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特表2023-545413Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体を含む免疫細胞およびそれを用いる方法｛ＴＣＥＬＬＲＥＣＥＰＴＯＲＳ、ＩＭＭＵＮＥＣＥＬＬＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧＴＣＥＬＬＲＥＣＥＰＴＯＲＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＵＳＩＮＧＴＨＥＳＡＭＥ｝

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-30

(54)【発明の名称】Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体を含む免疫細胞およびそれを用いる方法｛ＴＣＥＬＬＲＥＣＥＰＴＯＲＳ、ＩＭＭＵＮＥＣＥＬＬＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧＴＣＥＬＬＲＥＣＥＰＴＯＲＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＵＳＩＮＧＴＨＥＳＡＭＥ｝

(51)【国際特許分類】

C07K 14/725 20060101AFI20231023BHJP

C12N 15/12 20060101ALI20231023BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20231023BHJP

C12N 15/867 20060101ALI20231023BHJP

C12N 5/0783 20100101ALI20231023BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20231023BHJP

A61K 35/17 20150101ALI20231023BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20231023BHJP

【ＦＩ】

C07K14/725

C12N15/12 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/867 Z

C12N5/0783

A61P35/00

A61K35/17

A61K48/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023521138

(86)(22)【出願日】2021-10-07

(85)【翻訳文提出日】2023-04-07

(86)【国際出願番号】 KR2021013826

(87)【国際公開番号】W WO2022075784

(87)【国際公開日】2022-04-14

(31)【優先権主張番号】10-2020-0129446

(32)【優先日】2020-10-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523123248

【氏名又は名称】ダアンバイオセラピュティクスカンパニー、リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チョ、ビョウンチュル

(72)【発明者】

【氏名】ピョ、キョウンホ

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジャエフワン

(72)【発明者】

【氏名】ビェオン、イェオンセオン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ヨウンセオブ

(72)【発明者】

【氏名】シン、チュンフェン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

【要約】
本明細書では、抗原特異的Ｔ－細胞受容体だけでなく、核酸、ベクターおよびこれを含む免疫細胞およびこれを用いる方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｔ細胞受容体（Ｔｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ）であって、
（ｉ）アミノ酸配列ＣＡＦＩＧＨＧＧＳＱＧＮＬＩＦ（配列番号１）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＭＱＧＡＭＳＥＱＦＦ（配列番号１３）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＡＴＧＴＹＫＹＩＦ（配列番号２）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＰＥＦＡＲＡＬＤＮＱＰＱＨＦ（配列番号１４）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＹＧＧＧＳＥＫＬＶＦ（配列番号３）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＳＡＴＧＴＱＧＹＴＦ（配列番号１５）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｉｖ）アミノ酸配列ＣＡＬＩＮＡＲＬＭＦ（配列番号４）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＦＴＮＴＧＥＬＦＦ（配列番号１６）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｖ）アミノ酸配列ＣＡＶＮＧＧＳＱＧＮＬＩＦ（配列番号５）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＭＷＱＧＮＧＥＱＹＦ（配列番号１７）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｖｉ）アミノ酸配列ＣＡＭＲＥＧＹＧＧＡＴＮＫＬＩＦ（配列番号６）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＶＧＰＧＴＴＳＹＮＥＱＦＦ（配列番号１８）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｖｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＹＮＮＧＤＧＧＳＱＧＮＬＩＦ（配列番号７）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＴＳＲＤＲＳＴＤＴＱＹＦ（配列番号１９）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＴＤＧＧＳＡＲＱＬＴＦ（配列番号８）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＬＧＬＳＧＹＴＦ（配列番号２０）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｉｘ）アミノ酸配列ＣＡＴＬＹＮＴＤＫＬＩＦ（配列番号９）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＱＳＭＮＴＥＡＦＦ（配列番号２１）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｘ）アミノ酸配列ＣＡＭＲＧＰＷＲＧＳＳＧＳＡＲＱＬＴＦ（配列番号１０）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＲＴＧＬＳＹＥＱＹＦ（配列番号２２）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｘｉ）アミノ酸配列ＣＡＬＳＶＲＧＦＫＴＳＹＤＫＶＩＦ（配列番号１１）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＦＧＳＡＹＮＥＱＦＦ（配列番号２３）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｘｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＶＮＭＭＤＳＳＹＫＬＩＦ（配列番号１２）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＦＰＴＡＲＳＮＴＥＡＦＦ（配列番号２４）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、Ｔ細胞受容体。

【請求項2】

前記Ｔ細胞受容体は、
ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ（配列番号４９）のアミノ酸配列またはそのＭＨＣ－結合形態内に含まれたエピトープに結合することができる、請求項１に記載のＴ細胞受容体。

【請求項3】

前記エピトープは、
ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３およびＨＬＡ－Ａ＊３１：０１のうち、少なくとも一つと結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する、請求項２に記載のＴ細胞受容体。

【請求項4】

前記Ｔ細胞受容体は、
ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異を標的とする、請求項１に記載のＴ細胞受容体。

【請求項5】

前記ＴＣＲα鎖可変領域は、
配列番号５５のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号５５は、
配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＴ細胞受容体。

【請求項6】

前記ＴＣＲα鎖可変領域は、
配列番号５７のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号５７は、
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＴ細胞受容体。

【請求項7】

前記ＴＣＲβ鎖可変領域は、
配列番号５６のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号５６は、
配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＴ細胞受容体。

【請求項8】

前記ＴＣＲβ鎖可変領域は、
配列番号５８のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号５８は、
配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＴ細胞受容体。

【請求項9】

前記Ｔ細胞受容体は、
単鎖型（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｔｙｐｅ）である、請求項１に記載のＴ細胞受容体。

【請求項10】

前記ＴＣＲα鎖可変領域および前記ＴＣＲβ鎖可変領域は、
リンカー配列によって連結される、請求項２に記載のＴ細胞受容体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体をエンコードする核酸。

【請求項12】

前記核酸は、
配列番号５１～５４のうちの少なくとも一つの核酸配列；または
前記配列番号５１～５４のうちの少なくとも一つの核酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１１に記載の核酸。

【請求項13】

前記配列番号５１および５３は、
ＴＣＲα鎖可変領域をエンコードする核酸配列である、請求項１２に記載の核酸。

【請求項14】

前記配列番号５２および５４は、
ＴＣＲβ鎖可変領域をエンコードする核酸配列である、請求項１２に記載の核酸。

【請求項15】

前記核酸は、
Ｆｕｒｉｎ、２ＡおよびＩＲＥＳ配列をさらに含む、請求項１１に記載の核酸。

【請求項16】

請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項17】

前記ベクターは、
発現ベクターである、請求項１６に記載のベクター。

【請求項18】

前記発現ベクターは、
レンチウィルスベクターである、請求項１７に記載のベクター。

【請求項19】

前記ベクターは、
配列番号５０の核酸配列；または
前記配列番号５０の核酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１６に記載のベクター。

【請求項20】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体を含む、免疫細胞。

【請求項21】

前記免疫細胞は、
ＮＫ－９２細胞である、請求項２０に記載の免疫細胞。

【請求項22】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体を含む免疫細胞を含む、細胞治療薬。

【請求項23】

エフェクターＴ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒＴｃｅｌｌ）をさらに含む、請求項２２に記載の細胞治療薬。

【請求項24】

前記細胞治療薬は、
固形癌（ｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒ）治療薬である、請求項２２に記載の細胞治療薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体を含むＮＫ細胞およびこれを用いる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

２０１８年時点で、癌治療に用いられる細胞治療薬として、ギリアド、ノバルティス、ＭＯＬＭＥＤで開発された血液癌の治療薬であるＡｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ、Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ、Ｉｍｍｕｎｃｅｌｌ－ＬＣ等がすでに市場では癌治療に活用されており、フェーズ２／３に進んだ細胞治療薬の臨床試験も進行中であった。全体の細胞治療法開発の５０％以上が北米（ＵＳＡ）において進められており（２０１８年時点で３４４件）、中国でも相当な部分の研究が進行中である（２０３件）。

【0003】

癌細胞の表面を認識し、活性化するのに適したＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲを変形させたＴＣＲ－Ｔ、腫瘍の抗原を認識する自己Ｔ細胞、ＴＩＬなどの多様な形態の細胞治療薬が開発され、前臨床及び臨床研究が進行中である。特に、ＣＤ１９をターゲットとする細胞治療薬が最も多く開発されており、ＴＡＡ／ＴＳＡ、ＢＣＭＡ、ＧＤ２、ＨＥＲ２などがこれに続いている。市場にまで進出した細胞治療薬としては、ＣＤ１９がほぼ唯一であり、現在ＩＮＤ申請プロセスがほとんどの臨床および前臨床研究と連携して進行中である。

【0004】

細胞治療薬を現在使用中の免疫チェックポイント阻害剤（Ｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と比較したとき、腫瘍内Ｔ細胞の欠如により、免疫チェックポイント阻害剤に対する有効性が十分でないことと、腫瘍内Ｔ細胞のうち、腫瘍抗原を標的とするＴ細胞は、５％内外で少ないことから、免疫治療薬に対する限界が存在する。したがって、腫瘍を標的とする免疫細胞だけを増殖させて活用するという点で、腫瘍を集中的に攻撃することができる細胞治療薬は利点がある。

【0005】

肺癌の場合、世界的にも高い死亡率を持っており、特にアジアの肺癌患者の中ではＥＧＦＲ突然変異腫瘍が５０％と相当に高い方であり、このうちの２７％がＬ８５８Ｒの変異を有している。ＥＧＦＲ突然変異の特徴は、ＥＧＦＲ標的治療薬に対する効果が初期にはよく見られるが、８～１０か月後にはほとんどの患者が耐性を持ち、獲得耐性後の治療薬が全く存在しない状態である。特に免疫チェックポイント阻害剤との併用療法に対する効果がないことが知られ、新規な治療要素の開発が必要な状態である。

