特表 2023-545447 ＰＤ－Ｌ１に結合する多重特異性結合化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-30

(54)【発明の名称】ＰＤ－Ｌ１に結合する多重特異性結合化合物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20231023BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231023BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231023BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231023BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20231023BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231023BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231023BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231023BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231023BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231023BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231023BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231023BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C07K16/18

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N1/15

A61P35/00

A61P37/04

A61K39/395 U

A61K39/395 N

A61K39/395 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023522501

(86)(22)【出願日】2021-10-15

(85)【翻訳文提出日】2023-04-12

(86)【国際出願番号】 US2021055225

(87)【国際公開番号】W WO2022082005

(87)【国際公開日】2022-04-21

(31)【優先権主張番号】63/093,109

(32)【優先日】2020-10-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522039821

【氏名又は名称】キューエルエスエフ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】グー， シェンダ

(72)【発明者】

【氏名】チェン， シハオ

(72)【発明者】

【氏名】シュワイマー， ローレン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

ＰＤ－Ｌ１に結合する多重特異性結合化合物が、そのような結合化合物を作製する方法、そのような結合化合物を含む医薬組成物を含む組成物、及びＰＤ－Ｌ１の発現によって特徴付けられる障害を治療するためのそれらの使用とともに開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合する二重特異性抗体であって、以下：
ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位であって、それぞれが以下：
重鎖可変領域であって、
配列番号１または４を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号２または５を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号３または６を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって、
配列番号７または１０を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号８または１１を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号９または１２を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域；を含む前記２つの結合単位；ならびに
４－１ＢＢに結合する２つの結合単位であって、それぞれが単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み、前記単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が：
重鎖可変領域であって：
配列番号１３または１６を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号１４または１７を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号１５または１８を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号１９または２２を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号２０または２３を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号２１または２４を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、を含む、前記２つの結合単位、
を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項2】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ以下：
重鎖可変領域であって：
配列番号１を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号２を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号３を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号７を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号８を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号９を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項3】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ以下：
重鎖可変領域であって：
配列番号４を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号５を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号６を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号１０を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号１１を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号１２を含むＣＤＲ３配列と、を含む軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項4】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位が各々：
重鎖可変領域であって：
配列番号１３を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号１４を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号１５を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号１９を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号２０を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号２１を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項5】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位が各々：
重鎖可変領域であって：
配列番号１６を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号１７を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号１８を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号２２を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号２３を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号２４を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項6】

各々の結合単位中の前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列が、ヒトＶＨまたはヒトＶＬフレームワークに存在する、請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２５と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項8】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２５を含む重鎖可変領域を含む、請求項７に記載の二重特異性抗体。

【請求項9】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２７と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項10】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２７を含む軽鎖可変領域を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２６と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２６を含む重鎖可変領域を含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。

【請求項13】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項14】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載の二重特異性抗体。

【請求項15】

４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２９と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項16】

４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号２９を含む重鎖可変領域を含む、請求項１５に記載の二重特異性抗体。

【請求項17】

４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号３１と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項18】

４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号３１を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１７に記載の二重特異性抗体。

【請求項19】

４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号３０と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項20】

４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号３０を含む重鎖可変領域を含む、請求項１９に記載の二重特異性抗体。

【請求項21】

４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号３２と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項22】

４－１ＢＢに結合する前記２つの結合単位がそれぞれ、配列番号３２を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の二重特異性抗体。

【請求項23】

ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域配列、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域配列をさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項24】

前記重鎖定常領域配列が野生型ヒトＩｇＧ１定常領域配列（配列番号９２）を含む、請求項２３に記載の二重特異性抗体。

【請求項25】

前記重鎖定常領域配列が、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２４に記載の二重特異性抗体。

【請求項26】

前記重鎖定常領域配列が配列番号９３を含む、請求項２５に記載の二重特異性抗体。

【請求項27】

軽鎖定常領域配列をさらに含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項28】

前記軽鎖定常領域配列が、ヒトκ軽鎖定常領域配列（配列番号９１）を含む、請求項２７に記載の二重特異性抗体。

【請求項29】

前記軽鎖定常領域配列が、ヒトλ軽鎖定常領域配列を含む、請求項２７に記載の二重特異性抗体。

【請求項30】

４－１ＢＢに結合する前記結合単位のそれぞれにおいて、前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とがリンカー配列によって連結されている、請求項１～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項31】

前記リンカー配列がＧ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）を含む、請求項３０に記載の二重特異性抗体。

【請求項32】

前記Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）が、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８を含む、請求項３１に記載の二重特異性抗体。

【請求項33】

前記第２の結合単位のそれぞれが、リンカー配列によって前記重鎖定常領域配列のＣ末端に連結される、請求項２３～３２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項34】

前記リンカー配列がＧ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）を含む、請求項３３に記載の二重特異性抗体。

【請求項35】

前記Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）が、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８を含む、請求項３４に記載の二重特異性抗体。

【請求項36】

ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合する二重特異性抗体であって：
（ａ）配列番号４３の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号４１の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号４３の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドと；
（ｄ）配列番号４１の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと、を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項37】

ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合する二重特異性抗体であって：
（ａ）配列番号４４の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号４２の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号４４の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドと；
（ｄ）配列番号４２の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと、を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項38】

ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合する二重特異性抗体であって：
ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位であって、
重鎖可変領域であって：
配列番号１または４を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号２または５を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号３または６を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号７または１０を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号８または１１を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号９または１２を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域；を含む前記第１の結合単位；ならびに
ＣＤ４７に結合する第２の結合単位であって、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み、前記単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が：
重鎖可変領域であって：
配列番号５０または５３を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号５１または５４を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号５２または５５を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号５６または５９を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号５７または６０を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号５８または６１を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、を含む、前記第２の結合単位、を含む、
前記二重特異性抗体。

【請求項39】

請求項３８に記載の二重特異性抗体であって、ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が：
重鎖可変領域であって：
配列番号１を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号２を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号３を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号７を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号８を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号９を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項40】

請求項３８に記載の二重特異性抗体であって、ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が：
重鎖可変領域であって：
配列番号４を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号５を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号６を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号１０を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号１１を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号１２を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項41】

請求項３８に記載の二重特異性抗体であって、ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が：
重鎖可変領域であって：
配列番号５０を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号５１を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号５２を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号５６を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号５７を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号５８を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項42】

請求項３８に記載の二重特異性抗体であって、ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が：
重鎖可変領域であって：
配列番号５３を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号５４を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号５５を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号５９を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号６０を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号６１を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項43】

各々の結合単位中の前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列が、ヒトＶＨまたはヒトＶＬフレームワークに存在する、請求項３８～４２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項44】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２５と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３９に記載の二重特異性抗体。

【請求項45】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２５を含む重鎖可変領域を含む、請求項４４に記載の二重特異性抗体。

【請求項46】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２７と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３９に記載の二重特異性抗体。

【請求項47】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２７を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４６に記載の二重特異性抗体。

【請求項48】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２６と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３９に記載の二重特異性抗体。

【請求項49】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２６を含む重鎖可変領域を含む、請求項４８に記載の二重特異性抗体。

【請求項50】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３９に記載の二重特異性抗体。

【請求項51】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５０に記載の二重特異性抗体。

【請求項52】

ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が、配列番号６２と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３９に記載の二重特異性抗体。

【請求項53】

ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が、配列番号６２を含む重鎖可変領域を含む、請求項５２に記載の二重特異性抗体。

【請求項54】

ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が、配列番号６４と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３９に記載の二重特異性抗体。

【請求項55】

ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が、配列番号６４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５４に記載の二重特異性抗体。

【請求項56】

ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が、配列番号６３と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３９に記載の二重特異性抗体。

【請求項57】

ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が、配列番号６３を含む重鎖可変領域を含む、請求項５６に記載の二重特異性抗体。

【請求項58】

ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が、配列番号６５と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３９に記載の二重特異性抗体。

【請求項59】

ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位が、配列番号６５を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５８に記載の二重特異性抗体。

【請求項60】

ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域配列、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域配列をさらに含む、請求項３８～５９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項61】

前記重鎖定常領域配列が野生型ヒトＩｇＧ１定常領域配列（配列番号９２）を含む、請求項６０に記載の二重特異性抗体。

【請求項62】

前記重鎖定常領域配列が、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６１に記載の二重特異性抗体。

【請求項63】

前記重鎖定常領域配列が配列番号９３を含む、請求項６２に記載の二重特異性抗体。

【請求項64】

軽鎖定常領域配列をさらに含む、請求項３８～６３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項65】

前記軽鎖定常領域配列が、ヒトκ軽鎖定常領域配列（配列番号９１）を含む、請求項６４に記載の二重特異性抗体。

【請求項66】

前記軽鎖定常領域配列が、ヒトλ軽鎖定常領域配列を含む、請求項６４に記載の二重特異性抗体。

【請求項67】

ＣＤ４７に結合する前記第２の結合単位において、前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とがリンカー配列によって連結されている、請求項３８～６６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項68】

前記リンカー配列がＧ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）を含む、請求項６７に記載の二重特異性抗体。

【請求項69】

前記Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）が、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８を含む、請求項６８に記載の二重特異性抗体。

【請求項70】

前記第２の結合単位のそれぞれが、リンカー配列によって前記重鎖定常領域配列のＣ末端に連結される、請求項６０～６９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項71】

前記リンカー配列がＧ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）を含む、請求項７０に記載の二重特異性抗体。

【請求項72】

前記Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）が、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８を含む、請求項７１に記載の二重特異性抗体。

【請求項73】

２つの異なる重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を促進する１つ以上のノブ・イン・ホール変異を含む重鎖定常領域をさらに含む、請求項３８～７２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項74】

ＰＤ－Ｌ１及びＤＣＤ４７に結合する二重特異性抗体であって：
（ａ）配列番号６６の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号６７の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号６８の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと、を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項75】

ＰＤ－Ｌ１及びＤＣＤ４７に結合する二重特異性抗体であって：
（ａ）配列番号６９の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号７０の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号７１の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと、を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項76】

二重特異性抗体であって、ＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ前記二重特異性抗体の重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合した１つ以上のＩＬ１５ポリペプチドを含み、
ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位であって、
重鎖可変領域であって：
配列番号１または４を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号２または５を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号３または６を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号７または１０を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号８または１１を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号９または１２を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域；を含む前記第１の結合単位；ならびに
配列番号８６～９０のいずれかと少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＩＬ１５ポリペプチド、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項77】

請求項７６に記載の二重特異性抗体であって、ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が：
重鎖可変領域であって：
配列番号１を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号２を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号３を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号７を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号８を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号９を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項78】

請求項７６に記載の二重特異性抗体であって、ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が：
重鎖可変領域であって：
配列番号４を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号５を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号６を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記重鎖可変領域；ならびに
軽鎖可変領域であって：
配列番号１０を含むＣＤＲ１配列と；
配列番号１１を含むＣＤＲ２配列と；
配列番号１２を含むＣＤＲ３配列と、を含む前記軽鎖可変領域、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項79】

前記ＩＬ１５ポリペプチドが配列番号８６～９０のいずれか１つの配列を含む、請求項７６に記載の二重特異性抗体。

【請求項80】

前記ＩＬ１５ポリペプチドが、リンカー配列によって前記抗体の前記重鎖ポリペプチドサブユニットに連結されている、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項81】

前記リンカー配列が、配列番号３６、３７、３８、４９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７または１２８のいずれか１つの配列を含む、請求項８０に記載の二重特異性抗体。

【請求項82】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列が、ヒトＶＨまたはヒトＶＬフレームワークに存在する、請求項７６～８１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項83】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２５と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項７７に記載の二重特異性抗体。

【請求項84】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２５を含む重鎖可変領域を含む、請求項８３に記載の二重特異性抗体。

【請求項85】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２７と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７７に記載の二重特異性抗体。

【請求項86】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２７を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８５に記載の二重特異性抗体。

【請求項87】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２６と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項７７に記載の二重特異性抗体。

【請求項88】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２６を含む重鎖可変領域を含む、請求項８７に記載の二重特異性抗体。

【請求項89】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７７に記載の二重特異性抗体。

【請求項90】

ＰＤ－Ｌ１に結合する前記第１の結合単位が、配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８９に記載の二重特異性抗体。

【請求項91】

ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域配列、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域配列をさらに含む、請求項７６～９０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項92】

前記重鎖定常領域配列が野生型ヒトＩｇＧ１定常領域配列（配列番号９２）を含む、請求項９１に記載の二重特異性抗体。

【請求項93】

前記重鎖定常領域配列が、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９２に記載の二重特異性抗体。

【請求項94】

前記重鎖定常領域配列が配列番号９３を含む、請求項９３に記載の二重特異性抗体。

【請求項95】

軽鎖定常領域配列をさらに含む、請求項７６～９４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項96】

前記軽鎖定常領域配列が、ヒトκ軽鎖定常領域配列（配列番号９１）を含む、請求項９５に記載の二重特異性抗体。

【請求項97】

前記軽鎖定常領域配列が、ヒトλ軽鎖定常領域配列を含む、請求項９５に記載の二重特異性抗体。

【請求項98】

２つの異なる重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を促進する１つ以上のノブ・イン・ホール変異を含む重鎖定常領域をさらに含む、請求項７６～９７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項99】

ＰＤ－Ｌ１に結合し、各重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合したＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１０４の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号１０５の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号１０５の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１０４の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドと、
を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項100】

ＰＤ－Ｌ１に結合し、各重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合したＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１０６の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号１０７の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号１０７の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１０６の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドと、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項101】

ＰＤ－Ｌ１に結合し、各重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合したＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１０８の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号１０９の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号１１０の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１０８の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドと、
を含む前記二重特異性抗体。

【請求項102】

ＰＤ－Ｌ１に結合し、１つの重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合したＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１１１の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号１１２の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号１１３の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１１１の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドと、
を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項103】

ＰＤ－Ｌ１に結合し、１つの重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合したＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１１４の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号１１５の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号１１６の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１１４の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドと、
を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項104】

ＰＤ－Ｌ１に結合し、各重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合したＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１１７の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと；
（ｂ）配列番号１１８の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと；
（ｃ）配列番号１１９の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと；
（ｄ）配列番号１１７の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドと、
を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項105】

請求項１～１０４のいずれか１項に記載の抗体を含む、医薬組成物。

【請求項106】

ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする障害の処置方法であって、前記障害を有する対象に、請求項１～１０４のいずれか１項に記載の抗体、または請求項１０５に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記処置方法。

【請求項107】

ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする障害を処置するための医薬の調製における、請求項１～１０４のいずれか１項に記載の抗体の使用。

【請求項108】

ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする障害の処置に使用するための、請求項１～１０４のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項109】

前記障害ががんである、請求項１０６～１０８のいずれか１項に記載の方法、使用、または抗体。

【請求項110】

請求項１～１０４のいずれか１項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項111】

請求項１１０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項112】

請求項１１１に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項113】

請求項１１２に記載の細胞を、前記抗体の発現を許容する条件下で増殖させること、及び前記細胞から前記抗体を単離することを含む、請求項１～１０４のいずれか１項に記載の抗体の産生方法。

【請求項114】

有効用量の請求項１～１０４のいずれか１項に記載の抗体、または請求項１０５に記載の医薬組成物を、必要とする個体に投与することを含む、処置方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１６日出願の米国仮特許出願第６３／０９３，１０９号の出願日の優先権を主張し、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、配列表は、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２１年１２月３０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＱＬＳ－０００２－ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは２２８，９３０バイトである。

【0003】

発明の分野
本発明は、ＰＤ－Ｌ１に結合する多重特異性結合化合物に関する。本発明はさらに、そのような結合化合物を作製する方法、そのような結合化合物を含む医薬組成物を含む組成物、及びＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする障害を処置するためのそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0004】

