特表 2023-545218 生物学的試料からのＲＮＡ又はＤＮＡの検出のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-26

(54)【発明の名称】生物学的試料からのＲＮＡ又はＤＮＡの検出のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6806 20180101AFI20231019BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALN20231019BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6806 Z

C12Q1/6888 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023545894

(86)(22)【出願日】2021-10-06

(85)【翻訳文提出日】2023-05-30

(86)【国際出願番号】 US2021053849

(87)【国際公開番号】W WO2022076614

(87)【国際公開日】2022-04-14

(31)【優先権主張番号】63/088,347

(32)【優先日】2020-10-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523123422

【氏名又は名称】マテリアルズ アンド マシーンズ コーポレーション オブ アメリカ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】オーメン， アブラハム

(72)【発明者】

【氏名】ピスカテッリ， ヘザー

(72)【発明者】

【氏名】レヴィン， セス

(72)【発明者】

【氏名】ラスナイア， ゴヴァルダン

(72)【発明者】

【氏名】ハングマン， アリッサ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA20

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

核酸の単離又は精製なしでの、生物学的試料からの核酸の検出の方法が記載される。該方法は、分析の前の核酸の単離又は精製なしでの、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む、生物学的試料からのヒト、動物、ウイルス又は細菌由来の核酸の直接検出を含んでもよい。生物学的試料は、血液、尿、精液、組織、（鼻腔、頬側、眼、膣又は肛門の）スワブであってもよい。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸の検出の前の核酸の単離又は精製なしでの、生物学的試料からの直接のヒト、動物、微生物、及びウイルスの核酸検出の方法であって、
収集された生物学的試料を、処理バッファーと接触させること；
処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、２～１０分間、摂氏８０～９５度に加熱すること；
核酸について、生物学的試料を分析すること
を含む、方法。

【請求項2】

収集された生物学的試料が、ある体積のウイルス輸送培地溶液中に収集されたヒト由来の鼻腔スワブであり、分析された核酸によってＳａｒｓ－Ｃｏｖ２リボ核酸ウイルスが検出される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

処理バッファーが、収集された生物学的試料の体積と等しい体積の、１０％ウシ血清アルブミン、ｐＨ８の０．４ｍＭエチレンジアミン四酢酸、４８ｍＭグアニジンイソチオシアネート、及びｐＨ９．０の８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

加熱することが、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む、
請求項３に記載の方法。

【請求項5】

収集された生物学的試料が、５００マイクロリットルの処理バッファー中に収集されたヒト由来の口腔スワブであり、分析された核酸によってＳａｒｓ－Ｃｏｖ２リボ核酸ウイルスが検出される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

処理バッファーが、０．２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．７及び２ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含み、
加熱することが、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

収集された生物学的試料が、ブタのチューロープの口腔液試料であり、分析された核酸によってブタ生殖及び呼吸器症候群リボ核酸ウイルスが検出され、
収集された生物学的試料が、小型遠心機中で１０分間、２，０００倍の重力加速度で遠心分離される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

処理バッファーが、収集された生物学的試料の体積と等しい体積の、ｐＨ８の２ｍＭ １，２－シクロヘキサンジニトリロ四酢酸、ｐＨ８の４ｍＭからのジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ８の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ６．５の５ｍＭクエン酸ナトリウム、２ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

加熱することが、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏８０度で１０分間加熱することを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

収集された生物学的試料が、５０マイクロリットルのブタ血清であり、分析された核酸によってブタ生殖及び呼吸器症候群リボ核酸ウイルスが検出される、
請求項１に記載の方法。

【請求項11】

処理バッファーが、５０マイクロリットルの、ｐＨ８の２ｍＭ １，２－シクロヘキサンジニトリロ四酢酸、ｐＨ８の４ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ８の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８の１ｍＭエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、ｐＨ９．０の１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩であり、
加熱することが、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

収集された生物学的試料が、５０マイクロリットルのブタ処理液であり、分析された核酸によってブタ生殖及び呼吸器症候群リボ核酸ウイルスが検出される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

処理バッファーが、５０マイクロリットルの、３ｍＭ塩化マグネシウム、７５ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ９．０の５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、及び５．０ｍＭｍＭからのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含み、処理バッファーがｐＨ８．３に調節される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