【0006】

そこで、このような腫瘍の成長を指示する決定的な遺伝子病変を特異的に標的とする治療薬が必要なのが実情である。

【0007】

発明の背景となる技術は、本発明に対する理解をより容易にするために作成された。発明の背景となる技術に記載された事項が先行技術として存在すると認容するものとして解釈されてはならない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

一方、ナチュラルキラー細胞（ＮａｔｕｒａｌＫｉｌｌｅｒＣｅｌｌ、ＮＫｃｅｌｌ）は、先天性免疫系の主要成分を構成する細胞傷害性リンパ球である。一般的に、循環リンパ球のうち、約１０％～１５％を占めるＮＫ細胞は、抗原に対して非特異的であり、先行する免疫感作なしに、ウイルスが感染した細胞を含む多くの悪性細胞を標的化して結合することができ、さらに、これらをアポトーシスさせることができる。この際、標的細胞のアポトーシスは、細胞溶解を誘導することによって発生させることができる。

【0009】

したがって、ＮＫ細胞は、治療目的のために、対象体の末梢血リンパ球から単離され、単離されたＮＫ細胞は、再び細胞培養により多数を確保した後、対象体内に再注入する方式で使用されている。このような、ＮＫ細胞の治療、すなわち、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ注入療法は、感染または腫瘍細胞において非常に効果的な細胞死を誘発することができるので、注目を浴びている。しかし、ＮＫ細胞注入療法は、標的に限りがあることに限界がある。

【0010】

そこで、本発明の発明者らは、これを克服すべく、遺伝子改変を通じたＮＫ細胞に注目した。さらに具体的には、従来のＮＫ細胞ベースの細胞治療薬は、Ｆｃ受容体の発現を介して抗体依存性細胞傷害反応を誘導する、またはキメラ抗原受容体の発現を介した癌標的化などの戦略を立てている。しかし、このような戦略は、固形癌の治療において大きな効果を得られていないのが実情である。

【0011】

そのため、本発明の発明者らは、前述の固形癌治療の限界を克服するために、特定の抗原に特異的なＴ細胞受容体に注目し、これを通じてＮＫ細胞の固形癌への標的化を増進させようとした。

【0012】

結局のところ、本発明の発明者らは、固形癌に対する特定の分子変異を認識できるＴ細胞受容体を同定し、これをＮＫ細胞（ＮＫ－９２）および細胞株で発現されるように遺伝子を変形させ、固形癌に対するＮＫ細胞の標的化を向上させることができた。

【0013】

また、本発明の発明者らは、前述のＮＫ細胞にＦｃ受容体をさらに含ませると、標的化された固形癌に対する免疫応答がさらに向上されることを認知し、このことから本発明の発明者らは、Ｔ細胞受容体およびＦｃ受容体の両方を含み、固形癌に対する標的化及びその抗癌効果がさらに向上したＮＫ細胞を開発した。

【0014】

より具体的には、本発明の発明者らは、癌患者のＷＥＳとＲＮＡｓｅｑの結果に基づいて、抗原予測率９０％以上を示す解析プラットフォームを確認した。このとき、解析に適用されたアルゴリズムは、Ｎｅｔ－ＭＨＣアルゴリズムに基づくＮｅｏｐｅｐｓｅｅを介して抗原候補群を確認した。次に、予測された抗原を合成し、ＤＣ及びＣＤ８Ｔ細胞に処理し、抗原を検証する過程を実施した。

【0015】

このことからして、Ｌ８５８Ｒに対する抗原を認識できる主要ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅｓ）を発見した。その結果、Ａ＊３３：０３に対するＨＶＫＩＴＤＦＧＲ抗原結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙ）が高いだけでなく、ｎｅｏｐｅｐｓｅｅで提供される１０種類以上のパラメータ基準で、抗原として十分に機能することが予測できた。

【0016】

これに基づいて、腫瘍特異的な抗原を予測できる検証プラットフォームを構築し、抗原に対する反応を確認した。検証プラットフォームでは、ＨＬＡ－Ａがマッチングする健常人の末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）から樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＤＣ）を分化させ、抗原を認識し、これに基づいてＬ８５８Ｒに対する抗原反応性を測定した。

【0017】

その結果、予測通り、Ｌ８５８Ｒを認識するＨＬＡ－Ａを持つ患者において腫瘍に特異的に反応するＴ細胞が産生され、抗原に対する反応（ＩＦＮ－ｇａｍｍａＥＬＩＳＰＯＴ）を確認した。

【0018】

また、前述の過程を通じて同定されたＴ細胞のＴＣＲが免疫細胞内で発現可能であることが確認された。

【0019】

そこで、本発明が解決しようとする課題は、癌細胞の表面に増加するＭＨＣ－１－Ｌ８５８Ｒ新抗原複合体（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｃｏｍｐｌｅｘ）を標的するＴＣＲを有するＴ細胞またはＮＫ－９２細胞を提供し、癌細胞を直接的にアポトーシスさせることができるＥＧＦＲ変異体標的細胞治療薬を提供することである。

【0020】

また、本発明が解決しようとする他の課題は、前述のＴＣＲを有するＴ細胞またはＮＫ－９２細胞にＦｃ受容体をさらに含むことにより、それに対する免疫応答をさらに向上させ、癌細胞に対するアポトーシス機能がさらに向上した細胞治療薬を提供することである。

【0021】

さらに、前述のＨＬＡ－Ａのアジア人比率は２０％以上であり、ＥＧＦＲの突然変異を有する多くの患者が本発明の恩恵を受けられることが期待される。

【0022】

本発明の課題は、以上で述べた課題に限定されず、言及されないまた他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解されるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0023】

本発明の一実施形態によれば、本発明は、Ｔ細胞受容体（Ｔｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ）であって、
（ｉ）アミノ酸配列ＣＡＦＩＧＨＧＧＳＱＧＮＬＩＦ（配列番号１）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＭＱＧＡＭＳＥＱＦＦ（配列番号１３）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＡＴＧＴＹＫＹＩＦ（配列番号２）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＰＥＦＡＲＡＬＤＮＱＰＱＨＦ（配列番号１４）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＹＧＧＧＳＥＫＬＶＦ（配列番号３）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＳＡＴＧＴＱＧＹＴＦ（配列番号１５）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｉｖ）アミノ酸配列ＣＡＬＩＮＡＲＬＭＦ（配列番号４）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＦＴＮＴＧＥＬＦＦ（配列番号１６）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｖ）アミノ酸配列ＣＡＶＮＧＧＳＱＧＮＬＩＦ（配列番号５）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＭＷＱＧＮＧＥＱＹＦ（配列番号１７）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｖｉ）アミノ酸配列ＣＡＭＲＥＧＹＧＧＡＴＮＫＬＩＦ（配列番号６）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＶＧＰＧＴＴＳＹＮＥＱＦＦ（配列番号１８）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｖｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＹＮＮＧＤＧＧＳＱＧＮＬＩＦ（配列番号７）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＴＳＲＤＲＳＴＤＴＱＹＦ（配列番号１９）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＴＤＧＧＳＡＲＱＬＴＦ（配列番号８）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＬＧＬＳＧＹＴＦ（配列番号２０）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｉｘ）アミノ酸配列ＣＡＴＬＹＮＴＤＫＬＩＦ（配列番号９）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＱＳＭＮＴＥＡＦＦ（配列番号２１）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｘ）アミノ酸配列ＣＡＭＲＧＰＷＲＧＳＳＧＳＡＲＱＬＴＦ（配列番号１０）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＲＴＧＬＳＹＥＱＹＦ（配列番号２２）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｘｉ）アミノ酸配列ＣＡＬＳＶＲＧＦＫＴＳＹＤＫＶＩＦ（配列番号１１）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＦＧＳＡＹＮＥＱＦＦ（配列番号２３）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、または
（ｘｉｉ）アミノ酸配列ＣＡＶＮＭＭＤＳＳＹＫＬＩＦ（配列番号１２）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および
アミノ酸配列ＣＡＳＳＦＰＴＡＲＳＮＴＥＡＦＦ（配列番号２４）またはその変異体を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、Ｔ細胞受容体を提供する。

【0024】

本発明の特徴によれば、Ｔ細胞受容体は、
ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ（配列番号４９）のアミノ酸配列またはそのＭＨＣ－結合形態内に含まれたエピトープに結合することができ、エピトープは、
ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３およびＨＬＡ－Ａ＊３１：０１のうちの少なくとも一つと結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙ）を有することができる。

【0025】

本発明のもう一つの特徴によれば、Ｔ細胞受容体は、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異を標的とすることができる。

【0026】

本発明のもう一つの特徴によれば、ＴＣＲα鎖可変領域は、配列番号５５のアミノ酸配列からなり、前記配列番号５５は、配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。

【0027】

本発明のもう一つの特徴によれば、ＴＣＲα鎖可変領域は、配列番号５７のアミノ酸配列からなり、前記配列番号５７は、配列番号２のアミノ酸配列を含むことができる。

【0028】

本発明のもう一つの特徴によれば、ＴＣＲβ鎖可変領域は、配列番号５６のアミノ酸配列からなり、前記配列番号５６は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むことができる。

【0029】

本発明のもう一つの特徴によれば、ＴＣＲβ鎖可変領域は、配列番号５８のアミノ酸配列からなり、前記配列番号５８は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むことができる。

【0030】

本発明のもう一つの特徴によれば、Ｔ細胞受容体は、単鎖型（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｔｙｐｅ）であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0031】

本発明のもう一つの特徴によれば、前記ＴＣＲα鎖可変領域および前記ＴＣＲβ鎖可変領域は、リンカー配列によって連結されることができる。

【0032】

本発明の一実施形態によれば、本発明は、前述した内容によるＴＣＲをエンコードする核酸が提供される。

【0033】

本発明の特徴によれば、核酸は、配列番号５１～５４のうちの少なくとも一つの核酸配列；または前記配列番号５１～５４のうちの少なくとも一つの核酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する核酸配列を含むことができる。

【0034】

このとき、配列番号５１および５３は、ＴＣＲα鎖可変領域をエンコードする核酸配列を意味することができ、配列番号５２および５４は、ＴＣＲβ鎖可変領域をエンコードする核酸配列を意味することができる。