がんは世界中で主要な死因である。進行した転移性がんでは、放射線療法及び化学療法などの従来の治療レジメンは、生存期間の延長にわずかな効果しかない。低分子阻害剤及び阻害性モノクローナル抗体などの標的療法は、疾患進行の管理に大きな改善をもたらしたが、それにもかかわらず、特定の変異を有するがんのサブセットまたは標的可能な受容体を過剰発現するがんに限定されている。さらに、腫瘍細胞はさらに変異する場合もあるし、または薬物の阻害効果を回避する別のシグナル伝達経路に切り替える場合もあるので、これらの治療法に対する耐性が一般的である。免疫療法は、体自身の免疫システムを活用することにより、がんと闘う上で新たな可能性を秘めている。たとえば、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とするチェックポイント阻害剤は、この分野の研究開発を先導してきた。多重特異性抗体の開発により、新しい治療法が可能になった。

【0005】

ＰＤ－Ｌ１多重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１及び１つ以上の共刺激受容体、例えば、４－１ＢＢを標的とすることを目的としている。このような抗体は、いくつかの方法で機能する。最初に、それらの抗体は、免疫抑制性であるＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に結合する。第２に、それらはＰＤ－Ｌ１とその受容体ＰＤ－１との相互作用を遮断することにより、標準的なチェックポイント阻害剤の役割を果たす。第３に、４－１ＢＢなどの共刺激標的をＴ細胞上で架橋し、これが次に、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞の存在下でのみＴ細胞の増殖を刺激する。さらに、抗体の定常領域は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのＦｃガンマ受容体媒介機能を排除する変異を含んでもよい。したがって、ＰＤ－Ｌ１に対する多重特異性抗体は、腫瘍組織に限定される強力な免疫応答を有し、スタンドアロンの共刺激抗体でしばしば観察される望ましくない毒性から正常組織を保護する。

【発明の概要】

【0006】

本発明の態様は、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合する二重特異性抗体を含み、この抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位を含み、このそれぞれが以下：重鎖可変領域であって、配列番号１または４を含むＣＤＲ１配列；配列番号２または５を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号３または６を含むＣＤＲ３配列、を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号７または１０を含むＣＤＲ１配列；配列番号８または１１を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号９または１２を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含む２つの結合単位；ならびに４－１ＢＢに結合する２つの結合単位を含み、この２つの結合単位は、各々が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み、これが、重鎖可変領域であって、配列番号１３または１６を含むＣＤＲ１配列；配列番号１４または１７を含むＣＤＲ２配列；および配列番号１５または１８を含むＣＤＲ３配列を含む：重鎖可変領域；ならびに軽鎖可変領域であって、配列番号１９または２２を含むＣＤＲ１配列；配列番号２０または２３を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号２１または２４を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれ、重鎖可変領域であって、配列番号１を含むＣＤＲ１；配列番号２を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号３を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；ならびに軽鎖可変領域であって、配列番号７を含むＣＤＲ１配列；配列番号８を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号９を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれが、重鎖可変領域であって、配列番号４を含むＣＤＲ１配列、配列番号５を含むＣＤＲ２配列、配列番号６を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号１０を含むＣＤＲ１配列；配列番号１１を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号１２を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、以下：重鎖可変領域であって、配列番号１３を含むＣＤＲ１配列；配列番号１４を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号１５を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号１９を含むＣＤＲ１配列、配列番号２０を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号２１を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、以下：重鎖可変領域であって、配列番号１６を含むＣＤＲ１配列；配列番号１７を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号１８を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号２２を含むＣＤＲ１配列、配列番号２３を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号２４を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、各々の結合単位のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列はヒトＶＨまたはヒトＶＬフレームワーク中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２５と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２５を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２７と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２７を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２６と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２６を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２９と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号２９を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号３１と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号３１を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号３０と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号３０を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号３２と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する２つの結合単位はそれぞれ、配列番号３２を含む軽鎖可変領域を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域配列、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域配列は、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域配列（配列番号９２）を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域配列は、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域配列は、配列番号９３を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、抗体は、軽鎖定常領域配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域配列は、ヒトカッパ軽鎖定常領域配列（配列番号９１）を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域配列は、ヒトラムダ軽鎖定常領域配列を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢに結合する結合単位のそれぞれにおいて、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がリンカー配列によって連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）は、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、第２の結合単位のそれぞれは、リンカー配列によって重鎖定常領域配列のＣ末端に接続される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）は、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８を含む。

【0016】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合する二重特異性抗体を含み、これは（ａ）配列番号４３の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号４１の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；（ｃ）配列番号４３の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチド；及び（ｄ）配列番号４１の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む。

【0017】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合する二重特異性抗体を含み、これは（ａ）配列番号４４の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号４２の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；（ｃ）配列番号４４の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチド；及び（ｄ）配列番号４２の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む。

【0018】

本発明の態様は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合する二重特異性抗体を含み、この抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位を含み、これが以下：重鎖可変領域であって、配列番号１または４を含むＣＤＲ１配列；配列番号２または５を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号３または６を含むＣＤＲ３配列、を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号７または１０を含むＣＤＲ１配列；配列番号８または１１を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号９または１２を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含み；ならびにＣＤ４７に結合する第２の結合単位を含み、この第２の結合単位は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み、これが、重鎖可変領域であって、配列番号５０または５３を含むＣＤＲ１配列；配列番号５１または５４を含むＣＤＲ２配列；および配列番号５２または５５を含むＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域；ならびに軽鎖可変領域であって、配列番号５６または５９を含むＣＤＲ１配列；配列番号５７または６０を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号５８または６１を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位を含み、これは以下：重鎖可変領域であって、配列番号１を含むＣＤＲ１配列；配列番号２を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号３を含むＣＤＲ３配列、を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号７を含むＣＤＲ１配列；配列番号８を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号９を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は以下：重鎖可変領域であって、配列番号４を含むＣＤＲ１配列；配列番号５を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号６を含むＣＤＲ３配列、を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号１０を含むＣＤＲ１配列；配列番号１１を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号１２を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、以下：重鎖可変領域であって、配列番号５０を含むＣＤＲ１配列；配列番号５１を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号５２を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号５６を含むＣＤＲ１配列、配列番号５７を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号５８を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、以下：重鎖可変領域であって、配列番号５３を含むＣＤＲ１配列；配列番号５４を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号５５を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号５９を含むＣＤＲ１配列、配列番号６０を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号６１を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、各結合単位のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、ヒトＶＨまたはヒトＶＬのフレームワーク中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２５を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２７と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２７を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２６と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２６を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、配列番号６２と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、配列番号６２を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、配列番号６４と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、配列番号６４を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、配列番号６３と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、配列番号６３を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、配列番号６５と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位は、配列番号６５を含む軽鎖可変領域を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域配列、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域配列は、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域配列（配列番号９２）を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域配列は、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域配列は、配列番号９３を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、軽鎖定常領域配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域配列は、ヒトカッパ軽鎖定常領域配列（配列番号９１）を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域配列は、ヒトラムダ軽鎖定常領域配列を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する第２の結合単位において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がリンカー配列によって連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）は、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、第２の結合単位のそれぞれは、リンカー配列によって重鎖定常領域配列のＣ末端に接続される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ_４Ｓリンカー配列（配列番号３６）は、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を促進する１つ以上のノブ・イン・ホール変異を含む重鎖定常領域をさらに含む。

【0027】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合する二重特異性抗体を含み、これは（ａ）配列番号６６の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号６７の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；及び（ｃ）配列番号６８の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む。

【0028】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合する二重特異性抗体を含み、これは（ａ）配列番号６９の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号７０の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；及び（ｃ）配列番号７１の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む。

【0029】

本発明の態様は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ二重特異性抗体の重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合された１つ以上のＩＬ１５ポリペプチドを含む抗体を含み、これには、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位を含み、これが：配列番号１または４を含むＣＤＲ１配列；配列番号２または５を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号３または６を含むＣＤＲ３配列、を含む重鎖可変領域と；配列番号７または１０を含むＣＤＲ１配列、配列番号８または１１を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号９または１２を含むＣＤＲ３配列、を含む軽鎖可変領域と；配列番号８６～９０のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＩＬ１５ポリペプチドと、を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は以下：重鎖可変領域であって、配列番号１を含むＣＤＲ１配列；配列番号２を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号３を含むＣＤＲ３配列、を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号７を含むＣＤＲ１配列；配列番号８を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号９を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は以下：重鎖可変領域であって、配列番号４を含むＣＤＲ１配列；配列番号５を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号６を含むＣＤＲ３配列、を含む重鎖可変領域と；軽鎖可変領域であって、配列番号１０を含むＣＤＲ１配列；配列番号１１を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号１２を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、ＩＬ１５ポリペプチドは、配列番号８６～９０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５ポリペプチドは、リンカー配列によって抗体の重鎖ポリペプチドサブユニットに連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、配列番号３６、３７、３８、４９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７または１２８のいずれか１つの配列を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、ヒトＶＨまたはヒトＶＬのフレームワーク中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２５と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２５を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２７と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２７を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２６と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２６を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の結合単位は、配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域配列、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域配列は、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域配列（配列番号９２）を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域配列は、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域配列は、配列番号９３を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、抗体は、軽鎖定常領域配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域配列は、ヒトカッパ軽鎖定常領域配列（配列番号９１）を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域配列は、ヒトラムダ軽鎖定常領域配列を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、抗体は、２つの異なる重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を促進する１つ以上のノブ・イン・ホール変異を含む重鎖定常領域をさらに含む。

【0036】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ各重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合されたＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体を含み、これは：（ａ）配列番号１０４の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号１０５の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；（ｃ）配列番号１０５の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド；及び（ｄ）配列番号１０４の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。

【0037】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ各重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合されたＩＬ１５ポリペプチドを含む、二重特異性抗体を含み、これは：（ａ）配列番号１０６の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号１０７の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；（ｃ）配列番号１０７の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド；及び（ｄ）配列番号１０６の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。

【0038】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ各重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合されたＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体を含み、これは：（ａ）配列番号１０８の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号１０９の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；（ｃ）配列番号１１０の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド；及び（ｄ）配列番号１０８の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。

【0039】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ１つの重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合されたＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体を含み、これは：（ａ）配列番号１１１の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号１１２の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；（ｃ）配列番号１１３の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド；及び（ｄ）配列番号１１１の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。

【0040】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ１つの重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合されたＩＬ１５ポリペプチドを含む二重特異性抗体を含み、これは：（ａ）配列番号１１４の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号１１５の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；（ｃ）配列番号１１６の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド；及び（ｄ）配列番号１１４の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。

【0041】

本発明の態様には、ＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ各重鎖ポリペプチドサブユニットのＣ末端に融合されたＩＬ１５ポリペプチドを含む、二重特異性抗体を含み、これは：（ａ）配列番号１１７の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド；（ｂ）配列番号１１８の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；（ｃ）配列番号１１９の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド；及び（ｄ）配列番号１１７の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。

【0042】

本発明の態様は、本明細書に記載のような抗体を含む医薬組成物を含む。

【0043】

本発明の態様は、ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする障害の処置のための方法であって、このような障害を有する対象に対して、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

【0044】

本発明の態様は、ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする障害の処置のための医薬の調製における、本明細書に記載の抗体の使用を含む。

【0045】

本発明の態様は、ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする障害の処置に使用するための本明細書に記載の抗体を含む。いくつかの実施形態では、障害は、がんである。

【0046】

本発明の態様には、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本明細書に記載の特許請求の範囲のベクターを含む細胞を含む。

【0047】

本発明の態様は、抗体の発現を許容する条件下で、本明細書に記載の細胞を増殖させること、及びこの細胞から抗体を単離することを含む、本明細書に記載の抗体の産生方法を含む。

【0048】

本発明の態様は、個体に有効量の本明細書に記載の抗体、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む処置の方法を含む。

【0049】

これら及びさらなる態様は、実施例を含め、本開示の残りの部分でさらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】パネルＡは、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＨＥＫ２９３細胞への示された抗体構築物の結合を示すグラフである。パネルＢは、ヒト４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞への示された抗体構築物の結合を示すグラフである。パネルＣは、示された抗体構築物についてのヒトＰＤ－Ｌ１及びヒト４－１ＢＢのＥＣ５０値を示す表である。

【図2】パネルＡ及びＢは、それぞれＨＩＳタグ付きＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに対する抗体構築物の結合反応速度論を示すグラフである。パネルＣは、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢへの結合についてのＫＤ値を示す表である。

【図3】パネルＡは、ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１を発現するＨＥＫ２９３細胞への示された抗体構築物の結合を示すグラフである。パネルＢは、ｃｙｎｏ ４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞への示された抗体構築物の結合を示すグラフである。パネルＣは、示された抗体構築物についてのｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１及びｃｙｎｏ ４－１ＢＢのＥＣ５０値を示す表である。

【図4】パネルＡは、ＰＤ－Ｌ１を発現するＨＥＫ２９３細胞における示された抗体構築物のＰＤ－１遮断活性を示すグラフである。パネルＢは、４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞における示された抗体構築物の４－１ＢＢＬ遮断活性を示すグラフである。パネルＣは、示された抗体構築物についてのＰＤ－１及び４－１ＢＢＬのＩＣ５０値を示す表である。

【図5】パネルＡは、示された抗体構築物の二機能性ＥＬＩＳＡ結合を濃度の関数として示すグラフである。パネルＢは、示された抗体構築物についてのＮＦ－ｋＢレポーター活性を抗体濃度の関数として示すグラフである。

【図6】パネルＡ及びＢは、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）で刺激され、次いでＰＤ－Ｌ１＋Ａ４３１細胞と共培養されたヒトＰＢＭＣからの、それぞれＩＬ２放出及びＩＦＮγ放出を、示した濃度で示した抗体構築物とともに、示すグラフである。パネルＣは、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）で刺激され、次いでＰＤ－Ｌ１＋Ａ４３１細胞の有無で培養されたヒトＰＢＭＣからのＩＬ２放出を、示した濃度で示した抗体構築物とともに、示すグラフである。

【図7】パネルＡは、示された濃度で示された抗体構築物を使用したＳＥＢ刺激アッセイにおけるＩＬ２放出を示すグラフである。パネルＢは、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及びＰＤ－Ｌ１＋Ａ４３１細胞の存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を、示された濃度で示された抗体構築物とともに示すグラフである。

【図8】パネルＡは、指示された用量で指示された抗体構築物による処置を用いた、ＭＣ３８マウス腫瘍モデルについての初回投与後の日数の関数としての腫瘍体積を示すグラフである。パネルＢは、研究の最後に採取された各用量群についての腫瘍浸潤免疫細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）を示すグラフである。

【図9】パネルＡは、指示された用量で指示された抗体構築物による処置を用いた、Ａ４３１ヒト腫瘍モデルについての初回投与後の日数の関数としての腫瘍体積を示すグラフである。パネルＢは、研究の最後に採取された各用量群についての腫瘍浸潤免疫細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）を示すグラフである。

【図10】加速温度ストレス試験から得られたＱＬ３０１のＨＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルにおけるモノマー、凝集体及びフラグメントの計算されたパーセンテージを示す表である。

【図11】パネルＡは、ヒト血清中で７日間インキュベーションした後のＱＬ３０１に対する抗体濃度の関数として、及びストック対照として、二機能性ＥＬＩＳＡ結合を示すグラフである。パネルＢは、ＳＥＢ刺激アッセイにおけるＰＢＭＣからのＩＬ２放出を、示された濃度でヒト血清インキュベーションした及びストック対照ＱＬ３０１抗体を使用した抗体濃度の関数として示すグラフである。

【図12】パネルＡは、ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二重特異性抗体の模式図である。パネルＢは、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７へのＥＬＩＳＡ結合を、抗体濃度の関数として示すグラフである。

【図13】パネルＡ～Ｅは、抗体濃度の関数として示された細胞への示された抗体構築物の結合を示す一連のグラフである。

【図14】示されたＣＤ４７－ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体構築物による、刺激されたＡ４３１細胞に対するＰＤ－１遮断活性を、抗体濃度の関数として示すグラフである。

