特表 2023-545038 中和標的のシグナルオン検出のための方法、組成物、キット、およびシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-26

(54)【発明の名称】中和標的のシグナルオン検出のための方法、組成物、キット、およびシステム

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6813 20180101AFI20231019BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20231019BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20231019BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20231019BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6813 Z

G01N33/536 A

G01N33/53 M

G01N33/53 N

G01N33/53 D

G01N33/53 Z

C12Q1/686 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023521047

(86)(22)【出願日】2021-10-06

(85)【翻訳文提出日】2023-05-29

(86)【国際出願番号】 US2021053773

(87)【国際公開番号】W WO2022076559

(87)【国際公開日】2022-04-14

(31)【優先権主張番号】63/087,960

(32)【優先日】2020-10-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/173,039

(32)【優先日】2021-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/252,545

(32)【優先日】2021-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507244910

【氏名又は名称】プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】シュアン フォン

(72)【発明者】

【氏名】ワン ユー

(72)【発明者】

【氏名】イン ポン

(72)【発明者】

【氏名】ファン ツ ウィン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA20

4B063QQ79

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

中和抗体などの中和標的を検出するための方法、組成物、キット、およびシステムが本明細書で提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1のレポータープローブと前記標的との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。

【請求項2】

a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む第2の核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されており、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項1記載の方法。

【請求項3】

a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、かつ前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項1記載の方法。

【請求項4】

a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズされ、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項1記載の方法。

【請求項5】

以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料をブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記ブロッキングプローブ核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。

【請求項6】

i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含む、
請求項5記載の方法。

【請求項7】

以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的または間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。

【請求項8】

以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、
前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程であって、前記第1のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まない、前記提供する工程と;
d. 第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程であって、前記第2のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdTNPを含む、前記生成する工程と;
e. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。

【請求項9】

前記ポリメラーゼを提供することが、前記核酸のうちの1つまたは複数を伸長させる、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。

【請求項10】

核酸記録の有無を検出する前に、存在する場合の核酸記録を増幅することをさらに含む、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。

【請求項11】

前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。

【請求項12】

前記標的が生体分子である、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。

【請求項13】

前記標的が、抗体、核酸、小分子、または抗原である、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。

【請求項14】

前記標的が、中和抗体、抗原、スパイクタンパク質、核酸、または小分子である、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。

【請求項15】

前記抗原がワクチン中に含まれるか、または前記抗原がワクチンによってコードされる、請求項14記載の方法。

【請求項16】

前記試料が生物学的試料である、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。

【請求項17】

試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のレポータープローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。

【請求項18】

第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項17記載の組成物。

【請求項19】

試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。

【請求項20】

第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。

【請求項21】

前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項20記載の組成物。

【請求項22】

前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項21記載の組成物。

【請求項23】

第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。

【請求項24】

前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項24記載の組成物。

【請求項25】

前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項25記載の組成物。

【請求項26】

試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。

【請求項27】

第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、ハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項27記載のキット。

【請求項28】

試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。

【請求項29】

第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。

【請求項30】

前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項29記載のキット。

【請求項31】

前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項30記載のキット。

【請求項32】

第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。

【請求項33】

前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部が、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項32記載のキット。

【請求項34】

前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項33記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、2020年10月6日に出願された米国特許仮出願第63/087,960号、2021年4月9日に出願された米国特許仮出願第63/173,039号および2021年10月5日に出願された米国特許仮出願第63/252,545号の米国特許法第119条（e）の下での恩典を主張し、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0002】

技術分野
本開示は、中和抗体などの標的の検出のための方法、組成物、キット、およびシステムに関する。

【背景技術】

【0003】

背景
中和抗体は、抗原-抗体複合体を形成することを通じて標的成分の生物活性を変化させることを意図した抗体治療の1つの重要なカテゴリーである。免疫原性試験では、中和抗体または抗薬物抗体（ADA）の存在は、しばしば、対応する薬物の異常なPK挙動または有効性喪失をもたらす。他方、有害物質、すなわちウイルスおよびサイトカインを中和することができる抗体は、大きな治療的可能性を有することができる。中和抗体は、ウイルスに対する免疫および耐性についてのワクチン評価における重要な指標でもある。中和抗体の保護レベルは、デング熱、黄熱病、および日本脳炎などの多くのウイルスについて確立されている。機能的な細胞ベースのアッセイおよび競合的リガンド結合アッセイを含む現在の既存の方法はすべて、感受性に関して限られた性能を有する。したがって、中和抗体などの標的を検出するための方法および組成物が当技術分野で依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

概要
標的、例えば生物学的試料などの試料からの中和抗体を検出するための方法、組成物、およびキットが本明細書で提供される。一局面では、（ウイルス、サイトカイン、インターロイキンまたは他のタンパク質に対する）中和抗体を高感度に検出するための一般化された方法が本明細書で提供される。この方法は、中和抗体に対してのみ応答する特別に設計された核酸プローブで組換えタンパク質および抗体を標識すること、および増幅可能な核酸分子を生成することを含む。原理上、本明細書に記載される方法、組成物、およびキットは、結合抗体からのシグナルを除去または阻害し、qPCRまたはハイスループットシーケンシングを通じて中和抗体濃度を定量することができる。

【0005】

中和結合事象と非中和結合事象を区別するための核酸伸長をプログラムする原理は、図1に模式的に示されている。結合分子の対、例えば受容体-リガンド対は、特別に設計された核酸分子とコンジュゲートされる。対の1つのメンバーが標的と結合する場合、例えば、1つのメンバーが標的、例えば抗体または他の生体分子に結合することによって中和される場合、結合対にコンジュゲートされた核酸分子は、一般に、互いに結合することが妨げられる。標的に結合した結合対メンバー（A）にコンジュゲートされた核酸分子は、同じ核酸分子の配列（a^＊）の一部を有する末端で2回または複数回伸長されて、核酸記録、例えば「標的」配列c＊を生成することができる。対照的に、標的の非存在下では、結合対メンバーAは「中和」されず、依然として結合対メンバーBに結合することができる。この状況では、Bにコンジュゲートされた核酸配列の「妨害」のために、中間配列（b＊）のみが、a＊に伸長され得る。したがって、結合対相互作用、例えば受容体-リガンド相互作用が標的（例えば、中和抗体）の存在によって破壊された場合にのみユニークな配列が生成され、異なる実験工程にわたるいくつかの態様では、qPCRまたは次世代シーケンシングによって、生成された配列を増幅および定量することができる。結合対相互作用を破壊する（例えば、受容体-リガンド相互作用を破壊する）ことができない標的（例えば、結合抗体）は、このようなユニークな核酸配列を生成しない。

【0006】

中和結合事象と非中和結合事象を区別するための核酸伸長をプログラムする別の原理は、図16に模式的に示されている。結合分子の対、例えば受容体-リガンド対は、特別に設計された核酸分子とコンジュゲートされる。対の1つのメンバーが標的と結合する場合、例えば、1つのメンバーが標的、例えば抗体または他の生体分子に結合することによって中和される場合、結合対にコンジュゲートされた核酸分子は、一般に、互いに結合することが妨げられる。標的の存在下では、結合対メンバーAは「中和」され、結合対メンバーBに結合することができない。この状況では、Bにコンジュゲートされた核酸配列の「妨害」のために、a＊は、一般に、伸長することが妨げられるか、または、中間配列（b＊）のみがa＊に一般に伸長することができる。対照的に、標的の非存在下では、結合対メンバー（A）にコンジュゲートされた核酸分子は、同じ核酸分子の配列（a^＊）の一部を有する末端で2回または複数回伸長されて、核酸記録、例えば、「標的」配列c＊を生成することができる。したがって、結合対相互作用、例えば受容体-リガンド相互作用が標的（例えば、中和抗体）の存在によって破壊されない場合にのみユニークな配列が生成され、異なる実験工程にわたるいくつかの態様では、qPCRまたは次世代シーケンシングによって、生成された配列を増幅および定量することができる。結合対相互作用を破壊する（例えば、受容体-リガンド相互作用を破壊する）ことができない標的（例えば、結合抗体）は、このようなユニークな核酸配列を生成する。

【0007】

いくつかの態様において、本開示の方法は、レポータープローブの対が同じ標的を認識する場合にのみ、結合部分と非結合部分の間の相互作用時間の差を使用して核酸記録分子を生成する（図4および図11）。

【0008】

いくつかの他の態様において、本開示の方法は、結合部分と非結合部分の間の相互作用時間の差を使用して、標的の非存在下でのみ核酸記録分子を生成する（図17）。

【0009】

いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、鎖置換機構を利用して、第1および第2のレポータープローブが標的の存在下で互いに近接した場合にのみ核酸記録分子を生成する。例えば、図4、図11および図16を参照されたい。「鎖置換」は、同一の配列を有する2つの核酸鎖が、単一の相補的核酸鎖（または鎖のセグメント）に近接しているときに、その相補鎖に対して比較的急速な（例えば、タイムスケール＜1秒）競合を経験し、おそらくは「ランダムウォーク」機構によって相補鎖から互いを「置換する」機構を指す（例えば、その各々の内容が参照により本明細書に組み入れられるYurke et al.,Nature 406:605-608,2000;およびZhang et al.Nature Chemistry 3:103-113,2011を参照）。

【0010】

標的の存在下でのみ核酸記録分子を生成することにより、レポータープローブからのシグナルを除去することができ、qPCRまたはハイスループットシーケンシングを通じて標的濃度を定量することができる。一般に、この方法は、特別に設計された核酸とコンジュゲートされたレポータープローブの対と試料を接触させることを含む。2つのレポータープローブからの核酸は、標的の存在下で互いと相互作用して、検出することができる、例えば増幅することができる核酸記録を生成する。図4および11を参照されたい。

【0011】

いくつかの他の態様では、本方法は、特別に設計された核酸とコンジュゲートされた、レポータープローブおよびブロッキングプローブの対と、試料を接触させることを含む。レポータープローブおよびブロッキングプローブからの核酸は、標的の非存在下で互いと相互作用して、検出することができる、例えば増幅することができる核酸記録を生成する。図16および17を参照されたい。

【0012】

方法、組成物、およびキットは、少なくとも第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブ、および任意で第2のレポータープローブを含む。

【0013】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブは、標的と結合することができる第1の標的結合リガンドを含む。第1の標的結合リガンドは、両末端に一本鎖足場および/または対形成ドメインを含む特別に設計された二本鎖核酸に連結される。例えば、二本鎖核酸の各鎖は、その末端のうちの少なくとも1つに少なくとも1つの一本鎖足場および/または対形成ドメインを含む。さらに、各鎖は、ポリメラーゼによる相補鎖の合成を停止することができる分子または修飾を含む。

【0014】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブは、標的と結合することができる標的結合リガンドを含む。第2のレポータープローブは、第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸であって、第1のレポータープローブの第1の核酸の一本鎖足場/対形成ドメインの1つに実質的に相補的である領域またはドメインを含む、第2の核酸を含む。局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブの第2の核酸は、プライマー結合ドメインをさらに含む。

【0015】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブは、両端に一本鎖足場および/または対形成ドメインを含む二本鎖核酸を含み、足場および/または対形成ドメインの一方は第1のレポータープローブの二本鎖核酸の一本鎖足場/対形成ドメインの一方と実質的に相補的であり、足場および/または対形成ドメインの他方は第1のレポータープローブの二本鎖核酸の一本鎖足場/対形成ドメインの他方と実質的に同一である。いくつかのさらなる態様では、二本鎖核酸の鎖の1つはプライマー結合ドメインを含む。

【0016】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、ブロッキングプローブは、第1のレポータープローブの第1の標的結合リガンドおよび/または第2のレポータープローブの第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に結合するか、または複合体を形成することができるブロッキングリガンドを含む。言い換えれば、ブロッキングプローブは、第1および/または第2の標的結合リガンドとブロッキングリガンドとの間の相互作用によって、第1のレポートプローブおよび/または第2のレポータープローブと複合体を形成することができる。第1のレポートプローブへの標的の結合は、第1のレポータープローブとブロッキングプローブの間の複合体の形成を阻害する。同様に、第2のレポートプローブへの標的の結合は、第2のレポータープローブとブロッキングプローブの間の複合体の形成を阻害する。

【0017】

レポータープローブと同様に、ブロッキングプローブは、ブロッキングリガンドに連結され、第1のレポータープローブの第1の核酸の一本鎖足場/対形成ドメインの1つに実質的に相補的である領域またはドメインを含む特別に設計されたブロッキングプローブ核酸を含む。いくつかの態様において、ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸は、第2の足場または対形成ドメインをさらに含むことができる。第2の足場または対形成ドメインは、第1のレポータープローブの第1の核酸の他の一本鎖足場/対形成ドメインと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むことができる。

【0018】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの第1の標的結合リガンドおよび第2のレポータープローブの第2の標的結合リガンドは同じである、すなわち同じ分子/部分であるが、異なる核酸に連結されている。

【0019】

第1のレポータープローブの第1の標的結合リガンドおよび第2のレポータープローブの標的結合リガンドは、同じ標的に結合することができる。例えば、標的は、第1のレポータープローブの第1の標的結合リガンドおよび第2のレポータープローブの第2の標的結合リガンドに対する結合部位を含む。言い換えれば、第1および第2のレポータープローブは、同じ標的に同時に結合することができる。

【0020】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの第1の標的結合リガンドと第2のレポータープローブの第2の標的結合リガンドは異なる。

【0021】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブの第2の標的結合リガンドは抗体である。例えば、第2のレポータープローブの第2の標的結合リガンドはクラス特異的抗体である。

【0022】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの第1の核酸の一本鎖足場/対形成ドメインの1つは、ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸の一本鎖足場/対形成ドメインに相補的であり、第1のレポータープローブの第1の核酸の一本鎖足場/対形成ドメインの第2のものは、第2のレポータープローブの第2の核酸鎖の一本鎖足場/対形成ドメインに相補的である。

【0023】

設計1
局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの二本鎖核酸は、（1）第1の標的結合リガンドに連結された、第1の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する第1の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む。第2の核酸鎖は、第2の足場ドメイン（x）に連結された第1の足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）および第2の鎖のプライマードメイン（c）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第1のサブドメインおよび第2の鎖の第2のサブドメインは、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第2のサブドメイン（b）および第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）は、互いに実質的に相補的である。さらに、第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）および第1の足場ドメイン（b）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）、第1のサブドメインおよび第2のサブドメイン（b）は、第2の鎖のプライマードメイン（c）、第2のサブドメインおよび第1のサブドメイン（b＊）とハイブリダイズして、ストッパー分子（●）を含む二本鎖（二重鎖）領域を形成する。

【0024】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸は、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a）を含む。足場ドメイン（x＊）は、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第2の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である。第1の足場ドメイン（a）は、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の足場ドメイン（a）と実質的に同一である。

【0025】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブの第2の核酸は、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含む。足場ドメイン（a＊）は、第1のレポータープローブの二本鎖核酸鎖の足場ドメイン（a）および/またはブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸の第1の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である。

【0026】

設計2
局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの二本鎖核酸は、（1）第1の標的結合リガンドに連結された、第1の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する第1の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む。第2の核酸鎖は、第2の足場ドメイン（x）に連結された第1の足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）および第2の鎖のプライマードメイン（c）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第1のサブドメインと、第2のサブドメインおよび第2の鎖とは、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第2のサブドメイン（b）および第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）は、互いに実質的に相補的である。さらに、第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）および第1の足場ドメイン（b）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）、第1のサブドメインおよび第2のサブドメイン（b）は、第2の鎖のプライマードメイン（c）、第2のサブドメインおよび第1のサブドメイン（b＊）とハイブリダイズして、ストッパー分子（●）を含む二本鎖（二重鎖）領域を形成する。

【0027】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸は足場ドメイン（x＊）を含む。足場ドメイン（x＊）は、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第2の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である。ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸は、第1のレポータープローブの第1の核酸の足場ドメイン（a）と実質的に同一であるドメインまたは領域を含まない。

【0028】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブは、（1）標的結合リガンドに連結された、第2の核酸の第1の鎖と、（b）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する、第2の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（x）を含む。足場ドメイン（x）は、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第2の足場ドメイン（x）と実質的に同一である。足場ドメイン（x）は、ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）に実質的に相補的であることに留意されたい。第2のレポータープローブは、（2）足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含む第2の鎖をさらに含む。足場ドメイン（a＊）は、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である。

【0029】

設計3
局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブは、第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖に1つの末端においてハイブリダイズした二本鎖核酸を含む。第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖は、二本鎖核酸とハイブリダイズするための第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインと、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに連結された足場ドメイン（x）とを含む。二本鎖核酸は、（1）第1の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する、第1の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む。第2の鎖は、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）および第2の鎖のプライマードメイン（c）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第1のサブドメインと、第2のサブドメインおよび第2の鎖とは、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第2のサブドメイン（b）および第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）は、互いに実質的に相補的である。さらに、第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）および足場ドメイン（b）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）、第1のサブドメインおよび第2のサブドメイン（b）は、第2の鎖のプライマードメイン（c）、第2のサブドメイン、および第1のサブドメイン（b＊）とハイブリダイズして、ストッパー分子（●）を含む二本鎖（二重鎖）領域を形成する。プライマー結合ドメイン（c＊）は、標的と結合することができる分子/部分（標的結合リガンド）に連結された連結鎖の第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインとハイブリダイズするために、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインに連結される。

【0030】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸は足場ドメイン（x＊）を含む。足場ドメイン（x）は、標的結合リガンドに連結された核酸鎖の足場ドメイン（x＊）に実質的に相補的である。ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸は、第1のレポータープローブの核酸の足場ドメイン（a）と実質的に同一であるドメインまたは領域を含まない。

【0031】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブの第2の核酸は、（1）標的と結合することができる分子/部分（第2の標的結合リガンド）に連結された、第2の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する、第2の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（x）を含む。足場ドメイン（x）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である。足場ドメイン（x）は、ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）に実質的に相補的であることに留意されたい。第2の鎖は、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含む。足場ドメイン（a＊）は、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である。

【0032】

設計4（信号オフ）
局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの二本鎖核酸は、（1）標的結合リガンドに連結された、第1の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する第1の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む。第2の鎖は、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）および第2の鎖のプライマードメイン（c）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第1のサブドメインと、第2のサブドメインおよび第2の鎖とは、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第2のサブドメイン（b）および第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）は、互いに実質的に相補的である。さらに、第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）および足場ドメイン（b）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）、第1のサブドメインおよび第2のサブドメイン（b）は、第2の鎖のプライマードメイン（c）、第2のサブドメインおよび第1のサブドメイン（b＊）とハイブリダイズして、ストッパー分子（●）を含む二本鎖（二重鎖）領域を形成する。

【0033】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸は、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含む。足場ドメイン（a＊）は、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である。

【0034】

方法
別の局面において、本開示は、試料中の標的を検出するための方法を提供する。一般に、この方法は、試料を少なくとも、本明細書に記載される第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させることを含む。いくつかの態様において、この方法は、試料を、本明細書に記載される第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させることを含む。本明細書に開示されるように、シグナル、すなわち核酸記録は、標的の存在下でのみ生成される。したがって、検出は信号オン様式である。

【0035】

第1のレポータープローブとブロッキングプローブは、試料と接触させる前に複合体を形成することができることに留意されたい。これに代えてまたはこれに加えて、第1のレポータープローブとブロッキングプローブは、個別的に試料と接触させることができる。例えば、試料を第1のレポータープローブと接触させ、その後ブロッキングプローブと接触させることができる。

【0036】

同様に、第2のレポータープローブとブロッキングプローブは、試料と接触させる前に複合体を形成することができる。これに代えてまたはこれに加えて、第2のレポータープローブとブロッキングプローブは、個別的に試料と接触させることができる。例えば、試料を第2のレポータープローブと接触させ、その後ブロッキングプローブと接触させることができる。

【0037】

いくつかの態様において、ブロッキングプローブと接触させる前に、試料を第1および第2のレポータープローブと接触させる。

【0038】

標的を検出するための1つの例示的な戦略が図4および図11に図示されている。第1および第2のレポータープローブが標的に共結合すると、第1のレポータープローブの第1の核酸中の足場/対形成ドメインは、第2のレポータープローブの第2の核酸中の相補的足場/対形成ドメインとハイブリダイズする。ポリメラーゼ、例えば鎖置換ポリメラーゼは、ストッパー分子に達するまで、ハイブリダイズした鎖を伸長させる。この伸長は、第2のレポータープローブの第2の核酸に付加された新たに形成された領域またはドメインをもたらす。二本鎖核酸は鎖置換を受け、それによって、第2のレポータープローブの第2の核酸に付加された新たに形成された領域またはドメインは、二本鎖領域の他方の末端上の相補的領域とハイブリダイズする。ポリメラーゼ、例えば鎖置換ポリメラーゼは、第2のストッパー分子に到達するまで、新たにハイブリダイズした鎖を伸長する。得られた核酸は、1つの末端上に第1のレポータープローブの二本鎖核酸中の配列の一部と実質的に同一の配列を含み、他方の末端上に第2のレポータープローブ中の鎖の一部と実質的に同一の配列を含む。

【0039】

図4では、標的の非存在下において、第1および第2のレポータープローブはそれぞれ、ブロッキングプローブに結合したままである。ポリメラーゼは、ストッパー分子に達するまで鎖に沿って伸長する。伸長された核酸鎖は、互いから分離し得る。しかしながら、第1および第2のレポータープローブからの分離された伸長された鎖は互いにハイブリダイズしない。レポータープローブはもはや検出のために使用できないので、これはレポータープローブを不活性化する。したがって、ハイブリダイゼーション、伸長および鎖置換機構を通じて、第1のレポータープローブと第2のレポータープローブの核酸間の相互作用の記録は、標的の存在下でのみ生成される。

【0040】

図11では、標的の非存在下において、ポリメラーゼは、ブロッキングリガンドに連結された鎖に沿って伸長する。これは、第1および第2のレポータープローブから相互作用している鎖を放出する。しかしながら、第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブからの放出された鎖は互いにハイブリダイズしない。レポータープローブはもはや検出のために使用できないので、これはレポータープローブを不活性化する。したがって、第1のレポータープローブと第2のレポータープローブの核酸間の相互作用の記録は、ハイブリダイゼーション、伸長および鎖置換機構を介して標的の存在下でのみ生成される。

【0041】

別の局面では、組成物が本明細書で提供される。一般的には、組成物は、本明細書に記載される第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブのうちの少なくとも1つを含む。局面の任意の1つのいくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載される第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブのうちの少なくとも2つを含む。

【0042】

本明細書で提供されるさらに別の局面では、標的を検出するためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載される第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブのうちの少なくとも1つを含む。局面の任意の1つのいくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載される第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブのうちの少なくとも2つを含む。

【0043】

標的を検出するための別の例示的な戦略が図17に図示されている。標的の非存在下では、レポータープローブとブロッキングプローブとは互いに結合している。第1および/または第2のレポータープローブの核酸中の足場/対形成ドメインは、ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸中の相補的足場/対形成ドメインとハイブリダイズする。ポリメラーゼ、例えば鎖置換ポリメラーゼは、ストッパー分子に達するまで、ハイブリダイズした鎖を伸長させる。この伸長は、ブロッキングプローブのブロッキングプローブ核酸に付加された新たに形成された領域またはドメインをもたらす。二本鎖核酸は鎖置換を受け、それによって、ブロッキングプローブの核酸に付加された新たに形成された領域またはドメインは、二本鎖領域の他方の末端上の相補的領域とハイブリダイズする。ポリメラーゼ、例えば鎖置換ポリメラーゼは、第2のストッパー分子に到達するまで、新たにハイブリダイズした鎖を伸長する。得られた核酸は、1つの末端上に第1のレポータープローブの二本鎖核酸中の配列の一部と実質的に同一の配列を含み、他方の末端上にブロッキングプローブ核酸の一部と実質的に同一の配列を含む。標的の存在下では、レポータープローブとブロッキングプローブは互いに結合しない。レポータープローブはもはや検出のために使用できないので、これはレポータープローブを不活性化する。したがって、ハイブリダイゼーション、伸長および鎖置換機構を通じて、第1のレポータープローブとブロッキングプローブの核酸間の相互作用の記録、すなわち、核酸記録は、標的の非存在下でのみ生成される。

【0044】

設計5
中和結合事象と非酵素的鎖置換を伴う非中和結合事象を区別するための核酸伸長をプログラムする例が図31Aおよび31Bに模式的に示されている。図31Aでは、中和標的、例えば中和抗体を、特別に設計された核酸分子とコンジュゲートされた一対のレポータープローブ、例えばRBDと平衡状態でインキュベートし、それらの結合はレポータープローブを近接させる。ブロッキングプローブ、例えば、別の特別に設計された核酸分子とコンジュゲートされたACE2を順次添加して、レポータープローブ、例えばRBDと結合させる。しかしながら、ブロッキングプローブ、例えば、標的、例えば、中和抗体と同じレポータープローブ、例えば,RBD上の位置に、任意で、より低い親和性で結合するACE2は、一般的には、標的に既に結合したレポータープローブ、例えば、RBDと共局在化することができない。2つのレポータープローブの近接性が維持され、足場ドメイン（a＊）およびプライマードメイン（d＊）を含む核酸鎖の二重伸長を可能にして、ポリメラーゼの添加によってドメイン（d＊）、（a＊）、（b＊）、および（c＊）を含む核酸レポーターを生成する。対照的に、図31Bに示されるように、非中和標的を用いると、レポータープローブは「中和」されず、依然としてブロッキングプローブに結合することができる。レポータープローブのブロッキングプローブとの共局在化は、ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）がレポータープローブの連結鎖の相補的足場ドメイン（x）に結合することを可能にする。これは、第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）へのブロッキングプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）のハイブリダイゼーション、および/または第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）へのブロッキングプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）のハイブリダイゼーションによる足場媒介性鎖置換反応を誘発する。これは、レポータープローブから核酸を解離させ、二重伸長からの核酸記録の生成は一般に妨げられる。したがって、核酸記録は、レポータープローブとブロッキングプローブの間の結合、例えばRBD-ACE2相互作用が標的（例えば、中和抗体）の存在によって破壊された場合にのみ生成される。

【0045】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、前記方法は、（A）前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程と;（B）前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程と;（C）ポリメラーゼを提供し、それにより、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;（D）前記核酸記録の有無を検出する工程とを含み、前記核酸記録の存在は、前記標的が前記試料中に存在することを示し、（i）前記第1のレポータープローブは、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸は、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸は、（1）前記連結鎖にハイブリダイズし、前記連結鎖が、前記第1の標的結合リガンドに連結されており、かつ一本鎖足場ドメイン（a）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、ハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、第1の核酸の第1の鎖と;（2）前記第1の核酸の第1の鎖と実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖とを含み、前記二本鎖核酸は、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;（ii）前記第2のレポータープローブは、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸は、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とは、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができ、（iii）前記第1のブロッキングプローブは、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸は、ハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）は、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）は、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合は、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;（iv）前記第2のブロッキングプローブは、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸は、ハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）は前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk2）は前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合は、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する。

【0046】

（A）試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程、ならびに（B）試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程は、順次または同時であり得ることに留意されたい。例えば、まず試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させた後、第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させることができる。言い換えれば、第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブを試料に添加することができ、ある時間の後に、例えば、5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分、2分、3分、4分、5分、10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分、またはそれより後に、第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブを試料に添加することができる。

【0047】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブは、標的と結合することができる分子/部分（例えば、第1の標的結合リガンド）に連結された連結鎖に1つの末端においてハイブリダイズした二本鎖核酸を含む。第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖は、二本鎖核酸とハイブリダイズするための第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）と、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に連結された足場ドメイン（x）とを含む。二本鎖核酸は、（1）第1の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する第1の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む。第2の鎖は、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）および第2の鎖のプライマードメイン（c）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第1のサブドメインと、第2のサブドメインおよび第2の鎖とは、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第2のサブドメイン（b）および第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）は、互いに実質的に相補的である。さらに、第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）および足場ドメイン（b）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）、第1のサブドメインおよび第2のサブドメイン（b）は、第2の鎖のプライマードメイン（c）、第2のサブドメインおよび第1のサブドメイン（b＊）とハイブリダイズして、ストッパー分子（●）を含む二本鎖（二重鎖）領域を形成する。プライマー結合ドメイン（c＊）は、第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖の第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）とハイブリダイズするために、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結される。

