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特表2023-545493ゲノム編集の改善のための操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼバリアント
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-30
(54)【発明の名称】ゲノム編集の改善のための操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼバリアント
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20231023BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20231023BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20231023BHJP
C07K 14/315 20060101ALI20231023BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20231023BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/55 ZNA
C12N15/31
C07K14/315
C12N9/16 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023522947
(86)(22)【出願日】2021-10-13
(85)【翻訳文提出日】2023-06-08
(86)【国際出願番号】 US2021071839
(87)【国際公開番号】W WO2022082179
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】63/091,724
(32)【優先日】2020-10-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/155,554
(32)【優先日】2021-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/172,454
(32)【優先日】2021-04-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/196,073
(32)【優先日】2021-06-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/212,620
(32)【優先日】2021-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/232,719
(32)【優先日】2021-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500207899
【氏名又は名称】パイオニア ハイ－ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100126354
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 尚
(72)【発明者】
【氏名】アラルコン，クララ
(72)【発明者】
【氏名】ガスイオアー，ステファン ローレンス
(72)【発明者】
【氏名】ホウ，ゼングリン
(72)【発明者】
【氏名】ファン ヒンケル，エリザベス ソマーズ
(72)【発明者】
【氏名】ヤング，ジョシュア ケイ．
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
新規の操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼを使用する、細胞のゲノム中の標的配列のゲノム改変のための組成物及び方法が提供される。この方法及び組成物は、ガイドポリヌクレオチド／エンドヌクレアーゼシステムを用いて、細胞又は生物のゲノム内の標的配列を改変するか又は変化させるための有効なシステムを提供する。エンドヌクレアーゼを含むガイドポリヌクレオチド／エンドヌクレアーゼシステム等の、新規のエフェクター及びエンドヌクレアーゼシステム並びにそのようなシステムを含むエレメントも提供される。少なくとも１つのさらなるタンパク質サブユニットに任意選択的に共有結合若しくは非共有結合で連結されるか又はそれと集合された少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを含むガイドポリヌクレオチド／エンドヌクレアーゼシステムのための組成物及び方法、並びにリボヌクレオチドタンパク質としてエンドヌクレアーゼを直接送達するための組成物及び方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
操作されたＣａｓポリペプチドであって、（ａ）Ｃ末端三スプリット型ＲｕｖＣドメイン及び３つのジンクフィンガーモチーフ；
並びに
（ｂ）配列番号２０とのアラインメントに対する位置での下記のアミノ酸の内の１つ又は複数：２２６でのグリシン、２３０でのグリシン、３２７でのグルタミン酸、３２９でのグルタミン酸、３７６でのシステイン、３７９でのシステイン、３９５でのシステイン、３９８でのシステイン、及び４０６でのシステイン
を含み、
前記操作されたＣａｓポリペプチドは、下記：相対的な３８位置でのフェニルアラニン、相対的な４０位でのアラニン、相対的な７９位でのヒスチジン、相対的な８１位でのグルタミン酸、相対的な８７位でのアラニン、相対的な３３５位でのスレオニン、相対的な４０９位でのシステイン、相対的な４２１位でのグルタミン酸、相対的な４６７位でのリシン、又は相対的な４６８位でのグルタミン酸の内の少なくとも１つを含まず、
前記操作されたＣａｓポリペプチドは、ポリヌクレオチドの標的部位に部位特異的に結合し得る、
操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項2】
配列番号２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項3】
下記：相対的な３８位でのアスパラギン酸若しくはグルタミン酸、相対的な４０位でのグリシン、相対的な７９位でのアスパラギン酸、相対的な８１位でのグリシン、相対的な８７位でのリシン、相対的な１２０位でのプロリン、相対的な１４９位でのアスパラギン酸、相対的な１９０位でのリシン、相対的な２１７位でのヒスチジン、相対的な２９３位でのヒスチジン、相対的な２９８位でのセリン、相対的な３０６位でのフェニルアラニン、相対的な３１３位でのセリン、相対的な３２５位でのアスパラギン、相対的な３３５位でのアルギニン、相対的な３３８位でのバリン、相対的な４０５位でのアスパラギン、相対的な４０９位でのリシン若しくはアルギニン、相対的な４２１位でのアスパラギン若しくはアルギニン、相対的な４３０位でのプロリン、相対的な４６７位でのアルギニン、又は相対的な４６８位でのプロリンの内の少なくとも１つをさらに含む請求項１又は２に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項4】
前記操作されたＣａｓポリペプチドは、下記の温度：約４０℃、約３７℃、約３５℃、約３０℃、約２５℃、又は約２０℃の内の１つ又は複数にて、配列番号２０と比べて高い活性を有するエンドヌクレアーゼである、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項5】
前記ポリペプチドは、約５００個未満のアミノ酸の長さを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項6】
前記ポリペプチドは、複合体中に存在しており、前記複合体は、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド上の標的部位を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項7】
ポリヌクレオチドの前記標的部位に相補的な領域を含む可変ターゲティングドメインを含むガイドポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項8】
前記ガイドポリヌクレオチド可変ターゲティングドメインは、２０個未満のヌクレオチドを含む、請求項７に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項9】
前記操作されたＣａｓポリペプチドは、標的ポリヌクレオチド上のＰＡＭ配列を認識し、前記ガイドポリヌクレオチド及び前記Ｃａｓポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド上の前記標的部位に結合する複合体を形成する、請求項７又は８に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項10】
前記Ｃａｓポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドを開裂するエンドヌクレアーゼである、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項11】
前記操作されたＣａｓポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性に対して触媒的に不活性である、請求項１～３又は６～１０のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項12】
前記操作されたＣａｓポリペプチドは、Ｎ（Ｔ＞Ｗ＞Ｃ）ＴＴＣを含むＰＡＭ配列を認識する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項13】
前記Ｃａｓポリペプチドは、融合タンパク種の一部である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項14】
前記Ｃａｓポリペプチドは、融合タンパク質の一部であり、前記融合タンパク質は、異種ヌクレアーゼドメインをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項15】
デアミナーゼをさらに含む請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチドを含む合成組成物であって、異種ポリヌクレオチドをさらに含む合成組成物。
【請求項17】
前記異種ポリヌクレオチドは、発現エレメント、導入遺伝子、ドナーＤＮＡ分子、又はポリヌクレオチド改変鋳型である、請求項１６に記載の合成組成物。
【請求項18】
前記異種ポリヌクレオチドは、温度誘導性プロモーターである、請求項１６に記載の合成組成物。
【請求項19】
合成組成物であって、（ａ）請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド；
（ｂ）標的二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド；
及び
（ｃ）標的二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドに相補的な領域を含む可変ターゲティングドメインを含むガイドポリヌクレオチド
を含み、
前記Ｃａｓポリペプチドは、前記標的二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド上のＰＡＭ配列を認識し、前記ガイドポリヌクレオチド及び前記Ｃａｓポリペプチドは、前記標的二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドに結合する複合体を形成している、
合成組成物。
【請求項20】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド又は請求項１６～１９のいずれか一項に記載の合成組成物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項21】
前記ポリヌクレオチドは、前記操作されたＣａｓポリペプチドと、少なくとも１種の発現エレメントとをコードする、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項22】
前記ポリヌクレオチドは、前記操作されたＣａｓポリペプチドと、遺伝子とをコードする、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項23】
前記Ｃａｓポリペプチドは、固体マトリックスに付着しているか、又は前記Ｃａｓポリペプチドは、ガイドポリヌクレオチドと複合体化しており、前記Ｃａｓポリペプチド／ガイドポリヌクレオチド複合体は、固体マトリックスに付着している、請求項１～１６のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項24】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたＣａｓポリペプチド、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の合成組成物、又は請求項２０～２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む真核細胞。
【請求項25】
前記真核細胞は、植物細胞、動物細胞、又は真菌細胞である、請求項２４に記載の真核細胞。
【請求項26】
前記真核細胞は、単子葉植物細胞又は双子葉植物細胞である、請求項２４に記載の真核細胞。
【請求項27】
前記植物細胞は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、コムギ、キャノーラ、アブラナ、モロコシ、イネ、ライムギ、オオムギ、キビ、カラスムギ、サトウキビ、芝草、スイッチグラス、アルファルファ、ヒマワリ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、又はトマト由来の細胞である、請求項２６に記載の真核細胞。
【請求項28】
前記真核細胞は、約４０℃以下、約３７℃以下、約３５℃以下、約３０℃以下、約２５℃以下、又は約２０度以下の温度で存在している、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項29】
標的ポリヌクレオチド中に標的化編集を導入する方法であって、（ａ）請求項７～９のいずれか一項に記載のＣａｓポリペプチド及びガイドポリヌクレオチドを準備することであって、前記Ｃａｓポリペプチド／ガイドポリヌクレオチドは、前記標的ポリヌクレオチド上のＰＡＭ配列を認識する複合体を形成する、準備すること；
並びに
（ｂ）前記Ｃａｓポリペプチド／ガイドポリヌクレオチド複合体と、前記標的とを接触させること；
並びに
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチド中に標的化編集を導入すること
を含む方法。
【請求項30】
前記標的ポリヌクレオチドは、細胞の標的ゲノム配列であり、前記方法は、（ｉ）前記Ｃａｓポリペプチド／ガイドポリヌクレオチド複合体を前記細胞に送達すること；
（ｉｉ）前記細胞を、約４０℃以下、約３７℃以下、約３５℃以下、約３０℃以下、約２５℃以下、又は約２０度以下の温度でインキュベートすること；
（ｉｉｉ）前記細胞の前記標的ゲノム配列中の少なくとも１つのヌクレオチドを改変して、前記Ｃａｓポリペプチド／ガイドポリヌクレオチド複合体の送達前の前記細胞の前記標的ゲノム配列と比較して改変されたゲノム配列を生成すること；
及び
（ｉｖ）前記細胞から全生物を生成することであって、前記生物は、前記改変されたゲノム配列を含む、生成すること
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記細胞は、真核細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記真核細胞は、動物、真菌、又は植物に由来するか又はそれから得られる、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記真核細胞は、単子葉植物又は双子葉植物である植物に由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記植物は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、コムギ、キャノーラ、アブラナ、モロコシ、イネ、ライムギ、オオムギ、キビ、カラスムギ、サトウキビ、芝草、スイッチグラス、アルファルファ、ヒマワリ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、及びトマトからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記ガイドポリヌクレオチド可変ターゲティングドメインは、２０個未満のヌクレオチドを含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
異種ポリヌクレオチドを提供することをさらに含む請求項２９～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記異種ポリヌクレオチドは、ドナーＤＮＡ分子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記異種ポリヌクレオチドは、前記細胞中の配列と少なくとも５０％同一の配列を含むポリヌクレオチド改変鋳型である、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
前記異種ポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターである、請求項３６に記載の方法。
【請求項40】
前記標的化編集を、約４０℃以下、約３７℃以下、約３５℃以下、約３０℃以下、約２５℃以下、又は約２０度以下の温度で導入する、請求項２９～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
請求項１２に記載の不活性化された操作されたＣａｓポリペプチドであって、前記不活性化されたＣａｓポリペプチドは、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１４３のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１４４のアミノ酸配列、
又は
（ｄ）配列番号２０とのアラインメントに対する位置での下記のアミノ酸の内の１つ若しくは複数：相対的な２２８位でのアラニン、相対的な３２７位でのアラニン、４３４位でのアラニン
を含む、不活性化された操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項42】
前記不活性化されたポリペプチドは、エフェクター、エフェクタータンパク質、塩基編集分子、又はデアミナーゼに連結されている、請求項１２又は４１に記載の不活性化された操作されたＣａｓポリペプチド。
【請求項43】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のＣａｓポリペプチド、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項２３に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼ及び固体マトリックスを含むキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０２１年１０月１２日に作成された８５３４－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔというファイル名の、サイズが４８９キロバイトであるＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されており、且つ本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマット文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の正式な写しは、２０２１年１０月１２日に作成された８５３４－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔというファイル名の、サイズが４８９キロバイトであるＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されており、且つ本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマット文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、分子生物学の分野に関し、特に、新規のＲＮＡ誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの組成物、並びに細胞のゲノムを編集するか又は改変するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0003】
組換えＤＮＡ技術により、標的のゲノム位置にＤＮＡ配列を挿入し、且つ／又は特定の内在性染色体配列を改変することが可能になった。部位特異的組換えシステムを使用する部位特異的組み込み技術は、他の種類の組換え技術と同様に、様々な生物における目的の遺伝子の標的化される挿入の生成に使用されている。デザイナージンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はホーミングメガヌクレアーゼ等のゲノム編集技術は、標的ゲノムパータベーションの生成に利用可能であるが、これらの系は、特異性が低く、各標的部位用に再設計することが必要であり、そのために作製に多額の費用及び時間を要する設計ヌクレアーゼを使用する傾向がある。
【0004】
多様な活性（ＤＮＡの認識、結合、及び任意選択的な開裂）を包含するエフェクタータンパク質の様々なドメインを含むＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的配置短回文配列リピート）と称される古細菌又は細菌の適応免疫系を利用するより新しい技術が同定されている。
【0005】
これらの系のいくつかの同定及び特徴付けにもかかわらず、内在性の及び以前に導入された異種ポリヌクレオチドの編集を行うために、新規のエフェクター及び系を操作すること並びに真核生物（特に、動物及び植物）における活性を実証することが依然として必要とされている。
【0006】
本明細書では、新規の操作されたＣａｓポリペプチド及びエンドヌクレアーゼ、並びにこれらの使用のための方法及び組成物が説明されている。
【発明の概要】
【0007】
本明細書で開示されているのは、新規の操作されたＣａｓポリペプチドの組成物、及びその使用方法である。このＣａｓポリペプチドは、ガイドポリヌクレオチドにより誘導されて、ＰＡＭ依存的に二本鎖ＤＮＡを標的とし得る。一部の実施形態では、この操作されたＣａｓポリペプチドは、標的二本鎖ＤＮＡの標的部位で切断を導入可能な活性エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、このＣａｓポリペプチドは、このＣａｓポリペプチドを、二本鎖切断を不可能にするが一本鎖切断を可能にする１つ又は複数の変異を含む。一部の実施形態では、このＣａｓポリペプチドは、このＣａｓポリペプチドを、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれか又は両方の鎖の開裂を不可能にするが、標的ポリヌクレオチド配列に結合する能力を保持させる１つ又は複数の変異を含む。
【0008】
一態様では、少なくとも１つのジンクフィンガー様ドメイン、少なくとも１つのブリッジヘリックス様ドメイン、三スプリット型ＲｕｖＣドメイン（非連続のＲｕｖＣ－Ｉドメイン、ＲｕｖＣ－ＩＩドメイン、及びＲｕｖＣ－ＩＩＩドメインを含む）を含み、任意選択的に異種ポリヌクレオチドを含む新規の操作されたＣａｓポリペプチドが提供される。同様に提供されるのは、この新規の操作されたＣａｓポリペプチド又はエンドヌクレアーゼを含む合成組成物である。
【0009】
任意の態様では、組成物又は方法のいずれかにおいて、真核細胞、特に、植物細胞、真菌細胞、又は動物細胞における発現に最適化されている少なくとも１種の構成要素が提供される。
【0010】
一態様では、シントロフォモナス・パルミタチカ（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｉｔａｔｉｃａ）から得られるか又は由来する天然エフェクタータンパク質とは異なるアミノ酸配列を含むように操作されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む合成組成物が提供される。
【0011】
一態様では、真核細胞及び異種ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターを含む合成組成物であって、前記異種ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、約５００個未満のアミノ酸を含む、合成組成物が提供される。
【0012】
一態様では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリヌクレオチド又はエンドヌクレアーゼを含む合成組成物であって、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリヌクレオチド又はエンドヌクレアーゼは、配列番号２０とアラインされた場合には、配列番号２０のアミノ酸位置番号に対して、下記：相対的な３８位でのアスパラギン酸若しくはグルタミン酸、相対的な４０位でのグリシン、相対的な７９位でのアスパラギン酸、相対的な８１位でのグリシン、相対的な８７位でのリシン、相対的な１２０位でのプロリン、相対的な１４９位でのアスパラギン酸、相対的な１９０位でのリシン、相対的な２１７位でのヒスチジン、相対的な２９３位でのヒスチジン、相対的な２９８位でのセリン、相対的な３０６位でのフェニルアラニン、相対的な３１３位でのセリン、相対的な３２５位でのアスパラギン、相対的な３３５位でのアルギニン、相対的な３３８位でのバリン、相対的な４０５位でのアスパラギン、相対的な４０９位でのリシン若しくはアルギニン、相対的な４２１位でのアスパラギン若しくはアルギニン、相対的な４３０位でのプロリン、相対的な４６７位でのアルギニン、又は相対的な４６８位でのプロリンの内の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は７個を含む、合成組成物が提供される。
【0013】
一態様では、配列番号２０とアラインされた場合には、操作されたＣａｓポリペプチド又はエンドヌクレアーゼは、下記：相対的な３８位でのフェニルアラニン、相対的な４０位でのアラニン、相対的な７９位でのヒスチジン、８１位でのグルタミン酸、相対的な８７位でのアラニン、相対的な３３５位でのスレオニン、相対的な４０９位でのシステイン、相対的な４２１位でのグルタミン酸、相対的な４６７位でのリシン、又は相対的な４６８位でのグルタミン酸の内の少なくとも１つを含まない。
【0014】
一態様では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はエンドヌクレアーゼを含む合成組成物であって、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、下記のモチーフ：ＧｘｘｘＧ、ＥｘＬ、及び／又は１つ若しくは複数のＣｘｎ（Ｃ，Ｈ）（ｎ＝１つ若しくは複数のアミノ酸、このモチーフは、例えば、ＣｘｎＣ若しくはＣｘｎＨであり得る）の内の１つ、２つ、又は３つを含む、合成組成物が提供される。
【0015】
一態様では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はエンドヌクレアーゼを含む合成組成物であって、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、１つ又は複数のジンクフィンガーモチーフを含む、合成組成物が提供される。
【0016】
一態様では、合成組成物であって、配列番号２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３からなる群から選択される配列の少なくとも２５０、２５０～３００、少なくとも３００、３００～３５０、少なくとも３５０、３５０～４００、少なくとも４００個、又は４００個を超える連続するアミノ酸と少なくとも５０％、５０％～５５％、少なくとも５５％、５５％～６０％、少なくとも６０％、６０％～６５％、少なくとも６５％、６５％～７０％、少なくとも７０％、７０％～７５％、少なくとも７５％、７５％～８０％、少なくとも８０％、８０％～８５％、少なくとも８５％、８５％～９０％、少なくとも９０％、９０％～９５％、少なくとも９５％、９５％～９６％、少なくとも９６％、９６％～９７％、少なくとも９７％、９７％～９８％、少なくとも９８％、９８％～９９％、少なくとも９９％、９９％～１００％、又は１００％の配列同一性を共有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む合成組成物が提供される。
【0017】
一態様では、合成組成物であって、配列番号２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも２５０、２５０～３００、少なくとも３００、３００～３５０、少なくとも３５０、３５０～４００、少なくとも４００個、又は４００個を超えるアミノ酸と少なくとも５０％、５０％～５５％、少なくとも５５％、５５％～６０％、少なくとも６０％、６０％～６５％、少なくとも６５％、６５％～７０％、少なくとも７０％、７０％～７５％、少なくとも７５％、７５％～８０％、少なくとも８０％、８０％～８５％、少なくとも８５％、８５％～９０％、少なくとも９０％、９０％～９５％、少なくとも９５％、９５％～９６％、少なくとも９６％、９６％～９７％、少なくとも９７％、９７％～９８％、少なくとも９８％、９８％～９９％、少なくとも９９％、９９％～１００％、又は１００％の配列同一性を共有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む合成組成物が提供される。
【0018】
一態様では、合成組成物であって、標的部位の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、又は３０個を超える連続するヌクレオチドと少なくとも５０％、５０％～５５％、少なくとも５５％、５５％～６０％、少なくとも６０％、６０％～６５％、少なくとも６５％、６５％～７０％、少なくとも７０％、７０％～７５％、少なくとも７５％、７５％～８０％、少なくとも８０％、８０％～８５％、少なくとも８５％、８５％～９０％、少なくとも９０％、９０％～９５％、少なくとも９５％、９５％～９６％、少なくとも９６％、９６％～９７％、少なくとも９７％、９７％～９８％、少なくとも９８％、９８％～９９％、少なくとも９９％、９９％～１００％、又は１００％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む合成組成物が提供される。
【0019】
一態様では、本明細書の方法及び組成物のいずれに関して、ガイドポリヌクレオチドの可変ターゲティングドメイン部分は、２０個未満のリボヌクレオチドを含む。
【0020】
本明細書中の方法又は組成物のいずれかは、異種ポリヌクレオチドをさらに含み得る。この異種ポリヌクレオチドは、非コード調節発現エレメント、例えば、プロモーター、イントロン、エンハンサー、又はターミネーター；ドナーポリヌクレオチド；細胞中のポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド改変を任意選択的に含むポリヌクレオチド改変鋳型；導入遺伝子；ガイドＲＮＡ；ガイドＤＮＡ；ガイドＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド；エンドヌクレアーゼ；核局在化シグナル；及び細胞トランジットペプチドからなる群から選択され得る。
【0021】
一態様では、本明細書中で開示されている組成物のいずれかを使用するための方法が提供される。一部の実施形態では、例えば、細胞のゲノム中又はインビトロでＣａｓポリペプチド又はエンドヌクレアーゼをポリヌクレオチドの標的配列に結合させるための方法が提供される。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチド又はエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチド（例えばガイドＲＮＡ）と複合体を形成する。一部の実施形態では、複合体は、標的配列で又はその付近でポリヌクレオチド中のニック（一本鎖）又は切断（二本鎖）を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に生成する。一部の実施形態では、ニック又は切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。一部の実施形態では、ニック又は切断は、ポリヌクレオチド改変鋳型又はドナーＤＮＡ分子を用いて、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同組換え（ＨＲ）により修復される。
【0022】
任意の態様では、操作されたＣａｓポリペプチド又はエンドヌクレアーゼは、合成組成物中に存在し得、且つ約４５℃未満の温度でインキュベートされ得、例えば、約４０℃以下、約３７℃以下、約３５℃以下、約３０℃以下、約２８℃以下、又は約２５℃以下の温度でインキュベートされ得る。そのため、同様に提供されるのは、ポリヌクレオチドと、本明細書で開示されている任意の操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼとを接触させること、及び約４５℃未満の温度（例えば、約４０℃以下、約３５℃以下、約３０度以下、約２８℃以下、又は約２５℃以下の温度）でポリヌクレオチド中に切断を生じさせることを含む方法である。この切断を使用して、ポリヌクレオチド中に標的化改変又は変更標的部位（例えば、塩基の編集、欠失、又は挿入）を生成し得る。
【0023】
本明細書で説明されている新規の操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼは、任意の原核細胞又は真核細胞において、適切なＰＡＭを含み且つガイドポリヌクレオチドによって誘導される標的ポリヌクレオチドにおいて又はそれに隣接して二本鎖切断を生成し得る。一部の例では、細胞は、植物細胞、又は動物細胞、又は真菌細胞である。一部の例では、植物細胞は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、コムギ、キャノーラ、アブラナ、モロコシ、イネ、ライムギ、オオムギ、キビ、カラスムギ、サトウキビ、芝草、スイッチグラス、アルファルファ、ヒマワリ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、及びトマトからなる群から選択される。
【0024】
別の態様では、本明細書で説明されている操作されたＣａｓポリペプチドは、ヌクレアーゼ不活性化又は死滅Ｃａｓポリペプチドをもたらす１つ又は複数の変異を含む。例えば、本明細書で開示されている操作されたＣａｓポリペプチドは、配列番号２０とのアラインメントに対して、相対的な２２８位でのアラニン、相対的な３２７位でのアラニン、又は４３４位でのアラニンを含むように変更され得る。同様に開示されているのは、配列番号２１、配列番号１４３、又は配列番号１４４のアミノ酸配列を含む不活性化Ｃａｓポリペプチドである。本開示の不活性化された操作されたＣａｓポリペプチドは、エフェクター又はエフェクタータンパク質と連結され得、このエフェクター又はエフェクタータンパク質は、ポリヌクレオチド標的を認識、それに結合し、及び／又は開裂するか若しくは切れ目を入れる分子であり得る。本開示の不活性化された操作されたＣａｓポリペプチドは、標的化塩基編集のために、塩基編集分子（例えばデアミナーゼ）に連結され得る。エフェクター又はエフェクタータンパク質に作動可能に連結された本開示の不活性化された操作されたＣａｓポリペプチドは、約４５℃以下、約４０℃以下、約３７℃以下、約３５℃以下、約３０℃以下、約２５℃以下、又は約２０℃以下の温度で、エフェクター分子の標的化送達に使用され得る。
【0025】
図面及び配列表の簡単な説明
本開示は、本出願の一部を形成する下記の詳細な説明並びに付随する図面及び配列表から、より十分に理解され得る。
本開示は、本出願の一部を形成する下記の詳細な説明並びに付随する図面及び配列表から、より十分に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】Ｃａｓエンドヌクレアーゼバリアント酵母発現ベクターを示しており、ここで、Ａ＝ＲＯＸ３プロモーター（配列番号１）；Ｂ＝酵母最適化Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子（配列番号２）；Ｃ＝ＳＶ４０ ＮＬＳをコードする配列（配列番号３）；Ｄ＝ＣＹＣ１ ターミネーター（配列番号４）＝＝；Ｅ＝ＳＮＲ５２プロモーター（配列番号５）；Ｆ＝ハンマーヘッド型リボザイムをコードする配列（配列番号７）；Ｇ＝ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする配列（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン）（配列番号８）；Ｈ＝ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ可変ターゲティングドメイン１をコードする配列（配列番号９）；Ｉ＝ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ可変ターゲティングドメイン２をコードする配列（配列番号１０）；Ｊ＝ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ可変ターゲティングドメイン３をコードする配列（配列番号１１）；Ｋ＝ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ可変ターゲティングドメイン４をコードする配列（配列番号１２）；Ｌ＝ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ１をコードする配列（配列番号１３）；Ｍ＝ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ２をコードする配列（配列番号１４）；Ｎ＝ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ３をコードする配列（配列番号１５）；Ｏ＝ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ４をコードする配列（配列番号１６）；Ｐ＝デルタ型肝炎ウイルスリボザイム（配列番号１７）；Ｑ＝ＳＵＰ４ターミネーター（配列番号１８）；ｄＢ＝酵母最適化ヌクレアーゼ不活性化又は死滅Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子（配列番号１９）。配列番号は、例示である。
【図2】Ｃａｓエンドヌクレアーゼのポリペプチド配列（配列番号２０）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。
【図3】ヌクレアーゼ不活性化（死滅）Ｃａｓエンドヌクレアーゼのポリペプチド配列（配列番号２１）である。アラニンで置換された重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。
【図4A】図４：図４Ａは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での標的開裂検出に関する概要であり、標的開裂及び細胞修復により、アデニン栄養要求性、及び白色から赤色／ピンク色の細胞表現型への切り替えをもたらす非機能性ａｄｅ２遺伝子が形成される。図４Ｂは、標的化ＤＳＢ活性が改善されているＣａｓエンドヌクレアーゼバリアント及び／又は関連するガイドＲＮＡを発現する細胞を選択するために使用される表現型の差違を示す。１枚目の画像（左端）は、機能性ａｄｅ２遺伝子を有するコロニー（白色）を示す。２枚目の画像は、非機能性ａｄｅ２遺伝子を有するコロニーを示す。３枚目の画像は、非機能性ａｄｅ２遺伝子を含む複数のセクターを有するコロニー（斑点状の外観）を示す。４枚目の画像（右端）は、非機能性ａｄｅ２遺伝子を含む単一のセクターを有するコロニー（赤色部分を有する白色）を示す。白黒写真では、赤色部分は、白色部分と比較して濃い陰影として表示されており、且つ矢印で示されている。
【図4B】（上記の通り。）
【図5】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇのポリペプチド配列（配列番号２３）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。アミノ酸４０位を、太字の二重下線フォントで示す。
【図6】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＥ８１Ｇのポリペプチド配列（配列番号２４）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。アミノ酸８１位を、太字の二重下線フォントで示す。
【図7】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇのポリペプチド配列（配列番号２５）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。アミノ酸４０位及び８１位を、太字の二重下線フォントで示す。
【図8A】図８：図８Ａは、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニーの割合を示す。形質転換後、蒔いた細胞を、一晩３７℃でインキュベートし、次いで、コロニーが見えるまで３０℃で増殖させ（典型的には２日間）、その時点で採点した。図８Ｂは、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニーの割合を示す。形質転換後、蒔いた細胞を、一晩４５℃でインキュベートし、次いで、コロニーが見えるまで３０℃で増殖させ、その時点で採点した。コロニーを、完全に赤色（２）、複数の赤色セクター（３）、又は単一の赤色セクター（４）と採点した。赤色コロニーの割合を、各群（２、３、及び４）での赤色コロニーの数をコロニーの総数で除算することにより算出した。
【図8B】（上記の通り。）
【図9】３０℃、３７℃、及び４５℃での、２０ｎｔスペーサーを有するｓｇＲＮＡ１（配列番号２７）を有する「死滅」／不活性化Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（配列番号２１）の活性を示す。
【図10】２０ｎｔスペーサーを有するｓｇＲＮＡ１の配列（配列番号２７）を示す。
【図11】１８ｎｔスペーサーを有するｓｇＲＮＡ２の配列（配列番号２８）を示す。
【図12】１８ｎｔスペーサー（配列番号２８）を使用した場合での、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニーの割合を示す。形質転換後、蒔いた細胞を、一晩３７℃又は４５℃でインキュベートし、次いで、コロニーが見えるまで３０℃で増殖させ（典型的には２日間）、その時点で、コロニーを、完全に赤色（２）、複数の赤色セクター（３）、又は単一の赤色セクター（４）と採点した。赤色コロニーの割合を、各群（２、３、及び４）での赤色コロニーの数をコロニーの総数で除算することにより算出した。
【図13】アルギニンスキャン及びジンクフィンガー飽和変異誘発ライブラリーから同定されたバリアントに関して、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニーの割合を示す。Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇと組み合わせて、３７℃での一晩のインキュベーションによりアッセイした場合では、Ｔ３３５Ｒ、Ｃ４０９Ｋ、Ｃ４０９Ｒ、及びＥ４２１Ｎは、活性の改善を示したが、Ｅ４２１Ｒ、Ｋ４６７Ｒ、及びＥ４６８Ｐは、赤色コロニーの回復に劇的な影響を及ぼさない中性的であると思われた。Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ（配列番号２５）に対して、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号３８（図２２））は、スコアが３である赤色の酵母コロニー回復において、約１０倍の増加を提供する最大の増強をもたらした。Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｃ４０９Ｋ（配列番号３９（図２３））、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｃ４０９Ｒ（配列番号４０（図２４））、及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｅ４２１Ｎ（配列番号４１（図２５））は、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ（配列番号２５）と比較した場合に、約６～８倍の改善が得られた。
【図14】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒのポリペプチド配列（配列番号３８）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。アミノ酸４０、８１、及び３３５位を、太字の二重下線フォントで示す。
【図15】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｃ４０９Ｋのポリペプチド配列（配列番号３９）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。アミノ酸４０、８１、及び４０９位を、太字の二重下線フォントで示す。
【図16】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｃ４０９Ｒのポリペプチド配列（配列番号４０）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。アミノ酸４０、８１、及び４０９位を、太字の二重下線フォントで示す。
【図17】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｅ４２１Ｎのポリペプチド配列（配列番号４１）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。アミノ酸４０、８１、及び４１２位を、太字の二重下線フォントで示す。
【図18】植物組織でＣａｓアルファバリアントを試験するための方法及び組成物を示す。
【図19A】図１９：図１９Ａは、図２６に示す方法を使用する４５℃での熱処理におけるＤＮＡ配列の変化の存在を示す。図１９Ｂは、編集の大部分が、片方又は両方のアレルで発生する生殖細胞系であったことを示す。
【図19B】（上記の通り。）
【図20】得られたｍｓ２６遺伝子及びｗａｘｙ遺伝子での変異を示す。
【図21】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｈ７９Ｄ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒのポリペプチド配列（配列番号８４）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。バリアントのアミノ酸位置を、太字の二重下線フォントで示す。
【図22】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒのポリペプチド配列（配列番号８５）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。バリアントのアミノ酸位置を、太字の二重下線フォントで示す。
【図23】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号３８）、Ａ４０Ｇ＋Ｈ７９Ｄ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８４）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）、Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号９０）、及びＦ３８Ｄ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号９１）に関する、３７℃での一晩のインキュベーション後での、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニーの割合を示す。
【図24】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＦ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒのポリペプチド配列（配列番号９０）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。バリアントのアミノ酸位置を、太字の二重下線フォントで示す。
【図25】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＦ３８Ｄ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒのポリペプチド配列（配列番号９１）である。重要な触媒残基を、太字の下線付きフォントで示す。ジンクフィンガードメインを、破線の下線で示す。バリアントのアミノ酸位置を、太字の二重下線フォントで示す。
【図26A】図２６：図２６Ａは、ネイティブ（配列番号２０）又は不活性化（配列番号２１）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、並びに配列番号３８、配列番号８５、及び配列番号１０１～１０９のそれぞれのバリアントＣａｓエンドヌクレアーゼに関する、３０℃での３日間のインキュベーション後の、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニー赤色領域（写真画像におけるピクセルの数で決定される）の総割合を示す。図２６Ｂは、配列番号９０、及び配列番号１１０～１１８のそれぞれのバリアントＣａｓエンドヌクレアーゼに関する、３０℃での３日間のインキュベーション後の、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニー赤色領域（写真画像におけるピクセルの数で決定される）の総割合を示す。
【図26B】（上記の通り。）
【図27A】図２７：図２７Ａは、配列番号１０１、及び配列番号１１９～１２５のそれぞれのバリアントＣａｓエンドヌクレアーゼに関する、３０℃での３日間のインキュベーション後の、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニー赤色領域（写真画像におけるピクセルの数で決定される）の総割合を示す。図２７Ｂは、配列番号１１０、及び配列番号１２６～１３２のそれぞれのバリアントＣａｓエンドヌクレアーゼに関する、３０℃での３日間のインキュベーション後の、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニー赤色領域（写真画像におけるピクセルの数で決定される）の総割合を示す。
【図27B】（上記の通り。）
【図28】配列番号１３３～１４２のバリアントＣａｓエンドヌクレアーゼに関する、３０℃での３日間のインキュベーション後の、赤色のａｄｅ２表現型を含む酵母コロニー赤色領域（写真画像におけるピクセルの数で決定される）の総割合を示す。
【図29】野生型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ＣａｓエンドヌクレアーゼバリアントＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ（配列番号２５）又はＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号３８）によるゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）の一過性形質転換の３日後に回収した標的化変異の割合を示す。形質転換後、図１８に示すように、胚を、３日にわたり好ましい温度（ここでは２８℃）でインキュベートし、３回（３×）の熱ショック（それぞれ、４５℃で４時間継続）を行ったか；或いは形質転換した胚を、３日にわたり一定の３７℃又は２８℃でインキュベートした。
【図30A】図３０：図３０Ａは、下記の処置：４５℃での３回の４時間インキュベーション、又は３７℃、３３℃、若しくは２８℃で３日間下での、野生型（Ｗｔ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（配列番号２０）及びバリアントＣａｓエンドヌクレアーゼ（配列番号３８、８５、１３５、又は１３９）をコードするゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）最適化発現カセットによる一過性形質転換の３日後の回収した遺伝子間領域（ＩＲ）標的部位での標的化変異の割合を示す。図３０Ｂは、下記の処置：４５℃での３回の４時間インキュベーション、又は３７℃、３３℃、若しくは２８℃で３日間下での、野生型（Ｗｔ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（配列番号２０）及びバリアントＣａｓエンドヌクレアーゼ（配列番号３８、８５、１３５、又は１３９）をコードするゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）最適化発現カセットによる一過性形質転換の３日後の回収した雄性不稔２６（Ｍｓ２６）部位での標的化変異の割合を示す。
【図30B】（上記の通り。）
【図31】下記の処置：４５℃での３回の４時間インキュベーション、又は３７℃、３３℃、若しくは２８℃で３日間下での、示されたＣａｓエンドヌクレアーゼ（配列番号３８、８５、１３５、又は１３９）と比較した最初の野生型（Ｗｔ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（配列番号２０）に対する形質転換後の３日後に回収した標的化変異の割合の倍数改善を示す。
【図32】Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）Ｃａｓ－アルファ１０バリアントの不活性化バージョンであり且つＣＢＦ１タンパク質由来の転写活性化ドメイン（配列番号１４７）に連結されているヌクレアーゼ不活性又は死滅（ｄ）Ｃａｓ－アルファ１０（配列番号１４４）の発現コンストラクトを示す。
【図34】本明細書のコンストラクトの送達に関して試験した５つの異なる形質転換レジメンを示す。各レジメン１～５は、熱処理時間、熱処理回数、及びいつ熱処理（ある場合）を施したか（コンストラクト送達後の日数）を示す。
【図35】ｄＣａｓ－アルファ１０及びｄＣａｓ－アルファ１０－ＣＢＦ１（それぞれ、それぞれのｓｇＲＮＡを有する）の混合物（ヘテロ二量体）と比較して、ｄＣａｓ－アルファ１０－ＣＢＦ１単量体のみで構成されている二量体を生じるｄＣａｓ－アルファ１０－ＣＢＦ１を発現するアントシアニン陽性細胞の平均数を示す。
【図36】シトシンデアミナーゼと連結されたヌクレアーゼ不活性又は死滅（ｄ）Ｃａｓ－アルファヌクレアーゼをコードする発現コンストラクトを示す。
【図37】バリアントＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号３８）の発現後に回収した標的部位変異の割合を示す。
【図38】Ｃａｓ－アルファ４ ｔｒａｃｒＲＮＡにおける抗リピート領域及び二次構造を示す。
【図39】Ｃａｓ－アルファ８ ｔｒａｃｒＲＮＡにおける抗リピート領域及び二次構造を示す。
【図40】Ｃａｓ－アルファ１０ ｔｒａｃｒＲＮＡにおける抗リピート領域及び二次構造を示す。
【図41】Ｃａｓ－アルファ１４ ｔｒａｃｒＲＮＡにおける抗リピート領域及び二次構造を示す。
【図42】Ｃａｓ－アルファ４、Ｃａｓ－アルファ８、及びＣａｓ－アルファ１０、並びに本明細書で開示されているこれらそれぞれのバリアントとの使用のために設計された３種のｓｇＲＮＡを示す。
【図43】コード配列に隣接する（即ち、リボザイムが介在していない）Ｕ６プロモーター及びＵ６ターミネーターを含むＣａｓ－アルファ１０ ｓｇＲＮＡ（Ｃａｓ－アルファ１０バリアントと共に使用され得る）をコードする発現コンストラクトを示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
配列の説明及び本明細書に添付した配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１及び１．８２５に規定されている特許出願におけるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の開示を管理する規則に従う。配列の説明は、参照により本明細書に組み込まれる３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１及び１．８２５に規定されたアミノ酸の３文字コードを含む。
【0028】
配列番号１は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡ ＲＯＸ３プロモーター配列である。
【0029】
配列番号２は、人工ＤＮＡ酵母最適化Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子配列である。
【0030】
配列番号３は、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列をコードする人工ＤＮＡ配列である。
【0031】
配列番号４は、未知のＤＮＡ ＣＹＣ１ターミネーター配列である。
【0032】
配列番号５は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡ ＳＮＲ５２プロモーター配列である。
【0033】
配列番号６は、人工ＤＮＡターミネーター配列である。
【0034】
配列番号７は、ハンマーヘッド型リボザイム配列をコードするＤＮＡ配列である。
【0035】
配列番号８は、ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン）配列をコードする人工ＤＮＡ配列である。
【0036】
配列番号９は、ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ可変ターゲティングドメイン１配列をコードするサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡ配列である。
【0037】
配列番号１０は、ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ可変ターゲティングドメイン２配列をコードするサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡ配列である。
【0038】
配列番号１１は、ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ可変ターゲティングドメイン３配列をコードするサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡ配列である。
【0039】
配列番号１２は、ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ可変ターゲティングドメイン４配列をコードするサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡ配列である。
【0040】
配列番号１３は、ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ １配列をコードする人工ＤＮＡ配列である。
