(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-26
(54)【発明の名称】コサコニア・オリゼ ＨＮ０５及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20231019BHJP
C02F 3/34 20230101ALI20231019BHJP
C09K 3/00 20060101ALI20231019BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231019BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A ZNA
C02F3/34 Z
C09K3/00 109
C12N15/31
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023511678
(86)(22)【出願日】2022-09-16
(85)【翻訳文提出日】2023-02-14
(86)【国際出願番号】 CN2022119217
(87)【国際公開番号】W WO2023041008
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】202111096588.1
(32)【優先日】2021-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522111677
【氏名又は名称】中国熱帯農業科学院環境与植物保護研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110003823
【氏名又は名称】弁理士法人柳野国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】武春媛
(72)【発明者】
【氏名】陰文芳
(72)【発明者】
【氏名】呉東明
【テーマコード（参考）】
4B065
4D040
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065CA55
4B065CA56
4D040DD03
4D040DD14
(57)【要約】
本発明は、環境微生物の技術分野、特にコサコニア・オリゼ ＨＮ０５及びその使用に関し、該菌株の分類は、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ ＨＮ０５と名付けられ、嫌気性条件下でジクワットを分解でき、且つアントラキノン類化合物還元活性を持ち、その電子利用スペクトルが広く、同時に、菌株ＨＮ０５はＡＱＤＳと共同作用して、ジクワットの嫌気性分解を顕著に促進し、ジクワット汚染水処理及び土壌修復に適用でき、農薬汚染処理及び土壌修復の分野で良好な使用の可能性を持っている。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コサコニア・オリゼ ＨＮ０５であって、その分類は、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ ＨＮ０５と名付けられ、中国典型的培養物寄託センターに寄託され、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２１９５６ＨＮ０５であることを特徴とするコサコニア・オリゼＨＮ０５。
【請求項2】
コサコニア・オリゼ ＨＮ０５であって、コサコニア・オリゼ ＨＮ０５の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すヌクレオチド配列であることを特徴とするコサコニア・オリゼ ＨＮ０５。
【請求項3】
請求項１に記載のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５のアントラキノン類化合物還元における使用。
【請求項4】
請求項１に記載のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５とスクロースの組み合わせのアントラキノン類化合物の嫌気性還元における使用。
【請求項5】
前記スクロースの使用濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記アントラキノン類化合物は、ＡＨ２ＱＤＳ、α－ＡＨ２ＱＳ、ＡＨ２ＱＳ及び１，５－ＡＨ２ＱＤＳのうちの１種以上を含むことを特徴とする請求項３～５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項7】
請求項１に記載のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５の、農薬汚染処理と土壌修復における使用。
【請求項8】
前記コサコニア・オリゼ ＨＮ０５は、ジクワットを分解し、ジクワット汚染水処理及び土壌修復の目的を達成するために使用されることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記コサコニア・オリゼＨＮ０５は、嫌気性条件下でジクワットを分解するために使用されることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項10】
