特表 2023-545403 ＣＲＩＳＰＲを介した指令コドン書換え

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-30

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲを介した指令コドン書換え

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20231023BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231023BHJP

   C12N 15/82 20060101ALI20231023BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20231023BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/82 Z

A01H1/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023520242

(86)(22)【出願日】2021-10-01

(85)【翻訳文提出日】2023-05-31

(86)【国際出願番号】 EP2021077206

(87)【国際公開番号】W WO2022069756

(87)【国際公開日】2022-04-07

(31)【優先権主張番号】20306150.2

(32)【優先日】2020-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521045254

【氏名又は名称】リマグレン、ヨーロッパ

【氏名又は名称原語表記】ＬＩＭＡＧＲＡＩＮ ＥＵＲＯＰＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】ティエリー、リザシェ

【テーマコード（参考）】

2B030

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AD05

2B030CA11

2B030CA19

2B030CD17

(57)【要約】

本発明は、遺伝子内の変位の導入方法であって、前記方法は、細胞の修復マシーナリーにおいてエラー、ならびにエンドヌクレアーゼにより、特にＣＲＩＳＰＲシステムを用いて行われる切断を修復する場合に欠失および／または挿入の導入を使用する、方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

特定の変異が標的遺伝子の特定の位置において導入されている生物の細胞を得る方法であって、
ａ）複数の細胞の細胞において、
－エンドヌクレアーゼタンパク質、
－前記標的遺伝子中の標的位置を認識する第一ガイドＲＮＡ、
－前記標的遺伝子中の改変された標的位置を認識する第二ガイドＲＮＡであって、前記改変は、前記標的位置における前記第一ガイドＲＮＡにより誘導された前記エンドヌクレアーゼタンパク質による切断後に起こった少なくとも１つのヌクレオチド欠失に存する、前記第二ガイドＲＮＡ、
を導入し、
（ｉ）前記第一ガイドＲＮＡは、前記ヌクレアーゼを、前記標的位置において前記標的遺伝子を切断するように指令し、１～３ヌクレオチドの小欠失をいくつかの細胞内で前記切断サイトにおいて修復により導入し、
（ｉｉ）前記第二ガイドＲＮＡは、前記ヌクレアーゼを、前記改変された標的位置において前記標的遺伝子を切断するように指令し、所望のヌクレオチドの挿入は前記切断サイトにおいて修復することにより起こり、前記所望のヌクレオチドはこの位置における前記元のヌクレオチドと異なり、それにより、前記標的遺伝子の前記特定の位置における前記特定の変異を前記標的遺伝子の修復によって導入する、
ことと、
ｂ）前記特定の変異がフレームシフトの導入なしで導入された前記細胞を単離するために、前記複数の細胞を所望によりスクリーニングすることと、
を含んでなる、方法。

【請求項2】

第三ガイドＲＮＡを、前記エンドヌクレアーゼタンパク質ならびに前記第一ガイドＲＮＡおよび第二ガイドＲＮＡを含む前記細胞内に導入し、
（ｉ）前記第二ガイドＲＮＡを、改変された標的位置を認識するように設計し、改変は、前記第一ガイドＲＮＡによる前記切断後に前記標的遺伝子中の前記特定の位置における２つの所望のヌクレオチドの欠失に存し、および前記第二ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第一の所望のヌクレオチドを挿入し、
（ｉｉ）前記第三ガイドＲＮＡを、前記（ｉ）で得られた挿入により前記改変された標的位置を認識するように設計し、前記第三ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第二の所望のヌクレオチドを挿入し、
それにより、２つの所望のヌクレオチドが２つの元のヌクレオチドを置換した標的遺伝子を有する細胞を得る、
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

第四ガイドＲＮＡを、前記エンドヌクレアーゼタンパク質ならびに前記第一ガイドＲＮＡ、前記第二ガイドＲＮＡおよび前記第三ガイドＲＮＡを含む前記細胞内に導入し、
（ｉ）前記第二ガイドＲＮＡを、改変された標的位置を認識するように設計し、前記改変は、前記第一ガイドＲＮＡによる前記切断後に前記標的遺伝子中の前記特定の位置における３つのヌクレオチドの欠失に存し、および前記第二ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第一の所望のヌクレオチドを挿入し、
（ｉｉ）前記第三ガイドＲＮＡを、前記（ｉ）で得られた挿入後に得られた前記改変された標的位置を認識するように設計し、前記第三ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第二の所望のヌクレオチドを挿入し、
（ｉｉｉ）前記第四ガイドＲＮＡを、前記（ｉｉ）で得られた挿入により前記改変された標的位置を認識するように設計し、前記第四ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第三の所望のヌクレオチドを挿入し、
それにより、３つの所望のヌクレオチドが３つの元のヌクレオチドを置換した標的遺伝子を有する細胞を得る、
請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記特定の位置は、タンパク質をコードする遺伝子のコドンであり、前記変異は、前記タンパク質中のアミノ酸の変更を誘導する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記特定の位置は、タンパク質をコードする遺伝子の２つのコドンの２つまたは３つのヌクレオチドを含んでなり、前記変異は、前記２つまたは３つのヌクレオチドの変異を含み、それにより、前記タンパク質中の２つのアミノ酸の変更を引き起こす、請求項２または３に記載の方法。

【請求項6】

前記複数の細胞は、前記生物の細胞の組織または懸濁液である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記変異は、前記標的遺伝子中の１つのヌクレオチドの置換である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＦｎＣａｓ９、ＲＨＡ ＦｎＣａｓ９、ｘＣａｓ９およびＣａｓ９－ＮＧから成る群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記エンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡを、ＤＮＡベクターによりまたはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）として細胞に導入する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記標的遺伝子が変異された前記細胞を回収する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記生物は、植物である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記標的遺伝子の前記特定の位置において変異を含む少なくとも１つの細胞を含んでなる植物を、前記細胞集団から再生する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記細胞は、カルスを生成することを可能とし、前記植物を、前記カルスから再生する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

標的遺伝子の特定の位置において変異を含む少なくとも１つの細胞を含んでなる植物の産生方法であって、前記方法は、植物細胞に対して請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法を行うことおよび前記方法の実施後に得られた前記細胞から前記植物を再生することを含んでなる、方法。

【請求項15】

生物の細胞の標的遺伝子の特定の位置における特定の変異の導入のために必要なガイドの設計方法であって、
－欠失する必要があるヌクレオチドおよび前記欠失するヌクレオチドを置換するように挿入する所望のヌクレオチドを決定することにより、前記特定の位置を改変するように置換する必要がある前記ヌクレオチド／塩基を識別することと、
－前記標的遺伝子中の前記特定の位置の近くのＰＡＭを識別することであって、前記ＰＡＭは、前記編集のために使用されるエンドヌクレアーゼに応じて選択される、ことと、
－野生型配列中の前記特定の位置において二本鎖ＤＮＡを切断するように第一ガイドを設計することと、
－前記第一ガイドにより引き起こされる前記エンドヌクレアーゼによる前記切断後に得られる前記ヌクレオチドの前記欠失に特異的である第二ガイドを設計することと、
－２つのヌクレオチドが前記野生型配列から欠失されることになる場合に第三ガイドを設計することであって、前記第三ガイドは、前記第二ガイドの作用後期待される前記修復される配列の切断を引き起こす、ことと、
－３つのヌクレオチドが前記野生型配列から欠失されることになる場合に第四ガイドを設計することであって、前記第四ガイドは、前記第三ガイドの作用後期待される前記修復される配列の切断を引き起こす、ことと、
を含んでなる、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子内の変異の導入（遺伝子編集）方法であって、前記方法は、細胞の修復機構および特に、ＣＲＩＳＰＲシステムによる遺伝子編集を使用する、方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる遺伝子編集（ＧＥ）は、原核生物および真核生物ゲノムを編集するための世界的に広く使用されているツールである。（Jinek, M. et al. Science 337, 816-821 2012, Cong, L. et al. Science 339, 819-823 2013）

【0003】

３種類の編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより行われた二本鎖切断（ＤＳＢ）後に得られることができる。ＳＤＮ１編集は、ＤＮＡ鎖の修復は、細胞ＤＮＡ修復マシーナリー：非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）の１つの経路により行われる。修復は、切断サイトにおいて小挿入または欠失（インデル）をもたらす。