【0041】
配列番号１４は、ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ ２配列をコードする人工ＤＮＡ配列である。
【0042】
配列番号１５は、ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ ３配列をコードする人工ＤＮＡ配列である。
【0043】
配列番号１６は、ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ ４配列をコードする人工ＤＮＡ配列である。
【0044】
配列番号１７は、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列をコードするデルタ型肝炎ウイルスＤＮＡ配列である。
【0045】
配列番号１８は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡ ＳＵＰ４ターミネーター配列である。
【0046】
配列番号１９は、人工ＤＮＡ酵母最適化ヌクレアーゼの不活性化されたか又は死滅されたＣａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子配列である。
【0047】
配列番号２０は、シントロフォモナス・パルミタチカ（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｉｔａｔｉｃａ）ＰＲＴ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ配列である。
【0048】
配列番号２１は、人工ＰＲＴヌクレアーゼの不活性化されたか又は死滅したＣａｓエンドヌクレアーゼ配列である。
【0049】
配列番号２２は、シミアンウイルス４０ ＰＲＴ ＳＶ４０ ＮＬＳ配列である。
【0050】
配列番号２３は、人工ＰＲＴ ＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇバリアント配列である。
【0051】
配列番号２４は、人工ＰＲＴ ＣａｓエンドヌクレアーゼＥ８１Ｇバリアント配列である。
【0052】
配列番号２５は、人工ＰＲＴ ＣａｓエンドヌクレアーゼＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇバリアント配列である。
【0053】
配列番号２６は、４０及び８１位用の人工ＤＮＡ Ｃａｓエンドヌクレアーゼバリアント鋳型の配列である。
【0054】
配列番号２７は、人工ＲＮＡ ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ １配列である。
【0055】
配列番号２８は、人工ＲＮＡ ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ ２配列である。
【0056】
配列番号２９は、人工ＲＮＡ ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ ３配列である。
【0057】
配列番号３０は、人工ＲＮＡ ＣａｓエンドヌクレアーゼｓｇＲＮＡ ４配列である。
【0058】
配列番号３１は、人工ＰＲＴ Ｔ３３５Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0059】
配列番号３２は、人工ＰＲＴ Ｃ４０９Ｋ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0060】
配列番号３３は、人工ＰＲＴ Ｃ４０９Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0061】
配列番号３４は、人工ＰＲＴ Ｅ４２１Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0062】
配列番号３５は、人工ＰＲＴ Ｅ４２１Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0063】
配列番号３６は、人工ＰＲＴ Ｋ４６７Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0064】
配列番号３７は、人工ＰＲＴ Ｅ４６８Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0065】
配列番号３８は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0066】
配列番号３９は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｃ４０９Ｋ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0067】
配列番号４０は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｃ４０９Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0068】
配列番号４１は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｅ４２１Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0069】
配列番号４２は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｅ４２１Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0070】
配列番号４３は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｋ４６７Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0071】
配列番号４４は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｅ４６８Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0072】
配列番号４５は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＵＢＩプロモーター配列である。
【0073】
配列番号４６は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ） ＵＢＩ５’ＵＴＲ配列である。
【0074】
配列番号４７は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＵＢＩイントロン１配列である。
【0075】
配列番号４８は、ＳＴ－ＬＳ１イントロン２配列を含む人工ＤＮＡゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）最適化ｃａｓ－アルファ１０遺伝子である。
【0076】
配列番号４９は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ＤＮＡ ＳＴ－ＬＳ１イントロン２配列である。
【0077】
配列番号５０は、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列をコードする人工ＤＮＡゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）最適化配列である。
【0078】
配列番号５１は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＵＢＩターミネーター配列である。
【0079】
配列番号５２は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）Ｕ６プロモーター（転写を促進するための３’Ｇを含む）配列である。
【0080】
配列番号５３は、Ｃａｓ－アルファ１０ ｓｇＲＮＡ配列をコードする人工ＤＮＡ配列である。
【0081】
配列番号５４は、Ｍｓ２６標的配列用のＣａｓ－アルファ１０ ｓｇＲＮＡスペーサーをコードするゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ配列である。
【0082】
配列番号５５は、ワクシー（ｗａｘｙ）標的配列用のＣａｓ－アルファ１０ ｓｇＲＮＡスペーサーをコードするゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ配列である。
【0083】
配列番号５６は、ＨＤＶリボザイム配列をコードするデルタ型肝炎ウイルスＤＮＡ配列である。
【0084】
配列番号５７は、人工ＤＮＡターミネーター配列である。
【0085】
配列番号５８は、Ｍｓ２６ Ｃａｓ－アルファ１０標的部位配列のゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ基準である。
【0086】
配列番号５９は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失１配列である。
【0087】
配列番号６０は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失２配列である。
【0088】
配列番号６１は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失３配列である。
【0089】
配列番号６２は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失４配列である。
【0090】
配列番号６３は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失５配列である。
【0091】
配列番号６４は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失６配列である。
【0092】
配列番号６５は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失７配列である。
【0093】
配列番号６６は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失８配列である。
【0094】
配列番号６７は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失９配列である。
【0095】
配列番号６８は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型Ｍｓ２６欠失１０配列である。
【0096】
配列番号６９は、ワクシー（ｗａｘｙ）Ｃａｓ－アルファ１０標的部位配列のゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ基準である。
【0097】
配列番号７０は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失１配列である。
【0098】
配列番号７１は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失２配列である。
【0099】
配列番号７２は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失３配列である。
【0100】
配列番号７３は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失４配列である。
【0101】
配列番号７４は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失５配列である。
【0102】
配列番号７５は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失６配列である。
【0103】
配列番号７６は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失７配列である。
【0104】
配列番号７７は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失８配列である。
【0105】
配列番号７８は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失９配列である。
【0106】
配列番号７９は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ Ｃａｓ－アルファ１０誘発型ワクシー（ｗａｘｙ）欠失１０配列である。
【0107】
配列番号８０は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｄ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0108】
配列番号８１は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0109】
配列番号８２は、人工ＰＲＴ Ｈ７９Ｄ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0110】
配列番号８３は、人工ＰＲＴ Ａ８７Ｋ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0111】
配列番号８４は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｈ７９Ｄ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0112】
配列番号８５は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0113】
配列番号８６は、ゴマノハグサ属モザイクウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ ＦＭＶ由来エンハンサー配列である。
【0114】
配列番号８７は、ピーナッツ・クロロティック・ストリーク・ウイルス（Ｐｅａｎｕｔ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｓｔｒｅａｋ Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ ＰＣＳＶエンハンサー配列である。
【0115】
配列番号８８は、オシロイバナ属モザイクウイルス（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ ＭＭＶエンハンサー配列である。
【0116】
配列番号８９は、ＩＲ標的配列のＣａｓ－アルファ１０ ｓｇＲＮＡスペーサーをコードするゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＤＮＡ配列である。
【0117】
配列番号９０は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0118】
配列番号９１は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｄ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0119】
配列番号９２は、人工ＰＲＴ Ｔ１９０Ｋ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0120】
配列番号９３は、人工ＰＲＴ Ｔ２１７Ｈ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0121】
配列番号９４は、人工ＰＲＴ Ｌ２９３Ｈ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0122】
配列番号９５は、人工ＰＲＴ Ｋ２９８Ｓ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0123】
配列番号９６は、人工ＰＲＴ Ｈ３０６Ｆ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0124】
配列番号９７は、人工ＰＲＴ Ｖ３１３Ｓ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0125】
配列番号９８は、人工ＰＲＴ Ｓ３３８Ｖ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0126】
配列番号９９は、人工ＰＲＴ Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0127】
配列番号１００は、人工ＰＲＴ Ｎ４３０Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0128】
配列番号１０１は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0129】
配列番号１０２は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ２１７Ｈ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0130】
配列番号１０３は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｌ２９３ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0131】
配列番号１０４は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｋ２９８Ｓ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0132】
配列番号１０５は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｈ３０６Ｆ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0133】
配列番号１０６は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｖ３１３Ｓ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0134】
配列番号１０７は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｓ３３８Ｖ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0135】
配列番号１０８は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0136】
配列番号１０９は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｎ４３０Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0137】
配列番号１１０は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0138】
配列番号１１１は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ２１７Ｈ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0139】
配列番号１１２は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｌ２９３Ｈ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0140】
配列番号１１３は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｋ２９８Ｓ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0141】
配列番号１１４は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｈ３０６Ｆ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0142】
配列番号１１５は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｖ３１３Ｓ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0143】
配列番号１１６は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｓ３３８Ｖ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0144】
配列番号１１７は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0145】
配列番号１１８は、人工Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｎ４３０Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0146】
配列番号１１９は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0147】
配列番号１２０は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｌ２９３Ｈ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0148】
配列番号１２１は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｋ２９８Ｓ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0149】
配列番号１２２は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｈ３０６Ｆ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0150】
配列番号１２３は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｓ３３８Ｖ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0151】
配列番号１２４は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0152】
配列番号１２５は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｎ４３０Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0153】
配列番号１２６は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0154】
配列番号１２７は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｌ２９３Ｈ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0155】
配列番号１２８は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｋ２９８Ｓ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0156】
配列番号１２９は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｈ３０６Ｆ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0157】
配列番号１３０は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｓ３３８Ｖ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0158】
配列番号１３１は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0159】
配列番号１３２は、人工ＰＲＴ Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｎ４３０Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0160】
配列番号１３３は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ＋Ｎ４３０Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0161】
配列番号１３４は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｌ２９３Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0162】
配列番号１３５は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0163】
配列番号１３６は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｌ２９３Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0164】
配列番号１３７は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0165】
配列番号１３８は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｌ２９３Ｈ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0166】
配列番号１３９は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｎ４３０Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0167】
配列番号１４０は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋ Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0168】
配列番号１４１は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0169】
配列番号１４２は、人工ＰＲＴ Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｋ２９８Ｓ＋ Ｈ３０６Ｆ＋Ｎ４３０Ｐ Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ配列である。
【0170】
ネイティブＣａｓエンドヌクレアーゼの最適温度は、植物及び酵母等のいくつかの生物の典型的な生物学的温度を超えている。このために、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、最適な活性のために約４５℃の熱ショックを必要とすることになる。用途によっては、この特性を変更することが有利な場合がる。本明細書では、新規の操作されたＣＲＩＳＰＲエフェクター、システム及びそのようなエフェクターを含むエレメント、例えば、限定されないが、新規のガイドポリヌクレオチド／エンドヌクレアーゼ複合体、ガイドポリヌクレオチド、ガイドＲＮＡエレメント、Ｃａｓタンパク質、及びエンドヌクレアーゼ、並びにエンドヌクレアーゼ機能性を含むタンパク質（ドメイン）のための方法及び組成物示されている。また、エンドヌクレアーゼ、開裂準備完了複合体、ガイドＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の直接送達のための組成物及び方法が提供される。本開示は、細胞のゲノム中における標的配列のゲノム改変、遺伝子編集、及び細胞のゲノムへの目的のポリヌクレオチドの挿入のための組成物及び方法をさらに含む。同定されたバリアントは、ヒト等の様々な細胞型におけるゲノム編集結果を改善し、且つこの小型ＲＮＡによりガイドされたＣａｓヌクレアーゼの広範な採用に役立つだろう。
【0171】
特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、他に特に明記されない限り、下記に記載するように定義される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【0172】
本明細書で使用される場合、「核酸」は、ポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを含む。核酸はまた、断片及び改変ヌクレオチドも含み得る。そのため、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、及び「核酸断片」という用語は、一本鎖又は二本鎖であるＲＮＡ、及び／又は、ＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ－ＤＮＡのポリマーを示すために互換的に使用され、任意選択的に、合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、又は変化したヌクレオチド塩基を含む。ヌクレオチド（通常、５’－一リン酸塩形態で見出される）は、単一文字表示により、以下のように称される：アデノシン又はデオキシアデノシンに対し（それぞれ、ＲＮＡ又はＤＮＡに対し）「Ａ」、シトシン又はデオキシシトシンに対し「Ｃ」、グアノシン又はデオキシグアノシンに対し「Ｇ」、ウリジンに対し「Ｕ」、デオキシチミジンに対し「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）に対し「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）に対し「Ｙ」、Ｇ又はＴに対し「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴに対し「Ｈ」、イノシンに対し「Ｉ」、及び任意のヌクレオチドに対し「Ｎ」。
【0173】
「ゲノム」という用語は、原核及び真核細胞又は生物細胞に適用される場合、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞成分（例えば、ミトコンドリア又はプラスチド）内で見出されるオルガネラＤＮＡも包含する。
【0174】
「オープンリーディングフレーム」を、ＯＲＦと略記する。
【0175】
「選択的にハイブリダイズする」という用語には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、核酸配列の、非標的核酸配列及び非標的核酸の実質的排除へのハイブリダイゼーションと比較して特定の核酸標的配列への検出可能に大きい程度（例えば、バックグラウンドと比較して少なくとも２倍）のハイブリダイゼーションについての言及が含まれる。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的には、相互に少なくとも約８０％の配列同一性又は９０％の配列同一性、及び１００％までの配列同一性（即ち、完全相補性）を有する。
【0176】
「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語には、プローブがインビトロハイブリダイゼーションアッセイにおいてその標的配列に選択的にハイブリダイズするであろう条件についての言及が含まれる。ストリンジェントな条件は、配列によって変わり、環境によっても異なるであろう。ハイブリダイゼーション条件及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対して１００％相補的な標的配列を同定し得る（相同プロービング）。或いは、より低い類似性が検出されるように配列の不一致を認めるように、ストリンジェンシー条件を調整し得る（非相同プロービング）。一般に、プローブは、長さが約１０００個のヌクレオチド未満であり、任意選択的に長さが５００個のヌクレオチド未満である。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０～８．３で、且つ短いプローブ（例えば、１０～５０個のヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃で、長いプローブ（例えば、５０個超のヌクレオチド）の場合には少なくとも約６０℃で、塩濃度が、約１．５Ｍ Ｎａイオン濃度であり、典型的には約０．０１～１．０Ｍ Ｎａイオン濃度であるものである。ストリンジェントな条件をまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によっても達成し得る。低ストリンジェンシー条件の例として、３７℃での、３０～３５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からなる緩衝液によるハイブリダイゼーション、及び５０～５５℃での、１×～２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム）による洗浄が挙げられる。中度ストリンジェンシー条件の例として、３７℃での、４０～４５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び５５～６０℃での、０．５×～１×ＳＳＣによる洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例として、３７℃での、５０％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び６０～６５℃での、０．１×ＳＳＣによる洗浄が挙げられる。
【0177】
「相同性」は、類似するＤＮＡ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム領域に対する相同領域」とは、細胞又は生物のゲノム中の所与の「ゲノム領域」と類似する配列を有するＤＮＡの領域のことである。相同領域は、開裂される標的部位での相同組換えを促進するのに十分である任意の長さであり得る。例えば、相同領域は、この相同領域が、対応するゲノム領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、５～５５、５～６０、５～６５、５～７０、５～７５、５～８０、５～８５、５～９０、５～９５、５～１００、５～２００、５～３００、５～４００、５～５００、５～６００、５～７００、５～８００、５～９００、５～１０００、５～１１００、５～１２００、５～１３００、５～１４００、５～１５００、５～１６００、５～１７００、５～１８００、５～１９００、５～２０００、５～２１００、５～２２００、５～２３００、５～２４００、５～２５００、５～２６００、５～２７００、５～２８００、５～２９００、５～３０００、５～３１００個、又はより多くの塩基の長さを含み得る。「十分な相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列が相同組換え反応のための基質として作用するために十分な構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性は、各ポリヌクレオチド断片の全長とポリヌクレオチドの配列類似性とを含む。配列類似性を、配列の全長にわたる配列同一性パーセントで、並びに／又は１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチド等の局在化した類似性を含む保存領域、及び配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセントで説明し得る。
【0178】
本明細書で使用される場合、「ゲノム領域」は、標的部位のいずれかの側上に存在する、細胞のゲノム中の染色体のセグメントであるか、又は代わりに標的部位の一部も含むセグメントである。このゲノム領域は、少なくとも５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、５～５５、５～６０、５～６５、５～７０、５～７５、５～８０、５～８５、５～９０、５～９５、５～１００、５～２００、５～３００、５～４００、５～５００、５～６００、５～７００、５～８００、５～９００、５～１０００、５～１１００、５～１２００、５～１３００、５～１４００、５～１５００、５～１６００、５～１７００、５～１８００、５～１９００、５～２０００、５～２１００、５～２２００、５～２３００、５～２４００、５～２５００、５～２６００、５～２７００、５～２８００、５～２９００、５～３０００、５～３１００個、又はより多くの塩基を含み得、の結果、このゲノム領域は、対応する相同領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。
【0179】
本明細書で使用される場合、「相同組換え」（ＨＲ）は、相同部位での２つのＤＮＡ分子間でのＤＮＡ断片の交換を含む。相同組換えの頻度は、多くの因子に影響される。相同組換え量、及び相同組換えと非相同組組換えとの相対的比率は、異なる生命体間で変わる。一般に、相同領域の長さは相同組換え事象の頻度に影響を及ぼし、相同領域が長ければ長いほど、頻度が高くなる。相同組換えの観察に必要な相同領域の長さは、種によっても変わる。多くの場合、少なくとも５ｋｂの相同性が利用されてきたが、２５～５０ｂｐと小さい相同性を用いた相同組換えが観察されている。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：２５－３３；Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１２：４４１－５７；Ｗａｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４７６８－７２、Ｓｕｇａｗａｒａ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，（１９９２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：５６３－７５、Ｒｕｂｎｉｔｚ ａｎｄ Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、（１９８４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：２２５３－８；Ａｙａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５１９９－２０３；Ｌｉｓｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１５：１６１－７を参照されたい。
【0180】
核酸配列又はポリペプチド配列の状況における「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較窓全体にわたり最大の一致に対してアラインされた場合に同一である２つの配列における核酸塩基又はアミノ酸残基を意味する。
【0181】
「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較窓全体にわたり２つの適切にアラインされた配列を比較することにより決定される数値を指しており、この比較窓中のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の部分は、これら２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含む場合がある。このパーセンテージは、配列同一性のパーセンテージを得るために、一致した位置数を生じさせるために両方の配列内で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する位置の数を決定し、一致した位置数を比較窓内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算することによって算出される。配列同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％、又は５０％～１００％の任意のパーセンテージが挙げられるが、これらに限定されない。これらの同一性を、本明細書で説明されているプログラムのいずれかを使用して決定し得る。
【0182】
配列アラインメント、及び同一性パーセント、又は類似性算出を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムが挙げられるがこれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定し得る。本出願に関連して、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合には、別途指定しない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初に初期化した場合にソフトウェアで最初にロードされる値又はパラメータの任意のセットを意味する。
【0183】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ８：１８９－１９１により説明されている）と表示され且つＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中に見出されるアラインメント法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、及びＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）用の及び同一性パーセントの算出用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合には、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ８：１８９－１９１により説明されている）と表示され且つＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中に見出されるアラインメント法に対応する。多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。別途指定しない限り、本明細書に示される配列同一性／類似性値は、下記のパラメータを使用するＧＡＰバージョン１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた値を指す：ヌクレオチド配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト ５０、ギャップ長伸長ペナルティウエイト ３、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用し；アミノ酸配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト ８、ギャップ長伸長ペナルティ ２、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５）。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３－５３のアルゴリズムを使用して、一致した数を最大化し且つギャップ数を最小限に抑える２つの配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、全ての可能なアラインメント及びギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティ及びギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数及び最小のギャップを有するアラインメントを作成する。「ＢＬＡＳＴ」は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されている、生物学的配列間の類似領域を見出すために使用される検索アルゴリズムである。このプログラムでは、ヌクレオチド配列又はタンパク質配列を配列データベースと比較し、一致の統計学的有意性を算出して、クエリ配列に十分類似した配列を、類似性がランダムに起こったと予想されないように特定する。ＢＬＡＳＴは、特定された配列、及びそのクエリ配列に対するローカルアライメントを報告する。多くのレベルの配列同一性が、他の種からの又は天然に若しくは合成により改変されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは、同一の又は類似した機能又は活性を有する）の特定に有用であることは、当業者によく理解されるであろう。同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％、又は５０％～１００％の任意のパーセンテージが挙げられるが、これらに限定されない。実際に、５０％～１００％の任意のアミノ酸同一性、例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性は、本開示の説明に有用であり得る。
【0184】
ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列、それらのバリアント、並びにこれらの配列の構造的関係を、本明細書では互換的に使用される「相同性」、「相同の」、「実質的に同一の」、「実質的に類似の」、及び「実質的に対応する」という用語により説明し得る。これらは、１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチド塩基の変化が分子の機能（例えば、遺伝子の発現を仲介する能力、又はある特定の表現型を生じさせる能力）に影響することのないポリペプチド配列又は核酸配列を指す。これらの用語はまた、得られる核酸の機能特性が、初期の改変されていない核酸と比較して実質的に変わらない核酸配列の改変も指す。これらの改変には、核酸断片中の１つ又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、及び／又は挿入が含まれる。包含される実質的に類似の核酸配列を、（中度ストリンジェンシー条件下、例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６０℃で）本明細書に例示した配列と又は本明細書で開示されているヌクレオチド配列の任意の部分にハイブリダイズする能力によって規定し得、これらは、本明細書で開示されている核酸配列のいずれかと機能的に等価である。ストリンジェンシー条件を調節して、中度の類似性を有する断片（例えば、遠縁の生物由来の相同配列）を、高い類似性を有する断片（例えば、近縁の生物由来の機能酵素を複製する遺伝子）に対してスクリーニングし得る。ハイブリダイゼーション後洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。
【0185】
「センチモルガン」（ｃＭ）又は「マップ単位」は、２つのポリヌクレオチド配列、結合遺伝子、マーカー、標的部位、遺伝子座、又はこれらの任意の対間の距離であり、ここで、減数分裂の結果の１％は、組換えである。そのため、センチモルガンは、２つの結合遺伝子、マーカー、標的部位、遺伝子座、又はこれらの任意の対間の平均組換え頻度１％に等しい距離と均等である。
【0186】
「単離された」又は「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な部分は、通常、その自然発生的環境で見られるような、そのポリヌクレオチド又はタンパク質と同時に生じるか又はそれらと相互作用する成分を実質的に又は本質的に含まない。そのため、単離されたか又は精製されたポリヌクレオチド又はポリペプチド又はタンパク質は、組換え技術によって生成された場合には、他の細胞物質も培養培地も実質的に含まないか、又は化学的に合成された場合には、化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチド（最適には、タンパク質をコードする配列）は、このポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ中に、天然ではこのポリヌクレオチドに隣接している配列（即ち、このポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ中のこのポリヌクレオチドに天然に隣接しているヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満を含み得る。単離ポリヌクレオチドを、これが天然に存在する細胞から精製し得る。当業者に既知の従来の核酸精製方法を使用して、単離ポリヌクレオチドを得ることができる。この用語にはまた、組換えポリヌクレオチド及び化学的に合成されたポリヌクレオチドも包含される。
【0187】
「断片」という用語は、ヌクレオチド又はアミノ酸の連続したセットを指す。一実施形態では、断片は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又は２０個超の連続したヌクレオチドである。一実施形態では、断片は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又は２０個超の連続したアミノ酸である。断片は、前記断片の全長にわたっていくらかの同一性パーセントを共有する配列の機能を示してもよいし示さなくてもよい。
【0188】
「機能的に均等である断片」及び「機能的に均等な断片」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、由来するより長い配列と同じ活性又は機能を示す単離された核酸断片又はポリペプチドの一部又は部分配列を指す。一例において、断片は、この断片が活性タンパク質をコードするか否かにかかわらず、遺伝子発現を変化させる能力又はある特定の表現型を生成する能力を保持する。例えば、断片を、改変された植物に所望の表現型を生じさせる遺伝子の設計に使用し得る。遺伝子を、核酸断片を、それが活性酵素をコードするか否かにかかわらず、植物プロモーター配列に対してセンス配向又はアンチセンス配向で結合させることにより、抑制的に使用されるように設計し得る。
【0189】
「遺伝子」には、例えば、コード配列に先行する（５’非コード配列）及び後続する（３’非コード配列）調節配列を含む、特異的タンパク質等であるがこれに限定されない機能的分子を発現する核酸断片が含まれる。「天然遺伝子」は、遺伝子であって、それ自体の調節配列と共にその天然の内在的な位置に見出される遺伝子を指す。
【0190】
「内在性」という用語は、細胞又は生物中に天然に存在する配列又は他の分子を意味する。一態様では、内在性ポリヌクレオチドは、通常、細胞のゲノム中に見出されており、即ち異種ではない。
【0191】
「アレル」は、染色体の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つである。染色体の所与の遺伝子座に存在する全てのアレルが同じである場合には、この植物はこの遺伝子座でホモ接合性である。染色体の所与の遺伝子座に存在するアレルが異なる場合には、この植物はその遺伝子座でヘテロ接合性である。
【0192】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。「調節配列」は、コード配列の上流（５’－非コード配列）、コード配列内、又はコード配列の下流（３’－非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指しており、これは、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、及びステムループ構造が挙げられるが、これらに限定されない。
【0193】
「変異遺伝子」は、ヒト介入により変化している遺伝子である。そのような「変異遺伝子」は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、又は置換によって、対応する非変異遺伝子の配列とは異なる配列を有する。本開示のある特定の実施形態では、変異遺伝子は、本明細書で開示されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムから結果として生じる改変を含む。変異植物は、変異遺伝子を含む植物である。
【0194】
本明細書で使用される場合、「標的化変異」とは、本明細書で開示されている誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを含む方法を含む、当業者に既知の任意の方法を使用して標的遺伝子内の標的配列を変化させることによって作製された、天然遺伝子を含む、遺伝子（標的遺伝子と呼ばれる）中の変異のことである。
【0195】
「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」、及び「遺伝的ノックアウト」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ノックアウトは、Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによって部分的に又は完全に無効とされた、細胞のＤＮＡ配列を意味しており、例えば、ノックアウト前のＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードしていた場合もあり、調節機能（例えばプロモーター）を有していた場合もある。
【0196】
「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」、「遺伝子挿入」、及び「遺伝的ノックイン」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ノックインは、Ｃａｓタンパク質を用いるターゲティングによる（例えば、相同組換え（ＨＲ）により、好適なドナーＤＮＡポリヌクレオチドも使用される）細胞中の特定のＤＮＡ配列におけるＤＮＡ配列の置換又は挿入を意味する。ノックインの例は、遺伝子のコード領域における異種アミノ酸コード配列の特異的挿入、又は遺伝子座における転写調節エレメントの特異的挿入である。
【0197】
「ドメイン」は、連続した一続きのヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列であり得る）又はアミノ酸を意味する。
【0198】
「保存ドメイン」又は「モチーフ」という用語は、進化的に関連するタンパク質のアラインされた配列に沿って特定の位置で保存された一連のポリヌクレオチド又はアミノ酸を意味する。他の位置でのアミノ酸は相同タンパク質間で変動し得るが、特定の位置で高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、又は活性に必須のアミノ酸を指す。これらは、そのタンパク質相同体ファミリーのアラインされた配列の高い保存度によって同定されることから、新しく決定された配列を有するタンパク質が予め同定されたタンパク質ファミリーに属するか否かを決定する識別子又は「シグネチャー」として使用され得る。
【0199】
「コドン改変遺伝子」、又は「コドン優先遺伝子」、又は「コドン最適化遺伝子」とは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子のことである。
【0200】
「最適化（された）」ポリヌクレオチドとは、特定の異種宿主細胞における発現を改善するために最適化された配列のことである。
【0201】
「植物最適化ヌクレオチド配列」とは、植物における発現に最適化されており、特に植物における発現の増加に最適化されているヌクレオチド配列のことである。植物最適化ヌクレオチド配列は、コドン最適化遺伝子を含む。植物最適化ヌクレオチド配列を、発現の改善のための１つ又は複数の植物優先コドンを使用して、例えば、本明細書で開示されているＣａｓエンドヌクレアーゼ等のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を改変することによって合成し得る。例えば、宿主優先コドンの利用についての考察には、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１－１１を参照されたい。
【0202】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写を開始する他のタンパク質の認識及び結合に関係するＤＮＡの領域である。プロモーター配列は、近位の及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーター固有のエレメントであり得るか、又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来していてもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され、及び／又は合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。様々なプロモーターが、様々な組織型若しくは細胞型で、又は様々な発達段階で、又は様々な環境条件に応じて、遺伝子の発現を誘導し得ることは、当業者に理解されている。さらに、殆どの場合には調節配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることは認識されている。
【0203】
殆どの細胞型で最も多く遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に、「構成型プロモーター」と称される。「誘導性プロモーター」という用語は、例えば化学的化合物（化学的誘導因子）によって内在性若しくは外因性刺激の存在に応答して、又は環境、ホルモン、化学的及び／若しくは発育シグナルに応答して、コード配列若しくは機能的ＲＮＡを選択的に発現するプロモーターを指す。誘導性又は調節プロモーターとして、例えば、光、熱、ストレス、フラッディング若しくは乾燥、塩ストレス、浸透圧ストレス、植物ホルモン、創傷、又はエタノール、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ジャスモン酸、サリチル酸、若しくは毒性緩和剤等の化学物質によって誘導されるか又は調節されるプロモーターが挙げられる。
【0204】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列と間に位置するポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡの翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性又は翻訳効率に影響し得る。翻訳リーダー配列の例は、報告されている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ、（１９９５）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：２２５－２３６）。
【0205】
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」、又は「終結配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指しており、ポリアデニル化認識配列、及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子配列に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常は、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸区域の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１－６８０によって例示されている。