【0048】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のブロッキングプローブは、以下：第1のレポータープローブの標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、ブロッキングリガンド（例えば、第1のブロッキングリガンド）、を含む。第1のブロッキングプローブ核酸は、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含む。第1のブロッキングプローブ核酸の足場ドメイン（x＊）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である。第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）は、第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である。第1のレポータープローブへの標的の結合は、第1のレポータープローブとブロッキングプローブが複合体を形成することを阻害する。

【0049】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブは核酸を含み、前記核酸は、（1）標的と結合することができる分子/部分（例えば、第2の標的結合リガンド）に連結された、第2の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する第2の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む。足場ドメイン（x）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である。第2の鎖は、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含む。足場ドメイン（a＊）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である。

【0050】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のブロッキングプローブは、第2のレポータープローブの標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンド（例えば、第2のブロッキングリガンド）を含む。ブロッキングリガンドは、ブロッキングプローブ核酸に連結される。ブロッキングプローブ核酸は、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含む。足場ドメイン（x＊）は、第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である。ハイブリダイジングドメイン（Lk2）は、第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的である。第2のレポータープローブへの標的の結合は、第2のレポータープローブとブロッキングプローブが複合体を形成することを阻害する。

【0051】

設計6
中和結合事象と非酵素的鎖置換を伴う非中和結合事象を区別するための核酸伸長をプログラムする別の例が図34Aおよび34Bに模式的に示されている。図34Aでは、中和標的、例えば中和抗体を、特別に設計された核酸分子とコンジュゲートされた一対のレポータープローブ、例えばRBDと平衡状態でインキュベートし、それらの結合はレポータープローブを近接させる。しかしながら、ブロッキングプローブ、例えば、標的、例えば、中和抗体と同じレポータープローブ、例えば、RBD上の位置に、任意で、より低い親和性で結合するACE2は、一般的には、標的に既に結合したレポータープローブ、例えば、RBDと共局在化することができない。2つのレポータープローブの近接性が維持され、足場ドメイン（a＊）およびプライマードメイン（d＊）を含む核酸鎖の二重伸長を可能にして、ポリメラーゼの添加によってドメイン（d＊）、（a＊）、（b＊）、および（c＊）を含む核酸レポーターを生成する。対照的に、図34Bに示されるように、非中和標的を用いると、レポータープローブは「中和」されず、依然としてブロッキングプローブに結合することができる。レポータープローブのブロッキングプローブとの共局在化は、ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）がレポータープローブの連結鎖の相補的足場ドメイン（x）に結合することを可能にする。ブロッキングプローブ上の核酸は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが第1のレポータープローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および第2のプローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まないdNTP混合物の存在下で、ポリメラーゼによって伸長される。この伸長は、レポータープローブから核酸を解離させる。この酵素工程では、dNTP混合物中にないdNTPを必要とする、レポータープローブ中の核酸のポリメラーゼ伸長は禁止されることに留意されたい。レポータープローブ核酸の近接性が破壊されると、欠損したdNTPの添加後に、レポーター核酸鎖のポリメラーゼ伸長が起こりにくく、一般に、二重伸長からの核酸記録の生成が妨げられる。中和標的の存在下では、レポータープローブは近接状態を保ち、二段階伸長-第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが第1のレポータープローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および第2のプローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まないdNTP混合物の存在下での伸長に続く、第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが第1のレポータープローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および第2のプローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを含むdNTP混合物の存在下での伸長によって、ドメイン（d＊）、（a＊）、（b＊）、および（c＊）を含む核酸記録が生成される。したがって、レポータープローブとブロッキングプローブの間の結合、例えばRBD-ACE2相互作用が標的（例えば、中和抗体）の存在によって破壊された場合にのみ、ユニークな配列が生成される。

【0052】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、前記方法は、（A）前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程と;（B）前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程と;（C）ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程と;（D）ある時間（例えば、5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分、2分、3分、4分、5分、10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分、またはそれ以上）の後に、第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それにより、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;（E）前記核酸記録の有無を検出する工程とを含み、前記核酸記録の存在は、前記標的が前記試料中に存在することを示し、（i）前記第1のレポータープローブは、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸は、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸は、（1）連結鎖にハイブリダイズし、前記連結鎖が、前記第1の標的結合リガンドに連結されており、かつ一本鎖足場ドメイン（a）に連結されたハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、ハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、第1の核酸の第1の鎖と;（2）前記第1の核酸の第1の鎖と実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖とを含み、前記二本鎖核酸は、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;（ii）前記第2のレポータープローブは、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸は、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とは、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができ;（iii）前記第1のブロッキングプローブは、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸は、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合は、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;（iv）前記第2のブロッキングプローブは、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸は、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合は、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、（iv）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）は、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み;前記第1のdNTPミックスは、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および/または前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まず;前記第2のdNTPミックスは、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および/または前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しない前記ヌクレオチドに相補的なdTNPを含む。

【0053】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブは、標的と結合することができる分子/部分（例えば、第1の標的結合リガンド）に連結された連結鎖に1つの末端においてハイブリダイズした二本鎖核酸を含む。第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖は、二本鎖核酸とハイブリダイズするための第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）と、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に連結された足場ドメイン（x）とを含む。二本鎖核酸は、（1）第1の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する第1の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む。第2の鎖は、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）および第2の鎖のプライマードメイン（c）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第1のサブドメインと、第2のサブドメインおよび第2の鎖とは、互いに実質的に相補的である。第1の鎖の第2のサブドメイン（b）および第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）は、互いに実質的に相補的である。さらに、第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）および足場ドメイン（b）は、互いに実質的に相補的である。第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）、第1のサブドメインおよび第2のサブドメイン（b）は、第2の鎖のプライマードメイン（c）、第2のサブドメインおよび第1のサブドメイン（b＊）とハイブリダイズして、ストッパー分子（●）を含む二本鎖（二重鎖）領域を形成する。プライマー結合ドメイン（c＊）は、第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖の第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）とハイブリダイズするために、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結される。いくつかの態様において、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）は、2文字または3文字コードを利用する。例えば、2文字コードでは、4つのヌクレオチドのうちの2つ、例えば、A、G、C、およびTのうちの2つが、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）のヌクレオチド配列中で除外されている。3文字コードでは、4つのヌクレオチドのうちの1つ、例えばA、G、C、およびTのうちの1つが、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）のヌクレオチド配列中で除外されている。一般的には、足場ドメイン（a）または（b）中に存在するヌクレオチドが、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）中で除外されている。

【0054】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のブロッキングプローブは、以下：第1のレポータープローブの標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、ブロッキングリガンド（例えば、第1のブロッキングリガンド）、を含む。第1のブロッキングプローブ核酸は、足場ドメイン（x＊）を含む。第1のブロッキングプローブ核酸の足場ドメイン（x＊）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である。第1のレポータープローブへの標的の結合は、第1のレポータープローブと第1のブロッキングプローブが複合体を形成することを阻害する。

【0055】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブは核酸を含み、前記核酸は、（1）標的と結合することができる分子/部分（例えば、第2の標的結合リガンド）に連結された、第2の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する、第2の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む。足場ドメイン（x）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である。第2の鎖は、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含む。足場ドメイン（a＊）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である。いくつかの態様において、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）は、2文字または3文字コードを利用する。例えば、2文字コードでは、4つのヌクレオチドのうちの2つ、例えば、A、G、C、およびTのうちの2つが、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）のヌクレオチド配列中で除外されている。3文字コードでは、4つのヌクレオチドのうちの1つ、例えばA、G、C、およびTのうちの1つが、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）のヌクレオチド配列中で除外されている。一般的には、足場ドメイン（a）または（b）中に存在するヌクレオチドが、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）中で除外されている。

【0056】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のブロッキングプローブは、第2のレポータープローブの標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンド（例えば、第2のブロッキングリガンド）を含む。ブロッキングリガンドは、ブロッキングプローブ核酸に連結される。ブロッキングプローブ核酸は、足場ドメイン（x＊）を含む。足場ドメイン（x＊）は、第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である。第2のレポータープローブへの標的の結合は、第2のレポータープローブと第2のブロッキングプローブが複合体を形成することを阻害する。

【0057】

対照または参照試料（例えば、標的を含まない試料）に対して核酸記録の量を比較することによって、標的の有無を判定することができる。例えば、対照または参照試料（例えば、標的を含まない試料）に対して95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、65％未満、60％未満、45％未満、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、または5％未満の量は、標的が試料中に存在することを示す。

【図面の簡単な説明】

【0058】

本出願書類は、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含有する。カラー図面を有する本特許出願公開の写しは、請求および必要な手数料の支払いに応じて、特許庁によって提供されるであろう。

【図1】中和結合事象と非中和結合事象を区別するための核酸伸長をプログラムする原理の概略図である。Aが抗体または他の生体分子によって「中和」され、一般にBへの結合が妨げられる場合、配列a＊は2回または複数回伸長されて「標的」配列c＊を生成することができる。他方、Aが「中和」されず、なおBに結合することができる場合、Bにコンジュゲートした核酸配列の「妨害」のために、中間配列（b＊）のみがa＊に伸長されることができる。

【図2】抗体クラスに対して特異的ではない中和抗体アッセイのための例示的なプローブ設計の概略図である。A1およびA2は、異なるDNAプローブにコンジュゲートされた同じ受容体タンパク質である。Bは、A1およびA2に結合して受容体-リガンド複合体を形成する。同じ色を有するDNAドメインは互いに相補的である。

【図3】受容体-リガンド相互作用によるプローブ複合体形成の概略図である。

【図4】qPCR読み取りによって例示される検出機構の一態様の概略図である。中和抗体の存在は、ドメインa＊、b＊、c＊およびd＊の配列を有するDNA鎖の生成をもたらす。このDNA配列は、設計されたPCRプライマーの対によって特異的に増幅することができる。非中和抗体の存在は、プローブの「不活性化」をもたらし、ドメインa＊、b＊およびd＊を有する配列のみを生成することができる。

【図5】本方法の例示的な態様によるSARS-COV-2中和抗体アッセイのためのプローブ設計の概略図である。

【図6】例示的な態様によるクラス特異的中和抗体検出システムのためのプローブ設計および反応プロセスの概略図である。

【図7】抗体クラスに対して特異的ではない中和抗体アッセイのための別の例示的なプローブ設計の概略図である。A1およびA2は、異なるDNAプローブにコンジュゲートされた同じ受容体タンパク質である。Bは、A1およびA2に結合して受容体-リガンド複合体を形成する。同じ色を有するDNAドメインは互いに相補的である。

【図8】図7に図示されるプローブ設計の複合体を形成しないフォーマットの概略図である。

【図9】抗体クラスに対して特異的ではない中和抗体アッセイのためのさらに別の例示的なプローブ設計の概略図である。A1およびA2は、異なるDNAプローブにコンジュゲートされた同じ受容体タンパク質である。Bは、A1およびA2に結合して受容体-リガンド複合体を形成する。同じ色を有するDNAドメインは互いに相補的である。

【図10】図9に図示されるプローブ設計の複合体を形成しないフォーマットの概略図である。

【図11】qPCR読み取りによって例示される検出機構の一態様の概略図である。中和抗体の存在は、ドメインa＊、b＊、c＊およびd＊の配列を有するDNA鎖の生成をもたらす。このDNA配列は、設計されたPCRプライマーの対によって特異的に増幅することができる。非中和抗体の存在は、従前に共局在していたDNAプローブの「近接性の破壊」をもたらし、ドメインa＊、b＊およびd＊を有する配列のみを生成することができる。

【図12】本方法の例示的な態様によるモノクローナル抗体薬物に対する中和抗体の検出の概略図である。

【図13】モノクローナル抗体R2B17によって実証された抗SARS-COV-2-RBD抗体アッセイを示す。2つのRBDコンジュゲートが抗RBD mAbに結合するアッセイの基本構築物は、PCR増幅可能な配列d＊a＊b＊c＊を生成する。捕捉抗原として同じRBDタンパク質を使用する従来のELISAアッセイと比較して、SPEAR（Successive Proximity Extension Amplification Reaction）アッセイは、試料体積のわずか1パーセントで1,000倍高い感度を達成した。特に、この結合アッセイは、5桁の規模の線形範囲、および反復間での最小変動を示す。

【図14】14個のモノクローナル抗体による抗SARS-COV-2-RBD抗体アッセイ試験を示す棒グラフである。1つの抗体のみが、アッセイにおいて使用されたRBD組換えタンパク質配列のために応答を有さなかった。

【図15】室温で2時間のインキュベーション後に、ヒトACE2コンジュゲート（50nM）とSARS-COV-2 RBDコンジュゲート（5pM/10pM）との間で高い結合収率が達成され得ることを示す棒グラフである。

【図16】中和結合事象と非中和結合事象を区別するための核酸伸長をプログラムする別の原理の概略図である。Aが抗体または他の生体分子によって「中和」され、一般にBへの結合が妨げられる場合、配列a＊は一般に伸長が妨げられるか、または中間配列（b＊）のみが一般にa＊に伸長され得る。他方、Aが「中和」されず、なおもBに結合することができる場合、配列a＊は2回または複数回伸長されて、「標的」配列c＊を生成することができる。

【図17】SARS-COV-2中和抗体アッセイのプローブ設計および検出機構によって例示される検出機構の一態様の概略図である。スパイクタンパク質は、ヒトACE2受容体に結合し、リガンド-受容体複合体を形成する。同じ色を有するDNAドメインは互いに相補的である。中和抗体の存在は、スパイクタンパク質からのACE2の解離を促進し、ACE2上のa＊の伸長をもたらさない。非中和抗体の存在は、リガンド-受容体複合体およびコンジュゲートされたDNAプローブの近接を破壊せず、後続のポリメラーゼ伸長反応を促進して、ドメインa＊、b＊、c＊およびd＊の配列を有するDNA鎖を生成する。

【図18】SARS-Cov-2スパイクタンパク質に対する様々な中和抗体および非中和抗体に対する例示的なアッセイ応答を示す棒グラフである。詳細には、SAR-Cov-2 S1タンパク質に結合することについてACE2タンパク質と競合するために、1nMモノクローナル抗体を使用した。対照試料には抗体を添加しなかった。ΔCqは、抗体含有試料と対照試料との間のqPCRサイクル差を指す。このアッセイは、様々な抗体の中和能を区別することに関して高い特異性を示す。

【図19】図19Aは、異なる濃度での2つの抗SARS-Cov2モノクローナル抗体の中和能の測定を示す線グラフである。R2B17は中和抗体であり、R2B12は非中和抗体である。抗体は1nMから244fMまで希釈され、対照試料は抗体を含有しない。ΔCtは、抗体含有試料と対照試料との間のqPCRサイクル差を指す。図19Bは、ワクチン接種していない健康ドナー（すなわち、陰性）、SARS-Cov2感染から回復した患者およびワクチン接種患者（Moderna、2回投与）から収集した乾燥血液スポット試料に対する本開示の一態様によるアッセイ性能を示すプロットである。各乾燥血液スポット試料について、6mmスポットをくり抜き、500μLの溶出緩衝液を用いて溶出した。このアッセイは、すべての回復した患者試料およびワクチン接種ドナー試料から中和抗体を検出することが可能であることが実証される。

【図20】抗SARS-COV2抗体のための中和アッセイ（競合結合アッセイ）であるSPEAR-NAbの概略図である。SPEAR-NAbは、SPEARアッセイと類似のアフィニティープローブ構築物を配備し、SプローブおよびPプローブは、それぞれS1タンパク質およびAce2タンパク質にコンジュゲートする。アッセイは、試料をS1コンジュゲートと共にインキュベートした後、Ace2インキュベーションによって開始する。次いで、混合物は、qPCR増幅の前にポリメラーゼ反応を受ける。同一エピトープ上のS1への結合においてAce2より高い親和性を示す中和抗体は、Ace2がDNA伸長のためにS1と結合し、共局在化することを阻害する。対照的に、抗体または非中和抗体が存在しない条件では、S1の異なるエピトープ上での抗体の結合は、Ace2がS1と結合することを妨げない。Ace2は、S1と共局在化することができ、二重伸長を行って完全なレポーター配列を生成する。

【図21】図21A～21Cは、抗SARS COV2中和抗体検出に対するSPEAR-NAb特異度および感度を示す線グラフである。（図21A）異なる中和能の6つの抗SARS COV2モノクローナル抗体をELISAで試験し、S1との優れた類似の結合親和性を示した。250nMからの4倍希釈でこれらの抗体に対してSPEAR-NAb試験を行い、異なる中和能を有する抗SARS COV2抗体を区別することができた。（図21B）高い報告された中和能を有する抗体（R2B12、R2B17および5B7D7）は、非中和対応物（9B1E8、R1B8およびR2B12）よりも有意に高いシグナル阻害を示した。（図21C）SPEARは、市販のCPASSアッセイと比較して、感度の2桁の増加を有する。

【図22】SPEAR-NAb試験のためのDBS試料収集に関する実験ワークフローの概略図である。指先穿刺によって採取した血液をDBSカード上に収集し、一晩乾燥させる。6mmディスクをくり抜き、500μLのDBS溶出緩衝液中、37℃で1.5時間溶出する。

【図23】図23A～23Cは、陰性者、感染患者およびワクチン接種ドナーDBS試料の中和測定でのSPEAR-NAb対CPASS対PsVNAの比較を示す線グラフである。図23Aおよび23Bは、ワクチン接種および感染患者試料を陰性試料（非感染および非ワクチン接種）から明確に区別する上でのSPEAR-NAbの優れた感度（100％）および特異度（100％）を実証し、すべてのワクチン接種試料（n＝21）は患者試料（n＝19）の総平均を上回り、患者試料は陰性対象（n＝22）の総平均を上回るのに対して、CPASSおよびPsVNAは、DBS試料を用いた、患者試料からのワクチンの識別および陰性対象からのワクチン/患者試料の識別が不良である。図23Cは、10個のワクチン接種DBS試料に対する2倍希釈での中和力価測定である。SPEAR-Nabは、すべてのワクチン試料についての力価にわたる変化（最大256×）を測定する感度があり、ワクチン試料にわたってNT50を定量することができる。対照的に、CPassおよびPsVNAは、2×希釈ではるかに低い阻害を示し、8×希釈では、すべてのDBS試料から中和抗体を検出することができない。

【図24】血清、血漿、およびDBS試料に対するSPEAR-NAbの一致測定を示す線グラフである。SPEAR-Nabによって、DBSと血清/血漿試料の間で優れた一致が観察された（R2＝0.9788）。影が付された領域は、単純線形回帰の90％信頼区間を示す。

【図25】単一のDBS試料から、SARS-COV-2野生型（WT）ならびに英国（UK）、南アフリカ（SA）およびブラジル（BZ）から同定された異なるバリアントに対するワクチン接種ドナー（n＝37）の中和力価を測定することに関してSPEAR-NAbを示すプロットおよび線グラフである。50％阻害での中和力価（NT50）を、各試料で8×2倍希釈から内挿した。赤色のバー/線は、幾何平均力価（GMT）を示す。左パネルは、WTと比較してバリアントのNT50がより低いことを示す（UK（B.1.1.7）＞SA（B.1.351）＞BZ（P.1））。右側のパネルには、個体ごとのバリアント測定が示されており、S1バリアントでのNT50の類似の減少が観察される。統計的有意性検定は、フリードマン検定と、その後のDunnの多重比較である。

【図26】SPEARによるSARS-COV2汎IgGアッセイを示す線グラフおよびプロットグラフである。SPEARは、広いダイナミックレンジにわたって、低fMでS1コンジュゲートSPEARプローブによって抗SARS COV2モノクローナル抗体（R2B17）を定量する上で高い感度を示し、ELISAと比較して感度が4桁向上している（左パネル）。ワクチン対象および回復した患者からのDBS試料は、陰性DBS試料（非感染および非ワクチン接種ドナー）から完全に区別される（100％の感度および100％の特異度）。

【図27】SPEARによるSタンパク質発現アッセイを示すプロットグラフである。SPEARは、異なるS1結合エピトープの2つの抗SARS COV2モノクローナル抗体にコンジュゲートされたプローブを使用して、広いダイナミックレンジにわたって低fMでSタンパク質を定量する上で良好に機能する。SPEARは、ワクチン接種ドナーのDBS試料（初回投与後2日目または3日目）からS1のfMコピーを優れた特異度で検出することができる。

【図28】単一のDBS試料に対して複数のアッセイを実施することができることを示す一連のプロットグラフである。SPEAR/SPEAR-NabによるSタンパク質、汎IgGおよび中和抗体測定に関するワクチン接種対象（Moderna/Pfizer）の縦断研究。1回目および2回目の接種の前および後に、4人のワクチン接種対象のDBS試料を経時的に測定した。SPEARは、経時的にS1の明確なプロファイルを示し、最初のピークが4人すべての個体について最初の投与のおよそ3日後に観察され、汎IgGおよび中和抗体が上昇したように見えた時点で平坦化した。汎IgGおよび中和抗体についても同様のプロファイルが観察され、最初のピークは最初の接種後の14日目に観察され、経時的に徐々に減少し、2番目のピークは2回目の投与のおよそ9日後に観察された。

【図29】図29Aおよび29Bは、血清、血漿/血清（図29A）およびDBS（図29B）試料に対するSPEAR-NAbの測定を示す線グラフである。血清/血漿試料に対するプラーク減少中和試験（PRNT）とSPEAR-Nabとの間に優れた一致が観察された（R²＝0.9390）。PRNT血清/血漿試料とSPEAR-Nab DBS試料との間に優れた一致が観察された（R²＝0.9175）。影が付された領域は、単純線形回帰の90％信頼区間を示す。

【図30】DNA鎖置換アプローチに基づく中和抗体アッセイのための例示的なプローブ設計の概略図である。ブロッキングプローブ（A、ACE2）上の核酸は、レポータープローブ（R、RBD）上の連結鎖の一部に相補的であるように設計されている。ブロッキングプローブ（A、ACE2）とレポータープローブ（R、RBD）の共局在化は、足場媒介性鎖置換反応を開始して、近接反応のために必要とされるレポータープローブから核酸を解離させる。ブロッキングプローブACE2およびレポータープローブRBDは、AおよびRとして表記されている。

【図31】図31Aおよび31Bは、本開示の一態様による、中和標的、例えば中和抗体（図31A）対非中和標的（図31B）の検出のための非酵素的鎖置換アプローチの反応ワークフローの概略図である。（図31A）中和抗体のための反応ワークフロー。DNAをコンジュゲートしたRBDの対と共に中和抗体を平衡状態でインキュベートし、それらの結合はプローブを近接させる。別のDNAをコンジュゲートしたACE2を順次添加してRBDと結合させる。しかしながら、より低い親和性で中和抗体と同じRBDとの結合モチーフを共有するACE2は、一般に、結合部位が中和抗体によって既に占有されているRBDと共局在化することができない。レポータープローブの核酸の近接性が維持され、ポリメラーゼの添加によってプライマープローブの二重伸長を可能にして核酸記録を生成する。（図31B）非中和抗体のための反応ワークフロー。非中和抗体は異なるエピトープにおいてRBDと結合するが、ACE2はRBDと結合することができる。共局在化は、ドメインx＊がRBD上のリンカー鎖の相補的足場に結合することを可能にし、プローブを近接性から解離させる足場媒介性鎖置換反応を引き起こす。二重伸長からのレポーター配列の生成は、一般に防止される。

【図32】図31Aおよび31Bに示されている例示的な態様による中和抗体および非中和抗体の検出を示す棒グラフである。

【図33】酵素的およびDNA鎖置換アプローチに基づく中和抗体アッセイのための例示的なプローブ設計の概略図である。反応するDNA鎖は、逐次的な様式でのポリメラーゼ伸長を可能にするために2文字または3文字のコードから構成される。最初のポリメラーゼ伸長は、ブロッキングプローブ（A、ACE2）およびレポータープローブ（R、RBD）上の2文字でコードされた連結鎖（Lk1/1＊およびLk2/2＊上に茶色およびピンク色で示される）が共局在化されているときに、それらを伸長するようにプログラムされる。伸長は、レポータープローブの核酸の近接を破壊し、a＊ドメインの二重伸長からの核酸記録の生成を抑制する。ブロッキングプローブACE2およびレポータープローブRBDは、AおよびRとして表記されている。

【図34】図34Aおよび34Bは、本開示の一態様による、中和標的、例えば中和抗体（図34A）対非中和標的（図34B）の検出のための非酵素的鎖置換アプローチの反応ワークフローの概略図である。（図34A）中和抗体のための反応ワークフロー。DNAをコンジュゲートしたRBDの対と共に中和抗体を平衡状態でインキュベートし、それらの結合はレポータープローブを近接させる。別のDNAをコンジュゲートしたACE2を順次添加してRBDと結合させる。しかしながら、より低い親和性で中和抗体と同じRBDとの結合モチーフを共有するACE2は、一般に、結合部位が中和抗体によって既に占有されているRBDと共局在化することができない。2つのレポータープローブの核酸の近接性が維持され、3種類のdNTPの存在下でのプライマープローブの二重伸長を可能にして核酸記録を生成する。（図34B）非中和抗体のための反応ワークフロー。非中和抗体は異なるエピトープにおいてRBDと結合するが、ACE2はRBDと結合することができる。共局在化は、x＊（緑色のドメイン）がRBD上のリンカー鎖の相補的足場（x）に結合することを可能にする。2種類のdNTP（すなわち、dTTPおよびdCTP）を加えることにより、RBD上のリンカー領域（Lk1およびLk2＊）の2文字でコードされた配列を複製することによってx＊を伸長させ、RBDからDNAプローブを置換する。この酵素工程では、開始するために3番目の文字コードを必要とするプライマープローブのポリメラーゼ伸長が一般に禁止されていることに注目すべきである。レポータープローブの近接性が破壊されると、3番目の文字コードの添加後に、プライマー鎖のポリメラーゼ伸長が起こりにくく、一般に、二重伸長からのレポーター配列の生成が一般に妨げられる。

【発明を実施するための形態】

【0059】

詳細な説明
標的を検出するための例示的な態様が図4に図示されている。第1のレポータープローブの第1の標的結合リガンドおよび第2のレポータープローブの第2の標的結合リガンドが標的に共結合すると、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第1の核酸の第1の鎖中の足場ドメイン（a）は、第2のレポータープローブの第2の核酸の足場ドメイン（a＊）とハイブリダイズすることができる。ポリメラーゼ、例えば鎖置換ポリメラーゼは、ストッパー分子に達するまで、ハイブリダイズした鎖を伸長させる。この伸長は、第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）に付加された新たに形成されたサブドメイン（b＊）をもたらす。レポータープローブの標的結合リガンドは標的に結合したままであり、これにより核酸鎖の再編成が可能になる。この再編成は、新たに形成されたサブドメイン（b＊）が、第1のレポータープローブの第1の核酸の第2の鎖の相補的サブドメイン（b）と結合することを可能にする。鎖置換ポリメラーゼは、ストッパー分子に達するまで、再編成されたハイブリダイズした鎖を伸長させる。この第2の伸長は、第2のプライマー結合ドメイン（c＊）を新たに形成されたサブドメイン（b＊）に付加する。得られた核酸は、例えば、順にドメインd＊、a＊、b＊およびc＊を含み、第1のレポータープローブの第1の核酸と第2のレポータープローブの第2の核酸との間の相互作用の記録を提供する。

【0060】

プローブ
局面の任意の1つのいくつかの態様において、ブロッキングリガンドおよび標的は、標的結合リガンドの競合的結合パートナーである。例えば、標的およびブロッキングリガンドは、標的結合リガンドの同じ部分に結合し得る。これに代えてまたはこれに加えて、標的結合リガンドへの標的の結合は、ブロッキングリガンドに対する結合部位を変化させ、それによって標的結合リガンドとブロッキングリガンドの互いへの結合を阻害する。