請求項１に記載のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５とアントラキノン－２，６－ジスルホン酸ナトリウムのジクワットの嫌気性分解における使用。
【請求項11】
前記アントラキノン－２，６－ジスルホン酸ナトリウムの使用濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は２０２１年９月１８日に中国特許庁に提出された、出願番号「２０２１１１０９６５８８．１」、発明の名称「コサコニア・オリゼＨＮ０５及びその使用」の中国特許出願の優先権を要求し、そのすべての内容は参照により本出願に組み込まれる。
本出願は２０２１年９月１８日に中国特許庁に提出された、出願番号「２０２１１１０９６５８８．１」、発明の名称「コサコニア・オリゼＨＮ０５及びその使用」の中国特許出願の優先権を要求し、そのすべての内容は参照により本出願に組み込まれる。
【0002】
本発明は、環境微生物の技術分野、特にコサコニア・オリゼ ＨＮ０５及びその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ジクワット（１，１’－エチレン－２，２’－ビピリジンジブロミド、ｄｉｑｕａｔ）は非選択的接触型ビピリジン類除草剤であり、不耕起栽培、急速輪作、直播稲等の農林業生産に広く使用されている。ジクワットは持続性及び環境健康毒性がある。ゼブラフィッシュ胚の酸化的リン酸化反応を阻害し、ニジマス胚の成長障害、北西サンショウウオの慢性的な死を引き起こし、水生生態系の不均衡につながり、地下水の浸漬または食物連鎖形態を通じて、哺乳類に強い毒性を生み出し、ジクワットへの長期暴露はメスのマウスに生殖毒性を引き起こす可能性があり、農民がパーキンソン病にかかるリスクは高くなり、ジクワットの急性中毒は２１２８種類の病気を引き起こす可能性があり、かつ生物学的蓄積または急性中毒後に特別な解毒薬はない。したがって、環境でのジクワットの分解を加速することは非常に必要である。
【0004】
ジクワットは非常に水に溶解しやすく、表面流出が土壌、地下水体に入り、さまざまな低酸素環境に堆積するにつれて、より持続性があり、半減期は最大１０年である。したがって、環境におけるジクワットの分解を加速する鍵は、その嫌気性分解を強化することである。促進酸化法、嫌気性消化プール法等の方法が有機汚染物質の嫌気性分解を効果的に加速できることが報告されている。ただし、これらの方法には二次汚染と高コストの欠点がある。微生物ｉｎ ｓｉｔｕ修復技術は、便利で経済的、効率的で、グリーンの特性のため、有機汚染物質の嫌気性分解を強化する良い方法であると考えられている。
【0005】
土壌には、ジクワットに耐える微生物があり、この種のバクテリアは、ジクワットを炭素源または窒素源として、または共代謝形態で好気性呼吸を行うことができ、現在報告されているジクワット好気性分解菌には、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、酵母菌リポミセス・スタルケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）が含まれ、嫌気性の条件下では、ジクワットを分解及び変換するに関連する微生物は報告されていない。
【0006】
コサコニア属菌株には現在、９種があり、報告によると、コサコニア・カシサッカリ（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｑｕａｓｉｓａｃｃｈａｒｉ）とコサコニア・コワニ（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｃｏｗａｎｉｉ）が人体から分離されて得られることを除いて、他の７種Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓｐ.がすべて植物の根から分離されて得られ、窒素固定能力を備え、水稲、トウモロコシ、小麦、ラッカセイ等の植物の優れた窒素固定菌であり、現在、コサコニア・エスピー（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓｐ.）がアントラキノンを還元してジクワットを分解できることに関連する文献報告はまだない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
これを考慮して、本発明はコサコニア・オリゼＨＮ０５及びその使用を提供し、該菌株は土壌から分離されており、ジクワットの嫌気性分解とアントラキノン還元の特性がある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の技術的解決手段はこのように実現される。
【0009】
本発明は、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ ＨＮ０５と名付けられたコサコニア・オリゼ ＨＮ０５を提供し、２０２１年７月３０日、湖北武漢市武漢大学にある中国典型的培養物寄託センターに寄託され、寄託センターが該菌株に与える寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２１９５６である。
【0010】
さらに説明するように、コサコニア・オリゼ（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ）ＨＮ０５の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤＮＯ．１に示されているヌクレオチド配列である。