【0206】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒性転写により生じる産物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全相補性コピーである場合は、ＲＮＡ転写物は、一次転写物又はプレ－ｍＲＮＡと称される。ＲＮＡ転写物は、一次転写物プレＲＮＡの転写後プロセシングで得られたＲＮＡ配列である場合には、成熟ＲＮＡ又はｍＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず且つ細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり且つ逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは、一本鎖であり得るか、又はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を使用して、二本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を指し、細胞内又はインビトロでタンパク質に翻訳され得る。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物又はｍＲＮＡの全部又は一部に対して相補的であり且つ標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（例えば米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、即ち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、又はコード配列との相補性であり得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、又は翻訳され得ないがそれにもかかわらず細胞内プロセスに影響を及ぼす他のＲＮＡを指す。「相補体」及び「逆相補体」という用語は、ｍＲＮＡ転写物に関して本明細書では互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。
【0207】
「ゲノム」という用語は、生物の各細胞又はウイルス若しくは細胞小器官に存在する遺伝的材料（遺伝子及び非コード配列）の構成要素全体；並びに／或いは１つの親から（ハプロイド）単位として受け継いだ一式の染色体を指す。
【0208】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって調節されるような単一核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節し得る場合には、このコード配列と作動可能に連結されている（即ち、このコード配列は、プロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。別の例では、相補性ＲＮＡ領域は、直接的若しくは間接的のいずれかで、５’で標的ｍＲＮＡに、若しくは３’で標的ｍＲＮＡに、又は標的ｍＲＮＡ内で作動可能に連結され得るか、又は第１相補性領域は５’であり、その相補体は３’から標的ｍＲＮＡまでである。
【0209】
一般に、「宿主」は、異種成分（ポリヌクレオチド、ポリペプチド、他の分子、細胞）が導入されている生物又は細胞を指す。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、異種ポリヌクレオチド又はポリペプチドが導入されている、単細胞実体として培養された、インビボ又はインビトロの真核細胞、原核細胞（例えば、細菌若しくは古細菌細胞）又は多細胞生物由来の細胞（例えば細胞株）を指す。一部の実施形態では、細胞は、下記からなる群から選択される。古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻類細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞。一部の例では、細胞は、インビトロである。一部の例では、細胞は、インビボである。
【0210】
「組換え」という用語は、例えば、化学合成によって、又は遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作によって、２つのさもなければ分離している配列セグメントの人工的組合せを指す。
【0211】
「プラスミド」、「ベクター」、及び「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を多くの場合に運ぶ線状又は環状の追加の染色体要素を指しており、通常、二本鎖ＤＮＡの形態をとる。そのような要素は、線状又は環状形態の、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの、任意の起源に由来する、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ、又はヌクレオチド配列であり得、これらでは、いくつかのヌクレオチド配列は、目的のポリヌクレオチドを細胞に導入し得る固有のコンストラクトに結合されているか又は組み換えられている。「形質転換カセット」は、遺伝子を含み且つこの遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、遺伝子を含み且つこの遺伝子に加えて宿主中でこの遺伝子を発現させる要素を有する特定のベクターを指す。
【0212】
「組換えＤＮＡ分子」、「組換えＤＮＡコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「コンストラクト」、及び「組換えコンストラクト」という用語は、本明細書では互換的に使用される。組換えＤＮＡコンストラクトは、天然には一緒に見出されるとは限らない核酸配列（例えば、調節配列及びコード配列）の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡコンストラクトは、異なる起源に由来する調節配列及びコード配列を含み得るか、又は同一起源に由来するが天然に見出されるのとは異なる方法で配列された調節配列及びコード配列を含み得る。そのようなコンストラクトは、それ自体で使用され得るか、又はベクターと共に使用され得る。ベクターが使用される場合には、ベクターの選択は、当業者に公知であるように、宿主細胞にベクターを導入するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用し得る。当業者は、宿主細胞を問題なく形質転換し、選択し、且つ繁殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝要素について熟知している。当業者は、異なる独立した形質転換事象が、発現の異なるレベル及びパターンをもたらし得（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ ４：２４１１－２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８－８６）、そのため所望の発現レベル及びパターンを示す菌株を得るためには通常は複数の事象がスクリーニングされることも認識するであろう。そのようなスクリーニングを、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、タンパク質発現の免疫ブロッティング分析、酵素若しくは活性分析、及び／又は表現型分析を含む標準的な分子生物学的アッセイ、生化学的アッセイ、及び他のアッセイにより行い得る。
【0213】
「異種（の）」という用語は、特定のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の元の環境、場所、又は組成と、その現在の環境、場所、又は組成との間の相違を指す。非限定的な例として、下記が挙げられる：分類学的由来の相違（例えば、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）から得られるポリヌクレオチド配列は、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）植物のゲノム若しくはゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）の異なる亜種若しくは品種に挿入される場合には異種である；又は細菌から得られたポリヌクレオチドが、植物の細胞に導入された）、又は配列の相違（例えば、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）から得られ、単離され、改変され、トウモロコシ植物に再導入されたポリヌクレオチド配列）。本明細書で使用される場合、配列に関連した「異種（の）」は、異なる種、亜種、外来種を起源とする配列を指し得るか、又は同種からのものであれば、組成及び／又はゲノム遺伝子座が意図的なヒト介入により天然の形態から実質的に改変されている配列を指し得る。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、このポリヌクレオチドが由来した種と異なる種からのものであるか、又は同一／類似種からのものであれば、一方若しくは両方が元の形態及び／若しくはゲノム遺伝子座から実質的に改変されているか、又はこのプロモーターが、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの天然プロモーターではない。或いは、本明細書中に示される１種又は複数種の調節領域及び／又はポリヌクレオチドが、完全に合成であり得る。別の例では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる開裂用の標的ポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと異なる生物のものであり得る。別の例では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドへの挿入のために鋳型又はドナーとして作用する追加のポリヌクレオチドと共に標的ポリヌクレオチドに導入され得、ここで、追加のポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド及び／又はＣａｓエンドヌクレアーゼに対して異種である。
【0214】
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、前駆体又は成熟形態での機能的最終産物（例えば、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、又はタンパク質）の産生を指す。
【0215】
「成熟」タンパク質は、翻訳後プロセシングされたポリペプチド（即ち、一次翻訳産物中に存在するプレペプチド又はプロペプチドが全て除去されたポリペプチド）を指す。
【0216】
「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（即ち、プレペプチド及びプロペプチドが依然として存在している）を指す。プレペプチド及びプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであり得るが、これに限定されない。
【0217】
「ＣＲＩＳＰＲ」（クラスター化規則的配置短回文配列リピート）遺伝子座は、例えば、外来ＤＮＡを破壊するために細菌及び古細菌細胞によって使用される、ＤＮＡ開裂システムの成分をコードするある特定の遺伝子座を指す（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７－１７０；２００７年３月１日公開の国際公開第２００７０２５０９７号パンフレット）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短い可変ＤＮＡ配列（スペーサーと呼ばれる）によって分離された短いダイレクトリピート（ＣＲＩＳＰＲリピート）を含むＣＲＩＳＰＲアレイからなり得、これには、多様なＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子が隣接し得る。
【0218】
本明細書で使用される場合、「エフェクター」又は「エフェクタータンパク質」は、ポリヌクレオチド標的を認識し、それに結合し、且つ／又は開裂するか若しくは切れ目を入れることを含む活性を包含するタンパク質である。エフェクター又はエフェクタータンパク質は、エンドヌクレアーゼでもあり得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの「エフェクター複合体」には、ｃｒＲＮＡと標的の認識及び結合に関与するＣａｓタンパク質が含まれる。成分であるＣａｓタンパク質の一部は、標的ポリヌクレオチド開裂に関与するドメインをさらに含み得る。
【0219】
「Ｃａｓタンパク質」という用語は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。Ｃａｓタンパク質は、ｃａｓ遺伝子座の遺伝子によってコードされるタンパク質を含み、且つアダプテーション分子及び干渉分子を含む。細菌の適応免疫複合体の干渉分子には、エンドヌクレアーゼが含まれる。本明細書で説明されているＣａｓエンドヌクレアーゼは、１つ又は複数のヌクレアーゼドメインを含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：本明細書で開示されている新規のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２）タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、又はこれらの組み合わせ若しくは複合体。Ｃａｓタンパク質は、好適なポリヌクレオチド成分との複合体である場合には、特定のポリヌクレオチド標的配列の全て又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れるか又は開裂を行うことができる「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」又は「Ｃａｓエフェクタータンパク質」であり得る。本開示のＣａｓ－ベータエンドヌクレアーゼには、１つ又は複数のＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを有するものが含まれる。Ｃａｓタンパク質は、天然のＣａｓタンパク質の機能的断片若しくは機能的バリアントとさらに定義されるか、又は天然Ｃａｓタンパク質の少なくとも５０、５０～１００、少なくとも１００、１００～１５０、少なくとも１５０、１５０～２００、少なくとも２００、２００～２５０、少なくとも２５０、２５０～３００、少なくとも３００、３００～３５０、少なくとも３５０、３５０～４００、少なくとも４００、４００～４５０、少なくとも５００個、又は５００個を超える連続するアミノ酸と、少なくとも５０％、５０％～５５％、少なくとも５５％、５５％～６０％、少なくとも６０％、６０％～６５％、少なくとも６５％、６５％～７０％、少なくとも７０％、７０％～７５％、少なくとも７５％、７５％～８０％、少なくとも８０％、８０％～８５％、少なくとも８５％、８５％～９０％、少なくとも９０％、９０％～９５％、少なくとも９５％、９５％～９６％、少なくとも９６％、９６％～９７％、少なくとも９７％、９７％～９８％、少なくとも９８％、９８％～９９％、少なくとも９９％、９９％～１００％、又は１００％の配列同一性を共有しており且つ天然配列の少なくとも一部の活性を保持するタンパク質とさらに定義される。
【0220】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの「機能的断片」、「機能的に均等である断片」、及び「機能的に均等な断片」は、本明細書では互換的に使用され、標的部位を認識し、それに結合し、且つ任意選択的にほどくか、切れ目を入れるか、又は開裂する（標的部位内に一本鎖又は二本鎖切断を導入する）能力が保持されている本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの一部又は部分配列を指す。このＣａｓエンドヌクレアーゼの一部又は部分配列は、そのドメインのいずれか１つの完全な又は部分的（機能的）なペプチドを含み得、例えば、限定されないが、Ｃａｓ３ ＨＤドメインの全機能的部分、Ｃａｓ３ヘリカーゼドメインの全機能的部分、タンパク質の全機能的部分（例えば、限定されないが、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８ｂ１）を含み得る。
【0221】
本明細書で説明されているＣａｓエンドヌクレアーゼを含むＣａｓエンドヌクレアーゼ又はＣａｓエフェクタータンパク質の「機能的バリアント」、「機能的に均等であるバリアント」、及び「機能的に均等なバリアント」という用語は、本明細書では互換的に使用され、標的配列の全て又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択的ほどくか、切れ目を入れるか、又は開裂する能力が保持されている、本明細書で開示されているＣａｓエフェクタータンパク質のバリアントを指す。
【0222】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼはまた、多機能性Ｃａｓエンドヌクレアーゼも含み得る。「多機能性Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」及び「多機能性Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ機能（Ｃａｓエンドヌクレアーゼとして作用し得る少なくとも１つのタンパク質ドメインを含む）、及び限定されないが複合体を形成する機能（他のタンパク質と複合体を形成し得る少なくとも第２のタンパク質ドメインを含む）等の少なくとも１つの他の機能を有する単一のポリペプチドへの言及を含む。一態様では、多機能性Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼに典型的なドメインに対して（内部、上流（５’）、下流（３’）、若しくは内部５’及び３’の両方、又はこれらの任意の組み合わせで）少なくとも１つのさらなるタンパク質ドメインを含む。
【0223】
「カスケード」及び「カスケード複合体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ポリヌクレオチドと集合してポリヌクレオチド－タンパク質複合体（ＰＮＰ）を形成し得る多サブユニットタンパク質複合体への言及を含む。カスケードは、複合体の集合及び安定性、並びに標的核酸配列の特定に関してポリヌクレオチドに依存するＰＮＰである。カスケードは、ガイドポリヌクレオチドの可変ターゲティングドメインに相補的な標的核酸を見出して任意選択的に結合するサーベイランス複合体として機能する。
【0224】
「開裂準備完了カスケード」、「ｃｒカスケード」、「開裂準備完了カスケード複合体」、「ｃｒカスケード複合体」、「開裂準備完了カスケードシステム」、「ＣＲＣ」、及び「ｃｒカスケードシステム」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ポリヌクレオチド－タンパク質複合体（ＰＮＰ）を形成するポリヌクレオチドと集合し得る多サブユニットタンパク質複合体への言及を含み、ここで、カスケードタンパク質の１つは、標的配列の全て又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択的にほどくか、切れ目を入れるか、又は開裂し得るＣａｓエンドヌクレアーゼである。
【0225】
「５’－キャップ」及び「７－メチルグアニル酸（ｍ７Ｇ）キャップ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。７－メチルグアニル酸残基は、真核細胞内のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’末端上に位置する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）は、真核細胞内でｍＲＮＡを転写する。メッセンジャーＲＮＡキャッピングは、一般には次のように発生する：ｍＲＮＡ転写産物の最末端５’リン酸基は、ＲＮＡ末端ホスファターゼによって除去され、２つの末端リン酸が残る。グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）は、グアニリルトランスフェラーゼによって転写物の末端リン酸に加えられ、転写物末端に５’－５’三リン酸結合グアニンが残る。最後に、この末端グアニンの７－窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。
【0226】
本明細書での「５’－キャップを有していない」という専門用語は、５’－キャップの代わりに例えば５’－ヒドロキシル基を有するＲＮＡを指すために使用される。そのようなＲＮＡは、例えば「脱キャップＲＮＡ」と称され得る。５’－キャップドＲＮＡは核外輸送を受けるので、脱キャップＲＮＡは、転写後には核内でより十分に蓄積され得る。本明細書での１種又は複数種のＲＮＡ成分は、脱キャップされている。
【0227】
本明細書で使用される場合、「ガイドポリヌクレオチド」という用語は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、本明細書で説明されているＣａｓエンドヌクレアーゼ）と複合体を形成し得、且つＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、任意選択的に結合し、任意選択的に開裂することを可能にするポリヌクレオチド配列に関する。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はこれらの組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。
【0228】
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡの「機能的断片」、「機能的に均等である断片」、及び「機能的に均等な断片」という用語は、本明細書では互換的に使用され、それぞれ、ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡとしてそれぞれ機能する能力が保持されている、本開示のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡの一部又は部分配列を指す。
【0229】
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡ（それぞれ）の「機能的バリアント」、「機能的に均等であるバリアント」、及び「機能的に均等なバリアント」という用語は、本明細書では互換的に使用され、それぞれ、ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡとしてそれぞれ機能する能力が保持されている、本開示のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡのバリアントを指す。
【0230】
「単一ガイドＲＮＡ」及び「ｓｇＲＮＡ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）に融合した（ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合した）可変ターゲティングドメインを含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）である、２つのＲＮＡ分子の合成融合に関する。単一ガイドＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し得るＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み得、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導し得、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、任意選択的に結合し、任意選択的に切れ目を入れるか又は開裂（一本鎖又は二本鎖切断を導入）するのを可能にする。
【0231】
「可変ターゲティングドメイン」又は「ＶＴドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の１本の鎖（ヌクレオチド配列）にハイブリダイズし得る（相補的である）ヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性率は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であり得る。可変ターゲティングドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、可変ターゲティングドメインは、連続する一続きの１２～３０個のヌクレオチドを含む。可変ターゲティングドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列、又はこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【0232】
（ガイドポリヌクレオチドの）「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」又は「ＣＥＲドメイン」という用語は、本明細書中では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは、（トランス作用）ｔｒａｃｒヌクレオチドメイト配列に続いてｔｒａｃｒヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５００５９０１０Ａ１号明細書を参照されたい）、又はこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【0233】
本明細書で使用される場合、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステム」及び「誘導型Ｃａｓシステム」「ポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼ」、「ＰＧＥＮ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、複合体を形成し得る少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド及び少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを指しており、ここで、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導し得、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れるか又は開裂する（一本鎖又は二本鎖切断を導入する）ことを可能にする。本明細書におけるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、既知のＣＲＩＳＰＲシステム（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７－１７０；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３，１－１３；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０，１－１３）のいずれかのＣａｓタンパク質及び好適なポリヌクレオチド成分を含み得る。
【0234】
「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステム」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓシステム」、「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」、「ＲＧＥＮ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、複合体を形成し得る少なくとも１つのＲＮＡ成分及び少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを指しており、ここで、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位誘導し得、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れるか又は開裂する（一本鎖又は二本鎖切断を導入する）ことを可能にする。
【0235】
「標的部位」、「標的配列」、「標的部位配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」、「ゲノム標的遺伝子座」、及び「プロトスペーサー」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ポリヌクレオチド配列を指しており、例えば、限定はされないが、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体が認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れ得るか又は開裂し得る、細胞の、染色体、エピソーム、遺伝子座、又はゲノム中の他の任意のＤＮＡ分子（例えば、染色体ＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ）上のヌクレオチド配列を指す。標的部位は、細胞のゲノム中の内在性部位であり得るか、又は代わりに、標的部位は、細胞に対して異種であり得、そのため、細胞のゲノム中に天然には存在し得るか、若しくは標的部位は、天然で生じる場所に対して異種のゲノム位置に見出され得る。本明細書で使用される場合、「内在性標的配列」及び「天然標的配列」という用語は、本明細書では互換的に使用され、細胞のゲノムに内在するか又は天然の標的配列であって、細胞のゲノム中のこの標的配列の内在性又は天然の位置に存在する標的配列を指す。「人工標的部位」又は「人工標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、細胞のゲノムに導入される標的配列を指す。そのような人工標的配列は、細胞のゲノム中の内因性標的配列又は天然標的配列と配列が同一であり得るが、細胞のゲノム中の異なる位置（即ち、非内在位置又は非発生位置）に位置し得る。
【0236】
本明細書の「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）は、本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムによって認識される（標的とされる）標的配列（プロトスペーサー）に隣接する短鎖ヌクレオチド配列を指す。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列の後にＰＡＭ配列が続かない場合には、標的ＤＮＡ配列を成功裏に認識し得ない。本明細書のＰＡＭの配列及び長さは、使用されるＣａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体に依存して異なる可能性がある。ＰＡＭ配列は、任意の長さの配列であり得るが、典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチドの長さである。
【0237】
「変化した標的部位」、「変化した標的配列」、「改変標的部位」、「改変標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、未変化の標的配列と比較した場合に少なくとも１つの変化を含む、本明細書で開示されている標的配列を指す。そのような「変化」として、例えば下記が挙げられる：（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、（ｉｖ）少なくとも１つのヌクレオチドの化学的変化、又は（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせ。
【0238】
「改変ヌクレオチド」又は「編集ヌクレオチド」は、この非改変ヌクレオチド配列と比較した場合に少なくとも１つの変化を含む目的のヌクレオチド配列を指す。そのような「変化」として、例えば下記が挙げられる：（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、（ｉｖ）少なくとも１つのヌクレオチドの化学的変化、又は（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせ。
【0239】
「標的部位を改変する」及び「標的部位を変化させる」ための方法は、本明細書では互換的に使用され、変化した標的部位を生成するための方法を指す。
【0240】
本明細書で使用される場合、「ドナーＤＮＡ」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位内に挿入される目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトである。
【0241】
「ポリヌクレオチド改変鋳型」という用語には、編集されるヌクレオチド配列と比較した場合に少なくとも１つのヌクレオチド改変を含むポリヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、付加、又は欠失であり得る。任意選択的に、ポリヌクレオチド改変鋳型は、少なくとも１つのヌクレオチド改変に隣接する相同ヌクレオチド配列をさらに含み得、この隣接相同ヌクレオチド配列は、編集される所望のヌクレオチド配列に十分な相同性を提供する。
【0242】
本明細書中の「植物最適化Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」という用語は、植物細胞又は植物中での発現に最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるＣａｓタンパク質（例えば多機能性Ｃａｓタンパク質）を指す。
【0243】
「Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする植物最適化ヌクレオチド配列」、「Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする植物最適化コンストラクト」、及び「Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする植物最適化ポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用され、植物細胞又は植物中での発現に最適化された、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは機能的断片を指す。植物最適化Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む植物は、Ｃａｓ配列をコードするヌクレオチド配列を含む植物、及び／又はＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む植物を含む。一態様では、植物最適化Ｃａｓエンドヌクレアーゼヌクレオチド配列は、トウモロコシ最適化、イネ最適化、コムギ最適化、ダイズ最適化、ワタ最適化、又はキャノーラ最適化Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。
【0244】
「植物」という用語には、一般に、全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子、及びこれらの子孫が含まれる。植物は、単子葉植物又は双子葉植物である。植物細胞として、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。「植物要素」は、全植物又は植物構成要素を指すことが意図されており、これには、分化及び／又は未分化組織（例えば、限定されないが、植物組織、部分及び細胞型）が含まれ得る。一実施形態では、植物要素は、下記の内の１つである：全植物、実生、分裂組織、基本組織、維管束組織、表皮組織、種子、葉、根、シュート、茎、花、果実、ストロン、球根、塊茎、球茎、ケイキ、シュート、芽、腫瘍組織、並びに様々な形態の細胞及び培養物（例えば、単一細胞、プロトプラスト、胚、カルス組織）。プロトプラストは細胞壁を欠いているため、プロトプラストは、（全ての構成要素と共に天然に見出されるような）技術的に「無傷の」植物細胞ではないことに留意すべきである。「植物器官」という用語は、植物組織を指すか、又は植物の形態的にも機能的にも独立した部分を構成する一群の組織を指す。本明細書で使用される場合、「植物要素」は、植物の「部分」と同義であり、植物の任意の部分を指しており、別個の組織及び／又は器官を含み得、全体を通して「組織」という用語と互換的に使用され得る。同様に、「植物生殖要素」は、植物の有性生殖又は無性生殖によって他の植物を開始し得る植物の任意の部分（例えば、限定されないが、種子、実生、根、シュート、切片、若枝、接ぎ穂、走根、球根、塊茎、球茎、ケイキ、又は芽）に一般に言及することが意図されている。植物要素は、植物若しくは植物の器官、組織培養物、又は細胞培養物中に存在し得る。
【0245】
「子孫」は、植物のその後の任意の世代を含む。
【0246】
本明細書で使用される場合、「植物部分」という用語は、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生し得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、及び植物又は植物部分中で無傷の植物細胞（例えば、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、さや、柄、根、根端、葯、及び同類のもの）、並びにこれらの一部自体を指す。穀粒は、種の栽培又は繁殖以外の目的で栽培業者が生産する成熟種子を意味することが意図されている。再生植物の子孫、バリアント、及び変異体もまた、これらの一部が導入ポリヌクレオチドを含むことを条件として、本発明の範囲に含まれる。
【0247】
「単子葉植物の（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ）」又は「単子葉植物（ｍｏｎｏｃｏｔ）」という用語は、「単子葉植物綱（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ）」としても既知の被子植物のサブクラスを指しており、この種子は、典型的には、１枚の初期葉又は子葉のみを含む。この用語には、全植物、植物要素、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、植物細胞、及びこれらの子孫への言及が含まれる。
【0248】
「双子葉植物の（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ）」又は「双子葉植物（ｄｉｃｏｔ）」という用語は、「双子葉植物綱（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ）」としても既知の被子植物のサブクラスを指しており、この種子は、典型的には、２枚の初期葉又は子葉のみを含む。この用語には、全植物、植物要素、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、植物細胞、及びこれらの子孫への言及が含まれる。
【0249】
本明細書で使用される場合、「雄性不稔植物」は、生存可能な又はそうでなければ受精可能な雄性配偶子を作らない植物である。本明細書で使用される場合、「雌性不稔植物」は、生存可能な又はそうでなければ受精可能な雌性配偶子を作らない植物である。雄性不稔植物及び雌性不稔植物はそれぞれ、雌性稔性及び雄性捻性であり得ることが認められている。さらに、雄性稔性（雌性捻性以外）植物は、雌性稔性植物と交雑されると、生存可能な子孫を産生し得、雌性稔性（雄性捻性以外）植物は、雄性稔性植物と交配されると、生存可能な子孫を産生し得ることが認められている。
【0250】
本明細書中の「非従来型酵母」という用語は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））でもシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種でもない任意の酵母を指す。（“Ｎｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３を参照されたい）。
【0251】
本開示との関連では、「交雑した」、又は「交雑」、又は「交雑している」という用語は、子孫（即ち、細胞、種子、又は植物）を生成するための授粉による配偶子の融合を意味する。この用語は、有性交配（１種の植物と他の植物との授粉）、並びに自植（自家受粉、即ち、花粉及び胚珠（又は小胞子及び大胞子）が、同一植物又は遺伝的に同一の植物に由来する場合）の両方を包含する。
【0252】
「遺伝子移入」とう用語は、ある遺伝的背景から別の遺伝的背景への遺伝子座の所望のアレルの伝達を意味する。例えば、特定遺伝子座での所望のアレルの遺伝子移入は、２種の親植物間の有性交配により少なくとも１つの子孫植物へ伝達され得、ここで、親植物の少なくとも１つは、そのゲノム内に所望のアレルを有する。或いは、例えば、アレルの伝達は、例えば融合プロトプラスト内の２つのドナーゲノム間の組換えによって発生する可能性があり、ここで、ドナープロトプラストの少なくとも１つは、そのゲノム内に所望のアレルを有する。所望のアレルは、例えば導入遺伝子、改変した（変異したか又は編集された）天然のアレル、又はマーカー若しくはＱＴＬの選択されたアレルであり得る。
【0253】
「同質遺伝子系統」という用語は、比較用語であり、遺伝的には同一であるが処理が異なる基準生物である。一例では、２つの遺伝的に同一であるトウモロコシ植物胚を、１つは処理（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターエンドヌクレアーゼの導入）を受けており、もう１つはそのような処理を受けないコントロールである２つの異なるグループに分け得る。そのため、２つのグループ間の表現型の違いは、処理のみに起因し、植物の内在性遺伝子構造のいかなる固有性にも起因しない場合がある。
【0254】
「導入」は、成分が生物の細胞の内部又は細胞自体へ侵入するような方法で、細胞又は生物等の標的に、ポリヌクレオチド、又はポリペプチド、又はポリヌクレオチド－タンパク質複合体を提供することを意味することが意図されている。
【0255】
「目的のポリヌクレオチド」は、作物の望ましさ、即ち、農学的利益の形質を改善するタンパク質又はポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を含む。目的のポリヌクレオチドとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：農業経済学的に重要な形質、除草剤耐性、殺虫剤耐性、病害耐性、線虫耐性、除草剤耐性、微生物耐性、真菌耐性、ウイルス耐性、稔性又は不稔性、穀物特性、市販品、表現型マーカー、又は農業的若しくは商業的に重要なあらゆる他の形質をコードするポリヌクレオチド。目的のポリヌクレオチドは、センス又はアンチセンス配向でさらに利用され得る。さらに、複数種の目的のポリヌクレオチドは、さらなる利益を提供するために、合わせて利用され得るか、又は「積み重ねられ」得る。
【0256】
「複合形質遺伝子座」は、遺伝子的に互いに連結した複数の導入遺伝子を有するゲノムの遺伝子座を含む。
【0257】
本明細書中の組成物及び方法は、植物に対して、「農学的形質」、又は「農学的に重要な形質」、又は「農学的利益の形質」の改善を提供し得、そのような形質として下記が挙げられ得るが、これらに限定されない：本明細書の方法又は組成物による改変を含まない同質遺伝子系統の植物と比較した、病害耐性、乾燥耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、水利用効率の改善、窒素利用の改善、窒素固定の改善、有害生物耐性、草食動物耐性、病原体耐性、収率の向上、健康増強、活力改善、成長改善、光合成能の改善、栄養強化、タンパク質含有量の改変、油分含有量の改変、バイオマスの増加、苗条長の増加、根長の増加、根構造の改善、代謝産物の調整、プロテオームの調整、種子重量の増加、種子炭水化物組成の改変、種子油組成の改変、種子タンパク質組成の改変、種子栄養組成の改変。
【0258】
「農学的形質ポテンシャル」は、ライフサイクル中のある時点での、表現型（好ましくは改善した農学的形質）を示すか又は同じ植物の関連する別の植物要素に前記表現型を伝達する植物要素の能力を意味することが意図されている。
【0259】
「減少した」、「より少ない」、「より遅い」、及び「増加した」、「より速い」、「強化された」、「より大きい」という用語は、本明細書で使用される場合、改変されていない植物要素又は得られる植物と比較した、改変された植物要素又は得られる植物の特性の減少又は増加を指す。例えば、特性の減少は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、５％～１０％、少なくとも１０％、１０％～２０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、２０％～３０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、３０％～４０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、４０％～５０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、５０％～６０％、少なくとも約６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、８０％～９０％、少なくとも約９０％、９０％～１００％、少なくとも１００％、１００％～２００％、少なくとも２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、又はそれを超えて未処理のコントロールより低い場合があり、特性の増加は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、５％～１０％、少なくとも１０％、１０％～２０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、２０％～３０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、３０％～４０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、４０％～５０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、５０％～６０％、少なくとも約６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、８０％～９０％、少なくとも約９０％、９０％～１００％、少なくとも１００％、１００％～２００％、少なくとも２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、又はそれを超えて未処理のコントロールより高い場合がある。
【0260】
本明細書で使用される場合、「前に」という用語は、配列位置に関しては、ある配列の、別の配列の上流又は５’側の存在を指す。
【0261】
略語の意味は、下記のとおりである：「ｓｅｃ」は秒を意味しており、「ｍｉｎ」は分を意味しており、「ｈ」は時間を意味しており、「ｄ」は日を意味しており、「μＬ」はマイクロリットルを意味しており、「ｍＬ」はミリリットルを意味しており、「Ｌ」はリットルを意味しており、「μＭ」は「マイクロモルの」を意味しており、「ｍＭ」は「ミリモルの」を意味しており、「Ｍ」は「モルの」を意味しており、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味しており、「μｍｏｌｅ」又は「ｕｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味しており、「ｇ」はグラムを意味しており、「μｇ」又は「ｕｇ」はマイクログラムを意味しており、「ｎｇ」はナノグラムを意味しており、「Ｕ」は単位を意味しており、「ｂｐ」は塩基対を意味しており、「ｋｂ」はキロベースを意味している。
【0262】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの分類
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、成分の配列及び構造分析に従って分類されている。マルチサブユニットエフェクター複合体（Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型を含む）を有するクラス１システム、並びに単一タンパク質エフェクター（ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型を含む）を有するクラス２システムを含む、複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが説明されている（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３，１－１３；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０，１－１３；Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １（６）：ｅ６０；及びＫｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７：６７－７８）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、成分の配列及び構造分析に従って分類されている。マルチサブユニットエフェクター複合体（Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型を含む）を有するクラス１システム、並びに単一タンパク質エフェクター（ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型を含む）を有するクラス２システムを含む、複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが説明されている（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３，１－１３；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０，１－１３；Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １（６）：ｅ６０；及びＫｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７：６７－７８）。
【0263】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子と少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を含み、ｃｒＲＮＡリボ核タンパク質（ｃｒＲＮＰ）エフェクター複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座は、ｃｒＲＮＡ成分をコードするＤＮＡターゲティングスペーサーが散在する同一リピートからなるアレイ、及びＣａｓタンパク質成分をコードするｃａｓ遺伝子のオペロン様ユニットを含む。得られたリボ核タンパク質複合体は、配列特異的な方法でポリヌクレオチドを認識する（Ｊｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，５２９－５３６（２０１１））。ｃｒＲＮＡは、非相補鎖を移動させながら、相補ＤＮＡ鎖と塩基対を形成して、いわゆるＲループを形成することにより、エフェクター（タンパク質又は複合体）を二本鎖ＤＮＡ配列に配列特異的に結合させるガイドＲＮＡとして機能する。（Ｊｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，５２９－５３６）。
【0264】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のＲＮＡ転写物（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）は、Ｉ型及びＩＩＩ型システムにおけるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドリボヌクレアーゼによるか、又はＩＩ型システムにおけるＲＮａｓｅ ＩＩＩにより、リピート配列において特異的に開裂される。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子の数は、種によって変わり得る。
【0265】
異なるドメインを有するタンパク質をコードする異なるｃａｓ遺伝子が、異なるＣＲＩＳＰＲシステムに存在する。ｃａｓオペロンは、１つ又は複数のエフェクターエンドヌクレアーゼ及び他のＣａｓタンパク質をコードする遺伝子を含む。タンパク質サブユニットとして、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ ９（６）：４６７－４７７；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５；及びＫｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７：６７－７８で説明されているものが挙げられる。ドメインの種類として、発現に関与するもの（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシング、例えば、Ｃａｓ ６又はＲＮａｓｅ ＩＩＩ）、緩衝に関与するもの（ｃｒＲＮＡ及び標的結合のためのエフェクターモジュール並びに標的切断のためのドメインを含む）、アダプテーションに関与するもの（スペーサー挿入、例えば、Ｃａｓ１又はＣａｓ２）、及び補助に関与するもの（調節、又はヘルパー、又は未知の機能）が挙げられる。一部のドメインは、複数の目的のために機能する場合があり、とりわけ、例えばＣａｓ９は、エンドヌクレアーゼ機能のドメインと、標的開裂のためのドメインとを含む。
【0266】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、直接的ＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対形成を介して、単一のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）により誘導されて、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に近接するＤＮＡ標的部位を認識する（Ｊｏｒｅ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５２９－５３６、Ｗｅｓｔｒａ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ４６：５９５－６０５及びＳｉｎｋｕｎａｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＥＭＢＯ Ｊ．３２：３８５－３９４）。
【0267】
クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型を含む。クラスＩシステムの特有の特徴は、単一のタンパク質の代わりにエフェクターエンドヌクレアーゼ複合体が存在することである。カスケード複合体は、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）及び多様なＲＡＭＰ（リピート関連ミステリアスタンパク質）タンパク質スーパーファミリのコアフォールドである核酸結合ドメインを含む（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ４１，１３９２－１４００；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。ＲＡＭＰタンパク質サブユニットは、（ｃｒＲＮＡ－エフェクター複合体の骨格を含む）Ｃａｓ５及びＣａｓ７を含み（ここで、Ｃａｓ５サブユニットは、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルに結合し、大きいサブユニットと相互作用する）、多くの場合には、エフェクター複合体と緩く会合し且つ典型的にはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシングにおいてリピート特異的ＲＮａｓｅとして機能するＣａｓ６を含む（Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２０１５，３９：４２８－４４１；Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ２０１６，２２：３１８－３２９）。
クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型を含む。クラスＩシステムの特有の特徴は、単一のタンパク質の代わりにエフェクターエンドヌクレアーゼ複合体が存在することである。カスケード複合体は、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）及び多様なＲＡＭＰ（リピート関連ミステリアスタンパク質）タンパク質スーパーファミリのコアフォールドである核酸結合ドメインを含む（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ４１，１３９２－１４００；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。ＲＡＭＰタンパク質サブユニットは、（ｃｒＲＮＡ－エフェクター複合体の骨格を含む）Ｃａｓ５及びＣａｓ７を含み（ここで、Ｃａｓ５サブユニットは、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルに結合し、大きいサブユニットと相互作用する）、多くの場合には、エフェクター複合体と緩く会合し且つ典型的にはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシングにおいてリピート特異的ＲＮａｓｅとして機能するＣａｓ６を含む（Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２０１５，３９：４２８－４４１；Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ２０１６，２２：３１８－３２９）。
【0268】