【0004】

ＳＤＮ２は、修復を、鋳型を用いて相同組換え（ＨＲ）による配列の挿入により行う編集である。挿入は、標的配列と通常同じであるが、所望の修正を含んでなる。

【0005】

ＳＤＮ３は、修復をＨＲにより行うが、挿入は新たな遺伝子材料である編集でもある。

【0006】

塩基編集（ＢＥ）は、ゲノム工学における重要なツールになった。現在、ツールは、シチジン残基を標的とするため、およびより最近ではアデニン残基を標的とするために存在する（シチジンベースエディターおよびアデニンベースエディター）（Kim (2018), Rees and Liu (2018)）。これらのベースエディターは、特定のＤＮＡ領域に指令されるデアミナーゼ活性を可能とするＤＮＡ標的化システムと連結されたシチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼから成る。シチジンデアミナーゼのデアミナーゼ活性は、大多数、Ｃ残基をＴ残基に変換する。しかしながら、使用される酵素およびＢＥ構築に応じて、他の塩基を導入することができる。アデニンＢＥはより特異的であり、Ａ残基だけをＧ残基に変換する。

【発明の概要】

【0007】

本出願者は、ベースエディターを用いない１つまたは２つのコドンにおけるいくつかの塩基の変更を改変および指令するために反復Ｃａｓ９遺伝子編集を用いることによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９塩基編集および小ＳＤＮ２の代替および改良の両方である方法を開発した。

【0008】

この技術は、核酸配列中の１つまたは２つのコドンの編集を指示することができ、得られたタンパク質配列中の１つまたは２つの特定のアミノ酸の改変を生成することができる。指令コドン書換えを、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより切断された位置において行い、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、例えば、ｘＣａｓ９などの広範なＰＡＭバリアントと共に使用される場合、指令コドン書換えを非常に万能にする。指令コドン書換えは、ＳＤＮ２および相同組換えのための鋳型配列を必要としないので、オリゴベースのＳＤＮ２より効果的であると期待される。

【0009】

本明細書に開示されている方法は、コドン置換またはコドン書換えもしくは指令コドン書換えと呼ぶこともある。

【0010】

コドンは、タンパク質合成中のアミノ酸または終止シグナルをコードする核酸配列中の一連の３連続ヌクレオチドである。

【0011】

ヌクレオチドおよび塩基は、核酸配列の塩基成分：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）を呼ぶために代わりに使用される。

【0012】

ＰＡＭは、プロトスペーサー隣接モチーフであり、これは、ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるエンドヌクレアーゼにより標的とされるＤＮＡ配列中のＤＮＡ配列（通常、２～６塩基対）である。このモチーフは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによる標的領域の認識のために必須である。ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに特異的である。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのＰＡＭ配列は、標的ゲノムにおいて標的とされる可能性のある可能領域を決定する。

【0013】

野生型配列、または元の配列、または初期配列は、方法実施前、したがって、変異導入前の標的配列である。

【0014】

本発明の方法は、遺伝子編集ＣＲＩＳＰＲ技術およびＮＨＥＪ細胞ＤＮＡ修復マシーナリーの誤りがちな修復に基づく。

【0015】

ＮＨＥＪ経路は、ＤＳＢ修復のための主要な機序である。この経路は、２つの壊れたＤＮＡ末端を結合する（Lieber 2010）。ＮＨＥＪ経路は、ＤＮＡを修復して元のＤＮＡ配列の完全性を回復するか、あるいは修復されたＤＮＡ中のエラー、例えば、結合部における小欠失もしくは挿入を導入する。

【0016】

コドン書換えマシーナリーは、連続的または同時に使用される平滑末端および少なくとも２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を生成するＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを必要とする。

【0017】

本発明の方法は、標的生物における特定の改変を導入することを可能とする。

【0018】

前記方法を、真核細胞（動物、真菌細胞または植物細胞；好ましくは植物細胞；より好ましくはトウモロコシ、コムギ、イネ、アブラナ、ヒマワリ、オオムギ、ライムギ、ダイズ、ワタ、モロコシ、ビートルート）または原核細胞に適用することができる。

【0019】

したがって、より詳細には、本発明は、標的遺伝子の特定の位置における特定の変異の導入方法であって、前記方法は、
ａ）複数の細胞において、
－エンドヌクレアーゼタンパク質、
－前記標的遺伝子中の標的位置を認識する第一ガイドＲＮＡ、
－前記標的遺伝子中の改変された標的位置を認識する第二ガイドＲＮＡ（二次ガイド）であって、前記改変は少なくとも１つのヌクレオチド欠失に存する、第二ガイドＲＮＡ、
を導入することと、
ｂ）前記特定の変異がフレームシフトの導入なしで導入された前記細胞を単離するために、前記複数の細胞を所望によりスクリーニングすることと、
を含んでなる方法に関する。

【0020】

結果として、前記方法は、特定の変異が標的遺伝子中の特定の位置（または部位）において導入された生物の細胞を得ることを可能とする。標的遺伝子は、所与のタンパク質をコードする。タンパク質の１つまたは２つのコドンを改変して、その結果、このタンパク質配列の１つまたは２つのアミノ酸が改変される場合に、前記方法を行う。

【0021】

第一ガイドＲＮＡは、標的遺伝子中の所与の位置において二本鎖ＤＮＡの切断を引き起こす。前記位置は、所与の位置に近接したＰＡＭの部位（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、ＣＲＩＳＰＲシステムによる切断に対して標的とされるＤＮＡ領域に従う通常２～６塩基対長の短いＤＮＡ配列である）、および使用されるエンドヌクレアーゼの部位の両方に依存する。

【0022】

ＤＮＡ鎖の切断後、細胞ＤＮＡ修復マシーナリーは、切断されたＤＮＡを修復するために働き始める。この過程の間に、いくつかのエラーが起こる可能性があり、その結果、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドは、切断の部位において修復されたＤＮＡ配列中で欠失される。より大きい欠失も起こる可能性があるが、コドン書換え方法にとっては望ましくない。あるいは、細胞マシーナリーによるＤＮＡ修復過程の間に、いくつかのヌクレオチド挿入も可能である。

【0023】

したがって、本発明は、第一ガイドＲＮＡが、前記ヌクレアーゼを標的位置において標的遺伝子を切断するように指令する事実、および１～３ヌクレオチドの小欠失が、いくつかの細胞内で切断サイトにおいて修復により導入される事実を使用する。結果として、いくつかの細胞は、改変された標的位置を含み、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドはこの部位において欠損する。

【0024】

第二ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼが改変された標的位置において標的遺伝子を切断するように指令する。この第二切断により、切断サイトにおける修復の間の所望のヌクレオチドの挿入を有することを目的とし、前記所望のヌクレオチドは、この位置における元のヌクレオチドと異なり、それにより、標的遺伝子の特定の位置における特定の変異を標的遺伝子の修復によって導入する。

【0025】

２つだけのガイドＲＮＡが使用される場合（連続した欠失および挿入による１つのヌクレオチドの置換）に説明されているこの実施形態を、下記に開示されているように、２つ以上のヌクレオチドを置換するため、より多いガイドＲＮＡを用いて、修復は第一ガイドＲＮＡにより指令された切断後２つ以上のヌクレオチドの欠失を導入することができる事実を活用するように広げることができる。

【発明を実施するための形態】

【0026】

１つの実施形態では、複数の細胞は、生物の組織（通常自己完結型および特定の機能を有する生物の一部）である。別の実施形態では、複数の細胞は、組織である。別の実施形態では、複数の細胞は、生物の細胞の懸濁液である。更に別の実施形態では、複数の細胞は、培養レシピエントと接着された細胞である。

【0027】

好ましい実施形態では、生物は、植物である。特に、植物は、単子葉植物、好ましくは穀物である。単子葉植物として、イネ、コムギ、オオムギ、モロコシ、カラスムギ、トウモロコシなどの穀物を挙げることができるが、サトウキビも挙げることができる。コムギ細胞またはトウモロコシ細胞を用いて、前記方法を有利に行うことができる。別の実施形態では、植物は、双子葉植物である。双子葉植物の中でも、ダイズ、ワタ、トマト、テンサイ、ヒマワリ、またはアブラナを挙げることができる。

【0028】

好ましい実施形態では、複数の植物細胞は、小胞子、胚珠、プロトプラスト、接合体である。特定の実施形態では、細胞を、バイオリステック形質転換のために蒔く。

【0029】

好ましい実施形態では、植物組織は、胚、頂端分裂組織などの成長点、葉、根、茎、胚軸である。

【0030】

前記方法を植物細胞に対して行う場合、かかる植物細胞の全能性を使用することができ、前記植物細胞の全能性は、所与の細胞（例えば、細胞を成育し、培養細胞からカルスを形成した後）から植物全体、したがって、変異が特定の標的座位に導入された植物を再生することを可能とする。

