特表2023-544882膠芽腫に対する化学療法剤としてのホスファフェナレン－金（Ｉ）錯体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-25
(54)【発明の名称】膠芽腫に対する化学療法剤としてのホスファフェナレン－金（Ｉ）錯体
(51)【国際特許分類】
C07F 19/00 20060101AFI20231018BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20231018BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20231018BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231018BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231018BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231018BHJP
A61K 31/66 20060101ALI20231018BHJP
A61K 31/7135 20060101ALI20231018BHJP
C07C 329/16 20060101ALI20231018BHJP
C07C 331/02 20060101ALI20231018BHJP
C07F 9/6578 20060101ALN20231018BHJP
C07F 1/12 20060101ALN20231018BHJP
C07F 9/6584 20060101ALN20231018BHJP
【ＦＩ】
C07F19/00 CSP
A61K47/20
A61K9/08
A61P25/00
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K31/66
A61K31/7135
C07C329/16
C07C331/02
C07F9/6578
C07F1/12
C07F9/6584
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023522372
(86)(22)【出願日】2021-10-13
(85)【翻訳文提出日】2023-06-09
(86)【国際出願番号】 EP2021078277
(87)【国際公開番号】W WO2022079085
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】20201555.8
(32)【優先日】2020-10-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509223977
【氏名又は名称】ウニベルジテート ハイデルベルク
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ロメロ－ニエト カルロス
(72)【発明者】
【氏名】ロッシュ サスキア
(72)【発明者】
【氏名】ヘロルト－メンデ クリステル
(72)【発明者】
【氏名】フェルミ ヴァレンティーナ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
4H006
4H048
4H050
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB13
4C076CC01
4C076CC27
4C076DD55
4C076FF70
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA35
4C086HA01
4C086HA28
4C086MA01
4C086MA04
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4C086ZA02
4C086ZB26
4C086ZC20
4H006AA01
4H006AA03
4H006AB20
4H048AA01
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4H048AB20
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4H048VB10
4H050AA01
4H050AA03
4H050AB20
4H050AB28
(57)【要約】
膠芽腫は最も致命的な脳腫瘍の１つである。膠芽腫の治療が困難であることは、とりわけ、薬物に対する脳の感受性、化学療法剤の限られた脳浸透、及び従来の治療法に対する腫瘍細胞の耐性と関係がある。医薬として、特に膠芽腫等の脳癌の治療において使用される特定のホスファフェナレン－金（Ｉ）錯体、かかる錯体を含む医薬組成物及びキットを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬として使用される式（Ａ）：【化1】
ＡｒＩは、フェニル、ピリジン、ピロール、Ｎ－保護ピロール、フラン、チオフェン及び７員芳香族単環からなる群より選択される単環式芳香族部分、又はナフタレン、インドール及びベンゾチオフェンからなる群より選択される二環式芳香族部分を表し、
ＡｒＩは、ハロゲン原子（好ましくは、前記ハロゲン原子は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＦから選択される）、Ｎ、Ｓ又はＯを含む５員又は６員の芳香族複素環、Ｃ１～６脂肪族基及びＣ３～６脂環式基（前記Ｃ１～６脂肪族基及び／又は前記Ｃ３～６脂環式基は、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１つ以上のヘテロ原子を更に含んでもよい）からなる群より選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩは、それぞれ独立して、ベンゼン基、ピリジン基、ピロール基、Ｎ－保護ピロール基、又はチオフェン基を表し、
Ｒ１は、芳香族基、ヒドロキシ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基又はＣ１～Ｃ６アルコキシ基、好ましくはフェニル基を表し、
Ｘは、糖、アルブミン、ハロゲン原子、ＣＨ３、ＮＯ３、ＣＮ、及びＳＲ３からなる群より選択され、
Ｒ３は、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－グルコピラノシル、β－Ｄ－グルコピラノシル、２，３，４，６－テトラメシル－β－Ｄ－グルコピラノシル、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－α－Ｄ－グルコピラノシル、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル、ヘプト－Ｏ－アセチル－β－マルトシル、１，２－Ｏ－イソプロピリデン－５－α－Ｄ－キシロフラノシル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、２－モルホリノエチル、２’－エチル－１－β－Ｄ－グルコピラノシル、２’－エチル－１－チオ－β－Ｄ－グルコピラノシル、グルタチオニル塩酸塩、ＣＮ、Ｃ（ＮＨ２）２・ＨＣｌ、Ｃ（ＮＨ２）ＮＨＮＨ２、フェニル、１－アミノフェニル、２－ピリジル、６－メチル－２－ピリジル、４－ピリジル、チアゾリン－２－イル、４，５－ジヒドロチアゾール－２－イル、１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イル、ベンゾキサゾール－２－イル、ベンゾチアゾール－２－イル、（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２ＮＯ３ －、ピリミジン－２－イル、４－メチルピリミジン－２－イル、４，６－ジメチルピリミジン－２－イル、１，２－ジヒドロピリジン－２－イル、１，２－ジヒドロピリミジン－２－イル、９Ｈ－プリン－６－イル、２－アミノ－９Ｈ－プリン－６－イル、及び（ＮＨ２）２Ｃ＝からなる群より選択される）の化合物。
【請求項2】
ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩが共にナフタレン基、インドール基、Ｎ－保護インドール基、キノリン基、Ｎ－保護キノリン基、又はベンゾチオフェン基を表す、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項3】
ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩが共にナフタレン基を表す、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。
【請求項4】
ＡｒＩがベンゼン基、ナフタレン基、チオフェン基、フラン基、ピロール基、ベンゾチオフェン基、又はピリジン基であり、ＡｒＩが、ハロゲン原子（好ましくは、前記ハロゲン原子は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＦから選択される）、Ｎ、Ｓ又はＯを含む５員又は６員芳香族複素環、Ｃ１～６脂肪族基及びＣ３～６脂環式基（前記Ｃ１～６脂肪族基及び／又は前記Ｃ３～６脂環式基は、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１つ以上のヘテロ原子を更に含んでもよい）からなる群より選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよい、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項5】
ＡｒＩがチオフェン基であり、好ましくはＡｒＩが非非置換のチオフェン基である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項6】
ＡｒＩがピロール基であり、好ましくはＡｒＩがＮ原子上の置換基としてメチル基又はフェニルスルホニル基を有する、より好ましくはＮ原子上の置換基としてメチル基を有するＮ－置換ピロール基である、請求項１～４のいずかに記載の使用のための化合物。
【請求項7】
ＸがＣｌ、キサンテート、チオシアニド、及び３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートからなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項8】
Ｘが、キサンテート又は３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートであり、好ましくはＸが、３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートである、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項9】
ＡｒＩがＮ原子上の置換基としてメチル基を有するＮ－置換ピロール基であり、Ｒ１がフェニル基であり、Ｘが３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートである、請求項３に記載の使用のための化合物。
【請求項10】
前記ＡｒＩ、ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩの保護基がＳｉ（ＣＨ３）３、ＳＯ２Ｐｈ及び糖から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項11】
式（Ｂ）：【化2】
【請求項12】
Ｒがメチルであり、Ｘが３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項13】
医薬として使用される、請求項１１又は１２に記載の化合物。
【請求項14】
癌の治療用である、好ましくは脳癌の治療に使用される、請求項１～１０又は１３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項15】
前記化合物が膠芽腫治療用である、請求項１４に記載の使用のための化合物。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物と少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項17】
前記化合物が、ＤＭＳＯを含む水溶液に溶解され、好ましくは前記化合物が水とＤＭＳＯの混合物、より好ましくは５体積％～２０体積％のＤＭＳＯを含む水に溶解される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
医薬として使用される、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項19】
癌の治療用である、好ましくは脳癌の治療用である、より好ましくは膠芽腫、脳転移、髄膜腫、ＩＤＨ変異神経膠腫、又は頭頸部癌の治療用である、特に好ましくは膠芽腫の治療用である、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項20】
前記化合物が静脈内投与されるように用いられる、請求項１９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項21】
少なくとも請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物と容器とを備えるキット。
【請求項22】
チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の活性を阻害するための請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物の使用であって、前記化合物がｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏで使用される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬として、特に膠芽腫等の脳癌の治療において使用されるホスファフェナレン－金（Ｉ）錯体、かかる錯体を含む医薬組成物及びキット、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏでチオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の活性を阻害するためのかかる錯体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も一般的で悪性のヒト脳腫瘍であり、生存期間はわずか約１５ヶ月である。幾つかの主な理由は、急速な腫瘍細胞の増殖、腫瘍の不均一性、遺伝的不安定性、及び非常に浸潤性の成長である。特に非常に浸潤性の成長であるために、外科的に切除できない播種性腫瘍細胞を標的とする全身治療が必要となる。したがって、現在の治療は、手術とそれに続く放射線及びテモゾロミドベースの併用化学療法で構成されている。しかしながら、１年、２年、及び５年の生存率はそれぞれ４０％、１７．４％、及び５．６％であり、依然として非常に低く、このタイプの治療に対して腫瘍細胞の少なくとも一部の集団はかなりの耐性を示している。
【0003】
これは、自己複製及び化学療法に対する感受性の低下等の幹細胞のような特性を備えた未熟で高度に腫瘍原性の細胞集団に起因する可能性があり、これが腫瘍再発の原因のようであるという仮説が立てられている。
【0004】