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、少なくともＣａｓ５及びＣａｓ７を含む、カスケード（抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体）と呼ばれるエフェクタータンパク質の複合体を含む。エフェクター複合体は、単一のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びＣａｓ３と共に機能して、侵入するウイルスＤＮＡから防御する（Ｂｒｏｕｎｓ，Ｓ．Ｊ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－９６４；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）及びＲＮＡ－ＤＮＡ二本鎖をほどく能力が実証されている一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）刺激スーパーファミリ２ヘリカーゼを有する金属依存性ヌクレアーゼをコードするシグネチャー遺伝子ｃａｓ３（又はバリアントｃａｓ３’若しくはｃａｓ３”）を含む（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。標的認識に続いて、Ｃａｓ３エンドヌクレアーゼをカスケード－ｃｒＲＮＡ－標的ＤＮＡ複合体に動員して、ＤＮＡ標的を開裂して分解する（Ｗｅｓｔｒａ，Ｅ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ４６：５９５－６０５、Ｓｉｎｋｕｎａｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＥＭＢＯ Ｊ．３０：１３３５－１３４２、及びＳｉｎｋｕｎａｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＥＭＢＯ Ｊ．３２：３８５－３９４）。一部のＩ型システムでは、Ｃａｓ６は、ｃｒＲＮＡプロセシングに関与する活性エンドヌクレアーゼであり得、Ｃａｓ５及びＣａｓ７は、非触媒性ＲＮＡ結合タンパク質として機能するが、Ｉ型－Ｃシステムでは、ｃｒＲＮＡプロセシングは、Ｃａｓ５によって触媒され得る（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。Ｉ型システムは、７つのサブタイプに分けられる（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ ９（６）：４６７－４７７；Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７：６７－７８）。少なくともタンパク質サブユニットＣａｓ７、Ｃａｓ５、及びＣａｓ６を含む適応抗ウイルス防御のための改変Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連複合体（カスケード）であって、これらのサブユニットの１つがＣａｓ３エンドヌクレアーゼ又は改変制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩに合成的に融合されている、改変Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連複合体が説明されている（２０１３年７月４日に公開された国際公開第２０１３０９８２４４号パンフレット）。
【0269】
複数のｃａｓ７遺伝子を含むＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｓｓＲＮＡ又はｓｓＤＮＡを標的とし、ＲＮａｓｅ及び標的ＲＮＡ活性化ＤＮＡヌクレアーゼのいずれかとして機能する（Ｔａｍｕｌａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５（１０）４９－６１，２０１７）。Ｃｓｍ（ＩＩＩ－Ａ型）及びＣｍｒ（ＩＩＩ－Ｂ型）複合体は、標的ＲＮＡ結合／開裂をｓｓＤＮＡ分解と結合させるＲＮＡ活性化一本鎖（ｓｓ）ＤＮａｓｅとして機能する。外来ＤＮＡに感染すると、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に誘導されたＣｓｍ又はＣｍｒ複合体の新たな転写物への結合により、盛んに転写されているファージＤＮＡにＣａｓ１０ ＤＮａｓｅが動員され、その結果、転写物とファージＤＮＡとの両方が分解されるが、宿主ＤＮＡは分解されない。Ｃａｓ１０ ＨＤドメインはｓｓＤＮａｓｅ活性に関与し、Ｃｓｍ３／Ｃｍｒ４サブユニットはＣｓｍ／Ｃｍｒ複合体のエンドリボヌクレアーゼ活性に関与する。標的ＲＮＡの３’隣接配列は、Ｃｓｍ／ＣｍｒのｓｓＤＮａｓｅ活動に重要であり：ｃｒＲＮＡの５’ハンドルとの塩基対形成は、宿主ＤＮＡを分解から保護する。
【0270】
ＩＶ型システムは、ｃａｓ８様ドメインに加えて典型的なＩ型ｃａｓ５及びｃａｓ７ドメインを含むが、ほとんどの他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの特徴であるＣＲＩＳＰＲアレイを欠失し得る。
【0271】
クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型を含む。クラスＩＩシステムの特有の特徴は、エフェクター複合体の代わりに単一Ｃａｓエフェクタータンパク質が存在することである。ＩＩ型及びＶ型Ｃａｓタンパク質は、ＲＮａｓｅ Ｈフォールドを採用するＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインを含む。
クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型を含む。クラスＩＩシステムの特有の特徴は、エフェクター複合体の代わりに単一Ｃａｓエフェクタータンパク質が存在することである。ＩＩ型及びＶ型Ｃａｓタンパク質は、ＲＮａｓｅ Ｈフォールドを採用するＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインを含む。
【0272】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣａｓエンドヌクレアーゼをそのＤＮＡ標的に誘導するために、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を使用する。ｃｒＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的の１本の鎖に相補的なスペーサー領域と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）と塩基対合して、ＣａｓエンドヌクレアーゼにＤＮＡ標的を開裂させるＲＮＡ二本鎖を形成し、平滑末端を残す領域とを含む。スペーサーは、Ｃａｓ１及びＣａｓ２タンパク質を伴う十分解明されていないプロセスによって得られる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、典型的には、ｃａｓ９遺伝子に加えてｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子を含む（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：７２６－７３７；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。ＩＩ型ＣＲＩＳＲ－Ｃａｓ遺伝子座は、それぞれのＣＲＩＳＰＲアレイ内のリピートに部分的に相補的なｔｒａｃｒＲＮＡをコードし得、Ｃｓｎ１及びＣｓｎ２等の他のタンパク質を含み得る。ｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子の近傍にｃａｓ９が存在することが、ＩＩ型遺伝子座の特徴である（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。
【0273】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２）を含む単一のＣａｓエンドヌクレアーゼを含み（Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７：６７－７８，２０１７）、これは、Ｃａｓ９と異なり、標的開裂のためにさらなるトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡを必ずしも必要としない活性ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。
【0274】
ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、２つのＨＥＰＮ（高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合）ドメインを有するがＨＮＨドメインもＲｕｖＣドメインを有さず且つｔｒａｃｒＲＮＡ活性に依存しないヌクレアーゼをコードするｃａｓ１３遺伝子を含む。ＨＥＰＮドメインの大部分は、金属非依存性エンドＲＮａｓｅ活性部位を構成する保存モチーフを含む（Ａｎａｎｔｈａｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｄｉｒｅｃｔ ８：１５，２０１３）。この特徴のために、ＶＩ型システムは、他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに共通のＤＮＡ標的の代わりにＲＮＡ標的に作用すると考えられる。
【0275】
新規のＣａｓエンドヌクレアーゼＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
本明細書で開示されているのは、新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、その成分、及び前記成分を使用する方法である。このシステムは、新規のＣａｓエフェクタータンパク質であるＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。
本明細書で開示されているのは、新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、その成分、及び前記成分を使用する方法である。このシステムは、新規のＣａｓエフェクタータンパク質であるＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。
【0276】
本明細書で説明されている新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム成分は、異なるＣａｓシステムに由来する１つ又は複数のサブユニット、複数種の異なる細菌若しくは古細菌原核生物に由来するか若しくはそれらから改変されたサブユニット、及び／又は合成されたか若しくは操作された成分を含み得る。
【0277】
本明細書で説明されているのは、ｃａｓ遺伝子の新規配列を含む、新たに特定されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。さらに説明されているのは、新規のｃａｓ遺伝子及びタンパク質である。
【0278】
新規のＣａｓエンドヌクレアーゼシステム１０の１つの特徴は、ＣＲＩＳＰＲアレイの上流のエンドヌクレアーゼ遺伝子を含むがｃａｓ１遺伝子、ｃａｓ２遺伝子、又はｃａｓ４遺伝子を含まない遺伝子座構造である。
【0279】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム成分
Ｃａｓタンパク質
アダプテーション（スペーサー挿入）、干渉（エフェクターモジュール標的結合、標的ニッキング若しくは開裂－例えば、エンドヌクレアーゼ活性）、発現（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシング）、調節、又はその他に関与するタンパク質を含む多数のタンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ ｃａｓオペロンにコードされ得る。
Ｃａｓタンパク質
アダプテーション（スペーサー挿入）、干渉（エフェクターモジュール標的結合、標的ニッキング若しくは開裂－例えば、エンドヌクレアーゼ活性）、発現（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシング）、調節、又はその他に関与するタンパク質を含む多数のタンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ ｃａｓオペロンにコードされ得る。
【0280】
２つのタンパク質Ｃａｓ１及びＣａｓ２は、多くのＣＲＩＳＰＲシステム間で保存されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７：６７－７８，２０１７で説明されている）。Ｃａｓ１は、二本鎖ＤＮＡ断片を産生する金属依存性ＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼである。一部のシステムでは、Ｃａｓ１は、Ｃａｓ２と安定な複合体を形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲシステムのためのスペーサー獲得及び挿入に必須である（Ｎｕｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１：５２８－５３４，２０１４）。
【0281】
Ｃａｓ４（これは、ＲｅｃＢヌクレアーゼと類似性を有し得る）を含む多くの他のタンパク質が、種々のシステムで特定されており、ＣＲＩＳＰＲアレイへ組み込むための新規のウイルスＤＮＡ配列の捕捉に役割を果たすと考えられている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ７（１０）：ｅ４７２３２，２０１２）。
【0282】
一部のタンパク質は、複数の機能を包含し得る。例えば、クラス２のＩＩ型システムのシグネチャータンパク質であるＣａｓ９は、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシング、標的結合、及び標的開裂に関与することが実証されている。
【0283】
シントロフォモナス・パルミタチカ（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｉｔａｔｉｃａ）からのＣａｓエンドヌクレアーゼＣＲＩＳＰＲシステム等の一部の天然のシステムでは、エンドヌクレアーゼ遺伝子の付近では、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、又はＣａｓ４タンパク質をコードする遺伝子が検出されなかった。
【0284】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びエフェクター
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖間のリン酸ジエステル結合を開裂する酵素であり、塩基を損傷することなく特定の部位でＤＮＡを開裂する制限エンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼの例として、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及びＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）エフェクターエンドヌクレアーゼが挙げられる。
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖間のリン酸ジエステル結合を開裂する酵素であり、塩基を損傷することなく特定の部位でＤＮＡを開裂する制限エンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼの例として、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及びＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）エフェクターエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【0285】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、単一のエフェクタータンパク質として又は他の成分とエフェクター複合体を形成して、標的配列でＤＮＡ二本鎖をほどき、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成しているポリヌクレオチド（例えば、限定されないが、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡ）による標的配列の認識によって媒介された場合に、少なくとも１つのＤＮＡ鎖を任意選択的に切断する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列のそのような認識及び切断は、典型的には、正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に位置するか又はＤＮＡ標的配列の３’末端に隣接する場合に生じる。或いは、本明細書中のＣａｓエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断活性又はニッキング活性を欠いている場合があるが、好適なＲＮＡ成分と複合化した場合に、ＤＮＡ標的配列に依然として特異的に結合し得る。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書、及び２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５００５９０１０号明細書も参照されたい）。
【0286】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、個々のエフェクター（クラス２ ＣＲＩＳＰＲシステム）又はより大きいエフェクター複合体（クラスＩ ＣＲＩＳＰＲシステム）の一部として生じ得る。
【0287】
説明されているＣａｓエンドヌクレアーゼとして、例えば、Ｃａｓ３（クラス１ Ｉ型システムの特徴）、Ｃａｓ９（クラス２ ＩＩ型システムの特徴）、及びＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）（クラス２ Ｖ型システムの特徴）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0288】
Ｃａｓ３（並びにそのバリアントＣａｓ３’及びＣａｓ３”）は、一本鎖ＤＮＡヌクレアーゼ（ＨＤドメイン）及びＡＴＰ依存性ヘリカーゼとして機能する。Ｃａｓ３エンドヌクレアーゼのバリアントを、Ｃａｓ３エンドヌクレアーゼポリペプチドの一方又は両方のドメインの機能的活性を無効にすることによって得ることができる。ＡＴＰａｓｅ依存性ヘリカーゼ活性を（Ｃａｓ３－ヘリカーゼドメインの欠失、ノックアウトにより、又は重要な残基の変異誘発により、又は既に説明されているようにＡＴＰの非存在下で反応を組み立てることにより（Ｓｉｎｋｕｎａｓ，Ｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＥＭＢＯ Ｊ．３２：３８５－３９４）無効にすることで、改変Ｃａｓ３エンドヌクレアーゼを含む開裂準備完了カスケードをニッカーゼに変換し得る（ＨＤドメインは依然として機能しているため）。ＨＤエンドヌクレアーゼ活性の無効を、当該技術分野で既知の任意の方法（例えば、限定されないが、ＨＤドメインの重要な残基の変異誘発）で達成し得、この無効により、改変Ｃａｓ３エンドヌクレアーゼを含む開裂準備完了カスケードをヘリカーゼに変換し得る。Ｃａｓヘリカーゼ及びＣａｓ３ ＨＤエンドヌクレアーゼ活性の両方の無効を、当該技術分野で既知の任意の方法（例えば、限定されないが、ヘリカーゼ及びＨＤドメインの両方の重要な残基の変異誘発）で達成し得、この無効により、改変Ｃａｓ３エンドヌクレアーゼを含む開裂準備完了カスケードを、標的配列に結合する結合タンパク質に変換し得る。
【0289】
Ｃａｓ９（以前は、Ｃａｓ５、Ｃｓｎ１、又はＣｓｘ１２と呼ばれた）は、ｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチドと複合体を形成するか又は単一ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成してＤＮＡ標的配列の全て又は一部を特異的に認識して開裂するＣａｓエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９は、標的ｄｓＤＮＡの３’ＧＣリッチＰＡＭ配列を認識する。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ－ＩＩドメインに隣接するＨＮＨ（Ｈ－Ｎ－Ｈ）ヌクレアーゼと共にＲｕｖＣヌクレアーゼを含む。ＲｕｖＣヌクレアーゼ及びＨＮＨヌクレアーゼは、それぞれ標的配列で１本のＤＮＡ鎖を開裂し得る（両方のドメインの協調作用は、ＤＮＡ二本鎖の開裂をもたらす一方、１つのドメインの活性は、ニックをもたらす）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端近くに位置しており、サブドメインＩＩ及びＩＩＩは、タンパク質の中央に位置しており、ＨＮＨドメインに隣接している（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃｅｌｌ １５７：１２６２－１２７８）。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、典型的には、少なくとも１つのポリヌクレオチド成分と複合体を形成するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを利用するＤＮＡ開裂システムを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体を形成し得る。別の例では、Ｃａｓ９は、単一ガイドＲＮＡとの複合体で存在し得る（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。
【0290】
Ｃａｓ１２（以前は、Ｃｐｆ１、並びにバリアントｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、ＣａｓＸ、及びＣａｓＹと呼ばれていた）は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、ｄｓＤＮＡ標的にねじれ型の５’オーバーハングを生成した。一部のバリアントは、Ｃａｓ９の機能性と異なり、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。Ｃａｓ１２及びそのバリアントは、標的ｄｓＤＮＡ上の５’ＡＴリッチＰＡＭ配列を認識する。Ｃａｓ１２ａタンパク質のＮｕｃと呼ばれる挿入ドメインは、標的鎖開裂に関与することが実証されている（Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１６，１６５：９４９－９６２）。他のＣａｓ１２タンパク質におけるさらなる変異の研究により、Ｎｕｃドメインが、開裂に関与するＲｕｖＣドメインと共に誘導及び標的結合に寄与することが実証された（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２０１７，６６：２２１－２３３ ｅ２２４）。
【0291】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びエフェクタータンパク質は、標的ゲノム編集（単一及び多重の二本鎖切断及びニックによる）及び標的ゲノム調節（Ｃａｓタンパク質又はｓｇＲＮＡにエピジェネティックエフェクタードメインを結合させることによる）に使用し得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼはまた、ＲＮＡ誘導型リコンビナーゼとして機能するようにも操作され得、ＲＮＡテザーにより、多重タンパク質及び核酸複合体の集合の足場として機能し得た（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．１０：９５７－９６３）。
【0292】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びそのバリアント
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその機能的バリアントは、約５００個未満のアミノ酸からなる機能的ＲＮＡ誘導型ＰＡＭ依存性ｄｓＤＮＡ開裂タンパク質と定義され、３つのサブドメインに分割され且つブリッジヘリックス及び１つ又は複数のジンクフィンガーモチーフをさらに含むＣ末端ＲｕｖＣ触媒ドメイン；並びにヘリカルバンドル、ＷＥＤ楔状（又は「オリゴヌクレオチド結合ドメイン」、ＯＢＤ）ドメイン、及び任意選択的にジンクフィンガーモチーフを有するＮ末端Ｒｅｃサブユニットを含む。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその機能的バリアントは、約５００個未満のアミノ酸からなる機能的ＲＮＡ誘導型ＰＡＭ依存性ｄｓＤＮＡ開裂タンパク質と定義され、３つのサブドメインに分割され且つブリッジヘリックス及び１つ又は複数のジンクフィンガーモチーフをさらに含むＣ末端ＲｕｖＣ触媒ドメイン；並びにヘリカルバンドル、ＷＥＤ楔状（又は「オリゴヌクレオチド結合ドメイン」、ＯＢＤ）ドメイン、及び任意選択的にジンクフィンガーモチーフを有するＮ末端Ｒｅｃサブユニットを含む。
【0293】
本明細書で開示されている新規のＣａｓエンドヌクレアーゼバリアントタンパク質として、エフェクタータンパク質（エンドヌクラーゼ）が挙げられる。野生型（ＷＴ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質は、標的二本鎖ポリデオキシリボヌクレオチドの標的部位に又はこの標的部位付近に、Ｎ（Ｔ＞Ｗ＞Ｃ）ＴＴＣのＰＡＭ配列を必要とする。
【0294】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの機能的バリアントは、二本鎖切断活性又は一本鎖ニック活性を有しており、この活性は、ＷＴ Ｃａｓエンドヌクレアーゼの活性未満であってもよいし、ほぼ同一であってもよいし、さらに高い活性であってもよい。様々なレベルの活性は、施術者の希望に応じて異なる用途を有し得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又は機能的バリアントは、配列番号２０とアラインされた場合に、配列番号２０のアミノ酸位置番号に対して、下記のアミノ酸モチーフ：アミノ酸２２６位で始まるＧｘｘｘＧ；アミノ酸３２７位で始まるＥｘＬ；アミノ酸３７６位で始まるＣｘｎＣ；アミノ酸３９５位で始まるＣｘｎ（Ｃ，Ｈ）を含み、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、ｎは、任意の数である。一部の態様では、機能的バリアントは、配列番号２０とのアラインメントに対して、４０位でアラニン（Ａ）を有していないものである。一部の態様では、機能的バリアントは、配列番号２０とのアラインメントに対して、４０位でグリシン（Ｇ）を有するものである。一部の態様では、機能的バリアントは、配列番号２０とのアラインメントに対して、８１位でグルタミン酸（Ｅ）を有していないものである。一部の態様では、機能的バリアントは、配列番号２０とのアラインメントに対して、８１位でグリシン（Ｇ）を有するものである。機能的バリアントは、前述の内のいずれかの１種又は複数種のバリアントヌクレオチドを含み得る。一部の態様では、機能的バリアントは、配列番号２３、２４、又は２５の内のいずれかの少なくとも５０、５０～１００、少なくとも１００、１００～１５０、少なくとも１５０、１５０～２００、少なくとも２００、２００～２５０、少なくとも２５０、２５０～３００、少なくとも３００、３００～３５０、少なくとも３５０、３５０～４００、少なくとも４００、４００～４５０、少なくとも４５０個、又は４５０個を超える連続するアミノ酸と、少なくとも５０％、５０％～５５％、少なくとも５５％、５５％～６０％、少なくとも６０％、６０％～６５％、少なくとも６５％、６５％～７０％、少なくとも７０％、７０％～７５％、少なくとも７５％、７５％～８０％、少なくとも８０％、８０％～８５％、少なくとも８５％、８５％～９０％、少なくとも９０％、９０％～９５％、少なくとも９５％、９５％～９６％、少なくとも９６％、９６％～９７％、少なくとも９７％、９７％～９８％、少なくとも９８％、９８％～９９％、少なくとも９９％、９９％～１００％、又は１００％の配列同一性を含み、配列番号２６の少なくとも５０、５０～１００、少なくとも１００、１００～１５０、少なくとも１５０、１５０～２００、少なくとも２００、２００～２５０、少なくとも２５０、２５０～３００、少なくとも３００、３００～３５０、少なくとも３５０、３５０～４００、少なくとも４００、４００～４５０、少なくとも４５０個、又は４５０個を超える連続するアミノ酸と、少なくとも５０％、５０％～５５％、少なくとも５５％、５５％～６０％、少なくとも６０％、６０％～６５％、少なくとも６５％、６５％～７０％、少なくとも７０％、７０％～７５％、少なくとも７５％、７５％～８０％、少なくとも８０％、８０％～８５％、少なくとも８５％、８５％～９０％、少なくとも９０％、９０％～９５％、少なくとも９５％、９５％～９６％、少なくとも９６％、９６％～９７％、少なくとも９７％、９７％～９８％、少なくとも９８％、９８％～９９％、少なくとも９９％、９９％～１００％、又は１００％の配列同一性を含み；ここで、配列番号２０に対する４０位は、アラニンではないか、又は配列番号２０に対する８１位は、グルタミン酸ではないか、又は前述の任意の組み合わせである。
【0295】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼバリアントエンドヌクレアーゼの「機能的断片」は、配列番号２０の少なくとも５０、５０～１００、少なくとも１００、１００～１５０、少なくとも１５０、１５０～２００、少なくとも２００、２００～２５０、少なくとも２５０、２５０～３００、少なくとも３００、３００～３５０、少なくとも３５０、３５０～４００、少なくとも４００、４００～４５０、少なくとも４５０、又は４５０個を超える連続するアミノ酸と、少なくとも５０％、５０％～５５％、少なくとも５５％、５５％～６０％、少なくとも６０％、６０％～６５％、少なくとも６５％、６５％～７０％、少なくとも７０％、７０％～７５％、少なくとも７５％、７５％～８０％、少なくとも８０％、８０％～８５％、少なくとも８５％、８５％～９０％、少なくとも９０％、少なくとも９０％～９５％、少なくとも９５％、９５％～９６％、少なくとも９６％、９６％～９７％、少なくとも９７％、９７％～９８％、少なくとも９８％、９８％～９９％、少なくとも９９％、９９％～１００％、又は１００％の配列同一性を共有する４９７個未満のアミノ酸のポリヌクレオチドを指しており、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖を認識するか、この一方の鎖に結合するか、若しくはこの一方の鎖に切れ目を入れる能力を含むか、又は二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を開裂する能力を含むか、又は前述の任意の組み合わせを含む。
【0296】
ＲｕｖＣドメインは、エンドヌクレアーゼの機能性を包含することが文献で実証されている。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、エフェクタータンパク質をコードするＣａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子及び複数のリピートを含むアレイを含む遺伝子座から単離され得るか、又は特定され得る。
【0297】
ジンクフィンガーモチーフは、１つ又は複数の亜鉛イオンを、通常はシステイン及びヒスチジン側鎖によって配位させて、これらのフォールドを安定化させるドメインである。ジンクフィンガーは、亜鉛イオンに配位するシステイン残基及びヒスチジン残基のパターンで命名されている（例えば、Ｃ４は、亜鉛イオンに４つのシステイン残基が配位していることを意味しており、Ｃ３Ｈは、亜鉛イオンに３つのシステイン残基と１つのヒスチジン残基とが配位していることを意味する）。
【0298】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質は、亜鉛結合ドメインを形成し得る１つ又は複数のジンクフィンガー（ＺＦＮ）配位モチーフを含む。ジンクフィンガー様モチーフは、標的鎖及び非標的鎖の分離、並びにＤＮＡ標的へのガイドＲＮＡのローディングを助けることができる。１つ又は複数のジンクフィンガーモチーフを含むＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質は、標的ポリヌクレオチド上のリボ核タンパク質複合体にさらなる安定性を提供し得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質は、Ｃ４亜鉛結合ドメイン又はＣ３Ｈ亜鉛結合ドメインを含む。
【0299】
本明細書で使用される場合、「ドメイン」は、「モチーフ」と同義である。例えば、ジンクフィンガードメイン及びジンクフィンガーモチーフは、同義に使用される。同様に、亜鉛結合ドメイン及び亜鉛結合モチーフは、同義に使用される。
【0300】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、（１）ガイドＲＮＡのヌクレオチド配列と相同性を共有する配列、及び（２）ＰＡＭ配列を含む二本鎖ＤＮＡ標的に結合して開裂し得るＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。
【0301】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、二本鎖切断誘導剤として機能し、ニッカーゼ又は一本鎖切断誘導剤でもあり得る。一部の態様では、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼを使用して標的ＤＮＡ配列を標的化するか又は標的ＤＮＡ配列に動員させ得るが、開裂を誘発し得ない。一部の態様では、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を、機能的エンドヌクレアーゼと共に使用して、標的配列を開裂し得る。一部の態様では、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を、デアミナーゼ等の塩基編集分子と組み合わせ得る。一部の態様では、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼであり得る。一部の態様では、デアミナーゼは、アデニンデアミナーゼであり得る。一部の態様では、デアミナーゼは、ＡＤＡＲ－２であり得る。
【0302】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号２０の５０、５０～１００、少なくとも１００、１００～１５０、少なくとも１５０、１５０～２００、少なくとも２００、２００～２５０、少なくとも２５０、２５０～３００、少なくとも３００、３００～３５０、少なくとも３５０、３５０～４００、少なくとも４００、４００～４５０、少なくとも４５０個、若しくは４５０個を超える連続するアミノ酸と、少なくとも５０％、５０％～５５％、少なくとも５５％、５５％～６０％、少なくとも６０％、６０％～６５％、少なくとも６５％、６５％～７０％、少なくとも７０％、７０％～７５％、少なくとも７５％、７５％～８０％、少なくとも８０％、８０％～８５％、少なくとも８５％、８５％～９０％、少なくとも９０％、少なくとも９０％～９５％、少なくとも９５％、９５％～９６％、少なくとも９６％、９６％～９７％、少なくとも９７％、９７％～９８％、少なくとも９８％、９８％～９９％、少なくとも９９％、９９％～１００％、若しくは１００％の配列同一性を共有するＲＮＡ誘導型二本鎖ＤＮＡ開裂タンパク質、又は少なくとも部分的な活性を保持するその機能的断片若しくはその機能的バリアントとしてさらに定義される。
【0303】
本開示の操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼ、又は不活性の操作されたＣａｓポリペプチドは、配列番号２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３の内のいずれかをコードする任意の配列の少なくとも５０、５０～１００、少なくとも１００、１００～１５０、少なくとも１５０、１５０～２００、少なくとも２００、２００～２５０、少なくとも２５０、２５０～３００、少なくとも３００、３００～３５０、少なくとも３５０、３５０～４００、少なくとも４００、４００～４５０、少なくとも５００、５００～５５０、少なくとも６００、６００～６５０、少なくとも６５０、６５０～７００、少なくとも７００、７００～７５０、少なくとも７５０、７５０～８００、少なくとも８００、８００～８５０、少なくとも８５０、８５０～９００、少なくとも９００、９００～９５０、少なくとも９５０、９５０～１０００、少なくとも１０００個、又は１０００個を超える連続するヌクレオチドと、少なくとも５０％、５０％～５５％、少なくとも５５％、５５％～６０％、少なくとも６０％、６０％～６５％、少なくとも６５％、６５％～７０％、少なくとも７０％、７０％～７５％、少なくとも７５％、７５％～８０％、少なくとも８０％、８０％～８５％、少なくとも８５％、８５％～９０％、少なくとも９０％、９０％～９５％、少なくとも９５％、９５％～９６％、少なくとも９６％、９６％～９７％、少なくとも９７％、９７％～９８％、少なくとも９８％、９８％～９９％、少なくとも９９％、９９％～１００％、又は１００％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドによりコードされ得る。
【0304】
本開示の方法での使用のためのＣａｓエンドヌクレアーゼ、エフェクタータンパク質、又はこれらの機能的断片を、天然の供給源から単離し得るか、又は遺伝子改変された宿主細胞がこのタンパク質をコードする核酸配列を発現するように改変されている組換え供給源から単離し得る。或いは、Ｃａｓタンパク質を、無細胞タンパク質発現システムを使用して生成し得るか、又は合成的に生成し得る。エフェクターＣａｓヌクレアーゼを、単離して異種細胞に導入し得るか、又はその天然の形態から、その天然源と異なる型又は活性の大きさを示すように改変し得る。そのような改変として、断片、バリアント、置換、欠失、及び挿入が挙げられるが、これらに限定されない。ＣａｓエンドヌクレアーゼＷＴ組成物は、２０２０年７月１６日に公開された国際公開第２０２０１２３８８７号パンフレットで説明されている。
【0305】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びＣａｓエンドヌクレアーゼエフェクタータンパク質の断片及びバリアントを、部位特異的変異誘発及び合成構築等の方法により得ることができる。エンドヌクレアーゼ活性を測定する方法は、当該技術分野で公知であり、２０１３年１１月７日に公開された国際公開第２０１３１６６１１３号パンフレット、２０１６年１１月２４日に公開された国際公開第２０１６１８６９５３号パンフレット、及び２０１６年１１月２４日に公開された国際公開第２０１６１８６９４６号パンフレットが挙げられるが、これらに限定されない。
【0306】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓポリペプチドの改変形態を含み得る。Ｃａｓポリペプチドの改変形態として、Ｃａｓタンパク質の自然に存在するヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、又は置換）が挙げられ得る。例えば、一部の例では、Ｃａｓタンパク質の改変形態は、対応する野生型Ｃａｓポリペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満のヌクレアーゼ活性を有する（２０１４年３月６日に公開された米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号明細書）。一部の例では、Ｃａｓポリペプチドの改変形態は、ヌクレアーゼ活性を実質的に有しておらず、触媒的に「不活化されたＣａｓ」又は「失活したｃａｓ（ｄＣａｓ）」と呼ばれる。不活化されたＣａｓ／失活したＣａｓは、失活したＣａｓエンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含む。触媒的に不活性なＣａｓエフェクタータンパク質を異種配列に融合させて、活性を誘発し得るか、又は改変し得る。
【0307】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、１つ又は複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に加えて１つ、２つ、３つ又はより多くのドメイン）を含む融合タンパク質の一部であり得る。そのような融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列と、任意の２つのドメイン間（例えば、Ｃａｓと第１の異種ドメインとの間）の任意選択的なリンカー配列とを含み得る。本明細書のＣａｓタンパク質に融合され得るタンパク質ドメインの例として、エピトープタグ（例えば、ヒスチジン［Ｈｉｓ］、Ｖ５、ＦＬＡＧ、インフルエンザ赤血球凝集素［ＨＡ］、ｍｙｃ、ＶＳＶ－Ｇ、チオレドキシン［Ｔｒｘ］）、レポーター（例えば、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］、西洋ワサビペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、青色蛍光タンパク質［ＢＦＰ］）、及び下記の活性の内の１つ又は複数を有するドメインが挙げられるが、これらに限定されない：メチル化酵素活性、脱メチル化酵素活性、転写活性化活性（例えば、ＶＰ１６又はＶＰ６４）、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン改変活性、ＲＮＡ開裂活性、及び核酸結合活性。Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ分子又は他の分子、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６に結合するタンパク質とも融合し得る。
【0308】
触媒的に活性な及び／又は不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼを、異種配列に融合させ得る（２０１４年３月６日に公開された米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号明細書）。好適な融合パートナーとして、標的ＤＮＡ又は標的ＤＮＡに関連するポリペプチド（例えば、ヒストン又は他のＤＮＡ結合性タンパク質）に直接作用することにより転写を間接的に増加させる活性を提供するポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。さらなる好適な融合パートナーとして、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、又は脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。さらに好適な融合パートナーとして、標的核酸の転写増加を直接引き起こすポリペプチド（例えば、転写活性化因子又はその断片、転写活性化因子、小分子／薬剤反応性転写調節因子を誘導するタンパク質又はその断片等）が挙げられるが、これに限定されない。部分的に活性な又は触媒的に不活性なＣａｓ－ベータエンドヌクレアーゼはまた、別のタンパク質又はドメイン（例えば、Ｃｌｏ５１ヌクレアーゼ又はＦｏｋＩヌクレアーゼ）にも融合して、二本鎖切断を生成し得る（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３２，ｎｕｍｂｅｒ ６，Ｊｕｎｅ ２０１４）。
【0309】
本明細書で説明されているＣａｓエンドヌクレアーゼ等の触媒的に活性な又は不活性なＣａｓタンパク質はまた、ポリヌクレオチド配列中の単一又は複数の塩基の編集を指示する分子（例えば、ヌクレオチドの同一性を例えばＣ・ＧからＴ・Ａに又はＡ・ＴからＧ・Ｃに変化させ得る部位特異的デアミナーゼ）とも融合し得る（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．”Ｎａｔｕｒｅ（２０１７）；Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（６３０５）（２０１６）；Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．”Ｎａｔｕｒｅ ５３３（７６０３）（２０１６）：４２０－４）。塩基編集融合タンパク質は、例えば、活性な（二本鎖切断性）、部分的に活性な（ニッカーゼ）、又は不活化された（触媒的に不活性な）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及びデアミナーゼ（例えば、限定されないが、シチジンデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＢＥ２、ＢＥ３、ＢＥ４、ＡＢＥ、又は同類のもの）を含み得る。塩基編集修復阻害剤及びグリコシラーゼ阻害剤（例えば、（ウラシルの除去を防止する）ウラシルグリコシラーゼ阻害剤）は、一部の実施形態では、塩基編集システムの他の成分として企図されている。
【0310】
本明細書で説明されているＣａｓエンドヌクレアーゼは、当該技術分野で既知の方法（例えば、２０１６年１１月２４日に公開された国際公開第２０１６／１８６９５３号パンフレットで説明されている方法）により発現させて精製し得る。
【0311】
これまでに、特定のＰＡＭ配列を認識し得（２０１６年１１月２４日に公開された国際公開第２０１６１８６９５３号パンフレット、２０１６年１１月２４日に公開された国際公開第２０１６１８６９４６号パンフレット、及びＺｅｔｓｃｈｅ Ｂ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ １６３，１０１３）、且つ特定の位置で標的ＤＮＡを開裂し得る多くのＣａｓエンドヌクレアーゼが説明されている。新規の誘導型Ｃａｓシステムを使用する本明細書で説明されている方法及び実施形態に基づいて、当業者は、これらの方法を、これらの方法が任意の誘導型エンドヌクレアーゼシステムを使用し得るように適合させることが可能であることが理解される。
【0312】
Ｃａｓエフェクタータンパク質は、異種核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。本明細書中の異種ＮＬＳアミノ酸配列は、例えば、本明細書中の酵母細胞の核内で検出可能な量のＣａｓタンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有し得る。ＮＬＳは、塩基性の、正に帯電する残基（例えば、リシン及び／又はアルギニン）の１つ（一分節）又は複数（例えば、二分節）の短い配列（例えば、２～２０個の残基）を含み得、且つタンパク質表面上に曝されるのであれば、Ｃａｓアミノ酸配列中のどこにでも位置決めされ得る。ＮＬＳは、例えば、本明細書中のＣａｓタンパク質のＮ末端又はＣ末端に作動可能に連結され得る。例えば、２つ以上のＮＬＳ配列が、Ｃａｓタンパク質に連結され得、例えばＣａｓタンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方に連結され得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓコドン領域のＳＶ４０核ターゲティングシグナル上流、及びＣａｓコドン領域の二分ＶｉｒＤ２核定位シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７４４２－６）下流に作動可能に連結され得る。本明細書中の好適なＮＬＳ配列の非限定的な例として、米国特許第６，６６０，８３０号明細書及び同第７，３０９，５７６号明細書で開示されているものが挙げられる。
【0313】
ガイドポリヌクレオチド
ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的の認識、標的への結合、及び任意選択的な標的の開裂を可能にし、且つ単一分子又は二重分子であり得る。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はこれらの組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。任意選択的に、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド、ホスホジエステル結合、又は結合改変を含み得、結合改変として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣ、２，６－ジアミノプリン、２’－フルオロＡ、２’－フルオロＵ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、又は環化をもたらす５’から３’への共有結合的な連結。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドは、「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」とも呼ばれる（２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書、及び２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５００５９０１０号明細書）。ガイドポリヌクレオチドは、操作されてもよいし、合成されてもよい。
ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的の認識、標的への結合、及び任意選択的な標的の開裂を可能にし、且つ単一分子又は二重分子であり得る。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はこれらの組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。任意選択的に、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド、ホスホジエステル結合、又は結合改変を含み得、結合改変として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣ、２，６－ジアミノプリン、２’－フルオロＡ、２’－フルオロＵ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、又は環化をもたらす５’から３’への共有結合的な連結。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドは、「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」とも呼ばれる（２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書、及び２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５００５９０１０号明細書）。ガイドポリヌクレオチドは、操作されてもよいし、合成されてもよい。
【0314】
ガイドポリヌクレオチドには、天然には一緒に見出されない複数の領域（即ち、これらは、互いに異種である）を含むキメラ非天然ガイドＲＮＡが含まれる。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを認識し得る第２のヌクレオチド配列に連結された、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）を含むキメラ非天然ガイドＲＮＡでは、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は、天然には一緒に連結されて見出されない。
【0315】
ガイドポリヌクレオチドは、ｃｒヌクレオチド配列（例えばｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒヌクレオチド（例えばｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。場合によっては、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを連結して単一のガイド（例えばｓｇＲＮＡ）を形成するリンカーポリヌクレオチドが存在する。
【0316】
ｃｒヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的ドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインの一部である第２のヌクレオチド配列（ｔｒａｃｒメイト配列とも呼ばれる）を含む。ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒヌクレオチドに、相補性領域に沿ってハイブリダイズし得、且つＣａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン（即ちＣＥＲドメイン）を共に形成し得る。ＣＥＲドメインは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用し得る。二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列であり得る。一部の実施形態では、二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチド分子は、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ」と称され、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ－ＲＮＡ」と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中及び古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片を含み得る。本明細書で開示されているｃｒヌクレオチド中に存在し得る、細菌中及び古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片のサイズは、限定されないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はより多くのヌクレオチドの範囲であり得る。
【0317】
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒヌクレオチドは、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ－ＲＮＡ」と称される。一実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型ｃｒＲＮＡのリピート領域とアニールする配列、及び（ｉｉ）ステムループ含有部分を含む（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７）。二本鎖ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し得、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムとも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に誘導し得、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこの標的部位を認識し、この標的部位に結合し、且つ任意選択的にこの標的部位に切れ目を入れるか又は開裂する（一本鎖又は二本鎖切断を導入する）のを可能にする。（２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書、及び２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５００５９０１０号明細書）。
【0318】
一態様では、ガイドポリヌクレオチドは、本明細書で説明されているＰＧＥＮを形成し得るガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン、及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメインを含む。
【0319】
一態様では、ガイドポリヌクレオチドは、本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチドであって、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、ガイドポリヌクレオチドである。
【0320】
一態様では、ガイドポリヌクレオチドは、本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチドであって、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列ドメインは、安定性を増強するＲＮＡ骨格改変、安定性を増強するＤＮＡ骨格改変、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、ガイドポリヌクレオチドである（Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｏｍｍｏｎ ＲＮＡ－ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １２：９７６－９７７；２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書、及び２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５００５９０１０号明細書を参照されたい）。
【0321】
ガイドＲＮＡは、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡに連結されたキメラ非天然ｃｒＲＮＡを含む二重分子を含む。キメラ非天然ｃｒＲＮＡには、天然には一緒に見出されない複数の領域（即ち、これらは、互いに異種である）を含むｃｒＲＮＡが含まれる。例えば、第２のヌクレオチド配列（ｔｒａｃｒメイト配列とも呼ばれる）に連結された、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）を含むｃｒＲＮＡでは、第１の配列及び第２の配列は天然には一緒に連結されて見出されない。
【0322】
ガイドポリヌクレオチドはまた、ｔｒａｃｒヌクレオチド配列に連結されたｃｒヌクレオチド配列を含む単一分子（単一ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）でもあり得る。単一ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的ドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）、及びＣａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するＣａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲドメイン）を含む。
【0323】
単一ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメイン及び／又はＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。ｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列から構成される単一ガイドポリヌクレオチドは、「単一ガイドＲＮＡ」（連続した一続きのＲＮＡヌクレオチドで構成されている場合）、又は「単一ガイドＤＮＡ」（連続した一続きのＤＮＡヌクレオチドで構成されている場合）、又は「単一ガイドＲＮＡ－ＤＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称され得る。単一ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し得、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムとも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に誘導し得、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこの標的部位を認識し、この標的部位に結合し、且つ任意選択的にこの標的部位に切れ目を入れるか又は切断する（一本鎖又は二本鎖切断を導入する）のを可能にする。（２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書、及び２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５００５９０１０号明細書）。
【0324】
キメラ非天然単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）には、天然には一緒に見出されない複数の領域（即ち、これらは、互いに異種である）を含むｓｇＲＮＡが含まれる。例えば、天然には一緒に連結されて見出されない第２のヌクレオチド配列（ｔｒａｃｒメイト配列とも呼ばれる）に連結された、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）を含むｓｇＲＮＡ。