【0011】
さらに説明するように、アントラキノン類化合物還元におけるコサコニア・オリゼ（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ）ＨＮ０５の使用。
【0012】
さらに説明するように、農薬汚染処理及び土壌修復用における前記コサコニア・オリゼ（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ）ＨＮ０５の使用。
【0013】
さらに説明するように、前記コサコニア・オリゼ（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ）ＨＮ０５は、ジクワットを分解するために使用され、ジクワット汚染水処理及び土壌修復の目的を達成する。
【0014】
さらに説明するように、前記コサコニア・オリゼ（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ）ＨＮ０５は、嫌気性条件下でジクワットを分解するために使用される。
【0015】
さらに説明するように、前記コサコニア・オリゼ（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ）ＨＮ０５は、アントラキノン－２，６－ジスルホン酸ナトリウムと共同作用し、ジクワットの嫌気性分解を促進するために使用される。
【発明の効果】
【0016】
従来技術と比較して、本発明の有益な効果は次のとおりである。本発明は、海南省南渡江の川の堆積土壌から、濃縮分離して精製されたコサコニア・オリゼＨＮ０５（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ ＨＮ０５）であり、該菌株は嫌気性条件下でジクワットを分解でき、且つアントラキノン類化合物還元活性を持ち、その電子利用スペクトルが広く、同時に、コサコニア・オリゼＨＮ０５はＡＱＤＳと共同作用し、ジクワットの嫌気性分解を顕著に促進し、ジクワット汚染水処理及び土壌修復に効果的に適用でき、農薬汚染処理及び土壌修復の分野で良好な使用の可能性を持っている。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】本発明のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５の菌株形態透過電子顕微鏡図である。
【図2】本発明のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５の１６Ｓ ｒＲＮＡ系統発生樹である。
【図3】本発明のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５の嫌気性還元ＡＱＤＳの電子供与体スペクトル図である。
【図4】本発明のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５のジクワットの嫌気性分解動力学図である。
【図5】本発明のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５とＡＱＤＳがジクワットの嫌気性分解を共同に促進する最初のレベルの動力学フィッティング曲線である。
【0018】
生物寄託の説明
２０２１年７月３０日にコサコニア・オリゼ （ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ）ＨＮ０５は、中国典型的培養物寄託センターに寄託され、住所は湖北武漢市武漢大学、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２１９５６である。
２０２１年７月３０日にコサコニア・オリゼ （ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ）ＨＮ０５は、中国典型的培養物寄託センターに寄託され、住所は湖北武漢市武漢大学、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２１９５６である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の技術的な内容をよりよく理解するために、以下は本発明をさらに説明するための具体的な実施例を提供する。
【0020】
本発明の実施例で使用される実験的方法は、特別な説明がない場合、従来の方法である。
【0021】
本発明の実施例で使用される材料と試薬等は、特別な説明がない場合、商業的アプローチから得ることができる。
【0022】
実施例１－コサコニア・オリゼ ＨＮ０５の濃縮と分離
（１）無菌操作条件下で５ｇ堆積物サンプルを１００ｍｌの嫌気性液体培地に入れ、１リットルあたりの培地に０．５ｍｍｏｌ／ＬＡＱＤＳ（アントラキノン－２，６－ジスルホン酸ナトリウム、電子受容体）、２．５ｇ ＮａＨＣＯ３、０．２５ｇ ＮＨ４Ｃｌ、０．６８ｇ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＫＣｌ、１０．０ｍｌビタミン保存液、１０．０ｍｌ微量元素保存液を含有した。