【図15】示されたＣＤ４７－ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体構築物による、ｈｕＰＤ－Ｌ１＋ＨＥＫ２９３細胞に対するＰＤ－１遮断活性を、抗体濃度の関数として示すグラフである。

【図16】パネルＡは、示されたＣＤ４７－ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体構築物によるＡ４３１細胞に対するＳＩＲＰα遮断を、抗体濃度の関数として示すグラフである。パネルＢは、示されたＣＤ４７－ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体構築物によるｈｕＣＤ４７＋ＣＨＯ細胞に対するＳＩＲＰα遮断を、抗体濃度の関数として示すグラフである。

【図17】パネルＡは、指示された濃度で、示されたＣＤ４７－ＰＤ－Ｌ１抗体構築物を使用した、Ｒａｊｉ細胞の抗体媒介食作用を示すグラフである。パネルＢは、指示された濃度で、示されたＣＤ４７－ＰＤ－Ｌ１抗体構築物を使用した、ＭＭ．１Ｓ細胞の抗体媒介食作用を示すグラフである。

【図18】パネルＡ及びＢは、２人の異なるＲＢＣドナーについて、示された抗体濃度で、示されたＣＤ４７－ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の赤血球への結合を示すグラフである。

【図19】示された濃度の示された抗体構築物によって誘導された赤血球の血球凝集を示す画像である。

【図20】パネルＡ～Ｆは、ＩＣＲ－ＳＣＩＤマウスにおけるＡ４３１、ｈＰＢＭＣ同時移植腫瘍モデルにおける日数の関数としての腫瘍体積を示す一連のグラフである。投与群Ｇ１～Ｇ５は、異なる抗体構築物または対照（ＰＢＳ）を表す。

【図21】パネルＡ～Ｆは、図２０に記載の腫瘍モデルからの有効性評価項目を示すグラフである。

【図22】パネルＡ～Ｆは、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおけるＡ４３１、ｈＰＢＭＣ同時移植腫瘍モデルにおける日数の関数として、腫瘍体積を示す一連のグラフである。投与群Ｇ１～Ｇ５は、異なる抗体構築物または対照（ＰＢＳ）を表す。

【図23】パネルＡ～Ｆは、Ｃ末端にＩＬ１５融合を含む様々な二重特異性抗体構築物の模式図である。

【図24】パネルＡ～Ｃは、示された抗体濃度での、示された細胞への示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体構築物の結合を示す一連のグラフである。

【図25】パネルＡ～Ｃは、示された濃度での、示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体構築物に応答したＮＫ９２またはＭ０７ｅ細胞の増殖の代表的な例を示す一連のグラフである。

【図26】パネルＡ及びＢは、示された濃度で、示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体、またはモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１もしくはアイソタイプ対照ＩＬ１５抗体を使用した、ＭＯ７ｅ細胞上のｐＳＴＡＴ５の誘導を示すグラフである。

【図27】パネルＡ～Ｃは、示された濃度でのＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体曝露に応答した示された細胞型の増殖を示す一連のグラフである。

【図28】パネルＡ～Ｄは、示された濃度でのＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体曝露に応答した、示された細胞型の増殖を示す一連のグラフである。

【図29】パネルＡ～Ｄは、示された濃度でのＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体曝露に応答した、示された細胞型の増殖を示す一連のグラフである。パネルＥは、染色に使用された抗体を示す表である（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号が列挙されている）。

【図30】パネルＡ～Ｅは、示された細胞型、ならびに示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体構築物及び投与スケジュールについての時間の関数としての細胞数を示す一連のグラフである。

【図31】パネルＡ～Ｆは、示された細胞型、ならびに示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体構築物及び投与スケジュールについて、時間の関数として細胞数を示す一連のグラフである。

【図32】パネルＡ～Ｄは、Ｃ５７ＢＬ／６及びＮＳＧマウスにおける示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体構築物の薬物動態特性を示す一連のグラフである。

【図33】パネルＡ～Ｆは、示された用量で、示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５抗体構築物による、ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８マウス結腸癌細胞の腫瘍増殖阻害を示す一連のグラフである。パネルＧは、腫瘍体積を、腫瘍再チャレンジ後の日数の関数として示すグラフである。

【図34】パネルＡ～Ｇは、示された用量における、示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体構築物についてのヒトＰＢＭＣ腫瘍モデルと同時移植されたＡ４３１異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す一連のグラフである。

【図35】パネルＡ～Ｇは、図３４に示される用量で、示されるＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体構築物で処置されたヒトＰＢＭＣ腫瘍モデルと同時移植されたＡ４３１異種移植片から単離された腫瘍から採取された細胞の表現型分析を示す一連のグラフである。

【図36】パネルＡ～Ｇは、図３４に示される用量で、示されるＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体構築物で処置されたヒトＰＢＭＣ腫瘍モデルと同時移植されたＡ４３１異種移植片から単離された腫瘍から採取された細胞の表現型分析を示す一連のグラフである。

【図37】パネルＡ～Ｅは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、示された用量で、示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５抗体構築物による、ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８マウス結腸癌細胞の腫瘍増殖阻害を示す一連のグラフである。

【図38】パネルＡ～Ｆは、図３７に示される用量で、示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体構築物で処置された、ＭＣ３８マウス結腸癌腫瘍モデルから単離された腫瘍から採取された細胞の表現型分析を示す一連のグラフである。

【図39】パネルＡ～Ｇは、示された用量で、示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５二重特異性抗体について、ＣＤ１７－ＳＣＩＤマウスにおいてヒトＰＢＭＣと同時移植されたＮＣＩ－Ｈ１６５０細胞の腫瘍増殖阻害を示す一連のグラフである。

【図40】パネルＡは、ＰＤ－Ｌ１に結合する２つの同一の結合領域、及び４－１ＢＢに結合する２つの同一のｓｃＦｖを有する二重特異性ＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ抗体であるＱＬ３０１のモデルである。パネルＢは、ＱＬ３０１二重特異性抗体によって架橋された腫瘍細胞及びＴ細胞の図である。

【図41】パネルＡ及びＢは、２人の異なるドナーについて、二重特異性ＰＤ－Ｌ１ｘＣＤ４７抗体によって媒介されるＲＢＣの食作用の％を示すグラフである。

【図42】示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５抗体構築物の結合活性を示すグラフである。

【図43】示されたＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５抗体構築物に応答したＮＫ９２細胞の増殖を示すグラフである。

【図44】パネルＡ及びＢは、本発明のいくつかの実施形態によるＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢ二重特異性抗体構築物を使用した、アカゲザルにおける反復投与毒物学研究で観察されたＡＳＴ及びＡＬＴレベルを示すグラフである。

【図45】本発明のいくつかの実施形態によるＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二重特異性抗体構築物を使用した、ＮＯＧマウスの腫瘍モデルにおけるＡ３７５腫瘍増殖阻害を示すグラフである。

【図46】本発明の実施形態によるＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二重特異性抗体構築物を使用した、ＮＯＧマウスの腫瘍モデルにおけるＲａｊｉ腫瘍増殖阻害を示すグラフである。

【図47】本発明の実施形態によるＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二重特異性抗体構築物を用いた、カニクイザルにおける反復投与毒物学研究で観察された赤血球数を示すグラフである。

【図48】本発明の実施形態による、ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５－Ｔ２Ａ構築物のマウス交差反応代用物を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実施されたＭＣ３８腫瘍モデルで観察されたｃＤＣ１の刺激を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0051】

本発明の実施は、特に明記しない限り、当該技術分野の技術の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）、“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）、“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）、Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）などの文献において十分に説明されている。

【0052】

値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本明細書にも包含される。表示範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。

【0053】

特に明記しない限り、本明細書の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリング方式に従って番号付けされる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。

【0054】

以下の説明では、本発明のより完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が述べられている。しかしながら、本発明がこれらの具体的な詳細の１つ以上を伴わずに実施され得ることは、当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を曖昧にすることを回避するために、周知の特徴及び当業者に周知の手順は記載されていない。

【0055】

特許出願及び公報を含む、本開示を通じて引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0056】

Ｉ．定義
「含む」とは、記載する要素が組成物／方法／キットに必要であることを意味するが、特許請求の範囲内で他の要素が組成物／方法／キットなどを形成するために含まれ得る。

【0057】

「～から本質的になる」とは、記載する組成物または方法の範囲を、本発明の基本的及び新規の特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさない特定の物質またはステップに限定することを意味する。

【0058】

「～からなる」とは、特許請求の範囲で指定されていない任意の要素、ステップ、または成分が、組成物、方法、またはキットから除外されることを意味する。

【0059】

本明細書の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリング方式及びＥＵナンバリング方式に従って番号付けされている。Ｋａｂａｔナンバリング方式は、一般的に、可変ドメイン内の残基（およそ、重鎖の１～１１３残基）に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵナンバリング方式」または「ＥＵインデックス」は、一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）で報告されているＥＵインデックス）。「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の可変ドメインにおける残基番号への言及は、Ｋａｂａｔナンバリング方式による残基ナンバリングを意味する。本明細書に別段の定めがない限り、抗体の定常ドメインにおける残基番号への言及は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。

【0060】

免疫グロブリンとも称される抗体は、従来、少なくとも１つの重鎖及び１つの軽鎖を含み、重鎖及び軽鎖のアミノ末端ドメインは配列上可変であるため、一般に可変領域ドメイン、または可変重鎖（ＶＨ）もしくは可変軽鎖（ＶＨ）ドメインと称される。２つのドメインは、従来、特異的結合領域を形成するように会合するが、本明細書で論じられるように、特異的結合は、重鎖のみの可変配列でも得ることができ、抗体の様々な非天然構造が知られており、当該技術分野で使用されている。

【0061】

「機能的」または「生物学的に活性な」抗体または結合化合物とは、構造的、調節的、生化学的または生物物理学的事象において１つ以上の活性を発揮できるものである。例えば、機能的抗体または他の結合化合物は、抗原に特異的に結合する能力を有し得、結合は次いで、シグナル伝達または酵素活性などの細胞または分子事象を誘発または改変させ得る。機能的抗体または他の結合分子はまた、受容体のリガンド活性化を遮断し得る場合もあるし、またはアゴニストもしくはアンタゴニストとして機能する場合もある。抗体または他の結合化合物が、１つ以上の活性を発揮する能力は、ポリペプチド鎖の適切な折り畳み及びアセンブリを含む、いくつかの因子に依存する。

【0062】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一量体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、三本鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ナノボディなどを含み、また所望の生物学的活性を示す限り、抗体フラグメントも含む（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４－４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラであっても、または他の種に由来してもよい。

【0063】

抗体という用語は、全長重鎖、全長軽鎖、無傷の免疫グロブリン分子、またはこれらのポリペプチドのいずれかの免疫学的に活性な部分、すなわち、目的とする標的またはその一部の抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチドを指してもよく、そのような標的には、がん細胞、または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される免疫グロブリンは、低減または増強されたエフェクター細胞活性を提供する、改変されたＦｃ部分を有する操作されたサブクラスを含む、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来してもよい。

【0064】

本明細書中で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を指向し、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。本発明によるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、例えば、組換えタンパク質産生法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）を介して作製することもできる。

【0065】

抗体に関連して使用する用語「可変」とは、抗体可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で大きく異なっており、その配列が各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に使用されているという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等には分布していない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのいずれにおいても超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲを含み、これらは主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域により連結され、これら超可変領域は、βシート構造に連結するループを形成し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他方の鎖の超可変領域と近接して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。

【0066】

本明細書において使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメインの残基３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））及び／または重鎖可変ドメインの「超可変ループ」残基２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）由来の残基、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

【0067】

例示的なＣＤＲの呼称を本明細書に示すが、当業者であれば、配列の変動性に基づき、最も一般的に使用されているＫａｂａｔ定義（“Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． Ａ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ．” Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：６９４－７００を参照のこと）を含む、ＣＤＲのいくつかの定義が一般的に使用されていることを理解するであろう。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づいている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ． “Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅＲｅｇｉｏｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ． １９８９；３４２：８７７－８８３）。目的の代替のＣＤＲ定義には、限定されないが、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，“Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ．” Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６５７－６７０、Ｏｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）ｒｅｖｅａｌｓ ｐｅｃｕｌｉａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＣＤＲｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１：６２３０－６２３５、Ａｌｍａｇｒｏ “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔＲｅｃｏｇｎｉｚｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．”Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４；１７：１３２－１４３、及びＰａｄｌａｎｅｔ ａｌ． “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．” Ｆａｓｅｂ Ｊ．１９９５；９：１３３－１３９．によって開示された定義が含まれ、これらのそれぞれは、参照により本明細書に具体的に援用される。

【0068】

本明細書で使用される「多重特異性結合化合物」という用語は、２つ以上の抗原結合部位を含む結合化合物を意味する。本発明の実施形態による多重特異性結合化合物は、２つ、３つ、または４つのポリペプチドサブユニットを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる抗体様分子であってもよく、そのいずれも、標的抗原（例えば、ＰＤ－Ｌ１）に結合親和性を有する１つ以上の可変領域ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、一緒に結合単位を形成する一対の可変領域ドメイン（例えば、重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）形式の可変領域ドメインの対を含み、ここで、第１の可変領域ドメイン及び第２の可変領域ドメインはリンカーによって連結され、一緒に結合単位を形成する。本発明の多重特異性結合化合物は、本明細書に記載の特定の構成を含むがこれらに限定されない、結合単位の任意の適切な組み合わせまたは構成を有し得る。

【0069】

本明細書に記載の多重特異性結合化合物は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥサブクラスを含む任意の免疫グロブリンサブクラスに属し得る。特定の実施形態では、多重特異性結合化合物は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１サブタイプのものである。エフェクター機能を改変させるＣＨドメインの改変は、本明細書にさらに記載される。

【0070】

本明細書中で使用する「インタクトな抗体鎖」とは、全長の可変領域及び全長の定常領域（Ｆｃ）を含む抗体鎖である。インタクトな「従来の」抗体は、インタクトな軽鎖及びインタクトな重鎖、ならびに分泌型ＩｇＧ用の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＩｇＭまたはＩｇＡなどの他のアイソタイプは、異なるＣＨドメインを有してもよい。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。インタクトな抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得、これは、抗体のＦｃ定常領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、及び細胞表面受容体の下方調節が挙げられる。定常領域バリアントには、エフェクター特性、Ｆｃ受容体への結合などを変化させるバリアントが含まれる。

【0071】

重鎖のＦｃ（定常ドメイン）のアミノ酸配列に応じて、抗体及び様々な抗原結合タンパク質は、異なるクラスとして提供され得る。重鎖Ｆｃ領域の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。異なるクラスの抗体に対応するＦｃ定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれ得る。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成は、周知である。Ｉｇの形態には、ヒンジ修飾またはヒンジなしの形態が含まれる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３－４０９０、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｅｕｒ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６－７２５６、ＵＳ２００５／００４８５７２、ＵＳ２００４／０２２９３１０）。任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられ得る。

【0072】

「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。エフェクター機能の非限定的な例として、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、一般的に、Ｆｃ領域が受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦＣγＲＩＩＢ２、ＦＣγＲＩＩＩＡ、ＦＣγＲＩＩＩＢ受容体、及び低親和性ＦｃＲｎ受容体と相互作用することを必要とし、そして、当該技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。「死んだ」または「サイレンシングされた」Ｆｃとは、例えば、血清半減期の延長に関して活性を保持するように変異導入されているが、高親和性Ｆｃ受容体を活性化しないか、またはＦｃ受容体に対する親和性が低下しているＦｃである。

【0073】

「天然配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域としては、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然のバリアントが含まれる。

【0074】

「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変、好ましくは１つ以上のアミノ酸置換（複数可）によって天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１～約１０個のアミノ酸置換、及び好ましくは約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、親ポリペプチドの天然配列Ｆｃ領域及び／またはＦｃ領域との少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは、それらとの少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは、それらとの少なくとも約９５％の相同性を有する。

