特表 2023-545340 褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-30

(54)【発明の名称】褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/077 20100101AFI20231023BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20231023BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20231023BHJP

   A61K 35/35 20150101ALI20231023BHJP

   A61K 35/44 20150101ALI20231023BHJP

【ＦＩ】

C12N5/077

C12Q1/02

A61P3/04

A61K35/35

A61K35/44

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023502756

(86)(22)【出願日】2021-07-15

(85)【翻訳文提出日】2023-03-08

(86)【国際出願番号】 EP2021069888

(87)【国際公開番号】W WO2022013404

(87)【国際公開日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】2007407

(32)【優先日】2020-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516086358

【氏名又は名称】サントル ナショナル デ ラ ルシェルシュ シアンティフィック

(71)【出願人】

【識別番号】521296063

【氏名又は名称】シーエイチユー ド ニース

(71)【出願人】

【識別番号】523013237

【氏名又は名称】エタブリスメント フランチャイズ デュ サン

(71)【出願人】

【識別番号】521442659

【氏名又は名称】インスティテュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ ルシェルシュ メディカル

(71)【出願人】

【識別番号】523013248

【氏名又は名称】ウニベルシテ コート ダジュール

(71)【出願人】

【識別番号】523013259

【氏名又は名称】ウニベルシテ トゥールーズ ＩＩＩ－ポール サバティエ

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ダニ，クリスチャン，ジーン，ルシエン

(72)【発明者】

【氏名】ダニ，ヴィンセント

(72)【発明者】

【氏名】カステイラ，ルイス

(72)【発明者】

【氏名】ドグリオ，アライン，ピエール，ルイス

(72)【発明者】

【氏名】レテルトゥレ，フィリップ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA05

4B063QQ08

4B065AA93X

4B065AC20

4B065BA30

4B065BB07

4B065BB11

4B065BB12

4B065CA46

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA10

4C087BB33

4C087BB63

4C087BB64

4C087BB70

4C087NA14

4C087ZA70

(57)【要約】

本発明の主題は、褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法である。本方法は、以下の、
一方で、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞および褐色またはベージュヒト脂肪組織の幹細胞を含むヒト脂肪組織から間質性血管フラクション、ならびに他方で前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、褐色またはベージュヒト脂肪組織の幹細胞、およびコラーゲンを含む、ステップと、
前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、培養培地において懸濁液で培養するステップと
を含む、方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂肪組織由来の褐色またはベージュ脂肪細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで得るための方法であって、以下の、
一方で、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むヒト脂肪組織から間質性血管フラクション、ならびに他方で前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織の幹細胞、およびコラーゲンを含み、前記細胞外マトリックスの抽出が、機械的な解離ステップを含む、ステップと、
前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞の細胞増殖培地において懸濁液で培養するステップと、
脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞の分化を誘導して、褐色またはベージュ脂肪細胞を得るステップと
を含み、
前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスの抽出は、以下の
ヒト脂肪組織を遠心分離して、少なくとも２つの異なるフラクション、遠心分離された細胞外マトリックスを含むフラクションＡおよび間質性血管フラクションを得るステップと、
フラクションＡを機械的に解離して細胞外マトリックスを得るステップと
を含む、方法。

【請求項2】

前記脂肪組織の幹細胞の分化が、分化培地で誘導されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記機械的な解離ステップが、コラゲナーゼを含まない解離ステップであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記機械的な解離ステップが、非酵素的な解離ステップであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記間質性血管フラクションに存在する血液細胞を排除するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記細胞外マトリックスのコラーゲンが、原線維構成を有する構造化されたコラーゲンであることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスの混合物を培養するステップは、以下の
前記混合物を、無菌にて、前記増殖培地を含む懸濁培養バッグに移すステップと、
前記混合物を増幅させて、細胞クラスターを含む増幅した混合物を得るステップと
を含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞クラスターを含む増幅した混合物が、細胞凝集物を得るための機械的な解離の対象であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。

【請求項9】

増殖培地への、血清、線維芽細胞増殖因子、およびインスリン様増殖因子の添加を含むことを特徴とする、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

分化培地への、ロシグリタゾンおよび／またはＳＢ４３１５４２の添加を含むことを特徴とする、請求項２～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

表面マーカーＤＰＰ４を発現する幹細胞をソーティングすることを目的とするセルソーティングステップをさらに含むことを特徴とする請求項１～１０のうちの１項に記載の方法。

【請求項12】

ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞、およびコラーゲンを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法により抽出された細胞外マトリックス。

【請求項13】

請求項１３に記載の細胞外マトリックスと、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法により抽出された間質性血管フラクションとの混合物を含む組成物。

【請求項14】

細胞増殖培地が、血清、線維芽細胞増殖因子、およびインスリン様因子を含み、分化培地が、ロシグリタゾンおよび／またはＳＢ４３１５４２を含む、請求項１３に記載の組成物を含むキット。

【請求項15】

薬学的に有効な成分のスクリーニングおよび／または性質決定のための、請求項１２に記載の細胞外マトリックスのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。

【請求項16】

薬学的に有効な成分のスクリーニングおよび／または性質決定のための、請求項１３に記載の組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。

【請求項17】

薬学的に有効な成分のスクリーニングおよび／または性質決定のための、請求項１４に記載のキットのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。

【請求項18】

細胞療法でのその使用のため、または代謝性障害の処置のための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法により得られる褐色またはベージュ脂肪細胞を含む産物。

【請求項19】

肥満の処置のための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法により得られる褐色またはベージュ脂肪細胞を含む産物。

【請求項20】

請求項２～１１のいずれか１項に記載の方法による褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞の褐色またはベージュ脂肪細胞への分化のための分化培地であって、血清、増殖因子、ロシグリタゾン、およびＳＢ４３１５４２を補充、好ましくはウシ胎児血清、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、アスコルビン酸、ロシグリタゾン、Ｔ３、インスリン、およびＳＢ４３１５４２を補充した内皮細胞増殖培地を含む、分化培地。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト脂肪組織からの褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増殖のための方法に関する。さらに本発明は、褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法、細胞外マトリックス、細胞マトリックスおよび間質性血管フラクションの混合物を含む組成物、この組成物を含むキット、細胞外マトリックスまたは細胞外マトリックスおよび間質性血管フラクションの混合物を含む組成物の使用、その使用のため本発明の方法により得た褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞および褐色またはベージュ脂肪細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

従来技術
細胞療法は、組織または臓器が事故、病態、老化、および代謝性障害により変質した場合にそれらの機能を回復させることを目的とする細胞移植である。これは、「治療用」細胞と呼ばれる細胞の注射により、長期間の患者の処置を可能にする。これら細胞は、特に、患者自身からの複能性幹細胞から得られる。

【0003】

この患者において、褐色／ベージュ脂肪組織（ＢＡＴ）の質量を増大させることにより、患者の代謝上の適応性を改善しかつ／またはエネルギー依存を刺激するための検討がなされていた。これは、糖尿病、心血管疾患、および他の代謝性機能不全などの代謝性疾患に対処するように意図された革新的な手法である。実際に、褐色またはベージュ脂肪組織は、レドックス代謝の制御下で生物の熱放散に関与しており、これは、ホルモン分泌を介して内分泌およびパラクリンを制御する役割を果たす。よって、これら患者で「ＴＡＢ」機能と呼ばれる機能を回復させることは、魅力的な治療の選択肢を表す。

【0004】

しかしながら、褐色またはベージュ脂肪組織を用いる（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）自家細胞療法は、実際には存在せず、この主な理由は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための、成年患者、より具体的には肥満患者における褐色脂肪細胞の供給源が実質的にないことである。実際に、大量に、特に肥満患者に存在する白色脂肪組織とは異なり、褐色またはベージュ脂肪組織は、成年の男性においては特に希少であり、さらには肥満患者においてはほぼ存在せず、この実質的な不存在は、これが主な原因ではない場合、代謝性障害、限定するものではないが、特に過体重に関連した代謝性障害の悪化する要因を構成する。

【0005】

これに関連して、自家性褐色またはベージュ脂肪細胞の培養を行い、その後、糖尿病、心血管疾患、および他の代謝性機能障害などの肥満に関連する代謝性疾患に対処するために十分な量の治療用グレードの褐色またはベージュ脂肪細胞を得ることを可能にする細胞増幅方法を開発することが、必要とされている。

【0006】

脂肪組織サンプルから脂肪細胞前駆体を単離および増幅させるための標準的な手法は、酵素的な解離を経て、その後、培養皿のプラスチックへの結合により２次元（２D）でのその拡大を経る。この手法は、高価で時間がかかり、コンタミネーションのリスクを上げる多くの操作を必要とする。さらにこれは、組織の３次元構造の破壊、ならびにグラフトの血管新生および脂肪細胞の生理機能の両方に重要な役割を果たす内皮細胞などの目的の細胞種の喪失をもたらす。

【0007】

脂肪組織の非酵素的な解離は、より安価で速く、治療用グレードの生産の基準と一致する産物の製造にとって明らかな利点（外部の産物または混入物質への曝露を低下させる）を有する代替的な方法であると思われる。しかしながら、今日までに提示された非酵素的な解離方法は、得られた脂肪細胞前駆体の数が酵素的解離と比較して少ないといくつかの試験から報告されているため、十分ではない。さらに、成熟脂肪細胞、細胞外マトリックス、および脂肪組織の３次元構造は、常に、培養後の解離プロセスの終了時に、失われ、同様に内皮細胞も失われる。

【0008】

その中に脂肪細胞前駆体を播種し、よって、可能な限り脂肪組織の構造を再構成しようとするための異なる合成マトリックスが提案された。これらマトリックスはまた、移植前に本質的に骨性または軟骨性である、非脂肪細胞種へ脂肪細胞前駆体をｉｎ ｖｉｔｒｏで方向付けるために使用される。また、前駆体の分化を増大させ、脂肪組織の構造を良好に模倣するための脱細胞化された脂肪組織も提案されている。これら種のマトリックスの製造は、酵素的な反応または長い化学的処置を含む多くのステップを必要とする。さらに、定義により脱細胞化された組織は、これらの内在性細胞を失う。非細胞化されており、（以前は酵素的解離により単離された）脂肪組織前駆体が豊富であり、その後２Ｄ増幅された脂肪組織は、近年、良好な骨再構成のためのマトリックスとして提案されている。この生物学的なマトリックスを作製するための時間は長く、３週間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を必要とし、脂肪細胞前駆体の増幅を行うことができない。骨修復への関心のみが、著者により強調されていた。