ここで、ビタミン溶液は、１リットルあたりの脱イオン水には、５．０ｍｇの葉酸、０．２ｍｇのビタミンＢ６、６．５ｍｇのビタミンＢ２、３．０ｍｇのビタミンＢ１、１０ｍｇのニコチンアミド、１ｍｇのパントテン酸カルシウム、０．２ｍｇのビタミンＢ１２、２．０ｍｇのビタミンＨが含まれ、微量元素溶液は、１リットルあたりの脱イオン水には１．６ｇのエチレンジアミン四酢酸、３．０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１．０ｇ ＮａＣｌ、０．１ｇ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＣａＣｌ２、０．０１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ ＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ Ｈ３ＢＯ３、０．０２５ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが含まれる。上記の土壌－培地系に、（Ｎ２／ＣＯ２＝８０／２０）混合ガスを３０ｍｉｎ吹き込んで酸素を排出し、吹き込むことが完了したらすぐにゴム製のカバーを覆い、アルミニウムカバーを押して密封し、３０℃で静置して光を避けて培養し、培養液の色の変化状況を観察した。
（２）上澄み液の色が無色から徐々にオレンジ色になり、安定化する傾向がある場合、１０％の接種量で別の新鮮な濃縮培地に移送し、このようにして３回移送した。
（３）最後に、最終培養液を希釈コーティング平板法でＮＡ培地（ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、牛肉抽出物５ｇ／Ｌ、細菌性ペプトン１０ｇ／Ｌ、寒天粉末１８－２０ｇ／Ｌ、１％の微量元素溶液と１％のビタミン溶液から構成され、１×１０５ＰＡで２０ｍｉｎ滅菌した）表面においてコーティング分離を実行し、培地の表面にシングルコロニーを形成するまで３０℃で好気性培養し、シングルコロニーをピックアップしてシングルコロニーの分離と精製を行い、コサコニア・オリゼＨＮ０５を取得した。
（４）シングルコロニーをピックアップして、新鮮な濃縮培地において、再び培養し、系の色が無色からオレンジ色に変化した場合、菌株がＡＱＤＳの還元特性を持っていることを示した。
（１）無菌操作条件下で５ｇ堆積物サンプルを１００ｍｌの嫌気性液体培地に入れ、１リットルあたりの培地に０．５ｍｍｏｌ／ＬＡＱＤＳ（アントラキノン－２，６－ジスルホン酸ナトリウム、電子受容体）、２．５ｇ ＮａＨＣＯ３、０．２５ｇ ＮＨ４Ｃｌ、０．６８ｇ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＫＣｌ、１０．０ｍｌビタミン保存液、１０．０ｍｌ微量元素保存液を含有した。
ここで、ビタミン溶液は、１リットルあたりの脱イオン水には、５．０ｍｇの葉酸、０．２ｍｇのビタミンＢ６、６．５ｍｇのビタミンＢ２、３．０ｍｇのビタミンＢ１、１０ｍｇのニコチンアミド、１ｍｇのパントテン酸カルシウム、０．２ｍｇのビタミンＢ１２、２．０ｍｇのビタミンＨが含まれ、微量元素溶液は、１リットルあたりの脱イオン水には１．６ｇのエチレンジアミン四酢酸、３．０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１．０ｇ ＮａＣｌ、０．１ｇ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＣａＣｌ２、０．０１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ ＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ Ｈ３ＢＯ３、０．０２５ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが含まれる。上記の土壌－培地系に、（Ｎ２／ＣＯ２＝８０／２０）混合ガスを３０ｍｉｎ吹き込んで酸素を排出し、吹き込むことが完了したらすぐにゴム製のカバーを覆い、アルミニウムカバーを押して密封し、３０℃で静置して光を避けて培養し、培養液の色の変化状況を観察した。
（２）上澄み液の色が無色から徐々にオレンジ色になり、安定化する傾向がある場合、１０％の接種量で別の新鮮な濃縮培地に移送し、このようにして３回移送した。
（３）最後に、最終培養液を希釈コーティング平板法でＮＡ培地（ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、牛肉抽出物５ｇ／Ｌ、細菌性ペプトン１０ｇ／Ｌ、寒天粉末１８－２０ｇ／Ｌ、１％の微量元素溶液と１％のビタミン溶液から構成され、１×１０５ＰＡで２０ｍｉｎ滅菌した）表面においてコーティング分離を実行し、培地の表面にシングルコロニーを形成するまで３０℃で好気性培養し、シングルコロニーをピックアップしてシングルコロニーの分離と精製を行い、コサコニア・オリゼＨＮ０５を取得した。
（４）シングルコロニーをピックアップして、新鮮な濃縮培地において、再び培養し、系の色が無色からオレンジ色に変化した場合、菌株がＡＱＤＳの還元特性を持っていることを示した。
【0023】
実施例２－コサコニア・オリゼ ＨＮ０５の形態、生理学的生化学的および分子生物学の特性
（１）菌体の形態特性
光学顕微鏡下での観察により、該菌株はグラム陰性菌であり、ストレートロッドの形状で、シングルまたはペアであった。透過電子顕微鏡下で菌株の周毛を観察し（図１に示す）、移動性を備えた。