【0035】

本発明のもう一つの特徴によれば、核酸は、Ｆｕｒｉｎ、２ＡおよびＩＲＥＳ配列をさらに含むことができるが、これに制限されるものではない。

【0036】

本発明の一実施形態によれば、本発明は、前述した内容による核酸を含むベクターが提供される。

【0037】

このとき、ベクターは、発現ベクターであって、レンチウィルスベクターであってもよいが、これに制限されるものではなく、当業界で使用し得る発現ベクターを全部含むことができる。

【0038】

本発明の特徴によれば、ベクターは、配列番号５０の核酸配列；または前記配列番号５０の核酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する核酸配列を含むことができる。

【0039】

本発明の一実施形態によれば、本発明は、前述した内容によるＴ細胞受容体を含む免疫細胞が提供される。

【0040】

このとき、免疫細胞は、前述した内容によるＴＣＲ、核酸およびベクターを含むことができ、ＮＫ－９２細胞であってもよい。すなわち、免疫細胞は、前述した内容によるＴＣＲ、核酸およびベクターを含むことにより、ＴＣＲが発現されたＮＫ－９２であってもよい。

【0041】

さらに、免疫細胞は、ＮＫ－９２細胞であってもよいが、これに制限されるものではなく、ＴＣＲが挿入され修飾され得る多様な免疫細胞を全部含むことができる。

【0042】

本発明の一実施形態によれば、本発明は、前述したＴ細胞受容体を含む免疫細胞を含む細胞治療薬が提供される。

【0043】

本発明の特徴によれば、細胞治療薬は、効果Ｔ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒＴｃｅｌｌ）をさらに含むことができる。

【0044】

本発明のもう一つの特徴によれば、細胞治療薬は、固形癌（ｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒ）治療薬であってもよいが、これに制限されるものではなく、本発明の一実施形態による配列番号４９のＨＶＫＩＴＤＦＧＲ抗原を含むあらゆる癌腫に対する治療薬であってもよい。

【0045】

以下、実施形態を通じて本発明をより詳しく説明する。ただし、これらの実施形態は、本発明を例示的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施形態によって限定されるものと解釈されてはならない。

【発明の効果】

【0046】

本発明は、獲得耐性が生じた腫瘍に対する新規な治療薬として提案することができる。より具体的には、従来の肺癌治療薬は、初期は治療効果がみられるが、８～１０ヶ月後、ほとんどの患者から獲得耐性が発生する。しかし、これに対する代替治療薬が皆無の状態である。

【0047】

そこで、本発明は、こうした限界を克服できる新規治療薬として提案することができる。また、本発明は、獲得耐性だけでなく突然変異が発生し潜伏した（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）ＥＧＦＲを標的とし、治療できる効果がある。

【0048】

さらに、本発明は、半減期が存在する薬剤とは異なり、Ｔ細胞に対する初期活性（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）によって他の免疫応答まで一緒に増加させることによって殺腫瘍効果（ｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔ）を増強できる効果がある。

【0049】

より具体的には、本発明は、メモリーＴ細胞の分化および増殖を誘導し、癌細胞の防御機構を避け、癌または腫瘍性状態を治療、再発、進行、および転移を予防することができる効果がある。

【0050】

また、本発明は、従来のＴＫＩおよびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１のような治療薬と並行し、それぞれ薬剤の効果を増強させ、これによって、患者の生存率を増加させることができる効果がある。

【0051】

本発明による効果は、上記にて例示した内容により制限されるものではなく、より多様な効果が本明細書内に組み込まれている。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1】癌患者の抗原を予測するシステムおよびこれに基づくＴＣＲ－ＴまたはＴＣＲ－ＮＫ細胞の製造方法を例示的に示すものである。

【図2】Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅで予測される抗原を検証する過程を例示的に示すものである。

【図3】検証プラットフォームで解析した抗原特異的Ｔ細胞を検証した結果を示すものである。

【図4a】Ｌ８５８Ｒを標的とするＨＬＡ－Ａと抗原配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）結果を示すものである。

【図4b】Ｌ８５８Ｒを標的とするＨＬＡ－Ａと抗原配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）結果を示すものである。

【図5a】ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に結合する腫瘍特異的Ｔ細胞に対する結果である。

【図5b】ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に結合する腫瘍特異的Ｔ細胞に対する結果である。

【図5c】ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に結合する腫瘍特異的Ｔ細胞に対する結果である。

【図5d】ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に結合する腫瘍特異的Ｔ細胞に対する結果である。

【図6】抗原（ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマー）に特異的に活性が誘導されたＴ細胞の細胞キラー因子に対する結果である。

【図7】抗原（ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマー）に特異的に活性が誘導されたＴ細胞の受容体に対する分布図である。

【図8】Ｔフラスコ培養時、ＮＫ－９２細胞株に対する結果である。

【図9】ＦＢＳおよびＩＬ－２の濃度によるＮＫ－９２の増殖効率に対する結果である。

【図10】培養方法によるＮＫ－９２細胞株の細胞増殖効率に対する結果である。

【図11a】培養条件によるＮＫ－９２細胞株およびＦｃ受容体を発現するＮＫ－９２細胞株の活性因子および毒性因子に対する結果である。

【図11b】培養条件によるＮＫ－９２細胞株およびＦｃ受容体を発現するＮＫ－９２細胞株の活性因子および毒性因子に対する結果である。

【図12】タンパク質発現プロモーターによるＮＫ－９２細胞のＧＦＰ発現効率に対する結果である。

【図13a】ＮＫ－９２細胞におけるケモカイン受容体の発現に対する結果である。

【図13b】ＮＫ－９２細胞におけるケモカイン受容体の発現に対する結果である。

【図14a】ＮＫ－９２細胞におけるＣＤ３分子およびＴ細胞受容体分子の発現に対する結果である。

【図14b】ＮＫ－９２細胞におけるＣＤ３分子およびＴ細胞受容体分子の発現に対する結果である。

【図15a】本発明の一実施形態によるＴＣＲ配列を発現させるためのレンチウィルスベクターマップである。

【図15b】本発明の一実施形態によるＴＣＲ配列を発現させるためのＣＤ３分子およびＴ細胞受容体の核酸配列に対する模式図である。

【図16a】本発明の一実施形態によるＴＣＲの細胞活性を確認した結果である。

【図16b】本発明の一実施形態によるＴＣＲの細胞活性を確認した結果である。

【図17a】本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞に対する細胞キラー効果を確認した結果である。

【図17b】本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞に対する細胞キラー効果を確認した結果である。

【図18】本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞の腫瘍抑制効果を確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0053】

本発明の利点および特徴、並びにそれらを達成する方法は、添付される図面と共に詳細に後述する実施形態を参照すれば、明確になる。しかし、本発明は、以下に開示する実施形態に限定されるものではなく、様々な形態で具現されるものであり、ただし、本実施形態は本発明の開示が完全になるように、本願発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に理解できるように提供されるものであり、本発明は、特許請求の範囲によって定義されるだけである。本明細書にて使用される用語「Ｔ細胞受容体（Ｔ－ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）」は、天然（ｎａｔｕｒａｌ）ＴＣＲのみならず、ＴＣＲ変異体、断片、および構築物を含む。したがって、ＴＣＲは選択的に追加のドメインおよび／または部分を含み、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を含むヘテロダイマーだけでなく、多量体および単鎖構築物を含む。

【0054】

本明細書にて使用される用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、通常、結合ドメインが認識する抗原、典型的には（ポリ－）ペプチド上の部位を意味する。このとき、結合ドメインは抗原結合部位を意味する。すなわち、抗原標的の特定のエピトープと結合および相互作用する分子のドメインを意味する。

【0055】

本明細書にて使用される用語「ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌ、ＮＫｃｅｌｌ）」は、特定の抗原刺激の不在下で主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスに従って制限なく標的細胞をアポトーシスさせる免疫系の細胞である。標的細胞は、癌または腫瘍細胞であってもよい。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６の存在およびＣＤ３表面マーカーの不在を特徴とする。したがって、人工的にＣＤ３－ｇａｍｍａ、ｄｅｌｔａ、ｚｅｔａなどを挿入し、研究を行う予定である。

【0056】

本明細書にて使用される用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、形質転換プロセスによって許容細胞内に位置する場合、ベクターが複製できるように無傷のレプリコンを含む非染色体核酸を指す。ベクターは、バクテリアから複製できるが、哺乳類細胞では複製能力が限られており、ウィルス性または非－ウィルス性であってもよい。核酸を伝達するための非－ウィルスベクターは、ネイキッドＤＮＡ、単独またはカチオン性重合体と組み合わせてカチオン性脂質と複合体化したＤＮＡ、アニオン性およびカチオン性リポソーム、リポソームに含まれたカチオン性重合体、異種ポリリジン、規定された長さのオリゴペプチド、ポリエチレンアミンと縮合されたＤＮＡを含むＤＮＡタンパク質複合体および粒子、ウィルスおよびポリリジンＤＮＡを含む三元複合体を含む。

【0057】

本明細書にて使用される用語「免疫細胞」は、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒＴｃｅｌｌ、ＮＫＴ）、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌ、ＮＫ）、ヒト胚性幹細胞、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ、ＨＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ｉＰＳ）を含むことができる。このとき、Ｔ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、調節Ｔリンパ球、炎症性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球およびガンマ－デルタＴ細胞、先天性リンパ球（ＩＬＣ１、ＩＬＣ２）であってもよく、さらに、前述したＴ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびこれらの混合集団であってもよい。

【0058】

本明細書にて使用される用語「ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ、ＨＬＡ）」は、免疫系調節の原因となる細胞の表面上で主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質を暗号化するヒト遺伝子を指す。

【0059】

本明細書にて使用される用語「樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ、ＤＣ）」は、リンパ性または非－リンパ性組織で発見される形態学的に類似する細胞型の多様な集団の構成員を意味する。これらの細胞は、その独特の形態、および抗原ペプチドをＴ細胞に提示するタンパク質である表面ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の高い発現レベルを特徴とする。ＤＣを含むＡＰＣ（マクロファージなど）およびＴ細胞は、末梢血に由来する末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）のように便利に末梢血および多数の組織から単離または由来し分化し得る。