加熱することが、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

収集された生物学的試料が、ある体積のユニバーサル輸送培地中に収集されたヒト由来の口腔スワブであり、分析された核酸が、Ｇ６３Ｄ変異を有するヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）遺伝子である、
請求項１に記載の方法。

【請求項16】

処理バッファーが、ｐＨ８の０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、８０ｍＭグアニジンイソチオシアネート、及びｐＨ９．０の１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩を含む、ユニバーサル輸送培地の体積と等しい体積であり、
加熱することが、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

核酸の検出の前の核酸の単離又は精製なしでの、生物学的試料からの直接のヒト、動物、微生物、及びウイルスの核酸検出の方法であって、
収集された生物学的試料を、処理バッファーと接触させ、処理バッファーが少なくとも１つのキレート剤及び少なくとも１つの緩衝剤を含むこと；
処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、２～１０分間、摂氏８０～９５度に加熱すること；
核酸について、生物学的試料を分析すること
を含む方法。

【請求項18】

キレート剤が、ｐＨ８．０の０．４～１ミリモル濃度（ｍＭ）エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８の２ｍＭ １，２－シクロヘキサンジニトリロ四酢酸、ｐＨ８の２～４ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、．２５～５ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、及び１ｍＭエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

緩衝剤が、８～５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、３ｍＭ塩化マグネシウム、及び７５ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ６．５～６．７の５ｍＭクエン酸ナトリウム、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、
請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

処理バッファーが、４８～２５０ｍＭグアニジンイソチシネート、２ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、及びそれらの組合せからなる群から選択される溶解剤をさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、参照によって全体が組み込まれている、「ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＲＥＮＡ ＯＲ ＤＮＡ ＦＲＯＭ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＡＭＰＬＥＳ」と題された、２０２０年１０月６日に出願された米国特許仮出願第６３／０８８，３４７号の優先権の利益を主張するものである。

【背景技術】

【0002】

生物学的試料中の病原体核酸（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の迅速検出は、必要性が高い。現在、パンデミックの状況（例えばＣｏｖｉｄ－１９パンデミック）の増大によって、ウイルス、細菌及び真菌を含む病原体の迅速な同定に高い需要がある。核酸の検出のために利用可能な多くの従来の方法は、アッセイにおける核酸の検出又は同定の前に、核酸の精製又は単離（すなわち、遠心機又は磁気ビーズによる、分析のための他の細胞成分からの核酸の分離）を必要とする。例えば、従来のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術は、増幅及び検出の前に他の細胞成分及びデブリから核酸を単離するための、遠心機又は磁気ビーズの使用を含む。したがって、核酸検出の方法は、核酸の検出又は同定の前に、核酸の単離又は精製を必要としないことが望ましい。