これらの知見は、全ての腫瘍細胞集団を根絶することで、腫瘍の再成長を防ぐことができる、より効果的な治療剤の開発の緊急の必要性を強調している。
【0005】
現在の化学療法に対する脳腫瘍細胞の耐性を克服するための新規治療薬の更なる課題は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、腫瘍選択的な活性を発揮することの必要性である。この点で、金（Ｉ）錯体は有望な化合物であり、ＢＢＢを横断する能力を持っている（非特許文献１）。
【0006】
金錯体の作用機序に関する最も受け入れられている仮説の１つは、細胞の酸化還元恒常性に関与する酵素であり、腫瘍細胞において過剰発現することが示されている、チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の特異的阻害を含む（非特許文献２）。
【0007】
金（Ｉ）錯体は、ＴｒｘＲの選択的阻害に大きな可能性を秘めており、それらの錯体は、チオレドキシン酵素のＳＨ／Ｓｅ中心と特異的に相互作用し、その活性を阻害し、最終的に細胞アポトーシスを引き起こす能力を有する（非特許文献３）。
【0008】
それにもかかわらず、医学、金療法（chrysotherapy）における金錯体の使用は古代エジプト時代にさかのぼるが、後者の金錯体の臨床応用は今日ではかなり低い。何人かの著者は、この事実を試験された化合物の「安定性の悪さ」及び「溶解性」に起因するとしている（非特許文献４;及び上記で引用した非特許文献２）。
【0009】
現在、癌治療のために最も調査されている金錯体は、オーラノフィン（商標）及び誘導体である。それらの一般的な構造は、Ａｕ原子に結合した三置換ホスフィン配位子（フラグメントＡ）を有し、これが追加のアニオン性配位子（フラグメントＢ）を結合している、直鎖状分子からなる。
【化1】
【0010】
機構的調査により、両方の配位子が金錯体の抗腫瘍活性を調節することが明らかになった（上記で引用した非特許文献２）。第一に、フラグメントＡ及びフラグメントＢは、錯体の生理活性を確実にするために水性媒体に十分な溶解性を提供しなければならない。次いで、フラグメントＢは、金と特定のキャリア酵素との最初のカップリングを可能にするのに十分な不安定性でなければならない。次に、フラグメントＡの電子特性が重要な役割を果たし、標的に達するためにＴｒｘＲを積極的に阻害する種（すなわち、Ｒ３Ｐ－Ａｕ＋）に対して堅牢な安定性をもたらすものでなければならない。弱いＰ－Ａｕ結合は、加水分解、リンの不可逆的な酸化及び不活性な金コロイドの形成をもたらす。さらに、フラグメントＡの親油性及び立体障害は、金部分が細胞に浸透するための基本である（上記で引用した非特許文献３）。このように、分子系の生理活性を高めることは、様々な相乗特性の結果であるため、ハードルの高い課題である。
【0011】
フラグメントＡに最も採用されている部分は、ホモ三置換ホスフィンである。リン含有部分、特にフラグメントＡの複素環は、癌治療についてほとんど試験されていない。５員複素環に基づく錯体である２，５－ジアリールホスホールのみが今日まで使用されてきた。
【0012】
非特許文献５は、クロロ金錯体「［１－フェニル－２，５－ジ（２－ピリジル）ホスホール］ＡｕＣｌ」を、ヒトグルタチオンレダクターゼを阻害することができる新規金ホスホール阻害剤（ＧｏＰＩ）として報告しており、更にＧｏＰＩが、それぞれ、ＮＣＨ８２及びＮＣＨ８９に対するＩＣ５０値１２．５±０．８μＭ及び１０．８±０．８μＭで膠芽腫細胞株の増殖を阻害することを示した。
【0013】
ヒトグルタチオンレダクターゼ（ｈＧＲ）及びヒトチオレドキシンレダクターゼ（ｈＴｒｘＲ）に対するホスホール含有金及び白金錯体の効果、並びに腫瘍細胞に対する成長抑制作用は、非特許文献６によって記載された。ＮＣＨ８２及びＮＣＨ８９に対する５つの異なるホスホール含有錯体の抗増殖効果（ＩＣ５０）は、それぞれ７．２μＭ～８１．８μＭ、及び１０．８μＭ～８７．４μＭと報告された。
【0014】
さらに、非特許文献７は、ヒト乳癌ＭＣＦ－７細胞株に対するそれらの細胞傷害活性について異なる化合物、とりわけホスホール含有金及び白金錯体を評価した。
【0015】
非特許文献１（上記で引用）は、ヒト（ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９）及びラット（Ｃ６）の神経膠腫細胞株に対して抗増殖効果を示す金（Ｉ）錯体１－フェニル－ビス（２－ピリジル）ホスホール金クロリドチオ－β－ｄ－グルコース四酢酸（ＧｏＰＩ－糖）の抗腫瘍特性、並びにＧｏＰＩ－糖がチオレドキシンレダクターゼ（ＩＣ５０ ４．３ｎＭ）及びヒトグルタチオンレダクターゼ（ＩＣ５０ ８８．５ｎＭ）を阻害することを報告した。
【0016】
異なるホスホール金錯体の細胞傷害活性は、特許文献１にも開示されている。
【0017】
しかしながら、これらのホスホール金錯体の幾つかは水溶液中で不安定であることが従来技術で報告されている（上記で引用される非特許文献７）。
【0018】
したがって、従来技術から離れて、改善された安定性を有し、血液脳関門を通過することができ、腫瘍細胞の増殖を阻害することができ、腫瘍細胞を感作してアポトーシスを起こすことができる、医薬として、特に膠芽腫等の脳癌の治療において使用される化合物を提供することが本発明の目的である。更なる目的は、かかる化合物を含む医薬組成物及びキットを提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0019】
【特許文献1】米国特許第７９２３４３４号
【非特許文献】
【0020】
【非特許文献1】Jortzik E. et al. "Antiglioma activity of GoPI-sugar, a novel gold(I)-phosphole inhibitor: Chemical synthesis, mechanistic studies, and effectiveness in vivo", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 2014, 1844 (8), pages 1415-1426
【非特許文献2】Gandin V. et al., "Metal- and Semimetal-Containing Inhibitors of Thioredoxin Reductase as Anticancer Agents", Molecules, 2015, 20(7), 12732-12756
【非特許文献3】Zou T. et al., "Chemical biology of anticancer gold(III) and gold(I) complexes", Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 8786-8801
【非特許文献4】Nobili S. et al., "Gold compounds as anticancer agents: chemistry, cellular pharmacology, and preclinical studies", Med. Res. Rev. 2010, 30, 550-580
【非特許文献5】Deponte M. et al., "Mechanistic studies on a novel, highly potent gold-phosphole inhibitor of human glutathione reductase", J. Biol. Chem. 2005, 280, 20628-20637
【非特許文献6】Urig S. et al., "Undressing of Phosphine Gold(I) Complexes as Irreversible Inhibitors of Human Disulfide Reductases", Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, pages 1881-1886
【非特許文献7】Viry E. et al., "A sugar-modified phosphole gold complex with antiproliferative properties acting as a thioredoxin reductase inhibitor in MCF-7 cells", ChemMedChem 2008, 3, 1667-1670
【発明の概要】
【0021】
これらの目的は、請求項１に記載の使用のための化合物、請求項１０に記載の医薬組成物及び請求項１４に記載のキットによって解決された。本発明の主題は更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏにおける請求項１５に記載のチオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の活性を阻害するためのこれらの化合物の使用である。
【0022】
本発明によれば、医薬として使用される式（Ａ）：
（式中、
ＡｒＩは、フェニル、ピリジン、ピロール、Ｎ－保護ピロール、フラン、チオフェン及び７員芳香族単環からなる群より選択される単環式芳香族部分、又はナフタレン、インドール及びベンゾチオフェンからなる群より選択される二環式芳香族部分を表し、
ＡｒＩは、ハロゲン原子（好ましくは、ハロゲン原子は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＦから選択される）、Ｎ、Ｓ又はＯを含む５員又は６員の芳香族複素環、Ｃ１～６脂肪族基及びＣ３～６脂環式基（Ｃ１～６脂肪族基及び／又はＣ３～６脂環式基は、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１つ以上のヘテロ原子を更に含んでもよい）からなる群より選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩは、それぞれ独立して、ベンゼン基、ピリジン基、ピロール基、Ｎ－保護ピロール基、又はチオフェン基を表し、
Ｒ１は、芳香族基、ヒドロキシ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基又はＣ１～Ｃ６アルコキシ基、好ましくはフェニル基を表し、
Ｘは、糖、アルブミン、ハロゲン原子、ＣＨ３、ＮＯ３、ＣＮ、及びＳＲ３からなる群より選択され、
Ｒ３は、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－グルコピラノシル、β－Ｄ－グルコピラノシル、２，３，４，６－テトラメシル－β－Ｄ－グルコピラノシル、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－α－Ｄ－グルコピラノシル、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル、ヘプト－Ｏ－アセチル－β－マルトシル、１，２－Ｏ－イソプロピリデン－５－α－Ｄ－キシロフラノシル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、２－モルホリノエチル、２’－エチル－１－β－Ｄ－グルコピラノシル、２’－エチル－１－チオ－β－Ｄ－グルコピラノシル、グルタチオニル塩酸塩、ＣＮ、Ｃ（ＮＨ２）２・ＨＣｌ、Ｃ（ＮＨ２）ＮＨＮＨ２、フェニル、１－アミノフェニル、２－ピリジル、６－メチル－２－ピリジル、４－ピリジル、チアゾリン－２－イル、４，５－ジヒドロチアゾール－２－イル、１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イル、ベンゾキサゾール－２－イル、ベンゾチアゾール－２－イル、（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２ＮＯ３ －、ピリミジン－２－イル、４－メチルピリミジン－２－イル、４，６－ジメチルピリミジン－２－イル、１，２－ジヒドロピリジン－２－イル、１，２－ジヒドロピリミジン－２－イル、９Ｈ－プリン－６－イル、２－アミノ－９Ｈ－プリン－６－イル、及び（ＮＨ２）２Ｃ＝からなる群より選択される）の化合物が提供される。
【化2】
ＡｒＩは、フェニル、ピリジン、ピロール、Ｎ－保護ピロール、フラン、チオフェン及び７員芳香族単環からなる群より選択される単環式芳香族部分、又はナフタレン、インドール及びベンゾチオフェンからなる群より選択される二環式芳香族部分を表し、
ＡｒＩは、ハロゲン原子（好ましくは、ハロゲン原子は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＦから選択される）、Ｎ、Ｓ又はＯを含む５員又は６員の芳香族複素環、Ｃ１～６脂肪族基及びＣ３～６脂環式基（Ｃ１～６脂肪族基及び／又はＣ３～６脂環式基は、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１つ以上のヘテロ原子を更に含んでもよい）からなる群より選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩは、それぞれ独立して、ベンゼン基、ピリジン基、ピロール基、Ｎ－保護ピロール基、又はチオフェン基を表し、
Ｒ１は、芳香族基、ヒドロキシ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基又はＣ１～Ｃ６アルコキシ基、好ましくはフェニル基を表し、
Ｘは、糖、アルブミン、ハロゲン原子、ＣＨ３、ＮＯ３、ＣＮ、及びＳＲ３からなる群より選択され、
Ｒ３は、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－グルコピラノシル、β－Ｄ－グルコピラノシル、２，３，４，６－テトラメシル－β－Ｄ－グルコピラノシル、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－α－Ｄ－グルコピラノシル、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル、ヘプト－Ｏ－アセチル－β－マルトシル、１，２－Ｏ－イソプロピリデン－５－α－Ｄ－キシロフラノシル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、２－モルホリノエチル、２’－エチル－１－β－Ｄ－グルコピラノシル、２’－エチル－１－チオ－β－Ｄ－グルコピラノシル、グルタチオニル塩酸塩、ＣＮ、Ｃ（ＮＨ２）２・ＨＣｌ、Ｃ（ＮＨ２）ＮＨＮＨ２、フェニル、１－アミノフェニル、２－ピリジル、６－メチル－２－ピリジル、４－ピリジル、チアゾリン－２－イル、４，５－ジヒドロチアゾール－２－イル、１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イル、ベンゾキサゾール－２－イル、ベンゾチアゾール－２－イル、（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２ＮＯ３ －、ピリミジン－２－イル、４－メチルピリミジン－２－イル、４，６－ジメチルピリミジン－２－イル、１，２－ジヒドロピリジン－２－イル、１，２－ジヒドロピリミジン－２－イル、９Ｈ－プリン－６－イル、２－アミノ－９Ｈ－プリン－６－イル、及び（ＮＨ２）２Ｃ＝からなる群より選択される）の化合物が提供される。
【0023】
本発明による化合物は、ホスファフェナレンの誘導体である縮合６員リン複素環に基づく。これまで、６員リン誘導体は癌治療について調査されていなかった。本発明による化合物は更に、可能性のある化学療法剤としてこれまでに知られているホスフィン及びホスホールとは大きく異なる構造的及び電子的特性を有する。