【0061】

標的結合リガンドおよびブロッキングリガンドは、複合体を直接的にまたは間接的に形成することができることに留意されたい。例えば、標的結合リガンドおよびブロッキングリガンドは、互いに結合して複合体を直接的に形成することができる。あるいは、標的結合リガンドおよびブロッキングリガンドは、別の分子と同時に結合して複合体を間接的に形成することができる。複合体がどのように形成されるかにかかわらず、標的結合リガンドへの標的の結合は、標的結合リガンドとブロッキングリガンドの間の複合体の形成を阻害する。

【0062】

互いに結合することができ、メンバーの1つの対が標的との競合的結合パートナーである分子の任意の対を、本明細書に記載のレポーターおよびブロッキングプローブに使用することができる。局面のいずれかのいくつかの態様において、分子対は結合対のメンバーである。本明細書で使用される場合、「結合対」という用語は、高い親和性で、一般的には低マイクロモル濃度～ピコモル濃度の範囲で、互いを特異的に結合する部分の対を指す。結合対の一方のメンバーが第1の要素にコンジュゲートされ、対の他方のメンバーが第2の要素にコンジュゲートされている場合、第1および第2の要素は、結合対のメンバーの相互作用によって1つになる。結合対の非限定的な例としては、抗原:抗体（その抗原結合断片または誘導体を含む）、ビオチン:アビジン、ビオチン:ストレプトアビジン、ビオチン:ニュートラアビジン（またはビオチンに結合するアビジンの他のバリアントなど）、受容体:リガンドなどが挙げられる。結合対のためのさらなる分子としては、ニュートラアビジン、strep-tag、strep-tactinおよび誘導体、ならびに他のペプチド、ハプテン、色素ベースのタグ-抗タグの組み合わせ、例えばSpyCatcher-SpyTag、Hisタグ、Fcタグ、ジギトニン、GFP、FAM、ハプテン、SNAP-TAG.HRP、FLAG、HA、myc、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、小分子などを挙げることができる。いくつかの例示的な分子の対としては、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、薬物およびその標的などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0063】

いくつかの態様において、標的結合リガンドは受容体であり、ブロッキングリガンドは受容体に対するリガンドであるか、またはその逆である。

【0064】

いくつかの態様において、標的結合リガンドは抗体、例えばクラス特異的抗体であり得る。

【0065】

いくつかの態様において、標的結合リガンドは、DNAまたはRNA結合タンパク質であり得、ブロッキングリガンドは、核酸であるか、またはその逆である。

【0066】

核酸鎖
本明細書に記載されるように、プローブは、標的結合リガンドまたはブロッキングリガンドに連結された核酸鎖を含む。核酸鎖は、リガンド（例えば、標的結合リガンドまたはブロッキングリガンド）に共有結合または非共有結合され得ることに留意されたい。鎖は、その5'-末端によってまたはその3'-末端によって連結され得る。いくつかの好ましい態様において、鎖は、その5'-末端によってリガンド（例えば、標的結合リガンドまたはブロッキングリガンド）に連結される。局面の任意の1つのいくつかの態様において、連結鎖は、連結された末端に対して遠位の末端に一本鎖足場ドメインまたは対形成ドメインを含む。

【0067】

本明細書で使用される場合、「足場ドメイン」および「対形成ドメイン」は、第2の鎖とハイブリダイズするための相補性（complementary）を有する鎖の一部を指す。足場および/または対形成ドメインは、任意の所望の長さまたは配列のものであり得る。例えば、足場および/または対形成ドメインは、独立して、少なくとも4、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、またはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、足場および/または対形成ドメインは、100ヌクレオチドもしくはそれ未満、95ヌクレオチドもしくはそれ未満、90ヌクレオチドもしくはそれ未満、85ヌクレオチドもしくはそれ未満、80ヌクレオチドもしくはそれ未満、75ヌクレオチドもしくはそれ未満、70ヌクレオチドもしくはそれ未満、65ヌクレオチドもしくはそれ未満、60ヌクレオチドもしくはそれ未満、55ヌクレオチドもしくはそれ未満、50ヌクレオチドもしくはそれ未満、45ヌクレオチドもしくはそれ未満、40ヌクレオチドもしくはそれ未満、35ヌクレオチドもしくはそれ未満、または30ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さである。いくつかの態様では、足場および/または対形成ドメインは、約4ヌクレオチド～約50ヌクレオチド長であり得る。例えば、足場および/または対形成ドメインは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、足場および/または対形成ドメインは、4～10、4～15、4～20、4～25、4～30、4～35、4～40、4～45、または4～50ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、足場および/または対形成ドメインは40ヌクレオチドよりも長い。例えば、足場および/または対形成ドメインは、4～100ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様では、足場および/または対形成ドメインは、4～90、4～80、4～70、4～60、または4～50ヌクレオチドの長さを有する。

【0068】

いくつかの態様では、第1のレポータープローブは、第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、二本鎖核酸の第1のレポータープローブの第1の鎖は、標的結合リガンドに連結されており、連結された末端に対して遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む。二本鎖核酸の第1のレポータープローブの第2の鎖は、第1の鎖の足場ドメイン（a）に対して遠位の末端に、対形成ドメイン（x）に連結されたサブドメイン（b）を含み、対形成ドメイン（x）は第2の鎖の末端により近い。2本の鎖は互いに相補的であり、各末端に一本鎖領域を有する二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する。例えば、二本鎖分子は、二重鎖領域の一端に第1の鎖の足場ドメイン（a）を含む第1の一本鎖領域と、二重鎖領域の反対側末端に第2の鎖のサブドメイン（b）および対形成ドメイン（x）を含む第2の一本鎖領域とを含む。

【0069】

いくつかの態様では、第1のレポータープローブは、第1のレポータープローブの第1の鎖と第1のレポータープローブの第2の鎖とを含む二本鎖核酸（nucleic）を含み、二本鎖核酸の第1の鎖は、第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖にハイブリダイズしている。第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖は、対形成ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、対形成ドメイン（x）は、第1の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する。二本鎖核酸の第1の鎖は、一端に第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含み、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインに対して遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む。二本鎖核酸の第2の鎖は、第1の鎖の足場ドメイン（a）に対して遠位の末端にサブドメイン（b）を含む。2本の鎖は互いに相補的であり、各末端に一本鎖領域を有する二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する。例えば、二本鎖分子は、二重鎖領域の一端に第1の鎖の足場ドメイン（a）を含む第1の一本鎖領域と、二重鎖領域の反対側末端に第2の鎖のサブドメイン（b）を含む第2の一本鎖領域とを含む。連結鎖のハイブリダイジングドメインと第1の鎖のハイブリダイジングドメインは互いにハイブリダイズする。

【0070】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の二重鎖領域は、第1の鎖中のストッパー分子または修飾（●）および第2の鎖中のストッパー分子または修飾（●）を含む。本明細書で使用される場合、「ストッパー分子または修飾」は、ポリメラーゼによる鋳型指向性重合を終結させる分子または修飾を指す。言い換えれば、ストッパー分子または修飾は、ポリメラーゼ、例えば鎖置換ポリメラーゼが二重鎖領域を通って伸長するのを防止することができる。

【0071】

いくつかの態様では、ストッパー分子または修飾は、天然のヌクレオチドであり得る。例えば、ストッパー分子は天然のヌクレオチドであり得、ポリメラーゼによる伸長は、ストッパーヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの非存在下で行われ得る。例えば、「Cストッパー」は、dGTPの非存在下で重合を終結させることができる少なくとも1つのCヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ストッパーは少なくとも1つのCヌクレオチドである。いくつかの態様において、ストッパーは少なくとも1つのGヌクレオチドである。いくつかの態様において、ストッパーは少なくとも1つのAヌクレオチドである。いくつかの態様において、ストッパーは少なくとも1つのTヌクレオチドである。

【0072】

いくつかの態様では、重合を終結させる分子は、それぞれシトシンおよびグアニンの化学バリアントであるイソ-dGおよびイソ-dC（IDT）などの単一のまたは対形成した非天然ヌクレオチド配列である。イソ-dCは、イソ-dGと塩基対（水素結合）を形成するが、dGとは塩基対を形成しない。同様に、イソ-dGはイソ-dCと塩基対を形成するが、dCとは塩基対を形成しない。ストッパー位置で、ヘアピンの反対側に対でこれらのヌクレオチドを組み込むことによって、ポリメラーゼは、その位置に付加するための相補的なヌクレオチドを溶液中に有していないので停止される。

【0073】

いくつかの態様では、RNA塩基および/またはメチル化されたRNA塩基は、ヘアピンプライマー内の停止配列として使用され得る。重合を終結させる分子としては、例えば、2'-O-メチル化されたRNAが使用され得る。

【0074】

いくつかの態様において、重合を終結させる分子は、逆位のヌクレオチドである。例えば、5'→5'または3'→3'結合を介して結合したヌクレオチド。

【0075】

いくつかの態様では、重合を終結させる分子は、合成非DNAリンカー、例えば、Int Spacer 9（iSp9）またはSpacer 18（Integrated DNA Technologies（IDT））などのトリエチレングリコールスペーサーである。ポリメラーゼによる重合を終結させる任意の非天然リンカーが、本明細書で提供されるように使用され得ることを理解されたい。このような分子および修飾の他の非限定的な例としては、3炭素結合（/iSpC3/）（IDT）、ACRYDITE（商標）（IDT）、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン（NHSエステル）、コレステリル-TEG（IDT）、I-LINKER（商標）（IDT）、および3-シアノビニルカルバゾール（CNVK）ならびにこれらのバリアントが挙げられる。常にではないが、通例、短いリンカー（例えば、iSp9）は、より速い反応時間をもたらす。

【0076】

分子または修飾が対を形成していないので、重合を終結させる分子または修飾を含めると、二重鎖領域中に「バルジ」が生じることが多い。したがって、いくつかの態様では、二重鎖領域は、ストッパー分子または修飾の反対側に、単一のヌクレオチド（例えば、チミン）、少なくとも2つの同じヌクレオチド（例えば、チミン二量体（TT）または三量体（TTT））、または非天然修飾を含むように設計される。

【0077】

ストッパー分子は、相補的な位置または非相補的な位置にあり得ることに留意されたい。例えば、第1および第2のストッパー分子は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25ヌクレオチド（または塩基対）、またはそれより離れて配置され得る。ストッパー分子が非相補的位置にある場合、1つのストッパー分子は、第1の鎖の足場ドメイン（a）を有する二重鎖の末端により近くなり得、第2のストッパー分子は、第2の鎖の足場ドメイン（x）を有する二重鎖の末端により近くなり得る。いくつかの態様において、第1の鎖中のストッパー分子は、第2の鎖中のストッパー分子よりも、第1の鎖の足場ドメイン（a）を有する二重鎖末端により近い。

【0078】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、本明細書中に記載される核酸は、プライマー結合ドメイン（d）を含む。プライマー結合ドメインは、対形成し得る、すなわち二重鎖領域の一部であり得るか、または対形成しない、すなわち一本鎖であり得る。核酸の「プライマー結合ドメイン」は、相補的プライマーが結合するヌクレオチドの配列である。プライマー結合ドメインは、任意の所望の長さまたは配列のものであり得る。例えば、プライマー結合ドメインは、少なくとも4、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、またはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、プライマー結合ドメインは、100ヌクレオチドもしくはそれ未満、95ヌクレオチドもしくはそれ未満、90ヌクレオチドもしくはそれ未満、85ヌクレオチドもしくはそれ未満、80ヌクレオチドもしくはそれ未満、75ヌクレオチドもしくはそれ未満、70ヌクレオチドもしくはそれ未満、65ヌクレオチドもしくはそれ未満、60ヌクレオチドもしくはそれ未満、55ヌクレオチドもしくはそれ未満、50ヌクレオチドもしくはそれ未満、45ヌクレオチドもしくはそれ未満、40ヌクレオチドもしくはそれ未満、35ヌクレオチドもしくはそれ未満、または30ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さである。いくつかの態様では、プライマー結合ドメインは、約4ヌクレオチド～約50ヌクレオチド長であり得る。例えば、プライマー結合ドメインは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、プライマー結合ドメインは、4～10、4～15、4～20、4～25、4～30、4～35、4～40、4～45、または4～50ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、プライマー結合ドメインは40ヌクレオチドよりも長い。例えば、プライマー結合ドメインは、4～100ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、プライマー結合ドメインは、4～90、4～80、4～70、4～60、または4～50ヌクレオチドの長さを有する。プライマー結合ドメインは、1つより多くの（例えば、2つまたは3つの異なる）プライマーの結合を収容するように設計することができる。

【0079】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第1の鎖は、足場ドメイン（a）を有する末端に対して遠位の末端付近または末端にプライマー結合ドメイン（c＊）を含む。

【0080】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第1の鎖は、ストッパー分子または修飾（●）によって分離された第1のサブドメインと第2のサブドメイン（b）に分割されたドメインを含むことができる。例えば、プライマー結合ドメイン（c＊）を第1のドメインに連結することができ、第2のドメイン（b）を足場ドメイン（a）に連結することができる。したがって、いくつかの態様において、第1の鎖は、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む。

【0081】

存在する場合、第1の鎖の第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、任意の所望の長さまたは配列のものであり得る。さらに、第1の鎖の第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、同じ長さまたは異なる長さのものであり得る。例えば、第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、独立して、少なくとも4、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、またはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、100ヌクレオチドもしくはそれ未満、95ヌクレオチドもしくはそれ未満、90ヌクレオチドもしくはそれ未満、85ヌクレオチドもしくはそれ未満、80ヌクレオチドもしくはそれ未満、75ヌクレオチドもしくはそれ未満、70ヌクレオチドもしくはそれ未満、65ヌクレオチドもしくはそれ未満、60ヌクレオチドもしくはそれ未満、55ヌクレオチドもしくはそれ未満、50ヌクレオチドもしくはそれ未満、45ヌクレオチドもしくはそれ未満、40ヌクレオチドもしくはそれ未満、35ヌクレオチドもしくはそれ未満、または30ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さである。いくつかの態様では、第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、約4ヌクレオチド～約50ヌクレオチド長であり得る。例えば、第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、4～10、4～15、4～20、4～25、4～30、4～35、4～40、4～45、または4～50ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は40ヌクレオチドよりも長い。例えば、第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、4～100ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、4～90、4～80、4～70、4～60、または4～50ヌクレオチドの長さを有する。

【0082】

いくつかの態様において、第1の鎖の第1のサブドメインおよび/または第2のサブドメイン（b）は、バーコードまたはユニーク分子識別子（UMI）ドメインであり得る。例えば、第1の鎖の第2のサブドメイン（b）は、バーコードまたはユニーク分子識別子（UMI）ドメインであり得る。

【0083】

「バーコード」ドメインまたはサブドメインは、特定の分子を一意的に同定するヌクレオチドの配列である。バーコードは、当技術分野で「ユニーク分子識別子」（UMI）と呼ばれることもある。UMIは、別々の配列を核酸分子と結合し、増幅された核酸分子を一意的に同定するために使用することができる。いくつかの態様において、バーコードドメインは、4つのヌクレオチドのうちの3つのみを含有するヌクレオチド配列を含有し得る。例えば、バーコードドメインまたはサブドメインは、（a）A、TおよびCのみ、（b）A、TおよびGのみ、（c）G、TおよびCのみ、または（d）A、GおよびCのみを含み得る。したがって、バーコードドメインまたはサブドメインは、A、T、CまたはGのうちの1つを欠如し得る（含まなくてもよい）。バーコードドメインまたはサブドメインの長さは変化し得る。

【0084】

二重鎖の第2の鎖は、二重鎖領域を形成するために第1の鎖に相補的なヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの態様において、第2の鎖は、第1の鎖の第2のサブドメイン（b）に実質的に相補的である第1のサブドメイン（b＊）を含む。

【0085】

いくつかの態様では、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第2の鎖は、第1の鎖の第1のサブドメインに相補的である第2のサブドメインを含む。ストッパー分子（●）は、第2の鎖の第1のサブドメイン（b＊）と第2のサブドメインとの間に存在し得る。いくつかの態様では、第2の鎖はまた、第1の鎖のプライマー結合ドメイン（c＊）に実質的に相補的である「プライマードメイン」（c）を含む。

【0086】

いくつかの態様において、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第2の鎖は、足場ドメイン（x）に連結された第3のサブドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む。例えば、第2の鎖は、1つの末端に第1のサブドメイン（b＊）を含み、他方の末端に足場ドメイン（x）を含む。

【0087】

いくつかの態様において、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第2の鎖は足場ドメインを含まない。言い換えれば、第2の鎖は、第3のサブドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む。例えば、第2の鎖は、1つの末端に第1のサブドメイン（b＊）を含み、他方の末端にプライマードメイン（c）を含む。

【0088】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、ブロッキングプローブは、ブロッキングリガンドおよびこれに連結されたブロッキングプローブ核酸を含む。ブロッキングプローブ核酸は、ブロッキングリガンドに共有結合または非共有結合することができることに留意されたい。鎖は、その5'-末端によってまたはその3'-末端によって連結され得る。いくつかの好ましい態様において、鎖は、その5'-末端によってブロッキングリガンドに連結される。

【0089】

一般に、ブロッキングリガンドに連結されたブロッキングプローブ核酸は、連結された末端に対して遠位の末端に対形成ドメイン（x＊）を含む。対形成ドメイン（x＊）は、第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）に実質的に相補的である。いくつかの態様において、第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）とブロッキングプローブの対形成ドメイン（x＊）は互いにハイブリダイズする。

【0090】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、ブロッキングリガンドに連結されたブロッキングプローブ核酸は、対形成ドメイン（x＊）に連結された足場ドメイン（a）を含み、対形成ドメイン（x＊）は連結された末端に対して遠位の末端において存在する。連結鎖の足場ドメイン（a）および第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）は、実質的に同一のヌクレオチド配列を含むことができる。言い換えれば、ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）および第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）は、互いに実質的に同一である。

【0091】

いくつかの態様では、本明細書に記載される方法、組成物、およびキットは、第2のレポータープローブを含み得る。一般に、第2のレポータープローブは、第2の標的結合リガンドおよびこれに連結された第2の核酸を含む。第2の核酸は、第2の標的結合リガンドに共有結合的または非共有結合的に連結され得ることに留意されたい。鎖は、その5'-末端によってまたはその3'-末端によって連結され得る。いくつかの好ましい態様において、第2の核酸は、その5'-末端によって標的結合リガンドに連結される。一般に、連結鎖第2の核酸は、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含む。いくつかの態様では、足場ドメイン（a＊）は、標的結合リガンドと連結された末端に対して遠位の末端において存在する。第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である。

【0092】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブは、第2の標的結合リガンドと、第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸とを含む。第2の核酸は、第2の標的結合リガンドに連結された、第2の核酸の第1の鎖と、第1の鎖とハイブリダイズした第2の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、第2の標的結合リガンドに共有結合的または非共有結合的に連結され得ることに留意されたい。第1の鎖は、その5'-末端によってまたはその3'-末端によって連結され得る。いくつかの好ましい態様において、第1の鎖は、その5'-末端によって標的結合リガンドに連結される。一般に、第1の鎖は、連結された末端に対して遠位の末端で対形成ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む。対形成ドメイン（x）は、第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）と実質的に同一である。第2の鎖は、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された、第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む。第1の鎖（すなわち、連結鎖）および第2の鎖のハイブリダイジングドメインは、実質的に相補的であり、互いにハイブリダイズする。いくつかの態様では、足場ドメイン（a＊）は、連結鎖とハイブリダイズした末端に対して遠位の末端において存在する。第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である。

【0093】

いくつかの態様において、第2のレポータープローブの第2のターゲティング結合リガンドはクラス特異的抗体である。

【0094】

核酸鎖ドメイン
本明細書に記載される様々な核酸は、1つまたは複数のドメインを含む。本明細書で使用される場合、「ドメイン」とは、それぞれ、ドメインが対形成していない（相補的なヌクレオチドに結合していないヌクレオチドの連続したストレッチ）か、または対形成している（ヌクレオチド塩基対の連続したストレッチ-相補的なヌクレオチドに結合したヌクレオチド）かに応じて、ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の分離した連続的配列を指す。いくつかの態様では、ドメインは、分子内（同じ分子種内）および分子間（2つの別個の分子種間）相補性を定義する目的で、複数のサブドメインを有すると記載される。1つのドメインが他方のドメインのヌクレオチドと塩基対を形成する（ワトソン-クリック型ヌクレオチド塩基対形成を通じてハイブリダイズ/結合する）ヌクレオチドを含有し、その結果、2つのドメインが、対を形成する（二本鎖）か、または部分的に対を形成する分子種/構造を形成すれば、1つのドメイン（または1つのサブドメイン）は、別のドメイン（または別のサブドメイン）と「相補的」である。相補的ドメインは、いくつかの態様では、完全な相補性が提供されるが、対形成した構造を形成するために完全に（100％）相補的である必要はない。「ドメインa」、「ドメインb」、「ドメインc」などは、互いに異なるヌクレオチド配列を有するドメインを指すことを理解されたい。したがって、「ドメインa」は、「ドメインb」のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する。「ドメインa」および「ドメインa＊」は、2つのドメインが互いにハイブリダイズ（結合）することができるように、互いに相補的な（部分的にまたは完全に相補的な）ヌクレオチド配列を有するドメインを指すことも理解されるべきである。

【0095】

ドメインまたは他の分離したヌクレオチド配列は、それらが互いに連続していれば（2つのドメインを隔てるヌクレオチドが存在しなければ）、またはそれらが互いに50ヌクレオチド以内（例えば、1～50、1～40、1～30、1～20、1～10、1～5）であれば、互いに「隣接している」と見なされる。すなわち、いくつかの態様では、2つのドメインは、2つのドメインが互いに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、または50ヌクレオチドだけ隔てられていれば、隣接していると見なされ得る。

【0096】

ヌクレオチドドメインおよびサブドメインは、互いに対して、または核酸鎖の全長に対して3'および/または5'位に関して記載されている。
本明細書に記載されるドメインは、任意の所望の長さまたは配列のものであり得ることに留意されたい。例えば、本明細書に記載されているドメインは、少なくとも4、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、またはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されているドメインは、100ヌクレオチドもしくはそれ未満、95ヌクレオチドもしくはそれ未満、90ヌクレオチドもしくはそれ未満、85ヌクレオチドもしくはそれ未満、80ヌクレオチドもしくはそれ未満、75ヌクレオチドもしくはそれ未満、70ヌクレオチドもしくはそれ未満、65ヌクレオチドもしくはそれ未満、60ヌクレオチドもしくはそれ未満、55ヌクレオチドもしくはそれ未満、50ヌクレオチドもしくはそれ未満、45ヌクレオチドもしくはそれ未満、40ヌクレオチドもしくはそれ未満、35ヌクレオチドもしくはそれ未満、または30ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さである。いくつかの態様において、本明細書に記載されているドメインは、約4ヌクレオチド～約50ヌクレオチド長であり得る。例えば、本明細書に記載されているドメインは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されているドメインは、4～10、4～15、4～20、4～25、4～30、4～35、4～40、4～45、または4～50ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、本明細書に記載されているドメインは、40ヌクレオチドよりも長い。例えば、本明細書に記載されているドメインは、4～100ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されているドメインは、4～90、4～80、4～70、4～60、または4～50ヌクレオチドの長さを有する。

【0097】

本明細書に記載される方法、組成物、キット、およびシステムは、単一の標的または複数の標的を検出するために使用することができる。例えば、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、または100個の異なる標的を、例えば、単一の反応において検出することができる。

【0098】

有利には、本明細書に記載される方法、組成物、キット、およびシステムは、反応中に存在する低コピー数を有する標的を検出するために使用され得る。例えば、10～100のコピー数（例えば、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100）を、本明細書に記載される方法、組成物、キット、およびシステムを使用して検出することができる。

【0099】

核酸修飾
本明細書で提供される少なくとも1つの核酸鎖は、当技術分野で公知の1つまたは複数の核酸修飾を独立して含むことができる。例えば、核酸鎖は、天然に存在しない核酸および/または天然に存在しないヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体および/または化学修飾を独立して含むことができる。天然に存在しない核酸は、例えば、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドとの混合物を含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体は、リボース、リン酸および/または塩基部分で修飾することができる。

【0100】

例示的な核酸修飾には、核酸塩基修飾、糖修飾、糖間結合修飾、コンジュゲート（例えば、リガンド）およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一態様では、修飾は、デオキシリボ核酸で起こるように、リボース糖のデオキシリボース糖による置換を含まない。核酸修飾は当技術分野で公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20160367702号;米国特許出願公開第20190060458号;米国特許第8,710,200号;および米国特許第7,423,142号を参照されたい。

【0101】

例示的な修飾された核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジンならびにアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルの置換または修飾された類似体、例えば2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-（2-アミノプロピル）ウラシル、5-アミノアリルウラシル、8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびに2-アミノプロピルアデニンを含むN-2、N-6およびO-6置換プリン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3-デアザ-5-アザシトシン、2-アミノプリン、5-アルキルウラシル、7-アルキルグアニン、5-アルキルシトシン、7-デアザアデニン、N6,N6-ジメチルアデニン、2,6-ジアミノプリン、5-アミノ-アリル-ウラシル、N3-メチルウラシル、置換された1,2,4-トリアゾール、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、5-メトキシウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチル-2-チオウラシルを含む）、3-（3-アミノ-3カルボキシプロピル）ウラシル、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N4-アセチルシトシン、2-チオシトシン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、N-メチルグアニン、またはO-アルキル化塩基が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley＆Sons,1990に開示されているもの、およびEnglisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613によって開示されているものが挙げられる。

【0102】

例示的な糖修飾としては、2'-フルオロ、3'-フルオロ、2'-OMe、3'-OMe、および非環状ヌクレオチド、例えばペプチド核酸（PNA）、アンロックド核酸（UNA）、またはグリコール核酸（GNA）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0103】

いくつかの態様において、核酸修飾は、糖間結合の置換または修飾を含むことができる。例示的な糖間結合修飾としては、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、ホスホルアミダート、ホスホロチオアート、メチレンメチルイミノ、チオジエステル、チオノカルバマート、シロキサン、N,N'-ジメチルヒドラジン（-CH2-N（CH3）-N（CH3）-）、アミド-3（3'-CH2-C（＝O）-N（H）-5'）およびアミド-4（3'-CH2-N（H）-C（＝O）-5'）、ヒドロキシルアミノ、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボキサミド、カルボナート、カルボキシメチル、カルバマート、カルボキシラートエステル、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルフィド、スルホナート、スルホンアミド、スルホナートエステル、チオホルムアセタール（3'-S-CH2-O-5'）、ホルムアセタール（3'-O-CH2-O-5'）、オキシム、メチレンイミノ、メチレン（methykene）カルボニルアミノ、メチレンメチルイミノ（MMI、3'-CH2-N（CH3）-O-5'）、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノ、エーテル（C3'-O-C5'）、チオエーテル（C3'-S-C5'）、チオアセトアミド（C3'-N（H）-C（＝O）-CH2-S-C5'、C3'-O-P（O）-O-SS-C5'、C3'-CH2-NH-NH-C5'、3'-NHP（O）（OCH3）-O-5'および3'-NHP（O）（OCH3）-O-5'が含まれるが、これらに限定されない。

【0104】

局面のいずれかのいくつかの態様において、2'-修飾されたヌクレオシドは、2'-ハロ（例えば、2'-フルオロ）、2'-アルコキシ（例えば、2'-Oメチル、2'-Oメチルメトキシおよび2'-Oメチルエトキシ）、2'-アリールオキシ、2'-O-アミンまたは2'-O-アルキルアミン（アミンNH₂;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミンまたはポリアミノ）、O-CH₂CH₂（NCH₂CH₂NMe₂）₂、メチレンオキシ（4'-CH₂-O-2'）LNA、エチレンオキシ（4'-（CH₂）₂-O-2'）ENA、2'-アミノ（例えば、2'-NH₂、2'-アルキルアミノ、2'-ジアルキルアミノ、2'-ヘテロシクリルアミノ、2'-アリールアミノ、2'-ジアリールアミノ、2'-ヘテロアリールアミノ、2'-ジヘテロアリールアミノおよび2'-アミノ酸）NH（CH₂CH₂NH）_nCH₂CH₂-アミン（アミン＝NH₂、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ）、-NHC（O）R（R＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、2'-シアノ、2'-メルカプト、2'-アルキル-チオ-アルキル、2'-チオアルコキシ、2'-チオアルキル、2'-アルキル、2'-シクロアルキル、2'-アリール、2'-アルケニルおよび2'-アルキニルからなる群より選択される修飾を含む。