【0009】

３次元（３Ｄ）の懸濁培養は、これが組織の構造および内因的な質を保つことを本質的に可能にするため、２Ｄの標準的な方法に代わる選択方法を表す。この利点は、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪組織を最良に模倣する関連するヒトモデルの不存在が、肥満、ならびに２型糖尿病および心血管疾患などの関連する代謝性疾患に対処するために有効な新規の薬物の開発のための、前臨床段階の試験の間の主要な限定であるため、重要である。さらに、３Ｄ培養は、閉鎖されたシステムで達成可能であり、これにより操作およびコンタミネーションのリスクが下がる。

【発明の概要】

【0010】

上記を考慮すると、本発明が対処する技術的な問題は、ヒト白色脂肪組織から大量の幹細胞、特に治療用グレードの褐色またはベージュ脂肪細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで得ることである。

【0011】

この技術的な問題に対する本発明の解決策は、第１の目的では、褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法であって、以下の、
一方で、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むヒト脂肪組織から間質性血管フラクション、ならびに他方で前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織の幹細胞、およびコラーゲンを含み、前記細胞外マトリックスの抽出が、機械的な解離ステップを含む、ステップと、
前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、細胞増殖培地において懸濁液で培養するステップと、
を含む、方法を有する。

【0012】

よって、恐らくは細胞外マトリックスの存在により作製される間質性血管フラクションの懸濁培養は、３Ｄ増幅を可能にし、ネイティブな脂肪組織の環境において大量の細胞にアクセスさせ、よって、コンタミネーションのリスクを上げる操作が限定される。

【0013】

好適には、機械的な解離ステップは、コラゲナーゼを含まない解離ステップであり、機械的な解離ステップは、非酵素的な解離ステップであり、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの抽出は、以下の、
ヒト脂肪組織を遠心分離して、少なくとも２つの異なるフラクション、遠心分離された細胞外マトリックスを含むフラクションＡおよび間質性血管フラクションを得るステップと、
フラクションＡを機械的に解離して細胞外マトリックスを得るステップと
を含み、本方法は、間質性血管フラクションに存在する血液細胞を排除するステップをさらに含み、細胞外マトリックスのコラーゲンは、原線維構成を有する構造化されたコラーゲンであり、前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスの混合物を培養するステップが、以下の
前記混合物を、無菌にて、増殖培地を含む懸濁培養バッグに移すステップと、
前記混合物を増幅させて、細胞クラスターを含む増幅した混合物を得るステップと
を含み、細胞クラスターを含む増幅された混合物が、細胞凝集物を得るための機械的な解離の対象であり、増殖培地が、血清、線維芽細胞増殖因子、およびインスリン様増殖因子を含み、本方法が、表面マーカーＤＰＰ４を発現する幹細胞をソーティングすることを目的とするセルソーティングステップをさらに含む。

【0014】

第２の目的では、本発明は、褐色またはベージュ脂肪細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで得るための方法であって、以下の、
一方で、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むヒト脂肪組織から間質性血管フラクション、ならびに他方で前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織の幹細胞、およびコラーゲンを含み、前記細胞外マトリックスの抽出が、機械的な解離ステップを含む、ステップと、
前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、細胞増殖培地において懸濁液で培養するステップと、
脂肪組織の幹細胞の分化を誘導して、褐色またはベージュ脂肪細胞を得るステップと
を含む、方法に関する。

【0015】

好適には、脂肪組織の幹細胞の分化は、分化培地で誘導され、機械的な解離ステップは、コラゲナーゼを含まない解離ステップであり、機械的な解離ステップは、非酵素的な解離ステップであり、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの抽出は、以下の、
ヒト脂肪組織を遠心分離して、少なくとも２つの異なるフラクション、遠心分離された細胞外マトリックスを含むフラクションＡおよび機械的な間質性血管フラクションを得るステップと、
フラクションＡを機械的に解離して細胞外マトリックスを得るステップと
を含み、本方法は、間質性血管フラクションに存在する血液細胞を排除するステップをさらに含み、細胞外マトリックスのコラーゲンは、原線維構成を有する構造化されたコラーゲンであり、前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスの混合物を培養するステップが、以下の
前記混合物を、無菌にて、増殖培地を含む懸濁培養バッグに移すステップと、
前記混合物を増幅させて、細胞クラスターを含む増幅した混合物を得るステップと
を含み、細胞クラスターを含む増幅された混合物が、細胞凝集物を得るための機械的な解離の対象であり、増殖培地が、血清、線維芽細胞増殖因子、およびインスリン様増殖因子を含み、分化培地が、ロシグリタゾンおよび／またはＳＢ４３１５４２を含み、本方法が、表面マーカーＤＰＰ４を発現する幹細胞をソーティングすることを目的とするセルソーティングステップをさらに含む。

【0016】

第３の目的では、本発明は、上記に定義した方法により得られる可能性がある単離された細胞外マトリックスであって、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞、およびコラーゲンを含む、単離された細胞外マトリックスに関する。

【0017】

第４の目的では、本発明は、上記の細胞外マトリックスと、脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含む間質性血管フラクションとの混合物を含む組成物に関する。

【0018】

第５の目的では、本発明は、上記に定義された組成物、増殖培地、および分化培地を含むキットに関する。

【0019】

第６の目的では、本発明は、薬学的に有効な成分のスクリーニングおよび／または性質決定のための、上記に定義された細胞外マトリックスまたは上記に定義された組成物の使用に関する。

【0020】

第７の目的では、本発明は、細胞療法でのその使用のため、または代謝性障害の処置のための、上記の組成物からもたらされる褐色またはベージュ脂肪細胞に関する。

【0021】

第８の目的では、本発明は、肥満の処置のための、上記の組成物からもたらされる褐色またはベージュ脂肪細胞に関する。

【0022】

第９の目的では、本発明は、褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞の褐色またはベージュ脂肪細胞への分化のための分化培地であって、血清、増殖因子、ロシグリタゾン、およびＳＢ４３１５４２、好ましくはウシ胎児血清、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、アスコルビン酸、ロシグリタゾン、Ｔ３、インスリン、およびＳＢ４３１５４２を補充した内皮細胞増殖培地を含む、分化培地に関する。

【0023】

本発明は、添付の図面に関連してまとめられた以下の非限定的な説明を読むことにより、良好に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A】図１Ａは、本発明に係る、細胞外マトリックスおよび間質性血管フラクションの抽出に必要とされかつ十分なステップ（ステップ１～３）と、その共培養（ステップ４）とを表す。

【図1B】図１Ｂは、本発明に係る、間質性血管フラクションの細胞外マトリックス（Ｍ１～Ｍ４）および細胞集団（Ｃ１～Ｃ３）の連続的な抽出（ステップ１～５）と、その共培養（ステップ６）とを可能にする本方法のより詳細な概略図である。

【図1C】図１Ｃは、本発明に係る産物、すなわち、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスからもたらされるＥｘＡｄＥｘ－組織と呼ばれる産物、ならびに本発明に係る方法のさらなるステップによる凝集物の形成からもたらされるＥｘＡｄＥｘ－小葉と呼ばれる産物の例示である。

【図1D】図１Ｄは、本発明の方法による、産物ＥｘＡｄＥｘ－組織から産物ＥｘＡｄＥｘ－小葉を得るためのステップを表す。

【図2A-2K】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、および２Ｋは、産物ＥｘＡｄＥｘ－小葉およびＥｘＡｄＥｘ－組織における以下に列挙された遺伝子：ＦＡＢＰ４、ＰＬＩＮ１、アディポネクチン、ＣＤ３１、ＤＰＰ４、ＩＣＡＭ１、ＰＤＧＦＲａ、Ｉｎｈｉｂｉｎ ｂｅｔａ Ａ、ＭＳＣＡ１、ＩＬ１ｂ（Ｍ１ マクロファージ）、ＭＲＣＩ（Ｍ２ マクロファージ）の定量的ＰＣＲで表される量をそれぞれ比較するグラフである。

【図3A-3H】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ、および３Ｈは、前記産物において、免疫蛍光標識により、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、ＤＰＰ４、ＩＣＡＭ１、およびＣＤ３１をそれぞれ強調した、産物ＥｘＡｄＥｘ－小葉の共焦点イメージングにより得られる写真である。

【図4A-4C】図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、本発明の方法により試験した５つの異なる増殖培地でのヒト脂肪細胞幹細胞における低酸素マーカーＣＡ９、ならびに本発明の方法により試験した分化因子で強化した５つの異なる増殖培地での分化した幹細胞におけるＰＬＩＮ１およびＵＣＰ１のそれぞれの存在を代表する図面である。

【図5A-5C】図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、それぞれ、分化培地が脂肪細胞への分化を可能にすること（図５Ａ）、デキサメタゾンおよびＩＢＭＸの存在下で内皮細胞にとって毒性である（図５Ｂ）が、これら化合物が上記培地から除去される場合、毒性ではない（図５Ｃ）ことをそれぞれ示す光学顕微鏡画像である。

【図6A-6B】図６Ａおよび６Ｂは、本発明に係る異なる分化培地におけるＰＬＩＮ１およびＵＣＰ１の発現を示す図面である。

【図7A-7C】図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、本発明に係る方法の実施の前（左の写真）、増殖培地において２０日後（中央の写真）、増殖培地において２０日後、その後分化培地において２０日後（ＩＣＡＭ１を除く）（右の写真（ＩＣＡＭ１を除く））での、脂肪組織におけるマーカーＣＤ３１（図７Ａ）、ＤＰＰ４（図７Ｂ）、およびＩＣＡＭ１（図７Ｃ）の存在に係る内皮細胞および脂肪組織の幹細胞の異なる集団の可視化を可能にする蛍光顕微鏡の画像を示す。

【図8A-8B】図８Ａおよび８Ｂは、本発明に係る方法による混合の前の、これら図面における間質性血管フラクションおよび「Ｅｎｄｏｓｔｅｍ」フラクションと呼ばれるフラクションを形成する細胞外マトリックスにおけるＤＰＰ４タンパク質およびＩＣＡＭ１タンパク質が、染色体に結合した抗体により標識された、蛍光顕微鏡画像を示す。

【図9A】図９Ａは、マトリックスＭ２がコラーゲンを多く含む種であること、ピクロシリウスレッドで標識したコラーゲン（薄灰色）および核の標識（白色）を蛍光顕微鏡により示す。

【図9B】図９Ｂは、マトリックスＭ３が線維種であること、ピクロシリウスレッドで標識したコラーゲン（薄灰色および白色の線維）、ならびに核の標識（白色）を蛍光顕微鏡により示す。

【図9C】図９Ｃは、顕微鏡において、マトリックスＭ１の線維種を特徴づける。

【図9D】図９Ｄは、マトリックスＭ２がマトリックスの種類：線維種およびコラーゲンを多く含む種の観点から異種であることを顕微鏡により示す。

【図9E】図９Ｅは、マトリックスＭ３の線維種を示す顕微鏡画像である。

【図10A】図１０Ａは、マトリックスＭ４を含む機械的な解離の後のフラクションＡから遠心分離された脂肪組織の写真である。

【図10B】図１０Ｂは、マトリックスＭ４におけるオイルレッドＯ（薄灰色）の着色による成熟脂肪細胞およびＩ型コラーゲンを標識（非常に薄い灰色）することによるコラーゲンリッチマトリックスを蛍光顕微鏡により強調している。