【発明の概要】

【0003】

本発明の態様において、核酸の検出の前の核酸の単離又は精製なしでの、生物学的試料からの直接のヒト、動物、微生物、及びウイルスの核酸検出の方法、方法は収集された生物学的試料を、処理バッファーと接触させること；処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、２～１０分間、摂氏８０～９５度に加熱すること；核酸について、生物学的試料を分析することを含む。この態様において、収集された生物学的試料は、ある体積のウイルス輸送培地溶液中に収集されたヒト由来の鼻腔スワブであってもよく、分析された核酸によってＳａｒｓ－Ｃｏｖ２リボ核酸ウイルスが検出され；処理バッファーは、収集された生物学的試料の体積と等しい体積の、１０％ウシ血清アルブミン、ｐＨ８の０．４ｍＭエチレンジアミン四酢酸、４８ｍＭグアニジンイソチオシアネート、及びｐＨ９．０の８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩を含み；加熱することは、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む。この態様において、収集された生物学的試料は、５００マイクロリットルの処理バッファー中に収集されたヒト由来の口腔スワブであってもよく、分析された核酸によってＳａｒｓ－Ｃｏｖ２リボ核酸ウイルスが検出され；処理バッファーは、０．２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．７及び２ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含み、加熱することは、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む。この態様において、収集された生物学的試料は、ブタのチューロープの口腔液試料であってもよく、分析された核酸によってブタ生殖及び呼吸器症候群リボ核酸ウイルスが検出され、収集された生物学的試料は、小型遠心機中で１０分間、２，０００倍の重力加速度で遠心分離され；処理バッファーは、収集された生物学的試料の体積と等しい体積の、ｐＨ８の２ｍＭ １，２－シクロヘキサンジニトリロ四酢酸、ｐＨ８の４ｍＭからのジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ８の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ６．５の５ｍＭクエン酸ナトリウム、２ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含み、加熱することは、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏８０度で１０分間加熱することを含む。この態様において、収集された生物学的試料は、５０マイクロリットルのブタ血清であってもよく、分析された核酸によってブタ生殖及び呼吸器症候群リボ核酸ウイルスが検出され；処理バッファーは、５０マイクロリットルの、ｐＨ８の２ｍＭ １，２－シクロヘキサンジニトリロ四酢酸、ｐＨ８の４ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ８の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８の１ｍＭエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、ｐＨ９．０の１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩を含み、加熱することは、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む。この態様において、収集された生物学的試料は、５０マイクロリットルのブタ処理液であってもよく、分析された核酸によってブタ生殖及び呼吸器症候群リボ核酸ウイルスが検出され；処理バッファーは、５０マイクロリットルの、３ｍＭ塩化マグネシウム、７５ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ９．０の５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、及び５．０ｍＭｍＭからのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含み、処理バッファーはｐＨ８．３に調節され；加熱することは、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む。この態様において、収集された生物学的試料は、ある体積のユニバーサル輸送培地（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｄｉａ）中に収集されたヒト由来の口腔スワブであってもよく、分析された核酸は、Ｇ６３Ｄ変異を有するヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）遺伝子であり；処理バッファーは、ｐＨ８の０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、８０ｍＭグアニジンイソチオシアネート、及びｐＨ９．０の１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩を含む、ユニバーサル輸送培地の体積と等しい体積を含み；加熱することは、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏９５度で２分間加熱することを含む。

【0004】

本発明の態様において、核酸の検出の前の核酸の単離又は精製なしでの、生物学的試料からの直接のヒト、動物、微生物、及びウイルスの核酸検出の方法、方法は、収集された生物学的試料を、処理バッファーと接触させ、処理バッファーが少なくとも１つのキレート剤及び少なくとも１つの緩衝剤を含むこと；処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、２～１０分間、摂氏８０～９５度に加熱すること；核酸について、生物学的試料を分析することを含む。この態様において、キレート剤は、ｐＨ８．０の０．４～１ミリモル濃度（ｍＭ）エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８の２ｍＭ １，２－シクロヘキサンジニトリロ四酢酸、ｐＨ８の２～４ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、２５～５ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、及び１ｍＭエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。この態様において、緩衝剤は、８～５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、３ｍＭ塩化マグネシウム、及び７５ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ６．５～６．７の５ｍＭクエン酸ナトリウム、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。この態様において、処理バッファーは、４８～２５０ｍＭグアニジンイソチシネート、２ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、及びそれらの組合せからなる群から選択される溶解剤をさらに含んでもよい。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】核酸の検出又は同定の前の核酸の単離又は精製なしでの、生物学的試料からの直接の核酸検出のための方法における使用のための処理バッファーを示す図である。

【図2】処理バッファーを使用した、核酸の検出又は同定の前の核酸の単離又は精製なしでの、生物学的試料の一部からの核酸検出のための方法を示す図である。

【図3】生物学的試料としてのヒト鼻咽頭試料からＳａｒｓ－Ｃｏｖ２ ＲＮＡウイルスの存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する例の図である。

【図4】生物学的試料としてのヒト鼻咽頭試料からＳａｒｓ－Ｃｏｖ２ ＲＮＡウイルスの存在を検出するための処理バッファーを使用した方法２００の有効性を証明する例の図である。

【図5】生物学的試料としてのブタ由来の口腔液試料から、ブタベータアルテリウイルス１型とも呼ばれるブタ生殖及び呼吸器症候群（ＰＲＲＳという）ＲＮＡウイルスの存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する例の図である。

【図6】生物学的試料としてのブタ由来の血清試料から、ＰＲＲＳ ＲＮＡウイルスの存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する例の図である。

【図7】生物学的試料としてのブタ由来の処理液試料から、ＰＲＲＳ ＲＮＡウイルスの存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する例の図である。

【図8】生物学的試料としての口腔スワブを使用して、ヒトＤＮＡのヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）及び鎌状赤血球貧血（ＨＢＢ）遺伝子の存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する例の図である。