【0105】

局面のいずれかのいくつかの態様において、逆位のヌクレオシドはdTである。

【0106】

局面のいずれかのいくつかの態様において、5'-修飾されたヌクレオチドは、5'-モノチオホスファート（ホスホロチオアート）、5'-モノジチオホスファート（ホスホロジチオアート）、5'-ホスホロチオラート、5'-アルファ-チオトリホスファート、5'-ベータ-チオトリホスファート、5'-ガンマ-チオトリホスファート、5'-ホスホルアミダート、5'-アルキルホスホナート、5'-アルキルエーテルホスホナート、検出可能な標識、およびリガンドからなる群より選択される5'-修飾を含み、または3'-修飾されたヌクレオチドは、3'-モノチオホスファート（ホスホロチオアート）、3'-モノジチオホスファート（ホスホロジチオアート）、3'-ホスホロチオラート、3'-アルファ-チオトリホスファート、3'-ベータ-チオトリホスファート、3'-ガンマ-チオトリホスファート、3'-ホスホルアミダート、3'-アルキルホスホナート、3'-アルキルエーテルホスホナートおよび検出可能な標識からなる群より選択される3'-修飾を含む。

【0107】

いくつかの態様では、核酸修飾には、ペプチド核酸（PNA）、架橋された核酸（BNA）、モルホリノ、ロックド核酸（LNA）、グリコール核酸（GNA）、トレオース核酸（TNA）、または当技術分野で記載されている他の異種核酸（XNA）が含まれ得る。

【0108】

核酸鎖の安定性を改善するために様々な修飾および変形を行うことができることは当業者には明らかであろう。

【0109】

伸長反応
本明細書に記載される方法の態様は、ポリメラーゼを使用した核酸鎖の伸長を含む。核酸鋳型から核酸を合成する方法は、当技術分野で周知であり、当業者に利用可能である。例えば、そのすべての内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20050277146号、米国特許出願公開第20100035303号、および国際公開第2006030455号を参照されたい。

【0110】

一般に、伸長工程は、ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸の存在下で行われる。反応のすべての成分は、反応緩衝液中に提供することができる。ポリメラーゼ反応組成物、方法またはキット中の成分の濃度は、例えば、特定の用途およびその特定の用途のために必要とされる速度論に応じて変えることができる。

【0111】

重合の速度論は、例えば、温度、時間、緩衝液/塩条件、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）濃度を変えることによって制御することができることに留意されたい。ポリメラーゼは、ほとんどの酵素と同様に、イオン強度、pHおよび存在する金属イオンの種類（例えば、ナトリウムイオン対マグネシウムイオン）を含む多くの緩衝液条件に感受性である。したがって、伸長工程が実施される温度は、例えば、4℃～65℃（例えば、4℃、25℃、37℃、42℃または65℃）で変化し得る。様々な局面のいくつかの態様では、伸長工程が行われる温度は、4～25℃、4～30℃、4～35℃、4～40℃、4～45℃、4～50℃、4～55℃、4～60℃、10～25℃、10～30℃、10～35℃、10～40℃、10～45℃、10～50℃、10～55℃、10～60℃、25～30℃、25～35℃、25～40℃、25～45℃、25～50℃、25～55℃、25～60℃、25～65℃、35～40℃、35～45℃、35～50℃、35～55℃、35～60℃、または35～65℃である。様々な局面のいくつかの態様では、伸長工程は室温で行われる。いくつかの他の態様では、伸長工程は37℃で行われる。

【0112】

伸長工程は、約30分～約24時間行う（インキュベートする）ことができる。局面のいずれかのいくつかの態様では、伸長工程は、約1分、約2分、約3分、約4分、約5分、約6分、約7分、約8分、約9分、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、約50分、約55分、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約18時間、または約24時間行うことができる。

【0113】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様では、dNTPの濃度は、例えば、2～1000mMであり得る。例えば、dNTPの濃度は、2～10pM、2～15pM、2～20pM、2～25pM、2～30pM、2～35pM、2～40pM、2～45pM、2～50pM、2～55pM、2～60pM、2～65pM、2～70pM、2～75pM、2～80pM、2～85pM、2～90pM、2～95pM、2～100pM、2～110pM、2～120pM、2～130pM、2～140pM、2～150pM、2～160pM、2～170pM、2～180pM、2～190pM、2～200pM、2～250pM、2～300pM、2～350pM、2～400pM、2～450pM、2～500pM、2～600pM、2～700pM、2～800pM、2～900pM、または2～1000pMであり得る。例えば、dNTPの濃度は、2pM、5pM、10pM、15pM、20pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、65pM、70pM、75pM、80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、105pM、110pM、115pM、120pM、125pM、130pM、135pM、140pM、145pM、150pM、155pM、160pM、165pM、170pM、175pM、180pM、185pM、190pM、195pM、または200pMであり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、dNTPの濃度は、10～20pM、10～30pM、10～40pM、10～50pM、10～60pM、10～70pM、10～80pM、10～90pM、または10～100pMであり得る。dNTPバリアントも使用できることに留意されたい。

【0114】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様において、伸長工程は、合成された鎖を生成するのに十分な時間、核酸重合、鎖置換およびアニーリングをもたらす条件下で反応をインキュベートすることを含む。

【0115】

局面のいずれかのいくつかの態様において、ポリメラーゼは、DNA鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ（鎖置換ポリメラーゼ）などのDNAポリメラーゼ（DNAP）である。「鎖置換」は、合成中に遭遇する下流DNAを置換する能力を記載する。本明細書で提供されるように使用することができるDNA鎖置換活性を有するポリメラーゼの例には、phi29DNAポリメラーゼ（例えば、NEB＃M0269）、BstDNAポリメラーゼ、大きな断片（例えば、NEB＃M0275）、またはBsuDNAポリメラーゼ、大きな断片（例えば、NEB＃M0330）が含まれるが、これらに限定されない。鎖置換活性を有する他のポリメラーゼを使用することができる。

【0116】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様では、ポリメラーゼはphi29DNAポリメラーゼである。このような態様では、反応条件は以下の通りであり得る:精製されたウシ血清アルブミン（BSA）が補充された反応緩衝液（例えば、50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、10mM（NH₄）₂SO₄、4mM DTT）、pH7.5、30℃でインキュベート。

【0117】

局面のいずれかのいくつかの態様において、ポリメラーゼはBstDNAポリメラーゼ、大きな断片である。このような態様では、反応条件は以下の通りであり得る:IX反応緩衝液（例えば、20mM Tris-HCl、10mM（NH₄）₂SO₄、10mM KC1、2mM MgSO₄、0.1％TRITON（登録商標）X-100）、pH8.8、65℃でインキュベート。

【0118】

局面のいずれかのいくつかの態様において、ポリメラーゼはBsuDNAポリメラーゼである。このような態様では、反応条件は以下の通りであり得る:反応緩衝液（例えば、50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM DTT）、pH7.9、37℃でインキュベート。

【0119】

いくつかの態様では、ポリメラーゼは、BstDNAポリメラーゼBsu、Bst2.0、Bst3.0、Bsu、phi29、SDポリメラーゼ、これらの任意の組み合わせまたは断片である。

【0120】

本明細書で提供される方法において使用することができる他の例示的な反応条件には、Thermopol（登録商標）緩衝液;NEB（登録商標）緩衝液1、2、3、4;CutSmart（登録商標）緩衝液;Isothermal Amplification Bufferなどが含まれるが、これらに限定されない。カスタムの緩衝液は、0.5～2×のPBS;5～200mM Tris-HCl;5～200mM酢酸カリウム;5～200mM酢酸マグネシウム;5～200mMトリス酢酸塩を用いて作製することができ、または酵素活性を調節するために、これらの添加剤のうちの1つまたはすべてを添加して5～200mMのBis-Tris-Propane-HClを使用することができる（例えば、6～9.5のpH値で、1～50mM KCl、1～20mM MgSO4、1～20mM MgCl2、1～5mM DTT、0～500ug/ml BSA、1～500NaCl、0.01％～0.5％Triton X-100）。緩衝液はまた、dNTP（例えば、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP）を含むことができる。2～3種類のdNTPのみが使用される場合、省略されたヌクレオチドは、任意で機能的修飾を伴って、ポリメラーゼ作用に対するストッパーとして働く。

【0121】

核酸記録の検出
第1のレポータープローブ中の核酸鎖と第2のレポータープローブの核酸鎖との間の相互作用から生成された核酸記録は、核酸鎖を検出するための任意の方法を用いて検出することができる。核酸を検出するための方法は、当技術分野に周知であり、当業者に利用可能である。核酸を検出するための例示的な方法には、DNA配列決定、PCRに基づく技術、およびハイブリダイゼーションに基づく方法が含まれるが、これらに限定されない。

【0122】

核酸記録は、DNA結合色素を使用して検出することができる。例示的なDNA結合色素としては、とりわけ、アクリジン（例えば、アクリジンオレンジおよびアクリフラビン）、アクチノマイシンD（Jain,et al.J.Mol.Biol.68:21（1972）、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、アントラマイシン、BOBO（商標）-1、BOBO（商標）-3、BO-PRO（商標）-1、クロモマイシン、DAPI（Kapuseinski,et al.Nucl.Acids Res.6（112）:3519（1979）、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、ダウノマイシン、ディスタマイシン（例えば、ディスタマイシンD）、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第7,387,887号に記載される色素、エリプチシン、エチジウム塩（例えば、臭化エチジウム）、フルオロクマリン、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第4,257,774号に記載される蛍光性インターカレータ、GelStar（登録商標）（Cambrex Bio Science Rockland Inc.,Rockland,Me.）、Hoechst 33258（Searle and Embrey,Nucl.Acids Res.18:3753-3762（1990）、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））、Hoechst 33342、ホミジウム、JO-PRO（商標）-1、LIZ色素、LO-PRO（商標）-I、メパクリン、ミスラマイシン、NED色素、ネトロプシン、4',6-ジアミジノ-a-フェニルインドール、プロフラビン、POPO（商標）-1、POPO（商標）-3、PO-PRO（商標）-1、ヨウ化プロピジウム、ルテニウムポリピリジル、S5、SYBR（登録商標）Gold、SYBR（登録商標）Green I（米国特許第5,436,134号および同第5,658,751号）、SYBR（登録商標）Green II、SYTOX blue、SYTOX green、SYTO（登録商標）43、SYTO（登録商標）44、SYTO（登録商標）45、SYTOX（登録商標）Blue、TO-PRO（登録商標）-1、SYTO（登録商標）11、SYTO（登録商標）13、SYTO（登録商標）15、SYTO（登録商標）16、SYTO（登録商標）20、SYTO（登録商標）23、チアゾールオレンジ（Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、Wis）、TOTO（商標）-3、YO-PRO（登録商標）-1およびYOYO（登録商標）-3（Molecular Probes Inc.、Eugene、OR）を挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、SYBR（登録商標）Green I（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,436,134号;同第5,658,751号;およびまたは同第6,569,927号を参照）は、PCR反応を監視するために使用されてきた。当業者によって理解されるように、他のDNA結合色素も適切であり得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第4,883,867号;同第5,658,751号;同第8,865,904号;同第8,883,415号;同第9,040,561号;および同第9,115,397号を参照されたい。任意で、DNA結合色素は、OliGreenまたはPicoGreenである。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,436,134号を参照されたい。

【0123】

いくつかの態様では、核酸記録は、配列決定方法を使用することであり得る。配列決定方法は公知であり、Ulumina,Inc.（La Jolla,CA）またはLife Technologies（Carlsbad,CA）によって提供されるプラットフォームを含むがこれらに限定されない、様々なプラットフォームを用いて行うことができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Wang,et al.,Nat Rev Genet.10（1）:57-63（2009）;およびMartin,Nat Rev Genet.12（10）:671-82（2011）を参照されたい。任意で、核酸記録を検出するための方法は、マイクロアレイ法を含み、マイクロアレイ法は公知であり、Ambion,Inc.,（Austin,TX）およびLife Technologies（Carlsbad,CA）によって提供されるプラットフォームを含むがこれらに限定されない様々なプラットフォームを用いて実施することができる。

【0124】

核酸記録の増幅
いくつかの態様では、本方法は、例えば核酸記録を検出する前に、核酸記録を増幅する工程をさらに含む。本明細書で使用される場合、「増幅する」という用語は、反応の成分のすべてが完全な状態であれば、ポリヌクレオチドの増幅を可能にするのに十分な条件に核酸鎖を供する工程を指す。増幅反応の成分としては、例えば、プライマー、ポリヌクレオチドテンプレート、ポリメラーゼ、ヌクレオチドなどが挙げられる。「増幅する」という用語は、典型的には、標的核酸の「指数関数的」増加を指す。しかしながら、本明細書で使用される「増幅する」は、サイクル配列決定で得られるような、核酸の選択された標的配列の数の線形増加を指すこともできる。核酸配列を増幅および合成する方法は、当技術分野で公知である。例えば、それらのすべての内容が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第7,906,282号、同第8,367,328号、同第5,518,900号、同第7,378,262号、同第5,476,774号および同第6,638,722号を参照されたい。このような方法には、等温増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ならびにcDNA末端の迅速増幅（RACE）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、マルチプレックスRT-PCR、イムノPCR、SSIPA、qPCR、リアルタイムRT-qPCRおよびナノ流体デジタルPCRなどのPCRのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。したがって、本明細書に記載される方法は、試料をDNAポリメラーゼおよびプライマーのセットと接触させる工程を含む。局面のいずれかのいくつかの態様において、プライマーのセットは、別段示されない限り、少なくとも2つのプライマーを含み、約50塩基対（bp）～約50,000bpの標的を増幅するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む。

【0125】

局面のいずれかのいくつかの態様において、増幅工程は等温増幅を含む。本明細書で使用される場合、「等温増幅」は、単一の温度で起こる増幅を指す。例えば、増幅過程は単一の温度で行われるか、または増幅過程の主要な局面は単一の温度で行われる。一般に、等温増幅は、増幅される鋳型鎖を複製して結合した二重鎖を形成するポリメラーゼの能力に依存する。等温増幅は、一定温度での標的核酸の迅速かつ特異的な増幅を可能にする。一般に、等温増幅は、（i）標的核酸内の配列へのプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、および（ii）複数回のプライマーアニーリング、伸長および鎖置換（非限定的な例として、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質およびDNAポリメラーゼの組み合わせを使用）を含むその後の増幅から構成される。等温増幅において使用されるプライマーは、重合の開始を提供するのに十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドである、すなわち、各プライマーは、増幅されるべき標的核酸の鎖に相補的であるように特別に設計されている。

【0126】

等温増幅の非限定的な例としては、ループ媒介等温増幅（LAMP）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）、ヘリカーゼ依存性等温DNA増幅（HDA）、ローリングサークル増幅（RCA）、核酸配列ベース増幅（NASBA）、鎖置換増幅（SDA）、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）およびポリメラーゼスパイラル反応（PSR）が挙げられる。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、Yan et al.,Isothermal amplified detection of DNA and RNA,March 2014,Molecular BioSystems 10（5）,DOI:10.1039/c3mb70304eを参照されたい。

【0127】

局面のいずれかのいくつかの態様において、等温増幅反応はループ媒介等温増幅（LAMP）である、すなわち標的核酸を増幅する工程はループ媒介等温増幅を含む。LAMPは、DNAの増幅のための単一管技術であり、LAMPは、その後の複数回の増幅を容易にするためにループ構造を形成する4～6個のプライマーを使用する。したがって、局面のいくつかの態様では、増幅工程は、試料をDNAポリメラーゼおよびプライマーのセットと接触させることを含み、プライマーのセットは4、5、または6つのループ形成プライマーを含む。

【0128】

局面のいずれかのいくつかの態様において、等温増幅反応はリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）である、すなわち、標的核酸を増幅する工程はリコンビナーゼポリメラーゼ増幅を含む。RPAは、低温DNAおよびRNA増幅技術である。RPA過程は、リコンビナーゼ、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）および鎖置換ポリメラーゼという3つのコア酵素を使用する。リコンビナーゼは、オリゴヌクレオチドプライマーを二重鎖DNA中の相同な配列と対形成させることができる。SSBは、DNAの置換された鎖に結合し、プライマーが置換されるのを防ぐ。最後に、鎖置換ポリメラーゼは、プライマーが標的DNAに結合した場所でDNA合成を開始する。PCRと同じように、標的配列が実際に存在する場合に、2つの反対方向のプライマーを使用することにより、指数関数的DNA増幅反応が開始される。増幅を開始するために、熱または化学融解などの他の試料操作は必要とされない。最適な温度（例えば、37～42℃）では、RPA反応は急速に進行し、標的核酸の迅速な検出のために、典型的には10分以内に、わずか数個の標的コピーから検出可能なレベルまで特異的DNA増幅をもたらす。局面のいずれかのいくつかの態様において、一本鎖DNA結合タンパク質はgp32 SSBタンパク質である。局面のいずれかのいくつかの態様において、リコンビナーゼはuvsXリコンビナーゼである。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,666,598号を参照されたい。局面のいずれかのいくつかの態様において、RPAは、リコンビナーゼ支援増幅（RAA）とも称され得る。したがって、局面のいずれかのいくつかの態様において、増幅工程は、試料をリコンビナーゼおよび一本鎖DNA結合タンパク質と接触させることを含む。局面のいずれかのいくつかの態様において、増幅工程は、試料をDNAポリメラーゼ、プライマーのセット、リコンビナーゼおよび一本鎖DNA結合タンパク質と接触させることを含む。

【0129】

局面のいずれかのいくつかの態様において、等温増幅反応はヘリカーゼ依存性等温DNA増幅（HDA）である。HDAは、一定温度でのインビトロDNA増幅のために鎖を分離するために、ヘリカーゼの二本鎖DNA巻き戻し活性を使用する。局面のいずれかのいくつかの態様において、ヘリカーゼは、HDAの特異性および性能を改善することができる熱安定性ヘリカーゼであり、したがって、等温増幅反応は、好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（tHDA）であり得る。非限定的な例として、ヘリカーゼは、45～65℃で安定かつ活性である熱安定性UvrDヘリカーゼ（Tte-UvrD）である。したがって、局面のいくつかの態様では、増幅工程は、試料をDNAポリメラーゼ、プライマーのセットおよびヘリカーゼと接触させることを含み、ヘリカーゼは任意で熱安定性ヘリカーゼである。

【0130】

局面のいずれかのいくつかの態様において、等温増幅反応はローリングサークル増幅（RCA）である。RCAは、環状DNA鋳型および短いDNAまたはRNAプライマーから開始して、長い一本鎖分子を形成する。したがって、局面のいくつかの態様では、増幅工程は、試料（例えば、環状DNA）をDNAポリメラーゼおよびプライマーのセットと接触させることを含み、プライマーの第2のセットは単一のプライマーを含む。

【0131】

局面のいずれかのいくつかの態様において、等温増幅反応は、転写媒介増幅（TMA）としても知られる核酸配列ベースの増幅（NASBA）である。NASBAは、相補的DNAの環状形成および（例えば、RNアーゼHを使用した）元のRNA配列の破壊を通じたRNAの増幅のために主に使用される等温技術である。NASBA反応混合物は、3つの酵素、すなわち逆転写酵素（RT）、RNアーゼHおよびT7RNAポリメラーゼと、2つのプライマーとを含有する。T7RNAポリメラーゼは、5'-＞3'方向でのDNAからのRNAの形成を触媒するT7バクテリオファージ由来のRNAポリメラーゼである。プライマー1（P1）は、標的核酸上の配列に相補的な3'末端配列と、T7RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターの5'末端（＋）センス配列とを含有する。プライマー2（P2）は、P1でプライムされたDNA鎖に相補的な配列を含有する。NASBA酵素およびプライマーは、特定の核酸配列を指数関数的に増幅するために協調して動作する。NASBAは、標的RNAのcDNAへの増幅、RNAへの増幅、cDNAへの増幅などをもたらし、逆転写工程（例えば、RNAからDNA）および転写工程（例えば、DNAからRNA）が交互に行われ、RNAは各転写後に分解される。したがって、局面のいくつかの態様では、増幅工程は、試料（例えば、cDNA）をRNAポリメラーゼ、逆転写酵素、RNアーゼHおよびプライマーのセットと接触させることを含み、プライマーのセットは、RNAポリメラーゼによって認識される5'配列を含む。

【0132】

局面のいずれかのいくつかの態様において、等温増幅反応は鎖置換増幅（SDA）である。SDAは、制限エンドヌクレアーゼHincIIがその認識部位のヘミホスホロチオアート形態の非修飾鎖に切れ目を入れる能力、およびエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ（エキソ-クレノウ）DNAポリメラーゼが切れ目において3'末端を伸長し、下流のDNA鎖を置換する能力に基づく等温インビトロ核酸増幅技術である。指数関数的増幅は、センス反応とアンチセンス反応をカップリングすることから生じ、センス反応から置換された鎖がアンチセンス反応の標的として働き、逆もまた同様である。したがって、局面のいくつかの態様では、増幅工程は、試料をDNAポリメラーゼ（例えば、エキソ-クレノウ）、プライマーのセットおよび制限エンドヌクレアーゼ（例えば、HincII）と接触させることを含む。

【0133】

局面のいずれかのいくつかの態様では、等温増幅反応はニッキング酵素増幅反応（NEAR）であり、これはSDAと類似のアプローチである。NEARでは、DNAはポリメラーゼおよびニッキング酵素を使用して一定温度（例えば、55℃～59℃）で増幅される。ニッキング部位は、各ポリメラーゼ置換工程で再生され、指数関数的増幅をもたらす。したがって、局面のいくつかの態様では、増幅工程は、試料をDNAポリメラーゼ（例えば、エキソ-クレノウ）、プライマーのセットおよびニッキング酵素（例えば、N.BstNBI）と接触させることを含む。

【0134】

局面のいずれかのいくつかの態様において、等温増幅反応は、ポリメラーゼらせん反応（PSR）である。PSR法は、DNAポリメラーゼ（例えば、Bst）とプライマーの対を用いる。フォワードおよびリバースプライマー配列は、それらの5'末端において互いに逆であるのに対して、それらの3'末端配列は、それらのそれぞれの標的核酸配列に相補的である。PSR法は、61℃～65℃の一定温度で実施され、複雑ならせん構造をもたらす。したがって、局面のいくつかの態様では、増幅工程は、試料をDNAポリメラーゼ（例えば、エキソ-クレノウ）および5'末端が互いに逆であるプライマーのセットと接触させることを含む。

【0135】

局面のいずれかのいくつかの態様において、等温増幅反応は、ポリメラーゼ架橋らせん反応（PCLSR）である。PCLSRは、架橋して最終的ならせん状増幅生成物にすることができる3つの独立した必須のらせん状生成物を生成するために3つのプライマー（例えば、2つの外側らせんプライマーおよび架橋プライマー）を使用する。したがって、局面のいくつかの態様では、増幅工程は、試料をDNAポリメラーゼおよびプライマーのセット（例えば、2つの外側らせんプライマーおよび架橋プライマー）と接触させることを含む。

【0136】

したがって、本明細書で提供される方法、組成物、およびキットは、核酸記録を増幅し、記録の多くのコピーを作成するプライマーまたはプライマーセットを含むことができる。

【0137】

標的
本明細書に記載される方法、組成物、キット、および/またはシステムは、任意の所望の分子を検出するために使用することができる。例えば、標的が、第1のレポータープローブのメンバーおよび第2のレポータープローブのメンバーに結合するためのうちの少なくとも2つの結合部位を有せば、本明細書に記載される方法、組成物、キット、および/またはシステムを使用して、関心対象の任意の標的を検出することができる。中和抗体の検出を示す本開示中に含まれる実施例は、例示を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0138】

標的の例には、タンパク質、糖類（例えば、多糖類）、脂質、核酸（例えば、DNA、RNA、マイクロRNA）、小分子、および抗原が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、標的は生体分子である。本明細書で使用される場合、「生体分子」は、タンパク質、例えば抗体、多糖類、脂質、および核酸（例えば、DNAおよびmRNAなどのRNA）などの大きな高分子、ならびに一次代謝産物、二次代謝産物、および天然産物などの小分子を含む、生物体によって産生される任意の分子である。いくつかの態様において、標的は抗体である。いくつかの態様において、標的は小分子である。

【0139】

一態様において、標的は抗原である。抗原は、病原体の外側表面に存在する分子または分子構造であり、抗原特異的抗体または受容体による抗原の結合は、免疫応答を引き起こすことができる。抗原は、タンパク質、ペプチドおよび/または多糖類であり得る。例示的な抗原としては、外因性抗原、内因性抗原、自己抗原、同種抗原、異好性抗原、スーパー抗原、免疫原（完全抗原）およびハプテン（不完全抗原）が挙げられる。一態様において、抗原はワクチン中に含まれ、および/またはワクチンにコードされる。一態様において、抗原はRNAワクチンによってコードされる。一態様において、抗原はDNAワクチンによってコードされる。

【0140】

一態様において、抗原は、スパイクタンパク質、すなわちウイルスエンベロープの外側に突出するタンパク質構造である。スパイクタンパク質は、S-糖タンパク質としても知られている。

【0141】

標的は、感染症に応答して対象によって産生される分子であり得る。例えば、標的は中和抗体であり得る。「中和抗体」という用語は、例えば細胞またはウイルス上の受容体を封鎖することによって、その生物学的効果を中和または阻害することによって、感染因子、通常はウイルスが細胞に感染するのを防ぐことができる抗体を指す。中和は、抗体が特異的ウイルス抗原に結合し、病原体がそれらの宿主細胞に入るのを阻止するときに起こり得る。