【図10C】図１０Ｃは、ＣＤ３１イムノ標識により、Ｍ４マトリックスにおけるＣＤ３１＋内皮細胞により形成される毛細管構造（白色）；核の標識（濃灰色）を示す。

【図10D】図１０Ｄは、マトリックスＭ４におけるＰＤＧＦＲａ＋脂肪組織の幹細胞アレイの存在（薄灰色のドット）；核の標識（濃灰色）を表す。

【図11】図１１は、増殖中の細胞の核へのＥｄｕ、５－エチニル（ｅｔｈｙｌｎｙｌ）２’－デオキシウリジンの組み込みにより、内在性細胞が、本発明の細胞外マトリックスにおいて、懸濁液のＥＧＭ＋（商標）培地での増殖にて維持されること；核（濃灰色）、増殖している細胞（白色）、マトリックスの自己蛍光（薄灰色）を示す。

【図12】図１２は、本発明の細胞外マトリックスと共培養した外来性脂肪組織の幹細胞が、マトリックスに存在する脂肪組織のこれら幹細胞および内在性細胞から構成される構造を形成すること；３日間の共培養の後に撮影された画像、核（濃灰色）、コラーゲン（薄灰色）、脂肪組織の外来性幹細胞（薄灰色／白色）を示す。

【図13A】図１３Ａは、間質性血管フラクションに由来する、細胞外マトリックスを含まない懸濁液における脂肪組織の幹細胞および内皮細胞の細胞培養の間の細胞増殖の不存在；１０日間の共培養後に撮影された画像；核（濃灰色）、増殖している細胞の核（非常に薄い灰色）を示す。

【図13B】図１３Ｂは、本発明の細胞外マトリックスを含む懸濁液における間質性血管フラクションの細胞増殖能；１０日間の共培養の後に撮影された画像；核（濃灰色）、コラーゲンマトリックス（薄灰色）、Ｅｄｕ標識による増殖している細胞の核（白色）を示す。

【図14A】図１４Ａは、本発明の細胞外マトリックスを含む懸濁液（右）および含まない懸濁液（左）での培養により得た分化した細胞集団における内皮細胞マーカーＣＤ３１の発現レベルを示す。

【図14B】図１４Ｂは、本発明の細胞外マトリックスを含む懸濁液（右）および含まない懸濁液（左）での培養により得た分化した細胞集団における脂肪細胞幹細胞マーカーＰＤＧＦＲａの発現レベルを示す。

【図14C】図１４Ｃは、本発明の細胞外マトリックスを含む懸濁液（右）および含まない懸濁液（左）での培養により得た分化した細胞集団における成熟脂肪細胞マーカーＰＬＩＮ１の発現レベルを示す。

【図14D】図１４Ｄは、本発明の細胞外マトリックスを含む懸濁液（右）および含まない懸濁液（左）での培養により得た分化した細胞集団における成熟脂肪細胞マーカーアディポネクチンの発現レベルを示す。

【図15A-15B】図１５Ａおよび１５Ｂは、本発明に係る方法の増殖能の活性化を強調する画像である。図１５Ａでは、解離していない脂肪組織は、増殖している細胞を示さない。図１５Ｂでは、本組成物は増殖している細胞を示し、増殖している細胞の核は、この図面では白色で表されている。

【図16A-16F】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄ、１６Ｅ、および１６Ｆは、増殖培地での２０日間の培養後の、間質性血管フラクションの不存在下（図１６Ａ、１６Ｃ、１６Ｅ）のＥｎｄｏｓｔｅｍマトリックスと呼ばれるマトリックスおよびこの間質性血管フラクションを添加した（図１６Ｂ、１６Ｄ、１６Ｆ）Ｅｎｄｏｓｔｅｍマトリックスと呼ばれるマトリックスに含まれる増殖している細胞が標識されている画像である。

【図17A-17F】図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｅ、および１７Ｆは、単離した間質性血管フラクションで濃縮されているジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）の発現、ならびに単離したマトリックスで濃縮されるＩＣＡＭ１およびＣＤ３１の発現（図１７Ａ、１７Ｃ、１７Ｅ）、ならびに増幅した組成物におけるＤＰＰ４、ＩＣＡＭ１、およびＣＤ３１の発現（図１７Ｂ、図１７Ｄ、１７Ｆ）を示す。

【図18】図１８は、本発明に係る方法における脂肪組織の細胞外マトリックスの中のマーカーＤＰＰ４を有する細胞の増殖能（陽性Ｅｄｕ）を示す４つの写真から構成されている。

【図19】図１９は、マーカーＤＰＰ４を示す細胞集団（図面の上部３つの写真）またはこのマーカーＤＰＰ４を示さない細胞集団（下部の３つの写真）の褐色またはベージュ脂肪細胞へ分化する特性を示す写真から構成されている。

【図20A-20B】図２０Ａおよび２０Ｂは、マーカーＰＬＩＮ１（図２０Ａ）およびマーカーＵＣＰ１（図２０Ｂ）のリアルタイムでの定量ＰＣＲにより得られる、ＤＰＰ４を発現するかまたは発現しない細胞集団の褐色またはベージュ脂肪細胞へ分化する特性を示すグラフである。

【図21A-21B】図２１Ａおよび２１Ｂは、本発明に係る増幅した組成物における、Ｍ１型マクロファージおよびＭ２型マクロファージのそれぞれの存在を示す。

【図22】図２２は、本発明に係る細胞外マトリックスにおける特定のタンパク質の存在、および毛細管ネットワークの保存を示す写真のセットを含む。

【図23】図２３は、０日目、すなわち増幅した産物ＥｘＡｄＥｘ－組織の移植前、および２１日目の、マウスに移植した後の産物ＥｘＡｄＥｘ－組織における、ヒトＵＣＰ１の相対発現を示す。

【図24】図２４は、３つの蛍光顕微鏡写真を示しており、左の写真は、本発明の方法の実施前の白色脂肪細胞の中の褐色／ベージュ脂肪細胞の不存在を示し、中央の写真は、増幅および分化の方法の後の、ＵＣＰ１タンパク質の、過体重の個体におけるｅｘ ｖｉｖｏでの発現により薄灰色に特異的に標識された褐色／ベージュ脂肪細胞の存在を示し、右の写真は、重篤な肥満を有する患者における、本発明の実施の後の、ｅｘ ｖｉｖｏでの褐色／ベージュ脂肪細胞の存在を示す。

【図25A-25C】図２５Ａ、２５Ｂ、および２５Ｃは、塩化アンモニウムを含むＡＣＬと呼ばれる１×溶解バッファーでインキュベートした直後（図２５Ａ）、接着培養条件下での２４時間の培養の後（図２５Ｂ）および５日後（図２５Ｃ）の、間質性血管フラクションの精製後の脂肪組織の幹細胞のバイアビリティを示す。

【図26A-26D】図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、および２６Ｄは、塩化アンモニウムを含むＡＣＬと呼ばれる１×溶解バッファーでの異なる回数の処置後の生細胞および死細胞の数のフローサイトメトリー分析のグラフでの結果を示す。

【図27A-27C】図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃは、塩化アンモニウムを含むＡＣＬと呼ばれる１×溶解バッファーでインキュベートした直後（図２７Ａ）、接着培養条件下での２４時間の培養の後（図２７Ｂ）および５日後（図２７Ｃ）の、間質性血管フラクションの精製後の脂肪組織の内皮細胞のバイアビリティを示す。

【図28】図２８は、細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる決定により得られる、本発明のＥｘＡｄＥｘ法により増幅した脂肪組織の幹細胞のプロファイルを示す。

【図29A-29B】図２９Ａおよび２９Ｂは、フローサイトメトリーにより得た細胞表面マーカーを決定することにより得られたｅｘ ｖｉｖｏでの脂肪組織（図２９Ａ）および増幅したＥｘＡｄＥｘ産物（図２９Ｂ）のＡＳＣのプロファイルを示す。

【図30A-30C】図３０Ａ、３０Ｂ、および３０Ｃは、本発明に記載される増殖培地（図３０Ａ）、本発明に記載される分化培地（図３０Ｂ）、ならびにＤＭＥＭおよび血清を含む最適化されていない標準的な分化培地（図３０Ｃ）で培養したヒト脂肪組織から単離した内皮細胞を示す。

【図31】図３１は、ヌードマウスへの移植後（移植から４週間後）の本発明に記載される組成物の機能的な血管網の白色での可視化を有する。

【図32】図３２は、間質性血管フラクションの添加を含まない方法（Ａ）および精製した後に本発明において間質性血管フラクションとも称される下澄液（ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ）から単離した細胞の添加を含む方法（Ｂ）による、脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のバイアビリティおよび増幅能の比較を示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明を行うために、脂肪組織が提供される。これは実際に、個体、たとえば限定するものではないが過体重の個体、特に肥満、ならびに／または２型糖尿病および心血管疾患などの代謝性障害を有する個体由来の、脂肪組織、たとえば白色脂肪組織である。

【0026】

本発明の第１の目的は、脂肪組織、たとえば白色のヒト脂肪組織からの褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法であって、
一方で、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むヒト脂肪組織から機械的間質性血管フラクションと呼ばれる間質性血管フラクションを抽出（図１Ａ、ステップ１～２および図１Ｂ、ステップ１～３およびステップ５）、他方で前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスを抽出（図１Ａ、ステップ３および図１Ｂ、ステップ４）するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織の幹細胞、およびコラーゲンを含み、前記細胞外マトリックスの抽出が、機械的な解離ステップ（図１Ａ、ステップ３および図１Ｂ、ステップ４）を含むステップと、前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスを混合するステップ（図１Ａ、ステップ４および図１Ｂ、ステップ６）と、先行するステップで得た混合物を、細胞増殖培地と呼ばれる培養培地の懸濁液で培養するステップとを含む、方法である。この方法はまた、以下で（ｅｘ ｖｉｖｏでの脂肪細胞の増殖では）「ＥｘＡｄＥｘ法」とも呼ばれる。

【0027】

本発明の意味の中で、用語「間質性血管フラクション」は、ヒト脂肪組織のサンプルに存在する細胞を意味する。この間質性血管フラクションは、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含む。本発明に係る間質性血管フラクションは、下澄液とも呼ばれており、好適には、図１Ｂに記載のステップ２および３から生じ、ＤＰＰ４＊細胞を多く含む。