【0060】

本明細書にて使用される用語「治療」とは、癌の症状が好転したり利益となったりするすべての行為であれば制限なく含むことができる。

【0061】

本明細書にて使用される用語「特異的（に）結合」とは、一般にＴＣＲがその抗原結合部位を介してランダムな無関係の非－標的抗原よりもその意図された抗原標的により結合しやすいことを意味する。さらに、「特異的に結合する」とは、その抗原標的に対するＴＣＲの結合特異性が非標的抗原に対するその結合特異性よりも少なくとも約５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、さらにより好ましくは５０倍および最も好ましくは１００倍以上より大きいものであることを意味することができる。

【0062】

抗原の予測および検証の過程

【0063】

以下では、図１～図３の（ｂ）を参照し、Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅを介した抗原の予測および検証の過程を説明する。

【0064】

図１は、癌患者の抗原を予測するシステムおよびこれに基づいてＴＣＲ－ＴまたはＴＣＲ－ＮＫ細胞の製造方法を例示的に示すものである。例えば、患者の腫瘍からＲＮＡシーケンス(ＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ)、全エクソームシーケンス（ｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が、並びに正常な血液（ｎｏｒｍａｌｂｌｏｏｄ）における参照用ＷＥＳ(ｒｅｆｅｒｅｎｃｅＷＥＳ)を通じて患者腫瘍から発生する体細胞突然変異を確保した後、患者に由来する単核球を樹状細胞に分化し、前で確認された突然変異遺伝子から確認されるエピトープを露出し、抗原提示を通じてＴ細胞を増殖させ、増殖されたＴ細胞の反応性を確認し、確認された反応に基づいてＴ細胞のＴＣＲシーケンスを介してＴＣＲのＣＤＲ３配列を確保した後、この配列を含む遺伝子キャリアを通じてＴ細胞を腫瘍特異的細胞に変換させる。よって、自己Ｔ細胞若しくはＮＫ－９２細胞に基づいて細胞治療薬を生成し検証することができる。

【0065】

より具体的には、まず、抗原予測は腫瘍に対するワクチンや細胞治療薬の開発に先立って最も先行される必要がある。抗原予測は腫瘍に対する突然変異解析（ＷＥＳ：ｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により確保した異常な突然変異タンパク質であり、ＲＮＡｓｅｑを介して突然変異抗原が発現されることを根拠に証明される。腫瘍の抗原とＭＨＣ－１とのａｆｆｉｎｉｔｙが高まると、免疫細胞において認識し得る抗原として可能性があることを意味することができる。本研究では、抗原を解析するための解析パイプラインとしてＮｅｏｐｅｐｓｅｅを用いた。

【0066】

その次に、予測抗原に対するペプチドは、９５％以上の高純度で、９個のアミノ酸で合成／精製し、抗原の溶解に最も多く用いられるＤＭＳＯを溶媒とし、樹状細胞にＬＰＳとともに露出されたｍａｔｕｒｅＤＣに分化した後、Ｔ細胞を教育する。

【0067】

その次に、ＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現程度による検証が行われる。

【0068】

従来、抗原を解析できる検証プラットフォームとしてｐＶＡＣｓｅｑが最も一般的に用いられており、これはＬｉｎｕｘ（登録商標）とＰｙｔｈｏｎプログラムに基づくオープン解析プラットフォームである。このプログラムの中心となるアルゴリズムとしては、ＮｅｔＭＨＣ－ｐａｎというＨＬＡ－Ａの結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙ）を数値化することができ、ｐＶＡＣｓｅｑでは、追加でＲＮＡｓｅｑを介して腫瘍抗原の発現程度を含む。Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅも同様のアルゴリズムを含んでおり、１２個の追加のパラメータが含まれているので、より向上した解析プラットフォームを示す。既存に報告されている抗原探索プログラム間のベンチマーキング解析においても優れた結果を確保した解析プラットフォームである。Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅは、オープンソースプログラムであって、最近学術発表された解析技術である。

【0069】

したがって、本研究者らは、ＥＧＦＲに対する突然変異を有する患者に基づいて、Ｌ８５８ＲおよびＥ１９Ｄｅｌに対する突然変異の有無を判断して実験を行った。

【0070】

図１を参照すると、まず、患者の腫瘍のＷＥＳ、ＷＥＳにおける生殖細胞系列遺伝子変異（ｇｅｒｍｌｉｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ）またはＳＮＶを解析するためにｍａｔｃｈｅｄｎｏｒｍａｌｂｌｏｏｄを用いて参照解析を行った。ＷＥＳにて変異があるか否かを判断するために用いられたツールは、ＧＡＴＫ２パイプラインであり、ｈｇ３８に対するマッピングデータに基づいて解析を行った。

【0071】

患者の血液を５０ｍｌ確保し、ＩＦＮｇＥＬＩＳＰＯＴデータに基づいて血液中に存在するＤＣにＴ細胞を介して抗原に対する認識率検証を行った。

【0072】

その次に、コンピュータに提示された候補抗原の検証が完了すると、Ｔ細胞のＴＣＲｓｅｑを解析し、腫瘍の抗原を最もよく認識することができる主要なＴＣＲを検証する。

【0073】

その次に、検証されたＴ細胞のＴＣＲｓｅｑを介してＣＤＲ３の組換えＴＣＲを作製し、自己／同種Ｔ細胞およびＮＫ－９２細胞において抗原を特異的に認識できる細胞治療薬を生産し、これを検証する。

【0074】

図２は、Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅで予測された抗原検証プロセスを例示的に示したものである。この場合、抗原検証過程は全体で約２１日程が所要され、これはかなり短期間内に患者のＰＢＭＣから腫瘍特異的に反応する抗原を検証できるプラットフォームである。Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅで予測された抗原は、ＣＤ１４から分化したｉＤＣで合成された９ｍｅｒペプチド抗原とともにｍＤＣに分化、分化したＤＣはＴ細胞との共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）後、抗原特異的Ｔ細胞に増殖、ＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現度を根拠に検証する。各段階において細胞治療薬の開発における重要段階を１０段階で表し、ＱＣポイントを指定した。

【0075】

より具体的には、図２を参照すると、まず、初日患者の血液からＰＢＭＣを分離する。このとき、ＰＢＭＣを分離するのに用いられるプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）は、血液中のリンパ球と単核球を確保できる方法で、ＣＤ１４が陽性である細胞、すなわち、単核球を磁石と抗体－マイクロビーズ法によって確保することができる。

【0076】

その後、ＣＤ１４＋である細胞は、ＤＣに分化する過程を行う。このとき、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４を用いてｉｍＤＣへの分化を誘導する。

【0077】

次いで、ＣＤ８＋細胞もＣＤ１４－と同様の方法により採取した後、－８０℃で保管した後、抗原を提示できるｉｍＤＣに共培養するのに用いる。

【0078】

それから、７～８日目に既に合成した腫瘍抗原１０μｇ／ｍｌと共にＬＰＳを処理して１６時間培養し、ＤＣにおける腫瘍抗原が十分に認識されるように培養する。

【0079】

その後、洗浄過程を経て、ＣＤ８が陽性である細胞と一緒に培養する。

【0080】

次に、ＤＣ－ＣＤ８＋細胞の共培養を約１１日間行い、ＩＬ－７／ＩＬ－１５が施された専用培地で培養する。

【0081】

それから、１１日以降に確保されたＴ細胞のセルカウント（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇ）をし、セルカウントが完了した後、抗原を再処理し、Ｔ細胞で発現されるＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現可否をＥＬＩＳＰＯＴを通じて解析を行う。

【0082】

図３は、検証プラットフォームで解析した抗原特異的Ｔ細胞の検証結果を示すものである。このとき、Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅに対する抗原検証能力を確認するためのものであって、患者２０名（ＨＬＡ－Ａ型がＡ＊：２４：０２患者）に対する代表的な抗原を樹状細胞に認識させ、Ｔ細胞を教育させた後、実際に腫瘍抗原に対する反応があるかどうかを確認するためのＥＬＩＳＰＯＴ検証実験を行った。その結果、９０％以上の抗原検証能力があることが確認された。

【0083】

より具体的には、全世界中で最も多くの割合を占めるＨＬＡ－Ａ型のＡ＊２４．０２でもって実験を行った。２０名の患者を対象とした患者別の特異抗原をＮｅｏｐｅｐｓｅｅで予測し、合計４１個の抗原をＤＣに認識させ、Ｔ細胞を教育させた後、この抗原に対する反応程度をチェックした結果、４１個の抗原中の３個を除き、それぞれの腫瘍の抗原に反応を示した。さらに、抗原に対するＩＦＮ－ｇａｍｍａのスポット(ｓｐｏｔ)数および表面積（ａｃｔｉｖｉｔｙ）で表すことができ、ＩＦＮ－ｇａｍｍａのスポット数が多いほど抗原に対する提示（ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）が良好であることを意味することができ、表面積は抗原に対するＩＦＮ－ｇａｍｍａの量を意味することができる。さらに、何も処理していない群におけるＴ細胞のＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現程度をカットオフ（ｃｕｔ－ｏｆｆ）として陽性を判断した。

【0084】

そこで、図３を参照すると、Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅで予測するように、抗原に対するＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現予測度は、ＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現を基準に９０％以上の予測率を有することが示される。２０名の患者を対象とした患者別に特異抗原をＮｅｏｐｅｐｓｅｅで予測し、４１種の抗原に対する反応性を予測した結果、９０％以上の腫瘍抗原に対する反応が確認された。

【0085】

以上の結果から、予測力の高い腫瘍特異抗原を選別することができ、これを基に細胞治療薬の開発および検証が可能である。

【0086】

ＥＧＦＲ突然変異腫瘍に対する特異抗原の確保

【0087】

以下では、図４ａおよび４ｂを参照し、ＥＧＦＲ突然変異腫瘍に対する特異抗原について説明する。

【0088】

図４ａおよび４ｂは、Ｌ８５８Ｒを標的とするＨＬＡ－Ａと抗原配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の結果を示すものである。