ｐＨ７．２のＮＡ寒天固体培地平板で２４時間３０℃好気性培養した後、コロニーは丸く、表面が湿って滑らかであり、中央が突起し、半透明で、エッジがきちんとし、コロニーの直径が１～３ｍｍであった。
（２）生理学的生化学的特性
菌株は発酵型で、通性嫌気性であり、成長温度範囲は２５～３７℃（最も適切な３０℃）、ｐＨの範囲は４～９（最も適切なｐＨ＝６）、ＮａＣｌ％範囲０～５（最も適切な０．５％）であり、他の生理学的生化学的特性について、表１を参照した。
（１）菌体の形態特性
光学顕微鏡下での観察により、該菌株はグラム陰性菌であり、ストレートロッドの形状で、シングルまたはペアであった。透過電子顕微鏡下で菌株の周毛を観察し（図１に示す）、移動性を備えた。
ｐＨ７．２のＮＡ寒天固体培地平板で２４時間３０℃好気性培養した後、コロニーは丸く、表面が湿って滑らかであり、中央が突起し、半透明で、エッジがきちんとし、コロニーの直径が１～３ｍｍであった。
（２）生理学的生化学的特性
菌株は発酵型で、通性嫌気性であり、成長温度範囲は２５～３７℃（最も適切な３０℃）、ｐＨの範囲は４～９（最も適切なｐＨ＝６）、ＮａＣｌ％範囲０～５（最も適切な０．５％）であり、他の生理学的生化学的特性について、表１を参照した。
【0024】
【表1】
【0025】
（３）分子生物学の特性
細菌ＤＮＡ抽出キット（天根生物科技有限公司）で細菌の総ＤＮＡを抽出した。細菌１６Ｓ ｒＲＮＡユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’－ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ－３’，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）および１４９２Ｒ（５’－ＴＡＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ－３’，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を利用してＰＣＲ増幅を実行した。反応系は５０μＬ：テンプレートＤＮＡ２μＬ、ユニバーサルプライマー２７Ｆおよび１４９２Ｒがそれぞれ１μＬ、Ｔａｑ ｍｉｘ酵素２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ １１μＬである。ＰＣＲ反応条件：９５℃で５ｍｉｎ初期変性し、９５℃で３０秒変性し、５２℃で３０秒アニーリングし、７２℃で９０秒伸長し、３５個サイクル、７２℃で１０ｍｉｎ伸長した。増幅生成物を１％アガロースゲル電気泳動で検出し、上海生工生物工程技術服務有限公司によってシーケンスを完了した。
細菌ＤＮＡ抽出キット（天根生物科技有限公司）で細菌の総ＤＮＡを抽出した。細菌１６Ｓ ｒＲＮＡユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’－ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ－３’，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）および１４９２Ｒ（５’－ＴＡＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ－３’，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を利用してＰＣＲ増幅を実行した。反応系は５０μＬ：テンプレートＤＮＡ２μＬ、ユニバーサルプライマー２７Ｆおよび１４９２Ｒがそれぞれ１μＬ、Ｔａｑ ｍｉｘ酵素２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ １１μＬである。ＰＣＲ反応条件：９５℃で５ｍｉｎ初期変性し、９５℃で３０秒変性し、５２℃で３０秒アニーリングし、７２℃で９０秒伸長し、３５個サイクル、７２℃で１０ｍｉｎ伸長した。増幅生成物を１％アガロースゲル電気泳動で検出し、上海生工生物工程技術服務有限公司によってシーケンスを完了した。
【0026】
シーケンスの結果によると、ｈｔｔｐ：／／ｅｚｔａｘｏｎ－ｅ．ｅｚｂｉｏｃｌｏｕｄ．ｎｅｔ／でより高い相同性を持つ１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列をダウンロードし、近隣結合法による菌株の系統発生進化樹（図２に示す）を構築した。形態、生理学的生化学的および分子同定の結果を結合して、本発明の菌株が、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ） ＨＮ０５と名付けられた、コサコニア・オリゼであると最終的に決定された。
【0027】
実施例３－コサコニア・オリゼ ＨＮ０５は、異なる電子供与体を使用して、ＡＱＤＳを還元した
【0028】
本発明はＡＱＤＳを電子受容体として使用し、コサコニア・オリゼ ＨＮ０５の電子利用スペクトルを考察した。
【0029】
反応系の組成：細菌懸濁液、無機塩、ビタミン、微量元素、各材料の組成と含有量は、上記の濃縮分離培地と同じであり、電子受容体は０．５ｍｍｏｌ／ＬＡＱＤＳであり、電子供与体は、酢酸、グリセリン、スクロース、または乳酸を選択し、添加濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌであり、１ｍＬの細菌懸濁液であり、ＨＮ０５菌株をＮＡ液体培地に接種し、３０℃で１８ｈ好気性培養し、８０００ｒ／ｍｉｎで菌体を遠心分離して収集し、次に無機塩培地で菌体を２回洗浄し、最後に新鮮な無機塩培地で菌体を懸濁して細菌懸濁液を作った。