【0028】

本発明の意味の中で、用語「細胞外マトリックス」は、生体活性マトリックス、すなわち脂肪組織の異なるタンパク質（図２２）、特に内皮細胞を含む内在性細胞（図１０Ｃ）、脂肪組織の幹細胞（図１０Ｄ）、脂肪細胞およびマクロファージを含むマトリックスを意味する。図１１は、細胞外マトリックスで増殖している細胞の存在を示す（白色で標識されているＥｄｕ）。この細胞外マトリックスは、３Ｄ細胞増幅を可能にし、すなわち３次元での細胞の増幅を可能にする。本発明の細胞外マトリックスはまた、本明細書中以下で「ＥｎｄｏＳｔｅｍ－マトリックス」とも表される。

【0029】

脂肪組織の細胞外マトリックスのタンパク質は、コラーゲンを含む。このコラーゲンは、構造化されている。これは、原線維構成を有する。これは、特にＩ型およびＩＩＩ型のコラーゲンである（ピクロシリウスレッドで標識された繊維状コラーゲン線維を示す図９Ａおよび９Ｂ、ならびに抗コラーゲン抗体により標識され共焦点顕微鏡により観察されるＩ型コラーゲンを示す図１０Ｂを参照されたい）。脂肪組織の細胞外マトリックスのタンパク質は、特に、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、およびＩＶ型コラーゲンをさらに含む（図２２）。

【0030】

細胞外マトリックスの抽出は、非酵素的な解離ステップを含み、特に細胞外マトリックスの抽出は、機械的な解離ステップを含む。本発明の「機械的な解離」は、細胞外マトリックスの構造をインタクトなままにすることを可能にし、対して酵素的消化は、一般に、これを消化するコラゲナーゼを含む。よって、機械的な解離は、「脈管構造」の維持を可能にし、これは図７Ａに示されており、ここで血管網は、左の写真においてヒト脂肪組織の解離前に出現しており、ならびに中央の写真で解離および増幅後の血管網が示されている。さらにこの機械的な解離は、細胞外マトリックスのミクロ構造の維持を可能にし、結果としてｉｎ ｖｉｖｏでの脂肪組織の組織に類似する組織を有する。

【0031】

間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの抽出は、以下の、
ヒト脂肪組織を遠心分離して、少なくとも２つの異なるフラクション、遠心分離された細胞外マトリックスを含むフラクションＡおよび間質性血管フラクションを得るステップと、
フラクションＡを機械的に解離して細胞外マトリックスを得るステップと
を含む（図１Ａ）。

【0032】

ヒト脂肪組織の遠心分離のステップは、油の除去に加えて、提供されるヒト脂肪組織に含まれる血液および麻酔性の液体の除去を可能にする。またこのステップは、提供されるヒト脂肪組織の予備洗浄からもたらされる生理液の除去を可能にする。

【0033】

特定の実施形態では、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの抽出は、以下の、ヒト脂肪組織を遠心分離して、少なくとも２つの異なるフラクション、遠心分離された細胞外マトリックスを含むフラクションＡならびにヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むフラクションＢを得るステップと、
フラクションＡを機械的に解離して解離した細胞外マトリックスを含むフラクションＡ’を得るステップと、
フラクションＡ’を遠心分離して少なくとも細胞外マトリックスならびにヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むフラクションＢ’を得るステップと、
フラクションＢおよびＢ’を混合して、機械的間質性血管フラクションを得るステップと
を含む（図１Ｂ）。

【0034】

この実施形態では、ヒト脂肪組織を遠心分離するステップはさらに、提供される脂肪組織に含まれる油、血液、および麻酔性液体を除去することを可能にする。またこのステップは、提供されるヒト脂肪組織の予備洗浄からもたらされる生理液を除去することを可能にする。フラクションＡ’の遠心分離はまた、全ての油および生理液の残渣を除去することを可能にする。このフラクションＡ’を遠心分離するステップは、任意である。

【0035】

特定の実施形態では、本発明に係る方法は、血液細胞を排除するステップをさらに含む。これは、脂肪組織、およびＥｘＡｄＥｘと呼ばれる機械的解離法の上述のステップの間に得られる機械的ＳＶＦと呼ばれる異なる細胞ペレットに存在する赤血球型の血液細胞の排除である。この排除ステップは、無菌化した水で希釈した塩化アンモニウムを含む１×溶解バッファー（「塩化アンモニウム溶解溶液」、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（商標）－ＡＣＬと呼ばれる）での脂肪組織および／または細胞ペレットの１：１～１：１０の範囲の、バッファー：サンプル比、５～３０分間の範囲のインキュベーション時間の間、４～３７℃の温度でのインキュベーションの間に行われる。このステップは、赤血球の溶解を可能にする。図２５Ａ、２５Ｂ、および２５Ｃ、ならびに図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、および２６Ｄは、ＬＣＤ処置の脂肪組織の幹細胞に及ぼす効果を示す。この、５分超の期間にわたるＡＣＬでのインキュベーションの結果は、下澄液に含まれる幹細胞のバイアビリティおよび増殖能にダメージを与える。さらに、図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃは、下澄液に含まれる脂肪組織の内皮細胞のバイアビリティおよび増殖能に及ぼすＡＣＬでのインキュベーションの効果の欠如を示す。

【0036】

間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスの混合物の培養は、以下の、
前記混合物を、無菌にて、増殖培地を含む懸濁培養バッグに移すステップと、
前記混合物を増幅させて、細胞クラスターを形成するステップと
を含む。

【0037】

「無菌」での移動は、本発明の意味の中で、好ましくは閉鎖したシステムで行われる、移動である。この移動は、無菌にて、細胞培養の間の混入物質の存在を回避することを可能にする。増幅の間に形成される細胞クラスターの機械的な解離は、システムの開口を必要とせず、よって環境の要素による培養物のコンタミネーションへの細胞産物の曝露を回避する。

【0038】

一実施形態では、懸濁培養バッグ中の増殖培地は、ＥＧＭ＋（商標）培地である。この増殖培地は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性増殖因子（ＦＧＦ２）、インスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子１６５、アスコルビン酸、ヘパリン、およびヒドロコルチゾンで強化した（ＥＧＭ＋）内皮細胞増殖のための基本培地（ＥＧＭ）を含む。ＥＧＭ＋培地はまた、脂肪細胞幹細胞の増幅を、脂肪細胞へ分化するその特性を変えることなく可能にする。

【0039】

本発明の方法は、１０超、好適には２０超、特には３０超、好ましくは３５超である増幅係数で、脂肪組織の幹細胞の数の増幅を可能にする。この増殖係数は、前記細胞外マトリックスの存在下で単離したＳＶＦの培養後に得た細胞の数と、本発明の前の細胞の数との間の比である。実施例２に記載される特定の実施形態では、本発明の方法は、８日で３６からの増幅係数を有する。

【0040】

第２の目的では、本発明は、褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法であって、以下の、
上記に定義されるヒト脂肪組織の幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで増幅するステップと、
脂肪組織の幹細胞の分化を誘導して、褐色またはベージュ脂肪細胞を得るステップと
を含む。言い換えると、第２の目的では、本発明は、褐色またはベージュ脂肪細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで得るための方法であって、以下の、上記に定義されるようにヒト脂肪組織の幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで増幅するステップと、脂肪組織の幹細胞の分化を誘導して、褐色またはベージュ脂肪細胞を得るステップとを含む。

【0041】

よって、より具体的には、褐色またはベージュ脂肪細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法は、以下の、
一方で、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むヒト脂肪組織から間質性血管フラクションを、他方で、前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織の幹細胞、およびコラーゲンを含む、ステップと、
前記機械的間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、細胞増殖培地の懸濁液で培養するステップと、
脂肪組織の幹細胞の分化を誘導して、褐色またはベージュ脂肪細胞を得るステップと
を含む。よって言い換えると、褐色またはベージュ脂肪細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで得るための方法は、以下の、
一方で、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むヒト脂肪組織から間質性血管フラクションを、他方で前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞、およびコラーゲンを含む、ステップと、
前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、細胞増殖培地の懸濁液で培養するステップと、
脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞の分化を誘導して、褐色またはベージュ脂肪細胞を得るステップと
を含む。

【0042】

分化した細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法は、脂肪組織の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅に関連するステップを含み、脂肪組織の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のため方法の上記に提供される詳細はまた、分化した細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法にも当てはまる。言い換えると、褐色またはベージュ脂肪細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで得るための方法は、脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅に関連したステップを含み、脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法はまた、褐色またはベージュ脂肪細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで得るための方法にも当てはまる。

【0043】

特に、細胞外マトリックスの抽出は、非酵素的な解離ステップを含み、特に細胞外マトリックスの抽出は、機械的な解離ステップを含む。

【0044】

一実施形態では、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの抽出は、以下の、
ヒト脂肪組織を遠心分離して、少なくとも２つの異なるフラクション、遠心分離した細胞外マトリックスを含むフラクションＡおよび間質性血管フラクションを得るステップと、
フラクションＡを機械的に解離して細胞外マトリックスを得るステップと
を含む。

【0045】

別の実施形態では、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの抽出は、以下の、
ヒト脂肪組織を遠心分離して、少なくとも２つの異なるフラクション、遠心分離した細胞外マトリックスを含むフラクションＡ、ならびにヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むフラクションＢを得るステップと、フラクションＡを機械的に解離して、解離した細胞外マトリックスを含むフラクションＡ’を得るステップと、フラクションＡ’を遠心分離して、少なくとも細胞外マトリックスならびにヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織の幹細胞を含むフラクションＢ’を得るステップと、フラクションＢおよびＢ’を混合して間質性血管フラクションを得るステップと
を含む。

【0046】

細胞外マトリックスのコラーゲンは、ピクロシリウスレッド染色により明らかとなるＩ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンを含む（図９Ａおよび９Ｂを参照）。

【0047】

本発明に係る方法の特定の実施形態では、前記方法は、ＣＤ２６とも呼ばれる表面マーカーＤＰＰ４を発現する幹細胞をソーティングすることを目的とするセルソーティングステップをさらに含む。見込みのあるバリアントは、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスを混合した後であるが、前記混合物を細胞増殖培地の懸濁液で培養する前の、主にＥｘＡｄＥｘ法と呼ばれる方法の前に、ＣＤ２６／ＤＰＰＥを発現する細胞を選択／ソーティングすることで構成される。この目的は、特に、褐色またはベージュ脂肪細胞の前駆体細胞で使用される産物を強化すること、ならびに他方で、増幅される細胞産物の組成物をホモジナイズおよび標準化することである。