【0075】

ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｎｏ．Ｐ０１８５７によって提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヒトＩｇＧ２アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｎｏ．Ｐ０１８５９によって提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヒトＩｇＧ３アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｎｏ．Ｐ０１８６０によって提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヒトＩｇＧ４アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｎｏ．Ｐ０１８６１によって提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0076】

バリアントＦｃ配列は、ＥＵインデックス位置２３４、２３５、及び２３７でのＦｃγＲＩ結合を減少させるために、ＣＨ２領域に３つのアミノ酸置換を含んでもよい（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３；Ｈｅｚａｒｅｈ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：１２１６１；米国特許第５，６２４，８２１号（これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ配列は、以下のアミノ酸置換を含んでもよい：Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；及びＧ２３７Ａ。これらの３つのアミノ酸置換がＩｇＧ１ Ｆｃ配列に存在する場合、それらはＧ１ＡＡＡと呼んでもよい。

【0077】

ＥＵインデックス位置３３０及び３３１の補体Ｃ１ｑ結合部位における２つのアミノ酸置換は、補体結合を低下させる（Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１７８：６６１（１９９３）及びＣａｎｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１）を参照のこと）。位置２３３～２３６でのヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２残基ならびに位置３２７、３３０及び３３１でのＩｇＧ４残基への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低下させる（例えば、Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３－２４、及びＳｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ．，２００１． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６０４を参照のこと）。

【0078】

他のＦｃバリアントも可能であるが、これには、ジスルフィド結合を形成し得る領域が欠失しているか、または天然ＦｃのＮ末端で特定のアミノ酸残基が除去されているか、もしくはメチオニン残基がそれに付加されているバリアントが含まれるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、結合化合物の１つ以上のＦｃ部分は、ヒンジ領域に１つ以上の変異を含んでジスルフィド結合を排除してもよい。さらに別の実施形態では、Ｆｃのヒンジ領域は、完全に除去されてもよい。さらに別の実施形態では、結合化合物は、Ｆｃバリアントを含んでもよい。

【0079】

さらに、Ｆｃバリアントは、補体結合またはＦｃ受容体結合をもたらすためにアミノ酸残基を置換（変異）、欠失、または付加することによって、エフェクター機能を除去または実質的に低減するように構築され得る。例えば、限定されないが、欠失を、Ｃ１ｑ結合部位などの補体結合部位で行ってもよい。免疫グロブリンＦｃフラグメントのそのような配列誘導体を調製するための技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８に開示されている。加えて、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などによって改変されてもよい。

【0080】

「Ｆｃ領域を含む抗体」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリング方式による残基４４７）を、例えば、抗体の精製中に、または抗体をコードする核酸の組換え操作により除去してもよい。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を有する抗体を含んでも、または有さない抗体を含んでもよい。

【0081】

本発明の態様は、限定されないが、二重特異性、三重特異性などを含む多重特異性構成を有する結合化合物を含む。二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などにおいて多種多様な方法及びタンパク質構成が知られており、使用されている。

【0082】

２つ以上の抗体の可変ドメインを組換え融合することによって、多価人工抗体の産生のための様々な方法が開発されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド上の第１及び第２の抗原結合ドメインは、ポリペプチドリンカーによって接続される。そのようなポリペプチドリンカーの１つの非限定的な例は、４つのグリシン残基とそれに続く１つのセリン残基というアミノ酸配列を有するＧＳリンカーであり、ここで、この配列はｎ回繰り返され、ｎは、１～約１０の範囲の整数、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９である（配列番号１３３）。そのようなリンカーの非限定的な例として、ＧＧＧＧＳ（配列番号３６）（ｎ＝１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７）（ｎ＝２）が挙げられる。他の適切なリンカーも使用してもよく、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５；６５（１０）：１３５７－６９に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。追加のリンカー配列は、本明細書の他の場所に記載されており、任意の適切な構成で本発明の抗体に組み込んでもよい。

【0083】

本明細書に記載の抗体及び多重特異性結合化合物は、２つの重鎖がジスルフィド結合しているか、またはそうでなければ共有結合もしくは非共有結合で互いに結合している二量体の形態であってもよく、任意選択で、ポリペプチド鎖間の適切な対合を容易にするために、２つ以上のＣＨドメイン間の非対称界面を含んでもよい（一般には「ノブ・イントゥ・ホール」と呼ばれる）。重鎖ヘテロダイマー化のためのノブ・イントゥ・ホール抗体工学技術は、例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６ Ｊｕｌ；９（７）：１７－２１、及び米国特許第８，２１６，８０５号に考察されており、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非対称界面を含むＦｃ領域は、本明細書では略語「ＫｉＨ」と呼ばれてもよく、これはノブ・イントゥ・ホールを意味する。例えば、本発明の態様は、非対称界面を含み、本明細書において「Ｇ１ＡＡＡ ＫｉＨ」と呼ばれる、Ｇ１ＡＡＡ配列などのバリアントＦｃ領域配列を含む。

【0084】

「ＰＤ－Ｌ１」及び「プログラムされた死リガンド１」という用語には、任意のヒト及び非ヒト動物種のＰＤ－Ｌ１タンパク質が含まれ、具体的には、ヒトＰＤ－Ｌ１ならびに非ヒト哺乳動物のＰＤ－Ｌ１が含まれる。

【0085】

本明細書中で使用する「ヒトＰＤ－Ｌ１」という用語には、その供給源または調製様式に関係なく、ヒトＰＤ－Ｌ１の任意のバリアント、アイソフォーム及び種相同体（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＮＺＱ７）が含まれる。したがって、「ヒトＰＤ－Ｌ１」には、細胞が天然に発現するヒトＰＤ－Ｌ１、及びヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子をトランスフェクトした細胞上で発現するＰＤ－Ｌ１が含まれる。

【0086】

「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、「ＰＤ－Ｌ１抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１結合化合物」及び「ＰＤ－Ｌ１結合化合物」という用語は、本明細書で定義されるヒトＰＤ－Ｌ１を含む、ＰＤ－Ｌ１に免疫特異的に結合する、本明細書で定義される抗体または結合化合物を指して、本明細書では交換可能に使用される。

【0087】

「４－１ＢＢ」という用語は、任意のヒト及び非ヒト動物種の４－１ＢＢタンパク質を指し、具体的にはヒト４－１ＢＢ及び非ヒト哺乳動物の４－１ＢＢを含む。

【0088】

本明細書中で使用する「ヒト４－１ＢＢ」という用語には、その供給源または調製様式に関係なく、ヒト４－１ＢＢの任意のバリアント、アイソフォーム及び種相同体（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０７０１１）が含まれる。したがって、「ヒト４－１ＢＢ」には、ヒト４－１ＢＢ遺伝子でトランスフェクトされた細胞上で発現した細胞及び４－１ＢＢによって自然に発現したヒト４－１ＢＢを含む。

【0089】

「抗４－１ＢＢ抗体」、「４－１ＢＢ抗体」、「抗４－１ＢＢ結合化合物」及び「４－１ＢＢ結合化合物」という用語は、本明細書で定義されるヒト４－１ＢＢを含む、４－１ＢＢに免疫特異的に結合する、本明細書で定義される抗体または結合化合物を指して、本明細書では交換可能に使用される。

【0090】

「ＣＤ４７」及び「白血球表面抗原ＣＤ４７」という用語は、任意のヒト及び非ヒト動物種のＣＤ４７タンパク質を指し、具体的には、ヒトＣＤ４７及び非ヒト哺乳動物のＣＤ４７を含む。

【0091】

「ヒトＣＤ４７」という用語は、本明細書で使用されるとき、ヒトＣＤ４７（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０８７２２）の任意のバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を、その供給源または調製様式に関係なく含む。したがって、「ヒトＣＤ４７」には、細胞によって自然に発現したヒトＣＤ４７、及びヒトＣＤ４７遺伝子でトランスフェクトされた細胞上で発現されたＣＤ４７を含む。

【0092】

「抗ＣＤ４７抗体」、「ＣＤ４７抗体」、「抗ＣＤ４７結合化合物」及び「ＣＤ４７結合化合物」という用語は、本明細書で定義されるヒトＣＤ４７を含む、ＣＤ４７に免疫特異的に結合する、本明細書で定義される抗体または結合化合物を指して、本明細書では交換可能に使用される。

【0093】

「ＩＬ１５」及び「インターロイキン－１５」という用語は、任意のヒト及び非ヒト動物種のＩＬ１５タンパク質を指し、ヒトＩＬ１５及び非ヒト哺乳動物のＩＬ１５を特異的に含む。

【0094】

「ヒトＩＬ１５」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＩＬ１５（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ４０９３３）の任意のバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を、その供給源または調製様式に関係なく含む。したがって、「ヒトＩＬ１５」には、細胞によって自然に発現されたヒトＩＬ１５、及びヒトＩＬ１５遺伝子でトランスフェクトされた細胞上で発現されたＩＬ１５を含む。

【0095】

多重特異性抗体または多重特異性結合化合物を説明するために本明細書で使用される場合、「ＩＬ１５」という用語は、図２３のパネルＡ～Ｆに構成的に示されるように、ＩＬ１５タンパク質配列が融合される、ポリペプチドサブユニット（例えば、抗体重鎖または抗体軽鎖）を含む抗体または結合化合物であって、それにより融合ＩＬ１５タンパク質とＩＬ１５受容体との間の相互作用を促進する結合化合物を指す。

【0096】

参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインメントし、ギャップを導入して最大配列同一性パーセントを、必要に応じて、達成した後の、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野内の様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするために適切なパラメータを決定し得る。しかしながら、本明細書の目的のためには、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。

【0097】

「単離」抗体または結合化合物とは、その自然環境の成分から、同定及び分離、及び／または回収されたものである。その自然環境の混入成分は、抗体の診断上または治療上の使用を妨げる材料であり、これには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体を、（１）ローリー法により判定した場合に抗体の９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超になるまで、（２）スピニングカップシーケネータ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用して少なくとも１５残基のＮ末端配列もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を用いて還元条件もしくは非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、均質になるまで精製する。単離された抗体には、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内でのｉｎ ｓｉｔｕ抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製されるであろう。

【0098】

本発明の結合化合物には、多重特異性結合化合物が含まれる。多重特異性結合化合物は２つ以上の結合特異性を有する。「多重特異性」という用語には、具体的には、「二重特異性」及び「三重特異性」、ならびに高次のポリエピトープ特異性などの高次の独立した特異的結合親和性、ならびに四価抗体及び抗体フラグメントが含まれる。「多重特異性抗体」、及び「多重特異性結合化合物」という用語は、本明細書では最も広義で使用され、２つ以上の結合特異性を有する全ての抗体及び抗体様分子を包含する。本発明の多重特異性抗ＰＤ－Ｌ１結合化合物としては、具体的には、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質などのＰＤ－Ｌ１タンパク質上のエピトープに対して、及び異なるタンパク質、例えば、４－１ＢＢタンパク質またはＣＤ４７タンパク質などの上のエピトープに対して、免疫特異的に結合する結合化合物を含む。

【0099】

「エピトープ」とは、単一の抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位である。一般的に、抗原はいくつかまたは多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語は、具体的には、線状エピトープ及び立体配座エピトープを含む。

【0100】

抗体エピトープは、線状エピトープであっても、または立体配座エピトープであってもよい。直鎖状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続配列によって形成される。立体配座エピトープは、タンパク質配列において不連続であるが、タンパク質のその三次元構造への折り畳みの際に一緒になるアミノ酸から形成される。

【0101】

「価」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体分子または結合化合物中の特定数の結合部位を指す。

【0102】

「一価」結合化合物は、１つの結合部位を有する。したがって、一価結合化合物はまた、単一特異性でもある。

【0103】

「多価」結合化合物は、２つ以上の結合部位を有する。したがって、「二価」、「三価」、及び「四価」という用語は、それぞれ、２つの結合部位、３つの結合部位、及び４つの結合部位が存在することを指す。したがって、本発明による二重特異性結合化合物は、少なくとも二価であり、三価、四価、またはそうでなければ多価であってもよい。本発明の実施形態による二価結合化合物は、同じエピトープに対する２つの結合部位（すなわち、二価、モノパラトピック）を有してもよいし、または２つの異なるエピトープに対する２つの結合部位（すなわち、二価、二重パラトピック）を有してもよい。

【0104】

多種多様な方法及びタンパク質の構造が公知であり、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）及び結合化合物、三重特異性抗体及び結合化合物などの調製に使用される。

【0105】

「ヒト抗体」という用語は、本明細書中では、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含んで使用される。本明細書のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異が含まれてもよい。「ヒト抗体」という用語は、具体的には、ヒト重鎖可変領域配列を有する抗体及び結合化合物を含む。

【0106】

本明細書で使用される「キメラ」抗体という用語は、ラットまたはマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列、及び典型的にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を生成する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２－７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２；米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、及び同第４，８１６，３９７号を参照されたい。「キメラ抗体」という用語は、具体的には、非ヒト免疫グロブリン由来の可変領域配列及びヒト免疫グロブリン定常領域配列を有する抗体及び結合化合物を含む。

【0107】

本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む抗体または結合化合物を指す。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の配列も含み得る。抗体のヒト化の方法は当該技術分野で公知である。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－７；米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；及びＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，１８０，３７０号；欧州特許第２３９４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；欧州特許第５９２１０６号；欧州特許第５１９５９６号；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：４８９－４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． ７：８０５－８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９－９７３；及び米国特許第５，５６５，３３２号（これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0108】

本明細書中で使用する場合、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認知及び活性化段階とは対照的に、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を指す。いくつかのエフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を果たす。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る。例えば、ＦｃＲを発現する単球とマクロファージは、標的細胞の特異的な死滅及び免疫系の他の成分への抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食し得る。

【0109】

「ヒトエフェクター細胞」は、Ｔ細胞受容体またはＦｃＲなどの受容体を発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書に記載されるように、その天然源から、例えば、血液またはＰＢＭＣから単離され得る。

【0110】

「免疫細胞」という用語は、本明細書では最も広義で使用され、これには、限定するものではないが、骨髄またはリンパ系由来の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば、好中球、顆粒球、肥満細胞、及び好塩基球が挙げられる。

【0111】

抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に帰属する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。

【0112】

「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的とする分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されている動物モデルにおいて評価してもよい。

【0113】

「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が、同種抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）に結合することにより開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。

【0114】

本明細書で交換可能に使用される「指向性Ｔ細胞媒介性細胞傷害」及び「再指向性Ｔ細胞媒介性細胞傷害」は、架橋分子（例えば、二重特異性抗体）がＴ細胞（例えば、ＣＤ３）上の表面抗原及び標的細胞上の抗原（例えば、がん細胞上の表面抗原）を架橋する細胞媒介反応を指す。Ｔ細胞と標的細胞との架橋は、Ｔ細胞の細胞毒性活性を介してＴ細胞による標的細胞の死滅を促進する。リダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞毒性は、例えば、Ｖｅｌａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１８ １３１：３０－３８に記載されている。

【0115】

「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途指示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、平衡解離定数（ＫＤ）で表され得る。親和性は、当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、通常、抗原にゆっくり結合し、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体は、通常、抗原により早く結合し、結合したままである傾向がある。

【0116】

本明細書中で使用されるとき、「ＫＤ」または「ＫＤ値」とは、反応速度論様式で、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法によって決定される解離定数を指す。例えば、抗マウスＦｃセンサーにマウス－Ｆｃ融合抗原を負荷し、次いで抗体含有ウェルに浸して濃度依存的会合速度（ｋｏｎ）を測定する。抗体解離速度（ｋｏｆｆ）は最終工程で測定し、センサーを緩衝液のみを含有するウェルに浸す。ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比である。（さらなる詳細については、Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，１２（８），７９１－８００，２００９を参照のこと）。