【0030】
３つの繰り返しを設定した。それぞれ１、３、６、９、１２、および１５ｄ培養した時に嫌気性系におけるＡＱＤＳ還元生成物であるＡＨ２ＱＤＳの変化状況を測定した。可視－紫外線分光計を採用して３８５ｎｍの波長で還元状態ＡＨ２ＱＤＳの濃度を測定した。結果は、（図３に示すように）１５ｄの嫌気性培養後、嫌気性系におけるＡＱＤＳに明らかな還元現象があり、最初の９日間の系におけるＡＨ２ＱＤＳが大量に生成され、後期に徐々に安定したことを示した。コサコニア・オリゼＨＮ０５での４種の電子供与体の利用能力は明らかに異なり、利用能力は大きいから小さいまで順次：スクロース＞乳酸＞グリセリン＞酢酸であった。
【0031】
実施例４－コサコニア・オリゼ ＨＮ０５がジクワットを嫌気性分解した
１、反応系：嫌気性培地系では、７つの処理を設定し、
（１）スクロース（電子供与体）＋ジクワット（対照、スクロースとジクワットが反応するかどうかを考察した）。
（２）ＡＱＤＳ（電子受容体）＋ジクワット（対照、ＡＱＤＳとジクワットが反応するかどうかを考察した）。
（３）ＨＮ０５＋ジクワット（対照、生きている細菌がジクワットを直接分解するかどうかを考察した）。
（４）スクロース＋ＨＮ０５＋ジクワット（ジクワットがＨＮ０５の電子受容体として分解されるかどうかを考察した）。
（５）ＡＱＤＳ＋ＨＮ０５＋ジクワット（ジクワットがＨＮ０５の電子供与体として還元されるかどうかを考察した）。
（６）スクロース＋ＡＱＤＳ＋ＨＮ０５（不活化）＋ジクワット（対照、ＨＮ０５死んだ細菌がジクワットを分解するかどうかを考察した）。
（７）スクロース＋ＡＱＤＳ＋ＨＮ０５＋ジクワット（ＡＱＤＳ微生物の還元が、ジクワットの嫌気性分解を促進するかどうかを考察した）。
１、反応系：嫌気性培地系では、７つの処理を設定し、
（１）スクロース（電子供与体）＋ジクワット（対照、スクロースとジクワットが反応するかどうかを考察した）。
（２）ＡＱＤＳ（電子受容体）＋ジクワット（対照、ＡＱＤＳとジクワットが反応するかどうかを考察した）。
（３）ＨＮ０５＋ジクワット（対照、生きている細菌がジクワットを直接分解するかどうかを考察した）。
（４）スクロース＋ＨＮ０５＋ジクワット（ジクワットがＨＮ０５の電子受容体として分解されるかどうかを考察した）。
（５）ＡＱＤＳ＋ＨＮ０５＋ジクワット（ジクワットがＨＮ０５の電子供与体として還元されるかどうかを考察した）。
（６）スクロース＋ＡＱＤＳ＋ＨＮ０５（不活化）＋ジクワット（対照、ＨＮ０５死んだ細菌がジクワットを分解するかどうかを考察した）。
（７）スクロース＋ＡＱＤＳ＋ＨＮ０５＋ジクワット（ＡＱＤＳ微生物の還元が、ジクワットの嫌気性分解を促進するかどうかを考察した）。
【0032】
嫌気性培地は、無機塩、ビタミン、微量元素（無機塩、微生物、微量元素の成分及び濃度が濃縮分離培地と同じ）で構成され、ジクワットの濃度は５０ｍｇ／Ｌ、ＡＱＤＳは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、スクロースは５ｍｍｏｌ／Ｌであり、１ｍＬの細菌懸濁液（製造方法は電子供与体試験と同じ）である。ジクワット、ＡＱＤＳは他の成分と分けて滅菌し、滅菌（１１５℃で２０ｍｉｎ滅菌）した後に再び混合し、（Ｎ２／ＣＯ２＝８０／２０）混合ガスを３０ｍｉｎ吹き込んで酸素排出し、吹き込みが完了したら、すぐにゴム製のカバーを覆い、アルミニウムカバーを押して密封し、３０℃で静置して光を避けて培養した。
２、ジクワットの検出方法：高効率の液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ ２６９５）を使用して、ジクワットの含有量を測定し、クロマトグラフィー条件は、検出器がＰＤＡ、クロマトグラフィーカラムがＷａｔｅｒｓ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）、移動相が１５ｍｍｏｌヘプタンスルホン酸ナトリウムリン酸緩衝液溶液（トリエチルアミンでｐＨ＝２．５に調整し）：アセトニトリル（ｖ：ｖ）＝７６：２４、流速が１．０ｍＬ／ｍｉｎ、試料注入量が１０μＬ、検出波長が３０９ｎｍであることである。
３、データ処理：ジクワット分解率（％）＝（ジクワットの初期濃度Ｃ０－反応後のジクワットの濃度Ｃ）／Ｃ０×１００％。
分解半減期ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋ（すなわちｔ１／２＝０．６９３／ｋ）、Ｋは式Ｃｔ／Ｃ０＝ｅ－ｋｔを介して計算され、Ｃ０はジクワットの初期濃度であり、Ｃｔはｔ時刻でのジクワットの濃度であった。
２、ジクワットの検出方法：高効率の液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ ２６９５）を使用して、ジクワットの含有量を測定し、クロマトグラフィー条件は、検出器がＰＤＡ、クロマトグラフィーカラムがＷａｔｅｒｓ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）、移動相が１５ｍｍｏｌヘプタンスルホン酸ナトリウムリン酸緩衝液溶液（トリエチルアミンでｐＨ＝２．５に調整し）：アセトニトリル（ｖ：ｖ）＝７６：２４、流速が１．０ｍＬ／ｍｉｎ、試料注入量が１０μＬ、検出波長が３０９ｎｍであることである。