【発明を実施するための形態】

【0006】

分析の前の核酸の単離又は精製なしでの、生物学的試料からの核酸の検出の方法が記載される。方法は、分析の前の核酸の単離又は精製なしでの（すなわち、遠心機もしくは磁気ビーズによる、他の細胞成分からの核酸の単離もしくは精製なしで、又は１つの遠心分離工程で分析のための核酸を含む細胞を上清から分離し、第２の遠心分離工程で細胞デブリを核酸から分離させる２つ以上の遠心分離工程なしでの）生物学的試料からの核酸の直接検出を含んでもよい。方法は、処理バッファーを使用した、核酸のさらなる単離又は精製なしでの、生物学的試料からの核酸の検出を含んでもよい。生物学的試料は、血液、尿、組織、（鼻腔、頬側、眼、膣又は肛門の）スワブであってもよい。

【0007】

以下の用語は、本出願において使用される場合、定められた意味を有する。
ＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸を意味する。
ＥＧＴＡは、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸を意味する。
ＤＣＴＡは、１，２－シクロヘキサンジニトリロ四酢酸を意味する。
ＤＴＰＡは、ジエチレントリアミン五酢酸を意味する。
ＴＣＥＰ－ＨＣｌは、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を意味する。
トリス－ＨＣｌは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩を意味する。

【0008】

図１は、核酸の検出又は同定の前の核酸の単離又は精製なしでの、処理バッファーを使用した、生物学的試料からの核酸検出のための方法における使用のための、処理バッファー１００を示す。処理バッファーは、少なくとも１つのキレート剤及び少なくとも１つの緩衝剤を含む。処理バッファーは、溶解剤をさらに含んでもよい。

【0009】

処理バッファーの、少なくとも１つのキレート剤は、生物学的試料の、放出された核酸を安定化させ、試料中に含まれる他の細胞成分及び細胞デブリと相互作用して、核酸の単離又は精製なしでの核酸の分析を容易にする。キレート剤は、ｐＨ８．０の０．４～１ミリモル濃度（ｍＭ）ＥＤＴＡ、ｐＨ８の２ｍＭ ＤＣＴＡ、ｐＨ８の２～４ｍＭ ＤＴＰＡ、．２５～５ｍＭ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、及び１ｍＭ ＥＧＴＡ、並びにそれらの組合せからなる群から選択され得る。

【0010】

処理バッファーの、少なくとも１つの緩衝剤は、ｐＨ５～９の間の生物学的試料と接触させた処理バッファーのｐＨを維持することによって、生物学的試料を安定化させる。緩衝剤は、８～５０ｍＭトリスＨＣｌ、６．５～６．７のｐＨの５ｍＭクエン酸ナトリウム、３ｍＭ塩化マグネシウム、及び７５ｍＭ塩化カリウム、及びそれらの組合せからなる群から選択され得る。

【0011】

処理バッファーは、細胞膜、核、及びウイルスの場合処理バッファーへの生物学的試料の核酸の放出をさらに容易にするためにタンパク膜の、溶解をさらに容易にするための溶解剤をさらに含んでもよい。溶解剤は、４８～２５０ｍＭグアニジンイソチシネート及び２ｍＭ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ並びにそれらの組合せを含む。

【0012】

図２は、処理バッファーを使用した、核酸の検出又は同定の前の核酸の単離又は精製なしでの、生物学的試料からの核酸検出のための方法を示す。２０２において、生物学的試料が収集される。例えば、生物学的試料は、鼻腔もしくは口腔スワブ、ブタのチューロープ等の口腔試料、ブタ由来の血清試料、又は処理液試料（すなわち、子ブタ去勢及び断尾から回収された漿液性の液）であってもよい。収集は、ウイルスＲＮＡの場合等に、生物学的試料の核酸の安定化及び分解の予防のための、ユニバーサル輸送培地（ＵＴＭ）又はウイルス輸送培地（ＶＴＭ）への直接の収集を含んでもよい。生物学的試料の収集は、生物学的試料のタイプと関連した従来のメカニズムによってもよい。収集することは、生物学的試料を遠心分離して、生物学的試料の細胞成分由来の非細胞デブリ（例えば、チューロープ、食物等の破片）を分離することをさらに含んでもよい。収集することは、処理バッファーでの処理の前の凍結及び他の従来のメカニズムによって、生物学的試料を保管することをさらに含んでもよい。