【0117】

用語「治療、処置」、「治療する、処置する」などは、一般的に、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するものとして本明細書中で使用される。その効果は、その疾患または症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書中で使用する「治療、処置」は、哺乳動物における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすい可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない対象における発症を予防するか、（ｂ）その疾患を阻害する、すなわち、その発現を阻止するか、または（ｃ）その疾患を軽減する、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患または傷害の発症前、発症中、または発症後に投与してもよい。進行中の疾患の処置で、その処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化するか、または軽減するものは、特に興味深い。そのような処置は、影響を受けた組織の機能が完全に失われる前に実施することが望ましい。対象の治療薬は、疾患の症候期の間、及びいくつかの場合では疾患の症候期の後に投与してもよい。

【0118】

「治療有効量」とは、対象に治療効果を与えるために必要な活性薬剤の量を意図している。例えば、「治療有効量」とは、疾患に関連する病理学的症状、疾患の進行もしくは生理学的状態の改善を誘発、寛解、もしくは引き起こすか、または障害に対する耐性を改善する量である。

【0119】

「がん」及び「がん性」という用語は、制御されていない細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、または説明する。「腫瘍」は、１つ以上のがん性細胞を含む。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病、またはリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮性扁平上皮細胞癌）、皮膚癌、黒色腫、肺癌、例としては、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または胃の癌、例としては消化管癌、膵臓癌（例えば、膵管腺癌）、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、高異型度漿液性卵巣癌）、肝臓癌（例えば、肝細胞癌ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ））、膀胱癌（例えば、尿路上皮性膀胱癌）、精巣（生殖細胞腫瘍）癌、肝細胞腫、乳癌、脳癌（例えば、星状細胞腫）、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、腎細胞癌、腎芽腫またはウィルムス腫瘍）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、及び頭頸部癌が挙げられる。癌の追加の例としては、限定するものではないが、網膜芽細胞腫、テコーマ、アレノ芽細胞腫、肝細胞腫、血液悪性腫瘍、例としては、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫及び急性血液悪性腫瘍、子宮内膜または子宮癌、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、唾液腺癌、外陰癌、甲状腺癌、食道癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、神経鞘腫、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、及び尿路癌が挙げられる。

【0120】

「転移性癌」という用語は、組織起源のがん細胞が、血管またはリンパ腺によって元の部位から体内の１つ以上の他の部位に伝播し、起源の組織以外の１つ以上の臓器内で１つ以上の二次腫瘍を形成するがんの状態を意味する。顕著な例は、転移性乳癌である。

【0121】

「ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする」という用語は、ＰＤ－Ｌ１発現が、疾患または障害に特徴的な１つ以上の病理学的プロセスに関連するか、または関与する任意の疾患または障害を広く指す。具体的には、限定するものではないが、ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする疾患または障害としては、例えば、腫瘍細胞がＰＤ－Ｌ１を発現するがん、及び／または腫瘍関連間質がＰＤ－Ｌ１の発現を示すがん、及び／またはＰＤ－Ｌ１が免疫細胞で発現しているがんが挙げられる。このような障害としては、限定するものではないが、浸潤性乳癌、結腸腺癌、リンパ腫、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、膵臓腺癌、直腸腺癌、膀胱尿路上皮癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、胆管癌、多形性膠芽腫、肝細胞癌、中皮腫、メルケル細胞癌、腎細胞癌、肉腫（例えば、未分化肉腫）、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣胚細胞腫瘍、子宮癌肉腫、骨肉腫、神経膠芽腫、黒色腫、卵巣癌、胃癌、及び結腸直腸癌が挙げられる。

【0122】

「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連付けられる障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は、がんである。

【0123】

「腫瘍」は、本明細書に使用されるとき、悪性または良性に関わらず、あらゆる腫瘍性の細胞成長及び増殖、ならびにあらゆる前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。

【0124】

「治療する、処置する」、「治療、処置」及び「治療すること、処置すること」という用語は、本明細書において用いる場合、治療的処置及び予防的な防止的手段の両方を指し、その目的は、標的となる生理学的状態または障害を予防または減速（緩和）することである。処置を必要とする対象としては、特定の状態または障害をすでに有する対象、ならびに障害を有する傾向のある対象、または障害が予防されるべき対象が挙げられる。

【0125】

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書中では同じ意味で用いられ、処置について評価されている、及び／または処置されている哺乳動物を指す。一実施形態では、哺乳動物とは、ヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、限定されないが、がんを有する個体、自己免疫疾患を有する個体、病原体感染症を有する個体などを包含する。対象はヒトであってもよいが、他の哺乳動物、特にヒトの疾患の実験室モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラットなども含まれる。

【0126】

「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、及び製剤を投与する対象にとって許容できない程度に毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は、無菌である。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）とは、対象哺乳動物に適度に投与して、用いる活性成分の有効用量を提供し得る賦形剤である。

【0127】

「無菌」製剤とは、無菌であるか、またはすべての生存微生物及びそれらの胞子を含まないか、もしくはそれらを本質的に含まない。「凍結」製剤とは、温度が０℃未満の製剤である。

【0128】

「安定」製剤とは、内部のタンパク質が保管時にその物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物学的活性を本質的に保持する製剤である。好ましくは、製剤は、保管時に、その物理的及び化学的安定性、ならびにその生物学的活性を本質的に保持する。保管期間は、一般的に、製剤の意図される貯蔵寿命に基づいて選択される。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１． Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ． Ａ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０）（１９９３）に概説されている。安定性は、選択された温度において、選択された期間測定され得る。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、濁度を測定することによって、及び／または目視検査によって）、カチオン交換クロマトグラフィー、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）またはキャピラリーゾーン電気泳動を使用して電荷不均一性を評定することによって、アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析、質量分光分析、還元されたインタクトな抗体を比較するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、ペプチドマッピング（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ－Ｃ）分析、抗体の生物学的活性または抗原結合機能の評価などを含む様々な異なる方法で、質的及び／または量的に評価され得る。不安定性には、凝集、脱アミド化（例えば、Ａｓｎ脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域の断片化）、スクシンイミド形成、対形成していないシステイン（複数可）、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化の差異などのうちのいずれか１つ以上が含まれ得る。

【0129】

ＩＩ．詳細な説明
ＰＤ－Ｌ１ｘ ４－１ＢＢ二重特異性抗体
本発明の態様は、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合する多重特異性結合化合物、例えば二重特異性抗体を含む。多重特異性結合化合物は様々な構成を含んでもよく、各結合単位は一組のＣＤＲ配列を含んでもよい。ＰＤ－Ｌ１重鎖ＣＤＲ配列には、配列番号１～６が含まれる。ＰＤ－Ｌ１軽鎖ＣＤＲ配列には、配列番号７～１２が含まれる。抗４－１ＢＢ重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号１３～１８を含み、抗４－１ＢＢ軽鎖ＣＤＲ配列は配列番号１９～２４を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、配列番号１～２４のいずれか１つにおいて２つ以下のアミノ酸置換を有するＣＤＲ配列を含む。

【0130】

本発明の実施形態による多重特異性結合化合物は、本明細書で提供されるように、重鎖及び軽鎖の可変領域配列の任意の適切な組み合わせを含み得る。抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域配列には、配列番号２５及び２６が含まれる。抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域配列には、配列番号２７～２８が含まれる。抗４－１ＢＢ重鎖可変領域配列には、配列番号２９、３０、４５及び４６が含まれる。抗４－１ＢＢ軽鎖可変領域配列には、配列番号３１、３２、４７及び４８が含まれる。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、配列番号２５～３２及び４５～４８のいずれか１つの可変領域配列に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約９９．９％の同一性を有する可変領域配列を含む。

【0131】

本発明の実施形態による多重特異性結合化合物は、本明細書に列挙されるように、１つ以上の抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖ配列を含み得る。抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖ配列には、配列番号１２９～１３２が含まれる。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、配列番号１２９～１３２のいずれか１つのｓｃＦｖ配列に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約９９．９％の同一性を有するｓｃＦｖ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ配列は、リンカー配列によってポリペプチドサブユニット（例えば、重鎖または軽鎖ポリペプチドサブユニット）に連結される。リンカー配列の非限定的な例には、配列番号３６、３７、３８、４９及び１２０～１２８が含まれる。

【0132】

本明細書に記載の多重特異性結合化合物は、臨床的治療剤（複数可）としての有用性に寄与する多くの利点を提供する。この多重特異性結合化合物は、治療上の利点を示す特定の分子の選択を可能にする、さまざまな結合単位構成を有するメンバーを含む。

【0133】

適切な結合化合物は、例えば、図４０のパネルＡに示すように、限定されないが、二重特異性結合化合物としての使用を含む、開発及び治療または他の使用のために本明細書に提供される結合化合物から選択され得る。

【0134】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合し、配列番号４３の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド、配列番号４１の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、配列番号４１の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド、及び配列番号４３の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。この二重特異性抗体は、ＱＬ３０１（シグナル配列付き）と呼ばれる。

【0135】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合し、配列番号４４の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド、配列番号４２の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、配列番号４２の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド、及び配列番号４４の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。この二重特異性抗体は、ＱＬ３０１（シグナル配列なし）と呼ばれる。

【0136】

候補タンパク質に対する親和性の決定は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定などの当該技術分野において公知の方法を使用して実施され得る。本明細書に記載の多重特異性結合化合物は、約１０^－６～約１０^－１１、例としては限定するものではないが、約１０^－６～約１０^－１０；約１０^－６～約１０^－９；約１０^－６～約１０^－８；約１０^－８～約１０^－１１；約１０^－８～約１０^－１０；約１０^－８～約１０^－９；約１０^－９～約１０^－１１；～約１０^－９～約１０^－１０；またはこれらの範囲内の任意の値を含むＫｄでＰＤ－Ｌ１または４－１ＢＢに対する親和性を有し得る。親和性の選択は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験を含む、ＰＤ－Ｌ１または４－１ＢＢの生物学的活性を調節するための生物学的評価、ならびに潜在的な毒性の評価によって確認され得る。

【0137】

本明細書に記載の４本鎖ポリペプチドを含むがこれらに限定されない、多重特異性結合化合物の様々な形式が本発明の範囲内である。本明細書における多重特異性結合化合物は、具体的には、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに対して結合親和性を有する二重特異性結合化合物（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１×抗４－１ＢＢ結合化合物）を含む。そのような二重特異性結合化合物は、図４０のパネルＢに示されるように、腫瘍細胞の強力なＴ細胞媒介死滅を誘導する。

【0138】

ＰＤ－Ｌ１ｘＣＤ４７ 二重特異性抗体
本発明の態様は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合する多重特異性結合化合物、例えば二重特異性抗体を含む。多重特異性結合化合物は様々な構成を含んでもよく、各結合単位は一組のＣＤＲ配列を含んでもよい。ＰＤ－Ｌ１重鎖ＣＤＲ配列には、配列番号１～６が含まれる。ＰＤ－Ｌ１軽鎖ＣＤＲ配列には、配列番号７～１２が含まれる。抗ＣＤ４７重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号５０～５５を含み、抗ＣＤ４７軽鎖ＣＤＲ配列は、配列番号５６～６１を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、配列番号１～１２または５０～６１のいずれか１つにおいて２つ以下のアミノ酸置換を有するＣＤＲ配列を含む。

【0139】

本発明の実施形態による多重特異性結合化合物は、本明細書で提供されるように、重鎖及び軽鎖の可変領域配列の任意の適切な組み合わせを含んでもよい。抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域配列には、配列番号２５及び２６が含まれる。抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域配列には、配列番号２７～２８が含まれる。抗ＣＤ４７重鎖可変領域配列には、配列番号６２～６３が含まれる。抗ＣＤ４７軽鎖可変領域配列には、配列番号６４～６５が含まれる。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、配列番号２５～２８及び６２～６５のいずれか１つの可変領域配列に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約９９．９％の同一性を有する可変領域配列を含む。

【0140】

本発明の実施形態による多重特異性結合化合物は、本明細書に列挙されるように、１つ以上の抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖ配列を含み得る。抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖ配列には、配列番号７２～７５が含まれる。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、配列番号７２～７５のいずれか１つのｓｃＦｖ配列に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約９９．９％の同一性を有するｓｃＦｖ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ配列は、リンカー配列によってポリペプチドサブユニット（例えば、重鎖または軽鎖ポリペプチドサブユニット）に連結される。リンカー配列の非限定的な例には、配列番号３６、３７、３８、４９及び１２０～１２８が含まれる。

【0141】

本明細書に記載の多重特異性結合化合物は、臨床的治療剤（複数可）としての有用性に寄与する多くの利点を提供する。多重特異性結合化合物には、治療上の利点を示す特定の分子の選択を可能にする、さまざまな結合単位構成を有するメンバーを含む。

【0142】

適切な結合化合物は、例えば、図１２のパネルＡに示すように、限定されないが、二重特異性結合化合物としての使用を含む、開発及び治療または他の使用のために本明細書に提供される結合化合物から選択され得る。

【0143】

本発明の態様は、多重特異性化合物の所望の成分のヘテロ二量体化を促進するために、それらの重鎖サブユニットの間にノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）界面を含む多重特異性結合化合物を含む（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメインを含む第１の重鎖ポリペプチドサブユニット、及び抗ＣＤ４７結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖ）を含む第２の重鎖ポリペプチドサブユニット）。

【0144】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合し、かつ配列番号６６の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド、配列番号６７の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、配列番号６８の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む。この分子は、ｈｕＤ３９．５．２．３－ｈｕＧ４ａ＿ｈｏｌｅ＿ＲＦ＿ｈｕＥ１５．１＿ｓｃＦｖｄｓ－ｈｕＧ４ａ＿ｈｉｎｇｅＦｃ＿ｋｎｏｂ＿ＫｉＨｓｓと呼ばれる。

【0145】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合し、かつ配列番号６９の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド、配列番号７０の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、配列番号７１の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む。この分子は、ｈｕＤ３９．５．２．３－ｈｕＧ４ａ＿ｈｏｌｅ＿ＲＦ＿ｈｕＥ２４．６＿ｓｃＦｖｄｓ－ｈｕＧ４ａ＿ｈｉｎｇｅＦｃ＿ｋｎｏｂ＿ＫｉＨｓｓと呼ばれる。

【0146】

候補タンパク質に対する親和性の決定は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定などの当該技術分野において公知の方法を使用して実施することができる。本明細書に記載の多重特異性結合化合物は、約１０^－６～約１０^－１１、例としては、限定するものではないが：約１０^－６～約１０^－１０；約１０^－６～約１０^－９；約１０^－６～約１０^－８；約１０^－８～約１０^－１１；約１０^－８～約１０^－１０；約１０^－８～約１０^－９；約１０^－９～約１０^－１１；約１０^－９～約１０^－１０；またはこれらの範囲内の任意の値のＫｄで、ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ４７に親和性を有し得る。親和性の選択は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験を含む、ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ４７の生物学的活性を調節するための生物学的評価、ならびに潜在的な毒性の評価によって確認され得る。

【0147】

本明細書に記載の３本鎖または４本鎖ポリペプチドを含むがこれらに限定されない、多重特異性結合化合物の様々な形式が本発明の範囲内である。本明細書における多重特異性結合化合物は、具体的には、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に対して結合親和性を有する二重特異性結合化合物（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ４７結合化合物）を含む。そのような二重特異性結合化合物は、腫瘍細胞の強力なＴ細胞媒介死滅を誘導する。

【0148】

ＰＤ－Ｌ１ｘＩＬ１５結合化合物
本発明の態様は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＩＬ１５受容体との相互作用を促進するＩＬ１５領域を含む多重特異性結合化合物、例えば、二重特異性抗体を含む。多重特異性結合化合物は様々な構成を含んでもよく、各ＰＤ－Ｌ１結合単位は一組のＣＤＲ配列を含んでもよい。ＰＤ－Ｌ１重鎖ＣＤＲ配列には、配列番号１～６が含まれる。ＰＤ－Ｌ１軽鎖ＣＤＲ配列には、配列番号７～１２が含まれる。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、配列番号１～１２のいずれか１つにおいて２つ以下のアミノ酸置換を有するＣＤＲ配列を含む。