３、データ処理：ジクワット分解率（％）＝（ジクワットの初期濃度Ｃ０－反応後のジクワットの濃度Ｃ）／Ｃ０×１００％。
分解半減期ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋ（すなわちｔ１／２＝０．６９３／ｋ）、Ｋは式Ｃｔ／Ｃ０＝ｅ－ｋｔを介して計算され、Ｃ０はジクワットの初期濃度であり、Ｃｔはｔ時刻でのジクワットの濃度であった。
【0033】
結果を図４に示すように、０－２２ｄ嫌気性培養した対照群（１）および（２）のジクワットの濃度は基本的に変化しておらず、ジクワットとスクロース、ＡＱＤＳ、および単純なＨＮ０５の間に反応がないことを示した。処理（５）のジクワットも減少せず、ジクワットがＨＮ０５の電子供与体として分解されないことを示した。処理（３）及び（６）のジクワット濃度は２．０７％減少し、初期菌体がジクワットに微弱な吸着効果があることを示した。処理（４）中のジクワットの濃度は８．６０％減少し、ジクワットがＨＮ０５の電子受容体として菌株によって直接分解されるが、効果が弱いことを示した。処理（７）のジクワット分解率は、培養時間内に直線的に増加し、２２ｄの時に４１．９３％に達し、分解効果が顕著であり、ＨＮ０５とＡＱＤＳの共同作用は、ジクワットの嫌気性分解を顕著に促進できることを説明した。
【0034】
さらに、ＨＮ０５とＡＱＤＳがジクワットの分解を共同に促進する系において、分解率に対して最初のレベルの動力学フィッティングを実行し、結果は図５に示すように、決定係数Ｒ２＝０．９０９１、ｋ＝０．０２１０±０．００３０、これは、最初のレベルの動力学方程式に従う。これに基づいて、該系における菌株ＨＮ０５がジクワットへの分解半減期範囲を計算して（３３．７±４．６）ｄであった。
【0035】
実施例５－コサコニア・オリゼ ＨＮ０５がスクロースを電子供与体として利用してアントラキノン化合物を還元した
スクロース（５ｍｍｏｌ／ｌ）を電子供与体として、コサコニア・オリゼ ＨＮ０５が４種のアントラキノン化合物への還元能力を考察して比較した。
１ｍＬの細菌懸濁液を基本的な嫌気性培地に接種し、０．５ｍｍｏｌ／Ｌアントラキノン－１－スルホン酸ナトリウム（α－ＡＱＳ）、アントラキノン－２－スルホン酸ナトリウム（ＡＱＳ）、アントラキノン－２，６－ジスルホン酸二ナトリウム（ＡＱＤＳ）、又はアントラキノン－１，５－ジスルホン酸ナトリウム（１，５－ＡＱＤＳ）等の４種のアントラキノン化合物を潜在的な電子受容体として、ＨＮ０５を添加しない系とスクロースを添加しない系を対照として、培養条件は濃縮分離と同じである。３つの繰り返しを設定した。それぞれ１、３、６、９、１２、および１５ｄ培養した時に嫌気性系におけるアントラキノンの還元生成物であるアントラヒドロキノンの変化状況を測定した。可視－紫外分光光度法を使用して、アントラヒドロキノンの濃度を測定し、α－ＡＱＳ、ＡＱＳ、ＡＱＤＳ、１，５－ＡＱＤＳ還元生成物の紫外線吸収波長はそれぞれ３８０ｎｍ、３８２ｎｍ、３８５ｎｍ、３８５ｎｍであった。
スクロース（５ｍｍｏｌ／ｌ）を電子供与体として、コサコニア・オリゼ ＨＮ０５が４種のアントラキノン化合物への還元能力を考察して比較した。
１ｍＬの細菌懸濁液を基本的な嫌気性培地に接種し、０．５ｍｍｏｌ／Ｌアントラキノン－１－スルホン酸ナトリウム（α－ＡＱＳ）、アントラキノン－２－スルホン酸ナトリウム（ＡＱＳ）、アントラキノン－２，６－ジスルホン酸二ナトリウム（ＡＱＤＳ）、又はアントラキノン－１，５－ジスルホン酸ナトリウム（１，５－ＡＱＤＳ）等の４種のアントラキノン化合物を潜在的な電子受容体として、ＨＮ０５を添加しない系とスクロースを添加しない系を対照として、培養条件は濃縮分離と同じである。３つの繰り返しを設定した。それぞれ１、３、６、９、１２、および１５ｄ培養した時に嫌気性系におけるアントラキノンの還元生成物であるアントラヒドロキノンの変化状況を測定した。可視－紫外分光光度法を使用して、アントラヒドロキノンの濃度を測定し、α－ＡＱＳ、ＡＱＳ、ＡＱＤＳ、１，５－ＡＱＤＳ還元生成物の紫外線吸収波長はそれぞれ３８０ｎｍ、３８２ｎｍ、３８５ｎｍ、３８５ｎｍであった。
【0036】
結果を下表２に示すように、１５ｄの嫌気性培養後、「ＨＮ０５＋スクロース＋アントラキノン」の嫌気性系では、４種のアントラキノンはすべて、明らかな還元現象があったが、「ＨＮ０５＋アントラキノン」と「スクロース＋アントラキノン」の対照系では、アントラヒドロキノンの検出はなく、コサコニア・オリゼＨＮ０５はスクロースを電子供与体として、４種のアントラキノン化合物を嫌気性還元できることを示し、利用能力は大きいから小さいまで順次：ＡＱＤＳ＞α－ＡＱＳ＞ＡＱＳ＞１，５－ＡＱＤＳであった。
【0037】
【表2】
【0038】
上記は、本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を限定するために使用せず、本発明の精神と原則において、いかなる修正、同等の置換、および改善等は、本発明の保護範囲に含まれるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【手続補正書】