【0142】

標的のさらなる例としては、限定されないが、DNA、RNA、cDNA、すなわち逆転写に供されたRNAのDNA産物、A23187（カルシマイシン、カルシウムイオノフォア）、アバメクチン、アビエチン酸、酢酸、アセチルコリン、アクチン、アクチノマイシンD、アデノシン、アデノシン二リン酸（ADP）、アデノシン一リン酸（AMP）、アデノシン三リン酸（ATP）、アデニル酸シクラーゼ、アドニトール、アドレナリン、エピネフリン、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、エクオリン、アフラトキシン、寒天、アラメチシン、アラニン、アルブミン、アルドステロン、アリューロン、アルファアマニチン、アラントイン、アレスリン、a-アマナチン、アミノ酸、アミラーゼ、同化ステロイド、アネトール、アンギオテンシノーゲン、アニソマイシン、抗利尿ホルモン（ADH）、アラビノース、アルギニン、アスコマイシン、アスコルビン酸（ビタミンC）、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、オーキシン、アビジン、アザジラクチンA-C35H44O16、バクテリオシン、ボーベリシン、ビククリン、ビリルビン、生体高分子、ビオチン（ビタミンH）、ブレフェルジンA、ブラシノライド、ブルシン、カダベリン、カフェイン、カルシフェロール（ビタミンD）、カルシトニン、カルモジュリン、カルモジュリン、カルレティキュリン、カンフル-（C10H16O）、カンナビノール、カプサイシン、カルボヒドラーゼ、炭水化物、カルニチン、カラギーナン、カゼイン、カスパーゼ、セルラーゼ、セルロース-（C6H10O5）、セルレニン、臭化セトリモニウム（セトリミド）-C19H42BrN、チェレリスリン、クロモマイシンA3、チャパロニン、キチン、-クロラロース、クロロフィル、コレシストキニン（CCK）、コレステロール、コリン、コンドロイチン硫酸、桂皮アルデヒド、シトラル、クエン酸、シトリニン、シトロネラール、シトロネロール、シトルリン、コバラミン（ビタミンB12）、補酵素、補酵素Q、コルヒチン、コラーゲン、コニイン、コルチコステロイド、コルチコステロン、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）、コルチゾール、クレアチン、クレアチンキナーゼ、クリスタリン、a-シクロデキストリン、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、シクロパミン、シクロピアゾン酸、システイン、シスチン、シチジン、サイトカラシン、サイトカラシンE、シトクロム、シトクロムC、シトクロムcオキシダーゼ、シトクロムcペルオキシダーゼ、サイトカイン、シトシン-C4H5N3O、デオキシコール酸、DON（デオキシニバレノール）、デオキシリボフラノース、デオキシリボース、デオキシリボース核酸（DNA）、デキストラン、デキストリン、DNA、ドーパミン、酵素、エフェドリン、エピネフリン-C9H13NO3、エルカ酸-CH3（CH2）7CH＝CH（CH2）11COOH、エリスリトール、エリスロポエチン（EPO）、エストラジオール、オイゲノール、脂肪酸、フィブリン、フィブロネクチン、葉酸（ビタミンM）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ホルムアルデヒド、ギ酸、フォルムノシ（Formnoci）、フルクトース、フモニシンB1、ガンマグロブリン、ガラクトース、ガンマグロブリン、γ-アミノ酪酸、γ-ブチロラクトン、γ-ヒドロキシブチラート（GHB）、ガストリン、ゼラチン、ゲラニオール、グロブリン、グルカゴン、グルコサミン、グルコース-C6H12O6、グルコースオキシダーゼ、グルテン、グルタミン酸、グルタミン、グルタチオン、グルテン、グリセリン（グリセロール）、グリシン、グリコーゲン、グリコール酸、糖タンパク質（例えば、前立腺特異的抗原（PSA）などの糖タンパク質酵素）、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）、グランザイム、緑色蛍光タンパク質、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）、GTPアーゼ、グアニン、グアノシン、グアノシン三リン酸（＋GTP）、ハプトグロビン、ヘマトキシリン、ヘム、ヘムエリトリン、ヘモシアニン、ヘモグロビン、ヘムタンパク質、硫酸ヘパラン、高密度リポタンパク質、HDL、ヒスタミン、ヒスチジン、ヒストン、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、HLA抗原、ホモシステイン、ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、ヒト成長ホルモン、ヒアルロナート、ヒアルロニダーゼ、過酸化水素、5-ヒドロキシメチルシトシン、ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシトリプタミン、インジゴ色素、インドール、イノシン、イノシトール、インスリン、インスリン様成長因子、膜内在性タンパク質、インテグラーゼ、インテグリン、インテイン、インターフェロン、イヌリン、イオノマイシン、イオノン、イソロイシン、鉄硫黄クラスター、K252a、K252b、KT5720、KT5823、ケラチン、キナーゼ、ラクターゼ、乳酸、ラクトース、ラノリン、ラウリン酸、レプチン、レプトマイシンB、ロイシン、リグニン、リモネン、リナロール、リノール酸、リノレン酸、リパーゼ、脂質、脂質アンカータンパク質、リポアミド、リポタンパク質、低密度リポタンパク質、LDL、黄体形成ホルモン（LH）、リコペン、リジン、リゾチーム、リンゴ酸、マルトース、メラトニン、膜タンパク質、メタロプロテイン、メタロチオネイン、メチオニン、ミモシン、ミトラマイシンA、マイトマイシンC、モノマー、ミコフェノール酸、ミオグロビン、ミオシン、天然フェノール、核酸、オクラトキシンA、エストロゲン、オリゴペプチド、オリゴマイシン、オルシン、オレキシン、オルニチン、シュウ酸、オキシダーゼ、オキシトシン、p53、PABA、パクリタキセル、パルミチン酸、パントテン酸（ビタミンB5）、副甲状腺ホルモン（PTH）、パラプロテイン、パルダキシン、パルテノライド、パツリン、パキシリン（paxilline）、ペニシリン酸、ペニシリン、ペニトレムA、ペプチダーゼ、ペプシン、ペプチド、ペリマイシン、末梢膜タンパク質、ペロサミン、フェネチルアミン、フェニルアラニン、ホスファゲン、ホスファターゼ、リン脂質、フェニルアラニン、フィチン酸、植物ホルモン、ポリペプチド、ポリフェノール、多糖類、ポルフィリン、プリオン、プロゲステロン、プロラクチン（PRL）、プロリン、プロピオン酸、プロタミン、プロテアーゼ、タンパク質、プロテイノイド、プトレシン、ピレトリン、ピリドキシンまたはピリドキサミン（ビタミンB6）、ピロリジン、ピルビン酸、キノン、ラジシコール、ラフィノース、レニン、レチネン、レチノール（ビタミンA）、ロドプシン（視紅）、リボフラビン（ビタミンB2）、リボフラノース、リボース、リボザイム、リシン、RNA-リボ核酸、RuBisCO、サフロール、サリチルアルデヒド、サリチル酸、サルビノリンA-C23H28O8、サポニン、セクレチン、セレノシステイン、セレノメチオニン、セレノタンパク質、セリン、セリンキナーゼ、セロトニン、スカトール、シグナル認識粒子、ソマトスタチン、ソルビン酸、スクアレン、スタウロスポリン、ステアリン酸、ステリグマトシスチン、ステロール、ストリキニーネ、スクロース（糖）、糖類（全般）、スーパーオキシド、タウタンパク質、T2毒素、タンニン酸、タンニン、酒石酸、タウリン、テトロドトキシン、タウマチン、トポイソメラーゼ、チロシンキナーゼ、タウリン、テストステロン、テトラヒドロカンナビノール（THC）、テトロドトキシン、タプシガルジン、タウマチン、チアミン（ビタミンB1）-C12H17ClN4OS.HCl、トレオニン、トロンボポエチン、チミジン、チミン、トリアクシンC、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）、チロキシン（T4）、トコフェロール（ビタミンE）、トポイソメラーゼ、トリヨードチロニン（T3）、膜貫通受容体、トリコスタチンA、栄養ホルモン、トリプシン、トリプトファン、チューブリン、ツニカマイシン、チロシン、ユビキチン、ウラシル、尿素、ウレアーゼ、尿酸-C5H4N4O3、ウリジン、バリン、バリノマイシン、バナビン類（Vanabins）、バソプレシン、ベルクロゲン、ビタミン類（全般）、ビタミンA（レチノール）、ビタミンB、ビタミンB1（チアミン）、ビタミンB2（リボフラビン）、ビタミンB3（ナイアシンまたはニコチン酸）、ビタミンB4（アデニン）、ビタミンB5（パントテン酸）、ビタミンB6（ピリドキシンまたはピリドキサミン）、ビタミンB12（コバラミン）、ビタミンC（アスコルビン酸）、ビタミンD（カルシフェロール）、ビタミンE（トコフェロール）、ビタミンF、ビタミンH（ビオチン）、ビタミンK（ナフトキノン）、ビタミンM（葉酸）、ワートマニンおよびキシロースが挙げられる。

【0143】

いくつかの態様では、標的は、例えば細胞環境のタンパク質（例えば、細胞内タンパク質または膜タンパク質）などのタンパク質である。タンパク質の例としては、限定されないが、細胞骨格タンパク質（例えば、アクチン、arp2/3、コロニン、ジストロフィン、FtsZ、ケラチン、ミオシン、ネブリン、スペクトリン、タウ、タイチン、トロポミオシン、チューブリンおよびコラーゲン）および細胞外マトリックスタンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチン、f-スポンジン、ピカチュリンおよびフィブロネクチン）などの繊維状タンパク質;血漿タンパク質（例えば、血清アミロイドP成分および血清アルブミン）、凝固因子（例えば、補体タンパク質、C1インヒビターおよびC3コンバターゼ、第VIII因子、第XIII因子、フィブリン、プロテインC、プロテインS、プロテインZ、プロテインZ関連プロテアーゼインヒビター、トロンビン、フォンウィルブランド因子）およびC反応性タンパク質などの急性期タンパク質などの球状タンパク質;血液タンパク質;細胞接着タンパク質（例えば、カドヘリン、エペンジミン、インテグリン、Ncamおよびセレクチン）;イオンチャネル（例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体およびGABAa受容体などのリガンド開口型イオンチャネル、ならびにカリウム、カルシウムおよびナトリウムチャネルなどの電位開口型イオンチャネル）、共輸送（synport）/対向輸送タンパク質（例えば、グルコーストランスポーター）などの膜貫通輸送タンパク質（例えば、CFTR、グリコホリンDおよびスクランブラーゼ）;ホルモンおよび成長因子（例えば、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、インスリン、インスリン様成長因子およびオキシトシンなどのペプチドホルモン、ならびにアンドロゲン、エストロゲンおよびプロゲステロンなどのステロイドホルモン）;膜貫通受容体（例えば、Gタンパク質共役受容体、ロドプシン）および細胞内受容体（例えば、エストロゲン受容体）などの受容体;DNA結合タンパク質（例えば、ヒストン、プロタミン、CIプロテイン）;転写調節因子（例えば、c-myc、FOXP2、FOXP3、MyoDおよびP53）;免疫系タンパク質（例えば、免疫グロブリン、主要組織適合性抗原およびT細胞受容体）;栄養素貯蔵/輸送タンパク質（例えば、フェリチン）;シャペロンタンパク質;および酵素が挙げられる。

【0144】

試料/検体
試料中の標的を検出するための方法、組成物、キット、およびシステムが本明細書に記載されている。本明細書で使用される「試料」または「試験試料」という用語は、生物有機体、例えば試験を必要とする対象から採取または単離された試料を示すことができる。

【0145】

例示的な生物学的試料には、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、胸腺、大腸（colon）、扁桃、精巣、皮膚、脳、心臓、筋肉および膵臓組織などの組織試料が含まれる。他の例示的な生物学的試料には、生検、骨髄試料、臓器試料、皮膚断片および生物が含まれるが、これらに限定されない。臨床または法医学の状況から得られた材料も、生物学的試料という用語の意図された意味の範囲内である。一態様では、試料は、ヒト、動物または植物に由来する。一態様では、生物学的試料は組織試料、好ましくは臓器組織試料である。一態様では、試料はヒトである。試料は、例えば、剖検、生検、筋肉パンチ、または手術から得ることができる。試料は、固形組織または固形腫瘍、例えば、実質（parenchyme）、結合組織または脂肪組織、心臓または骨格筋、平滑筋、皮膚、脳、神経、腎臓、肝臓、脾臓、乳房、癌腫（例えば、腸、鼻咽頭、乳房、肺、胃など）、軟骨、リンパ腫、髄膜腫、胎盤、前立腺、胸腺、扁桃、臍帯または子宮であり得る。組織は、腫瘍（良性または悪性）、癌性または前癌性組織であり得る。試料は、疾患もしくは他の病態に罹患しているか、またはそれらが疑われる（正常もしくは罹患）か、または正常もしくは健康と考えられる動物またはヒト対象から得ることができる。

【0146】

局面のいずれかのいくつかの態様では、生物学的試料は、痰試料、咽頭試料または鼻試料である。局面のいずれかのいくつかの態様において、生物学的試料は細胞または組織または末梢血または体液である。いくつかの態様において、生物学的試料は生検、腫瘍試料、生物流体試料;血液;血清;血漿;尿;精液;粘液;組織生検;臓器生検;滑液;胆汁液;脳脊髄液;粘膜分泌;滲出液;汗;唾液;間質液;または組織試料である。この用語は、上述の試料の混合物も含む。「試験試料」という用語はまた、非処理または前処理された（または前処理された（pre-processed））生物学的試料を含む。

【0147】

一態様では、血液試料は、乾燥血液スポット試料である。乾燥血液スポットを得るための方法は、当技術分野で公知であり、一般的には、少なくとも5マイクロリットル、10マイクロリットル、15マイクロリットルまたはそれより多くの血液をWhatman 31ETFカード紙上に斑点状に採取し、少なくとも0.25時間、0.5時間、1時間、2時間、3時間またはそれより長く風乾させることを含む。乾燥血液スポット試料を得るための方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,093,062号;同第9,110,053号;同第9,207,151号;同第10,531,821号;同第11,000,850号にさらに記載されている。

【0148】

様々な態様において、乾燥血液スポットが使用される場合、試料液滴は、溶液、例えば溶出緩衝液中で乾燥血液スポットディスクを再構成することによって調製される。一態様では、溶出緩衝液は以下からなる。

【0149】

いくつかの事例では、ディスクは約10mm未満の直径を有し、約1000μL未満の溶液、または約750μL未満の溶液、または約500μL未満の溶液、または約250μL未満の溶液、または約25μL～約750μLの範囲、または約25μL～約500μLの範囲、または約25μL～約250μLの範囲、または約25μL～約150μLの範囲の溶液で再構成される。

【0150】

いくつかの事例では、試料は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれより多くの乾燥血液スポット試料を含む。

【0151】

いくつかの事例では、乾燥血液スポットディスクは、約1mm～約15mm、または約1mm～約8mm、または約1mm～約6mm、または約1mm～約4mmの範囲の直径を有する。ディスクは、基材上に血液を堆積させることによって調製される。一態様において、乾燥血液スポットは、約10mL未満の血液または約1mL未満の血液または約100μL未満の血液を使用して作製される。

【0152】

一態様において、本明細書中に記載されるアッセイは、単一の容器基材中に含まれる試料に対して行われる。一態様において、本明細書中に記載されるアッセイは、多容器基材、例えば、24ウェル、96ウェル、384ウェルまたはそれより多くのプレート中に含まれる試料に対して行われる。

【0153】

局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料は非処理試験試料であり得る。本明細書で使用される場合、「非処理試験試料」という語句は、溶液中の希釈および/または懸濁を除いて、事前の試料前処理を有さない試験試料を指す。試験試料を処理するための例示的な方法には、遠心分離、濾過、超音波処理、均質化、加熱、凍結および解凍、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料は凍結試験試料であり得る。凍結試料は、本明細書に記載される方法、アッセイ、およびシステムを使用する前に解凍することができる。解凍後、本明細書に記載される方法、アッセイ、およびシステムに供する前に、凍結試料を遠心分離することができる。局面のいずれかのいくつかの態様において、試験試料は、例えば、遠心分離および清澄化された試験試料を含む上清の収集による、清澄化された試験試料である。局面のいずれかのいくつかの態様において、試験試料は、前処理された試験試料、例えば、遠心分離、均質化、超音波処理、濾過、解凍、精製、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される処理から得られる上清または濾液であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様において、試験試料を化学試薬および/または生物学的試薬で処理することができる。化学試薬および/または生物学的試薬は、例えば、処理中に、その中の生体分子（例えば、核酸およびタンパク質）を含む試料の安定性を保護および/または維持するために使用することができる。当業者は、本明細書に記載される中和抗体などの、標的の検出のために必要とされる生物学的試料の前処理に適した方法およびプロセスを熟知している。

【0154】

組成物およびキット
本明細書に記載される方法を使用して標的を検出するための組成物、キット、およびシステムも本明細書で提供される。

【0155】

いくつかの態様では、組成物は、本明細書に記載される第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブのうちの少なくとも1つを含む。

【0156】

本明細書に記載される組成物は、核酸重合および/または連結のための1つまたは複数の試薬/成分をさらに含むことができる。したがって、本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様では、組成物はポリメラーゼをさらに含む。例えば、DNAポリメラーゼ。局面のいずれかのいくつかの態様において、ポリメラーゼは鎖置換活性を有するポリメラーゼである。

【0157】

局面のいずれかのいくつかの態様において、組成物は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）、塩および/または緩衝液などの核酸重合および/または増幅のための1つまたは複数の試薬をさらに含む。

【0158】

いくつかの態様では、組成物は乾燥組成物である。

【0159】

いくつかの態様では、組成物は、標的、例えば参照標的をさらに含む。

【0160】

一局面では、試料中の標的を検出するためのキットが本明細書で提供される。キットは、本明細書で提供される組成物の1つのいずれか、ならびにそのための包装および資料を含むことができる。したがって、いくつかの態様において、キットは、本明細書中に記載される第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブのうちの少なくとも1つを含む。

【0161】

いくつかの態様では、キットは、核酸の重合および/または増幅のための1つまたは複数の試薬/成分をさらに含むことができる。例えば、キットは、ポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼ、例えば鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含むことができる。

【0162】

局面のいずれかのいくつかの態様において、キットは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）、塩および/または緩衝液などの、核酸重合および/または増幅のための1つまたは複数の試薬をさらに含む。

【0163】

いくつかの態様では、キットは、標的、例えば参照標的をさらに含むことができる。

【0164】

本明細書に記載される第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブのうちの少なくとも1つを含む反応混合物も本明細書で提供される。いくつかの態様では、反応混合物は、ポリメラーゼ（例えば、鎖置換活性を有するポリメラーゼ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）、塩および/または緩衝液などの、核酸重合および/または増幅のための1つまたは複数の試薬をさらに含む。

【0165】

本明細書で提供される別の局面では、標的を検出するためのシステムが提供される。このシステムは、本明細書に記載される第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブのうちの少なくとも1つを含む。いくつかの態様では、システムは、ポリメラーゼ（例えば、鎖置換活性を有するポリメラーゼ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）、塩および/または緩衝液などの、核酸重合および/または増幅のための1つまたは複数の試薬をさらに含む。

【0166】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様が、以下の付番された態様によって表される。
態様1）以下の工程を含む、試料中の標的分子を検出する方法
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるリガンドであって、第2の核酸に連結されている、前記リガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のレポータープローブと前記標的分子との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。
態様2）a. 前記試料を、第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが第1の標的結合リガンドを含み、二本鎖核酸分子に連結されており、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合分子に連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的分子が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：第1および/または第2のターゲティングリガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のプローブの前記核酸と前記第2のプローブの前記核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様3）a. 前記試料を、第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的分子に結合することができ二本鎖核酸分子に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖とを含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合する第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む第1の核酸鎖に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第1の鎖にハイブリダイズしハイブリダイゼーションドメインを含む第2の鎖であって、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1の鎖のハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的であり、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のプローブの前記核酸と前記第2のプローブの前記核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様4）a. 前記試料を、第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第1の標的結合リガンドであって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む核酸鎖に連結されている、前記第1の標的結合リガンド、前記第1の鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記標的結合リガンドに連結された前記核酸鎖にハイブリダイズし、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む第1の核酸鎖に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第1の鎖にハイブリダイズしハイブリダイゼーションドメインを含む第2の鎖であって、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1の鎖のハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的であり、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：第1および/または第2のターゲティングリガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のプローブの前記核酸と前記第2のプローブの前記核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様5）以下の工程を含む、試料中の標的分子を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるリガンドであって、第2の核酸に連結されている、前記リガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的分子の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的分子が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様6）a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の標的結合リガンドを含み、二本鎖核酸分子に連結されており、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合分子に連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1のターゲティングリガンドおよび/または前記第2のターゲティングリガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用の核酸記録と;
c. 前記核酸記録を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的分子が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様7）前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成し、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成する、前記態様のいずれかの方法。
態様8）前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体中に存在せず、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体中に存在しない、前記態様のいずれかの方法。
態様9）前記記録核酸を生成する工程がポリメラーゼによる伸長を含む、前記態様のいずれかの方法。
態様10）前記ポリメラーゼがスタンド（stand）置換ポリメラーゼである、態様7の方法。
態様11）核酸記録を検出するより前に前記核酸記録を増幅することをさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
態様12）前記第1のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様13）前記第2のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様14）前記標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの方法。
態様15）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が同じである、前記態様のいずれかの方法。
態様16）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が異なる、態様1～14のいずれかの方法。
態様17）第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様18）前記標的分子が生体分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様19）前記標的分子が抗体、核酸、小分子、または抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様20）前記標的分子が中和抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様21）前記標的分子が核酸である、態様1～20のいずれかの方法。
態様22）前記標的分子が小分子である、態様1～20のいずれかの方法。
態様23）前記標的分子が抗原である、態様1～20のいずれかの方法。
態様24）前記抗原がスパイクタンパク質である、態様19または23の方法。
態様25）前記抗原がRNAワクチンによってコードされる、態様19または23の方法。
態様26）前記試料が生物学的試料である、前記態様のいずれかの方法。
組成物の態様
態様27）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
組成物。
態様28）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. 第2の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部がハイブリダイズすることができる、前記第2のレポータープローブと;
c. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第3の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第2のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
組成物。
態様29）前記第1のレポーターが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様24または25の組成物。
態様30）前記第1のレポーターが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、前記核酸鎖と、前記連結された鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸とを含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結された前記核酸鎖にハイブリダイズし、かつハイブリダイゼーションドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかの組成物。
態様31）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様32）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含み、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記標的結合リガンドに連結された前記鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様33）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様34）前記第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様35）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様36）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様37）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含み、前記第1の鎖および第2の鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインが互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様38）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様39）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様40）前記ブロッキングプローブが、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のプローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかの組成物。
態様41）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の存在下では1回以下伸長することができる、
組成物。
態様42）前記第1のレポーターが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様38の組成物。
態様43）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様41または42の組成物。
態様44）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、態様41～43のいずれかの組成物。
態様45）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、前記足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様41～44のいずれかの組成物。
態様46）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～45のいずれかの組成物。
態様47）前記ブロッキングプローブが、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～46のいずれかの組成物。
態様48）前記第1のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様49）前記第2のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様50）前記標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様51）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が同じである、前記態様のいずれかの組成物。
態様52）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が異なる、前記態様のいずれかの組成物。
態様53）前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様54）前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかの組成物。
態様55）第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様56）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様57）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様58）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様59）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第1のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第2のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様60）核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様61）ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様62）前記ポリメラーゼがスタンド（stand）置換ポリメラーゼである、態様61の組成物。
態様63）dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様64）塩をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様65）緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様66）前記標的分子をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。

【0167】

キットの態様
態様67）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
キット。
態様68）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. 第2の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部がハイブリダイズすることができる、前記第2のレポータープローブと;
c. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第3の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第2のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
キット。
態様69）前記第1のレポーターが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様63または64のキット。
態様70）前記第1のレポーターが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、前記核酸鎖と、前記連結された鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸とを含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結された前記核酸鎖にハイブリダイズし、かつハイブリダイゼーションドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかのキット。
態様71）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様72）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含み、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記標的結合リガンドに連結された前記鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様73）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様74）前記第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様75）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様76）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様77）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含み、前記第1の鎖および第2の鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインは互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様78）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含む、前記態様のいずれかのキット。
態様79）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様80）前記ブロッキングプローブが、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のプローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかのキット。
態様81）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の存在下では1回以下伸長することができる、
キット。
態様82）前記第1のレポーターが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様81のキット。
態様83）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様81または82のキット。
態様84）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、態様81～83のいずれかのキット。
態様85）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様81～84のいずれかのキット。
態様86）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様81～85のいずれかのキット。
態様87）前記ブロッキングプローブが、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様81～86のいずれかのキット。
態様88）前記第1のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様89）前記第2のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様90）前記標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかのキット。
態様91）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が同じである、前記態様のいずれかのキット。
態様92）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が異なる、前記態様のいずれかのキット。
態様93）前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかのキット。
態様94）前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかのキット。
態様95）第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかのキット。
態様96）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様97）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様98）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様99）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第1のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第2のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様100）核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様101）ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様102）前記ポリメラーゼがスタンド（stand）置換ポリメラーゼである、態様101のキット。
態様103）dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様104）塩をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様105）緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様106）前記標的分子をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。

【0168】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様は、以下の付番された態様によって表される。
態様1：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1のレポータープローブと前記標的との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。
態様2：a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む第2の核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されており、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様1の方法。
態様3：a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、かつ前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様1の方法。
態様4：a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズされ、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様1の方法。
態様5：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料をブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記ブロッキングプローブ核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様6：i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である足場第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含む、
態様5の方法。
態様7:前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成し、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成する、前記態様のいずれかの方法。
態様8:前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体中に存在せず、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体中に存在しない、前記態様のいずれかの方法。
態様9：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、かつ前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的または間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様10：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、
前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程であって、前記第1のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まない、前記提供する工程と;
d. 第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程であって、前記第2のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdTNPを含む、前記生成する工程と;
e. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様11:前記ポリメラーゼを提供することが、前記核酸のうちの1つまたは複数を伸長させる、前記態様のいずれかの方法。
態様12:前記ポリメラーゼがスタンド（stand）置換ポリメラーゼである、態様11の方法。
態様13:核酸記録の有無を検出する前に、存在する場合の核酸記録を増幅することをさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
態様14:前記第1の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様15:前記第2の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様16:前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの方法。
態様17:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかの方法。
態様18:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかの方法。
態様19:第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様20:前記標的が生体分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様21:前記標的が抗体、核酸、小分子、または抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様22:前記標的が中和抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様23:前記標的が核酸である、前記態様のいずれかの方法。
態様24:前記標的が小分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様25:前記標的が抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様26:前記抗原がスパイクタンパク質である、態様21または25の方法。
態様27:前記抗原がワクチン中に含まれるか、または前記抗原がワクチンによってコードされる、態様21または25の方法。
態様28:前記抗原がDNAワクチンによってコードされる、態様27の方法。
態様29:前記抗原がRNAワクチンによってコードされる、態様27の方法。
態様30:前記試料が生物学的試料である、前記態様のいずれかの方法。
態様31:試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のレポータープローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様32:第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む、第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
態様31の組成物。
態様33:前記第1のレポータープローブが、前記第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様31または32の組成物。
態様34:前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されている、前記第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかの組成物。
態様35:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様36:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含み、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖の前記第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様37:前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様38:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様39:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様40:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸を含み、足場ドメイン（a＊）に連結された足場プライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様41:前記第2のレポータープローブが、前記足場第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含み、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインおよび前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様42:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様43:前記ブロッキングプローブ核酸足場が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様44:前記ブロッキングプローブ核酸が、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a）を含み、前記足場第2の足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または前記足場第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、前記第1の足場ドメイン（a）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかの組成物。
態様45:試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様46:前記第1の核酸が、前記第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様45の組成物。
態様47:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様41または42の組成物。
態様48:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、態様41～43のいずれかの組成物。
態様49:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、前記足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様41～44のいずれかの組成物。
態様50:前記ブロッキングプローブ核酸が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～45のいずれかの組成物。
態様51:前記ブロッキングプローブ核酸が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～46のいずれかの組成物。
態様52:前記第1の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様53:前記第2の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様54:前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様55:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかの組成物。
態様56:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかの組成物。
態様57:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様58:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかの組成物。
態様59:第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様60:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様61:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様62:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様63:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、かつ/または前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様64：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様65：前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様64の組成物。
態様66：前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングリガンドハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様65の組成物。
態様67：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様68：前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様67の組成物。
態様69：前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様68の組成物。
態様70:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様64～69のいずれかの組成物。
態様71:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含み、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記標的結合リガンドに連結された前記連結鎖のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、態様64～70のいずれかの組成物。
態様72:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様64～71のいずれかの組成物。
態様73:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様64～72のいずれかの組成物。
態様74:第2の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、態様64～73のいずれかの組成物。
態様75:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドが結合対である、態様64～74のいずれかの組成物。
態様76:前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが結合対である、態様64～75のいずれかの組成物。
態様77:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドならびに/または前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、態様64～76のいずれかの組成物。
態様78:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、態様64～77のいずれかの組成物。
態様79:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、態様64～77のいずれかの組成物。
態様80:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、態様64～79のいずれかの組成物。
態様81:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記第1のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様64～80のいずれかの組成物。
態様82:前記第2の標的結合リガンドが受容体であり、前記第2のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様64～81のいずれかの組成物。
態様83:前記組成物が核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様84:ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様85:前記ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、態様84の組成物。
態様86:dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様87:塩をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様88:緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様89:前記標的をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様90:試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様91:第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む、第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
態様82のキット。
態様92:前記第1の核酸が、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様82または83のキット。
態様93:前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されている、前記第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかのキット。
態様94:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様95:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含み、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖の前記第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様96:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様97:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様98:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様99:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖を含み、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様100:前記第2のレポータープローブが、前記足場第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含み、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインおよび前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様101:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含む、前記態様のいずれかのキット。
態様102:前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含むブロッキングプローブ核酸を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様103:前記ブロッキングプローブが、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a）を含むブロッキングプローブ核酸を含み、前記足場第2の足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、前記足場第2の足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または前記足場第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、前記第1の足場ドメイン（a）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかのキット。
態様104:試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様105:前記第1の核酸が、前記第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様96のキット。
態様106:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様96または97のキット。
態様107:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、態様96～98のいずれかのキット。
態様108:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、前記足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様96～99のいずれかのキット。
態様109:前記ブロッキングプローブ核酸が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様96～100のいずれかのキット。
態様110:前記ブロッキングプローブ核酸が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様96～101のいずれかのキット。
態様111:前記第1の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様112:前記第2の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様113:前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかのキット。
態様114:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかのキット。
態様115:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかのキット。
態様116:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかのキット。
態様117:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかのキット。
態様118:第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかのキット。
態様119:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様120:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様121:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様122:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、かつ/または前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様123：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様124：前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様123のキット。
態様125：前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様124のキット。
態様126：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様127：前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部が、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様126のキット。
態様128：前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様127のキット。
態様129:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様123～129のいずれかのキット。
態様130:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含み、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、態様123～129のいずれかのキット。
態様131:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様123～130のいずれかのキット。
態様132:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様123～131のいずれかのキット。
態様133:第2の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、態様123～132のいずれかのキット。
態様134:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドが結合対である、態様123～133のいずれかのキット。
態様135:前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが結合対である、態様123～134のいずれかのキット。
態様136:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドならびに/または前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、態様123～135のいずれかのキット。
態様137:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、態様123～136のいずれかのキット。
態様138:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、態様123～137のいずれかのキット。
態様139:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、態様123～138のいずれかのキット。
態様140:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記第1のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様123～139のいずれかのキット。
態様141:前記第2の標的結合リガンドが受容体であり、前記第2のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様123～140のいずれかのキット。
態様142:核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様143:ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様144:前記ポリメラーゼがスタンド（stand）置換ポリメラーゼである、態様143のキット。
態様145:dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様146:塩をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様147:緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様148:前記標的をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。