【0031】

前記方法を植物胚芽細胞（花粉、胚珠）に対して行う場合、植物胚芽細胞を使用して別の胚芽細胞を受精させ、得られた植物において変異を導入するために植物を生成することができる。別の実施形態では、倍加半数体を生成し、植物を再生する。

【0032】

１つの実施形態では、変異は、標的遺伝子における１つのヌクレオチドの置換である。この実施形態では、２つのみのガイドＲＮＡを使用することができる。第一ガイドは、第一切断を指令することを目的とする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の標的特異性を、ｇＲＮＡの５’末端において２０ｎｔ配列により決定する。標的とのｇＲＮＡの塩基対形成後、Ｃａｓ９は、二本鎖が所望の標的配列においてＰＡＭの約３～４ヌクレオチド上流での破壊を媒介する。

【0033】

第二ガイドＲＮＡを、第一ｇＲＮＡを用いて切断が起こったサイトにおいて－１ヌクレオチドの座位において初期配列に指令するように設計する。したがって、第二ｇＲＮＡは、第一切断後の修復が適切でなく、１つの欠失がこの修復ステップ中に導入された細胞に対する切断のみを認識して指令する。したがって、エンドヌクレアーゼは、欠失を有する標的サイトにおいて二本鎖サイトを再度切断する。

【0034】

次いで、修復が再度起こり、ランダムなヌクレオチドが前記切断サイトに挿入される可能性がある。したがって、所望のヌクレオチドが元のヌクレオチドに置換して挿入された細胞を識別するためにスクリーニングし、それにより、変異が導入された細胞を得ることは可能である。

【0035】

別の実施形態では、第三ガイドＲＮＡ（三元ガイド）を、エンドヌクレアーゼタンパク質ならびに第一ガイドＲＮＡおよび第二ガイドＲＮＡを有する細胞内に導入し、
（ｉ）前記第二ガイドＲＮＡを、改変された標的位置を認識するように設計し、改変は、前記第一ガイドＲＮＡによる前記切断後に前記標的遺伝子中の前記特定の位置における２つの所望のヌクレオチドの欠失に存し、および前記第二ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第一の所望のヌクレオチドを挿入し、
（ｉｉ）前記第三ガイドＲＮＡを、前記（ｉ）で得られた挿入により前記改変された標的位置を認識するように設計し、前記第三ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第二の所望のヌクレオチドを挿入し、
それにより、変異標的遺伝子（２つの所望のヌクレオチドが２つの元のヌクレオチドを置換し、少なくとも１つのヌクレオチドは元のヌクレオチドと異なるかまたは２つの所望のヌクレオチドは２つの元のヌクレオチドと異なる）を得る。

【0036】

この実施形態では、３つのガイドＲＮＡを使用し、前記方法は、第一ｇＲＮＡにより指令された切断が修復され、それにより、改変された配列をもたらす場合、２つの所望のヌクレオチドの欠失は導入される可能性があるという事実を活用する。

【0037】

この実施形態では、第二ガイドＲＮＡは、改変された配列（第一切断サイトにおける元の配列－２つの所望のヌクレオチドの欠失）を認識し、この改変された配列を有する細胞内で切断を行うようにエンドヌクレアーゼを指令することができる。切断後、修復機構は、二本鎖を閉じ、１つのランダムなヌクレオチドが挿入され、二次改変配列をもたらす可能性がある。

【0038】

第三ＲＮＡガイドは、第一の所望のヌクレオチドが挿入された二次改変配列に対して特異的である。この第一の所望のヌクレオチドは、この部位に存在した元のヌクレオチドと異なる。第三ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼを、二次改変配列を切断するように指令する。

【0039】

第二の所望のヌクレオチドを、修復サイトに挿入してよい。したがって、第二の所望のヌクレオチドが挿入された細胞を識別するためにスクリーニングすることは可能である。

【0040】

第三ｇＲＮＡにより指令された切断後に挿入された第二の所望のヌクレオチドは、元（未変異配列）における同じ部位に存在していた元のヌクレオチドと同じであってよいことは注目すべきである。これは、２つのヌクレオチド欠失における第一の所望のヌクレオチドだけを改変したい場合に起こり得る。

【0041】

この実施形態では、特定の変異が２つのコドンと重複する場合、元の標的遺伝子の１つまたは２つのコドンを改変することができる。

【0042】

別の実施形態では、４つのガイドＲＮＡを使用する：第一ｇＲＮＡは、元の配列において切断を指令し、第二ｇＲＮＡは、前記切断サイトにおける３つの所望のヌクレオチドの欠失を有する元の配列に特異的であり、第三ｇＲＮＡは、３つの所望のヌクレオチドの欠失および元のヌクレオチドと異なる第一の所望のヌクレオチドの１つの挿入を有する元の配列に特異的であり、ならびに第四ｇＲＮＡは、３つの所望のヌクレオチドの欠失が第一切断後に行われ、その後、２つの所望のヌクレオチドが修復中（第二ｇＲＮＡおよび第三ｇＲＮＡを用いた切断後）に連続的に挿入された元の配列に特異的である。

【0043】

手短に言えば、第一ｇＲＮＡは、所定のサイトにおいて切断を指令する。修復は、３つの所望のヌクレオチドの欠失を導入し、それにより、第一改変配列をもたらし得る。

【0044】

第二ｇＲＮＡは、第一改変配列に対して特異的であり、エンドヌクレアーゼによる切断を指令する。修復時、１つのランダムなヌクレオチドの挿入が起こり、それにより、第二改変配列をもたらすことができる。

【0045】

第三ｇＲＮＡは、第一の所望のヌクレオチド（元のヌクレオチドと異なる）が挿入された第二改変配列に対して特異的である。第三ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ切断を指令して修復し、この時、１つのランダムなヌクレオチドを挿入してよく（第一の所望のヌクレオチドの下流）、第三改変配列をもたらす。

【0046】

第四ｇＲＮＡ（四次ガイド）は、第二の所望のヌクレオチドが挿入された第三改変配列に対して特異的である。第四ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ切断を指令して修復し、この時、１つのランダムなヌクレオチドを挿入してよく（第二の所望のヌクレオチドの下流）、第四改変配列をもたらす。

【0047】

第四改変配列を有する細胞のスクリーニングにより、第三の所望のヌクレオチドが第二の所望のヌクレオチドの下流に挿入された細胞を識別することは可能である。

【0048】

第一の所望のヌクレオチドが同じ部位において元のヌクレオチドと異なるが、１つまたは他の２つの所望のヌクレオチドは、元の配列に存在したヌクレオチドと同じであってよいことは注目すべきである。１つの実施形態では、第一の所望のヌクレオチドは異なるが、２つの最後に再導入されたヌクレオチドは、元の配列中のヌクレオチドと同じである。別の実施形態では、２つの第一の所望のヌクレオチドは異なるが、再導入された最後のヌクレオチドは、元の配列中のヌクレオチドと同じである。別の実施形態では、３つの所望のヌクレオチドは、元の配列中のヌクレオチドと異なる。

【0049】

この実施形態では、第四ガイドＲＮＡを、前記エンドヌクレアーゼタンパク質ならびに前記第一ガイドＲＮＡ、前記第二ガイドＲＮＡおよび前記第三ガイドＲＮＡを含む細胞内に導入し、
（ｉ）前記第二ガイドＲＮＡを、改変された標的位置を認識するように設計し、前記改変は、前記第一ガイドＲＮＡによる前記切断後に前記標的遺伝子中の前記特定の位置における３つのヌクレオチドの欠失に存し、および前記第二ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第一の所望のヌクレオチドを挿入し、
（ｉｉ）前記第三ガイドＲＮＡを、前記（ｉ）で得られた挿入後に得られた前記改変された標的位置を認識するように設計し、前記第三ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第二の所望のヌクレオチドを挿入し、
（ｉｉｉ）前記第四ガイドＲＮＡを、前記（ｉｉ）で得られた挿入により前記改変された標的位置を認識するように設計し、前記第四ガイドＲＮＡによる前記切断後の前記修復は、前記改変された標的位置において第三の所望のヌクレオチドを挿入し、
それにより、標的遺伝子が変異する（３つの所望のヌクレオチドは、３つの元のヌクレオチドを置換し、少なくとも１つのヌクレオチドは対応する元のヌクレオチドと異なるか、または２つのヌクレオチドは対応する元のヌクレオチドと異なるか、または３つのヌクレオチドは対応する元のヌクレオチドと異なる）細胞を得る。

【0050】

エンドヌクレアーゼ、およびガイドＲＮＡを、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として、または異なる要素をコードする遺伝子構築物を含んでなるベクターを用いて植物中に送達することができる。