【0149】

本発明の実施形態による多重特異性結合化合物は、本明細書で提供されるように、重鎖及び軽鎖の可変領域配列の任意の適切な組み合わせを含んでもよい。抗ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域配列には、配列番号２５及び２６が含まれる。抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖可変領域配列には、配列番号２７～２８が含まれる。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、配列番号２５～２８のいずれか１つの可変領域配列に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約９９．９％の同一性を有する可変領域配列を含む。

【0150】

本発明の実施形態による多重特異性結合化合物は、本明細書に列挙されるように、１つ以上の抗ＩＬ１５配列を含み得る。ＩＬ１５配列には、配列番号８６～９０が含まれる。いくつかの実施形態では、多重特異性結合化合物は、配列番号８６～９０のいずれか１つのＩＬ１５配列に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約９９．９％の同一性を有するＩＬ１５配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５配列は、リンカー配列によってポリペプチドサブユニット（例えば、重鎖または軽鎖ポリペプチドサブユニット）に連結される。リンカー配列の非限定的な例には、配列番号３６、３７、３８、４９及び１２０～１２８が挙げられる。

【0151】

本明細書に記載の多重特異性結合化合物は、臨床的治療剤（複数可）としての有用性に寄与する多くの利点を提供する。多重特異性結合化合物は、治療上の利点を示す特定の分子の選択を可能にする、さまざまな結合単位構成を有するメンバーを含む。

【0152】

適切な結合化合物は、例えば、図２３のパネルＡ～Ｆに示すように、限定されないが、二重特異性結合化合物としての使用を含む、開発及び治療または他の使用のために本明細書に提供される結合化合物から選択され得る。

【0153】

本発明の態様は、多重特異性化合物の所望の成分のヘテロ二量体化を促進するために、それらの重鎖サブユニットの間にノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）界面を含む多重特異性結合化合物を含む（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び第１のＩＬ１５タンパク質を含む第１の重鎖ポリペプチドサブユニット、ならびに抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び第２のＩＬ１５タンパク質を含む第２の重鎖ポリペプチドサブユニット）。

【0154】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、２つのＩＬ１５タンパク質を含み（各重鎖ポリペプチドサブユニット上のもの）、配列番号１０４の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド、配列番号１０５の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、配列番号１０５の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド、及び配列番号１０４の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。この分子は、Ｄ３９．５．２．３－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５ＲａＳｕ－ＩＬ１５－Ｔ２Ａと呼ばれ、図２３のパネルＡに模式的に示されている。

【0155】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、２つのＩＬ１５タンパク質を含み（各重鎖ポリペプチドサブユニット上のもの）、配列番号１０６の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド、配列番号１０７の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、配列番号１０７の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド、及び配列番号１０６の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。この分子は、Ｄ３９．５．２．３－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５－ＩＬ１５ＲａＳｕ－Ｔ２Ｂと呼ばれ、図２３パネルＤに模式的に示されている。

【0156】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、２つのＩＬ１５タンパク質を含み（各重鎖ポリペプチドサブユニット上のもの）、配列番号１０８の配列を含む第１及び第２の軽鎖ポリペプチド、配列番号１０９の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、及び配列番号１１０の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む。この分子は４本鎖分子であり、重鎖ポリペプチド間にＫｉＨ界面を含み、ヘテロ二量体化を促進する。この分子は、Ｄ３９．５．２．３－Ｇ１ＡＡＡ．ＫｉＨ－ＩＬ１５＋ＩＬ１５ＲａＳｕ－Ｔ３と呼ばれ、図２３のパネルＦに模式的に示されている。

【0157】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、１つのＩＬ１５タンパク質を含み（１重鎖ポリペプチドサブユニット上）、配列番号１１１の配列を含む第１及び第２の軽鎖ポリペプチド、配列番号１１２の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、及び配列番号１１３の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む。この分子は４本鎖分子であり、重鎖ポリペプチド間にＫｉＨ界面を含み、ヘテロ二量体化を促進する。この分子は、Ｄ３９．５．２．３－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５ＲａＳｕ－ＩＬ１５－Ｔ２Ａ－モノと呼ばれ、図２３のパネルＢに模式的に示されている。

【0158】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、１つのＩＬ１５タンパク質を含み（１重鎖ポリペプチドサブユニット上）、配列番号１１４の配列を含む第１及び第２の軽鎖ポリペプチド、配列番号１１５の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、及び配列番号１１６の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む。この分子は４本鎖分子であり、重鎖ポリペプチド間にＫｉＨ界面を含み、ヘテロ二量体化を促進する。この分子は、Ｄ３９．５．２．３－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５－ＩＬ１５ＲａＳｕ－Ｔ２Ｂ－モノと呼ばれ、図２３のパネルＥに模式的に示されている。

【0159】

好ましい一実施形態では、二重特異性結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、２つのＩＬ１５タンパク質を含み（各重鎖ポリペプチドサブユニット上のもの）、配列番号１１７の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチド、配列番号１１８の配列を含む第１の重鎖ポリペプチド、及び配列番号１１９の配列を含む第２の重鎖ポリペプチド、及び配列番号１１７の配列を含む第２の軽鎖ポリペプチドを含む。この分子は４本鎖分子であり、重鎖ポリペプチド間にＫｉＨ界面を含み、ヘテロ二量体化を促進する。この分子は、Ｄ３９．５．２．３－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５ＲａＳｕ－ＩＬ１５－Ｔ２Ａ－マスクと呼ばれ、図２３のパネルＣに模式的に示されている。

【0160】

候補タンパク質に対する親和性の決定は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定などの当該技術分野において公知の方法を使用して実施することができる。本明細書に記載の多重特異性結合化合物は、約１０^－６～約１０^－１１、例としては、限定するものではないが：約１０^－６～約１０^－１０；約１０^－６～約１０^－９；約１０^－６～約１０^－８；約１０^－８～約１０^－１１；約１０^－８～約１０^－１０；約１０^－８～約１０^－９；約１０^－９～約１０^－１１；約１０^－９～約１０^－１０；またはこれらの範囲内の任意の値のＫｄで、ＰＤ－Ｌ１に親和性を有し得る。親和性の選択は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験を含む、ＰＤ－Ｌ１またはＩＬ１５の生物学的活性を調節するための生物学的評価、ならびに潜在的な毒性の評価によって確認され得る。

【0161】

本明細書に記載の３本鎖または４本鎖ポリペプチドを含むがこれらに限定されない、多重特異性結合化合物の様々な形式が本発明の範囲内である。本明細書における多重特異性結合化合物には、特に、ＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性を有し、ＩＬ１５受容体との相互作用を促進する１つ以上のＩＬ１５タンパク質を含む二重特異性結合化合物（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１×ＩＬ１５結合化合物）が含まれる。そのような二重特異性結合化合物は、腫瘍細胞の強力なＴ細胞媒介死滅を誘導する。

【0162】

以下の表は、本明細書に記載の結合化合物をアセンブルする際に使用される様々な配列を提供する。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【表15】

【表16-1】

【表16-2】

【表17】

【表18】

【表19-1】

【表19-2】

【表20】

【表21】

【表22-1】

【表22-2】

【表22-3】

【表23-1】

【表23-2】

【表23-3】

【表23-4】

【表23-5】

【表23-6】

【表23-7】

【表23-8】

【0163】

結合化合物の調製
本発明の多重特異性結合化合物は、当該技術分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、結合化合物及びその抗原結合フラグメントはまた、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母を含む適切な真核宿主または原核宿主におけるコード化核酸の発現により、組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。

【0164】

医薬組成物、使用及び処置の方法
本発明の別の態様は、適切な薬学的に許容される担体と混合した本発明の１つ以上の多重特異性結合化合物を含む医薬組成物を提供することである。本明細書で使用される薬学的に許容される担体は、限定されないが、アジュバント、固体担体、水、緩衝液、もしくは治療成分を保持するために当該技術分野で使用される他の担体、またはそれらの組み合わせに例示される。

【0165】

一実施形態では、医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合する多重特異性結合化合物を含む。一実施形態では、医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合する多重特異性結合化合物を含む。一実施形態では、医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、１つ以上のＩＬ１５タンパク質を含む多重特異性結合化合物を含む。

【0166】

本発明に従って使用される結合化合物の医薬組成物は、所望の純度を有するタンパク質を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照のこと）と混合することによって、例えば、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、貯蔵用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用する用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0167】

経口投与用の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与の用量）で提供され得る。製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書の結合化合物は、静脈内注射もしくは注入によって投与されても、または皮下投与されてもよい。注射投与に関して、本明細書の結合化合物を、水溶液中、好ましくは生理的に適合する緩衝液中で製剤化して、注射部位の不快感を低減し得る。溶液は、上記のように担体、賦形剤、または安定剤を含有し得る。あるいは、結合化合物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌された、発熱物質ナシの水での構成のために凍結乾燥された形態であり得る。

【0168】

抗体製剤は、例えば、米国特許第９，０３４，３２４号に開示されている。本発明の結合化合物についても同様の製剤を使用してもよい。皮下抗体製剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１６０３５５５９１号及び米国特許出願公開第２０１６０１６６６８９号に記載されている。

【0169】

使用方法
本明細書に記載の多重特異性結合化合物及び医薬組成物は、限定されないが、本明細書に上記される病態及び疾患を含む、ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とする疾患及び病態の処置に使用され得る。

【0170】

一態様では、本明細書の多重特異性結合化合物及び医薬組成物を使用して、ＰＤ－Ｌ１の発現を特徴とするがんを処置し得る。本明細書で使用される場合、「ＰＤ－Ｌ１の発現によって特徴付けられる」がんとしては、限定するものではないが、１つ以上の腫瘍細胞がＰＤ－Ｌ１を発現するがん、及び／または腫瘍関連間質がＰＤ－Ｌ１の発現を示すがん、及び／または免疫細胞がＰＤ－Ｌ１の発現を示すがんが挙げられる。このような障害としては、限定するものではないが、浸潤性乳癌、結腸腺癌、リンパ腫、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、膵臓腺癌、直腸腺癌、膀胱尿路上皮癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、胆管癌、多形性膠芽腫、肝細胞癌、中皮腫、メルケル細胞癌、腎細胞癌、肉腫（例えば、未分化肉腫）、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣胚細胞腫瘍、子宮癌肉腫、骨肉腫、神経膠芽腫、黒色腫、卵巣癌、胃癌、及び結腸直腸癌が挙げられる。

【0171】

疾患の処置のための本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む、多くの異なる要因によって変化する。通常、患者は、ヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオンアニマル、ウサギ、マウス、ラットなどの実験用哺乳動物などもまた、処置され得る。処置用量を漸増させて、安全性及び有効性を最適化し得る。

【0172】

用量レベルは、当業者によって容易に決定され得るが、必要に応じて、例えば、治療への対象の応答を変化させる必要に応じて、変化させてもよい。単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療する宿主及び特定の投与様式に応じて異なる。一般的に、単位剤形は、約１ｍｇ～約５００ｍｇの活性成分を含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、薬剤の治療用量は、宿主の体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内で有り得る。例示的な処置計画は、２週間に１回もしくは１か月に１回または３～６か月に１回の投与を伴う。本発明の治療物質は、通常、複数回投与される。単回投与の間隔は、毎週、毎月または毎年であってもよい。間隔はまた、患者における治療物質の血中レベルを測定することによって指定されるように、不定期であってもよい。あるいは、本発明の治療物質を徐放性製剤として投与してもよく、その場合、あまり頻繁な投与を必要としない。用量と頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に依存して様々に異なる。

【0174】

一般的に、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製され、注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁するのに適した固体形態もまた、調製することができる。本明細書の医薬組成物は、直接の、または固体（例えば、凍結乾燥）組成物の再構成後の静脈内または皮下投与に適している。調製物はまた、上記で考察したように、アジュバント効果を増強するために、リポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリド、もしくはコポリマーなどの微粒子に乳化してもまたはカプセル化してもよい。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７－１１９，１９９７。本発明の薬剤は、活性成分の徐放またはパルス放出を可能にするような方法で製剤化することが可能な、デポー注射またはインプラント調製物の形態で投与してもよい。医薬組成物は、一般的に、無菌で、実質的に等張であり、米国食品医薬品局のすべての優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）の規制に完全に準拠して製剤化される。

【0175】

本明細書に記載の抗体及び抗体構造の毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に対する致死用量）を測定することによって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が、治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトでの使用に毒性のない用量範囲を策定する際に用いることができる。本明細書に記載の抗体の用量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いる剤形及び利用する投与経路に応じて、この範囲内で様々に異なり得る。正確な処方、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。

【0176】

投与用組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解した抗体または他の薬剤（例えば、別の削摩剤）を含むであろう。様々な水性担体、例えば緩衝食塩水などを使用してもよい。これらの溶液は無菌であり、一般的に望ましくない物質を含まない。これらの組成物を、従来の周知の滅菌技法によって無菌化してもよい。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質（ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）を含有し得る。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は大きく変動し得、選択された特定の投与様式及び患者のニーズに従って、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ ｅｄ．，１９８０）及びＧｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６））。

【0177】

本発明の活性剤及びその製剤、ならびに使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。キットはさらに、少なくとも１つの追加の試薬、例えば、化学療法薬などを含んでもよい。キットは通常、キットの内容物の使用目的を示すラベルを含む。本明細書中で使用する「ラベル」という用語には、キット上にもしくはキットと共に供給されるか、または他の方法でキットに付随する、あらゆる書面または記録物が含まれる。

【0178】

ここで十分に説明されている本発明は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行い得ることが当業者に明らかとなるであろう。

【実施例】

【0179】

実施例１：ＰＤ－Ｌ１または４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞へのＱＬ３０１の結合
ＰＤ－Ｌ１または４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルＶ底プレートに１×１０^５の密度で播種した。段階希釈した抗体を細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＡＦ６４７標識抗ヒトＦｃ二次抗体を加え、氷上で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を７ＡＡＤ生存色素を含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。結果を図１のパネルＡ～Ｃに示す。

【0180】

実施例２：結合の反応速度論
ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムで結合の反応速度論を測定した。抗体をＦｏｒｔｅＢｉｏの抗ヒト Ｆｃキャプチャー（ＡＨＣ）センサーにロードした後、ｈｉｓタグ付き組換えＰＤ－Ｌ１または４－１ＢＢタンパク質を結合させた。結果を図２のパネルＡ～Ｃに示す。

【0181】

実施例３：ＰＤ－Ｌ１またはｃｙｎｏ ４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞へのＱＬ３０１の結合
カニクイザルＰＤ－Ｌ１または４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルＶ底プレートに１×１０^５の密度でプレートした。段階希釈した抗体を細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＡＦ６４７標識抗ヒトＦｃ二次抗体を加え、氷上で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を７ＡＡＤ生存色素を含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。その結果を図３のパネルＡ～Ｃに示す。

【0182】

実施例４：ＱＬ３０１競合アッセイ
ＰＤ－Ｌ１または４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルＶ底プレートに１×１０^５の密度でプレートした。段階希釈した抗体を細胞に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。Ｈｉｓタグ付き組換えＰＤ－Ｌ１または４－１ＢＢタンパク質を、それぞれのプレートに加え、氷上でさらに１５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＡＰＣ標識抗Ｈｉｓ－タグ二次抗体を加え、氷上で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を７ＡＡＤ生存色素を含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。結果を図４のパネルＡ～Ｃに示す。