【0024】
ホスファフェナレン系に基づくクロロ金（Ｉ）錯体の調製は、Romero-Nieto C. et al., "Paving the Way to Novel Phosphorus-Based Architectures: A Noncatalyzed Protocol to Access Six-Membered Heterocycles", Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54(52), 15872-15875に記載された。
【0025】
本発明による化合物は、ジメチルスルホキシド／Ｈ２Ｏ溶液中で予想外に高い安定性を示すだけでなく、細胞傷害効果も示すことが今般見出された。
【0026】
本発明によれば、上記式（Ａ）において、ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩは共にナフタレン基、インドール基、Ｎ－保護インドール基、キノリン基、Ｎ－保護キノリン基、又はベンゾチオフェン基を表すことが好ましい。
【0027】
本発明の好ましい実施の形態によれば、ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩは共にナフタレン基を表す。
【0028】
ＡｒＩはベンゼン基、ナフタレン基、チオフェン基、フラン基、ピロール基、ベンゾチオフェン基、又はピリジン基であり、ＡｒＩは、ハロゲン原子（好ましくは、ハロゲン原子は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＦから選択される）、Ｎ、Ｓ又はＯを含む５員又は６員芳香族複素環、Ｃ１～６脂肪族基及びＣ３～６脂環式基（Ｃ１～６脂肪族基及び／又はＣ３～６脂環式基は、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１つ以上のヘテロ原子を更に含んでもよい）からなる群より選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよいことが更に好ましい。
【0029】
好ましい実施の形態によれば、ＡｒＩは置換されていない。別の好ましい実施の形態によれば、ＡｒＩは、上述した群から選択される１個又は２個、より好ましくは１個の置換基によって置換されている。
【0030】
上記式（Ａ）において、ＡｒＩは、フェニル、ピリジン、ピロール、Ｎ－保護ピロール、フラン、チオフェンからなる群より選択されることが好ましい。好ましい実施の形態によれば、ＡｒＩはチオフェン基であり、より好ましくは非置換のチオフェン基である。
【0031】
好ましい実施の形態によれば、ＡｒＩはピロール基であり、好ましくはＡｒＩはＮ原子上の置換基としてメチル基又はフェニルスルホニル基を有する、特に好ましくはＮ原子上の置換基としてメチル基を有するＮ－置換ピロール基である。
【0032】
好ましい実施の形態によれば、上記式（Ａ）中のＸは、Ｃｌ、キサンテート、チオシアニド、及び３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートからなる群より選択される。Ｘはキサンテート又は３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートであることが更に好ましく、Ｘは３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートであることがより好ましい。
【0033】
本発明の特定の一実施の形態によれば、ＡｒＩはＮ原子上の置換基としてメチル基を有するＮ－置換ピロール基であり、ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩは共にナフタレン基を表し、Ｒ１はフェニル基であり、Ｘは３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートである。
【0034】
本発明の一実施の形態によれば、本発明の化合物は化合物１である。本発明の別の実施の形態によれば、本発明の化合物は化合物２である。本発明の別の実施の形態によれば、本発明の化合物は化合物３である。本発明の別の実施の形態によれば、本発明の化合物は化合物４である。
【0035】
本発明の別の実施の形態によれば、本発明の化合物は化合物５である。本発明の別の実施形の態によれば、本発明の化合物は化合物６である。本発明の別の実施の形態によれば、本発明の化合物は化合物７である。本発明の別の実施の形態によれば、本発明の化合物は化合物８である。化合物５～化合物８は、本明細書で提供されるそれらの特定の用途に関係なく、それ自体が化合物として本発明の一部をなすことを理解されたい。
【0036】
ＡｒＩ、ＡｒＩＩ及びＡｒＩＩＩの保護基、すなわちＮ－保護ピロール基、Ｎ－保護インドール基及び／又はＮ－保護キノリン基については、好ましくはＳｉ（ＣＨ３）３、ＳＯ２Ｐｈ及び糖から選択される。しかしながら、当該技術分野において一般的に知られている他の適切な保護基も使用することができる。
【0037】
ヘテロ原子を含む前述の環状基におけるヘテロ原子（複数の場合もある）の位置に関して、本発明による化合物は、全ての可能な構造異性体を含む。
【0038】
本発明の一実施の形態によれば、本発明は、式（Ｂ）：
（式中、Ｒはメチル又はＳＯ２Ｐｈであり、Ｘはクロリド又は３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートであり、好ましくは、Ｒはメチルであり、Ｘは３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートである）の化合物を提供する。本発明の一実施の形態によれば、上記化合物は、医薬として使用するために提供される。
【化3】
【0039】
好ましい実施の形態によれば、本発明による化合物は、癌の治療において使用されるものである。
【0040】
更に好ましい実施の形態によれば、本発明による化合物は、脳癌の治療に使用されるものであり、好ましくは膠芽腫の治療に使用されるものである。
【0041】
本発明の主題は更に、本発明による化合物と少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物である。医薬組成物は、静脈内投与されることを特徴とすることが好ましい。
【0042】
さらに、本発明による医薬組成物において、化合物はＤＭＳＯを含む水溶液に溶解することが好ましく、好ましくは、化合物は水とＤＭＳＯの混合物に溶解し、より好ましくは５体積％～２０体積％のＤＭＳＯを含む水に溶解する。好ましくは、本明細書に記載の医薬組成物は、医薬として使用されるものである。
【0043】
好ましい一実施の形態によれば、医薬組成物は、癌の治療に使用される、より好ましくは脳癌の治療に使用される、更により好ましくは膠芽腫、脳転移、髄膜腫、ＩＤＨ変異神経膠腫、又は頭頸部癌の治療に使用される、特に好ましくは膠芽腫の治療に使用されるものである。
【0044】
本発明は更に、少なくとも上記のような本発明による化合物と容器とを備えるキットに関する。
【0045】
本発明の主題は更に、チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の活性を阻害するための上記のような本発明による化合物の使用であり、該化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏで使用される。
【0046】
本発明の一態様は更に、対象の治療方法に関し、本明細書に記載の化合物、本明細書に記載される医薬組成物、又は本明細書に記載のキットが、上記治療の一部として使用される。
【0047】
本発明は、添付の図面と併せて解釈すると、本発明の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】化合物４の３つの生物学的複製のうちの１つから得られたＮＣＨ８２細胞の４８時間での用量反応曲線を示す図である。この複製において、化合物４は１．５５μＭのＩＣ５０でＮＣＨ８２腫瘍細胞の成長を阻害した。
【図2】創傷治癒アッセイを用いたＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９、ＮＣＨ１２５、及びＮＣＨ２１０の腫瘍細胞の遊走に対する化合物４の効果を示す図である。
【図3】化合物４の濃度の増加に伴って増加するアポトーシス／ネクローシス細胞の数を示す図である。図３Ａは、ＮＣＨ８９の未処理細胞、並びに１μＭ、２μＭ、及び１０μＭの化合物４に２４時間曝露した場合のフローサイトメトリー分析を示す。図３Ｂは、従来の膠芽腫細胞株ＮＣＨ８２及びＮＣＨ８９のアポトーシス細胞及びネクローシス細胞の相対的な割合を示す積み上げ型グラフである。図３Ｃは、神経膠腫幹細胞株ＮＣＨ４２１ｋ、ＮＣＨ６４４、及びＮＣＨ６６０ｈのアポトーシス細胞及びネクローシス細胞の相対的な割合を示す積み上げ型グラフである。
【図4】（Ａ）ＮＣＨ９３の未処理細胞、並びに１μＭ、２μＭ及び５μＭの化合物６に４８時間曝露した場合のフローサイトメトリー解析、並びに（Ｂ）脳転移細胞株、（Ｃ）髄膜腫細胞株、（Ｄ）ＩＤＨ変異神経膠腫細胞株、及び（Ｅ）頭頸部癌細胞株のアポトーシス細胞及びネクローシス細胞の割合をまとめた積み上げ型グラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0049】
本発明化合物の評価中に、本発明者らは、金－ホスファフェナレン誘導体が数週間にわたってジメチルスルホキシド／Ｈ２Ｏ溶液中に驚くほど可溶性であり、非常に安定であることを認識した。
【0050】
クロロ誘導体（以下に示す化合物１）でさえ、水溶液中で不安定であると報告された類縁体２，５－ジアリールホスホール金錯体（上記で引用される非特許文献７）とは対照的に、かかる高い安定性を示した。
【0051】
第１段階では、フラグメントＢがＣｌであり、下記式（Ｉ）：
で表される上記ホスファフェナレンクロロ誘導体（化合物１）を、［１－フェニル－２，５－ジ（２－ピリジル）ホスホール］ＡｕＣｌ、トリフェニルホスフィン－ＡｕＣｌ（Ｐｈ３ＰＡｕＣｌ）及びトリエチルホスフィン－ＡｕＣｌ（Ｅｔ３ＰＡｕＣｌ）を含む一連の異なるクロロ誘導体と比較することにより、本発明化合物の電子特性を調べた。
【化4】
【0052】
これらの錯体は全て、オーラノフィン様構造の合成のためのフラグメントＡとして報告された別個のリン配位子を含んでいる。［１－フェニル－２，５－ジ（２－ピリジル）ホスホール］ＡｕＣｌは、上で引用した非特許文献５によって新規の金ホスホール阻害剤（ＧｏＰＩ）として報告された。
【0053】
後者のリン配位子の明確な電子特性を反映して、それらの３１Ｐ－ＮＭＲはＡｕＣｌ錯体系列内で大きく異なっていた。［１－フェニル－２，５－ジ（２－ピリジル）ホスホール］ＡｕＣｌ、Ｐｈ３ＰＡｕＣｌ及びＥｔ３ＰＡｕＣｌの３１Ｐシグナルは３２ｐｐｍ～４０ｐｐｍの範囲にあるが、化合物１は２．６ｐｐｍでシングレットを示す（表１を参照されたい）。３１Ｐ－ＮＭＲと同様に、差はかなり限定的であるが、化合物１のＰ－Ａｕ結合距離（２．２２５Å）は、２．２３０Å～２．２３１Åの範囲にある他の金錯体よりも小さい（表１）。後者は、ホスファフェナレンのより強い電子供与能、したがって、化合物１に対するより強いＰ－Ａｕ結合の両方を示す。
【0054】
リン系配位子の立体的要求は、その安定性に関するだけでなく、細胞膜の浸透にも重要な役割を果たすため、重要な特徴である。したがって、これらの化合物の立体障害に関する洞察を提供するために、埋め込み体積パーセント（Ｖ％）を計算し、金原子の配位球に浸透するリン配位子の電子密度をマッピングした。
【0055】
値Ｖ％が高いほど、金原子はより遮蔽される。したがって、化合物１におけるホスファフェナレン配位子のＶ％値はＰｈ３Ｐ（３０．７％）に匹敵する。最も低い値（２７．９％）はトリエチルホスフィンで見られ、最も高い値は２，５－ジ（２－ピリジル）ホスホール誘導体（３２．８％）に属し、これはおそらく金配位球にピリジル置換基が存在するためである。
【0056】
ホスファフェナレン配位子対ホスホール及びホスフィンの対照的な特性を裏付けた後、フラグメントＢの効果を分析した。このために、３つの更なる化合物である下記式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）で表される化合物２、化合物３及び化合物４を調査した。
【化5】
【0057】
重要なことに、化合物１～化合物４は全て、ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ混合物１：９に容易に溶解する。化合物１は最も溶解性が低く、０．１Ｍより高い濃度で沈殿し始めた。一方、化合物４は、最も多様な溶媒、すなわちメタノール、エタノール、ＤＣＭ、ＣＨＣｌ３、Ｅｔ２Ｏ及びアセトンに可溶であり、ペンタン及びヘキサンには不溶であった。
【0058】
３１Ｐ－ＮＭＲの特徴については、フラグメントＢを変更することで、化合物１の２．５６ｐｐｍから、化合物２、化合物３及び化合物４のシグナルがそれぞれ６．６５ｐｐｍ、７．１ｐｐｍ及び８．１７ｐｐｍにシフトした（表１を参照されたい）。繰り返すが、これは、３１Ｐ－ＮＭＲシグナルが３０ｐｐｍ以上で見られるホスホール及びホスフィンの類縁体とは全く対照的である。化合物１～化合物４の構造特性を更に詳しく知るために、Ｘ線分析を行った。
【0059】
そのため、化合物２及び化合物３の結晶化に成功し、それらの特性を親化合物１と比較した（表１）。残念ながら、数ヶ月にわたって化合物４を技術及び溶媒のプールで結晶化する試みは失敗した。
【0060】
一連の化合物１～化合物３の中で、Ａｕ－Ｐ結合長は、化合物１の２．２２５Åから化合物２及び化合物３のそれぞれ２．２４３Å及び２．２５Åまでわずかに伸びている。Ａｕ－フラグメントＢ結合距離は同じ傾向に従い、化合物１の２．２９３Åから化合物２及び化合物３の２．３２６Å及び２．３３２Åとなる。
【0061】
【表1】
【0062】
１Ｈ－ＮＭＲを７２時間（バイオアッセイの一般的な測定時間を超える）モニタリングすることにより、錯体１～錯体４の安定性を検証するために実施された実験では、分解の兆候は見られなかった。
【0063】
化合物１～化合物４の特徴を分析した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行った。まず、ホスファフェナレン－金（Ｉ）錯体１～４の最も効果的なフラグメントＢを、クリスタルバイオレット増殖アッセイによる神経膠腫細胞増殖の抑制について系統的に調べた。この目的のため、ＧＢＭ細胞株ＮＣＨ８２及びＮＣＨ８９を、それぞれ化合物１、化合物２、化合物３、及び化合物４の濃度を増加させて４８時間インキュベートした。
【0064】
全ての誘導体が神経膠腫細胞増殖の阻害に対して活性であることが明らかになった（表２を参照されたい）。化合物１～化合物３は、ＮＣＨ８２及びＮＣＨ８９でそれぞれ８．２１±０．５２μＭ～１１．４±０．１１μＭ、及び１５．１±０．７１μＭ～１８．１±１．０４μＭの範囲の平均ＩＣ５０値を示したが、最も強い抗増殖効果は、化合物４を含むチオ糖について観察され、それぞれ、ＧＢＭ細胞株ＮＣＨ８２及びＮＣＨ８９に対する平均ＩＣ５０値が１．４４±０．１６μＭ及び２．９±０．４１μＭであった。
【0065】
図１は、ＮＣＨ８２に適用された化合物４の３つの生物学的複製のうちの１つを例示的に示す。
【0066】