【0051】

送達方法は、当業者に公知である。例えば、エレクトロポレーション、バイオリステック、ウイルス媒介形質転換、アグロバクテリウム媒介植物形質転換（Ishida et al., 1996）を挙げることができる。

【0052】

異なる要素をコードする遺伝子構築物を含んでなるベクターは、プラスミドであってよい。エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸を、プロモーターの制御の下で蒔く。本発明のプロモーターは、ＺｍＵｂｉプロモーター、ＴａＵ６プロモーター、トウモロコシＵ６プロモーター、トウモロコシＵ３プロモーター、イネＵ３プロモーターおよびイネＵ６プロモーターなどの構成的プロモーターを含んでなる。

【0053】

所望により、ベクターは、ｂａｒ、ｎｐｔＩＩ、ハイグロマイシンおよび／または視覚性マーカー（ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＧＵＳ）などの選択可能なマーカーを含んでなることができる。

【0054】

エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡを含んでなるＲＮＰ複合体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生およびアセンブリし、標的細胞に送達する（照射、エレクトロポレーション、ＰＥＧ形質転換）。

【0055】

上記のように、変異が、遺伝子によりコードされたタンパク質中のアミノ酸の変更を誘導する場合が好ましい。別の実施形態では、変異は、タンパク質の２つの連続したアミノ酸の変更をもたらす（２つまたは３つの欠失を導入する修復能が使用される場合、特定の位置がタンパク質をコードする遺伝子の２つのコドンの２つまたは３つのヌクレオチドを含んでなる場合、および変異がこれらのヌクレオチドのうちの少なくとも２つの変異を含み、それにより、前記タンパク質中の２つのアミノ酸の変更を引き起こす場合）。別の実施形態では、変異は、コード配列中に終止コドンを作成し、それにより、短縮タンパク質をもたらす。別の実施形態では、遺伝子の発現を減少または増加するために、例えば、遺伝子のプロモーター中の遺伝子の調節領域において、変異を導入する。

【0056】

好ましい実施形態では、細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して細胞数を増加させる。別の実施形態では、生物が植物である場合、標的遺伝子が変異した細胞を回収し、植物／小植物全体を再生する（特に、細胞はカルスを形成することを可能とし、植物はカルスから再生する）。各再生植物／小植物のサンプルを、分析用に採取する。ＤＮＡ全体を各サンプルから抽出し、配列決定して特定の変異の存在を検出する。あるいは、標的遺伝子中の標的領域に特異的なプライマーを使用して標的領域を増幅する。標的領域を配列決定して、特定の変異の存在を検出する。

【0057】

複数の細胞から再生された植物に対してスクリーニングを行ってよい。なお、再生植物は総じてキメラ植物（再生植物が様々な変異細胞（いくつかの変異イベントは本明細書に開示されている反復方法を考慮して存在し得る）を含むので）ならびに非変異細胞である。全細胞内に変異を有する植物を得る１つの方法は、たぶん胚芽細胞が特定の変異を含むであろう植物を選択するために再生された植物をスクリーニングすることであろう。

【0058】

このスクリーニングの１つの方法は、上記の再生された植物のサンプル（体細胞組織）を使用すること、および変異を有するＤＮＡの定量分析を行うことであろう。体細胞内の変異率がより高いほど、変異が細胞分裂および再生の早期に起こる可能性ならびに胚細胞も変異し、したがって、変異が伝染性である確率が高くなる可能性が高まる。結果として、各植物からの同様なサンプル（例えば、パンチにより葉から採取された円）を用いた複数の再生された植物をスクリーニングすることにより、特定の変異を含む細胞の量を評価することおよびこれらの細胞を収穫した植物を選択することは、変異されたＤＮＡの量の定量により可能である。例えば、サンプル中の変異量により（したがって、変異ＤＮＡ解析のために同様なサンプルを採取することの重要性）植物をランク付けすること、および更なる処理のために第一十分位数（解析されたＤＮＡ中の変異の最大量を有する植物の１０％）を選択することは可能である。別の実施形態では、解析されたＤＮＡ中の変異の最大量を有する植物の５％、または植物の２％、または植物の１％を選択する。

【0059】

かかる選択された植物を、他の植物との更なる交雑のために使用することができる。一定の割合の次世代植物は、特定の変異に対してヘテロ接合性である。

【0060】

別の方法は、再生された植物を分析しないが、これらの植物を交雑して後代の特定の変異の存在についてスクリーニングすることであろう。

【0061】

特定の変異が植物において除草剤耐性を導入する場合、前記除草剤を含んでなる選択的培地上で細胞を選択する。

【0062】

別の実施形態では、標的遺伝子の特定の位置において変異を含む少なくとも１つの細胞を含んでなる植物を、細胞集団から再生する。

【0063】

使用されるエンドヌクレアーゼを、当技術分野において公知のエンドヌクレアーゼから選択することができる。エンドヌクレアーゼは、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、最も好ましくは、クラス２のＩＩ型（Ｃａｓ９）エンドヌクレアーゼである。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ＣｊＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＭｎＣａｓ９）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）（ＦｎＣａｓ９）、Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）の三重変異体（ＲＨＡ ＦｎＣａｓ９）、改良されたＣａｓ９（Hu et al, Nature. 2018 Apr 5;556(7699):57-63)、またはCas9-NG (Ren et al, Molecular Plants, 12 (7), 2019, 1015-1026に記載されているｘＣａｓ９）などのいずれかの公知の宿主由来のＣａｓ９を使用することができる。本明細書に開示されている方法において使用されるエンドヌクレアーゼは、標的配列を切断する場合、平滑末端を生成しなければならない。

【0064】

本発明は、標的遺伝子の特定の位置において変異を含む少なくとも１つの細胞を含んでなる植物の産生方法であって、前記方法は、上記に開示されている標的遺伝子において変異を導入する方法を実施すること、およびこの方法の実施後得られた細胞から植物を再生することを含んでなる、方法にも関する。この方法は、上記方法により複数の細胞から再生された複数の植物から植物を選択するステップも含んでよい。

【0065】

本発明は、生物の細胞の標的遺伝子の特定の位置における特定の変異の導入のために必要なガイドの設計方法であって、前記方法は、
－欠失する必要があるヌクレオチドおよび前記特定の位置において前記欠失されるヌクレオチドを置換するように挿入する所望のヌクレオチドを決定することにより、前記特定の位置を改変するように置換する必要がある前記ヌクレオチド／塩基を識別することと、
－前記標的遺伝子中の前記特定の位置の近くのＰＡＭを識別することであって、前記ＰＡＭは、前記編集のために使用される前記エンドヌクレアーゼに応じて選択される、ことと、
－野生型配列中の前記特定の位置において前記エンドヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断するように第一ガイドを設計することと、
－前記第一ガイドにより引き起こされる前記エンドヌクレアーゼによる前記切断後に得られる前記ヌクレオチドの前記欠失に特異的である第二ガイドを設計することと、
２つのヌクレオチドが前記野生型配列から欠失されることになる場合に第三ガイドを設計することであって、前記第三ガイドは、前記第二ガイドの作用後期待される前記修復される配列の切断を引き起こして所望のヌクレオチドの導入をもたらす、ことと、
３つのヌクレオチドが前記野生型配列から欠失されることになる場合に第四ガイドを設計することであって、前記第四ガイドは、前記第三ガイドの作用後期待される前記修復される配列の切断を引き起こして所望のヌクレオチドの導入をもたらす、ことと、
を含んでなる、方法にも関する。

【0066】

したがって、前記方法は、目的の改変に応じて特異的に設計されたガイドを用いて所望の変異を得るようにＣＲＩＳＰＲ適用後、非相同末端連結修復から得られたランダム変異において、コドン書換えを指令するように指令された反復的濃縮である。

【0067】

第一ガイド（一次ガイド）および本発明のエンドヌクレアーゼは、書換えする所望のヌクレオチドにおいて切断を含む天然（野生型）配列を標的とすることができる。いくつかの細胞では、１～３ヌクレオチドからの小欠失または１ヌクレオチドの挿入は、合理的高頻度に出現する。