【0048】

実際に、表面マーカーＣＤ２６の存在によりソーティングされたヒト脂肪組織の幹細胞のソーティングは、表面マーカーＣＤ２６を発現した細胞が、好ましくは褐色／ベージュ脂肪細胞に分化する特性を有することを強調している。図２０Ａは、ＤＰＰ４＋集団およびＤＰＰ４－集団が、全て、マーカーＰＬＩＮ１の発現により脂肪細胞へと分化する特性を有することを示している（図２０Ａ）。しかしながら、ＤＰＰ４＋集団のみが、褐色／ベージュ脂肪細胞マーカーＵＣＰ１を発現する脂肪細胞へと分化している（図２０Ｂ）。図１９での図示は、ＵＣＰ１タンパク質の蛍光イメージングにより、ＵＣＰ１タンパク質が、ＤＰＰ４＋を発現する脂肪組織の幹細胞でのみ発現され、脂肪生成培地で分化したことを示している。ソーティングした細胞の培養後に得られる産物の使用は、主に、肥満および代謝性疾患の細胞療法の適用に関連しているが、この種の制御された組成物産物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用もまた可能である。セルソーティングの方法形式は、このタンパク質を発現する細胞を同定するためのＤＰＰ４に特異的な抗体結合に基づく。第１の分離技術は、蛍光色素と結合した抗体を結合することから構成され、ソーティングは、少なくとも４つの異なる細胞集団を分離できる高スループットサイトメーター／セルソーターである自動化セルソーティングプラットフォーム（Ａｒｉａ ＩＩＩ（商標）型、ＢＤ）で行う。他の方法は、磁場で目的の細胞の保持を可能にする磁気ボールと結合した抗体の使用に基づく免疫磁性セルソーティングに関する（ｃｌｉｎｉＭＡＣｓ（商標）型技術， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（商標））。これら２つの技術は、最終産物における目的の細胞産物の高度の均一性（＞９５％）を可能にすることができる。これら技術は全て、プラットフォームを適合させることを条件として細胞療法の適用のＧＭＰ条件下で行われるソーティングと適合可能である（磁気ソーティング用のＡｕｔｏｍａｔｅ ＣｌｉｎｉＭａｃｓＴ（商標）、ＧＭＰ ｓｏｒｔｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）。

【0049】

本発明の一実施形態では、前記間質性血管フラクションおよび前記細胞外マトリックスの混合物の培養は、以下の、
前記混合物を、無菌にて、培養培地を含む懸濁培養バッグに移すステップと、
前記混合物を増幅させて、細胞クラスターを形成するステップと
を含む。

【0050】

機械的なＳＶＦフラクションおよびマトリックスフラクションの混合物の増幅からもたらされる産物は、「ＥｘＡｄＥｘ－組織」と呼ばれ得る。本方法の終了時のさらなるステップでの凝集物の形成からもたらされる産物は、「ＥｘＡｄＥｘ－小葉」と呼ばれ得る。これら産物は、図１Ｃにまとめられている。産物ＥＸＡＤＥＸ－小葉は、本発明に係る方法のさらなるステップで得ることができる産物である。共培養ステップの終了時に、産物は、培養フラスコ中のＥＧＭ＋増殖培地で上述のように増幅される。次にこれは、増幅された産物ＥｘＡｄＥｘ－組織を構成する。図１Ｄに示されるように、この増幅された産物は、撹拌または撹拌せずに、６ウェル、１２ウェル、または２４ウェルの非接着性ＵＬＡ（Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）培養プレートの中の増殖培地、特にはＥＧＭ＋増殖培地に移される。その後、凝集物の形成が観察される、これらは、記載の条件下で３～１０日後の産物ＥｘＡｄＥｘ－組織にて記載された全ての特徴を含む。これら特徴は、ヒト脂肪組織の幹細胞、内皮細胞、および細胞外マトリックスの成分の存在により定義される。この産物はまた、成熟脂肪細胞およびマクロファージの存在により性質決定される。分子マーカーのうち、図２Ａ～２Ｋに示されるように、マーカーＣＤ３１、ＤＰＰ４、ＩＣＡＭＩ、ＦＤＧＦＲＡ、ＰＬＮＩ１、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、ＩＬ１Ｂ、およびＭＲＣＩ１が見出される。これら図面は、同等の方法で産物ＥｘＡｄＥｘ－組織およびＥｘＡｄＥｘ－小葉で見出される、上述のマーカーの発現の比較を示す。ＭＳＣＡ１の発現のみが、２つの産物間で異なり、産物ＥｘＡｄＥｘ－組織と比較したＥｘＡｄＥｘ－小葉の分子シグネチャーを構成する。ＥｘＡｄＥｘ－小葉に存在するタンパク質の性質決定はまた、共焦点蛍光顕微鏡によりなされ、脂肪組織の細胞外マトリックスの主要なタンパク質、特にＩ型コラーゲン（図３Ａ）およびＩＶ型コラーゲン（図３Ｂ）、同様にフィブロネクチン（図３Ｃ）、ラミニン（図３Ｄ）、エラスチン（図３Ｅ）、および脂肪組織の幹細胞のマーカーＤＰＰ４（図３Ｆ）、ＩＣＡＭ１（図３Ｇ）、ならびに内皮細胞マーカーＣＤ３１（図３Ｈ）の存在を示す。産生される単位は、産物ＥｘＡｄＥｘ－組織よりも均一な大きさであり、分子のスクリーニングの観点から製薬業界により使用される標準に適合される。産物ＥｘＡｄＥｘ－小葉はまた、細胞療法の観点からシリンジ注射に良好に適合される。これら産物ＥｘＡｄＥｘ－小葉の単位は、異なる増幅時間、たとえば１０日間の増幅および最大４０日間で、産物ＥｘＡｄＥｘ－組織から産生され得る。これら凝集体は、形成されると、もはや増幅能を有さないが、１０日超の培養でバイアビリティを有する。ＥｘＡｄＥｘ－小葉の単位は、白色脂肪細胞の産物範囲に維持され得、または分化に誘導され得、または褐色またはベージュ脂肪細胞に分化され得る。

【0051】

最終的に、本発明に係る方法は、３Ｄの活性細胞外マトリックスにて維持される、褐色またはベージュ脂肪細胞幹細胞（ｈＡＳＣ）を増幅して、脂肪組織の微小環境の生細胞、すなわち内皮細胞（ｈＥＣ）ならびにＭ１およびＭ２のマクロファージを維持することを可能にしながら、これらを褐色またはベージュ脂肪細胞へ分化させることを目的とする（図２１Ａ、２１Ｂ）。この目的のため、ｈＥＣの増殖および分化のために従来より使用される培養培地が、ｈＥＣに毒性であり、ｈＥＣの増殖のために従来より使用される培養培地が、ｈＡＳＣ分化の阻害剤であるため、培養培地が開発されている。よって、２つの培養培地が、確立された：ｈＡＳＣの増殖を可能にする増殖培地、および増幅したｈＡＳＣのマーカーＵＣＰ１を発現する脂肪細胞への分化を可能にする分化培地。これら２つの培養培地の独創性は、これらがヒト脂肪組織の内皮細胞の維持とも適合可能であることである。

【0052】

１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭと呼ばれる培地（ダルベッコ（商標）改変イーグル培地）は、ｈＡＳＣの増殖のための参照培地である。しかしながら、この培地は、内皮細胞を生きたままにすることはない。増殖培地を判定するために、一般にヒト内皮細胞の増殖のために販売されている５つの培地を試験した。これらは、以下の培地であった：
Ｎｏ．１：Ｅｎｄｏ－ＢＭ ＥＰＣ：ＰｒｅｐｏＴｅｃｈ（商標）ｃｏｍｐａｎｙにより販売（製品参照記号：Ｃａｔ：ＧＳ－ＥＰＣ）
Ｎｏ．２：ＰｒｅｐｏＴｅｃｈ（商標）ｃｏｍｐａｎｙにより販売されるＥｎｄｏ－ＢＭ ＭａｃｒｏＶ（製品参照記号：Ｃａｔ：ＧＳ－ＭａｃｒｏＶ）
Ｎｏ．３：ＰｒｅｐｏＴｅｃｈ（商標）ｃｏｍｐａｎｙにより販売されるＥｎｄｏ－ＢＭ ＭｉｃｒｏＶ（製品参照記号：Ｃａｔ：ＧＳ－ＭｉｃｒｏＶ）
Ｎｏ．４：Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（商標）ｃｏｍｐａｎｙにより販売されるＥＧＭ＋（製品参照記号：Ｃａｔ：ＣＣ－２２０１１ ｐｌｕｓ Ｃ－３９２１６）
Ｎｏ．５：Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（商標）ｃｏｍｐａｎｙにより販売されるＭＶ２（製品参照記号：ＣＣ－３９２２６ ｐｌｕｓ Ｃ－２２０２２Ｂ）。

【0053】

２Ｄ培養では、これら５つの培地は、参照培地と同じ効率でヒト脂肪組織の幹細胞の増殖を可能にする。しかしながら、増殖培地Ｎｏ．４、すなわちＥＧＭ＋は、図４Ａに示されるように、特に他の試験した培地とは異なり、ｈＡＳＣが３Ｄ懸濁液にある場合に、ＥＧＭ＋が細胞の低酸素を、その後低酸素マーカーＣＡ９を誘導しないことから、選択された。

【0054】

ＥＧＭ＋増殖培地の組成は、以下の通りである：２％のＦＣＳ；５ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ）；１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２－線維芽細胞増殖因子２）；２０ｎｇ／ｍｌのｌｏｎｇ Ｒ３ インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）；ＩＦ／ｍｌの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）１６５；１μｇ／ｍｌのアスコルビン酸；２２．５μｇ／ｍｌのヘパリン；０．２μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを補充した内皮細胞増殖培地（内皮細胞の増殖）。

【0055】

分化培地を決定するために、異なる培地を試験した。これら培地は、脂肪生成因子で強化し、次に、ｈＡＳＣの分化に関して試験した。これら結果は、培地Ｎｏ．１～３とは異なり、脂肪生成因子を補充したＥＧＭ＋が、図４Ｂに示されるように、脂肪細胞の分化を可能にすることを表した（これは脂肪細胞マーカーＰＬＮ１の発現により決定される）。しかしながら、褐色／ベージュ脂肪細胞の特異的なマーカーＵＣＰ１の発現は非常に少なく、これは図４Ｃに示されている。よって、この最初のＥＧＭ＋分化培地４は、最適化されていない。また、培地ＮＯ．５は、さらには追及されていないＥＧＭ＋に対する選択肢であることに留意されたい。

【0056】

よって、最適化されていない増殖培地の組成は、好適には、脂肪細胞因子を補充した上述のもの、すなわち、２％のＦＣＳ；５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ；１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；２０ｎｇ／ｍｌのｌｏｎｇ Ｒ３ １ＧＦ；０．５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ因子１６５；１μｇ／ｍｌのアスコルビン酸；２２．５μｇ／ｍｌのヘパリン；０．２μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン：２μＭのロシグリタゾン；１ｎＭのＴ３；２．５μｇ／ｍｌのインスリン；０．２５Ｍのデキサメタゾン；５００μＭのＩＢＭＸ、非特異的なホスホジエステラーゼ阻害剤を補充したＥＧＭである。