後者の錯体の活性を更に裏付けるために、追加の原発性膠芽腫細胞株ＮＣＨ２１０及びＮＣＨ１２５を化合物４で処理し、同等、また更に良好な平均ＩＣ５０値、すなわちそれぞれ２．７９±０．０７μＭ及び０．７８±０．０４μＭを得た（表２）。
【0067】
【表2】
【0068】
ほとんどの薬物ベースの治療法が治療抵抗性の膠芽腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）のために失敗する可能性があるという仮定に基づいて、本発明者らは、ＮＣＨ４２１ｋ、ＮＣＨ６４４、及びＮＣＨ６６０ｈ等の十分に特徴付けられたＧＳＣ株を標的とする可能性を更に調査した。これらの細胞株は、Campos B. et al., “Differentiation therapy exerts antitumor effects on stem-like glioma cells“, Clin Cancer Res. 2010 May 15;16(10), pages 2715-28に記載された。
【0069】
この目的のため、その抗増殖特性を考慮して、化合物４を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏｗ（商標）アッセイを使用して浮遊ニューロスフェアとして成長するＧＳＣに対して用いた。その結果、ＧＳＣの処理では、ＮＣＨ４２１ｋ、ＮＣＨ６４４、ＮＣＨ６６０ｈでそれぞれ６．９５±１．９５μＭ、６．６０±１．９８μＭ、及び２．６６±０．５８μＭの顕著な平均ＩＣ５０値を示した。この特定のタイプの細胞でわずかに高いＩＣ５０値は、それらの深い自己複製能力及び薬物感受性の低下によって引き起こされる可能性があり、それでも後者のＩＣ５０値は、従来のＧＢＭ細胞で見られるのと同様の範囲にある。
【0070】
腫瘍細胞の増殖の増加に加えて、侵襲性の高い細胞成長はＧＢＭの悪性腫瘍を引き起こす。本発明による化合物の抗癌作用のより完全な全体像を得るために、ＧＢＭ細胞浸潤に対する化合物４の効果を、ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９、ＮＣＨ１２５、及びＮＣＨ２１０の細胞を用いた従来の創傷治癒アッセイを用いて調べた。
【0071】
異なる濃度での化合物４の適用は、少なくとも対応するＩＣ５０濃度を採用した場合にのみ、未処理の対照細胞と比較して創傷閉鎖を有意に減少させ、より低い濃度の化合物４では同じことは観察されなかった。
【0072】
創傷閉鎖は、濃度ｃ（ＩＣ５０）／２及びｃ（ＩＣ５０）／１０で顕著な影響を受けなかった。それにもかかわらず、限られた腫瘍細胞増殖しか起こらない２４時間という短い観察時間は、化合物４の作用機序が、その顕著な抗増殖特性に加えて、ＩＣ５０値で追加の抗遊走成分を含む可能性があることを依然として支持している。
【0073】
創傷治癒アッセイの結果を図２に示す。創傷治癒アッセイは、ＧＢＭ細胞単層をピペットチップで掻き取り、濃度ｃ（ＩＣ５０）／１０、ｃ（ＩＣ５０）／２、ｃ（ＩＣ５０）、及びｃ（ＩＣ５０）×２の化合物４で２４時間処理することによって実施した。細胞を、掻き取りを導入した後の０時間（ｔ０）及び２４時間（ｔ１）に画像化した。細胞遊走を、ｔ０での無細胞領域及びｔ１でのそれらの減少を測定することによって評定した。
【0074】
図２の左上隅は、ＮＣＨ８２ ｐ８５腫瘍細胞を無処理（対照）で、及びｃ（ＩＣ５０）の化合物４で処理し、インキュベーション時間０及び２４時間で撮った写真である。図２の棒グラフは、個々の細胞株のデータを３つの生物学的反復の平均±標準偏差として表したものを示す。
【0075】
さらに、化合物４がＧＢＭ細胞（ＮＣＨ８２及びＮＣＨ８９）及びＧＳＣ（ＮＣＨ４２１ｋ、ＮＣＨ６４４、及びＮＣＨ６６０ｈ）を感作してアポトーシスを起こすことができるかどうかを分析した。化合物４の濃度の増加に伴うアポトーシス／ネクローシス細胞の増加を図３に示す。図３Ａは、ＮＣＨ８９未処理細胞のフローサイトメトリー分析を示し、１μＭ、２μＭ、及び１０μＭの化合物４に２４時間曝露すると、アポトーシス／ネクローシス細胞の用量依存的な増加が明らかになった。
【0076】
図３Ｂは、従来の膠芽腫細胞株ＮＣＨ８２及びＮＣＨ８９のアポトーシス細胞及びネクローシス細胞の相対的な割合を示す積み上げ型グラフであり、図３Ｃは、神経膠腫幹細胞株ＮＣＨ４２１ｋ、ＮＣＨ６４４、及びＮＣＨ６６０ｈのアポトーシス細胞及びネクローシス細胞の相対的な割合を示す積み上げ型グラフである。
【0077】
したがって、異なる濃度の化合物４との４８時間のインキュベーション期間後、従来のＧＢＭ細胞及びＧＳＣをフローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をアポトーシス／ネクローシスの指標として使用した。表２に列挙された得られたＩＣ５０値と一致して、ＮＣＨ８２細胞が最も感受性の高いＧＢＭ細胞株のようであった。
【0078】
既に２μＭの薬物濃度が高い割合の細胞でアポトーシスを誘導した（図３Ｂ）。対照的に、ＮＣＨ８９細胞はプログラムされた細胞死に対してより耐性があり、化合物４の濃度２μＭでは、細胞死が観察されなかった（図３Ｂ）。分析されたＧＳＣ（図３Ｃ）では、アポトーシスの誘導が実証されたが、程度は低かった。
【0079】
請求項１で定義される化合物、すなわち６員リン複素環に基づく金（Ｉ）錯体は、従来の膠芽腫細胞だけでなく、重要なことに、膠芽腫幹細胞様細胞に対しても新規化学療法剤の開発のための顕著な可能性を有することを示すことができた。
【0080】
これは、４つの異なるホスファフェナレン－金（Ｉ）誘導体の細胞傷害効果の体系的評定の結果であり、チオ糖誘導体、すなわち化合物４について最良の結果が得られた。特に、化合物４は、従来のＧＢＭ細胞及びＧＳＣの両方について細胞増殖の有意な抑制を示した。
【0081】
さらに、化合物４は膠芽腫細胞に対して抗遊走効果を示し、従来のＧＢＭ細胞及びＧＳＣ細胞を感作してアポトーシスを起こすことが示された。本発明による化合物は、高い安定性を提供し、水性媒体への溶解性を満たし、可能性のある更なる要件を満たす合成汎用性を提供する。
【0082】
前述の化合物１～化合物４で得られた有望な知見から離れて、本発明者らは、本明細書において記載される（claimed）化合物の優れた分光学的特性、安定性、及び最も重要なことに、生理活性を示す、更に特異的な改良型ホスファフェナレン－金（Ｉ）錯体の開発に着手した。
【0083】
これに関して、下記式（Ｖ）：
で表されるＡｕＣｌフラグメントに配位したホスファフェナレンコアと縮合したピロール部分を含む化合物５を試験した
【化6】
【0084】
ピロール含有ホスファフェナレンは安定しており、材料科学に関連して優れた光電子特性を実証し、最大８０％の蛍光量子収率を持ち、光電気化学セル、有機発光ダイオード、及びエレクトロフルオロクロミックデバイスに使用されている。これらの特性に基づいて、ピロール含有ホスファフェナレンは、ｉｎ ｖｉｖｏでの機構調査にとって特に価値のある重要な分光学的特性を有する薬物の追加の利点を提供する可能性がある。
【0085】
化合物５は更に、化合物５のクロリド原子を、下記の式（ＶＩ）（本明細書では式（Ｂ）とも参照される）に示すように化合物６中の３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートと置き換えて、化合物２（上記を参照されたい）の類縁体化合物である化合物６に変換した：
【化7】
【0086】
生理活性に対する追加の構造修飾の影響を分析するために、ピロールのメチル置換基をより嵩高い置換基、すなわちフェニルスルホニルに置き換えた。これにより、下記式（ＶＩＩ）で表されるクロリド原子を担持した化合物７、及び下記式（ＶＩＩＩ）で表される３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレート部分を有する対応する誘導体化合物８がそれぞれ得られた。
【化8】
【0087】
構造修飾は分子の電子分布の変化をもたらし、これらは１Ｈ－ＮＭＲに反映される（データ示さず）。化合物５のＣｌ原子を糖誘導体３，４，５－トリアセチルオキシ－６－（アセチルオキシメチル）オキサン－２－チオレートに置換して化合物６を生成しても、わずかな変化しか生じなかった。
【0088】
しかしながら、Ｎ－置換基は大きな影響を及ぼした。ピロール縮合ホスファフェナレンの窒素にフェニルスルホニル基を導入すると、ピロールフラグメントとナフタレンの特定のプロトンの劇的な脱遮蔽がもたらされた。
【0089】
次に、化合物１及び化合物５のクロリド誘導体と比較して、化合物７はフェニルスルホニル基の電子求引効果に由来する構造結果を示す。一方、化合物４、化合物６及び化合物８の全ての糖誘導体は、８．２ｐｐｍ、９．１ｐｐｍ及び９．５ｐｐｍで明確に脱遮蔽された３１Ｐ－ＮＭＲを示す。これらの値は、以前に報告された生理活性ホスホール及びホスフィンベースの金錯体で観察されたもの（３２ｐｐｍ～４７ｐｐｍの範囲）よりも大幅に低い。
【0090】
薬物の生理活性における縮合ホスファフェナレン環の役割を調べるために、膠芽腫細胞株ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９及びＮＣＨ１４９における細胞増殖を阻害する化合物５の能力を調べた。この目的のため、化合物５の濃度を増大させて細胞をインキュベートし、細胞増殖をクリスタルバイオレットアッセイにより評価した。
【0091】
化合物５は、３つの細胞株全てにおいて抗増殖効果を示した。細胞株ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９及びＮＣＨ１４９の平均ＩＣ５０値は、それぞれ８．１μＭ、１５．１μＭ及び８．８７μＭであった（以下の表３を参照されたい）。これらの値は、上記の表２に示すように化合物１で見られる値、すなわちＮＣＨ８２及びＮＣＨ８９でそれぞれ１１．４μＭ及び１７．３μＭのＩＣ５０と比較してわずかに低い。
【0092】
したがって、チオフェン部分をピロール環で置換することによってホスファフェナレンコアを修飾することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの改善された抗増殖活性をもたらす。上で検討される観察結果と一致して、金部分のクロリド原子を糖誘導体に置き換えると、薬物の生理活性が著しく増加する（表２及び表３）。
【0093】
化合物６は、化合物５よりも１桁低い平均ＩＣ５０値を示し、サブマイクロモル濃度、すなわち、細胞株ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９及びＮＣＨ１４９についてそれぞれ０．７３μＭ、４．００μＭ及び０．８７μＭに達した（表３）。ここでも、これらの値は、ピロール複素環の代わりにチオフェン環に縮合したホスファフェナレンを含有する類縁体化合物４（表３）の値よりも著しく低い。
【0094】
次に、ホスファフェナレンコアの窒素にフェニルスルホニルフラグメントを導入すると（化合物８）、化合物５と比較してより高い生理活性がもたらされる。しかしながら、その値は化合物６のＮ－メチル誘導体のものより若干低い。
【0095】
【表3】
【0096】
化合物８の平均ＩＣ５０値は、膠芽腫細胞株ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９及びＮＣＨ１４９でそれぞれ１．３７μＭ、４．４９μＭ及び２．８５μＭであった（表３）。全体として、生理活性を維持するためにホスファフェナレンコアの縮合複素環に関して柔軟性があるように見えるが、ホスファフェナレンコアの縮合複素環の特定の種類は薬物の生理活性に影響を与えるようである。具体的には、ピロールは細胞傷害活性の更なる改善をもたらすようである。
【0097】
対照的に、電子受容性フェニルスルホニル基を有するホスファフェナレンの嵩高さを更に増加させることも、薬剤の生理活性を大部分維持するが、それ以上増強しない。
【0098】
化合物６で得られた顕著な結果に基づいて、一連の異なる癌細胞株に対するその抗増殖効果を調べた。この目的のため、上記の３つの膠芽腫細胞株に加えて、脳転移（ＮＣＨ５１７、ＮＣＨ６０４ａ及びＮＣＨ４６６）、髄膜腫（ＮＣＨ９３及びＢｅｎＭｅｎ－１）、ＩＤＨ変異神経膠腫（ＮＣＨ５１１ｂ、ＮＣＨ１６１８及びＮＣＨ３７６３）、及び頭頸部癌細胞株（ＨＮＯ２１０、ＨＮＯ１９９及びＨＮＯ９７）を含む他の１１の癌細胞株に化合物６を用いた（表３）。
【0099】
全体として、化合物６は全ての細胞株で優れた抗増殖効果を示し、侵襲性の高い脳転移癌細胞さえも含む幾つかの細胞株の平均ＩＣ５０値は約１．５μＭであった。ＩＤＨ変異神経膠腫細胞株ＮＣＨ１６８１では、ＩＣ５０値がわずか０．８８μＭで印象的な結果が得られた。
【0100】
これらの結果に動機付けられて、脳転移、髄膜腫、ＩＤＨ変異神経膠腫及び頭頸部癌に由来する癌細胞株においてアポトーシスを誘導する化合物６の能力を分析した。この目的で、細胞を異なる濃度の化合物６と共に４８時間インキュベートし、続いてフローサイトメトリーによって分析した（図４Ａの代表例を参照されたい）。アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をアポトーシス／ネクローシスの指標として使用した。
【0101】
予想通り、化合物６は、分析された全ての細胞株でアポトーシス／ネクローシスを誘導することができた（図４）。得られたＩＣ５０値（上記の表３を参照）と一致して、脳転移及び髄膜腫細胞株は、頭頸部癌細胞株よりも感受性が高いように見えた。２μＭの薬物濃度は、ＮＣＨ４６６、ＮＣＨ５１７、ＮＣＨ６０４ａ及びＮＣＨ９３のうち５０％を超える細胞でアポトーシス／ネクローシスを誘導した（図４Ｂ及び図４Ｃ）。一方、頭頸部癌細胞株の５０％を超える細胞でアポトーシス／ネクローシスを引き起こすには、５μＭの薬物濃度が必要であった（図４Ｅ）。
【0102】
これらの驚くべき優れた結果に加えて、本発明の化合物は、照明の反復サイクルに対する制御された熱力学的条件下での化合物６及び化合物８を用いた実験的試験によって示されるように、非常に高い安定性を示した（データは示さず）。
【0103】
本発明の一例として観察された化合物６の高い生理活性及び分光学的特性に基づいて、ＮＣＨ８２細胞株における薬物取り込み動態を調べた。この目的のため、化合物６の濃度を増加させて細胞を処理し、その薬物取り込みを蛍光顕微鏡（励起／発光３５０ｎｍ／４５５ｎｍ；データは示さず）でモニターした。
【0104】
驚くべきことに、１０μＭ（すなわちＩＣ５０値を超える濃度）の化合物６でわずか１時間処理した後、細胞は化合物を内在化させ、収縮及び剥離を開始することができた。１μＭの化合物６で処理した細胞は、１時間後に化合物を吸収し始めたが、その死は２４時間後にのみ観察できた。０．１μＭの濃度で使用した場合、化合物６は２４時間後に内在化を開始したが、処理開始から４８時間後に初めて死細胞が観察された。
【0105】
要約すると、本明細書に提示された結果は、本発明のホスファフェナレン金錯体の生理活性が、それらの構造的特徴の僅かな化学修飾によって影響を受け、改善され得ることを実証する。それらの固有の特性は、π伸長コア上の電子分布、分子の嵩高さ及びそれらの光物理的特性を調整することを可能にする。
【0106】
特に、ピロール縮合ホスファフェナレン誘導体は、チオフェンベースの類縁体よりも更に改善された性能をもたらすようであり、これら全ての化合物が数週間安定していることは注目に値する。また、金原子に結合した糖誘導体は、クロリド原子と比較して更に増加した生理活性を提供する。全体として、本明細書に記載される（described and claimed herein）ホスホフェナレン金錯体は、顕著な、前例のない、驚くべき抗増殖能力を持つ。
【0107】