【0169】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様は、以下の付番された態様によって表される。
態様1）以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1のレポータープローブと前記標的との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。
態様2）a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む第2の核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されており、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの方法。
態様3）a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、かつ前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの方法。
態様4）a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズされ、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの方法。
態様5）以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料をブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記ブロッキングプローブ核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様6）i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含む、
前記態様のいずれかの方法。
態様7）以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的または間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様8）以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、
前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程であって、前記第1のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まない、前記提供する工程と;
d. 第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程であって、前記第2のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdTNPを含む、前記生成する工程と;
e. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様9）前記ポリメラーゼを提供することが、前記核酸のうちの1つまたは複数を伸長させる、前記態様のいずれかの方法。
態様10）核酸記録の有無を検出する前に、存在する場合の核酸記録を増幅することをさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
態様11）前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの方法。
態様12）前記標的が生体分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様13）前記標的が、抗体、核酸、小分子、または抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様14）前記標的が、中和抗体、抗原、スパイクタンパク質、核酸、または小分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様15）前記抗原がワクチン中に含まれるか、または前記抗原がワクチンによってコードされる、前記態様のいずれかの方法。
態様16）前記試料が生物学的試料である、前記態様のいずれかの方法。
態様17）試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のレポータープローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様18）第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかの組成物。
態様19）試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様20）第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様21）前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかの組成物。
態様22）前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの組成物。
態様23）第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様24）前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかの組成物。
態様25）前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの組成物。
態様26）試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様27）第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、ハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかのキット。
態様28）試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様29）第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様30）前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかのキット。
態様31）前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかのキット。
態様32）第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様33）前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部が、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかのキット。
態様34）前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
a. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかのキット。

【0170】

いくつかの選択された定義
便宜のため、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および語句の意味が、以下に提供されている。別段の記載がなければ、または文脈上黙示されていなければ、以下の用語および語句は、以下に提供される意味を含む。特に明記されていない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、その用語または語句が属する技術分野においてその用語または語句が得た意味を排除するものではない。定義は、本明細書で提供される局面の特定の態様を記載することを補助するために提供されており、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、特許請求の範囲に記載された発明を限定することは意図されていない。さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0171】

免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,19th Edition,Merck Sharp＆Dohme Corp.出版,2011（ISBN 978-0-911910-19-3）;Robert S.Porter et al.（eds.）,The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine,Blackwell Science Ltd.出版,1999-2012（ISBN 9783527600908）;およびRobert A.Meyers（ed.）,Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995（ISBN 1-56081-569-8）;Immunology by Werner Luttmann,Elsevier出版,2006;Janeway's Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver（eds.）,Taylor＆Francis Limited,2014（ISBN 0815345305,9780815345305）;Lewin's Genes XI,Jones＆Bartlett Publishers出版,2014（ISBN-1449659055）;Michael Richard Green and Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA（2012）（ISBN 1936113414）;Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA（2012）（ISBN 044460149X）;Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch（ed.）Elsevier,2013（ISBN 0124199542）;Current Protocols in Molecular Biology（CPMB）,Frederick M.Ausubel（ed.）,John Wiley and Sons,2014（ISBN 047150338X,9780471503385）,Current Protocols in Protein Science（CPPS）,John E.Coligan（ed.）,John Wiley and Sons,Inc.,2005;およびCurrent Protocols in Immunology（CPI）（John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe,（eds.）John Wiley and Sons,Inc.,2003（ISBN 0471142735,9780471142737）に見出すことができ、これらの内容はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0172】

本明細書で使用される場合、「核酸」は、DNA、RNA、一本鎖、二本鎖、またはより高度に凝集したハイブリダイゼーションモチーフ、およびこれらの任意の化学修飾を意味する。

【0173】

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」という用語は、別の一本鎖核酸もしくはその領域と（分子間ハイブリダイゼーション）、または同じ核酸の別の一本鎖領域と（分子内ハイブリダイゼーション）水素結合した塩基対相互作用を形成する一本鎖核酸またはその領域の現象を指す。ハイブリダイゼーションは、関与する塩基配列によって支配され、相補的な核酸塩基が水素結合を形成し、任意のハイブリッドの安定性は、塩基対の種類（例えば、G:C塩基対はA:T塩基対よりも強い）および連続する塩基対の数によって決定され、相補的な塩基のより長いストレッチはより安定なハイブリッドを形成する。

【0174】

「実質的に同一」という用語は、2つ以上のヌクレオチド配列が少なくとも65％、70％、80％、85％、90％、95％または97％の同一のヌクレオチドを有することを意味する。いくつかの態様では、「実質的に同一」は、2つ以上のヌクレオチド配列が同じ同一のヌクレオチド、すなわち同じヌクレオチド配列を有することを意味する。

【0175】

本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、一般に、2組の核酸間でのハイブリダイズした対形成または結合相互作用の可能性を指す。相補的核酸は、標準的なワトソン・クリック塩基対形成および非ワトソン・クリック塩基対形成（例えば、ゆらぎ塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成）による水素結合対形成を介して互いに結合することができる。いくつかの態様では、2組の核酸は、互いに100％相補的であり得る。他の態様では、2組の核酸は、相補的ではない1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれより多くのヌクレオチドを含み得る。他の態様では、2組の核酸は、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％相補的であり得る。いくつかの態様において、2組の核酸は、それらが安定な複合体または一過性の複合体を形成することができる限り、相補的である。本明細書で使用される「相補的」配列はまた、ハイブリダイズする能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン・クリック塩基対ならびに/または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含むか、または完全にそれらから形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対には、G:Uのゆらぎ塩基対形成またはフーグスティーン塩基対形成が含まれるが、これらに限定されない。

【0176】

「実質的に相補的」という用語は、2つ以上のヌクレオチド配列が少なくとも65％、70％、80％、85％、90％、95％、または97％相補的であることを意味する。いくつかの態様では、「実質的に相補的」とは、2つ以上のヌクレオチド配列が互いに100％相補的であることを意味する。

【0177】

核酸が「二本鎖」と呼ばれる場合、核酸鎖の対が、典型的には例えばDNAを伴う水素結合したらせん状アレイで存在することが当業者によって理解される。二本鎖オリゴヌクレオチドの100％相補的な形態に加えて、本明細書で使用される「二本鎖」という用語はまた、バルジおよびループなどの構造的特徴を含む形態を含むことを意味する（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられるStryer,Biochemistry,Third Ed.（1988）を参照）。

【0178】

「ポリメラーゼ」は、ポリヌクレオチド、例えばDNAおよび/またはRNAの鋳型指向性合成を行う酵素を指す。この用語は、完全長ポリペプチドとポリメラーゼ活性を有するドメインの両方を包含する。DNAポリメラーゼは、当業者に周知であり、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritime）、またはこれらの改変バージョンから単離されたまたは由来するDNAポリメラーゼを含むがこれらに限定されない。市販のポリメラーゼ酵素のさらなる例としては、クレノウ断片（New England Biolabs（登録商標）Inc.）、Taq DNAポリメラーゼ（QIAGEN（登録商標））、9°N（商標）DNAポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.）、Deep Vent（商標）DNAポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.）、Manta DNAポリメラーゼ（Enzymatics（登録商標））、Bst DNAポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.）およびphi29 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.）が挙げられるが、これらに限定されない。ポリメラーゼには、DNA依存性ポリメラーゼと逆転写酵素などのRNA依存性ポリメラーゼの両方が含まれる。DNA依存性DNAポリメラーゼの少なくとも5つのファミリーが公知であるが、ほとんどがファミリーA、BおよびCに分類される。様々なファミリー間での配列類似性はほとんどまたは全く存在しない。ほとんどのファミリーAポリメラーゼは、ポリメラーゼ、3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性および5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性を含む複数の酵素機能を含み得る一本鎖タンパク質である。ファミリーBポリメラーゼは、典型的には、ポリメラーゼおよび3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性を有する単一の触媒ドメイン、ならびに補助因子を有する。ファミリーCポリメラーゼは、典型的には、重合および3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性を有するマルチサブユニットタンパク質である。大腸菌（E.coli）では、DNAポリメラーゼI（ファミリーA）、II（ファミリーB）およびIII（ファミリーC）の3種類のDNAポリメラーゼが見出されている。真核細胞では、3つの異なるファミリーBポリメラーゼ、DNAポリメラーゼα、δおよびεが核複製に関与し、ファミリーAポリメラーゼ、ポリメラーゼγがミトコンドリアのDNA複製のために使用される。他の種類のDNAポリメラーゼとしては、ファージポリメラーゼが挙げられる。同様に、RNAポリメラーゼとしては、典型的には、真核生物RNAポリメラーゼI、II、およびIII、ならびに細菌RNAポリメラーゼの他、ファージおよびウイルスポリメラーゼが挙げられる。

【0179】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、隣接する残基のα-アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を指すために互換的に使用される。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関して使用されることが多いのに対して、「ペプチド」という用語は、小さなポリペプチドに関して使用されることが多いが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物およびその断片を指す場合、本明細書では互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片ならびに前述のものの他の等価物、バリアント、断片および類似体が含まれる。

【0180】

「抗体」という用語は、4つのポリペプチド鎖、2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖で構成される任意の免疫グロブリン（Ig）分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）、またはIg分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持するその任意の機能的断片、変異体、バリアントもしくは誘導体を広く指す。このような変異体、バリアントまたは誘導体抗体フォーマットは、当技術分野で公知である。その非限定的な態様は以下で論述され、完全長抗体およびその抗原結合部分を含む様々な形態、例えば、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Fab、F（ab'）、F（ab'）2、Fv抗体、Fab発現ライブラリーによって産生される断片、ジスルフィド結合されたFv、scFv、単一ドメイン抗体（dAb）、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性（dual specific）抗体、抗イディオタイプ抗体、二重特異性（bispecific）抗体、これらの機能的に活性なエピトープ結合断片、二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105（1987））および単鎖（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85 5879-5883（1988）およびBird et al.,Science 242,423-426（1988））ならびに/または上記のいずれかの抗原結合断片などが含まれるが、これらに限定されない（一般的には、参照により本明細書に組み入れられる、Hood et al.,Immunology,Benjamin,N.Y.,2ND ed.（1984）,Harlow and Lane,Antibodies.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1988）およびHunkapiller and Hood,Nature,323,15-16（1986）を参照）。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得ることが理解されるべきである。さらに、抗体は、ヒト抗体および/またはヒト化抗体であり得る。

【0181】

本明細書で使用される場合、「接触させる」とは、本明細書で提供される少なくとも1つの構成要素（例えば、試料、標的など）を送達または曝露するための任意の適切な手段を指す。いくつかの態様では、接触させることは、ヒトの身体活動、例えば注射;分配、混合、および/または容器を傾けて上清を移す行為;ならびに/または送達装置もしくは機械の操作を含む。

【0182】

本明細書において使用される「含む（comprising）」または「含む（comprises）」という用語は、組成物、方法およびこの方法または組成物にとって不可欠であるこれらの各構成要素に関して使用されるが、不可欠であるか否かを問わない指定されていない要素の包含に対してなお開かれている。

【0183】

本明細書で使用される場合、「～から本質的になる」という用語は、所与の態様に対して必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基本的および新規なまたは機能的特性に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。

【0184】

本明細書で使用される場合、「...を少なくとも2回伸長された」、「...を1回以下伸長された」または所与の回数「伸長された」という用語は、その大部分が「...を少なくとも2回伸長された」、「...を1回以下伸長された」、または前記所与の回数「伸長された」複数の核酸を指す。大部分は、前記複数の少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または少なくとも99.9％であり得る。この用語は、複数内の各々およびすべての核酸（すなわち、複数のうちの100％）がそのように伸長されることを必要としないが、そのように伸長されることを包含し得る。

【0185】

単数形の用語「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明確に反対を表さなければ、複数表記を含む。同様に、「または」という用語は、文脈が明確に反対を表さなければ、「および」を含むものとする。本開示の実施または検査において、本明細書に提供されたものと類似のまたは均等な方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載されている。「e.g.」という略号は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において、非限定的な例を表すために使用される。したがって、「e.g.」という略号は、「例えば」という用語と同義である。

【0186】

本明細書に開示されている本発明の代替的要素または態様の群分けは、限定と解釈してはならない。各群の構成要素は、個別的にまたは群の他の構成要素もしくは本明細書に見出される他の要素との任意の組み合わせで参照され、権利請求され得る。便宜および/または特許性を理由として、群の1つまたは複数の構成要素を群内に含めることができ、または群から削除することができる。何らかのこのような包含または削除が起きる場合、本明細書は、修飾されたものとして群を含有するものと見なされ、したがって、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュ群の書かれた記述を充足する。

【0187】

さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0188】

実施例または別段の指示がある場合以外、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。「約」という用語は、百分率に関連して使用される場合、言及されている値の±5％（例えば、±4％、±3％、±2％、±1％）を意味し得る。

【0189】

値の範囲が提供される場合、範囲の上限と下限との間の各数値が本明細書で企図され、開示される。

【0190】

好ましい態様を本明細書に詳細に図示および説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなく様々な改変、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内にあると見なされることは、当業者には明らかであろう。さらに、まだ示されていない範囲まで、本明細書に記載および図示された様々な態様のいずれの1つも、本明細書に開示された他の態様のいずれかに示された特徴を組み込むようにさらに改変することができることが当業者には理解されよう。

【0191】

本開示の態様の記述は、網羅的であることを意図したものではなく、または開示されている正確な形態に本開示を限定することを意図したものではない。本開示の具体的な態様および本開示に対する実施例が、例示の目的で本明細書に記載されているが、当業者が認識する通り、様々な均等な改変が本開示の範囲内において可能である。例えば、方法の工程および機能が所定の順序で提示されているが、別の態様は異なる順序で機能を発揮し得るか、または機能は実質的に同時に発揮され得る。本明細書に提供されている本開示の教示は、適宜、他の手順または方法に対して適用することができる。本明細書に開示されている様々な態様は、さらなる態様を提供するために組み合わせることができる。必要であれば、上記参考文献および出願の組成物、機能および概念を利用して、本開示のさらなる態様を与えるために、本開示の局面は改変することができる。

【0192】

先述の態様のいずれの具体的な要素も、他の態様中の要素と組み合わせまたは置き換えることができる。さらに、本開示のある態様と関連する利点はこれらの態様に関して記載されているが、他の態様がこのような利点を呈することもあり得、本開示の範囲に属するために、すべての態様がこのような利点を呈することを必ずしも必要としない。

【0193】

本発明の趣旨または範囲を変更することなく、様々な改変、追加、置換などを行うことができ、そのような改変および変形は、以下の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内に含まれることが当業者には明らかであろう。

【実施例】

【0194】

実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。

【0195】

以下の実施例のための一般的な方法および材料は以下の通りである。

【0196】

乾燥血液スポット（DBS）試料の調製:手動DBSパンチャーまたは半自動DBSパンチャーを使用して6mmのDBSパンチを得て、1.5mLチューブに入れた。試料の間にブランクカードを5回くり抜くことにより、パンチャーを洗浄した。500μLのDBS溶出緩衝液を各チューブに添加し、500rpmで振盪しながら、37℃で1時間試料を溶出した。DBS溶出緩衝液は、1×PBS中に1％BSA、0.2％NP40、0.2×プロテアーゼ阻害物質を含有した。DBS溶出液を10,000×gで10分間遠心分離し、各試料について400μLの上清を収集した。

【0197】

SARS-CoV-2 S1タンパク質検出SPEARアッセイ:実施例12および13では、S1タンパク質を標的とする2つの市販のモノクローナル抗体をSPEAR DNA配列Sとコンジュゲートし、SARS-CoV-2ワクチンレシピエントからのP.DBS溶出液をSPEARプローブと共に37℃で1時間インキュベートした後、酵素反応およびqPCR増幅を行った。酵素反応の前に、加熱工程は追加しなかった。

【0198】

SARS-CoV-2 汎IgG結合SPEARアッセイ:実施例1、2、3、11、および13では、Fcタグ付きSARS-CoV-2 S1タンパク質をSPEAR DNA配列Sとコンジュゲートしたか、またはSARS-CoV-2ワクチンレシピエントからのP.DBS溶出液をSPEARプローブと共に25℃で1時間インキュベートした後、上記のように酵素反応およびqPCRを行った。酵素反応の前に、加熱工程は追加しなかった。縦断的実験のために、DBS溶出緩衝液を使用して、ワクチン接種された対象からのDBS試料をさらに50倍に希釈した。

【0199】

SARS-CoV-2中和抗体検出アッセイ:実施例2、5、6、7、9、10、13、および14では、試料中の抗体がS1タンパク質に結合することを可能にするために、SPEAR DNA配列SをコンジュゲートしたS1タンパク質を4℃で一晩または室温で2時間試料とインキュベートした。次いで、ACE2タンパク質をS1タンパク質結合について抗体と競合させるために、SPEAR DNA配列PをコンジュゲートしたACE2タンパク質を試料と共に室温で30分間インキュベートした。その後、酵素反応を行ってSPEAR DNAシグナル分子を生成させた。試料がより多くの中和抗体を含有するほど、S1タンパク質に結合することができるACE2タンパク質はより少なくなり、したがってより低いSPEARシグナルを与える。陽性対照試料は1nMのR2B17抗体（モノクローナルSARS-CoV-2中和抗体Genscript）を含有し、陰性対照試料は試料希釈緩衝液のみを含有し、抗体を含有せず、0％阻害を表すためにこれを使用した。試料の阻害は、以下の式を使用して、試料と陰性対照試料との間のSPEARシグナル差から計算した。

【0200】

定量的中和力価測定のために、試料を連続希釈し（DBS試料は2から256倍まで1:2で希釈し、血清/血漿試料は10から163840倍まで1:4で希釈した。）、4PL Sigmoidalフィッティングを使用して阻害曲線をプロットし、Prism 9を使用して、曲線から50％阻害のための希釈倍率（すなわち、NT50）を計算した。全血中の最終NT50は、内挿したNT50に50を乗じることによって導出した。乗数50は、6mmのDBSパンチが約10μLの血液を含有し、500μLのDBS溶出緩衝液中に溶出したと推定することによって導出された。

【0201】

ELISAを使用した抗体結合検出:実施例1、7および11では、SARS-CoV-2 RBDタンパク質を標的とするモノクローナル抗体をGenscriptから購入した。Fcタグ付きRBDタンパク質をMaxiSorp（商標）96ウェルELISAプレート上に1μg/mLで、4℃で一晩コーティングした。洗浄後、プレートを室温で1時間アッセイ希釈剤でブロッキングした。8μg/mLから始めて、SARS-CoV-2抗体陰性DBS溶出液中にRBDターゲティング抗体を1:4で段階希釈した。RBDコートしたプレートと共に試料を室温で1時間インキュベートした後、洗浄し、HRPコンジュゲート化二次抗体を室温で1時間インキュベートした（抗ヒト1:10000、抗マウス1:25000、抗ウサギ1:10000）。基質反応を暗所で15分間行い、マイクロプレートリーダーを用いて、試料の吸光度を450nmで測定した。

【0202】

CPass（商標）SARS-CoV-2中和抗体検出アッセイ:実施例8では、CPass（商標）キットをGenscriptから購入し、販売業者のプロトコルに従った。簡単に記載すると、ACE2コートしたプレートをブロッキング緩衝液（ELISAアッセイ希釈液）で室温にて1時間ブロッキングした。1:9の体積比で、試料および対照を試料希釈緩衝液で希釈した。次いで、HRPをコンジュゲートしたRBDタンパク質と共に試料を37℃で30分間インキュベートし、続いてACE2プレートと共に37℃で15分間インキュベートした。洗浄後、基質反応のためにTMB溶液を15分間添加し、マイクロプレートリーダーを使用して試料の吸光度を450nmで測定した。

【0203】

プラーク減少中和試験（PRNT）およびシュードウイルスに基づく中和アッセイ
PRNT:実施例9および14では、Corgenix,Inc.（Broomfield、CO、USA）によってPRNTアッセイを行った。詳細には、Vero E6細胞を6ウェルプレートに維持し、SARS-CoV-2ウイルス（WA01/2020分離株）を約2000pfu/mLに希釈した（1:1の比で血清/血漿試料中に希釈した後、最終ウイルス濃度は約1000pfu/mLである）。BA-1培地を使用して、SARS-CoV-2ワクチンレシピエント血清/血漿試料を1:5～1:10240（すなわち、ウイルス溶液と混合した後、1:10から1:20480）で2倍に段階希釈した。血清/血漿試料を1:1の比でウイルスと混合し、37℃で1時間インキュベートした。血清/血漿ウイルス混合物をVero E6細胞上に添加し、15分ごとに培地を分配するために揺動しながら37℃で45分間インキュベートした。次いで、細胞単層を細胞培養培地中の1％アガロースで覆い、37℃で24時間インキュベートした。第1の層の上に、1％のアガロースおよび0.005％のニュートラルレッドを含有する第2の層を形成し、試料を37℃で24時間インキュベートした。各ウェル内のプラークの数を計数する。各アッセイについて、3つの陰性対照試料および1つの陽性対照試料を含めた。以下の式を使用して各希釈についての阻害値を計算し、4PLシグモイダルフィッティングを使用して希釈倍率曲線に対して阻害をフィッティングすることによって50％阻害（NT50）を計算した。

【0204】

シュードウイルスに基づく中和アッセイ:実施例8では、シュードウイルス（SARS-CoV-2-スパイク-偽型化HIVビリオン）を社内で作製し、Siら（A human-airway-on-a-chip for the rapid identification of candidate antiviral therapeutics and prophylactics.Nat Biomed Eng 5,815-829（2021））に記載されている通りに、中和アッセイを行った。1×PBS中1％BSAを含有する試料希釈緩衝液中に、1:2から1:256まで血清/血漿試料を2倍に段階希釈した（ウイルスと細胞を混合した後、最終希釈倍率は1:20から1:2560であった）。20μLの試料を80μLのウイルス溶液（MOI＝0.1）と混合し、37℃で30分間インキュベートした。次いで、混合物を20,000個のACE2-293T細胞を含有する100μLの培地と混合し、37℃で72時間インキュベートした。宿主細胞中のシュードウイルス粒子の数を反映するルシフェラーゼ活性を、Bright-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して測定した。

【0205】

実施例1. 抗SARS-CoV-2抗体アッセイ（抗体R2B17）
図13は、モノクローナル抗体R2B17によって実証された抗SARS-COV-2-RBD抗体アッセイを示す。2つのRBDコンジュゲートが抗RBD mAbに結合するアッセイの基本構築物は、PCR増幅可能な配列d＊a＊b＊c＊を生成する。捕捉抗原として同じRBDタンパク質を使用する従来のELISAアッセイと比較して、SPEAR（Successive Proximity Extension Amplification Reaction）アッセイは、試料体積のわずか1パーセントで1000倍高い感度を達成した。特に、この結合アッセイは、5桁の規模の線形範囲、および反復間での最小変動を示す。

【0206】

実施例2. 抗SARS-CoV-2抗体アッセイ（多重抗体）
図14は、14個のモノクローナル抗体による抗SARS-COV-2-RBD抗体アッセイ試験を示す棒グラフである。1つの抗体のみが、アッセイにおいて使用されたRBD組換えタンパク質配列のために応答を有さなかった。

【0207】

実施例3. 抗SARS-CoV-2抗体アッセイ（単一抗体）
図15は、室温で2時間のインキュベーション後に、ヒトACE2コンジュゲート（50nM）とSARS-COV-2 RBDコンジュゲート（5pM/10pM）との間で高い結合収率が達成され得ることを示す棒グラフである。

【0208】

実施例4. 抗SARS-CoV-2抗体アッセイ（多重抗体）
図18は、SARS-Cov-2スパイクタンパク質に対する様々な中和抗体および非中和抗体に対する例示的なアッセイ応答を示す棒グラフである。詳細には、SAR-Cov-2 S1タンパク質に結合することについてACE2タンパク質と競合するために、1nMモノクローナル抗体を使用した。対照試料には抗体を添加しなかった。ΔCqは、抗体含有試料と対照試料との間のqPCRサイクル差を指す。このアッセイは、様々な抗体の中和能を区別することに関して高い特異性を示す。

【0209】

実施例5. 抗SARS-CoV-2抗体アッセイ（R2B17およびR2B12）
図19Aは、異なる濃度での2つの抗SARS-Cov2モノクローナル抗体の中和能の測定を示す線グラフである。R2B17は中和抗体であり、R2B12は非中和抗体である。抗体は1nMから244fMまで希釈され、対照試料は抗体を含有しない。ΔCtは、抗体含有試料と対照試料との間のqPCRサイクル差を指す。

【0210】

実施例6. SARS-CoV-2陰性ドナー、回復した患者、およびワクチン接種患者における中和抗体
図19Bは、ワクチン接種していない健康ドナー（すなわち、陰性）、SARS-Cov2感染から回復した患者、およびワクチン接種患者（Moderna、2回投与）から収集した乾燥血液スポット試料に対する本開示の一態様によるアッセイ性能を示すプロットである。各乾燥血液スポット試料について、6mmスポットをくり抜き、500μLの溶出緩衝液を用いて溶出した。このアッセイは、すべての回復した患者試料およびワクチン接種ドナー試料から中和抗体を検出することが可能であることが実証される。

【0211】

実施例7. 抗SARS-CoV-2抗体アッセイの特異度および感度
図21A～21Cは、抗SARS COV2中和抗体検出に対するSPEAR-NAb特異度および感度を示す線グラフである。（図21A）異なる中和能の6つの抗SARS COV2モノクローナル抗体をELISAで試験し、S1との優れた類似の結合親和性を示した。250nMからの4倍希釈でこれらの抗体に対してSPEAR-NAb試験を行い、異なる中和能を有する抗SARS COV2抗体を区別することができた。（図21B）高い報告された中和能を有する抗体（R2B12、R2B17および5B7D7）は、非中和対応物（9B1E8、R1B8およびR2B12）よりも有意に高いシグナル阻害を示した。（図21C）SPEARは、市販のCPASSアッセイと比較して、感度の2桁の増加を有する。