【0057】

最適化されていない上述の分化培地は、好適には、以下の方法で最適化される。まず、ｈＡＳＣの分化を増大させるためにＥＧＦおよびヒドロコルチゾンを除去する（両化合物は、ＵＣＰ１の発現を阻害できると文献に記載されている）。次に、ｈＥＣのバイアビリティを維持するためにデキサメタゾンおよびＩＢＭＸを除去する：図５Ａに示されるように、分化培地は、脂肪細胞への分化を可能にするが、ｈＥＣ（内皮細胞－図５Ｂ）に対しては毒性である。しかしながら、最初の３日後に分化カクテルのデキサメタゾンおよびＩＢＭＸを除去することは、ｈＥＣのバイアビリティの維持を可能にする（図５Ｃ）。次に、再度、脂肪細胞への分化のためのデキサメタゾンおよびＩＢＭＸの除去を補うために化合物ＳＢ４３１５４２を添加する：最初の３日後に分化カクテルからデキサメタゾンおよびＩＢＭＣを除去する影響は、脂肪細胞（ＰＬＩＮ１）への分化の減少である。ＴＧＦｂ経路阻害剤のＳＢ４３１５４２の添加は、図６ＧＡに示されるように分化の修復を可能にする。ＳＢ４３１５４２は、ｈＥＣのバイアビリティに関する結果を有さない。最後に、ＳＢ４３１５４２の添加およびロシグリタゾンの維持は、図６Ｂに示されるように、ＵＣＰ１の発現を可能にする。さらに、ロシグリタゾンの存在は、ロシグリタゾンが最初の３日間のみ存在する場合この発現は非常に低いため、特に好適である。

【0058】

よって、最適化した分化培地の最終的な組成は、好適には以下の通りである：０．１％～５％、好ましくは２％のＦＣＳ；２ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；１０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌのｌｏｎｇ Ｒ３ ＩＧＦ－１；０．１ｎｇ／ｍｌ～１ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５；０．５μｇ／ｍｌ～２μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌのアスコルビン酸；０．５μＭ～４μＭ、好ましくは２μＭのロシグリタゾン；０．５ｎＭ～１０μＭ、好ましくは１ｎＭのＴ３；０．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、好ましくは２．５μｇ／ｍｌのインスリン；０．１μＭ～０．５００μＭ、好ましくは０．２５μＭのデキサメタゾン；１００μＭ～８００μＭ、好ましくは５００μＭの３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）；１μＭ～１０μＭ、好ましくは５μＭのＳＢ４３１５４２を補充したＥＧＭ。

【0059】

この分化培地は、デキサメタゾンおよびＩＢＭＣを含む第１の分化培地である。しかしながらこれら化合物は、おおよそ分化の最初の３日間のみ存在する。組成が上述の第１の分化培地と一致するが、デキサメタゾンおよびＩＢＭＸを含まない第２の分化培地が使用される。

【0060】

よって、この第２の分化培地の最終的な組成は、たとえば以下の通りである：０．１％～５％、好ましくは２％のＦＣＳ；２ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；１０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌのｌｏｎｇ Ｒ３ ＩＧＦ－１；０．１ｎｇ／ｍｌ～１ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５；０．５μｇ／ｍｌ～２μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌのアスコルビン酸；０．５μＭ～４μＭ、好ましくは２Μｍのロシグリタゾン；０．５ｎＭ～１０μＭ、好ましくは１ｎＭのＴ３；０．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、好ましくは２．５μｇ／ｍｌのインスリン；１μＭ～１０μＭ、好ましくは５μＭのＳＢ４３１５４２。

【0061】

さらに、恐らくは、第１および／または第２の分化培地は、５μｇ／ｍｌ～５０μｇ／ｍｌ、たとえば２２．５μｇ／ｍｌのヘパリンおよび１μＭ～２０μＭ、たとえば１０μＭのＹ２７６３２を含む。

【0062】

図７Ａに示されるように、ｈＥＣは、増殖培地の組成において２０日、およびその後の分化培地の組成において２０日超の後に、常に検出可能である。この図面では、ＥＣは、マーカーＣＤ３１の発現により可視化されている。左の写真は、本発明に係る方法の実施前の脂肪組織の写真である。中央の写真は、増殖培地における２０日後のこの組織の写真である。右の写真は、増殖培地において２０日、次に分化培地において２０日後のこの組織の写真である。また図７Ｂは、ＤＰＰ４細胞が、増殖培地の組成において２０日、およびその後の分化培地の組成において２０日超の後に常に検出可能であることを示している。またこれは、２０日の共培養の後に増幅された組織において常に検出可能である脂肪細胞前駆体ＩＣＡＭ１でも有効である。

【0063】

分化培地において、他の組成で必要または使用できない因子：－Ｙ２７６３２は、懸濁液において細胞のバイアビリティを増大させると報告されている；－ヘパリン；－脂肪生成因子が、他の濃度で使用され得る。

【0064】

本発明の例示的な実施形態では、脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞の褐色またはベージュ脂肪細胞への分化は、ｉｎ ｖｉｖｏで誘導される。実際に、以下の実施例４は、本発明の方法により増幅された産物が、ヌードマウスへ移植された後に、脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞の褐色またはベージュ脂肪細胞への分化を可能にすることを示している。

【0065】

第３の目的では、本発明は、上記に定義された方法により得られる可能性のある単離された細胞外マトリックスであって、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞、およびコラーゲンを含む、単離された細胞外マトリックスに関する。言い換えると、細胞外マトリックスは、本発明の方法の抽出ステップの間に抽出され、よって、上述の細胞外マトリックスの全ての特徴を含む。

【0066】

コラーゲンは、Ｉ型の構造化されたコラーゲン、およびＩＩＩ型コラーゲンである（図９Ａおよび図９Ｂ）。細胞外マトリックスは、特にフィブロネクチンをさらに含む（図２２）。

【0067】

第４の目的では、本発明は、上記に定義した細胞外マトリックスおよび間質性血管フラクションの混合物を含む組成物であって、上記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織の血管網の内皮細胞、脂肪組織の幹細胞、およびコラーゲンを含み、上記間質性血管フラクションが、脂肪組織の血管網の内皮細胞および褐色またはベージュ脂肪組織の幹細胞を含む、組成物に関する。

【0068】

言い換えると、組成物は、本発明の方法の抽出ステップの間に抽出される細胞外マトリックスと、本発明の方法のこの同じ抽出ステップの間に抽出される間質性血管フラクションとを含む。よって、本組成物の細胞外マトリックスは、上述の細胞外マトリックスの全ての特徴を含む。よって、本組成物の間質性血管フラクションは、上述の間質性血管フラクションの全ての特徴を含む。

【0069】

コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンである。細胞外マトリックスは、フィブロネクチンをさらに含む（図２２）。

【0070】

間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの混合物の増幅の前に、本発明の方法により得られるこの組成物は、組織組成物である。この組成物は、成熟脂肪細胞をさらに含む。

【0071】

第５の目的では、本発明は、上記に定義した組成物、増殖培地、および分化培地を含むキットに関する。

【0072】

第６の目的では、本発明は、特に肥満ならびに／または関連する代謝性疾患、たとえば２型糖尿病および心血管疾患に対する、薬理学的な有効成分のスクリーニングおよび／または性質決定のための、上記に定義した細胞外マトリックスのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用または上記に定義した組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

【0073】

さらに本発明は、上記に定義した方法により得られるかまたは上記に定義した組成物に由来し、細胞療法における使用が意図されているかもしくはその使用のため、または代謝性障害の処置のための、褐色またはベージュ脂肪細胞に関する。用語「～に由来する」は、脂肪細胞が、褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞の分化により、組成物から生じる意味として理解すべきである。

【0074】

よって、本発明は、本発明の方法により得た組成物であって、褐色もしくはベージュ脂肪細胞または当該脂肪細胞の前駆体を含み、細胞療法における使用が意図されているかもしくはその使用のための、または代謝性障害の処置のための、組成物に関する。この組成物は、ヒト脂肪組織の組織組成物であり、本発明の方法により得られる全ての産物、すなわち、増殖後またはさらには分化後の、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの混合物を含む。

【0075】

褐色もしくはベージュ脂肪細胞または当該脂肪細胞の前駆体は、過体重または肥満の個体における肥満の処置のために使用され得る。この目的のため、一例では、サンプルは、個体の白色脂肪組織から採取される。その後、この採取された組織は、本発明の方法により処置されることにより、この例ではさらに、上述の産物ＥｘＡｄＥｘ－組織またはさらにはＥｘＡｄＥｘ－小葉が得られる。褐色またはベージュ脂肪細胞の前駆体幹細胞が増幅を経たこれら産物は、その後、好適には、褐色またはベージュ脂肪細胞への分化の対象である。次に、これら褐色またはベージュ脂肪細胞を含む産物は、たとえば白色脂肪組織の中または個体の当該組織の近くに移植される。褐色またはベージュ脂肪細胞を含む産物は、先行する段落に定義される組織組成物であることに留意されたい。別の実施形態では、褐色またはベージュ脂肪細胞は移植されないが、本発明の方法により増幅を経た褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞、言い換えると、増殖後の間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの混合物を含む上記に定義した組織組成物が移植され、成熟した白色またはベージュ脂肪細胞への分化は、移植された個体の身体で行われる。

【0076】

実施例
実施例１．機械的な抽出
ａ）プロセスの間の細胞およびマトリックス集団の性質決定のための機械的な抽出プロセス
ヒトドナー由来の脂肪組織サンプルからの、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの機械的な抽出が、以下のステップにより行われ得る（図１Ａおよび１Ｂ）。

【0077】

１．－２０ｋＰａでの陰圧で２ｍｍのコールマンカニューラを備えた１０ｃｃの無菌のシリンジでの吸引による脂肪組織の除去。

【0078】

２．異なる相を分離するために、シリンジを、回収チューブにて１６００ｒｃｆ（相対遠心力）、３分で遠心分離する。油の分画および血液の分画および麻酔液を除去する。Ｃ１と称されるペレット状の分画を保持する。

【0079】

３．１ユニットの生理食塩水をシリンジに注射し、撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートする。シリンジを、回収チューブにて１６００ｒｃｆにて３分間遠心分離する。生理的な液体の分画および油の分画を除去する。Ｃ２と称されるペレット状の分画を保持する。