【0089】

図４ａを参照すると、ＥＧＦＲに対するＬ８５８Ｒ突然変異を認識できる抗原は、Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅを通じて選別され、ＥＧＦＲに対するＬ８５８Ｒ突然変異ペプチドと野生型（ｗｉｌｄ、ＷＴ）のペプチドを生産し、ＥＧＦＲに対するＬ８５８Ｒ突然変異を認識できる抗原を１２個のｍａｊｏｒＨＬＡ－Ａに適用し、９～１１ｍｅｒに対する抗原予測程度をＭＨＣ結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙ）を通じて検証した。

【0090】

前述した過程により、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０６およびＨＬＡ－Ａ＊３１０１を含むＨＬＡ－Ａが選別され、これらはいずれも５％以上の高い頻度を有することが示され、このうちの１０％以上の頻度を有するＨＬＡ－Ａ＊２４０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１およびＨＬＡ－Ａ＊３３０３を選択し、ＥＧＦＲに対するＬ８５８Ｒ突然変異を含む計患者１０名のサンプルから抗原を導き出すことを試みた。

【0091】

そこで、図４ｂを参照すると、ＥＧＦＲに対するＬ８５８Ｒ突然変異を含む計患者１０名のサンプルは、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２およびＨＬＡ－Ａ＊０２０１とは異なり、全部共通してＨＬＡ－Ａ＊３３０３を含むことが示されることにより、ＨＬＡ－Ａ＊３３０３が選択され、これに対する抗原を確認した。

【0092】

結局、ＨＬＡ－Ａ＊３３０３に基づく患者のサンプルからＨＶＫＩＴＤＦＧＲ配列の抗原が同様の反応（結果）を有するものであることが示されたことによって、ＥＧＦＲに対するＬ８５８Ｒ突然変異に対する標的抗原をＨＶＫＩＴＤＦＧＲとして選定された。

【0093】

以上の結果から、予測力の高い腫瘍特異抗原を選別することができ、これに基づいて細胞治療薬の開発および検証が可能である。

【0094】

Ｔ細胞受容体（Ｔｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）

【0095】

以下では、図５ａ～図７を参照し、ＥＧＦＲ突然変異腫瘍に対する特異抗原を標的することができるＴＣＲについて説明する。このとき、ＥＧＦＲ突然変異腫瘍に対する特異抗原を標的することができるＴＣＲを確認するため、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒに特異的Ｔ細胞を生産し、生産されたＴ細胞をテトラマー（Ｔｅｔｒａｍｅｒ）を用いて分離（ｓｏｒｔｉｎｇ）した。さらに、分離された細胞は、単一細胞ＲＮＡ解析法により解析された。

【0096】

より具体的には、まず、個体の血液からＣＤ１４＋陽性細胞を分離し、ＥＧＦＲ－ＭＴ抗原（９ｍｅｒ）と共に培養し、抗原提示を誘導した後、同一個体のＣＤ８＋陽性細胞とも１４日間共培養した後、ＥＬＩＳＰＯＴを通じてＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒに特異的Ｔ細胞の存在を確認した。さらに、テトラマーを用いてＥＧＦＲ－ＭＴ９ｍｅｒ－ＭＨＣ－１ｃｏｍｐｌｅｘと結合できるＴ細胞を選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）した後、ｓｃＲＮＡｓｅｑ／ＶＤＪを通じてそのＴＣＲに対する配列を確保した。

【0097】

まず、図５ａ～図５ｄを参照し、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異抗原に特異的Ｔ細胞選別過程について説明する。

【0098】

図５ａは、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞に対する結果である。このとき、説明の都合上、図５ｂ～図５ｄを参照にして説明する。さらに、ＴＣＲを確認するために、Ａ＊３３：０３／Ａ＊０２．０６を含む個体から試料を採取した。

【0099】

ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）は、記憶Ｔ細胞（ｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌｓ）であって、ＣＤ４４^＋ＣＣＲ７^＋セントラルメモリー細胞（ｃｅｎｔｒａｌｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌｓ、Ｔｃｍ）およびＣＤ４４^＋ＣＣＲ７^－エフェクターメモリー細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌｓ、Ｔｅｍ）とこれが混合した細胞（ＴｃｍａｎｄＴｅｍｍｉｘｅｄ、ＣＤ４４^＋ＣＣＲ７^＋／－）を含むことが示された。

【0100】

より具体的には、図５ｂ～図５ｄを参照すると、１ａにて述べたＴ細胞における細胞活性因子に対する発現結果が示されている。

【0101】

まず、図５ｂを参照すると、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に結合する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）は、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌを発現することが示され、これは、成熟Ｔ細胞因子であるため、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）が成熟したＴ細胞であることを意味することができる。

【0102】

次に、図５ｃを参照すると、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）は、ＣＤ２５およびＣＤ６９を発現することが示され、これは、細胞活性因子であるため、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）は、活性化したエフェクターＴ細胞であること（ｅｆｆｅｃｔｏｒＴｃｅｌ）を意味することができる。

【0103】

次に、図５ｄを参照すると、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）は、ＣＣＲ７、ＩＦＮ－ｇａｍｍａおよびＧｒａｎｚｙｍｅ－Ｂを発現することが示される。

【0104】

このとき、ＣＣＲ７は、メモリー細胞因子であるため、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）はメモリーＴ細胞であって、長時間体内で生存し、２次免疫応答を惹起することを意味することができる。

【0105】

さらに、ＩＦＮ－ｇａｍｍａおよびＧｒａｎｚｙｍｅ－Ｂは、細胞毒性因子であるため、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）は、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を分泌できるＴ細胞であることを意味することができる。

【0106】

そこで、本発明の一実施形態によるＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）は、Ｌ８５８Ｒ突然変異を含む腫瘍に対するｉｎｖｉｖｏ免疫応答において、活性化されたＴ細胞を意味し、これによって、Ｌ８５８Ｒ突然変異を含む腫瘍に抗癌効果を有することができる。

【0107】

以下では、図６および７を参照し、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異抗原に特異的Ｔ細胞に対する受容体（ＴＣＲ）について説明する。このとき、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異抗原に特異的Ｔ細胞に対する受容体配列は、図５ａ～図５ｄの過程を通じて選別されたＴ細胞における細胞キラー因子の発現に基づいて導かれた。

【0108】

より具体的には、図６は、抗原（ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマー）に特異的に活性が誘導されたＴ細胞の細胞キラー因子に対する結果である。

【0109】

まず、図６の（ａ）を参照すると、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）のうち、細胞キラー因子を発現する細胞は、約８００個の全細胞中、１０～１５％程度を示すことが示され、活性された全細胞中、約２７％程度の割合を示すことが示される。すなわち、ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマーに特異的に付着する腫瘍特異的Ｔ細胞（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ－Ａ＊３３：０３テトラマー陽性Ｔ細胞）は、活性される場合、高い割合で細胞毒性（キラー）因子を発現することができることを意味することができ、これによって、腫瘍おいて、効果的に細胞毒性（キラー）効果を有することができる。

【0110】

したがって、図６の（ｂ）を参照すると、前述した細胞キラー因子を発現するＴ細胞中、細胞キラー因子が最も高く発現する細胞のみを選別した後、これらの相関関係を解析した。

【0111】

そこで、図７を参照すると、抗原（ＥＧＦＲ－ＭＴ－Ｌ８５８Ｒ－ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３テトラマー）に特異的に活性が誘導されたＴ細胞の受容体に対する分布図が示される。このとき、Ｔ細胞の受容体に対する解析は、図２にて選別された細胞に基づいて行われ、単一細胞解析を通じてＴ細胞受容体の鎖に対するＶ、Ｄ、ＪおよびＣ構成配列を解析し、これに基づいてＣＤＲ３配列に対する配列解析を行った。まず、解析されたＴ細胞受容体は、計２９５種もの多様さを有し、このうちの上位１０までのＴ細胞受容体鎖に対する解析結果は、以下の［表１］に示されており、ＴＲＡＶ２３／ＤＶ６およびＴＲＢＶ１８に対する組み合わせとＴＲＡＶ２４およびＴＲＢＶ１９に対する組み合わせが最も高い頻度を有することを示す。

【0112】

［表１］

【表1】

【0113】

さらに、前述した［表１］の解析結果に基づいて、生成されたＣＤＲ３に対する配列は、以下の［表２］に示しており、これらは全部、細胞キラー因子を発現するＴ細胞に基づいて選別されたことによって、配列番号１～１２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１３～２４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含む場合、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異腫瘍に対する抗癌効果を有することができる。このとき、［表２］の順序は、細胞キラー因子（ＩＦＮ－ｇａｍｍａ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ－Ｂ）の発現率によって羅列した（ランク１が最も高い発現率）。

【0114】

さらに、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異腫瘍に対する抗癌効果がより効果的なＴＣＲは、配列番号１～８のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１３～２０のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含むＴＣＲであってもよい。

【0115】

このとき、細胞キラー因子の発現レベル（分泌能）は、配列番号１および２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１３および１４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含むＴＣＲが最も高いことが開示されているが、配列番号３～１２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１５および２４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含むＴＣＲの細胞キラー因子に対する発現レベルは、類似することが示されている。

【0116】

そこで、配列番号１～１２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３を含むＴＣＲの細胞キラー効果は同じであってもよく、配列番号１３～２４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含むＴＣＲの細胞キラー効果もまた同じであってもよい。

【0117】

ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異腫瘍に対する抗癌効果が最も効果的なＴＣＲは、配列番号１および２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１３および１４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含むＴＣＲであってもよい。

【0118】

［表２］

【表2】

【表3】

【0119】

以上の結果によって、前述した配列番号１～１２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１３～２４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含む本発明の一実施形態によるＴＣＲは、高い頻度で発現されるＣＤＲ３を含むことにより、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）をより正確に標的することができ、本発明の一実施形態によるＴＣＲは、細胞キラー因子の発現もまた非常に高いので、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原を含む腫瘍において、より効果的な抗癌反応（腫瘍細胞アポトーシス効果）を有することができる。