【0183】

実施例５：ＱＬ３０１二機能性ＥＬＩＳＡ及びＮＦ－ｋＢレポーターアッセイ
組換えＨｉｓタグ付き４－１ＢＢタンパク質を、室温で一晩、振とうしながら９６ウェルプレート上にコーティングした。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳでプレートを洗浄した後、プレートを２％のＢＳＡで６０分間ブロックし、抗体を加え、室温で６０分間振とうしながらインキュベートした。洗浄後、ビオチン化組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質をプレートに加え、室温で６０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合したストレプトアビジンを添加し、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質を加え、５～１０分間インキュベートして発色させた後、０．１６Ｍ硫酸を加えて反応を停止させた。プレートリーダーで吸光度を読み取った。レポーターアッセイのために、ＮＦ－ｋＢ転写制御下のウミシイタケルシフェラーゼレポーター要素も含む４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０^４細胞で播種した。親ＨＥＫ２９３細胞またはＰＤ－Ｌ１を発現するＨＥＫ２９３細胞を、１ウェルあたり同じ細胞数で添加した。次に、段階希釈した抗体を加え、５％のＣＯ_２で３７℃で２４時間インキュベートした。その後、上清を回収し、９６ウェルのホワイトウォールプレートに移し、ＱｕａｎｔｉＬｕｃ試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を加えた。発光は、プレートリーダーですぐに読み取った。その結果を図５のパネルＡ～Ｂに示す。

【0184】

実施例６：サイトカイン放出
ヒトＰＢＭＣを抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で刺激し、ＱＬ３０１、ＰＤ－Ｌ１もしくは４－１ＢＢモノクローナル、またはそれらの組み合わせと共に、ＰＤ－Ｌ１＋Ａ４３１細胞と共にインキュベートした。ＱＬ３０１は、ＩＬ２及びＩＦＮγの放出を誘導したが、抗ＰＤ－Ｌ１もしくは４－１ＢＢ単独、または２つの組み合わせでは誘導されなかった。Ａ４３１細胞が存在しない場合、ＩＬ２の誘導は有意に少なかった。その結果を図６のパネルＡ～Ｃに示す。各ドットは、個々のドナーを表し、値は対照抗体の倍数である。

【0185】

実施例７：ＳＥＢ刺激アッセイにおけるサイトカイン放出
ＩＬ２放出は、ＱＬ３０１の存在下でのＳＥＢ刺激アッセイでも観察されたが、ＰＤ－Ｌ１もしくは４－１ＢＢモノクローナル、または２つの組み合わせでは観察されなかった。ＱＬ３０１は、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及びＰＤ－Ｌ１＋ Ａ４３１細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を誘導したが、これはＰＤ－Ｌ１もしくは４－１ＢＢモノクローナル、または２つの組み合わせでは観察されなかった。その結果を図７のパネルＡ～Ｂに示す。

【0186】

実施例８：ＭＣ３８腫瘍モデル
ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８マウスがん細胞を、ヒトＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢのダブルノックインＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に移植した。平均腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に達した後、ＱＬ３０１、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル、または生理食塩水を週２回腹腔内投与した。１０ｍｇ／ｋｇのＱＬ３０１は、等モル用量の８ｍｇ／ｋｇのＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも有意に有効である（ｐ＜０．０００１、ｎ＝６）。研究終了時の腫瘍浸潤免疫細胞の分析では、生理食塩水またはＰＤ－Ｌ１モノクローナルと比較して、ＱＬ３０１を投与された動物の腫瘍にＣＤ８＋Ｔ細胞が多いことが示された（ｐ＜０．０１）。
その結果を図８のパネルＡ～Ｂに示す。

【0187】

実施例９：Ａ４３１腫瘍モデル
第２のモデルでは、Ａ４３１ヒトがん細胞をＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスの脇腹にヒトＰＢＭＣと同時移植した。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１モデルの結果と一致して、ＱＬ３０１は、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも腫瘍増殖抑制効果が高く、腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が高かった（ｎ＝８）。その結果を図９のパネルＡ～Ｂに示す。

【0188】

実施例１０：加速温度ストレス試験
４２℃で２８日間にわたる加速温度ストレステストでは、ＱＬ３０１のＨＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルの変化は最小限であった（５つの時点のクロマトグラムを重ね合わせたもの）。モノマー、凝集体、及びフラグメントの計算されたパーセンテージは、最初の生産組成の１％以内に留まった。その結果を図１０に示す。

【0189】

実施例１１：ヒト血清におけるＱＬ３０１のインキュベーション
ＱＬ３０１をヒト血清中で７日間インキュベートし、ＳＥＢ刺激アッセイにおいて、結合及びＰＢＭＣからのＩＬ２放出を刺激する能力について試験した。４℃のストック対照と血清でインキュベートした分子のと間に有意な変化は観察されなかった。その結果を図１１のパネルＡ～Ｂに示す。

【0190】

実施例１２：ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７へのＥＬＩＳＡ結合
ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７へのＥＬＩＳＡ結合を評価した。Ｉｍｍｕｌｏｎ ＨＢＸ プレートを、２μｇ／ｍＬのｈＰＤＬ１－ＦＣ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）で４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、４％のＮＦＤＭ／ＰＢＳで室温で１時間ブロックした。ブロックを除去し、４％のＮＦＤＭ／ＰＢＳで希釈した抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１μｇ／ｍＬのｈｕＣＤ４７－Ｃ３３Ｓ＿ｈｉｓを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて ＰＢＳＴで３回洗浄した。抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ（ＡｂＣａｍ、１：２０，０００）を各ウェルに添加し、室温で４５分間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄した後、アッセイをＴＢＭで発色させ、続いて２Ｎ硫酸で発色させた。その結果を図１２のパネルＢに示す。図１２のパネルＡは、ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ４７二重特異性抗体の模式図である。

【0191】

実施例１３：ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ４７二重特異性抗体のＨＥＫ２９３細胞への結合
細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。１ウェルあたり １×１０^５個の細胞を９６ウェルＶ底プレートに分配した。試験抗体の連続希釈物を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。その細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次に、細胞を５０μＬの二次抗体、ＡＦ６４７ Ｆ（ａｂ’）^２ヤギ抗ヒト ＩｇＧ、Ｆｃ特異的、１：５００希釈液（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－６０６－０９８）に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。最後に、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、７－ＡＡＤを含む１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。その結果を図１３のパネルＡ～Ｅに示す。

【0192】

実施例１４：ＰＤ－１ Ｆｃ－ビオチンブロッキング
細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。１ウェルあたり１．２×１０^５個の細胞を９６ウェルＶ底プレートに分配した。０．５μｇ／ｍＬのＰＤ－１－ビオチン（最終濃度）を細胞に添加し、氷上で５分間インキュベートした。次に、試験抗体の連続希釈物を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。その細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次に、その細胞を５０μＬの二次抗体、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号Ｆ００５０）に１０μＬ／１０^６細胞で再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。最後に、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、７－ＡＡＤを含む１２０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。その結果を図１４及び図１５に示す。

【0193】

実施例１５：ＳＩＲＰα Ｆｃ－ビオチンブロッキング
細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。ウェルあたり１．２×１０^５個の細胞を、９６ウェルＶ底プレートに分配した。１．２５μｇ／ｍＬのＳＩＲＰα－ビオチン（最終濃度）を細胞に添加し、氷上で５分間インキュベートした。次に、試験抗体の連続希釈物を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。その細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次に、細胞を５０μＬの二次抗体、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号Ｆ００５０）に１０μＬ／１０^６細胞で再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。最後に、その細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、７－ＡＡＤを含む１２０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。その結果を図１６のパネルＡ～Ｂに示す。

【0194】

実施例１６：Ｒａｊｉ及びＭＭ．１Ｓ細胞のＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７媒介食作用
組換えヒトＭ－ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－４９２）及び組換えヒト ＩＬ－１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９８－４４８）由来のマクロファージを、新たに単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生成した。０日目に非接着細胞を除去した後、Ｒｈ Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を組織培養フラスコ内の接着細胞に添加し、３日目と７日目に新鮮な培地を補充し、Ｒｈ ＩＬ－１０（１０ｎｇ／ｍｌ）を７日目に添加し、さらに１０％熱不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０でさらに２日間インキュベートした。次いで、ＣＦＳＥ標識標的細胞（１×１０^５細胞／ウェル）及びエフェクター細胞（２．５×１０^４細胞／ウェル）を、５％ＣＯ_２インキュベーター中で、２時間、９６ウェル超低アタッチメントＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号７００７）での試験抗体の連続希釈とともに３７℃でインキュベートした。次に、細胞を９６ウェルｖ底ＰＰプレートに移し、スピンダウンしてペレットにし、２０％熱不活化ＦＢＳを含むＤＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞を２０％ＨＩ ＦＢＳを含むＤＰＢＳで再懸濁した。ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ３６抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＡ１－１０２１０）を、試験抗体を含むウェルに加え、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、２０％ＨＩ ＦＢＳを含む２００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄した。最後に、細胞を７－ＡＡＤを含む緩衝液で再懸濁した。サンプルは、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用してフローサイトメトリーで分析し、さらにＣＤ４７－ＰＤＬ１抗体によって誘導されるマクロファージによる標的細胞の食作用を示すＬｉｖｅ ＣＦＳＥ／ＡＰＣ二重陽性でＦｌｏｗＪｏ ゲーティングを使用して分析した。その結果を図１７のパネルＡ～Ｂに示す。

【0195】

実施例１７：赤血球へのＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７の結合
密度勾配遠心分離による単核球の分離後にバフィーコートから得られたヒト赤血球（ＲＢＣ）を、５０ｍＬコニカルチューブに慎重に移した。ＲＢＣをＤＰＢＳで３回洗浄し、遠心分離後に上清を注意深く除去した。次に、ＤＰＢＳを添加して、赤血球の１０％溶液を作成した。１ウェルあたり１×１０^６個の細胞を９６ウェルＶ底プレートに分配した。試験抗体の連続希釈物を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＲＢＣを、２％ＦＢＳ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む２００μＬのＤＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で２回洗浄した。次に、ＲＢＣを１００μＬの二次抗体、ＡＦ６４７ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒト ＩｇＧ、Ｆｃ特異的、１：５００希釈液（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－６０６－０９８）に再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。最後に、ＲＢＣを２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁した。その結果を図１８のパネルＡ～Ｂに示す。

【0196】

実施例１８：ＣＤ４７抗体によって誘導される赤血球の血球凝集
Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから入手した新鮮な全血をＤＰＢＳで１：１の比率で希釈した。その後、２μＬの希釈血液を９６ ウェルＵ底プレートに分配した。段階希釈した試験抗体５０μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。結果の写真ファイルを撮影した。その結果を図１９に示す。

【0197】

実施例１９：ＩＣＲ－ＳＣＩＤマウスにおけるＡ４３１／ｈＰＢＭＣ同時移植腫瘍モデル
各マウスが５×１０^６個のＡ４３１細胞及び１．５×１０^７個のヒトＰＢＭＣを受容するように、ＩＣＲ－ＳＣＩＤマウスにＡ４３１細胞及びヒトＰＢＭＣとマトリゲルとの混合物を皮下移植した。腫瘍が平均１４０ｍｍ^３に達したとき、０、４、７、１１、及び１５日目に、１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰの試験抗体または等量のＰＢＳをマウスに投与した（ｎ＝８）。腫瘍の増殖及びマウスの体重は、毎週２回モニタリングした。１８日目に腫瘍を採取し、リンパ球及び単球の含有量を分析した。その結果を図２０のパネルＡ～Ｆ及び図２１のパネルＡ～Ｆに示す。

【0198】

実施例２０：ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおけるＡ４３１腫瘍モデル
ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに、マウス１匹あたり５×１０^６個のＡ４３１細胞を皮下移植した。腫瘍が平均１１０ｍｍ^３に達したとき、０、４、８、１１、１４及び１８日目に、２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰの試験抗体または等量のＰＢＳをマウスに投与した（ｎ＝６）。腫瘍の増殖及びマウスの体重は、毎週２回モニタリングした。その結果を図２２のパネルＡ～Ｆに示す。

【0199】

実施例２１：ＰＤＬ１－ＩＬ１５抗体は、ヒトまたはカニクイザルＰＤ－Ｌ１またはヒトＩＬ２Ｒβ及びヒトＩＬ２Ｒγを発現する細胞に結合する
細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。１ウェルあたり２×１０^５個の細胞を、９６ウェルＶ底プレートに分配した。試験抗体の連続希釈物を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次に、細胞を５０μＬの二次抗体、ＡＦ６４７ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ｈｕ ＩｇＧ、Ｆｃ特異的、１：５００希釈液（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－６０６－０９８）に再懸濁し、氷上で２５分間インキュベートした。最後に、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、７－ＡＡＤを含む１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。その結果を図２４のパネルＡ～Ｃに示す。

【0200】

実施例２２：ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５抗体に応答したＮＫ９２またはＭ０７ｅ細胞の増殖
ＮＫ９２細胞は、１２．５％ウマ血清、１２．５％ウシ胎児血清、０．２ｍＭイノシトール、０．０２ｍＭ葉酸、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び１００－２００Ｕ／ｍＬＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）を補充したＭＥＭ－アルファ培地（Ｇｉｂｏ、１２５６１０５６）で培養した。Ｍ０７ｅ細胞は、２０％ウシ胎児血清及び１０ｎｇ／ｍＬＧＭ－ＣＳＦを補充したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、１２４４００４６）中で培養した。これらの増殖アッセイでは、細胞を採取し、ＩＬ２もＧＭ－ＣＳＦも含まない適切な培地で２回洗浄した。細胞を２０，０００細胞／ウェルで白色９６ ウェルプレートに分配し、５％ＣＯ_２中、３７℃で４時間飢餓状態にした。次いで、試験抗体の連続希釈物を添加し、そのプレートをさらに３日間インキュベートした。増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して製造元の指示に従って測定した。発光は、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３で記録した。その結果を図２５のパネルＡ～Ｃに示す。

【0201】

実施例２３：ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５抗体によるＭ０７ｅ細胞でのｐＳＴＡＴ５の誘導
Ｍ０７ｅ細胞を採取し、ＧＭ－ＣＳＦを含まない２０％ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ 培地で２回洗浄した。細胞は、５％ＣＯ_２中、３７℃で２４時間、ＧＭ－ＣＳＦを枯渇させ、次いで、９６ウェルＶ底プレートに１ウェルあたり１．５×１０^５細胞で分配した。試験抗体の連続希釈物を添加し、５％ＣＯ_２中、３７℃で２０分間インキュベートした。陽性対照として ＧＭ－ＣＳＦで刺激したウェルについては、１０分後にＧＭ－ＣＳＦを加え、合計１０分間の刺激を行った。インキュベーションが完了しとき、最終濃度が１．５％のパラホルムアルデヒドになるように４％のパラホルムアルデヒドを培養液に直接加えて細胞を固定し、室温で１０分間インキュベートした。次に、１００μＬの氷冷メタノールを加えて細胞を透過処理し、激しくピペッティングして混合した。４°で１０分間インキュベートした後、細胞を染色緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで、ヒトＦｃブロックを含む染色緩衝液５０μＬで再懸濁した。次に、抗ｐＳＴＡＴ５ 抗体（ＡＦ６４７マウス抗ＳＴＡＴ５ ｐＹ６９４、ＢＤカタログ番号６１２５９９）またはアイソタイプ対照（マウス ＩｇＧ１アイソタイプ対照、ＢＤ、カタログ番号５５７７１４）を加え、室温で１５～３０分間インキュベートした。次に、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、ＬＳＦ Ｆｏｒｔｅｓｓａでの分析のために１２０ｕＬの染色緩衝液に再懸濁した。その結果を図２６のパネルＡ～Ｂに示す。