【0325】
単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。一実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列（「ループ」とも呼ばれる）は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００個のヌクレオチドの長さであり得る。別の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、テトラループ配列（例えば、限定されないが、ＧＡＡＡテトラループ配列）を含み得る。
【0326】
ガイドポリヌクレオチドを、ガイドポリヌクレオチドを化学的に合成すること（例えば、限定されないが、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３、９８５－９８９）、ガイドポリヌクレオチドのインビトロでの生成、及び／又はガイドＲＮＡの自己スプライシング（例えば、限定されないが、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、ＰＮＡＳ １１２：３５７０－３５７５）を含む、当該技術分野で既知の任意の方法によって生成し得る。
【0327】
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
本明細書中の「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムにより認識され得る（標的化され得る）標的配列（プロトスペーサー）に隣接する短いヌクレオチド配列を指す。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列の後にＰＡＭ配列がなければ、この標的ＤＮＡ配列を正しく認識し得ない。本明細書中のＰＡＭの配列及び長さは、使用されるＣａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体に応じて異なり得る。ＰＡＭ配列は任意の長さであり得るが、典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個のヌクレオチドの長さである。
本明細書中の「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムにより認識され得る（標的化され得る）標的配列（プロトスペーサー）に隣接する短いヌクレオチド配列を指す。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列の後にＰＡＭ配列がなければ、この標的ＤＮＡ配列を正しく認識し得ない。本明細書中のＰＡＭの配列及び長さは、使用されるＣａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体に応じて異なり得る。ＰＡＭ配列は任意の長さであり得るが、典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個のヌクレオチドの長さである。
【0328】
「ランダム化ＰＡＭ」及び「ランダム化プロトスペーサー隣接モチーフ」は、本明細書では互換的に使用され、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムによって認識される（標的化される）標的配列（プロトスペーサー）に隣接するランダムＤＮＡ配列を指す。ランダム化ＰＡＭ配列は任意の長さであり得るが、典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチドの長さである。ランダム化されたヌクレオチドは、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれか１つを含む。
【0329】
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体
本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、標的配列の全て又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れるか、ほどくか、又は切断することができる。
本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、標的配列の全て又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れるか、ほどくか、又は切断することができる。
【0330】
ＤＮＡ標的配列の両方の鎖を開裂し得るガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、典型的には、エンドヌクレアーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、野生型エンドヌクレアーゼドメイン、又は各エンドヌクレアーゼドメインの一部若しくは全ての活性を保持しているそのバリアント）を含む。そのため、野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書で開示されているＣａｓタンパク質）又はＣａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインの一部又は全ての活性を保持しているそのバリアントは、ＤＮＡ標的配列の両方の鎖を開裂し得るＣａｓタンパク質の好適な例である。
【0331】
ＤＮＡ標的配列の一本鎖を開裂し得るガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、本明細書では、ニッカーゼ活性（例えば、部分的開裂能力）を有すると特徴付けられ得る。Ｃａｓニッカーゼは、典型的には、ＣａｓがＤＮＡ標的配列の一本鎖のみを開裂する（即ち、切れ目を入れる）ことを可能にする１つの機能的エンドヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）変異した機能不全ＲｕｖＣドメイン、及び（ｉｉ）機能的ＨＮＨドメイン（例えば野生型ＨＮＨドメイン）を含み得る。別の例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば野生型ＲｕｖＣドメイン）、及び（ｉｉ）変異した機能不全ＨＮＨドメインを含み得る。本明細書での使用に適したＣａｓ９ニッカーゼの非限定的な例は、２０１４年７月３日に公開された米国特許出願公開第２０１４０１８９８９６号明細書で開示されている。一対のＣａｓニッカーゼを使用して、ＤＮＡターゲティングの特異性を増加させ得る。一般に、このことを、異なるガイド配列を備えるＲＮＡ成分と結び付けられることにより、所望のターゲティングのために領域内の逆鎖上のＤＮＡ配列を標的としてごく近くで切れ目を入れる２つのＣａｓニッカーゼを提供することにより行ない得る。そのような各ＤＮＡ鎖の近くの開裂は、二本鎖切断（即ち、一本鎖オーバーハングを有するＤＳＢ）を引き起こし、これは、その後、非相同性末端結合ＮＨＥＪ（変異につながる不完全な修復になりやすい）又は相同組換えＨＲの基質として認識される。これらの実施形態における各ニックは、例えば、少なくとも約５、５～１０、少なくとも１０、１０～１５、少なくとも１５、１５～２０、少なくとも２０、２０～３０、少なくとも３０、３０～４０、少なくとも４０、４０～５０、少なくとも５０、５０～６０、少なくとも６０、６０～７０、少なくとも７０、７０～８０、少なくとも８０、８０～９０、少なくとも９０、９０～１００個、又は１００個以上（又は５～１００個の任意の整数）の塩基分、互いに離れた状態であり得る。本明細書中の１つ又は２つのＣａｓニッカーゼタンパク質は、Ｃａｓニッカーゼ対で使用され得る。例えば、変異したＲｕｖＣドメインを有するがＨＮＨドメインが機能するＣａｓ９ニッカーゼ（即ち、Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ－）を使用し得る（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ－）。各Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ－）は、各ニッカーゼをそれぞれの特定のＤＮＡ部位に標的として向けるガイドＲＮＡ配列を有する本明細書中の好適なＲＮＡ成分を使用することにより、互いに近い（最大で１００塩基対離れている）特定のＤＮＡ部位に誘導され得る。
【0332】
ある特定の実施形態でのガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡ標的部位配列に結合し得るが、標的部位配列ではどの鎖も開裂しない。そのような複合体は、ヌクレアーゼドメインの全てが変異して機能不全であるＣａｓタンパク質を含み得る。例えば、ＤＮＡ標的部位配列に結合し得るが標的部位配列でいかなる鎖も開裂しないＣａｓ９タンパク質は、変異した機能不全ＲｕｖＣドメイン及び変異した機能不全ＨＮＨドメインの両方を含み得る。標的ＤＮＡ配列に結合するがこの標的ＤＮＡ配列を開裂しない本明細書中のＣａｓタンパク質を使用して、遺伝子発現を調整し得、例えば、この場合には、Ｃａｓタンパク質は、転写因子（又はその一部）（例えば、リプレッサー又は活性化因子、例えば本明細書で開示されるもののいずれか）と融合する可能性がある。
【0333】
一態様では、本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＰＧＥＮ）は、ＰＧＥＮであって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、任意選択的に、少なくとも１つのタンパク質サブユニット又はその機能的断片に共有結合しているか、又は非共有結合的に連結されているか、又は集められている、ＰＧＥＮである。
【0334】
本開示の一実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド及び少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドを含むガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＰＧＥＮ）であって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質サブユニット又はその機能的断片を含み、前記ガイドポリヌクレオチドは、キメラ非天然ガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、標的配列の全て又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れるか、ほどくか、又は開裂し得る。
【0335】
Ｃａｓエフェクタータンパク質は、本明細書で開示されるＣａｓエンドヌクレアーゼエフェクタータンパク質であり得る。
【0336】
本開示の一実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクター複合体は、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド及びＣａｓエンドヌクレアーゼエフェクタータンパク質を含むガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体（ＰＧＥＮ）であって、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体は、標的配列の全て又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れるか、ほどくか、又は開裂し得る。
【0337】
ＰＧＥＮは、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体であり得、ここで、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、少なくとも１つのタンパク質サブユニット又はその機能的断片の１つのコピー又は複数のコピーをさらに含む。一部の実施形態では、前記タンパク質サブユニットは、Ｃａｓ１タンパク質サブユニット、Ｃａｓ２タンパク質サブユニット、Ｃａｓ４タンパク質サブユニット、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ＰＧＥＮは、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体であり得、ここで、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣａｓ４からなる群から選択される少なくとも２つの異なるタンパク質サブユニットをさらに含む。
【0338】
ＰＧＥＮは、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体であり得、ここで、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及び任意選択的にＣａｓ４を含む１つのさらなるＣａｓタンパク質からなる群から選択される少なくとも３つの異なるタンパク質サブユニット又はその機能的断片をさらに含む。
【0339】
一態様では、本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体（ＰＧＥＮ）は、ＰＧＥＮであって、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、少なくとも１つのタンパク質サブユニット又はその機能的断片に共有結合的に又は非共有結合的に連結されている、ＰＧＥＮである。ＰＧＥＮは、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体であり得、ここで、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質ポリペプチドは、Ｃａｓ１タンパク質サブユニット、Ｃａｓ２タンパク質サブユニット、任意選択的にＣａｓ４タンパク質サブユニットを含む１つのさらなるＣａｓタンパク質サブユニット、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質サブユニット又はその機能的断片の１つのコピー又は複数のコピーに共有結合的に又は非共有結合的に連結されるか又は集められる。ＰＧＥＮは、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体であり得、ここで、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及び任意選択的にＣａｓ４を含む１つのさらなるＣａｓタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つの異なるタンパク質サブユニットに共有結合的に又は非共有結合的に連結されるか又は集められる。ＰＧＥＮは、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体であり得、ここで、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及び任意選択的にＣａｓ４を含む１つのさらなるＣａｓタンパク質、並びにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも３つの異なるタンパク質サブユニット又はその機能的断片に、共有結合的に又は非共有結合的に連結されている。
【0340】
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体の任意の成分、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエフェクタータンパク質複合体自体、並びにポリヌクレオチド改変鋳型及び／又はドナーＤＮＡを、当該技術分野で既知の任意の方法により、異種細胞又は生物に導入し得る。
【0341】
細胞の形質転換のための組換えコンストラクト
本開示のガイドポリヌクレオチド、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド改変鋳型、ドナーＤＮＡ、本明細書で開示されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム、及び任意選択的に目的の１つ又は複数のポリヌクレオチドをさらに含むこれらのいずれか１つの組み合わせを、細胞に導入し得る。細胞として、ヒト、非ヒト、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母、及び植物の細胞、並びに本明細書で説明されている方法によって作製された植物及び種子が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のガイドポリヌクレオチド、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド改変鋳型、ドナーＤＮＡ、本明細書で開示されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム、及び任意選択的に目的の１つ又は複数のポリヌクレオチドをさらに含むこれらのいずれか１つの組み合わせを、細胞に導入し得る。細胞として、ヒト、非ヒト、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母、及び植物の細胞、並びに本明細書で説明されている方法によって作製された植物及び種子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0342】
本明細書で使用される標準の組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該技術分野では公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）でより完全に説明されている。形質転換法は、当業者に公知であり、下記で説明する。
【0343】
ベクター及びコンストラクトには、環状プラスミド及び線形ポリヌクレオチドが含まれ、これらには、目的のポリヌクレオチド、及び任意選択的な他の構成要素（例えば、リンカー、アダプター、調節要素、又は分析要素）が含まれる。一部の例では、認識部位及び／又は標的部位を、イントロン、コード配列、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／又は調節領域内に含有させ得る。
【0344】
原核細胞及び真核細胞における新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現及び利用のための成分
本発明は、原核細胞／生物又は真核細胞／生物において、標的配列の全て又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れるか、ほどくか、又は開裂し得るガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステムを発現させるための発現コンストラクトをさらに提供する。
本発明は、原核細胞／生物又は真核細胞／生物において、標的配列の全て又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択的に切れ目を入れるか、ほどくか、又は開裂し得るガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステムを発現させるための発現コンストラクトをさらに提供する。
【0345】
一実施形態では、本開示の発現コンストラクトは、Ｃａｓ遺伝子（又は本明細書で説明されているＣａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む、最適化された植物）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター、及び本開示のガイドＲＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、原核細胞／生物又は真核細胞／生物において、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を駆動し得る。
【0346】
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメイン、及び／又はＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変は、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドを細胞内位置に標的化する改変又は配列、追跡をもたらす改変又は配列、タンパク質のための結合部位をもたらす改変又は配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣヌクレオチド、２，６－ジアミノプリンヌクレオチド、２’－フルオロＡヌクレオチド、２’－フルオロＵヌクレオチド；２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的な連結、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得るが、これらに限定されない。これらの改変は、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらし得、この追加の有利な特徴は、安定性の改変又は調節、細胞内ターゲティング、追跡、蛍光標識、タンパク質用又はタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の改変、細胞分解に対する耐性の改変、及び細胞透過性の増大の群から選択される。
【0347】
Ｃａｓ９媒介ＤＮＡターゲティングを行うために真核細胞中でｇＲＮＡ等のＲＮＡ成分を発現させる方法は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを使用することであり、これは、正確に定義された改変されていない５’末端及び３’末端を有するＲＮＡの転写を可能にする（ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：４３３６－４３４３；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１６１）。この戦略は、トウモロコシ及びダイズを含むいくつかの異なる種の細胞に問題なく適用されている（２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書）。５’キャップを有していないＲＮＡ成分を発現させる方法が説明されている（２０１６年２月１８日に公開された国際公開第２０１６／０２５１３１号パンフレット）。
【0348】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼのための標的部位に挿入される目的のポリヌクレオチドを有する細胞又は生物を得るために、様々な方法及び組成物を用い得る。そのような方法は、標的部位に目的のポリヌクレオチドを組み込む相同組換え（ＨＲ）を用い得る。本明細書で説明されいてる１つの方法において、目的のポリヌクレオチドは、ドナーＤＮＡコンストラクトによって生物細胞に導入される。
【0349】
ドナーＤＮＡコンストラクトは、目的のポリヌクレオチドに隣接する第１及び第２の相同領域をさらに含む。ドナーＤＮＡの第１の及び第２の相同領域は、細胞又は生物のゲノムの標的部位中に存在するか又はこの標的部位に隣接する第１及び第２のゲノム領域に対し相同性をそれぞれ共有する。
【0350】
ドナーＤＮＡを、ガイドポリヌクレオチドに繋留させ得る。繋留されたドナーＤＮＡは、ゲノムの編集、遺伝子の挿入、及び標的ゲノムの調節で有用な標的及びドナーＤＮＡの共局在化を可能にし得、且つ内在性ＨＲ機構の機能が大きく低下していると予想される有糸分裂終細胞のターゲティングでも有用であり得る（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．１０：９５７－９６３）。
【0351】
標的及びドナーポリヌクレオチドによって共有される相同性又は配列同一性の量は、変動し得、約１～２０ｂｐ、２０～５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、７５～１５０ｂｐ、１００～２５０ｂｐ、１５０～３００ｂｐ、２００～４００ｂｐ、２５０～５００ｂｐ、３００～６００ｂｐ、３５０～７５０ｂｐ、４００～８００ｂｐ、４５０～９００ｂｐ、５００～１，０００ｂｐ、６００～１，２５０ｂｐ、７００～１，５００ｂｐ、８００～１，７５０ｂｐ、９００～２，０００ｂｐ、１～２．５ｋｂ、１．５～３ｋｂ、２～４ｋｂ、２．５～５ｋｂ、３～６ｋｂ、３．５～７ｋｂ、４～８ｋｂ、５～１０ｋｂ、又は標的部位の全長以下の範囲内の単位整数値を有する全長及び／又は領域を含む。これらの範囲には、この範囲内の全ての整数が含まれており、例えば、１～２０ｂｐの範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０ｂｐが含まれる。相同性の量を、２種のポリヌクレオチドの完全にアラインされた長さ全体にわたる配列同一性パーセントでも説明し得、これには、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８％～９９％、９９％、９９％～１００％、又は１００％の配列同一性パーセントが含まれる。十分な相同性は、ポリヌクレオチドの長さと、全体的な配列同一性パーセントと、任意選択的な連続したヌクレオチドの保存領域又は局所的な配列同一性パーセントとの任意の組み合わせを含み、例えば、十分な相同性を、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する７５～１５０ｂｐの領域と説明し得る。十分な相同性をまた、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする２つのポリヌクレオチドの予測能力によって説明し得、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；及びＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【0352】
所定のゲノム領域とドナーＤＮＡ上で見出される対応する相同領域との間の構造的類似性は、相同組換えが発生することを可能にする任意の程度の配列同一性であり得る。例えば、ドナーＤＮＡの「相同領域」及び生物ゲノムの「ゲノム領域」によって共有される相同性又は配列同一性の量は、これらの配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性であり得る。
【0353】
ドナーＤＮＡ上の相同領域は、標的部位に隣接する任意の配列に対する相同性を有する可能性がある。一部の例では、相同領域は、標的部位に直接隣接するゲノム配列に対して相当の配列相同性を共有するが、この相同領域を、標的部位に対してさらに５’又は３’であり得る領域に対して十分な相同性を有するように設計し得ることが認識される。相同領域はまた、下流のゲノム領域に加えて標的部位の断片との相同性も有し得る。
【0354】
一実施形態では、第１の相同領域は、標的部位の第１の断片をさらに含み、第２の相同領域は、標的部位の第２の断片を含み、第１の断片及び第２の断片は異なる。
【0355】
目的のポリヌクレオチド
本明細書では、目的のポリヌクレオチドについてさらに説明するが、これには、商業市場及び作物の開発に関係する商業市場の関心を反映するポリヌクレオチドが含まれる。目的の作物及び市場は変化しており、開発途上国が世界市場を広げるにつれて、新規の作物及びテクノロジーもまた出現するであろう。加えて、農業形質、並びに収量及び雑種強勢等の特徴に関する我々の理解が高まるにつれて、遺伝子操作のための遺伝子の選択は、これに応じて変化するであろう。
本明細書では、目的のポリヌクレオチドについてさらに説明するが、これには、商業市場及び作物の開発に関係する商業市場の関心を反映するポリヌクレオチドが含まれる。目的の作物及び市場は変化しており、開発途上国が世界市場を広げるにつれて、新規の作物及びテクノロジーもまた出現するであろう。加えて、農業形質、並びに収量及び雑種強勢等の特徴に関する我々の理解が高まるにつれて、遺伝子操作のための遺伝子の選択は、これに応じて変化するであろう。
【0356】
目的のポリヌクレオチドの一般的なカテゴリとして、例えば、ジンクフィンガー等の情報に関与する目的の遺伝子、キナーゼ等の伝達に関与する目的の遺伝子、及び熱ショックタンパク質等のハウスキーピングに関与する目的の遺伝子が挙げられる。より具体的な目的のポリヌクレオチドとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：作物の収量、穀物の品質、作物の栄養素含有量、デンプン及び炭水化物の品質及び量、並びに穀粒サイズ、スクロース負荷、タンパク質の品質及び量、窒素固定及び／又は利用、脂肪酸及び油組成に影響を及ぼすもの挙げられるがこれらに限定されない農学的利益の形質に関与する遺伝子、非生物的ストレス（例えば、乾燥、窒素、温度、塩分、毒性金属、若しくは微量元素、又は殺虫剤及び除草剤等の毒素に対する抵抗性を付与するもの）に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、生物的ストレス（例えば、真菌、ウイルス、細菌、昆虫、及び線虫による攻撃、並びにこれらの生物に関連する病気の進行）に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子。
【0357】
油、デンプン、及びタンパク質の含有量等の農学的に重要な形質を、従来の育種方法の使用に加え、遺伝子的に改変し得る。改変として、オレイン酸、飽和油、及び不飽和油の含有量の増加、リシン及び硫黄の濃度上昇、必須アミノ酸の提供、またデンプンの改変が挙げられる。ホリドチオニンタンパク質の改変は、米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第５，８８５，８０２号明細書、及び同第５，９９０，３８９号明細書で説明されている。
【0358】
目的のポリヌクレオチド配列は、病気耐性又は有害生物耐性の導入に関与するタンパク質をコードし得る。「病気耐性」又は「有害生物耐性」は、植物と病原体との相互作用の結果である有害な症状を植物が回避することが意図されている。有害生物耐性遺伝子は、ネキリムシ、ヨトウムシ、ヨーロッパアワノメイガ、及び同類のもの等の高収量を阻害する有害生物に対する耐性をコードし得る。抗菌性を保護するリゾチーム若しくはセクロピン等の病気耐性及び昆虫耐性遺伝子、又は抗真菌性を保護するデフェンシン、グルカナーゼ、若しくはキチナーゼ等のタンパク質、又は線虫若しくは昆虫を制御する、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）エンドトキシン、プロテアーゼ阻害剤、コラゲナーゼ、レクチン、若しくはグルコシダーゼは、いずれも有用な遺伝子産物の例である。病気耐性形質をコードする遺伝子として、フモニシンに対する等の解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号明細書）、非病原性（ａｖｒ）遺伝子及び病気耐性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２；及びＭｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：１０８９）、及び同類のものが挙げられる。昆虫耐性遺伝子は、根切り虫、ヨトウムシ、ヨーロッパアワノメイガ、及び同類のもの等の穀粒収穫量の低下（ｙｉｅｌｄ ｄｒａｇ）をもたらす有害生物に対する耐性をコードし得る。そのような遺伝子として、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号明細書；同第５，７４７，４５０号明細書；同第５，７３６，５１４号明細書；同第５，７２３，７５６号明細書；同第５，５９３，８８１号明細書；及びＧｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９）、及び同類のものが挙げられる。
【0359】
「除草剤耐性タンパク質」、又は「除草剤耐性をコードする核酸分子」の発現により得られるタンパク質として、このタンパク質を発現しない細胞より、より高濃度の除草剤に耐える能力、又はこのタンパク質を発現しない細胞より、より長期間ある特定の濃度の除草剤に耐える能力を細胞に付与するタンパク質が挙げられる。除草剤耐性形質を、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ、アセトヒドロキシ酸合成酵素、ＡＨＡＳとも呼ばれる）の働きを阻害するように作用する除草剤、特に、スルホニル尿素（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）（ＵＫ：スルホニル尿素（ｓｕｌｐｈｏｎｙｌｕｒｅａ））型除草剤に対する耐性をコードする遺伝子、グルタミン合成酵素の働きを阻害するように作用する除草剤、例えば、ホスフィノトリシン若しくはｂａｓｔａに対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ｂａｒ遺伝子）、グリホサートに対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子及びＧＡＴ遺伝子）、ＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ＨＰＰＤ遺伝子）、又は当該技術分野で既知の他のそのような遺伝子によって植物に導入し得る。例えば、米国特許第７，６２６，０７７号明細書、同第５，３１０，６６７号明細書、同第５，８６６，７７５号明細書、同第６，２２５，１１４号明細書、同第６，２４８，８７６号明細書、同第７，１６９，９７０号明細書、同第６，８６７，２９３号明細書、及び同第９，１８７，７６２号明細書を参照されたい。ｂａｒ遺伝子は、除草剤ｂａｓｔａに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は、抗生物質カナマイシン及びジェネテシンに対する耐性をコードし、ＡＬＳ遺伝子変異体は、除草剤クロロスルフロンに対する耐性をコードする。
【0360】
さらに、目的のポリヌクレオチドはまた、目的の標的化遺伝子配列のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部分に対して相補的であるアンチセンス配列も含み得る。アンチセンスヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするために構築される。アンチセンス配列の改変を、この配列が対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして対応するｍＲＮＡの発現を妨害する限り作成し得る。この方法で、対応するアンチセンス配列に対する７０％、８０％、又は８５％の配列同一性を有するアンチセンスコンストラクトを使用し得る。さらに、標的遺伝子の発現を崩壊させるためにアンチセンスヌクレオチドの部分が使用されてもよい。一般に、少なくとも５０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、又はより多くの配列を使用し得る。
【0361】
加えて、目的のポリヌクレオチドをまた、植物の内在性遺伝子の発現を抑制するセンス配向でも使用し得る。センス配向のポリヌクレオチドを使用して植物中での遺伝子の発現を抑制する方法は、当該技術分野で既知である。この方法は、一般に、内因性の遺伝子の転写に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部に作動可能に連結された、植物内での発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトで植物を形質転換することを含む。典型的には、そのようなヌクレオチド配列は、内因性遺伝子の転写配列に対し相当の配列同一性を有しており、一般に、約６５％を超える配列同一性、約８５％を超える配列同一性、又は約９５％を超える配列同一性を有する。米国特許第５，２８３，１８４号明細書及び同第５，０３４，３２３号明細書を参照されたい。
【0362】
目的のポリヌクレオチドはまた、表現型マーカーでもあり得る。表現型マーカーは、陽性選択マーカーであるか又は陰性選択マーカーであるかにかかわらず、視覚マーカー及び選択マーカーを含むスクリーニングマーカー又は選択マーカーである。任意の表現型マーカーを使用し得る。具体的には、選択マーカー又はスクリーニングマーカーは、多くの場合は特定の条件下において、分子若しくはこの分子を含む細胞を特定するか、又はこの分子若しくは細胞に有利若しくは不利に選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、限定されないがＲＮＡ、ペプチド、若しくはタンパク質の産生等の活性をコードし得るか、又はＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機及び有機化合物若しくは組成物、及び同類のものの結合部位を提供し得る。
【0363】
選択マーカーの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、Ｂａｓｔａ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ））等の抗生物質を含む、他の点では毒性の化合物に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；レシピエント細胞において他の点では欠失している産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；容易に同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ等の表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、赤色（ＲＦＰ）等の蛍光タンパク質、及び細胞表面タンパク質）；ＰＣＲにとっての新規のプライマー部位（例えば、以前には並置されていなかった２つのＤＮＡ配列の並列）の生成、制限エンドヌクレアーゼ又は他のＤＮＡ改変酵素、化学物質等の作用を受けていないか又は受けたＤＮＡ配列の含有、並びにその同定を可能にする特異的改変（例えばメチル化）に必要なＤＮＡ配列の含有。
【0364】
さらなる選択マーカーとして、スルホニル尿素、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、及び２，４－ジクロロフェノキシアセテート（２，４－Ｄ）等の除草化合物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジンスルホンアミド、ピリミジニルサリチル酸、及びスルホニルアミノカルボニル－トリアゾリノンに対する耐性のためのアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）（Ｓｈａｎｅｒ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ，１９９７，Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６９－１１０）；グリホサート耐性５－エノールピルビルシキメイト－３－ホスフェート（ＥＰＳＰＳ）（Ｓａｒｏｈａ ｅｔ ａｌ． １９９８，Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ７：６５－７２）を参照されたい。
【0365】
目的のポリヌクレオチドは、他の形質（例えば、限定されないが、除草剤耐性、又は本明細書で説明されている任意の他の形質）と組み合わせて積み重ねられ得るか又は使用され得る遺伝子を含む。目的のポリヌクレオチド及び／又は形質は、２０１３年１０月３日に公開された米国特許出願公開第２０１３０２６３３２４号明細書及び２０１３年８月１日に公開された国際公開第２０１３／１１２６８６号パンフレットで説明されているような複合形質遺伝子座に一緒に積み重ねられ得る。
【0366】
目的のポリペプチドは、本明細書で説明されている目的のポリヌクレオチドによってコードされる任意のタンパク質又はポリペプチドを含む。
【0367】
さらに提供されるのは、標的部位に組み込まれた目的のポリヌクレオチドをゲノム中に含む少なくとも１種の植物細胞を同定する方法である。ゲノムの標的部位又はその近傍への挿入がなされた植物細胞の同定に、様々な方法が使用可能である。そのような方法を、標的配列中の変化を検出するための標的配列の直接分析と見なし得、ＰＣＲ法、配列決定法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００９年５月２１日に公開された米国特許出願公開第２００９０１３３１５２号明細書を参照されたい。この方法はまた、ゲノムに組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含む植物細胞から植物を回収することも含む。植物は、不稔性又は稔性であり得る。任意の目的ポリヌクレオチドが提供され、植物のゲノムの標的部位に組み込まれ、植物で発現され得ることが確認される。
【0368】
植物における発現のための配列の最適化
植物好適遺伝子の合成方法は、当該技術分野で使用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書及び同第５，４３６，３９１号明細書、並びにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７－４９８を参照されたい。植物宿主において遺伝子発現を高めるためのさらなる配列の改変が知られている。これらの改変として、例えば、疑似のポリアデ二ル化シグナルをコードする１つ又は複数の配列の除去、１つ又は複数のエクソン－イントロンスプライス部位シグナルの除去、１つ又は複数のトランスポゾン様リピートの除去、及び遺伝子発現に有害であるおそれのあるそのようなよく特徴付けられた他の配列の除去が挙げられる。配列のＧ－Ｃ含量を、所与の植物宿主の平均レベル（この宿主植物細胞で発現される既知の遺伝子を参照して算出される）に調整し得る。可能であれば、配列が改変されて、１つ又は複数のｍＲＮＡの予測されるヘアピン二次構造が回避される。そのため、本開示の「植物最適化ヌクレオチド配列」は、１つ又は複数のそのような配列改変を含む。
植物好適遺伝子の合成方法は、当該技術分野で使用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書及び同第５，４３６，３９１号明細書、並びにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７－４９８を参照されたい。植物宿主において遺伝子発現を高めるためのさらなる配列の改変が知られている。これらの改変として、例えば、疑似のポリアデ二ル化シグナルをコードする１つ又は複数の配列の除去、１つ又は複数のエクソン－イントロンスプライス部位シグナルの除去、１つ又は複数のトランスポゾン様リピートの除去、及び遺伝子発現に有害であるおそれのあるそのようなよく特徴付けられた他の配列の除去が挙げられる。配列のＧ－Ｃ含量を、所与の植物宿主の平均レベル（この宿主植物細胞で発現される既知の遺伝子を参照して算出される）に調整し得る。可能であれば、配列が改変されて、１つ又は複数のｍＲＮＡの予測されるヘアピン二次構造が回避される。そのため、本開示の「植物最適化ヌクレオチド配列」は、１つ又は複数のそのような配列改変を含む。
【0369】
発現エレメント
本明細書で開示されているＣａｓタンパク質又は他のＣＲＩＳＰＲシステム成分をコードする任意のポリヌクレオチドは、宿主細胞における転写又は調節を容易にするために、異種発現エレメントに機能的に連結され得る。そのような発現エレメントとして、プロモーター、リーダー、イントロン、及びターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。発現エレメントは、「最小」であり得、これは、発現調節因子又は修飾因子として依然として機能する、天然の供給源に由来する短い配列を意味する。或いは、発現エレメントは、「最適化」され得、これは、そのポリヌクレオチド配列が特定の宿主細胞においてより望ましい特徴を伴って機能するために、その天然の状態から改変されていることを意味する（例えば、限定されないが、トウモロコシ植物中での発現を改善するために、細菌プロモーターが「トウモロコシ最適化」され得る）。或いは、発現エレメントは、「合成」であり得、これは、発現エレメントがインシリコで設計され、宿主細胞で使用するために合成されることを意味する。合成発現エレメントは、全体的に合成であってもよいし、部分的に合成（天然に存在するポリヌクレオチド配列の断片を含む）であってもよい。
本明細書で開示されているＣａｓタンパク質又は他のＣＲＩＳＰＲシステム成分をコードする任意のポリヌクレオチドは、宿主細胞における転写又は調節を容易にするために、異種発現エレメントに機能的に連結され得る。そのような発現エレメントとして、プロモーター、リーダー、イントロン、及びターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。発現エレメントは、「最小」であり得、これは、発現調節因子又は修飾因子として依然として機能する、天然の供給源に由来する短い配列を意味する。或いは、発現エレメントは、「最適化」され得、これは、そのポリヌクレオチド配列が特定の宿主細胞においてより望ましい特徴を伴って機能するために、その天然の状態から改変されていることを意味する（例えば、限定されないが、トウモロコシ植物中での発現を改善するために、細菌プロモーターが「トウモロコシ最適化」され得る）。或いは、発現エレメントは、「合成」であり得、これは、発現エレメントがインシリコで設計され、宿主細胞で使用するために合成されることを意味する。合成発現エレメントは、全体的に合成であってもよいし、部分的に合成（天然に存在するポリヌクレオチド配列の断片を含む）であってもよい。
【0370】
ある特定のプロモーターは、他のものよりも高率でＲＮＡの合成を誘導し得ることが示されている。これは、「強力なプロモーター」と呼ばれている。ある特定の他のプロモーターは、特定の細胞型又は組織型でのみ高いレベルでＲＮＡの合成を誘導し得ることが示されており、このプロモーターが、ある特定の組織で好適にＲＮＡ合成を誘導するが他の組織では低いレベルでＲＮＡ合成を誘導する場合には、「組織特異性プロモーター」又は「組織優勢プロモーター」と呼ばれることが多い。
【0371】
植物プロモーターは、植物細胞において転写を開始し得るプロモーターを含む。植物プロモーターの説明については、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ４０：１－２２；Ｐｏｒｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４），５６（１），３８－４９を参照されたい。
【0372】
構成型プロモーターとして、例えば、コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０－２）；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３－７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２：６１９－３２；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号明細書）、及び同類のものが挙げられる。
【0373】
組織優先プロモーターは、特定の植物組織内での強化された発現をターゲティングするために使用され得る。組織優先プロモーターとして、例えば、２０１３年７月１１日に公開された国際公開第２０１３１０３３６７号パンフレット、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２－８０３；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２５４：３３７－４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ６：１５７－６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１２：１３３１－４１；Ｖａｎ Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１２：５２５－３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１２：５１３－５２４；Ｌａｍ，（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２０：１８１－９６；及びＧｕｅｖａｒａ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ ４：４９５－５０５が挙げられる。葉優先プロモーターとして、例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５－６５；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ１０５：３５７－６７；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３５：７７３－８；Ｇｏｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ ３：５０９－１８；Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３：１１２９－３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：９５８６－９０；Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９５８）ＥＭＢＯ Ｊ ４：２７２３－９；Ｔｉｍｋｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５７－８を参照されたい。根優先プロモーターとしては、例えば、Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７－１８（ダイズ根特異的グルタミン合成酵素遺伝子）；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１１－２２（サイトゾルグルタミン合成酵素（ＧＳ））；Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１０５１－６１（サヤインゲンのＧＲＰ １．８遺伝子における根特異的制御エレメント）；Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４：４３３－４３（Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）マンノピン合成酵素（ＭＡＳ）の根特異的プロモーター）；Ｂｏｇｕｓｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６３３－４１（パラスポニア・アンデルソニイ（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）及びトレマ・トメントサ（Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）から単離された根特異的プロモーター）；Ｌｅａｃｈ ａｎｄ Ａｏｙａｇｉ，（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ７９：６９－７６（Ａ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ｒｏｌＣ及びｒｏｌＤ根誘導遺伝子）；Ｔｅｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ ８：３４３－５０（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）創傷誘導ＴＲ１’及びＴＲ２’遺伝子）；ＶｆＥＮＯＤ－ＧＲＰ３遺伝子プロモーター（Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９－７２）；及びｒｏｌＢプロモーター（Ｃａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１－９１；ファゼオリン遺伝子（Ｍｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３：４７６－８２；Ｓｅｎｇｏｐｔａ－Ｇｏｐａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：３３２０－４）が挙げられる。米国特許第５，８３７，８７６号明細書、同第５，７５０，３８６号明細書、同第５，６３３，３６３号明細書、同第５，４５９，２５２号明細書、同第５，４０１，８３６号明細書、同第５，１１０，７３２号明細書、及び同第５，０２３，１７９号明細書も参照されたい。
【0374】
種子優先プロモーターには、種子発育中活性な種子特異的プロモーター、及び種子発芽中活性な種子発芽プロモーターの両方が含まれる。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １０：１０８を参照されたい。種子優先プロモーターとして、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導メッセージ）；ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）；及びｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール－１－リン酸合成酵素）；並びに例えば２０００年３月２日に公開された国際公開第２００００１１１７７号パンフレット及び米国特許第６，２２５，５２９号明細書で開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。双子葉植物用の種子優先プロモーターとして、インゲンマメ－β－ファセオリン、ナピン（ｎａｐｉｎ）、β－コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン、及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。単子葉植物用の種子優先プロモーターとして、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａガンマゼイン、ワクシー（ｗａｘｙ）、シュランケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）１、シュランケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）２、グロブリン１、オレオシン、及びｎｕｃ１が挙げられるが、これらに限定されない。２０００年３月９日に公開された国際公開第２００００１２７３３号パンフレットも参照されたい。この文献には、ＥＮＤ１及びＥＮＤ２遺伝子由来の種子優先プロモーターが開示されている。
【0375】
化学誘導性（調節）プロモーターを使用して、外因性の化学調節剤の適用によって原核及び真核細胞又は生物での遺伝子発現を調節し得る。このプロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモーター、又は化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学抑制性プロモーターであり得る。化学誘導性プロモーターとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２－２プロモーター（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８－７７）、発芽前除草剤として使用されている疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ－ＩＩ－２７、１９９３年１月２１日に公開された国際公開第１９９３００１２９４号パンフレット）、及びサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ－１ａプロモーター（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３－７）。他の化学調節プロモーターとして、ステロイド応答性プロモーター（例えば、グルココルチコイド誘導性プロモーター（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０４２１－５；ＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ １４：２４７－２５７を参照されたい）；テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９－３７；米国特許第５，８１４，６１８号明細書、及び同第５，７８９，１５６号明細書）が挙げられる。
【0376】
病原体の感染後に誘導される病原体誘導性プロモーターとして、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、ベータ－１，３－グルカナーゼ、キチナーゼ等の発現を調節するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0377】
ストレス誘導性プロモーターとして、ＲＤ２９Ａプロモーター（Ｋａｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２８７－９１）が挙げられる。当業者は、乾燥、浸透圧ストレス、塩ストレス、及び温度ストレス等のストレス条件をシミュレートするためのプロトコル、並びにシミュレートしたか又は天然に発生したストレス条件に置かれた植物のストレス耐性を評価するためのプロトコルに精通している。
【0378】
植物細胞に有用な誘導性プロモーターの別の例は、２０１３年１１月２１日に公開された米国特許出願公開第２０１３０３１２１３７号明細書で説明されているＺｍＣＡＳ１プロモーターである。
【0379】
植物細胞に有用な様々な種類の新規のプロモーターが絶えず発見されており、多くの例を、Ｏｋａｍｕｒｏ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ編集（１９８９）のＴｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１１５，Ｓｔｕｍｐｆ ａｎｄ Ｃｏｎｎ，ｅｄｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１－８２に見出し得る。
【0380】
新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム成分によるゲノムの改変
本明細書で説明されているように、誘導されたＣａｓエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識して結合し得、且つ一本鎖（ニック）又は二本鎖切断を導入し得る。一本鎖又は二本鎖切断がＤＮＡ内に導入されると、細胞のＤＮＡ修復機構は、この切断を修復するように活性化される。エラープローンＤＮＡ修復機構は、二本鎖切断部位で変異を作り出し得る。破損した末端を１つに結合させるための最も一般的な修復機構は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ５：１－１２）。染色体の構造的完全性は、典型的には、修復により維持されるが、欠失、挿入、又は他の再配列（例えば染色体転座）もあり得る（Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，２００２，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１１２１－３１；Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７５：２１－９）。