【0120】

ＮＫ細胞

【0121】

以下では、図８～図１４ｂを参照し、ＥＧＦＲ突然変異腫瘍に対する特異抗原を標的することができるＴＣＲおよびＦｃ受容体を含むＮＫ細胞について説明する。

【0122】

まず、図８を参照すると、Ｔフラスコ培養時、ＮＫ－９２細胞株に対する結果を示す。このとき、ＮＫ細胞は、ＮＫ－９２細胞であり、Ｘ－ｖｉｖｏ１０培地またはＸｕｒｉＴ細胞培地を用いて培養され、より具体的には、培養液はＸ－ｖｉｖｏ１０またはＸｕｒｉＴ細胞培地に１～１０％ヒトＡＢ血清、１００～２０００Ｕ／ｍｌＩＬ－２、０．１～５ｍＭのＬ－アスパラギン酸、０．１～５ｍＭのＬ－グルタミン、０．１～５ｍＭのＬ－セリンが添加され、これらの容量はこれに制限されるものではない。さらに、ＮＫ－９２細胞は、２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で継代培養し、Ｔフラスコに培養し、３日おきに継代培養した。さらに、細胞増殖は、ヘマトサイトメーターを用いて細胞個数を測定し、細胞生存率は、トリパンブルー染色または細胞死マーカーのＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いて確認し、細胞増殖効率は、細胞増殖因子であるＫＩ６７で染色し、フローサイトメトリーを用いて確認した。前述した過程は、図８および図９と同様に行われた。

【0123】

ＮＫ－９２細胞の細胞密度（ｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙ）は、継代培養により培養２２日目まで１×１０^５～１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで一定に維持されることが示されており、これを増殖倍数（ｆｏｌｄｅｘｐａｎｓｉｏｎ）としてみると、ＮＫ－９２細胞の数は、培養２２日間で１２６倍増加したことが示された。さらに、細胞生存率（ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、培養２２日目まで８０～１００％で一定に維持されることが示され、細胞分化能（ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）もまた培養２２日目まで７０～８５％で一定に維持されることが示された。

【0124】

その次に、図９を参照すると、ＦＢＳおよびＩＬ－２の濃度によるＮＫ－９２の増殖効率に対する結果を示す。

【0125】

まず、図９の（ａ）および（ｂ）を参照すると、ＦＢＳ濃度によるＮＫ－９２の増殖効率は、ＦＢＳが５％添加された場合が最も良いことが示された。さらに、図１３ａおよび図１３ｂを参照すると、ＩＬ－２濃度によるＮＫ－９２の増殖効率は、ＩＬ－２が１０００Ｕ／ｍｌ添加された場合が最も良いことが示された。すなわち、ＮＫ－９２細胞において、ＦＢＳおよびＩＬ－２が高いほど、増殖効率が高くなることが示されており、ＮＫ－９２細胞の増殖効率を最も好ましく高めることができるＦＢＳおよびＩＬ－２の濃度は、それぞれ５％および１０００Ｕ／ｍｌであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0126】

図１０を参照すると、培養方法によるＮＫ－９２細胞株の細胞増殖効率に対する結果を示す。このとき、ＮＫ－９２細胞は、効果的な増殖のため、細胞増殖装置であるＸｕｒｉＷ－２５装置を用いて培養された。このとき、ＮＫ－９２の培養液は前述した図１１ａ～図１５ｂにて用いられた培養液と同じであり、ＸｕｒｉＷ－２５装置に２Ｌ～１０Ｌサイズのｐｅｒｆｕｓｉｏｎｂａｇを取り付けてから培養液を接種して安定化させた。さらに、培養液の温度およびｐＨが安定化した後、０．５～１．０×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｂａｇのＮＫ－９２細胞が接種され、培養環境条件は、２から２ＲＰＭで攪拌（ｓｈａｋｉｎｇ）されるように設定された。また、細胞生存率、細胞増殖率、細胞個数は、細胞接種以後、１２時間毎に測定し、２日おきに培養液の半分をフィルターを通じて除去した後、新規な培養液を接種し、最終的に２Ｌのｐｅｒｆｕｓｉｏｎｂａｇには１Ｌの、１０Ｌのｐｅｒｆｕｓｉｏｎｂａｇには５Ｌの培養液で細胞を培養した。さらに、０．５～１．０×１０^１０細胞数に到達したとき、細胞収穫装置であるＳｅｆｉａＳ－２０００を用いてＮＫ－９２細胞を収穫した後、細胞の生存率、細胞増殖率、細胞の個数を測定した。

【0127】

図１０の（ａ）を参照すると、細胞密度は、ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ１０Ｌｓｃａｌｅで培養した場合が最も速く１＊１０^２の細胞密度に到達することが示され、このとき、１００倍に至るまでの時間は一般的なＴフラスコ培養よりも１１日短縮されたことが示された。さらに、図１０の（ｂ）を参照すると、増殖倍数は、ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ１０Ｌｓｃａｌｅで培養した場合が、最も速く１＊１０^１０の増殖倍数に到達することが示され、このとき、１＊１０^１０に至るまでの時間は一般的なＴフラスコ培養よりも１１日短縮されたことが示された。そこで、ＮＫ－９２細胞は、ＸｕｒｉＷ－２５装置において、ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ１０Ｌｓｃａｌｅ培養した場合、より速い時間内に多くの数を獲得することができる。

【0128】

図１１ａおよび１１ｂを参照すると、培養条件によるＮＫ－９２細胞株およびＦｃ受容体を発現するＮＫ－９２細胞株の活性因子および毒性因子に対する結果を示す。このとき、ＮＫ－９２細胞の細胞活性表面因子、細胞毒性因子およびケモカイン受容体を確認するためにそれぞれのアンチボディで染色した後、フローサイトメトリーを用いて確認した。より具体的には、細胞活性表面因子は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６を用いて確認し、細胞毒性因子は、ＣＤ１０７、グランザイムＢ（ＧｒａｎｚｙｍｅＢ）およびパーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）を通じて確認した。

【0129】

図１１ａを参照すると、培養条件によるＮＫ－９２細胞株の活性因子および毒性因子に対する結果を示す。ＮＫ－９２は、Ｘｕｒｉ培地で培養された場合、細胞活性表面因子であるＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６と細胞毒性因子であるＣＤ１０７、グランザイムＢおよびパーフォリンが全部発現することが示される。これと同様に、ＮＫ－９２は、Ｘ－ｖｉｖｏ培地で培養された場合、細胞活性表面因子であるＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６と細胞毒性因子であるＣＤ１０７、グランザイムＢおよびパーフォリンが全部発現することが示された。

【0130】

さらに、図１１ｂを参照すると、培養条件によるＦｃ受容体を発現するＮＫ－９２細胞株の活性因子および毒性因子に対する結果を示す。Ｆｃ受容体を発現するＮＫ－９２は、Ｘｕｒｉ培地で培養された場合、細胞活性表面因子であるＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６と細胞毒性因子であるＣＤ１０７、グランザイムＢおよびパーフォリンが全部発現することが示される。これと同様に、Ｆｃ受容体を発現するＮＫ－９２は、Ｘ－ｖｉｖｏ培地で培養された場合、細胞活性表面因子であるＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６と細胞毒性因子であるＣＤ１０７、グランザイムＢおよびパーフォリンが全部発現することが示された。

【0131】

以上の結果によって、ＮＫ－９２細胞株およびＦｃ受容体を発現するＮＫ－９２細胞株は、Ｘｕｒｉ培地およびＸ－ｖｉｖｏ培地の全部で培養される場合、細胞の活性および細胞毒性の機能を全部発現することができる。

【0132】

図１２を参照すると、タンパク質発現プロモーターによるＮＫ－９２細胞のＧＦＰ発現効率に対する結果を示す。このとき、ＮＫ－９２細胞にてＴ細胞受容体の発現のためのプロモーターを選別するため、それぞれのプロモーターによるタンパク質発現を確認した。より具体的には、電気穿孔法およびｐＣＡＧ－ＧＦＰ、ｐＥＦ－１α－ＧＦＰ、ｐＣＭＶ－ＧＦＰプラスミドを用いてＮＫ－９２細胞を形質転換させた。このとき、プラスミドの濃度は、１×１０^６ｃｅｌｌ当たり２ｕｇであってもよいが、これに制限されるものではない。次に、形質導入後、２４時間後にフローサイトメトリーおよびＣＡＧ、ＥＦ－１α、ＣＭＶなどを用いてＧＦＰタンパク質の発現を確認した。

【0133】

ＧＦＰに対する発現率は、ｐＣＭＶプロモーターが最も高いことが示されたことによって、ＮＫ－９２細胞におけるＴ細胞受容体の発現のためのプロモーターは、ｐＣＭＶが最も好ましい。

【0134】

図１３ａおよび図１３ｂは、ＮＫ－９２細胞にてケモカイン受容体の発現に対する結果を示すものである。このとき、ケモカイン受容体は、図１１ａ～図１１ｂと同様の方法で、フローサイトメトリーおよびケモカイン受容体であるＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１を通じて発現が確認された。まず、図１３ａを参照すると、前述した培養条件および方法により培養されたＮＫ－９２細胞は、ケモカイン受容体であるＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８およびＣＣＲ９を発現することが示される。

【0135】

さらに、図１３ｂを参照すると、ＮＫ－９２細胞は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６およびＣＸ３ＣＲ１を発現することが示された。

【0136】

そこで、前述した培養条件および方法により培養されたＮＫ－９２細胞は、ケモカイン受容体を発現することによって、後天性免疫応答を活性化させることができる。

【0137】

図１４ａおよび図１４ｂは、ＮＫ－９２細胞におけるＣＤ３分子およびＴ細胞受容体分子の発現に対する結果を示すものである。このとき、電気穿孔法およびｐＣＭＶ－ＣＤ３γＴ２ＡδＦ２ＡεＰ２ＡζプラスミドとｐＣＭＶ－ＴＣＲαＴ２Ａβプラスミドを用いてＮＫ－９２細胞を形質転換させた。このとき、プラスミドの濃度は、１×１０^６ｃｅｌｌ当たり２ｕｇであってもよいが、これに制限されるものではない。次いで、形質導入後、２４時間後にフローサイトメトリーを用いてＣＤ３分子およびＴ細胞受容体分子の発現を確認した。

