｎｍ検出。
【0063】
側鎖
Ｒ１は、独立して、ＣＨ３（Ｌ－Ａｌａ）、ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｖａｌ）、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（Ｌ－Ｉｌｅ）、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｌｅｕ及びＤ－Ｌｅｕ）、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ２（シクロブチル）であり、
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、第一級アミンからの合成中に逐次的に組み込まれるペプトイド単位の側鎖であり、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２から選択される。アルコール又はアミン官能基を有する側鎖は、保護された形態、すなわちアルコール官能基についてはシリルエーテル及びアミン官能基についてはｔｅｒｔ－ブチルカルバメート（Ｂｏｃ）でオリゴマーに組み込まれており、
Ｒ４は、以下の：
から選択される脂肪族又は芳香族基である。
Ｒ５は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ４Ｘ（式中、オルト位、メタ位又はパラ位のＸは、独立して、Ｈ、ＯＭｅ、ＣＦ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＮＯ２である）、３－インドリル、３－キノリニルである。
Ｒ１は、独立して、ＣＨ３（Ｌ－Ａｌａ）、ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｖａｌ）、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（Ｌ－Ｉｌｅ）、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（Ｌ－Ｌｅｕ及びＤ－Ｌｅｕ）、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ２（シクロブチル）であり、
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、第一級アミンからの合成中に逐次的に組み込まれるペプトイド単位の側鎖であり、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２から選択される。アルコール又はアミン官能基を有する側鎖は、保護された形態、すなわちアルコール官能基についてはシリルエーテル及びアミン官能基についてはｔｅｒｔ－ブチルカルバメート（Ｂｏｃ）でオリゴマーに組み込まれており、
Ｒ４は、以下の：
【化20】
から選択される脂肪族又は芳香族基である。
Ｒ５は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ４Ｘ（式中、オルト位、メタ位又はパラ位のＸは、独立して、Ｈ、ＯＭｅ、ＣＦ３、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＮＯ２である）、３－インドリル、３－キノリニルである。
【0064】
Ｃ末端にα－アミノ酸、続いてβ－及び２つのα－ペプトイド残基を組み込むＮ－アシル化ペプトマーの合成のための２－クロロトリチルクロリド樹脂上での代表的な合成スキーム。
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン；Ｆｍｏｃ：フルオレニルメチルオキシカルボニル；ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド；ＨＦＩＰ：１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロイソプロパノール；ｔ．ａ．：室温；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
【化21】
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン；Ｆｍｏｃ：フルオレニルメチルオキシカルボニル；ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド；ＨＦＩＰ：１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロイソプロパノール；ｔ．ａ．：室温；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
【0065】
合成した分子
【化22】
【化23】
【0066】
合成
一般式（Ｉ）に対応する化合物を、シンター及びストップコックを備えた５ｍＬプラスチックシリンジ内の２－クロロトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ １００～２００メッシュ）上で合成した。反応中、シリンジをオービタルシェーカー加熱プラッ
トフォーム上に置いた。
一般式（Ｉ）に対応する化合物を、シンター及びストップコックを備えた５ｍＬプラスチックシリンジ内の２－クロロトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ １００～２００メッシュ）上で合成した。反応中、シリンジをオービタルシェーカー加熱プラッ
トフォーム上に置いた。
【0067】