本明細書で説明されているように、誘導されたＣａｓエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識して結合し得、且つ一本鎖（ニック）又は二本鎖切断を導入し得る。一本鎖又は二本鎖切断がＤＮＡ内に導入されると、細胞のＤＮＡ修復機構は、この切断を修復するように活性化される。エラープローンＤＮＡ修復機構は、二本鎖切断部位で変異を作り出し得る。破損した末端を１つに結合させるための最も一般的な修復機構は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ５：１－１２）。染色体の構造的完全性は、典型的には、修復により維持されるが、欠失、挿入、又は他の再配列（例えば染色体転座）もあり得る（Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，２００２，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１１２１－３１；Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７５：２１－９）。
【0381】
ＤＮＡ二本鎖切断は、相同組換え経路を刺激するための効果的な因子であると思われる（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８：２８１－９２；Ｔｚｆｉｒａ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：５６７－９；Ｐｕｃｈｔａ，（２００５）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５６：１－１４）。ＤＮＡ切断剤を使用すると、植物において人工的に構築された相同ＤＮＡリピート間で相同組換えの２～９倍の増加が観察された（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８：２８１－９２）。トウモロコシのプロトプラストにおける線状ＤＮＡ分子による実験で、プラスミド間の相同組み換えの増進が示された（Ｌｙｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３０：２０９－１８）。
【0382】
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、細胞内の二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ切断を修復する機構である。相同組換え修復として、相同組換え（ＨＲ）及び一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）が挙げられる（Ｌｉｅｂｅｒ．２０１０ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：１８１－２１１）。ＨＤＲの最も一般的な形態は、ドナーＤＮＡとアクセプターＤＮＡとの間の最長配列相同性要件を有する相同組換え（ＨＲ）と呼ばれる。ＨＤＲの他の形態には、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）及び切断誘導性複製が含まれ、これらは、ＨＲと比較して短い配列相同性を必要とする。ニック（一本鎖切断）での相同組換え修復は、二本鎖切断に対するＨＤＲと異なる機構で起こり得る（Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｍａｉｚｅｌｓ．ＰＮＡＳ（００２７－８４２４），１１１（１０），ｐ．Ｅ９２４－Ｅ９３２）。
【0383】
例えば相同組換え（ＨＲ）による原核細胞及び真核生細胞又は生物細胞のゲノムの改変は、遺伝子操作の強力なツールである。相同組換えは、植物（Ｈａｌｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３１：１８６－９３）及び昆虫（Ｄｒａｙ ａｎｄ Ｇｌｏｏｒ，１９９７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４７：６８９－９９）において実証されている。相同組換えはまた、他の生物においても実施されてきた。例えば、寄生原虫であるリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）における相同組換えのために、少なくとも１５０～２００ｂｐの相同性が必要とされた（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ ａｎｄ Ｄｕｍａｓ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：４２７８－８６）。糸状菌であるアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）では、遺伝子置換えは５０ｂｐと少ない隣接相同性を用いて達成されている（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：ｅ９７）。標的化遺伝子置換えはまた、繊毛虫類であるテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）においても実証されている（Ｇａｅｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：５３９１－８）。哺乳動物では、相同組換えは、培養で増殖させ、形質転換し、選択し、マウス胚に導入し得る多能性胚性幹細胞株（ＥＳ）を使用してマウスにおいて最も成功している（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｙ ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．）。
【0384】
遺伝子ターゲティング
本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステムを、遺伝子ターゲティングに使用し得る。
本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステムを、遺伝子ターゲティングに使用し得る。
【0385】
一般に、ＤＮＡターゲティングを、好適なポリヌクレオチド成分と関連するＣａｓタンパク質により、細胞中の特定のポリヌクレオチド配列において一方又は両方の鎖を開裂することによって実施し得る。ＤＮＡ中に一本鎖又は二本鎖切断が誘導されると、細胞のＤＮＡ修復機構が活性化され、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＤＲ）プロセスによって切断が修復され、これにより標的部位が改変され得る。
【0386】
標的部位のＤＮＡ配列の長さは変動し得、例えば長さが少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３０個を超えるヌクレオチドである標的部位が含まれる。標的部位は、回文構造であり得、即ち、一方の鎖上の配列が相補鎖上で反対方向に同じものを読み取ることがさらに可能である。ニック／開裂部位は標的配列内に存在し得るか、又はニック／開裂は標的配列の外側に存在する可能性がある。別のバリエーションでは、開裂は、互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で起きて平滑末端切断を生じる可能性があり、又は他の場合には、切り込みがずれて、「粘着末端」とも呼ばれる一本鎖オーバーハング（５’オーバーハング又は３’オーバーハングであり得る）を生じさせる可能性がある。ゲノム標的部位の活性バリアントも使用し得る。そのような活性バリアントは、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はより高い配列同一性を含み得、この活性バリアントは生物学的活性を保持しており、従って、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより認識されて開裂され得る。
【0387】
エンドヌクレアーゼによる標的部位の一本鎖又は二本鎖切断を測定するためのアッセイは、当該技術分野で既知であり、一般には、認識部位を含むＤＮＡ基質への作用物質の全体的活性及び特異性を測定する。
【0388】
本明細書におけるターゲティング法を、例えば、この方法で２つ以上のＤＮＡ標的部位が標的化されるように実施し得る。そのような方法は、任意選択により、多重法として特徴付けられ得る。ある特定の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はより多い標的部位が同時に標的化され得る。多重法は、典型的には、複数の異なるＲＮＡ成分（そのそれぞれが、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を固有のＤＮＡ標的部位に誘導するように設計されている）が提供される、本明細書中のターゲティング法により実施される。
【0389】
遺伝子編集
ＤＳＢと改変鋳型とを組み合わせるゲノム配列の編集プロセスは、一般に、染色体配列中の標的配列を認識し、ゲノム配列にＤＳＢを導入し得るＤＳＢ誘導物質又はＤＳＢ誘導物質をコードする核酸、及び編集対象のヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの改変を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド改変鋳型を宿主細胞に導入することを含む。ポリヌクレオチド改変鋳型は、少なくとも１つのヌクレオチド改変部に隣接するするヌクレオチド配列をさらに含み得。この隣接する配列は、ＤＳＢに隣接する染色体領域に実質的に相同である。ＤＳＢ誘導物質（例えばＣａｓ－ｇＲＮＡ複合体）を使用するゲノム編集は、例えば、２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書、２０１５年２月２６日に公開された国際公開第２０１５０２６８８６号パンフレット、２０１６年１月１４日に公開された国際公開第２０１６００７３４７号パンフレット、及び２０１６年２月１８日に公開された国際公開第２０１６／０２５１３１号パンフレットで説明されている。
ＤＳＢと改変鋳型とを組み合わせるゲノム配列の編集プロセスは、一般に、染色体配列中の標的配列を認識し、ゲノム配列にＤＳＢを導入し得るＤＳＢ誘導物質又はＤＳＢ誘導物質をコードする核酸、及び編集対象のヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの改変を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド改変鋳型を宿主細胞に導入することを含む。ポリヌクレオチド改変鋳型は、少なくとも１つのヌクレオチド改変部に隣接するするヌクレオチド配列をさらに含み得。この隣接する配列は、ＤＳＢに隣接する染色体領域に実質的に相同である。ＤＳＢ誘導物質（例えばＣａｓ－ｇＲＮＡ複合体）を使用するゲノム編集は、例えば、２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書、２０１５年２月２６日に公開された国際公開第２０１５０２６８８６号パンフレット、２０１６年１月１４日に公開された国際公開第２０１６００７３４７号パンフレット、及び２０１６年２月１８日に公開された国際公開第２０１６／０２５１３１号パンフレットで説明されている。
【0390】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムのいくつかの使用が説明されており（例えば、２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８Ａ１号明細書、２０１５年２月２６日に公開された国際公開第２０１５０２６８８６号パンフレット、及び２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５００５９０１０号明細書を参照されたい）、これとして、目的のヌクレオチド配列（例えば調節エレメント）の改変又は置換、目的のポリヌクレオチドの挿入、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、スプライシング部位の改変、及び／又は代替スプライシング部位の導入、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変、アミノ酸及び／又はタンパク質の融合、並びに目的の遺伝子中に逆方向リピートを発現することによる遺伝子サイレンシングが挙げられるが、これらに限定されない。
【0391】
タンパク質を、アミノ酸の置換、欠失、トランケーション、及び挿入を含む様々な方法で改変し得る。そのような操作のための方法は、一般に既知である。例えば、タンパク質のアミノ酸配列バリアントを、ＤＮＡ内の変異により調製し得る。変異誘発法、及びヌクレオチド配列の改変として、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７－８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及びこれらで引用されている文献が挙げられる。タンパク質の生物学的活性に影響を与えそうにないアミノ酸置換についてのガイダンスは、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルで見出される。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換する等の保存的置換が好ましい場合がある。保存的な欠失、挿入、及びアミノ酸置換は、タンパク質の特性に過激な変化を引き起こさないことが期待されており、任意の置換、欠失、挿入、又はこれらの組み合わせの影響を、ルーチンのスクリーニング分析で評価し得る。二本鎖切断誘導活性についてのアッセイは既知であり、一般には、標的部位を含むＤＮＡ基質上の作用物質の全体的活性及び特異性を測定する。
【0392】
本明細書で説明されているのは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、並びにＣａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドを含む複合体を用いたゲノム編集方法である。ガイドＲＮＡ及びＰＡＭ配列の特徴付けに続いて、エンドヌクレアーゼ及び関連するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の成分を、植物を含む他の生物において染色体ＤＮＡを改変するために利用し得る。最適な発現及び核局在化（真核細胞の場合）を容易にするために、この複合体を含む遺伝子は、２０１６年１１月２４日に公開された国際公開第２０１６１８６９５３号パンフレットで説明されている通りに最適化され得、次いで当該技術分野で既知の方法によってＤＮＡ発現カセットとして細胞に送達され得る。活性複合体を含むために必要な成分は、ＲＮＡを分解から保護する改変を伴うか若しくは伴わないＲＮＡとしても送達され得るか、又はキャップされたか若しくはキャップされていないｍＲＮＡとしても送達され得るか、（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１２６１７）、又はＣａｓタンパク質ガイドポリヌクレオチド複合体としても送達され得るか、（２０１７年４月２７日に公開された国際公開第２０１７０７００３２号パンフレット）、又はこれらの任意の組み合わせとしても送達され得る。加えて、複合体の一部又は複数の部分、及びｃｒＲＮＡを、ＤＮＡコンストラクトから発現させ得、一方、他の成分は、ＲＮＡを分解から保護する改変を伴うか又は伴わないＲＮＡとして送達され、又はキャップされたか若しくはキャップされていないｍＲＮＡとして送達され（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１２６１７）、又はＣａｓタンパク質ガイドポリヌクレオチド複合体として送達され（２０１７年４月２７日に公開された国際公開第２０１７０７００３２号パンフレット）、又はこれらの任意の組み合わせとして送達される。ｃｒＲＮＡをインビボで生成するために、例えば、２０１７年６月２２日に公開された国際公開第２０１７１０５９９１号明細書で説明されているように、ｔＲＮＡ由来エレメントを使用して、ｃｒＲＮＡ転写産物をそのＤＮＡ標的部位に複合体を誘導し得る成熟形態に開裂するために内在性ＲＮＡｓｅも動員し得る。ニッカーゼ複合体を個別に又は協調して使用して、ＤＮＡ鎖の一方又は両方に単一又は複数のＤＮＡニックを生成し得る。さらに、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの開裂活性を、その開裂ドメイン中の重要な触媒残基を改変することによって不活性化させ得（Ｓｉｎｋｕｎａｓ，Ｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＥＭＢＯ Ｊ．３２：３８５－３９４）、その結果、相同組換え修復を増強するか、転写活性化を誘導するか、又はＤＮＡ局部構造を再構築するために使用され得るＲＮＡ誘導ヘリカーゼが生じる。さらに、Ｃａｓ開裂ドメイン及びヘリカーゼドメインの活性を、両方ともノックアウトし得、且つ他のＤＮＡ切断、ＤＮＡニッキング、ＤＮＡ結合、転写活性化、転写抑制、ＤＮＡ再構築、ＤＮＡ脱アミノ化、ＤＮＡのほどき、ＤＮＡ組換え増強、ＤＮＡ組込み、ＤＮＡ逆位、及びＤＮＡ修復剤と組み合わせて使用し得る。
【0393】
ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮＡ（存在する場合）及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの他の成分（例えば、可変ターゲティングドメイン、ｃｒＲＮＡリピート、ループ、抗リピート）の転写方向を、２０１６年１１月２４日に公開された国際公開第２０１６１８６９４６号パンフレット、及び２０１６年１１月２４日に公開された国際公開第２０１６１８６９５３号パンフレットで説明されているように推定し得る。
【0394】
本明細書で説明されているように、適切なガイドＲＮＡ要件が確立されると、本明細書で開示されている新規の各システムについてのＰＡＭ優先度を調べ得る。開裂複合体がランダム化ＰＡＭライブラリーの分解をもたらす場合には、重要な残基の変異誘発により、又は既に説明されているようにＡＴＰの非存在下で反応を組み立てることにより（Ｓｉｎｋｕｎａｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＥＭＢＯ Ｊ．３２：３８５－３９４）、ＡＴＰａｓｅ依存性ヘリカーゼ活性を無効にすることによって複合体をニッカーゼに変換することができる。２つのプロトスペーサー標的によって分離されたＰＡＭランダム化の２つの領域を利用して二本鎖ＤＮＡ切断を生成し得、これを捕捉して配列決定して、それぞれの複合体による開裂を支持するＰＡＭ配列を調べ得る。
【0395】
一実施形態では、本発明は、細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、本明細書で説明されている少なくとも１つのＰＧＥＮを細胞に導入すること、及び前記標的で改変を有する少なくとも１つの細胞を同定することを含み、前記標的部位での改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置き換え、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの化学的改変、及び（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせからなる群から選択される、方法を説明する。
【0396】
編集されるヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識されて開裂される標的部位内又はその外に位置し得る。一実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチド改変は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより認識されて開裂される標的部位での改変ではない。別の実地形態では、編集される少なくとも１つのヌクレオチドとゲノム標的部位との間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、９００、又は１０００個のヌクレオチドが存在する。
【0397】
ノックアウトは、インデル（ＮＨＥＪによる標的ＤＮＡ配列中のヌクレオチド塩基の挿入若しくは欠失）により生じ得るか、又は標的部位での若しくはその近傍の配列の機能を低下させるか若しくは完全に喪失させる配列の特異的除去により生じ得る。
【0398】
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ誘導標的化変異は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識されて開裂されるゲノム標的部位の内又は外に位置するヌクレオチド配列内で発生し得る。
【0399】
細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を編集する方法は、非機能性遺伝子産物の機能を回復させることにより、外因性選択マーカーを使用しない方法であり得る。
【0400】
一実施形態では、本発明は、細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、本明細書で説明されている少なくとも１つのＰＧＥＮ、及び少なくとも１つのドナーＤＮＡを細胞に導入することであり、前記ドナーＤＮＡは、目的のポリヌクレオチドを含む、導入することを含み、任意選択的に、前記標的部位又はその近傍に前記目的のポリヌクレオチドが組み込まれた少なくとも１つの細胞を同定することをさらに含む方法を説明する。
【0401】
一態様では、本明細書で開示されている方法は、標的部位で目的のポリヌクレオチドの組み込みを提供するために、相同組換え（ＨＲ）を使用し得る。
【0402】
本明細書で説明されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム成分の活性により、標的部位に挿入された目的のポリヌクレオチドを有する細胞又は生物を生成するために、種々の方法及び組成物が使用され得る。本明細書で説明されている１つの方法では、目的のポリヌクレオチドは、ドナーＤＮＡコンストラクトによって生物細胞に導入される。本明細書で使用される場合、「ドナーＤＮＡ」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位内に挿入される目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトである。ドナーＤＮＡコンストラクトは、目的のポリヌクレオチドに隣接する第１及び第２の相同領域をさらに含む。ドナーＤＮＡの第１及び第２の相同領域は、細胞又は生物のゲノムの標的部位中に存在するか又はこの標的部位に隣接する第１及び第２のゲノム領域に対し相同性をそれぞれ共有する。
【0403】
ドナーＤＮＡを、ガイドポリヌクレオチドに繋留させ得る。繋留されたドナーＤＮＡは、ゲノムの編集、遺伝子の挿入、及び標的ゲノムの調節で有用な標的及びドナーＤＮＡの共局在化を可能にし得、且つ内在性ＨＲ機構の機能が大きく低下していると予想される有糸分裂終細胞のターゲティングでも有用であり得る（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．１０：９５７－９６３）。
【0404】
標的及びドナーポリヌクレオチドによって共有される相同性又は配列同一性の量は、変動し得、約１～２０ｂｐ、２０～５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、７５～１５０ｂｐ、１００～２５０ｂｐ、１５０～３００ｂｐ、２００～４００ｂｐ、２５０～５００ｂｐ、３００～６００ｂｐ、３５０～７５０ｂｐ、４００～８００ｂｐ、４５０～９００ｂｐ、５００～１，０００ｂｐ、６００～１，２５０ｂｐ、７００～１，５００ｂｐ、８００～１，７５０ｂｐ、９００～２，０００ｂｐ、１～２．５ｋｂ、１．５～３ｋｂ、２～４ｋｂ、２．５～５ｋｂ、３～６ｋｂ、３．５～７ｋｂ、４～８ｋｂ、５～１０ｋｂ、又は標的部位の全長以下の範囲内の単位整数値を有する全長及び／又は領域を含む。これらの範囲には、この範囲内の全ての整数が含まれており、例えば、１～２０ｂｐの範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０ｂｐが含まれる。相同性の量を、２種のポリヌクレオチドの完全にアラインされた長さ全体にわたる配列同一性パーセントでも説明し得、これには、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性パーセントが含まれる。十分な相同性は、ポリヌクレオチドの長さと、全体的な配列同一性パーセントと、任意選択的な連続したヌクレオチドの保存領域又は局所的な配列同一性パーセントとの任意の組み合わせを含み、例えば、十分な相同性を、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する７５～１５０ｂｐの領域と説明し得る。十分な相同性をまた、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする２つのポリヌクレオチドの予測能力によって説明し得、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；及びＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【0405】
エピソームＤＮＡ分子をまた、二本鎖切断内にライゲートし得、例えば、染色体二本鎖切断内にＴ－ＤＮＡを組み込み得る（Ｃｈｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｑｕｅ，（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３３：９５６－６５；Ｓａｌｏｍｏｎ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ １７：６０８６－９５）。二本鎖切断の周囲の配列が、例えば、二本鎖切断の成熟に関係するエキソヌクレアーゼ活性によって改変されると、遺伝子変換経路は、例えば、非分割性体細胞中の相同染色体又はＤＮＡ複製後の姉妹染色分体等の相同配列を利用できる場合には、原初の構造を取り戻し得る（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：３４２－５２）。異所性及び／又は後成的ＤＮＡ配列も相同組換えのためのＤＮＡ修復鋳型として機能し得る（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１１７３－８１）。
【0406】
一実施形態では、本開示は、細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を編集する方法であって、本明細書で説明されている少なくとも１つのＰＧＥＮ、及びポリヌクレオチド改変鋳型を細胞に導入することであり、前記ポリヌクレオチド改変鋳型は、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む、導入することを含み、任意選択的に、編集されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの細胞を選択することをさらに含む方法を含む。
【0407】
本ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを少なくとも１種のポリヌクレオチド改変鋳型と組み合わせて
使用して、目的のゲノムヌクレオチド配列の編集（改変）を可能にし得る。（２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書及び２０１５年２月２６日に公開された国際公開第２０１５０２６８８６号パンフレットも参照されたい）。
使用して、目的のゲノムヌクレオチド配列の編集（改変）を可能にし得る。（２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書及び２０１５年２月２６日に公開された国際公開第２０１５０２６８８６号パンフレットも参照されたい）。
【0408】
目的のポリヌクレオチド及び／又は形質は、２０１２年９月２７日に公開された国際公開第２０１２１２９３７３号パンフレット及び２０１３年８月１日に公開された国際公開第２０１３１１２６８６号パンフレットで説明されているような複合形質遺伝子座に一緒に積み重ねられ得る。本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼシステムは、二本鎖切断を効率よく生成するシステムを提供し、複合形質遺伝子座における形質の積み重ねを可能にする。
【0409】
遺伝子ターゲティングを媒介する、本明細書で説明されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステムを、異種遺伝子挿入を誘導する方法及び／又は複数の異種遺伝子を含む複合形質遺伝子座を生成する方法において、２０１２年９月２７日に公開された国際公開第２０１２１２９３７３号パンフレットで開示されているのと同様の方法で使用し得、この方法では、目的の遺伝子を導入するための二本鎖切断誘発剤の使用に代えて、本明細書で開示されているガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステムが使用される。独立した導入遺伝子を、互いに０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、２、又は５センチモルガン（ｃＭ）以内に挿入することにより、単一の遺伝子座として導入遺伝子を繁殖させ得る（例えば、２０１３年１０月３日に公開された米国特許出願公開第２０１３０２６３３２４号明細書又は２０１３年３月１４日に公開された国際公開第２０１２１２９３７３号パンフレットを参照されたい）。導入遺伝子を含む植物を選択した後、（少なくとも）１つの導入遺伝子を含む植物を交雑させて、両導入遺伝子を含むＦ１を形成し得る。これらのＦ１（Ｆ２又はＢＣ１）からの子孫のうち、１／５００の子孫は、同一の染色体上に組み換えられた２つの異なる導入遺伝子を有するであろう。その後、複雑な遺伝子座を、単一遺伝子座として両導入形質と共に繁殖させ得る。この過程は繰り返して、所望する形質を幾らでも積み上げ得る。
【0410】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムのさらなる使用が説明されており（例えば、２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書、２０１５年２月２６日に公開された国際公開第２０１５０２６８８６号パンフレット、２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５００５９０１０号明細書、２０１６年１月１４日に公開された国際公開第２０１６００７３４７号パンフレット、及び２０１６年２月１８日に公開されたＰＣＴ出願の国際公開第２０１６０２５１３１号パンフレットを参照されたい）、これとして、目的のヌクレオチド配列（例えば調節エレメント）の改変又は置換、目的のポリヌクレオチドの挿入、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、スプライシング部位の改変、及び／又は代替スプライシング部位の導入、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変、アミノ酸及び／又はタンパク質の融合、並びに目的の遺伝子中に逆方向リピートを発現することによる遺伝子サイレンシングが挙げられるが、これらに限定されない。
【0411】
本明細書で説明されている遺伝子編集組成物及び方法から得られる特徴を評価し得る。目的の表現型又は形質と相関する染色体間隔を同定することができる。染色体間隔を同定するために、当該技術分野で公知の様々な方法が利用可能である。そのような染色体間隔の境界は、目的の形質を制御する遺伝子に連結されるであろうマーカーを包含すると描出される。換言すると、染色体間隔は、その間隔（間隔の境界を定義す末端マーカーを含む）内に存在する任意のマーカーが特定の形質のマーカーとして使用され得るように決められる。一実施形態では、染色体間隔は、少なくとも１つのＱＴＬを含み、さらには、実際複数のＱＴＬを含み得る。同じ間隔内に複数のＱＴＬが非常に近接していると、１つのマーカーが複数のＱＴＬと連結するので、特定のマーカーの特定のＱＴＬとの関連が不明確になる場合がある。逆に、例えば、非常に近接している２つのマーカーが所望の表現型形質と共分離している場合には、これらのマーカーのそれぞれが同じＱＴＬ又は２つの異なるＱＴＬを特定しているのかどうか、しばしば不明確になる。「量的形質遺伝子座」又は「ＱＴＬ」という用語は、少なくとも１つの遺伝的背景（例えば、少なくとも１つの育種集団）中における量的表現型形質の発現差異に関連するＤＮＡの領域を指す。ＱＴＬ領域は、問題の形質に影響する遺伝子を包含するか、又はこの遺伝子と緊密に関連している。「ＱＴＬのアレル」は、ハプロタイプ等の連続したゲノム領域内又は連鎖群内に、複数の遺伝子又は他の遺伝因子を含み得る。ＱＴＬのアレルは、特定のウィンドウ内のハプロタイプを示し得、前記ウィンドウは、１つ又は複数の多型マーカーのセットで定義され得、且つ追跡され得る連続したゲノム領域である。ハプロタイプを、特定のウィンドウ内の各マーカーで、アレルの固有の指紋によって定義し得る。
【0412】
細胞へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム成分の導入
本明細書で説明されている方法及び組成物は、生物又は細胞に配列を導入する特定の方法に依存せず、この生物の少なくとも１つの細胞の内部にポリヌクレオチド又はポリペプチドを侵入させるのみである。導入には、核酸が細胞のゲノム内に組み込まれ得る、真核細胞又は原核細胞内への核酸の組込みに関する言及が含まれ、且つ核酸、タンパク質、又はポリヌクレオチド－タンパク質複合体（ＰＧＥＮ、ＲＧＥＮ）の細胞への一過性（直接）提供への言及が含まれる。
本明細書で説明されている方法及び組成物は、生物又は細胞に配列を導入する特定の方法に依存せず、この生物の少なくとも１つの細胞の内部にポリヌクレオチド又はポリペプチドを侵入させるのみである。導入には、核酸が細胞のゲノム内に組み込まれ得る、真核細胞又は原核細胞内への核酸の組込みに関する言及が含まれ、且つ核酸、タンパク質、又はポリヌクレオチド－タンパク質複合体（ＰＧＥＮ、ＲＧＥＮ）の細胞への一過性（直接）提供への言及が含まれる。
【0413】
ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又はポリヌクレオチド－タンパク質複合体を細胞又は生物に導入する方法は、当該技術分野で既知であり、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、安定形質転換法、一過性形質転換法、弾道粒子加速法（粒子衝撃法）、ウィスカー媒介形質転換、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、直接遺伝子導入、ウイルス媒介導入、トランスフェクション、形質導入、細胞透過性ペプチド、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介直接タンパク質送達、局所適用、有性交雑、有性繁殖、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0414】
例えば、ガイドポリヌクレオチド（ガイドＲＮＡ、ｃｒヌクレオチド＋ｔｒａｃｒヌクレオチド、ガイドＤＮＡ及び／又はガイドＲＮＡ－ＤＮＡ分子）は、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチド分子として細胞に直接（一過性に）導入され得る。ガイドＲＮＡ（又はｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）をまた、細胞内に、前記細胞内でガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）を転写し得る特定のプロモーターに作動可能に連結された、ガイドＲＮＡ（又はｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする異種核酸断片を含む組換えＤＮＡ分子を導入することによって間接的に導入し得る。特定のプロモーターは、限定はされないが、厳密に定義され、改変されていない５’末端及び３’末端を有するＲＮＡの転写を可能にする、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり得る（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１６１；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：４３３６－４３４３；２０１５年２月２６日に公開された国際公開第２０１５０２６８８７号パンフレット）。細胞内でガイドＲＮＡを転写し得る任意のプロモーターを使用し得、このプロモーターとして、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された熱ショック／熱誘導性プロモーターが挙げられる。
【0415】
植物細胞は、動物細胞（例えばヒト細胞）、真菌細胞（例えば酵母細胞）、及びプロトプラストと異なり、例えば、植物細胞は、成分の送達に障壁として作用し得る植物細胞壁を含む。
【0416】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及び／又はガイドＲＮＡ、及び／又はリボ核タンパク質複合体、及び／又は前述のいずれか１つ若しくは複数をコードするポリヌクレオチドの植物細胞への送達を、当該技術分野で既知の方法により達成し得、この方法として下記が挙げられるが、これらに限定されない：リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）媒介形質転換（例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ））、粒子媒介送達法（粒子衝撃法）、（例えば、プロトプラストへの）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞透過性ペプチド、又はメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介直接タンパク質送達。
【0417】
本明細書で説明されているＣａｓエンドヌクレアーゼ等のＣａｓエンドヌクレアーゼを、Ｃａｓポリペプチド自体（Ｃａｓエンドヌクレアーゼの直接送達と呼ばれる）、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及び／又はガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体自体を当該技術分野で既知の任意の方法を使用して直接導入することにより、細胞に導入し得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼをまた、このＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする組換えＤＮＡ分子を導入することによって間接的に細胞に導入し得る。エンドヌクレアーゼを、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、細胞に一過性で導入し得るか、又は宿主細胞のゲノムに組み込み得る。エンドヌクレアーゼ及び／又は誘導ポリヌクレオチドの細胞への取り込みを、２０１６年５月１２日に公開された国際公開第２０１６０７３４３３号パンフレットで説明されているような細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いて促進し得る。細胞内でＣａｓエンドヌクレアーゼを発現し得る任意のプロモーターを使用し得、このプロモーターとして、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された熱ショック／熱誘導性プロモーターが挙げられる。
【0418】
ポリヌクレオチド改変鋳型の植物細胞への直接送達を、粒子媒介送達によって達成し得、限定されないが、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介トランスフェクション、ウィスカー媒介形質転換、エレクトロポレーション、粒子衝撃法、細胞透過性ペプチド、又はメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介直接タンパク質送達等の他の任意の直接送達法を、植物細胞等の真核細胞におけるポリヌクレオチド改変鋳型の送達に問題なく使用し得る。
【0419】
ドナーＤＮＡを、当該技術分野で既知の任意の手段によって導入し得る。ドナーＤＮＡを、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換又はバイオリスティック粒子衝突法を含む当該技術分野で既知の任意の形質転換法によって提供し得る。ドナーＤＮＡは、細胞内で一過性で存在し得るか、又はウイルスレプリコンを介して導入される可能性がある。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及び標的部位の存在下において、ドナーＤＮＡは、形質転換された植物ゲノムに挿入される。
【0420】
誘導型Ｃａｓシステム成分の任意の１つの直接送達は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体成分を受容する細胞の富化及び／又は可視化を促進し得る他のｍＲＮＡの直接送達（共送達）を伴い得る。例えば、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ成分（及び／又はガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体自体）を、表現型マーカー（例えば、限定されないが、ＣＲＣ（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １２：６５－７９）等の転写活性化因子）をコードするｍＲＮＡと一緒に直接共送達することにより、２０１７年４月２７日に公開された国際公開第２０１７０７００３２号パンフレットで説明されているように非機能性遺伝子産物の機能が回復することによって、外因性選択マーカーを使用することなく細胞の選択及び濃縮を可能にし得る。
【0421】
本明細書で説明されているガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（本明細書で説明されている開裂準備完了複合体を表す）の細胞への導入には、前記複合体の個々の成分を別々に又はまとめて細胞に導入すること、並びに直接（ガイドのためのＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼのためのタンパク質及びタンパク質サブユニット、又はこれらの機能的断片として直接送達）又は成分を発現する組換えコンストラクト（ガイドＲＮＡ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、タンパク質サブユニット又はこれらの機能的断片）によって導入することが含まれる。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮ）の細胞への導入には、リボヌクレオチド－タンパク質としてガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を細胞に導入することが含まれる。このリボヌクレオチド－タンパク質を、本明細書で説明されているように、細胞に導入する前に組み立て得る。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼリボヌクレオチドタンパク質を構成する成分（少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、少なくとも１つのタンパク質サブユニット）を、インビトロで又は細胞（本明細書で説明されているようなゲノム改変の標的とされる）に導入される前に、当該技術分野で既知の任意の手段によって組み立て得る。
【0422】
ＲＧＥＮリボ核タンパク質の直接送達は、その後、複合体が急速に分解し、細胞内での複合体の存在が一時的となるような形での、細胞ゲノムの標的部位におけるゲノム編集を可能にする。このＲＧＥＮ複合体の一時的存在は、オフターゲット効果を減少させることに繋がり得る。対照的に、プラスミドＤＮＡ配列によるＲＧＥＮ成分（ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）の送達は、これらのプラスミドからのＲＧＥＮの持続的な発現をもたらし得、これはオフターゲット効果を増大させ得る（Ｃｒａｄｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：９５８４－９５９２；Ｆｕ，Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８２２－８２６）。
【0423】
直接送達を、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮ）（本明細書で説明されている開裂準備完了複合体を表す）の任意の１つの成分（例えば、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、少なくとも１つのＣａｓタンパク質、及び任意選択的な１つのさらなるタンパク質）を、微粒子（例えば、限定されないが、金粒子、タングステン粒子、及び炭化ケイ素ウィスカー粒子）を含む送達マトリックスと組み合わせることによって達成し得る（２０１７年４月２７日に公開された国際公開第２０１７０７００３２号パンフレットも参照されたい）。この送達マトリックスは、成分の任意の１つ、例えばＣａｓエンドヌクレアーゼを含み得、これは、固体マトリックス（例えば、衝撃用粒子）に付着している。
【0424】
一態様では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成するガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質がそれぞれＲＮＡ及びタンパク質として細胞に導入される複合体である。
【0425】
一態様では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成するガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質並びに複合体の少なくとも１つのタンパク質サブユニットがそれぞれＲＮＡ及びタンパク質として細胞に導入される複合体である。
【0426】
一態様では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体（開裂準備完了複合体）を形成するガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質並びに複合体の少なくとも１つのタンパク質サブユニットがインビトロで予め組み立てられ、リボヌクレオチド－タンパク質複合体として細胞に導入される複合体である。
【0427】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はポリヌクレオチド－タンパク質複合体（ＰＧＥＮ、ＲＧＥＮ）を、植物又は植物細胞等の真核細胞に導入するためのプロトコルは既知であり、下記が挙げられる：マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０－３４及び米国特許第６，３００，５４３号明細書）、分裂組織形質転換（米国特許第５，７３６，３６９号明細書）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２－６、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号明細書及び同第５，９８１，８４０号明細書）、ウィスカー媒介形質転換（Ａｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １１：１１２６－１１３４；Ｓｈａｈｅｅｎ Ａ．ａｎｄ Ｍ．Ａｒｓｈａｄ ２０１１ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ（２０１１），３４５－３５８ Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒｏｓａｒｉｏ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：ＩｎＴｅｃｈ、Ｒｉｊｅｋａ、Ｃｒｏａｔｉａ．ＣＯＤＥＮ：６９ＰＱＢＰ；ＩＳＢＮ：９７８－９５３－３０７－２０１－２）、直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７１７－２２）、及び弾道粒子加速法（米国特許第４，９４５，０５０号明細書；同第５，８７９，９１８号明細書；同第５，８８６，２４４号明細書；同第５，９３２，７８２号明細書；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）“Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ” ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ＆Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－６；Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２２：４２１－７７；Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７－３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８７：６７１－４（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ ａｎｄ ＭｃＭｕｌｌｅｎ，（１９９１）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２７Ｐ：１７５－８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９６：３１９－２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６－４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５－９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９－６３（トウモロコシ）；米国特許第５，２４０，８５５号明細書；同第５，３２２，７８３号明細書、及び同第５，３２４，６４６号明細書；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９１：４４０－４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３－９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ－Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１１：７６３－４；米国特許第５，７３６，３６９号明細書（穀草類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５３４５－９（ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ））；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ，（１９８５）ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７－２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ９：４１５－８）、及びＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８４：５６０－６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５－５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １２：２５０－５；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７－１３（イネ）、並びにＯｓｊｏｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：７４５－５０（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）経由トウモロコシ）。
【0428】
或いは、ポリヌクレオチドを、細胞又は生物をウイルス又はウイルス核酸と接触させることにより植物又は植物細胞内に導入し得る。一般に、そうした方法は、ポリヌクレオチドをウイルス性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に組み込むことを含む。一部の例では、目的のポリペプチドを、最初、ウイルス性ポリタンパク質の一部として合成し得、これは、後でインビボ又はインビトロのタンパク質分解処理を受けて、所望の組み換えタンパク質が生成される。ウイルス性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、ポリヌクレオチドを植物に導入し、そこにコードされているタンパク質を発現させる方法は既知であり、例えば、米国特許第５，８８９，１９１号明細書、同第５，８８９，１９０号明細書、同第５，８６６，７８５号明細書、同第５，５８９，３６７号明細書、及び同第５，３１６，９３１号明細書を参照されたい。
【0429】
ポリヌクレオチド又は組換えＤＮＡコンストラクトを、種々の一過性形質転換法を使用して、原核及び真核細胞又は生物に提供し得るか、又は導入し得る。そのような一過性形質転換法として、植物へのポリヌクレオチドコンストラクトの直接導入が挙げられるが、これに限定されない。
【0430】
誘導型Ｃａｓシステムのいずれかの又は全ての成分（タンパク質及び／又は核酸）の取り込みを容易にする分子（例えば、細胞透過性ペプチド及びナノキャリア）を使用する方法を含む任意の方法で、核酸及びタンパク質を細胞に提供し得る。２０１１年２月１０日に公開された米国特許出願公開第２０１１００３５８３６号明細書及び２０１５年１月７日に公開された欧州特許出願公開第２８２１４８６Ａ１号明細書も参照されたい。
【0431】
原核細胞及び真核細胞若しくは生物又は植物部分にポリヌクレオチドを導入する他の方法（例えば、プラスチド形質転換法及び実生又は成熟種子から組織にポリヌクレオチドを導入する方法）を使用し得る。
【0432】
安定形質転換は、生物に導入されたヌクレオチドコンストラクトが生物のゲノムに組み込まれ、その子孫に受け継がれ得ることを意味することが意図されている。一過性形質転換は、ポリヌクレオチドが生物に導入されるが、この生物のゲノムに組み込まれないか、又はポリペプチドが生物に導入されることを意味することが意図されている。一過性形質転換は、導入された組成物が生物内で一時的にのみ発現されるか又は存在することを示す。
【0433】
スクリーニングマーカー表現型を使用することなく標的部位に又は標的部位の近くで改変ゲノムを有する細胞を同定するために、様々な方法を利用し得る。そのような方法を、ＰＣＲ法、シークエンシング法、ヌクレアーゼ消化、サザンブロット、及びこれらの任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない、標的配列内の何らかの変化を検出するために標的配列を直接的に分析することであると見なし得る。
【0434】
細胞及び植物
本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドを、細胞に導入し得る。細胞として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト、非ヒト、動物、哺乳動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母、及び植物細胞、並びに本明細書で説明されている方法によって作製された植物及び種子。単子葉植物及び双子葉植物並びに植物要素を含む任意の植物を、本明細書で説明されている組成物及び方法と共に使用し得る。
本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドを、細胞に導入し得る。細胞として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト、非ヒト、動物、哺乳動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母、及び植物細胞、並びに本明細書で説明されている方法によって作製された植物及び種子。単子葉植物及び双子葉植物並びに植物要素を含む任意の植物を、本明細書で説明されている組成物及び方法と共に使用し得る。
【0435】
使用可能な単子葉植物の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：トウモロコシ（ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ））、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、ヒエ（例えば、トウジンビエ（ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）））、キビ（パニクム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、コムギ（コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）の種、例えば、トリティクム・アエスティバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリティクム・モノコクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ））、サトウキビ（サッカルム属の種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．））、カラスムギ（アヴィーナ属（Ａｖｅｎａ））、オオムギ（ホルデウム属（Ｈｏｒｄｅｕｍ））、スイッチグラス（パニクム・ヴィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、バナナ（ムサ属の種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．））、ヤシ、観賞植物、芝草、及び他の草。
【0436】
使用可能な双子葉植物の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種（例えば、限定はされないが、アブラナ又はキャノーラ）（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、Ｂ．カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ブラシカ・ジュンケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ．ｊｕｎｃｅａ））、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））、アラビドプシス（アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、ヒマワリ（ヘリアントゥス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ワタ（ゴシピウム・アルボレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ）、ゴシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ））、及びラッカセイ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ））、トマト（ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、ジャガイモ（ソラナム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）。