【0013】

２０４において、収集された生物学的試料は、処理バッファーで処理される。生物学的試料がＶＴＭ又はＵＴＭに収集される場合、処理バッファーは、収集された生物学的試料の体積と等しい体積で使用される。生物学的試料が処理バッファーに直接収集される場合、４００～６００マイクロリットルの体積を使用してもよい。

【0014】

処理バッファーは、生物学的試料に基づいて選択される。例えば、生物学的試料が鼻腔スワブである場合、処理バッファーは、０．２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．７及び２ｍＭ ＴＣＥＰ－ＨＣｌを含んでもよい。

【0015】

例えば、生物学的試料が鼻腔又は口腔スワブである場合、処理バッファーは、０～１０％ウシ血清アルブミン、ｐＨ８の０．４ｍＭ～０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、４８ｍＭ～８０ｍＭグアニジンイソチオシアネート、及びｐＨ９．０の８～１０ｍＭトリス－ＨＣｌを含んでもよい。

【0016】

生物学的試料がブタのチューロープ等の口腔液試料である場合、処理バッファーは、ｐＨ８の２ｍＭ ＤＣＴＡ、ｐＨ８の２～４ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ８の１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５の５ｍＭクエン酸ナトリウム、２ｍＭ ＴＣＥＰ－ＨＣｌを含んでもよい。

【0017】

生物学的試料が血清試料である場合、処理バッファーは、ｐＨ８の２ｍＭ ＤＣＴＡ、ｐＨ８の２～４ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ８の１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８の１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ９．０の１０ｍＭトリスＨＣｌを含んでもよい。

【0018】

生物学的試料がブタ由来の処理液である場合、処理バッファーは、バッファーがｐＨ８．３に調節されている、３ｍＭ塩化マグネシウム、７５ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ９．０の５０ｍＭトリスＨＣｌ、及び０．２５ｍＭ～５．０ｍＭ ＴＣＥＰ、並びにそれらの組合せを含んでもよい。

【0019】

２０６において、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料が加熱される。加熱することは、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、摂氏８０～９５度で２～１０分間加熱することを含んでもよい。加熱することによって、細胞又はタンパク質カプセル溶解が引き起こされ、核酸が処理バッファーへさらに放出される。

【0020】

２０８において、処理バッファーと接触させた、加熱された生物学的試料は、ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ ＣＯＭＰＯＳＩＩＯＮ ＦＯＲ ＣＩＲＣＵＬＡＲＩＺＩＮＧ ＯＧＬＩＧＯＮＵＣＥＬＥＯＴＩＤＥ ＰＲＯＢＥＳと題された米国特許出願第１６／６４２，３０８号に記載されているようなパドロックプローブを使用した配列増幅とヌクレオチド検出の組合せ（本明細書でＣ－ＳＡＮＤ（登録商標）分析という）等の、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、等温増幅等の従来の核酸検出及び同定方法を使用して、微生物、ウイルス、ヒト、又は動物核酸検出について分析される。例えば、分析が蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲ又は蛍光検出を用いたＣ－ＳＡＮＤ分析である場合、分析を行うデバイスは、ＷＡＶＥＬＥＮＧＴＨ ＳＣＡＮＮＩＮＧ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦと題された米国特許第９，５６８，４２９号及び第９，８１０，６３１号に記載されているようなデバイスであってもよい。

【0021】

分析工程は、検出のための核酸から非細胞性の微粒子状物質及び細胞デブリを同時に分離する、核酸検出の前の遠心分離工程を含んでもよい。

【0022】

図３は、生物学的試料としてのヒト鼻咽頭試料からのＳａｒｓ－Ｃｏｖ２ ＲＮＡウイルスの存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する。処理バッファーは、１０％ウシ血清アルブミン、ｐＨ８の０．４ｍＭ ＥＤＴＡ、４８ｍＭグアニジンイソチオシアネート、及びｐＨ９．０の８ｍＭトリス－ＨＣｌを含んだ生物学的試料の収集の前に選択された。この場合には特定の処理バッファーが使用されたが、他の処理バッファーを使用してもよい。