【0068】

同時または順次導入して、所望の欠失（１～３ヌクレオチド）を有する天然配列を認識する第二ガイド（二次ガイド）を細胞に送達する。所望の欠失の出現の場合、変異配列は、二次ガイドのおかげでエンドヌクレアーゼにより再び切断される。この時、高頻度の挿入を利用して、一部分の細胞は、新しいヌクレオチドを挿入する。
・目的の書換えが１ヌクレオチドである場合、細胞／植物を解析して、適切なコドンをコードする所望のヌクレオチドを有する編集された植物を選択する。
・目的の書換えが２または３ヌクレオチド（２または３ヌクレオチド欠失イベントに基づいて）である場合、所望のヌクレオチドの欠失および各々の連続的挿入に特異的な第三ガイド（三次ガイド）および第四ガイド（四次ガイド）も同時導入され、反復的に機能する。細胞／植物を解析して、適切なコドンをコードする所望のヌクレオチドを有する編集された植物を選択する。

【0069】

コドン中の１ヌクレオチドの書換えを目的とする場合、コドン書換えマシーナリーは、少なくとも２つのガイドＲＮＡを含んでなる。コドン書換えは、部分的コドン書換えとなる。

【0070】

コドン中の２ヌクレオチドの書換えを目的とする場合、コドン書換えマシーナリーは、少なくとも３つのガイドＲＮＡを含んでなる。コドン書換えは、部分的コドン書換えとなる。

【0071】

コドン中の３ヌクレオチドの書換えを目的とする場合、コドン書換えマシーナリーは、少なくとも４つのガイドＲＮＡを含んでなる。コドン書換えは、完全コドン書換えとなる。

【0072】

いくつかのステップを本明細書に開示する：
ステップ１＝標的生物における対象とする標的核酸配列中の標的ヌクレオチドコドンを識別し、各切断イベントにおいてヌクレオチドの連続的欠失／付加により前記コドンを改変するように置換される必要があるヌクレオチド／塩基を識別する。最後に、同数の塩基を欠失し、対象とする標的核酸内にフレームシフトが存在しないように配列中に同数の塩基を付加する。

【0073】

標的コドンの改変は、野生型タンパク質と比較して、対象とする標的核酸によりコードされるタンパク質の配列内のアミノ酸改変によるタンパク質レベルの改変を誘導する。いくつかの実施形態では、変異は、遺伝子配列において終止コドンを導入する。

【0074】

タンパク質中のこのアミノ酸改変は、標的生物に特異的遺伝形質をもたらす。

【0075】

植物における対象とする遺伝形質は、例えば：収穫改良、栄養素取込みの改良、植物構造の改良、非生物的ストレス（熱、寒冷、干ばつ、塩分、浸透圧ストレス・・・）に対する耐性の改良、官能特性、生物的ストレス（昆虫、線虫、真菌、細菌、ウイルス・・・）に対する耐性の耐容能、除草剤／抗生物質に対する耐容能、種子油含有率の改良、種子タンパク質含有率の改良である。

【0076】

ステップ２＝編集のために使用されるエンドヌクレアーゼに応じて対象とする標的核酸配列中の標的ヌクレオチドコドン近くのＰＡＭ識別

【0077】

当業者は、異なるエンドヌクレアーゼのＰＡＭ特異性を知っている。

【0078】

本発明のエンドヌクレアーゼは、平滑末端、通常、クラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを生成するＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである。本発明のクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、国際公開第２０１４／０９３６６１号または国際公開第２０１３／１７６７７２号に記載されているＳｐＣａｓ９であり得、Wang et al (2020)におけるＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＦｎＣａｓ９、ＲＨＡ ＦｎＣａｓ９であり得、ｘＣａｓ９（Hu et al, 2018）、Ｃａｓ９－ＮＧ (Nishimasu et al, 2018)であり得る。

【0079】

ステップ３＝標的ヌクレオチドコドンを改変するために必要な切断／切断サイトおよび所望の連続的欠失／挿入の部位を識別する

【0080】

切断サイトにおいて観察される最も多いＮＨＥＪ修復エラーは、１～３ヌクレオチドの欠失および１ヌクレオチドの挿入である。

【0081】

Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、Ｃａｓ９における２つのヌクレアーゼドメインは、各々、ＰＡＭの３塩基上流でＤＮＡ鎖の１つを切断して、平滑末端ＤＮＡ二本鎖切断端（ＤＳＢ）を残す。ＰＡＭ配列上流（５’）の４番目のヌクレオチドの欠失、４番目および５番目のヌクレオチドの欠失、もしくは４番目、５番目および６番目のヌクレオチドの欠失または４番目の位置における１つのヌクレオチドの挿入は、野生型配列中に導入される高頻度の改変である。

【0082】

ステップ４＝野生型配列中の所望の位置における二本鎖ＤＮＡを切断するための一次ガイドの設計ならびに連続的所望の欠失または挿入イベントに対して特異的な次のガイドの設計（ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼは標的配列中の二本鎖切断端（切り口とも呼ばれる）を導入することができることが思い出される）は、総じて、ヌクレオチド挿入または１～３ヌクレオチド欠失により修復される。

【0083】

ステップ５＝改変コドンを得るための細胞内または複数の細胞内のガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする発現カセット）およびエンドヌクレアーゼ（またはエンドヌクレアーゼをコードする発現カセット）の導入

【0084】

コドン書換えマシーナリーの送達は、標的細胞に依存する。当業者は、送達方法を如何に適応させるかを知っている。

【0085】

コドン書換えマシーナリーを、例として、核酸ベクター中の発現カセットまたはリボ核タンパク質複合体として送達することができる。

【0086】

ステップ６＝所望のコドン改変を有する編集された細胞を識別するために細胞をスクリーニングする

【0087】

全ての細胞のＤＮＡを抽出し、標的領域を、充分なプライマーを用いて増幅し、配列決定する。標的領域を野生型配列にアラインし、編集の導入を検証する。

【0088】

編集された細胞の識別を、全ＲＮＡまたは全タンパク質の抽出により行うことができる。

【0089】

例えば、コドン改変が形態差または耐性を導入する場合、編集された細胞を目視で識別することも可能である。

【0090】

編集された細胞が植物細胞である場合、編集された細胞を編集された植物に再生することができる。当業者は、各植物に適した再生方法を知っている。

【0091】

コドン書換え方法を開始する前に、細胞ＤＮＡ修復マシーナリーを用いて得られた各可能性のあるヌクレオチドの欠失および挿入の頻度を決定するために、ガイドＲＮＡを用いて対象とする標的核酸配列内の標的領域を試験することは可能である。

【0092】

この試験を行うために、ガイドＲＮＡは、選択されたエンドヌクレアーゼを細胞に提供する。細胞を、編集に充分な条件下で維持する。全ての細胞のＤＮＡを抽出し、標的領域を、充分なプライマーを用いて増幅し、増幅産物を配列決定する。

【0093】

したがって、標的領域における４ヌクレオチドの欠失および挿入の頻度を測定することができる。

【0094】

このステップは、切れ目の部位において最もありそうな挿入または欠失イベントに対してガイドの設計を最適化するのに役立つ。

【0095】

場合によっては、コドンの改変を、欠失および挿入のいくつかの異なるシナリオにより行うことができる。このステップは、よりありそうなシナリオに基づいてガイドの設計を可能とすることにより最終的な効率を増大することができる。

【図面の簡単な説明】

【0096】

【図1】野生型配列のＡｓｐ９４コドンを標的とする一次ガイドＲＮＡのスペーサー配列の設計。上側の核酸配列は、ＺｍＨＲＣ（配列番号１）の標的領域である。上側の場合、核酸配列は、置換する必要があるコドンである（ＡｓｐをコードするＧＡＴ）。下線の塩基は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列である。下側の核酸配列は、野生型配列の一次ガイドＲＮＡにおいて使用されるＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４スペーサー設計（配列番号３）である。

【図2】ＺｍＨＲＣ標的領域における最も一般的インデル。野生型配列は、上部に示されている（配列番号４３）。標的配列は、四角形内に示されており；ＰＡＭ配列は下線を引いており；欠失は破線により示され；Ａｓｐ９４のコドンは太字である（配列番号４４～４８）。

【図3】１０５編集Ｔ０植物の中からＺｍＨＲＣにおけるインデル型の修復。

【図4】Ａｓｐ９４コドンを標的とする二次ガイドＲＮＡのスペーサー配列の設計。上側核酸配列は、ＧＡＴコドンの３ヌクレオチド（ｄｅｌ３）の欠失を有するＺｍＨＲＣ（配列番号１）における標的領域である。下線の塩基は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列である。下側の核酸配列は、ガイドＲＮＡにおいて使用されるＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３特異的スペーサー設（配列番号１２）である。