Ｃ末端のＬ－ロイシン及びこのアミノ酸の前のβ－ペプトイド残基で記載される典型的な合成において、２－クロロトリチルクロリド樹脂（１．３３ｍｍｏｌｇ－１、０．１００ｇ、０．１３３ｍｍｏｌ）を、２ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中で膨潤させた（２×２０分）。濾過後、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨの２．２Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液０．１２ｍＬ（２．０当量）を添加し、続いてＤＩＥＡの０．４Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液２．０ｍＬ（６．０当量）を添加した。混合物を２５℃で４０分間撹拌した。樹脂を排出し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２ｍＬ）で洗浄し、Ｆｍｏｃ－ロイシンの樹脂への結合を同じ条件下で繰り返した。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（５×２ｍＬ）で洗浄した。２０％ピペリジンＤＭＦ溶液２．０ｍＬを添加し、室温で１５分間撹拌することにより、Ｆｍｏｃ基を除去した。同じ条件下で操作を繰り返し、その後、樹脂をＤＭＦ（５×２ｍＬ）で洗浄し、排出した。
【0068】
β－ペプトイド残基の導入。樹脂を、－ＣＨ２Ｃｌ２で２回－２０℃にて洗浄することにより冷却した。－２０℃に冷却した塩化アクリロイルの０．２２Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液１．２１ｍＬ（２．０当量）を添加し、続いて冷却（－２０℃）したＥｔ３Ｎ（３．０当量）の０．５Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液０．８ｍＬを添加した。樹脂を２５℃で１時間撹拌し、排出し、次いで同じ条件下、塩化アクリロイルで再び処理した。樹脂を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（５×２ｍＬ）で洗浄し、排出した。得られたアクリルアミドを、アミンＲ２ＮＨ２の２．０Ｍイソプロパノール溶液（１２．０当量）で、５０℃で２４時間処理した。樹脂を濾過した後、同じ条件下でアザ－マイケル反応を繰り返した。樹脂をイソプロパノール（５×２ｍＬ）で洗浄した後、２つのα－ペプトイド残基のサブモノマー合成を行った。
【0069】
α－ペプトイド残基の合成。樹脂に、ブロモ酢酸の０．４Ｍ ＤＭＦ溶液２．０ｍＬ（６．０当量）、続いてＣＩＤの０．５Ｍ ＤＭＦ溶液２．１３ｍＬ（８．０当量）を添加した。２５℃で５分間撹拌した後、樹脂を排出し、ＤＭＦ（５×２ｍＬ）で洗浄した。次いで、得られたブロモアセトアミドを、アミンＲ３ＮＨ２（２０．０当量）の２．０Ｍ ＤＭＦ溶液で処理し、混合物を撹拌プラットフォーム上に４０℃で１時間放置した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×２ｍＬ）で洗浄した。最後の２つのブロモアセチル化及び置換ステップを同じ条件下で繰り返して、所望のＲ４側鎖を有する第４の残基を構築した。次いで、ペプトマーのＮ末端を、以下に記載される全般的手順の１つに従ってアシル化した後、樹脂からその除去を行った。
【0070】
切断のために、樹脂をＨＦＩＰの２．４Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液１．５ｍＬで処理した。２５℃で４０分間撹拌した後、樹脂を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（５×２ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去した。最後に、ペプトマーをＣＨ２Ｃｌ２中２５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
２ｍＬで、室温で１０分間処理することによって、側鎖のシリル化保護基又はＢｏｃ保護基を除去した。最終生成物を含有する反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）で希釈した後、真空中で完全に蒸発させた。全ての微量のＴＦＡを除去するために、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した生成物を真空下で蒸発させ、この操作を５回繰り返した。
２ｍＬで、室温で１０分間処理することによって、側鎖のシリル化保護基又はＢｏｃ保護基を除去した。最終生成物を含有する反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）で希釈した後、真空中で完全に蒸発させた。全ての微量のＴＦＡを除去するために、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した生成物を真空下で蒸発させ、この操作を５回繰り返した。
【0071】
樹脂結合ペプトマーのＮ末端のアシル化のための全般的手順。
アセチル化：樹脂に、無水酢酸の１．７Ｍ ＤＭＦ溶液１．５６ｍＬ（２０．０当量）、続いてＤＩＥＡの２．０Ｍ ＤＭＦ溶液０．８ｍＬ（１２．０当量）を添加した。２５℃で９０分間撹拌した後、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×２ｍＬ）で洗浄した。
アセチル化：樹脂に、無水酢酸の１．７Ｍ ＤＭＦ溶液１．５６ｍＬ（２０．０当量）、続いてＤＩＥＡの２．０Ｍ ＤＭＦ溶液０．８ｍＬ（１２．０当量）を添加した。２５℃で９０分間撹拌した後、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×２ｍＬ）で洗浄した。
【0072】
ベンゾイル化：樹脂に、塩化ベンゾイルの１．０Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液０．８ｍＬ（６．０当量）、続いてＤＩＥＡの２．０Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液０．８ｍＬ（１２．０当量）を添加した。２５℃で４０分間撹拌した後、樹脂を排出し、ＣＨ２Ｃｌ２（５×２ｍＬ）