ホスホフェナレン金錯体は、膠芽腫、脳転移、髄膜腫、ＩＤＨ変異神経膠腫及び頭頸部癌に由来する１４の異なる腫瘍細胞株の増殖を阻害する。さらに、上記化合物は、癌細胞株を感作してアポトーシスを起こすようであり、細胞への効率的な取り込みを実証する。
【0108】
まとめると、本発明のホスファフェナレン金錯体の広範な適用性及び高い生理活性により、それらの顕著な分光学的特性と相まって、致死性疾患の改善された治療のための有望な治療薬を提供するためにこれらの化合物を適切に使用できると考えられる。
【0109】
本発明の範囲に含まれる構造修飾は、実験的に試験された特許請求の範囲の化合物の実質的に同じ溶媒和殻半径を有する。これらの修飾は、錯体の親油性をわずかに変更するだけである。しかしながら、本発明による全ての錯体のサイズが比較的小さいため、親油性の変化は、細胞傷害効果に関して実質的な差異をもたらすとは予想されない。
【0110】
本発明の範囲に含まれる全ての化合物は、抗癌効果を担う活性金原子を保持／配位するために、リン中心において同等の電子密度を示す。したがって、現在請求されている全ての化合物が、類似の構造特性に基づいて類似の技術的効果を示すことは合理的かつ妥当であると考えられる。
【実施例】
【0111】
以下では、前述の化合物の合成及び特性評価に関する実験的詳細が提供される。
【0112】
一般的な情報
全ての反応を、乾燥ガラス器具中及びシュレンク技術を用いて精製アルゴン又は窒素の不活性雰囲気下で行った。ＣＨ２Ｃｌ２及びＴＨＦ等の溶媒を、溶媒精製システムＭＢ ＳＰＳ－８００から直接使用した。ＡｃＯＥｔ、エタノールアセトンを商業供給業者から購入し、そのまま使用した。キサントゲン酸エチルカリウム、ＡｇＮＯ３、ＫＳＣＮ、１－チオ－β－Ｄ－グルコース四酢酸、硫酸マグネシウムを、商業供給業者から購入し、そのまま使用した。
全ての反応を、乾燥ガラス器具中及びシュレンク技術を用いて精製アルゴン又は窒素の不活性雰囲気下で行った。ＣＨ２Ｃｌ２及びＴＨＦ等の溶媒を、溶媒精製システムＭＢ ＳＰＳ－８００から直接使用した。ＡｃＯＥｔ、エタノールアセトンを商業供給業者から購入し、そのまま使用した。キサントゲン酸エチルカリウム、ＡｇＮＯ３、ＫＳＣＮ、１－チオ－β－Ｄ－グルコース四酢酸、硫酸マグネシウムを、商業供給業者から購入し、そのまま使用した。
【0113】
ＮＭＲ測定：
１Ｈ、１３Ｃ、１及び３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを、BrukerのＡｖａｎｃｅ ＤＲＸ－３００、BrukerのＡｖａｎｃｅ ５００、又はBrukerのＡｖａｎｃｅ ６００で記録した。化学シフトは百万分率（ｐｐｍ、δ）で表され、外部の８５％Ｈ３ＰＯ４（３１Ｐ）、又は内部標準として溶媒シグナル（１Ｈ／１３Ｃ）：ＣＤ２Ｃｌ２（５．３３ｐｐｍ／５３．８０ｐｐｍ）を参照する。シグナルの記載は、ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｍ＝マルチプレット、及びｂｒ＝ブロードを含む。結合定数は全て絶対値で、Ｊ値はヘルツ（Ｈｚ）単位で表される。
１Ｈ、１３Ｃ、１及び３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを、BrukerのＡｖａｎｃｅ ＤＲＸ－３００、BrukerのＡｖａｎｃｅ ５００、又はBrukerのＡｖａｎｃｅ ６００で記録した。化学シフトは百万分率（ｐｐｍ、δ）で表され、外部の８５％Ｈ３ＰＯ４（３１Ｐ）、又は内部標準として溶媒シグナル（１Ｈ／１３Ｃ）：ＣＤ２Ｃｌ２（５．３３ｐｐｍ／５３．８０ｐｐｍ）を参照する。シグナルの記載は、ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｍ＝マルチプレット、及びｂｒ＝ブロードを含む。結合定数は全て絶対値で、Ｊ値はヘルツ（Ｈｚ）単位で表される。
【0114】
質量分析：
ＭＳ及びＨＲＭＳを、ハイデルベルク大学のＯｒｇａｎｉｓｃｈ－Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔで測定した。ＤＡＲＴスペクトルにはBrukerのＡｐｅｘＱｅ ｈｙｂｒｉｄ ９．４ Ｔ ＦＴ－ＩＣＲを使用し、ＥＩスペクトルにはＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦＧＣｘ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔを使用した。
ＭＳ及びＨＲＭＳを、ハイデルベルク大学のＯｒｇａｎｉｓｃｈ－Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔで測定した。ＤＡＲＴスペクトルにはBrukerのＡｐｅｘＱｅ ｈｙｂｒｉｄ ９．４ Ｔ ＦＴ－ＩＣＲを使用し、ＥＩスペクトルにはＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦＧＣｘ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔを使用した。
【0115】
リン配位子の立体障害：
埋め込み体積パーセント％Ｖの計算は、無料のウェブアプリケーションソフトウェア（http://www.molnac.unisa.it/OMtools/sambvca.php）を使用し、球半径として３．５０Åを考慮し実行した。水素原子は省略され、計測したＢｏｎｄｉ半径は１．７であった。このソフトウェアは、Poater, B. et al., "SambVca: A Web Application for the Calculation of the Buried Volume of N‐Heterocyclic Carbene Ligands", Eur. J. Inorg. Chem., 2009, pages 1759-1766によって提示される。
埋め込み体積パーセント％Ｖの計算は、無料のウェブアプリケーションソフトウェア（http://www.molnac.unisa.it/OMtools/sambvca.php）を使用し、球半径として３．５０Åを考慮し実行した。水素原子は省略され、計測したＢｏｎｄｉ半径は１．７であった。このソフトウェアは、Poater, B. et al., "SambVca: A Web Application for the Calculation of the Buried Volume of N‐Heterocyclic Carbene Ligands", Eur. J. Inorg. Chem., 2009, pages 1759-1766によって提示される。
【0116】
Ｘ線結晶学：
Ｘ線結晶構造解析を、BrukerのＳｍａｒｔ ＣＣＤ又はBrukerのＳｍａｒｔ ＡＰＥＸ機でＭｏ－Ｋα放射を用いて測定した。回折強度を、ローレンツ効果及び偏光効果について補正した。経験的吸収補正を、逆格子空間のラウエ対称性に基づくＳＡＤＡＢＳを用いて適用した（吸収補正用プログラムＳＡＤＡＢＳ ２００８／１；G. M. Sheldrick, Bruker Analytical X-ray-Division, Madison, Wisconsin 2012）。
Ｘ線結晶構造解析を、BrukerのＳｍａｒｔ ＣＣＤ又はBrukerのＳｍａｒｔ ＡＰＥＸ機でＭｏ－Ｋα放射を用いて測定した。回折強度を、ローレンツ効果及び偏光効果について補正した。経験的吸収補正を、逆格子空間のラウエ対称性に基づくＳＡＤＡＢＳを用いて適用した（吸収補正用プログラムＳＡＤＡＢＳ ２００８／１；G. M. Sheldrick, Bruker Analytical X-ray-Division, Madison, Wisconsin 2012）。
【0117】
重原子回折を直接法で解き、フルマトリックス最小二乗アルゴリズムでＦ２に対して洗練した。水素原子を等方的に洗練又は計算した。構造は、ＳＨＥＬＸＴＬ［Ｓ２］ソフトウェアパッケージを使用して解き、洗練した。化合物２の結晶構造を室温でＤＣＭ／ペンタンから、化合物３の結晶構造を室温でゆっくりと蒸発させることによりＤＣＭ溶液から得た。これらの化合物の補足結晶学データは、ケンブリッジ結晶学データセンターからwww.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif－ＣＣＤＣ １８３２８１３（化合物２）及び１８３２８１４（化合物３）を介して無料で入手することができる。
【0118】
細胞培養条件：
膠芽腫（ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９及びＮＣＨ１４９）、脳転移（ＮＣＨ４６６、ＮＣＨ５１７及びＮＣＨ６０４ａ）、髄膜腫（ＮＣＨ９３及びＢｅｎ－Ｍｅｎ－１（ＤＳＭＺ、ドイツ国ブラウンシュヴァイク））及び頭頸部癌（ＨＮＯ９７、ＨＮＯ１９９及びＨＮＯ２１０）に由来する接着成長細胞株、並びにＩＤＨ変異神経膠腫（ＮＣＨ５５１ｂ、ＮＣＨ１６１８及びＮＣＨ３７６３）に由来する幹細胞様細胞株を、既に記載したように特性評価し、培養した（B. Campos et al., Clin. Cancer Res. 2010, 16 (10), 2715-2728. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-09-1800.、P. Dao Trong et al., IJMS 2018, 19 (10), 2903. https://doi.org/10.3390/ijms19102903.、Y. Jungwirth et al., Cancers 2019, 11 (4), 545. https://doi.org/10.3390/cancers11040545.、S. Karcher et al., Int. J. Cancer 2006, 118 (9), 2182-2189. https://doi.org/10.1002/ijc.21648.、及びC. Rapp et al., Acta Neuropathol. 2017, 134 (2), 297-316. https://doi.org/10.1007/s00401-017-1702-1.）。
膠芽腫（ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９及びＮＣＨ１４９）、脳転移（ＮＣＨ４６６、ＮＣＨ５１７及びＮＣＨ６０４ａ）、髄膜腫（ＮＣＨ９３及びＢｅｎ－Ｍｅｎ－１（ＤＳＭＺ、ドイツ国ブラウンシュヴァイク））及び頭頸部癌（ＨＮＯ９７、ＨＮＯ１９９及びＨＮＯ２１０）に由来する接着成長細胞株、並びにＩＤＨ変異神経膠腫（ＮＣＨ５５１ｂ、ＮＣＨ１６１８及びＮＣＨ３７６３）に由来する幹細胞様細胞株を、既に記載したように特性評価し、培養した（B. Campos et al., Clin. Cancer Res. 2010, 16 (10), 2715-2728. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-09-1800.、P. Dao Trong et al., IJMS 2018, 19 (10), 2903. https://doi.org/10.3390/ijms19102903.、Y. Jungwirth et al., Cancers 2019, 11 (4), 545. https://doi.org/10.3390/cancers11040545.、S. Karcher et al., Int. J. Cancer 2006, 118 (9), 2182-2189. https://doi.org/10.1002/ijc.21648.、及びC. Rapp et al., Acta Neuropathol. 2017, 134 (2), 297-316. https://doi.org/10.1007/s00401-017-1702-1.）。
【0119】
接着性成長細胞株（ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９、ＮＣＨ２１０、及びＮＣＨ１２５）並びに神経膠腫幹細胞様細胞株（ＮＣＨ４２１ｋ、ＮＣＨ６４４、ＮＣＨ６６０ｈ）を、術中に得られた膠芽腫サンプルから樹立し、既に記載したように特性評価し、培養した（S. Karcher et al., Int. J. Cancer. 2006, 118, 2182-2189.、C. Rapp et al., Acta Neuropathol. 2017, 134, 297-316.、及びB. Campos et al., Clin. Cancer Res. 2010, 16, 2715-2728.）。細胞株は認証され、ハイデルベルク大学医学部の治験審査委員会によって承認された研究提案に従って、患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
【0120】
増殖アッセイ－接着細胞株：
細胞成長に対する異なる化合物の効果を、前述のようにクリスタルバイオレット法によって評価した（J. P. Rigalli et al., Cancer Lett. 2016, 376, 165-172.）。簡潔には、細胞を９６ウェルプレート（１００００細胞／ウェル）に播種した。２４時間後、細胞培養培地を新鮮な化合物含有培地（１０種類の異なる濃度（０．０１μＭ～２００μＭ））に置き換えた。４８時間の曝露後の細胞増殖阻害の程度を、生存細胞のクリスタルバイオレット染色により決定した。したがって、細胞を洗浄し、０．５％クリスタルバイオレット溶液（１００ｍｌメタノール中２．５ｇ、４００ｍｌアクアビデスト（aqua bidest：再蒸留水）で希釈）で１５分間染色し、すすぎ、一晩乾燥させた。
細胞成長に対する異なる化合物の効果を、前述のようにクリスタルバイオレット法によって評価した（J. P. Rigalli et al., Cancer Lett. 2016, 376, 165-172.）。簡潔には、細胞を９６ウェルプレート（１００００細胞／ウェル）に播種した。２４時間後、細胞培養培地を新鮮な化合物含有培地（１０種類の異なる濃度（０．０１μＭ～２００μＭ））に置き換えた。４８時間の曝露後の細胞増殖阻害の程度を、生存細胞のクリスタルバイオレット染色により決定した。したがって、細胞を洗浄し、０．５％クリスタルバイオレット溶液（１００ｍｌメタノール中２．５ｇ、４００ｍｌアクアビデスト（aqua bidest：再蒸留水）で希釈）で１５分間染色し、すすぎ、一晩乾燥させた。
【0121】
次に、クリスタルバイオレットをメタノールに可溶化し、５５５ｎｍにおける吸光度を測定した。増殖指数は、以前に記載されたようにベースライン（細胞なし）に対する百分率としてクリスタルバイオレット吸収強度として計算した（T. Peters et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2006, 372, 291-299.）。細胞生存率をμＭ単位の薬物濃度（μＭ単位の（化合物ｘの）ｃ）の１０進対数に対してプロットし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０２（GraphPad Software、米国サンディエゴ）を使用してシグモイド用量反応曲線に適合させた。
【0122】
増殖アッセイ－神経膠腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）株：