【0023】

生物学的試料は、従来のＶＴＭ溶液中に収集された従来の鼻腔スワブを使用して、ヒト鼻咽頭試料から収集された。従来のＶＴＭ溶液中に収集された生物学的試料は、次いで処理バッファーで処理され、処理バッファーの体積は、ウイルス輸送培地溶液中に収集された生物学的試料の体積と等しかった。

【0024】

処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料は、次いで摂氏９５度で２分間加熱された。加熱の完了の際に、処理バッファーと接触させ、加熱された、５マイクロリットルの収集された生物学的試料は、次いでＳａｒｓ－ＣｏＶ２ ＲＮＡウイルス及びＤＮＡ、特にＣｏｘ－１（チトクロムｃオキシダーゼサブユニット１ミトコンドリア遺伝子）のヒト内部ポジティブコントロールについて分析された。分析は、蛍光検出を用いたＣ－ＳＡＮＤであり、放出された生物学的試料を有する処理バッファーを、試薬と接触させて、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２ ＲＮＡウイルス及びＣｏｘ－１の蛍光検出を用いたＣ－ＳＡＮＤ分析を行った。この例において、分析を行うためのデバイスとして、ＷＡＶＥＬＥＮＧＴＨ ＳＣＡＮＮＩＮＧ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦと題された米国特許第９，５６８，４２９号及び第９，８１０，６３１号に記載されているようなデバイスを使用して分析を行ったが、蛍光検出を用いたＣ－ＳＡＮＤ分析を行うことができる他の装置を使用してもよい。

【0025】

図３のグラフ３００は、方法によって、Ｃｏｘ－１ポジティブ内部標準３０２及びＳａｒｓ－Ｃｏｖ２ ＲＮＡウイルス３０４の両方が検出されたことを証明し、処理バッファーを使用した方法２００によって、生物学的試料からの核酸の精製又は単離なしでのＲＮＡ及びＤＮＡの検出が可能になることを証明する。グラフのｙ軸上の単位は蛍光強度である。

【0026】

図４は、生物学的試料としてのヒト鼻咽頭試料からＳａｒｓ－Ｃｏｖ２ ＲＮＡウイルスの存在を検出するために処理バッファーを使用した方法２００の有効性を証明する。処理バッファーは、０．２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．７及び２ｍＭ ＴＣＥＰ－ＨＣｌを含んだ生物学的試料の収集の前に選択した。この場合には特定の処理バッファーが使用されたが、他の処理バッファーを使用してもよい。

【0027】

生物学的試料は、５００マイクロリットルの処理バッファー中に収集された従来の鼻腔スワブを使用して、ヒト鼻咽頭試料から収集された。処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料は、次いで摂氏９５度で２分間加熱された。

【0028】

１００マイクロリットルの、加熱された、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料は、次いでＳａｒｓ－ＣｏＶ２ ＲＮＡウイルスについて分析された。分析は、蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲであり、加熱された、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、乾燥試薬と接触させて、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２ ＲＮＡの蛍光検出を用いた従来のリアルタイムＰＣＲを行った。この例において、分析を行うデバイス例として、ＷＡＶＥＬＥＮＧＴＨ ＳＣＡＮＮＩＮＧ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦと題された米国特許第９，５６８，４２９号及び第９，８１０，６３１号に記載されているようなデバイスを使用して分析を行ったが、蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲが可能な他の装置を使用してもよい。

【0029】

図４のグラフ４００は、方法２００によってＳａｒｓ－Ｃｏｖ２ ＲＮＡウイルス４０４が検出されたことを証明し、処理バッファーを使用した方法２００によって、生物学的試料からの核酸の精製又は単離なしでのＲＮＡの検出が可能になることを証明する。グラフのｙ軸上の単位は蛍光強度であり、ｘ軸単位はリアルタイムＰＣＲサイクルを示す。

【0030】

図５は、生物学的試料としてのブタ由来の口腔液試料から、ブタベータアルテリウイルス１型とも呼ばれるブタ生殖及び呼吸器症候群（ＰＲＲＳという）ＲＮＡウイルスの存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する。処理バッファーは、ｐＨ８の２ｍＭ ＤＣＴＡ、ｐＨ８の４ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ８の１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５の５ｍＭクエン酸ナトリウム、２ｍＭ ＴＣＥＰ－ＨＣｌを含んだ生物学的試料の収集の前に選択した。この場合には特定の処理バッファーが使用されたが、他の処理バッファーを使用してもよい。