【図5】Ａｓｐ９４コドンを標的とする三次ガイドＲＮＡのスペーサー配列の設計。上側核酸配列は、ＧＡＴコドンの３ヌクレオチドの欠失および１つのＴの挿入（ｄｅｌ３ｉｎｓＴ）を有するＺｍＨＲＣ（配列番号１）における標的領域である。下線の塩基は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列である。下側の核酸配列は、ガイドＲＮＡにおいて使用されるＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３ｉｎｓＴ特異的スペーサー設（配列番号１５）である。

【図6】Ａｓｐ９４コドンを標的とする四次ガイドＲＮＡのスペーサー配列の設計。上側核酸配列は、ＧＡＴコドンの３ヌクレオチドの欠失および２つのＴの挿入（ｄｅｌ３ｉｎｓＴＴ）を有するＺｍＨＲＣ（配列番号１）における標的領域である。下線の塩基は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列である。下側の核酸配列は、ガイドＲＮＡにおいて使用されるＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３ｉｎｓＴＴ特異的スペーサー設（配列番号１８）である。

【図7】ＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ－９４－Ｐｈｅ完全コドン書換え（配列番号４９）。

【図8】野生型配列のＶａｌ２８６コドンを標的とする一次ガイドＲＮＡのスペーサー配列の設計。上側核酸配列は、ＴａＬｏｘ１における標的領域である。上側の場合、核酸配列は、置換される必要があるコドンである（ＶａｌをコードするＧＴＣ）。第二核酸配列は、相補鎖である。下線の塩基は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列である。下側の核酸配列は、野生型配列のガイドＲＮＡにおいて使用されるＴａＬｏｘ１＿Ｖａｌ２８６特異的スペーサー（配列番号２１）である。

【図9】染色体ＢおよびＤのＴａＬｏｘ１標的領域における最も一般的インデル。野生型配列（配列番号５０）は、上部に示される。標的配列は、四角形内に示されており；ＰＡＭ配列は下線を引いており；欠失は破線により示され；Ｖａｌ２８６のコドンは太字である（配列番号５１～５５）。

【図10】５１編集Ｔ０植物の中からＴａＬｏｘ１におけるインデル型の修復。

【図11】Ｖａｌ２８６コドンを標的とする二次ガイドＲＮＡのスペーサー配列の設計。上側核酸配列は、２ヌクレオチドの欠失（ｄｅｌ２）を有するＴａＬｏｘ１における標的領域である。第二核酸配列は、相補鎖である。下線の塩基は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列である。下側の核酸配列は、ガイドＲＮＡにおいて使用されるＴａＬｏｘ１＿Ｖａｌ２８６－ｄｅｌ２特異的スペーサー設計（配列番号２７）である。

【図12】Ｖａｌ２８６コドンを標的とする三次ガイドＲＮＡのスペーサー配列の設計。上側核酸配列は、２ヌクレオチドの欠失および１つのＡの付加（ｄｅｌ２ｉｎｓＡ）を有するＴａＬｏｘ１における標的領域である。第二核酸配列は、相補鎖である。下線の塩基は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列である。下側の核酸配列は、ガイドＲＮＡにおいて使用されるＴａＬｏｘ１＿Ｖａｌ２８６－ｄｅｌ２ｉｎｓＡ特異的スペーサー設計（配列番号３０）である。

【図13】ＴａＬｏｘ１＿Ｖａｌ－２８６－Ｇｌｕ部分的コドン書換え（配列番号５６）。

【図14】野生型配列のＳｅｒ６２１コドンを標的とする一次ガイドＲＮＡのスペーサー配列の設計。上側核酸配列は、ＺｍＡＬＳ２における標的領域である。上側の場合、核酸配列は、置換される必要があるコドンである（ＳｅｒをコードするＡＧＴ）。下線の塩基は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列である。下側の核酸配列は、野生型配列のガイドＲＮＡにおいて使用されるＺｍ＿ＡＬＳ２＿Ｓｅｒ６２１特異的スペーサー設計（配列番号３５）である。

【図15】Ｓｅｒ６２１コドンを標的とする二次ガイドＲＮＡのスペーサー配列の設計。上側核酸配列は、標的コドンにおけるＧの欠失（ｄｅｌ１）を有するＺｍＡＬＳ２における標的領域である。下線の塩基は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列である。下側の核酸配列は、ガイドＲＮＡにおいて使用されるＺｍＡＬＳ２＿Ｓｅｒ６２１－ｄｅｌ１特異的スペーサー設計（配列番号３８）である。

【図16】ＺｍＡＬＳ２ Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ部分的コドン書換え（配列番号５７）。

【実施例】

【0097】

実施例１：完全コドン書換え：トウモロコシにおけるＨＲＣ遺伝子を標的とするコドン書換えマシーナリー
Ａ）標的コドンの識別。
選択された標的は、トリーティクム・アエスティウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＫ４５０３０６．１）由来の仮想ヒスチジンリッチカルシウム結合タンパク質をコードする遺伝子であるフザリウムヘッドブライト感受性遺伝子ＨＲＣ（Su et al.）である。トウモロコシＨＲＣ遺伝子（Zea maize cvA188）を同定した（配列番号１）。ＺｍＨＲＣタンパク質（配列番号２）中の位置９４におけるアスパラギン酸アミノ酸（Ａｓｐ）をコードする標的コドンＧＡＴは、同位置においてフェニルアラニンアミノ酸（Ｐｈｅ）をコードするＴＴＴまたはＴＴＣにより置換されることを目的とする。所望の置換は、ＺｍＨＲＣにおけるＡｓｐ－９４－Ｐｈｅ変異である。
配列番号１においてＡｓｐ９４コドンを標的とする一次ｇＲＮＡを、野生型配列のＡｓｐ９４コドン後の切断点を導入するようにコード鎖上に設計した。（図１）

【0098】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる期待される切断サイトは、ＰＡＭサイトの３塩基上流（５’）に位置する（下線）。切断は、Ａｓｐ９４のＧＡＴコドンにおけるＴ後に位置する。

【0099】

Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの送達によるトウモロコシ植物細胞におけるゲノム編集ならびにトウモロコシ植物の再生
Ｃａｓ９ ｇＲＮＡガイドを、実施例１Ａ）に記載されている切断サイトを標的とするように設計し（配列番号４）、前記ガイドを発現する核酸を、トウモロコシＵ６プロモーター（配列番号５）の後ろで高コピー数プラスミドにクローン化して配列番号６を生成する。

【0100】

ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９遺伝子は、当技術分野において公知の標準的技術を用いてイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）に最適化されたコドン（配列番号７）であり、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を両末端において添加した：配列番号８によりコードされたサルウイルス４０（ＳＶ４０）単節型アミノ末端ＮＬＳならびに、それぞれ、アミノ末端およびカルボン酸末端における配列番号９によりコードされたアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）ヌクレオプラスミンＮＬＳ。Ｃａｓ９の最適化配列を、トウモロコシユビキチンプロモーターならびに第一イントロン（Christensen et al.）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＮＯＳターミネーター（Depicker et al.）の制御下、標準的方法によりクローン化した。

【0101】

Ｃａｓ９発現カセットおよびｇＲＮＡカセットを、レポーターおよび選択可能なマーカーカセットを有するバイナリーペクターｐＭＲＴに導入してｐＢＩＯＳ１２０９４ベクターを生成し、アグロバクテリウム株強病原性ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１（Komari et al.）に形質転換した。

【0102】

トウモロコシＡ１８８未成熟胚をアグロバクテリウム株強病原性ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１およびIshida et al, 2007に記載されている手順に従って再生された植物においてｐＢＩＯＳ１２０９４を用いて形質転換した。

【0103】

Ｃ）一次ガイドを用いて得られた変異プロファイルの解析
編集を検出するため、再生されたトウモロコシ植物由来のＤＮＡを、葉サンプルから抽出し、Ａｓｐ９４標的サイトを、プライマーＰＰ＿０３３５９＿Ｆ（配列番号１０）およびＰＰ＿０３３５９＿Ｒ（配列番号１１）を用いて増幅する。増幅産物を、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術を用いて配列決定する。Ａｓｐ９４標的サイトを中心とした１０ヌクレオチド領域における少なくとも１ヌクレオチドのインデルを有する配列数を評価する。（図２）

【0104】

１０５ Ｔ０トランスジェニック植物におけるインデル型の修復を図３に示す。

【0105】

Ａｓｐ－９４－Ｐｈｅ変異に必要なＡｓｐ９４の座位における３ヌクレオチドの欠失および１ヌクレオチドの挿入は可能性があり高頻度である。加えて、Ｔヌクレオチドの挿入は、１ヌクレオチドの挿入で頻繁に見られる。