ＩＤＨ変異神経膠腫由来の神経膠腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）及びＧＳＣ株の細胞成長に対する化合物４及び化合物６の効果を評定するため、細胞ＡＴＰレベルを発光ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Promega Corp、ウィスコンシン州マディソン）を用いて測定した。ＧＣＳスフェロイド培養物を穏やかに解離させ、細胞懸濁液を９６ウェル組織培養プレート（８０００細胞／ウェル、１００μｌ／ウェル）に播種した。化合物なしで２４時間のインキュベーション期間の後、０．０１μＭから２００μＭの範囲の１０種類の最終濃度で新たに再構成された化合物を添加し、細胞を４８時間インキュベートした。
ＩＤＨ変異神経膠腫由来の神経膠腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）及びＧＳＣ株の細胞成長に対する化合物４及び化合物６の効果を評定するため、細胞ＡＴＰレベルを発光ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Promega Corp、ウィスコンシン州マディソン）を用いて測定した。ＧＣＳスフェロイド培養物を穏やかに解離させ、細胞懸濁液を９６ウェル組織培養プレート（８０００細胞／ウェル、１００μｌ／ウェル）に播種した。化合物なしで２４時間のインキュベーション期間の後、０．０１μＭから２００μＭの範囲の１０種類の最終濃度で新たに再構成された化合物を添加し、細胞を４８時間インキュベートした。
【0123】
測定前に、プレートを室温で３０分間平衡化した。次に、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を各ウェルに加え、プレートをオービタルシェーカーに２分間置き、内容物を混合した。次いで、プレートを室温で１０分間インキュベートし、最後に発光を測定した。細胞生存率をμＭ単位の薬物濃度（ｃ（化合物４／化合物６の）μＭ）の１０進対数に対してプロットし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０２（GraphPad Software、米国サンディエゴ）を使用してシグモイド用量反応曲線に適合させた。
【0124】
アポトーシスに対する薬物の効果（アネキシンＶアポトーシスアッセイ）：
アポトーシス及びネクローシスの程度を定量化するために、ＤＡＰＩと組み合わせたアネキシンＶ染色、又はアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による細胞の二重標識のいずれかを使用した。二重標識により、アポトーシス細胞（アネキシンＶ陽性／ＤＡＰＩ陰性又はアネキシンＶ陽性／ＰＩ陰性）とネクローシス細胞（アネキシンＶ陽性／ＤＡＰＩ陽性又はアネキシンＶ陽性／ＰＩ陽性）との区別が可能になる。細胞を６ウェルプレート（２．５×１０５／ウェル）に播種し、一晩放置した。培地を規定の薬物濃度又は化合物溶媒ＤＭＳＯ（未処理対照）を含む新鮮な培地に置き換え、２４時間インキュベートした。陽性対照として、１μＭのアポトーシス誘導試薬スタウロスポリン（＃９９５３、Cell Signaling Technology、米国ダンバス）で細胞を処理した。
アポトーシス及びネクローシスの程度を定量化するために、ＤＡＰＩと組み合わせたアネキシンＶ染色、又はアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による細胞の二重標識のいずれかを使用した。二重標識により、アポトーシス細胞（アネキシンＶ陽性／ＤＡＰＩ陰性又はアネキシンＶ陽性／ＰＩ陰性）とネクローシス細胞（アネキシンＶ陽性／ＤＡＰＩ陽性又はアネキシンＶ陽性／ＰＩ陽性）との区別が可能になる。細胞を６ウェルプレート（２．５×１０５／ウェル）に播種し、一晩放置した。培地を規定の薬物濃度又は化合物溶媒ＤＭＳＯ（未処理対照）を含む新鮮な培地に置き換え、２４時間インキュベートした。陽性対照として、１μＭのアポトーシス誘導試薬スタウロスポリン（＃９９５３、Cell Signaling Technology、米国ダンバス）で細胞を処理した。
【0125】
アポトーシス細胞及びネクローシス細胞を含む処理上清を回収した後、細胞を採取し、洗浄し、最大１×１０６細胞を、製造元の指示に従って１：１０００のＤＡＰＩ溶液で希釈したＦＩＴＣコンジュゲート化アネキシンＶ抗体と共にインキュベートするか（＃５１－６５８７４Ｘ、BD Bioscienes、米国フランクリンレイクス）、又は製造元の指示に従ってＦＩＴＣコンジュゲート化アネキシンＶ抗体及びＰＩと共に１５分間インキュベートした（＃５１－６５９７４Ｘ、BD Bioscienes、米国フランクリンレイクス）。細胞を、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（BD Bioscienes、米国フランクリンレイクス）を用いたフローサイトメトリーによって取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ７．６．５（TreeStar、米国アーランド）によって分析した。
【0126】
神経膠腫細胞遊走に対する薬物の効果（スクラッチアッセイ）：
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞遊走に対する薬物の効果を評定するため、細胞を６ウェルプレート（５×１０５／ウェル）に播種し、付着させた。翌日、細胞単層を直線的に掻き取り、ｐ２００ピペットチップで「スクラッチ」を作製した。細胞を洗浄することにより破片を除去し、培地を２４時間３つの異なる細胞株特異的濃度（ＩＣ５０、ＩＣ５０／２、ＩＣ５０／１０）の化合物含有培地５ｍｌと置き換えた。位相差画像を、ＳＣ３０カメラを備えたＢＸ５０顕微鏡（いずれもオリンパス株式会社、日本国東京）を用いて、それぞれの薬物濃度への曝露の０時間及び１２時間後に取得した。両方の時点での無細胞領域を定量化し、イメージングソフトウェアｃｅｌｌＳｅｎｓ（オリンパス株式会社、日本国東京）を使用して比較した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞遊走に対する薬物の効果を評定するため、細胞を６ウェルプレート（５×１０５／ウェル）に播種し、付着させた。翌日、細胞単層を直線的に掻き取り、ｐ２００ピペットチップで「スクラッチ」を作製した。細胞を洗浄することにより破片を除去し、培地を２４時間３つの異なる細胞株特異的濃度（ＩＣ５０、ＩＣ５０／２、ＩＣ５０／１０）の化合物含有培地５ｍｌと置き換えた。位相差画像を、ＳＣ３０カメラを備えたＢＸ５０顕微鏡（いずれもオリンパス株式会社、日本国東京）を用いて、それぞれの薬物濃度への曝露の０時間及び１２時間後に取得した。両方の時点での無細胞領域を定量化し、イメージングソフトウェアｃｅｌｌＳｅｎｓ（オリンパス株式会社、日本国東京）を使用して比較した。
【0127】
薬物取り込み動態：
ＮＣＨ８２細胞による化合物６の取り込み動態を測定するために、ＮＣＨ８２細胞を９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）に播種し、２４時間後、細胞培養培地を化合物６又はＤＭＳＯを含有する培地（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）と置き換えた。画像を、処理開始後１時間、２４時間、４８時間に蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社、日本国新宿）で撮影した。励起／発光スペクトルが３５０ｎｍ／４５５ｎｍのレーザーを使用し、１０倍の対物レンズで画像を撮影した。
ＮＣＨ８２細胞による化合物６の取り込み動態を測定するために、ＮＣＨ８２細胞を９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）に播種し、２４時間後、細胞培養培地を化合物６又はＤＭＳＯを含有する培地（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）と置き換えた。画像を、処理開始後１時間、２４時間、４８時間に蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社、日本国新宿）で撮影した。励起／発光スペクトルが３５０ｎｍ／４５５ｎｍのレーザーを使用し、１０倍の対物レンズで画像を撮影した。
【0128】
合成手順
化合物１を、Romero-Nieto C. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2015（上記で引用、金錯体１６として示される）によって以前に報告されたように調製した。
化合物１を、Romero-Nieto C. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2015（上記で引用、金錯体１６として示される）によって以前に報告されたように調製した。
【0129】
化合物２
【化9】
【0130】
化合物１（１当量、０．０７６ｍｍｏｌ、４２ｍｇ）を４ｍＬのＤＣＭに溶解し、キサントゲン酸エチルカリウム（１当量、０．０７６ｍｍｏｌ、１２ｍｇ）を室温で加えた。粗物質を１．５時間撹拌した。次いで、混合物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、揮発分を減圧下で除去した。粗物質をＡｃＯＥｔで３回洗浄し、ＤＣＭ溶液からのゆっくりとした蒸発によって結晶化させた。収率：８８（４２ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）。
1H-NMR (600 MHz, CD2Cl2): δ 8.26 (ddd, J = 18.8, 7.0, 1.2 Hz, 1H), 8.21 (dd, J = 7.4, 0.8 Hz, 1H), 8.17 (dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H), 8.07 (dd, J = 2.9, 1.1 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.63-7.61 (m, 1H), 7.42 (ddd, J = 13.7, 8.3, 1.1 Hz, 2H), 7.33 (td, J = 7.4, 2.0 Hz, 1H), 7.26 (td, J = 7.5, 2.5 Hz, 2H), 4.55-4.50 (m, 2H), 1.40 (d, J = 14.2 Hz, 3H)。
13C{1H}{31P} NMR (151 MHz, CD2Cl2): δ 138.3 (s, 1C), 136.8 (s, 1C), 136.1 (s, 1C), 135.2 (s, 1C), 134.5 (s, 1C), 133.6 (s, 1C), 132.4 (s, 1C), 131.6 (s, 1C), 129.9 (s, 1C), 129.4 (s, 1C), 128.4 (s, 1C), 127.6 (s, 1C), 127.2 (s, 1C), 126.2 (s, 1C), 124.8 (s, 1C), 124.6 (s, 1C), 123.0 (s, 1C), 123.0 (s, 1C), 70.6 (s, 1C), 14.3 (s, 1C)。
31P-NMR (243 MHz, CD2Cl2): δ 6.55。
ＨＲＭＳ（ＥＩ＋） Ｃ１０Ｈ４Ｂｒ４Ｏ２ ＋の計算値４７１．６９３９、実測値４７１．６９４０。
1H-NMR (600 MHz, CD2Cl2): δ 8.26 (ddd, J = 18.8, 7.0, 1.2 Hz, 1H), 8.21 (dd, J = 7.4, 0.8 Hz, 1H), 8.17 (dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H), 8.07 (dd, J = 2.9, 1.1 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.63-7.61 (m, 1H), 7.42 (ddd, J = 13.7, 8.3, 1.1 Hz, 2H), 7.33 (td, J = 7.4, 2.0 Hz, 1H), 7.26 (td, J = 7.5, 2.5 Hz, 2H), 4.55-4.50 (m, 2H), 1.40 (d, J = 14.2 Hz, 3H)。
13C{1H}{31P} NMR (151 MHz, CD2Cl2): δ 138.3 (s, 1C), 136.8 (s, 1C), 136.1 (s, 1C), 135.2 (s, 1C), 134.5 (s, 1C), 133.6 (s, 1C), 132.4 (s, 1C), 131.6 (s, 1C), 129.9 (s, 1C), 129.4 (s, 1C), 128.4 (s, 1C), 127.6 (s, 1C), 127.2 (s, 1C), 126.2 (s, 1C), 124.8 (s, 1C), 124.6 (s, 1C), 123.0 (s, 1C), 123.0 (s, 1C), 70.6 (s, 1C), 14.3 (s, 1C)。
31P-NMR (243 MHz, CD2Cl2): δ 6.55。
ＨＲＭＳ（ＥＩ＋） Ｃ１０Ｈ４Ｂｒ４Ｏ２ ＋の計算値４７１．６９３９、実測値４７１．６９４０。
【0131】
化合物３
【化10】
【0132】
化合物１（１当量、０．２７３ｍｍｏｌ、１５０ｍｇ）をエタノール４ｍＬに懸濁し、４ｍｌの水に溶解したＡｇＮＯ３（１当量、０．２７３ｍｍｏｌ、４６ｍｇ）と混合した。混合物を１時間撹拌し、５ｍＬのＤＣＭを加えた。３０分間撹拌した後、水中８ＭのＫＳＣＮ ８０μＬを加えた。混合物を１時間撹拌し、ＤＣＭ相を分離し、水相をＤＣＭで３回抽出した。ＭｇＳＯ４で乾燥した後、粗物質を減圧下で濃縮し、セライトを通して濾過した。生成物を、シリカ及びＤＣＭ／ペンタン６：４から純粋なＤＣＭへの溶離液混合物を使用するカラムクロマトグラフィーで精製し、ＤＣＭ／ペンタン混合物から結晶化した。収率：６５％（１０２ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ）。
1H-NMR (600 MHz, CD2Cl2): δ 8.26 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.18 (dd, J = 19.1, 7.0 Hz, 1H), 8.13 (dd, J = 6.6, 3.3 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.71-7.65 (m, 2H), 7.42-7.37 (m, 3H), 7.31 (td, J = 7.8, 2.2 Hz, 2H)。
13C{1H}{31P} NMR (151 MHz, CD2Cl2): δ 138.2 (s, 1C), 136.9 (s, 1C), 136.3 (s, 1C), 134.6 (s, 1C), 134.1 (s, 1C), 134.0 (s, 1C), 132.6 (s, 1C), 132.1 (s, 1C), 130.1 (s, 1C), 129.6 (s, 1C), 128.3 (s, 1C), 127.4 (s, 1C), 126.2 (s, 1C), 125.0 (s, 1C), 123.3 (s, 1C), 123.3 (s, 1C), 121.9 (s, 1C)。
31P-NMR (243 MHz, CD2Cl2): δ 7.10。
ＨＲＭＳ（ＥＩ＋） Ｃ１０Ｈ６Ｂｒ２Ｏ２ ＋の計算値３１５．８７２９１、実測値３１５．８７３７。