【0202】

実施例２４：ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５抗体は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞の増殖を増大させる
ＰＢＭＣは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎプロトコルに従って単離された。製造業者のプロトコルに従って、赤血球を、ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で溶解した。単離後、ＰＢＭＣを、２％ＦＢＳを加えたＰＢＳで１回洗浄し、２×１０^７細胞／ｍＬで再懸濁した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔは、６μＭで調製し、最終濃度 ３μＭになるようにＰＢＭＣに添加した。暗所で室温で１０分間インキュベートした後、等量のＦＢＳを添加して反応を停止させた。次に、ＰＢＭＣを２％ＦＢＳを加えたＰＢＳで２回洗浄し、１０％熱不活化 ＦＢＳを含むＲＰＭＩに２×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。次いで、ＰＢＭＣを９６ウェルプレートに１ウェルあたり２×１０^５細胞で分配した。次いで、試験抗体の連続希釈物を添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で５日間インキュベートした。次に、対応するフルオロフォアを有する次のヒトタンパク質に対する抗体で染色することにより、ＰＢＭＣの増殖を分析した：ＣＤ３－ＢＢ５１５、ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｈ７、ＣＤ８－ＡＰＣ、ＣＤ５６－ＢＶ７８６、及びＣＤ２５ ＢＵＶ３９５。その結果を図２７のパネルＡ～Ｃ、図２８のパネルＡ～Ｄ、及び図２９のパネルＡ～Ｅに示す。

【0203】

実施例２５：マウスリンパ球数に対するＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５抗体の薬力学
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、試験抗体または等量のＰＢＳをＩＰ投与した（ｎ＝３）。１、４、６、８、及び１１日目に全血を採取した。マウスＦｃブロックＣＤ１６／ＣＤ３２クローン２．４Ｇ２（ＢＤカタログ番号５５３１４２）を、抗凝固処理したマウス全血５０μＬに、血液５０μＬあたり１．２～１．５μＬで添加し、４℃で５分間インキュベートした。マウスのリンパ球マーカーに対する蛍光色素結合抗体を混合し、血液サンプルに加え、次いでこれを暗所で４℃で１５～２０分間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプルに８００μＬを加えて激しくボルテックスすることにより、赤血球をＢＤ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ、カタログ番号５５５８９９）で溶解した。暗所で室温で１５分間インキュベーションした後、サンプルを３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を、２ｍＬのＢＤ染色緩衝液（ＢＤカタログ番号５５４６５７）で１回洗浄し、１サンプルあたり７－ＡＡＤを含む３５０μＬのＢＤ染色緩衝液及び５０μＬのカウンティングビーズ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎカタログ番号４２４９０２）と再懸濁する。その結果を図３０のパネルＡ～Ｅに示す。

【0204】

実施例２６：マウスリンパ球数に対するＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５抗体の薬力学
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、試験抗体（０．５ｍｇ／ｋｇ）または等量のＰＢＳをＩＰ投与した（ｎ＝３）。全血を４時間後と １、２、３、６、及び８日目に採取した。マウスＦｃブロックＣＤ１６／ＣＤ３２クローン２．４Ｇ２（ＢＤカタログ番号５５３１４２）を、血液５０μＬあたり１．２～１．５μＬで５０μＬの抗凝集マウス全血に加えて４℃で５分間インキュベートした。マウスのリンパ球マーカーに対する蛍光色素結合抗体を混合し、血液サンプルに加え、次いで、これを暗所で４℃で１５～２０分間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプルに８００μＬを加えて激しくボルテックスすることにより、赤血球を、ＢＤ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ、カタログ番号５５５８９９）で溶解した。暗所で室温で１５分間インキュベーションした後、サンプルを３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を、２ｍＬのＢＤ染色緩衝液（ＢＤカタログ番号５５４６５７）で１回洗浄し、１サンプルあたり７－ＡＡＤを含む３５０μＬのＢＤ染色緩衝液及び５０μＬのカウンティングビーズ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４２４９０２）と再懸濁した。その結果を図３１のパネルＡ～Ｆに示す。

【0205】

実施例２７：Ｃ５７ＢＩ／６及びＮＳＧマウスにおけるＤ３９．５－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５型Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３及びＴ２Ａモノの薬物動態測定
パネルＡ～Ｃ：研究２７：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各時点でｎ＝６、ｎ＝３）に０日目に１回ＩＶ投与した。全血及び血漿を、４時間目及び１、２、３、６及び８日目に採取した。研究２８：ＮＳＧマウスにマトリゲルとともにＵ１１８細胞（５×１０^６細胞／マウス）を移植した。腫瘍が２５０ｍｍ^３に達したとき、腫瘍を有する各マウスを、腫瘍を有しないＮＳＧマウスと群分けした。ＰＢＳ群には、２匹の非腫瘍担持マウスがいた。０日目に、マウスにヒトＰＢＭＣをＩＶ注射した（５×１０^６細胞／マウス）。１日目に、マウスに試験抗体または同量のＰＢＳを投与した。２、４、７、及び１１日目に全血及び血漿を採取した。パネルＤ：Ｃ５７Ｂｌ／６ マウス（各時点でｎ＝６、ｎ＝３）に０日目に１回ＩＰ投与した。全血及び血漿を４時間で、ならびに１、２、３、７及び９日目に採取した。その結果を図３２のパネルＡ～Ｄに示す。

【0206】

実施例２８：ＰＤＬ１－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５－Ｔ２ＡによるヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８マウス結腸癌細胞の腫瘍増殖阻害
ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウスあたり５×１０^６細胞を、マトリゲルと共に皮下に移植した。腫瘍が平均１６５ｍｍ^３に達したとき、マウスを無作為化（ｎ＝１０）し、試験分子または等量のＰＢＳを０、７、及び１４日目にＩＰ投与した。腫瘍の増殖及び体重は、毎週２回モニタリングした。その結果を図３３のパネルＡ～Ｆに示す。ＰＤＬ１－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５－Ｔ２Ａ処置後の無腫瘍マウスに、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１またはＢ１６Ｆ１０がん細胞のいずれかを再チャレンジした。データを図３３のパネルＧに示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１は増殖せず、持続的な防御免疫記憶が示唆された。

【0207】

実施例２９：ヒトＰＢＭＣと同時移植されたＡ４３１異種移植片の腫瘍増殖阻害
Ａ４３１細胞（５×１０^６細胞／マウス）をヒトＰＢＭＣ（１５×１０^６細胞／マウス）及びマトリゲル（１：１）と混合し、次いでＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。腫瘍が平均 １００ｍｍ^３に達したとき、マウスを無作為化（ｎ＝８）し、試験分子または等量のＰＢＳを０、６、及び１３日目にＩＰ投与した。腫瘍の増殖及び体重は、毎週２回モニタリングした。マウスを安楽死させ、２７日目に腫瘍を採取した。腫瘍をホモジナイズし、ヒトＴ細胞及びＮＫ細胞マーカーＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、及びＣＤ５６について染色した。サンプルは、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用したフローサイトメトリーによって分析し、ＦｌｏｗＪｏを使用してさらに分析した。結果を図３４のパネルＡ～Ｇに示す。腫瘍現型分析由来のデータを図３５のパネルＡ～Ｇ及び図３６のパネルＡ～Ｇに示す。グループ１、２、３、及び４では、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞が有意に増大した。

【0208】

実施例３０：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＰＤＬ１－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５－Ｔ２ＡによるヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８マウス結腸癌細胞の腫瘍増殖阻害
ＭＣ３８細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウスあたり０．６×１０^６細胞を、マトリゲルと共に皮下に移植した。腫瘍が平均１４５ｍｍ^３に達したとき、マウスを無作為化（ＰＢＳについてｎ＝５、ｎ＝８）し、試験分子または等量のＰＢＳを０、７、及び１４日目にＩＰ投与した。腫瘍の増殖及び体重は、毎週２回モニタリングした。腫瘍をホモジナイズし、マウスＴ細胞及びＮＫ細胞マーカーＣＤ４５、ＣＤ９０．２、ＣＤ８、ＣＤ４、及びＮＫ１．１について染色した。サンプルを、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用したフローサイトメトリーによって分析し、ＦｌｏｗＪｏを使用してさらに分析した。その結果を図３７のパネルＡ～Ｅに示す。腫瘍現型分析由来のデータを図３８のパネルＡ～Ｆに示す。

【0209】

実施例３１：ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＰＢＭＣと同時移植されたＮＣＩ－Ｈ１６５０細胞の腫瘍増殖阻害
ＮＣＩ－Ｈ１６５０細胞（１０×１０^６細胞／マウス）をヒトＰＢＭＣ（１０×１０^６細胞／マウス）及びマトリゲル（１：１）と混合し、次いでＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。腫瘍が平均 ９５ｍＭ^３に達したとき、マウスを無作為化（ｎ＝８）し、試験分子または等量のＰＢＳを０、７、及び１４日目にＩＰ投与した。腫瘍の増殖及び体重は、毎週２回モニタリングした。その結果を図３９のパネルＡ～Ｇに示す。

【0210】

実施例３２：ＣＤ４７－ＰＤＬ１二重特異性抗体によって誘導される赤血球（ＲＢＣ）の食作用は、モノクローナル抗ＣＤ４７抗体の食作用よりも少ない
組換えヒトＭ－ＣＳＦ及び組換えヒトＩＬ－１０由来マクロファージは、実施例１６及び図１７に記載のように生成された。慎重に分離したＲＢＣを、１μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ３４５５４）で標識した。ＣＦＳＥ標識ＲＢＣ（１×１０^５細胞／ウェル）及びマクロファージ（２．５×１０^４細胞／ウェル）を、５％ＣＯ_２中で、２時間、９６ウェル超低アタッチメントＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号ＲＥＦ７００７）での試験抗体の連続希釈とともに３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を９６ウェルｖ底ＰＰプレートに移し、スピンダウンしてペレットにし、２０％熱不活化ＦＢＳを含むＤＰＢＳで１回洗浄した。細胞を２０％ＨＩ ＦＢＳを含むＤＰＢＳで再懸濁し、ＡＰＣ結合した抗ヒトＣＤ３６抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＡ１－１０２１０）を試験抗体を含むウェルに加え、氷上で２０分間インキュベートした。細胞は、２０％ＨＩ ＦＢＳを含む２００μＬ ＤＰＢＳで２回洗浄した。最後に、細胞を７－ＡＡＤを含む緩衝液で再懸濁した。サンプルは、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用してフローサイトメトリーで分析し、さらに抗ＣＤ４７抗体によって誘導されるマクロファージによるＲＢＣの食作用を示す Ｌｉｖｅ ＣＦＳＥ／ＡＰＣ二重陽性でＦｌｏｗＪｏゲーティングを使用して分析した。その結果を図４１のパネルＡ及びＢに示す。

【0211】

実施例３３：ＭＭＰ１４及びｕＰＡで切断する前後のＴｙｐｅ２Ａマスク抗体のＣＨＯＫ１－ＩＬ２Ｒｂ／ｇ細胞への結合。
１６μｇの各抗体を、塩化亜鉛を補充した、０．４μｇのフリン活性化ＭＭＰ１４及び０．４μｇのｕＰＡを用いて、３７°で一晩消化した。消化後に、ＣＨＯＫ１－ＩＬ２Ｒｂ／ｇ細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。１ウェルあたり１×１０^５個の細胞を、９６ウェルｖ底プレートに分配した。試験抗体（切断及び未切断）の連続希釈物を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。その細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次に、細胞を５０μＬの二次抗体、ＡＦ６４７ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ｈｕ ＩｇＧ、Ｆｃ特異的、１：５００希釈液（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－６０６－０９８）に再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした。最後に、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、７－ＡＡＤを含む１２０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。その結果を図４２に示し、ＩＬ１５ＲｂのＤ１のみを使用する抗体では結合を減少させない；しかし、ＩＬ１５Ｒｂでマスキングすると結合が１０分の１を超えて減少することが示される。

【0212】

実施例３４：ＭＭＰ１４及びｕＰＡによる切断前後のＴｙｐｅ２Ａマスク抗体に応答したＮＫ９２細胞の増殖
ＮＫ９２細胞は、１２．５％ウマ血清、１２．５％ウシ胎児血清、０．２ｍＭのイノシトール、０．０２ｍＭの葉酸、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び１００－２００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）を補充したＭＥＭ－アルファ培地（Ｇｉｂｏ、１２５６１０５６）で培養した。１６μｇの各抗体を、塩化亜鉛を補充した、０．４μｇのフリン活性化ＭＭＰ１４及び０．４μｇのｕＰＡを用いて、３７°で一晩消化した。消化後、ＮＫ９２細胞を回収し、ＩＬ２を含まない培養培地で２回洗浄した。その細胞を２０，０００細胞／ウェルで白色９６ウェルプレートに分配し、５％ＣＯ_２中、３７℃で４時間飢餓状態にした。次いで、試験抗体の連続希釈物を添加し、そのプレートをさらに３日間インキュベートした。増殖は、製造元の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。発光は、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３で記録した。その結果を図４３に示し、ＩＬ１５Ｒｂによるマスキングが増殖を５～１５分の１に減少させることを示している。

【0213】

実施例３５：ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体の４週間反復投与毒物学研究におけるアカゲザルにおけるＡＳＴ及びＡＬＴレベル
ＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体の４週間反復投与毒性研究をアカゲザルで実施し、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルを測定した。その結果を図４４のパネルのＡ及びＢに示す。反復投与後にＡＳＴまたはＡＬＴレベルの慢性的な上昇はなく、３、１０、及び３０ｍｇ／ｋｇのＰＤ－Ｌ１ｘ ４－１ＢＢが肝臓への毒性効果を最小限に抑えたことが示唆されている。

【0214】

実施例３６：ＮＯＧマウスにおけるＰＤ－Ｌ１×ＣＤ４７（ＱＬ４０１）二重特異性抗体によるＡ３７５腫瘍増殖阻害
Ａ３７５細胞の接種前に、ヒトＰＢＭＣをＮＯＧマウスに移植した。この腫瘍モデルからの結果を図４５に示す。１０ｍｇ／ｋｇでのＰＤ－Ｌ１ｘＣＤ４７（ ＱＬ４０１）の抗腫瘍効果は、マグロリマブ、デュルバルマブ、またはそれらの組み合わせと同等かそれ以上強力であった。

【0215】

実施例３７：ＮＯＧマウスにおけるＰＤ－Ｌ１×ＣＤ４７（ＱＬ４０１）二重特異性抗体によるＲａｊｉ腫瘍増殖阻害
Ｒａｊｉ細胞の接種前に、ヒトＰＢＭＣをＮＯＧマウスに移植した。この腫瘍モデルからの結果を図４６に示す。１０ｍｇ／ｋｇでのＰＤ－Ｌ１ｘＣＤ４７（ＱＬ４０１）の抗腫瘍効果は、マグロリマブと同等であった。

【0216】

実施例３８：ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ４７二重特異性抗体の４週間反復投与毒物学研究におけるカニクイザルでの赤血球数
カニクイザルにおいて、ＰＤ－Ｌ１ｘ ＣＤ４７二重特異性抗体を用いた４ 週間の反復投与毒性研究を実施した。このモデルからの結果を図４７に示す。ＰＤ－Ｌ１ｘ ＣＤ４７を１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で繰り返し投与した後、赤血球数は正常範囲を有意に下回ることはなかった。

【0217】

実施例３９：ＰＤＬ１－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５－Ｔ２Ａのマウス交差反応代用物によるｃＤＣ１の刺激
ＭＣ３８腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植し、約１００ｍＭ^３まで増殖させた。マウスは、生理食塩水、非標的ＩＬ－１５ 融合タンパク質、及びＰＤ－ＰＤＬ１－Ｇ１ＡＡＡ－ＩＬ１５－Ｔ２Ａのマウス交差反応性代用物で処置した。腫瘍流出リンパ節を収集し、抗原提示細胞をＦＡＣＳで分析した。その結果を図４８に示す。ＰＤ－Ｌ１ｘ ＩＬ－１５ 代用物分子は、従来の樹状細胞 １（ｃＤＣ１）のより高いパーセンテージを誘導し、抗原提示細胞の刺激による抗腫瘍効果の二次メカニズムが示唆されている。

【0218】

本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、説明されたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、及び置換を見出すであろう。本明細書に記載する本発明の実施形態に対する様々な代替手段が、本発明の実施において採用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造、ならびにそれらの均等物が、それにより包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33-1】

【図33-2】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【配列表】

2023545447000001.app

【国際調査報告】