【0106】

【表1】

【0107】

Ａｓｐ９４のコドンに対するＴＴＴによるＧＡＴの置換は、妥当な頻度で起こり得る。期待される改変は、ＧＡＴコドンの３ヌクレオチドの欠失およびＴの３連続付加である。

【0108】

Ｄ）二次ガイドＲＮＡの設計
一次ガイドを用いて得られることができる様々な変異の中でも、３ヌクレオチド（ＧＡＴ）の欠失が望ましい（ｄｅｌ３）。二次ガイドを、Ａｓｐ９４コドンの３ヌクレオチド（ＧＡＴ）の欠失を有するＺｍＨＲＣ配列に特異的であるように設計する。（図４）

【0109】

Ｃａｓ９ ｇＲＮＡガイド（配列番号１３）を、ＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３を標的とするように設計し、前記ガイドを発現する核酸を、トウモロコシＵ６プロモーター（配列番号５）の後ろで高コピー数プラスミドにクローン化して配列番号１４を生成する。

【0110】

Ｅ）三次ガイドＲＮＡの設計。
二次ガイドを用いて得られることができる様々な変異の中でも、１ヌクレオチド（Ｔ）の挿入が望ましい（ｄｅｌ３ｉｎｓＴ）。三次ガイドを、ＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３において１ヌクレオチド（Ｔ）の挿入を有するＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３配列に特異的であるように設計する。（図５）

【0111】

Ｃａｓ９ ｇＲＮＡガイド（配列番号１６）を、ＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３ｉｎｓＴを標的とするように設計し、前記ガイドを発現する核酸を、トウモロコシＵ６プロモーター（配列番号５）の後ろで高コピー数プラスミドにクローン化して配列番号１７を生成する。

【0112】

Ｆ）四次ガイドＲＮＡの設計。
三次ガイドを用いて得られることができる様々な変異の中でも、１ヌクレオチド（Ｔ）の挿入が望ましい（ｄｅｌ３ｉｎｓＴＴ）。四次ガイドを、ＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３ｉｎｓＴにおいて１ヌクレオチド（Ｔ）の挿入を有するＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３ｉｎｓＴＴ配列に特異的であるように設計する。（図６）

【0113】

Ｃａｓ９ ｇＲＮＡガイド（配列番号１９）を、ＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４－ｄｅｌ３ｉｎｓＴＴを標的とするように設計し、前記ガイドを発現する核酸を、トウモロコシＵ６プロモーター（配列番号５）の後ろで高コピー数プラスミドにクローン化して配列番号２０を生成する。
四次ガイドを用いて得られることができる様々な変異の中で、１ヌクレオチド（Ｔ）の挿入が起こり、したがって所望のＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ－９４－Ｐｈｅコドン書換えを生成する。（図７）

【0114】

Ｇ）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの送達によるトウモロコシ植物細胞におけるコドン書換えならびにトウモロコシ植物の再生
一次、二次、三次および四次ガイドのためのＣａｓ９発現カセットおよびｇＲＮＡカセットを、レポーターおよび選択可能なマーカーカセットを有するバイナリーペクターｐＭＲＴに導入して、ｐＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ－９４－Ｐｈｅ＿Ｃｄ－ＲＷベクターを生成し、強病原性アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１に形質転換した（実施例１Ａのように）。

【0115】

トウモロコシＡ１８８未成熟胚を、アグロバクテリウム株強病原性ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１においてｐＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ－９４－Ｐｈｅ＿Ｃｄ－ＲＷを用いて形質転換し、実施例１Ｂに記載されている手順に従って植物を再生する。

【0116】

Ｈ）トウモロコシ植物において得られる変異プロファイルの解析
編集を検出するため、再生されたトウモロコシ植物由来のＤＮＡを、葉サンプルから抽出し、ＺｍＨＲＣ＿Ａｓｐ９４標的サイトを、プライマーＰＰ＿０３３５９＿Ｆ（配列番号１０）およびＰＰ＿０３３５９＿Ｒ（配列番号１１）を用いて増幅する。増幅産物を、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術を用いて配列決定する。所望のＡｓｐ－９４－Ｐｈｅコドン書換えを含む植物を識別し、これらの表現型を、フサリウム病原菌の存在下で評価する。

【0117】

実施例２：部分的コドン書換え：コムギにおけるＬｏｘ１遺伝子を標的とするコドン書換えマシーナリー
Ａ）標的コドンの識別。
選択された標的は、９－リポキシゲナーゼをコードするトリティクム・アエスティウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＱ１６６６９２．１）由来のリポキシゲナーゼ１遺伝子（Ｌｏｘ１）である。この遺伝子のサイレンシングは、コムギに赤かび病に対する耐性を付与する。

【0118】

Ｌｏｘ１遺伝子を改変するこの実験では、ＴａＬｏｘ１の位置２８６においてバリンアミノ酸（Ｖａｌ）をコードする標的コドンＧＴＣをＧＡＡまたはＧＡＧにより置換して同位置においてグルタミン酸アミノ酸（Ｇｌｕ）をコードする。所望の置換は、ＴａＬｏｘ１におけるＶａｌ－２８６－Ｇｌｕ変異である。

【0119】

ＴａＬｏｘ１を標的とする機能性ｇＲＮＡは、Wang et al, 2018により、相補鎖上で識別された。このガイドを選択して一次ガイドを設計する。（図８）

【0120】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる期待される切断サイトは、Wang et al, 2018により示されているようにＬｏｘ１タンパク質のＶａｌ２８６のためのコドン中のＧの後、ＰＡＭサイトの３塩基上流（５’）に位置する。

【0121】

コドン表により、Ａｓｐは、ＧＡＡまたはＧＡＧのいずれかによりコードされる。Ｖａｌ－２８６－Ｇｌｕ変異のための最小経路は、ＡＡまたはＡＧによるＧＴＣコドンの最終２ヌクレオチド（ＴＣ）の置換を含む。

【0122】

Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの送達によるコムギ植物細胞におけるゲノム編集およびコムギ植物の再生
Ｃａｓ９ ｇＲＮＡガイド（配列番号２２）を、実施例２Ａ）に記載されているサイトを標的とするように設計し、前記ガイドを発現する核酸を、コムギＵ６プロモーター（配列番号２３）の後ろで高コピー数プラスミドにクローン化して配列番号２４を生成する。

【0123】

Ｃａｓ９発現カセットおよびｇＲＮＡカセットを、レポーターおよび選択可能なマーカーカセットを有するバイナリーペクターｐＭＲＴに導入してｐＢＩＯＳ１２０９３ベクターを生成し、アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０５に形質転換した。

【0124】

コムギ未成熟胚を、Ishida et al, 2015により記載されているように形質転換し、選択し、再生した。

【0125】

Ｃ）一次ガイドを用いて得られた変異プロファイルの解析
編集を検出するため、コムギ植物由来のＤＮＡを、葉サンプルから抽出し、Ｖａｌ２８６標的サイトを、プライマーＰＰ＿０３３４４＿Ｆ（配列番号２５）およびＰＰ＿０３３４４＿Ｒ（配列番号２６）を用いて増幅する。増幅産物を、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術を用いて配列決定する。Ｖａｌ２８６標的サイトを中心とした１０ヌクレオチド領域における少なくとも１ヌクレオチドのインデルを有する配列数を評価する（図９）。

【0126】

５１ Ｔ０トランスジェニック植物におけるインデル型の修復を図１０に示す。

【0127】

したがって、Ｖａｌ－２８６－Ｇｌｕ変異に必要なＶａｌ２８６の座位における２ヌクレオチドの欠失および１ヌクレオチドの挿入は可能性がある。加えて、全４ヌクレオチドは、１ヌクレオチドの中で見られる。

【0128】

【表2】

【0129】

Ｖａｌ２８６のＧＴＣコドンにおけるＡＡまたはＡＧによるＴＣの置換は、妥当な頻度で起こり得る。置換ＡＡは、ＡＧより高頻度で起こる。

【0130】

Ｄ）二次ガイドＲＮＡの設計。
一次ガイドを用いて得られることができる様々な変異の中でも、２ヌクレオチド（ＴＣ）の欠失が望ましい。二次ガイドを、Ｖａｌ２８６コドンの２ヌクレオチド（ＴＣ）の欠失を有するＴａＬｏｘ１配列に特異的であるように設計する。（図１１）

【0131】

Ｃａｓ９ ｇＲＮＡガイド（配列番号２８）を、ＴａＬｏｘ１＿Ｖａｌ２８６－ｄｅｌ２を標的とするように設計し、前記ガイドを発現する核酸を、コムギＵ６プロモーター（配列番号２３）の後ろで高コピー数プラスミドにクローン化して配列番号２９を生成する。