1H-NMR (600 MHz, CD2Cl2): δ 8.26 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.18 (dd, J = 19.1, 7.0 Hz, 1H), 8.13 (dd, J = 6.6, 3.3 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.71-7.65 (m, 2H), 7.42-7.37 (m, 3H), 7.31 (td, J = 7.8, 2.2 Hz, 2H)。
13C{1H}{31P} NMR (151 MHz, CD2Cl2): δ 138.2 (s, 1C), 136.9 (s, 1C), 136.3 (s, 1C), 134.6 (s, 1C), 134.1 (s, 1C), 134.0 (s, 1C), 132.6 (s, 1C), 132.1 (s, 1C), 130.1 (s, 1C), 129.6 (s, 1C), 128.3 (s, 1C), 127.4 (s, 1C), 126.2 (s, 1C), 125.0 (s, 1C), 123.3 (s, 1C), 123.3 (s, 1C), 121.9 (s, 1C)。
31P-NMR (243 MHz, CD2Cl2): δ 7.10。
ＨＲＭＳ（ＥＩ＋） Ｃ１０Ｈ６Ｂｒ２Ｏ２ ＋の計算値３１５．８７２９１、実測値３１５．８７３７。
【0133】
化合物４
【化11】
【0134】
ＮａＨを室温で５ｍＬのＴＨＦ中の１－チオ－β－Ｄ－グルコース四酢酸（１当量、０．１８２ｍｍｏｌ、６６ｍｇ）に加えた。混合物を１時間撹拌し、カニューレを介してセライトを通して濾過し、室温で５ｍＬのＴＨＦに溶解した化合物１（０．９当量、０．１６４ｍｍｏｌ、９０ｍｇ）に加えた。溶液を１．５時間撹拌し、溶媒を真空下で除去した。粗物質をＤＣＭに溶解し、セライトを通して濾過し、シリカ及び溶離液としてＡｃＯＥｔ／アセトン８：２を使用するカラムクロマトグラフィーに供した。収率：７２％（１０４ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）。
1H-NMR (600 MHz, CD2Cl2): δ 8.31-8.24 (m, 3H), 8.12 (ddd, J = 6.2, 2.9, 1.1 Hz, 1H), 8.06 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.69-7.64 (m, 2H), 7.45-7.39 (m, 2H), 7.35-7.32 (m, 1H), 7.30-7.26 (m, 2H), 5.20-5.14 (m, 2H), 5.08 (dt, J = 13.1, 9.5 Hz, 2H), 4.14 (qd, J = 12.0, 3.7 Hz, 2H), 3.77 (ddd, J = 10.0, 5.0, 2.5 Hz, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.91 (s, 3H)。
13C{1H}{31P} NMR (151 MHz, CD2Cl2): δ 170.3 (s, 1C), 169.9 (s, 1C), 169.5 (s, 1C), 169.4 (s, 1C), 137.9 (s, 1C), 137.9 (s, 1C), 136.4 (s, 1C), 136.32(s, 1C), 135.6 (s, 1C), 135.5 (s, 1C), 135.1 (s, 1C), 135.1 (s, 1C), 134.2 (s, 1C), 134.1 (s, 1C), 133.0 (s, 1C), 132.0 (s, 1C), 132.0 (s, 1C), 131.1 (s, 1C), 131.1 (s, 1C), 129.5 (s, 1C), 129.0 (s, 1C), 128.9 (s, 1C), 128.1 (s, 1C), 127.2 (s, 1C), 126.7 (s, 1C), 124.3 (s, 1C), 122.8 (s, 1C), 122.8 (s, 1C), 122.5 (s, 1C), 122.4 (s, 1C), 83.0 (s, 1C), 77.6 (s, 1C), 75.7 (s, 1C), 73.9 (s, 1C), 68.7 (s, 1C), 62.6 (s, 1C), 20.9 (s, 1C), 20.4 (s, 1C), 20.4 (s, 1C), 20.4 (s, 1C)。
31P-NMR (122 MHz, CDCl3)
ＨＲＭＳ（ＥＩ＋） Ｃ１０Ｈ６Ｂｒ２Ｏ２ ＋の計算値３１５．８７２９、実測値３１５．８７２８。
1H-NMR (600 MHz, CD2Cl2): δ 8.31-8.24 (m, 3H), 8.12 (ddd, J = 6.2, 2.9, 1.1 Hz, 1H), 8.06 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.69-7.64 (m, 2H), 7.45-7.39 (m, 2H), 7.35-7.32 (m, 1H), 7.30-7.26 (m, 2H), 5.20-5.14 (m, 2H), 5.08 (dt, J = 13.1, 9.5 Hz, 2H), 4.14 (qd, J = 12.0, 3.7 Hz, 2H), 3.77 (ddd, J = 10.0, 5.0, 2.5 Hz, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.91 (s, 3H)。
13C{1H}{31P} NMR (151 MHz, CD2Cl2): δ 170.3 (s, 1C), 169.9 (s, 1C), 169.5 (s, 1C), 169.4 (s, 1C), 137.9 (s, 1C), 137.9 (s, 1C), 136.4 (s, 1C), 136.32(s, 1C), 135.6 (s, 1C), 135.5 (s, 1C), 135.1 (s, 1C), 135.1 (s, 1C), 134.2 (s, 1C), 134.1 (s, 1C), 133.0 (s, 1C), 132.0 (s, 1C), 132.0 (s, 1C), 131.1 (s, 1C), 131.1 (s, 1C), 129.5 (s, 1C), 129.0 (s, 1C), 128.9 (s, 1C), 128.1 (s, 1C), 127.2 (s, 1C), 126.7 (s, 1C), 124.3 (s, 1C), 122.8 (s, 1C), 122.8 (s, 1C), 122.5 (s, 1C), 122.4 (s, 1C), 83.0 (s, 1C), 77.6 (s, 1C), 75.7 (s, 1C), 73.9 (s, 1C), 68.7 (s, 1C), 62.6 (s, 1C), 20.9 (s, 1C), 20.4 (s, 1C), 20.4 (s, 1C), 20.4 (s, 1C)。
31P-NMR (122 MHz, CDCl3)
ＨＲＭＳ（ＥＩ＋） Ｃ１０Ｈ６Ｂｒ２Ｏ２ ＋の計算値３１５．８７２９、実測値３１５．８７２８。
【0135】
化合物５の合成
シュレンクアダプターに接続されたベークアウトした１０ｍＬ一口丸底フラスコに、２－（８－ブロモナフタレン－１－イル）－１－メチル－１Ｈ－ピロール（１．０当量、０．１８ｍｍｏｌ、５２ｍｇ）を３．６ｍＬの乾燥Ｅｔ２Ｏに溶解し、－８０℃に冷却した。次いで、ｔＢｕＬｉ（１．０当量、０．１８ｍｍｏｌ、０．１１ｍＬ、ペンタン中１．７Ｍ）を滴下して加えた。
シュレンクアダプターに接続されたベークアウトした１０ｍＬ一口丸底フラスコに、２－（８－ブロモナフタレン－１－イル）－１－メチル－１Ｈ－ピロール（１．０当量、０．１８ｍｍｏｌ、５２ｍｇ）を３．６ｍＬの乾燥Ｅｔ２Ｏに溶解し、－８０℃に冷却した。次いで、ｔＢｕＬｉ（１．０当量、０．１８ｍｍｏｌ、０．１１ｍＬ、ペンタン中１．７Ｍ）を滴下して加えた。
【0136】
その直後に、リチオ化した２－（８－ブロモナフタレン－１－イル）－１－メチル－１Ｈ－ピロールをＰｈＰＣｌ２（１．０５当量、０．１９μｍｏｌ、２６μＬ、９７％）と反応させ、反応混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、続いて４．５ｍＬ ＤＣＭ及びクロロ（ジメチルスルフィド）金（Ｉ）（ＤＭＳ－ＡｕＣｌ）（１．０当量、０．１８ｍｍｏｌ、５３ｍｇ）を加え、反応混合物を更に１．５時間撹拌した。
【0137】
溶媒を再度真空下で除去し、淡褐色固体を得た。アルミナ及び溶離液としてＤＣＭ：ペンタン（７：３）の混合物を使用するカラムクロマトグラフィーで精製した後、黄色固体７６ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）を単離した（収率：７８％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.17 (dd, J = 18.4, 6.7 Hz, 2H), 8.02 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.1, 1H), 7.80 (d, J = 8.51 Hz, 1H), 7.61 - 7.58 (m, 2H), 7.49 (dd, J = 14.0, 7.0 Hz, 2H), 7.33 - 7.30 (m, 1H), 7.26 - 7.24 (m, 2H), 6.92 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.53 (dd, J = 5.5, 2.8 Hz, 1H), 4.12 (s, 3H)。
13C{1H} and DEPT 135 NMR (101 MHz, CDCl3): δ 136.9 (d, CH), 135.3 (s, C), 134.7 (s, C), 134.3 (d, C), 133.2 (d, CH), 133.0 (d, CH), 132.3 (d, CH), 131.2 (d, CH), 129.8 (d, CH), 129.0 (d, CH), 128.9 (s, CH), 128.7 (d, CH), 126.1 (s, C), 126.0 (d, CH), 125.0 (d, C), 124.2 (s, C), 123.6 (s, C), 127.7 (d, CH), 112.4 (d, CH), 106.0 (d, C), 39.4 (s, CH3)。
31P{1H} NMR (162 MHz，CDCl3中): δ 2.64。ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ：［Ｃ２１Ｈ１６ＡｕＣｌＮＰ］・＋の［Ｍ・＋］計算値５４５．０３７４、実測値５４５．０４０４。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.17 (dd, J = 18.4, 6.7 Hz, 2H), 8.02 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.1, 1H), 7.80 (d, J = 8.51 Hz, 1H), 7.61 - 7.58 (m, 2H), 7.49 (dd, J = 14.0, 7.0 Hz, 2H), 7.33 - 7.30 (m, 1H), 7.26 - 7.24 (m, 2H), 6.92 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.53 (dd, J = 5.5, 2.8 Hz, 1H), 4.12 (s, 3H)。
13C{1H} and DEPT 135 NMR (101 MHz, CDCl3): δ 136.9 (d, CH), 135.3 (s, C), 134.7 (s, C), 134.3 (d, C), 133.2 (d, CH), 133.0 (d, CH), 132.3 (d, CH), 131.2 (d, CH), 129.8 (d, CH), 129.0 (d, CH), 128.9 (s, CH), 128.7 (d, CH), 126.1 (s, C), 126.0 (d, CH), 125.0 (d, C), 124.2 (s, C), 123.6 (s, C), 127.7 (d, CH), 112.4 (d, CH), 106.0 (d, C), 39.4 (s, CH3)。
31P{1H} NMR (162 MHz，CDCl3中): δ 2.64。ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ：［Ｃ２１Ｈ１６ＡｕＣｌＮＰ］・＋の［Ｍ・＋］計算値５４５．０３７４、実測値５４５．０４０４。
【0138】
化合物６の合成
ベークアウトしたシュレンクチューブ内で、１－チオ－β－Ｄ－グルコース四酢酸（１．０当量、０．０６１ｍｍｏｌ、２２ｍｇ）を２ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した。次いで、ＮａＨ（２．０当量、０．１２２ｍｍｏｌ、３ｍｇ）を加え、反応混合物を１時間撹拌した。得られた懸濁液を、１．６ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した化合物５（０．９当量、０．０５５ｍｍｏｌ、３０ｍｇ）の入ったベークアウトしたシュレンクチューブに不活性雰囲気下でセライトを通して濾過した。
ベークアウトしたシュレンクチューブ内で、１－チオ－β－Ｄ－グルコース四酢酸（１．０当量、０．０６１ｍｍｏｌ、２２ｍｇ）を２ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した。次いで、ＮａＨ（２．０当量、０．１２２ｍｍｏｌ、３ｍｇ）を加え、反応混合物を１時間撹拌した。得られた懸濁液を、１．６ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した化合物５（０．９当量、０．０５５ｍｍｏｌ、３０ｍｇ）の入ったベークアウトしたシュレンクチューブに不活性雰囲気下でセライトを通して濾過した。
【0139】
１．５時間撹拌した後、溶媒を真空下で除去した。アルミナ及び溶離液としてＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ（２：８）混合物を使用するカラムクロマトグラフィーで精製すると、３５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）の黄色固体が得られた（収率：７３％）。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 8.28 (dd, J = 18.2, 7.0 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.65 - 7.57 (m, 2H), 7.56 - 7.50 (m, 2H), 7.35 - 7.28 (m, 3H), 6.94 (dt, J = 4.1, 2.7 Hz, 1H), 6.65 (ddd, J = 8.0, 5.4, 2.8 Hz, 1H), 5.23 - 5.10 (m, 4H), 4.22 (dd, J = 12.2, 4.7 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.12 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 3.77 (ddd, J = 9.2, 4.5, 2.2 Hz, 1H), 2.09 (s, 3H), 2.01 (d, J = 10.7 Hz, 6H), 1.88 (s, 3H)。