で洗浄した。
で洗浄した。
【0073】
カルボン酸からのアシル化：フェニル酢酸からの本明細書に記載される典型的なカップリング反応において、フェニル酢酸の０．４Ｍ ＤＭＦ溶液２．０ｍＬ（６．０当量）及びＤＩＣの０．５Ｍ ＤＭＦ溶液２．１３ｍＬ（８．０当量）を、樹脂に連続的に添加した。２５℃で１時間撹拌した後、樹脂を排出し、ＤＭＦ（５×２ｍＬ）で洗浄した。
【0074】
合成した化合物（ＹＣ５５、ＹＣ－６０）のうち、ＹＣ５５は、ＴＲＩＰ８ｂ－ＨＣＮ相互作用の破壊においてＮＵＣＣ５９５３と等しい効力を示した（表１：ペプトイドのＩＣ５０）。
【表2】
【0075】
髄腔内又は全身的のいずれかで注射された新規ペプチド模倣化合物の鎮痛効果が、マウスにおけるオキサリプラチン誘発性急性神経障害性疼痛において実証された。
【0076】
こうして、リード化合物ＹＣ５５は、髄腔内投与した場合、ＯＩＰＮマウスにおいて用量依存的鎮痛効果を示した（図９）。
【0077】
化合物ＹＣ５５はまた、皮下投与した場合も、ＯＩＰＮマウスにおいて用量依存的鎮痛効果を示した（図１０）。
【0078】
マウスをＹＣ５５で皮下投与して処置した場合、ロータロッド試験において歩行運動活性の変化は観察されなかった（図１１）。
【0079】
ＹＣ５５はまた、パクリタキセル誘発性神経障害のラットモデルにおいて、髄腔内投与した場合に用量依存的鎮痛効果を示した（図１２）。
【0080】
ＹＣ５５の髄腔内投与は、外傷性坐骨神経損傷によって誘発された神経障害のモデルにおいて抗痛覚過敏効果を示し（図１３）、ＴＲＩＰ８ｂ相互作用を破壊するストラテジーが、いくつかの神経障害性疼痛状態において鎮痛作用を有し得ることを示唆した。
【0081】
化合物ＭＰ２０８、ＭＰ４０５（５μｇ、髄腔内）及びＭＰ３４１、ＭＰ３５４、ＭＰ３７６（１０ｍｇ／ｋｇ、皮下）は、マウスのオキサリプラチン誘発性神経障害モデルにおいて鎮痛効果を示した（それぞれ図１４及び図１５）。
【0082】
同様に、化合物ＬＦ１０８、ＬＦ３０６、ＬＦ１８８（図１６）、ＬＦ４００、ＬＦ３２９、及びＬＦ２９５（図１７）、ＬＦ２７５、ＬＦ２６１、及びＬＦ１２６（図１８）、ＬＦ２３９、ＬＦ２２２、及びＬＦ１７６（図１９）は、マウスのオキサリプラチン誘発性急性神経障害モデルにおいて鎮痛効果（５μｇ、髄腔内）を示した。
【0083】
Ｂ－三量体ペプト模倣体
三量体ペプトマー化合物はまた、ＨＣＮ２チャネルのカルボキシ末端配列の模倣体である。それらは、ＴＲＩＰ８ｂとＨＣＮ２のＣ末端領域（ｂｐ：４ＥＱＦ）との共結晶の広範なＸ線構造試験に基づいて設計された。
三量体ペプトマー化合物はまた、ＨＣＮ２チャネルのカルボキシ末端配列の模倣体である。それらは、ＴＲＩＰ８ｂとＨＣＮ２のＣ末端領域（ｂｐ：４ＥＱＦ）との共結晶の広範なＸ線構造試験に基づいて設計された。
【0084】
これらのリガンドは、以下の式ＬＦ３６９又は以下の一般式（ＩＩ）：
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、先に定義したとおりであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｒ３、ＣＯＲ５（式中Ｒ５は、先に定義したとおりである）、又はＲ７であり、
Ｒ７は、独立して、以下のうちの１つ：
である］によって表される式を有する。
【化24】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、先に定義したとおりであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｒ３、ＣＯＲ５（式中Ｒ５は、先に定義したとおりである）、又はＲ７であり、
Ｒ７は、独立して、以下のうちの１つ：
【化25】
である］によって表される式を有する。
【0085】
この化合物は、ペプチド－ペプトイドハイブリッドオリゴマー（ペプトマー）であるＯｓｔｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）［１７］。これらは、配列のＣ末端に配置されたα－アミノ酸、続いて２つのペプトイド残基を含む、３つの単位を含む。
【0086】
合成を、ｔｅｒｔ－ブチルエステルとして保護されたα－アミノ酸（ＬＦ３６９の合成の場合、Ｘａａ－ｔＢｕ、Ｌ－Ｌｅｕ－ｔＢｕ）から溶液中で行った。また、これらの合成を、四量体ペプチド模倣体について先に記載したように、樹脂上で行い得る。この単位から、一般式（Ｉ）に対応する分子に関して伸長を、「サブモノマー化学」アプローチによって行った。コア単位がβ－ペプトイド型のものである場合、その構築に必要な２つのステップは、Ｘａａ－ｔＢｕと塩化アクリロイルとの反応、続いて所望の側鎖（Ｒ２）を骨格に導入するためのアザ－マイケル反応である。第３のα－ペプトイド単位を、二量体を臭化ブロモ酢酸でアシル化し、続いて臭素原子をアミンで置換することによって構築する。Ｒ６がＨである場合、使用するアミンは第一級アミンＲ３ＮＨ２である。Ｒ６がＣＯＲ５である場合、Ｒ３ＮＨ２で処理した後に得られた第二級アミンを、カップリング条件下で酸塩化物、酸無水物又はカルボン酸でアシル化する。Ｒ６＝Ｒ７である化合物を、Ｎ末端ブロモアセチル化二量体を第二級アミンＲ３Ｒ７ＮＨで処理することによって得る。それらを、Ｎ末端にＮＨＲ３を有する化合物の還元的アミノ化によっても得ることができる。最終ステップは、ＴＦＡでの処理によって側鎖及びＣ末端を脱保護することである。
【0087】
ＬＦ３６９の合成のための正確な実験プロトコルは以下のとおりである。
フラスコ内で、Ｌ－ｌｅｕ－ｔＢｕ（１．７４ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を４５ｍＬの無水ＴＨＦに溶解する。不活性アルゴン雰囲気下のフラスコを０℃に冷却する。トリエチルアミン（２．３ｍＬ、３１．４ｍｍｏｌ、４当量）を添加し、続いて塩化アクリロイル（０．７６ｍＬ、９．４ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加する。０℃で３時間撹拌した後、薄層クロマトグラフィー（５０／５０シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ）によると完全な変換を示