【0031】

生物学的試料は、口腔液としてブタのチューロープから収集した。収集された生物学的試料は、次いで小型遠心機中で２，００００倍の重力加速度で１０分間遠心分離して、収集された生物学的試料から非細胞デブリ（すなわち、チューロープ断片又は食物粒子）を分離させた。収集された生物学的試料は処理バッファーで処理され、処理バッファーの体積は、収集された生物学的試料の体積と等しかった。

【0032】

処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料は、次いで摂氏８０度で１０分間加熱された。加熱の完了の際に、処理バッファーと接触させ、加熱された、およそ１０マイクロリットルの収集された生物学的試料は、次いでＰＲＲＳウイルスＲＮＡについて分析された。分析は、蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲであり、加熱された、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、試薬と接触させて、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡの蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。この例において、分析を行うデバイス例として、ＷＡＶＥＬＥＮＧＴＨ ＳＣＡＮＮＩＮＧ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦと題された米国特許第９，５６８，４２９号及び第９，８１０，６３１号に記載されているようなデバイスを使用して分析を行ったが、蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲを行うことができる他の装置を使用してもよい。

【0033】

図５のグラフ５００は、方法によってＰＲＲＳ ＲＮＡウイルス５０４が検出されたことを証明し、処理バッファーを使用した方法２００によって、生物学的試料からの核酸の精製又は単離なしでのＲＮＡの検出が可能になることを証明する。グラフのｙ軸上の単位は蛍光強度であり、ｘ軸の単位はリアルタイムＰＣＲサイクルである。

【0034】

図６は、生物学的試料としてのブタ由来の血清試料から、ＰＲＲＳ ＲＮＡウイルスの存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する。処理バッファーは、ｐＨ８の２ｍＭ ＤＣＴＡ、ｐＨ８の４ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ８の１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８の１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ９．０の１０ｍＭトリスＨＣｌを含んだ生物学的試料の収集の前に選択した。この場合には特定の処理バッファーが使用されたが、他の処理バッファーを使用してもよい。

【0035】

生物学的試料は、血清として収集し、５０マイクロリットルの、収集された生物学的試料は、処理バッファーで処理され、処理バッファーの体積は、収集された生物学的試料の体積と等しかった。

【0036】

処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料は、次いで摂氏９５度で２分間加熱された。加熱され、処理バッファーと接触させた生物学的試料は、次いで遠心分離して、非細胞性及び細胞性の粒子を核酸から分離させた。遠心分離の完了の際に、処理バッファーと接触させ、加熱された、およそ１０マイクロリットルの収集された生物学的試料は、次いでＰＲＲＳ ＲＮＡウイルスについて分析された。分析は、蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲであり、加熱された、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、試薬と接触させて、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡの蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。この例において、分析を行うデバイス例として、ＷＡＶＥＬＥＮＧＴＨ ＳＣＡＮＮＩＮＧ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦと題された米国特許第９，５６８，４２９号及び第９，８１０，６３１号に記載されているようなデバイスを使用して分析を行ったが、蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲを行うことができる他の装置を使用してもよい。

【0037】

図６のグラフ６００は、方法によってＰＲＲＳウイルスＲＮＡ６０４が検出されたことを証明し、処理バッファーを使用した方法２００によって、生物学的試料からの核酸の精製又は単離なしでのＲＮＡの検出が可能になることを証明する。グラフのｙ軸上の単位は蛍光強度であり、ｘ軸単位はリアルタイムＰＣＲのサイクルである。

【0038】

図７は、生物学的試料としてのブタ由来の処理液試料から、ＰＲＲＳ ＲＮＡウイルスの存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する。処理バッファーは、バッファーがｐＨ８．３に調節されている、３ｍＭ塩化マグネシウム、７５ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ９．０の５０ｍＭトリスＨＣｌ、及び５．０ｍＭからのＴＣＥＰ－ＨＣｌを含んだ生物学的試料の収集の前に選択した。この場合には特定の処理バッファーが使用されたが、他の処理バッファーを使用してもよい。

【0039】

生物学的試料は、血清として収集し、５０マイクロリットルの、収集された生物学的試料は、処理バッファーで処理され、処理バッファーの体積は、収集された生物学的試料の体積と等しかった。