13C{1H} and DEPT 135 NMR (101 MHz, CDCl3): δ 171.2 (s, C), 170.7 (s, C), 170.0 (d, C), 137.0 (dd, CH), 134.6 dd, C), 133.6 (d, C), 133.3 (0, CH), 132.6 (dd, CH), 131.2 (s, CH), 129.9 (dd, CH), 129.4 (s, C), 129.2 (d, CH), 129.0 (s, CH), 127.3 (d, CH), 126.4 (d, CH), 126.3 (s, CH), 125.6 (d, C), 122.7 (s, CH), 112.8 (dd, CH), 83.4 (s, CH), 77.9 (s, CH), 76.0 (s, CH), 74.6 (s, CH), 69.2 (s, CH), 63.1 (s, CH2), 39.7 (s, CH3), 21.5 (s, CH3), 21.0 (d, CH3)。
31P{1H} NMR (162 MHz，DCl3中): δ 9.11。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ＋）：［Ｃ３５Ｈ３５ＡｕＮＯ９ＰＳ］・＋の［Ｍ・＋］計算値８７３．１４３６、実測値８７４．１４９４。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 8.28 (dd, J = 18.2, 7.0 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.65 - 7.57 (m, 2H), 7.56 - 7.50 (m, 2H), 7.35 - 7.28 (m, 3H), 6.94 (dt, J = 4.1, 2.7 Hz, 1H), 6.65 (ddd, J = 8.0, 5.4, 2.8 Hz, 1H), 5.23 - 5.10 (m, 4H), 4.22 (dd, J = 12.2, 4.7 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.12 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 3.77 (ddd, J = 9.2, 4.5, 2.2 Hz, 1H), 2.09 (s, 3H), 2.01 (d, J = 10.7 Hz, 6H), 1.88 (s, 3H)。
13C{1H} and DEPT 135 NMR (101 MHz, CDCl3): δ 171.2 (s, C), 170.7 (s, C), 170.0 (d, C), 137.0 (dd, CH), 134.6 dd, C), 133.6 (d, C), 133.3 (0, CH), 132.6 (dd, CH), 131.2 (s, CH), 129.9 (dd, CH), 129.4 (s, C), 129.2 (d, CH), 129.0 (s, CH), 127.3 (d, CH), 126.4 (d, CH), 126.3 (s, CH), 125.6 (d, C), 122.7 (s, CH), 112.8 (dd, CH), 83.4 (s, CH), 77.9 (s, CH), 76.0 (s, CH), 74.6 (s, CH), 69.2 (s, CH), 63.1 (s, CH2), 39.7 (s, CH3), 21.5 (s, CH3), 21.0 (d, CH3)。
31P{1H} NMR (162 MHz，DCl3中): δ 9.11。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ＋）：［Ｃ３５Ｈ３５ＡｕＮＯ９ＰＳ］・＋の［Ｍ・＋］計算値８７３．１４３６、実測値８７４．１４９４。
【0140】
化合物７の合成
ベークアウトしたシュレンクチューブ内で、２－（８－ブロモナフタレン－１－イル）－１－（フェニルスルホニル）－１Ｈ－ピロール（１．０当量、１０２μｍｏｌ、４２ｍｇ）を５ｍＬの乾燥Ｅｔ２Ｏに溶解し、－９０℃に冷却した。次いで、ｔＢｕＬｉ（１．０当量、１０２μｍｏｌ、０．０６ｍＬ、ペンタン中１．７Ｍ）を滴下して加えた。その直後に、リチオ化した中間体をＰｈＰＣｌ２（１．０当量、１０２μｍｏｌ、１４μＬ、９７％）と反応させ、反応混合物を室温で１時間撹拌した。
ベークアウトしたシュレンクチューブ内で、２－（８－ブロモナフタレン－１－イル）－１－（フェニルスルホニル）－１Ｈ－ピロール（１．０当量、１０２μｍｏｌ、４２ｍｇ）を５ｍＬの乾燥Ｅｔ２Ｏに溶解し、－９０℃に冷却した。次いで、ｔＢｕＬｉ（１．０当量、１０２μｍｏｌ、０．０６ｍＬ、ペンタン中１．７Ｍ）を滴下して加えた。その直後に、リチオ化した中間体をＰｈＰＣｌ２（１．０当量、１０２μｍｏｌ、１４μＬ、９７％）と反応させ、反応混合物を室温で１時間撹拌した。
【0141】
溶媒を真空下で除去し、２ｍＬのＤＣＭ及びクロロ（ジメチルスルフィド）金（Ｉ）（ＤＭＳ－ＡｕＣｌ）（１．０当量、１０２μｍｏｌ、３０ｍｇ）を加え、反応混合物を更に１時間撹拌した。溶媒を再度真空下で除去し、褐色固体を得た。シリカ及び溶離液としてＤＣＭを使用するカラムクロマトグラフィーで精製した後、２４ｍｇ（３６μｍｏｌ）の黄色固体を単離した（収率：５１％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.70 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 18.7, 7.1 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 3.6 Hz, 1H), 7.65 - 7.54 (m, 3H), 7.49 (dd, J = 7.6, 3.8 Hz, 3H), 7.39 - 7.28 (m, 6H), 6.67 (dd, J = 4.5, 3.6 Hz, 1H)。
13C{1H} and DEPT 135 NMR (101 MHz, CDCl3): δ 137.7 (d, C), 137.0 (s, C), 136.5 (d, CH), 134.6 (s, CH), 133.6 (d, C), 133.3 (s, CH), 132.4 (s, CH), 132.3 (s, CH), 131.9 (s, CH), 130.8 (s, CH), 130.6 (s, CH), 129.2 (s, CH), 129.1 (s, CH), 128.6 (s, CH), 126.9 (s, CH), 126.1 (s, CH), 125.9 (s, CH), 122.2 (d, C), 115.6 (d, CH)。
31P{1H} NMR (162 MHz，CDCl3中): δ 5.57。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：［Ｃ２６Ｈ１８ＡｕＣｌＮＯ２ＰＳ］・＋の［Ｍ・＋］計算値６７１．０１５０、実測値６７１．０２０５。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.70 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 18.7, 7.1 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 3.6 Hz, 1H), 7.65 - 7.54 (m, 3H), 7.49 (dd, J = 7.6, 3.8 Hz, 3H), 7.39 - 7.28 (m, 6H), 6.67 (dd, J = 4.5, 3.6 Hz, 1H)。
13C{1H} and DEPT 135 NMR (101 MHz, CDCl3): δ 137.7 (d, C), 137.0 (s, C), 136.5 (d, CH), 134.6 (s, CH), 133.6 (d, C), 133.3 (s, CH), 132.4 (s, CH), 132.3 (s, CH), 131.9 (s, CH), 130.8 (s, CH), 130.6 (s, CH), 129.2 (s, CH), 129.1 (s, CH), 128.6 (s, CH), 126.9 (s, CH), 126.1 (s, CH), 125.9 (s, CH), 122.2 (d, C), 115.6 (d, CH)。
31P{1H} NMR (162 MHz，CDCl3中): δ 5.57。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：［Ｃ２６Ｈ１８ＡｕＣｌＮＯ２ＰＳ］・＋の［Ｍ・＋］計算値６７１．０１５０、実測値６７１．０２０５。
【0142】
化合物８の合成
１－チオ－β－Ｄ－グルコース四酢酸（１．０当量、０．０４１ｍｍｏｌ、１５ｍｇ）を、１．４ｍＬの乾燥ＴＨＦの入ったベークアウトしたシュレンクチューブに溶解した。その後、ＮａＨ（２．０当量、０．０８２ｍｍｏｌ、２ｍｇ）を加え、反応混合物を１時間撹拌した。得られた懸濁液を、１．１ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した化合物７（０．９当量、０．０３７ｍｍｏｌ、２５ｍｇ）の入ったベークアウトしたシュレンクチューブに不活性雰囲気下でセライトを通して濾過した。
１－チオ－β－Ｄ－グルコース四酢酸（１．０当量、０．０４１ｍｍｏｌ、１５ｍｇ）を、１．４ｍＬの乾燥ＴＨＦの入ったベークアウトしたシュレンクチューブに溶解した。その後、ＮａＨ（２．０当量、０．０８２ｍｍｏｌ、２ｍｇ）を加え、反応混合物を１時間撹拌した。得られた懸濁液を、１．１ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した化合物７（０．９当量、０．０３７ｍｍｏｌ、２５ｍｇ）の入ったベークアウトしたシュレンクチューブに不活性雰囲気下でセライトを通して濾過した。
【0143】
１．５時間撹拌した後、溶媒を真空下で除去した。アルミナ及び溶離液としてＥｔＯＡｃ：ペンタン（６：４）混合物を使用するカラムクロマトグラフィーによる精製により、２０ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）の黄色固体を得た（収率：５４％）。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 8.70 (dd, J = 7.4, 4.3 Hz, 1H), 8.16 (ddd, J = 18.2, 6.3, 3.5 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.82 (dt, J = 7.2, 3.5 Hz, 2H), 7.61 - 7.55 (m, 2H), 7.53 - 7.48 (m, 2H), 7.47 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.42 - 7.28 (m, 6H), 6.82 - 6.77 (m, 1H), 5.21 - 5.09 (m, 4H), 4.23 (dd, J = 12.2, 4.7 Hz, 1H), 4.13 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 7.2, 2.2 Hz, 1H), 2.09 (s, 3H), 2.02 (d, J = 14.8 Hz, 7H), 1.88 (s, 3H)。
13C{1H} and DEPT 135 NMR (101 MHz, CDCl3): δ 171.6 (d, C), 170.6 (s, C), 170.1 (s, C), 170.0 (s, C), 137.5 (d, C), 136.7 (t, CH), 134.8 (s, CH), 133.8 (t, C), 133.3 (s, CH), 132.7 (dd, CH), 131.9 (s, CH), 130.8 (dd, CH), 129.5 (dd, CH), 129.2 (s, CH), 128.5 (d, CH), 127.3 (d, CH), 126.4 (d, CH), 126.2 (s, CH), 122.6 (t, C), 116.0 (s, CH), 83.5 (s, CH), 76.1 (s, CH), 74.5 (s, CH), 69.2 (s, CH), 63.1 (s, CH2), 21.5 (s, CH3), 21.1 (d, CH3)。
31P{1H} NMR (162 MHz，CDCl3中): δ 9.45。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：［Ｃ４０Ｈ３７ＡｕＮＯ１１ＰＳ２Ｎａ］・＋の［Ｍ・＋］計算値１０２２．１１０９、実測値１０２２．１１２２。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 8.70 (dd, J = 7.4, 4.3 Hz, 1H), 8.16 (ddd, J = 18.2, 6.3, 3.5 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.82 (dt, J = 7.2, 3.5 Hz, 2H), 7.61 - 7.55 (m, 2H), 7.53 - 7.48 (m, 2H), 7.47 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.42 - 7.28 (m, 6H), 6.82 - 6.77 (m, 1H), 5.21 - 5.09 (m, 4H), 4.23 (dd, J = 12.2, 4.7 Hz, 1H), 4.13 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 7.2, 2.2 Hz, 1H), 2.09 (s, 3H), 2.02 (d, J = 14.8 Hz, 7H), 1.88 (s, 3H)。
13C{1H} and DEPT 135 NMR (101 MHz, CDCl3): δ 171.6 (d, C), 170.6 (s, C), 170.1 (s, C), 170.0 (s, C), 137.5 (d, C), 136.7 (t, CH), 134.8 (s, CH), 133.8 (t, C), 133.3 (s, CH), 132.7 (dd, CH), 131.9 (s, CH), 130.8 (dd, CH), 129.5 (dd, CH), 129.2 (s, CH), 128.5 (d, CH), 127.3 (d, CH), 126.4 (d, CH), 126.2 (s, CH), 122.6 (t, C), 116.0 (s, CH), 83.5 (s, CH), 76.1 (s, CH), 74.5 (s, CH), 69.2 (s, CH), 63.1 (s, CH2), 21.5 (s, CH3), 21.1 (d, CH3)。
31P{1H} NMR (162 MHz，CDCl3中): δ 9.45。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：［Ｃ４０Ｈ３７ＡｕＮＯ１１ＰＳ２Ｎａ］・＋の［Ｍ・＋］計算値１０２２．１１０９、実測値１０２２．１１２２。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】