【0080】

４．シリンジを、Ｔｕｌｉｐ（登録商標）型のコネクターにより接続された別の雄型ルアーロック型のシリンジに接続させて、乳化により組織の解離を行う。２．４ｍｍ、１．４ｍｍ、および１．２ｍｍの３種類のＴｕｌｉｐ（登録商標）コネクターが、３０の通路にわたり連続して使用される。

【0081】

５．１ユニットの生理食塩水をシリンジに注射し、撹拌しながら、３７℃で３０分間インキュベートする。シリンジを、回収チューブにて１６００ｒｃｆで３分間遠心分離する。生理的な液体の分画および油の分画を排除する。Ｃ３と称されるペレット状の分画を保持する。

【0082】

６．シリンジの中身ならびに血液細胞を以前に除去した回収チューブの中身Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３を、増殖段階のため３７℃にてＥＧＭ＋培養培地を含む培養バッグに無菌的接続を介して移す。

【0083】

組織解離の上記のステップ４の間、Ｔｕｌｉｐ（登録商標）のブランド以外のブランドのコネクターが使用され得る。使用されるコネクターの数は、１～５の間に含まれる。これらコネクターを介した通路の数は、１０～５０の間に含まれる。

【0084】

図１Ａは、ステップ２においてＣ１およびＣ２の集団、ならびにマトリックスＭ１およびＭ２を集めることを可能にする方法を示す。ステップ３では、集団Ｃ３ならびにマトリックスＭ３およびＭ４がグループ分けされている。

【0085】

ｂ）得られた細胞集団の性質決定
上述のプロセスは、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスを連続して抽出することを可能にする。細胞集団は、特に、蛍光顕微鏡、定量的ＰＣＲによる分子の性質決定、およびフローサイトメトリーにより、特徴づけられる。
得られた間質性血管フラクションは、マーカーＤＰＰの遺伝子発現のレベルにある大部分のＤＰＰ４＋型細胞（図１７Ａ）および顕微鏡によるＤＰＰ４タンパク質の観察（図８Ａ）により特徴づけられる。比較すると、ＩＣＡＭ１タンパク質は、ほとんど存在しない（図１７Ｃおよび図８Ｂ）。

【0086】

得られた細胞外マトリックスは、遺伝子発現レベルにある大部分のＩＣＡＭ１＋型細胞（図１７Ｃ）およびＣＤ３１＋細胞（図１７Ｅ）により特徴づけられる。この結果は、顕微鏡により観察されるＩＣＡＭ１タンパク質を発現する細胞の存在により確認される（図８Ｂ）。

【0087】

得られた増幅したＥｘＡｄＥｘ産物は、特に、ＣＤ２６＊型細胞により性質決定される（図２８）。特に、ｅｘ ｖｉｖｏでの脂肪組織および増幅されたＥｘＡｄＥｘ産物の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のプロファイルは、細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる決定により得られる。よって、本発明の方法はマーカーＣＤ２６を発現する細胞集団の、４％から５１％への増加を可能にすることが示されている（図２９Ａ）。マーカーＣＤ５４を発現する細胞は存在するが、本発明の方法により増幅されない（図２９Ｂ）。

【0088】

ｃ）本方法の異なるステップの間に得られるマトリックスＭ１～Ｍ４の性質決定
本明細書中Ｍ１と称される、ステップ２の間に得られるマトリックスは、線維型である（図９Ｃ）。

【0089】

本明細書中Ｍ２と称される、ステップ３の間に得られるマトリックスは、線維型であり、コラーゲンを多く含む（図９Ｄ）。このコラーゲンは、ピクロシリウスレッドにより明らかにされており（図９Ａ）、さらに、杆体様のコラーゲン構造を可視化させる。このマトリックスは、内在性細胞を含む。

【0090】

本明細書中Ｍ３と称される、ステップ５の間に得られ、回収チューブで単離されるマトリックスは、線維型である（図９Ｅおよび図９Ｂ）。またこのマトリックスは、内在性細胞を含む。単離されたマトリックスのコラーゲンは、図９Ｂにおいて、Ｉ型およびＩＩＩ型のコラーゲン線維を染色するピクロシリウスレッドにより明らかにされる。得られた赤色（図９Ｂでは灰色の影）は、コラーゲンが組織化されたままであること、すなわち、本発明のコラーゲンが常にαヘリックスの二次構造および三重ヘリックスの四次構造を有することを表している。これは分解されていない。実際に、組織化されていないコラーゲンは、ピクロシリウスレッドにより緑色に染色される。

【0091】

本明細書中Ｍ４と称される、ステップ５の間に得られ、シリンジに含まれるマトリックスは、成熟脂肪細胞の大部分およびＩ型コラーゲンのフレームワークから構成される（図１０Ｂ）。また、マトリックスＭ４は、ＣＤ３１＋内皮細胞（図１０Ｃ）および脂肪組織のＰＤＧＦＲａ＋幹細胞のネットワーク（図１０Ｄ）により形成される毛細管構造から構成される。

【0092】

ｄ）Ｃ１／Ｃ２下澄液（ｉｎｆｒａｔａｎｔ）の精製
Ｃ１およびＣ２の集団は、４～３７℃に含まれる温度で、５分～３０分まで変動するインキュベーション時間の間に１：１～１：１０の範囲のバッファー：サンプル比にて無菌水で希釈した、ＡＣＬと呼ばれる塩化アンモニウムを含む１×溶解バッファーにて細胞ペレットをインキュベートすることにより血液細胞を予め除去する。脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞に及ぼすこのＡＣＬ処置の効果を決定するために、フローサイトメトリー解析を行った。よって、合計１×１０^５個のヒト脂肪組織の幹細胞を、対照としての生理食塩水にて、または、１０容量の血液細胞溶解溶液にて異なる時間でインキュベートした。図２５Ａは、異なる組成物でのインキュベーション後の生細胞の数の観点からの直接的なバイアビリティを表す。図２５Ｂは、２４時間の培養後のバイアビリティを表し、図２５Ｃは、接着培養条件下で５日後の増殖能を有する（テューキーの事後検定、ｎ＝５で＊＜０．０５；＊＊＜０．０１；＊＊＊＜０．００１）。フローサイトメトリーによるこの解析の図画での結果は、図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、および２６Ｄに示されており、ＡＣＬでの異なる処置時間後の生細胞および死細胞の数の可視化を可能にする。生理食塩水溶液は、参照として取られている。これら図面において、ヨウ化プロピジウム染色により同定された、左の灰色のボックスに生細胞が表され、右のボックスに死細胞が表されている。この染色は、細胞膜が損傷した細胞にのみ浸透する性質を有する。同様に、脂肪組織の内皮細胞に及ぼす下澄液の精製の影響を決定するために、フローサイトメトリーによる別の解析を行った。よって、合計１×１０^５個のヒト脂肪組織の内皮細胞を、対照としての生理食塩水溶液において、または１０容量の血液細胞溶解溶液において異なる時間でインキュベートした。図２７Ａは、異なる組成物におけるインキュベーションの後の生細胞の数の観点からの直接的なバイアビリティを表す。図２７Ｂは、２４時間後のバイアビリティを表し、図２７Ｃは、接着培養条件下での５日後の増殖能を示す。これら解析から５分間超であるＡＣＬでのインキュベーション期間が下澄液に含まれる脂肪組織の幹細胞のバイアビリティおよび増殖能を損なうことがもたらされる。さらに、ＡＣＬでのインキュベーションは、ヒト脂肪組織の内皮細胞のバイアビリティまたは増殖能に作用しない。

【0093】

実施例２．細胞の増殖および分化
脂肪組織の褐色またはベージュ脂肪細胞の幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖および脂肪組織を模倣する環境での分化のための方法は、以下のステップを含む。

【0094】

１．集団Ｃ１～Ｃ３およびＥｎｄｏＳｔｅｍマトリックスＭ１～Ｍ４と呼ばれるマトリックスを含む実施例１で得た最終産物は、バッグの中の懸濁液で培養し、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間撹拌しながらＥＧＭ＋増殖培地で維持した後、同じ条件下で、好ましくは撹拌しながら維持する。

【0095】

２．ＥＧＭ＋増殖培地は、２日ごとに５０％を変える。

【0096】

３．５日目および１０日目に、チューリップに取り付けられた２つのシリンジまたは２つの培養バッグを介した通路による閉鎖したシステムでの機械的な解離を行う。

【0097】

４．１４日目に、ＥＧＭ＋増殖培地を、２５０μＭのデキサメタゾン；５００μＭのＩＢＭＸ；１μＭのロシグリタゾン；２μＭのＴ３および２．５μｇ／ｍｌのインスリンで強化したＥＧＭ＋から構成される分化カクテルＩと置き換える。

【0098】

５．１７日目に、分化培地Ｉを、１μＭのロシグリタゾン；２μＭのＴ３、および２．５μｇ／ｍｌのインスリンで強化したＥＧＭ＋から構成される分化培地ＩＩに置き換える。

【0099】

実施例３．マトリックスの増幅能の性質決定
本発明のＥｎｄｏＳｔｅｍ－マトリックスと呼ばれる細胞外マトリックスは、特に、異なる特異的なマーカーの存在下で、蛍光顕微鏡により性質決定されている。よって、増殖している細胞は、図１１に例示されるように、ＤＮＡ複製の段階の間、蛍光Ｅｄｕ（５－エチニル（ｅｔｈｙｌｎｙｌ）－２’－デオキシウリジン）の本発明のマトリックスＥｎｄｏＳｔｅｍ－マトリックスへの組み込みにより検出されており、これらが生理活性であることを証明している。実際に、図１１は、マトリックスに対し内在性である細胞が、増幅段階の間に増殖で維持されることを示している。

【0100】

さらに、図１２は、本発明の細胞外マトリックスとの３日間の共培養の後に共培養した脂肪組織の外来性幹細胞の存在を強調している。よって、細胞外マトリックスは、間質性血管フラクションの増殖のための支持を提供することを可能にし：添加された脂肪組織の幹細胞は、懸濁液において、マトリックスのＥｎｄｏＳｔｅｍ－マトリックスに結合し得る。これは、外来性細胞が、本発明に係る細胞外マトリックスに結合する特質を有することを示しており、マトリックスが、臨床またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用のため、特に薬理学的な有効成分のスクリーニングおよび／または性質決定のために、それ自体で単独で使用され得ることを表している。外来性幹細胞は、たとえば目的のタンパク質を発現するように、遺伝子改変され得る。さらに、外来性幹細胞は、非脂肪細胞または具体的には脂肪細胞幹細胞であり得る。これは、たとえば皮膚幹細胞、特には、皮膚の上皮幹細胞または人工多能性幹細胞であり得る。

【0101】

図１３Ｂを参照すると、間質性血管フラクションは、本発明のＥｎｄｏＳｔｅｍマトリックスでのその培養により増幅される。逆に、図１３Ａを参照すると、間質性血管フラクションが、細胞外マトリックスを伴わずに懸濁液で培養される場合、増殖しない細胞凝集体が観察される。よって、本発明の細胞外マトリックスは、添加した脂肪組織の幹細胞を増幅する特性を有する。