【0040】

処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料は、次いで摂氏９５度で２分間加熱された。加熱され、処理バッファーと接触させた生物学的試料は、次いで遠心分離して、非細胞性及び細胞性の粒子を核酸から分離させた。遠心分離の完了の際に、処理バッファーと接触させ、加熱された、およそ１０マイクロリットルの収集された生物学的試料は、次いでＰＲＲＳ ＲＮＡウイルス及びＤＮＡ、特にＣｏｘ－１のブタ内部ポジティブコントロールについて分析された。分析は、蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲであり、加熱された、処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料を、試薬と接触させて、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ及びＣｏｘ－１の蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。この例において、分析を行うデバイス例として、ＷＡＶＥＬＥＮＧＴＨ ＳＣＡＮＮＩＮＧ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦと題された米国特許第９，５６８，４２９号及び第９，８１０，６３１号に記載されているようなデバイスを使用して分析を行ったが、蛍光検出を用いたリアルタイムＰＣＲを行うことができる他の装置を使用してもよい。

【0041】

図７のグラフ７００は、方法によってＣｏｘ－１ポジティブ内部標準７０２及びＰＲＲＳ ＲＮＡウイルス７０４が検出されたことを証明し、処理バッファーを使用した方法２００によって、生物学的試料からの核酸の精製又は単離なしでのＲＮＡ及びＤＮＡの検出が可能になることを証明する。グラフのｙ軸上の単位は蛍光強度であり、ｘ軸の単位はリアルタイムＰＣＲのサイクルを示す。

【0042】

図８は、生物学的試料としての口腔スワブを使用してヒトＤＮＡのヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）及び鎌状赤血球貧血（ＨＢＢ）遺伝子の存在を検出するための処理バッファーを配置した方法２００の有効性を証明する。処理バッファーは、ｐＨ８の０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８０ｍＭグアニジンイソチオシアネート、及びｐＨ９．０の１０ｍＭトリス－ＨＣｌを含んだ生物学的試料の収集の前に選択した。この場合には特定の処理バッファーが使用されたが、他の処理バッファーを使用してもよい。

【0043】

生物学的試料は、従来のＶＴＭ溶液中に収集された従来の口腔スワブを使用して、口腔スワブから収集された。従来のＶＴＭ溶液中に収集された生物学的試料は、次いで処理バッファーで処理され、処理バッファーの体積は、ウイルス輸送培地溶液中に収集された生物学的試料の体積と等しかった。

【0044】

処理バッファーと接触させた、収集された生物学的試料は、次いで摂氏９５度で２分間加熱された。加熱の完了の際に、処理バッファーと接触させ、加熱された、収集された生物学的試料は、次いで１００塩基対のラダーとともに２％アガロースゲルを使用した従来のＰＣＲ及びゲル電気泳動プロトコールを使用して、ヘモクロマトーシス遺伝子、特にＧ６３Ｄ及びＣ２８２Ｙ変異を有するＨＦＥ遺伝子、並びに鎌状赤血球貧血遺伝子、特にＨＢＢ遺伝子について分析された。

【0045】

図８は、ゲル８００の写真によってＰＣＲ及びゲル電気泳動の結果を示す。８０２は、１００塩基対のラダーのカラムを表し、８１０は、ゲル上で２００塩基対のバンドが現れる場所を同定している。８０４は、Ｃ２８２Ｙ変異領域を特異的に増幅したＰＣＲ産物の同定のためのカラムであり、２１６塩基対に、Ｃ２８２Ｙ変異の位置を有するヘモクロマトーシス遺伝子の存在を示すバンドがある。８０６は、Ｇ６３Ｄ変異を特異的に増幅したＰＣＲ産物の同定のためのカラムであり、２２０塩基対に、Ｇ６３Ｄ変異の位置を有するヘモクロマトーシス遺伝子の存在を示すバンドがある。８０８はＨＢＢ遺伝子の同定のためのカラムであり、２２７塩基対に、鎌状赤血球貧血のＨＢＢ遺伝子の存在を示すバンドがある。図８は、処理バッファーを使用した方法２００によって、生物学的試料からの核酸の精製又は単離なしでのＤＮＡの検出が可能になることを証明する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】