【0212】

実施例8. SPEAR-Nab、CPASS、およびPsVNAアッセイの比較
図23A～23Cは、陰性者、感染患者、およびワクチン接種ドナーDBS試料の中和測定でのSPEAR-NAb対CPASS対PsVNAの比較を示す線グラフである。図23Aおよび23Bは、ワクチン接種および感染患者試料を陰性試料（非感染および非ワクチン接種）から明確に区別する上でのSPEAR-NAbの優れた感度（100％）および特異度（100％）を実証し、すべてのワクチン接種試料（n＝21）は患者試料（n＝19）の総平均を上回り、患者試料は陰性対象（n＝22）の総平均を上回るのに対して、CPASSおよびPsVNAは、DBS試料を用いた、患者試料からのワクチンの識別および陰性対象からのワクチン/患者試料の識別が不良である。図23Cは、10個のワクチン接種DBS試料に対する2倍希釈での中和力価測定である。SPEAR-Nabは、すべてのワクチン試料についての力価にわたる変化（最大256×）を測定する感度があり、ワクチン試料にわたってNT50を定量することができる。対照的に、CPassおよびPsVNAは、2×希釈ではるかに低い阻害を示し、8×希釈では、すべてのDBS試料から中和抗体を検出することができない。

【0213】

実施例9. 血清、血漿、およびDBS試料に対するSPEAR-NAbの一致測定
図24は、血清、血漿、およびDBS試料に対するSPEAR-NAbの一致測定を示す線グラフである。SPEAR-Nabによって、DBSと血清/血漿試料の間で優れた一致が観察された（R²＝0.9788）。影が付された領域は、単純線形回帰の90％信頼区間を示す。

【0214】

実施例10. 様々なSARS-CoV-2株に対する中和力価
図25は、単一のDBS試料から、SARS-COV-2野生型（WT）ならびに英国（UK）、南アフリカ（SA）およびブラジル（BZ）から同定された異なるバリアントに対するワクチン接種ドナー（n＝37）の中和力価を測定することに関してSPEAR-NAbを示すプロットおよび線グラフである。50％阻害での中和力価（NT50）を、各試料で8×2倍希釈から内挿した。赤色のバー/線は、幾何平均力価（GMT）を示す。左パネルは、WTと比較してバリアントのNT50がより低いことを示す（UK（B.1.1.7）＞SA（B.1.351）＞BZ（P.1））。右側のパネルには、個体ごとのバリアント測定が示されており、S1バリアントでのNT50の類似の減少が観察される。統計的有意性検定は、フリードマン検定と、その後のDunnの多重比較である。

【0215】

実施例11. SPEAR-NAb対ELISA汎IgGアッセイ
図26は、SPEARによるSARS-COV2汎IgGアッセイを示す線グラフおよびプロットグラフである。SPEARは、広いダイナミックレンジにわたって、低fMでS1コンジュゲートSPEARプローブによって抗SARS COV2モノクローナル抗体（R2B17）を定量する上で高い感度を示し、ELISAと比較して感度が4桁向上している（左パネル）。ワクチン対象および回復した患者からのDBS試料は、陰性DBS試料（非感染および非ワクチン接種ドナー）から完全に区別される（100％の感度および100％の特異度）。

【0216】

実施例12. Sタンパク質発現アッセイ
図27は、SPEARによるSタンパク質発現アッセイを示すプロットグラフである。SPEARは、異なるS1結合エピトープの2つの抗SARS COV2モノクローナル抗体にコンジュゲートされたプローブを使用して、広いダイナミックレンジにわたって低fMでSタンパク質を定量する上で良好に機能する。SPEARは、ワクチン接種ドナーのDBS試料（初回投与後2日目または3日目）からS1のfMコピーを優れた特異度で検出することができる。

【0217】

実施例13. 単一のDBS試料に対して実施された複数のアッセイ
図28は、単一のDBS試料に対して複数のアッセイを実施することができることを示す一連のプロットグラフである。SPEAR/SPEAR-NabによるSタンパク質、汎IgGおよび中和抗体測定に関するワクチン接種対象（Moderna/Pfizer）の縦断研究。1回目および2回目の接種の前および後に、4人のワクチン接種対象のDBS試料を経時的に測定した。SPEARは、経時的にS1の明確なプロファイルを示し、最初のピークが4人すべての個体について最初の投与のおよそ3日後に観察され、汎IgGおよび中和抗体が上昇したように見えた時点で平坦化した。汎IgGおよび中和抗体についても同様のプロファイルが観察され、最初のピークは最初の接種後の14日目に観察され、経時的に徐々に減少し、2番目のピークは2回目の投与のおよそ9日後に観察された。

【0218】

実施例14. 血清、血漿/血清、およびDBSに対するSPEAR-NAbの測定
図29Aおよび29Bは、血清、血漿/血清（図29A）、およびDBS（図29B）試料に対するSPEAR-NAbの測定を示す線グラフである。血清/血漿試料に対するプラーク減少中和試験（PRNT）とSPEAR-Nabとの間に優れた一致が観察された（R²＝0.9390）。PRNT血清/血漿試料とSPEAR-Nab DBS試料との間に優れた一致が観察された（R²＝0.9175）。影が付された領域は、単純線形回帰の90％信頼区間を示す。

【0219】

実施例15: 中和抗体および非中和抗体の検出におけるSPEAR非酵素的鎖置換アプローチの性能
図32は、図31Aおよび31Bに示されるワークフローの一態様による中和抗体および非中和抗体の検出を示す棒グラフである。SARS-CoV-2モノクローナル抗体（ACE2に対する高い些細な中和能を有するR2B17およびR2B12）ありまたはなしで、レポータープローブRBDコンジュゲートの対を4℃で一晩インキュベートし、続いてDNAをコンジュゲートしたACE2または浮遊性の置換DNA鎖を0nM、50nMまたは200nMで添加して、酵素反応の前に室温で30分間インキュベートした。ACE2の非存在下では、中和抗体および非中和抗体は同等のシグナルを示した。50nMおよび200nMのACE2の添加によって、非中和抗体のサイクル閾値（Ct）は高度に低下し、ほぼバックグラウンドレベルまで低下したのに対して、中和抗体のCtはそれほど影響を受けなかった。200nMのACE2での中和抗体と非中和抗体との間でほぼ5サイクルの差、すなわちコピー数の28倍の差が観察された。このような差は、同じ濃度の浮遊性の鎖では漏出がほとんど見られなかったことによって証明されたACE2とRBDの共局在化によって大部分が与えられた。

【0220】

本願を通じて引用されている、参照文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属の特許出願を含むすべての特許およびその他の刊行物は、例えば、本明細書に記載されている技術と関連して使用され得る、このような刊行物中で記載されている方法を提供および開示する目的で、参照により、明示的に本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、専ら、本出願の出願日より前におけるそれらの開示のために提供されている。これに関するいずれも、先行発明を理由としてまたは何らかの他の理由のために、本発明者らがこのような開示の日付に先行する資格を有していないことを認めたものと解釈すべきではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容についての表明は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性についての何らかの自認を構成するものではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【誤訳訂正書】

【提出日】2023-08-29

【誤訳訂正1】

【訂正対象書類名】明細書

【訂正対象項目名】０１６６

【訂正方法】変更

【訂正の内容】

【0166】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様が、以下の付番された態様によって表される。
態様1）以下の工程を含む、試料中の標的分子を検出する方法
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるリガンドであって、第2の核酸に連結されている、前記リガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のレポータープローブと前記標的分子との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。
態様2）a. 前記試料を、第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが第1の標的結合リガンドを含み、二本鎖核酸分子に連結されており、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合分子に連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的分子が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：第1および/または第2のターゲティングリガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のプローブの前記核酸と前記第2のプローブの前記核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様3）a. 前記試料を、第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的分子に結合することができ二本鎖核酸分子に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖とを含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合する第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む第1の核酸鎖に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第1の鎖にハイブリダイズしハイブリダイゼーションドメインを含む第2の鎖であって、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1の鎖のハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的であり、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のプローブの前記核酸と前記第2のプローブの前記核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様4）a. 前記試料を、第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第1の標的結合リガンドであって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む核酸鎖に連結されている、前記第1の標的結合リガンド、前記第1の鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記標的結合リガンドに連結された前記核酸鎖にハイブリダイズし、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む第1の核酸鎖に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第1の鎖にハイブリダイズしハイブリダイゼーションドメインを含む第2の鎖であって、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1の鎖のハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的であり、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：第1および/または第2のターゲティングリガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のプローブの前記核酸と前記第2のプローブの前記核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様5）以下の工程を含む、試料中の標的分子を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるリガンドであって、第2の核酸に連結されている、前記リガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的分子の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的分子が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様6）a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の標的結合リガンドを含み、二本鎖核酸分子に連結されており、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合分子に連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1のターゲティングリガンドおよび/または前記第2のターゲティングリガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用の核酸記録と;
c. 前記核酸記録を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的分子が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様7）前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成し、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成する、前記態様のいずれかの方法。
態様8）前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体の状態でなく、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体の状態でない、前記態様のいずれかの方法。
態様9）前記記録核酸を生成する工程がポリメラーゼによる伸長を含む、前記態様のいずれかの方法。
態様10）前記ポリメラーゼがスタンド（stand）置換ポリメラーゼである、態様7の方法。
態様11）核酸記録を検出するより前に前記核酸記録を増幅することをさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
態様12）前記第1のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様13）前記第2のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様14）前記標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの方法。
態様15）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が同じである、前記態様のいずれかの方法。
態様16）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が異なる、態様1～14のいずれかの方法。
態様17）第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様18）前記標的分子が生体分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様19）前記標的分子が抗体、核酸、小分子、または抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様20）前記標的分子が中和抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様21）前記標的分子が核酸である、態様1～20のいずれかの方法。
態様22）前記標的分子が小分子である、態様1～20のいずれかの方法。
態様23）前記標的分子が抗原である、態様1～20のいずれかの方法。
態様24）前記抗原がスパイクタンパク質である、態様19または23の方法。
態様25）前記抗原がRNAワクチンによってコードされる、態様19または23の方法。
態様26）前記試料が生物学的試料である、前記態様のいずれかの方法。
組成物の態様
態様27）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
組成物。
態様28）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. 第2の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部がハイブリダイズすることができる、前記第2のレポータープローブと;
c. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第3の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第2のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
組成物。
態様29）前記第1のレポーターが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様24または25の組成物。
態様30）前記第1のレポーターが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、前記核酸鎖と、前記連結された鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸とを含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結された前記核酸鎖にハイブリダイズし、かつハイブリダイゼーションドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかの組成物。
態様31）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様32）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含み、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記標的結合リガンドに連結された前記鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様33）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様34）前記第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様35）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様36）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様37）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含み、前記第1の鎖および第2の鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインが互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様38）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様39）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様40）前記ブロッキングプローブが、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のプローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかの組成物。
態様41）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の存在下では1回以下伸長することができる、
組成物。
態様42）前記第1のレポーターが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様38の組成物。
態様43）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様41または42の組成物。
態様44）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、態様41～43のいずれかの組成物。
態様45）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、前記足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様41～44のいずれかの組成物。
態様46）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～45のいずれかの組成物。
態様47）前記ブロッキングプローブが、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～46のいずれかの組成物。
態様48）前記第1のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様49）前記第2のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様50）前記標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様51）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が同じである、前記態様のいずれかの組成物。
態様52）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合が異なる、前記態様のいずれかの組成物。
態様53）前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様54）前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかの組成物。
態様55）第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様56）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様57）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様58）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様59）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第1のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第2のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様60）核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様61）ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様62）前記ポリメラーゼがスタンド（stand）置換ポリメラーゼである、態様61の組成物。
態様63）dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様64）塩をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様65）緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様66）前記標的分子をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。

【誤訳訂正2】

【訂正対象書類名】明細書

【訂正対象項目名】０１６８

【訂正方法】変更

【訂正の内容】

【0168】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様は、以下の付番された態様によって表される。
態様1：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1のレポータープローブと前記標的との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。
態様2：a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む第2の核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されており、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様1の方法。
態様3：a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、かつ前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様1の方法。
態様4：a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズされ、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様1の方法。
態様5：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料をブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記ブロッキングプローブ核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様6：i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である足場第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含む、
態様5の方法。
態様7:前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成し、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成する、前記態様のいずれかの方法。
態様8:前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体の状態でなく、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体の状態でない、前記態様のいずれかの方法。
態様9：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、かつ前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的または間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様10：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、
前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程であって、前記第1のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まない、前記提供する工程と;
d. 第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程であって、前記第2のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdTNPを含む、前記生成する工程と;
e. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様11:前記ポリメラーゼを提供することが、前記核酸のうちの1つまたは複数を伸長させる、前記態様のいずれかの方法。
態様12:前記ポリメラーゼがスタンド（stand）置換ポリメラーゼである、態様11の方法。
態様13:核酸記録の有無を検出する前に、存在する場合の核酸記録を増幅することをさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
態様14:前記第1の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様15:前記第2の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様16:前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの方法。
態様17:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかの方法。
態様18:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかの方法。
態様19:第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様20:前記標的が生体分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様21:前記標的が抗体、核酸、小分子、または抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様22:前記標的が中和抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様23:前記標的が核酸である、前記態様のいずれかの方法。
態様24:前記標的が小分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様25:前記標的が抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様26:前記抗原がスパイクタンパク質である、態様21または25の方法。
態様27:前記抗原がワクチン中に含まれるか、または前記抗原がワクチンによってコードされる、態様21または25の方法。
態様28:前記抗原がDNAワクチンによってコードされる、態様27の方法。
態様29:前記抗原がRNAワクチンによってコードされる、態様27の方法。
態様30:前記試料が生物学的試料である、前記態様のいずれかの方法。
態様31:試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のレポータープローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様32:第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む、第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
態様31の組成物。
態様33:前記第1のレポータープローブが、前記第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様31または32の組成物。
態様34:前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されている、前記第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかの組成物。
態様35:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様36:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含み、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖の前記第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様37:前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様38:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様39:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様40:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸を含み、足場ドメイン（a＊）に連結された足場プライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様41:前記第2のレポータープローブが、前記足場第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含み、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインおよび前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様42:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様43:前記ブロッキングプローブ核酸足場が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様44:前記ブロッキングプローブ核酸が、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a）を含み、前記足場第2の足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または前記足場第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、前記第1の足場ドメイン（a）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかの組成物。
態様45:試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様46:前記第1の核酸が、前記第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様45の組成物。
態様47:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様41または42の組成物。
態様48:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、態様41～43のいずれかの組成物。
態様49:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、前記足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様41～44のいずれかの組成物。
態様50:前記ブロッキングプローブ核酸が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～45のいずれかの組成物。
態様51:前記ブロッキングプローブ核酸が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～46のいずれかの組成物。
態様52:前記第1の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様53:前記第2の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様54:前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様55:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかの組成物。
態様56:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかの組成物。
態様57:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様58:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかの組成物。
態様59:第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様60:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様61:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様62:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様63:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、かつ/または前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様64：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様65：前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様64の組成物。
態様66：前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングリガンドハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様65の組成物。
態様67：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様68：前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様67の組成物。
態様69：前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様68の組成物。
態様70:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様64～69のいずれかの組成物。
態様71:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含み、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記標的結合リガンドに連結された前記連結鎖のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、態様64～70のいずれかの組成物。
態様72:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様64～71のいずれかの組成物。
態様73:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様64～72のいずれかの組成物。
態様74:第2の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、態様64～73のいずれかの組成物。
態様75:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドが結合対である、態様64～74のいずれかの組成物。
態様76:前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが結合対である、態様64～75のいずれかの組成物。
態様77:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドならびに/または前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、態様64～76のいずれかの組成物。
態様78:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、態様64～77のいずれかの組成物。
態様79:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、態様64～77のいずれかの組成物。
態様80:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、態様64～79のいずれかの組成物。
態様81:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記第1のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様64～80のいずれかの組成物。
態様82:前記第2の標的結合リガンドが受容体であり、前記第2のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様64～81のいずれかの組成物。
態様83:前記組成物が核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様84:ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様85:前記ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、態様84の組成物。
態様86:dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様87:塩をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様88:緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様89:前記標的をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様90:試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様91:第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む、第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
態様82のキット。
態様92:前記第1の核酸が、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様82または83のキット。
態様93:前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されている、前記第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかのキット。
態様94:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様95:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含み、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖の前記第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様96:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様97:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様98:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様99:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖を含み、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様100:前記第2のレポータープローブが、前記足場第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含み、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインおよび前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様101:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含む、前記態様のいずれかのキット。
態様102:前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含むブロッキングプローブ核酸を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様103:前記ブロッキングプローブが、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a）を含むブロッキングプローブ核酸を含み、前記足場第2の足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、前記足場第2の足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または前記足場第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、前記第1の足場ドメイン（a）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかのキット。
態様104:試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様105:前記第1の核酸が、前記第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様96のキット。
態様106:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様96または97のキット。
態様107:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、態様96～98のいずれかのキット。
態様108:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、前記足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様96～99のいずれかのキット。
態様109:前記ブロッキングプローブ核酸が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様96～100のいずれかのキット。
態様110:前記ブロッキングプローブ核酸が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様96～101のいずれかのキット。
態様111:前記第1の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様112:前記第2の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様113:前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかのキット。
態様114:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかのキット。
態様115:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかのキット。
態様116:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかのキット。
態様117:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかのキット。
態様118:第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかのキット。
態様119:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様120:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様121:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様122:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、かつ/または前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様123：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様124：前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様123のキット。
態様125：前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様124のキット。
態様126：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様127：前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部が、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様126のキット。
態様128：前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様127のキット。
態様129:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様123～129のいずれかのキット。
態様130:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含み、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、態様123～129のいずれかのキット。
態様131:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様123～130のいずれかのキット。
態様132:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様123～131のいずれかのキット。
態様133:第2の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、態様123～132のいずれかのキット。
態様134:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドが結合対である、態様123～133のいずれかのキット。
態様135:前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが結合対である、態様123～134のいずれかのキット。
態様136:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドならびに/または前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、態様123～135のいずれかのキット。
態様137:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、態様123～136のいずれかのキット。
態様138:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、態様123～137のいずれかのキット。
態様139:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、態様123～138のいずれかのキット。
態様140:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記第1のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様123～139のいずれかのキット。
態様141:前記第2の標的結合リガンドが受容体であり、前記第2のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様123～140のいずれかのキット。
態様142:核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様143:ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様144:前記ポリメラーゼがスタンド（stand）置換ポリメラーゼである、態様143のキット。
態様145:dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様146:塩をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様147:緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様148:前記標的をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。

【手続補正書】

【提出日】2023-08-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1のレポータープローブと前記標的との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。

【請求項2】

a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む第2の核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されており、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項1記載の方法。

【請求項3】

a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、かつ前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項1記載の方法。

【請求項4】

a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズされ、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項1記載の方法。

【請求項5】

以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料をブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記ブロッキングプローブ核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。

【請求項6】

i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含む、
請求項5記載の方法。

【請求項7】

以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的または間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。

【請求項8】

以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、
前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程であって、前記第1のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まない、前記提供する工程と;
d. 第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程であって、前記第2のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを含む、前記生成する工程と;
e. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。

【請求項9】

前記ポリメラーゼを提供することが、前記核酸のうちの1つまたは複数を伸長させる、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。

【請求項10】

核酸記録の有無を検出する前に、存在する場合の核酸記録を増幅することをさらに含む、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。

【請求項11】

前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。

【請求項12】

前記標的が生体分子である、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。

【請求項13】

前記標的が、抗体、核酸、小分子、または抗原である、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。

【請求項14】

前記標的が、中和抗体、抗原、スパイクタンパク質、核酸、または小分子である、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。

【請求項15】

前記抗原がワクチン中に含まれるか、または前記抗原がワクチンによってコードされる、請求項14記載の方法。

【請求項16】

前記試料が生物学的試料である、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。

【請求項17】

試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のレポータープローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。

【請求項18】

第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項17記載の組成物。

【請求項19】

試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。

【請求項20】

第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。

【請求項21】

前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項20記載の組成物。

【請求項22】

前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項21記載の組成物。

【請求項23】

第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。

【請求項24】

前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項23記載の組成物。

【請求項25】

前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項24記載の組成物。

【請求項26】

試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。

【請求項27】

第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、ハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項26記載のキット。

【請求項28】

試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。

【請求項29】

第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。

【請求項30】

前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項29記載のキット。

【請求項31】

前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項30記載のキット。

【請求項32】

第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。

【請求項33】

前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部が、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
請求項32記載のキット。

【請求項34】

前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
請求項33記載のキット。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0044】

設計5
中和結合事象と非酵素的鎖置換を伴う非中和結合事象を区別するための核酸伸長をプログラムする例が図31Aおよび31Bに模式的に示されている。図31Aでは、中和標的、例えば中和抗体を、特別に設計された核酸分子とコンジュゲートされた一対のレポータープローブ、例えばRBDと平衡状態でインキュベートし、それらの結合はレポータープローブを近接させる。ブロッキングプローブ、例えば、別の特別に設計された核酸分子とコンジュゲートされたACE2を順次添加して、レポータープローブ、例えばRBDと結合させる。しかしながら、ブロッキングプローブ、例えば、標的、例えば、中和抗体と同じレポータープローブ、例えば,RBD上の位置に、任意で、より低い親和性で結合するACE2は、一般的には、標的に既に結合したレポータープローブ、例えば、RBDと共局在化することができない。2つのレポータープローブの近接性が維持され、足場ドメイン（a＊）およびプライマードメイン（d＊）を含む核酸鎖の二重伸長を可能にして、ポリメラーゼの添加によってドメイン（d＊）、（a＊）、（b＊）、および（c＊）を含む核酸レポータープローブを生成する。対照的に、図31Bに示されるように、非中和標的を用いると、レポータープローブは「中和」されず、依然としてブロッキングプローブに結合することができる。レポータープローブのブロッキングプローブとの共局在化は、ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）がレポータープローブの連結鎖の相補的足場ドメイン（x）に結合することを可能にする。これは、第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）へのブロッキングプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）のハイブリダイゼーション、および/または第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）へのブロッキングプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）のハイブリダイゼーションによる足場媒介性鎖置換反応を誘発する。これは、レポータープローブから核酸を解離させ、二重伸長からの核酸記録の生成は一般に妨げられる。したがって、核酸記録は、レポータープローブとブロッキングプローブの間の結合、例えばRBD-ACE2相互作用が標的（例えば、中和抗体）の存在によって破壊された場合にのみ生成される。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0045】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、前記方法は、（A）前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程と;（B）前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程と;（C）ポリメラーゼを提供し、それにより、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;（D）前記核酸記録の有無を検出する工程とを含み、前記核酸記録の存在は、前記標的が前記試料中に存在することを示し、（i）前記第1のレポータープローブは、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸は、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸は、（1）前記連結鎖にハイブリダイズし、前記連結鎖が、前記第1の標的結合リガンドに連結されており、かつ一本鎖足場ドメイン（a）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、第1の核酸の第1の鎖と;（2）前記第1の核酸の第1の鎖と実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖とを含み、前記二本鎖核酸は、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;（ii）前記第2のレポータープローブは、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸は、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とは、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができ、（iii）前記第1のブロッキングプローブは、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸は、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）は、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）は、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合は、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;（iv）前記第2のブロッキングプローブは、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸は、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）は前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）は前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合は、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0051】

設計6
中和結合事象と非酵素的鎖置換を伴う非中和結合事象を区別するための核酸伸長をプログラムする別の例が図34Aおよび34Bに模式的に示されている。図34Aでは、中和標的、例えば中和抗体を、特別に設計された核酸分子とコンジュゲートされた一対のレポータープローブ、例えばRBDと平衡状態でインキュベートし、それらの結合はレポータープローブを近接させる。しかしながら、ブロッキングプローブ、例えば、標的、例えば、中和抗体と同じレポータープローブ、例えば、RBD上の位置に、任意で、より低い親和性で結合するACE2は、一般的には、標的に既に結合したレポータープローブ、例えば、RBDと共局在化することができない。2つのレポータープローブの近接性が維持され、足場ドメイン（a＊）およびプライマードメイン（d＊）を含む核酸鎖の二重伸長を可能にして、ポリメラーゼの添加によってドメイン（d＊）、（a＊）、（b＊）、および（c＊）を含む核酸レポータープローブを生成する。対照的に、図34Bに示されるように、非中和標的を用いると、レポータープローブは「中和」されず、依然としてブロッキングプローブに結合することができる。レポータープローブのブロッキングプローブとの共局在化は、ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）がレポータープローブの連結鎖の相補的足場ドメイン（x）に結合することを可能にする。ブロッキングプローブ上の核酸は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まないdNTP混合物の存在下で、ポリメラーゼによって伸長される。この伸長は、レポータープローブから核酸を解離させる。この酵素工程では、dNTP混合物中にないdNTPを必要とする、レポータープローブ中の核酸のポリメラーゼ伸長は禁止されることに留意されたい。レポータープローブ核酸の近接性が破壊されると、欠損したdNTPの添加後に、レポーター核酸鎖のポリメラーゼ伸長が起こりにくく、一般に、二重伸長からの核酸記録の生成が妨げられる。中和標的の存在下では、レポータープローブは近接状態を保ち、二段階伸長-第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まないdNTP混合物の存在下での伸長に続く、第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを含むdNTP混合物の存在下での伸長によって、ドメイン（d＊）、（a＊）、（b＊）、および（c＊）を含む核酸記録が生成される。したがって、レポータープローブとブロッキングプローブの間の結合、例えばRBD-ACE2相互作用が標的（例えば、中和抗体）の存在によって破壊された場合にのみ、ユニークな配列が生成される。

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0052】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、前記方法は、（A）前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程と;（B）前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程と;（C）ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程と;（D）ある時間（例えば、5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分、2分、3分、4分、5分、10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分、またはそれ以上）の後に、第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それにより、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;（E）前記核酸記録の有無を検出する工程とを含み、前記核酸記録の存在は、前記標的が前記試料中に存在することを示し、（i）前記第1のレポータープローブは、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸は、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸は、（1）連結鎖にハイブリダイズし、前記連結鎖が、前記第1の標的結合リガンドに連結されており、かつ一本鎖足場ドメイン（a）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、第1の核酸の第1の鎖と;（2）前記第1の核酸の第1の鎖と実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖とを含み、前記二本鎖核酸は、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;（ii）前記第2のレポータープローブは、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸は、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とは、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができ;（iii）前記第1のブロッキングプローブは、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸は、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合は、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;（iv）前記第2のブロッキングプローブは、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸は、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合は、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、（iv）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）は、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み;前記第1のdNTPミックスは、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および/または前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まず;前記第2のdNTPミックスは、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および/または前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しない前記ヌクレオチドに相補的なdNTPを含む。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0055】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第2のレポータープローブは核酸を含み、前記核酸は、（1）標的と結合することができる分子/部分（例えば、第2の標的結合リガンド）に連結された、第2の核酸の第1の鎖と、（2）第1の鎖に実質的に相補的であり、第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成する、第2の核酸の第2の鎖とを含む。第1の鎖は、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む。足場ドメイン（x）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である。第2の鎖は、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含む。足場ドメイン（a＊）は、第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である。いくつかの態様において、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）は、2文字または3文字コードを利用する。例えば、2文字コードでは、4つのヌクレオチドのうちの2つ、例えば、A、G、C、およびTのうちの2つが、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）のヌクレオチド配列中で除外されている。3文字コードでは、4つのヌクレオチドのうちの1つ、例えばA、G、C、およびTのうちの1つが、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）のヌクレオチド配列中で除外されている。一般的には、足場ドメイン（a）または（b）中に存在するヌクレオチドが、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）中で除外されている。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0057】