【0102】

さらに、図１６は、脂肪組織の幹細胞の増幅を得るために間質性血管フラクションおよびマトリックスの共培養の必要性を強調することを可能にする。図１６Ａ、１６Ｃ、および１６Ｅは、間質性血管フラクションを添加せずに培養したＥｎｄｏｓｔｅｍマトリックスで増殖している細胞の低い比率を示している。図１６Ｂ、１６Ｄ、および１６Ｆは、間質性血管フラクションおよび細胞外マトリックスの共培養が、脂肪組織の幹細胞の優れた増殖を得ることを可能にすることを示している。また、脂肪組織の幹細胞のバイアビリティおよび増幅能を比較するために、間質性血管フラクションを添加しない組成物（図３２Ａ）または細胞外マトリックスおよび下澄液から単離した細胞の混合物を含む組成物（図３２Ｂ）に含まれる細胞を、機械的な消化により単離し、接着条件下で４８時間培養した後、固定し、クリスタルバイオレットで染色することにより、細胞密度を観察した。セルウェルに含まれる細胞は、図３２において黒色で示されている。よって、図３２Ａは、間質性血管フラクションを添加しない場合の細胞集団の弱い増幅を示している。図３２Ｂは、培養後の間質性血管フラクションの細胞集団の増幅を示している。

【0103】

実施例１のステップの間に得た異なるマトリックスＭ１～Ｍ４の細胞増幅能を検証した。よって、約１０４個の脂肪組織の幹細胞を、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ （ＵＬＡ）のウェルにて、異なるマトリックスＭ１～Ｍ４の存在下で懸濁液に維持した。８日後に、細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡによりマトリックスから分離し、次に計測した。得られた値を、以下の表１に示す。

【表1】

【0104】

上記の表で、個々のマトリックスＭ１～Ｍ４の特定の場合、増幅係数は、細胞外マトリックスの存在下での培養後に得た細胞の数と、細胞外マトリックスの不存在下で得た細胞の数との間の比率である。

【0105】

マトリックスＭ２およびＭ４は、脂肪組織の幹細胞の強力な増幅力を有する。得られたマトリックスＭ２の体積は、Ｍ４の体積と比較して非常に小さい（図１０Ａ）。マトリックスＭ４は、本発明で定義される細胞外マトリックスを表す。

【0106】

異なる細胞マーカー（脂肪組織の幹細胞および内皮細胞のマーカーＣＤ３１）の発現レベルを、増殖培地において、本発明の細胞外マトリックス上にて間質性血管フラクションの懸濁液での培養後に解析した。この試験は、褐色／ベージュ脂肪組織のＤＰＰ４幹細胞の増幅（図１７Ｂ）、ヒト脂肪組織の脂肪細胞のＩＣＡＭ１前駆体幹細胞の保存（図１７Ｄ）、および内皮細胞集団の保存（図１７Ｆ）を明らかにしている。

【0107】

異なる細胞マーカー（内皮細胞マーカーＣＤ３１、脂肪細胞幹細胞マーカーＰＤＧＦＲａ、ならびに２つの成熟脂肪細胞のマーカーＰＬＮ１およびアディポネクチン）の発現のレベルを、産物ＥｘＡｄＥｘ－組織の増幅および分化のステップの後に本発明の細胞外マトリックス上で間質性血管フラクションの懸濁液での培養後に解析した。図１４は、本発明の細胞外マトリックスを伴わない間質性血管フラクションの懸濁液における培養からもたらされる、これらの発現レベルの比較を示す。この試験は、脂肪組織の血管網の内皮細胞（図１４Ａ）および脂肪組織の幹細胞（図１４Ｂ）の増幅を明らかにしている。またこの試験は、本発明の細胞外マトリックスにより誘導される最良の分化能を強調することを可能にしている（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。よって、本発明の細胞外マトリックスで３Ｄ増幅された脂肪組織の幹細胞は、脂肪細胞へ分化する特性を保持している。

【0108】

本発明のＥｘＡｄＥｘプロセスはまた、細胞の増幅および分化の間に、ネイティブな血管網を保存することを可能にする。図３０Ａ、３０Ｂ、および３０Ｃは、異なる培地において培養した後にヒト脂肪組織から単離した内皮細胞を表す。図３０Ａは、本発明の増殖培地で培養した後の脂肪組織の内皮細胞を示す。図３０Ｂは、本発明の分化培地での培養後の脂肪組織の内皮細胞を示す。

【0109】

また、図３０Ｃは、ＤＭＥＭおよび血清を含む、標準的な最適化されていない分化培地での培養後の脂肪組織の内皮細胞を示す。結果として、本発明に記載される培地のみが、増殖および褐色／ベージュ脂肪組織への分化のステップの間に内皮細胞を保存することを可能にする。内皮細胞の保存は、特に、褐色／ベージュ脂肪組織の移植適用に重要であり、移植後の血管新生、よって移植産物のバイアビリティを可能にする。これに関して、本明細書において、本発明の方法により得られる増幅した組成物に存在し、恐らくは分化したネイティブな血管網は、ヌードマウスにおいて移植後の血管新生能を有することが示されている。実際に、図３１において白色で出現しているように、ヌードマウスへの移植から４週間後に、本発明の組成物は、機能的な血管網を有する。

【0110】

外食片に同化し得る解離していない脂肪組織が、ｅｘ ｖｉｖｏで短時間生存可能でありつつけることに留意されたい。よって、図１５に特に示されるように、解離により単離されるマトリックスは、解離していない組織（図１５Ａ）とは異なり、増殖している細胞を含む（図１５Ｂ）。図１５Ａおよび１５Ｂは、解離していない組織（図１５Ａ）および単離したマトリックス（図１５Ｂ）において細胞増殖を比較することを可能にする。図１５Ａでは、解離していない脂肪組織は、増殖している細胞を示さない。図１５Ｂでは、本組成物は、増殖している細胞を示す。実際に、この図面は、白色で、増殖している細胞の核を示す。

【0111】

洗浄液の遠心分離により、本発明により単離される細胞は、マーカーＤＰＰ４により分子学的に特徴づけられることに留意されたい。ＤＰＰ４は、高い増殖能を有し、脂肪組織の間質性細網に局在化している、ＩＣＡＭ１前脂肪細胞の前駆細胞のマーカーである。これらは、本発明に係る組成物において増殖する特性を有する細胞である。これら細胞が、従来技術の方法により行われる洗浄の後に除去されることに留意することが重要である。同様にこれは図１７Ａに示されており、ＤＰＰ４の発現は、単離された間質性血管フラクションに集中している。マトリックスは、ほとんど発現しない。しかしながら、図１７Ｃに示されるように、ＩＣＡＭの発現は、図１７ＥのＣＤ３１型細胞と同様に、単離したマトリックスに集中している。本組成物において増幅を担持する細胞は、ＤＰＰ４を発現する添加された細胞である。

【0112】

実際に、図１８は、共培養産物において、Ｅｄｕ増殖マーカーを発現する細胞が、同様にマーカーＤＰＰ４を発現する細胞であることを示している。よって、増幅力を担持する幹細胞は、優先的には、ＤＰＰ４またはｃｄ２６＋型細胞である。

【0113】

さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの脂肪組織はマクロファージを含むこと、および本発明に係る増幅した組成物は、図２１ａに示されるようにＭ１型のマクロファージの存在を維持し、図２１Ｂに示されるようにＭ２型のマクロファージの存在を維持することに留意されたい。図２１Ａでは、Ｍ１型マクロファージは、マーカーＩＬ－１ｂにより明らかとなり、図２１Ｂでは、Ｍ２型マクロファージは、マーカーＭＲＣＩ１により明らかとなる。

【0114】

最後に、図２２に示されるように、本発明に係る単離したマトリックスは、細胞外マトリックスのタンパク質、すなわち特に、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンを含む。ＣＤ３１内皮細胞の染色は、毛細管ネットワークが保存されていることを示している。

【0115】

実施例４－増幅／褐色／ベージュ脂肪細胞への分化
図１９は、これが、優先的に褐色／ベージュ脂肪細胞の前駆体である陽性ＤＰＰ４細胞であることを示している。実際に、ＤＰＰ４＋を発現し、本発明で記載される培地により分化したヒト脂肪組織の幹細胞の単離した集団（図１９の一番上の線）は、共焦点顕微鏡でのマーカーＵＣＰ１の発現を示す。しかしながら、表面マーカーＤＰＦ４を発現しないヒト脂肪組織の幹細胞集団は、分化後にマーカーＵＣＰ１の発現を示さない。分子解析により、これら知見が確認され、これは脂肪細胞分化マーカーＰＬＮ１が陽性または陰性のＤＰＰ４集団に関して比較可能であることを示している（図２０ａ）、が、褐色／ベージュ脂肪組織の分化のマーカーは、マーカーＤＰＰ４を発現する幹細胞から分化して集団でのみ観察可能である（図２０Ｂ）。

【0116】

増幅したが分化していない産物ＥｘＡｄＥｘ－組織を、「ヌード」と呼ばれる免疫不全マウスの褐色脂肪組織の近くに、肩甲骨間レベルに注射した。注射から２１日後（Ｄ２１）に、産物ＥｘＡｄＥｘ－組織をサンプリングした。ＲＮＡは、サンプリングされた組織の構成要素の細胞から抽出した。褐色／ベージュ脂肪細胞のマーカーＵＣＰ１の発現レベルを、注射前（Ｊ０）の産物のレベルと比較した。Ｄ０およびＤ２１でのＵＣＰ１の発現レベルを、リアルタイム定量ＰＣＲにより決定した後、これらを、発現が２つの条件下で変動しない参照遺伝子、すなわち遺伝子：ヒトＧＵＳＢ（βグルクロニダーゼ）と関連付けることにより決定した。図２３に示されるように、増殖し移植した組織は、移植後に褐色／ベージュ脂肪細胞へのｉｎ ｖｉｖｏでの細胞分化に供されたように思われる。実際に、図２４に示されるように、本発明の方法の実施前の白色皮下脂肪組織に褐色／ベージュ脂肪細胞は存在しない（図２４、左の写真）。過体重の人物の脂肪組織由来の本発明の後のｅｘ ｖｉｖｏでの（ＵＣＰ１タンパク質の発現により特異的に標識される）褐色／ベージュ脂肪細胞の存在（図２４、中央の写真）。重篤な肥満を有する患者の脂肪組織由来の本発明の後のｅｘ ｖｉｖｏでの褐色／ベージュ脂肪細胞の存在（図２４、右の写真）。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図17F】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図30C】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【国際調査報告】