す。形成した塩を濾過により除去し、濾液を真空下で蒸発させ、得た生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（５０／５０シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ）により精製する。アクリルアミドを収率９３％（１．７６ｇ、７．２７ｍｍｏｌ）で白色固体として単離する。
フラスコ内で、Ｌ－ｌｅｕ－ｔＢｕ（１．７４ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を４５ｍＬの無水ＴＨＦに溶解する。不活性アルゴン雰囲気下のフラスコを０℃に冷却する。トリエチルアミン（２．３ｍＬ、３１．４ｍｍｏｌ、４当量）を添加し、続いて塩化アクリロイル（０．７６ｍＬ、９．４ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加する。０℃で３時間撹拌した後、薄層クロマトグラフィー（５０／５０シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ）によると完全な変換を示
す。形成した塩を濾過により除去し、濾液を真空下で蒸発させ、得た生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（５０／５０シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ）により精製する。アクリルアミドを収率９３％（１．７６ｇ、７．２７ｍｍｏｌ）で白色固体として単離する。
【0088】
アザ－マイケル反応。先に形成したアクリルアミド（１．７６ｇ、７．２７ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのエタノールに溶解する。ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルエーテルとして保護されたアルコール官能基を有するエタノールアミン（２．６８ｇ、１５．２８ｍｍｏｌ、２．１当量）を添加し、反応混合物を６０時間加熱還流する。次いで、溶媒を蒸発させ、反応粗製物をシリカゲルクロマトグラフィー（９０／１０／０．１ ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ／Ｅｔ３Ｎ）により精製して、二量体を収率９０％収率（２．７４ｇ、６．５８ｍｍｏｌ）で黄色がかった油状物として得る。
【0089】
二量体のアシル化反応。二量体（２．７４ｇ、６．５８ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＴＨＦに溶解し、反応器をアルゴンで不活性化し、次いで－２０℃に冷却する。トリエチルアミン（１．１ｍＬ、７．８９ｍｍｏｌ、１．２当量）を溶液に添加し、続いて臭化２－ブロモアセチル（０．６２ｍＬ、７．８９ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加する。－２０℃で３時間撹拌した後、反応混合物を濾過する。得られた濾液を蒸発させ、反応粗生成物をシリカゲルでクロマトグラフィー処理する（６０／４０／０．１のシクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ／Ｅｔ３Ｎ）。ブロモアセチル化二量体を収率６７％（２．３６ｇ、４．４ｍｍｏｌ）で黄色がかった油状物として単離する。
【0090】
置換反応。先に得た生成物（２．３６ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＴＨＦに溶解する。トリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．８ｍｍｏｌ、２当量）、次いで保護エタノールアミンＨ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＯＴＢＤＭＳ（２．３１ｇ、１３．２ｍｍｏｌ、３当量）を溶液に添加する。アルゴン雰囲気下の反応媒体を室温で一晩撹拌する。次いで、反応混合物を濾過し、得た濾液を蒸発させる。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（９５／５／０．１のＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ／Ｅｔ３Ｎ）により精製して、三量体を収率８３％（２．３０ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）で油状物として得る。
【0091】
三量体のアセチル化。得られたアミン（２．３ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの酢酸エチルに溶解する。トリエチルアミン（２．０２ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ、４当量）、次いで無水酢酸（２．７５ｍＬ、２９ｍｍｏｌ、８当量）を溶液に添加する。反応物をアルゴン下に、室温で６０時間置く。溶媒を蒸発させた後、得た粗製物をシリカゲルでクロマトグラフィー処理（９０／１０／０．１のＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン／Ｅｔ３Ｎ）して、Ｎ－アセチル化三量体を収率９２％（２．２７ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）で無色油状物として得る。
【0092】