【0138】

まず、図１４ａを参照すると、ＣＤ３分子を発現するＮＫ－９２細胞は、全ＮＫ－９２細胞に対して２８．８％を示すことが示される。すなわち、Ｔ細胞抗原受容体の補助タンパク質鎖であるＣＤ３がＮＫ－９２細胞にて発現されることによって、前述した過程によりＮＫ－９２細胞にＴＣＲが安定的に形質導入されたことを意味することができる。

【0139】

次に、図１４ｂを参照すると、Ｔ細胞受容体を発現するＮＫ－９２細胞は、全ＮＫ－９２細胞に対して８．３％を示すことが示される。すなわち、Ｔ細胞抗原受容体がＮＫ－９２細胞にて発現されることによって、前述した過程によりＮＫ－９２細胞にＴＣＲが安定的に形質導入されたことを意味することができる。

【0140】

以上の過程を通じて本発明は、固形癌、特に、ＥＧＦＲ突然変異を含む肺癌をより効果的に標的化することができるＴＣＲおよびこれを含む免疫細胞すなわち、ＮＫ細胞を提供することができ、これを通じて抗癌効果を向上させることができる。

【0141】

結局、本発明の免疫細胞は、前述したＴＣＲを含むことにより、ＥＧＦＲ突然変異を含む肺癌をより効果的に標的化できることによって、標的化された癌細胞に対する抗癌効果をさらに向上させることができる。

【0142】

本発明の一実施形態によるＴＣＲおよびこれを含むＮＫ細胞

【0143】

以下では、図１５ａおよび図１５ｂを参照し、本発明の一実施形態によるＴＣＲ（配列番号１～１２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１３～２４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含むＴＣＲおよびこれを含むＮＫ細胞の構成について具体的に説明する。

【0144】

図１５ａは、本発明の一実施形態によるＴＣＲ配列を発現させるためのレンチウィルスベクターマップである。

【0145】

このとき、ＮＫ－９２細胞への形質導入（ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）に特異的に活性が誘導されるＴＣＲの配列を発現）のために、レンチウィルスベクターが用いられ、形質導入において使用できるベクターは、レンチウィルスベクターに限定されるものでなく、当業界で形質導入に使用しうる多様なベクターを全部使用することができる。

【0146】

本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列発現のためのレンチウィルスベクター配列：
ＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧ－３'（配列番号５０）

【0147】

さらに、ベクターは、ＣＤ３分子の構成要素とＴＣＲαおよびベータの構成要素を含むことができる。

【0148】

そこで、図１５ｂを参照すると、本発明の一実施形態によるＴＣＲ配列を発現させるためのＣＤ３分子およびＴ細胞受容体の核酸配列に対する模式図が示されている。

【0149】

本発明の一実施形態によるＴＣＲ配列を発現させるためのＣＤ３分子およびＴ細胞受容体の核酸配列に対する構成要素は、各要素は独立した発現のために、Ｆｕｒｉｎ＋ｘ２Ａ配列およびＩＲＥＳ配列で連結されている。

【0150】

本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列発現のためのＴＣＲα核酸配列（ＴＲＡＶ２３／ＤＶ６）：５'－ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＴＡＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＣＧＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＴＴＡＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＡＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＣＴＴＡＡＴＧＣＣＴＣＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＧＴＡＧＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣ［ＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＡＡＣＣＴＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＣＴＴＴ］ＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＣＣＧＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣ－３'（配列番号５１）

【0151】

本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列発現のためのＴＣＲβ核酸配列（ＴＲＢＶ１８）：５'－ＡＴＧＡＧＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＣＡＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＣＣＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣ［ＴＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＴＴＧＣＧＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴ］ＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧ－３'（配列番号５２）

【0152】

このとき、配列番号５１および５２は、それぞれ本発明の一実施形態によるＴＣＲである配列番号１および１３のアミノ酸配列に対する核酸配列（配列番号２５および３７）を含んでおり、配列番号５１および５２に対するアミノ酸配列は、以下の配列番号５５および５６の通りである（［］で表示）。

【0153】

本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列発現のためのＴＣＲαアミノ酸配列（ＴＲＡＶ２３／ＤＶ６）：ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＤＳＡＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＱＳＳＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬ［ＣＡＡＴＧＴＹＫＹＩＦ］ＧＲＧＴＳＬＩＶＨＰＹＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号５５）

【0154】

本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列発現のためのＴＣＲβアミノ酸配列（ＴＲＢＶ１８）：ＭＳＩＧＬＬＣＣＡＡＬＳＬＬＷＡＧＰＶＮＡＧＶＴＱＴＰＫＦＱＶＬＫＴＧＱＳＭＴＬＱＣＡＱＤＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＭＧＬＲＬＩＨＹＳＶＧＡＧＩＴＤＱＧＥＶＰＮＧＹＮＶＳＲＳＴＴＥＤＦＰＬＲＬＬＳＡＡＰＳＱＴＳＶＹＦ［ＣＡＳＳＰＥＦＡＲＡＬＤＮＱＰＱＨＦ］ＧＰＧＴＲＬＴＶＬＥＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＥＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ－３'（配列番号５６）

【0155】

本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列発現のためのＴＣＲα核酸配列（ＴＲＡＶ２４）：５'－ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＴＡＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＣＧＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＴＴＡＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＡＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＣＴＴＡＡＴＧＣＣＴＣＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＧＴＡＧＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣ［ＴＧＴＧＣＣＴＴＴＡＴＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴ］ＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＣＣＧＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣ－３'（配列番号５３）

【0156】

本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列発現のためのＴＣＲβ核酸配列（ＴＲＢＶ１９）：５'－ＡＴＧＡＧＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＣＡＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＣＣＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣ［ＴＧＴＧＣＣＡＧＴＡＧＴＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＴＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣ］ＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧ－３'（配列番号５４）

【0157】

このとき、配列番号５３および５４は、それぞれ本発明の一実施形態によるＴＣＲである配列番号２および１４のアミノ酸配列に対する核酸配列（配列番号２６および３８）を含んでおり、配列番号５３および５４に対するアミノ酸配列は、以下の配列番号５７および５８の通りである（［］で表示）。

【0158】

本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列発現のためのＴＣＲαアミノ酸配列（ＴＲＡＶ２４）：ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＤＳＡＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＱＳＳＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬ［ＣＡＦＩＧＨＧＧＳＱＧＮＬＩＦ］ＧＲＧＴＳＬＩＶＨＰＹＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号５７）

【0159】

本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列発現のためのＴＣＲβアミノ酸配列（ＴＲＢＶ１９）：ＭＳＩＧＬＬＣＣＡＡＬＳＬＬＷＡＧＰＶＮＡＧＶＴＱＴＰＫＦＱＶＬＫＴＧＱＳＭＴＬＱＣＡＱＤＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＭＧＬＲＬＩＨＹＳＶＧＡＧＩＴＤＱＧＥＶＰＮＧＹＮＶＳＲＳＴＴＥＤＦＰＬＲＬＬＳＡＡＰＳＱＴＳＶＹＦ［ＣＡＳＳＭＱＧＡＭＳＥＱＦＦ］ＧＰＧＴＲＬＴＶＬＥＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＥＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ（配列番号５８）

【0160】

前述した本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列は、ＮＫ細胞のみならず、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒＴｃｅｌｌ、ＮＫＴ）、ヒト胚性幹細胞、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ、ＨＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ｉＰＳ）などを含む多様な免疫細胞にて発現させ、使用することができ、これによって、このような本発明の一実施形態によるＴＣＲの配列を含む免疫細胞は、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）を含む多様な腫瘍細胞に対してより効果的な免疫応答および抗癌効果を有することができる。

【0161】

本発明の一実施形態によるＴＣＲおよびこれを含むＮＫ細胞に対する検証

【0162】

以下では、図１６ａ～図１８を参照し、本発明の一実施形態によるＴＣＲ（配列番号１～１２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１３～２４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含む）およびこれを含むＮＫ細胞の抗癌効果について具体的に説明する。

【0163】

このとき、ＮＫ細胞に発現させたＴＣＲは、配列番号１および２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１３および１４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含むＴＣＲが用いられたが、これは、例示に過ぎず、配列番号１～１２のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３および配列番号１３～２４のアミノ酸配列から構成されたＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含むＴＣＲ間の細胞キラー効果は差異がないために選択的に使用することができる。

【0164】

図１６ａおよび図１６ｂは、本発明の一実施形態によるＴＣＲの細胞活性を確認した結果である。

【0165】

まず、図１６ａを参照すると、比較例１は、ノックアウト（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ）されたＪｕｒｋａｔ細胞が用いられ（ｃｏｎｔｒｏｌ、ＴＣＲＫＯ）、比較例２は、レンチウィルスを用いてノックアウトされたＪｕｒｋａｔ細胞にＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＨＬＡ－Ａ０２：０１抗原に特異的ＴＣＲを発現させた細胞（ＮＹ－ＥＳＯ－１２：０１ＴＣＲ）が用いられた。さらに、実施形態１（Ｌ８５８Ｒ１３３：０３ＴＣＲ）および２（Ｌ８５８Ｒ２３３：０３ＴＣＲ）では、レンチウィルスを用いてノックアウトされたＪｕｒｋａｔ細胞に本発明の一実施形態によるＴＣＲを発現させた細胞が用いられた。より具体的には、実施形態１（Ｌ８５８Ｒ１３３：０３ＴＣＲ）は、配列番号１および１３（ＴＲＡＶ２３／ＤＶ６およびＴＲＢＶ１８に対する配列番号２５および３７の核酸配列）のアミノ酸配列を含む配列番号５１および５２の核酸配列に基づくＴＣＲを発現させた細胞であり、実施形態２（Ｌ８５８Ｒ２３３：０３ＴＣＲ）は、配列番号２および１４（ＴＲＡＶ２４およびＴＲＢＶ１９に対する配列番号２６および３８の核酸配列）のアミノ酸配列を含む配列番号５３および５４の核酸配列に基づいたＴＣＲを発現させた細胞である。