【0437】
使用可能なさらなる植物として、下記が挙げられる：ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））、サツマイモ（イポモエア・バタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ））、キャッサバ（マニホット・エスキュレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、コーヒー（コフィア属（Ｃｏｆｆｅａ）種）、ココナッツ（ココス・ヌキフェラ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ））、カンキツ樹（ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）種）、ココア（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ））、チャノキ（カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（ムサ属（Ｍｕｓａ）種）、アボカド（ペルセア・アメリカーナ（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））、イチジク（フィークス・カシカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ））、グアバ（シジウム・グアジャバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オレア・エウロパエ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ））、パパイア（カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ））、カシュー（アナカルジウム・オクシデンタレ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ））、マカデミア（マカダミア・インテグリフォリア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、アーモンド（プルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ））、サトウダイコン（ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、野菜類、観賞植物、及び針葉樹。
【0438】
使用可能な野菜類として、下記が挙げられる：トマト（トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、レタス（例えば、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ））、サヤマメ（インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、ライマメ（ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ））、エンドウマメ（レンリソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）種）、並びにキュウリ（キュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ））、カンタロープ（Ｃ．カンタルペンシス（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ））及びマスクメロン（Ｃ．メロ（Ｃ．ｍｅｌｏ））等のキュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）のメンバー。観賞植物として、下記が挙げられる：アザレア（ツツジ属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）種）、アジサイ（アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（ブッソウゲ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ））、バラ（バラ属（Ｒｏｓａ）種）、チューリップ（チューリップ属（Ｔｕｌｉｐａ）種）、ラッパズイセン（スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）種）、ペチュニア（ツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ））、カーネーション（カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ））、ポインセチア（ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ））、及びキク。
【0439】
使用可能な針葉樹として、下記が挙げられる：マツ、例えば、テーダマツ（ピヌス・タエダ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ））、スラッシュパイン（ピヌス・エリオッティ（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ））、ポンデローサマツ（ピヌス・ポンデローサ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ））、ロッジポールパイン（ピヌス・コントルタ（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ））、及びモントレーマツ（ピヌス・ラジアータ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ））；ダグラスモミ（シュードツガ・メンジエシイ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））；アメリカツガ（ツガ・カナデンシス（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））；ベイトウヒ（ピケア・グラウカ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ））；アメリカスギ（セコイアセンペルビレンズ（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ））；トドマツ、例えば、ヨーロッパモミ（アビエス・アマビリス（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ））及びバルサムモミ（アビエス・バルサメア（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ））；並びにヒマラヤスギ、例えば、ベイスギ（ツヤ・プリカータ（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ））及びアラスカイエローシーダー（カマエキパリス・ノットカテンシス（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））。
【0440】
本開示のある特定の実施形態では、稔性植物は、生存可能な雄性及び雌性配偶子を生み出す植物であり、自家稔性植物である。そのような自家稔性植物は、他の植物の配偶子及びこれに含まれる遺伝的材料の貢献によらずに子孫植物を作り得る。本開示の他の実施形態は、植物が生存可能な又はそうでなければ受精可能な雄性配偶子若しくは雌性配偶子又は両方を作らないことから、自家稔性でない植物の使用を伴い得る。
【0441】
本開示は、１種又は複数種の導入された形質又は編集されたゲノムを含む植物の育種での使用を見出す。
【0442】
２種の形質を、例えば互いから５ｃＭの遺伝距離でゲノムにどのようにして積み重ね得るかの非限定的な例は、下記のように説明される：ゲノムウインドウ内の第１のＤＳＢ標的部位に組み込まれた第１のトランスジェニック標的部位を含み、且つ第１の目的のゲノム遺伝子座を有していない第１の植物を、ゲノムウインドウ内の異なるゲノム挿入部位で目的のゲノム遺伝子座を含む第２のトランスジェニック植物に交配させ、第２の植物は、第１のトランスジェニック標的部位を含まない。この交配からの植物子孫の約５％は、第１のＤＳＢ標的部位に組み込まれた第１のトランスジェニック標的部位、及びゲノムウインドウ内の異なるゲノム挿入部位に組み込まれた第１の目的のゲノム遺伝子座の両方を有する。規定されたゲノムウインドウ内に両方の部位を有する子孫植物を、第２のＤＳＢ標的部位に組み込まれた第２のトランスジェニック標的部位及び／又は規定されたゲノムウインドウ内に第２の目的のゲノム遺伝子座を含み、且つ第１のトランスジェニック標的部位及び第１の目的のゲノム遺伝子座を欠いている第３のトランスジェニック植物とさらに交配させ得る。この後、第１のトランスジェニック標的部位、第１の目的のゲノム遺伝子座、及びゲノムウインドウ内の異なるゲノム挿入部位に組み込まれた第２の目的のゲノム遺伝子座を有する子孫を選択する。そのような方法を使用して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１個、又はより多い、ＤＳＢ対象部位に組み込まれたトランスジェニック標的部位、及び／又はゲノムウインドウ内の異なる部位に組み込まれた目的のゲノム遺伝子座を有する複合形質遺伝子座を含むトランスジェニック植物を作り得る。このようにして、様々な複合形質遺伝子座を生成し得る。
【0443】
細胞及び動物
本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、動物細胞に導入し得る。動物細胞として下記が挙げられるが、これらに限定されない：脊索動物、節足動物、軟体動物、環形動物、刺胞動物、若しくは棘皮動物を含む門の生物；又は哺乳動物、昆虫、鳥類、両生類、爬虫類、若しくは魚類を含む綱の生物。一部の態様では、動物は、ヒト、マウス、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ラット、ショウジョウバエ（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）種）、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ミナミメダカ、ウミヤツメ、フグ、アマガエル（例えば、ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）種）、サル、又はチンパンジーである。企図される特定の細胞種として、下記が挙げられる：単数体細胞、二倍体細胞、生殖細胞、ニューロン、筋肉細胞、内分泌又は外分泌細胞、上皮細胞、筋肉細胞、腫瘍細胞、胚細胞、造血細胞、骨細胞、生殖細胞、体細胞、幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、前駆細胞、減数分裂細胞、及び有糸分裂細胞。一部の態様では、生物由来の複数の細胞が使用され得る。
本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、動物細胞に導入し得る。動物細胞として下記が挙げられるが、これらに限定されない：脊索動物、節足動物、軟体動物、環形動物、刺胞動物、若しくは棘皮動物を含む門の生物；又は哺乳動物、昆虫、鳥類、両生類、爬虫類、若しくは魚類を含む綱の生物。一部の態様では、動物は、ヒト、マウス、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ラット、ショウジョウバエ（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）種）、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ミナミメダカ、ウミヤツメ、フグ、アマガエル（例えば、ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）種）、サル、又はチンパンジーである。企図される特定の細胞種として、下記が挙げられる：単数体細胞、二倍体細胞、生殖細胞、ニューロン、筋肉細胞、内分泌又は外分泌細胞、上皮細胞、筋肉細胞、腫瘍細胞、胚細胞、造血細胞、骨細胞、生殖細胞、体細胞、幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、前駆細胞、減数分裂細胞、及び有糸分裂細胞。一部の態様では、生物由来の複数の細胞が使用され得る。
【0444】
開示されている新規の操作されたＣａｓポリペプチドを使用して、動物細胞のゲノムを種々の方法で編集し得る。一態様では、１つ又は複数のヌクレオチドを欠失させることが所望され得る。別の態様では、１つ又は複数のヌクレオチドを挿入することが所望され得る。一態様では、１つ又は複数のヌクレオチドを置換させることが所望され得る。別の態様では、別の原子又は分子との共有結合的な又は非共有結合的な相互作用によって１つ又は複数のヌクレオチドを改変することが所望され得る。
【0445】
開示されている操作されたＣａｓポリペプチドによるゲノム改変を使用して、標的生物の遺伝子型及び／又は表現型の変化をもたらし得る。そのような変化は、好ましくは、目的の表現型若しくは生理学的に重要な特性の改善、内因性欠陥の是正、又はいくつかの型の発現マーカーの発現に関連する。一部の態様では、目的の表現型又は生理学的に重要な特性は、動物の全体的な健康、適応性、若しくは生殖能、動物の生態学的適応性、又はその環境におけるこの動物と他の生物との関係若しくは相互作用に関連している。一部の態様では、目的の表現型又は生理学的に重要な特性は、下記からなる群から選択される：健康全般の改善、疾患の好転、疾患の改善、疾患の安定化、疾患の予防、寄生虫感染症の処置、ウイルス感染症の処置、レトロウイルス感染症の処置、細菌感染症の処置、神経障害の処置（例えば、限定されないが、多発性硬化症）、内因性遺伝子欠陥の是正（例えば、限定されないが、代謝性障害、軟骨形成不全症、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症、抗リン脂質症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎、バース症候群、乳癌、シャルコー・マリー・トゥース病、大腸癌、ネコなき症候群、クローン病、嚢胞性線維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓性素因、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳胞症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、マルファン症候群、筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド症候群、ポルフィリン症、早老症、前立腺癌、網膜色素変性症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、皮膚癌、脊髄性筋萎縮症、テイ＝サックス病、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、及びウィルソン病）、先天性免疫障害の処置（例えば、限定されないが、免疫グロブリンサブクラス欠損症）、後天性免疫障害の処置（例えば、限定されないが、ＡＩＤＳ及び他のＨＩＶ関連障害）、癌の処置、並びに他の方法による効果的な治療選択肢のない、希少な又は「オーファン」病態を含む疾患の処置。
【0446】
本明細書で開示されている組成物又は方法を使用して遺伝子改変されている細胞を、遺伝子治療等の目的のために、例えば、疾患を処置するために、又は抗ウイルス、抗病原体、若しくは抗癌治療剤として、農業において遺伝子改変された生物の生産のために、又は生物学的研究のために、対象に移植し得る。
【0447】
インビトロでのポリヌクレオチドの検出、結合、及び改変
本明細書に開示されている組成物を、単離されたポリヌクレオチド配列を伴う一部の態様では、インビトロ方法において使用するための組成物としてさらに使用し得る。前記単離されたポリヌクレオチド配列は、改変のための１つ又は複数の標的配列を含み得る。一部の態様では、前記単離されたポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ産物、又は合成されたオリゴヌクレオチドであり得る。
本明細書に開示されている組成物を、単離されたポリヌクレオチド配列を伴う一部の態様では、インビトロ方法において使用するための組成物としてさらに使用し得る。前記単離されたポリヌクレオチド配列は、改変のための１つ又は複数の標的配列を含み得る。一部の態様では、前記単離されたポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ産物、又は合成されたオリゴヌクレオチドであり得る。
【0448】
組成物
標的配列の改変は、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換、既存のヌクレオチドへの原子分子の付加、ヌクレオチド改変、又は前記標的配列への異種ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの結合の形態であり得る。１つ又は複数のヌクレオチドの挿入は、反応混合物中にドナーポリヌクレオチドを含めることによって達成され得、前記ドナーポリヌクレオチドは、本明細書で開示されている操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼによって生成される二本鎖切断部分に挿入される。この挿入は、非相同末端結合又は相同組換えによって行われ得る。
標的配列の改変は、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換、既存のヌクレオチドへの原子分子の付加、ヌクレオチド改変、又は前記標的配列への異種ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの結合の形態であり得る。１つ又は複数のヌクレオチドの挿入は、反応混合物中にドナーポリヌクレオチドを含めることによって達成され得、前記ドナーポリヌクレオチドは、本明細書で開示されている操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼによって生成される二本鎖切断部分に挿入される。この挿入は、非相同末端結合又は相同組換えによって行われ得る。
【0449】
一態様では、標的ポリヌクレオチドの配列は、改変前に既知であり、操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼによる処理から得られるポリヌクレオチドの配列と比較される。一態様では、標的ポリヌクレオチドの配列は、改変前は未知であり、操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼによる処理は、前記標的ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法の一部として使用される。
【0450】
操作されたＣａｓポリペプチドによるポリヌクレオチド改変は、Ｃａｓ遺伝子座から同定された完全長ポリペプチドの使用により達成され得るか、又はＣａｓ遺伝子座から同定されたポリペプチドの断片、改変、若しくはバリアントから達成され得る。一部の態様では、前記操作されたＣａｓポリペプチドは、表１に列挙されている生物から得られるか、又は誘導される。一部の態様では、前記Ｃａｓポリペプチドバリアントは、配列番号２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３の内のいずれかと少なくとも８０％の同一性を共有するポリペプチドである。一部の態様では、前記Ｃａｓポリペプチドバリアントは、配列番号２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３の内のいずれかの機能的バリアントである。一部の態様では、前記Ｃａｓポリペプチドバリアントは、配列番号２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３の内のいずれかの機能的断片である。一部の態様では、前記Ｃａｓポリペプチドバリアントは、配列番号２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３からなる群から選択されるポリヌクレオチドによりコードされるＣａｓポリペプチドである。一部の態様では、前記Ｃａｓポリペプチドは、Ｎ（Ｔ＞Ｗ＞Ｃ）ＴＴＣのＰＡＭ配列を認識するＣａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドである。一部の態様では、Ｃａｓポリペプチドバリアントは、Ｃａｓポリペプチドポリヌクレオチドとして提供される。一部の態様では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３、又は２３～２６、３１～４４、８０～８５、９０～１４２、１９７、及び３３１～３３３の内のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％を共有する配列からなる群から選択されるＣａｓポリペプチドをコードする。
【0451】
一部の態様では、操作されたＣａｓポリペプチドは、操作されたか又は改変された野生型Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ、機能的Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログバリアント、機能的な操作されたＣａｓポリペプチド断片、活性の又は不活化された操作されたＣａｓポリペプチドバリアントを含む融合タンパク質、Ｃ末端若しくはＮ末端又はＮ末端及びＣ末端の両方で１つ又は複数の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む操作されたＣａｓポリペプチド、ビオチン化された操作されたＣａｓポリペプチド、操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼニッカーゼ、操作されたＣａｓポリペプチドオルソログエンドヌクレアーゼ、ヒスチジンタグをさらに含む操作されたＣａｓポリペプチド、並びにこれらの任意の２つ以上の混合物
からなる群から選択され得る。
からなる群から選択され得る。
【0452】
一部の態様では、操作されたＣａｓポリペプチドは、ヌクレアーゼドメイン、転写アクチベータードメイン、転写リプレッサードメイン、エピジェネティック改変ドメイン、開裂ドメイン、核局在化シグナル、細胞透過ドメイン、転座ドメイン、マーカー、又は標的ポリヌクレオチド配列又は前記標的ポリヌクレオチド配列が得られるか若しくは誘導される細胞に対して異種である導入遺伝子をさらに含む融合タンパク質である。
【0453】
一部の態様では、複数の操作されたＣａｓポリペプチドが所望され得る。一部の態様では、前記複数の操作されたＣａｓポリペプチドは、異なる生物源に由来するか又は同じ生物内の異なる遺伝子座に由来する操作されたＣａｓポリペプチドを含み得る。一部の態様では、前記複数の操作されたＣａｓポリペプチドは、標的ポリヌクレオチドに対し異なる結合特異性を有する操作されたＣａｓポリペプチドを含み得る。一部の態様では、前記複数の操作されたＣａｓポリペプチドは、異なる開裂効率を有する操作されたＣａｓエンドヌクレアーゼを含み得る。一部の態様では、前記複数の操作されたＣａｓポリペプチドは、異なるＰＡＭ特異性を有する操作されたＣａｓポリペプチドを含み得る。一部の態様では、前記複数の操作されたＣａｓポリペプチドは、分子組成が異なる操作されたＣａｓポリペプチド（即ち、操作されたＣａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び操作されたＣａｓポリペプチドであるポリペプチド）を含み得る。
【0454】
ガイドポリヌクレオチドは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｔｒａｃｒＲＮＡを含むキメラ分子、ｃｒＲＮＡを含むキメラ分子、キメラＲＮＡ－ＤＮＡ分子、ＤＮＡ分子、又は１つ若しくは複数の化学的改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとして提供され得る。
【0455】
操作されたＣａｓポリペプチド及び／又はガイドポリヌクレオチドの貯蔵条件は、温度、物質の状態、及び時間に関するパラメータを含む。一部の態様では、Ｃａｓポリペプチド及び／又はガイドポリヌクレオチドは、約－８０℃、約－２０℃、約４℃、約２０～２５℃、又は約３７℃で保存される。一部の態様では、Ｃａｓポリペプチド及び／又はガイドポリヌクレオチドは、液体、凍結液体、又は凍結乾燥粉末として保存される。一部の態様では、Ｃａｓポリペプチド及び／又はガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも１年間、又は１年超にわたって安定である。
【0456】
反応の可能なポリヌクレオチド成分（例えば、ガイドポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、任意選択的なＣａｓポリペプチドポリヌクレオチド）のいずれか又は全ては、ベクター、コンストラクト、線状化若しくは環状化プラスミドの一部として提供され得るか、又はキメラ分子の一部として提供され得る。各成分は、別々に又は一緒に反応混合物に供給され得る。一部の態様では、１種又は複数種のポリヌクレオチド成分は、その発現を調節する異種の非コード調節エレメントに作動可能に連結されている。
【0457】
標的ポリヌクレオチドの改変のための方法は、最小要素を組み合わせて、操作されたＣａｓポリペプチド（又は上記で説明されているバリアント、断片、若しくは他の関連分子）、標的ポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列に実質的に相補的であるか又は選択的にハイブリダイズする配列を含むガイドポリヌクレオチド、及び改変のための標的ポリヌクレオチドを含む反応混合物にすることを含む。一部の態様では、操作されたＣａｓポリペプチドは、ポリペプチドとして提供される。一部の態様では、操作されたＣａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドポリヌクレオチドとして提供される。一部の態様では、ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、又は化学的改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド分子として提供される。
【0458】
成分のいずれか１つの貯蔵緩衝液、又は反応混合物は、安定性、有効性、又は他のパラメータについて最適化され得る。貯蔵緩衝液又は反応混合物のさらなる成分は、緩衝組成物、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ＨＥＰＥＳ、グリセロール、ＢＳＡ、塩、乳化剤、洗剤、キレート剤、レドックス剤、抗体、ヌクレアーゼ非含有水、プロテイナーゼ、及び／又は粘性剤を含み得る。一部の態様では、貯蔵緩衝液又は反応混合物は、下記の成分の少なくとも１つを含む緩衝液をさらに含む：ＨＥＰＥＳ、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、プロテイナーゼ、プロテイナーゼＫ、グリセロール、ヌクレアーゼ非含有水。
【0459】
インキュベーション条件は、所望の結果に従って変化する。温度は、好ましくは、少なくとも１０℃、１０～１５℃、少なくとも１５℃、１５～１７℃、少なくとも１７℃、１７～２０℃、少なくとも２０℃、２０～２２℃、少なくとも２２℃、２２～２５℃、少なくとも２５℃、２５～２７℃、少なくとも２７℃、２７～３０℃、少なくとも３０℃、３０～３２℃、少なくとも３２℃、３２～３５℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、又は４０℃超である。インキュベーション時間は、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも６分、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、少なくとも１０分、又は１０分超である。
【0460】
インキュベーション前、インキュベーション中、又はインキュベーション後の反応混合物中のポリヌクレオチドの配列を、当該技術分野で既知の任意の方法によって決定し得る。一態様では、標的ポリヌクレオチドの改変を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログと組み合わせる前に、反応混合物から精製されたポリヌクレオチドの配列を標的ポリヌクレオチドの配列と比較することによって確認し得る。
【0461】
インビトロ又はインビボでのポリヌクレオチドの検出、結合、及び／又は改変に有用な、本明細書で開示されている組成物のいずれか１つ又は複数が、キット内に含まれ得る。キットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ又はそのようなものをコードするポリヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼオルソログを含み、任意選択的に、効率的な貯蔵を可能にする緩衝液成分、及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ、又はＣａｓエンドヌクレアーゼオルソログの異種ポリヌクレオチドへの導入を可能にする１種又は複数種のさらなる組成物をさらに含み、ここで、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ又はＣａｓエンドヌクレアーゼオルソログは、前記異種ポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドの改変、付加、欠失、又は置換をもたらし得る。さらなる態様では、本明細書で開示されているＣａｓエンドヌクレアーゼオルソログは、混合プールからの１種又は複数種のポリヌクレオチド標的配列の富化のために使用され得る。さらなる態様では、本明細書で開示されているＣａｓエンドヌクレアーゼオルソログは、インビトロでの標的ポリヌクレオチドの検出、結合、及び／又は改変での使用のために、マトリックス上に固定化され得る。
【0462】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、貯蔵、精製、及び／又は特性評価の目的のために、固体マトリックスに付着され得るか、会合し得るか、又は添付され得る。固体マトリックスの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：フィルタ、クロマトグラフィー樹脂、アッセイプレート、試験管、極低温バイアル等。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、実質的に精製され、適切な緩衝溶液中に保存されるか又は凍結乾燥され得る。
【0463】
検出方法
標的ポリヌクレオチドに結合した操作されたＣａｓポリペプチド：ガイドポリヌクレオチド複合体を検出する方法として、当該技術分野において知られる任意の方法が挙げられ得、例えば、限定されないが、顕微鏡法、クロマトグラフィー分離、電気泳動、免疫沈降、ろ過、ナノポア分離、マイクロアレイ、及び下記で説明するものが挙げられ得る。
標的ポリヌクレオチドに結合した操作されたＣａｓポリペプチド：ガイドポリヌクレオチド複合体を検出する方法として、当該技術分野において知られる任意の方法が挙げられ得、例えば、限定されないが、顕微鏡法、クロマトグラフィー分離、電気泳動、免疫沈降、ろ過、ナノポア分離、マイクロアレイ、及び下記で説明するものが挙げられ得る。
【0464】
ＤＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、既知のＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブに結合するタンパク質を調べ、相互作用の特異性を評価する。この技術は、ポリアクリルアミド又はアガロースゲルの電気泳動に供された場合にはタンパク質－ＤＮＡ複合体が遊離ＤＮＡ分子よりもゆっくりと移動するという原理に基づいている。ＤＮＡの移動速度は、タンパク質に結合すると遅くなるため、このアッセイはまた、ゲル遅延度アッセイとも呼ばれる。タンパク質特異的抗体を結合成分に添加すると、電気泳動中にさらにゆっくりと移動するより大きい複合体（抗体－タンパク質－ＤＮＡ）が生成され、これは、スーパーシフトとして既知であり、タンパク質の同一性を確認するために使用され得る。
【0465】
ＤＮＡプルダウンアッセイは、ビオチン等の高親和性タグで標識されたＤＮＡプローブを使用し、このタグにより、このプローブの回収又は固定化が可能となる。ＤＮＡプローブは、ＥＭＳＡで使用されるものと同様の反応で、細胞ライセートからのタンパク質と複合体化され得、次いで、アガロース又は磁気ビーズを使用して複合体を精製するために使用され得る。その後、タンパク質をＤＮＡから溶出し、ウェスタンブロットによって検出するか、又は質量分析によって同定する。或いは、タンパク質を親和性タグで標識し得るか、又はＤＮＡ－タンパク質複合体を、目的のタンパク質に対する抗体を使用して単離し得る（スーパーシフトアッセイと同様）。この場合、タンパク質に結合した未知のＤＮＡ配列を、サザンブロット法やＰＣＲ分析により検出する。
【0466】
レポーターアッセイは、目的のプロモーターの翻訳活性のインビボリアルタイム読み出しを提供する。レポーター遺伝子は、標的プロモーターＤＮＡ配列と、研究者によってカスタマイズされたレポーター遺伝子ＤＮＡ配列との融合体であり、ＤＮＡ配列は、ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼのような検出可能な特性を有するタンパク質をコードする。これらの遺伝子は、目的のプロモーターが活性化されたときにのみ酵素を産生する。酵素は次に、基質を触媒して、分光器によって検出され得る光又は色の変化をもたらす。レポーター遺伝子からのシグナルは、同じプロモーターから駆動される内在性タンパク質の翻訳の間接的決定因子として使用される。
【0467】
マイクロプレート捕捉・検出アッセイは、固定化されたＤＮＡプローブを使用して、特異的なタンパク質－ＤＮＡ相互作用を捕捉し、標的特異的抗体とのタンパク質同一性及び相対量を確認する。一般的には、ＤＮＡプローブは、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェル又は３８４ウェルマイクロプレートの表面に固定化される。細胞抽出物を調製し、添加して、結合タンパク質をオリゴヌクレオチドに結合させる。次に、抽出物を除去し、各ウェルを数回洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去する。最後に、検出のために標識された特異的抗体を使用して、タンパク質を検出する。この方法は極めて高感度であり得、１ウェル当たり０．２ｐｇ未満の標的タンパク質が検出される。この方法はまた、アミン反応性表面化学でコーティングされたマイクロプレート上に固定化され得る第一級アミン等の他のタグで標識されたオリゴヌクレオチドにも利用され得る。
【0468】
ＤＮＡフットプリント法は、生細胞内でも、タンパク質－ＤＮＡ複合体中の個々のヌクレオチドについての詳細な情報を得るために最も広く使用されている方法の１つである。そのような実験では、化学物質又は酵素がＤＮＡ分子を改変するか又は消化するために使用される。配列特異的タンパク質がＤＮＡに結合する場合には、これらは結合部位を改変又は消化から保護し得る。これは、その後、変性ゲル電気泳動によって可視化され得、保護されていないＤＮＡはおおよそランダムに開裂される。従って、それは、バンドの「ラダー」として現れ、タンパク質によって保護された部位は、対応するバンドがなく、バンドのパターンにおいて足跡のように見える。従って、この足跡により、タンパク質－ＤＮＡ結合部位における特定のヌクレオシドが確認される。
【0469】
顕微鏡技術には、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、及び原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）が含まれる。
【0470】
クロマチン免疫沈降分析（ＣｈＩＰ）は、タンパク質をこのＤＮＡ標的に共有結合させ、その後、これらに結合を解き、別々に特徴付ける。
【0471】
試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）は、標的タンパク質をオリゴヌクレオチドのランダムライブラリーに曝露する。結合するこれらの遺伝子は、分離され、ＰＣＲによって増幅される。
【0472】
本発明は、特に、好ましい実施形態及び様々な代替実施形態を参照して示されおり且つ説明されてきたが、関連する技術分野の当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更がその中でなされ得ることを理解するであろう。例えば、下記の特定の実施例は、特定の標的部位又は標的生物を使用して、本明細書で説明されている方法及び実施形態を例示し得るが、これらの実施例における原理は、任意の標的部位又は標的生物に適用され得る。従って、本発明の範囲は、下記で例示される具体例ではなく、本明細書で列挙されている本発明の実施形態に包含されることが理解されるであろう。本出願において参照される全ての引用された特許、出願、及び刊行物は、あらゆる目的のために、それぞれが個々に且つ具体的に参照により組み込まれたのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0473】
下記は、本発明のいくつかの態様の特定の実施形態の例である。実施例は、説明の目的のためにのみ提供されるものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確実にする努力がなされているが、当然のことながら、多少の実験誤差及び偏差が許容されるべきである。
【0474】
実施例１：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡ発現カセット
この実施例では、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞で使用するためのＣａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットを生成する方法が説明されている。
この実施例では、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞で使用するためのＣａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットを生成する方法が説明されている。
【0475】
一方法では、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で効率的な発現させるために、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を、当該技術分野で既知の標準的な方法により酵母コドン最適化させた。この最適化されたＣａｓ－アルファエンドヌクレアーゼタンパク質の核局在化を容易にするために、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）（ＳＶ４０）単節型核局在化シグナル（ＮＬＳ）（（ＰＫＫＫＲＫＶ配列番号２２））をコードするヌクレオチド配列を、５’末端又は３’末端のいずれかに任意選択的に付加した。次いで、最適化されたｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ遺伝子及びＮＬＳバリアントのヌクレオチド配列を合成し、ＲＯＸ３プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターとの間の２ミクロン酵母プラスミドＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）に作動可能にクローニングした。酵母最適化Ｃａｓ－アルファヌクレアーゼ発現カセットの一例、及び本明細書で説明されている配列への言及を、図１に見出し得る。
【0476】
Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼは、５’プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在下で二本鎖ＤＮＡを開裂するように、小型ＲＮＡ（本明細書ではガイドＲＮＡと称される）により誘導される（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４８，５０１６－５０２３、及び米国特許出願公開第２０２００１９０４９４Ａ１号明細書）。このガイドＲＮＡは、Ｃａｓ－アルファによる認識を補助する配列（Ｃａｓ－アルファ認識ドメインと称される）、及びＤＮＡ標的部位の１本の鎖と塩基対合することによってＣａｓ－アルファ開裂を誘導する働きをする配列（Ｃａｓ－アルファ可変ターゲティングドメイン）を含む。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞中でＣａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ開裂活性を誘導するのに必要な小型ＲＮＡを転写するために、ハンマーヘッド（例えば、Ｃａｓ－アルファガイドＲＮＡの最初に対して相補性を有する６ｂｐの５’配列（例えば、Ｃａｓ－アルファ１０の場合にはＧＴＡＡＡＴ）及びデルタ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするＤＮＡ配列を、最初に、酵母ａｄｅ２遺伝子を標的とし得る可変ターゲティングドメインを有するＣａｓ－アルファ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするＤＡＮ配列の５’末端及び３’末端それぞれに付加した。次に、リボザイム及びＣａｓ－アルファをコードするｓｇＲＮＡの末端に、ＳＮＲ５２プロモーター及びＳＵＰ４ターミネーターを作動可能に連結させた。次いで、ＤＮＡ断片を合成し、ｃａｓ－アルファ遺伝子を含むＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２ミクロンベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にクローニングした。酵母最適化Ｃａｓ－アルファガイドＲＮＡ発現カセットの一例、及び本明細書で説明されている配列への言及を、図１に見出し得る。
【0477】
陰性コントロールとして使用するために、ヌクレアーゼ不活性化又は死滅（ｄ）Ｃａｓ－アルファ酵母発現コンストラクトも生成した。ここで、ＤＮＡホスホジエステル骨格開裂の調整に関与するＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の３つのアミノ酸（Ｃａｓ－アルファ１０の場合には、Ｄ２２８、Ｅ３２７、及びＤ４３４）を、アラニン残基で置換した（図２及び３）。このことを、部位特異的変異誘発（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して酵母最適化ｃａｓ－アルファ遺伝子内のコドンを変更することにより達成した。ａｄｅ２ガイドＲＮＡ発現カセットも含む酵母最適化ｄＣａｓ－アルファ発現コンストラクトの一例を、図１に示す。
【0478】
実施例２：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換
この実施例では、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットをサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞に形質転換する方法が説明されている。
この実施例では、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットをサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞に形質転換する方法が説明されている。
【0479】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換するために、いくつかの方法（酢酸リチウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、熱ショック、エレクトロポレーション、バイオリスティック等）を使用し得る（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ．１：３９５－４０３）。ここで、Ｆｒｏｚｅｎ－ＥＺ ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、リチウムカチオンベースの方法に類似するアプローチを使用した。製造者の説明に従って、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コンピテント細胞を産生した。このことを、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＢＹ４７４２）（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｙｅａｓｔ．１４：１１５－１３２）（ＡＴＣＣ））を、酵母抽出物－ペプトン－デキストロース（ＹＰＤ）ブロス（Ｇｉｂｃｏ）中で、０．８～１．０のＯＤ６００ｎｍに相当する対数増殖期の中期まで増殖させることにより達成した。次に、この細胞を、遠心分離（５００×ｇ、４分間）によってペレット化し、培地をデカントし、ペレットを、ＥＺ １溶液 １０ｍｌで穏やかに洗浄し、再び細胞を遠心分離で沈降させ、その後、洗浄液を除去した。次いで、この細胞を、ＥＺ ２溶液 １ｍｌに再懸濁させ、等分し、－７０℃で保存したか、又は次の工程で使用した。次に、２ミクロン酵母プラスミドＤＮＡ ０．５～１μｇ（５μｌ未満中）をコンピテント細胞 ５０μｌに添加することにより、形質転換を実施した。任意選択的に、予想されるＣａｓ－アルファ二本鎖切断部位に隣接する、相同性を有する二本鎖ＤＮＡ修復鋳型もまた、含めた（５０μＭで０．５μｌ）。ＤＮＡ中で穏やかに混合した後、ＥＺ ３溶液 ５００μｌを添加した。次に、細胞を、６０～９０分にわたり３０℃でインキュベートし、このインキュベーションの間に、細胞を３～４回フリッキング又はボルテックスした。形質転換後、細胞を、約３時間にわたりＹＰＤブロス中で増殖させ、ペレット化し、滅菌水１ｍｌで１回洗浄し、滅菌水１ｍｌに再懸濁させ、次いで約２００μｌを、選択培地（例えば、限定されないが、６．７ｇ／Ｌの、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２０ｇ／Ｌのグルコース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ）、１．９２ｇ／Ｌの酵母ヒスチジンドロップアウト培地（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、及び２０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ Ａｇａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）））上に蒔いた。活性に最適な培養条件を決定するために、細胞を、コロニーが形成されるまで３０℃でインキュベートしたか、又は一晩ある温度範囲（典型的には３７℃及び４５℃）でインキュベートし、次いで、コロニーの増殖が見えるまで３０℃で戻した。
【0480】
実施例３：細胞ＤＮＡ標的開裂の改善のための選択
この実施例では、二本鎖ＤＮＡ標的開裂が改善されたＣａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ又はガイドＲＮＡバリアントを選択する方法が説明されている。
この実施例では、二本鎖ＤＮＡ標的開裂が改善されたＣａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ又はガイドＲＮＡバリアントを選択する方法が説明されている。
【0481】
一方法では、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のａｄｅ２遺伝子（ＢＹ４７４２，遺伝子型－ＭＡＴαｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｌｙｓ２Δ０ ｕｒａ３Δ０）を、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ標的開裂の標的とした（図４Ａ）。ここで、非機能性ａｄｅ２遺伝子が形成される標的開裂及び細胞修復により、アデニン栄養要求性、及び白色から赤色（ピンク色）の細胞表現型への切り替え生じる（Ｕｇｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３０：４８５－４９２、及び米国特許出願公開第２０２００１９０４９４Ａ１号明細書）。この色の変化を使用して、標的化ＤＳＢ活性が改善されたＣａｓヌクレアーゼバリアント及び／又は関連するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現する細胞を選択した（図４Ｂ）。コロニーと見なされた場合に、且つａｄｅ２遺伝子がどれだけ早く破壊されたかに応じて、赤色の着色は、完全に赤色（図４Ｂ、画像２）から、他は白色コロニー内の小さい赤色セクターの観察までの様々であった（図４Ｂ、画像３及び４）。この表現型パターンも使用して、バリアント間の活性の差違も定量した（図４Ｂ）。完全な赤色と採点されたコロニー、いくつかのセクターを含むもの、又は１つだけ赤色セクターを含むものを計数し、存在するコロニーの総数で除算した。一部の例では、コロニーの計数の代わりに、酵母コロニーの画像を、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｉｇｈｔ Ｄｓ－Ｆｉ１カメラ（株式会社ニコン，日本）及びＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＢＲソフトウェア（バージョン４．００．０７）（株式会社ニコン，日本）で撮影し、総酵母領域を（ピクセルとして）最初に決定し、次いで、カスタムスクリプトを使用して、赤色の総割合を算出することにより分析した。
【0482】
改善されたＣａｓバリアントを同定すると、ヒスチジンを含まない酵母ブロス ５ｍｌ（例えば、限定されないが、６．７ｇ／Ｌの、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２０ｇ／Ｌのグルコース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ）、及び１．９２ｇ／Ｌの酵母ヒスチジンドロップアウト培地（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ））に移し、振盪しつつ３０℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ９６キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、バリアントをコードする２ミクロンプラスミドを単離した。精製後、プラスミドを、製造業者の指示に従ってＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ ＥＰＩ３００（Ｌｕｃｉｇｅｎ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に形質転換させ、選択培地（例えば、限定されないが、６．７ｇ／Ｌの、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２０ｇ／Ｌのグルコース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ）、１．９２ｇ／Ｌの酵母ヒスチジンドロップアウト培地（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、及び２０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ Ａｇａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））上に蒔いた。複数の２ミクロンベクターを単一の酵母細胞中で維持し得ることから、各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換から６つのコロニーを選択し、それぞれを使用して、２Ｘ ＹＴ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又はカルベニシリンを含む同等のもの ２ｍｌに接種した。培養物を、振盪しつつ３７℃で一晩増殖させ、次いで、培養物の半分を、ｃａｓ－アルファ遺伝子に直接隣接するか又はこの遺伝子内の領域に特異的なプライマーを使用するローリングサークル増幅及びサンガー配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に供した。配列決定後、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、様々なバリアントを含むことが分かっている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物（残り半分）から、プラスミドＤＮＡを単離した。最後に、各プラスミド 約１μｇを、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に再形質転換させ、赤色の細胞表現型に関して評価して改善を確認した。改善されたバリアント、及び元（野生型）のＣａｓ－アルファエンドヌクレアーゼとの比較を行なうために、典型的には、全てのプラスミドでさらなる酵母形質転換を実施し、ａｄｅ２標的部位を認識して開裂する能力を比較した。ヌクレアーゼ活性が存在しない赤色コロニーの形成割合を測定するために、ヌクレアーゼ不活化又は死滅（ｄ）Ｃａｓ－アルファ発現プラスミド（実施例１を参照されたい）を、陰性コントロールとして使用した。
【0483】
実施例４：ライブラリーの設計及び生成
この実施例では、二本鎖ＤＮＡ標的開裂を改善するためにＣａｓエンドヌクレアーゼバリアントを設計して生成する方法が説明されている。
この実施例では、二本鎖ＤＮＡ標的開裂を改善するためにＣａｓエンドヌクレアーゼバリアントを設計して生成する方法が説明されている。
【0484】
一方法では、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ（例えば、限定されないが、Ｃａｓ－アルファ１０（配列番号２））の各位置（既にグリシンを含む位置を除く）にグリシンアミノ酸を導入した（グリシンスキャンとも呼ばれる）。第２の方法では、Ｃａｓ－アルファジンクフィンガードメインを包含する領域（例えば、限定されないが、Ｃａｓ－アルファ１０のアミノ酸３７２～４２８及び４５６～４９７位（図２））の各位置に全ての他のアミノ酸（合計１９種）を導入して、飽和変異誘発を実施した。第３の方法では、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ（例えば、限定されないが、Ｃａｓ－アルファ１０（図２））の各位置（既にアルギニンを含む位置を除く）でアルギニンアミノ酸置換を行なった（アルギニンスキャンとも呼ばれる）。第４の方法では、タンパク質全体（例えば、限定されないが、Ｃａｓ－アルファ１０（図２））の各位置で全ての他のアミノ酸（合計１９種）を導入して、飽和変異誘発を実施した。第５の方法では、Ｃａｓ－アルファ認識ドメインを含む、Ｃａｓ－アルファガイドＲＮＡの部分を、各位置に３種の他の可能なヌクレオチド全てを導入する飽和変異誘発に供した（例えば、限定されないが、配列番号８）。第６の方法では、本明細書で列挙された他のアプローチで同定された有益な変化を、１つ又は複数の有益な変化を既に含むバリアントに（単独で又は組み合わせて）組み込み、これらの複合効果に関してアッセイした。
【0485】
全てのライブラリーアプローチに関して、図１に示されている酵母発現プラスミド中のｃａｓ－アルファヌクレアーゼ遺伝子内のコドン（構成要素Ｂ（配列番号２））を、ＧｅｎＰｌｕｓ遺伝子合成技術（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して、様々なアミノ酸をコードするように変更した。
【0486】
実施例５：ＤＮＡ標的開裂が改善されたＣａｓエンドヌクレアーゼバリアント
この実施例では、二本鎖ＤＮＡ開裂活性が改善されたＣａｓエンドヌクレアーゼが説明されている。実施例４で生成した全てのバリアントを試験した。これらには、各位置でグリシン置換及びアルギニン置換が行なわれたバリアント（既にグリリン又はアルギニンを含んでいたバリアントを除く）、ジンクフィンガードメイン（配列番号２０に対して、３７２～４２８及び４５６～４９７位）に対して並びにタンパク質全長（配列番号２０に対して１～４９７位）わたり全ての可能なアミノ酸置換、並びに有益な改変の組み合わせを含むバリアントが含まれた。アッセイを実行して、所望の活性が改善されているバリアントを捕捉した。
この実施例では、二本鎖ＤＮＡ開裂活性が改善されたＣａｓエンドヌクレアーゼが説明されている。実施例４で生成した全てのバリアントを試験した。これらには、各位置でグリシン置換及びアルギニン置換が行なわれたバリアント（既にグリリン又はアルギニンを含んでいたバリアントを除く）、ジンクフィンガードメイン（配列番号２０に対して、３７２～４２８及び４５６～４９７位）に対して並びにタンパク質全長（配列番号２０に対して１～４９７位）わたり全ての可能なアミノ酸置換、並びに有益な改変の組み合わせを含むバリアントが含まれた。アッセイを実行して、所望の活性が改善されているバリアントを捕捉した。
【0487】
２つの異なる位置でのグリシンアミノ酸の置換Ａ４０Ｇ（配列番号２３（図５））及びＥ８１Ｇ（配列番号２３（図６））により、非改変（Ｗｔ）Ｃａｓ－アルファ１０（配列番号２０（図２））と比較して、３７℃での一晩のインキュベーションで回収された赤色の分泌されたＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コロニー（スコア４）の数が増加した（図８Ａ）。４５℃処置により、完全に赤色のコロニー（スコア２）の頻度が約２倍改善された（図８Ｂ）。組み合わせた場合には（配列番号２５（図７））、これらの効果は相加的であり、二本鎖ＤＮＡ開裂活性がさらに大きく増強された。その結果、４５℃インキュベーションを使用する場合には、完全に赤色のコロニー（スコア２）の回収が約３倍増強され、３７℃処置により、セクター化されたコロニー（スコア４）の回収が１０倍を超えて改善された（図８Ａ及び８Ｂ）。最後に、ｄＣａｓ－アルファ１０を使用する実験では、赤色のコロニーが得られず（図９）、このことから、得られた結果がＣａｓ－アルファ開裂活性の変化と直接関連していたことが示される。
【0488】