対照または参照試料（例えば、標的を含まない試料）に対して核酸記録の量を比較することによって、標的の有無を判定することができる。例えば、対照または参照試料（例えば、標的を含まない試料）に対して95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、65％未満、60％未満、45％未満、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、または5％未満の量は、標的が試料中に存在することを示す。
[本発明1001]
以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1のレポータープローブと前記標的との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。
[本発明1002]
a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む第2の核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されており、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
本発明1001の方法。
[本発明1003]
a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、かつ前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
本発明1001の方法。
[本発明1004]
a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズされ、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
本発明1001の方法。
[本発明1005]
以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料をブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記ブロッキングプローブ核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
[本発明1006]
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含む、
本発明1005の方法。
[本発明1007]
以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的または間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
[本発明1008]
以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、
前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程であって、前記第1のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まない、前記提供する工程と;
d. 第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程であって、前記第2のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdTNPを含む、前記生成する工程と;
e. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
[本発明1009]
前記ポリメラーゼを提供することが、前記核酸のうちの1つまたは複数を伸長させる、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
核酸記録の有無を検出する前に、存在する場合の核酸記録を増幅することをさらに含む、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記標的が生体分子である、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記標的が、抗体、核酸、小分子、または抗原である、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記標的が、中和抗体、抗原、スパイクタンパク質、核酸、または小分子である、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記抗原がワクチン中に含まれるか、または前記抗原がワクチンによってコードされる、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記試料が生物学的試料である、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のレポータープローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
[本発明1018]
第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
本発明1017の組成物。
[本発明1019]
試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
[本発明1020]
第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
[本発明1021]
前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
本発明1020の組成物。
[本発明1022]
前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
本発明1021の組成物。
[本発明1023]
第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
[本発明1024]
前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
本発明1024の組成物。
[本発明1025]
前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
本発明1025の組成物。
[本発明1026]
試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
[本発明1027]
第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、ハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
本発明1027のキット。
[本発明1028]
試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
[本発明1029]
第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
[本発明1030]
前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
本発明1029のキット。
[本発明1031]
前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
本発明1030のキット。
[本発明1032]
第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
[本発明1033]
前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部が、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
本発明1032のキット。
[本発明1034]
前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
本発明1033のキット。

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0080】

局面の任意の1つのいくつかの態様において、第1のレポータープローブの二本鎖核酸の第1の鎖は、ストッパー分子または修飾（●）によって分離された第1のサブドメインと第2のサブドメイン（b）に分割されたドメインを含むことができる。例えば、プライマー結合ドメイン（c＊）を第1のサブドメインに連結することができ、第2のサブドメイン（b）を足場ドメイン（a）に連結することができる。したがって、いくつかの態様において、第1の鎖は、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む。

【手続補正9】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0093】

いくつかの態様において、第2のレポータープローブの第2の標的結合リガンドはクラス特異的抗体である。

【手続補正10】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0103】

いくつかの態様において、核酸修飾は、糖間結合の置換または修飾を含むことができる。例示的な糖間結合修飾としては、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、ホスホルアミダート、ホスホロチオアート、メチレンメチルイミノ、チオジエステル、チオノカルバマート、シロキサン、N,N'-ジメチルヒドラジン（-CH2-N（CH3）-N（CH3）-）、アミド-3（3'-CH2-C（＝O）-N（H）-5'）およびアミド-4（3'-CH2-N（H）-C（＝O）-5'）、ヒドロキシルアミノ、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボキサミド、カルボナート、カルボキシメチル、カルバマート、カルボキシラートエステル、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルフィド、スルホナート、スルホンアミド、スルホナートエステル、チオホルムアセタール（3'-S-CH2-O-5'）、ホルムアセタール（3'-O-CH2-O-5'）、オキシム、メチレンイミノ、メチレンカルボニルアミノ、メチレンメチルイミノ（MMI、3'-CH2-N（CH3）-O-5'）、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノ、エーテル（C3'-O-C5'）、チオエーテル（C3'-S-C5'）、チオアセトアミド（C3'-N（H）-C（＝O）-CH2-S-C5'、C3'-O-P（O）-O-SS-C5'、C3'-CH2-NH-NH-C5'、3'-NHP（O）（OCH3）-O-5'および3'-NHP（O）（OCH3）-O-5'が含まれるが、これらに限定されない。

【手続補正11】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0166】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様が、以下の付番された態様によって表される。
態様1）以下の工程を含む、試料中の標的分子を検出する方法
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるリガンドであって、第2の核酸に連結されている、前記リガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のレポータープローブと前記標的分子との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。
態様2）a. 前記試料を、第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、二本鎖核酸分子に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合分子に連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的分子が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：第1および/または第2のターゲティングリガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のプローブの前記核酸と前記第2のプローブの前記核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様3）a. 前記試料を、第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的分子に結合することができ二本鎖核酸分子に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖とを含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む第1の核酸鎖に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第1の鎖にハイブリダイズしハイブリダイゼーションドメインを含む第2の鎖であって、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1の鎖のハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的であり、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のプローブの前記核酸と前記第2のプローブの前記核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様4）a. 前記試料を、第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、およびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第1の標的結合リガンドであって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む核酸鎖に連結されている、前記第1の標的結合リガンド、前記第1の鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記標的結合リガンドに連結された前記核酸鎖にハイブリダイズし、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的分子に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む第1の核酸鎖に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第1の鎖にハイブリダイズしハイブリダイゼーションドメインを含む第2の鎖であって、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1の鎖のハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的であり、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：第1および/または第2のターゲティングリガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1のプローブの前記核酸と前記第2のプローブの前記核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様5）以下の工程を含む、試料中の標的分子を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるリガンドであって、第2の核酸に連結されている、前記リガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的分子の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的分子が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様6）a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、二本鎖核酸分子に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合分子に連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1のターゲティングリガンドおよび/または前記第2のターゲティングリガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、核酸鎖に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記核酸鎖が、前記第1のレポータープローブの前記核酸の足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
b. 前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的分子が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程と
を含む、態様1の方法。
態様7）前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成し、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成する、前記態様のいずれかの方法。
態様8）前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体の状態でなく、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体の状態でない、前記態様のいずれかの方法。
態様9）前記記録核酸を生成する工程がポリメラーゼによる伸長を含む、前記態様のいずれかの方法。
態様10）前記ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、態様7の方法。
態様11）核酸記録を検出するより前に前記核酸記録を増幅することをさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
態様12）前記第1のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様13）前記第2のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様14）前記標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの方法。
態様15）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかの方法。
態様16）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、態様1～14のいずれかの方法。
態様17）第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様18）前記標的分子が生体分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様19）前記標的分子が抗体、核酸、小分子、または抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様20）前記標的分子が中和抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様21）前記標的分子が核酸である、態様1～20のいずれかの方法。
態様22）前記標的分子が小分子である、態様1～20のいずれかの方法。
態様23）前記標的分子が抗原である、態様1～20のいずれかの方法。
態様24）前記抗原がスパイクタンパク質である、態様19または23の方法。
態様25）前記抗原がRNAワクチンによってコードされる、態様19または23の方法。
態様26）前記試料が生物学的試料である、前記態様のいずれかの方法。
組成物の態様
態様27）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
組成物。
態様28）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. 第2の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部がハイブリダイズすることができる、前記第2のレポータープローブと;
c. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第3の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第2のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
組成物。
態様29）前記第1のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様24または25の組成物。
態様30）前記第1のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、前記核酸鎖と、前記連結された鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸とを含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結された前記核酸鎖にハイブリダイズし、かつハイブリダイゼーションドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかの組成物。
態様31）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様32）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含み、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記標的結合リガンドに連結された前記鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様33）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様34）前記第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様35）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様36）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様37）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含み、前記第1の鎖および第2の鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインが互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様38）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様39）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様40）前記ブロッキングプローブが、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のプローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかの組成物。
態様41）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の存在下では1回以下伸長することができる、
組成物。
態様42）前記第1のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様38の組成物。
態様43）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様41または42の組成物。
態様44）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、態様41～43のいずれかの組成物。
態様45）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、前記足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様41～44のいずれかの組成物。
態様46）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～45のいずれかの組成物。
態様47）前記ブロッキングプローブが、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～46のいずれかの組成物。
態様48）前記第1のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様49）前記第2のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様50）前記標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様51）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかの組成物。
態様52）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかの組成物。
態様53）前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様54）前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかの組成物。
態様55）第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様56）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様57）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様58）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様59）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第1のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第2のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様60）核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様61）ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様62）前記ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、態様61の組成物。
態様63）dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様64）塩をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様65）緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様66）前記標的分子をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。

【手続補正12】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0167】

キットの態様
態様67）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
キット。
態様68）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. 第2の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブであって、前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部がハイブリダイズすることができる、前記第2のレポータープローブと;
c. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第3の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第2のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、標的分子の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の非存在下では1回以下伸長することができる、
キット。
態様69）前記第1のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様63または64のキット。
態様70）前記第1のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、前記核酸鎖と、前記連結された鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸とを含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結された前記核酸鎖にハイブリダイズし、かつハイブリダイゼーションドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかのキット。
態様71）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様72）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含み、前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記標的結合リガンドに連結された前記鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様73）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様74）前記第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様75）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様76）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様77）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含み、前記第1の鎖および第2の鎖の前記ハイブリダイゼーションドメインは互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様78）前記第2のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された第1の核酸鎖であって、足場ドメイン（x）に連結されたハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第1の核酸鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されたハイブリダイジングドメインを含む第2の核酸鎖とを含む、前記態様のいずれかのキット。
態様79）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様80）前記ブロッキングプローブが、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のプローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかのキット。
態様81）a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のプローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつ第2の核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部と前記ブロッキングプローブの前記核酸の一部とが、前記標的分子の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的分子の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1のレポータープローブの前記核酸の一部が、前記標的分子の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的分子の存在下では1回以下伸長することができる、
キット。
態様82）前記第1のレポータープローブが、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸鎖と;
b. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第2の核酸鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様81のキット。
態様83）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様81または82のキット。
態様84）前記第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイゼーションドメインを含む、態様81～83のいずれかのキット。
態様85）前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様81～84のいずれかのキット。
態様86）前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様81～85のいずれかのキット。
態様87）前記ブロッキングプローブが、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（x＊）を含む核酸鎖を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様81～86のいずれかのキット。
態様88）前記第1のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様89）前記第2のターゲティングリガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様90）前記標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかのキット。
態様91）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかのキット。
態様92）前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかのキット。
態様93）前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかのキット。
態様94）前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかのキット。
態様95）第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかのキット。
態様96）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様97）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様98）前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様99）前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第1のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と第2のブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様100）核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様101）ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様102）前記ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、態様101のキット。
態様103）dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様104）塩をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様105）緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様106）前記標的分子をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。

【手続補正13】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0168】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様は、以下の付番された態様によって表される。
態様1：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1のレポータープローブと前記標的との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。
態様2：a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む第2の核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されており、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様1の方法。
態様3：a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、かつ前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様1の方法。
態様4：a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズされ、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様1の方法。
態様5：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料をブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記ブロッキングプローブ核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様6：i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含む、
態様5の方法。
態様7:前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成し、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体を形成する、前記態様のいずれかの方法。
態様8:前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体の状態でなく、かつ/または前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブが、前記試料との接触より前に複合体の状態でない、前記態様のいずれかの方法。
態様9：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、かつ前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的または間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様10：以下の工程を含む、試料中の標的を検出する：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、
前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程であって、前記第1のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まない、前記提供する工程と;
d. 第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程であって、前記第2のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを含む、前記生成する工程と;
e. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様11:前記ポリメラーゼを提供することが、前記核酸のうちの1つまたは複数を伸長させる、前記態様のいずれかの方法。
態様12:前記ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、態様11の方法。
態様13:核酸記録の有無を検出する前に、存在する場合の核酸記録を増幅することをさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
態様14:前記第1の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様15:前記第2の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの方法。
態様16:前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの方法。
態様17:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかの方法。
態様18:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかの方法。
態様19:第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様20:前記標的が生体分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様21:前記標的が抗体、核酸、小分子、または抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様22:前記標的が中和抗体である、前記態様のいずれかの方法。
態様23:前記標的が核酸である、前記態様のいずれかの方法。
態様24:前記標的が小分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様25:前記標的が抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様26:前記抗原がスパイクタンパク質である、態様21または25の方法。
態様27:前記抗原がワクチン中に含まれるか、または前記抗原がワクチンによってコードされる、態様21または25の方法。
態様28:前記抗原がDNAワクチンによってコードされる、態様27の方法。
態様29:前記抗原がRNAワクチンによってコードされる、態様27の方法。
態様30:前記試料が生物学的試料である、前記態様のいずれかの方法。
態様31:試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のレポータープローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様32:第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む、第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
態様31の組成物。
態様33:前記第1のレポータープローブが、前記第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様31または32の組成物。
態様34:前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されている、前記第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかの組成物。
態様35:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様36:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含み、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖の前記第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様37:前記第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様38:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様39:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様40:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸を含み、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様41:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含み、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインおよび前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様42:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様43:前記ブロッキングプローブ核酸が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様44:前記ブロッキングプローブ核酸が、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a）を含み、前記第2の足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、前記第1の足場ドメイン（a）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかの組成物。
態様45:試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様46:前記第1の核酸が、前記第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様45の組成物。
態様47:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様41または42の組成物。
態様48:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、態様41～43のいずれかの組成物。
態様49:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、前記足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様41～44のいずれかの組成物。
態様50:前記ブロッキングプローブ核酸が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～45のいずれかの組成物。
態様51:前記ブロッキングプローブ核酸が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様41～46のいずれかの組成物。
態様52:前記第1の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様53:前記第2の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかの組成物。
態様54:前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの組成物。
態様55:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかの組成物。
態様56:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかの組成物。
態様57:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様58:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかの組成物。
態様59:第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかの組成物。
態様60:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様61:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様62:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様63:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、かつ/または前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかの組成物。
態様64：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様65：前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様64の組成物。
態様66：前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングリガンドハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様65の組成物。
態様67：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様68：前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様67の組成物。
態様69：前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様68の組成物。
態様70:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様64～69のいずれかの組成物。
態様71:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含み、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記標的結合リガンドに連結された前記連結鎖のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、態様64～70のいずれかの組成物。
態様72:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様64～71のいずれかの組成物。
態様73:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様64～72のいずれかの組成物。
態様74:第2の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、態様64～73のいずれかの組成物。
態様75:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドが結合対である、態様64～74のいずれかの組成物。
態様76:前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが結合対である、態様64～75のいずれかの組成物。
態様77:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドならびに/または前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、態様64～76のいずれかの組成物。
態様78:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、態様64～77のいずれかの組成物。
態様79:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、態様64～77のいずれかの組成物。
態様80:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、態様64～79のいずれかの組成物。
態様81:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記第1のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様64～80のいずれかの組成物。
態様82:前記第2の標的結合リガンドが受容体であり、前記第2のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様64～81のいずれかの組成物。
態様83:前記組成物が核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様84:ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様85:前記ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、態様84の組成物。
態様86:dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様87:塩をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様88:緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様89:前記標的をさらに含む、前記態様のいずれかの組成物。
態様90:試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様91:第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む、第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
態様82のキット。
態様92:前記第1の核酸が、前記標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様82または83のキット。
態様93:前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインから遠位の末端にある一本鎖足場ドメイン（a）に連結されている、前記第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
前記態様のいずれかのキット。
態様94:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様95:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含み、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖の前記第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様96:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様97:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様98:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸を含み、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む、前記態様のいずれかのキット。
態様99:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖を含み、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様100:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含み、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインおよび前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが互いに実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様101:前記第2のレポータープローブが、前記第2の標的結合リガンドに連結された第2の核酸の第1の鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含み、足場ドメイン（x）が、前記第2の標的結合リガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在する、前記第2の核酸の第1の鎖と、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖とを含む、前記態様のいずれかのキット。
態様102:前記ブロッキングプローブが、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（x＊）を含むブロッキングプローブ核酸を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である、前記態様のいずれかのキット。
態様103:前記ブロッキングプローブが、第2の足場ドメイン（x＊）に連結された第1の足場ドメイン（a）を含むブロッキングプローブ核酸を含み、前記第2の足場ドメイン（x＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、前記第2の足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブおよび/または前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に相補的であり、前記第1の足場ドメイン（a）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である、前記態様のいずれかのキット。
態様104:試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様105:前記第1の核酸が、前記第1の標的結合リガンドに連結された二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
a. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と;
b. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含む、
態様96のキット。
態様106:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様96または97のキット。
態様107:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された前記第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結された第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、態様96～98のいずれかのキット。
態様108:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含み、前記足場ドメインが、前記第1のサブドメイン（b＊）に実質的に相補的である、態様96～99のいずれかのキット。
態様109:前記ブロッキングプローブ核酸が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端に足場ドメイン（a＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様96～100のいずれかのキット。
態様110:前記ブロッキングプローブ核酸が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）を含み、足場ドメイン（a＊）が、前記ブロッキングリガンドに連結された末端に対して遠位の末端において存在し、足場ドメイン（a＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である、態様96～101のいずれかのキット。
態様111:前記第1の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様112:前記第2の標的結合リガンドおよび前記ブロッキングリガンドが結合対である、前記態様のいずれかのキット。
態様113:前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかのキット。
態様114:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、前記態様のいずれかのキット。
態様115:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、前記態様のいずれかのキット。
態様116:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、前記態様のいずれかのキット。
態様117:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記ブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、前記態様のいずれかのキット。
態様118:第2の標的結合リガンドがクラス特異的抗体である、前記態様のいずれかのキット。
態様119:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様120:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（a＊）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（a）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様121:前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様122:前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズし、かつ/または前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）と前記ブロッキングプローブの足場ドメイン（x＊）が互いにハイブリダイズする、前記態様のいずれかのキット。
態様123：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様124：前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様123のキット。
態様125：前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様124のキット。
態様126：第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様127：前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部が、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
態様126のキット。
態様128：前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
態様127のキット。
態様129:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）を含む、態様123～129のいずれかのキット。
態様130:前記第1の核酸の第1の鎖が、足場ドメイン（a）に連結された第2のサブドメイン（b）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第1のサブドメインに連結されたプライマー結合ドメイン（c＊）に連結されたハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含み、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、態様123～129のいずれかのキット。
態様131:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様123～130のいずれかのキット。
態様132:前記第1の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（x）に連結された足場ドメイン（b）に連結されたプライマードメイン（c）に連結されたストッパー分子（●）に連結された第2のサブドメインに連結された第1のサブドメイン（b＊）を含む、態様123～131のいずれかのキット。
態様133:第2の核酸の第2の鎖が、足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結された前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、態様123～132のいずれかのキット。
態様134:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドが結合対である、態様123～133のいずれかのキット。
態様135:前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが結合対である、態様123～134のいずれかのキット。
態様136:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第1のブロッキングリガンドならびに/または前記第2の標的結合リガンドおよび前記第2のブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、態様123～135のいずれかのキット。
態様137:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが同じである、態様123～136のいずれかのキット。
態様138:前記第1の標的結合リガンドおよび前記第2の標的結合リガンドが異なる、態様123～137のいずれかのキット。
態様139:前記第1の標的結合リガンドが受容体である、態様123～138のいずれかのキット。
態様140:前記第1の標的結合リガンドが受容体であり、前記第1のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様123～139のいずれかのキット。
態様141:前記第2の標的結合リガンドが受容体であり、前記第2のブロッキングリガンドが前記受容体のリガンドである、態様123～140のいずれかのキット。
態様142:核酸増幅のための1つまたは複数の成分をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様143:ポリメラーゼをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様144:前記ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、態様143のキット。
態様145:dNTPをさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様146:塩をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様147:緩衝剤をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
態様148:前記標的をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。

【手続補正14】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0169】

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様は、以下の付番された態様によって表される。
態様1）以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよびブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み;
ii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
b. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1のレポータープローブと前記標的との間の相互作用の核酸記録を生成する工程と;
c. 前記核酸記録を検出する工程。
態様2）a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの前記二本鎖核酸の足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）を含む第2の核酸に連結されている、前記第2の標的結合リガンド、を含み、前記標的が、前記第1のレポータープローブおよび前記第2のレポータープローブと同時に結合することができ;
iii. 前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されており、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である第2の足場ドメイン（x＊）とを含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの方法。
態様3）a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（xおよびb）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、かつ前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの方法。
態様4）a. 前記試料を前記第1のレポータープローブおよび前記ブロッキングプローブと接触させる工程が、前記試料を、前記第1のレポータープローブ、第2のレポータープローブ、および前記ブロッキングプローブと接触させることを含み、
i. 前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズされ、足場ドメイン（x）から遠位の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、以下：前記標的に結合することができる第2の標的結合リガンドであって、前記第1のレポータープローブの対形成ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第1の鎖、に連結されている、前記第2の標的結合リガンド;前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズされ、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインを含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメインに実質的に相補的であり、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメインが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み;
iii. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドおよび/または第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、前記ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し、かつ/または前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記ブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの方法。
態様5）以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料をブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記ブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記ブロッキングプローブ核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の非存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様6）i. 前記第1の核酸が二本鎖核酸を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結され、前記二本鎖核酸の第1の末端に一本鎖足場ドメイン（a）を含む、第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、
前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）と実質的に同一である第1の足場ドメイン（a）と、プライマー結合ドメイン（d＊）とを含む、
前記態様のいずれかの方法。
態様7）以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的または間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程と;
d. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様8）以下の工程を含む、試料中の標的を検出する方法：
a. 前記試料を第1のレポータープローブおよび第2のレポータープローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、
前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）が、前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のプローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中に存在しないヌクレオチドを含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記接触させる工程と;
b. 前記試料を第1のブロッキングプローブおよび第2のブロッキングプローブと接触させる工程であって、
i. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができるブロッキングリガンドであって、ブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングリガンド、を含み、前記ブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
ii. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記接触させる工程と;
c. ポリメラーゼおよび第1のdNTPミックスを提供する工程であって、前記第1のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを実質的に含まない、前記提供する工程と;
d. 第2のdNTPミックスおよび任意でポリメラーゼを提供し、それによって、前記第1の核酸と前記第2の核酸との間の相互作用が存在する場合に前記相互作用の核酸記録を生成する工程であって、前記第2のdNTPミックスが、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）または（b）中に存在するが前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1）中および前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2）中には存在しないヌクレオチドに相補的なdNTPを含む、前記生成する工程と;
e. 前記核酸記録の有無を検出する工程であって、前記核酸記録の存在が、前記標的が前記試料中に存在することを示す、前記検出する工程。
態様9）前記ポリメラーゼを提供することが、前記核酸のうちの1つまたは複数を伸長させる、前記態様のいずれかの方法。
態様10）核酸記録の有無を検出する前に、存在する場合の核酸記録を増幅することをさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
態様11）前記第1の標的結合リガンドおよび/または前記第2の標的結合リガンドならびに前記ブロッキングリガンドが、受容体およびリガンド、核酸および核酸結合タンパク質、抗体および抗原、抗体の抗原結合断片および抗原、抗体およびFc受容体、抗体およびプロテインA、アプタマーおよびその結合標的、または薬物およびその結合標的である、前記態様のいずれかの方法。
態様12）前記標的が生体分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様13）前記標的が、抗体、核酸、小分子、または抗原である、前記態様のいずれかの方法。
態様14）前記標的が、中和抗体、抗原、スパイクタンパク質、核酸、または小分子である、前記態様のいずれかの方法。
態様15）前記抗原がワクチン中に含まれるか、または前記抗原がワクチンによってコードされる、前記態様のいずれかの方法。
態様16）前記試料が生物学的試料である、前記態様のいずれかの方法。
態様17）試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1のレポータープローブの前記標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様18）第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部および前記第2の核酸の一部がハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかの組成物。
態様19）試料中の標的を検出するための組成物であって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様20）第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様21）前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかの組成物。
態様22）前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの組成物。
態様23）第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するための組成物であって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記組成物。
態様24）前記組成物が、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかの組成物。
態様25）前記組成物が、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかの組成物。
態様26）試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様27）第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含む第2のレポータープローブ
をさらに含み、
前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、ハイブリダイズすることができ、
前記第2の核酸の一部および前記ブロッキングプローブ核酸の一部が、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかのキット。
態様28）試料中の標的を検出するためのキットであって、
a. 第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含む、第1のレポータープローブと;
b. ブロッキングリガンドを含むブロッキングプローブであって、前記ブロッキングリガンドが、前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができ、かつブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記ブロッキングプローブと
を含み、
前記第1の核酸の一部と前記ブロッキングプローブ核酸の一部とが、前記標的の非存在下でハイブリダイズすることができ、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の非存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様29）第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、足場ドメイン（x）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、第1のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk1）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）が前記第1のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第1のレポータープローブと前記第1のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害し;
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様30）前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部とが、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかのキット。
態様31）前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、第2のブロッキングプローブハイブリダイジングドメイン（Lk2）に連結された足場ドメイン（x＊）を含み、足場ドメイン（x＊）が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的であり、ハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2のレポータープローブのハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかのキット。
態様32）第1のレポータープローブおよび第1のブロッキングプローブを含む、試料中の標的を検出するためのキットであって、
i. 前記第1のレポータープローブが、第1の核酸に連結された第1の標的結合リガンドを含み、前記第1の核酸が、以下：前記第1の標的結合リガンドに連結された連結鎖であって、足場ドメイン（x）に連結された、第1の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）を含む、前記連結鎖と、前記連結鎖にハイブリダイズした二本鎖核酸と、を含み、
前記二本鎖核酸が、
1. 前記第1の標的結合リガンドに連結された前記連結鎖にハイブリダイズし、かつ第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）を含む、第1の核酸の第1の鎖であって、前記第1の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk1）が一本鎖足場ドメイン（a）に連結されており、足場ドメイン（a）が、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）から遠位の末端において存在し、ハイブリダイジングドメイン（Lk1）がハイブリダイジングドメイン（Lk1＊）に実質的に相補的である、前記第1の核酸の第1の鎖と、
2. 前記第1の核酸の第1の鎖に実質的に相補的であり、前記第1の核酸の第1の鎖と二本鎖領域（二重鎖領域）を形成し、前記二本鎖核酸の第2の末端に足場ドメイン（b）を含む、第1の核酸の第2の鎖と
を含み、前記二本鎖核酸が、前記二重鎖領域内に、前記第1の核酸の第1の鎖中の第1のストッパー分子、および前記第1の核酸の第2の鎖中の第2のストッパー分子を含み;
ii. 前記第1のブロッキングプローブが、以下：前記第1の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第1のブロッキングリガンドであって、第1のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第1のブロッキングリガンド、を含み、前記第1のブロッキングプローブ核酸が、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、
前記第1のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記複合体の形成を阻害し、
前記第1の核酸の一部が、前記標的の存在下では核酸記録を生成するために少なくとも2回伸長することができ、前記標的の非存在下では1回以下伸長することができる、
前記キット。
態様33）前記キットが、第2のレポータープローブをさらに含み、
前記第2のレポータープローブが、前記標的に結合することができ第2の核酸に連結された第2の標的結合リガンドを含み、前記第2の核酸が、以下：前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（x）と実質的に同一である足場ドメイン（x）に連結された、第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）を含む、第2の核酸の第1の鎖；前記第2の核酸の第1の鎖にハイブリダイズし、かつ第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）を含む、第2の核酸の第2の鎖であって、前記第2の核酸の第2のハイブリダイジングドメイン（Lk2）が、前記第2の核酸の第1のハイブリダイジングドメイン（Lk2＊）に実質的に相補的であり、前記第1のレポータープローブの足場ドメイン（a）に実質的に相補的である足場ドメイン（a＊）に連結されたプライマー結合ドメイン（d＊）に連結されている、前記第2の核酸の第2の鎖、を含み、前記第1の核酸の一部と前記第2の核酸の一部が、前記標的の存在下でハイブリダイズすることができる、
前記態様のいずれかのキット。
態様34）前記キットが、第2のブロッキングプローブをさらに含み、
a. 前記第2のブロッキングプローブが、以下：前記第2の標的結合リガンドと直接的にまたは間接的に複合体を形成することができる第2のブロッキングリガンドであって、第2のブロッキングプローブ核酸に連結されている、前記第2のブロッキングリガンド、を含み、前記第2のブロッキングプローブ核酸が、前記第2のレポータープローブの足場ドメイン（x）に実質的に相補的である足場ドメイン（x＊）を含み、前記第2のレポータープローブへの前記標的の結合が、前記第2のレポータープローブと前記第2のブロッキングプローブとが複合体を形成するのを阻害する、
前記態様のいずれかのキット。

【国際調査報告】