【提出日】2023-02-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コサコニア・オリゼ ＨＮ０５であって、その分類は、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ ＨＮ０５と名付けられ、中国典型的培養物寄託センターに寄託され、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２１９５６ＨＮ０５であることを特徴とするコサコニア・オリゼＨＮ０５。
【請求項2】
コサコニア・オリゼ ＨＮ０５であって、コサコニア・オリゼ ＨＮ０５の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すヌクレオチド配列であることを特徴とするコサコニア・オリゼＨＮ０５。
【請求項3】
請求項１に記載のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５のアントラキノン類化合物還元における使用。
【請求項4】
請求項１に記載のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５とスクロースの組み合わせのアントラキノン類化合物の嫌気性還元における使用。
【請求項5】
前記スクロースの使用濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記アントラキノン類化合物は、ＡＨ２ＱＤＳ、α－ＡＨ２ＱＳ、ＡＨ２ＱＳ及び１，５－ＡＨ２ＱＤＳのうちの１種以上を含むことを特徴とする請求項３～５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項7】
請求項１に記載のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５の、農薬汚染処理と土壌修復における使用。
【請求項8】
前記コサコニア・オリゼ ＨＮ０５は、ジクワットを分解し、ジクワット汚染水処理及び土壌修復の目的を達成するために使用されることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項9】
請求項１に記載のコサコニア・オリゼ ＨＮ０５とアントラキノン－２，６－ジスルホン酸ナトリウムのジクワットの嫌気性分解における使用。
【請求項10】
前記アントラキノン－２，６－ジスルホン酸ナトリウムの使用濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項９に記載の使用。【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0025】
（３）分子生物学の特性
細菌ＤＮＡ抽出キット（天根生物科技有限公司）で細菌の総ＤＮＡを抽出した。細菌１６Ｓ ｒＲＮＡユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’－ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ－３’，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）および１４９２Ｒ（５’－ＴＡＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ－３’，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）を利用してＰＣＲ増幅を実行した。反応系は５０μＬ：テンプレートＤＮＡ２μＬ、ユニバーサルプライマー２７Ｆおよび１４９２Ｒがそれぞれ１μＬ、Ｔａｑ ｍｉｘ酵素２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ １１μＬである。ＰＣＲ反応条件：９５℃で５ｍｉｎ初期変性し、９５℃で３０秒変性し、５２℃で３０秒アニーリングし、７２℃で９０秒伸長し、３５個サイクル、７２℃で１０ｍｉｎ伸長した。増幅生成物を１％アガロースゲル電気泳動で検出し、上海生工生物工程技術服務有限公司によってシーケンスを完了した。
細菌ＤＮＡ抽出キット（天根生物科技有限公司）で細菌の総ＤＮＡを抽出した。細菌１６Ｓ ｒＲＮＡユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’－ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ－３’，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）および１４９２Ｒ（５’－ＴＡＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ－３’，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）を利用してＰＣＲ増幅を実行した。反応系は５０μＬ：テンプレートＤＮＡ２μＬ、ユニバーサルプライマー２７Ｆおよび１４９２Ｒがそれぞれ１μＬ、Ｔａｑ ｍｉｘ酵素２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ １１μＬである。ＰＣＲ反応条件：９５℃で５ｍｉｎ初期変性し、９５℃で３０秒変性し、５２℃で３０秒アニーリングし、７２℃で９０秒伸長し、３５個サイクル、７２℃で１０ｍｉｎ伸長した。増幅生成物を１％アガロースゲル電気泳動で検出し、上海生工生物工程技術服務有限公司によってシーケンスを完了した。
【国際調査報告】