【0132】

Ｅ）三次ガイドＲＮＡの設計。
二次ガイドを用いて得られることができる様々な変異の中でも、ＡまたはＧヌクレオチドの挿入が望ましい。Ａ挿入の頻度が標的座位においてより高い（実施例２Ｃ）ので、Ａの挿入は好ましい。三次ガイドを、ＴａＬｏｘ１＿Ｖａｌ２８６－ｄｅｌ２において１ヌクレオチド（Ａ）の挿入を有するＴａＬｏｘ１＿Ｖａｌ２８６－ｄｅｌ２配列に特異的であるように設計する。（図１２）

【0133】

Ｃａｓ９ ｇＲＮＡガイド（配列番号３１）を、ＴａＬｏｘ１＿Ｖａｌ２８６－ｄｅｌ２ｉｎｓＡを標的とするように設計し、前記ガイドを発現する核酸を、コムギＵ６プロモーター（配列番号２３）の後ろで高コピー数プラスミドにクローン化して配列番号３２を生成する。
三次ガイドを用いて得られることができる様々な変異の中で、Ａの挿入が起こり、所望のＶａｌ－２８６－Ｇｌｕコドン書換えを生成する。（図１３）

【0134】

Ｆ）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの送達によるコムギ植物細胞におけるコドン書換えおよびコムギ植物の再生
一次、二次および三次ガイドのためのＣａｓ９発現カセットおよびｇＲＮＡカセットを、レポーターおよび選択可能なマーカーカセットを有するバイナリーペクターに導入して、ｐＴａＬｏｘ１＿Ｖａｌ－２８６－Ｇｌｕ＿Ｃｄ－ＲＷベクターを生成し、アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０５に形質転換した。

【0135】

コムギ未成熟胚を、Ishida et al, 2015により記載されているように形質転換し、選択し、再生した。

【0136】

Ｇ）一次ガイドを用いて得られた変異プロファイルの解析
編集を検出するため、コムギ植物由来のＤＮＡを、葉サンプルから抽出し、Ｖａｌ２８６標的サイトを、プライマーＰＰ＿０３３４４＿Ｆ（配列番号２５）およびＰＰ＿０３３４４＿Ｆ（配列番号２６）を用いて増幅する。増幅産物を、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術を用いて配列決定する。所望のＶａｌ－２８６－Ｇｌｕコドン書換えを含む植物を識別し、これらの表現型を評価する。

【0137】

実施例３：部分的コドン書換え：トウモロコシにおける除草剤耐性のためのＺｍＡＨＡＳ遺伝子を標的とするコドン書換えマシーナリー
Ａ）標的コドンの識別。
選択された標的は、除草剤および選択可能なマーカー遺伝子アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳまたはＡＬＳ）である。トウモロコシＡＬＳタンパク質中の位置６２１におけるアスパラギン（Ａｓｎ）によるセリン（Ｓｅｒ）の置換は、クロルスルフロンまたはイマゼタピルなどのスルホニルウレア除草剤に対するトウモロコシカルスの耐性をもたらす（Zhu et al.）。トウモロコシは、２つの遺伝子：ＡＬＳ１（配列番号３３）およびＡＬＳ２（配列番号３４）を有する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ変異をＺｍＡＬＳ２に導入するように設計する。

【0138】

ＺｍＡＬＳ２中の位置６２１におけるセリンアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする標的コドンＡＧＴは、トウモロコシの除草剤耐性を導入するために、同位置においてアスパラギンアミノ酸（Ａｓｎ）をコードするようにＡＡＴまたはＡＡＣにより置換しなければならない。所望の置換は、ＺｍＡＬＳ２におけるＳｅｒ－６２１－Ａｓｎ変異である。

【0139】

Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ変異を導入するための塩基置換は、次の最小変更を要する：ＡＧＴにおいてＧを欠失してＡにより置換してＡＡＴを生成する。

【0140】

Ｂ）一次ガイドＲＮＡの設計
最適Ｃａｓ９ ＰＡＭ配列を、Ｓｅｒ６２１コドンにおける標的とされるＧの直後に切れ目を導入するように、標的とされるヌクレオチドＺｍＡＬＳ２の近くで識別する。（図１４）

【0141】

Ｃａｓ９ ｇＲＮＡガイドを設計し（配列番号３６）、前記ガイドを発現する核酸を、トウモロコシＵ６プロモーター（配列番号５）の後ろで高コピー数プラスミドにクローン化して配列番号３７を生成する。

【0142】

Ｃ）二次ガイドＲＮＡの設計
一次ガイドを用いて得られることができる様々な変異の中でも、１ヌクレオチド（Ｇ）の欠失が望ましい。二次ガイドを、ＺｍＡＬＳ２＿Ｓｅｒ６２１の１ヌクレオチド（Ｇ）の欠失を有するＺｍＡＬＳ２配列に特異的であるように設計する。（図１５）

【0143】

Ｃａｓ９ ｇＲＮＡガイド（配列番号３９）を、ＺｍＡＬＳ２＿Ｓｅｒ６２１－ｄｅｌ１を標的とするように設計し、前記ガイドを発現する核酸を、トウモロコシＵ６プロモーター（配列番号５）の後ろで高コピー数プラスミドにクローン化して配列番号４０を生成する。

【0144】

二次ガイドは、欠失されたＧの部位において切断を導入してこのサイトに新たな変異を誘導する。これらの変異のいくつかはヌクレオチド（Ａ）の挿入であり、ＺｍＡＬＳ２へのＳｅｒ－６２１－Ａｓｎ変異を生成する（図１６）。

【0145】

Ｄ）トウモロコシプロトプラストにおけるコドン書換え
１つの実験では、一次ｇＲＮＡ（配列番号３７）および二次ｇＲＮＡ（配列番号４０）プラスミドの両方を、標準的ＰＥＧ系プロトコール（Cao et al.）を用いて、Ｃａｓ９カセットおよびレポーターカセットでトウモロコシＡ１８８プロトプラストに同時形質転換する。

【0146】

編集を検出するため、トウモロコシプロトプラスト由来のＤＮＡを抽出し、Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ標的サイトを、プライマーＺｍＡＬＳ＿６２１＿ｆｏｒ（配列番号４１）およびＺｍＡＬＳ＿６２１＿ｒｅｖ（配列番号４２）を用いて増幅する。増幅産物を、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術を用いて配列決定する。所望のＧからＡへ編集（Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ）した配列数を評価して、コドン書換えの相対的効率を決定する。

【0147】

Ｅ）トウモロコシカルスにおけるコドン書換え
第二実験では、Ｃａｓ９発現カセットならびに一次ｇＲＮＡ（配列番号３７）および二次ｇＲＮＡ（配列番号４０）の両方を、レポーターおよび選択可能なマーカーカセットを有するバイナリーペクターｐＭＲＴに導入して、ｐＺｍＡＬＳ２＿Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ＿Ｃｄ－ＲＷベクターを生成した。

【0148】

ｐＺｍＡＬＳ２＿Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ＿Ｃｄ－ＲＷを、Kirihara, 1994により記載されている遺伝子銃によりトウモロコシブラックメキシカンスイート（ＢＭＳ）細胞懸濁液に導入する。個別のクロルスルフロン耐性カルスを単離し、ＤＮＡを標準的プロトコールにより抽出した。

【0149】

Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ標的サイトを、プライマーＺｍＡＬＳ＿６２１＿ｆｏｒ（配列番号４１）およびＺｍＡＬＳ＿６２１＿ｒｅｖ（配列番号４２）を用いて増幅する。増幅産物を配列決定して、特定のコドン書換えを確認する。

【0150】

Ｆ）ＡＨＡＳ遺伝子により除草剤耐性トウモロコシ植物を得るためのコドン書換え
第三実験では、ｐＺｍＡＬＳ２＿Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ＿Ｃｄ－ＲＷを、アグロバクテリウム株強病原性ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１に形質転換し（Komari et al.）、トウモロコシＡ１８８未成熟胚およびIshida et al, 2007により記載されている手順に従って再生された植物を形質転換するために使用する。

【0151】

Ｔ０植物に対して、Ｓｅｒ－６２１－Ａｓｎ標的サイトを、プライマーＺｍＡＬＳ＿６２１＿ｆｏｒ（配列番号４１）およびＺｍＡＬＳ＿６２１＿ｒｅｖ（配列番号４２）を用いて増幅する。増幅産物を配列決定して、特定のコドン書換えを確認し、頻度を評価する。クロルスルフロン耐性を、Svitashev et al, 2015により記載されているＴ１植物に対して確認する。

【0152】

［参考文献］

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

2023545403000001.app

【国際調査報告】