側鎖及びＣ末端の脱保護。三量体化合物（５０２ｍｇ、０．７７６ｍｍｏｌ、１当量）を４ｍＬのＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ（４７．５：４７．５：５）混合物に溶解する。室温で２時間撹拌した後、１０ｍＬのジクロロメタンを添加する。反応媒体を真空下で蒸発させ、次いでジクロロメタンとの５回の共蒸発を行う。次いで、生成物を５ｍＬの蒸留水に再溶解し、室温で２時間撹拌下のままにする。溶媒を蒸発させ、次いでトルエンとの５回の共蒸発を行い、ＬＦ３６９（３６２ｍｇ）を油状物として得る。
【0093】
側鎖
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、先に定義したとおりであり、
Ｒ６は、Ｒ３、Ｈ、ＣＯＲ５（式中、Ｒ５は、先に定義したとおりである）、又はＲ７であり、
Ｒ７は、独立して、以下のうちの１つ：
である。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、先に定義したとおりであり、
Ｒ６は、Ｒ３、Ｈ、ＣＯＲ５（式中、Ｒ５は、先に定義したとおりである）、又はＲ７であり、
Ｒ７は、独立して、以下のうちの１つ：
【化26】
である。
【0094】
一般式（ＩＩ）のペプトイド、例えばＬＦ３６９の溶液合成のための代表的な合成スキーム。
【化27】
【0095】
一般式（ＩＩ）のペプトイド、例えばＬＦ３６９の支持合成のための代表的な合成スキーム。
【化28】
【0096】
合成した分子
【化29】
【0097】
合成
化合物ＬＦ３６９（５μｇ、髄腔内）は、オキサリプラチン誘発性神経障害のマウスモデルにおいて鎮痛効果を示した（図２０）。
化合物ＬＦ３６９（５μｇ、髄腔内）は、オキサリプラチン誘発性神経障害のマウスモデルにおいて鎮痛効果を示した（図２０）。
【0098】
参考文献一覧
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２０． Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１０６４６－１０６４７，１９９２
２１． Ｃｕｌｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１５：５２８２－５３３５，２０１０
２２． Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，３５：２０－３２，１９９５
２３． Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９：１５０８－１５０９，２００７
２４． Ｖｏｌｌｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１：８４９７－８２０１，２０１３
２５． Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：１３３－１４２，２０１０
２６． Ｃｈｏｎｇｓｉｒｉｗａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：２７９４－２７９９，２００８
２７． Ｍｅｓｉｒｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５：４６６４．ｄ
ｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ５６６４，２０１４
２８． Ｍａｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｎｎｅｌｓ（Ａｕｓｔｉｎ），５（３）：２４１－２５０，２０１１
１． Ｆｉｎｎｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，１４（２）：１６２－１７３，２０１５
２． ｖｏｎ Ｈｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，７３（４）：６３８－６５２
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３． Ｈｅｒｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３２（１８）：１９４１－１９６７，２０１４
４． Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９３（６６８５）：５８７－５９１，１９９８
５． Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９３（５）：７１７－７２９，１９９８
６． Ｓｅｉｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６（１６）：９３９１－９３９６，１９９９
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１９． Ｈａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３：７０８－７１８，１９９８
２０． Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１０６４６－１０６４７，１９９２
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２２． Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，３５：２０－３２，１９９５
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２８． Ｍａｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｎｎｅｌｓ（Ａｕｓｔｉｎ），５（３）：２４１－２５０，２０１１
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【国際調査報告】