【0166】

さらに、実施形態１および２（Ｌ８５８Ｒ１３３：０３ＴＣＲおよびＬ８５８Ｒ２３３：０３ＴＣＲ）の場合、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）テトラマーに特異的に反応し、ＩＦＮ－ｇａｍｍａのような細胞キラー因子が分泌されるため、比較例１、２および実施形態１、２をＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＨＬＡ－Ａ０２：０１抗原テトラマー（ｔｅｔｒａｍｅｒ）およびＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）テトラマー（ｔｅｔｒａｍｅｒ）に露出させ、ＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現を測定した。

【0167】

そこで、図１６ｂを参照すると、比較例１（ＴＣＲＫＯＪｕｒｋａｔＴｃｅｌｌ）の場合、抗原を認知できるＴＣＲを含まないため、ＩＦＮ－ｇａｍｍａ発現細胞（ＩＦＮ－γ ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓ）がないことが示されており、比較例２（ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲＪｕｒｋａｔＴｃｅｌｌ）の場合、ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＨＬＡ－Ａ０２：０１抗原のみを認知できるＴＣＲを含むため、ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＨＬＡ－Ａ０２：０１抗原でのみＩＦＮ－ｇａｍｍａ発現細胞が存在することが示される。

【0168】

さらに、実施形態１および２（Ｌ８５８Ｒ１３３：０３ＴＣＲおよびＬ８５８Ｒ２３３：０３ＴＣＲ）の場合、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）を認知できる本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むことにより、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）テトラマーに特異的に反応し、ＩＦＮ－ｇａｍｍａが発現することが示される。

【0169】

すなわち、本発明の一実施形態によるＴＣＲは、免疫細胞に発現され、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）に特異的に反応し、ＩＦＮ－ｇａｍｍａのような細胞キラー因子（サイトカイン）を分泌することができることを意味することができる。

【0170】

さらに、本発明の一実施形態によるＴＣＲは、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）以外のＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＨＬＡ－Ａ０２：０１抗原では、ＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現を誘導しないため、本発明が標的しようとするＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）に高度の標的化が可能であることを意味することができる。

【0171】

そこで、本発明の一実施形態によるＴＣＲは、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）を含む腫瘍において、より効果的に標的化が可能であることによって、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含む免疫細胞は、向上された抗癌効果を有することができる。

【0172】

図１７ａおよび図１７ｂは、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞に対する細胞キラー効果を確認した結果である。このとき、細胞キラー効果を確認するために、リアルタイム細胞アナライザー（Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ、ＲＴＣＡ）が用いられ、腫瘍細胞試料であって、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）を発現する患者に由来する腫瘍細胞株であるＹＵ１１５４（抗原特異的標的細胞）およびＹＵ１０９４（抗原非特異的標的細胞、ＥＧＦＲ^{ｍｕｔＨＬＡ１１：０１}）が使用された。さらに具体的には、解析装置の細胞培養プレートに前述した患者に由来の腫瘍細胞株である腫瘍細胞（ｔａｒｇｅｔｃｅｌｌ、Ｔ）を培養した後、ＮＫ－９２細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌ、Ｅ）と一定の割合（Ｔ：Ｅｒａｔｉｏ）で共培養し、培養時間による細胞キラー（ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ）程度を測定した。このとき、ＮＫ－９２細胞は、野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ、ＷＴ）ＮＫ－９２細胞と本発明の一実施形態によるＴＣＲ（ＥＧＦＲ^{ｍｕｔＨＬＡ３３：０３}－ＴＣＲ、ＤＡＡＮ－０１）を含むＮＫ－９２細胞を含み、これら間のキラー程度を比較した。さらに、以下では、説明の都合上、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ－９２細胞を実施形態と命名し、野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ、ＷＴ）ＮＫ－９２細胞を比較例と命名し、説明する。

【0173】

まず、図１７ａを参照すると、ＹＵ１１５４（抗原特異的標的細胞）に対する細胞キラー効果が示され、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞（ＴＣＲ－ＮＫ）すなわち、実施形態の場合、比較例（野生型ＮＫ細胞）より高いキラー効果を有することが示された。

【0174】

より具体的には、図１７ａの（ａ）を参照すると、本発明の実施形態は、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して１０および５０の割合（ＴＣＲ－ＮＫ１：１０、１：５０）で共培養された場合、６時間の間、約６０％以上のキラー効果を有することが示された。これに対し、比較例は、標的細胞（腫瘍細胞）に対する割合に関係なく、全部５０％以下のキラー効果を有することを示す。

【0175】

さらに、図１７ａの（ｂ）を参照すると、本発明の実施形態は、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して１０および５０の割合（ＴＣＲ－ＮＫ１：１０、１：５０）で共培養された場合、１２時間の間、約７０％以上のキラー効果を有することが示された。これに対し、比較例は、標的細胞（腫瘍細胞）に対する割合に関係なく、全部５０％以下のキラー効果を有することを示す。

【0176】

さらに、図１７ａの（ｃ）を参照すると、本発明の実施形態は、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して１０および５０の割合（ＴＣＲ－ＮＫ１：１０、１：５０）で共培養された場合、７２時間の間、約８５％以上のキラー効果を有することが示された。これに対し、比較例は、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して５０の割合（ＷＴ－ＮＫ１：５０）で共培養された場合を除いては、全部１０％以下のキラー効果を有することが示され、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して５０の割合（ＷＴ－ＮＫ１：５０）で共培養された場合でも、前述した本発明の実施形態より低い約８０％のキラー効果のみを有することが示された。

【0177】

結局、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞は、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）において、より効果的に細胞キラーを誘導することができ、これによって、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）を含む腫瘍において、向上された抗癌効果を有することができる。

【0178】

次に、図１７ｂを参照すると、ＹＵ１０９４（抗原非特異的標的細胞）に対する細胞キラー効果が示され、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞（ＴＣＲ－ＮＫ）すなわち、実施形態の場合、比較例（野生型ＮＫ細胞）より高いキラー効果を有することが示された。

【0179】

より具体的には、図１７ｂの（ａ）を参照すると、本発明の実施形態は、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して１０および５０の割合（ＴＣＲ－ＮＫ１：１０、１：５０）で共培養された場合、６時間の間、約４０％以上のキラー効果を有することが示された。これに対し、比較例は、標的細胞（腫瘍細胞）に対する割合に関係なく、全部４０％未満のキラー効果を有することを示す。

【0180】

さらに、図１７ｂの（ｂ）を参照すると、本発明の実施形態は、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して１０および５０の割合（ＴＣＲ－ＮＫ１：１０、１：５０）で共培養された場合、１２時間の間、約５０％以上のキラー効果を有することが示された。これに対し、比較例は、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して５０の割合（ＷＴ－ＮＫ１：５０）で共培養された場合を除いては、全部４０％未満のキラー効果を有することが示され、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して５０の割合（ＷＴ－ＮＫ１：５０）で共培養された場合にも前述した本発明の実施形態より約５％程低いキラー効果を有することが示された。

【0181】

さらに、図１７ｂの（ｃ）を参照すると、本発明の実施形態は、標的細胞（腫瘍細胞）１に対して１０および５０の割合（ＴＣＲ－ＮＫ１：１０、１：５０）で共培養された場合、７２時間の間、約７０％以上のキラー効果を有することが示された。これに対し、比較例はいずれも前述した本発明の実施形態（ＴＣＲ－ＮＫ１：１０、１：５０）より低いキラー効果を有することが示された。

【0182】

【0183】

図１８は、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞の腫瘍抑制効果を確認した結果である。このとき、腫瘍抑制効果は、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）を発現するように誘導された患者に由来する腫瘍動物モデル（ＮＯＧｍｉｃｅｉｍｐｌａｎｔｅｄｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）から確認され、腫瘍動物モデルは、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）を含む患者に由来する腫瘍組織を移植した後、腫瘍の大きさが１００～１５０ｍｍ^３以上になるように４～５か月（ｍｏｎｔｈ）飼育した後、標的の大きさに到達したとき、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ－９２細胞を注入（注射）した。さらに、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞の注入は、２回／週ずつ計４週間行われ、注入量は１回注射時、１＊１０^７～５＊１０^７の範囲で選択され、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞の注入容量は、細胞治療薬の方法によって多様に選択され、使用されることができる。また、比較例として、野生型ＮＫ－９２細胞および抗癌薬物（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｄｒｕｇ）、すなわち、ＣＤ１６－ＮＫ－９２細胞がそれぞれ注入され、使用された。

【0184】

図１８を参照すると、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞（ＤａａｎＮＫｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙ）を注入した場合、動物モデルの腫瘍体積（ｔｕｍｏｒｖｏｌｕｍｅ）は、約２００％以下であることが示され、これは、抗癌薬物（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｄｒｕｇ）および野生型ＮＫ細胞処理より低い大きさであることが示された。

【0185】

すなわち、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞は、従来の抗癌薬物および一般的な免疫細胞の注入より腫瘍抑制において、効果的であることを意味することができ、特に、本発明の一実施形態によるＴＣＲを含むＮＫ細胞は、全身免疫細胞の注入に比べて統計学的に有意な差を有することによって（ｐ＜０．００１）、ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ突然変異抗原（ＨＶＫＩＴＤＦＧＲ－Ａ＊３３：０３）を含む腫瘍において、標的抗癌（免疫）効果が顕著に向上されたことを意味することができる（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。

【0186】

以上、添付された図面を参照にして本発明の実施形態をより詳細に説明したが、本発明は、必ずしもこのような実施形態に制限されるものではなく、本発明の技術思想を逸脱しない範囲内で種々変形して実施することができる。したがって、本発明に開示された実施形態は、本発明の技術思想を限定するものではなく説明するためのものであり、このような実施形態によって本発明の技術思想の範囲が限定されるものではない。したがって、上記で説明した実施形態はあらゆる点で例示的なものであり、限定的なものではないことを理解すべきである。本発明の保護範囲は、以下の特許請求の範囲によって解釈されるべきであり、それと同等の範囲内にあるすべての技術思想は本発明の権利範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

【図1】