アルギニンスキャン及びジンクフィンガー飽和変異誘発ライブラリー（実施例４を参照されたい）により、Ｗｔ Ｃａｓ－アルファ１０タンパク質と比較して二本鎖ＤＮＡ開裂活性が顕著に増強されるさらなる変更が得られた。これらには、Ｔ３３５Ｒ（配列番号３１）、Ｃ４０９Ｋ（配列番号３２）、Ｃ４０９Ｒ（配列番号３３）、Ｅ４２１Ｎ（配列番号３４）、Ｅ４２１Ｒ（配列番号３５）、Ｋ４６７Ｒ（配列番号３６）、及びＥ４６８Ｐ（配列番号３７）が含まれた。Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇと組み合わせて、３７℃一晩インキュベーションでアッセイした場合には、Ｔ３３５Ｒ、Ｃ４０９Ｋ、Ｃ４０９Ｒ、及びＥ４２１Ｎは、活性の改善を示したが、Ｅ４２１Ｒ、Ｋ４６７Ｒ、及びＥ４６８Ｐは、赤色コロニーの回収に劇的な影響を及ぼさない中性であると思われた（図１３）。Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ（配列番号２５）と比較して、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号３８（図１４））により、スコア３の赤色の酵母コロニーの回収が約１０倍増加する最大増強が得られた（図１３）。Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｃ４０９Ｋ（配列番号３９（図１５））、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｃ４０９Ｒ（配列番号４０（図１６））、及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｅ４２１Ｎ（配列番号４１（図１７））は、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ（配列番号２５）（図１３）と比較した場合に、約６～８倍の改善が得られた。
【0489】
タンパク質全体にわたる飽和変異誘発により、３７℃でのＷｔ Ｃａｓ－アルファ１０活性を改善する更なる残基が得られた。これには、Ｆ３８Ｄ（配列番号８０）、Ｆ３８Ｅ（配列番号８１）、Ｈ７９Ｄ（配列番号８２）、及びＡ８７Ｋ（配列番号８３）が含まれた。先に同定された最良のバリアントであるＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号３８）と個別に組み合わせた場合には、Ｈ７９Ｄ及びＡ８７Ｋは、３７℃での活性をさらに増強し、Ｆ３８Ｄ及びＦ３８Ｅは、中性効果を有していた。具体的には、Ａ４０Ｇ＋Ｈ７９Ｄ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８４）（図２１）及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）（図２２）により、酵母コロニー増殖でａｄｅ２遺伝子破壊が早期に起こることを示す表現型カテゴリ２及び３に採点されるコロニーの高い割合が得られた（図２３）。Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）は、活性を最大に増強し、Ａ４０Ｇ＋Ｈ７９Ｄ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８４）と比べて、完全に赤色の表現型を有する酵母コロニーが多く得られた（図２３）。Ｆ３８Ｄ（配列番号８０）、Ｆ３８Ｅ（配列番号８１）、Ｈ７９Ｄ（配列番号８２）、及びＡ８７Ｋ（配列番号８３）を、Ｔ３３５Ｒとだけ試験した場合には、２つの組み合わせＦ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号９０）（図２４）及びＦ３８Ｄ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号９１）（図２５）は、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒと比べて優れていることも示され、ａｄｅ２遺伝子機能性を破壊する能力において、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒと同様のスコアを示した（図２３）。
【0490】
飽和変異誘発ライブラリーからの追加のラウンドのスクリーニングから、３７℃でのＷｔ Ｃａｓ－アルファ１０活性を増強する９つのさらなるバリアントが生じた。これらは、Ｔ１９０Ｋ（配列番号９２）、Ｔ２１７Ｈ（配列番号９３）、Ｌ２９３Ｈ（配列番号９４）、Ｋ２９８Ｓ（配列番号９５）、Ｈ３０６Ｆ（配列番号９６）、Ｖ３１３Ｓ（配列番号９７）、Ｓ３３８Ｖ（配列番号９８）、Ｉ４０５Ｎ（配列番号９９）、及びＮ４３０Ｐ（配列番号１００）であった。コンビナトリアル増強に関して試験するために、２つの先のバリアントＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）及びＦ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号９０）を、親タンパク質として選択した。また、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）及びＦ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号９０）に関する３７℃での活性は飽和に近かったことから、３０℃でのインキュベーションを使用して改善を評価した。さらに、より多くのバリアントの比較を可能にするために、カスタム画像解析スクリプトを使用して、赤色に着色された酵母領域の総割合を算出した。Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）（親１としても既知である）に関して、Ｔ１９０Ｋ（配列番号１０１）、Ｌ２９３Ｈ（配列番号１０３）、Ｋ２９８Ｓ（配列番号１０４）、Ｈ３０６Ｆ（配列番号１０５）、Ｉ４０５Ｎ（配列番号１０８）、及びＮ４３０Ｐ（配列番号１０９）と対形成した場合には、３０℃での細胞活性は、先のバリアントと比べて著しく増強された（図２６Ａ）。これらの同一のバリアントを、Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号９０）（親２としても既知である）と組み合わせた場合には、Ｎ４３０Ｐ（配列番号１１８）との対形成により、破壊されたＡｄｅ２表現型が大幅に増加した（図２６Ｂ）。
【0491】
次に、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（配列番号１０１）及びＦ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（配列番号１１０）を、Ｔ２１７Ｈ、Ｌ２９３Ｈ、Ｋ２９８Ｓ、Ｈ３０６Ｆ、Ｓ３３８Ｖ、Ｉ４０５Ｎ、及びＮ４３０Ｐと組み合わせて試験した。図２７Ａ及び２７Ｂに示すように、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ（配列番号１１９）を除いて、ほとんどの組み合わせが相加的であった。さらに、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（配列番号１０１）との組み合わせにより、概して、Ｆ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（配列番号１１０）との同様の組み合わせと比べて高い細胞活性が得られた（図２７Ａ及び２７Ｂ）。この観察に基づいて、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（配列番号１０１）を使用して、活性をさらに改善するさらなる組み合わせに関してスクリーニングした。このことから、下記が同定された：Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ＋Ｎ４３０Ｐ（配列番号１３３）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｌ２９３Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１３４）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１３５）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｌ２９３Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１３６）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１３７）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｌ２９３Ｈ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１３８）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｎ４３０Ｐ（配列番号１３９）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ（配列番号１４０）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１４１）、及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｎ４３０Ｐ（配列番号１４２）。これらの組み合わせにより、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（配列番号１０１）と比較して、３０℃で活性が３～５倍増加した（図２７Ａ及び２８）。
【0492】
Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（配列番号１０１）及びＦ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（配列番号１１０）の活性を増強する組み合わせを、さらに調べた。このため、親開始タンパク質としてＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ又はＦ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋのいずれかを使用して、Ａ１２０Ｐ（配列番号３３１）、Ｙ１４９Ｅ（配列番号３３２）、Ｔ１９０Ｋ（配列番号９２）、Ｔ２１７Ｈ（配列番号９３）、Ｌ２９３Ｈ（配列番号９４）、Ｋ２９８Ｓ（配列番号９５）、Ｈ３０６Ｆ（配列番号９６）、Ｑ３２５Ｎ（配列番号１９７）、Ｓ３３８Ｖ（配列番号９８）、Ｉ４０５Ｎ（配列番号９９）、Ｅ４２１Ｈ（配列番号３３３）、及びＮ４３０Ｐ（配列番号１００）の全ての可能な組み合わせを含む２つの新規のライブラリーを生成した。酵母中で２８℃にてアッセイした場合に、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１３５）と同等以上の活性を示す合計９２個のさらなる組み合わせを同定した（表１）。
【0493】
実施例６：オルソログの活性の改善
この実施例では、Ｃａｓオルソログの細胞活性を改善する方法が説明されている。
この実施例では、Ｃａｓオルソログの細胞活性を改善する方法が説明されている。
【0494】
一方法では、１種のＣａｓタンパク質に関して特定された有益なアミノ酸変化を最初にマッピングし、次いでオルソログタンパク質に変換する。このために、改善されたＣａｓタンパク質とオルソログとの間の保存領域を、複数配列アラインメントツールであるＭＵＳＣＬＥ ３．８．３１（Ｅｄｇａｒ （２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ３２，１７９２－１７９７）及びＭＳＡＰＲｏｂｓ（Ｌｉｕ ｅｔ．ａｌ． （２０１０）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２６：１９５８－１９６４）を使用して特定した。二次構造及び３Ｄ予測（ＭＯＤＥＬＬＥＲ、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ（ＢＩＯＶＩＡ）、及びＰｙｍｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ））も使用して、保存された構造的特徴を特定してアラインメントを改善し得る。次に、保存領域と重複するＣａｓタンパク質活性を改善するアミノ酸をオルソログに転置し、実施例３で説明したように独立して又は組み合わせて細胞活性の増強に関して調べた。
【0495】
Ｃａｓ－アルファ１０とＣａｓ－アルファオルソログ４、８、１４、１５、１６、及び３１（配列番号１９８～２０２）とのアラインメントにより、活性を改善するために変更され得るオルソログ中の位置を特定した（表２）。
【0496】
実施例７：ＤＮＡ標的開裂が改善されたガイドＲＮＡバリアント
この実施例では、二本鎖ＤＮＡ開裂活性が改善されたＣａｓエンドヌクレアーゼガイドＲＮＡバリアントが説明されている。
この実施例では、二本鎖ＤＮＡ開裂活性が改善されたＣａｓエンドヌクレアーゼガイドＲＮＡバリアントが説明されている。
【0497】
一方法では、Ｃａｓ－アルファ１０操作一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の可変ターゲティングドメインの長さを、２０個から１８個のヌクレオチド（ｎｔｓ）へと短縮し、二本鎖ＤＮＡ開裂活性への影響に関して評価した（配列番号２７及び２８、図１０及び１１を参照されたい）。このことを、酵母２ミクロン発現カセット中のａｄｅ２ ｓｇＲＮＡ１（配列番号１３）をコードする配列を合成して、ｓｇＲＮＡ２をコードする配列（配列番号１４）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）で置き換え、続いてＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に形質転換させ、（実施例２及び３で説明したように）赤色コロニー表現型に関して評価することにより達成した。
【0498】
図１２及び８Ａで示すように、３７℃での一晩の処理で赤色に着色されたセクターを示すコロニー（スコア４）の数は、１８ｎｔの長さのスペーサーを使用する場合には、２０ｎｔ長さのスペーサーと共に生成した場合と比べて約４倍多かった（２６％対６％）。まとめると、このとから、約１８ｎｔというより短いスペーサー長により二本鎖ＤＮＡ開裂活性の増強が支持されることが分かる。
【0499】
別の方法では、ガイドＲＮＡのスペーサー以外の領域をトランケートし、実施例３で説明されているように活性の増強を評価した。このために、トランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡの領域を、ＢＬＡＳＴ ２．７．３（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ． （１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２１５，４０３－４１０）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）中のリピートと塩基対形成可能な配列（５ｂｐ以上）に関して最初に評価し、「ｂｌａｓｔｎ－ｓｈｏｒｔ」パラメータ下で、及び目視検査により、低複雑度配列フィルタを無効にした。Ｃａｓ－アルファ４、８、１０、及び１４ヌクレアーゼ（配列番号１９８、１９９、２０、及び２００）に属するｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２０４～２０６、３３４）は全て、それぞれのｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲリピート部分（配列番号２０７～２０９、及び３３５）と塩基対形成可能な少なくとも２つの領域を示した（図３８～４１）。Ｃａｓ－アルファ４、８、及び１０の場合には、最初の領域（抗リピート１）は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’半分中に存在しており、２番目（抗リピート２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’半分中に存在していた（図３８～４０）。Ｃａｓ－アルファ１４の場合には、抗リピート１及び２は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’半分に位置しており、３番目（抗リピート３）は、３’部分に位置していた（図４１）。これらの領域を定義すると、ｓｇＲＮＡを、ｔｒａｃｒＲＮａ及びｃｒＲＮＡを接続配列（例えば、限定されないが、５’－ＧＡＡＡ－３’）で連結することにより操作した。Ｃａｓ－アルファ４、８、及び１０の場合には、各ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡから３種のｓｇＲＮＡを設計し、これらのｓｇＲＮＡは、これらのｓｇＲＮＡのスペーサー領域中に、Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧを表す２０Ｎｓのストレッチを有していた（図４２）。第１の設計（図４２）は、抗リピート１及び２により提供される完全長相補性を利用した（配列番号２１０～２１２）。第２の設計（図４２）では、ｃｒＲＮＡリピート及び抗リピート２の両方の領域を短縮させた（配列番号２１３～２１６）。そして第３の設計（図４２）では、ｃｒＲＮＡリピートをさらにトランケートし、抗リピート２を完全に除去した（配列番号２１７～２１９）。Ｃａｓ－アルファ１４に関しても同様のｓｇＲＮＡ設計プロセスに従ったが、３つの抗リピートシグネチャーの存在に起因して変更した。この場合には、第１のｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ中の抗リピートとＣＲＩＳＰＲリピートとの間の全塩基対形成を利用した（配列番号３４５）。第２のｓｇＲＮＡでは、抗リピート１配列、及びＣＲＩＳＰＲリピート中に相補性を有する対応する領域を除去した（配列番号３４６）。そして第３の設計では、抗リピート１及び３と、ＣＲＩＳＰＲリピート中の塩基対形成領域との両方を除去した（配列番号３４７）。
【0500】
次に、得られたｓｇＲＮＡの二次構造を、Ｖｉｅｎｎａ Ｐａｃｋａｇｅバージョン２．４．１８（Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４）Ｍｏｎａｔｓｈ． Ｃｈｅｍ．１２５１６７）を使用して評価した。全てのガイドＲＮＡに関して、ｓｇＲＮＡの５’末端から１番目又は２番目のステム－ループは、ステム構造中にミスマッチした塩基対を有する不完全なフォールドを含んでいた（Ｃａｓ－アルファ４に関するステム－ループ１（図３８）、Ｃａｓ－アルファ８に関するステム－ループ２（図３９）、Ｃａｓ－アルファ１０に関するステム－ループ２（図４０）、及びＣａｓ－アルファ１４に関するステム－ループ２（図４１）） より安定した構造を生成するために、ステム領域中のミスマッチした塩基を除去してフォールドをトリミングした（配列番号２２０～２４２、３４８～３５０）。或いは、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端から５ｎｔｓずつ最大２５ｎｔｓを欠失させ、抗リピート１の配列が損なわれることになった場合には、トランケーションを中止した（配列番号２４３～３０８）。さらに、Ａ、Ｇ、又はＣヌクレオチドを、先に説明したように３個を超えるウラシルヌクレオチドのポリヌクレオチドストリング中に置換して（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、操作されたｓｇＲＮＡ中の早期ポリメラーゼＩＩＩ終結シグナルを除去した（配列番号３５５～３６４）。
【0501】
２つの抗リピート配列に加えて、Ｃａｓ－アルファ１０のｔｒａｃｒＲＮＡはまた、塩基対形成し得る５’末端及び３’末端で、ウラシルヌクレオチドにより中断された１６ｂｐ領域も示した。この特性をさらに試験するために、設計４～７（配列番号３０９～３１２）であるｓｇＲＮＡの別のセットを操作した。ここで、５’末端及び３’末端で相補性を示す領域をトランケートし（配列番号３１０及び３１１））、且つｃｒＲＮＡ中のＣＲＩＳＰＲリピートをトランケートした（配列番号３１２）。ステム－ループ２をまた、ｓｇＲＮＡ設計のそれぞれの安定性を増加させるために改変した（配列番号３１３～３２４）。
【0502】
別の方法では、様々な植物ポリメラーゼＩＩＩターミネーター（配列番号３２５～３２９）を、Ｃａｓ－アルファガイドＲＮＡ発現、及び関連するＣａｓ－アルファヌクレアーゼ活性への影響に関して試験した。ＤＮＡデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索において、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来のＵ６非コード小型核ＲＮＡをコードする配列（配列番号３３０）をクエリとして使用して、ポリメラーゼＩＩＩターミネーターを特定した。次いで、７０％超の同一性及びカバー率を有するアラインメントからのターミネーター領域を単離し、ガイドＲＮＡ発現コンストラクトを構築し（図４３）、実施例８で説明するように、Ｃａｓ－アルファ細胞活性を増強する能力に関して試験した。
【0503】
別の方法では、Ｃａｓ－アルファ二本鎖ＤＮＡ標的結合及び任意選択的な開裂を誘導可能なガイドポリヌクレオチドを改変する。一例では、２’－デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）を、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）又はｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとのｓｇＲＮＡ融合物のスペーサーに導入して、Ｃａｓ９に関して先に説明したように特異性を増強し得る（Ｄｏｎｏｈｏｕｅ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ．８１：３６３７－３６４９）。Ｃａｓ－アルファヌクレアーゼの場合には、この改変を、許容される特異性を有することが分かっている位置に配置し得る（例えば、 ガイドＲＮＡ（ｒ）とＤＮＡ（ｄ）標的との間又は標的認識の遠位端の位置（１７、１８、１９、及び２０位）でのｒＧ：ｄＴ、ｒＵ：ｄＴ、又はｒＵ：ｄＧミスマッチ（実施例１１を参照されたい））。他の状況では、この改変を、例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２４，１０１２－１０１９又はＳｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．７，１３２７４の方法を使用して、ガイドＲＮＡスペーサー全体の位置に配置して、最大のオンターゲット活性及び最小のオフターゲット活性に関して経験的に評価し得る。
【0504】
実施例８：温度依存性ゲノム編集
この実施例では、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡの細胞内活性を細胞中の温度で制御する方法が説明されている。細胞の一例として、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞が使用される。
この実施例では、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡの細胞内活性を細胞中の温度で制御する方法が説明されている。細胞の一例として、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞が使用される。
【0505】
トウモロコシ最適化Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現コンストラクト
Ｗｔ又はバリアントｃａｓ－アルファ１０遺伝子をコードする配列を、最初に、トウモロコシ細胞中での発現にコドン最適化させ、この遺伝子に、各局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列を付加した（図１８）。得られた遺伝子を、熱ショック条件下での構成的発現を確実にするための、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ユビキチン（ＵＢＩ）遺伝子に由来する配列、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）中での発現を防ぐために組み込まれるジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）由来のＳＴ－ＬＳ１イントロン２から完全に構成されている発現カセットに入れた（図１８）（Ｓｔｒｅａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （２００４）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １３，２９９－３１２、及びＬｉｂｉａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０，６１０－６１５）。 一部の例では、これは、発現をブーストするのに有利な場合がある。例えば、エンハンサーも、ＺＭ－ＵＢＩプロモーターの上流に含まれ得る（例えば、限定されないが、配列番号８６～８８）。次に、標的を、トウモロコシ雄性不稔２６（Ｍｓ２６）及びワクシー（ｗａｘｙ）遺伝子（Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ． （２０１３）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ． ７６，８８８－８９９；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ４，ｅ７６１２）内で又は遺伝子間領域（ＩＲ）中で選択した。このことを、Ｃａｓ－アルファ１０の最適なＰＡＭ（５’－ＴＴＣ－３’）を最初に同定することにより行なった（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。次いで、ＰＡＭの３’直後の１４～３０ｎｔｓの連続したストレッチを、ｓｇＲＮＡ中でスペーサーとして使用するために単離した。発現を容易にするために、Ｍｓ２６、ワクシー（ｗａｘｙ）、又はＩＲ部位を標的とするＣａｓ－アルファ１０ ｓｇＲＮＡをコードする配列を、Ｃａｓ９からのｓｇＲＮＡに関して既に説明されているトウモロコシＵ６発現カセットに挿入した（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１６９，９３１－９４５、及びＫａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６，２５３）（図１８）。スペーサーの長さを厳密に制御するために、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）シス作用型リボザイムをコードする配列を、スペーサーの３’直後に任意選択的に追加した（図１８）。一部の例では、リボザイムを省略し、ガイドＲＮＡスペーサーをコードする配列の３’直後にＵ６ターミネーターを置いた（図４３）。
Ｗｔ又はバリアントｃａｓ－アルファ１０遺伝子をコードする配列を、最初に、トウモロコシ細胞中での発現にコドン最適化させ、この遺伝子に、各局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列を付加した（図１８）。得られた遺伝子を、熱ショック条件下での構成的発現を確実にするための、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ユビキチン（ＵＢＩ）遺伝子に由来する配列、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）中での発現を防ぐために組み込まれるジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）由来のＳＴ－ＬＳ１イントロン２から完全に構成されている発現カセットに入れた（図１８）（Ｓｔｒｅａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （２００４）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １３，２９９－３１２、及びＬｉｂｉａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０，６１０－６１５）。 一部の例では、これは、発現をブーストするのに有利な場合がある。例えば、エンハンサーも、ＺＭ－ＵＢＩプロモーターの上流に含まれ得る（例えば、限定されないが、配列番号８６～８８）。次に、標的を、トウモロコシ雄性不稔２６（Ｍｓ２６）及びワクシー（ｗａｘｙ）遺伝子（Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ． （２０１３）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ． ７６，８８８－８９９；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ４，ｅ７６１２）内で又は遺伝子間領域（ＩＲ）中で選択した。このことを、Ｃａｓ－アルファ１０の最適なＰＡＭ（５’－ＴＴＣ－３’）を最初に同定することにより行なった（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。次いで、ＰＡＭの３’直後の１４～３０ｎｔｓの連続したストレッチを、ｓｇＲＮＡ中でスペーサーとして使用するために単離した。発現を容易にするために、Ｍｓ２６、ワクシー（ｗａｘｙ）、又はＩＲ部位を標的とするＣａｓ－アルファ１０ ｓｇＲＮＡをコードする配列を、Ｃａｓ９からのｓｇＲＮＡに関して既に説明されているトウモロコシＵ６発現カセットに挿入した（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１６９，９３１－９４５、及びＫａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６，２５３）（図１８）。スペーサーの長さを厳密に制御するために、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）シス作用型リボザイムをコードする配列を、スペーサーの３’直後に任意選択的に追加した（図１８）。一部の例では、リボザイムを省略し、ガイドＲＮＡスペーサーをコードする配列の３’直後にＵ６ターミネーターを置いた（図４３）。
【0506】
トウモロコシ細胞の形質転換
他の形質転換方法（例えば、限定されないが、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンサイファ（Ｅｎｓｉｆｅｒ）ベース、ナノ粒子媒介、又はプロトプラストを利用するアプローチ）を使用し得る（Ｓａｒｄｅｓａｉ ａｎｄ Ｓｕｂｒａｍａｎｙａｍ（２０１８）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｃｈａｍ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，４６３－４８８、Ｒａｔｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （２０１９）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３７－４８、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ．１２，１０３７－１０４０、Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４０，２０４－２０７、及びＧｏｌｏｖｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ．９０，４１－５２）が、Ｗｔ Ｃａｓ－アルファ１０ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡプラスミド発現カセットを、既に説明されているような粒子媒介バイオリスティック形質転換を使用して、視覚的選択マーカー（例えば、限定されないが、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ））又は化学的選択マーカー（例えば、限定されないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）をコードする発現コンストラクトと一緒に、９～１０日齢のトウモロコシ未熟胚に共送達した（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５、及びＫａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。細胞分裂を促進するために、非構成型プロモーターから発現されるベビーブーム（ｂａｂｙ ｂｏｏｍ）及びｗｕｓｃｈｅｌ２遺伝子、トウモロコシリン脂質トランスフェラーゼタンパク質、並びにトウモロコシオーキシン誘発性も、それぞれ、前述した発現カセットと一緒に送達した（Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ． （２０１８）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｐｌａｎｔ． ５４，２４０－２５２）。
他の形質転換方法（例えば、限定されないが、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンサイファ（Ｅｎｓｉｆｅｒ）ベース、ナノ粒子媒介、又はプロトプラストを利用するアプローチ）を使用し得る（Ｓａｒｄｅｓａｉ ａｎｄ Ｓｕｂｒａｍａｎｙａｍ（２０１８）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｃｈａｍ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，４６３－４８８、Ｒａｔｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （２０１９）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３７－４８、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ．１２，１０３７－１０４０、Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４０，２０４－２０７、及びＧｏｌｏｖｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ．９０，４１－５２）が、Ｗｔ Ｃａｓ－アルファ１０ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡプラスミド発現カセットを、既に説明されているような粒子媒介バイオリスティック形質転換を使用して、視覚的選択マーカー（例えば、限定されないが、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ））又は化学的選択マーカー（例えば、限定されないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）をコードする発現コンストラクトと一緒に、９～１０日齢のトウモロコシ未熟胚に共送達した（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５、及びＫａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。細胞分裂を促進するために、非構成型プロモーターから発現されるベビーブーム（ｂａｂｙ ｂｏｏｍ）及びｗｕｓｃｈｅｌ２遺伝子、トウモロコシリン脂質トランスフェラーゼタンパク質、並びにトウモロコシオーキシン誘発性も、それぞれ、前述した発現カセットと一緒に送達した（Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ． （２０１８）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｐｌａｎｔ． ５４，２４０－２５２）。
【0507】
トウモロコシでの温度による活性の調節
二本鎖ＤＮＡ標的開裂を刺激するために、ＤＮＡ発現カセットの形質転換後に、１日又は３日連続にわたり、短い熱パルスを適用した（図１８）。温度インキュベーションの前後に、細胞を、その好ましい温度（例えば、限定されないが、２８℃）で培養した（図１８）。他の例では、高温でのより長いインキュベーションを適用した（例えば、限定されないが、３日間）（図１８）。コントロールとして、熱処理しない実験も行なった。
二本鎖ＤＮＡ標的開裂を刺激するために、ＤＮＡ発現カセットの形質転換後に、１日又は３日連続にわたり、短い熱パルスを適用した（図１８）。温度インキュベーションの前後に、細胞を、その好ましい温度（例えば、限定されないが、２８℃）で培養した（図１８）。他の例では、高温でのより長いインキュベーションを適用した（例えば、限定されないが、３日間）（図１８）。コントロールとして、熱処理しない実験も行なった。
【0508】
細胞ＤＮＡ二本鎖の切断及び修復に関する標的部位の分析
一方法では、再生植物をサンプリングし、既に説明されているものと同様のＡｍｐｌｉ－Ｓｅｑを使用して、Ｃａｓ－アルファ１０標的を、細胞ＤＮＡ二本鎖の切断及び修復の証拠に関して調べた（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（図２６）。遺伝の可能性を評価するために、各植物に関して、編集配列及び野生型配列の読み取りの頻度も算出した。トウモロコシは２倍体であることから、変異体の読み取りが約５０％及び約１００％である植物を、それぞれ、標的変異に関してヘテロ接合及びホモ接合であると仮定し得た（図１８）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ．１２，７９７－８０７、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．２０１６）。
一方法では、再生植物をサンプリングし、既に説明されているものと同様のＡｍｐｌｉ－Ｓｅｑを使用して、Ｃａｓ－アルファ１０標的を、細胞ＤＮＡ二本鎖の切断及び修復の証拠に関して調べた（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（図２６）。遺伝の可能性を評価するために、各植物に関して、編集配列及び野生型配列の読み取りの頻度も算出した。トウモロコシは２倍体であることから、変異体の読み取りが約５０％及び約１００％である植物を、それぞれ、標的変異に関してヘテロ接合及びホモ接合であると仮定し得た（図１８）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ．１２，７９７－８０７、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．２０１６）。
【0509】
別の方法では、一過性実験を、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５及びＫａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５で説明されているものと同様に実施した。このために、形質転換の２～１０日後に、形質転換された未成熟胚を回収し、ゲノムＤＮＡを抽出し、Ｃａｓ－アルファ標的を、Ｃａｓ－アルファＤＮＡ開裂及び修復を示す変異の存在に関して、Ａｍｐｌｉ－ｓｅｑにより調べた。
【0510】
結果
Ｗｔ Ｃａｓ－アルファ１０による実験では、再生したＴ０植物の分析により、４５℃熱処理でのみＤＮＡ配列の変化が明らかになった（図１９Ａ）。この変化は、Ｍｓ２６及びワクシー（ｗａｘｙ）標的の予想される切断部位を中心としていた（図２０）。この改変は、典型的には、ｇＲＮＡ標的認識の部分と重複する欠失で構成されていた（図２０）。単回の４時間での４５℃インキュベーション後、形質転換植物の３８％が、ヘテロ接合又はホモ接合のいずれかに分類されるワクシー（ｗａｘｙ）遺伝子中の標的変異を含んでいた（図１９Ａ）。３回の４時間での４５℃熱パルスにより、ワクシー（ｗａｘｙ）変異を有するＴ０植物の頻度は、５９％に上昇した（図１９Ａ）。ワクシー（ｗａｘｙ）標的では、回収された編集はまた、ヘテロ接合状態及びホモ接合状態のほぼ均等な分布を含む傾向もあった（図１９Ｂ）。Ｍｓ２６標的では、単回の温度処理を適用した場合に、Ｔ０植物の１４％が、ヘテロ接合又はホモ接合と評価される標的配列改変を含んでいた（図１９Ａ）。これは、３回連続の熱ショック後に、３１％まで増加した（図１９Ａ）。ワクシー（ｗａｘｙ）部位とは対照的には、編集の大部分は、ヘテロ接合に分類された（図１９Ｂ）。
Ｗｔ Ｃａｓ－アルファ１０による実験では、再生したＴ０植物の分析により、４５℃熱処理でのみＤＮＡ配列の変化が明らかになった（図１９Ａ）。この変化は、Ｍｓ２６及びワクシー（ｗａｘｙ）標的の予想される切断部位を中心としていた（図２０）。この改変は、典型的には、ｇＲＮＡ標的認識の部分と重複する欠失で構成されていた（図２０）。単回の４時間での４５℃インキュベーション後、形質転換植物の３８％が、ヘテロ接合又はホモ接合のいずれかに分類されるワクシー（ｗａｘｙ）遺伝子中の標的変異を含んでいた（図１９Ａ）。３回の４時間での４５℃熱パルスにより、ワクシー（ｗａｘｙ）変異を有するＴ０植物の頻度は、５９％に上昇した（図１９Ａ）。ワクシー（ｗａｘｙ）標的では、回収された編集はまた、ヘテロ接合状態及びホモ接合状態のほぼ均等な分布を含む傾向もあった（図１９Ｂ）。Ｍｓ２６標的では、単回の温度処理を適用した場合に、Ｔ０植物の１４％が、ヘテロ接合又はホモ接合と評価される標的配列改変を含んでいた（図１９Ａ）。これは、３回連続の熱ショック後に、３１％まで増加した（図１９Ａ）。ワクシー（ｗａｘｙ）部位とは対照的には、編集の大部分は、ヘテロ接合に分類された（図１９Ｂ）。
【0511】
Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇバリアント（配列番号２５）及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒバリアント（配列番号３８）の活性も調べた。一過性実験セットアップを使用して、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒは両方とも、ＩＲ標的部位においてＷｔ Ｃａｓ－アルファ１０（配列番号２０）と比較してインデル頻度が上昇した（図２９）。３回の４時間での４５℃処理により、これは、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇを使用した場合には約２倍の増強と等しく、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒによる活性のほぼ３倍の増加と等しかった（図２９）。形質転換された胚を、回収するまで３７℃で保持した場合には、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒでは改善がさらに顕著であり、それぞれ、標的変異活性が約５倍及び１７倍増加した（図２９）。野生型酵素及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ酵素は、２８℃でインデルを生じなかったが、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒは、非常に低い頻度の標的変異誘発を生じた（図２９）。
【0512】
追加の一過性実験により、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１３５）、及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｎ４３０Ｐ（配列番号１３９）はまた、植物細胞中における編集頻度も増強することを確認した。ＩＲ標的部位及びＭｓ２６標的部位の両方を、３回の４時間にわたる４５℃インキュベーション、３７℃で３日間、３３℃で３日間、及び３０℃で３日間という４回温度レジメン下で調べた。比較対象として使用するために、Ｗｔ Ｃａｓ－アルファ１０（配列番号２０）及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号３８）も含めた。３種の新規のバリアント（配列番号８５、１３５、及び１３９）は全て、両方の標的部位でＷｔ Ｃａｓ－アルファ１０と比較してインデル頻度を増加させ、３７℃で改善が最高になった（図３０Ａ及びＢ）。ＩＲ部位及びＭｓ２６部位全体で平均化した場合には、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ、及びＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｎ４３０Ｐは、それぞれ、３７℃でのインデル頻度が５６．９倍、９１．９倍、及び８５．８倍増加した（図３１）。活性の顕著な増加を、３３℃及び３０℃でも観察した（図３１）。
【0513】
実施例９：遺伝子活性化
この実施例では、Ｃａｓ－アルファタンパク質、ガイドＲＮＡ、及び転写活性化ドメインを使用して遺伝子転写を活性化する方法が説明されている。転写活性化ドメインの一例として、冷因子結合１（ｃｏｌｄ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ １）（ＣＢＦ１）タンパク質由来の転写活性化ドメインが使用される。
この実施例では、Ｃａｓ－アルファタンパク質、ガイドＲＮＡ、及び転写活性化ドメインを使用して遺伝子転写を活性化する方法が説明されている。転写活性化ドメインの一例として、冷因子結合１（ｃｏｌｄ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ １）（ＣＢＦ１）タンパク質由来の転写活性化ドメインが使用される。
【0514】
一方法では、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞中のアントシアニン色素沈着経路が活性化される。赤色の細胞表現型が得られるアントシアニンの産生を刺激するには、２つの転写因子Ｒ及びＣ１の協調的な作用が必要であることから（Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ ｅｔ ａｌ． （２０００）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ． ９７，１３５７９－１３５８４）、ｒ遺伝子を、Ｃａｓ－アルファによる転写上方制御の標的とし得、さらに、ｃ１遺伝子を、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２，３８３においてＣａｓ９又はＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲ系に関して説明されていたのと同様の成分を有するトランスジェニックコンストラクトから過剰発現させる。
【0515】
図１８に示すＣａｓ－アルファヌクレアーゼ発現コンストラクトを、最初に、標的結合及び遺伝子活性化が可能なＣａｓ－アルファタンパク質をコードするように操作した。一例として、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）Ｃａｓ－アルファ１０バリアントが、ヌクレアーゼ不活性又は死滅（ｄ）Ｃａｓ－アルファ１０（配列番号１４４）へと変換され、且つＣＢＦ１タンパク質（配列番号１４７）由来の転写活性化ドメインと連結された、図３２を参照されたい。Ｃａｓ－アルファ１０の二量体化、標的認識、及びその後の遺伝子活性化へのＣＢＦ１融合の効果を試験するために、ＣＢＦ１ドメインを含まない別のＣａｓ－アルファ１０発現コンストラクトも操作した（図３３）。次に、ｒ遺伝子プロモーター領域で３つの標的を選択し、実施例８で説明されているようにｓｇＲＮＡ発現コンストラクトを作製した。次いで、得られた発現コンストラクトを、Ｃ１過剰発現カセットと一緒に、実施例８で説明されている粒子媒介バイオリスティック形質転換を使用して、未成熟トウモロコシ杯に共送達した。最初に、２つの実験を設定した。１番目を、ＣＢＦ１連結ｄＣａｓ－アルファ１０（図３２）及びｓｇＲＮＡ発現カセットのみで実施し、２番目を、ｓｇＲＮＡコンストラクトと一緒に、非連結（図３３）とＣＢＦ１連結ｄＣａｓ－アルファ１０（図３２）発現プラスミドとの１：４混合物を使用して組み立てた。図３４、レジメン２で示されているように、形質転換後に、胚を、３日にわたり３７℃に暴露した。形質転換の４日後に、両方の処理からの胚の表面上で、赤色のアントシアニン表現型を観察し、写真で記録した。ｒプロモーターｓｇＲＮＡをコードするコンストラクトを使用することなく実施した陰性コントロール実験から、アントシアニン色素沈着の証拠が得られず、このことから、観察された表現型の変化は、ｄＣａｓ－アルファ１０及びそのｓｇＲＮＡによるＣＢＦ１のｒ遺伝子のプロモーターへの動員に直接関係していたことが示される。加えて、ｄＣａｓ－アルファ１０－ＣＢＦ１及びそれぞれのｓｇＲＮＡ発現カセットのみで組み立てられた実験により、ｄＣａｓ－アルファ１０－ＣＢＦ１のみで構成された二量体が、
ｄＣａｓ－アルファ１０及びｄＣａｓ－アルファ１０－ＣＢＦ１で構成されたヘテロ二量体と比べて遺伝子発現を効率的に活性化することを示すアントシアニン陽性細胞の最大数が得られた（図３５を参照されたい）。
ｄＣａｓ－アルファ１０及びｄＣａｓ－アルファ１０－ＣＢＦ１で構成されたヘテロ二量体と比べて遺伝子発現を効率的に活性化することを示すアントシアニン陽性細胞の最大数が得られた（図３５を参照されたい）。
【0516】
実施例１０：塩基編集
この実施例では、Ｃａｓ－アルファタンパク質、ガイドＲＮＡ、及びデアミナーゼを使用して一塩基多型（ＳＮＰ）をＤＮＡ標的に導入する方法が説明されている。デアミナーゼの一例として、シトシンデアミナーゼが使用される。
この実施例では、Ｃａｓ－アルファタンパク質、ガイドＲＮＡ、及びデアミナーゼを使用して一塩基多型（ＳＮＰ）をＤＮＡ標的に導入する方法が説明されている。デアミナーゼの一例として、シトシンデアミナーゼが使用される。
【0517】
一方法では、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）バイオリスティック形質転換実験（実施例８を参照されたい）を、ワクシー（ｗａｘｙ）遺伝子を標的とする単一ガイドＲＮＡと、シトシンデアミナーゼと連結されたヌクレアーゼ不活性又は死滅（ｄ）Ｃａｓ－アルファヌクレアーゼとをコードするＤＮＡ発現コンストラクトで実行した（図３６で示されているコンストラクトを参照されたい）。次いで、再生Ｔ０植物を、Ａｍｐｌｉ－Ｓｅｑを使用して、ＤＮＡ標的部位内での変化の存在に関して分析した（実施例８を参照されたい）。
【0518】
再生された１１例の植物から、１例は、ワクシー（ｗａｘｙ）ガイドＲＮＡ標的（５’－ＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＣＴＴ－３’（配列番号５５））内にＳＮＰを含むことが分かった。編集は、Ｃ－ＧからＴ－Ａ ｂｐへの変化が生じる５位で起こり、且つＴ０植物では約５０％の頻度で起こっており（配列読み取りの４５％は、Ｔ－Ａ ｂｐ変化を含んでおり、５５％は改変されていなかった）、このことから、この変化は遺伝するであろうことが示されている。陰性コントロールとして、実験を、デアミナーゼ融合を含まないｄＣａｓ－アルファＤＮＡ発現コンストラクト（図３３を参照されたい）と、ワクシー（ｗａｘｙ）ターゲティング単一ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ発現プラスミドとでも実施した。この実験から再生されたＴ０植物（ｎ＝１２５）から、ワクシー（ｗａｘｙ）標的改変の証拠が得られなかった。
【0519】
実施例１１：二本鎖ＤＮＡターゲティング特異性
この実施例では、Ｃａｓ－アルファタンパク質及びガイドＲＮＡの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡターゲティング特異性が説明されている。
この実施例では、Ｃａｓ－アルファタンパク質及びガイドＲＮＡの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡターゲティング特異性が説明されている。
【0520】
一方法では、ガイドＲＮＡの、スペーサーと呼ばれるｄｓＤＮＡターゲティングに関与する領域に、単一点変異を導入した。一部の例では、単一改変は、ヌクレオチドトランスバージョンであったが、別の例では、単一改変は、ヌクレオチド転位であり、他の実験では、オリジナル以外の３つの可能なヌクレオチド全てを導入した。ｄｓＤＮＡターゲティング特異性を迅速に評価するために、ａｄｅ２遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを使用して、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で実験を実施した。このアプローチにより、ミスマッチしたガイドＲＮＡ及びＣａｓ－アルファエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ発現カセットを、酵母に形質転換させ（実施例２を参照されたい）、ａｄｅ２遺伝子の開裂及び非機能的修復から得られる赤色の細胞表現型の存在を、視覚マーカーとして使用した（実施例３を参照されたい）。
【0521】
Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号８５）は、スペーサーとＤＮＡ標的との間の単一ミスマッチに対してＳｐＣａｓ９と比べて感受性であった（表３、４、及び５）。一般に、単一ヌクレオチドミスマッチにより、開裂効率が全く低下しないか、又は大幅に低下した。この例外として、ガイドＲＮＡ（ｒ）とＤＮＡ（ｄ）標的との間又は標的認識の遠位端の位置（例えば、１７、１８、１９、及び２０位）でのｒＧ：ｄＴ、又はｒＵ：ｄＴ、及び一部の例ではｒＵ：ｄＧミスマッチが挙げられた（表４及び５）。この傾向はまた、より活性なバリアント（例えば、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１３５））にも及んでいた（表６）。
【0522】
別の方法では、Ｃａｓ－アルファ１０標的認識に隣接するＤＮＡターゲティング特異性を評価した。ここで、Ｃａｓ－アルファ標的開裂に起因する不正確な二本鎖切断修復の頻度をランク付けし、高活性群及び低活性群に分類し、部位の各側に隣接する標的配列を、優先度に関して評価した。このために、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）一過性実験（実施例８を参照されたい）を、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ発現カセット及び３９箇所の位置を標的とする単一ガイドＲＮＡによるパーティクルガン形質転換を使用して実施した。
【0523】
Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号３８）により標的化された部位の３８％（３９箇所中１５箇所）は、高活性を示した（図３７）。位置頻度マトリックスを使用する高活性標的の両側に隣接する１０塩基対の分析（Ｓｔｏｒｍｏ（２０１３）Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．１，１１５－１３０）により、さらなる特異性が明らかになった（表７）。ここで、ＰＡＭ認識の５’直後のＡ－Ｔ又はＧ－Ｃ ｂｐ（ＰＡＭの５’ １位）、並びに予想された切断部位内のＴ－Ａ、Ｇ－Ｃ、及びＣ－Ｇ塩基対（ガイドＲＮＡ標的の３’ ４位）は、高活性標的部位で好ましいことが分かった（表７）。
【0524】
表１は、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（親（Ｐ）１）及びＦ３８Ｅ＋Ｈ７９Ｄ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ（Ｐ２）コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定されたさらなるバリアントを示す。各Ｃａｓ－アルファ１０バリアントに関して同定された位置及びアミノ酸変化を、下記で列挙する。各実験からの２枚の写真からの赤色酵母ピクセルの割合を平均化し、この平均を使用して、Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ（配列番号１３５）と比較した赤色の細胞表現型の倍数変化（ＦＣ）を算出した。反復間の標準偏差（ＳＤ）を示す。
【0525】
【表1】
【0526】
【表2】
【0527】
【表3】
【0528】
表２は、Ｃａｓ－アルファ４、８、１４、１５、１６、及び３１にマッピングされて転位され得るＣａｓ－アルファ１０活性増強改変を示す。各オルソログに関して、転位に起因する位置及びアミノ酸変化を示す。
【0529】
【表4】
【0530】
表３は、ＳｐＣａｓ９ ｄｓＤＮＡターゲティング特異性を示す。スペーサーの各位置に、３つの可能性があるミスマッチしたヌクレオチド全てを導入し、独立してアッセイした。完全に一致したスペーサー及びＤＮＡ標的鎖の配列を示す。空白のセルは、スペーサー中に存在するオリジナルのヌクレオチドを表す。スペーサー及びＤＮＡ標的中の位置を、ＰＡＭ近位から遠位まで番号付けし、１は、ＰＡＭから最も近く、２０は、ＰＡＭから最も遠い。実験を、形質転換後に、３７℃での一晩インキュベーションで実施した。開裂を、３回の複製全体で平均化し、赤色酵母ピクセルの割合として示す。参照として、完全に（Ｐ）一致するスペーサーで実施した実験からの赤色の割合を示す。
【0531】
【表5】
【0532】
表４は、標的１でのＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ ｄｓＤＮＡターゲティング特異性を示す。スペーサーの各位置に、３つの可能性があるミスマッチしたヌクレオチド全てを導入し、独立してアッセイした。完全に一致したスペーサー及びＤＮＡ標的鎖の配列を示す。空白のセルは、スペーサー中に存在するオリジナルのヌクレオチドを表す。スペーサー及びＤＮＡ標的中の位置を、ＰＡＭ近位から遠位まで番号付けし、１は、ＰＡＭから最も近く、２０は、ＰＡＭから最も遠い。実験を、形質転換後に、３７℃での一晩インキュベーションで実施した。開裂を、３回の複製全体で平均化し、赤色酵母ピクセルの割合として示す。参照として、完全に（Ｐ）一致するスペーサーで実施した実験からの赤色の割合を示す。
【0533】
【表6】
【0534】
表５は、標的２でのＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ ｄｓＤＮＡターゲティング特異性を示す。スペーサーの各位置に、３つの可能性があるミスマッチしたヌクレオチド全てを導入し、独立してアッセイした。完全に一致したスペーサー及びＤＮＡ標的鎖の配列を示す。空白のセルは、スペーサー中に存在するオリジナルのヌクレオチドを表す。スペーサー及びＤＮＡ標的中の位置を、ＰＡＭ近位から遠位まで番号付けし、１は、ＰＡＭから最も近く、２０は、ＰＡＭから最も遠い。実験を、形質転換後に、３７℃での一晩インキュベーションで実施した。開裂を、３回の複製全体で平均化し、赤色酵母ピクセルの割合として示す。参照として、完全に（Ｐ）一致するスペーサーで実施した実験からの赤色の割合を示す。
【0535】
【表7】
【0536】
表６は、標的２でのＡ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ａ８７Ｋ＋Ｔ３３５Ｒ＋Ｔ１９０Ｋ＋Ｔ２１７Ｈ＋Ｋ２９８Ｓ＋Ｈ３０６Ｆ＋Ｉ４０５Ｎ ｄｓＤＮＡ（配列番号１３５）ターゲティング特異性を示す。スペーサーの全ての奇数位置に、反転変異（例えば、ＡからＴへ、ＴからＡへ、ＣからＧへ、又はＧからＣへ）を導入した。完全に一致したスペーサー及びＤＮＡ標的鎖の配列を示す。空白のセルは、アッセイしなかった位置及びヌクレオチドの組み合わせを表す。スペーサー及びＤＮＡ標的中の位置を、ＰＡＭ近位から遠位まで番号付けし、１は、ＰＡＭから最も近く、２０は、ＰＡＭから最も遠い。実験を、形質転換後に、３７℃での一晩インキュベーションで実施した。１回の反復からの開裂を、赤色酵母ピクセルの割合として示す。参照として、完全に（Ｐ）一致するスペーサーで実施した実験からの赤色の割合を示す。
【0537】
【表8】
【0538】
表７は、高活性Ｃａｓ－アルファ１０（Ａ４０Ｇ＋Ｅ８１Ｇ＋Ｔ３３５Ｒ（配列番号３８））標的部位に隣接するＤＮＡ領域の塩基対組成の正規化された百分率を示す。標的部位のＴＳ鎖及び優先度に下線を引いている。予想される切断部位は、ガイドＲＮＡ標的の３’領域中における３位の直前及び４位の直後で生じる。
【0539】
【表9】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図27A】
【図27B】
【図28】
【図29】
【図30A】
【図30B】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【配列表】
【国際調査報告】